DE1910715A1 - Antimikrobielle Faktoren und deren Verwendung - Google Patents
Antimikrobielle Faktoren und deren VerwendungInfo
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Description
1310715
DR. WALTER NlELSCH
Patentanwalt
2 Hamburg 70 28. Feb. 1959
SdiloßstraBe 112 Postfach 10914
Fernruf: 652 97 07
Stanley Drug Products, Inc., Portland t Oregon
(Vereinigte Staaten von Nordamerika)
Antimikrobielle Paktoren und deren Verwendung
Diese Erfindung bezieht sich auf Substanzen, die antimikrobielle Aktivität besitzen und auf Verfahren, um diese Paktoren
zu erhalten·. Nahezu bis jetzt herrschte die Ansicht, daß normale
Haut und Schleimhautoberflächen undurchdringliche Barrieren für den Durchtritt der meisten Mikroorganismen bilden
wurden* Jedoch ist es jetzt bekannt, daß verschiedene
Körpergewebe häufig einer Ansammlung von Mikroorganismen ausgesetzt
sind* Man muß daher die Fähigkeit der Bakterien sich zu vermehren feststellen, wenn sie in die Gewebe durchgedrungen
sind. Es gibt experimentelle Peststellungen, daß in gesunden Säugern die Gewebe selbst Mittel oder antimikrobiel-Ie
Paktoren enthalten, die eine Vermehrung verhindern oder das Überleben der Mikroorganismen selbst.
Studien an normalen menschlichen Geweben zeigen, daß solche Gewebe verschiedene Substanzen enthalten, die antimikrobiologische
Wirkungen besitsen«, Untersuchungen dieser Art sind in unseren Laboratorien über 25 Jahre lang durchgeführt worden.
Diese Arbeiten haben ergeben, daß in tierischen Geweben nicht spezifische Materialien anwesend sind. Extrakte aus
Rindergehirn und der Rindermilz sind seit langem - wie auch andere Organe und Gewebe - für Forschungsuntersuchungen verwendet
worden.
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Nutini und Lynch berichten in Nature, Band 156, 194-5, Seite
419 und im Journal of Bacteriology, Band 52, 1946, Seite 681,
daß rohe Extrakte aus Rindergehirn, wenn diese prophylaktisch
in vivo verabreicht wurden, ganz ausgezeichnete Schutzgrade bei der Maus gegen Staphylokokkeninfektionen erzielten. Der
gleiche Extrakt wurde auch als gut therapeutisch wirksam festgestellt. Wenn der Extrakt in vitro benutzt wurde, wurde
berichtet, daß er die gelbe B Varietät (virulent) in eine avirulente weiße R Type umwandelte.
Selbst solche Arbeiten mit Antistaphylokokkenfalcboren sind im Gehirn und in der Milz von Säugern seit über 20 Jahren durchgeführt
worden, aber unsere Kenntnis in diesem Gebiet ist unbefriedigend geblieben. Tatsächlich ist das ganze Gebiet der
Grundmechanismen der Virulenz, Pathogenität und die eng im
Zusammenhang stehenden Aspekte der Wirts -Parasiten Beziehungen bei Staphylokokken und ähnlichen Infektionen,
wie Streptokokken-Infektionen,noch größtenteils unverständlich
und zeigt eine riesige Varietät von Problemen. Viele von diesen sind bis jetzt spekulativ oder teleologisch geblieben.
Selbst die Fähigkeit der alkoholisch niedergeschlagenen Extrakte des Rindergehirns bei der prophylaktischen und therapeutischen
Behandlung von Staphylokokkeninfektionen ist· bestätigt worden, jedoch verschiedene andere Materialien, diein
dem rohen Extrakt zusammen mit den aktiven Hauptbestandteilen anwesend sind, verhindern ihren breiten Gebrauch.
Viele Versuche sind durchgeführt worrden, um die rohen Extrakte
zu fraktionieren und den aktiven Hauptbestandteil zu isolieren. Direkte oder indirekte Lösungsmittelextraktionsmethoden
sind benutzt worden, aber die Ergebnisse sind widersprechend und die doppelte Durchführung der Arbeit ist sehr
schwierig. Da Äther, Chloroform, Pyridin und Phenol als Lösungsmittel häufig benutzt wurden, besitzt die Lösungsmittelextraktion
den Nachteil, daß verschiedene benötigte
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Lösungsmittel später Toxizitätspr-oblernc aufwerfen. In der
Vergangenheit sind die Fraktionen mit toxischan Mengen des
Lösungsmittels verunreinigt gewesene Aus diesem Grunde ist
die Lösungsmittelextraktion nur teilweise erfolgreich gewesen,* Die Methoden sind auch im einzelnen allzu sy sterne.;, „sch und
fraglich, um kommerzielle -Verwendbarkeit zu besitzen.
