DE2010788A1 - Wasserunlösliche Substanzen mit Antigenwirkung und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

DR.ING.F.WrrXSTJlOFF 5 MUNCDIN 9O DIPIa. ING. β. PUX4 acHWXiOZKSTHAsaX · DR.J.T.PKCHMANN nwm M««ll

DR. ING. D. BXHRXNS PJLTXIfTANWlLTX

1A-37 513

Beschreib uns zu der Patentanmeldung

MIIES lABORATOHIES, INC. Elkhart, Indiana 465H, U.S.A. betreffend:

"Wasserunlösliche Substanzen mit Antigenwirkung und Verfahren

zu ihrer Herstellung;"

Die Erfindung bezieht sich auf neuartige wasserunlösliche Substanzen mit Antigenwirkung (im folgenden auch "antigene Substanzen oder antigene Stoffe" genannt) und auf ein Verfahren zu ihrer Herstellung, ferner betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Substanzen als Wirkstoffe in Depot-Mitteln mit antigener Wirkung.

Es ist seit langem bekannt, daß bei verschiedenen Individuen beim Einnehmen und insbesondere beim Einatmen von gewissen natürlich vorkommenden und synthetisch hergestellten Teilchen oder Stoffen und. bei Insektenstichen eine bestimmte Reaktion auftritt, die. charakterisiert ist durch verschiedene allergische Symptome, wie Niesen, Aktivierung der Schleimdrüsen, lokales ödem, Hautschwellungen, Schock und Erweiterung der Blutgefäße. Die diese Reaktion hervorrufenden Teilchen-oder Stoffe enthalten alle ein wirksames Prinzip oder Stoffe mit Allergenwirkung und einen inaktiven Rückstand. Die Reaktionen selbst können harmlos oder ernsthafter sein, können jedoch auch zu physiologischen und psychologischen Komplikationen führen.

Eine Hyposensxbxlisierung von allergische Symptome aufweisen-•den Individuen ist, wie beobachtet wurde, wirksam zur Vorbeugung

0098 39/2119 - 2 -

oder mindestens wesentlichen Verringerung der unangenehmen Wirkungen, denen diese Individuen ausgesetzt sind. In der HyposensiMlisierungstherapie werden dem Patienten Injektionen von zunehmender Stärke eines Antigens bzw. einer Kombination von Antigenen gegeben, bis eine Dauerdosis erreicht ist. Das verabreichte Antigen bzw. die betreffende Kombination wird gewöhnlich im Hinblick auf eine vermutete oder nachgewiesene Verwandtschaft zu beobachteten allergischen Symptomen oder Reaktionen ausgewählt. Die Dauerdosis wird entweder aufrechterhalten oder je nach der Jahreszeit oder den betreffenden allergischen Erscheinungen eingestellt.

Es wurden bereits Allergenextrakte in verschiedenen Formen hergestellt und für die erwähnte Hyposensibilisierungsbehandlung ausgewertet. Als Beispiele seien wäßrige Antigenextrakte, Antigenemulsionen in Ol (haltbare Zubereitungen), Antigen-Gelatine-Kombinationen u.dgl. genannt.

Leider wird das Antigen aufgrund seiner hohen Wasserlöslichkeit in einigen der erwähnten Zubereitungen rasch vom Körpersystem absorbiert, was dann sum Auftreten einer systemischen oder konstitutionellen allergischen Reaktion führt. Da man mit einer derartigen Reaktion rechnen muß, werden die Mittel schwach dosiert und es sind daher häufige Injektionen nötig. Auch Mineralölemulsionen wurden verwendet, um die Abgabe bzw. Absorption des Antigens zu verzögern; dies hat jedoch häufig zu unerwünschten Abszessen an der Injektionsstelle oder zu anderen Nebenreaktionen an oder in der Nähe der Injektionsstelle geführt.

