DE2923144A1 - Vakzin zur prophylaxe und behandlung von durch trichophyton mentagrophytes hervorgerufenen trichophytien und seine herstellung - Google Patents

Description

Vakzin zur Prophylaxe und Behandlung von durch Trichophyton «entagrophytes hervorgerufenen Trichophytien und seine Herstellung

Die Erfindung betrifft ein neues Yakzin zur veterinärmedizinischen Prophylaxe und Behandlung von durch den Erreger Trichophyton aentagrophytes hervorgerufenen Trichophytien und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Deraatosen von Tieren und darunter die Trichophytie von Pelstieren und Kaninchen sind weltweit verbreitet· Das überstehen der Trichophytie durch die Tiere verschlechtert die Handelsqualit&t der Tellerzeugnisse und erschwert die Zuchtarbeit sowie den Verkauf der Tiere und des Fleische.· in der industriellen Kaninchenzucht. Kranke Tiere sind daneben eine standige Gefahr und insteckungsquelle für das Bedienungspersonal und dessen Kontaktpersonen.

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Von den derzeit verwendeten Bekämpfungsmitteln wird Griseofulvin als bestes antimykotisches Antibiotikum angesehen, dessen Verwendung zufriedenstellende Resultate bei Dermatosen von Pelztieren und Kaninchen liefert. Aufgrund des Itastands, daß die Bäume, in denen entsprechende Tiere gehalten werden, durch resistente Erreger von Dermatosen infiziert sind, unterliegen die Tiere in infizierten Betrieben einer ständigen Ansteckungsgefahr. In derartigen Fällen kann eine vorbeugende Behandlung Bit Griseofulvin nur bei täglicher Applikation dieses Präparats während des ganzen Lebens der Tiere gewährleistet werden, was praktisch undurchführbar ist, da hierzu bedeutende Mengen an Griseofulvin erforderlich wären, was diesen Weg zur Bekämpfung von Bermatosen wirtschaftlich unvertretbar ■acht.

Es ist bereits ein Vaksin zur Prophylaxe der Trichophytie von Rindern bekannt, das eine Suspension von Mikrokonidien des immunogenen Stamms Trihhophyton faviforae var. album (T. verrucosum) Br. 150 in einer sterilen physiologischen Losung ait einer Konzentration von 6 bis 9 Hillionen pro ■1 der physiologischen Lösung darstellt.

Sas Verfahren zur Herstellung dieses Vakzine besteht darin, daß aan eine immunogene Kultur von Trichophyton faviforme var. album Br. 150 auf einen festen oder flüssigen Hähmediu* bei 26 bis 28 ⁰C 12 bis 15 lage bis zur optimalen Speicherung der Hikrokonidien dieser Kultur züchtet, dann die Biomasse abtrennt, diese bis zur Erzielung einer Suspension von Einselzellen des Mikroorganismus homogenisiert und das Endprodukt abtrennt (vgl die FR-PS 2 189 022 sowie den SU-Urheberschein 572864-1).

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Dieses Vaksin findet lediglich sur Prophylaxe der Trichophytie des fiindes Verwendung und kann nicht xur Prophylaxe und Behandlung von Trichophytien eingesetzt werden, die durch Erreger einer anderen ixt, beispielsweise durch Trichophyton «entagrophytes, hervorgerufen sind.

In der Literatur fehlen bislang Ingaben über Mittel xur apexifischen Prophylaxe und Behandlung von Trichophytien, die durch den Erreger Trichophyton mentagrophytes hervorgerufen werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe sugrunde, durch Auswahl und Untersuchung anderer Trichophytonkulturen ein Taksin xur Prophylaxe und Behandlung der durch den Erreger Trichophyton «entagrophytes hervorgerufenen Trichophytie xu entwickeln·

Die Aufgabe wird anspruchsgea&fi gelöst·

Das erfindungsgemiße Takxin sur Prophylaxe und Behandlung der durch Trichophyton «entagrophytes hervorgerufenen Trichophytie stellt eine Suspension von Hikrokonidien eines iaaunogenen Staus der Art Trichophyton «entagrophytes in einer physiologischen Lösung mit eine· pH-Wert von 6,2 bis 7,0 in einer Menge von 15 bis 25 Hillionen pro el der physiologischen Lösung, darunter 8 bis 25 Millionen lebensfähige Mikrokonidien, dar·

Zur Erhaltung der Lebensfähigkeit und der Iuunogenität der Mikrokonidien enthält das Yakxin auch ein Schutxaediua «it 10,0 bis 40,0 Gew.-% Sorbit oder Saccharose, 2,0 bis 10,0 Gew,-% Gelatine, Rest Wasser, in einer Menge von 1 »1

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Schutsmedium auf 600 bis 1000 Killionen Kikrokonidien. Das getrocknete Vakzin stellt äußerlich eine graubraune, poröse trockene Hasse dar. Das Vakzin wird beispieleweise in Glasfläschchen von 10 bis 20 al Fassungsvermögen in den Handel gebracht, die jeweils 50, 100 bzw 200 Dosen enthalten.

Fläschchen mit beschädigtem Verschluß ohne Etikette, die Fremdbeimengungen bzw nach der Auflösung nicht zerfallende Hocken enthalten, sind zu verwerfen· Sas verworfene nicht-verwendete Takzin sowie die Fläschchen, in denen es enthalten war, behandelt «an durch 1-stündiges Kochen.

Tor der Applikation verdünnt nan das trockene Yakzin in einen Verhältnis von 1 al Lösungsmittel auf 1 Dosis Vaksin·

Zur Auflösung des Vakzine entnimmt man mit einer sterilen Spritze mit ladel 8 bis 10 ml Lösungsmittel und spritzt dieses unter aseptischen Bedingungen in das Fläschchen mit dem Vaksin ein. Beim Schütteln löst sich das trockene Vaksin schnell auf und bildet eine gleichmäßige Suspension, die man mit der gleichen Spritze in das Flaschchen mit dem Lösungsmittel Überträgt. Das verdünnte Vakzin ist während 2 Stunden nach der Auflösung verwendbar.

