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Orf-Infektionen (Ecthyma contagiosum, Pustulardermatitis,
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Lippengrind) sind bei den Scharen schon lange bekannt. Sie sind unbiquitär
in den Schafpopulationen verbreitet, führten bisher in der Regel aber nur vereinzelt
zu klinischen Ausbrüchen. Erst durch den zunehmenden Trend zu intensiveren Haltungsmethoden
in der Schafzucht, wie z.B. Lammermastan der Lammbar, beobachtet man Seuchenausbrüche,
die zu schweren wirtschaftlichen Verlusten führen. Für die Ziegen treffen die gleichen
Kriterien zu. Da sie aber gegenüber der Schafhaltung wirtschaftlich unbedeutend
sind, wird im folgenden nur von den Verhältnissen beim Schaf gesprochen.
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Die üblichen konservativen Behandlungsmethoden bleiben ohne durchschlagenden
Erfolg, da sie das Infektionsgeschehen in den betroffenen Herden nicht verringern
können. Auch die Schutzimpfung mit den bisher bekannten tebendimpfstoffen befriedigte
nicht. Hohe Restvirulenz des Impfvirus mit yermehrten Impfkomplikationen (Impferkrankungen),
kutaner Applikationsmodus, zu später Smpfstoffeinsatz, geringe Virusmenge pro Impfdosis,
fehlende Revaccinationen u.a.m. sind Grunde für die schlechten Impfergebnisse.
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Die Immunität gegen die Pustulardermatitis, wie sie im Verlaufe einer
natürlichen Infekt ion erworben wird, ist sehr labil und hält in der Regel nicht
länger als 8 Monate. Sie beruht im wesentlichen auf zellulären Immunitätsmechanismen.
Antikörper werden Je nach Verlaufsform (klinisch inapparent, Lokalkrankheit, zyklischgeneralisierte
Allgemeinkrankheit) sehr unterschiedlich gebildet. Häufig können im Verlaufe eines
natürlichen Infektionsgeschehens bei sehr Jungen Tieren weder neutralisierende noch
komplementbindende oder präzipitierende Antikörer nachgewiesen werden. Bei erwachsenen
Schafen findet man dagegen relativ häufig Antikörper,
da sich die
Tiere im Verlauf ihres Lebens immer wieder anstecken, was zu einem Booster mit entsprechender
Antikörperbildung führt. Die Antikörper werden von der Mutter auf die Neugeborenen
betragen, schützen aber nicht immer.
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Eine aktive Schutzimpfung gegen Ecthyma(Pustulardermatitis) muß die
vorstehend genannten Gegebenenheiten berücksichtigen.
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Die bisherigen Lebendimpfstoffe werden wegen ihrer Restvirulenz cutan
bzw. percutan angewendet. Sie besitzen bezüglich Wirksamkeit den Nachteil, daß sie
zwar zu einer guten zellulären, aber nur geringen humoralen Immunität führen.
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Rein technisch besteht zudem die Möglichkeit, daß nicht genügend Impfvirus
über die Skarifikation bzw. percutane Impfung verabfolgt wird, was zu einer verminderten
bzw.
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ausbleibenden Immunitätsbildung führt. Bezüglich Unschä.dlichkeit
haben sie noch weit mehr Nachteile. Wegen ihrer Restvirulenz sind sie für neugeborene
Lämmer und nicht-immune Kontakttiere durch Auslösung von Impferkrankungen gefährlich.
Die cutane bzw. percutane Verabreichung führt zu lokalen Pustelbildungen, die in
mehrerlei Hinsicht bedenklich sind. Die Impflinge können sich über die lokalen Impfreaktionen
sekundär mit Bakterien und anderen Infektionserregern infizieren. Bei säugenden
Mutterschafen kann es zu einer Infektion des Euters und damit zur Infekt ion der
Lämmer kommen. Wird anstelle der Innenschenkel die Unterseite des Schwanzansatzes
als Applikationsort verwendet, ist eine Selbstinfektion der Vulfa möglich. Die größte
Gefahr besteht jedoch für die Umgebung über die Verbreitung des Impfvirus durch
Kontakt empränglicher Schafe mit den Impfpusteln und abfallenden Impfborken und
-krusten. Nicht geimpfte Schafe, besonders wenn sie sich gerade im Stadium einer
Immunsuppression befinden, können dadurch schwer erkranken. Cutan geimpft Tiere
düren bis zum Abfall der Impfkrusten deshalb nicht in den Markt gebracht werden.
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Mutterschafe sind nur dann impffähig, wenn die Impfung spätestens
6 bis 8 Wochen vor der Lammzeit durchgeführt wird.
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Letztlich sind die cutanen Lebendimpfstoffe wegen ihrer
Restvirulenz
auch für den Menschen gefährlich. Aus all sen Gründen sind die bisherigen Orfvirus-Cutan-Lebendimpf
stoffe in der Regel nur als Notimplung eingesetzt worden.
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Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, einen attenuierten
und durch Klonselektion gereinigten Orf-Virusstamm zu schaffen, der sich aufgrund
seiner fehlenden Pathogenität und seiner guten Immunogenität zur Herstellung eines
Lebendimpfstoffes eignet, der Schafen und Ziegen parenteral gegeben wird, dennoch
keine Nebenwirkungen zeigt und zugleich eine signifikante Senkung der Mortalität
bei Schafen und Lämmern induziert. Diese Aufgaben werden gemäß den Patentansprüchen
gelöst.