Außerdem erwies es sich oft als wünschenswert, beispielsweise aus bakteriellen Toxinen oder ÜJoxoiden und Viren prophylaktische Vakzine herzustellen, die dann bei Injektion eine verzögerte Adsorption erfuhren, was sich in einer verlängerten Antikörperbildung auswirkte. Derartige prophylaktische Vakzine waren jedoch, nacii den bisherigen Methoden schwierig herzustel-

^len* 009839/2119 - 3 -

Viele der diesen bekannten Formen von Antigenextrakten anhaftenden Nachteile wurden überwunden bei Verwendung von

.Antigenextrakten, die nach dem in der USA-Patentschrift '3 .148 121 beschriebenen Verfahren hergestellt waren. Nach

. diesem bekannten Verfahren behandelt man das ganze nicht entfettete allergenische Material mit einer Extraktionsflüssigkeit in i'orm eines wäßrigen heterocyclischen tertiären Amins, trennt die flüssige Phase, die den Wirkstoff enthält, vom Rückstand ab, den man verwirft, und gewinnt aus dem heterocyclischen tertiären Amin die Wirkstoffe durch Zugabe von Wasser und einer Alaunlösung zu dem flüssigen Extrakt, wodurch die Wirkstoffe unlöslich werden. Der ausgefällte Komplex wird dann mehrmals mit Wasser, gewaschen, um das gesamte heterocyclische tertiäre Amin zu entfernen und wird dann schließlich in einem physiologisch zulässigen Vehikel, z.B. einer Salzlösung, resuspendiert. Derartige antigene Extrakte werden kurz als PEAP, d.h. ein durch Pyridin extrahiertes und durch Alaun präzipitiertes Antigen-bezeichnet, da Pyridin das meist angewandte heterocyclische tertiäre Amin darstellt.

Obgleich die mit Hilfe dieses Verfahrens hergestellten Antigen- - extrakte eine wesentliche Verbesserung gegenüber den bisher bekannten Extrakten mit allergenisehen Wirkungen darstellten, hatte das Verfahren doch den Nachteil, daß man schlechte Ausbeuten, z.B. etwa 50 % der ursprünglich im wäßrigen Pyridinextrakt anwesenden Eiweißstickstoffeinheiten (= P.N.U. = Protein Nitrogen Units) erzielte*

Gegenüber diesem Stand der Technik ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen Substanzen mit Antigenwirkung bereitzustellen, bei welchem 'ein wesentlicher Anteil der in der Extraktionsflüssigkeit enthaltenen Wirkstoffe als wasserunlösliche Antigensubstanzen gewonnen werden.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, Depöt-Hittel mit Antigenwirkung bereitzustellen, in denen wasserunlösliche Antisen-

009839/2119 _ 4 -

COPY

stoffe enthalten sind, die ihre Wirkung langsam entfalten und leicht absorbiert werden, ohne daß die Gefahr von schädlichen Systemreaktionen oder anderen Nebenwirkungen besteht.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen Substanzen mit Antigenwirkung aus flüssigen Extrakten oder Suspensionen von Antigenmaterial, bakteriellen Toxinen und Viren ist dadurch, gekennzeichnet, daß man den flüssigen Extrakt bzw· die Suspension mit einem vorgebildeten oder einem in situ gebildeten Aluminiumtannat zusammenbringt, so daß sich aus dem Extrakt eine wasserunlösliche Antigensubstanz ausscheidet, die man anschließend gewinnt.

Die Erfindung umfaßt ferner Depot-Mittel mit Antigenwirkung, die aus einer Kombination von wie oben hergestellten wasserunlöslichen Antigensxxbstanzen und physiologisch zusätzlichen Vehikeln bestehen.