Sas Vakzin wird zur Prophylaxe und Behandlung von durch den Erreger Trichophyton mentagrophrtes hervorgerufenen Trichophytien von Felstieren und Kaninchen und anderen Vierarten appliziert. Das Vakzin ist unschädlich und ruft bei gesunden Tieren keine Erkrankung hervor·

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Das Verfahren but Prophylaxe und Behandlung von Trichophytie besteht darin, daß aan den !Fieren das erfindungsgemäße Vakxin intramuskulär auf der Innenseite der Hüfte in einer Dosis von 1 bis 4 al zweimal in einen Zeitabstand von 7 bis 10 Sagen einspritzt. Sie Einspritzstelle desinfiziert aan vorher ait 70 £igem Äthanol. Tor jedes Tier wird eine sterile Nadel verwendet. Spritzen und Nadeln sterilisiert aan durch Kochen. 5 bis 10 Tage nach der zweiten Injektion kann sich bei den Tieren an der Stelle, an der das Vakzin eingespritzt wurde, auf der Haut ein Grind von 5 bis 10 na Durchmesser bilden, das sich nach bis 20 Tagen ablöst.

Die Iaaunitat tritt bei den Tieren 20 bis 25 Tage nach der zweiten Injektion ein. Die Dauer der Immunität beträgt mindestens drei Jahre.

Zur Therapie spritzt aan den an Trichophrtie erkrankten Tieren sowie den ait ihnen in direktem Kontakt stehenden Tieren, die keine klinischen Anzeichen einer Erkrankung haben, das Vakzin ein· Das Vakzin wird ebenfalls zweimal injiziert.

Die therapeutische Wirkung tritt 15 bis 30 Tage nach der zweiten Injektion ein und äußert sich in einer Ablösung der Grinde und in der Wiederherstellung der Haardecke an den befallenen Stellen.

Die Schlachtung der Kaninchen und der Genuß ihres Fleische sind nach 20 Tagen ohne Einschränkung erlaubt. Bei einer Hotschlachtung geiapfter Kaninchen verwendet aan das Fleisch in den ersten 20 Tagen nach der Impfung nach

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allgemeinen Hegeln nach den Herausschneiden der Injektionsstelle·

Bas erfindungsgemäße Vakzin erwies sich bei der Prüfung an Tieren wie Füchsen, Kaninchen und anderen Arten als unschädlich. Es wurde keine negative Wirkung wie etwa eine Verringerung des Appetits, Temperaturerhöhung oder ein Einfluß auf die Reproduktion festgestellt.

Das an »ehr als 324500 Tieren geprüfte erfindungsgemäße Vakzin zeigte einen hohen therapeutischen Effekt, der die Verwendung nekrotisierender Medikamente, die die Qualität des Fells verschlechtern, aueschließt. Sas erfindungsgemäße Vakzin besitzt eine hohe prophylaktische Wirkung von über 99 %.

Die Erfindung gibt ferner ein Verfahren zur Herstellung des Vakzine an.

Beim erfindungsgeaäßen Verfahren zur Herstellung eines Vakzine zur Prophylaxe und Behandlung der durch den Erreger Trichophyton mentagrophytes hervorgerufenen Trichophytie wird eine Pilzkultur auf einem Nährmedium mit Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff sowie biologischen Wirkstoffen bis zur optimalen Speicherung der Hikrokonidien gezüchtet, worauf die erhaltene Biomasse abgetrennt, bis zur Erzielung einer Suspension von Einzelzellen des Mikroorganismus homogenisiert und die erhaltene Suspension anschließend getrocknet wird, worauf das Vakzin resultiert* erfindungsgemäß wird dabei als Pilzkultur eine Kultur von Trichophyton mentagrophytes eingesetzt, die auf dem Hährmedium 15 bis 30 Tage bei einer Temperatur von 26 bis

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28 ⁰C gezüchtet wird.

Zur Erhaltung der Lebensfähigkeit und der Iaaunogenität der Mikrokonidien vermischt man die erhaltene Suspension der einzelnen Zellen des Mlkroorgaoismua Tor der Trocknung alt einem Schutxaediua alt eine« Gehalt von 10,0 bis 40,0 Gew.-% Sorbit oder Saccharose und 2,0 bis 10,0 Gew.-Ji Gelatine, Best Vasser, in einer Menge von 1 al Schutxaediua pro al der obigen Suspension, die 600 bis 1000 Hillionen Mikrokonidien enthält.

Hs Pilskultur verwendet aan sweckaäßigerweise den Staaa Trichophyton nentagrophytes Vr. 135/1963« selektioniert nach dea Verfahren ier stufenweisen gezielten Auswahl besonders schnell wachsender Filikolonien alt reichlicher Speicherung rundlichovaler Mikrokonidien. Dieser neue Staaa ist in der Kulturensammlung des Instituts für experimentelle Veterlnlraedisin der UdSSR hinterlegt und unter der Fuaaer 135/1963 registriert. Er besitzt folgende morphologische Merkaale und physiologische Eigenschaften:

Morphologische Merkaale: Sie reifet 20- bis 25-tägige Kultur weist das Mycel und zahlreiche Mikrokonidien auf. Traubenföraig angeordnete oder an den Seitenzweigen des Mycels sitsende rundlichovale Mikrokonidien koaaen reichlich vor, seltener stabförmige, 1,5 bis 3,5 ja* große Mikrokonidien. Me Sicke des Mycels beträgt 0,8 bis 2,0 yea· Die spiralförmigen Ifyphenranken fehlen. Selten koaaen 3- bis 5-Keaaeraakrokonidien alt stumpfen Enden vor.

