DD265279A3

DD265279A3 - Verfahren zur Herstellung von Schweinepest-Vakzine

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Publication number: DD265279A3
Authority: DD
Publication date: 1989-03-01

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von lyophilisierten Zellkultur-Lebendvakzine gegen die klassische Schweinepest mit dem lapinisierten Sp-Virusstamm "China" in fetalen Schweinenierenzellkulturen. Ziel der Erfindung ist die mit geringem Aufwand verbundene Produktion hochwertiger Immunpraeparate, die bei parenteraler und aerogener Anwendung beim Schwein eine solide Immunitaet gegen die Infektion mit virulentem Sp-Virus vermitteln. Die Aufgabe besteht darin, durch ein effektives Gewebeaufschliessungsverfahren mit anschliessender Zellkultivation unter Rollkulturbedingungen die Virusausbeute so zu erhoehen, dass aus 48 g embryonalem Nierengewebe der Impfstoff fuer 1 Million Schweine mit einem Durchschnittstiter von 106 Schweineschutzdosen hergestellt werden kann. Die Lyophilisation wird mit einem speziellen Stabilisator nach bekannten Verfahren durchgefuehrt.

Description

Charakteristik der bisher bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß zur vorbeugenden Immunisierung von Schweinen gegen die Sp Zellkulturimpfstoffe verwendet werden, die lebendes modifiziertes Sp-Virus in lyophilisierter Form enthalten. Die Verfahren zu ihrer Herstellung unterscheiden sich in der Art und Weise der Virusattenuierung und der Zollkult; v<?'.ion.

Bei einem Teil der Vakzinen wird das Sp-Virus durch Serienpassagen in Zellkulturen des homologen Wirtes attenuierl und in diesen produziert. Verwendet werden Primärkulturen aus embryonalen Schweinenieren (Bass und Ray, JAVMA142,1112-1 '47, 1963), Ferkelhoden (Kubin, ZbI. Vet. Med. B Ί¹.61-59,1964) sowie Schweineleukozyten und Zellen aus dem Plexus chorioideus (Öse, Berkmann, Ziegler, GaIe und Hughes, Vet. Med. 59,606-609,1964), ferner virushaltige Zellen von Langzeitkulturen aus den Nieren experimentell mit Sp-Virus infizierter Schweine (Soekawa und Izawa, BRD-Offen'egungsschrift 1617668), persistent infizierte stabile Zellinien aus Schweinenieren (Torlone und Titoli, Atti. Soc. Hai. Sei. Vet. i8, 734-/40,1964) und die stabile Zellinie IB-RS-2, die attenuiertes Sp-Virus unbekannter Herkunft enthält (Prunet, BRD-Offenlegungsschrift 2121237). Auch heterologe Zellkulturen finden zur Virusattenuierung und Vakzineherstellung Verwendung. Hierzu dienen Serienpassagen in Zellkulturen aus Ferkelhoden, Kälbyrhoden und Meerschweinchennieren, wobei mit letzteren die Vr'<zineherstellung erfolgt (Sasakawa und Kumagai, Jap. Agr. Res. Quart. 1966), Wechselpassegen in vitro und in vivo nach Adaption des Sp-Virus an Hühnerembryonen, in Hühnerembryozellkulturen, über Kaninchen und Schweine in Wiederkäuerzellen mit anschließender Vakzineproduktion in Schafzellkulturen (Svangard, Armbruster und Carmones, Veterinärmed. Nachrichten, 1969,255-271), die CCVP-Methode der Langzeitkultivation in Schweine- und Rindernierenzellkulturen (Sato, Hanaki und Nobuto, Archiv f. Virusforschung XV, 113-121,1965) und die Isolierung „Kalter Mutanten" durch Serienpassagen in Primärkulturen aus embryonalen Rinder- und Schafzellen bei 31⁰C (Launais, Aynaud und Corthier, Rev. Med. Vet., 123,1537-1554,1972). Bei anderen Vakzinen wird von lapinisierten Sp-Virusstämmen ausgegangen, die an Zellkulturen vom Schwein oder von heterologen Wirten adaptiert und in diesen zur Impfstoffherstellung kultiviert werden. Verwendet werden der Stamm „Hudson", vornehmlich aber Vertreter des Stammes „China", die sich durch besondere Unschädlichkeit für Schweine auszeichnen. Dio Virusvermehrung erfolgt in primären Einschichtzellkulturen aus Ferkelnieren (Barnaure, Popa und Dumetrescu, Lucrarüe Inst. Cercet. Vet. Biopräparate Pasteur 13,16-22,1977), embryonalen Ferkelnieren (Mischenko, Arb. d. Staatl. Wiss. Prüfungsinst. f. Vet. Präp. 18,55-61,1972), Kaninchennieren (Lang, Lefthenotis und Mackowiak, Compt. Rend. Acad. Sei. 251,1593-1594,1960), Lammnieren (Precausta, Bran, Kato, Teire und Marcon, Rev. Med. Vet., 126,969-981,1976), Kaninchen- und Schafnieren (Leftheriotis, Precausta und Caillere, Rev. Med. Vet. 122,33-44,1971).