Bei der praktischen Durchführung des Verfahrens ist die Art und Weise, auf welche der flüssige Extrakt aus dem Antigenmaterial hergestellt wurde, nicht als ausschlaggebend anzusehen. Zur Abtrennung der Wirkstoffe bzw. der Stoffe mit antigenischer Wirksamkeit von den inaktiven Anteilen sind verschiedene Methoden bekannt. In dem Lehrbuch "Fundamentals of Modern Allergy", herausgegeben von Frigal, McGraw-Hill Co., Inc., 19^0 finden sich verschiedene repräsentative Verfahren und Flüssigkeiten zur Extraktion von Substanzen mit Allergenwirkung. Wäßrige Extraktionsflüssigkeiten sind u.a. die sog. Ooca¹ s-Lösung mit einem pH von etwa 8,"2 oder eine gepufferte Salzlösung mit einem pH von ungefähr 7,0, eine gepufferte iiatriumformaldehydsulfoxylatlösung mit einem pH von etwa 7 »4- oder eine konzentriertere Lösung von liatriumformaldehydsulfoxylat und gepuffertem Kochsalz. Andere * Extraktionsflüssigkeiten, wie die in der bereits erwähnten USA-Patentschrift ; 1^8 121, können ebenfalls zur Gewinnung des flücsi(jeri Extraktes, aus welchem die erfindungcgemäßen

009339/2119 " ^b ~

BAD ORIGINAL

wasserunlöslichen Antigensubstanzen zu gewinnen sind, verwendet werden. Auch Glycerin oder eine Glycerin-Kochsalzlösung wurden mit Erfolg zur Extraktion des Antigenmaterials verwendet. Auch auf dem Gebiet der Extraktion von Bakterien- und Virenkulturen zur Verwendung als immunogene Mittel wurden zahlreiche Extraktionsflüssigkeiten vorgeschlagen. So ist beispielsweise in der britischen Patentschrift 527 803 ein Verfahren zur Extraktion von Bakterienkulturen beschrieben, das darin besteht, daß man eine Flüssigkeit, wie Guanidin₇dazu verwendet, um die Wirkstoffe zu solubilisieren und von dem inaktiven Bakterienrückstand abzutrennen. Die hier genannten Verfahren und Hilfsmittel sind jedoch keineswegs vollständig und es muß. dem Fachmann überlassen bleiben, die in jedem IPaIl günstigsten Extraktionsmittel und Verfahren auszuwählen.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Substanzen mit Antigenwirkung lassen sich flüssige Extrakte von vielen Stoffen mit Antigenwirkung verwenden. Es handelt sich dabei um Substanzen mit Allergenwirkung, wie gewöhnlicher Staub, wie er in Wohnhäusern vorkommt und im Staubsauger aufgenommen wird und um Staub aus Handwerksbetrieben, wie z.B. Sägemehl; als weitere allergenisch aktive Substanzen seien genannt: Epithelteile, wie Schuppen aus dem Fell von Katzen, Hunden, Pferden und Kaninchen; Federn, z.B. solche von Gänsen und Hühnern; Samenkörnern, z.B. Baumwoll- und Kapoksamen; Insekten und Ausscheidungen von Insekten, wie Bienen, Hornissen und Mosquitos; Poll.en von Bäumen, Gräsern und Kräutern, wie z.B. Kuckucksblume, Wiesenlieschgras, Ahorn- und Pappelbäumen; Schimmelsubstanzen, wie Aspergillus niger und Alternaria. Beispiele für andere Antigenstoffe sind Bakterien, wie Pneumokokken, Haemophilus pertussis und andere gramm-negative haemophile Organismen, Bakterien der Goli-Typhus-Ruhr-Salmonolla-Gruppe und Kokken, wie Meningokokkus sowie andere Toxine, Toxoide und Viren«

Das aktive Prinzip bzw. die Stoffe mit allergenischer Wirkung werden zweckmäßigerweise aus den eine Allergie verursachenden