Kulturaerkmale: Der Staaa wird auf Vurseagar kultiviert und wächst auch gut auf Glucoseagar nach Sabouraud, also

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Fleisch-Pepton-ftLucoseagar. Beim lupfen ale Suspension auf Würzeagar (pH-Wert 5,6 ois 7,0) bildet sich beim Inkubieren bei 24- bis 28 ⁰C während 5 bis 8 Tagen ein weißer, geschlossener und zusammenhangender dicker Film; am 1Oi bis 25* Sag wird das Filzgeflecht pulvrig und nimmt eine gelbliche Färbung an. Beim Impfen durch Stich in den Kolben bildet sich eine weiße, leicht angehobene mächtige Kolonie, die am 20. bis 30. Sag die gesamte Oberfläche des Mediums einnimmt und pulvrig wird. Auf der Rückseite der Kolonie bildet der Filz eine schwach rotbraune Pigmentation.

Tirulenz: Beim Aufbringen auf skarifizierte Haut der Tiere ruft er eine Schuppung der Epidermis hervor, die nach 15 lagen von selbst abheilt. Sie ist ungefährlich für Tiere, die im Kontakt mit geimpften Tieren stehen, ebenso besteht für mit dem Stamm oder mit immunisierten Tieren umgehende Menschen kein Ansteckungsrisiko·

Beaktoganität: Sie Einspritzung der lebenden Kultur führt bei Tieren nicht zu einem klinischen Erscheinungsbild einer Erkrankung und keinerlei Veränderungen im Gesamtbefinden wie Temperaturanstieg an der Injektionsstelle, Anschwellung oder etwa einer Erhöhung der Gesamt-KSrpertemperatur, auch wird keine Verweigerung der Futteraufnahme festgestellt.

Antigene Eigenschaften: Der Serumtiter der immunisierten Tiere beträgt 1:320 bis 1:1280 (Agglutinationsreaktion).

T^M<>i"^wogene Aktivität» Der Stamm Trichophyton mentagrophy— tee Hr. 135/1963 erzeugt bei der Applikation bei

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Felxtieren void Kaninchen sub Zweck der Immunisierung eine stabile Immunität. Sie Immunität tritt bei geimpften Tieren 20 bis 25 Tage nach der Injektion des Vakzine ein. Me Bauer der Immunität beträgt mindestens drei Jahre.

Das erfindungsgemäfie Verfahren zur Herstellung des Vakzine wird wie folgt durchgeführt:

Bas Verfahren umfaßt folgende Schritte: Herstellung des Hährmediums; Inokulation in flache Matratzenkolben und Züchtung des Filzes; Herstellung des Züchtungsmediums; Abnahme und Zerkleinerung des Mycels; Vereinigung des Homogenisats mit dem Schutsmedium; dosiertes Abfüllen in Fläschchen; lyophilisierung des Materials; Verschließen und Etikettierung der Fläschchen; Eontrolle des Vakzine·

Die Einimpfung der Kultur, die Abnahme und Zerkleinerung des Mycels, die Vereinigung des Homogenisats mit dem Schutzmedium, das Abfüllen in Flaschehen und Verschließen der Fläschchen nach der Trocknung führt man unter Einhaltung strenger Sterilitätsbedingungen in speziellen Boxen mit Zu- und Abluftventilation unter Zufuhr steriler Luft durch.

Als Nährmedium zur Züchtung der Kultur von Trichophyton mentagrophytes dient Vürzeagar. Zur Herstellung des Vürzeagars verwendet man ungehopfte Bierwürze mit einer Acidität xach Terner von 1,9 bis 2,3 °, die man während 3 Tagen einer fraktionierten Sterilisation mit strömendem Dampf während 30 min täglich unterwirft. Die sterilisierte Bierwürze lagert man 30 Tage unter Kühlung auf 4-2 bis +8 °0.

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Die Bierwürze wird mit nicht alkalischem Leitungswasser oder destilliertem Wasser auf einen Gehalt an Kohlenhydraten nach Balling von 7 bis δ % verdünnt und in einen Kochkessel eingegossen; vor der Sterilisation stellt man den pH-Vert auf 7,8 bis 8,2 ein, gibt dann 2,5 Ms 3,0 % Agar-Agar zu, erwärmt bis zur Auflösung des Agars, filtriert durch ein Watte-Kvill-Filter und füllt in sterile Gefäße ab. Danach wird 40 min bei einem Druck von 0,7 at sterilisiert« Hach der Sterilisation soll der pH-Wert des Würzeagars 6,2 bis 6,8 betragen. Die Schichten mit dem Würzeagar hält man nach der Sterilisation zur Kontrolle der Sterilität des Mährmedimas 3 Tage in einem Thermostaten bei einer Temperatur von 26 bzw 37 °C» wonach sie sorgfältig visuell auf Reinheit geprüft werden.

Zur Herstellung von Impfmaterial spült man die - je nach Wachstumsstärke - 20- bis 25-tägige, auf Würzeagar in den Matratzenkolben gezüchtete Kultur des IProduktionsstamms mit steriler physiologischer Lösung ab, worauf mit 5 bis 7 ml Filzsuspension pro Matratze beimpft wird. Die beimpften Matratzen werden 20 bis 25 Tage je nach Wachstumsstärke und Sporenbildung in einem Thermostaten und bei einer Temperatur von 26 bis 28 ⁰G gehalten. Bei der Züchtung prüft man vom zweiten lag an die Matratzen mit der Kultur visuell auf das Vorliegen fremder Verunreinigungen. Bei Vorliegen bakterieller oder fungSser Verunreinigungen werden die Matratzen verworfen.

Zur Herstellung des Vakzine beimpft man die Matratzen mit dem Hährmedium mit dem erhaltenen Impfmaterial der Kultur Trichophyton mentagrophytes. Als Hährmedium zur Züchtung der Kultur dient Würzeagar oder ein anderes Nährmedium,

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auf dem ein reichliches Wachstum der Filzmasse und eine Speicherung der Mikrokonidien ohne Verlust der iamunogenen Aktivität gewährleistet ist. Die Züchtung wird 15 bis 30 Tage bei einer Temperatur von 26 bis 28 ⁰C durchgeführt. Nach Beendigung der Züchtung nimmt nan die Filzmasse ab und zerkleinert sie (Homogenisierung). Sie Homogenisierung der Pilzmasse wird in Zerkleinerungsgeräten durchgeführt, die während des Arbeitens vollständige Sterilität gewährleisten.

