DE69634334T2 - Kultivierung von lawsonia intracellularis, impfstoffe gegen lawsonia intracellularis und diagnostische agenzien - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft anti-Lawsonia intracellularis-Impfstoffe und Verfahren zum Schützen gegen Lawsonia intracellularis-Infektionen und zum Diagnostizieren dieser Infektionen. Die Produkte und Verfahren der Erfindung erschließen sich teilweise als Ergebnis des verbesserten Verfahrens, das wir für die Züchtung von L. intracellularis im Großmaßstab aufgefunden haben.
  • Beschreibung des Stands der Technik
  • L. intracellularis, der Verursacher von porziner proliferativer Enteropathie ("PPE") befällt praktisch sämtliche Tiere, einschließlich Menschen, Kaninchen, Frettchen, Hamster, Füchse, Pferde und so andersartige Tiere, wie Strauße und Emus.
  • L. intracellularis stellt eine Hauptursache von Verlusten in Schweineherden dar. Schätzungen über die Verbreitung und das Auftreten von PPE in den USA haben ergeben, dass etwa 20% der Schweineherden betroffen sind und sich die geschätzten Verluste auf 20 Millionen Dollar jährlich belaufen.
  • Ein übereinstimmendes Merkmal von PPE ist das Auftreten von intrazytoplasmatischen, nicht-membrangebundenen, gekrümmten Bazillen innerhalb von Enterozyten in betroffenen Bereichen des Darms. Die mit PPE assoziierten Bakterien werden als "Campylobacter-ähnliche Organismen" bezeichnet; S. McOrist et al., Vet. Pathol., Bd. 26, (1989), S. 260–264. Später wurden die verursachenden Bakterien als neue taxonomische Gattung und Spezies identifiziert und lokal als "Ileal symbiont (IS) intracellularis" bezeichnet; C. Gebhart et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Bd. 43, Nr. 3 (1993), S. 533–538. Neuerdings werden diese Bakterien mit der taxonomischen Bezeichnung Lawsonia (L.) intracellularis bezeichnet; S. McOrist et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Bd. 45, Nr. 4, (1995), S. 820–825. Diese drei Namen werden in austauschbarer Weise zur Bezeichnung des gleichen Organismus, der hier näher identifiziert und beschrieben wird, verwendet. Wir sind bestrebt, während der gesamten Erörterung der vorliegenden Erfindung die taxonomische Bezeichnung L. intracellularis zu verwenden.
  • L. intracellularis ist ein obligates, intrazelluläres Bakterium, das durch normale bakteriologische Verfahren auf herkömmlichen zellfreien Medien nicht gezüchtet werden kann und von dem bekannt ist, dass es für das Wachstum an epitheliale Zellen angeheftet sein muss. S. McOrist et al., Infection and Immunity, Bd. 61, Nr. 10 (1993), S. 4286–4292, und G. Lawson et al., J. of Clinical Microbiology, Bd. 31, Nr. 5 (1993), S. 1136–1142 erörtern die Züchtung von L. intracellularis unter Verwendung von IEC-18-Darmepithel-Zellmonoschichten von Ratten in herkömmlichen Gewebekulturkolben. Ferner erörtert H. Stills, Infection and Immunity, Bd. 59, Nr. 9 (1991), S. 3227–3236 die Verwendung von humanen embryonalen "Intestine 407"-Darmzell-Monoschichten und GPC-16-Meerschweinchen-Kolonadenokarzinom-Zellmonoschichten in herkömmlichen Gewebekulturkolben. Diese früheren Züchtungsverfahren sind arbeitsintensiv und eignen sich nicht zur Durchführung in größerem Maßstab.
  • Die Gewinnung von Erkenntnissen über L. intracellularis-Infektionen und die Behandlung und wirksame Bekämpfung der Krankheit wird durch die anspruchsvollen Wachstumsbedingungen von L. intracellularis in in vitro-Kulturen behindert. Zur Zeit besteht ein Bedürfnis nach einem verbesserten Verfahren zur Züchtung von L. intracellularis. Ferner gibt es ein Bedürfnis nach anti-L. intracellularis-Impfstoffen und wirksamen Werkzeugen zur Diagnose von L. intracellularis-Infektionen.
  • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Züchtungsverfahren bereitzustellen, das die Züchtung von L. intracellularis im Großmaßstab zur Herstellung von Impfstoffen und diagnostischen Mitteln ermöglicht.
  • Zur Lösung dieser und weiterer Aufgaben und in Übereinstimmung mit der hier vorgestellten und breit beschriebenen Erfindung wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Züchtung von L. intracellularis und zur Gewinnung von großen Mengen an dadurch gebildeten Bakterien bereitgestellt.
  • Erfindungsgemäß werden L. intracellularis-Bakterien bei einer Sauerstoffkonzentration von etwa 0 bis etwa 18% inkubiert, wobei die Bakterien zur Züchtung von L. intracellularis bewegt werden und die Bakterien in Suspension gehalten werden.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Züchtung von L. intracellularis-Bakterien durch Inokulieren einer HEp-2-, McCoys- oder IEC-18-Zellmonoschicht, die eine Konfluenz von etwa 30% zeigt, mit einem Inokulum, das L. intracellularis-Bakterien umfasst, so dass die Zellen mit den Bakterien infiziert werden, bereitgestellt. Die infizierten Zellen werden sodann bei einer Temperatur von etwa 36 bis etwa 38°C bei einer Sauerstoffkonzentration von etwa 0% bis etwa 8,0% gezüchtet, bis die Zellen Konfluenz erreichen. Die infizierten Zellen und Wachstumsmedien werden sodann in einen Fermenter, Bioreaktor, Rührkolben oder einen anderen Behälter, der sich zur Aufrechterhaltung der Zellen in Suspension eignet, gegeben. Die infizierten Zellen werden sodann unter Bewegen der Zellen inkubiert, um die L. intracellularis- Bakterien zu züchten, während die infizierten Zellen in Suspension gehalten werden. Ein Teil des gezüchteten L. intracellularis wird sodann einer Passage auf frischen Kulturzellen unterzogen, um die Produktion von L. intracellularis-Bakterien zu erhöhen.
  • Avirulente L. intracellularis-Bakterien werden erzeugt, indem man die gezüchteten L. intracellularis-Bakterien einer ausreichenden Anzahl an Passagen unterzieht und einen geschwächten Stamm auswählt oder indem man die gezüchteten Bakterien chemischen Maßnahmen zur Abschwächung unterwirft. Ferner werden unter Anwendung der erfindungsgemäßen Züchtungsverfahren abgetötete L. intracellularis-Impfstoffe hergestellt. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Bakterien kontinuierlich mindestens etwa 6 bis 8 Monate gezüchtet, während sie mindestens etwa 7 bis 12 Passagen unterzogen werden, um einen abgeschwächten Stamm zur Verwendung als Impfstoff zu erzeugen. Die abgeschwächten Bakterien werden sodann mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff vermischt und einem Tier in einer zur Erzeugung einer Immunreaktion wirksamen Menge verabreicht. Wir haben den derzeit bevorzugten abgeschwächten Stamm (N343NP40wk) bei der American Type Culture Collection hinterlegt.
  • Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden in der nachstehenden Beschreibung dargelegt und ergeben sich aus der Beschreibung oder können bei der praktischen Durchführung der Erfindung erfasst werden.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Der hier verwendete Ausdruck "L. intracellularis" bedeutet intrazelluläre, gekrümmte, gram-negative Bakterien, die ausführlich von C. Gebhart et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Bd. 43, Nr. 3 (1993), S. 533–538, und von S. McOrist et al. Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Bd. 45, Nr. 4 (1995), S. 820–825, beschrieben worden sind. Der Ausdruck umfasst (ohne Beschränkung hierauf) die folgenden Bakterien: das bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, unter der Hinterlegungsnummer ATCC 55672 hinterlegte Bakterium; die bei der National Collection of Type Cultures, Colindale, London, unter den Hinterlegungsnummern NCTC 12656 und 12657 hinterlegten Bakterien; die verursachenden Bakterien, die aus mit PPE infizierten Schweinen oder anderen Tieren in der gesamten Welt bei Kenntnis des Stands der Technik und der hier vermittelten Lehre erhalten werden können; und Varianten oder Mutanten von beliebigen der vorstehenden Bakterien, unabhängig davon, ob sie spontan oder auf künstlichem Wege erhalten worden sind.
  • Der hier verwendete Ausdruck "abgeschwächter Stamm" bedeutet beliebige L. intracellularis-Stämme, die durch die hier beschriebenen Züchtungs- und Passagetechniken zur Erzielung einer avirulenten Beschaffenheit unter Aufrechterhaltung der immunogenen Eigenschaften bei Verabreichung an ein Wirtstier erhalten werden können. Wie nachstehend dargelegt, wurden mehrere unterschiedliche L. intracellularis-Stämme nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gezüchtet und abgeschwächt, um abgeschwächte immunogene Stämme mit Wirksamkeit als Impfstoffe bei Schweinen und anderen Tieren, die gegenüber L. intracellularis-Infektionen empfindlich sind, zu erhalten.
  • Es ist zu erwarten, dass sich die erfindungsgemäßen abgeschwächten Stämme als Immunogene in antimikrobiellen Impfstoffen für Tiere, einschließlich Vögeln, Fischen, Rindern, Schweinen, Pferden, Säugetieren und Primaten im allgemeinen und Menschen, eignen. Derartige Impfstoffe lassen sich unter Berücksichtigung der hier vermittelten Lehre nach dem Fachmann geläufigen Techniken herstellen. Ein derartiger Impfstoff enthält eine immunologisch wirksame Menge des abgeschwächten Stammes in einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff. Der Impfstoff kann in einer oder mehreren Dosen verabreicht werden. Eine immunologisch wirksame Menge lässt sich ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand unter Berücksichtigung der hier vermittelten Lehre durch aus dem Stand der Technik bekannte Maßnahmen bestimmen. Die Menge der avirulenten Bakterien soll ausreichen, um eine Immunreaktion bei krankheitsempfindlichen Tieren zu stimulieren, wobei sie aber immer noch avirulent sind. Dies hängt vom speziellen Tier, dem Bakterium und der betroffenen Krankheit ab. Die empfohlene Dosis, die dem empfindlichen Tier zu verabreichen ist, beträgt vorzugsweise etwa 103 bis 109 Bakterien/kg Körpergewicht und insbesondere etwa 105 bis etwa 107 Bakterien/kg Körpergewicht. Die Trägerstoffe sind dem Fachmann geläufig und umfassen Stabilisatoren und Verdünnungsmittel. Ein derartiger Impfstoff kann auch ein geeignetes Adjuvans enthalten. Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können in Kombination mit anderen Impfstoffen verwendet werden, z. B. als Verdünnungsmittel eines anderen lyophilisierten Impfstoffes, oder sie können vor der Lyophilisation mit einem anderen Impfstoff vereinigt werden. Die Impfstoffpräparate können auch getrocknet werden, z. B. durch Gefriertrocknung für Lagerungszwecke oder für die anschließende Zubereitung zu flüssigen Impfstoffen.
  • Der hier verwendete Ausdruck "großtechnische Züchtung" bedeutet einen Züchtungsumfang von L. intracellularis von mehr als etwa 2,0 bis 3,0 Liter und umfasst die Herstellung im Maßstab von 100 Litern oder mehr. Der hier verwendete Ausdruck "Züchtung" bedeutet ein Verfahren zur Förderung des Wachstums, der Reproduktion und/oder Proliferation von L. intracellularis.
  • Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Züchtungsverfahrens können Kulturzellen zunächst mit einem Inokulum, das L. intracellularis-Bakterien enthält, inokuliert werden, um die Zellen mit den Bakterien zu infizieren. Zur praktischen Durchführung der Erfindung können zahlreiche Zelllinien verwendet werden, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) IEC-18 (ATCC 1589) – intestinale Epithelzellen von Ratten, HEp-2 (ATCC 23) – humane epidermoide Karzinomzellen, McCoys (ATCC 1696) – (nicht-spezifizierte) Mäusezellen, MDCK (ATCC 34) – Madin-Darby-Hundenierenzellen, BGMK (Biowhittaker #71-176) – Buffalo-Green-Monkey-Nierenzellen und intestinale Epithelzellen von Schweinen. Bei den bevorzugten Kulturzellen handelt es sich um HEp-2-, McCoys- oder IEC-18-Zellen. Alternativ können die Bakterien in einem zellfreien System gezüchtet werden, sofern die Bakterien bei der entsprechenden Konzentration von gelöstem O2 gemäß der hier gegebenen Lehre gehalten werden.