0Q9839/21 19 - 6 -

BAD

ία-37 513 20 Ί 07

Teilchen oder Stoffen auf uine zur Gewinnung von Antigenextrakten übliche Ι«\-;1ϋο extrahiert, Bei dieser Arbeitsweise werden die Substanzen r.ur.aiüiner mit: der rrtraktionsflüssigkeit stehengelassen. Eiu Leitdauer kann dabei von wenigen Stunden bic su m-yhruroii Tage:.!, schwanken» Bei der Extraktion von Aliergeiieii keimen die fjub^tiui^eii iait einem Lösungsmittel, wie iither, entfettet werden, ehe man sie extrahiert oder man kann auch auf völlig uiieiitfettete Allergene arbeiten. Um die Extraktion au verve 11 ständigen, werden die Aiitigenstoffe nach Abgießen der ersten Extraktionsflüssigkeit nocliaals mit frischer Sxtraktn.cnsflüßsigkeib in Kontakt gebracht. Nach dein Extrahinren kann cie Extiü.kOionsflüssigkeit, welche die wäruelabiien V.'irkstoffe enthält, steril über ein Filtariciooen oder durch eine I^iltermeiabran filuriert werden. Wie jedoch bereits bemerkt., ist: die Methode, auf welche der flüssige Extrakt von allergeiiiseh aktivem Material erhalten wird, fur das erfmdangsgemäße Verfahren nicht; ausschlaggebend,- es können die ta wahrten biochemischen Extraktionsinethoden angewanat -./erden., iim dieses physiologisch aktive Ausgangsmateriil für das. erfind.ungsgeiaärie Verfahren zu erhalten.

Ähnliche Präparate können. £.uch aus Lösuiigen von ba". teriallen Toxinen oder Tuxoiden, ζ.3>, von denjenigen, die aus den Diphtherie- oder l'euaixasoi'-ga'.iisiiien stamnen, gewonnen werden. Man kann derartige 'I'annat-Vakain.e auch LersüelJ <---n aus Suspensionen von Viren, s.B. des Influenza- Vi-.'Ui, mit dein Ziel der Gewinnung - ^n Influenza-Vakzin von Depot-Typ. Selbstverständlich kami die grunasä^zliche Arboi osv/eise für jeden Antigentyp angev/andt v/erden, für v/elchen ein Depot-Vakzin hergestellt werden soll.

Das zur BiIc;.ang der erfind'onc;-gemäßen wasserunlöslichen Sabstaiizen ^it imtigeii'/j rkung aas dem flüssigen Extrakt verv/encietc Aiujiij.riiiJi:;t;a/u..a:' kaum vorgefo:-:-rit seia, ehe ss dem Ä.ifcigcncxürakt zugeflig"? wird und liegt aa^:·. vorzugsv/eise als üel oder Suspension vor. Dieses vorgefor::it3 ji-iuminiumtannat

0 0 9 8 3 9/2119 - 7 _

BAD ORiGiNAL

wird dadurch hergestellt, daß man eine lösliche Quelle für Aluminium und Gerbsäure zusammenbringt. Ein Gel kann beispielsweise leicht dadurch hergestellt werden, daß man eine wäßrige Lösung von Natriumacetat und Kaliumaluminiumsulfat (hydratisiert) zusammenbringt mit einer Lösung von Natrium-■ ac ©tat "und Gerbsäure. Die Lösung kann · susätslich bis zu 50 % Glycerin enthalten. Die Anteils Verhältnisse dieser Lösungen sind zwar nicht kritisch, werden jedoch vorsugsxieise so gewählt, daß man ein Verhältnis von Gerbsäure au Aluminiumion von 1 : 3 erhält. Das Gel wird dann aus der Flüssigkeit abzentrifugiert oder anderweitig abgetrennt und mit einer Waschflüssigkeit, z.B. einer 0,9&igen Salzlösung, gewaschen. Nach d©m Waschen wird das Gel ans niedergeschlagenem Äluminiumtannat in 0,9%iger Kochsalzlösung suspendiert und man gibt dis Antigenextraktlösung su_s so daß sich die gewünschten wasserunlöslichen Antigensubstanzen bilden.