Wahrend der gesamten Bauer der Beschickung, Zerkleinerung und des Austragens der Biomasse darf in den Arbeitskammern von Homogenisierungsgeräten bzw von Kolloidmühlen verschiedener Typen, in denen die Biomasse zerkleinert und in Kreislauf geführt wird, eine Temperatur von +25 ⁰C nicht überschritten werden. Sie Zerkleinerungsgeräte sollen ferner im Betrieb die Ablösung der Mikrokonidien von ihrer Verbindung mit dem Hycel ohne Beschädigung gewährleisten.

Nach Beendigung der Homogenisierung vereinigt man das Homogenisat mit dem Schutsmedium· Als Schutzmedium (Trocknungsmedium) verwendet man eine sterile wäßrige Lösung, die 10 bis 40 % Saccharose oder Sorbit und 2 bis 10 % Gelatine enthält.

Zur Herstellung des Schutsmediums gibt man zu heißem destilliertem Wasser Gelatine und nach deren Auflösung Saccharose zu. Bas Gemisch filtriert man, stellt den pH-Vert auf 7,0 bis 7 »4 ein und unterwirft einer fraktionierten Sterilisation. Fach der Sterilisation soll der pH-Wert im Bereich von 6,2 bis 6,8 liegen.

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Bas Vermischen des Homogenisats mit den Schutsmedium geschieht in einer Menge von 1 «1 Schutsmedium pro ml der Mikrokonidieneuspension, die 600 bis 1000 Millionen Mikrokonidien enthält. Nach dem Vermischen wird das erhaltene Taksin in Flasche hen abgefüllt und darin lyophilisiert. Jede Serie des Takeine wird auf Löslichkeit, Tor liegen mechanischer Verunreinigungen, Bestfeuchtigkeit, Fehlen des Wachstums fremder Mikroflora und von Schimmelpilsen, Gehalt an Hikrokonidien, Geaalt an lebenden Kikrokonidien, Unschädlichkeit und immunogene Aktivität geprüft.

Das Takxin wird in einem trockenen Baum bei einer Temperatur Ton 2 bis 6 ⁰C aufbewahrt.

Me Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen für die Prüfung des Taksins sowie das Terfahren xu seiner Herstellung erläutert.

Beispiel Prüfung und Terwendung des Vakxins.

Das Vakxin wurde auf seine Wirksamkeit gegen die Scherpilzflechte von Feixtieren und Kaninchen geprüft.

Die erhaltenen Versuohsserien des Vaksins wurden auf BeIn heit geprüft.

Ihre Unschädlichkeit wurde an 68 Kaninchen und 74 Füchsen und Polarfüchsen hei intramuskulärer Applikation in Dosen von 0,2 bis 4,0 mlAg Körpergewicht festgestellt. Dabei

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traten keine Nebenwirkungen auf.

Die Versuche ergaben, daß das Yakzin unschädlich und areaktogen ist· Bein luftragen auf skarifizierte Haut ruft sie eine leichte Schuppung der Epidemie hervor, die nach 7 bis 15 Tagen vergeht. Sie intramuskuläre Applikation in Dosen von 3»5 und 10 ml Je Tier (Fuchs, Polarfuchs) führt nicht EU einem klinischen Bild der Krankheit. Es wurden keine Veränderungen im Gesamtbefinden, keine Erhöhung der Gesamt- und der lokalen Körpertemperatur, keine Futtereinnahmeverweigerung und keine anderen Veränderungen festgestellt. An der Injektionsstelle bildet sich nach 10 bis 15 Tagen ein dünnes Grind von 2 bis 8 mm Durchmesser, eine spezifische Reaktion auf die Immunisierung, die nach 15 bis 20 Tagen spontan verschwindet.

In Versuchen an 42 Kaninchen wurde festgestellt, daß die zweimal mit den Versuchsserien des Vakzins immunisierten Tiere eine experimentelle Ansteckung mit virulenten Kulturen und dem pathogenen Material (Erreger Trichophyton mentagrophytes) aushalten.

Die Ansteckung erfolgte in herkömmlicher Weise 1 bis 2 Monate nach der zweiten Injektion des Vakzine. In allen Fällen wurden am 8. bis 16. Tag an der Ansteckungestelle allergische Erscheinungen wie Schuppung der Epidermis und Bildung einzelner dünner gräulicher Grinde, die sich zum 20. bis 25· Tag vollständig ablösten. Auf der gesamten Ansteckungsfläche wurde ein intensiver Haarwuchs festgestellt. Die mykologiechen Untersuchungen waren negativ. Bei nicht immunisierten Kontrollkaninchen wurden an der Ansteckungsstelle eine starke Entzündungsreaktion,

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Schnerzhaftigkeit bei der Palpation, Bildung eines dicken, geschlossenen Grinds und bisweilen auch das Auftreten sekundärer Herde am Kopf festgestellt. Der Infektionsprozeß dauert bis zu 75 Sagen. Es wurden Betrokulturen isoliert. Die Haardecke stellte sich 1 bis 1,5 Monate nach den Verschwinden des klinischen Bildes der Erkrankung wieder her.

Sie Versuchsergebnisse sind in Tabelle 1 angeführt.

	Tabelle 1	Materialien für die experimentelle Ansteckung	erkrankt
		Kultur	-
Nr. der Gruppe	Zahl der immuni sierten Tiere	Kultur	-
1	9	Kultur	3
2	9	pathologisches Material	-
3	3 (Kontrolle)	pathologisches Material	-
4-	9	pathologisches Material	3
5	9
6	3 (Kontrolle)

Die erhaltenen Angaben über die Unschädlichkeit und die immunogene Aktivität der Versuchsserien des Vakzine

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machten es möglich, zur Durchführung von Versuchen an Pelztieren überzugehen.