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Der erfindungsgemäße Orfvirus-Lebendimpfstoff besitzt die oben genannten
Nachteile nicht. Die parenterale Verabreichung gewährleistet, daß Jeder Impfling
die für eine Immunisierung notwendige Impfdosis tatsächlich erhält. Großflächige
Haubläsionen mit Gefahr einer bakteriellen Kontamination entstehen ebenso wenig
wie Kontakt infektionen neugeborener Lämmer oder Selbstinfektionen der Vulva. Eine
über abfallende Pusteln und Krusten mögliche Verbreitung des Impfvirus mit Gefährdung
empfänglicher Tiere und Menschen unterbleibt. Der Impfvorgang ist durch die parenterale
Applikation gegenüber der kutanen einfach und nicht zeitaufwendig.
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Neben diesen Gegebenheiten ist der dem Orfvirus-Lebendimpfstoff zugrunde
liegende Impfstamm avirulent und ohne Kontagiosität. Neugeborene, empfängliche Lämmer
erkrankten auch bei überhöhter Impfdosis nicht und stecken gleichaltrige Tiere per
Kontakt nicht an, Trächtige Tiere überstehen die Impfung komplikationslos, die Neugeborenen
bleiben reaktionsfrei. Aus all diesen Gründen eignet sich der Orfvirus-Lebendimpfstoff
der Erfindung nicht nur zur Notimpfung, er kann auch gefahrlos prophylaktisch sowohl
zum
Schutz empfänglicher, gefährdeter Herden wie bei Lämmern an
der Lammbar eingesetzt werden.
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Bezüglich Wirksamkeit ist dieser Orfvirus-Lebendimpfstoff den bisherigen
Orfvirus-Cutan-Impfstoffen ebenfalls überlegen. Er induziert eine systemische Immunität,
die sowohl zellulär wie humoral ausgebildet wird. Eine Boosterimpung ist in kurzem
Abstand möglich und erhöht die Wirksamkeit, besonders bezüglich Ausbildung humoraler
Immunitätsmechanismen.
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Ein weiterer Vorteil des Lebendimpfstoffes liegt darin, daß bereits
2 bis 3 Tage alte Lämmer aktiv durch eine zweimalige Impfung im Abstand von 10 bis
14 Tagen immunisiert werden können. Bei Impflingen mit einer natürlich erworbenen
aktiven Immunität wirkt die Schutzimpfung als Booster. Bei Lämmern mit einer passiv
erworbenen, maternalen Immunität ist sie indifferent.
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Besonders charakterisiert ist der neue Orfvirus-Lebendimplstoff durch
die Eigenschaften des Orfvirus-Impfstammes D 1701. Er unterscheidet sich von den
bisher bekannten, in Orf-Lebendimpfstoffen enthaltenen Impfviren 1. durch die Art
seiner Gewinnung als Virusausgangsmaterial über eine Selektion in Zellkulturen aus
Organen oder Geweben von Wiederkäuerembryonen, vorzugsweise in sekundären Nierenkulturen
von Schafembryonen, aus dem Pustelmaterial eines an generalisierter Pustulardermatitis
erkrankten Lammes, das gleichzeitig mit Adenovirus mischinfiziert war; 2. durch
die Art seiner Attenuierung in Zellkulturen aus Organen oder Geweben von Wiederkäuerembryonen,
vorzugsweise in sekundären Nierenkulturen aus Schafembryonen mittels kontinuierlicher
Passagen (Endver'dünnungsmethode), die zu einem Virulenzverlust des Orfvirus für
Lämmer und Schafe unter Erhalt der immunisierenden Eigenschaften
führte;
3. durch die Fähigkeit, sich auch in heterologen Zellkulturen, vorzugsweise in sekundären
Zellkulturen aus Rinderembryolungen (heterologies Zellsystem) zu vermehren, wodurch
für die Impfherstellung ein heterologes Zellsystem verwendet werden kann, das eine
endogene Kontamination des Impfstoffes bei der Produktion mit Schafviren und Chlamydien
des Schaftes verhindert; 4. durch seine hohe Vermehrungsintensität in sekundären
fötalen Rinderlungenkulturen mit Titern bis in8,0 KID50/ml, die eine wirtschaftliche
Produktion des Imp£-stoffes ermöglicht; 5. durch seine Stabilität während und nach
der J,yophilisierung bei Temperaturen unter +40C über 3 Jahre; 6. durch seine guten
immunisierenden Eigenschaften nach parenteraler Applikation bei Lämmern und Schafen;
70 durch seine Unschädlichkeit für neugeborene Lämmer und trächtige Schafe nach
parenteraler Applikation; 80 durch seine fehlende Kontagiosität.
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Die Gewinnung des neuen Orfvirus-Impfstammes unterteilt sich in 3
Stufen, wobei in der 1. Stufe die Abtrennung von evti, vorhandenen anderen Virusarten
erfolgt. In der 2. Stufe erfolgt die Vermehrung des neu gewonnenen Virusmaterials
und dessen erste Klonselektion zur Gewinnung eines genetisch einheitlichen Virusmaterials.