Das Aluminiumtannat kann ferner leicht dadurch erzeugt werden, daß man die entsprechenden Heagentien unmittelbar dem Extrakt zufügt. Um im Extrakt Aluminiumtannat zu bilden, werden eine geeignete Quelle für Aluminium und eine Gerbsäurelösung getrennt unmittelbar dem Extrakt zugefügt. Als Beispiele für geeignete Aluminiumquellen seien genannt: Natriumaluminat, Kaliumaluminiumsulfat, Aluminiumsulfat, Aluminiumlactat und Aluminiumchlorid. Der vereinigten Lösung aus Extrakt und löslichem Aluminiumsalz wird soviel Gerbsäurelösung zugegeben, daß sich ein Verhältnis zwischen der Konzentration der Gerbsäure und derjenigen des Aluminiumions von etwa 1 : 2> einstellt.

Zur Erzielung einer maximalen Ausbeute an wasserunlöslicher ' Anti£eiX£substanz und eines im v/es entliehen vollständigen Entzuges von Aritigeiinaterial aus dem Extrakt muß eine adequate Menge Aluminiumtannat oder Aluminiuntannat bildende Verbindungen zugesetzt werden, wobei dieser äucatz vorzugsweise im ÜberFchu.: ist. üo kann der völlige: Entzug von Antiken-Stoff en . ev.'irkt v;erden, wenn nan Gerichtsveriiäitnisüe von Aluniniun zu Iroteineiticketoff von et.v;a λ : 1 bis 1^ : 1 wählt.

00 9839/2119 - ö -

BAD ORIGINAL

Auch bei größeren Überschüssen erhält man einen vollständigen Entzug der Antigenstoffe und gegebenenfalls kann, je nach den besonderen Arbeitsbedingungen, der Überschuß auch geringer gehalten werden.

Der Protein- oder Eiweißstickstoff in den Extrakten wird im allgemeinen in Proteinstickstoffeinheiten (P.N.U.) ausgedrückt, wobei eine Einheit 0,00001 mg Stickstoff je ml des Extraktes entspricht. Die Proteinstickstoffeinheit (P.N.U.) wird gewöhnlich verwendet, um den Wirkstoffgehalt von Allergenextrakten auszudrücken und kann daher im vorliegenden Fall daau dienen, die Stärke der erfindungsgemäß gebildeten wasserunlöslichen Antigensubstanzen zu bezeichnen.

Nachdem die wasserunlöslichen Antigensubstanzen abgetrennt und gewaschen sind, werden sie zweckraäßigerweise in einem physiologisch zulässigen Vehikel, das für Injektionsflüssigkeiten brauchbar ist, suspendiert. Ein derartiges Vehikel kann z.B. eine sterile isotonische Kochsalzlösung sein. Das Vehikel sollte soweit wie möglich frei von schädlichen Nebenwirkungen, wie sekundären allergenischen Reaktionen sein und darf die Struktur der erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Antigensubstanzen nicht stören.

Ein richtig zusammengesetztes Arzneimittel, das eine oder mehrere erfindungsgemäße Antigensubstanzen in einem, entsprechenden Vehikel enthält, wird zweckmäßigerweise dem Patienten durch Injektion in einer Stärke verabreicht, die von der gewünschten prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung abhängt. Sind die Antigensubstanzen Allergene zur llyposensibilisierungstherapie, so sind die Anfangsstärken im allgemeinen geringer als die endgültige Dosis, welche den geviünschten Schutz ausüben soll. Bei einem erwachsenen Patienten ist eine endgültige Dosis zwischen etv/a 3 000 und 5 OCJO P.Ii.U. bevorzugt. Selbstverständlich hängt die für die beabsichtigte Wirkung notwendige Dosierung von Größe und Alter des Patienten und seinen beobachteten Reaktionen auf die

009839/2119 - 9 -

Injektionen ab. Ba allgemeinen werden diese Arzneimittel subkutan verabreicht.