In einer trichophyteninfizierten Pelztierfarm wurde zu prophylaktischen Zwecken eine zweimalige Immunisierung von 230 klinisch gesunden Fuchs- und Polarfuchswelpen von jeweils 2,5 bis 3 kg Körpergewicht durchgeführt. Sas Takzin wurde in einer Menge von 1 ml intramuskulär von der Innenseite in die Hüftgegend und nach 7 Tagen nochmals in gleicher Dosis injiziert. Bas Gesamtbefinden der Tiere war zufriedenstellend, es wurden keine Komplikationen an der Injektionsstelle festgestellt. Fach 7 bis 12 Tagen trat an der Injektionsstelle ein dünnes Grind von höchstens 10 mm Durchmesser auf, das sich nach 10 bis 20 Tagen ablöste. Während einer Beobachtungszeit von sechs Monaten erkrankte kein geimpftes Tier an Trichophytie, während in der gleichen Zeit in der mit Trichophytie befallenen Farm 28 Fähen (weibliche Tiere) und 344 Velpen erkrankten. 1,5 Monate nach der Immunisierung wurden fünf geimpfte und drei nicht geimpfte Polarfüchse (Kontrolle) einer experimentellen inst eckung unterworfen. Die drei Kontrolltiere erkrankten an Trichophytie, die fünf geimpften hielten die experimentelle Ansteckung aus.

Unter industriellen Bedingungen wurde das Yakzin in Pelztierfarmen geprüft, in denen während einiger Jahre jährlich Scherpilzflechte registriert wurde. In einem der Betriebe wurde vor der Verwendung des Vakzine zu Behandlungs- und prophylaktischen Zwecken das Antibiotikum Griseofulvin verwendet, auch wurden neben der medikamentösen Behandlung Desinfektionsmaßnahmen durchgeführt. Die Krankheit wurde jedoch während mehr als fünf Jahren

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registriert und neigte zur weiteren Ausbreitung. In den der Verwendtang des Vakzine vorangegangenen Jahr erkrankten 229 Tiere der Grundherde und 994 Welpen an Scherpilzflechte · In diesem Zusammenhang wurden zur Prophylaxe 17294 Tiere geimpft. Es wurden keine Komplikationen an der Stelle der Einspritzung des Präparats festgestellt. Das Gesamtbefinden der Tiere war zufriedenstellend, auch wurden keine Futtereinnahmeverweigerung sowie keine Unterdrückung oder negativer Einfluß auf die Reproduktion und die Pelzfellqualität festgestellt. 105 Welpen mit Hautbefall wurden ausgesondert, die vereinzelte haarlose Flecken in der Eopfgegend aufwiesen. Die meisten kranken Welpen wurden nach der ersten Applikation des Takzins ausgesondert; sie wurden ohne zusätzliche Behandlung gesund.

Im nächsten Jahr wurde in dem Betrieb der gesamte früher nicht geimpfte Tierbestand von 15998 Tieren einer Immunisierung unterworfen. Dabei traten keine Fälle von Trichophytie auf.

ihnliehe Resultate wurden auch in einer anderen Pelztierfarm erhalten, in der erstmals Triehophytie aufgetreten war und 36 weibliche Tiere (Füchse) und 344 Fuchswelpen erkrankten. Sie Immunisierung des gesamten Tierbestands mit dem Vakzin machte es möglich, die Infektion vollständig zu bekämpfen.

Sie Ergebnisse der praktischen Prüfung des Vakzine gegen Scherpilzflechte der Pelztiere in fünf Pelztierfarmen sind in der nachstehenden Tabelle 2 angeführt.

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	lfd. Nr.	Tierart	geimpft	darunter kranke	erkrankt	nach 1 Monat	insgesamt	Wirksam keit	I
	1	Fuchs	insgesamt	36	Gesamtzahl der Tiere	-	-	100	ro O I
	2	Polarfuchs Fuchs	25898	23	im 1. Monat	9	0,2	99,8
	3	Polarfuchs Fuchs Fuchs	37473	35 16	-	3 8	0,8 0,1	99,2 99,9
909		Polarfuchs	11818 7460		96
850/085	5	Fuchs		-	93 2	-	0,1	99,9
σ>		4838
	5

Insgesamt:87487

110

196

20

0,2

99,8

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Zu therapeutischen Zwecken wurde das Vakzin in Pelztierfarmen an' 185 kranken Füchsen und Polarfüchsen mit verschieden schwerem klinischen Bild der Trichophytie geprüft. Das Vakzin wurde den Tieren intramuskulär von der Innenseite der Hüfte in einer Dosis von 2 bis 4- ml zweimal mit einem Zeitabstand von 7 bis 10 Tagen injiziert. Die Genesung trat nach 15 bis 35 lagen ohne zusätzliche Behandlung der befallenen Bereiche ein.

Insgesamt wurde das Vakzin in Pelztierfarmen, die durch Trichophytie infiziert waren, an einem Bestand von mehr als 211000 Silberfüchsen und Polarfüchsen angewandt, wodurch es möglich wurde, die Farmen zu sanieren und die Qualität der Fellerzeugnisse zu erhohen·

Die praktische Prüfung des Yakzins bei Trichophytie der Kaninchen in Kaninchenzuchtbetrieben industriellen Typs mit Haltung der Kaninchen in Innenställen und einem Bestand von mehr als 113000 fieren zeigte, daß man die Erkrankung bei der Applikation des Vakzine in ständig trichophytieinfizierten Bäumen zusammen mit allgemeinen sanitären und Desinfektionsmaßnahmen bekämpfen und die Farmen auf Dauer von einer Xrichophytieinfektion freihalten kann.

Beispiel 2

Herstellung einer Vakzinserie in einer Menge von 300 000 Dosen.

