DE2713371C2

DE2713371C2 -

Info

Publication number: DE2713371C2
Application number: DE2713371A
Authority: DE
Inventors: Eldon Vernon Lincoln Nebr. Us Davis
Original assignee: NORDEN LABORATORIES Inc LINCOLN NEBR US
Current assignee: NORDEN LABORATORIES Inc LINCOLN NEBR US
Priority date: 1976-03-30
Filing date: 1977-03-25
Publication date: 1989-01-05
Also published as: GB1580844A; ZA771893B; JPS6216933B2; LU77030A1; AU2329177A; FR2346022A1; CA1085724A; BE852756A; JPS62115279A; IE44911B1; JPS52120117A; JPS6257307B2; FR2346022B1; NZ183618A; IE44911L; US4031204A; NL7703197A; DE2713371A1; AU510744B2

Description

Die Anmeldung betrifft das im Anspruch 1 angegebene feline Rhinotracheitis Virus, ATCC-Nr. VR 814, das im Anspruch 2 angegebene modifizierte feline Rhinotracheitis Virus, ATCC-Nr. VR 815 und den im Anspruch 3 angegebenen Impfstoff gegen die Rhinotracheitis der Katze. Die Ansprüche 4 und 5 betreffen Ausgestaltungen des Impfstoffs.

Die Rhinotracheitis der Katze ist eine fieberhafte, hoch kontagiöse Viruskrankheit, die plötzlich auftritt und durch Conjunctivitis, Tränen- und Nasenausfluß verbunden mit Schnupfen und Niesen und krankhaften Veränderungen des oberen Respirationstraktes charakterisiert ist. Die Krankheit wurde erstmals von Crandell und Maurer, Proc. Soc. Exptl. Biol. & Med., Bd. 97 (1958), S. 487 bis 490, beschrieben. Das Virus gehört aufgrund seiner Struktur, seiner chemisch- physikalischen und biologischen Eigenschaften in die Herpesgruppe. Es ist für etwa 40% der Infektionen des oberen Respirationstraktes von Katzen veranwortlich.

Ein Impfstoff gegen Rhinotracheitis (nachstehend kurz mit FVR, d. h. feline viral rhinotracheitis bezeichnet) wurde von Bittle und Rubic, Am. J. Vet. Res., Bd. 36 (1975), S. 89 bis 91 und Scott, Feline Practice, Jan.-Feb. 1975, Seiten 17 bis 22 beschrieben.

Dieser Impfstoff wird durch 81malige Reihenpassage eines virulenten FVR-Virus in primärer feliner Nierenzellkultur und 17malige Passage in feliner diploider Zungenzellkultur erhalten. Ferner ist in der DE-OS 25 12 903 ein FVR-Impfstoff aus einem virulenten FVR-Virus durch Reihenpassage in Katzenzellkulturen beschrieben.

Die bekannten Impfstoffe werden intramuskulär bei der normalen Körpertemperatur der Katze (39°C) gegeben. Bei dieser Temperatur erfolgt keine Vermehrung des Virus und der Impfstoff verhält sich praktisch als inaktivierter Impfstoff bzw. Tot-Impfstoff. Während der Injektion des Impfstoffes muß der Respirationstrakt der Katze gegen Infektion durch das Virus geschützt werden. Die bekannten Impfstoffe haben ferner den Nachteil, daß zur Bewirkung einer Immunität mehrere Impfungen erforderlich sind, und daß trächtige Katzen nicht geimpft werden sollen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen modifizierte Rhinotracheitis Viren enthaltenden Impfstoff gegen die Rhinotracheitis der Katze (FVR) zu schaffen, der intranasal, beispielsweise durch Eintropfen oder Sprühen einer Impfstofflösung in die Nasenlöcher, intraocular durch Eintropfen der Impfstofflösung in die Augen und den nasalen Tränenkanal und damit in die Nase und den Rachenraum oder durch Injektion gegeben werden kann, und der einen sicheren und wirksamen Schutz gegen die Erkrankung bietet. Ferner soll der Impfstoff auch zur Impfung von trächtigen Katzen ohne Gefahr eines Aborts oder teratogener Wirkungen geeignet sein. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekenn zeichneten Gegenstand.

