DE2840506A1 - Neue teilchenfoermige materialien, ihre herstellung und ihre anwendung als arzneimittel, insbesondere als choleravaccine - Google Patents

Description

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INSTITUT MERIEUX

Lyon, Rhone (Frankreich)

-Serie 51-

Neue teilchenförmige Materialien, ihre Herstellung und ihre Anwendung als Arzneimittel, insbesondere als Choleravaccine

Dr.Be/fi

Θ09813/0959

Beschreibung

Die Erfinciung betrifft ein neues teilchenförmiges Material, dessen Herstellung und dessen Anwendung als Arzneimittel.

ils ist bekannt, daß zur Verhütung des wirksamen Ausbrechens der Cholera es erforderlich ist, eine gute Immunität gegenüber dem Cholera-Toxin zu erlangen.

Die Erfindung hat zum Ziel ein neues teilchenförmiges Material, das in der Lage ist, insbesondere eine Immunität und eine Synthese von Cholera-Antitoxin-Antikörpern dadurch zu verleihen, daß die Teilchen dem lebenden Organismus verabreicht werden, der ein Immunabwehrsystem besitzt.

Die Erfindung hat insbesondere ein neues Material zum Gegenstand, das aus Trägerteilchen besteht, die mit einer ersten Schicht umhüllt sind, die aus einem Gangliosid oder einem Gangliosid-Derivat besteht, das eine Affinität gegenüber Cholera-Toxin aufweist, sowie eine zweite Umhüllung besitzt, die aus dem Cholera-Toxin besteht.

Die als Träger verwendeten Teilchen können rote Blutkörperchen sein, insbesondere von Tieren verschiedener Arten, sie können auch verschiedene bakterielle Keime sein, insbesondere Cholera-Vibrionen vom Typ INABA oder vom Typ OGAWA, sowie Teilchen von organischen Polymeren, wie einem synthetischen oder natürlichen Latex oder von colloidalen oder Granulatteilchen von Kohle, von Polysaccharide-oder modifiziertem Polysaccharid-Teilchen, von Teilchen von porösen Mineralien, die von Polysacchariden oder modifizierten Polysacchariden umhüllt sind und, ganz allgemein, aus anderen Teilchenarten, auf welche man mindestens eines der Fixierverfahren für Ganglioside oder dessen Derivate, die im folgenden beschrieben sind, durch-

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führen kann.

Die porösen Mineralteilchen, die oben genannt sind, sind insbesondere Metalloxide, wie Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Magnesiumoxid, Titandioxid und deren sythetische oder natürliche Derivate, wie die Gläser, Silicate, Borosilicate oder das Kaolin.

Gemäß vorliegender Erfindung wird durch den Ausdruck "Cholera-Toxin" nicht allein eine toxische Form, die richtig als Choleragen bezeichnet wird, verstanden, sondern auch eine nicht-toxische Form, die Choleragenoid genannt wird. Ls ist bekannt, daß das Choleragen sich auf natürliche und fortschreitende Weise oder unter Einwirkung der Wärme, in das Choleragenoid umwandelt. Das Choleragen und das Choleragenoid sind beide in dem Filtrat von Cholera-Vibrionen-Kulturen vorhanden.

Es ist bekannt, daß von den verschiedenen Gangliosiden das Gangliosid G„.. und bestimmte Derivate davon eine Affinität starker biochemischer und spezifischer Art gegenüber Choleragen und Choleragenoid aufweisen. Diese Affinität wird in gleicher Weise bei verschiedenen Derivaten des Gangliosids G_M1 beobachtet. Dies ist insbesondere der Fall beim Lysogangliosid Gw-. Das Lysogangliosid G„- wird durch alkalische Hydrolyse des Gangliosids G_M1 erhalten, insbesondere nach einem Verfahren, das von Holmgren, Männsson und Svennerholm in Medical Biology (1974), 52, Seite 229-233 beschrieben wurde. Diese alkalische Hydrolyse hat zum Ziel, die beiden N-Acetylfunktionen und die N-Acylfunktion-. des Gangliosids G_M1 in eine Aminfunktion NH₂ zu überführen.

Die anderen Gangliosid-Derivate haben in gleicher Weise eine Affinität gegenüber Cholera-Toxin.

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Erfindungsgemäß wird unter der Bezeichnung "Derivat des Gangliosids G₁" alles verstanden, was sich vom Gangliosid ableitet und eine Affinität gegenüber Cholera-Toxin aufweist, insbesondere die Produkte einer partiellen oder totalen Hydrolyse der N-Acylgruppen oder N-Acetylgruppen zu Gruppen NH₂ des Gangliosids G₁, sowie ebenfalls der Mono- oder a-Sialo-Ganglioside, die aus der sauren Behandlung der Gangliosiae oder ihrer Derivate herrühren (insbesondere derjenigen Derivate, die aus der totalen Hydrolyse oder partiellen Hydrolyse der N-Acylgruppen oder N-Acetylgruppen herrühren).

Die Größendimensionen der Teilchen des erfindungsgemaßen Materials schwanken zwischen 0,1 und 1000 ,um.

Die Erfindung hat ebenfalls ein Herstellungsverfahren des oben definierten teilchenförmigen Materials zum Ziel. Dieses Verfahren besteht in einer ersten Stufe darin, das Gangliosid G . und/oder dessen Derivate auf dem teilchenförmigen Träger zu fixieren. Diese Fixierung kann durch Errichten einer chemischen Bindung oder mit Hilfe eines anderen Affinitätphänomens, z.B. einer Adsorption, verwirklicht werden.

Die zweite Stufe des erfindungsgemaßen Verfahrens besteht darin, das Cholera-Toxin an die Teilchen, die mit dem Gangliosid G_M1 oder einem seiner Derivate umhüllt sind, zu fixieren.

Gemäß einer allgemeinen Arbeitsweise ist es dann, wenn die Teilchen mit dem Gangliosid G_M1 oder dem Lysogangliosid G . wie im folgenden beschrieben hergestellt werden, sehr leicht und sehr schnell verlaufend, das teilchenförmige Material, das das Cholera-Toxin angesammelt enthält, herzustellen. Dies

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wird dadurch erreicht, daß eine einfache Inkubierung mit dem Filtrat der Kultur durchgeführt wird und anschließend ausreichend zentrifugiert wird, um eine Reinigung und eine Konzentration des Toxins an die Teilchen zu erhalten. Die überstehende Flüssigkeit kann in einer einzigen Stufe vom Tbcin befreit werden und danach können im allgemeinen alle anderen Macromoleküle, die nicht brauchbar sind, zurückbleiben. Es wird dabei erreicht, daß das Toxin sich wegen der sehr starken Affinität des Gangliosids oder Lysogangliosids G ... in Teilchenform gegenüber dem Choleragen und dem Choleragenoid an die Teilchen konzentriert.

Zum Fixieren der Schicht des Cholera-Toxins (in der zweiten Stufe des Verfahrens) werden die mit dem Gangliosid G,,.. und/oder einem seiner Derivate umhüllten Teilchen eine ausreichende Zeit in Kontakt gehalten, um eine Sättigung oder eine teilweise Gewinnung reaktiver Stellen (Gangliosid G oder seiner Derivate) durch das Toxin zu erhalten, wie es gerade gewünscht wird. Diese Zeit schwankt allgemein zwischen 1 Minute und 60 Minuten, wobei die Temperatur zwischen O und 60°C liegt.

Das teilchenförmige Material, das Gegenstand der Erfindung ist, ist insbesondere aus roten Blutkörperchen zusammengesetzt, auf die eine erste Schicht fixiert ist, die aus dem Gangliosid G^ oder einem seiner Derivate besteht und eine zweite Schicht aufweist, die aus dem Choleragen oder Choleragenoid oder deren Gemische besteht.

Die Blutkörperchen sind vorzugsweise mit einer Carbonylverbindung behandelt, bevor sie mit den beiden Schichten umhüllt werden.

Die Carbonylverbindung ist vorzugsweise Formol oder Glutaraldehyd.

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Die Erfindung hat ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung des teilchenförmigen Materials zum Gegenstand, das aus den derart umhüllten Blutkörperchen zusammengesetzt ist.