  • Bei Verwendung von Kulturzellen befinden sich die Zellen vor der Inokulation vorzugsweise (jedoch nicht notwendigerweise) in Form einer Monoschicht. Zur Bildung einer Monoschicht können die Zellen auf herkömmliche Kolben überimpft werden. Die einzelnen Kolben werden im allgemeinen mit etwa 1 × 105 Zellen bis etwa 10 × 105 Zellen pro 25 cm2-Kolben im Gemisch mit Wachstumsmedium beimpft. Bei den Wachstumsmedien kann es sich um beliebige Medien für die Zellzüchtung handeln, die eine Stickstoffquelle, notwendige Wachstumsfaktoren für die gewählten Kulturzellen und eine Kohlenstoffquelle, wie Glucose oder Lactose, enthalten. Beim bevorzugten Medium handelt es sich um DMEM mit 2–5% fötalem Kälberserum, obgleich auch verschiedene handelsübliche Medien unter Erzielung von guten Ergebnissen verwendet werden können.
  • Wir haben festgestellt, dass eine erfolgreiche Züchtung von L. intracellularis verstärkt wird, indem man die Kulturzellen in einem konstanten Wachstumsstadium hält. Daher soll die Kulturzellen-Monoschicht zum Zeitpunkt der Inokulation eine Konfluenz von etwa 20% bis etwa 50% aufweisen. Vorzugsweise sollen sich die Zellen zum Zeitpunkt der Inokulation in einem Konfluenzzustand von etwa 30% bis etwa 40% befinden, wobei eine Konfluenz von etwa 30% besonders bevorzugt wird.
  • Beim Inokulum kann es sich um eine reine Kultur von L. intracellularis handeln, die beispielsweise aus den hinterlegten Stämmen ATCC 55672, NCTC 12656 oder NCTC 12657 oder von infizierten Schweinen oder anderen Tieren unter Anwendung der hier beschriebenen Isolierungs- und Reinigungstechniken erhalten worden sind.
  • Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich beim Inokulum für die praktische Durchführung der Erfindung um ein intestinales Homogenisat, das durch Abschaben von Schleimhaut des Ileums eines mit PPE infizierten Schweins oder eines anderen infizierten Tiers hergestellt worden ist. Bei der Herstellung eines intestinalen Homogenisats sollen die für die Züchtung ausgewählten ilealen Schnitte schwere Läsionen mit starker Verdickung des Darms aufweisen. Aufgrund der fragilen Natur der Bakterien sollen Proben vorzugsweise nach der Nekropsie so rasch wie möglich bei –70°C gelagert werden. Vorzugsweise wird ein Antibiotikum, gegenüber dem L. intracellularis resistent ist, wie Vancomycin, Amphotericin B oder Mitglieder der Aminoglycosidgruppe von Antibiotika, einschließlich Gentamicin und Neomycin, um nur einige aufzuführen, dem Inokulum zugesetzt, um verunreinigende Bakterien zu unterdrücken, jedoch das Wachstum von L. intracellularis zuzulassen. Unabhängig davon, ob es sich beim Inokulum um eine reine Kultur oder um ein intestinales Homogenisat handelt, kann die Inokulation der Kulturzellen durch verschiedene, aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren unter Berücksichtigung der hier gegebenen Lehre vorgenommen werden.
  • Die Bakterien und/oder inokulierten Kulturzellen werden sodann unter einer verringerten Konzentration an gelöstem O2 inkubiert. Bei Konzentrationen an gelöstem Sauerstoff von mehr als 18% ergibt sich ein suboptimales Wachstum von L. intracellularis, wobei das Wachstum schließlich bei Sauerstoffkonzentrationen außerhalb dieses Bereiches zum Stillstand kommt. Vorzugsweise werden die inokulierten Kulturzellen bei einer Konzentration an gelöstem Sauerstoff im Bereich von etwa 0 bis etwa 10% inkubiert. Insbesondere werden die Zellen bei einer Sauerstoffkonzentration im Bereich von etwa 0 bis etwa 8% inkubiert, wobei eine Sauerstoffkonzentration von etwa 0% bis etwa 3,0% besonders bevorzugt wird.
  • Ferner ist für das einwandfreie Wachstum von L. intracellularis eine geeignete Konzentration an Kohlendioxid von Bedeutung. Bei Kohlendioxidkonzentrationen von mehr als 10% und weniger als 4% kommt es zu einem nicht-optimalen Wachstum, wobei das Wachstum bei Kohlendioxidkonzentrationen außerhalb dieses Bereiches schließlich zum Stillstand kommt. Vorzugsweise liegt die Kohlendioxidkonzentration im Bereich von etwa 6% bis etwa 9%, wobei eine Kohlendioxidkonzentration von etwa 8,8% besonders bevorzugt wird.
  • Ferner werden die Zellen vorzugsweise bei einer Wasserstoffkonzentration im Bereich von etwa 73 bis etwa 94% inkubiert. Stickstoff kann anstelle eines Teils oder der Gesamtheit des vorhandenen Wasserstoffes verwendet werden. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen bei etwa 0–8,0% O2, etwa 8,8% CO2 und etwa 83,2% H2 inkubiert.
  • Inokulierte Zellen können in einem doppelten Gasinkubator oder einer anderen Gaskammer, die die geeigneten Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentrationen enthalten und die einen Suspensionszustand der Zellen während der Inkubation ermöglichen, inkubiert werden. Die Kammer soll eine Einrichtung aufweisen, um die inokulierten Zellen in Suspension zu halten. Ferner soll sie einen Gasmonitor und eine Gaszufuhrquelle zur Zufuhr und Aufrechterhaltung der geeigneten Gaskonzentrationen aufweisen. Die Inkubationstemperatur soll im Bereich von 30°C bis 45°C und vorzugsweise im Bereich von etwa 36°C bis etwa 38°C liegen. Insbesondere beträgt die Temperatur etwa 37°C. Die notwendige Ausrüstung für die erfindungsgemäßen Züchtungs- und Abschwächungsverfahren ist für den Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet unter Berücksichtigung der hier vermittelten Lehre leicht zugänglich. Ein Beispiel für eine Ausrüstung, die zur Durchführung der Erfindung geeignet ist, ist ein doppelter Gasinkubator, z. B. das von der Fa. Lab-Line, Melrose Park, Illinois, erhältliche Modell 480, in Verbindung mit Rührkolben, um die Zellen in Suspension zu halten. Die derzeit bevorzugte Ausrüstung umfasst einen Fermenter, einen Bioreaktor oder eine Drehschüttelvorrichtung mit einem Gehalt an mindestens etwa 2 Liter Medium, die zur Aufrechterhaltung der Kulturzellen in Suspension durch Einleiten von Gas in geeigneter Konzentration oder durch andere Maßnahmen einer mechanischen Bewegung befähigt sind, wobei die kontinuierliche Überwachung der Konzentration an gelöstem O2 im Medium ermöglicht wird. Die Firmen New Brunswick, Braun und andere Firmen stellen geeignete Fermenter und Bioreaktoren für diesen Zweck her.
  • Durch Aufrechterhaltung eines suspendierten Zustands der inokulierten Zellen während der Inkubation wird ein maximales Wachstum der Zellen und somit von L. intracellularis erreicht, wobei man die Belastung der einzelnen Zellen gegenüber dem Wachstumsmedium und dem geeigneten Gemisch aus Sauerstoff und Kohlendioxid erhöht. Die Kulturzellen können nach verschiedenen, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren bewegt und in Suspension gehalten werden, wozu beispielsweise Kulturkolben, Rollflaschen, Membrankulturen und Rührkolben gehören. Die Zellen können während der Inkubation in Suspension gehalten werden, indem man sie in einem Rührkolben im Innern eines doppelten Gasinkubators oder einer ähnlichen Vorrichtung inkubiert. Der hier verwendete Ausdruck "Rührkolben" bedeutet einen Kolben oder einen anderen Behälter, der sich einer Schaufel, eines Rührflügels oder eines anderen Mittels bedient, um die Kultur zu bewegen und die darin enthaltenen Zellen in Suspension zu halten.
  • Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die inokulierten Zellen inkubiert, bis die Zellen einen konfluenten Zustand erreichen. Anschließend werden die Zellen in einen Rührkolben, der Wachstumsmedium enthält, gegeben und in einem doppelten Gasinkubator inkubiert, wobei im Kolben für einen Rührvorgang gesorgt wird. Vorzugsweise werden die inokulierten Zellen in den Rührkolben geschabt. Dies kann durch verschiedene, dem Fachmann geläufige Maßnahmen erfolgen, beispielsweise unter Verwendung eines Zellschabers, um die Zellen abzulösen. Nachdem die Zellen in den Rührkolben gebracht worden sind, wird die Schaufel des Rührkolbens typischerweise mit etwa 30 bis etwa 60 U/min gedreht, um zu erreichen, dass die infizierten Zellen in Suspension gehalten werden.
  • Eine Portion von gezüchtetem L. intracellularis wird sodann einer Passage auf frische Kulturzellen unterworfen, um die Bildung von L. intracellularis-Bakterien zu erhöhen. Der Ausdruck "Passage" oder Variationen davon bedeuten den Vorgang der Übertragung eines Teils der gezüchteten L. intracellularis-Bakterien auf frische Kulturzellen, um die frischen Zellen mit dem Bakterium zu infizieren. Der hier verwendete Ausdruck "frisch" bedeutet Zellen, die noch nicht mit L. intracellularis infiziert worden sind. Vorzugsweise sind derartige Zellen durchschnittlich nicht mehr als etwa 1 Tag alt.
  • Die Passage von L. intracellularis in Suspensionskulturen kann erreicht werden, indem man einen Teil der ursprünglichen Kultur entnimmt und in einen neuen Kolben mit einem Gehalt an frischen Kulturzellen gibt. Wenn die ursprüngliche Kultur eine hohe Anzahl an Bakterien/ml aufweist, z. B. mehr als etwa 104 Bakterien/ml, ist es bevorzugt, etwa 1 bis 10% (Vol./Vol.) Kultur aus dem infizierten Kolben in einen neuen Kolben mit einem Gehalt an frischen Zellen zu geben. Dies wird vorzugsweise durchgeführt, wenn 50–100% der Zellen infiziert sind. Wenn weniger als 50% der Zellen infiziert sind, wird eine Passage vorzugsweise erreicht, indem man die Kultur im Verhältnis von 1:2 in einen neuen Kolben aufteilt und das Volumen durch frisches Medium auffüllt. In beiden Fällen sind eine Zelllysis und andere Stufen nicht erforderlich, in direktem Gegensatz zur Passage von Monoschicht-Kulturen gemäß dem Stand der Technik.
  • Nach ausreichendem Wachstum der Kulturzellen und anschließender Infektion von L. intracellularis mit einer Zellinfektivität von mehr als etwa 70%, bestimmt durch IFA, TCID50 oder ein anderes vergleichbares Verfahren, wird mindestens ein Teil der gezüchteten L. intracellularis-Bakterien geerntet. Die Erntestufe kann durchgeführt werden, indem man die Bakterien aus der Suspension nach verschiedenen, dem Fachmann geläufigen Techniken unter Berücksichtigung der hier vermittelten Lehre abtrennt. Vorzugsweise werden die L. intracellularis-Bakterien geerntet, indem man den Inhalt der gesamten Suspension oder eines Teils davon zentrifugiert, um die Kulturzellen zu pelletisieren, anschließend die erhaltenen Zellpellets resuspendiert und die infizierten Zellen lysiert. Typischerweise wird mindestens ein Teil des Inhalts etwa 20 Minuten mit etwa 3000 × g zentrifugiert, um die Zellen und Bakterien zu pelletisieren. Das Pellet kann sodann beispielsweise in einer Saccharose-Phosphat-Glutamat-(SPG)-Lösung resuspendiert und einer etwa 4-maligen Passage durch eine Nadel Nr. 25 unterzogen werden, um die Zellen der Lysis zu unterziehen. Wenn eine weitere Reinigung erwünscht ist, können die Proben etwa 5 Minuten mit etwa 145 × g zentrifugiert werden, um Zellkerne und Zellbruchstücke zu entfernen. Der Überstand kann sodann etwa 20 Minuten mit etwa 3000 × g zentrifugiert werden. Das erhaltene Pellet kann in einem geeigneten Verdünnungsmittel, wie SPG mit fötalem Kälberserum (zur Herstellung von geernteten Bakterien, die sich zum Einfrieren oder zur Verwendung als Inokulum eignen) oder Wachstumsmedium (zur Herstellung von geernteten Bakterien, die sich besser für die Passage auf frische Zellen eignen), resuspendiert werden.