Die Beispiele dienen der näheren Erläuterung der Erfindung. Beispiel ^

5,0 g eines Gemisches von Pollen der hohen und niedrigen Kuckucksblume ("Ragweed", Gattung Ambrosia) wurden, nachdem sie mit wasserfreiem Äther entfettet und getrocknet worden waren, in ein Glasgefäß eingebracht und mit 70 ml einer wäßrigen gepufferten Extraktionslösung über schicht et, die 0,8 % Natriumchlorid, 0,5 % Phenol und Natrium- und Kaliumphosphatpuffer zur Einstellung des pH-Wertes auf 7,0 enthielt. Nachdem das Gemisch 5 Tage bei Raumtemperatur (etwa 2J⁰C) gestanden hatte, wurde die Flüssigkeit abgezogen und der Rest mit 50 ml frisch gepufferter Extraktionslösung überschichtet, wonach das ganze nochmals 2 Tage bei Raumtemperatur stehen gelassen wurde. Auch die zweite Extraktionslösung wurde abgegossen und der Rückstand verworfen. Die vereinigten Lösungen wurden zwecks Sterilisation über einer Membran gefiltert. Man erhielt 85 ml, die je ml 50 000 P.N.U. enthielten.

Dem sterilisierten Extrakt wurden nun zunächst I70 ml 1%ige Natriumaluminatlösung und dann eine 1Q%ige Gerbsäurelösung zugegeben, bis zu beobachten war, daß keine Antigensubstanz mehr unlöslich wurde. Die wasserunlösliche Antigensubstanz wurde dann durch Dekantieren abgetrennt und 5^aI mit physiolo gischer Kochsalzlösung gewaschen. Der P.N.U.-Wert der wasserunlöslichen Antigensubstanz zeigte, daß das in den vereinigten sterilisierten Extrakten enthaltene Antigen zu 10p % zurückgewonnen worden war.

Die wasserunlösliche Antigensubstanz wurde in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und das Volumen der Suspension dem ursprünglichen Volumen des gepufferten Extraktes angeglichen.

■ - 10 00 9 839/2119

BAD ORIGINAL

Beispiel 2

Man arbeitet nach Beispiel 1, jedoch _mi-fc folgenden Änderungen: Anstatt der dort benutzten Pollen wurde jetzt gesammelter Staub aus dem Haushalt verwendet, der unmittelbar ohne Entfetten in die Extraktionslösung eingebracht wurde. Die resultierende wasserunlösliche Antigensubstanz hatte einen P.N.U.Wert von 40 000, was zeigte, daß das Antigen zu 100 50 zurückgewonnen war. Die gewonnene wasserunlösliche Antigensubstanz wurde dann wie in Beispiel 1 weiterbehandelt.

Beispiel 3

Man arbeitete wiederum nach Beispiel 1, wobei jedoch die dort verwendeten Pollen durch ein Gemisch aus Graspollen ersetzt worden waren. Die prozentuale Wiedergewinnung und die Erscheinungsform der wasserunlöslichen Antigensubstanz entsprachen dem Beispiel 1.

Bei spiel 4

5 g der in Beispiel 1 verwendeten Pollen wurden in ein Gefäß eingebracht und mit soviel Extraktionslösung versetzt, daß die Pollen gerade bedeckt waren. Die Extraktionslösung war eine ßO/oige wäßrige Pyridinlösung, der ein Phosphatpuffer zugesetzt worden war, um den pH-Wert auf 7*0 zu bringen. Das Gemisch wurde 2 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wurden die nicht-gelösten Pollen abfiltriert und der Extrakt zunächst durch normales Filterpapier und dann über eine Membran zwecks Sterilisation gefiltert. 100 ml des v.'äßricen Pyridine:·:traktes wurden vereinigt mit ioO nl i'/ui^or liatriumaluminatlösung und daraufhin wurde eine ΛΟ'-,Λν-β Gerbsäui^elösung zugeführt, bis keine Au c ε ehe idling mehr zu beot richten i.-ar. Die wasserunlösliche Ariti^ensubrroanZ v/urde abfiltriert und ϊ?η;λ1 :sit pnv.^iolo^ic-cico? IxOCh;;air:lösung ^ev:.?.-;c'^:·.'?::. Luvr P.i,.U.-.-.'erc dieser v:asserunlö;;j..icnen ^iii-i^ensubKuaiii: zei_L;;:o eine 'iuü^-i^e küch^ev/innunr: de3 Antigen.", berechnet auf den

009839/2119 - ^1] -

P.N.U.-Wert des sterilisierten Extraktes, an. Die wasserunlösliche Antigensubstanz wurde in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, wobei das Volumen der Suspension so eingestellt wurde, daß es dem ursprünglichen Volumen der sterilisierten Exträktlösung entsprach. .