Das Verfahren besteht in einer ersten Stufe darin, eine Suspension von roten Blutkörperchen in physiologischer Kochsalzlösung mit einer Carbonylverbindung reagieren zu lassen, z.B. mit einer Lösung der physiologischen Kochsalzlösung, die jene Carbonylverbindung enthält, und daß man das erhaltene Produkt in Kontakt mit einer Lösung hält, die das Choleragen, Choleragenoid oder Gemische davon enthält.

Unter der Bezeichnung "physiologische Kochsalzlösung" versteht man eine wässrige Lösung mit einem im wesentlichen neutralen pH-Wert, die 9 g/l Natriumchlorid enthält.

Vorzugsweise läßt man die roten Blutkörperchen mit der Carbonylverbindung etwa 15 min. bis 15 Std. bei einer Temperatur, die zwischen O und 6O°C schwanken kann, in Kontakt.

Die roten Blutkörperchen, die derart behandelt worden sind, werden anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend in einer physiologischen Kochsalzlösung in Lösung gebracht.

Im allgemeinen schwankt die Menge der verwendeten Carbonylverbindung zwischen 0,01 ]
von roten Blutkörperchen.

verbindung zwischen 0,01 bis 20 g je 100 cm der Suspension

Um das Gangliosid G_M1 zu fixieren, stellt man einen pH-Wert oberhalb oder gleich 8 bei der Gangliosidlösung oder einer Suspension der roten Blutkörperchen, die behandelt werden soll, ein.

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Vorzugsweise arbeitet man zum Fixieren des Gangliosids G„-bei einem pH-Wert nahe 13.

Die Temperatur bei der Inkubierung kann zwischen O und 6O°C liegen und beträgt vorzugsweise etwa 45°C. Die Inkubationszeit beträgt allgemein mindestens etwa 1 Stunde und vorzugsweise etwa 15 Stunden.

Die Suspension wird anschließend zentrifugiert und der Bodensatz aus der Zentrifuge wird gewaschen und in einer physiologischen Kochsalzlösung in Suspension gebracht.

Um das Lysogangliosid G ... an die roten Blutkörperchen zu fixieren arbeitet man vorzugsweise in folgender Weise: Zu der Suspension der roten Blutkörperchen, die der Behandlung mit der Carbony!verbindung unterworfen worden waren, fügt man eine Lösung des Lysogangliosids G.... bei einem pH-Wert oberhalb 5 und vorzugsweise nahe 7 zu. Vorzugsweise wird eine Temperatur, die zwischen 0 und 60⁰C schwankt, über eine Dauer, die von 30 Minuten bis etwa 3 Stunden schwankt, inkubiert.

Danach wird die Suspension einer Zentrifugierung unterworfen und der Bodensatz der Zentrifugierung wird gesammelt und gewaschen und in physiologischer Kochsalzlösung in Suspension gebracht.

Es wird beobachtet, daß es möglich ist, das Lysogangliosid G_M1 direkt an frische Blutkörperchen zu fixieren. Dennoch stellt man fest, daß häufig bei starken Dosen des Lysogangliosids das Phänomen der Hämolyse auftritt. Aus diesem Grunde wird bevorzugt, die roten Blutkörperchen mit der Carbony!verbindung derart vorzubehandeln, daß diese gegenüber dem hämolytischen Einfluß unempfindlich werden.

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Es wurde festgestellt, daß die Aldehydfunktion, die von den roten Blutkörperchen nach der Behandlung durch Glutaraldehyd dargeboten wird, mit der Reaktion bei der Fixierung des Gangliosids nicht stört. Überraschenderweise wird sogar festgestellt, daß eine chemische Neutralisation vorzugsweise mit den Aldehydfunktionen durch Zugabe einer Lösung von Glycocoll in einer Menge von 20 g/l bewirkt wird, bei einem pH-Wort zwischen 7 und 11, wobei diese Behandlung keine letzte Fixierung des Gangliosids beim alkalischen pH-Wert erfordert.

Das teilchenförmige Material gemäß der Erfindung kann mit roten Blutkörperchen irgendwelchen Ursprungs hergestellt werden, z.B. mit menschlichen Blutkörperchen, Blutkörperchen vom Hammel, vom Affen, vom Hasen, vom Hund, von der Ziege, von der Kuh, vom Pferd, vom Huhn, von der Taube, von der Gans usw..

Nachdem die mit einer ersten Schicht des Gangliosids G₁₁ oder des Lysogangliosids G_M1 beschichteten roten Blutkörperchen erhalten worden sind, werden diese beschichteten Blutkörperchen mit einer Lösung in Berührung gebracht, die das Cholera-Toxin enthält. Wegen der spezifischen Affinität des Gangliosids G_Mi gegenüber dem Cholera-Toxin kann die Cholera-Toxinlösung eine unreine Lösung sein, z.B. ein Filtrat einer Rohkultor von Cholera-Vibrionen. Man erhält nach dem Fixieren auf der ersten Schicht (auf Gangliosid) eine zweite Umhüllung (Cholera-Toxin).

Um die zweite Schicht bzw. Hülle zu fixieren, die bei der zweiten Stufe des Verfahrens hergestellt wird, läßt man die mit der ersten Schicht umhüllten roten Blutkörperchen in Kontakt mit einer Lösung des Toxins über eine Zeit, die zwischen 1 Minute und 60 Minuten schwankt, wobei eine Tempe-

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ratur angewendet wird, die zwischen O und 6O⁰C schwankt und vorzugsweise von 20 bis 45°C beträgt.

Die Teilchen werden nach üblichen Verfahrenweisen getrennt, z.B. durch Zentrifugieren, wonach sie gewaschen werden, um gegebenenfalls vorhandene Verunreinigungen zu eliminieren, wonach man sie in eine Suspension mit physiologischer Kochsalzlösung bringt oder sie noch einer Gefriertrocknung unterwirft.

Das teilchenförmige Material gemäß der Erfindung kann in gleicher Weise aus Bakterien bestehen, die als teilchenförmiger Träger dienen.

Die Technik des Fixierens des Lysogangliosids G₁ oder von dessen Derivaten an Bakterienkeime geschieht analog der Verfahrensweise , die für das Fixieren an rote Blutkörperchen beschrieben wurde.

Vor dem Fixieren des Gangliosids Gj,.. oder seiner Derivate werden die Vibrionen durch Behandlung mit einer Carbonylverbindung (Formol, Glutaraldehyd usw.) unter den gleichen Bedingungen inaktiviert, wie sie oben für die roten Blutkörperchen beschrieben wurden.

Im experimentellen Teil ist die Technik der Fixierung des Gangliosids G_M1 und des Lysogangliosids G_M1 an die Bakterienteilchen, insbesondere am Beispiel von Cholera-Vibrionen beschrieben.

Das teilchenförmige Material gemäß der Erfindung kann auch dann erhalten werden, wenn als Träger organische Polymerteilchen dienen, wie natürlicher oder synthetischer Latex.

Allgemein können Teilchen von organischen Polymeren verwendet

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werden, die in der Lage sind, eine stabile homogene Suspension in Wasser aufrechtzuerhalten, gegebenenfalls dank der Gegenwart eines Detergens, vorzugsweise eines anionischen Netzmittels. Man kann z.B. Polymere auf der Basis von monomeren Vinylverbindungen verwenden, wie von Styrol, Butadien, Divinylbenzol usw., die auch noch andere chemische Funktionen enthalten können, wie Alkoholfunktionen, Amingruppen, Epoxydgruppen, Carbonsäuregruppen, Sulfosäuregruppen und entsprechende Ester.

Man stellt bei der Fixierung des Gangliosids G_M1 an die Latexteilchen fest, daß diese den gleichen Gesetzen gehorcht wie die Fixierung an die roten Blutkörperchen. Insbesondere wird beobachtet, daß es notwendig ist, bei einem alkalischen pH-Wert zu arbeiten, um das Gangliosid G.... zu kuppeln, wobei jedoch ein alkalischer pH-Wert nicht notwendig ist, um das Lysogangliosid G_M1 zu kuppeln. Die Fixierung des Toxins wird in analoger Weise wie dies vorher beschrieben wurde bewirkt.