  • Wie vorstehend erwähnt, wird ein wirksames Wachstum von L. intracellularis für die großtechnische Erzeugung verstärkt, indem man die Gewebezellen in einem aktivem Wachstumszustand hält. Bei Monoschichten nimmt die Geschwindigkeit der Zellteilung dann, wenn die Kulturen konfluent werden, erheblich ab. Versuche zur Züchtung von L. intracellularis auf Monoschicht-Gewebekulturen waren nur beschränkt erfolgreich und eine Vergrößerung des Herstellungsmaßstabs war nicht möglich. Dagegen erleichtert die Verwendung von Suspensionskulturen in erheblichem Maße die Aufrechterhaltung der Zellen in aktivem Zustand und ermöglicht eine kontinuierliche Kulturexpansion und Vergrößerung des Herstellungsmaßstabs. Unter Verwendung eines Fermenters und von etwa 0–3% gelöstem O2 gemäß der vorstehenden Erläuterung war es uns möglich, bis zu etwa 108 Bakterien/ml zu züchten. Ferner waren wir in der Lage, die gezüchteten Bakterien für viele Monate in aktivem Zustand zu halten. Wir erwarten, dass dies unbegrenzt möglich ist.
  • Vor der vorliegenden Erfindung nahm man allgemein an, dass Zellen an einer Oberfläche haften müssen, um mit L. intracellularis infiziert werden zu können. Die erfindungsgemäßen Zellsuspensionen stellen etwas Besonderes dar und stehen im Widerspruch zu dieser Theorie. Bei Verwendung von McCoys- oder IEC-18-Zellen werden vorzugsweise Gelatine-, Agarose-, Kollagen-, Acrylamid- oder Siliciumdioxid-Kügelchen, wie die porösen Cultisphere-G-Mikroträger der Fa. HyClone Laboratories, Logan, UT, zusammen mit dem Wachstumsmedium zugesetzt. Jedoch erfordern HEp-2-Zellen und andere Zellen beim erfindungsgemäßen Züchtungsverfahren keine Mikroträger. Dies ergibt einen besonders vorteilhaften und wirtschaftlichen Weg zur großtechnischen Züchtung.
  • Zur Aufrechterhaltung von Kulturen werden bei HEp-2-Kulturen in wöchentlichen Abständen vorzugsweise 25–50% der Kultur entnommen und durch frisches Medium ersetzt. Für Zellkulturen mit Mikroträgern oder Kügelchen werden vorzugsweise 1- bis 2-mal wöchentlich 25–50% der Kultur entnommen und durch frische Mikroträger oder Kügelchen und frisches Medium ersetzt. Für großtechnische Zwecke können weitere 25–50% Medium oder Medium mit Mikroträgern der Kultur zugesetzt werden.
  • Je nach der Geschwindigkeit, mit der die Kulturzellen infiziert werden, erfolgt eine Passage auf frische Zellen etwa alle 2 bis etwa 5 Wochen. Unter der Annahme, dass die Kulturzellen innerhalb von 2–3 Wochen zu mindestens 70% infiziert werden, erfolgt eine Passage vorzugsweise etwa alle 3 bis 4 Wochen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen gegen L. intracellularis bereit. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird nach Aufrechterhaltung der infizierten Zellen in Suspension für einen längeren Zeitraum (z. B. 6–8 Monate) mindestens ein Teil der gezüchteten L. intracellularis-Bakterien geerntet und auf eine mögliche Abschwächung überprüft. Eine derartige Überprüfung wird vorzugsweise durch Belastung von Wirtstieren oder Tiermodellen vorgenommen, um einen abgeschwächten Stamm auszuwählen. Derartige abgeschwächte Stämme werden gemäß der hier vermittelten Lehre in Impfstoffen verwendet. Die erfindungsgemäßen Impfstoffe mit abgeschwächtem L. intracellularis haben sich als wirksam gegen eine L. intracellularis-Infektion bei verschiedenen Tieren erwiesen. Eine Wirksamkeit beim Menschen ist ebenfalls zu erwarten.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine rasche Kulturerweiterung, eine 100- bis 1000-fache Ausbeutesteigerung und eine Kostenverminderung. Im Ergebnis lässt sich für die Impfstoffherstellung die reichliche Produktion von L. intracellularis-Bakterien, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugt worden sind, leicht abschwächen. Eine Abschwächung ist in Monoschichtkulturen aufgrund der geringen Ausbeute an Bakterien, die durch herkömmliche Monoschicht-Züchtungsverfahren erzeugt werden, schwierig. Im Gegensatz dazu ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren zur Züchtung von L. intracellularis einen erheblich leichteren und schnelleren Zugang zu einer großen Anzahl von Bakterien für diesen Zweck. Je mehr Zellen und Zellteilungen auftreten, desto größer ist der Grad an vorkommenden Mutationen, was bei der Impfstoffentwicklung einen Vorteil darstellt. Ein Wachstum in Suspension nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhöht die Expression von wichtigen Immunogenen, die durch umweltbedingt regulierte Gene gesteuert werden, und von deren Expressionsprodukten.
  • Die erhaltenen abgeschwächten Stämme können in Gewebekultur-Monoschichten gemäß den Angaben im nachstehenden Beispiel 1 gezüchtet werden, werden aber vorzugsweise nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in Suspensionskulturen gezüchtet. Zu weiteren Maßnahmen für eine Abschwächung gehören eine chemische Abschwächung, z. B. unter Verwendung von N-Methylnitrosoguanadin und anderen bekannten Mitteln. Unabhängig davon, ob mehrfache Passagen oder chemische Maßnahmen zum Einsatz kommen, wird ein abgeschwächtes L. intracellularis erzeugt und für Impfzwecke ausgewählt.
  • Allgemein wird ein abgeschwächter, immunogener L. intracellularis-Stamm nach kontinuierlicher Züchtung von mindestens etwa 150 bis 250 Tagen erzeugt, wobei während dieser Zeit die Kultur mindestens etwa 7 bis etwa 12 Passagen unterzogen wird. Weitere abgeschwächte Kulturen können unter Abänderung dieser Zahlen erzeugt werden, sofern man sich der Überwachungs- und Auswahlverfahren gemäß der hier vermittelten Lehre bedient.
  • Nachstehend wird die Erfindung anhand der folgenden Beispiele erläutert, die jedoch nur beispielhaft sind und nicht als Beschränkung anzusehen sind.
  • Beispiel 1
  • Isolierung von L. intracellularis aus dem Darm von amerikanischen Schweinen mit porziner proliferativer Enteropathie
  • Materialien und Verfahren
  • Auswahl von Inokulumproben
  • Die Probe N24912 wurde aus einer Herde einer Farm in Iowa erhalten, wo festgestellt wurde, dass 15 von 300 5 Monate alten, schlachtreifen "finisher"-Schweinen trotz Behandlung mit Penicillin einen blutigen Stuhl aufwiesen. Bei Nekropsie der Schweine wies der Darm (Ileum) eine verdickte Schleimhaut auf. Histopathologische Untersuchungen mit Silberfärbung ergaben das Vorliegen von gekrümmten, intrazellulären Bakterien und eine verborgene Enterozyten-Hyperplasie zur Bestätigung der Diagnose von PPE. Die Probe Nr. N72994 wurde von einer 1,5 Jahre alten SPF Muttersau (zweiter Wurf) in einer Farm in Minnesota erhalten. Die Herdengröße betrug 70–80 Sauen. Von einer antibiotischen Behandlung war nichts bekannt. Bei der Nekropsie war die Schleimhaut des Ileums verdickt, wobei eine gewisse Hämorrhagie vorlag. Eine Giminez-Färbung der Schleimhaut zeigte zahlreiche gekrümmte Bakterien. Die Probe Nr. N101494 wurde von einem 12 Wochen alten Ferkel von einer Farm in Indiana mit 600 "furrow-to-finish"-Sauen erhalten. Das Schwein wurde beim Einsetzen einer blutigen Diarrhö mit Tylan-Injektionsmittel behandelt, wobei das Tier jedoch bald nach der Behandlung einging.
  • Präparation von von Schweinen abgeleiteten bakteriellen Inokula
  • Darmproben wurden bei –70°C aufbewahrt. Die Därme wurde geöffnet und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Schleimhautproben von 1 g wurden in Natriumkaliumglutamat (SPG) geschabt und 30 Sekunden mit 4,0 ml 1% Trypsin (JRH Biosciences, Lenexa, KS) in SPG homogenisiert. Die Suspensionen wurden 35 Minuten bei 37°C inkubiert. Sodann wurden 10 ml SPG/10% fötales Kälberserum (FCS) (JRH Biosciences, Lenexa, KS) zugegeben und die Proben wurden 1 Minute in einer Gewebemühle gemahlen. Sodann wurden 10 ml SPG/10% (FCS) zugegeben. Sodann wurde 1-mal durch Filterpapier (Whatman 113V; Whatman Labsales, Hillsboro, OR) und sodann nacheinander durch 5,0-, 1,0- und 0,65 μm-Membranfilter filtriert. Die Filtrate wurden in Aliquotmengen aufgeteilt und bei –70°C in 1,0 ml-Aliquotmengen eingefroren. Die Schleimhaut wurde auf einem Objektträger zur Giminez-Färbung ausgestrichen. Getrennte Ausstriche von Filtraten wurden mit IFA unter Verwendung eines spezifischen monoklonalen Antikörpers für L. intracellularis gefärbt; S. McOrist et al., Vet. Rec., Bd. 121 (1987), S. 421–422.
  • Zellkultur
  • IEC-18-Zellen (intestinale Epithelzellen von Ratten, ATCC CRL 1589) wurden in DMEM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) mit L-Glutamin und 10% FCS gezüchtet und wöchentlich routinemäßig einer Passage mit Trypsin unterzogen. Zellmonoschichten wurden bei 37°C in Luft mit 5% CO2 gezüchtet.
  • Infektion der Zellkultur
  • IEC-18-Zellen wurden in einer Menge von 1,25 × 105 Zellen auf 25 cm2-Kolben und in vergleichbaren Raten auf "Chamberslides" (Nunc, Inc., Naperville, IL) überimpft und 24 Stunden inkubiert. Sodann wurden die Medien entfernt. Eingefrorene, von Schweinen stammende bakterielle Isolate wurden rasch aufgetaut und in DMEM/7% FCS mit Vancomycin (100 μg/ml) und Amphotericin B (2,0 μg/ml) in Verhältnissen von 1,0 ml Homogenisat auf 15 ml Medium verdünnt und zu den Monoschichten gegeben. Monoschichten und bakterielle Suspensionen wurden 30 Minuten mit 2000 × g zentrifugiert und auf anaerobe Standgefäße übertragen. Die Gefäße wurden evakuiert. Das Gas wurde durch Wasserstoff und Kohlendioxid unter Bildung eines Gemisches von 8,0% O2, 10% CO2 und 82% H2 ersetzt. Die Kulturen wurden 3 Stunden bei 37°C inkubiert, sodann erneut mit DMEM/7% FCS mit L-Glutamin, Vancomycin (100 μg/ml), Neomycin (50 μg/Liter) und Amphotericin B (2,0 μg/ml) versorgt. Die Kulturen wurden wieder in die anaeroben Standgefäße gebracht und 6 Tage inkubiert, wobei alle 2 Tage das Medium ausgetauscht wurde,
  • Passage von L. intracellularis
  • L. intracellularis-Bakterien wurden einer Zelllysis unter Verwendung von Kaliumchlorid gemäß den Angaben von G. Lawson et al., J. Clin. Microbiol., Bd. 31 (1993), S. 1136–1142, unterzogen und anschließend zu frischen IEC-18-Monoschichten gegeben. Die Medien wurden von den Monoschichten abgegossen. Nach Zugabe von 0,1% KCl wurden die Zellen 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Entfernen des KCl wurde SPG/10% zugegeben und die Monoschichten wurden mechanisch mit einem Zellschaber abgelöst. Die Zellen wurden durch 3-malige Passage durch eine Spritze mit einer Nadel Nr. 21 lysiert. Zellkerne wurden durch 5-minütige Zentrifugation mit 100 × g entfernt. Die bakterielle Suspension in der überstehenden Flüssigkeit wurde zu frischen, 1 Tag alten Monoschichten von IEC-18-Zellen gegeben.
