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Verfahren zur Herstellung von Bakterienpräparaten von Treponema Pallidum
Die
Erfindung betrifft die Züchtung von Mikroorganismen in künstlichen Medien in vitro
und die Giewinnung von wertvollen Präparaten daraus.
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Ein wesentliches Ziel der Erfindung ist die Entwicklung von reinen
pathogenen Kulturen von Treponema Pallidum (Spirochaeta Pallida) unmittelbar aus
menschlichen Syphilomata in gewebefreien flüssigen Medien in vitro, woraus die Mikroorganismen
leicht In einer Menge und Form, wie sie für die Erzeugung wertvoller Derivate geeignet
sind, abgetrennt werden können. Tierische Stämme von Treponema Pallidum, z. B. von
Kaninchen oder Affen, können indessen ebenfalls ohne Virulenzverlust in dem neu
entdeckten Medium gezüchtet und Derivate von solchen pathogenen Kulturen gemäß der
Erfindung sicher abgeleitet werden.
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In einer Zusammenstellung von Arbeiten von führenden Autoritäten
auf dem Syphilisgebiet, im Bulletin Nr. 6 (Syphilis) der American Association for
the Advancement of Skiende (The Science Presse, I938) veröffentlicht, ist dargelegt,
daß die »Spirochaeta Palli,lia ein empfindlicher Parasit und vielen vernichtenden
Mitteln der Umgebung unterworfen ist, wie Trockenheit, Licht, Hitze und Kälte, und
daß sie nicht lange außerhalb des menschlichen Körpers leben kann. Da sie weder
einen Zwisdhenwirt noch einen bekannten Einkapselungszustand besitzt, muß sie einen
raschen Sprung von Wirt zu Wirt machen oder untergehen« (S. 36). »Es besteht
eine
ausgedehnte Literatur über das Züchten der Spirochaeta Pallida, wobei das bestbekannte
Verfahren das von Noguchi ist (1911). Veröffentlichte Berichte widersprechen sich
jedoch und müssen z. Z. mit Mißtrauen betrachtet werden. Solange das Wachstum der
Syphilisspirochaete in Reagenzgläsern nicht eine wohlbewährte Tatsache ist, ist
es unwahrscheinlioh, daß der Lebenskreislauf dieses Organismus vollständig und befriedigend
geklärt werden kann. Unsere Erfahrungen, durch Impfen von Kaninchen den Lebenskreislauf
der Spirochaeta Pallida bestimmen zu helfen, sind weit davon entiernt, befriedigend
genannt werden zu können. Wenn irgend etwas damit erzielt wurde, so war es nur,
die Sache zu verwirren. Es ist eine gewisse Schwierigkeit gewesen, die krankhaften
Veränderungen der Kaninchenspirochaetosis (Spirochaeta cuniculi) von denen der menschlichen
Syphilis bei Kaninchen (Spirochaeta PallMa) zu unterscheiden. Dr. Warthin betrachtete
die Veränderungen, welche in Kaninchen durch Stämme von Spirochaeta Pallida hervorgerufen
wurden, weder als charakteristisch noch als vergleichbar mit denen der menschlichen
Syphilis« (S. 51). »Syphilis des Kaninchens ist nicht völlig vergleichbar weder
mit der erworbenen noch der angeborenen menschlichten Sypihilis, verbindet aber
Elemente beider Bedingungen « (S. 64). » Schließlich sollte erwähnt werden, daß
Stämme von. Spirochaeta Pallida, welche in Kaninchen für lange Perioden weitergeführt
wurden, immer noch für den Menschen pathogen sind, wie sich durch gelegentliche
zufällige Infektionen erwies « (S. 67). » Obwohl Noguchi, Kolmer und andere berichten,
daß sie Spirochaeta l'allida in vitro gezüchtet haben, ist das Verfahren ungewöhnlich
und schwierig. Ein wirklicher Erfolg in dieser Züchtung könnte den Weg zur Immunisierung
weisen« (S. I89).