Bei den Latiz es ist die Vorbehandlung mit einer Carbonylverbindung im allgemeinen nutzlos. Bei den Latizes, die funktionelle Gruppen NH₂ enthalten, erlaubt jedoch eine Vorbehandlung die chemische Aktivierung des Trägers.

Ganz allgemein geschieht die Fixierung des Gangliosids oder von dessen Derivaten an die Teilchen wahrscheinlich durch das Phänomen der Inkorporierung des hydrophoben Teils des Gangliosids oder von dessen Derivaten an die hydrophoben Stellen des teilchenförmigen Trägers. Dieses Phänomen reicht an sich aus, kann jedoch gegebenenfalls durch eine chemische Kupplungsreaktion mit den reaktiven Funktionen, die gegebenenfalls an der Oberfläche der Teilchen vahanden sind, vervollständigt werden.

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Das teilchenförmige Material gemäß der Erfindung kann auch mit Hilfe von Teilchen von Aktivkohle gebildet werden.

Bei den Teilchen von kolloidalem Kohlenstoff, die analog denjenigen sind, die in Tusche enthalten sind, können die gleichen Techniken wie beim Latex angewendet werden.

Um die sehr groben Aktivkohleteilchen zu behandeln, bei denen granulometrisch Größen zwischen 1 und 10 /um gemessen werden, ist die Technik des Fixierens noch einfacher aufgrund der erheblichen Adsorptionskraft dieser Teilchen. In gleicher Weise wird das Gangliosid G_M1 schon bei einem neutralen pH-Wert anstelle des alkalischen pH-Wertes absorbiert. Die Fixierung des Toxins wird in analoger Weise wie vorher beschrieben durchgeführt.

Das teilchenförmige Material gemäß der Erfindung kann mit Hilfe von Polysaccharidteilchen gebildet werden. Die Polysaccharidteilchen können sichtbare Teilchen darstellen oder sie können unsichtbare lösliche Macromoleküle darstellen. Der Ausdruck "Polysaccharide" umfaßt ebenfalls die modifizierten Polysaccharide. Die Polysaccharide sind insbesondere Dextran, die Cellulosen, die Stärke, Agarose usw. und die modifizierten Polysaccharide sind insbesondere Dialkylaminoalkyl- oder Di(hydroxyalkyl)aminoalkyl-polysaccharide, wie z.B. Diäthylaminoäthy ldextran, Diäthylaminoäthylcellulose, usw..

Die Polysaccharide können in gleicher Weise nicht nur zur Bildung der Teilchen verwendet werden, sondern auch zur Bildung einer Umhüllung um mineralische Teilchen, insbesondere mineralische Oxide, wie die im folgenden erwähnten.

Die porösen mineralischen Teilchen, die mit Polysacchariden oder modifizierten Polysacchariden umhüllt sind, können insbe-

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sondere diejenigen sein, die in der DT-OS 26 33 246 beschrieben sind, oder sie können solche sein, wie sie in der gleichzeitig angemeldeten Erfindung vom gleichen Datum, betreffend ein neues Material, aas biologische Makromoleküle reversibel fixiert werden können, sowie dessen Herstellung und dessen Anwendung beschrieben sind.

Die nit Polysacchariden umhüllten mineralischen Teilchen der DT-OS 26 33 246 bestehen aus einem porösen mineralischen Träger, wie einem porösen mineralischen Oxid, das unmittelbar an der Oberfläche durch ein aminiertes polymeres Polysaccharid umhüllt ist.

Der poröse mineralische Träger kann Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Magnesiumoxid, ein Titanoxid oder deren synthetische oder natürliche Derivate sein, wie Gläser, Borosilicate, Silicate, Kaolin usw..

Das aminierte Polysaccharidpolymer wird an den porösen mineralischen Träger durch Ankleben fixiert.

Die innere Oberfläche des porösen mineralischen Trägers ist vorzugsweise unterhalb oder gleich 100 m /g und beträgt, falls möglich, zwischen 5 und 80 m /g. Der mittlere Porendurchmesser liegt vorzugsweise oberhalb oder gleich 25 nm und wenn möglich, zwischen 50 und 100 nm. Bei größeren Oberflächen oder kleineren Porendurchmessern wird die innere Oberfläche des Trägers dem Polysaccharidpolymer nicht mehr zugänglich. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht der poröse mineralische Träger aus Siliciumdioxid oder Aluminiumoxid und vorzugsweise wird ein poröser Siliciumdioxidträger mit anionischem Charakter verwendet, der beispielsweise durch Verfahrensweisen erhalten wird, wie sie in den FR-PS 1 473 239, 1 473 240, 1 475 929 und 1 482 867 beschrieben sind.

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Beispielsweise werden poröse Siliciumdioxidsorten verwendet, die von der Firma RIIONE-POULENC CHIMIE FINE unter Bezeichnungen wie SPHEROSILS XOB 030, XOB 015, und XOB 005 im Handel sind, wobei diese Siliciumdioxidsorten spezifische Oberflächen von 50, 25 bzw. 10 m /g aufweisen.

Da aminierte Polysaccharidpolymer, mit dem die innere Oberfläche des porösen mineralischen Trägers imprägniert und bedockt ist, hat einen ausgeprägten kationischen Charakter und hat sehr gute hydrophile Eigenschaften. Es soll ein Molekulargewicht von mindestens 10 Dalton, nach Möglichkeit zwischen 10 und 10 Dalton aufweisen. Es kann eine beliebige Konstitution aufweisen und insbesondere ein aminiertes Derivat des Dextrans, der Stärke, der Cellulose, der Agarose oder eines natürlichen oder synthetischen Polymeren aller bekannten Ösen sein.

Die Amin-Funktionen des Polysaccharidpolymeren können primärer, sekundärer oder tertiärer oder gebenenfalls sogar quaternärer Natur sein.

Das aminierte Polysaccharidpolymer kann insbesondere der folgenden Formel I entsprechen:

^R1

R (CH₉) - N . (I)

2 η

^R2

worin R ein Polysaccharid-Rest, wie z.B. ein Dextran-, Stärke-, Cellulose- oder Agarose-Rest, ist, η ist eine ganze Zahl im Wert von 1 bis 10, vorzugsweise 2 bis 5, R₁ und R₂, die gleich oder verschieden sein können, stellen

einen niederen Alkyl- oder Hydroxyalkylrest dar, z.B. Reste der Formeln -CH₃, -CH₂ - CH₃, -CH₂OH, -CH₂-CH₂OH oder

-CH₂-CHOH-CH₃, wobei diese Polymeren mit Hilfe eines klassischen

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Quaternisierungsmittels, wie einem Alkylhalogenid oder Hydroxyalky!.halogenid, Dimethylsulfat oder dergleichen quaternisiert sein können.

Unter den Verbindungen dieses Typs kann man insbesondere anführen die unter den Bezeichnungen DEAE DEXTRAN(Diäthylaminoäthyldextran)vom Molekulargewicht 500 000 und QAL· DEXTRAN(Diäthylaminoäthyldextran, quaternisiert) von der Firma PHARMACIA im Handel vertriebenen Produkte, ferner das unter der Bezeichnung DEAE amidon (Diäthylaminoäthylstärke) vertriebene Produkt und ebenso die kationischen Stärken, wie sie unter der Bezeichnung CATO von der Firma ROQUETTE NATIONAL vertrieben werden.

Das aminierte Polysaccharidpolymere kann mit einem Vernetzungsmittel vernetzt werden, wie mit 1, 4-Butandioldiglycidyläther oder Epichlorhydrin, Epibromhydrin, einem Diepoxid der Formel II

-3"l

CH-R¹^-N-R¹- - CH - CH₀ (II)

-ο

worin:

R' ein Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ein. niedermolekularer Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlen stoffatomen, ist,

R*2 und R'₃ für eine Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise einem niedermolekularen Alkylenrest stehen, wie im Diepoxid der Formel

(CH₂J₃

CH₀ - CH- CH₀ - N - CH₀ - CH - CH₀

909813/0959 - ιε -

Das Herstellungsverfahren für die umhüllten Teilchen des aminierten Polysaccharids kann nach zwei verschiedenen Methoden praktisch durchgeführt werden, nämlich der Imprägnierung in der Säule und der Imprägnierung im beheizten Trockenschrank. Diese beiden Methoden werden im folgenden kurz beschrieben.

