DE2725204A1

DE2725204A1 - Immunitaets-stimulierendes medikament und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2725204A1
Application number: DE19772725204
Authority: DE
Inventors: Gerard Ayme
Original assignee: Institut Merieux SA
Current assignee: Institut Merieux SA
Priority date: 1976-06-04
Filing date: 1977-06-03
Publication date: 1977-12-22
Also published as: BE855357A; NL7706174A; FR2374042B1; DE2725204C2; CA1091582A; US4337243A; US4182751A; FR2374042A1; GB1583889A

Description

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INSTITUT MERIEUX, 17, rue Bourgelat, F-69002 Lyon (Frankreich) Immunitäts-stimulierendes Medikament und Verfahren zu seiner

Herstellung

7098&1/0K80

Die Erfindung betrifft ein neues Medikament, das durch seine Eigenschaft, die nicht spezifische Immunität zu stimulieren, bemerkenswert ist.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des Medikaments.

Die Erfindung schlägt die Bereitstellung eines neuen Produkts vor, das ein Medikament darstellt, das die nicht-spezifische Immunität stimuliert und einen gereinigten Extrakt bakteriellen Ursprungs mit Proteinnatur darstellt, der physikalisch-chemisch definiert ist.

Es ist bereits insbesondere aus der US-PS 3 483 290 bekannt, daß es möglich ist, immunitäts-stimulierende Präparate durch Extraktion von bakteriellem Material, insbesondere Protoplasma-Material, nämlich hauptsächlich aus Escherichia coil mittels Phenol herzustellen, wobei dieser Extrakt vom Phenol durch alkoholische Fällung befreit wird. Allerdings erlaubt das vorbeschriebene Verfahren nicht, in ausreichender Weise Endotoxine mit Lipopolysaccharidcharakter zu eliminieren, welche fiebererzeugende Wirkungen und toxische Eigenschaften einschleppen und somit verhindern, daß man ein wirkliches Arzneimittel erhält. Zwar wird nach dem Verfahren der genannten US-PS versucht, die Vergiftung des Präparats durch Endotoxin zu begrenzen indem es nach dem Zerkleinern der Zellen hauptsächlich vom Protoplasma ausgeht. Dies reicht aber nicht aus, um eine ausreichende Eliminierung sicherzustellen, da die Kontamination selbst dann weiter besteht, wenn der Gehalt an Endotoxin relativ schwach ist.

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Weiterhin führt das genannte Verfahren zu einem Extrakt, der in Wasser unlöslich ist, was es unmöglich macht, eine ausreichende letztliche Reinigung zu erzielen und die Herstellung von wirklich kontrollierbaren Arzneimitteln nicht zuläßt.

Die Erfindung schlägt ein Arzneimittel bzw. Medikament und ein Verfahren zu dessen Herstellung vor, die geeignet sind, diese Nachteile zu überwinden, wobei ein neues praktisch anwendbares Medikament zur Verfügung gestellt wird, das kontrollierbar ist.

Das Medikament ist sowohl als Arzneimittel für Menschen wie auch als veterinärmedizinisches Mittel verwendbar und kann in einem sehr weiten Anwendungsbereich gegen infizierende Mittel eingesetzt werden, wobei es in jedem Fall das Niveau der Immun-Abwehrkräfte anhebt, z.B. gegen Beeinträchtigungen durch tumorbildende Faktoren. Es kann in gleicher Weise mit anderen Mitteln zur Bekämpfung von aggresiven Krankheitserscheinungen eingesetzt werden, z.B. zur Erhöhung der Vaccinaktivität, zur Verstärkung der Aktivität von Antibiotika , indem es die notwendige Anwendungsdosierung vermindert oder als synergistisches Mittel in Verbindung mit bestimmten Mitteln mit Antitumorwirkung.

Das Medikament besitzt eine Toxizität, die ausreichend schwach ist, daß sie bei wirksamen Dosen negiert werden kann, und wiederholte Behandlungen erlaubt.

Weiterhin bietet das erfindungsgemäße Medikament eine große Stabilität, was die Konservierung und den Gebrauch erleichtert. Es kann beispielsweise durch Filtrieren und/ oder durch Erwärmen sterilisiert werden.

Schließlich schlägt die Erfindung ein Verfahren vor, durch welches das Medikament hergestellt werden kann, wobei das Verfahren den Vorteil aufweist, daß es einfach,

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preiswert und leicht durchzuführen ist und in sehr einfacher Weise zahlreichen Varianten unterworfen werden kann, auf welche Weise es eine große Anpassungsfähigkeit an die Herstellungsweise ermöglicht.

Die Erfindung hat ein neues, die nicht-spezifische Immunität stimulierendes Medikament zum Gegenstand, das einen in Phenol löslichen Extrakt von Mikroorganismen enthält und dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen phenollöslichen Extrakt oder eine Fraktion eines solchen Extrakts von einem oder mehreren einzelligen Mikroorganismen enthält, nämlich von Bakterien, Hefepilzen oder Protozoen, wobei dieser Extrakt oder diese Extraktfraktion wasserlöslich gemacht ist und von Endotoxinen befreit ist und weitgehend von Phenol befreit ist und in einer Dosis, die den EmpfängerOrganismus stimuliert, vorliegt.

Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung enthält das Medikament einen Extrakt oder eine Extraktfraktion von phenollöslichen Bakterien oder Mykobakterien.

Unter den Bakterien sind die folgenden bevorzugt: Neisseria meningitidis, Proteus nirabilis, Bordetella pertussis, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter antiratus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bruceila abortus, Corynebacterium pseudodiphteria, Corynebacterium parvum, Staphylococcus aureus.

Besonders bevorzugt sind bei dem Medikament Extrakte von Neisseria meningitidis Serumgruppe A, Neisseria meningitidis Serumgruppe C, Proteus mirabilis oder Klebsiella pneumoniae.

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Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung enthält das Medikament einen Extrakt oder eine Extraktfraktion von Mycobakterien, vorzugsweise von Mycobacterium phlei, Mycobacterium Kansasii, M.scrofulaceum, M.intracellulare, M.fortuitum.

In dem Fall, wenn das Medikament einen phenollöslichen Extrakt von Hefepilzen enthält, wird bevorzugt ein Extrakt von Saccharomycds Cerevesiae verwendet.

Das erfindungsgemäße Medikament kann mit anderen Produkten oder pharmakologisehen Zubereitungen verbunden sein, wie mit Corynebacterium parvum, Antibiotika, Antimitosepräparaten, Corticoidpräparaten, Vitaminen und weiterhin mit verschiedenen Vaccinen, z.B. solchen gegen Grippe, Keuchhusten,Poliomyeletis, Masern, Röteln, Tetanus-Anatoxinen und Diphterie-Anatoxinen sowie Polysacchariden aus Meningococcen entweder allein oder im Gemisch.