Viel Arbeit bei der Isolierung des aktiven Hauptbestandteiles aus tierischen Zeilgewebsextrakten wurde für die Verwendung
von Jonenaustauscherharzen geleistet. Diese Arbeitsweise hat
jedoch nur zu einem begrenzten Erfolg geführt. Einer der Nachteile der Jonenaustauscherharze beruht darauf, daß ihre
Verwendbarkeit primär auf Unterschieden in elektrischen Ladungen der zu trennenden Substanzen beruht, jedoch erscheint
ein hoher Trennungsauflösungsgrad bei der Anwendung von Gewebeextrakten nicht zu erreichen zu sein. Aktive Fraktionen
konnten abgetrennt werden, aber eine weitere Reinigung war noch erforderlich. Jedoch die Entfernung von in den Fraktionen
vorhandenen Substanzen ist schwierig gewesen. Einige anwesende Bestandteile in den Fraktionen müssen für die Experimentaltiere
als gesundheitsschädlich angesehen werden und sie scheinen die antimikrobielle Aktivität der Fraktion zu maskieren.
Hieraus ist ersichtlich, daß aufgrund der Komplexität der Gehirn- und Milzextrakte aktive Fraktionen nicht aus diesen
mit einem genügenden Präzisionsgrad isoliert worden sind, um die Öffentlichkeit damit zu beliefern.
Rohe Gehirn- oder Milz-Alkoholextrakte, obwohl als wirksam
beschrieben, sind nicht vollständig als aktive Wirkstoffe mit antimikrobieller Aktivität brauchbar. Wenn sie benutzt v/erden,
sind große Dosen erforderlich, zum Beispiel mehr als 500 mg.
Zusätzlich sind Schwankungen zwischen den Ansätzen an Gehirnextrakten festgestellt worden. Aufgrund ihrer komplexen
chemischen Nr.tur schwanken die Ergebnisse von Wirt zu Wirt.
Aus diesem Grunde sind sie nicht genügend sicher für die Verabreichung. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein · ■
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_ 4- —
ungewöhnlich konzentrierter und damit weniger chemisch komplexer antimikrobieller Faktor, wobei der Faktor Z enthalten
ist, aus dem Alkoholextrakt aus Säugergehirn oder Säugermilz durch Gelfiltration des rohen Extraktes erhalten.
Der Faktor ist besonders gegen Kokken- und Bazillen -Infelc~ tionen wirksam.
Es ist angenommen worden in Bezug auf Jonenaustauscherharze, daß diese Materialien Fraktionen auf der Basis ihrer Ladungen selektiv auswählen. Gelfiltrationsharze verwenden ein
vollständig verschiedenes Prinzip der Trennung. Im Prinzip arbeiten sie als Molekularsiebe; dies bedeutet, sie gestatten
den Durchtritt von Materialien durch ein Harzbett auf der Basis ihrer Molekulargewichte. Im Prinzip kann gesagt werden,
daß die Gelfiltrationsharze wie Siebe in umgekehrter Weise arbeiten. Die größeren Moleküle werden von der Gelbasis ausgeschlossen
und gehen durch diese unverzüglich durch, wäh- ' rend die kleineren Teilchen durch das Gel festgehalten und in
der Reihenfolge gemäß ihren abfallenden Molekulargewichten abgegeben werden. Da die Gele nicht ionischer Natur sind,
können sie für alle Materialien, gleich ob sie kationisch, anionisch oder nichtionisch sind, verwendet werden.
Die Gelfiltration ist eine bekannte Methode für die Fraktionierung
von Substanzen in wäßrigen Losungen. Sie wird bei jeder Temperatur, Zimmertemperaturen und mit jedem der leicht
erhältlichen Gele durchgeführt. Diese Gele bestehen aus hydrophilen Ketten, die vernetzt sind. Sie sind frei von ionischen
Gruppen und der polare Charakter hängt meist mit dem hohen Gehalt an Hydroxylgruppen zusammen. Trotzdem die Gele was- "
serunlöslich sind, besitzen die Gele ein beträchtliches Schwellungsvermögen. Makromoleküle werden von der Gelphase
vollständig ausgeschlossen und gehen ohne Retention hindurch. Jedoch Substanzen von niedrigem oder mittlerem Molekulargewicht
durchdringen die Gelteilchen in einem Ausmaß, welches in den meisten Fällen durch ihre Molekularabmessungen und den
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Vornetzungsgrad des Gels bestimmt wird. Das am häufigsten
verwendete Gel ist ein Dextrangel, welches durch Vernetzen von Dextran in solcher Weise hergestellt ist, daß die PoIysaccharidketten
ein makromolekulares Netzwerk von großer Stabilität bilden. Andere hydrophile Gele sind erhältlich, die
zum Beispiel von Stärke und Polyvinylalkohol stammenβ
Gegenstand der Erfindung ist ein antimikrobieller Faktor Z,
wobei dieser Faktor eine neutrale Fraktion mit einem Molekulargewichtsbereich von 1000 bis 2000 ist und aus von Säugern
stammenden Gehirn- und Milz-Alkoholextrakten durch Gelfiltration vorliegt und die Fraktion unlöslich in Wasser, löslich
in angesäuertem V/asser ist und im wesentlichen ein Galactocorebrosid
in seiner Zusammensetzung darstellt.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform ist der Faktor Z aus der Fraktionierung durch Gelfiltration eines Ablaufes aus der
Elution von Holz- oder Knochenkohle durch angesäuertes Wasser des Alkoholextraktes stammend, wobei der Faktor Z im wäßrigen
Elubant aus dem Gelfiltrationsharz mit einem pH-Wert in einem Bereich von 4- bis 5 in dem Elutionsabschnitt durch eine pH-Kurve
bestimmt worden ist.
