<Desc/Clms Page number 1>
Verfahren zur Herstellung eines Staphylococcen-Impfstoffes
Die Erfindung betrifft die Herstellung eines neuen Staphylococcen-Vaccines.
Seit etwa sechzig Jahren versucht man, biologische Produkte herzustellen, die gegen StaphylococcenInfektionen immunisierend wirken. Diese Produkte, von denen einige im Handel erhältlich sind, haben jedoch beim Menschen nur zweifelhafte, indifferente oder enttäuschende Ergebnisse gebracht. Heute sind Staphylococcen-Infektionen ein noch ernsteres Problem als in den vergangenen fünfundzwanzig Jahren.
Das ist umso überraschender, als gegen andere bakterielle Infektionen, wie Typhus, Diphtherie, Keuchhusten, Tetanus, Lungenentzündung usw., zufriedenstellende immunisierende Mittel mit Erfolg entwickelt worden sind.
Es wurde gefunden, dass ein einzigartiges Staphylococcen-Vaccin hergestellt werden kann, indem man die intakten Zellen bestimmter Stämme von Staphylococcus aureus mit Phenol und einem wässerigen Lösungsmittel extrahiert und das Phenol und das unlösliche feste Material von der wässerigen Lösung trennt. Die zwei Extraktionen können entweder gleichzeitig durchgeführt werden oder die Phenolextraktion wird vor der Extraktion mit dem wässerigen Lösungsmittel durchgeführt, was vorzuziehen Ist. Die besonderen Stämme von Staphylococcus aureus, die zur Herstellung der erfindungsgemässen Vaccine verwendet werden können, sind die Stämme UC76, Smith, S193N4, H & D, Castellani, MCD138, SK4473, K6, K93 und K93M. Von diesen Stämmen werden die Stämme K93M, MCD138, S193N4 und UC76 bevorzugt.
Jeder dieser Stämme von Staphylococcus aureus ist in der Kulturenkollektion von Parke, Davis & Company in Detroit, Michigan, und in der Kulturenkollektion des Fermentation Laboratory, Northern Utilization Research and Development Division, U. S. Department of Agriculture in Peoria, Illinois, unter den in der folgenden Tabelle angegebenen Nummern hinterlegt.
EMI1.1
<tb>
<tb>
Stamm <SEP> Parke, <SEP> Davis <SEP> & <SEP> Co. <SEP> Northern <SEP> Utilization <SEP> Research <SEP> Laboratory
<tb> Kollektion <SEP> Nr. <SEP> Kollektion <SEP> Nr. <SEP>
<tb>
UC76 <SEP> 05068 <SEP> NRRL <SEP> B-2467
<tb> Smith <SEP> 05067 <SEP> NRRL <SEP> B-2468
<tb> S193N4 <SEP> 05089 <SEP> NRRL <SEP> B-2469
<tb> H & D <SEP> 05087 <SEP> NRRL <SEP> B-2471
<tb> Castellani <SEP> 05088 <SEP> NRRL <SEP> B-2472
<tb> MCD138 <SEP> 05085 <SEP> NRRL <SEP> B-2473
<tb> SK4473 <SEP> 05086 <SEP> NRRL <SEP> B-2474
<tb> K6 <SEP> 05090 <SEP> NRRL <SEP> B-2475 <SEP>
<tb> K93 <SEP> 05091 <SEP> NRRL <SEP> B-2476
<tb> K93M <SEP> 05092 <SEP> NRRL <SEP> B-2477
<tb>
Die intakten Zellen der oben erwähnten, als Ausgangsmaterial verwendeten besonderen Stämme von Staphylococcus aureus, können entweder lebend (entwicklungsfähig),"getötet" (entwicklungsunfahig) oder eine Mischung davon sein, also "teilweise getötet".
Das genaue Verfahren zur Herstellung der "getöte- : en" oder"teilweise getöteten"Styphylococcen ist nicht kritisch. Zu den Inaktivierungsmethoden, die
<Desc/Clms Page number 2>
EMI2.1
während 2 h) und Phenol (llo bei 250C während etwa 18 h).