Das erfindungsgemäße Medikament kann in verschiedener Form zubereitet werden, z.B. in injizierbaren Formen, wie beispielsweise unter Bildung einer Lösung oder Suspension in physiologischer Nährlösung oder mit einem ölexcipienten oder außerdem in einer Emulsion von Öl in Wasser oder Wasser in Öl entwe/in gefriergetrockneten Formen oder in der Form von Aerosolen oder in trinkbarer Form oder in rektal anwendbarer Form. Vorzugsweise enthält das Medikament ein Adjuvans, an welches es vorzugsweise adsorbiert ist, z.B. Aluminiumhydroxid.

Das Medikament kann aber auch in Form einer Salbe mit Hilfe eines gewöhnlich anwendbaren Exzipienten verarbeitet sein.

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Die zu verabreichende Dosis hängt von dem Krankheitszustand ab, der behandelt werden soll, sowie von der Art der Behandlung und dem Organismus, welcher die Behandlung empfängt. Diese Dosierung kann ohne Schwierigkeiten nach den in der Medizin oder in der Veterinärmedizin an sich bekannten Methoden für die Behandlung einer Immunitäts-Stimulierung bestimmt werden.

Beispielsweise kann eine Dosis 10 bis 1.000 mg, auf das Extrakt-Trockengewicht bezogen, enthalten und für die Behandlung von Menschen ist eine zweckmäßige Dosis in der Größenordnung von 400 /Ug.

Die Verabreichung des Medikaments kann auf äußerlichem Wege erfolgen, z.B. in Form einer Salbe oder eines Pulvers, sie kann auch subkutan, intradermal, parenteral, intraperitoneal oder intramuskulär oder auch durch Inhalation in Form eines Aerosols oder auf oralem oder rektalem Wege erfolgen.

Das erfindungsgemäße Medikament ist insbesondere der Behandlung durch Stimulierung der nicht spezifischen Immunität bei Verbrennungen, bei Traumata oder bei Organismen ohne immunologische Abwehr angepaßt. Es kann weiterhin als vorbeugendes oder heilendes Mittel im Infektionsbereich angewendet werden, z.B. bei banalen Infektionen oder zur Verhinderung von Folgekomplikationen bei viralen oder tumoralen Krankheitsbildern.

Das erfindungsgemäße Medikament hat nur eine sehr schwache Toxizität je nach dem verwendeten Mikroorganismus, wie sich durch Gewichtsgewinn bei Nagetieren, bei der Untersuchung der Sensibilisierungskraft bei Kaninchen und bei Meerschweinchen und bei den Versuchen über die

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chronische Toxizität bei Ferkeln, Kälbern und erwachsenen Rindern zeigt.

Das erfindungsgemäße Medikament wirkt nämlich durch Stimulierung des nicht-spezifischen Immunitätssystems. Es bietet eine antibakterielle Aktivität sowie eine antivirale Wirkung, die bemerkenswert sind. Weiterhin zeigt es einen hervorragenden Schutz gegen bakterielle Superinfektionen nach viralen Affektionen. Es besitzt eine Einführungskraft für das Interferon. Weiterhin provoziert es einen wesentlichen Anstieg des Titers von zirkulierenden heterologen Antikörpern.

Das Medikament bietet weiterhin eine wesentliche Zellaktivität. Die Phagozytose wird stark stimuliert und es wird festgestellt, daß die Abstoßungsreaktion gegen Fremdgewebe unterdrückt wird sowie ein mitogener Effekt, nämlich bei menschlichen Lymphozyten, auftritt.

Die Erfindung hat außerdem zum Gegenstand ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Medikaments, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus, wie ein Bakterium, einen Hefepilz oder ein Protozoon mit Hilfe von flüssigem Phenol bei Extrakt!onstemperatüren unter 7O°C extrahiert und nach dem Sammeln der Phenolphase das Phenol eliminiert und den Extrakt wasserlöslich macht.

Von den verwendbaren Phenolen ist Phenol selbst oder gegebenenfalls die Kresole, insbesondere m-Kresol oder 3-Methyl-4-chlorkresol bevorzugt.

Die Temperatur bei der Extraktion liegt vorzugsweise unter 7O°C und über O⁰C. Mit Vorteil kann man bei einei Termperatur zwischen 60 und 67⁰C arbeiten.

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Die Extraktionsdauer beträgt einige Minuten bis einige Stunden. Vorzugsweise beträgt sie zwischen 30 Minuten und 3 Stunden.

Die Phenolmenge, die gegenüber der Wassermenge der anfangs eingesetzten Suspension verwendet wird, kann beliebig sein und liegt z.B. zwischen 15 bis 85 %. Man zieht es vor, eine Phenolmenge zu verwenden, die eine besonders zufriedenstellende Emulsion ergibt. Im Fall der Verwendung von Phenol selbst (CgH₅OH) beträgt diese Menge vorzugsweise 45 % Phenol.

Falls Gram-negative Bakterien verwendet werden, kann man die Extraktion direkt an einer Bakteriensuspension durchführen. Wenn Gram-positive Bakterien oder Mykrobakterien verwendet werden, kann die Extraktion nach dem Zerkleinern oder nach einer bakteriellen Lyse vor der Extraktion durchgeführt werden. Vorzugsweise wird die Extraktion in Gegenwart eines anionischen Detergens, wie z.B. Natrium-dodecylsulfat durchgeführt. Die Gegenwart eines Detergens erleichtert das Arbeiten und läßt ebenso bestimmte sensibilisierende Aktivstoffe, insbesondere die Endotoxine, verschwinden.

Der pH-Wert ist praktisch unabhängig, jedoch kann aus Einfachheitsgründen das Phenol bei einer Suspension mit praktisch neutralem pH-Wert angewendet werden.

Die Trennung zwischen der phenolischen Phase und der , wäßrigen Phase kann in klassischer Weise durchgeführt werden, z.B. durch Zentrifugieren sowie durch direkte Abtrennung nach dem Dekantieren, z.B. mit Hilfe einer Pipette.

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2 ⁷ 7 5 2 O A

Die Abtrennung der wäßrigen Phase von der phenolischen Phase kann vorzugsweise am leichtesten und am vollständigesten durch Zugabe von Salzen erfolgen, wie z.B. NaCIp oder NaCl bei erhöhter Konzentration. Das Salz kann entweder in kristallisierter Form oder in Form einer konzentrierten Lösung zugefügt werden und die Zugabe kann sowohl erstmalig bei der Extraktion, als auch nach der Aufspaltung der Emulsion aus Phenol/Wasser in eine phenolische, bereits dekantierte Phase eingeschaltet werden, un es vom gesättigten Wasser zu befreien. Die erhaltene phenolische Phase, die durchsichtig und gefärbt ist, kann mit Wasser mehrmals gewaschen werden.

Diese Verfahrensschritte erlauben praktisch die Gesamtmenge der Endotoxine zu eliminieren, sogar im Fall der Gram-negativen Bakterien, wie E.coil, die stark kontaminiert sind.

Es ist bemerkenswert, daß das Verfahren besonders wirksam durch eine Extraktion mit extrem weiten Grenzen hinsichtlich der Temperatur, der Konzentration zwischen der phenolischen Phase und der wäßrigen Phase, des pH-Wertes und der Ionenstärke durchgeführt werden kann.