In der 3. Stufe wird dieses genetisch einheitliche Virusmaterial einer weiteren
Attenuierung und einer nachfolgenden 2. Klonselektion unterzogen.
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Der neue Orfvirus-Impf stamm kann in der Praxis unter folgenden Bedingungen
gewonnen werden: 1. Stufe: Als Ausgangsmaterial dient Gewebematerial, z.B.
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Pustelmaterial aus dem Maulbereich eines neugeborenen oder
einige
Wochen, vorzugsweise 2 Wochen alten Lammes, das an einer schweren, generalisierten
Pustulardermatitis erkraSt oder gestorben ist. Das Gewebematerial wird in an sich
bekannter Weise zur Gewinnung einer detritusfreien Suspension aufgearbeitet (Zerkleinern
durch verschiedene Methoden, Aufnehmen in Antibiotika-haltiger, gepufferter Salzlösung,
Abzentrifugieren, Verwendung des Überstandes). Die erhaltene zellfreie Suspension
wird auf Zellkulturen aus Organen oder Geweben von Wiederkäuerembryonen, vorzugsweise
sekundären Nierenkulturen von Lammembryonen verimpft. Durch mindestens 4, vorzugsweise
7 Passagen in derartigen Zellkulturen, werden gleichzeitig vorhandene Adenoviren
oder andere Virus art en entfernt. Die Passagen werden bei 30 bis 390C, vorzugsweise
37°C, durchgeführt.
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2. Stufe: In der Vermehrungsstufe werden ebenfalls Passagen in Zellkulturen
von Organen oder Geweben aus Wiederkäuerembryonen, vorzugsweise in sekundären Nierenkulturen
von Lammembryonenlbei 330 bis 390C, vorzugsweise 370C, durchgeführt. Das Virusmaterial
der 16. Passage wird in an sich bekannter Weise über 3 Plaque-Passagen einer Klonselektion
unterzogen. Das dabei gewonnene, genetisch einheitliche Orfvirus-Material wird für
die 3. Stufe verwendet.
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3. Stufe: In der Attenuierungsstufe wird das nunmehr genetisch einheitliche
Virusmaterial durch mindestens weitere 80, vorzugsweise mindestens 120 Passagen
33° bis 39°C, vorzugsweise 37°C, in den in Stufe 2 genannten Zellkulturen attenuiert.
Dabei werden nach Jeder Passage lichtmikroskopische und elektronenoptische Untersuchungen
der Virusernten eingeschaltet. Außerdem wird nach jeder Passage der Infektiositätstiter
in Zellkulturen geprüft. Untaugliches Passagematerial wird vernichtet.
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Für den Nachweis der Wirksamkeit und Unschädlichkeit werden jeweils
2 Lämmer im Alter von 1 bis 2 Tagen aus einer OrfvirusrreienZucht (serologisch negativ)
subcutan mit 1 ml vermehrungsfähigem Orfvirus der betreffenden Passage (2x107 KID50/ml)
geimpft und 21 Tage mit gleichalten, nicht geimpften Lämmern gleicher Abstimmung
gehalten. Erkranken die Tiere in diesem Zeitraum nichts werden sie anschließend
für den cutanen Wirksamkeitstest verwendet. Hierfür werden die Lämmer mit 106KID50/ml
virulentem Orfvirus der 16. Passage percutan nach der Skarifikationsmethode nach
Herzberg (vgl. A.
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Mayr, P.A. Bachmann, B. Bibrack und G. Wittmann: Virologische Arbeitsmethodeen,
Gustav Fischer Verlag, 1974, Band 1, Seite 599) an der Schenkelinnenfläche testinfiziert.
Ein belastbarer Immunschutz besteht dann, wenn es innerhalb von 21 Tagen nach der
Testinfektion an den Skarifikationsstellen weder zu einer infiltrativen, länger
anhaltenden Rötung mit Quaddelbildung, noch zu einer Papel- oder Pustelbildung kommt.
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Die Tiere dürfen auch keine Störung des Allgemeinbefindens zeigen.
Als Kontrollen werden jeweils einige gleichalte, nicht geimpft Lämmer, testinfiziert.
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Die Prüfung der Wirksamkeit und Unschädlichkeit des Passagematerials
wird in regelmäßigen Abständen, d.h. nach Jeweils 20 bis 30 Passagen, durchgeführt.
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Aufgrund der Ergebnisse der Kontrolluntersuchungen der 120.
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Zellkulturpassage in embryonalen Lammnierenkulturen werden noch weitere
15 Passagen zur Sicherheit durchgeführt Die Virusernte der 135. Passage wird zur
Herstellung des Orf-Impfvirusstammes verwendet. Hierfür wird die Virusernte in an
sich bekannter Weise über 3 Klonisierungs-Passagen mittels Plaquetechnik genetisch-gereinigt
und anschließend in embryonalen Lammnierenkulturen vermehrt. Für die Verwendung
zur Impfstoffherstellung wird dieses genetisch einheitliche Virusmaterial über mindestens
einer, vorzugsweise 1 bis 2 Passagen, auf embryonale Rinderlungenkulturen adaptiert.