Soweit bekannt, werden die Zellkulturen in stationärer Position bebrütet (Soekawa und Izawa, BRD-Offenlegungsschrift 1617568), (Mischenko, Arb. d. Staatl. Wiss. Prüfungsinst. f. Vet. Präp. 18,55-61,1972).

Die erwähnten Herstellungsverfahren für Sp-Zellkulturvakzinen weisen verschiedene Nachteile auf. Diese sind entweder durch Mängel der verwendeten Virusstämme bedingt, die in homologen Primärkulturen zytopaihische Veränderungen hervorrufen, die vermutlich unspezifische Veränderungen hervorrufen, die vermutlich unspezifischer Natur sind (Mahnet und Mayr, „Schweinepest" VEB Gustav Fischer Verlag Jene, 1974), oder sie beruhen auf Schwierigkeiten bei der Herstellung der Zellkulturen aus schwer gewinnbarem Ausgangsgewebe. In anderen Fällen erfordert die Vielzahl der zu bearbeitenden Organe von kleinen Gewebespendern einen erhöhten Produktionsaufwand mit gestoigeiicm Kon'aminationsrisiko. Scnließlich können bei Vakzination mit heterologen Sp-Vakzinen nach Kontakt mit Feldvirus Virusträger entstehen, wenn der Antigengehalt auf 'Ao der Normalimpfctosis abfällt (Leunen, Ann. Med. Vet., 119,93-103,1975). Bei Verwendung stabiler Zellinien muß mit onkogenen Zellaktivitäten gerechnet werden.

Ziel der Erfindung

Mit der vorliegenden Erfindung wird für die industriemäßige Sp-Vakzineproduktion ein effektives Verfahren angeboten, mit dem bei geringem Produktionsaufwand große Mengen von Impfstoff mit hohem Schutzwert für Schweine hergestellt werden können, der sowohl für die parenteral als auch für die aerogene Anwendung geeignet Ist und eine solide Immunität gegen die Infektion mit virulentem Sp-Virus vermittelt.

Darlegung des Wesens der Erfindung Technisch« Aufgabe Den erwähnten Mängeln der bekannten Verfahren zur Herstellung von Sp-Zeilkulturvakzinen liegen Ursachen zugrunde, die

durch die Art der verwendeten Zellkulturen und/oder Virusstemme oder durch die Kultivationstechnolog!e bedingt sind.

Ein erhöhtes Kontaminationsrisiko durch latente Viren besteht vornehmlich bei solchen Vakzinen, die mit Zellkulturen aus den Organen von Schweinen post partum hergestellt worden sind. Zytopathische Effekte in den Produktionskulturen, die bei einigen

dieser Valu'nen beobachtet werden, sind vermutlich hierdurch bedingt.