  • Überwachung der Infektion von Zellkulturen
  • Die Infektion wurde überwacht, indem Zellen auf "Chamberslides" 5 Minuten mit kaltem Aceton/Methanol fixiert wurden. Die Färbung wurde durch Immunofluoreszenz- und Immunoperoxidase-Verfahren durchgeführt. Bei beiden Verfahren wurde ein monoklonaler Maus-Antikörper (gemäß S. McOrist et al., Vet. Rec., Bd. 121 (1987), S. 421–422) als primärer Antikörper und entweder anti-Maus-Immunoglobulin G-Fluorochrom-Konjugat (Fluoresceinisothiocyonat, Organon Teknika Corporation, Durham, NC) oder Peroxidase-Konjugat (Ziegen-anti-Maus-Immunoglobulin G; Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) verwendet. Die quantitative Bestimmung der Bakterien wurde durch Auszählen der Anzahl an spezifisch gefärbten Bakterien innerhalb von Zellen auf jedem Objektträger vorgenommen.
  • Polymerase-Kettenreaktion
  • Proben-Inokula und passagierte Bakterien wurden als Matrizen-DNA in einer PCR unter Anwendung des Probenvorbereitungsverfahrens, der Primer und der Zyklusparameter gemäß den Angaben von Jones et al., J. Clin. Microbiol., Bd. 31 (1993), S. 2611–2615, und McOrist et al., Vet. Microbiol., (1994), S. 1–8) eingesetzt. Es wurden folgende Zyklusparameter eingehalten: 93°C für 5 Minuten, 55°C für 45 Sekunden und 72°C für 45 Sekunden für den ersten Zyklus. 33 Zyklen wurden bei den vorstehend erwähnten Temperaturen für 45 Sekunden pro Temperatur durchgeführt, sowie ein Zyklus bei 93°C für 45 Sekunden, 55°C für 45 Sekunden und 72°C für 2 Minuten. Zur Inokulation von IEC-18-Zellen wurden nur positive Inokula verwendet. Die PCR wurde auch zur Überwachung des Passagematerials zur Bestätigung von Infektionen durchgeführt. Durch PCR erzeugte DNA wurde zur Sequenzierung der Iowa State University Nucleic Acid Facility übergeben. Die Ergebnisse der Sequenzierung wurden mit den Sequenzen von Gary F. Jones gemäß seiner Dissertation, University von Minnesota, Minneapolis, MN (Juni 1993), verglichen.
  • Ergebnisse
  • Auswahl der Inokulumproben
  • Die Schweine Nr. N24912 und N72994 wiesen eine schwere PPE mit blutigem Darminhalt und verdickter Schleimhaut auf. N101494 wies eine schwere PPE und eine schwere Hämorrhagie auf, die zu einem großen Blutgerinnsel im intestinalen Lumen führte. Die Giminez-Färbung der Schleimhautausstriche zeigte eine große Anzahl von gekrümmten oder S-förmigen Bakterien. IFA-Färbungen ergaben eine große Anzahl von hell fluoreszierenden Bakterien in von Schweinen abgeleiteten bakteriellen Inokula.
  • Überwachung der Infektion von Zellkulturen
  • Inokulierte Monoschichten wurden durch Lichtmikroskopie während des gesamten Wachstumszyklus überwacht. Es wurden geringe morphologische Veränderungen der Zellen beobachtet. Nicht-infizierte Monoschichten, die unter einer verringerten Sauerstoffspannung (8% O2) gezüchtet worden waren, wiesen eine ähnliche Morphologie auf.
  • Durch Immunofluoreszenz und Immunoperoxidase gefärbte infizierte Kulturen zeigten große Anzahlen an gekrümmten oder S-förmigen, spezifisch gefärbten Bakterien, die offensichtlich innerhalb der Zellen vorlagen. Die Monoschichten zeigten keine konfluente Infektion. Infizierte Zellen waren häufig eng mit infizierten Herden von 1 bis 10 Zellen assoziiert. Stark infizierte Zellen (d. h. Zellen mit 30 oder mehr Bakterien) traten auch in Verbindung mit Zellen mit weniger als 30 Bakterien auf. Die Bakterienzahlen erreichten nach etwa 6 Tagen ihr Maximum. Die Infektion war abhängig von den spezifischen Wachstumsbedingungen. Die Bakterien wurden erfolgreich dem hier beschriebenen Zelllysisverfahren unterworfen. Eine Zentrifugation von neu inokulierten Zellen war nicht erforderlich, erhöhte aber die Anzahl an infizierten Zellen. Eine Zentrifugation verminderte ferner die Verunreinigung, indem man die Zellen, die der Infektion mit antibiotikafreiem Medium ausgesetzt waren, nach 3 Stunden mit einem antibiotikumhaltigen Medium versorgte. Eine Verringerung von FCS von 10% auf 7% im Medium war erforderlich, um das Wachstum der IEC-18-Zellen zu verlangsamen, um den Bakterien ein Wachstum in höherer Anzahl vor Erreichen des konfluenten Zustands der Monoschichten zu ermöglichen.
  • Polymerase-Kettenreaktion
  • Eine PCR von chromosomaler DNA ergab ein 319 bp-Fragment (einschließlich Primer) aus sämtlichen Isolaten. Ein Fragment von geeigneter Größe wurde visuell mit einer bekannten positiven Probe, die von McOrist et al. (1994) durch PCR erzeugt worden war, verglichen. Die Sequenzanalyse der PCR-Produkte von N24912, N72994 und N101494 bestätigte eine enge Homologie (97–99%) zu der von Jones (1993) bestimmten p78-Sequenz.
  • Beispiel 2
  • Wachstum von L. intracellularis in Suspensionskulturen von HEp-2-Zellen
  • Herstellung von intestinalen Homogenisaten für ein Inokulum
  • Ein intestinales Homogenisat wurde durch Abschaben der Schleimhaut von 6,0 bis 8,0 cm Ileum von den intestinalen Proben von Beispiel 1 hergestellt. Trypsin (1%) wurde zur abgeschabten Schleimhaut gegeben. Die Proben wurden kurz homogenisiert und sodann 35 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 10 ml SPG/10% FBS zugegeben, wonach die Proben in einer Gewebemühle gemahlen wurden. Weitere 10 ml SPG/10% FBS wurden zugesetzt. Die Homogenisate wurden durch ein Whatman V113-Filter und anschließend durch 5,0-, 1,0- und 0,65 μm-Filter gegeben. Die Proben wurden in 1 ml-Aliquotanteile aufgeteilt und bei –70°C eingefroren.
  • Infektion einer Zellkultur
  • Verfahren A
  • Gewebezellen wurden in einer Menge von 1 × 107 Zellen auf 50 ml DMEM/10% FBS in einem 100 ml fassenden Rührkolben überimpft. Die Kulturen wurden 24 Stunden inkubiert und sodann mit Vancomycin und Fungizon versetzt. Eine Ampulle gefrorenes, intestinales Homogenisat wurde rasch aufgetaut und in 3,0 ml DMEM/5% FBS mit Vancomycin (100 μg/ml) und Amphotericin B (2,0 μg/ml) verdünnt. Die Probe wurde durch ein 0,65 μm-Filter gegeben und in den Kolben gebracht. Sodann wurde die Kultur in eine Gaskammer gegeben, evakuiert und mit Wasserstoff und Kohlendioxid unter Bildung eines Gemisches aus 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% H2 begast. Die Kulturen wurden 3 Stunden bei 37°C inkubiert und sodann mit Neomycin und Gentamycin versetzt. Die Kultur wurde nach 24 Stunden erneut mit DMEM/5% FBS mit L-Glutamin, Vancomycin (100 μg/ml), Neomycin (50 μg/Liter), Gentamycin (50 μg/Liter) und Amphotericin B (2,0 μg/ml) versorgt.
  • Verfahren B
  • Zwei herkömmliche 25 cm2-Kolben wurden mit 1,25 × 105 HEp-2-Zellen in DMEM/10% FBS beimpft. Es wurde eine 18- bis 24-stündige Züchtung durchgeführt. Zum Zeitpunkt der Inokulation wiesen die Zellen eine Konfluenz von 30% auf. Das Inokulum wurde in DMEM/5% FBS verdünnt. Wenn das Inokulum aus einem intestinalen Homogenisat stammte, enthielt das Medium ferner Vancomycin (100 μg/ml) und Amphotericin B (2,0 μg/ml). Die Kulturen wurden in eine Gaskammer gebracht, evakuiert und erneut mit Wasserstoff und Kohlendioxid unter Bildung eines Gemisches aus 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% H2 begast. Sodann wurden die Kulturen 3 Stunden bei 37°C inkubiert und anschließend mit Neomycin und Gentamycin versetzt. Die Kultur wurde nach 24 Stunden erneut mit DMEM/5% FBS zusammen mit L-Glutamin, Vancomycin (100 μg/ml), Neomycin (50 μg/Liter), Gentamycin (50 μg/Liter) und Amphotericin B (2,0 μg/ml) versorgt. Es waren keine Antibiotika erforderlich, wenn es sich beim Inokulum um eine reine Kultur handelte. Die Kulturen wurden 6 Tage oder bis zur Konfluenz inkubiert. Die Zellen wurden von den Kolben abgeschabt und in einen 100 ml-Rührkolben mit einem Gehalt an 50 ml DMEM/5% FBS gegeben.
  • Die Kultur wurde in wöchentlichen Abständen 1:2 verdünnt, indem man entweder eine Hälfte der Kultur erntete und frisches Medium zugab oder indem man eine Übertragung in einen größeren Rührkolben vornahm und mehr Medium zusetzte.
  • Passage der Kultur
  • Die Kultur wurde einer Passage auf frische HEp-2-Zellen unterworfen, indem man neue HEp-2-Zellen in einer Menge von 1 × 107 in DMEM/5% FBS gab. Man ließ die neue Kultur über Nacht bei 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% H2 inkubieren. Sodann wurde die neue Kultur mit infizierter Kultur inokuliert und gemäß den vorstehenden Angaben bei verringerten O2-Konzentrationen inkubiert. Die Inokulummengen hingen vom Infektionsgrad der ursprünglichen Kultur ab.
  • Ernten und Lagern der Kulturen
  • Die Kultur wurde geerntet, indem die erwünschte Menge der Kultur durch 20-minütige Zentrifugation mit 3000 × g gesammelt wurde. Das Pellet wurde in Saccharose-Phosphat-Glutamat(SPG)-Lösung resuspendiert und einer 4-maligen Passage durch eine Nadel Nr. 25 unterzogen. Sodann wurden die Kulturen in Aliquotmengen aufgeteilt und bei –70°C eingefroren. Zur weiteren Reinigung wurde die Probe 3 Minuten mit 145 × g zentrifugiert, um Zellkerne und Zellbruchstücke zu entfernen. Der Überstand wurde sodann 20 Minuten mit 3000 × g zentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet in Verdünnungsmittel resuspendiert.