Die positiven Ergebnisse, die bei den Extrakten sehr zahlreicher Mikroorganismen, die im Umfang der vorliegenden Erfindung geprüft wurden, beobachtet wurden, erlauben außerdem die Feststellung, daß die Extrakte die Herstellung von Medikamenten gestatten, gleich welchen Ursprungs die verwendeten Bakterien, Mycobakterien oder Hefepilze sind.

Nach der Extraktion wird ein Verfahrensschritt der Entfernung des Phenols eingeschaltet, um das aktive Material mit Protein-Natur zu isolieren, das in der phenolischen Phase gelöst ist. Aus Gründen der großen physikochemischen Stabilität dieses Extrakts kann die Eliminierung des Phenols durch zahlreiche verschiedene Verfahrensschritte erreicht werden.

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Gemäß einer ersten Durchführungsform des Verfahrens kann man eine alkoholische Ausfällung bewirken und den Niederschlag isolieren.

Gemäß einer zweiten Durchführungsform des Verfahrens wird die phenolische Phase mit einem Fällungsmittel behandelt, das z.B. Polyäthylenglykol in phenolischer Lösung darstellt. Eine erste Reinigungsstufe wird mit der Konzentration von Polyäthylenglykol erreicht, die das Fraktionieren der vorhandenen Moleküle in verschiedenen Gruppen gestattet.

Gemäß einer dritten Durchführungsform des Verfahrens kann die ElimiAierung des Phenols durch Destillation unter vermindertem Druck erfolgen.

Das nach den verschiedenen genannten Verfahren erhaltene Produkt ist praktisch frei von Phenol und in Wasser unlöslich. Nach eventuellen Waschen und/oder Dialysen zur Entfernung der letzten Phenolspuren kann es in Suspension in Wasser oder einer Pufferlösung oder einem physiologischen Serum gebracht und homogenisiert werden.

Das Produkt hält eine Behandlung bei erhöhter Temperatur im Autoklaven von z.B. 115⁰C während 30 Minuten aus und kann auch in wäßrige Suspension gebracht und durch Gefriertrocknung entwässert werden.

Es kann auch einer bestimmten Behandlung unterworfen werden, um es wasserlöslich zu machen und es noch weiter zu reinigen.

Bei dieser Behandlung werden mehrere Verfahrensschritte durchgeführt, nämlich das in Lösung bringen z.B. mit Hilfe oberflächenaktiver Mittel, das Eliminieren bestimmter

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toxischer Bestandteile durch Absorption an verschiedene Träger, wie Aktivkohle, Silicagel, Ton oder vorzugsweise Bariumsulfat, Eliminieren von überschüssigem oberflächenaktivem Mittel, beispielsweise durch Behandlung mit Kaliumchlorid und anschließender Zentrifugierung und Fraktionierung nach verschiedenen in der Biochemie bekannten Methoden, wie insbesondere durch die verschiedenen Arten der Chromatographie und der Elektrophorese.

Das erhaltene lösliche und gereinigte Produkt kann vorzugsweise mit einem feinteiligen Träger, z.B. mit Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat oder Calciumphosphat gemischt werden oder der Komplexbildung mit einem Makromolekül unterworfen werden, z.B. einem Polykation, wie methyliertem Albumin oder einem DEAE-Dextran.

Gemäß einer weiteren Arbeitsweise wird die gewonnene phenolische Phase dialysiert, vorzugsweise gegen einen alkalischen Puffer unter Bedingungen äußerster Schnelligkeit.

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Wenn ein Rückstand noch vorhanden ist, wird dieser eliminiert, nachdem das wasserlösliche gewonnene Produkt einmal oder mehrmals einer Reinigungsoperation und der Konzentration unterworfen wurde und gegebenenfalls an ein Adjuvans oder ein Gel gebunden wurde oder mit einem Makromolekül als Niederschlag komplexiert wurde.

Die weiteren Vorzüge und Eigenschaften der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung und insbesondere den nicht als Beschränkung aufzufassenden Beispielen.

Extraktion

Beispiel 1: Extraktion in Phenol

Es wurden 10 g trockener Bakterienzellen oder Hefepilzzellen mit 350 cnr destilliertem Wasser vermischt und die Mischung auf eine Temperatur von 65°C gebracht. Danach wurden 315 cm³ auf 65°C erwärmtes Phenol und 35 cm⁵ Natriumdodecylsulfat einer Konzentration von 6,66 Gew.-% ebenfalls auf 65⁰C erwärmt, zugefügt. Die Endkonzentration von Phenol betrug 45 % und von Natriumdodecylsulfat 3.125 %o,

Die Mischung wurde eine Stunde gerührt und anschließend bei einer Temperatur von 65°C stehengelassen. Danach wurde sie auf 0 bis + 4⁰C gekühlt und eine Nacht bei 4⁰C stehengelassen.

Es wurde eine untere phenolische Phase und eine obere wäßrige Phase mit einer Zwischenphase, die den größten Teil der Rückstände enthielt, erhalten. Die Zwischenphase und die wäßrige Phase wurde abgetrennt und danach mittels Zentrifugieren bei 35 000 g die phenolische Phase eine Stunde bei 10⁰C absitzen gelassen. Die Zwischenphase und die wäßrige Phase, die erhalten wurden, wurden entfernt und die phenolische Phase, die durchsichtig und gefärbt war, wurde gesammelt.

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Das gleiche Extraktionsverfahren wurde mit allen Mikroorganismen durchgeführt, die Gegenstand der Erfindung sind.

Beispiel 2; Extraktion in m-Kresol

Es wurde eine Suspension, die 10 g trockene Bakterien in 500 cm destilliertem Wasser enthielt, auf 37°C erwärmt und mit 500 cm m-Kresol, das auf 37 C erwärmt war, gemischt. Nach 3 Minuten Rühren bei 37°C wurde das Gemisch zentrifugiert und die wässrige Phase und die Zwischenphase eliminiert.

Beispiel 3; Extraktion in Phenol

Es wurde ein Gemisch von 10 g trockenen Bakterien mit 400 mg destilliertem Wasser auf AO⁰C erwärmt. Danach wurden 350 cm Phenol von 90% bei 4 ⁰C zugegeben. Die Mischung wurde 6 Stunden bei 4°C gerührt und eine Nacht bei 4 C stehengelassen. Danach wurde die wässrige Phase und die Zwischenphase durch Zentrifugieren entfernt.

Beispiel 4;

Es wurde ein Gemisch von 10 g trockenen Bakterien mit 350 cm einer Lösung von 30% Natriumchlorid gemischt und auf 65°C erwärmt. Es wurden 315 cnr reines Phenol, das auf 65°C erwärmt war und 35 cm einer Lösung von 0,2 m Natriumdodecylsulfat, die auf 65°C erwärmt war, zugefügt und das Gemisch bei dieser Temperatur eine Stunde gerührt. Es wurde anschließend das Gemisch auf 25°C gekühlt.