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Die Original-Plaque nach der 3. Klonselektion der 135. Passage, d.h.
der Orf-Impfvirusstamm, wird mit D 1701 bezeichnet. Eine Probe dieses Stammes ist
bei der Bayerischen Landesimpfanstalt, Am Neudeck 1, 8000 München 95, unter der
Nummer D 1701 am 2. September 1981 hinterlegt worden.
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Der neue Orfvirus-Lebendimpfstoff kann nach den üblichen Methoden
aus dem Original-Plaque D 1701, d.h. dem Orf-Impfvirusstamm, hergestellt werden,
z.B. in primären oder sekundären Zellkulturen oder in permanenten Zellinien aus
Warmblütergeweben, unter Einschaltung der üblichen Kontrollen auf bakterielle, virale
oder Pilz-Kontaminationen und unter Beachtung der bekannten Grundsätze und Anforderungen
für die Herstellung von Impfstoffen.
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Der erfindungsgemäße neue Impfstoff kann durch Vermehrung des Orf-Impfvirusstammes
D 1701 in Zellkulturen von Vögeln oder Säugern, die empfänglich für das Orfvirus
sind, vorzugsweise in primären, sekundären oder permanenten Zellkulturen aus Organen
oder Geweben von Wiederkäuerembryonen, insbesondere in sekundüren Nierenkulturen
von Lammembryonen, durch Bebrütung bei 33° bis 39°C, vorzugsweise bei 37°C, hergestellt
werden. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden zur Impfvirusvermehrung
sekundäre Lungenzellkulturen aus Rinderembryonen verwendet, da diese leichter zu
beschaffen sind und zusätzlich eine höhere Zellausbeute garantieren. Auch die Verwendung
dieser Zellkulturen als S-uspensionskulturen oder Microcarrier-Kulturen ist möglich.
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In der besonders bevorzugten Ausführungsform werden für die Herstellung
des Orfvirus-Lebendimpfstoffes sekundäre Zellkulturen aus Lungen von Rinderembryonen
benutzt. Deren Herstellung erfolgt nach der üblichen Trypsininisierungstechnik in
Industrieflaschen bei stationärer Bebrü-
tung. Das Zellsediment
der Anzuchtpassage wird bakteriologisch und mykologisch nach den internationalen
Vorschriften auf Kontaminationen untersucht. Die Beobachtungszeit der flüssigen
und festen Nährböden (aerob und anaerob) beträgt 14 Tage bei +37°C und Raumtemperatur
(20° bis 240c).
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Das Anzuchtmedium besteht vorzugsweise aus scher Lösung + 10 % Lactalbumin
+ 10 % fötales Rinderserum + Antibiotika; beim Erhaltungsmedium beträgt der prozentuale
Anteil des Lactalbumin 5 O,o und des fötalen Rinderserums 2 .
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Für die Animpfung der sekundären fötalen Rinderlungenkulturen wird
jeweils frisches Saatvirus des Orfvirus-Stammes D 1701 (d.h. plaquegereinigtes Virus)
verwendet, das zwecks Adaptierung zuvor Jeweils 1 bis 2 Passagen in sekundären Lungenkulturen
aus Rinderembryonen durchläuft. Die Animp»-dosis beträgt 4 x 107,5 KID50.
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Die virusinfizierten Zellen werden 3 bis 10 Tage, vorzugsweise 4 Tage,
bis zur Ausbildung eines optimalen cytopathischen Effektes, bei 33° bis 390 C, vorzugsweise
bei 37 Ca bebrütet. Anschließend werden die Zellkulturen in toto bei -200 bis -700C
oder bei tieferen Temperaturen eingefroren. Bis zum Abschluß der bakteriologischen,
virologischen und mykologischen Untersuchungen und der Kontrollen der nicht beimpften
Zellkulturen verbleiben die Virusernten bei dieser Temperatur. Wenn alle Kontrollen
den Sicherheitsvorschriften entsprechen, werden die Virusernten aufgestaut Dadurch
werden noch intakte Zellen zerstört und damit zellgebundenes Virus freigesetzt,
wodurch sich der Virustiter erhöht. Unter sterilen Bedingungen werden danach die
Zellen und der Zelldetritus mittels Filtration oder Zentrifugation, bevorzugt durch
Zentrifugieren mit 300 g entfernt. Dem Filtrat bzw. dem überstand werden Stabilisatoren,
vorzugsweise je 2,5 % Molico (Magermilchpulver) und 2,5 % Pepton zugefügt.
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Es können natürlich auch andere Methoden zum Aufschluß der Zellen,
z.B. Ultraschall, sowie andere, für das Orfvirus geeignete Stabilisatoren, verwendet
werden.
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Abschließend werden die Virussuspensionen auf einen pH-Wert von 7,4
eingestellt, portioniert, z.B. in Mengen von 4 ml, und lyophilisiert. Der lyophilisierte
Orf-Lebendimpfstoff ist bei einer Lagerung bei. +40c oder niedrigeren Temperaturen
mindestens 3 Jahre stabil. Der Infektiositatstiter des Lyophilisates bleibt unter
diesen Bedingungen in einem Zeitraum von 3 Jahren unverändert.
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Die Beispiele erläutern die Erfindung.