Gemäß der ersten Methode gibt man das poröse mineralische Oxid in eine Chromatographiesäule, indem man das trockene und homogene Pulver einfüllt. Man führt anschließend das aminierte Polysaccharidpolymer in Lösung ein. Der Überschuß des aminierten Polysaccharidpolymeren wird anschließend durch Eluierung mittels einer Pufferlösung ausgewaschen.

Gemäß der zweiten Methode, als Imprägnierung im beheizten Trockenschrank bezeichnet, wird das poröse mineralische Oxid nach dem Wiegen kalt oder warm mit einer wässrigen Lösung des- aminierten Polysaccharidpolymeren imprägniert. Man trocknet dann im Dampftrockenschrank zwischen 50 und 12O°C, bis Gewichtskonstanz erreicht ist.

Es ist möglich, nach der Imprägnierung gemäß einer der oben beschriebenen Methoden und nach einer Trocknung im Dampftrockenschrank zwischen ungefähr 50 und 8O°C zwecks Gewinnung eines homogenen Pulvers, das erhaltene Produkt dann mit einer Lösung eines Vernetzungsmittels in einem flüchtigen Lösungsmittel, wie Diäthylather, zu behandeln. Als Vernetzungsmittel kann man irgendeines der oben erwähnten Vernetzungsmittel verwenden.

Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels hält man das Ganze ungefähr 15 Stunden lang auf einer Temperatur von 40 bis 12O°C.

Die porösen mineralischen Teilchen, die mit dem gegebenenfalls modifizierten Polysaccharid gemäß der gleichzeitigen, oben ge-

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nannten Patentanmeldung umhüllt sind, bestehen aus einem porösen mineralischen Träger, der mit einem Polysaccharidpolymeren oder einem Polymeren eines modifizierten PoIysaccharids umhüllt ist, z.B. mit einem aminierten PoIysaccharid gemäß Formel I, wobei die Polysaccharid-ümhüllung, falls notwendig, durch Vernetzung stabilisiert ist und wobei die Umhüllung aus dem Polysaccharid oder modifizierten PoIysaccharid mit dem Lysogangliosid G oder jedem anderen teil·· weise oder vollständig hydroIysierten Derivat des Gangliosids G_M1, wie es oben definiert wurde, aufgepfropft ist, wobei die schematische Formel- dieser Gangliosidverbindungen R¹^-NH₃ ist, in der R" den Rost eines Moleküls bedeutet, der vom Gangliosid G_M1 oder Lysogangliosid G^ abgeleitet ist und die aufgepfropfte Bindung dieses Moleküls der allgemeinen Formal IV entspricht:

R₃' - CH₂ - NH - R" (TV)

in der R" die oben genannte Bedeutung hat und R₃ - CH₂ den Rest des genannten Polysaccharidpolymeren oder Polymeren des modifizierten Polysaccharids bedeutet, wobei letzterer

und
einer oxidierenden Abbaureaktion/anschließend einer Reduktion unterworfen worden war.

Der poröse mineralische Träger besteht bevorzugt aus einem Metalloxid, wie Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Magnesiumoxid oder einem Titanoxid oder deren natürliche oder synthetische Derivate, wie Gläsern , Silicaten, Borosilicaten, Kaolin usw.. Das Polysaccharidpolymer ist insbesondere Cellulose, das Polymer des modifizierten Polysaccharids ist insbesondere Diäthylaminoäthyldextran, Diäthylaminoäthylstärke oder Diäthylaminoäthylcellulose; die Umhüllung aus dem Polymer des gegebenenfalls modifizierten Polysaccharids ist, sofern erforderlich, durch Vernetzung stabilisiert, wobei das Netzmittel z.B. eine Dicarbonylverbindung, ein Halogenhydrin oder ein Diepoxid ist, insbesondere 1,4-Butandioldiglycidylather.

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Epichlorhydrin, Epibromhydrin oder ein Epoxyd der oben genannten Formel II.

Das Herstellungsverfahren des Materials gemäß der gleichzeitig angemeldeten Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine Umhüllung des porösen mineralischen Trägers durch das Polysaccharidpolymer oder durch das Polymer des modifizierten Polysaccharide durchführt, und die Polysaccharidumhüllung in eine Umhüllung des modifizierten Polysaccharids auf Wunsch überführt, daß man, falls erforderlich, eine Vernetzung zur Stabilisierung der Umhüllung bewirkt, daß man die Polysaccharid- oder modifizierte Polysaccharidumhüllung einer oxidierenden Spaltungsreaktion nach einem bekannten Verfahren unterwirft, daß man das hierdurch erhaltene Oxidationsprodukt mit dem Lysogangliosid G.„ oder einem anderen Derivat des Gangliosids G.... , wie oben definiert, umsetzt, wobei dieses die allgemeine Formel R" - NH₂ hat, und daß man das erhaltene Iminderivat der Wirkung/eines Reduktionsmittels unterwirft, das in der Lage ist, die Iminbindung in eine Aminbindung zu reduzieren.

Das oben beschriebene Verfahren besteht insbesondere in der Fixierung des Lysogangliosids G₁ oder irgendeines anderen Derivats von G_M1, wie oben definiert, an die Umhüllung aus dem Polysaccharid oder modifiziertem Polysaccharid durch eine Folge der folgenden Reaktionen:

a) Eine oxidative Abspaltung der *-Glycolgruppe, um eine Carbonylverbindung der allgemeinen Formel R'₄ - CHO zu erhalten, in der R¹. den Rest des Polysaccharidmoleküls nach der oxidativen Spaltungsreaktion ist;

b) die Reaktion des Gangliosidderivats G₁ der Formel R¹¹NH₂ mit den Carbonylgruppen gemäß der Gleichung

R'₄ - CHO + R" - NH₂ '*^R<4 " ^{CH = N} ~ ^R" ^{+ H}2°

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c) die Reduktion der Iminbindung zu einer stabilen Aminbindung z.B. durch nassierenden Wasserstoff gemäß der Reaktion R'₄ - CH = N - R' + 2H *R₃ - CH₂ - NH - R" ,

wobei R₃ die obige Definition hat.

Die verschiedenen chemischen Umwandlungen können bei Umgebungstemperatur in einer Chromatographischen Säule durchgeführt werden.

Um die oxidative Spaltungsreaktion durchzuführen, kann man z.B. Perj.odsäure oder deren Derivate verwenden, wie ein Alkalimetallperjodat, oder auch Bleitetraacetat.

Zur Reduktionsreaktion kann man z.B. ein Hydrid verwenden, wie Natriumborhydrid.

Um die Umhüllung des porösen mineralischen Trägers mit dem Polysaccharxdpolymer oder dem Polymer des modifizierten PoIysaccharids zu bewirken, kann man gemäß der DT-OS 26 33 246 vorgehen, d.h. man kann in eine chromatographische Säule den porösen mineralischen Träger in Form eines Pulvers einfüllen, eine Pufferlösung vom pH-Wert 3 bis 12 bis zur Äquilibrierung durchlaufen lassen, eine Lösung des genannten Polymeren in derselben Pufferlösung einführen und bis zur Abwesenheit des Polymeren im Eluat eluieren oder man kann den porösen mineralischen Träger mit Hilfe einer wässrigen Lösung des Polymeren bei einem pH-Wert zwischen 3 und 12 imprägnieren und anschließend bei einer Temperatur zwischen 50 und 120°C bis zur Gewichtskonstanz trocknen.

Um eine Umhüllung aus Cellulose zu erhalten, ist es vorteilhaft, in folgender Weise zu arbeiten:

Man imprägniert den porösen mineralischen Träger mit Hilfe einer Lösung eines Celluloseester, trocknet und unterwirft den um-

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hüllten Träger der Einwirkung einer alkalischen wässrigen Lösung, um die Estergruppen zu hydrousieren. Man erhält in dieser Weise einen porösen mineralischen Träger, der von Cellulose in regenerierter Form umhüllt ist. Die Celluloseumhüllung, die in dieser Weise erhalten wurde, ist sehr stabil und kleidet die Poren des porösen mineralischen Trägers vollständig aus. Es ist nicht erforderlich, diese Umhüllung durch Vernetzung zu stabilisieren.