B e i s ρ i e 1 .5

7,5 g Pollen des Wiesenlieschgrases wurden in einem Gefäß mit 100 ml "Tris-HaCr'-Extraktionslösung (5 g NaCl, 1 g Natriumazid, 5 mMol Tris-(hydroxymethyl)aminomethan, 1,22 mI1ol HOl; Wasser auf 1 1) überschichtet. Das ganze wurde 5 Tage bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Umrühren stehengelassen. Die Extraktionslösung wurde dann von den restlichen Pollen abfiltriert und gegen wäßriges Glycerin in 3 Stufen bis zu einer Glycerin-Endkonzentration von 50 % dialysiert. Die Glycerinlösung enthielt zum Schluß 423/Ug Proteinstickstoff Oe ml.

10 ml der Glycerinlösung wurden vermischt mit 250 mg Aluminiumtannat-Gel mit einem Gehalt von 11,4 mg Aluminium. Das Aluminiumtannat-Gel war wie folgt hergestellt worden: Man mischt 10 Volumen einer 50/oigen Glycerinlösung in Wasser, 4 Volumen einer Lösung yon 2 % Natriumacetat und 5 % Kaliumaluminiumsulfat (hydratisiert) und 2 Volumen einer Lösung von 2 ^c/o Natriumacetat und 5 % Gerbsäure. Das Aluminiumtannat-Gel wird zentrifugiert und 3mal mit einer 0,9/oigen Natriumchloricllösung gewaschen, worauf das Endprodukt in 0,9>"iger Natriumchloridlösunk suspendiert wird. Das Gemisch aus Extrakt und Aluminiumtannat-Gel wurde 1 Tag bei Raumtemperatur stehengelassen und dann zentrifugiert, um die wasserunlösliche Antigensubstanz von der flüssigen Phase abzutrennen. Die Antigensubstans wurde 4mal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und dann in einer solchen Lösung resuspendiert. V/ic gefunden wurde, enthielt die wasserunlösliche Antigensubstanz 1OO /3 des ursprünglich in dem Glycerinextrakt an-

- 12 -

009839/2119 "

BAD ORIGINAL

1A-57 513 20107

- 12 wesenden Proteinstickstoffs.

Beispiel 6

10 ml der gemäß Beispiel 5 bereiteten Glycerinlösung von Wiesenlieschgraspollen wurden vermischt mit 4- ml einer wäßrigen 5%igen Kaliumaluminiumsulfatlösung, die 2 % Natriumacetat enthielt, und 2 ml einer wäßrigen Lösung aus 5 % Gerbsäure und 5 % Natriumacetat. Das Gemisch blieb 1 Tag lang stehen, worauf die gebildete wasserunlösliche Antigensubstanz abgetrennt und wie oben gewaschen wurde. Die Bestimmung des Proteinstickstoffs ergab, daß der ursprünglich in dem Glycerinextrakt verfügbare Stickstoff praktisch zu 100 % erhalten worden war.