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Gemäß der Erfindung list ein wirklicher Erfolg in einer solchen anaerolischen
Züchtung in flüssigen Medien über eine Reibe von Jahren mit gleichzeitigem Erfolg
in der anfänglidhen Isolierung von frischen Stämmen von Treponema Pallidum von Menschen
erzielt worden. Auch die Entwicklung von Kulturen von solchen Ausgangsstämmen, welche
in der ersten und in anschließenden Übertragungen in ein reichlicher zur Verfägung
stehendes, von festen und verunreinigenden Stoffen freies Kulturmedium ohne Verlust
der Pathogenität oder Virulenz für viele Generationen weiter fortgezüchtet werden
können, war gemäß der Erfindung wirklich erfolgreich.
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Es wurde gefunden, daß reine pathogene frische Stämme oder Kulturen
von Treponema Pallidum sowohl von menschlichen wie von tierischen Syphiolmata anfänglich
in fruchtbarer Weise in vitro in einem flüssigen Kulturmedium fortgezüchtet werden
können, welches zum größeren Teil aus menschlichem Blutserum und zum kleineren Teil
aus Schweineblut besteht, daß reine pathogene Nachkulturen von Treponema Pallidum
weiter in fruchtbarer Weise in vitro aus einer Anfangs'kultur entweder in einem
gleicihen Kulturmedium oder in einem aus reinem Schweineblutserum bestehenden Kulturmedium
fortgezüchtet werden können und daß der Zusatz kleiner Mengen von Calciumchloid
und Glucose zu beiden Medien die Fruchtbarkeit, die Beweglickeit und die augenscheinliche
Lebensfähigkeit der Mikroorganismen ohne offensichtliche Änderungen in der Morphologie
oder Pathogenität beträchtlich vergrößert.
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Zur Herstellung des primären Kulturmediums wird vorzugsweise ein
Nährstoff, z. B. 0,1 gGlucose, und 0,02 g Calciumchlorid zu 100 ccm frisch erhaltenem,
menschlichem, serologisch negativem und unter sterilen Bedingungen gesammeltem Blutserum
zugesetzt. Diese Mischung kann in Weinen Mengen von je 5 ccm z. B. in gewöhnliche,
mit Baumwollstopfen versehende, sterile Kulturröhren gegeben und die Mischung in
den verschlossenen Röhren dann in ein Wasserbad von z. B. 54 bis 600 für 24 Stunden
gebracht werden, um Antikörper zu beseitigen, Freiheit von Mikroorganisamen oder
Sporen zu sichern und die Komlementaktivität zu zerstören. rot com steriles Schweinehlut
werden beispielsweise in 10 ccm physiologischer Kochsalzlösung (o,850/eige wässrige
Lösung von Natriumehlorid), enthaltend z. B. I °/0 Natriumcitrat oder ein anderes
mildes Antikoagulation. s, mittel, gesammelt.
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Etwa 1 Tropfen (16/1 ccm) des stabilisierten Schweineblutes wird
mit 5 ccm' des serologisch negativen sterilen menschlichen Blutserums in einer der
Kulturröhren vermischt, und hierzu wird ein Tropfen einer menschlichen Schankerflüssigkeit
oder eines anderen, Treponema Pallidum enthaltenden Syphilomas zugesetzt, vorzugsweise
frei von Blut oder Geweben. Das die Impfung enthaltende Kulturmedium wird mit einer
Schicht aus gleichen Teilen von Paraffin und gelber Vaseline verschlossen. Die Röhre
wird dann mit. steriler Baumwolle zugestopft, mit Paraffin bedeckt und in einen
Brutapparat bei einer Bruttemperatur von z. B. 300 gebracht. Unter anaerobischen
Brutbedingungen wird nach 5 bis 14 Tagen die Vermehrung der Treponema Pallidum mit
den Augen sichtbar, und nach 3 bis 4 Woohen wird das Wachstum sehr stark, Die Blutkörperchen
oder deren Reste setzen sich allmählich auf dem Boden ab, und die Treponema Pallidum
sammelt sich in größter Anzahl an der Oberfläche des Mediums in der Brutröhre während
der Brutzeit an, so daß die Kulturen aus der Röhre im wesentlichen frei von Blutkörperchen
oder deren überrasten herausgenommen werden können.