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Es wurde anschließend zentrifugiert und eine obere Phenolphase erhalten, die dekantiert wurde. Es wurde ein Gemisch mit dem gleichen Volumen destillierten keimfreien Wasseis bei 25°C hergestellt und 30 Minuten auf 25⁰C zur Bildung einer Emulsion gerührt. Anschließend wurde zum Aufbrechen der Emulsion zentrifugiert und die auf diese Weise gewaschene Phenolphase gewonnen,nachdem die überstehende wäßrige Phase dekantiert worden war.

Beispiel 5: Extraktion in Phenol

Es wurde ein Gemisch gemäß Beispiel 1 hergestellt und gemäß diesem Beispiel 1 Stunde gerührt und anschließend auf einer {Temperatur von 65⁰C gehalten. Das Gemisch wurde anschließend auf +5°C gekühlt und kristallisiertes Natriumchlorid in einer Menge, die ausreichte, um die Konzentration der wäßrigen Phase auf 30 % zu bringen, wozu 115,5g notwendig waren, zugefügt. Es wurde 30 Minuten bei + 20⁰C gerührt und anschließend zentrifugiert. Die überstehende phenolische Phase wurde isoliert.

II. Phenolentfernung

Beispiel 6;

Es wurde die Phenolphase, die gemäß Beispiel 1 erhalten worden war, mit dem 5-fachen Volumen Methanol, das auf 20⁰C vorgekühlt war, vermischt. Vorzugsweise können weiterhin 0,01 Volumina einer gesättigten Natriumacetatlösung in Methanol zugefügt werden.

Die Mischung wurde anschließend mehrere Stunden stehengelassen, z.B. über Nacht, bei erniedrigter Temperatur von z.B. 4⁰C.

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Anschließend wurde die überstehende Methanolphase abdekantiert, wobei das Sediment bei 15,000 g abzentrifugiert wurde, was etwa 30 Minuten dauerte.

Der Rückstand wurde konserviert z.B. für eine spätere oder soforte Solubilisierungsbehandlung oder Ausfällung. Er kann auch gefriergetrocknet werden, wodurch in gleicher Weise das Phenol eliminiert wird, und im trockenen Zustand über längere Zeiträume aufbewahrt werden. Die Suspension oder das gefriergetrocknete Produkt können im Autoklav erwärmt werden.

Der Rückstand kann in gleicher Weise gewaschen oder dialysiert werden, um das restliche Phenol zu entfernen, und kann z.B. in physiologischer Lösung wieder aufgenommen werden. Sie kann beispielsweise in destilliertem Wasser mit dem 2-fachen Volumen, bezogen auf die phenolische Phase, mit der sie behandelt worden ist, aufgenommen werden und anschließend unter Rühren gegen das 50-fache Volumen destilliertes Wasser bei 4°C dialysiert werden, was mehrere Stunden, z.B. eine Nacht dauert. Diese Dialyse kann ein zweites Mal gegen physiologische Lösung wiederholt werden, die auf einen pH-Wert 7 gepuffert ist. Es wird schließlich eine Fraktion S erhalten, die in Wasser unlöslich ist. Diese Fraktion S kann durch Erwärmen im Autoklaven, z.B. auf 115°C über 30 Minuten sterilisiert werden.

Beispiel 7;

Der vorstehend gewonnenenFraktion S oder eir7 einfachen Rückstand aus der Suspension in Wasser, die im gleichen Volumen Wasser dispergiert sind und eine Konzentration von 4 bis 5 mg Protein je cm aufweisen, werden 0,1 Volumen Natriumdodecylsulfat,(0,2-molar) Tropfen für Tropfen ohne Rühren bei Umgebungstemperatur zugefügt, um die Fraktion aufzulösen.

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Das Rühren wird fortgesetzt bis zur vollständigen Auflösung, wonach man 0,5 Volumina einer Suspension von 18,75% Bariumsulfat in Wasser zufügt. Nach 2 Stunden Rühren bei Umgebungstemperatur wird 30 Minuten mit 15.000 g zentrifugiert. Der Bodensatz wird eliminiert und die überstehende Flüssigkeit wird mit dem 0,05-fachen Volumen gesättigter Kaliumchloridlösung versetztem das Dodecylsulfat zu eliminieren, welches ausfällt. Anschließend wird etwa 30 Minuten bei 15 000 g zentrifugiert. Der Bodensatz wird eliminiert und die überstehende durchsichtige Flüssigkeit wird gesammelt. Diese wird gegen physiologisch gepuffertes Wasser vom pH-Wert 7 mit dreimal einer Menge von 1 : 50 Volumina bis zur Befreiung vom restlichen Phenol oder restlichem Kaliumchlorid dialysiert.

Es wird dann über ein Filter mit Mikroporen von 0,45 pm bis 0,22 um filtriert, wobei eine Fraktion SS erhalten wird, die im Gegensatz zur Fraktion S wasserlöslich ist.

Vorzugsweise wird diese Fraktion mit einem Adjuvans, wie Aluminiumhydroxyd oder einem anderen Gel oder DEAE-Dextran oder einem methylierten Albumin versetzt.

Beispiel 8;

Die durch Extraktion gemäß Beispiel 1 erhaltene phenolische Phase wird gegen destilliertes Wasser unter Rühren in einem Dialyslerschlauch dialysiert bis zur Befreiung von Phenol, was drei Dialysen mit je 50 Volumina Wasser erforderte..

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Es wurde eine neue Dialyse gegen einen Natriumphosphat-Puffer vom pH-Wert 8 bei Umgebungstemperatur unter Rühren des Dialyseschlauchs bis zur Auflösung des Rückstands durchgeführt. Diese Dialyse wird zweimal mit je 50 Volumina durchgeführt.

Die Gesamt-Dialysedauer beträgt mehrere Stunden, z.B. etwa 48 Stunden.

Falls ein Rückstand besteht , wird 30 Minuten bei 15 000 g zentrifugiert. Der Rückstand wird eliminiert. Anschließend wird bei einer großen Zahl von Bakterien kein Rückstand mehr beobachtet.

Die überstehende gefärbte Flüssigkeit wird einer Dialyse gegen physiologisch gepuffertes Wasser vom pH-Wert 7 unterworfen, wobei zwei Dialysen mit je 50 Volumina durchgeführt wurden. Es wurde in gleicher Weise eine Fraktion SSp erhalten, die noch aktiver als die Fraktion SS im Beispiel 8 war.

Es wurde die Reinigung unter Absenken des pH-Werts auf 4 durch Zugabe von Salzsäure unter Rühren fortgesetzt, wobei ein Niederschlag erhalten wurde. Bei der Durchführung einer Zentrifugierung bei 15 000 g über 30 Minuten wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt.

Der Niederschlag wurde in destilliertem Wasser in einer Menge von 1 Volumen je 1 Volumen Niederschlag aufgeschlämmt unter Senken des pH-Wertes und es wurde erneut eine Dialyse gegen physiologisch gepuffertes Wasser vom pH-Wert 7 durchgeführt bis zur vollständigen Lösung, was nach 3 Operationen mit je 50 Volumina der Fall war.