Beispiel 7

Die in Beispiel 1 erhaltene wasserunlösliche Antigensubstanz wurde an Meerschweinchen erprobt; die Versuchstiere waren 55 normale weibliche, jungfräuliche Albino-Meerschweinchen aus gemischten Stämmen, die je 250 bis 275 g wogen. Die Auswertungsmethode entsprach der Arbeit von Gordon und Mansmann in J.Allergy 36, S. 239 bis 248 (1965). Jedem Versuchstier wurde eine kleine Dosis (100/Ug Proteinstickstoff) antigenes Material in den Nacken injiziert. 20 Meercchweinchen erhielten die wasserunlösliche Antigensubstanz in physiologischer Kochsalzlösung, 25 Tieren wurde PEAP-Ragweed-Extrakt injiziert. Jedes Versuchstier wurde nur einmal verwendet. 9 Tage nach Injektion wurde die eine Hälfte der Tiere, 15 Tage nach Injektion die andere Hälfte getestet. Jedes der Tiere wurde intradernal getestet mit sowohl 10 wie 100 /ug Proteinstickstoff eines wäßrigen Ragweed-Extraktes, der im wesentlichen wie in Teil 1 des Beispiels 1 beschrieben, hergestellt worden war. Jede Stelle des Ilauttests vmrde beobachtet und die Querschnitte der Gebildeten Pu." bein in mn nach 4, 24 und 48 Stunden inch dem Hauttest gemessen. L·;: v.'urden Untersuchungen ar. lebende:; i'ier (biopsien) vorgenommen zur physiologischen Aus-

009339/2119 -13-

BAD

1A-37 513 - 13 -

wertung. 10 nicht immunisierte Vergleichstiere wurden auf gleiche Art getestet.

4 Stunden nach dem Hauttest wurde beobachtet, daß die !Tiere, welche die wasserunlösliche Antigensubstanz erhalten hatten, mit Pusteln von durchschnittlich 11,4 mm Querschnitt reagierten und daß die Tiere, die PEAP erhalten hatten, Pusteln mit durchschnittlich 11,5'mm aufwiesen, wobei beide Reaktionen für eine Verabreichung von 100/Ug gelten. Beim Hauttest mit 10/Ug hatten die Tiere, denen die wasserunlösliche antigene Substanz verabreicht worden war, Pusteln von durchschnittlich 9,4 mm, die Tiere, die PEAP erhalten hatten, Pusteln von * durchschnittlich 8,8 mm Querschnitt, was für die kombinierten Resultate von 8 und 15 Tagen gilt. 15 Tage nach Injektion hatten jedoch die Tiere, die 10 /ug wasserunlösliche Antigensubstanz erhalten hatten, Pusteln von durchschnittlich 11,7 Querschnitt, während die Tiere, die PEAP erhalten hatten, Pusteln von durchschnittlich 7>82 mm Querschnitt aufwiesen.

PATENTANSPRÜCHE :

009839/2119

BAD ORiGiMAL

- 14 -

Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE

   1) Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen Substanzen mit Antigenwirkung, dadurch gekennzeichnet , daß man aus einem Antigenextrakt und entweder vorgebildetem Aluminiumtannat oder in situ gebildetem Aluminiumtannat eine wasserunlösliche Substanz mit Antigenwirkung erzeugt, die man aus dem Gemisch isoliert.

   2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Aluminiumtannat verwendet, das durch Zusammenbringen einer löslichen (Quelle für Aluminium mit Gerbsäure vorgebildet wurde.

   5) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man ein vorgebildetes Aluminium tannat verwendet, bei dessen Erzeugung die Quelle für Aluminium, Natriumaluminat, Kaliuiaaluminiumsulfat, Aluminiumsulfat, Aluminiumlactat oder Aluminiumchlorid war.

   ^Lv) Verfahren nach. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man zwecks Bildung des Aluminiuiatannates in situ getrennt eine lösliche Quelle für Aluminium und Gerbsäure mit dem flüssigen Extrakt kombiniert.

   5) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß die lösliche quelle für Aluminium liatriumaluminat, Kaliuinaluniiniunisulf at, Aluniniunisulf ab, Aluminiumlactat oder Aluminiumchlorid int.

   6) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß nan einen flüssigen .--ntirenexOrakt verv/endet, bei den das üxtraktiorisnitfcel eine v.'ä^ri^e Pyriöinlöi-unr ist.

   00 9839/2 119 ~

   hergestellten wasserunlöslichen Antigensubstanzen als Wirkstoffe, zusammen mit einem physiologisch zulässigen Vehikel, in Depot-Mitteln mit Antigenwirkung.

   009839/2 119