Als Nährmedium zur Züchtung von Impfmaterial von Tricho-

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phyton mentagrophytes dient Vürzeagar. Dazu verwendet man ungehopfte Bierwürze alt einer Acidität nach ferner von 1,9 hie 2,3 °, die «an 3 Tage einer fraktionierten Sterilisation im strömenden Dampf bei einer Behandlungedauer von jeweils 30 »in täglich unterwirft. Die sterilisierte Bierwürze lagert nan bis zu 30 Tage in eine· Kühlraum bei einer Temperatur von +2 his 6 ⁰C. Die Bierwürze verdünnt man dann mit Wasser auf einen Gehalt von Kohlenhydraten nach Balling von 7 his 8 %, stellt den pH-Wert auf 7*8 bis 8,2 ein, gibt 2,5 bis 3,0 % Agar-Agar su und sterilisiert 40 min bei einem Druck von 0,7 atm· Nach der Sterilisation betragt der pH-Vert des Viirzeagars 6,2 bis 6,8. Zur Beimpfung von 1,5-1-Hatratzenkolben mit Mährmedium bringt man in den Ausgangs-Impflcolben mit einer 20- bis 30-tägigen Kultur 150 bis 200 ml sterile physiologische Lösung ein. Hit der erhaltenen Suspension beimpft man durch den eingesetzten Siphon 30 bis 35 Kolben mit jeweils 7 his 8 ml. Die beimpften Matratzen stellt man in halb geneigter oder horizontaler Lage (mit dem Hähraedium nach oben) in einen Thermostaten und hält bei einer Temperatur von 26 bis 28 ⁰C. lach 5 bis 8 Tagen bildet sich ein geschlossener Film des Pilzgeflechts, der zum 10· bis 25· Tag pulvrig wird und eine gelbliche Farbe annehmen kann. Vom 18. bis 25· Tag an verwendet man die Katrat sen zur Herstellung des Vakzine·

Zur Herstellung des Hährmediums zur Züchtung der Kultur von Trichophyton mentagrophytes (hierfür verwendet man insbesondere den Stamm Trichophyton mentagrophytes Vr. 135/1963) verdünnt man sterile ungehopfte Bierwürze mit Leitungswasser auf einen Gehalt an Kohlenhydraten nach Balling von 7 his 8 %, stellt den pH-Vert auf 7*0 bis 7,4

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ein, lost unter Zugabe und Erhitzen 2,5 bis 3 % mikrobiologischen Agar-Agar auf, filtriert und gießt in einer Henge von jeweils 300 ml in Matratzen. Dann sterilisiert man 40 min bei einem Druck von 0,7 atm. Anschließend beimpft man 200 Matratzen mit dem Stamm Trichophyton mentagrophytes 135/^963· Hierzu verwendet man 7 Matratzen mit einer 20- bis 30-tägigen Kultur. Nach 20 bis 25 Tagen prüft man die Matratzen mit der gewachsenen Kultur sorgfältig visuell und verwirft bei geringstem Verdacht auf Verunreinigung. Man bereitet ferner 4,5 1 Echutzmedium und prüft es auf Reinheit. Zur Herstellung des Schutzmediums gibt man zu heißem destilliertem Wasser 4 Gew.-% Speisegelatine zu, filtriert nach der Auflösung von 20 Gew.-# Saccharose und stellt den pH-Vert auf 7,0 bis 7,4 ein. Dann sterilisiert man das Medium an drei aufeinanderfolgenden Tagen, und zwar am ersten Tag 30 min mit strömendem Dampf, am zweiten und dritten Tag jeweils 20 min mit strömendem Dampf und dann 40 min bei einem Druck von 0,7 atm.

Anschließend führt man eine Probemahlung der von fünf Matratzen abgenommenen Kultur in 300 ml sterilem Wasser und eine Zählung der Mikrokonidien durch und bestimmt die für die Mahlung benötigte Zahl der Matratzen mit der Kultur, damit der Sehalt des Homogenisats an Mikrokonidien 400 Millionen Mikrokonidien pro ml beträgt. Die Kultur wird dann in sterilen Bozen abgenommen, wozu man mit einem speziellen Kratzer das Pilzgeflecht von der Oberfläche des Würzeagars abnimmt und in mit Deckeln versehene Dosen einbringt. Die Pilzmasee wird abgenommen, indem man die Oberfläche des Nährmediums minimal mitnimmt. Gleich nach der Abnahme wird das Filzgeflecht gemahlen. Das Mahlen der Pilzmasse wird in Homogenisatoren durchgeführt,

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die die notwendige Zerkleinerung und gleichzeitig Sterilität ia Betrieb gewährleisten· Die Temperatur in den Irbeitskaamern darf während des Mahlens 30 ⁰C nicht übersteigen. Dem HoBogenisat gibt man das Schutzaediua in einer Menge von 1 al Schutsmedium pro al Homogenität su, das 600 bis 1000 Hillionen Mikrokonidien enthält. Das Gemisch verrührt man und füllt in Fläschchen ab. Die Kassetten ait den Fläschchen unter zweischichtigen Mullappen bringt man nach dem Abfüllen unverzüglich in eine auf eine Temperatur von -40 bis -50 ⁰C abgekühlte Kammer des Kühlers sum schnellen Gefrieren ein. Nach 12 bis 16 h überträgt aan die gut durchgefrorenen Fläschchen ait dem Vakzin schnell in eine vorbereitete und abgekühlte Kammer des Subliaators, verschließt die Kammer und schaltet die Vakuumpumpen ein. Nach 1 bis 3 h schaltet aan die Heizung auf eine Teaperatur von +30 bis +40 ⁰C ein. Die Heizung wird so gesteuert, daß die Temperatur ia Produkt pro Stunde üb 1 bis 3 ⁰C erhöht wird. Bei einer Temperatur des Produkts von 8 bis 10 ⁰C reduziert man die Heizung auf eine Temperatur von +25 ⁰C und hält diese Temperatur bis zur Beendigung der Trocknung aufrecht. Die Temperatur ia Produkt darf +25 ⁰C nicht übersteigen. Die Trocknung dauert 90 bis 96 h. Nach Beendigung der Trocknung verschließt aan die Fläschchen ait Stöpseln und rollt ein. Zur Prüfung der Qualität des Takzins werden von jeder Serie 30 Fläschchen entnommen, von denen aan 15 zur Prüfung der Qualität verwendet und die übrigen 15 Fläschchen ia Archiv aufbewahrt.