Es wurde eine Fraktion erhalten, die mit SSpH bezeichnet wurde und eine Lösung in Wasser bildet.

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Beispiel 9:

Der gemäß Beispiel 1 erhaltene phenolische Extrakt wurde einer Fällung durch Zugabe von Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht zwischen 1.500 und 20.000, vorzugsweise in der Größenordnung von 6.000 unterworfen.

Der erhaltene Niederschlag wurde danach wie vorher zentrifugiert und isoliert. Er wurde in Wasser in Suspension gebracht, vorzugsweise in physiologischer Lösung.

Die erhaltenen Fraktionen zeigen die gleiche Aktivität und sind nicht löslich. Sie können durch Verfahrensweisen analog den Beispielen 7 und 8 löslich gemacht werden. Die Aktivität der Stimulierung der nicht-spezifischen Immunität wurde an einer großen Zahl von Mäusen durch schwere Tests bewiesen, die bakterielle Infektionen hatten. Es wurden Bakterien der Stämme Salmonella, Pseudomonas, Escherichia coli, Staphylocoques, Neisseria meningitidis Serumgruppe A, B, C, Klebsieila pneumoniae und Brucella Abortus verwendet.

In der folgenden Tabelle I sind die Schutzdosen 50 % der diversen Extrakte von 12 verschiedenen Ursprüngen vor der Erwärmung und nach der Erwärmung auf 115⁰C während 30 Minuten festgehalten. Das Prüfungsmittel war Salmonella.

Die folgende Tabelle II zeigt die kumulierten Ergebnisse, die mit verschiedenen Extrakten von Neisseria und Proteus erhalten wurden, ausgedrückt in Prozentsätzen der überlebenden Tiere durch unterschiedliche Dosen, die den Mäusen verabreicht wurden, in /ug Trockengewicht.

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In der folgenden Tabelle III werden die Ergebnisse als Funktion der an Mäusen verabreichten Dosierungen gezeigt, die eine Schutzwirkung von erfindungsgemäßen Extrakten gegen Meningitidis Serumgruppe A, B und C zeigen.

Als Beispiel wird auf Fig. 4 verwiesen, in der graphisch auf der Abszisse das Zeitintervall der Stimulation bei der Prüfung und auf der Ordinate der Prozentsatz der überlebenden Tiere dargestellt sind. Die Dosen wurden an Mäuse intraperitoneal verabreicht.

Die Kurve 1 stellt die Kinetik bei Mäusen dar, die durch 50 /Ug der Extrakte S Meningo M 21 nach einem Salmonella-Test erhalten wurde. Die Kurve 2 stellt die Kinetik dar, die bei einer Stimulierung mit 10 yug der Extrakte SS mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans, bei Meningo M 29 gegen Staphylo als Prüfsubstanz erhalten wurde.

Die Kurve 3 stellt die Kinetik bei einer Stimulierung durch 10 /Ug der Extrakte SS plus Aluminiumoxid bei Pertussis Bp bei der Prüfung gegenüber Staphylo dar. Man sieht, daß die Stimulierung innerhalb eines Tages stattfindet, das höchste Niveau in 2 bis 3 Tagen erlangt und 2 bis 3 Wochen auf dem hohen Niveau bleibt.

Die Tabelle IV zeigt die Ergebnisse, die durch Extrakte von Neisseria und Proteus als Funktion des Zeitabstandes nach der Verabreichung an Mäuse mit Extrakten gemäß der Erfindung und der späteren Prüfung erhalten wurden, wobei der Teststamm N.meningitidis Serumgruppe A, B und C war.

Die Tabelle V zeigt die Ergebnisse, die bei einer Stimulierung durch einen Extrakt SS plus Aluminiumhydroxid bei Neisseria erhalten wurden, vor allen Dingen als Folge einer einzigen Stimulierung gefolgt von einem Test mit Salmonella

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3 Tage später und einem Test mit Pseudomonas 17 Tage nachher, sowie nach einem Test mit mehrfacher Stimulierung 0,7 bzw. 15 bzw. 21 bzw. 28 Tage später und einem Test mit Salmonella am 3·, 10., und 18. Tag bzw. mit Pseudomonas am 24. Tag und mit CoIi am 31. Tag.

Tabelle VI zeigt die Schutzwirkung gegen gemischte Testkulturen durch einen Extrakt von Heisseria. Das Testmittel bestand aus einem Gemisch von 4 Bakterienspezies von Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus und Coil.

Die Wirkung der wiederholten Stimulierung ist zahlenmäßig unter Tabelle VII dargestellt.

Tabelle VIII zeigt die Ergebnisse, die bezüglich der Schutzwirkung durch einen Extrakt von Neisseria gegen verschiedene Virusarten EMC (Virus der Encephalomyocardie bei Mäusen) und SF (Virus Semliki-Forest) erhalten wurden.

Die Medikamente gemäß der Erfindung zeigen ebenfalls eine erhebliche Schutzwirkung gegen eine Subinfektion bakterieller Art auf einer Virusinfektion. Dies wird durch eine Probe bestätigt, wobei Mäusen eine Testdosierung von Viren verabreicht wurde, die einer DL 50 entsprachen, wobei 3 Tage später eine Bakterienprobe einer Dosis oberhalb der IDMM verabreicht wurde.

Die Tabelle IX stellt die Aktivität eines Extrakts von Neisseria gegen die Subinfektion bakterieller Art über einer Virusinfektion EMC dar, wobei der große Pfeil das Verabreichungsdatum des Medikaments und der kleine Pfeil das Verabreichungsdatum des Testmittels darstellt, das im ersten Fall alleine EMC war und im zweiten Fall alleine

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Coil darstellt, während es im dritten Fall eine Doppelprobe aus EMC und CoIi darstellte.

Man stellt fest, daß nach einer einzigen Injektion des Extrakts SS von Neisseria vor oder nach der Virusinfektion ein hervorragender Schutz vermittelt wird.

Die Versuche wurden an mehr als 20.000 Mäusen durchgeführt und zeigen, daß die mit dem erfindungsgemäßen
Medikament immunstimulierten Mäuse trotz der schwerwiegenden Versuchsbedingungen gute Widerstandsfähigkeit zeigten. Als Medikamente mit den besten Wirkungen haben sich diejenigen erwiesen, die Extrakte von Neisseria und Proteus und, in geringerem Ausmaß, Klebsiella, enthielten.

Die hervorragende Aktivität der Extrakte von Neisseria meningitidis wird in gleicher Weise durch verschiedene Versuchsmodelle bestätigt, die bei größeren Tierarten, Schweinen und Rindern,durchgeführt wurden. Diese Extrakte können z. B. Schweine gegen Rötelinfektionen in ausreichendem Maße schützen, während die nicht-stimulierten Tiere generalisierte Schäden davontrugen.

Allgemein gesprochen werden die besten Resultate mit Fraktionen SS und insbesondere durch Fraktionen SSp erhalten.