Das Polysaccharidpolymere oder Polymere des modifizierten Polysaccharids, das zum Imprägnieren verwendet worden ist und die innere Oberfläche des porösen mineralischen Trägers bedeckt, hat ein Molekulargewicht von mindestens 10 Dalton, vorzugsweise zwischen 10 und 10*> Dalton.

Tin.·
das Choleratoxin an die Teilchen zu fixieren, die aus Lysogangliosid G^₁ oder dessen Derivaten bestehen oder damit ausgekleidet sind, arbeitet man, wie oben bezüglich der umhüllten roten Blutkörperchen beschrieben wurde.

Die Erfindung hat ebenfalls die Anwendung des teilchenförmigen Materials, das in der genannten Weise mit dem Cholera-Toxin umhüllt worden ist, zum Gegenstand. Diese Anwendung besteht in der Verabreichung des genannten teilchenförmigen Materials an Lebewesen, die ein Immunsystem besitzen, mit dem Ziel, insbesondere eine Antikörperbildung zu induzieren.

Man stellt fest, daß das ganze teilchenförmige Material gemäß der Erfindung nach der Injektion in ein Tier in der Lage ist, eine aktive Antikörpersynthese des Cholera-Antitoxins zu induzieren mit sehr hohen Titern. Die Antikörper können aus dem Blut nach bekannten Methoden isoliert werden. Es ist von Interesse, diese Antikörper zu erhalten, da sie insbesondere als Reagenzien in der Serologie verwendbar sind.

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Bei den Tieren, die gegen Cholera empfindlich sind oder hierdurch beeinträchtigt werden und beim Menschen stellt diese Anwendung eine Impfung dar.

Die Erfindung hat ebenfalls die Anwendung des oben beschriebenen teilchenförmigen Materials als Arzneimittel zum Ziel.

Das Arzneimittel kann, wie das genannte Vaccin, auf oralem Weg verabreicht werden. Wenn das erfindungsgemäße Material aus Trägerteilchen auf der Basis bakterieller Keime und insbesondere inaktivierter Vibrionen oder auf der Basis von Polysacchariden oder löslichen modifizierten Polysacchariden aufgebaut ist, kann es auf parenteralem Weg, insbesondere subkutan verabreicht werden.

Das Vaccinierungsverfahren gemäß der Erfindung besteht in der ein- oder mehrmaligen Verabreichung einer Dosis des teilchenförmigen Materials, die in der Lage ist, eine Immunreaktion durch Antikörperbildung zu induzieren.

Weiterhin gestattet das teilchenförmige Material gemäß der Erfindung bei der oralen Verabreichung an Menschen, die Vibrionen tragen und bei denen das Risiko besteht, daß sie Cholera oder Sympthome ähnlich einer Diarrhöe haben oder bekommen werden, daß eine Stimulierung der Immunität erhalten wird, insbesondere eine ImmunitätsStimulierung der Schleimhäute des Verdauungstrakts und des Darmtrakts.

Weiterhin gestattet das teilchenförmige Material gemäß der Erfindung bei Individuen, die vorher auf parenteralem oder oralem Weg gegen Cholera mit Hilfe eines Präparats aus gereinigten und inaktivierten Toxinen und/oder mit Hilfe eines Vaccins einer Vaccine gemäß der Erfindung geimpftvorden sind, bei der Verabreichung auf oralem Weg die Erzielung der Wirkung

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einer Immunitätsreaktion auf dem Niveau der Verdauungsschleimhäute.

Es ist besonders festzuhalten, daß bei der Verwendung insbesondere der Teilchen auf Basis von Kohle oder Latex es möglich ist, außer dem Cholera-Toxin andere Makromoleküle zu fixieren, die in dem Kulturfiltrat der Cholera-Vibrionen vorhanden sind. Durch diese Tatsache der Immunität, die durch diese Teilchen verliehen wird und die weniger spezifisch als diejenige der anderen Teilchen ist, können bestimmte Vorteile in dem Fall erzielt werden, wenn die Immunität gegen das einzelne Toxin nicht ausreicht.

Es soll ebenfalls bemerkt werden, daß es möglich ist, solche Teilchen herzustellen, die zwar mit dem Gangliosid G_M1 oder dem Lysogangliosid G_M1 bedeckt sind, aber nicht durch das Cholera-Toxin gesättigt sind. Bei der Verabreichung durch den Verdauungstrakt bei Menschen, die an Cholera leiden, erlauben diese nicht an Cholera-Toxin gesättigten Teilchen die Erzielung eines doppelten Schutzes, wobei dieses Präparat einmal gestattet, die erforschte Immunität zu induzieren und es andererseits das Individuum zeitweilig gegen jede Ausscheidung von Cholera-Toxin über gegebenenfalls vorhandene Vibrionen im Verdauungstrakt schützt, wobei dieses Cholera-Toxin vorzugsweise an diejenigen Stellen fixiert wird, die vom Gangliosid oder Lysogangliosid G_M1 besetzt sind, aber noch nicht durch das Cholera-Toxin abgesättigt sind.

Wegen der Anwesenheit des Gangliosids G_M1 oder eines Derivats davon, das CholerafToxin an die Teilchen gebunden Üäl% wird das Toxin gleichzeitig und automatisch inaktiviert. Als Wirkung kann man feststellen, daß das teilchenförmige Material, das in dieser Weise erhalten wurde, von den toxischen Eigenschaften entblößt ist, die das Cholera-Toxin aufweist.

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Durch die Verbindung des Cholera-Toxins mit einem Teilchen kann das Toxin sehr leicht durch die immunisierten Zellen des Organismus erkannt werden. Die Teilchen spielen einmal die Rolle eines Vaccineprinzips und einmal des Adjuvanz-Prinzips. Gegenstand der Erfindung ist außerdem das oben geschilderte teilchenförmige Material in der Form von Arzneimitteln, insbesondere einer Vaccine.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann entweder in Form eines Pulvers (z.B. gefriergetrocknet) vorliegen, das in Wasser oder einer physiologischen Kochsalzlösung (Lösung von etwa 9 g/l Natriumchlorid in Wasser) gelöst oder darin suspendiert wird, oder es kann in Form einer Lösung oder Suspension für direkte Verabreichung dargeboten werden.

Die folgenden Äispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel Ί

Diees Beispiel behandelt die Fixierung des Cholera-Toxins auf porösem Siliciumdioxid, das mit DEAE-Dextran umhüllt ist, welches mit 1,4-Butandioldiglycidyläther vernetzt worden war, sowie anschließend mit Gangliosid umhüllt worden ist.

Aus 1 kg Kalbshirn wird ein wässriger Extrakt von etwa 7 1 hergestellt. Diese Methode ist in L. Svennerholm: Gangliosides, isolation Methods in carbohydrate chemistry. Band 6, Edition R.L Whister und J.N. Bemiller, Acad. Press, New York 1972 beschrieben.

Dieser wässrige Extrakt wird unmittelbar durch eine Säule gegeben, die 50 g Träger enthält, der gemäß Beispiel 3 der DT-OS 26 33 246 hergestellt worden war und vorzugsweise mit einem TRIS-HCl-Puffer 0,05 m vom pH-Wert 6,8 äquilibriert

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worden war. Die Ausbeute betrug 200 cm³/cm /h. Die Ganglioside, darunter etwa 40% Gangliosid G„ bleiben unter diesen Bedingungen in der Säule hängen. Man wäscht zuerst mit den folgenden Lösungen in der angegebenen Reihenfolge: TRIS-HCl 0,05m, pH 6,8

NaOH 0,1 η -

Die zahlreichen Verunreinigungen werden mit einem Gemisch von Chloroform, Methanol und Wasser im Volumenverhältnis 30:60:25 eliminiert. Nach der Fixierung des Gangliosids auf dem teilchenförmigen Träger wird anschließend das Cholera-Toxin in folgender Weise hierauf fixiert:

Das teilchenförmige Produkt, das in der vorhergehenden Stufe erhalten wurde, wird mit einer Lösung von Cholera-Toxin einige Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert. Nach dem Zentrifugieren wird festgestellt, daß die überstehende Flüssigkeit keinen toxischen Charakter mehr hat. Anschließend wird der Rückstand der Zentrifugierung mit einer Lösung aus Natriumchlorid in einer Menge von 9g/l Wasser gewaschen, um die nicht an das Lysogangliosid G_M1 fixierten Proteine zu entfernen. Schließlich wird eine Suspension von 10% der Teilchen erhalten. Diese Suspension wird gefriergetrocknet.