  • Bestimmung von lebensfähigem L. intracellularis in Gewebekultur
  • Die Bestimmung von lebensfähigem L. intracellularis wurde durch Ermittlung der 50-prozentigen Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50) durchgeführt. Dazu wurden 2,0 ml der zu testenden Kultur entnommen. Die Zellen wurden durch 4- malige Passage durch eine Nadel Nr. 25 lysiert. Sodann wurde die Probe seriell 1:10 in DMEM/5% FBS mit einem Gehalt an Vancomycin (100 μg/ml) und Amphotericin B (2,0 μg/ml) verdünnt. Die Verdünnungen wurden auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen in einer Menge von 0,1 ml/Vertiefung gegeben. Die Mikrotiterplatten wurden mit HEp-2-Zellen in einer Menge von 1250 Zellen/Vertiefung beimpft. Vor der Infektion wurde eine 18- bis 24-stündige Züchtung durchgeführt. Es wurden 3 bis 6 Vertiefungen/Verdünnung verwendet. Die Platte wurde 6 Tage bei Gaskonzentrationen von 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% H2 inkubiert. Die Zellen wurden 2 Minuten mit einem kalten Gemisch aus 50% Aceton und 50% Methanol fixiert. Sodann wurden die Vertiefungen mit 0,03 ml/Vertiefung monoklonalem anti-IS-intracellularis-Antikörper (McOrist, 1994) in 1:2000-Verdünnung in PBS versetzt. Die Platte wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert und sodann 3-mal mit PBS gewaschen. anti-Maus-FITC in 1:30-Verdünnung wurde in einer Menge von 0,03 ml/Vertiefung zugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C wurde die Platte 3-mal mit ddH2O gewaschen und getrocknet. Die Proben wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Der TCID50/ml-Wert wurde bestimmt.
  • Ergebnisse
  • Die TCID50-Ergebnisse zeigten, dass die Kulturen bis zu 1 × 106 Bakterien/ml enthielten. Dies wurde in 45 Tagen erreicht. Das Kulturvolumen wurde in der gleichen Zeitspanne auf 3,0 Liter vergrößert.
  • Beispiel 3
  • Wachstum von L. intracellularis in Suspensionskulturen von McCoys-Zellen
  • Präparation von intestinalen Homogenisaten für das Inokulum
  • Ein intestinales Homogenisat wurde gemäß den Angaben in Beispiel 2 hergestellt. Eine Probe von L. intracellularis, die gemäß dem Verfahren des folgenden Beispiels gezüchtet worden war, wurde unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags am 19. Mai 1995 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland USA, 20852, unter der Hinterlegungsnummer 55672 hinterlegt.
  • Infektion der Zellkultur
  • Zwei herkömmliche 25 cm2-Kolben wurden mit 1,25 × 105 McCoys-Zellen in DMEM/10% FBS beimpft. Es wurde eine 18- bis 24-stündige Züchtung durchgeführt. Zum Zeitpunkt der Inokulation wiesen die Zellen eine Konfluenz von 30% auf. Das Inokulum wurde in DMEM/5% FBS verdünnt. Wenn das Inokulum aus einem intestinalen Homogenisat stammte, enthielt das Medium ferner Vancomycin (100 μg/ml) und Amphotericin B (2,0 μg/ml). Die Kulturen wurden in eine Gaskammer gebracht, evakuiert und erneut mit Wasserstoff und Kohlendioxid unter Bildung eines Gemisches aus 8,0% O2, 10% CO2 und 82% H2 begast. Sodann wurden die Kulturen 3 Stunden bei 37°C inkubiert und anschließend mit Neomycin und Gentamycin versetzt. Die Kultur wurde nach 24 Stunden erneut mit DMEM/5% FBS zusammen mit L-Glutamin, Vancomycin (100 μg/ml), Neomycin (50 μg/Liter), Gentamycin (50 μg/Liter) und Amphotericin B (2,0 μg/ml) versorgt. Es waren keine Antibiotika erforderlich, wenn es sich beim Inokulum um eine reine Kultur handelte. Die Kulturen wurden 6 Tage bis zur Konfluenz inkubiert. Die Zellen wurden von den Kolben abgeschabt und in einen 100 ml fassenden Rührkolben mit einem Gehalt an 50 ml DMEM/2% FBS und 0,05 g Cultisphere-G Mikroträgern gegeben. Die Kolben wurden mit 40–50 U/min gerührt.
  • Die Kulturen wurde alle 2 bis 3 Wochen im Verhältnis 1:2 verdünnt, indem man entweder eine Hälfte der Kultur erntete und frisches Medium und Cultisphere-G-Perlen zusetzte oder indem man die Kultur in einen größeren Rührkolben brachte und zusätzlich mit Medium und Cultisphere-G-Perlen versetzte. Die Endkonzentration der Perlen in der Kultur betrug etwa 0,001 g Perlen/ml.
  • Passage der Kultur
  • Die Kultur wurde einer Passage auf frische McCoys-Zellen unterworfen, indem man neue McCoys-Zellen in einer Menge von 1 × 107 in DMEM/2% FBS und 0,05 g Cultisphere-G-Perlen überimpfte. Man ließ die neue Kultur über Nacht bei 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% H2 inkubieren. Sodann wurde die neue Kultur mit 2,5 ml infizierter Kultur inokuliert und gemäß den vorstehenden Angaben bei verringerten O2-Konzentrationen inkubiert.
  • Ernten und Lagern der Kulturen
  • Die Kultur wurde geerntet, indem die erwünschte Menge der Kultur durch 20-minütige Zentrifugation mit 3000 × g gesammelt wurde. Das Pellet wurde in Saccharose-Phosphat-Glutamat(SPG)-Lösung resuspendiert und einer 4-maligen Passage durch eine Nadel Nr. 22 unterzogen. Sodann wurden die Kulturen in Aliquotmengen aufgeteilt und bei –70°C eingefroren. Zur weiteren Reinigung wurde die Probe 5 Minuten mit 145 × g zentrifugiert, um Zellkerne und Zellbruchstücke zu entfernen. Der Überstand wurde sodann 20 Minuten mit 3000 × g zentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet in Verdünnungsmittel resuspendiert.
  • Bestimmung von lebensfähigem L. intracellularis in der Gewebekultur
  • Die quantitative Bestimmung von lebensfähigem L. infracellularis wurde gemäß den Angaben in Beispiel 2 unter Verwendung einer Nadel Nr. 22 zur Lysis der Zellen und unter Verwendung von McCoys-Zellen in einer Menge von 1250 Zellen/Vertiefung zur Beimpfung der Mikrotiterplatten durchgeführt.
  • Ergebnisse
  • Die TCID50-Ergebnisse zeigten, dass die Kulturen bis zu 1 × 106 Bakterien/ml enthielten. Dies wurde in weniger als 1 Monat erreicht. Das Kulturvolumen wurde in der gleichen Zeitspanne auf 3,0 Liter vergrößert.
  • Beispiel 4
  • Bestimmung der infektiösen Dosis von L. intracellularis-Reinkulturen in Wirtstieren
  • Zusammenfassung
  • Eine Untersuchung an 31 Schweinen wurde durch Infektion von normalen Schweinen in einem Alter von 6 Wochen mit reinen Kulturen von L. intracellularis der Probe N72994 durchgeführt. Die Schweine wurden willkürlich in 4 Gruppen eingeteilt. Die Gruppen wurden in getrennten Pferchen gehalten. Die Gruppe 1 umfasste 7 Schweine und wurde als negative Kontrollgruppe herangezogen, die nicht-infiziertes Gewebe oder keine Verabreichung erhielt. Die Gruppe 2 umfasste 8 Schweine mit einer Dosierung von 107 Bakterien/Schwein. Die Gruppe 3 umfasste 8 Schweine mit einer Dosierung von 106 Bakterien/Schwein. Die Gruppe 4 umfasste 8 Schweine mit einer Dosierung von 105 Bakterien/Schwein.
  • Fäkale Abstriche wurden an den Tagen 0, 7, 14, 21 und 24 für einen PCR-Test gewonnen. Am Tag 24 wurde eine Nekropsie der Schweine durchgeführt. Ileum, Jejunum und Kolon wurden für den PCR-Test, die histopathologische Untersuchung und FA-Färbung (alle vorstehend beschrieben) gewonnen.
  • Der PCR-Test in der ilealen Schleimhaut ergab die Anwesenheit von L. intracellularis zu 100% bei der hohen Dosis, zu 75% bei der mittleren Dosis und zu 50% bei der niedrigen Dosis. Die histopathologischen Ergebnisse zeigten einen Anstieg an mononuklearen Zellen in der Lamina propria und Submucosa zu 88% bei der hohen Dosis, zu 75% bei der mittleren Dosis und zu 88% bei der niedrigen Dosis. Eine verborgene Hyperplasie wurden bei der hohen Dosis zu 50%, zu 63% bei der mittleren Dosis und zu 50% bei der niedrigen Dosis festgestellt. Die FA-Färbung ergab L. intracellularis in Gewebeschnitten des Ileums, Jejunums und Kolons zu 88% bei der hohen Dosis, zu 63% bei der mittleren Dosis und zu 63% bei der niedrigen Dosis. Die Kontrolltiere erwiesen sich in Bezug auf das Auftreten von L. intracellularis bei PCR, FA und Silberfärbung als negativ.
  • Somit wurde eine Reinkultur in erfolgreicher Weise zur Infektion mit PPE und zur Herbeiführung von entsprechenden Läsionen eingesetzt. Die Postulate von Koch wurden durch die Identifizierung und Isolierung von L. intracellularis aus den infizierten Tieren erfüllt.
  • Bei den belasteten Tieren wurde durch Silberfärbung, FA und PCR bei 100% der Tiere mit hoher Dosis die Gewinnung und Identifizierung bestätigt.
  • Materialien und Methoden
  • Wachstum des Inokulums
  • Ein herkömmlicher 75 cm2-Kolben wurde mit 3,75 × 105 HEp-2-Zellen in DMEM/10% FBS beimpft. Eine Züchtung wurde 18–24 Stunden bei 37°C mit 5 CO2 durchgeführt. (Die Zellen wiesen zum Zeitpunkt der Inokulation eine Konfluenz von 30% auf.) Ein Fläschchen mit N72994 wurde in 15 ml DMEM/5% FBS verdünnt. Die Kultur wurde in eine Gaskammer gebracht, evakuiert und erneut mit Wasserstoff und Kohlendioxid unter Bildung eines Gemisches aus 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% H2 begast. Die Kultur wurde nach 24 Stunden erneut mit DMEM/5% FBS versorgt.
  • Die Kulturen wurden 6 Tage inkubiert. Anschließend wurden die Zellen von den Kolben abgeschabt und in 100 ml fassende Rührkolben mit einem Gehalt an 50 ml DMEM/5% FBS gegeben. Das Kolbenvolumen wurde durch Verdopplung des Mediumvolumens in wöchentlichen Abständen erhöht. Die Kultur wurde 3 Wochen in dem Rührkolben gezüchtet.
  • Ernten der Kulturen
  • Die Kultur wurde durch 20-minütiges Zentrifugieren mit 3000 × g geerntet. Das Pellet wurde in einer Saccharose-Phosphat-Glutamat-Lösung (SPG) zusammen mit 10% FBS resuspendiert und einer 4-maligen Passage durch eine Nadel Nr. 25 unterworfen. Das Inokulum wurde in SPG/10% FBS auf das Endvolumen verdünnt. 1:10-Verdünnungen wurden hergestellt.
  • Das Inokulum für die Kontrollen bestand aus nicht-infizierten HEp-2-Zellen, die auf die gleiche Konzentration von lebensfähigen Zellen wie die infizierte Kultur verdünnt worden waren. Die Zellen wurden auf die gleiche Weise wie die infizierte Kultur geerntet. Die Kontrollschweine erhielten eine ähnliche Dosis an Zellen wie die Gruppe mit der hohen Dosis.
  • Quantitative Bestimmung von L. intracellularis
  • Die Bestimmung von lebensfähigem L. intracellularis wurde durch Bestimmung der 50-prozentigen Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50) durchgeführt. Dazu wurden 2 ml der zu testenden Kultur entnommen. Die Zellen wurden durch 4-malige Passage durch eine Nadel Nr. 22 lysiert. Sodann wurde die Probe seriell 1:10 in DMEM/5% FBS mit einem Gehalt an Vancomycin (100 μg/ml) und Amphotericin B (2,0 μg/ml) verdünnt. Die Verdünnungen wurden auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen in einer Menge von 0,1 ml/Vertiefung gegeben. Die Mikrotiterplatten wurden mit HEp-2-Zellen in einer Menge von 2500 Zellen/Vertiefung beimpft. Vor der Infektion wurde eine 18- bis 24-stündige Züchtung durchgeführt. Es wurden 12 Vertiefungen/Verdünnung verwendet. Die Platte wurde 6 Tage bei Gaskonzentrationen von 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% N2 inkubiert. Die Zellen wurden 2 Minuten mit einem kalten Gemisch aus 50% Aceton und 50% Methanol fixiert. Sodann wurden die Vertiefungen mit 0,03 ml/Vertiefung monoklonalem anti-L-intracellularis-Antikörper (McOrist, 1997) in 1:2000-Verdünnung in PBS versetzt. Die Platte wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert und sodann 3-mal mit PBS gewaschen. anti-Maus-FITC in 1:30-Verdünnung wurde in einer Menge von 0,03 ml/Vertiefung zugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C wurde die Platte 3-mal mit ddH2O gewaschen und getrocknet. Die Proben wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Der TCID50/ml-Wert wurde bestimmt.