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Die immunstimulierende Wirkung wird merklich erhöht durch Verwendung eines Adjuvans, wie folgt: AIpO,, AlPO^, Latex, Aerosol, DEAE-Dextran und methyliertes Albumin.

Die Proben haben gleichermaßen gezeigt, daß eine bestimmte antivirale Stimulierung erhalten wurde. Wenn z. B. ein Extrakt von Neisseria in einer Dosis von 5 /Ug bei Mäusen intranasal angewendet wurde, wurden 8 von 10 Mäusen gegen Grippevirus mit Hilfe des Aerosols geschützt.

Die Fig. 1 stellt graphisch auf der Abszisse die Zahl der Tage nach der Stimulierung durch einen viralen Prüfstoff EMC und auf der Ordinate den Prozentsatz der überlebenden Tiere dar. Die Kurve A entspricht den Mäusen, die intraperitoneae eine Dosis von 225 /Ug Extrakt von Neisseria und 150 mg Aluminiumhydroxid erhalten hatten. Die Kurve B stellt Vergleichsversuche mit Tieren dar, die lediglich anstelle der Stimulierung intraperitoneae 150 #ug Aluminiumhydroxid erhalten haben und die Kurve C stellt Vergleichsversuche mit Tieren dar, denen lediglich physiologische Kochsalzlösung verabreicht wurde.

Die Fig, 2 stellt graphisch in ähnlicher Weise wie Fig. 1 Tiere dar, die mit dem gleichen Produkt subkutan behandelt wurden.

In gleicher Weise wurde festgestellt, daß bei tumoralen Wirkungsmodellen bei Mäusen eine synergistische Wirkung durch Verbindung zwischen den erfindungsgemäß hergestellten Medikamenten und bestimmten Anti-Tumormitteln besteht, z. B. bei Corynebacterium parvum, wobei eine besonders bemerkenswerte synergistische Wirkung bei der Behandlung mit Hilfe einer solchen Verbindung durch einen hohen Heiltiter festgestellt wurde.

709851/0880 -29-

In gleicher Weise wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Medikamente eine Stimulierung der nicht-spezifischen zirkulierenden heterologen Antikörper sicherstellen, ebenso v/ie eine Stimulierung bei einer Anzahl lymphoider sekretierender Zellen. Vom Standpunkt der Wirksamkeit bei Zellen aus gesehen, wird eine Stimulierung der Phagozytose, eine Stimulierung der Organe des reticulo-endothelialen Systems, eine Wirkung des Anhaltens von Hypersensibilisierungsreaktionen verzögerter Natur bei Meerschweinchen, ein Anhalten der Immun-Gewebeabstoßungsreaktion und einer Stimulierung der Synthese von ADN durch aktive menschliche Lymphocyten in vitro erhalten.

Die Fig. 3 erläutert graphisch die Adjuvanswirkung, die bei Mäusen gegenüber Antigrippe-Antikörpern nach der Immunisierung durch eine bivalente Grippevakzine A und B erhalten wird. Auf der Abszisse der Figur sind logarithmisch die Dosierungen in /Ug eines Extrakts von Neisseria auf Aluminiumhydroxid und auf der Ordinate der Logarithmus des Titers von IHA aufgetragen. Die Kurve A stellt die Wirkung der Grippevakzine der Valenz A ohne Adjuvans dar, während die Kurve A^ den Fall darstellt, in dem die Vakzine mit einem Adjuvans durch einen Extrakt gemäß der Erfindung angereichert ist.

Die Kurve B entspricht der Vakzine der Valenz B ohne Adjuvans und die Kurve B₁ der Vakzine mit dem Adjuvans der Valenz B.

In allgemeiner Weise zeigen die verschiedenen Fraktionen S, SS, SSP, SSH, SSpH ein hohes Wirkungsniveau.

In einer Mehrzahl der Fälle wird vorgezogen, einen Extrakt SS zu verwenden, dessen Unschädlichkeit und Sterilisation leichter zu kontrollieren sind als beim Extrakt S und welcher außerdem nicht löslich ist und dessen Fabrikation leichter als die der Extrakte SSp und SSH ist.

- 30 -

709851 /0R80

Das erfindungsgemäße Medikament wird vorzugsweise an ein Adjuvans adsorbiert, vorzugsweise Aluminiumoxid und wird vorzugsweise gefriergetrocknet.

In getrockneter Form kann das Medikament vorteilhaft im Autoklav z.B. auf 115°C erhitzt werden, wobei noch eine reine Attenuation der toxischen Reaktionen erfolgt, die eventuell noch vorhanden sein könnten.

- 31 -

7098 5 1 /ORBO

TABELLE

Schutzdosis (DP 50) von 50 % bei verschiedenen Extrakten als Trockengewicht in /ug gegenüber

mit Salmonella infizierten Mäusen

'· Medikament-Herkunft	S	125,3) ■	Fraktionstyp	SS	112,2	(167,1)	SS -	H Al	■	: SSp	+ Al	• ro	I
	14,4(	(107,1)	194,1	(210,4)	. 7,1	(14,1)	: SSp	: 26,2	(57,0)		VjJ -λ
: Neisseria meningitidis	15,8	(130,8)	495,4		7,6	(14,8)	:176,4 (392,7)	14,7	(9,0)	cn
: Proteus mirabilis	76,4				10,6	(7,2)	. 65,3 (111,8)		(90,8)	INJ O
: Klebsiella pneumoniae :	25,1		423,8		37,8	(25,1)		26,2
: Staphylococcus aureus	72,5	(165,2)'			40
: Bordetella pertussis	75,0	(631,5)		(318,2)		(30,3)
: Moraxella			286,5		62,2	(141,1)
: Pseudomonas aeruginosa	110,7	(165,2)	413	(795,6)	90,8	(198)
: Brucella abortus	319,4	(265,5)·			96,1	(118,8)		134
: Escherichia coli			>225				625
: Mycobacterium phlei	252,2			(230,3)
• : Corynebacterium : diphteriae •						(67,3)	>225 ■
: Corynebacterium parvum •			Extrakts nach
	50 des		Erwärmen auf	115°C -
in Klammern: DP					30 min.

TABELLE II

Kumulierte Ergebnisse mit Extrakttypen, die nach ihrer immunstimulierenden Wirkung
ausgewählt sind.

Salmonella - Test

to OO cn

OO

Dosis bei

Herkunft Fraktion

225 :

. Mäusen in

75 :

/Ug

Trockengewicht

20 :

10 :

8,3 i

5 :

2,5 :

0,9

DP 50

Neisseria ss + Al überleben
de/getestete Ί
Z Uber-
lebensquote
SS + Al S/E
erwärmt 115⁴C, %
30 min.