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Beispiel 1 Als Ausgangsmaterial dient Pustelmaterial aus dem Maulbereich
eines etwa zwei Wochen alten Lammes, das an einer schweren, generalisierten Pustulardermatitis
(Ecthyma) erkrankt war. Das Pustelmaterial wird nach entsprechender Aufarbeitung
(AuSschluß, Gewinnung des detritusfreien Überstandes) elektronenoptisch (Abklatschpräparat)
untersucht und gleichzeitig auf Sekundärkulturen (übliche Trypsinierungstechnik)
verschiedener Organe und Gewebe von Lammembryonen, vorzugsweise auf Sekundärkulturen
aus Haut Niere und Hoden von Schafembryonen verimpft. Das Anzuchtmedium für alle
drei Zellkulturarten besteht aus Earle'scher Lösung mit 10 % Lactalbumin (LA), 10
% fötalem Rinderserum (FRS) und einem üblichen Antibiotikazusatz. Beim Erhaltungsmedium
(Virusmedium) wird der prozentuale Anteil des Lactalbumins auf 5 % und des fötalen
Rinderserums auf 2 ffi gesenkt.
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Nach Auftreten eines klaren cytopathischen Effektes (cpE) bzw. nach
7 bis 5 Tagen werden die beimpften Kulturen für die Virusernte bei -200C eingefroren,
wieder aufgetaut und auf neue Zellkulturen der gleichen Art verimpft (o,i ml pro
Röhrchen).
Jede Virusernte wird außerdem bakteriologisch sowie virologisch, lichtmikroskopisch
und elektronenoptisch auf das Vorhandensein von Plasmaeinschlüssen bzw. typischen
Viruspartikeln untersucht.
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Von Jeder Passage wird außerdem der Infektiositätstiter in der Zellkultur,
die für die Passage verwendet wurde, festgestellt In der 16. Passage beträgt der
Infektiositätstiter 106,75 KID50/ml gegenüber einem Titer von 104,5 KID50/ ml in
der 2. Passage. Wenn zu diesem Zeitpunkt auch eine gleichzeitig bei der Anzucht
vorhanden gewesene, andere Virusart nicht mehr nachweisbar ist, wird mit der Virusernte
der 16. Passage eine Klonselektion über 3 Plaque-Passagen durchgeführt.
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Für die Plaquereinigung können Schälchen-(Animpfung) und Röhrchenkulturen
(Vermehrung des Plaquevirus) verwendet werden.
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Die Plaqueschälchen werden nach der bekannten Methode mit Nierenzellen
aus Schafembryonen (1. Subkultur) angelegt.
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Verimpft werden Virusverdünnungen (10-4 bis 10-6) auf jeweils 3 Schälchen
(0,2 ml pro Schälchen). Die Adsorptionszeit beträgt 2 Stunden. Danach wird mit 3
ml 2prozentigem Difco-Agar + doppeltem Eagle-Earle mit 10 % fötalem Rinderserum
(Mischungsverhältnis 1 : 1) überschichtet. Aus den Verdünnungen 10-4m lo 5 und 10
6 werden nach einer Bebrütungszeit von 4 bis 5 Tagen bei 3700 im C02-Brutschrank
Plaques gestochen und auf Röhrchen-Kulturen überimpft (2. Subkultur mit Anzuchtmedium
Earletscher Lösung 2 FRS + 5% LA).
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Dies ergibt die 1. Plaquereinigungspassage. In gleicher Weise wird
eine 2. und 3. Plaquereinigung vorgenommen, wobei das in den Röhrchen angezüchtete
Virus Jeweils wieder auf Plaqueschälchen ausgesät wird.
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Das Virusmaterial der 3. Plaquereinigung wird dann in sekundären
Nierenzellkulturen aus Schafembryonen vermehrt , gereinigt und bakteriologisch sowie
virologisch (Elelctronenmikroskop, Serologie) nochmals überprüft.
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Anschließend wird das so gewonnene Virusmaterial auf Unschädlichkeit
und Immunogenität im Tierversuch an 2 seronegativen, 1 bis 2 Tage alten Lämmern
geprüft. Sie werden subcutan mit 1 ml Virusmaterial (2 x 107'° KID50/ml) geimpft
und 21 Tage zusammen mit 2 gleichalten, nicht geimpften Lämmern gleicher Abstammung
beobachtet.
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Die Impfungen erfolgen an der haarlosen Stelle hinter dem Ellbogen
oder kaudal des Schulterblattes. Täglich werden Temperatur, Blutbild, Futteraufnahme
und Gewichtszunahme kontrolliert. Außerdem werden die Tiere hinsichtlich lokaler
Reaktionen und des Allgemeinbefindens (Freßlust, Allergie usw.) beobachtet.
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Die testinfizierten Lämmer sowie nach einigen Tagen Verzögerung auch
die Kontrolltiere erkranken an einer typischen Orfinfektion. Dieser Befund zeigt,
daß das Orfvirusmaterial durch die vorangegangenen Passagen und Reinigungsstufen
noch nichts an seiner Pathogenität eingebüßt hat. Das genetisch einheitliche Virusmaterial
dient deshalb als Ausgangsmaterial für alle weiteren Manipulationen.