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Von dieser Anfangskultur können Nachkulturen in der gleichen Weise
in weiteren Röhren gezüchtet werden, welche ein gleiches Kulturmedium enthalten.
Für die Gewinnung wertvoller Derivate werden die Nachkulturen vorzugsweise in einem
Kulturmedium aus von Gewebe oder Blutkörperchen freiem Schweineblutserum entwickelt.
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Zur Gewinnung des Schweineblutseruns wird frisches Schweinehlut zunächst
gekühlt, koaguliert und zentrifugiert, um das Serum von den festen Stoffen zu trennen.
Das Serum wird bis zur Ver-
wendung kühl und steril gehalten. Wenn
das Serum als Kulturmedium verwendet werden soll, wird eine kleine Nienge, z. 13.
0,02% Calciumchlorid, und eine kleine Nfenge eines Nährmittels, z.n. 0,1% Glucose,
zu dem Serum zugesetzt und die Mischung in einer Kulturröhre auf z. R. 54 bis 600
während 1/2 Stunde oder länger erhitzt. Nach dem Abkühlen auf etwa 350 wird ein
Tropfen der zuvor in der Mischung aus menschlichem Blutserum und Schweineblut gezüchteten
Treponema-Pallidum-Kultur zugesetzt und die Kulturröhre, wie oben beschrieben, verschlossen,
Die Nachzüchtungen werden anaerobisch bei im wesentlichen der gleichen Temperatur
für im wesentlichen die gleiche Zeit und unter im wesentlichen gleichen Bedingungen
wie die primäre Züchtung ausgebrütet.
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Die in vitro erzeugten Nachzüchtungen gedeihen und vermehren sich
in dem aus Schweineblutserum als Hauptbestandteil bestehenden Kulturmedium augenseileinl-ich
ebenso gut wie die frischen in vitro erzeugten Stämme in dem Kulturmedium gedeihen
und sich vermehren, welches menschliches Blutserum als Hauptbestandteil enthält.
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Nachzüchtungen von den Nachzüchtungen können unbegrenzt in der gleichen
Weise und in jedem der beiden Kulturmedien ohne morphologische Veränderung oder
Verlust der Beweglichkeit oder Nrlust der Virulenz in den Mikroorganismen fortgepflanzt
werden. Bei der Prüfung mit dem Dunkelfeldmikroskop in jedem Stadium der Kultur
oder Nachkultur zeigen die Mikroorganismen die charakteristischen morphologischen
Merkmale, Bewegungen und Struktureinzelheiten des patho genen Treponema Pallidum.
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Wird ein Tropfen unverdünntes menschliches Syphilisserum mit einem
Tropfen von einer der neuen Kulturen von Treponema Pallidum, welche in physiologischer
Kochsalzlösung dispergiert und durch Hitze abgetötet ist und eine Nephelometerkonzentration
von beispielsweise 100 000 oooTreponema Pallidum je Kubikzentimeter besitzt, vermischt,
so erzeugt er eine vollstä ndige Zusammenhallung innerhalb von 41/2 bis 10 Minuten.
während verdünnte oder unverdünnte negative Sera keine Agglutination verursachen.
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Die Injektion von erfindungsgemäßen späten Nachkulturen von Treponema
Pallidum (39. Nachkultur) in Affen und Kaninchen infizierte sie mit Syphilis mit
den charakteristischen Sc'han.kergeschwüren innerhalb 3 bis 6 Wochen und syphilitischen
Veränderungen in den langen Knochen. Der Wassermanntest war bei jedem Tier vor dem
Einimpfen negativ, aber die 8 l>is I2 Wochen nac'h der Schankerentwicklung gemachten
Prüfungen fielen positiv aus.