90/96:
iere:
93,8

112,5:

295/328:
89,9

40 :

25 :

213/350:
60,9 :

65/112
58

7/32
21,9

7,07

Proteus SS + Al S/E

46/64
71,9

16/16:

341/420-
81,2

12/16

332/435
76,3

23/32:

103/228
45,2

167/376:
44,4

77/148
52

5/48
10,4

14,09

SS + Al S/E
erwärmt %

8/8

23/24
95,8

10/16

311/515
60,4

13/24
54,2

3/8

7,58

SSp + Al S/E

20/24
83,3

. 27/32
84,4

33/48
68,8

. 11/40
27,5

26/56
46,4

: 9/38
. 23,7

14,79

7/8

: 20/24
: 83,3

: 40/56
: 71,4

29/48
. 60,4

: 14/32
: 43,8

14,72

: 8/8

: 44/56
: 78,6

Meßzahl nicht-stimuliert = % Überlebensquote = 1,7 %

ν»

TABELLE III

Schutz gegen Nelsseria meningitidis, Serumgruppe A, B und C Zahl der überlebenden bei je 10 Versuchen (außer anderer Heilung)

'. Herkunft Proben-Nr. Extrakt	Dosis bei Mäusen subkutan in /Ug 225 75 25 15 3	Test interparitoneal Serumgruppe DL 50 Über lebende ' t
:Neisseria A MA 32 S : SS : : SS + Al : : Al	1 OO 6 2 0' 7 5 0 O Ol	• A 150 O : • • » ·
:Neisseria A MA 34 SS + Al :Proteus Pm 03 SS + Al : Al	5/9 3 1 6/9 5 2 0/9 O 1	A 250 O : •
• :Neisseria A MA 30 S : SS + Al rNeisseria C MC 31 S : SS + Al	: 7 9 : 8 7 ■	B 100 O : • • • ι ·
:Neisseria A MA 30 S : SS + Al : Al •	: 8 : 15/20 : 1/20	: C 50 O :

TABELLE

IV

Schutz gegen Neisseria meningitldis, Serumgruppe A,B und C durch Extrakte SS + Al bei Neisseria und Proteus.

30 min

auf 115 C) Kinetik

■> I

: Nr.

s typ

«>
O Al

200 pg + 100 ug

7

rage

C

: 50

: 90

14

Tage

: C

10 .

O

21 Tage

B

: C

. O ί

10

[erwärmt

Stimulierungsverzögerung,^SrSiShuSI ^Verab"

C >

MA 34

SS + Al

Al

A :

B :

% überlebende

: 30

: 20

A

: B

% Überlebende

20 :

10

A :

% Überlebende

: 10 :

10

Test mit N.meningitidis Serumgruppe
intraperitoneal ^{6 yi}^

C >

1/3

: O

10 :

O

: O

O

Herkunft :Proben : Extrakt- Dosis/Maus

c ι Proteus

1/9

100

: O

: 30

30 :

O

10

30

: 20

10

Neisseria :

C )

200 + 100

80

: O

: 10

10 :

O

10

: O

O

• Pm 03

: SS + Al

1/3

30

: O

O :

O

10

O

: 10
I

O

1/9

: O

■
O

O

I
: O

O

100 pg

70

: 10

: O

20

. O

O

10

: O

O

1/3

20

: O

10

ί O

: 10

O

: 10

1/9

30

O

10

O

20

10

O

10

O

Testsubstanz

A 3 500 Keime
B 400 Keime
C 1 200 Keime

120 DL 50 40 DL 50 10 DL 50

Überlebende: Überlebende: Überlebende:

TABELLE

Schutz gegen aufeinanderfolgende Gaben Testsubstanz durch Neisseria-Extrakt SS + Al

EINMALIGE STIMULATION

Dosis/Maus

Stimulation JO

30 ijg 10 pg 3,3 vq

Stimulation Test

JO

Test mit Salmonella J3

Test mit Pseudomonas J17

Zahl der Über-

lebenden bei Tests = 0/16

16

J3
Salmonella

Dosis/Maus 30 pg

10 vg

3,3 wg

Zahl der Überlebenden bei 8 Tests

J7

= 0/8

Jl5 J21 J28 JlO J18 J24
Salmonella Salmonella Pseudomonas

8 5 4

7
4
1

J31 CoIi

7 4 1

ro

cn

NJ O

TABELLE

VI

Schutz gegen gemischte Testsubstanzen (4 Bakterienspezies) durch Neisseria-Extrakt SS + Al

^•Stimulation
^Testsubstanz

cn 25 vq

-»Dosis/Maus 8,3 yg

-*· 2,7 yg

°° Zahl der Überl oo

JO JlO	JO - J7 JlO	JO - JlO J3 -	J7 ! • JlO:	JO J17	JO - J7 - J14 J17	: JO - J7 - J14 - J21 : J24
8 4 O	8 5 O	7 2 3		7 2	8 8 4	'. 8 : 5 : 1
ander	ι bei 8 Tee	Meßzahl	0/8
JO .J3 -
' 8 . 4 • O
its

TABELLE VII

Wirkung wiederholter Stimulierungen mit Neisseria-Extrakt SS + Al Testsubstanz Salmonella

Zahl der Stimu- Zeitraum zwischen Test 10 Tage nach der Test 17 Tage nach der lierungen jeder Stimulierung letzten Stimulierung letzten Stimulierung

Dosis/Maus = 75 /Ug 25 8,3 75 25 8,3

«* 1 8 8 2 7 5 0

S 2 7 Tage 8 8 7 7/7 6 6

co 2 14 Tage 8 8 6 8 7 6

i" ... OJ

3 7 Tage 15/16 16/16 12/15 8 4 3

ο 3 14 Tage 15/16 14/15 15/16 6 6/7 4

Zahl der Überlebenden bei 8 Tests (außer anderer Heilung) Meßzahl : 0/8

TABELLE VIII

Schutz gegen Virus-Testsubstanzen durch Neisseria-Extrakte (in % überlebende Mäuse)

co OO cn

σ oo CD O

Testsubstanz	EMC subkutan	EMC intraperitoneal	SF subkutan
Stimulationsweg	sub- I intra- ] intra kutan ; perito-; venös	. ^:intra- ^: intra- sub- . perito— .. kutan J_nIaI , ^venos	. ^:intra- ^: , . sub- :perito-: intra kutan jneaL : venos
D§lai en jours avant epreuve	• · 1 - 4:1 - 4:1 - 4 • · • · * · • ·	• · ■ · 1 - 4:1 - 4:1 - 4 • · • ·	• · 1 - 4:1 - 4:1 - 4 • · • ·
S SS SS + Al Vergleich Al : Vergleich H₂O	• · 60 - 70:25 - 10:65 - 20 • ■ 40 - 30:30 - O :60 - 20 • · 70 - 50:30 - 10:55 - 0 • · 45 - 20:5 - ioil5 - 10 • · 5 - 20:5 - 20:5 - 20 • · • ·	• · 90 - 40:90 - 10:60 - 10 ■ · • · 70 - 70:100- O :30 - 10 • · • · 50 - 30:80 - O :30 - 10 * · 20 - 30:30 - 10:40 - O • · 10 - 10:10 - 10:10 - 10 • · • ·	• · 80 - 40:10 - 10:60 - 10 • · 60 - 60:20 - 0 :40 - 10 • · 80 - 70:10 - 0 :60 - 20 • * • * 20 - 30:20 - 20:40 - 0 • · • · 0- 0:0 -0:0 -0 • ·