  • Tiere
  • 31 Schweine beiderlei Geschlechts im Alter von 6 Wochen (PIC × Lieske-Muttersauen und große weiße Eber) wurden von Dr. Kent Schwartz zur Verfügung gestellt. Die Schweine wurden willkürlich entsprechend dem Gewicht am Tag 0 auf 4 Pferche aufgeteilt.
  • Anlage
  • Vier Pferche in einer kleinen Aufzuchtanlage, die einen Abstand von mindestens 3 ft voneinander aufwiesen, wurden zur Aufnahme der Schweine herangezogen. Die Pferche wiesen Drahtböden und feste Abteilvorrichtungen auf. Die Pferche wurden mit einem Ofen mit einer zonalen Ergänzungswärme durch Heizlampen erwärmt. Die Temperatur wurde während der Versuchsdauer auf 78 bis 85°F gehalten.
  • Futter und Wasser
  • Ein 19% Protein enthaltendes, gemahlenes Mais-Soja-Futter, das frei von Antibiotika war, wurde nach Belieben über Fütterungsvorrichtungen aus rostfreiem Stahl bereitgestellt. Wasser wurde nach Belieben über Behälter mit Saugstutzen bereitgestellt.
  • Infektion der Schweine
  • Am Tag 0 wurden die Schweine gewogen. Blutproben wurden über einen in den retroorbitalen Sinus eingesetzten Kapillarschlauch gewonnen. Das Serum wurde gewonnen und bei –20°C eingefroren. Ferner wurden fäkale Abstriche für die PCR gewonnen. Die Schweine erhielten intragastrisch über einen Magenschlauch ein Inokulum von 10 ml.
  • Figure 00220001
  • Die Schweine wurde gewogen. Blutentnahmen wurden an den Tagen 0, 10, 17 und 24 vorgenommen.
  • Polymerase-Kettenreaktion
  • Die Infektion der Schweine wurde durch PCR unter Verwendung von Primern und Zyklusparametern gemäß den Angaben von Jones (1993) überwacht. Kotproben wurden an den Tagen 0, 7, 14, 21 und 24 genommen. Die Schleimhaut des Darms wurde durch PCR geprüft.
  • Histopathologie
  • Schnitte von Ileum, Jejunum und Kolon wurden mit Formalin fixiert, routinemäßig verarbeitet, mit Ilematoxylin und Eosin gefärbt sowie mit Silber imprägniert und bewertet. Die Schnitte wurden ferner unter Verwendung von monoklonalem Antikörper, der für L. intracellularis spezifisch war, gefärbt.
  • Ergebnisse
  • Klinische Anzeichen
  • Klinische Anzeichen von lockerem Stuhl wurden bei der Gruppe mit der hohen Dosis nach 3 Tagen beobachtet. Die Anzeichen erreichten nach 14 Tagen ihr Maximum und verschwanden anschließend allmählich.
  • Gewichtszunahme
  • Die durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme wurde berechnet. Es ergab sich, dass die Gruppen mit hoher und mittlerer Dosis im Vergleich zur Kontrollgruppe eine verringerte Gewichtszunahme aufwiesen. Beim Vergleich der Gruppen ergab sich eine Dosis-Titer-Wirkung bei der Gewichtszunahme.
  • PCR
  • 14 Tage lang wurde keine Abscheidung im Kot festgestellt. Nach 21 Tagen waren 37,5% der Schweine mit hoher Dosis im Kot PCR-positiv. Nach Nekropsie wurde die Ileumschleimhaut durch PCR geprüft. Bei der hohen Dosis waren 100% positiv, bei der mittleren Dosis 75%, bei der niedrigen Dosis 50% und bei der Kontrolle 0%.
  • Grobe Läsionen
  • Grobe Läsionen wurden bei 2 Schweinen mit der hohen Dosis (#50 und #202) festgestellt. Die Schweine wiesen eine etwa 3 ft lange Verdickung im Ileum mit Nekrose beim Schwein #202 auf.
  • Histopathologie
  • FA
  • Die FA-Färbung an Schnitten des Ileums, Jejunums und Kolons ergaben die Anwesenheit von L. intracellularis bei 87,5% der Tiere mit hoher Dosis, 62,5% der Tiere mit mittlerer und niedriger Dosis und 0% der Kontrolltiere.
  • Mikroskopische Läsionen
  • Läsionen wurden bei 100% mit der hohen Dosis, 75% mit der mittleren Dosis, 87,5% mit der niedrigen Dosis und 14% der Kontrolltiere festgestellt. Dies wurde durch Beobachtung von vermehrten mononuklearen Zellen in der Lamina propria und Submucosa festgestellt, häufig in Verbindung mit Hyperplasie der Peyer-Plaques. Ferner wurde eine verborgene Hyperplasie beobachtet.
  • Silberfärbung
  • Die Silberfärbung von Schnitten auf das Vorliegen von intrazellulären, gekrümmten Bakterien wurde ebenfalls durchgeführt. Dies ergab die Anwesenheit von Bakterien bei 87,5% der Tiere mit hoher Dosis, 62,5% der Tiere mit mittlerer Dosis, 87,5% der Tiere mit niedriger Dosis und 0% der Kontrolltiere.
  • Diskussion
  • Die Schweine wurden erfolgreich mit Reinkulturen von L. intracellularis infiziert. Bei Dosen von 107 Bakterien zeigten 100% der Schweine eine Infektion, bestimmt durch PCR und mikroskopische Läsionen. Die Schwere der Läsionen und die Menge der Bakterien in den Gewebeschnitten waren relativ gering. Diese Untersuchung stellt ein zufriedenstellendes Belastungsmodell mit L. intracellularis dar, und zwar aufgrund der Anwesenheit von L. infracellularis und mikroskopischen Läsionen bei den Schweinen. Die Läsionen lassen sich durch eine zweite Dosis 7 Tage nach der ersten Dosis verstärken.
  • Beispiel 5
  • Test auf die Wirksamkeit eines Hamster-Impfstoffes
  • Ziel
  • Das Ziel besteht in der Bewertung eines Laboratoriumstiermodells zur Bestimmung der Sicherheit und Wirksamkeit eines avirulenten Lebendimpfstoffs von L. intracellularis bei Hamstern.
  • Zusammenfassung
  • Eine Studie an 40 Hamstern wurde durchgeführt, indem Hamster im Alter von 3 Wochen mit Reinkulturen eines hochgradig passagierten Stammes von L. intracellularis geimpft wurden und die Tiere 22 Tage nach der Impfung mit Reinkulturen von geringfügig passagiertem virulentem Material belastet wurden. Die Hamster wurden in drei Gruppen unterteilt. Die Gruppe A wurde am Tag 0 mit 1 Dosis von L. intracellularis Stamm N72994 geimpft. Die Gruppe B diente als Kontrollgruppe und erhielt keine Impfstoffkultur. Beide Gruppen wurden 22 und 25 Tage nach der Impfung mit 2 Dosen einer Reinkultur von L. intracellularis Stamm N343 belastet. Die Gruppe C wurde mit dem Stamm N101494 belastet, um die relative Virulenz im Vergleich zum Stamm N343 zu bestimmen. Die Gruppen A und B umfassten jeweils 15 Hamster. Die Gruppe C umfasste 10 Hamster. Die TCID50-Ergebnisse zeigten, dass die Hamster mit 105 TCID50/Dosis geimpft waren. Die N343-Belastung enthielt 105,5 TCID50/Dosis. Die Belastungsdosis für die Gruppe C betrug 102,75 TCID50/Dosis. Kotabstriche wurden an den Tagen 0, 7, 14, 21, 29, 36 und 43 zur Durchführung eines Tests mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gesammelt. Am Tag 21 wurden jeweils 5 Tiere der Gruppen A und B einer Nekropsie unterzogen, um einen PCR-Test der Schleimhäute sowie FA-, Hematoxalin- und Eosin-Färbungen sowie Silberfärbungen von ilealen Schnitten vorzunehmen, um eine fortbestehende Kolonisation mit Bakterien in den geimpften Hamstern festzustellen. Die restlichen Tiere wurden 21 Tage nach der Belastung einer Nekropsie mit ähnlichen Tests unterzogen.
  • Die PCR-Ergebnisse zeigten die Anwesenheit von L. intracellularis in den Darmschleimhäuten von 100% der Hamster der Gruppe A 21 Tage nach der Impfung. Die Hamster der Gruppe B waren 21 Tage nach der Impfung alle negativ. 21 Tage nach der Belastung waren 50% der Hamster in der Gruppe A PCR-positiv und 100% in der Gruppe B. Die Histopathologie der Schnitte ergab schwache bis schwere Läsionen bei 50% der Tiere der Gruppe A und schwache Läsionen bei 50% der Tiere der Gruppe B 21 Tage nach der Belastung. 21 Tage nach der Impfung zeigte keines der Tiere Läsionen. Die Tiere der Gruppe C wiesen 21 Tage nach der Belastung keine Läsionen auf. Mit FA- und Silberfärbungen konnte das Vorliegen von L. intracellularis in keinem der Schnitte nachgewiesen werden.
  • Es wurde somit eine 50%ige Verringerung von Infektionen bei Hamstern, die mit einem hochgradig passagierten Stamm von L. intracellularis geimpft worden waren, durch PCR festgestellt. Der Darm war von einer geringen Anzahl von intrazellulären Organismen kolonisiert, wie das Fehlen von beobachteten Organismen bei mit FA- und Silberfärbung gefärbten Schnitten festgestellt wurde. Die Hamster der Gruppe C zeigten keinerlei Infektionen während der gesamten Studie, was höchstwahrscheinlich auf die geringe Dosierung der Bakterien zurückzuführen war.
  • Materialien und Methoden
  • Beschreibung der Hamster
  • Es wurden 3 Wochen alte weibliche Harlan Sprague Dawley-Hamster herangezogen.
  • Wachstum des Inokulums
  • Impfstoffkultur
  • Es wurde eine kontinuierliche Kultur von L. intracellularis, die 29 Wochen in HEp-2-Zellen gezüchtet worden war, verwendet. Die Kultur wurde auf ähnliche Weise, wie es im Abschnitt über die Belastungskultur angegeben wurde, gezüchtet, mit der Ausnahme, dass die Kultur alle 2 bis 3 Wochen einer Passage auf neue HEp-2-Zellen unterzogen wurde.
  • Belastungskulturen
  • Ein herkömmlicher 75 cm2-Gewebekulturkolben wurde mit 3,75 × 105 McCoys-Zellen in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum (FBS) beimpft. Eine Züchtung wurde 18–24 Stunden bei 37°C mit 5% CO2 durchgeführt. Sodann wurde das Medium von den Zellen entfernt und ein Fläschchen N343 MSC X, verdünnt in 14 ml DMEM/2% FBS wurde in den Kolben gegeben. Die Kultur wurde in eine Gaskammer gebracht, evakuiert und mit Wasserstoff und Kohlendioxid unter Bildung eines Gemisches aus 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% H2 begast. Die Kultur wurde 6 Tage gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen in einen 100 ml fassenden Rührkolben geschabt und mit 90 ml DMEM/2% FBS und 0,01 g Cultisphere-G-Perlen versetzt. Die Kultur wurde bei den vorstehend angegebenen Gaskonzentrationen gezüchtet. Das Kolbenvolumen wurde in wöchentlichen Abständen durch Verdopplung des Mediums erhöht. Die Kultur wurde 25 Tage im Rührkolben auf ein endgültiges Volumen von 250 ml gezüchtet.
  • Der Stamm N101494 wurde auf die gleiche Weise wie der Stamm N343 gezüchtet.