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Es wurde gefunden, daß, wenn Treponema-Pallidum-Kulturen mit verdünntem
oder unverdünntem Schweineserum oder Schweineblut gemischt werden die Organismen
lebhafter werden und nicht zusammenklumpen oder agglutinieren, während bei der Mischung
der gleichen Kulturen mit gleichen Mengen von verdünnten oder unverdünnten Seren
von Kaninchen, Meerschweinchen, Rindern, Pferden oder Schafen die Organismen zusammenzuklumpen
beginnen. Während die Wassermannreaktion von Kaninchen-, Meerschwein-. chen-und
Kälberblut positiv sein könnte, waren die.
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Wassermannreaktionen mit Schweineblut immer negativ. Da Schweine nicht
mit Syphilis infiziert werden können, scheint es, daß keine Antikörper in ihrem
Blut zugegen sind, welche auf die Vermehrung von Treponema Pallidum störend einwirken
würden, und daß die einzigarfige, in der Säugetierphysilogie durch den Stoffwechsel
des Schweins eingenommene Stellung ebenso wie die Widerstandsfähigkeit seines B'lutserums
gegen verderbende Organismen und gegen Haemolyse und seine Fähigkeit, lange seine
natürlichen biologischen Eigen. schaften zu bewahren, es besonders zur Verwendung
in Kulturmedien geeignet macht.
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Wie auch immer die Erklärung, dafür sein malg, die auf Forschungen
beruhende Erfindung hat zu einem wirklichen Erfolg in der fruchtbaren Züchtung in
vitro von virulentem, pathogenem, von Verunreinigungen freiem Treponema Pallidum
geführt, welche mit Leichtigkeit und Sicherheit sowohl aus menschlichen wie aus
tierischen Quellen herrührenden Stämmen erhalten werden.
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Zur Gewinnung von Präparaten aus den vorstehend beschriebenen Treponema-Pallidum-Kulturen
können die entweder in dem ersten oder im zweiten Kulturmedium gewachsenen Züchtungen
verwendet werden. Die letzteren werden wegen der Abwesenheit von Blutkörperchen
oder deren Resten bevorzugt, wie sie sonst in der Anreicherung von Treponema Palliidum
gegenwärtig sind.
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Wenn ein genügendes Wachstum von. Treponema Pallidum erfolgt ist,
kann der sie enthaltende Teil des Kulturmediums in eine schnell laufende Zentrifuge
gegossen und I Stunde bei hoher Tourenzahl zentrifugiert werden, nm das Flüssige
vom Festen zu trennen. Der Rückstand wird dann mehrere Male mit physiologischer
Kochsalzlösunggewaschen, bis alle Spuren des ursprünglichen Kulturmediums entfernt
sind.
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Wie oben erwähnt, können die aus menschlichen oder tierischen Stämmen
von Treponema Pallidum in menschlichem Blutserum und Schweineblut oder in Schweineblutserum
gezüchteten Kulturen für den Agglutinierungsnachweis von Syphilis durch Auswaschen
aller Spuren des Kulturmediums und Erhitzen der Mikroorganismen in einer physiologiscWhen
Kochsalzlösung auf 65° während I Stunide geeignet gemacht werden. Das Produkt besitzt
eine Nephelometerdichte von annähernd I00 000 000 Organismen je Kubikzentimeter.
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Eine ähnliche, aber konzentriertere Dispersion von Treponema Pallidum,
durch Hitze in physiologischer Kochsalzlösung abgetötet und mit 0,25 % Trikresol
als Konservierungsmittel versetzt, wurde als Impfstoff verwendet, um vier gesunde
serologisch negative Affen zu immunisieren. Jedes Tier erhielt sechs intravenöse
Einspritzungen, beginnend mit einer Dosis von 0,1 ccm Lymphe mit einer Nephenometerdichte
von I 000 000 000 Treponema Palliduin je Kubikzentimeter Lymplhe. Jede nach-
folgen,
de Dosis wurde um 0,1 ccm vergrößert, bis als Enddosis 0,6 ccm gegeben wurde. go
Tage nach den letzten Injektionen wurden die vier geimpften Affen und zwei nicht
geimpfte gesunde, serologisch negative Kontrollaffen intratestikuliert mit frischem
Syphiloma, erhalten aus menschlichen Syphilisgeschwüren, infiziert. Die nicht geimpften
Affen zeigten Schankergeschwüre 5 bis 6 Wochen nach der Infizierung. Keine solche
Veränderungen oder andere syphilitische Symptome entwickelten sich bei den geimpften
Affen, welche I Jahr lang jede Woche untersucht wurden.