Beispiel 2

Dieses Beispiel betrifft das Aufpfropfen von Lysogangliosid G_M auf einen porösen mineralischen Träger, der mit Diäthylaminoäthyldextran imprägniert und in zweiter Stufe vernetzt worden war und danach mit Cholera-Toxin behaftet worden war.

2.1 - Ein Träger auf der Basis von DEAE-Dextran wird gemäß einer Verfahrensweise, wie sie in der DT-OS 26 33 246 be-

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schrieben ist, hergestellt.

Zu einer Lösung von 7,5% DEAE-Dextran in einer Menge von 3Or.il vom pH-Wert 11,5 werden 1Og Spherosii XOB 030 zugefügt, uas Gemisch wird eine Nacht bei 80°C getrocknet und anschließend wird hierzu 30 cm einer Lösung- von Butandioldiglycidylather in einer Menge von 1,5% in Diäthyläther zugegeben. Der Äther wird im Luftstrom abgeblasen und das Gemisch wird 15 Stunden auf 80⁰C gehalten, um eine Vernetzung des DEAE-Dextrans zu erzielen.

2.2 - Die Lösung der Ganglioside wird durch Chromatographie durch Ionenaustauscher an poröses Siliciumdioxid, das mit ÜEAE-Dextran imprägniert worden war, gemäß dem vorigen Beispiel hergestellt.

Die Lösung des rohen Gangliosids, die erhalten wird, enthält etwa 40% Gangliosid G,-, das erfindungsgemäß benutzt werden kann.

Die beiden N-Acetyl-Funktionen und die N-Acyl-Funktion am Gangliosid G.... werden zu Amingruppen NU- durch alkalische Hydrolyse gemäß einem an sich bekannten Verfahren hydrolysiert, (Homgren - Mansson - Svennerholm, Medical Biology (1974) , Band 52, Seite 229-233). Das erhaltene Produkt wird Lysogangliosid genannt und besitzt drei N^-Gruppen je Molekül. Nach dem Gefriertrocknen wird das erhaltene Pulver in einem Carbonat-Puffer 0,01m vom pH-Wert 9 gelöst, der 20 g/l Natriumchlorid enthält, wobei eine Konzentration von 1 mg/cm angewendet wird. 1 cm dieser Lösung enthält etwa 370 ,ug

3
Sialinsäure je cm .

2.3 - Oxidation mit PerJ_odsäure auf dem Träger.

Es werden 10 g Spherosii XOB 030, die mit DEAE-Dextran, das in zweiter Stufe vernetzt worden war, imprägniert war, zu 100 cm einer wässrigen Lösung von 0,02 m Watriumperj-odat (pH etwa 4,5) zugefügt. Die Oxidationsdauer be-

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trug 2 Stunden und dieses Verfahren wurde sehr gut bei Umgebungstemperatur durchgeführt.

Anschließend wird der Träger mit einer Lösung von 0,01 m Natriumcarbonat vom pH-Wert 9 unter Zusatz von 20 g/l Natriumchlorid gewaschen. Die erhöhte ionische Aufladung dieses Puffers wird durch Sättigen der kationischen Gruppen mit vernetztem und oxidiertem DEAE-Dextran bestimmt, da die Chlorid-Ionen die schließliche Fixierung des Lysogangliosids durch elektrostatische Kräfte beeinträchtigen, wodurch eine Reaktion der Amingruppen mit den Aldehyd-Funktionen des Trägers ermöglicht werden könnte.

In dieser Stufe ist es leicht, die Aldehyd-Funktion am oxidierten Träger zu messen. In Gegenwart des Schiff'sehen Reagenz entwickelt sich eine rosa-violette intensive Färbung.

2.4 - Aufpfropfen des Lysogangliosids.

Der gemäß dem vorstehenden Abschnitt hergestellte Träger wird zusätzlich mit 50 cm einer Lösung des Lysogangliosids ^GM1 9^ewascnen· Nach 2 Stunden Berührungsdauer wird die überstehende Flüssigkeit abdekantiert. Mittels einer Dosis von Sialinsäure ist es leicht, zu zeigen, daß die Gesamtmenge Lysogangliosid an den Träger gekuppelt worden war (95 bis 100%).

Der Träger wird mit einem Carbonat-Puffer vom pH-Wert 9 gespült. In dieser Stufe ist es leicht, in gleicher Weise zu zeigen, daß die Färbung des Trägers mit dem Schiff"sehen Reagenz viel schwächer ist als in der vorhergehenden Stufe, was anzeigt, daß das Lysogangliosid an die Aldehyd-Funktionen des oxidierten Trägers gut fixiert worden ist.

2.5 - Reduktion durch Natriumborhydrid

Es werden 50 cm einer Lösung von 0,2 m NaBH, in Wasser zu der in der vorherigen Stufe hergestellten Träger zugefügt. Nach einer Kontaktzeit von 2 Stunden bei ümgebungs-

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"Ιο" 28Λ0506

temperatur wi rd dar Träger mit Wasser gespült, das durch die Säule gegeben wurde.

Nach dem Äquilibrieren mit dem Puffer für die ausgewählte Chromatographie (Phosphatpuffer 0,OI m vom pH-Wert 7,2 n.it einem Gehalt von 20 g/l :;aCl) ist die Säule mit einer biospezifischen Affinität zur Verwendung vorbereitet. In diesem Stadium ist keine Spur aldehydischer Funktionen mehr durch Färbung mit dem Schiff'sehen Reagenz zu entdecken. Die Aldehyd-Funktionen, die nicht mit dem Lysogangliosid reagiert haben, werden in primäre Alkohol-Funktionen überführt.

2.6 - Fixierung des Cholera-Toxins.

Um das Toxin zu fixieren, wird analog Beispiel 1 gearbeitet.

Beispiel 3

Aufpfropfen des Lysogangliosids G_r... auf einen porösen mineralischen Träger, der mit Cellulose imprägniert ist und anschlißender Fixierung von Cholera-Toxin.

3.1 - Imprägnierung mit Cellulose.

Es werden 10 g Spherosil XOC 005 (oder ein anderer poröser mineralischer Träger) zu 30 cm einer Lösung von 3% Celluloseacetat in Aceton gegeben (Cellulosepropionat oder andere Ester, die im organischen Lösungsmittel löslich sind und hydrolysierbar sind, können ebenfalls verwendet werden, wenn sie die ursprüngliche Cellulose durch alkalische Hydrolyse zurückbilden). Das Gemisch wird in einem warmen Luftstrom getrocknet. Das erhaltene Pulver wird, falls notwendig, gesiebt und in eine Säule eingebracht.

Es wird mit 10 1 einer wässrigen Lösung von NaOH 0,Tn gewaschen, die kontinuierlich in einer Menge von 500cm /h

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über eine Macht laufengelassen wird. Nach dieser alkalischen Hydrolyse kann die Säule mit Aceton oder Wasser gewaschen werden, das den vorgegebenen pH-Wert hat, wonach die Cellulose regeneriert ist und nicht mehr löslich ist und vollständig das Innere der Poren des porösen mineralischen Trägers besetzt, wobei die Auskleidung bosser ist als bei dem anfangs verwendeten Polymeren und eine leichtere vollständige Besetzung der inneren Oberfläche erfolgt. Aus diesem Grunde ist die Verwendung von Celluloseestern mit möglichst niedrigem Molekulargewicht zu empfehlen.

3.2 - Herstellung der Lösung von Lysogangliosid G^₁ mit Amin-

Funktionen.

Hierbei werden die gleichen Bedingungen gemäß 2.2 des Beispiels 2 eingehalten.

3.3 - Oxidation des Trägers mit Periodat.

Es werden die gleichen Bedingungen eingehalten wie in Abschnitt 2.3.

3.4 - Aufpfropfen von Lysogangliosid.

Es v/erden die gleichen Bedingungen eingehalten wie in Abschnitt 2.4.