Eine speziellere Ausführungsform umfaßt den Faktor gemäß der vorstehend genannten Ausführungsform, wobei der Ablauf das
Eluat ist, welches von der Elution der Holz- oder Knochenkohle stammt.
Eine weitere Ausführungsform beinhaltet den Faktor gemäß der
genannten speziellen Ausführungsform, wobei der Ablauf ein wioderaufgelöster Rückstand ist, der aus dem Holz- oder
Knachonkohle-Eluat bei einem neutralen pH-Wert ausgefällt
wurde.
Die Erfindung betrifft auch den Faktor gemäß der zuletzt genannten
Ausführungsform im Gemisch mit einem flüssigen
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BAD
pharmazeutischen Verdünnungsmittel zur Verwendung als injizierbare
Flüssigkeit.
Die Erfindung umfaßt auch den Paktor in zur Trockne eingeengter
Form und mit einem festen pharmazeutischen Verdün- . nungsmittel vermischt, zur.Verwendung als Tablette,
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des Faktors in pharmazeutisch wirksamen Dosen als Linderungsmittel
für Säuger zur Herabsetzung der Beschwerden bei Kokkenoder Bazilleninfektionen.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Isolierung des antimikrobiellen Faktors Z, dadurch gekennzeichnet,
daß man rohe Alkoholextrakte aus dem Gehirn oder der Milz von Säugern einer Gelfiltration unterwirft und den Faktor, hauptsächlich
aus Glactocerebrosid bestehend, als neutrale Fraktion mit einem Molekulargewichtsbereich von 1000 bis 2000
isoliert.
Eine speziolle Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet,
daß der rohe Alkoholexträct mit einem Absorbens zwecks Beladung mit den antimikrobiellen Fektoren behandelt
wird und das beladene Absorbens mit angesäuertem Wp.sser zv/ecks Entladung ausgewaschen und der saure Ablauf der G'elfiltration
unterworfen wird.
Eine speziellere Ausführungsform der vorstehenden Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß als Absorbens Aktivkohle oder
oin amorphes Silikat eingesetzt wird.
Eine weitere spezielle Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß das beladene Absorbens zur Entfernung
von wasserlöslichen Verunreinigungen mit Wasser gewaschen und dann das beladene Absorbens mit einem
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fettlösenden organischen Lösungsmittel zur Entfernung unerwünschter
Fette behandelt und danach das beladene Absorbens durch Zugabe von angesäuertem Wasser entladen wird.
Eine weitere spezielle Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß das zur Entladung des belaäenen
Absorbens verwendete angesäuerte Wasser vor der Gelfiltration so lange mit Alkali versetzt wird, bis der antimikrobielle
Faktor vollständig ausgefällt ist.
Der Alkoholextrakt, gewöhnlich als roher Gehirnextrakt bezeichnet,
dient als Basis zum Vergleich und seine Herstellung soll nun erläutert werden.
Der benutzte rohe Rindergehirnextrakt wurde aus frisch.erhaltenem
Gehirn eines örtlichen Schlachthofes hergestellt. Nach Entfernen der einhüllenden Hirnhaut (Pia Mater) wurde es von
anhängenden Blutgerinnseln durch Waschen befreit und in einem Fleischzerkleinerer homogenisiert. Es wurde dann mit destilliertem
Wasser im Verhältnis 1 kg Gehirn : 1 1 destilliertem Wasser vermischt und 20 bis 24· Stunden im Kälteraum (2~4° C)
gelagert. Am Ende dieses Abschnittes wurde der wäßrige Extrakt unter leichtem Druck durch Käsefiltertuch filtriert. Zur vollständigen
Extraktion wurde der Rückstand bei 2500 Umdrehungen/Min.
20 Minuten zentrifugiert. Der wäßrige Extrakt wurde dann durch Zugabe von ausreichenden Mengen 95#igem Äthylalkohol
(etwa 3 Liter Extrakt : 16 Liter 95#igem Alkohol) deproteinisiert,
wodurch eine Lösung mit zuletzt einer Konzentration von 80$ Alkohol erhalten wurde. Diese Lösung wurde
sorgfältig gemischt durch Schütteln in sich wiederholenden Zeitabständen über einen Zeitraum von 25 Stunden bei Raumtemperatur.