Das zur Extraktion verwendete wässerige Lösungsmittel ist vorzugsweise Wasser, obwohl auch physiologisch verträgliche wässerige Salzlösungen, wie physiologische Salzlösung, Hank'sche Salzlösung u. dgl., verwendet werden können. Die Menge des wässerigen Lösungsmittels ist nicht von kritischer Bedeutung, aber es ist vorteilhaft, nicht mehr zu verwenden, als nötig ist, um das gewünschte Antigen wirksam zu extrahieren. Verwendet man einen Überschuss des wässerigen Lösungsmittels, so wird die Wirksamkeit pro Milliliter des erhaltenen Vaccines unerwünscht niedrig und es ist dann die Verabreichung einer unbequem grossen Menge des Vaccines erforderlich. Die Menge des zur Extraktion verwendeten Phenols ist ebenfalls nicht kritisch.
Wenn beide Extraktionen gleichzeitig durchgeführt werden, muss eine genügend grosse Menge an Phenol verwendet werden, damit sich eine phenolische Phase ausbildet ; aber die Phenolmenge darf nicht so gross sein, dass das gesamte vorhandene wässerige Lösungsmittel gelöst wird. Wenn die Phenolextraktion vor der Extraktion mit dem. wässerigen Lösungsmittel durchgeführt wird, so muss die Phenolphase genug Wasser enthalten, um das Phenol flüssig zu machen, aber nicht genug, um die Abscheidung einer getrennten wässerigen Phase zu bewirken ; diese. Bedingungen sind bei einem Wassergehalt zwischen etwa 5-30% gegeben.
Da die als Ausgangsmaterial verwendeten intakten Zellen der Staphylococcen feucht sind und Wasser enthalten, ist es gewöhnlich nicht erforderlich, dem Phenol sehr viel Wasser beizugeben, um es flüssig zu machen. Das normale und bevorzugte Vorgehen ist so, dass man Phenol verwendet, das schliesslich nicht mehr als lälo Wasser enthält. Obwohl die Phenolextraktion ein wesentlicher Schritt in dem Verfahren ist, ist es nicht möglich gewesen,. genau festzustellen, was das Phenol bewirkt oder wie es seine wesentliche Funktion bewerkstelligt. Es scheint jedoch, dass das Phenol auf eine neue Art und Weise wirkt, und nicht bloss als Lösungsmittel für verunreinigende Proteine. Eine Untersuchung der phenolischen Phase zeigt, dass sie nur eine sehr kleine Menge Protein und praktisch kein Antigenmaterial enthält.
Dies führt zur Annahme, dass das Phenol mechanisch wirken dürfte, um die Zellwand zu brechen, so dass das Antigen der Extraktion durch das wässerige Lösungsmittel freigegeben wird, und gleichzeitig das meiste Protein derart denaturiert, dass es weder im Phenol noch im wässerigen Lösungs- mittel löslich ist.
Das erhaltene wässerige Vaccinprodukt sollte nicht wesentlich mehr als etwa 0, 2% Phenol enthalten.
Jeder Phenolüberschuss, der in das Endprodukt gelangt, kann durch Dialyse oder durch Extraktion mit einem flüchtigen, mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel, wie Äther oder Chloroform und anschliessender Vakuumbehandlung der wässerigen Lösung zum Abtreiben etwa gelöster Lösungsmittelspuren entfernt werden. Anderseits kann auch das Phenol, wenn die zwei Extraktionen des Verfahrens nicht gleichzeitig durchgeführt werden, während des Prozesses abgetrennt werden. Dies wird in folgender Weise durchgeführt : Die Zellen der Staphylococcen werden mit Phenol extrahiert und das Phenol wird von den unlöslichen festen Stoffen durch Zentrifugieren, Filtrieren, Dekantieren usw. abgetrennt.
Die unlöslichen festen Stoffe werden dann mit einem flüchtigen organischen Lösungsmittel für Phenol, wie Äther, Chloroform, absolutes Äthanol, Aceton u. dgl., gewaschen. Etwa vorhandenes, flüchtiges organisches Lösungsmittel, welches in den phenolunlöslichen festen Stoffen nach dem Waschen zurückbleibt, lässt man verdampfen, bevor man die unlöslichen festen Stoffe mit dem wässerigen Lösungsmittel extrahiert.