  • Ernten der Kulturen
  • Impfstoffkultur
  • Die Kultur wurde durch 20-minüte Zentrifugation mit 3000 × g geerntet. Das Pellet wurde in Saccharose-Phosphat-Glutamat-Lösung (SPG) mit 10% FBS resuspendiert und einer 4-maligen Passage durch eine Nadel Nr. 25 unterzogen. Das Inokulum wurde in SPG/10% FBS auf das endgültige Volumen (15 ml) verdünnt.
  • Belastungskulturen
  • Die Kulturen wurden durch 20-minütige Zentrifugation mit 3000 × g geerntet. Die Pellets wurden in Saccharose-Phosphat-Glutamat-Lösung (SPG) mit 10% FBS resuspendiert und einer 4-maligen Passage durch eine Nadel Nr. 25 unterzogen. Das Inokulum wurde in SPG/10% FBS auf das Endvolumen verdünnt (20 ml für den Stamm N343 und 10 ml für den Stamm N101494).
  • Dosierung bei den Hamstern
  • Impfstoff
  • Am Tag 0 wurden sämtliche Hamster der Gruppe A oral mit 1 ml des hergestellten Impfstoffes geimpft.
  • Belastung
  • 22 Tage nach der Impfung erhielten 10 Hamster der Gruppe A und 10 Hamster der Gruppe B eine orale Dosierung von 0,5 ml des Belastungskulturstammes N343. Die Gruppe C wurde mit 0,5 ml des Belastungskulturstammes N101494 belastet.
  • Quantitative Bestimmung von IS-intracellularis
  • Die Bestimmung von lebensfähigem IS-intracellularis wurde durch Ermittlung der 50-prozentigen Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50) durchgeführt. Dazu wurden 2 ml der zu testenden Kultur entnommen. Die Zellen wurden durch 4-malige Passage durch eine Nadel Nr. 22 lysiert. Sodann wurde die Probe seriell 1:10 in DMEM/5% FBS mit einem Gehalt an Vancomycin (100 μg/ml) und Amphotericin B (2,0 μg/ml) verdünnt. Die Verdünnungen wurden auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen in einer Menge von 0,1 ml/Vertiefung gegeben. Die Mikrotiterplatten wurden mit McCoys-Zellen in einer Menge von 1250 Zellen/Vertiefung beimpft und vor der Infektion 18 bis 24 Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Es wurden 12 Vertiefungen/Verdünnung verwendet. Die Platte wurde 6 Tage bei Gaskonzentrationen von 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% N2 inkubiert. Am 6. Tag wurden die Zellen 2 Minuten mit einem kalten Gemisch aus 50% Aceton und 50% Methanol fixiert. Sodann wurden die Vertiefungen mit 0,03 ml/Vertiefung monoklonalem anti-IS-intracellularis-Antikörper in 1:2000-Verdünnung in PBS versetzt. Die Platte wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert und sodann 3-mal mit PBS gewaschen. anti-Maus-FITC in 1:30-Verdünnung wurde in einer Menge von 0,03 ml/Vertiefung zugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C wurde die Platte 3-mal mit ddH2O gewaschen und getrocknet. Die Proben wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Der TCID50/ml-Wert wurde bestimmt.
  • Überwachung der Infektion von Hamstern
  • Die Infektion von Hamstern wurde durch PCR unter Anwendung von Primern und Zyklusparametern gemäß den Angaben von Gary Jones überwacht. Kotproben wurden an den Tagen 0, 7, 14, 21, 29, 36 und 43 nach der Impfung gewonnen. Am Schluss wurde auch die Darmschleimhaut der Hamster durch PCR geprüft.
  • Histopathologie
  • Schnitte von Ileum und Kolon wurden mit Formalin fixiert, routinemäßig bearbeitet, mit Hemtoxylin und Eosin sowie durch Silberimprägnierung gefärbt und bewertet. Ferner wurden die Schnitte unter Verwendung von monoklonalem, für L. intracellularis spezifischem Antikörper gefärbt.
  • Durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme
  • Das Gewicht der Hamster wurde 21, 28, 35 und 42 Tage nach der Impfung bestimmt, um die durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme zu ermitteln.
  • Ergebnisse
  • Es wird auf die nachstehende Tabelle Bezug genommen.
  • TCID50
  • Die TCID50-Ergebnisse zeigten, dass die Impfstoffgruppe (Gruppe A) 104,86 TCID50/Hamster erhalten hatte. Die Hamster in den Gruppen A und B wurden mit dem Stamm N343 belastet und erhielten 105,5 TCID50. Die Hamster der Gruppe C wurden mit dem Stamm N101494 belastet und erhielten 102,75 TCID50/Hamster.
  • PCR
  • Der PCR-Test ergab die Anwesenheit von L. intracellularis bei 100% der geimpften Hamster, bei denen 21 Tage nach der Impfung eine Nekropsie durchgeführt wurde. Ein Test 43 Tage nach der Impfung ergab, dass 100% der Kontrollhamster und 50% der geimpften Hamster mit L. intracellularis infiziert waren. Keiner der mit N101494 belasteten Hamster war positiv. Bei keinem der Hamster wurde während der gesamten Studie eine Abscheidung im Kot festgestellt.
  • Histopathologie
  • H&E-Färbungen ergaben keine histologischen Läsionen in sämtlichen Schnitten der Hamster, bei denen 21 Tage nach der Impfung eine Nekropsie durchgeführt wurde. In Schnitten, die 43 Tage nach der Impfung vorgenommen wurden, wiesen 50% der Impfstoffgruppe eine schwache bis schwere lymphozytische Enteritis und 50% der Kontrollgruppe eine schwache lymphozytische Enteritis auf. Bei der N101494-Kontrollgruppe wurden keine Läsionen festgestellt.
  • Durch FA-Färbungen konnte die Anwesenheit von L. intracellularis bei keinem der Hamster 43 Tage nach der Impfung nachgewiesen werden.
  • Diskussion
  • Bei Hamstern, die mit einem hochgradig passagierten Stamm von L. intracellularis geimpft waren, konnte durch PCR eine 50%ige Verringerung der Infektion festgestellt werden.
  • Figure 00280001
  • Figure 00290001
  • Figure 00300001
  • Beispiel 6
  • Versuch zur Bestimmung der Wirksamkeit des Schweine-Impfstoffes
  • Ziel
  • Das Ziel dieser Studie besteht darin, die Sicherheit, die dauerhafte Kolonisierung und die Wirksamkeit eines avirulenten Lebendisolats und eines abgetöteten Isolats von L. intracellularis bei Schweinen mit einem Alter von 2 bis 3 Wochen zu bewerten. Eine Wirtstierstudie wurde durchgeführt, wobei Schweine im Alter von 3 Wochen geimpft und anschließend einer virulenten Belastung mit L. intracellularis Stamm N343 unterzogen wurden, um die Unterschiede in der Schutzwirkung der Vakzine zu vergleichen.
  • Verfahren
  • Am 11. Dezember 1995 wurden insgesamt 45 Schweine im Alter von 3 Wochen von der H&K-Farm bezogen. Sie wurden zur Fa. Veterinary Resources, Inc., einer Forschungseinrichtung in der Nähe von Cambridge, Iowa, transportiert, wo sie markiert wurden, um jedes einzelne Schwein individuell zu identifizieren. Die Schweine wurden bis 2 Tage vor Beginn der Studie in dieser Anlage gehalten, um eine Akklimatisierung an die Anlage zu ermöglichen. Während der gesamten Studie erhielten die Tiere Futter, das frei von Antibiotika war.
  • Am 13. Dezember wurden bei sämtlichen Tieren folgende Maßnahmen durchgeführt: Gewichtsbestimmung, Blutentnahme zur Gewinnung von Serum, klinische Bewertung und Gewinnung von Kotabstrichen. Sodann wurden die Schweine willkürlich in Gruppen von 5 Tieren eingeteilt und in Wannen gestellt. 20 Schweine wurden in einen getrennten Raum gebracht. Sie wurden als Kontrollgruppe und strikte Kontrollgruppe bezeichnet. 15 Schweine wurden in einen zweiten Raum für den ISi-1-Impfstoff gebracht. In einem dritten Raum befanden sich 10 Schweine für ISi-2.
  • Die Lebendvakzine wurde beim NOBL Laboratories Research and Development-Institut hergestellt und als experimentelles serielles ISi-1 identifiziert. ISi-1 (Stamm N343) wurde von einem Schwein isoliert und 29 Wochen kontinuierlich in Reinkultur gezüchtet. Der Impfstoff wurde in McCoys-Zellen in Rührkolben bei vermindertem Sauerstoffgehalt gezüchtet, bis eine Infektion von nahezu 100% beobachtet wurde. Eine Probe des hochgradig passagierten N343-Stammes, der für ISi-1 verwendet wurde, wurde weitere 11 Wochen passagiert ("N343NP40wk") und gemäß dem Budapester Vertrag am 22. Mai 1996 bei der ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland USA, 20852, unter der Hinterlegungsnummer 55783 hinterlegt. Die Kulturen wurden durch 20-minütige Zentrifugation mit 3000 × g geerntet. Die Pellets wurden in Saccharose-Phosphat-Glutamat-Lösung (SPG) mit 10% FBS resuspendiert und einer 4-maligen Passage durch eine Nadel Nr. 25 unterzogen. Die Lysate wurden 5 Minuten mit 500 × g zentrifugiert, um die Zellbruchstücke und Mikroträger-Perlen zu pelletisieren. Der Überstand wurde gewonnen und bei –70°C bis etwa 1 Stunde vor der Impfung aufbewahrt, wonach er bis zur Verabreichung auf Eis gelagert wurde.
  • Die abgetötete Vakzine (ISi-2) wurde auf ähnliche Weise 12 1/2 Wochen gezüchtet, passagiert und geerntet und in einem Percol-Gradienten gereinigt. Die gereinigten Bakterien wurden sodann bei –70°C bis etwa 1 Woche vor der Impfung aufbewahrt, wobei sie während des letztgenannten Zeitraums bei 4°C bei normalen Sauerstoffkonzentrationen, die für L. intracellularis toxisch werden, gelagert wurden. AlOH wurde zu den Bakterien zur Erzielung eines Endgemisches mit 10% AlOH zugegeben. Die Proteinkonzentration wurde nach dem Biuret-Verfahren bestimmt.
  • Quantitative Bestimmung von lebenden IS-intracellularis
  • Die quantitative Bestimmung von lebensfähigem L. intracellularis wurde durch Bestimmung der 50-prozentigen infektiösen Gewebekultur-Dosis (TCID50) durchgeführt. Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit McCoys-Zellen in einer Menge von 1250 Zellen/Vertiefung beimpft und 18–24 Stunden vor der Infektion gezüchtet. Die Proben wurden seriell 1:10 mit DMEM/5% FBS mit einem Gehalt an Vancomycin (100 μg/ml) und Amphotericin B (2,0 μg/ml) verdünnt. Die Verdünnungen wurden zu den Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in einer Menge von 0,1 ml/Vertiefung gegeben. 12 Vertiefungen/Verdünnungen wurden verwendet. Die Platte wurde 6 Wochen bei 37°C und Gaskonzentrationen von 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% N2 inkubiert. Die Zellen wurden 50 Minuten mit einem kalten Gemisch aus 50% Aceton und 50% Methanol fixiert. Sodann wurden die Vertiefungen mit 0,03 ml/Vertiefung monoklonalem anti-L. intracellularis-Antikörper (entwickelt von Dr. Steven McOrist) in 1:2000-Verdünnung in PBS versetzt. Die Platte wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert und sodann 3-mal mit PBS gewaschen. anti-Maus-Immunoglobulin G-Fluorochrom-Konjugat (FITC) in Verdünnung von 1:30 wurde in einer Menge von 0,03 ml/Vertiefung zugegeben und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Sodann wurde die Platte 3-mal mit ddH2O gewaschen und getrocknet. Die Proben wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Der TCID50/ml-Wert wurde unter Anwendung des Reed-Muench-Berechnungsverfahrens bestimmt.
  • Die TCID50-Ergebnisse zeigten, dass ISi-1 1,8 × 105 Bakterien/ml aufwies. Beim vierten Inokulum handelte es sich um ein Placebo, das von Gewebekulturzellen abgeleitet war, die auf die gleiche Weise wie die Impfstoffe bearbeitet worden waren.
  • Der abgetötete Impfstoff wurde gemäß dem Biuret-Verfahren auf seinen Gesamtproteingehalt getestet. Der Wert betrug 0,311 mg/ml.