Es wurde dann mittels Vakuum filtriert durch ein Whatmann-Filter Nr. 1 und der Alkohol unter Anlegen von
Vakuum bei 50 bis 55° C abdestilliert. Das alkoholfreie Konzentrat
wurde dann mit Gelite (Filterhilfsmittel auf
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Kieselgurbasis) vermischt und auf 70 bis 80° C erhitzt und
durch eine Celite-Filterschicht filtriert. Das Filtrat wurde im Eisschrank aufbewahrt und die Filtration durch Celite-Schichten
solange fortgesetzt, bis ein klares, goldfarbiges Produkt erhalten wurde. Der pH-Wert dieses Extraktes wurde
auf 7>0 eingestellt,durch Seitz-Filtration sterilisiert und
unter Einfrieren in sterilen Serumfla'schen aufbewahrt. Die zu
verabreichenden Vclumenmengen an die Versuchstiere wurden bestimmt,
indem das Trockengewicht Jedes Ansatzes ermittelt · wurde.
Die rohen Zellgewebeextrakte, gemäß der vorstehend beschriebenen
Arbeitsweise erhalten, bestehen aus einer komplexen Mischung aus biologischen Materialien. Als solche sind sie
nicht ein vollständig befriedigendes Ausgangsmaterial für die Art des hierin empfohlenen Fraktionierverfahrens. Es wurde*
deshalb entschieden, eine reinere Fraktion zu benutzen. Vorzugsweise wurde der rohe Extrakt durch ein Bett, welches
hauptsächlich aus Absorbentien wie Holz- oder Knochenkohle oder amorphem Silikat bestand, durchgegeben, wobei die aktiven
Inhaltsstoffe am Absorbens verblieben. Die aktiven Inhaltsstoffe wurden dann mit angesäuertem Wasser eluiert
und den Ablauf ließ man durch ein Gelfiltrationsharz durch-' sickern.
Holz- oder Knochenkohle sind in der Vergangenheit benutzt worden, um Verunreinigungen aus rohen Gewebeextrakten zu entfernen»
Wenn diese Materialien jeäoch in vivo getestet wurden,
wurde festgestellt, daß die Holz- oder Knochenkohlenfiltrate
keine antimikrobielle Aktivität im Vergleich zum Ausgangsmaterial besaßen. Hierbei ist die Tatsache übersehen worden,
daß diese aktive, gereinigtere Fraktion als Rückstand an der Kohle festgehalten worden war. Um dies zu verdeutlichen, wird
das folgende Arbeitsverfahren für die Herstellung des Kohleablaufes aus rohem Gehirn oder roher Milz, wobei die Arbeitsweise
ebenfalls unabhängig von Temperatur und Druck ist,
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wiedergegeben;
Ein Volumen roher Gewebeextrakt wurde in einen Erlenmeyerkolben gegeben und 1/10 Teil Aktivkohle (Norite A) hinzugefügt» Die
Mischung" wurde dann gut durchgerührt und in eine Schüttelmaschine eingespannt und für 15 Minuten mit 220 Ausschlägen
pro Minute geschüttelt. Die erhaltene Suspension wurde dann unter Vakuumanwendung filtriert, um den flüssigen Anteil abzutrennen.
Dann wurde der Aktivkohlekuchen mit dem halben Volumen Wasser ausgewaschen, um so viel als möglich des wasserlöslichen
Materials zu entfernen. Die dritte Behandlungsstufe beinhaltet das Waschen der Aktivkohle mit einem geeigneten organischen
Lösungsmittel, um unerwünschte Fettstoffe zu entfernen. Zu diesem Zweck wurde ein Gemisch Äthylalkohol-Diäthyläther (1:1)
verwendet. Hiervon wurde ein Volumen dieses Gemisches durch den Aktivkohlekuchen gegeben und durch Anlegen von Vakuum abgesaugt.
Wenn an der Aktivkohle durch den Geruch kein organisches Lösungsmittel mehr festgestellt werden konnte, wurde die Aktivkohle
allmählich mit einem Volumen N/50 HCl und mit einem halben Volumen N/10 HCl gewaschen. In der Endstufe wurde die Aktivkohle
mit einem Volumen Wasser nachgewaschene
Um sicherzustellen, die Fraktion der vorliegenden Erfindung von dem Aktivkohle-Ablauf zu erhalten, wurde die Gelfiltration dieser
Stufe angeschlossen. Jedoch wurde im Laufe der Isolierung von Fraktionen mit aktiven Faktoren eine wünschenswerte Zwischenstufe
festgestellt. Da der pH-Wert von einigen Fraktionen zu niedrig für eine Einbringung in die Tiere war, wurde der pH-Wert
auf Neutralität eingestellt. Hierbei wurde festgestellt, daß zu diesem Zeitpunkt ein bräunlich flockiger Niederschlag
bei der Annäherung des pH an 7}0 erschien. Beim sauren pH ist
diese Fraktion eine farblose, klare Lösung und besitzt einen Geruch, der dem Schwefelwasserstoff ähnlich ist. Venn die Lösung
den Neutralpunkt erreicht, erscheint ein gelber flockiger
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Wiederschlag und der Geruch wechselt vollständig. Bei einem Versuch, alles unlösliche.Material zu entfernen, wurde ein
Überschuß an Natriumhydroxyd hinzugefügt. Die unlösliche Substanz wurde durch Zentrifugieren entfernt, mit Äthanol-Äthergemisch
(9:1) gewaschen und nachzentrifugiert. Die Ausbeute an dieser Substanz war sehr klein im Vergleich zum Ausgangsmaterial,
annähernd etwa 1 Prozent. Ein Teil dieses Materials wurde für in vivo-Versuche benutzt, um festzustellen, ob es
eine Antistaphylokokken-Aktivität besitzen würde. Die Probe aus einem rohen Milzextrakt hergestellt, wurde an eine Gruppe
weiblicher C3H/HeJ Mäuse mit einem Altersbereich von 19 bis 21 Wochen verabreicht. Um das Material zu lösen wurde es in
N/10 HCl gebracht und die Tiere erhielten jedes 0,1 ml, wobei dies 1,0 mg des festen Materials entsprach. Die Verabreichung
wurde für eine Dreitagesperiode fortgesetzt, während sie am
4-, Tag eine Impfung von 0,5 ml einer (62$ Lichtdurchlässigkeit)
Original-Mikroorganismen-Suspension erhielten. Die folgenden Ergebnisse wurden festgestellt.