Bei andeien Vakzinen führen Besonderheiten des Produktionsvirusstammes, sich nur in Zeilkulturen aus schwer zugänglichen Geweben μ vermehren wie Chorioidplexuszellen vom Schwein zu einer erhöhten bakteriellen Kontaminationsgefahr. Dies gilt

in ähnlicher Weise auch für Zellkulturvakzinen aus den Organen kleiner heterologer Wirte und für die Bereitstellung von

Produktions- und Vorratszellkulturen bei stabilen Zellinien. Die Nachteile der zur Vakzineherstellung benutzton Stationärkulturtechnologie Degen in der arbeitsaufwendigen Verwendung

zahlreicher kleiner Kulturgofäße für die Zellkultur- und Virusproduktion. Ihre Handhabung erfordert viele Arbeitsschritte, dieerhöhte Personalkosten verursachen und die Gefahr der Koimelnschleppung beinhalten. Zudem ist der Schutzwert der mitdiesem Verfahren hergestellten lyophilieierten Sp-Zellkulturvakzinon im allnemeinen nicht ausreichend, um unter

Praxi-.bedingungen eine wirksame aerogene Immunisierung zu gewährleisten. Zur Beseitigung dor Mängel der bisher bekannten Verfahren stellt sich für die vorliegende Erfindung die Aufgabe, bei Verwendung fetaler Ferkelnieren und von an diese Zellen adaptierten lapinlsiertem Sp-Virus Stamm ,China* durch Intensivierung der Zeil- und Viruskultivation bei Anwendung der Rollkulturtechnologie die Virusausbeute und damit den Virusger alt der Vakzine zu erhöhen, um hierdurch zu einem für die parenterale und aerogene Immunisierung gegen die Sp in

gleicher Weise geeigneten Impfstoff zu gelangen.

Merkmale der Erfindung Erfindungsgemäß werden die Nieron 100-115 Tage alter Schweinefeten zur Herstellung von Einschichtzollkulturen in Rollkulturflaschen und zur Virusproduktion verwendet. Dabei wird die Zellausbeute dadurch erhöht, daß man die dekapsulierten Ferkelnieren unter Einbeziehung von Rinde und Mark mechanisch mit Rasierklingen bis zu einem zerfließenden Zellbrei

zerkleinert und ohne das zuvor sorgfältig entfernte 8indegewebe des Nierenbeckens 3 bis 4 Zyklen einer Kurzzeittrypsination von20 Minuten Dauer unterwirft. Die zellhaltige Trypsinlösung wird einem sterilen Zeilzüchtungsmedium, das 15% Rinderserumenthält bis zu einem Verhältnis von 1:10v/v zugegeben.

Das übliche Fragmentieren des Nierengewebes mittels Schere und das Zentrifugleren der Zellen r ir Entfernung des Trvpsins

werden vermieden.

Es wurde gefunden, daß aus den relativ geringen Mengen fetalen Nierengewebes, das in der Regel 60-7Og pro Sau beträgt,

große Mengen kleiner Zellaggregaticnen erhalten werden, die in einfachen Zeilzüchtungsmedien eine größere

Proliferationeaktivitat aufweisen als die nach den üblichen Präparationsverfahren gewonnenen Zellen. Es wurde ferner gefunden, daß die aus 1 g Nierengewsbe isolierten Zellen ausreichen, um in 1 RollkulnHIasche mit 1200cm¹ Nutzfläche nach durchschnittlich 4-5 Bebrütungstagen bei 38⁰C eine geschlossene Zellage zu bilden. Ehe Erneuerung des Zeilzüchtungsmediums ist nicht erforderlich. Erfindungsgemäß wird die Virusproduktion durch Beimpfung der Zellkulluren mit hohen Konzentrationen von