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Beispiel 2 Pustelmaterial von akut an Orf erkrankten, neugeborenen
Lämmern wird in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise angezUchtet, über 16 Passagen
in embryonalen Lammnierenkulturen vermehrt und über Klonselektion gereinigt. Das
Virusmaterial der 7. Plaquereinigung wird als Ausgangsmaterial für weitere 80 Kulturpassagen
in embryonalen Lammnierenkulturen verwendet. Dabei werden die in Beispiel 1 beschriebenen
Kontrolluntersuchungen bezüglich Reinheit, Unschädlichkeit und Wirksamkeit durchgeführt.
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Die 96. Passage in embryonalen Lammnîerenzellkulturen besitzt einen
Infektiositätstiter von 107,5 KID50/ml.
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Die index in Beispiel 1 beschriebene Weise mit dem Virusmaterial
der 96. Passage infizierten Lämmer erkranken typisch an einer Orfinfektion. Die
klinischen Symptome treten allerdings 1 bis 2 Tage später auf und sind nur noch
abortiv.
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ISaispiel 3 Das Virusmaterial aus Beispiel 2 (96. Kulturpassage)
wird über weitere 24 Passagen in embryonalen Lammnierenkellen vermehrt. Bei der
routinemäßigen Überprüfung der Virusernte der 120. Kulturpassage wird im Tierversuch
festgestellt, daß die infizierten Lämmer sowie die Kontaktlämmer nicht erkranken.
Daraufhin werden weitere 15 Passagen als zusätzliche Sicherheit durchgeführt.
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Die Virusernte der 135. Passage wird in der in Beispiel 1 beschriebenen
Weise 3mal mittels Plaquetechnik nach der Endverdünnungsmethode gereinigt, um ein
genetisch einheitliches Virusmaterial zu erhalten.
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Das Virusmaterial aus der 3. Plaquereinigung wird dann in sekundären
Nierenzellkulturen aus Schafembryonen vermehrt , gereinigt und bakteriologisch und
virologisch (Eletronenmikroskop, Serologie) nochmals überprüft. Insgesamt werden
auf diese Weise 2 Liter Saatvirusmaterial hergestellt, die nach Abschluß der Kontrollen
portioniert (a 4 ml), ohne Zusatz lyophilisiert und bei -800C gelagert werden. Dieses
Material dient als Saatvirus für die Herstellung des Orfvirus-Lebendimpfstoffes.
Vor der Lyophilisierung hat das Saatvirus einen Virustiter von 108'5 KID50/ml und
nach der Lyophilisierung einen solchen von 107'5 KID50/ml.
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Für die Herstellung des Orfvirus-Lebendimpfstoffes aus dem durch Plaquereinigung
erhaltenen Orfvirus-Impfstamm können
sekundäre Zellkulturen aus
Lungen von Rinderembryonen benutzt werden, deren Herstellung nach den üblichen Methoden
erfolgt. Das Zellsediment der Anzuchtpassagen wird dabei jeweils bakteriologisch
und mykologisch nach den internationalen Vorschriften auf Kontaminationen untersucht.
Das Anzuchtmedium der Zellkulturen besteht aus Lösung + 10 ß Lactalbumin + 10 d
fötales Rinderserurn sowie der üblichen Antibiotikazugabe. Beim Erhaltungsmedium
ist der prozentuale Anteil des Lactalbumin auf 5 ß und der des fötalen Rinderserums
auf 2 % gesenkt. Die Zellkulturen werden in Industrieflaschen stationär bebrütet.
Für die Animpfung der sekundären fötalen Rinderlungenkulturen wird Jeweils frisches
Saatvirus des Orfstammes D 1701 (plaquegereinigtes Virus) verwendet, das zuvor über
1 bis 2 Passagen in sekundären Rinderlungenzellkulturen adaptiert worden ist. Die
Animpfdosis beträgt etwa 4 x 107,5 KID50/ml in 4ml.
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Die infizierten Zellkulturen werden 4 Tage, d.h. bis zur Ausbildung
eines optimalen cpE, bei 370C bebrütet. Anschließend 0 werden die Zellkulturen in
toto bei -20 C eingefroren, wieder aufgetaut, gepoolt und für die erforderlichen
Kontrolluntersuchungen Proben entnommen. Danach lagert das Virusmaterial bis zum
Abschluß der Kontrolluntersuchungen bzw. bis zur Weiterverarbeitung bei 700 C. Entsprechen
alle Kontrollen den Sicherheitsvorschriften, wird die Virus ernte aufgetaut und
unter sterilen Bedingungen noch vorhandene Zellen und der Zelldetritus niedertourig
abzentrifugiert. Dem Überstand wird 2,5 % Molico (Magermilchpulver) und 2,5 % -Pepton
zugefügt und der pII-Wert auf 7,4 eingestellt.
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Der so vorbereitete Impfstoff wird portioniert und lyophilisiert.
Der Virustiter eines derartigen lyophilisierten Impfstoffes kann je nacn Charge
zwischen 106>5 bis 10ß, KID50/ml schwanken. Für die Impfungen wird das Lyophilisat
mit sterilem Aqua dest. aufgelöst. Die Impfdosis pro Tier beträgt 1 ml subcutan.