Der pH-Wert des erhaltenen Impfstoffes wird, wenn notwendig, auf etwa 6 - 8, gebracht, vorzugsweise auf annähernd 7, 2. Wenn das Vaccin nicht isotonisch ist, so wird es vorzugsweise durch Zufügen von Natriumchlorid isotonisch gemacht. Das erhaltene Vaccin kann in verschiedener Weise sterilisiert
EMI2.2
von ungelösten festen Stoffen sowie von Teilen des zur Gewinnung der Staphylococcen verwendeten Kulturmediums. Es ist nicht lebend (entwicklungsfähig) und enthält sehr wenig Stickstoff im Vergleich zu den als Ausgangsmaterial verwendeten Zellen. Bei parenteralerVerabreichung bewirkt es einen konstant hohen Grad an Immunität, u. zw. nicht nur gegen den bei seiner Bereitung verwendeten Staphylococcus aureusStamm, sondern auch gegen Infektion durch andere Staphylococcus aureus-Stämme.
Das Vaccin ist in der Hinsicht einzigartig, dass die Menge der schützenden Antikörper, deren Entstehung es verursacht, bei Versuchstieren gemessen und seine Wirksamkeit gegen grosse Erreger-Dosen von verschiedenen Stämmen von Staphylococcus aureus deutlich gezeigt werden kann. Das Vaccin ruft bei Verabreichung keine unerwünschten lokalen oder allgemeinen Reaktionen hervor.
<Desc/Clms Page number 3>
Die Erfindung wird durch folgende Beispiele näher erläutert. Beispiel l : 250 ml einer sterilen Kulturbrühe mit folgender Zusammensetzung :
EMI3.1
<tb>
<tb> Durch <SEP> tryptischen <SEP> Abbau <SEP> aus <SEP> Kasein <SEP> gewonnenes
<tb> Pepton <SEP> (Trypticase) <SEP> 17, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Mit <SEP> Papain <SEP> aufgeschlossenes <SEP> Sojamehl <SEP> (Phyton) <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> Dikaliumphosphat <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Dextrose <SEP> 2,5 <SEP> g
<tb> Wasser <SEP> 1000, <SEP> 0 <SEP> g
<tb>
EMI3.2
<Desc/Clms Page number 4>
24105 Carworth Farms Nr. 1-Albinomäuse (18-22 g) wurden zwecks Beimpfung in sieben Gruppen zu je 15 Mäusen geteilt.
Die Mäuse jeder Gruppe wurden mit 0, 2 ml variierender Verdünnungen des Vaccins mit steriler physiologischer Salzlösung subkutan geimpft. Die für die einzelnen Gruppen verwendeten
EMI4.1
Gruppe 5-0, 2 ml einer 1 10000-Verdünnung I Gruppe 6 - 0. 2 ml einer 1 : 30000-Verdünnung
Gruppe 7 - 0. 2 ml einer 1 : 100 000-Verdünnung
7 Tage später wurden die Mäuse jeder Gruppe sowie 30 Mäuse einer Kontrollgruppe durch intraperitoneale
Injektion von 10 000 LD50 des UC76-Stammes von Staphylococcus aureus (0, 5 ml einer 1 : 100000-Ver- dünnung einer nach 6 h erhaltenen Kultur von Staphylococcus aureus UC76 in dem oben beschriebenen i flüssigen Medium) infiziert. Die Mäuse wurden 5 Tage lang beobachtet und die Todesfälle registriert.
Der
Prozentsatz der Überlebenden in jeder Gruppe wurde berechnet und aus diesen Überlebensziffern wurde die für 50% der Mäuse schützende Verdünnung (PD50) nach der Miller-Tainter-Methode, Proc. Soc. Exp. Biol.
Med. 57 [1944], 264 et seq. berechnet. Die Überlebensdaten für diesen Versuch sind in der folgenden
Tabelle gezeigt.