zeiikuituradaptiertem Sp-Virus des Stammes »China* eingeleitet, das mindestens 10^eSchweineschutzdosen pro 2 ml enthält. Eswird in Mengen von 10% des Zellzüchtungsmediums direkt auf die Zellkultur inokuliert. Die Adsorptionsperiode beträgt60 Minuten bei 38⁰C. In dom danach zugegebenen Erhaltungsmedium sind 10% Serum vom Pferd enthalten. Zum Zeitpunkt desmaximalen Virusgehaltes am 3. Tage p.i. wird das Oberwiegend zellgebundene Virus durch Zerstörung der Zellen durchklimatische Beugung freigesetzt. Die noch an derfl »fäßwand haftenden Zellen werden durch Abschütteln mit dem im Auftauenbegriffenen teilweise noch gefrorenen Medium in die Virusflüssigkeit Oberführt. Die Virusernte wird bei - 6O⁰C gelagert. Der

Virusgehalt wird durch Titration bestimmt. In den Virusernten sind in der Regel 10*·' Schweineschutzdosen pro 2 ml enthalten. Zur Herstellung des lyophllieierten Impfstoffes wird das Virus mit einem Trockenschutzmedium aus entrahmter Milch, Rohrzucker, Glutaminsäure und Gelatine versehen. Es wird der Vakzine in einer Endkonzentration von 33% zugesetzt. Mit dem orf indungsgemöRen Vorfahren können aus 48g fetalem Nierengewebe 15 000 ml hochtitriges Virus gewonnen werden,

aus dem Sp-impfstoff für 1 Million Schweine bei parenteral Einzelimpfung, oder der Aerosol-Impfstoff für eine gleich große

Zahl von Schweinen bei Gruppe nimpfung produziert werden kann. Dur Schutzwert einer Impfdosis der aufgelösten Trockenvakzine beträgt 10⁴ echweineimmunitfierende Einheiten. Aufführungsbaispl·!

Die aus dem Uterus von 100-111» Tage trächtigen Sauen entwickelten Feten worden an den Hinterbeinen mit vierzinkigen, feststellbaren Zan»en gefaßt und durch Absetzen der Nabelschnur dinikt an dor Bauchwand und Kehlschnitt entblutet. Die äußere Desinfektion erfolgt durch ein Tauchbad In 1%lger Wcfasterillösung. Bei den hängend fixierten Tieren wird die Bauchwand mit der Schere eröffnet. Nach Vorfall der Eingeweide werden unter Schonung der Kopse! die Nieren gelöst und in einem Erlenmeyer-Weithalskolbnn gesammelt. Die Dekapsulation erfolgt in einer Drigalski-Schale. Zur Fragmentation des Nierengewebes wird dib Niere am Hilus mit der Pinzette gofaßt und mit Rasierklingen bis zu einem zerfließenden Gewebebrei zerkleinert. Das Nierenparenchym wird von dem Beckenbindegewebe abgestreift, gesammelt und in Mengen von 16g in einen Erlenmeyerkclben eingebracht.

Die Trypeinbehandlung wird als fraktionierte Kurzzelttrypslnatlon durchgeführt. Hierbei erfolgen 4 Extraktionen mit je etwa 100-15OmI 0,26%iger, 37"C warmer Trypsinlösung. Die trypsinlerten Ztillsuspenslonen werden durch Sieben von groben Bestandteilen befreit, bei 4°C gesammelt und nach beendeter Trypsinatlon In 4600ml Zellzuchtmedium bestehend aus Hankescher Salzmischung mit 0,6 % Lektalbumlnhydrolysat und 16% Rinderserum mit den üblichen Antibiotikazusätzen aufgeschwemmt. Zur Schonung der Zellen wird die Trypeinlösung nicht durch Zentrifugation abgetrennt.

Zur Zellzüchtung werden etwa 300ml des zellhaltigen Mediums in handelsübliche 5000ml Steilbrustflaschen gegossen. Diese werden in einer Rollereinrichtung bei 38⁰C bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 8 Umdrehungen pro Stunde inkubiert. Nach 4-5tägiger Bebrütung ist das Zellwachstum in den Kulturen komplett. Eine Erneuerung des Zellzuchtrrudiums wird nicht vorgenommen.