Das Vakzin wird auf folgende Kennwerte geprüft: Aussehen, Vorliegen aechanischer Verunreinigungen, Löslichkeit, Bestfeuchtigkeit, bakterielle Reinheit, Reinheit in Bezug

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auf Schimmelpilze, Gehalt und Lebensfähigkeit der Mikrokonidien, Unschädlichkeit und immunogene Aktivität.

Bas erhaltene Vakzin stellt eine poröse, graubraune trokkene Masse in Form einee Hohrs dar, die sich beim Schütteln von den Wandungen des Fläschchens ablost.

Zur Bestimmung der Löslichkeit bringt man in fünf Fläschchen mit dem Vakzin jeweils 5 bis 10 ml steriles Wasser oder physiologische Lösung ein. Der Inhalt des Fläschchens soll sich beim Schütteln in 2 bis 3 min ohne Niederschlag auflösen.

Zum nachweis von mechanischen Verunreinigungen prüft man die Fläschchen mit dem ungelösten Vakzin visuell im Durchlicht· Fläschchen mit mechanischen Verunreinigungen (Glassplittern, Stückchen des Gummistöpsels udgl) werden verworfen.

Zur Bestimmung der Restfeuchtigkeit nimmt man drei Einwaagen, jede von ungefähr 1 g Gewicht (dh ie 1 bis 2 Fläschchen), und bringt sie in Büchsen 1 h in einen !Trockenschrank bei einer Temperatur von +100 bis +105 ⁰G ein. Sie Bestfeuchtigkeit des Vakzins beträgt 1 bis 3,5 %·

Zur Prüfung des fehlenden Wachstums fremder Hikroflora verwendet man fünf Fläschchen mit gelöstem Vakzin. Aus jedem Fläschchen entnimmt man mit einer Bnteurpipette ein bis zwei Tropfen und beimpft vier Probiergläser mit Fleisch-Pepton-Agar, Fleisch-Pepton-Bouillon, Kitt-Tarozzi-Medium, Czapek-Agar bzw Würzeagar. Die Probiergläser trennt man in zwei Teile (zwei für jedes Medium) und bringt sie

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10 Tage in einen Thermostaten mit einer Temperatur von 26 ⁰C bzw 37 ⁰C ein. Die Beimpfungen auf das Kitt-Tarozzi-Medium und die rieisch-Pepton-Bouillon impft man am 5· Tag auf die gleichen Medien über· Außerdem impft man von der Fleisoh-Pepton-Bouillon auf den Fleisch-Pepton-Agar über und bringt wieder in den Thermostaten ein.

Die Kulturen sind rein, das Wachstum fremder Flora fehlt.

Die Zahl der Mikrokonidien zählt man in 1 ml des im Lösungsmittel gelösten Vakzine. Ils Losungsmittel dient eine sterile physiologische Lösung mit einem pH-Wert von 6,4 bis 7,0. Die Hikrokonidien zählt man in einer Zählkammer (zB einer Gorjajew-Kammer) und bildet aus den Zählergebnissen von fünf Fläschchen den Mittelwert.

Der Gehalt an Mikrokonidien beträgt 15 bis 25 Millionen pro ml.

Den Gehalt an kolonienbildenden Mikrokonidien bestimmt man wie folgt (die Bestimmung wird mit fünf ftäschchen mit dem gelösten Yakzin durchgeführt):

Man nimmt fünf Probiergläser· In jedes Probierglas pipettiert man 4,5 ml steriles Wasser ein. Nach Schütteln entnimmt man dem Fläschchen mit dem Yakzin 0,5 ml und bringt sie in das erste Probierglas ein, verrührt den Inhalt mit einer neuen Pipette, entnimmt 0,5 ml, bringt diese in das zweite Probierglas ein usw, dh man stellt eine Yerdünnungsreihe von 10 bis 10**^ her. Aus dem fünften Probierglas bringt man jeweils 0,5 ml in sechs Petrischalen auf Würzeagar (pH «6,3 bis 6,8) ein und verteilt sorgfältig

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über die Oberfläche· Die Fetrisehalen deckt man ab -und stellt in einen Thermostaten von +26 ⁰C. Die Zahl der gewachsenen Kolonien zählt man am 5· Tag mit einem Kolonienzähler· Man addiert die Anzahl der gewachsenen Kolonien in den sechs Schalen, dividiert diese Zahl durch drei und erhält die Zahl der lebensfähigen Zellen pro ml. Biese Größe, multipliziert mit 10-, gibt die Zahl der lebensfähigen Mikrokonidien an. Die Zahl der lebensfähigen Mikrokonidien nach der Trocknung beträgt mindestens 8 bis 10 Millionen pro ml des gebrauchsfähigen Vakzine·

Sie Unschädlichkeit des Takzins wird an Kaninchen geprüft, denen jeweils 5 »1 gelöstes Yakzin intramuskulär von der Außenseite in die Hüftgegend eingespritzt werden· Für jede Serie werden 5 Kaninchen mit einem Gewicht von 2,5 bis 3*0 kg verwendet.

Die Tiere werden 10 Tage beobachtet; die Kaninchen sollen am Leben bleiben. Serien, die den Tod der Tiere oder Komplikationen an der Injektionsetelle in Form von Abszessen oder Gewebenekrosen hervorrufen, werden nochmals mit der doppelten Anzahl von Tieren geprüft. Bei erneutem Sterben auch nur eines Kaninchens oder bei der Entstehung von Abszessen oder Hekrosen wird diese Serie verworfen, dh zB durch Autoklavieren vernichtet.

Die immunogene Aktivität wird an acht Kaninchen geprüft, wobei zwei Kaninchen das Yakzin zweimal jeweils in einer Dosis von 1,0 ml injiziert wird. Nach 30 Tagen unterwirft man fünf geimpfte Tiere und drei nicht geimpfte Kontrolltiere einer Ansteckung mit einer virulenten Kultur von Trichophyton mentagrophytes. Die Ansteckung erfolgt in

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50 χ 50 mm große ausgeschorene Hautbereiche des Rückens zwischen den Schulterblättern. Die Haut wischt nan mit 70 %igem ithanol und skarifiziert mit einer Rasierklinge. Das PiIigeflecht einer 30-tägigen Kultur, die zusammen «it Agar aus zwei Probiergläsern entnommen wird, verreibt »an und bringt sie mit einem Spatel in gleichen !Feilen auf die Haut von acht Kaninchen auf.