Ul 00

ro

cn fsj O

- 39 -TABELLE IX

272520A

Schutz gegen bakterielle Superinfektion auf Viruskrankheit (Mittel aus 2 Versuchen

überlebende

infizierte lebende

	M 29	EMC +	I I	Coli Ψ	7/20	35	Z	Z
Schutz gegen Testsubstanz EMC	J Λ '	JO EMC t	I T" M29 \7	«,Coli	10/20 14/20	50 70	Z Z
		¹ Jo EMC	Jl	J3	0/40 36/40 36/36	0 90 100	Z Z Z	Z
		JO		J3	3/60 52/60	5 86,7	Z
Schutz gegen Testsubstanz Coli	M 29		i ι	Coli	60/60	100 Z
	J - 3		M 29 <7	^J₃ Coli f	39/40	97,5
			Jl	J3 Coli
Schutz gegen Doppel-Test substanz M		f I		J3 iloli
EMC danach Coli J	29	EMC γ	I t	J3
M	-'3	JO EMC	I I
J	ι I	¹ jo EMC j.	J! M 29
	ι ι - 3	JO EMC	Jl
JO

709851 /0880

Leerseite

Claims

Patentansprüche

Λ Die unspezifische Immunität stimulierendes Medikament, dadurch gekennzeichnet, daß es einen phenollöslichen Extrakt oder eine Fraktion dieses Extrakts von ein oder mehreren einzelligen Mikroorganismen aus der Gruppe der Bakterien, Hefepilze und Protozoen enthält, wobei dieser Extrakt oder die Extraktfraktionen wasserlöslich gemacht, von Endotoxinen befreit und in ausreichendem Ausmaß von Phenol befreit und in eine den Empfängerorganismus stimulierte Menge dosiert ist bzw. sind.
2. Medikament nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Extrakt oder einer extrakten Fraktion aus mindestens einer Bakterienart besteht, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Neisseria meningitidis, Proteus mirabilis und Klebsiella pneumoniae.
3. Medikament nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Extrakt oder einer extrakten Fraktion aus Neisseria meningitidis der Serumgruppe A oder der Serumgruppe C besteht.
4. Medikament nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Extrakt oder einer extrakten Fraktion mindestens eines Bakteriums, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Bordetella Pertussis, Acinetobacteur anitratus, Pseudonomas aeroginosa, Escherichia coil, Brucella abortus, Corynebacterium pseudodiphteriae, Corynebacterium parvum, Staphylococcus aureus.

7 0 9 8 B 1 / 0 B a 0
5. Medikament nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Extrakt oder eine extrakte Fraktion von Mykrobakterien enthält.
6. Medikament nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Extrakt oder eine Extraktfraktion aus mindestens einem Mykobakterium, ausgewählt aus der Gruppe: Mycobacterium phlei, Mycobacterium Kansasii, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium fortuitum, enthält.
7. Medikament nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Extrakt oder eine Extraktfraktion von Saccharomyces Cerevisiae oder Candida Albicans enthält.
8. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem eine Vakzine enthält.
9. Medikament nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Vakzine enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe der Vakzine gegen Grippe, Keuchhusten, Kinderlähmung, Masern, Röteln, Tetanus-Anatoxine, Diphterie-Anatoxine und Polyeacchariden von Meningococcen.
10. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es an ein Adjuvant adsorbiert ist.

709851/0R80
11. Medikament nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es an Aluminiumhydroxid adsorbiert ist.
12. Medikament nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem der folgenden Adjuvantien verbunden ist: AlPO₇₄, Latex, Aerosil, DEAE-Dextran, methyliertes Albumin.
13. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem ein Antitumormittel enthält.
1A. Medikament nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es als AntSumormittel Corynebacterium Parvum enthält.
15. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 1^, dadurch gekennzeichnet, daß es so konditioniert ist, daß es eine Dosis mit 10 bis 1000 /Ug, bezogen auf Trockengewicht, enthält.
16. Verfahren zur Herstellung eines Medikamentes nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus, wie ein Bakterium, einen Hefepilz oder ein Protozoon mittels flüssigem Phenol extrahiert bei einer Extraktionstemperatur unter 70⁰C und anschließend die Phenolphase gewinnt, das Phenol entfernt und anschließend das Extrakt wasserlöslich macht.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man Phenol selbst oder Cresole zum Extrahieren verwendet.
18. Verfahren nach Anspruch 16 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion bei eirer Temperatur zwischen 60 und 67°C durchführt.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Extraktionsdauer zwischen einigen Minuten und einigen Stunden, insbesondere zwischen 30 Minuten und 3 Stunden auswählt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Phenolmenge in Bezug auf die Wassermenge der Anfangssuspeneion zwischen 15 und 85 % auswählt.
21. Verfahren rach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Extraktion von Grampositiven Bakterien oder Mikrobakterien eine Zerreibung oder bakterielle Lyse durchführt.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion in Gegenwart eines anionischen Detergent durchführt.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung der phenolischen Phase von der wässrigen Phase durch Zugabe von Salz

in erhöhter Konzentration erleichtert.

709RB1 /OPRO
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß man das Phenol durch alkoholische Ausfällung entfernt.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der alkoholischen Ausfällung den Niederschlag durch Zentrifugieren sammelt und danach den Niederschlag erneut in destilliertem Wasser aufschlämmt und gegen 50 Volumina Wasser dialysiert.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ausfällung des phenolischen Extrakts durch Zugabe von Polyäthylenglykol durchführt.
27. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet,

daß man ein Polyäthylenglykol mit einem Molekular-

τοοοο gewicht zwischen 1500 und -3ΟΟΘ- verwendet.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß man durch Abdampfen der phenolischen Phase unter vermindertem Druck das Phenol abtrennt .
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß man den Extrakt mittels oberflächenaktiver Mittel in Lösung hält.

709RB1 /OPBO
30. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man den Extrakt durch Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels wieder auflöst und danach tine Ausfällung mittels Baryumsulphat durchführt und anschließend zentrifugiert und den Bodensatz entfernt und die überstehende Flüssigkeit bis zur Entfernung des restlichen Phenols dialysiert.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß man die Phenolentfernung durch Dialyse bewirkt.
32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Dialyse der phenolischen Phase gegen destilliertes Wasser sowie eine Dialyse gegen einen Natriumphosphatpuffer durchführt.
33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß man eine weitere Dialyse gegen Wasser, das mit einer physiologischen Pufferlösung auf pH 7 eingestellt ist, durchführt.
34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert zur Ausfällung senkt, daß man eine Zentrifugierstufe zur Entfernung der überstehenden Flüssigkeit einschaltet und daß man den erhaltenen Niederschlag in destilliertes Wasser einbringt und anschließend eine Dialyse gegen auf pH 7 gepufferte physiologische wäßrige Lösung durchführt.

709851/ 0Π RfI