Getestete Fraktion Zahl der Prozentzahl der Sterblich-
Tiere keit in Stunden nach der Impfung
24- 48 72 96 120
unbehandelt (Kontrolle) 10 50 70 80 80 80
behandelt 10 0 0 0 0 0
Das Material wurde nachgetestet, um seine Aktivität zu bestimmen. Bei dieser Versuchsreihe wurden nämlich C3H/HeJ männliche
Mäuse im Alter von 24- bis 26 Wochen mit der Probe, wie schon
vorstehend beschrieben, behandelt. Sie wurden mit einer Original-Mikroorganismen-Suspension
(60$ Lichtdurchlässigkeit) subkutan beimpft. Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe zeigt Tabelle
2,
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ORIGINAL INSPECTED
Tabelle | 2 | Prozentzahl dor Sterblich keit in Stunden nach der Impfung |
72 | 96 120 | |
Getestete Fraktion | Zahl der Tiere |
• 24- 4-8 | 80 20 |
80 80 20 20 |
|
50 70 0 20 |
|||||
Kontrolle behandelt |
10 10 |
Aus den vorstehenden Ergebnissen kann geschlossen werden, daß wir nun ein viel besser geeignetes Material für die letzte
Fertigungsstufe des aktiven Faktors erhalten hatten. Es behielt die gleiche Aktivität wie das Rohmaterial und es besaß viele
der Charakteristiken, um identifizierbar mit den bisher untersuchten Substanzen zu sein.
Bei der Durchführung dieser Studien wurden Boontucky und
schweizer Albinomäuse, beide männlich und weiblich, ständig benutzt mit Ausnahme von einigen wenigen Experimenten für
Vergleichszwecke. Die Tiere waren zwischen 10 und 30 Wochen
alt und besaßen ein Durchschnittsgewicht von 20 bis 25 g. Diese
Tiere wurden meistens mit der Rockland-Diät aufgezogen und gehalten.
Alle Studien, beides in vivo und in vitro, wurden unter Verwendung
eines penicillinresistenten Stammes Staphylococcus aureus Original durchgeführt, der erstmalig von einer akuten
Tonsillitis isoliert worden war und in unseren Laboratorien seit Jahren gezüchtet worden ist. Jedoch wurden auch äquivalente
Ergebnisse erhalten, wenn Bazillen wie Salmonella typhi benutzt wurden. Der Staphylococcus aureus Stamm wurde.in der
lyophilisierten Form aufbewahrt und bei 0° C gelagert. Die lyophilisierte Probe wurde erst auf sterilen Difco SA 110
Schalen kultiviert und dann in Schrägstellung auf das gleiche Medium überführt. Diese Schrägansätze wurden nach 24- Stunden
Wachstum unter Abkühlung aufbewahrt (annähernd 1° C wie die Ausgangskultur). Die Behandlung bestand in einer subkutanen
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Injektion der Tiere. Die Endstufe in dem Verfahren verdeutlicht
der folgende Abschnitt.
30 g Dextrangel (Sephadex G-25 von der Firma Pharmacia, Uppsala
(Schweden)) wurde durch die Standardbehandlung mit Natriumchlorid aktiviert und chloridfrei gewaschen. Nachdem die Säule
ihr Gleichgewicht erreicht hatte, wurde eine kleine Filterpapierscheibe auf die obere Fläche des Harzbettes aufgelegt und
die Probe eingeführt. Die Konzentration der Probe wurde immer bei 10 mg/pro ml in N/10 HCl aufrechterhalten und das Volumen
reichte von 15 bis 25 ml in Abhängigkeit von der Höhe des
Harzbettes. Die Probe ließ man durch das Harz hindurchsickern und nachdem diese vollständig im Hr.rzbett vorlag, wurde mit
destilliertem Wasser eluiert. Wenn die Elution beendet war,-wurde die Säule mit 2#iger HCl ausgewaschen, um jegliches gefärbte
Material zu entfernen, welches in der Säule verblieben war und schließlich mit destilliertem Wasser nachgewaschen.