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Der Infektiositätstiter des erfindungsgemäßen, lyophilisierten Orf-Lebendimpfstoffes
ist bei einer Lagerung bei +4°C oder bei niedrigeren Temperaturen über mindestens
7 Jahre stabil. Entsprechende Lagerungsversuche mit 4 verschiedenen Impfstoffchargen
über 1, 2 bzw. 3 Jahre zeigten, daß der Infektiositätstiter bei geeigneter Lagerung.
bis zum 1020. Tag keinerlei Einbußen erleidet.
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B e i s p i e l 4 Um die Verwendungsmöglichkeit und die Wirksamkeit
des vermehrungsfähigen Orf-Impfstoffes der Erfindung zu zeigen, sind einige Beispiele
von prophylaktischen und postinfektionellen Impfversuchen im folgenden zusammengestellt:
A) Subcutane Impfung von 2 bis 4 Wochen alten, seronegativen Lämmern Die Tiere werden
mit 2 x 107 KID50/ml in 1 ml subcutan geimpft. Vor der Impfung sowie nach 2, 6 und
12 Wochen werden Blutproben entnommen. Die Antikörperbildung wird nach den bekannten
Verfahren mittels Serumneutralisationstest in Röhrchen-Sekundär-Kulturen aus embryonalen
Rinderlungen durchgerührt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
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Tabelle I
| Tier Serumtiter nach |
| Nr. |
| 2 Wochen 6 Wochen 12 Wochen |
| 1 0 0 1 : 16 |
| 2 1 : 128 1 : 16 1 : 16 |
| 3- 1 : 16 1 : 16 1 : 16 |
| 4 1 : 8 1 : 32 1 : 16 |
| 5 0 0 0 |
| 6 o o 1 : 16 |
| 7 1 : 16 0 1 : 16 |
| 8 0 1:8 1:8 |
| 9 1 : 8 1 : 16 1 : 16 |
Von 9 seronegativen, 2 bis 4 Wochen alten Lämmern> hatten 2
Wochen nach der Schutzimpfung 5 Tiere Serum-Titer von 1 : 8 bis 1 : 128, nach 3
Monaten reagierten 8 Tiere positiv. Lamm Nr. 5 blieb immer negativ.
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B) Cutane Belastungsinfektion (Challenge-Test) bei neugeborenen Lämmern
Von den 10 seronegativen zusammengestalltens neugeborenen Lämmern (1 bis 2 Tage
alt) wurden 3 Tiere mit 2 x 107>0 KID50/ml subcutan geimpft. 7 Tiere blieben
als Kontrollen ungeimpft. 21 Tage später wurden lmpflinge und Kontrollen mit 106
KID50 virulentem Orfvirus (16. Passage) percutan nach der Skarifikationsmethode/Herzberg
an der Schenkelinnenfläche (0,1 ml) testinfiziert.
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Die 3 seronegativen, im Alter von 1 bis 2 Tagen schuZzgeimpften Lämmer
reagierten in dem nach 21 Tagen durchgeführten cutanen Challenge-Test lokal nicht.
An den SkariLikationsstellen kam es weder zu einer infiltrativen, länger anhaltenden
Rötung mit Quaddelbildung noch zu einer Papel-oder Pustelbildung. Das Allgemeinbefinden
der Tiere war in einem Beobachtungszeitraum von 14 Tagen nicht gestört. Die 7 seronegativen
Kontrolltiere aus dem gleichen Orfvirusfreien Bestand, die 21 Tage im gleichen Raum
mit den 3 Impllingen gehalten wurden, reagierten auf die gleichzeitig mit den Impflingen
durchgeführten cutanen Belastungsinfektionen durchwegs positiv. Nach 2 bis 3 Tagen
kam es bei ihnen an den Skarifikationsstellen zu einer Rötung mit Quaddelbildung
und nachfolgender Entwicklung von typischen Bläschen bzw. Pusteln.Während dieser
Zeit war das Allgemeinbefinden der Tiere leicht gestört (verminderte Futteraufnahme,
1 bis 2 Tage geringgradige Temperaturerhöhung). Zu einer Allgemeinkrankheit kam
es nicht. Die Bläschen und Pusteln trockneten nach 4 bis 5 Tagen ein und verschorften.
Nach 10 bis 14 Tagen waren die Tiere wieder gesunde
C) Postinfektionelle
Notimpfung von neugeborenen Lämmern an der Mutter Die klinisch kontrollierbare Wirksamkeit
ließ sich unter Praxisbedingungen bei den Notimpfungen untersuchen. Eine besondere
Gruppe bildeten dabei die in den ersten Lebenstagen geimpften Lämmer an der Mutter.
Bei diesen Impfungen wurden als Kriterium der Wirksamkeit die Morbiditäts- und Mortalitätsraten
in einem vergleichsweisen Zeitraum vor und nach der Impfung ein und derselben Herde
bzw. Mastperiode herangezogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.