  • Die Schweine wurden am 13.12.1995 geimpft. Der Lebendimpfstoff wurde in einer Dosis von 2 ml intranasal mit 1 ml/Nasenloch verabreicht. Der (abgetötete) ISi-2-Impfstoff wurde in einer Menge von 1,5 ml/Schwein intramuskulär verabreicht und 14 Tage später nochmals gegeben. Sämtliche Kontrolltiere erhielten nicht-infizierte Zellen auf die gleiche Weise wie die Lebendimpfstoffe.
  • Beobachtungen und Proben
  • Kotabstriche und Serumproben wurden während der gesamten Studie in Abständen von 7 Tagen gewonnen. Die Kotabstriche wurden nach dem PCR-Testverfahren unter Verwendung des Primersets
    5'-TATGGCTGTCAAACACTCCG-3' und
    5'-TGAAGGTATTGGTATTCTCC-3' für die DNA-Amplifikationen verarbeitet. Folgende Zyklusparameter wurden eingehalten: 93°C für 5 Minuten, 55°C für 45 Sekunden und 72°C für 45 Sekunden beim ersten Zyklus. 33 Zyklen wurden bei den vorerwähnten Temperaturen für 45 Sekunden pro Temperatur durchgeführt. Beim letzten Zyklus galten folgende Bedingungen: 93°C für 45 Sekunden, 55°C für 45 Sekunden und 72°C für 2 Minuten. Die Primer entsprechen den Angaben von Jones et al.
  • Belastung
  • Sämtliche Tiere, ausgenommen strikte Kontrollen, erhielten 26 und 27 Tage nach der Impfung eine Belastungskultur, die aus niedrigpassagierten Kulturen von L. intracellularis-Stämmen N343 und N72994 bestanden, die 8 und 12 Wochen kontinuierlich gezüchtet worden waren. Die Kulturen wurden durch 20-minütige Zentrifugation mit 3000 × g gewonnen. Die Pellets wurden in Saccharose-Phosphat-Glutamat-Lösung (SPG) mit 10% fötalem Kälberserum resuspendiert und einer 4-maligen Passage unter Verwendung einer Nadel Nr. 25 unterzogen. Einige geerntete Kulturen wurden bei –70°C bis zum Zeitpunkt der Belastung gelagert, während andere Kulturen bis zum Belastungstag gezüchtet und dann geerntet wurden. Die Belastungsinokula wurden vereinigt. Die TCID50-Werte der Kulturen wurden bestimmt. Die Proben wurden bis zur Verabreichung auf Eis gelagert.
  • Die am 8.1.1996 verabreichte Belastungskultur bestand aus 4 × 104 Bakterien/ml. Die am 9.1.1996 verabreichte Belastungskultur wies 3 × 104 Bakterien/ml auf. Die Schweine erhielten an beiden Tagen 15 ml Belastungskultur mit einer Magenspülung. Die Tiere erhielten somit 6 × 105 Bakterien/Schwein und 4,7 × 105 Bakterien/Schwein am 8.1.1996 bzw. am 9.1.1996.
  • Ergebnisse
  • Sicherheit
  • Ergebnisse der Kot-PCR-Bestimmung: Der Nachweis von L. intracellularis unter Anwendung von PCR ergab, dass keines der Schweine zu Beginn der Studie Bakterien ausschied. 7 Tage nach der Impfung waren sämtliche Schweine negativ. 14 Tage nach der Impfung waren 3 Schweine in der ISi-1-Gruppe positiv. 2 Tiere in der ISi-1-Gruppe waren 21 Tage nach der Impfung positiv, während sämtliche übrigen Tiere negativ waren. 26 Tage nach der Impfung gab es keine Tiere, die Bakterien ausschieden, wie durch PCR nachgewiesen wurde. 26 Tage nach der Impfung wurden 5 Schweine der Gruppe ISi-1 und der Kontrollgruppe sowie 4 Schweine aus der Gruppe ISi-2 einer Nekropsie unterzogen. Es wurden Proben von Ileum, Kolon, mesenterischen Lymphknoten und Mandeln sowie Lungenproben aus Schweinen mit Läsionen, die einen Verdacht auf Pneumonie ergaben, gewonnen.
  • Der PCR-Test wurde an einzelnen Ileum- und Lungenproben durchgeführt. Mandeln, Kolon und Lymphknoten wurden für die Behandlungsgruppe vereinigt und einer PCR unterzogen. Die PCR-Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt.
  • Figure 00340001
  • Histologische Schnitte der Ilea wurden unter Verwendung eines für L. intracellularis spezifischen, monoklonalen Antikörpers als primärem Antikörper und eines anti-Maus-Immunoglobulin G-Fluorochrom-Konjugats als sekundärem Antikörper gefärbt. L. infracellularis wurde bei 3 von 5 Schweinen der ISi-1-Gruppe festgestellt. Sämtliche übrigen Schweine waren bei der Fluoreszenz-Antikörperfärbung negativ.
  • Die restlichen Schweine wurden 21 Tage nach der Belastung einer Nekropsie unterzogen. Dabei wurden die gleichen Proben für die Bewertung genommen. Die PCR-Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt.
  • Figure 00350001
  • FA-Färbungen der Ilea wurden gemäß den vorstehenden Angaben gemacht und erwiesen sich bei 7 von 10 Tieren in der Kontrollgruppe als positiv. Sämtliche übrigen Tiere waren in Bezug auf das Vorliegen von L. intracellularis negativ.
  • Das Serum wurde auf die Bildung von IgG-Antikörper durch die Schweine nach Belastung mit L. intracellularis getestet. Der Test wurde durch Beimpfen von mit Gewebekultur behandelten Terasaki-Platten mit McCoys-Zellen in einer Menge von 125 Zellen/Vertiefung durchgeführt. Vor der Infektion wurde eine 18- bis 24-stündige Züchtung durchgeführt. Eine reine Kultur von L. intracellularis wurde sodann in einer Verdünnung von 1000–3000 Bakterien/ml in DMEM mit 5% fötalem Kälberserum zu den Vertiefungen in einer Menge von 0,01 ml/Vertiefung gegeben. Die Platte wurde 6 Tage bei Gaskonzentrationen von 8,0% O2, 8,8% CO2 und 83,2% N2 inkubiert. Die Zellen wurden 2 Minuten mit einem kaltem Gemisch aus 50% Aceton und 50% Methanol fixiert. Die Seren der Schweine wurden 1:75 in steriler PBS verdünnt. Das verdünnte Serum wurde in einer Menge von 0,01 ml/Vertiefung zu den Vertiefungen gegeben. Die Platten wurden sodann 30 bis 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Platten 5-mal mit steriler PBS gewaschen. Sodann wurden die Vertiefungen in einer Menge von 0,01 ml/Vertiefung mit anti-Schwein-IgG-Immunoglobulin G-Fluorochrom-Konjugat versetzt. Die Platte wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Sodann wurden die Platten 5-mal mit ddH2O gewaschen und getrocknet. Proben wurden 5-mal mit ddH2O gewaschen und getrocknet. Die Proben wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Die Vertiefungen, in denen Bakterien festgestellt wurden, wurden als positiv bezeichnet. Vertiefungen ohne Bakterien wurden als negativ bezeichnet.
  • Ergebnisse
    Figure 00360001
  • Tiere, die am Tag 0 positiv waren, wurden in wöchentlichen Abständen erneut getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass sämtliche Tiere 14 Tage nach der Impfung serologisch negativ wurden. Dies ist nicht unerwartet, da die Schweine am Tag 0 ein Alter von 3 Wochen aufwiesen und positive Ergebnisse in diesem Alter auf mütterliche Antikörper zurückzuführen sein können.
  • Die Seren wurden zusammen mit einem positiven Kontrollserum getestet, das durch Hyperimmunisierung eines Schweins mit L. intracellularis, das in Reinkultur gezüchtet worden war, erhalten worden war. Ein negatives Kontrollserum wurde von einem gnotobiotischen Schwein der South Dakota State University gewonnen.
  • Die vorstehende Beschreibung und die vorstehenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung bevorzugter Ausführungsformen, mit denen die Ziele, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung realisiert werden. Keinesfalls ist damit beabsichtigt, die vorliegende Erfindung hierauf zu beschränken.

Claims (23)

  1. Verfahren zur Züchtung von L. intracellularis-Bakterien, umfassend das Gewinnen von Kulturzellen, die mit L. intracellularis infiziert sind, das Inkubieren der infizierten Zellen bei einer Sauerstoffkonzentration von weniger als etwa 18%, wobei die infizierten Zellen in Suspension gehalten werden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend ferner die Stufe einer Passage eines Teils der Zellen auf frische Zellen, um die Erzeugung von L. intracellularis-Bakterien zu erhöhen.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, umfassend ferner die Stufe des Erntens mindestens eines Teils der Zellen.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die L. intracellularis-Bakterien von einem Tier, das mit L. intracellularis infiziert ist, erhalten werden.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei dem Tier um ein Schwein handelt.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Inkubation bei einer Sauerstoffkonzentration im Bereich von 0% bis etwa 8% erfolgt.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Inkubation bei einer Sauerstoffkonzentration im Bereich von 0% bis etwa 3% erfolgt.
  8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Inkubation bei einer Kohlendioxidkonzentration im Bereich von etwa 6% bis etwa 9% erfolgt.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Inkubation bei einer Wasserstoffkonzentration im Bereich von etwa 73% bis etwa 94% erfolgt.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Inkubation bei 0% bis etwa 8% O2, etwa 8,8% CO2 und etwa 83,2% H2 erfolgt.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kulturzellen aus der Gruppe HEp-2-, McCoys- und IEC-18-Zellen ausgewählt werden.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die McCoys- und IEC-18-Zellen sich auf Mikroträgern befinden.
  13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei es sich bei den Kulturzellen um HEp-2-Zellen handelt, die in Abwesenheit von Mikroträgern gezüchtet werden.
  14. L. intracellularis-Bakterien, wobei die Bakterien aus der Gruppe der Bakterien, die als ATCC 55672 und ATCC 55783 hinterlegt sind, ausgewählt werden.
  15. Verfahren zur Züchtung von L. intracellularis-Bakterien umfassend folgende Stufen: (1) Inokulieren von Kulturzellen mit einem Inokulum mit einem Gehalt an L. intracellularis-Bakterien, um die Zellen mit den Bakterien zu infizieren; und (2) Inkubieren der infizierten Zellen bei einer Temperatur von etwa 36°C bis etwa 38°C bei einer Sauerstoffkonzentration von 0% bis etwa 8%, wobei die infizierten Zellen bewegt werden, um die Züchtung von L. intracellularis durchzuführen, während die infizierten Zellen in Suspension gehalten werden.
  16. Verfahren zur Erzeugung eines abgeschwächten L. intracellularis-Stammes, umfassend das Gewinnen der mit L. intracellularis-Bakterien infizierten Kulturzellen, das Inkubieren der infizierten Zellen bei einer Sauerstoffkonzentration von 0% bis etwa 18%, das Bewegen der infizierten Zellen, um die Züchtung der Bakterien durchzuführen, während die infizierten Zellen in Suspension gehalten werden, die Passage mindestens eines Teils der kultivierten Bakterien, das Ernten mindestens eines Teils der kultivierten Bakterien und das Auswählen eines abgeschwächten Stammes, um abgeschwächte L. intracellularis-Bakterien bereitzustellen.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Inkubation bei einer Sauerstoffkonzentration im Bereich von 0% bis etwa 3% erfolgt.
  18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Inkubation bei einer Kohlendioxidkonzentration im Bereich von etwa 6% bis etwa 9% erfolgt.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Inkubation bei einer Sauerstoffkonzentration im Bereich von etwa 73% bis etwa 94% erfolgt.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Inkubation bei 0% bis etwa 8% O2, etwa 8,8% CO2 und etwa 83,2% H2 erfolgt.
  21. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Kulturzellen aus der Gruppe HEp-2-, McCoys- und IEC-18-Zellen ausgewählt werden.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei es sich bei den Kulturzellen um HEp-2-Zellen handelt, die in Abwesenheit von Mikroträgern gezüchtet werden.
  23. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Kulturzellen 6 bis 8 Monate in Suspension gehalten werden.
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