Danach war die Säule wieder zum Gebrauch bereit.
Im früheren Abschnitt der Arbeit mit dem Dextrangelharz (Sephadex)
wurde das Zusammensetzungsverhältnis in dem Elutionsabschnitt
mittels der pH-Kurve bestimmt, was schwierig durchzuführen war« Es wurde jedoch gefunden,' daß, sobald man die Durchflußgeschwindigkeit
beherrschte, dieses Problem nicht mehr " · existierte. Es wurde festgestellt, daß die langsamere Elutionszeit
eine beträchlich größere Wiederauflösung der Materialien ergab, eine Tatsache, die große Bedeutung für die Isolationsstudien besitzt. Das gewünschte Verhältnis sollte ein Volumen
Wasser zu 5 bis 15 Volumina des Harzes pro Stunde betragen bis
die Elution vollständig erfolgt ist, wie dies durch den pH angezeigt ist.
Bei der Elution wurde das Viertel des Porenvolumens mit diesen Fraktionen erhalten, wenn der pH-Bereich zwischen 4 und 5 lag.
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Die Molekulargewichte dieser Materialien lagen in dem Bereich von 1OOO bis 2000. Es wurde festgestellt, daß dies die aktive
Fraktion war, wie dies aus ihren Eigenschaften sich ergibt,
Untersuchungen in vivo mit der Fraktion, die von der GeIfiltration
erhalten wurde, zeigte einen scharfen Schnitt in der Trennung des aktiven Materials von dem Rest der anwesenden
Substanzen. Die Resultate waren aus verschiedenen Gründen ganz ausgezeichnet. Zuerst wurden die Materialien mit einem Dosierungsspiegelwert
von nicht mehr als 1 mg erprobt, wobei der erreichte Schutz bei den Tieren von 100% bis 8C$ reichte. Diese
Angaben geben die Ergebnisse wieder, die mit Materialien erhalten worden waren, die wiederholt aus Hirn beziehungsweise Milz
isoliert worden waren. Die Tiere, die überlebten, zeigten in vielen Fällen keinerlei Zeichen von Infektion, selbst bei so
früher, wie einer 2 Tage Nachimpfung und in einigen Fällen, in denen sich Läsionen von der Infektion ergeben hatten, heilten
diese innerhalb von 5 bis 6 Tagen vollständig aus. Die äußerst aktive Fraktion dieser Erfindung ist das wäßrige Elutant aus
dem Gelfiltrationsharz mit einem pH-Bereich von 4—5>
in dem Elutionsabschnitt durch eine pH-Kurve bestimmt. Das Konzentrat
ist eine neutrale Fraktion, die unlöslich in Wasser, aber löslich in angesäuertem V/asser ist. Es ist hauptsächlich Galactocerebrosid
in der Zusammensetzung und besitzt ein Molekulargewicht von etwa 1.500.
Der Faktor Z besitzt, wie bereits nachgewiesen, ungewöhnliche prophylaktische Werte und vermindert die Zwischenfälle aus
schädlichen Effekten von Kokkeninfektionen. Es wird empfohlen, daß der Faktor periodisch oral eingenommen werden kann als
Tablette, etwa wöchentlich oder monatlich in einer Menge von 100 bis 500 mg Dosen, vorzugsweise 150 bis 250 mg Dosen. Besonders
vor Zeitabschnitten, in denen die Kontaktgefahr mit Staphylokokken- oder Streptokokkeninfektionen erhöht ist, wie
vor der Einlieferung in ein Hospital, können Injektionen verabreicht werden. Es ist möglich den Faktor mit Wasser,
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Pflanzenöl, Monoglycerid- oder Diglycerid-Trägern für Injektionszwecke
zu kombinieren. Natriumchlorid kann Verwendung finden, um die Lösung isotonisch einzustellen. Zusätzlich kann
das Wasser entfernt werden, wenn es erforderlich ist, durch Abdestillation unter vermindertem Druck bei etwa 40° C, wobei
das getrocknete Material einen Festkörper bildet, der zur Herstellung
von Tabletten geeignet ist. Geeignete Farbmittel, Gleitmittel und Bindemittel können zusammen mit festem pharmazeutischem
Trägerstoff verarbeitet werden, um Tabletten oder Kapseln zu bilden. Geeignete Träger sind Stärke, Milchzucker,
Fruchtzucker und andere feste pharmazeutische Verdünnungsmit"
tel.
Tabelle 3 zeigt eine Zusammenstellung einer Anzahl von prophylaktischen
Behandlungen, die mit verschiedenen Proben des Faktors Z, der nach der vorliegenden Erfindung erhalten worden
ist, durchgeführt worden sind. In diesen Versuchsreihen wurden alle Behandlungen - wie schon früher beschrieben - ausgeführt
und beides, Behandlung und Beimpfung wurden subkutan durchgeführt. Die Gesamtdosierung pro Tier betrug in den meisten Fällen
0,3 mg, jedoch in anderen Fällen war sie niedriger, nämlich bei 0,2 mg pro Tier.
getestete % Lichtdurch- Zahl derProzentzahl der Sterblichkeit
Fraktion lässigkeit der'Tiere . in Tagen nach der Impfung
Organismen- ' - - " suspension .