1
EMI4.2
<tb>
<tb> Gruppe <SEP> verwendete <SEP> Verdünnung <SEP> von <SEP> Todesfälle <SEP> an <SEP> Tagen <SEP> %
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> ml <SEP> des <SEP> Vaccins <SEP> nach <SEP> der <SEP> Infektion <SEP> Überlebende
<tb> 0 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Kontrolle <SEP> nicht <SEP> behandelt <SEP> 0 <SEP> 30 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 1 <SEP> 1-100 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 100
<tb> 2 <SEP> 1-300 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 100
<tb> 3 <SEP> 1-1000 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 93, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 1-3000 <SEP> 0 <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 53.
<SEP> 3 <SEP>
<tb> 5 <SEP> 1-10000 <SEP> 0 <SEP> 15 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> 1-30000 <SEP> 0 <SEP> 15 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 7 <SEP> 1-100000 <SEP> 0 <SEP> 15 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
Aus dieser Tabelle geht hervor, dass alle Kontrollmäuse innerhalb von etwa 24 h starben und dass durch 0, 2 ml des von 1 auf 300 verdünnten Vaccins kaum mehr als 50% der Mäuse geschützt wurden. Der aus diesen Daten errechnete tatsächliche PD50 des Vaccins betrug 3100 pro 0, 2 ml oder 15 500 pro ml.
Die Dialyse bei der obigen Arbeitsweise kann man umgehen, indem man den phenol-unlöslichen Niederschlag mit Äther wäschtuI1d den etwa im festen Niederschlag vorhandenen Äther verdunsten lässt, bevor man die Extraktion mit Wasser beginnt.
Beispiel 2 : 10 Proberöhren, die 10 ml einer sterilen Kulturbrühe mit derselben Zusammensetzung wie die in Beispiel 1 beschriebene, enthielten, wurden mitje einem Tropfen (eine Öse voll) einer Stammkultur des UC76-Stammes von Staphylococcus aureus belegt und unter aseptischen Bedingungen 6 h bei 37 C bebrütet.
Mengen von je 2 ml dieser lebenden Kulturen wurden verwendet, um 43 Roux-Kolben zu belegen, die je 200 ml eines sterilen festen Kulturmediums mit folgender Zusammensetzung enthielten :
EMI4.3
<tb>
<tb> Durch <SEP> tryptischen <SEP> Abbau <SEP> von <SEP> Kasein <SEP> gewonnenes
<tb> Pepton <SEP> (Trypticase) <SEP> 15, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> - <SEP> Mit <SEP> Papain <SEP> aufgeschlossenes <SEP> Sojamehl <SEP> (Phyton) <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Agar <SEP> 15, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 1000, <SEP> 0 <SEP> g
<tb>
<Desc/Clms Page number 5>
Die belegten Kulturen wurden bei 37 Cunter aseptischen Bedingungen 18 h lang bebrütet.
Die lebenden Staphylococci aurei UC76 wurden von den Oberflächen der 43 Kulturen mit der Mindestmenge steriler physiologischer Salzlösung gewaschen und die erhaltene Suspension 1 h lang 4000 Umdr/min zentrifugiert. Die überstehende Schicht wurde verworfen und die zusammengeballten Zellen (40, 1 g Feuchtge- wicht) (annähernd 1, 8 X 1013 Organismen) wurden in 219 ml destilliertem Wasser suspendiert ; Volumen der Suspension 245 ml. Eine Probe von 9 ml wurde entnommen und die restlichen 236 ml der Suspension in zwei gleiche Teile geteilt. Jeder Teil von 118 ml der wässerigen Suspension von lebenden Zellen von Staphylococcus aureus UC76 wurde mit 256, 3 g Phenol und 156ml Wasser in einem Waring-Mischer 8 min gemischt.