3.5 - Reduktion durch Natriumborhydrid.

Es werden die gleichen Bedingungen wie in Absatz 2.5 eingehalten.

3.6 - Fixieren des Cholera-Toxins.

Es werden die gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 eingehalten.

Beispiel 4

Fixierung des Lysogangliosids G_M1 auf rote Blutkörperchen, die

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vorher mit einer Carbonylverbindung behandelt worden waren, und anschließender Fixierung des Cholera-Toxins.

4.1 - Es werden rote Blutkörperchen vom Schaf viermal mit physiologischer Kochsalzlösung (pH 7,2 - NaCl 9 g/l) derart gewaschen, daß die überstehende Waschflüssigkeit am Schluß vollständig klar war.

Die Blutkörperchen werden in einer Konzentration von 8% in physiologische Kochsalzlösung gebracht und hierzu ein gleiches Volumen einer 3%-igen Zormaldehydlösung in physiologischer Kochsalzlösung zugefügt. Nach einar Inkubationszeit von 18 Stunden bei 37°C werden die mit Formalin behandelten Blutkörperchen viermal mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend in 10%-ige physiologische Kochsalzlösung gebracht.

4.2 - Behandlung der Blutkörperchen mit Glutaraldehyd.

Die Blutkörperchen des Schafs werden viermal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und dann in einer Konzentration von 10% gebracht, wozu das 20-fache Volumen 5%-iger schwacher Glutaraldehydlösung in physiologischer Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 zugegeben wurde. Nach einer Inkubationszeit von 2 Stunden bei Umgebungstemperatur werden die mit Glutaraldehyd behandelten Blutkörperchen in destilliertem Wasser gewaschen und dann in physiologische Kochsalzlösung in einer Menge von 10% eingebracht.

4.3 - Fixierung des Gangliosids G... an die vorher mit der

Carbonylverbindung behandelten Blutkörperchen. Die roten Blutkörperchen, die mit Formaldehyd oder Glutaraldehyd behandelt worden waren und aus der vorigen Stufe erhalten worden waren, werden mit einer 0,1 η Natriumhydroxydlösung oder mit einer anderen basischen Lösung mit

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alkalischem pH-Wert unterhalb oder gleich 8 und vorzugsweise gleich 13 gewaschen.

Ein Volumen dieser 10%-igon Suspension wird mit einem Volumen einer Gangliosidlösung in 0,1 η Natriumcarbonat, die 100 /ug Sialinsäure je cm enthielt, inkubiert, was

3
etv/a 0,5 mg Gangliosid G,,.. /cm entspricht.

Die Inkubationstemperatur kann zwischen 0 und 60°C liegen, v/ird aber vorzugsweise auf 45°C eingestellt.

Die Kontaktzeit wird über 1 Stunde, vorzugsweise etwa 15 Stunden aufrechterhalten.

Die Suspension wird anschließend "entrifugiert, wobei eine Dosis von Sialinsäure, die der überstehenden Flüssigkeit zugegeben wird, die Abschätzung des Prozentsatzes der Fixierung des Gangliosids an die roten Blutkörperchen von ungefähr 50% gestattet.

Nach drei Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung wird die schließlich erhaltene Suspension auf eine Konzentration von 10% gebracht und konserviert.

4.4 - Fixierung von Lysogangliosid G„.. an rote Blutkörperchen, die vorher mit einer Carbonylverbindung behandelt worden waren.
Eine Suspension von roten Blutkörperchen, die mit Formalin oder Glutaraldehyd behandelt worden waren, in 10%-iger

die
Konzentration, wie vorstehend hergestellt worden ist, wird mit 2 mg gefriergetrocknetem Pulver von Lysogangliosid G„. versetzt. Eine Menge von 0,1 bis 10 mg ergibt in gleicher Weise zufriedenstellende Ergebnisse. Der pH-Wert der Inkubationslösung beträgt 7,2, kann aber auch alkalisch sein, wie dies nach der vorstehenden Methode erreicht wird.

Die Inkubationsdauer beträgt 30 Minuten bis 3 Stunden.

Die Inkubationstemperatur kann zwischen 0 und 60°C schwanken, wird aber vorzugsweise bei 37°C gewählt.

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Nach dem Zentrifugieren wird die überstehende Flüssigkeit für die Kupplung, die nicht mehr als 1 bis 5% Lysogangliosid am Anfang enthält, der gleichen Fixiermethode unterworfen.

Nach drei Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung wird die schließlich erhaltene Suspension wieder aufgenommen und bei einer Konzentration von 10% konserviert.

Das Lysogangliosid G_M1, das als Ausgangsprodukt verwendet worden war, wird durch alkalische Hydrolyse nach einem Verfahren gewonnen, das von Holmgren, Mansson und Svennerholm in Medical Biology (1974), Band 52, Seite 229 bis 233, beschrieben wurde.

4.5 - Fixierung des Cholera-Toxins.

'das Toxin zu fixieren wird analog Beispiel 1 gearbeitet.

Beispiel 5

Dieses Beispiel beschreibt die Kupplung des Gangliosids G. oder Lysogangliosids G_M1 an Latex-Teilchen und anschließende Fixierung von Cholera-Toxin.

5.1 - Es werden 3 Volumina einer 10%-igen Suspension von Latex zu 1 Volumen einer Ganglxosidlösung, die 1 bis 3 mg G_M1 je cm enthält, zugegeben.

Der verwendete Latex ist ein Handelsprodukt der Firma RHONE-POULENCE mit der Bezeichnung ESTAPOR. Der pH-Wert der Suspension wird auf 13 durch Zugabe einer ausreichenden Menge 1n Natriumcarbonat eingestellt. Die Inkubationstemperatur beträgt 45°C, kann aber zwischen 5 und 6O°C schwanken.

Die Kontaktzeit beträgt etwa 15 Stunden. Die Suspension wird mit 30 000 U/min. 1 Stunde mit der Ultrazentrifuge abzentrifugiert.

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Eine Dosis Sialinsäure und die Dosierung des Gangliosids in der überstehenden Flüssigkeit gestatten, daß die Gesamtmenge G_M1 an die Latex-Teilchen fixiert werden. Nach drei Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung,zu der ein Netzmittel (tween 80) in einer Konzentration von 0,1% zugegeben war, ist es möglich festzustellen, daß die gesamte biologische Aktivität von G,... aus der überstehenden Flüssigkeit verschwunden ist, was nicht bei den überstehenden Flüssigkeiten aus den Waschen der Fall war, und sich im Bodensatz der Zentrifugierung befindet, der dann in eine Endkonzentration von 1 % gebracht und konserviert wird.

5.2 - Kupplung des Lysogangliosids G.,...

Die gleiche Technik wie für das Gangliosid G₁₁ wird angewendet mit der Ausnahme, daß der pH-Wert nicht notwendigerweise alkalisch sein muß. Ein neutraler pH-Wert ist gut geeignet.

5.3 - Fixierung des Cholera-Toxins.

Es wird gemäß Beispiel 1 gearbeitet. Um jedoch das als Endprodukt erhaltene teilchenförmige Material abzutrennen, wird anstelle der Ultrazentrifugierungsstufe des vorliegenden Falls eine Zentrifugierung durchgeführt.

Beispiel 6

Dieses Beispiel beschreibt die Kupplung von Gangliosid G .. an Aktivkohleteilchen und anschließende Fixierung von Cholera-Toxin.

6.1 - Es wird 1 Volumen einer Suspension von Kohleteilchen von 30% mit einem Volumen einer Lösung des Gangliosids G^ in einer Konzentration zwischen 1 und 3 mg/cm gemischt.

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Nach dem Zentrifugieren, Waschen und Wiederholen mit einer physiologischen Kochsalzlösung bei einer Konzentration von 1 % wird die Suspension zum Fixieren von Cholera-Toxin verwendet.

Es wird in gleicher Weise gearbeitet, aber anstelle des Gangliosids G_A.. wird das Lysogangliosid G .. fixiert.

6.2 - Fixierung von Cholera-Toxin.