Kontrolle | 62 |
Aktiv+ | 62 |
Kontrolle | 60 |
Aktiv zk~- | 60 |
Kontrolle | 55 |
Aktiv+11 | 55 |
Akt i viU' | 55 |
1 | 2 | 3 | 4· | 5 | |
10 | 60 | 60 | 60 | 70 | 70 |
10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
10 | 70 | 90 | 90 | 90 | 90 |
10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
10 | 60 | 80 | 80 | 80 | 90 |
10 | 0 | O | 10 | 10 | 10 |
10 | 0 | 10 | 10 | 10 | 10 |
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■ύέ. hergestellt aus rohem Hdrnextrakt
+ hergestellt aus rohem Malzextrakt " Gesamtdosis 0,2 mg
Es ist ersichtlich aus den vorstehenden Ausführungen, daß durch
diese Erfindung ein sehr wirksames Verfahren zum Herabsetzen der Schädigungen von Kokkeninfektionen bei Säugern aufgefunden
worden ist. Dies wird durchgeführt, indem man den Säuger durch
periodische Verabreichung mit dem beschriebenen Faktor versorgt· Die Herstellung der Fraktion gemäß der praktischen Ausführung
der Erfindung wird nun im folgenden noch erläutert werden und verdeutlicht alle Stufen in einem einzigen Beispiel.
Roher Milzextrakt (100 ml mit 1300 mg Extraktsubstanz) wird
mit 10 g Aktivkohle durchgerührt und filtriert. Das Filträt wird weggeworfen. Die Aktivkohle wird viermal mit je 25 ml
einer Mischung Diäthyläther : Alkohol 1 : 1 ausgewaschen. Die Auswaschlösung wird weggeworfen. Die Aktivkohle wird dann
mit 150 ml 0,1 N HCl gewaschen und filtriert. Die Aktivkohle
wird weggeworfen. Zu dem Filtrat wird ein Überschuß an Natriumhydroxydlösung
gegeben bis die Ausfällung vollständig ist. Die Suspension wird zentrifugiert und das Überstehende weggeworfen.
Der Rückstand wird mit Diäthyläther-Äthanolgemisch 1 : 1 gewaschen und die Auswaschlösung weggeworfen. Der Rückstand
wird in einem Exsikkator getrocknet. Die Ausbeute an dieser Stelle beträgt 70 bis 100 mg oder 5 bis 7#>
aber das Material ist in etwa 1/40 der Konzentration des Origiralrohextraktes
angereichert (etwa 40-fache Konzentration der Aktivität bezogen auf das Gewicht). Weitere Reinigung wird erzielt
durch Auflösen von 250 mg dieses Materials in 1N HCl, wobei
eine Konzentration von 25 mg pro ml erhalten wird. Man läßt
diese Lösung durch eine Säule mit der Abmessung 12 mm χ 33 cm
mit Dextrangel (Sephadex G-25) durchlaufen. Die Säule wird mit Wasser eluiert und die Fraktionen werden in einem
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Fraktionssammler aufgefangen. Der pH der Fraktionen wird bestimmt und das aktive Material befindet sich in den Fraktionen
mit einem pH-Bereich von 4,5 bis 4,6. Die Ausbeute beträgt etwa 15 mg aus 250 mg teilweise gereinigtem Material oder
aus etwa 3900 mg Rohextrakt in einer Gesamtausbeute von etwa
0,4$. Dieses Material ist aktiv mit etwa 1/10 der Dosierung
der vorhergehenden Fraktion und äquivalent zu einer etwa 400-fachen Gesamterhöhung der Aktivität auf der Gewichtsbasis.
In Tabelle 4 werden Resultate wiedergegeben, wenn Tiere mit einer Suspension von Staphylococcus aureus (60$ Lichtdurch—
lässigkeit) nach einer Behandlung mit Fraktionen behandelt, worden sind, die gemäß Arbeitsweise D erhalten worden sind.