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Tabelle II
| Status vor der Impfung Status nach der Impfung |
| Herde Morbidität Mortalität Zahl der Morbidität Mortalität |
| Lämmer |
| 1 100 % 20,5 % 278 21 % 0,7 % |
| 2 50-60 % 3 % 480 10 % 0 |
| 3 100 % 0 326 20 % 0 |
| 4 100 % 0 22 0 0 |
In 4 Herden, für die vergleichbare Morbiditäts- und Mortalitätszahlen
der vorangegangenen Perioden verfügbar waren, konnte die Wirksamkeit einer Notimpfung
statistisch erfaßt werden. Es handelte sich insgesamt um 1106 Lämmer. In allen 4
Herden führte die Not impfung zu einer drastischen Senkung sowohl der Morbidität
als auch der Mortalität. Bei den Lämmern an der Mutter sank die Morbidität von vorher
50 bis 100 % auf 0 bis 21 $ und die Mortalität von vorher 0 bis 20,5 ç auf O - 0,7
%. Bei Lämmern, die trotz Impfung erkrankten, verlief die Krankheit mild bis abortiv.
An Lippen und Maulschleimhaut entwickelten sich wenige Bläschen ohne Störung des
Allgemeinbefindens. Die Bläschen trockneten rasch ein und die Futteraufnahme war
nicht gestört.
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D) Postinfektionelle Impfung von Lämmern an der Lammbar Die zur Mast
an der Lammbar aurgestallten, einige Tage alten Lämmer, erkranken bei der enzootischen
Verseuchung unserer Schafbestände mit Orfvirus in Problembetrieben fast regelmäßig
an Pustulardermatitis mit relativ hohen Verlustquoten.
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Die Gründe hierfür sind vielfältig: Durchseuchte Mütter übertragen
auf die Neugeborenen nur gelegentlich eine belastbare, passive Immunität, die Neugeborenen
infizieren sich sofort, die Fähigkeit zu einer aktiven Immunitätsbildung ist bei
ihnen noch nicht voll entwickelt und die Gegebenheiten der Lammbar führen zunächst
zu einem starken Streß mit immunsuppressiven Folgen. Eine aktive Schutzimpfung der
zur Lammbar aufgestallten Tiere gegen Ecthyma ist deshalb von Anfang an problematisch.
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Die aktive Immunisierung wurde mit einer zweimaligen Impfung versucht:
1. Impfung bei der Aufstallung (2 bis 3 Tage alte Lämmer), 2. Impfung nach 10 bis
14 Tagen. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.
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Tabelle III
| Problem- Status vor der Impfung Status nach der Impfung |
| betrieb Morbidität Mortalität Zahl der Morbidität Mortalität |
| Lämmer |
| A 100 % 7,7 % 124 66,1 % 0 |
| B 100 % 66 % 31 93,5 % 3,2 |
Der Erfolg der Schutzimpfung war zwar überraschend, aber hinsichtlich
der Morbidität nicht befriedigend, denn die Morbiditätsraten ließen sich nur geringgradig
senken. Der Krankheitsverlauf war jedoch durchwegs milder und die Milchaufnahme
wurde demzufolge nicht unterbrochen, Es kam zu keinen nennenswerten Gewichtsverlusten
und der Entwicklungsrückstand war nur geringfügig. Die schweren Verlaufsformen mit
Todesfolge konnten durch die Schutzimpfung dagegen drastisch reduziert werden. In
dem Problembetrieb "A" sank die Mortalität von 7,7 auf 0 und in dem Problembetrieb
"B" von 66 % auf 3,2 %.
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Beispiel 5 Für den erfindungsgemäßen Orfvirus-Lebendimpf stoff werden
folgende Impfprogramme empfohlen: 1. Prophylaktische Impfungen a) Alle Tiere, die
älter als 3 Monate sind, werden unabhängig vom Trächtigkeitsstadium einmal subcutan
geimpft.
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b) Schafe unter 3 Monaten werden zweimal im Abstand von 4 bis 6 Wochen
subcutan geimpft.
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c) Je nach Seuchenlage werden die Schutzimpfungen halbjährlich bis
Jährlich wiederholt.
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2. Notimpfungen a) Alle noch nicht erkrankten Tiere werden sofort
wie bei den prophylaktischen Schutzimpfungen subcutan geimpft.
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b) Neugeborene Lämmer werden am 1. oder 2. Lebenstag erstmals subcutan
geimpft, nach 10 bis 14 Tagen und 3 Monaten werden sie revacciniert.
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Die Impfdosis kann unabhängig vom Alter 1 ml,en'tsnrechend 106'5 bis
107'5 KID50 Orf-Lebendimpfstoff, betragen. Der Impfstoff wird subcutan verabreicht.
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Für den Erfolg der Schutzimpfung, gleichgültig, ob es sich um die
Prophylaxe oder Not impfung handelt, ist wichtig, daS wirklich alle Tiere in das
Impfprogramm einbezogen werden.
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Wird bei den prophylaktischen Schutzimpfungen die Impfimmunität der
Herde durch jährliche Revaccinationen aufrechterhalten, so verstärkt sie sich. Hiervon
profitieren vor allem die Neugeborenen, einmal über einen besseren Immuntransfer
von der Mutter auf das Neugeborene und zum anderen durch den immer geringer werdenden
Infektionsdruck. In gut immunis-ierten Herden kann sich das Feldvirus nicht mehr
vermehren.
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Hierdurch werden auch die indirekten Schäden einer Orf-In-Sektion
bei den Tieren vermieden (z.B. höhere Anfälligkeit für Mischinfektionen oder Moderhinke).