Die Beobachtung erfolgt während 30 Tagen. Die immunisierten Tiere reagieren auf die Ansteckung, indem sie an der Stelle des Aufbringens am 5· bis 15· Tag eine allergische Reaktion in Pore einzelner mit einem Grind bedeckter Bereiche oder eines geschlossenen, zusammenhängenden Schorfs zeigen. Eine starke Entzündungereaktion fehlt. Bei der Mikroskopie wird kein Befall der Haare und kein Eindringen des Filzes in die Haarfollikel beobachtet. Am Haar und in den Hautschuppen können vereinzelte Hycelfäden und kleinere Ansammlungen von Pilzarthrosporen nachgewiesen werden. Zum 16. bis 20. Tag stößt die Haut an der Stelle des Aufbringens des virulenten Materials die Grinde vollständig ab, während am 25. bis 30. Tag ein intensiver Haarwuchs festgestellt wird.

Die nicht immunisierten Kontrolltiere zeigen am 8. bis 15· Tag eine starke exsudative Entzündungsreaktion unter Bildung dicker Grinde.

Der klinische Prozeß der Ansteckung dauert bis 30 und mehr Tage und ist durch ein aktives Eindringen dee Erregers in die Haarfollikel gekennzeichnet. Bei der Mikroskopie findet man zahlreiche Pilzelemente wie Sporenketten und Hycelfäden um das Haar herum, im Haar und in den Haut-

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schuppen·

Von den fünf immunisierten Kaninchen sollen Tier nicht an Trichophytie erkranken, während die drei Eontrolltiere aufgrund der mikroskopiechen Untersuchung ein typisches Bild des Trichophytieprozesses zeigen.

Die Erfindung betrifft zusammengefaßt ein neues Vakzin zur veterinärmedizinischen Prophylaxe und Behandlung von durch den Erreger Trichophyton mentagrophytes hervorgerufenen Trichophytien und seine Herstellung·

Das erfindungsgemäfie Yakzin stellt eine Suspension von Hikrokonidien eines immunogenen Stamms von Trichophyton mentagrophytes in einer physiologischen Lösung mit pH 6,2 bis 7,0 in einer Menge von 15 bis 25 Millionen Mikrokonidien pro ml physiologischer Losung, darunter 8 bis 25 Millionen lebensfähige Mikrokonidien, dar.

Das erfindungsgemäBe Terfahren zur Herstellung des Vakzins besteht darin, daß man eine Kultur des Filzes Trichophyton mentagrophytes auf einem Nährmedium, das Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff sowie biologische Wirkstoffe enthält, bei einer temperatur von 26 bis 28 ⁰C 15 bis 30 Tage bis zur optimalen Speicherung der Mikrokonidien züchtet, die erhaltene Biomasse abtrennt, diese bis zur Erzielung einer Suspension von Einzelteilen des Mikroorganismus homogenisiert und die erhaltene Suspension trocknet.

Bas Yakzin ist zur Prophylaxe und Behandlung von durch den

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Erreger Trichophyton nentagrophytes hervorgerufenen Trichophytien von !Tieren wie Füchsen, Polarfüchsen, Kaninchen udgl verwendbar.

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Claims (4)

Ansprüche

1. Vakzin zur Prophylaxe und Behandlung von durch den Erreger Xrichophyton mentagrophytes hervorgerufenen Irichophytien,

dadurch gekennzeichnet,

daß ββ eine Suspension von Mikrokonidien eines immunogenen Stammes der Art Trichophyton mentagrophytes in einer physiologischen Lösung ait einem pH-Wert von 6,2 bis 7,0 in einer Menge von 15 bis 25 Millionen pro ml physiologische Lösung, darunter von 8 bis 25 Millionen lebensfähiger Mikrokonidien, darstellt.

2. Vakzin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß es zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit und Immunogenität der Mikrokonidien ferner ein Schutzmedium mit 10,0 bis 40,0 Gew.-# Sorbit

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oder Saccharose und 2,0 bis 10,0 Gew.-% Gelatine, Best Wasser, in einer Menge von 1 ml Schutzmedium auf 600 bis 1000 Hillionen Hikrokonidien enthält.

3. Verfahren zur Herstellung des Vakzine nach Anspruch 1, durch eine Pilzkultur auf einem Kährmedium mit Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff und biologischen Wirkstoffen bis zur optimalen Speicherung der Hikrokonidien, Abtrennung der erhaltenen Biomasse, Homogenisierung der Biomasse bis zur Erzielung einer Suspension von Einzelzellen des Mikroorganismus und anschließende Trocknung der Suspension unter Erhalt des Vakzine, dadurch gekennzeichnet, dafi als Filzkultur eine Kultur von Trichophyton mentagrophrtes verwendet wird, die 15 bis 30 Tage auf dem Hährmedium bei 26 bis 28 ⁰C gezüchtet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3« dadurch g β kke nnzeichnet , daß man die erhaltene Suspension der einzelnen Zellen des Mikroorganismus vor der Trocknung mit einem Schutzmedium mit 10,0 bis 40,0 Gew.-% Sorbit oder Saccharose und 2,0 bis 10,0 Gew.-% Gelatine, Best Wasser, in einer Menge von 1 ml Schutzmedium pro ml der Suspension, die 600 bis 1000 Millionen Mikrokonidien enthält, vermischt.

5· Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet , daß man den Stamm Trichophyton mentagrophvtes Vr. 135/1963 verwendet, der nach dem Verfahren der gezielten Auswahl besonders schnell wachsender Filzkolonien mit reichlicher Speicherung rundlichovaler Hikrokonidien selektioniert

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wurde und in der Kultrurensaaelung des Instituts für experimentelle Veterinärmedizin der UdSSR hinterlegt und unter Hr. 135/1963 registriert ist.

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