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Ein wertvolles Derivat kann durch Vermischen der zentrifugierten
und gewaschenen, wie oben beschrieben entwickelten Kulturen von Treponema Pallidum
in einem Nährboden, wie z. B. sterilen 10/oigen Glucosebouillon von p, 7,4, und
anaerobischen 6wöchentlichem Ausbrüten hergestellt werden, währenddessen alle Organismen
abzusterben scheinen. Ein toxissthes Derivat wird dadurch, wahrscheinlich durch
Ausscheidung oder Bildung von Stoffwechselprodukten, erzeugt, Wenn keine Verunreinigung
durch fremde Organismen in dem Medium am Ende dieser Zeit ersclheint, wird die hergestellte
Suspension durch ein feines Berkefeld-Filter filtriert und aerobisch und anaerobisch
auf Sterilität durch Ausbrüten in gewöhnlichen Kulturmedien und in den vorbeschriebenen
Blutserumkulturmedien geprüft. Wenn nach 4 Wochen Brutzeit die Kulturmedien immer
noch steril bleiben, kann das gekühlt aufbewahrte Filtrat verwendet werden.
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Solche Filtrate von Treponema-Pallidum-Kulturen geben positive intradermale
Reaktionen in mit Syphilis infizierten Affen und Kaninchen und negative Reaktionen
in nicht infizierten Kontrolltieren.
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Wenn intradermale Injektionen eines solchen Filtrats Affen und Kaninchen
gegeben wurden, wurde der Bauch von verdächtigen und gesunden Tieren rasiert und
mit Alkohol gewaschen.
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1 minim (64,8 mg) des Filtrats wurde intradermal auf einer Seite
und eine gleiche'Menge von Glucosebouillon intradermal auf der gegenüberliegenden
Seite jeder reinen Fläche zur Kontrolle injiziert.
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Die syphilitisch infizierten Tiere gaben eine positive Reaktion durch
die Entwicklung von roten Pickeln von etwa 2,54 bis 3,81 cm im Durchmesser um den
Punkt der Injektion des Filtrats. Keine Rötung entwickelte sich an den Injektionsstellen
der Glucosebouillon bei den infizierten Tieren oder an den Injektionsstellen des
Filtrats oder des Glucoscbouillons bei den nicht infizierten Tieren.
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Es ist zu beachten, daß die Mengen. gewinnung von reinen Kulturen
von unmittelbar gewonnenen menschlichen Stämmen von Treponema Pallidum in vitro
frei von Gewebeverunreinigungen und ohne die morphologische und pathogene Veränderung,
welche mit dem Wachstum und der Fortpflanzung solcher Organismen in lebenden Tieren
verbunden ist, die Gelegenheit für Studien des Lebenskreislaufs dieser Organismen
und der Einwirkung spezifischer Mittel darauf zur Kontrolle oder Vernichtung ermöglicht.
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PATENTANSPRX, CHE 1. Verfahren zur Herstellung von Bakterienpräparaten
von Treponema Pallidum, insbesondere aus einem menschlichen Stamm, dadurch gekennzeichnet,
daß die Bakterien in einem flüssigen, hauptsächlich aus menschlichem Blutserum bestehenden
und einem kleinen Teil Schweinehlut sowie gegebenenfalls geringe Mengen eines Nährstoffes
und eines Konservierungsmittels enthaltenden Kulturmedium gezüchtet werden.