Quelle 'Totaldcsis der mg,
Fraktionen
Zahl der Prozentzahl der Sterblich-Mäuse
keit in Tagen nach der Impfung
0 | ,3 | 10 | 1 | 2 | 3 . | 4 | 5 | |
Kontrolle | 10 | 60 | 60 | 60 | 70 | 70 | ||
Milz · | 0 | ,3 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Kontrolle | 10 | 70 | 90 | 90 | 90 | 90 | ||
Milz | 0 | ,2 | 10 | 0 | 10 | 10 | 10 | 10 |
Kontrolle | 0 | ,2 | 10 | 60 | 80 | 80 | 80 | 90 |
Milz | 10 | 0 | 0 | 10 | 10 | 10 | ||
Gehirn | 0 | 10 | 10 | 10 | 10 | |||
Somit ist ein antimikrobieller Faktor aus rohen Gewebeextrakten
isoliert worden, der hoch aktiv ist und die letalen Effekte
909841 /U97
unterdrückt , die von Staphylokokken-Infektionen, von Kokken
und Bazillen sich ergeben. Der antimikrobielle Faktor dieser Erfindung zeigte sich bei einigen hundert Tieren als sehr aktiv
bei extrem niedrigen Behandlungsdosierungen und zeigte keine toxischen Effekte bei den Tieren. Ein vorläufiges Experiment
in der Zellgewebeatmung unter Verwendung einer normalen Mäuseleber zeigte keine toxischen Effekte als ein Ergebnis der Inkubation
der Zellgewebe in einem Medium, das dieses Material enthielt, wenn CO2 gemessen wurde. Weil nur eine solch kleine
Menge des Materials benötigt wurde, um den Tieren einen Schutz zu verleihen, wurde gefunden, daß unser Faktor Z tatsächlich
eine reine chemische Verbindung ist', nämlich das Galactocere=-
brosid und es ist in relativ hoher Reinheit erhalten worden. Variationen und Modifikationen in dem Verfahren und bei den
Verwendungen werden dem Fachmann auf dem Gebiet möglich erscheinen. So können die Extraktionen und Filtrationen bei Zimmertemperatur
durchgeführt werden und Druckanwendung ist möglich. Solche Abwandlungen sollen mit in den Schutzumfang dieser
Erfindung fallen.
909841/U9
Claims (12)
1.) Antimikrobieller Faktor Z, wobei dieser Faktor eine neutrale Fraktion mit einem Molekulargewichtsbereich von
1000 bis 2000 ist und aus von Säugern stammenden Gehirn- und Milz-Alkoholextrakten durch Gelfiltration vorliegt
und die Fraktion unlöslich in Wasser, löslich in angesäuertem Wasser ist und im wesentlichen ein Galactocerebrosid
in seiner Zusammensetzung darstellt..
2.) Faktor Z gemäß Anspruch 1, aus der Fraktionierung durch
Gelfiltration eines Ablaufes aus der Elution von Holzoder Knochenkohle durch angesäuertes Wasser des Alkoholextraktes
stammend, wobei der Faktor Z im wäßrigen Elutant aus dem Gelfiltrationsharz mit einem pH-Wert in ·
einem Bereich von 4- bis 5 in dem Elutionsabschnitt durch
eine pH-Kurve bestimmt worden ist.
3.) Faktor gemäß Anspruch 2, worin der Ablauf das Eluat ist,
welches von der Elution der Holz- oder Knochenkohle stammt,
4-.) Faktor gemäß Anspruch 2, worin der Ablauf ein wiederaufgelöster
Rückstand ist, der aus dem Holz- oder Knochenkohle-Eluat bei einem neutralen pH-Wert ausgefällt wurde,
5.) Faktor gemäß Anspruch 4 im Gemisch mit einem flüssigen
pharmazeutischen Verdünnungsmittel zur Verwendung als injizierbare Flüssigkeit.
909841/1497
6.) Faktor gemäß Anspruch 4- in zur Trockne eingeengter Form
und mit einem festen pharmazeutischen Verdünnungsmittel vermischt, zur Verwendung als Tablette.
7.) Verwendung des Faktors gemäß Anspruch 4- in pharmazeutisch wirksamen Dosen als Linderungsmittel für Säuger zur Herabsetzung
der Beschwerden bei Kokken- oder Bazilleninfektionen.
8.) Verfahren zur Isolierung des antimikrobiellen Faktors Z,
dadurch gekennzeichnet, daß man rohe Alkoholextrakte aus dem Gehirn oder der Milz von Säugern einer Gelfiltration
unterwirft und den Faktor,hauptsächlich aus Galactocerebrosid bestehend, als neutrale Fraktion mit einem Molekulargewichtsbereich
von 1000 bis 2000 isoliert.
9.) Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der rohe Alkoholextrakt mit einem Absorbens zwecks Beladung
mit den antimikrobiellen Faktoren behandelt wird und das beladene Absorbens mit angesäuertem Wasser zwecks
Entladung ausgewaschen und der saure Ablauf der Gelfiltration unterworfen wird.
10.) Verfahren nach Anspruch 8 oder 9» dadurch gekennzeichnet,
daß als Absorbens Aktivkohle oder ein amorphes Silikat eingesetzt wird.
11.) Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das beladene Absorbens zur
Entfernung von wasserlöslichen Verunreinigungen mit Wasser gewaschen wird und dann das beladene Absorbens mit einem
fettlösenden organischen Lösungsmittel zur Entfernung unerwünschter
Fette behandelt wird und dann das beladene Absorbens mit angesäuertem Wasser entladen wird.
909841/1497 BAD ORIGINAL
12.) Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 11,
dadurch gekennzeichnet, daß das zur Entladung des beladenen Absorbens verwendete angesäuerte Wasser vor der Gelfiltration
so lange mit Alkali· ^ersetzt wird, bis der antimikrobielle Faktor vollständig ausgefällt vorliegt.
909841/U97
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