Man arbeitet analog Beispiel 1, falls erforderlich wird die Zentrifugierung durch eine ültrazentrifugierung mit 30 000 U/min ersetzt, die 1 Stunde durchgeführt wird (vor allem in dem Fall, daß die Teilchen kolloidal sind). .Anschließend wird der Bodensatz der Zentrifuge mit physxLogischer Kochsalzlösung gewaschen, wobei eine konzentrierte Suspension erhalten wird, die es gestattet durch Verdünnung Dosierungen einer Vaccine gegen Cholera herzustellen.

Beispiel 7

Immunisierung von Kaninchen.

Die Suspension von 10% Teilchen, die gemäß Beispiel 4 erhalten worden waren, wird Kaninchen injiziert, wobei 1 cm jede Woche subkutan über 4 Wochen eingeimpft wurden. Jedes Kaninchen wurde ausnahmslos immunisiert und bildete Antikörper von roten Antiblutkorperchen, die leicht durch Mischen mit Antiserum mit 1 Volumen einer Suspension von 50% frischer roter Blutkörperchen eliminiert werden konnten.

Nach der Behandlung wurde festgestellt, daß a) die Seren der derart immunisierten Kaninchen eine einzige Fällungslinie mit einem Filtrat ergeben, das aus einer an Toxin angereicherten Kultur stammt, wobei eine doppelte Immunodiffusion stattfindet,

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b) daß diese Fällungslinie eine vollständige Identitätsreaktion mit derjenigen Linie ergibt, die zwischen einem geeichten Cho]ara-Toxin-Präparat, das gereinigt worden war, und dem gleichen Kaninchen-Antiserum erhalten worden war und c), daß jede Fällungslinie nicht mehr zwischen den Kaninchenseren und dem gleichen Kulturpräparat bestand, das von der toxischen Aktivität befreit worden war.

Beispiel 8

Dieses Beispiel betrifft das Aufpfropfen von Gangliosid G

oder Lysogangliosid G_M1 auf Cholera-Vibrionen.

Eine Suspension von Cholera-Vibrionen (Typ INABA oder OGAWA oder ein Gemisch dieser beiden Typen) wird auf eine Konzen-

9 3

tration von 10 Keime /cm gebracht. Diese Suspension wird mit Formol oder mit Glutaraldehyd behandelt in einer Weise, die sich nicht von den rigorosen Bedingungen unterschied, wie sie oben bei den roten Blutkörperchen in Suspension angewendet worden war. Die Kupplungstechnik des Gangliosids oder Lysogangliosids G . ist die gleiche wie oben für die roten Blutkörperchen beschrieben. Ebenfalls ist die Kupplungstechnik der zweiten Schicht (Toxin) die gleiche, wie oben für die Blutkörperchen beschrieben wurde.

Das erhaltene Produkt kann, falls gewünscht, gefriergetrocknet werden. Es stellt eine Vaccine dar, die subkutan verabreicht werden kann.

Beispiel 9

Dieses Beispiel betrifft die Fixierung von Cholera- Toxin an Kohleteilchen, die mit Gangliosid G_M1 umhüllt sind, ohne daß das Gangliosid durch Toxin abgesättigt ist.

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Es wird wie gemäß Beispiel 6 gearbeitet und durchweg eine geringere Menge an Cholera-Toxin verwendet, z.B. eine 50%-ige Menge, wie sie notwendig ist, um die reaktiven Stellen des Gangliosids G_M1 abzusättigen.

Es wird eine Suspension erhalten, die bei der Verabreichung auf oralem Weg es gestattet, gegen Krankheiten von Personen zu schützen, die einer Cholera-Kontaminierung ausgesetzt waren.

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Claims (21)

Patentansprüche

1. Teilchenförmiges Material, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Trägermaterialteilchen besteht, die mit einer ersten Schicht überzogen sind, uio aus oi-ier.. Gangliosid oder einem Derivat des Gangliosids besteht, das mit einer Affinität gegenüber Choleratoxin ausgerüstet ist, sowie eine zweite Schicht aufweist, diu aus dor, Choleratoxin besteht.

2. Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerteilchen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus roten Blutkörperchen, Bakterienkeimen, insbesondere inaktivierten Cholera-Vibrionen, organischen Polymeren, die in der Lage sind, eine stabile Suspension in Wasser zu bilden, v/ie sythetischer oder natürlicher Latex, Kohleteilchen, Teilchen von Polysacchariden oder modifizierten Polysacchariden und porösen mineralischen Teilchen, die mit Polysacchariden oder modifizierten Polysacchariden, die gegebenenfalls vernetzt sind, umhüllt sind.

3. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß das Gangliosid oder das Derivat eines Gangliosids ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gangliosid G_M1, Lysogangliosid G_M1, Produkte der partiellen Hydrolyse des Gangliosids G^ sowie

Mono- oder a-sialo Ganglioside, die Produkte einer Säurebehandlung der Ganglioside oder ihrer Derivate sind.

4. Verfahren zur Herstellung eines Materials nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich-

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net, daß man in erster Stufe das Gangiiosid und/oder das Gangliosidderivat auf die Trägerteilchen fixiert und anschließend in einer zweiten Stufe das Choleratoxin auf den Teilchen fixiert, die mit dem Gangiiosid oder dem Gangliosidderivat umhüllt sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Fixieren der Schicht des Choleratoxins die mit dem Gangiiosid und/oder Gangliosidderivat umhüllten Teilchen in Berührung mit dem Toxin solange beläßt, daß eine Sättigung erhalten wird, und daß man gegebenenfalls das Gangiiosid in Verbindung mit dem Toxin teilweise zurückgewinnt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeichnet , daß das Trägermaterial aus roten Blutkörperchen besteht, die vorzugsweise mit einer Carbony!verbindung behandelt worden sind.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Fixieren des Gangliosids G auf den roten Blutkörperchen, die vorzugsweise mit der Carbonylverbindung behandelt worden sind, eine Lösung des Gangliosids in einer Suspension der roten Blutkörperchen bei einem pH-Wert oberhalb oder gleich 8 behandelt.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Fixieren des Lysogangliosids G_M1 eine Suspension der roten Blutkörperchen, die vorzugsweise mit einer Carbony!verbindung behandelt worden sind, mit einer Suspension von roten Blutkörperchen behandelt, die mit einer Lösung des Lysogangliosids G,... bei einem pH-Wert oberhalb 5 behandelt worden sind.

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9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeichnet , daß man als Träger bakterielle Teilchen verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß man bakterielle Teilchen verwendet, die Cholera-Vibrionen darstellen.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß die Cholera-Vibrionen vorzugsweise mit einer Carbonylverbindung inaktiviert worden sind.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Trägorteilchen organische Polymere sind, die sich dadurch auszeichnen, daß sie in Wasser in stabiler Suspension gehalten werden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß diese organischen Polymeren von Vinylmonomeren abgeleitet sind, wie Styrol, Butadien oder Divinylbenzol.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Tragerteilchen Kohleteilchen sind.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Trägerteilchen Teilchen von Polysacchariden oder Teilchen von modifizierten Polysacchariden sind.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Trägerteilchen poröse Mineralteilchen sind, die von Polysacchariden oder modifizierten Polysacchariden umhüllt sind.

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17. Verwendung eines Materials nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung von Cholera-Antitoxin-Antikörpern durch injizieren des Materials einem Tier und isolieren der gebildeten Antikörper nach an sich bekannten Verfahren.

18. Verwendung eines Materials nach einem der Ansprüche 1 bis als Arzneimittel.

19. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß menschlichen Überträgern von Vibrionen, die im Verdacht stehen, die Cholera zu haben oder gehabt zu haben, das teilchenförmige Material nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oral verabreicht wird.

20. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet , daß man den menschlichen Patienten auf parenteralem Wege, insbesondere subkutan ein teilchenförmiges Material verabreicht, wie es in den Ansprüchen 1 bis 3 definiert ist, wobei das teilchenförmige Material mit Hilfe von Trägerteilchen gewonnen worden ist, das aus bakteriellen Keimen besteht, wie inaktivierten Cholera-Vibrionen, oder aus Polysacchariden oder löslichen modifizierten Polysacchariden zusammengesetzt ist.

21. Arzneimittel, insbesondere Vaccine, dadurch gekennzeichnet , daß sie als wirksamen Bestandteil ein teilchenförmiges Material gemäß der Defination der Ansprüche 1 bis 3 enthält.

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