Die Temperatur stieg von 15 auf 36oC. Die erhaltenen Mischungen wurden vereinigt und auf 100C gekühlt ; Volumen 800 ml. Zwei Schichten bildeten sich. Die Mischung wurde bei +10oC 60 min langbei4000 Umdr/min zentrifugiert, was die Abscheidung von vier Phasen bewirkt : einer oberen wässerigen Phase, einer mittleren Niederschlagsphase unter der wässerigen Phase, einer H1enolphase unterhalb
EMI5.1
lere Niederschlagsphase wurde mit der Niederschlagsphase vereinigt und mit den 10 ml destillierten Was- sers, die verwendet worden waren, um die Gefässe während der Übertragung zu spülen, verdünnt. Die ver- einigten Niederschläge und das Waschwasser wurden mit der wässerigen Phase vermischt, und die erhalte- ne Suspension wurde bei 4000 Umdr/min 2 h zentrifugiert.
Die wässerige Phase (Volumen 400 ml) wurde abgetrennt und bei +4oC gegen strömendes Leitungswasser dialysiert. Während der Dialyse wurde der Di- alysensack in Bewegung gehalten. Die Dialyse gegen strömendes Leitungswasser dauerte etwa 2 Tage. Der
Dialysensack wurde dann in ruhendes destilliertes Wasser mit einer Temperatur von +4. oC übertragen und die Dialyse bei einmaligem Wechsel des destillierten Wassers etwa 2 Tage lang fortgesetzt. Dasdialysier- te Material, dasein Volumen von 450 ml hatte, war klar und farblos. 3, 825 g Natriumchlorid wurde dem wässerigen Vaccin zugefügt, um es physiologisch zu machen, und der pH-Wert durch Zugabe von 0, 15 ml einer 0, ln-Natriumhydroxydlösung von 6, 9 auf 7, 2 gebracht.
Das Vaccin wurde in eine sterile 500 ml-
Flasche übertragen, Thimerosal bis zu einer Konzentration von 1 : 10000 zugefügt und das Vaccin über
Nacht bei Raumtemperatur gelagert. Eine Probe von 30 ml wurde entnommen, um die Sterilität und die immunogenische Wirksamkeit nach der in Beispiel l beschriebenen Methode zu prüfen. Der Rest des Vaccins wurde bei +4 C gelagert und nach abschliessenden Sterilität-, Sicherheit-un Wirksamkeitstests in Fla- schen mit Gummihütchen gefüllt, die je 10, 5 ml fassten. Die Sterilitätstests in flüssigem thioglycolsaurem Medium zeigten, dass das Vaccin steril war. Der immunogenische Test nach der in Beispiel 1 be- schriebenen Methode zeigte, dass das Vaccin eine Wirksamkeit von 975 PD50 pro ml gegen eine 10000 LD50-Erregerdosis des UC76-Stammes von Staphylococcus aureus hatte.
Gegebenenfalls kann die Dialyse im obigen Verfahren weggelassen werden, indem man die wässerige Phase (400 ml Volumen) mit mehreren Teilen Äther extrahiert und dann die wässerige Lösung zur Verdampfung von gelöstem Äther im Vakuum behandelt.
Ähnliche Vaccine, wie die in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen, können bereitet werden, indem man an Stelle des nach den vorstehenden Beispielen verwendeten Stammes UC76 von Staphylococcus aureus, zur Beimpfung des Nährmediums einen der folgenden Stämme von Staphylococcus aureus verwen- det : Smith, S193N4, H & D, Castellani, MCD138, SK4473, K6, K93 und K93M.
PATENTANSPRÜCHE : I. Verfahren zur Herstellung eines Staphylococcen-Impfstoffes, dadurch gekennzeichnet, dass man die intakten Zellen des Stammes NRRL B-2467, NRRL B-2468, NRRL B-2469, NRRL B-2471, NRRL B-2472, NRRL B-2473, NRRL B-2474, NRRL B-2475, NRRL B-2476 oder NRRL B-2477 von Staphylococcus aureus mit Phenol, welches eine genugende Menge Wasser enthält, um es flüssig zu machen, und einem wässerigen Lösungsmittel, wie Wasser oder einer wässerigen Salzlösung, extrahiert und das Phenol und unlösliches festes Material von der wässerigen Lösung abtrennt, um eine wässerige Lösung zu erhalten, die fähig ist, die Produktion eines schützenden Antikörpers gegen Staphylococcus aureus anzuregen.