Die Viruskultivation wird nach Entfernung des Zellzüchtungsmediums durch die Beimpfung mit Sp-Virus eingeleitet. Hierbei werden 30ml Sp-Virus des lapinisierten, an Ferkelnierenzellen adaptierten Sp-Virusstammes „China" mit 10* Schweineschutzdosen pro 2 ml direkt auf die Zellen inokuliert. Nach einor Adsorptionszeit von 60 Minuten bei 38⁰C werden etwa 300ml eines 10% Pferdeserum enthaltenden Virusmediums aus Hanksscher Salzmischung mit 0,5% Laktalbuminhydrolysat und den gebräuchlichen Antibiotika hinzugefügt. Die beimpften Kulturen werden 3 Tage lang in der Rollereinrichtung bebrütet. Die Ernte des Virus erfolgt durch einen Gefrier-Tau-Zyklus im Alkohol-Trockeneisbad bei Rotation der Kulturflaschen um die Längsachse. Nachdem siun eine Schicht gefrorenen Modiums über der gesamten Zellfläche gebildet hat, werden die Rollerfiaschen einige Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Dat.. -ih werden die an der Flaschenwand haftenden Zellen mit dem noch partiell gefrorenen Medium abgeschüttelt. Mit diesem Verfahren wird das zeilassoziierte Virus erfaßt. Das vollständig aufgetaute Virus witd in Mengen bis zu 2500ml gesammelt und bei Temperaturen unter -60°C eingefroren. Der Virusgehalt wird durch Titration von 2 ml dekadischer Virusverdünnungen am Schwein ermittelt. Zur Herstellung der lyophilisierten Sp-Zellkultutvakzine wird dem aufgetauten Virus ein Stabilisator in Mengen von 33% v/v hinzugefügt, der Trockenmagermilch und ein Trockenschutzmedium enthält, das die folgende Zusammensetzung aufweist:

KOH	ad	0,548 g
!-Glutaminsäure	1,440 g
K₂HPO₄	2,508 g
NH₂PO₄	1,030 g
Saccharose	150,000 g
20%ige Gelatine	200,000 g
Aqua idesl.	1000,000 ml

Das Trockenschutzmedium wird zunächst dazu verwendet, die lyophilisierte Magermilch, die in der Vakzine in einer EndKonzentration von 4% enthalten ist, in Lösung zu bringen. Erst danach wird es dem Virus zugesetzt. Die Ampullierung und Lyophilisation wird nach bekannten Verfahren vorgenommen.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Schweinepestvakzinen durch Vermehrung von lapinisiertem an Ferkelnierenzellen adaptiertem Schweinepestvirus vom Stamm „China" in fetalen Schweinenierenzellkulturen, gekennzeichnet dadurch, daß man das Nierenparenchym 100-115 Tage alter Schweinefeten mechanisch zu einem fließenden Zellbrei zerkleinert, vom Bindegewebe sorgfältig abstreift, fraktioniert, 20 bis 40min lang mit der lOfachen Menge warmer Trypsinlösung behandelt, die Zellen anschließend in der lOfachen Menge 15% Rinderserum enthaltenden Zellzuchtmediums aufschwemmt, unter Rollkulturbedingungen züchtet, die kompletten Zellkulturen mit einer Multiplizität von 0,01 bis 0,001 mit Schweinepest-Zellkulturvirus infiziert, ein Erhaltungsmedium mit 2% bis 10% Pferdeserum hinzufügt, nach 3tägiger Inkubation die Zellen durch klimatische Beugung zersprengt, von der Gefäßwand abschüttelt, bei -60⁰C zwischenlagert und unter Zusatz eines Trockenschutzmediums, das Rohrzucker, Gelatine, !-Glutaminsäure und Magermilch enthält, lyophilisiert.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes für die aktive Immunisierung von Schweinen gegen die klassische Schweinepest (Sp).