Der Impfstoff der Erfindung wird durch Bestrahlung eines FVR-Virus mit UV-Licht hergestellt, das seinerseits einer Behandlung mit chemischen mutagenen Mitteln unterworfen worden ist. Vorzugsweise wird ein FVR-Virus mit UV-Licht bestrahlt, der einer mutagenen Behandlung mit 5-Fluoruracil, 5-Fluordesoxyuridin und/oder Bromdesoxyuridin unterworfen worden ist, so daß sich das Virus zwar gut bei 30 ±2°C, jedoch nicht so gut bei 37°C vermehrt.

Zur Behandlung mit den chemischen Mutagenen kann jedes virulente FVR-Virus eingesetzt werden. Das Virus kann mit Hilfe einer geeigneten Wirtszellenkultur isoliert und in bekannten Medien vermehrt und aufbewahrt werden. Geeignete Wirtszellenkulturen sind alle Zellen der Gattung felidae, wie Nieren, Zunge, Trachea, Nasenmuscheln, Tonsillen und Lunge. Bevorzugt sind feline Nierenzellen. Das Virus wird nach einer Vorbehandlung der Substratzellen mit 5-Fluoruracil, 5-Fluordesoxyuridin, Bromdesoxyuridin oder einem anderen bekannten DNA-Inhibitor mit chemischen Mutagenen (DNA-Inhibitoren) unterworfen. Vor zugsweise wird zur Mutation des Virus ein Gemisch von 5-Fluoruracil, 5-Fluordesoxyuridin und Bromdesoxyuridin verwendet. Sodann werden die Viruskulturen bei 30 ±2°C, vorzugsweise bei 31°C, einer Klonierung unterworfen, um das Virus zu reinigen. Diejenigen Viren, die sich bei dieser Temperatur gut vermehren, werden zur wiederholten Behandlung eingesetzt. Die Mutationsbehandlung wird 12 bis 36 Stunden, vorzugsweise 24 Stunden, wiederholt.

Das nach der Mutationsbehandlung erhaltene Virus, das bei der American Type Culture Collection unter der Nr. VR 814 hinterlegt wurde, wird sodann mit UV-Licht bestrahlt, bis etwa 90 bis 99%, vorzugsweise 95 bis 99% und insbesondere etwa 99% der Viruspopulation abgetötet sind. Vor der Impfung von Katzen wird der Rest des mit UV-Licht behandelten Virusmaterials bei 31°C nochmals einer Klonierung unterworfen. Vorzugsweise werden die geklonten Viren 1 bis 12mal, vorzugs weise 10 bis 12mal einer Reihenpassage bei 30 ±2°C unterworfen. Jeder Virusklon kann auch mehrmals, vorzugsweise ein weiteres Mal mit UV-Licht bestrahlt und vor der letzten Passage und bzw. oder vor der Impfung geklont werden.

Obwohl die Vermehrung des Virus (sowohl des chemisch mutierten als auch des mit UV-behandelten Virus) bei 31°C optimal ist, kann das Virus auch bei Temperaturen bis zu etwa 37°C vermehrt werden. Die Vermehrung des Virus ist unter natürlichen Bedingungen bei 39°C gehemmt. Vorzugsweise wird die Vermehrung des Virus bei 30 ±2°C durchgeführt.

Zur Herstellung des modifizierten Virus wird ein aus einer 3 Monate alten Katze isoliertes virulentes FVR-Virus verwendet. Das Virus wurde während einer Routineuntersuchung von Infektionen des oberen Respirationstrakts isoliert und wurde dem Rachenraum einer Katze entnommen, die keine klinischen Symptome von Erkrankungen des oberen Rachenraums zeigte. Zur Feststellung, ob das Virus gegenüber empfindlichen Tieren infektiös ist, wurde es einer Passage in felinen Nierenzellen (NLFK-1) unterworfen und sodann intranasal zwei spezifisch pathogenfreien Katzen verimpft. 3 bis 8 Tage nach der Impfung wurde Anorexie, Pyrexie, Schwierigkeiten bei der Atmung und Trägheit beobachtet. Diese Symptome sind ein Indiz dafür, daß das Virus gegenüber empfänglichen Katzen infektiös ist und keine natürlich vorkommende avirulente Variante darstellt.

Als Wirtszellen zur Isolierung und für sämtliche weiteren Untersuchungen wird eine stabile, serienmäßig subkultivierbare feline Nierenzellinie verwendet, die als NLFK-1 bezeichnet wird. Zur Zellvermehrung und als Erhaltungsmedium für das Virenwachstum wird isotonische, gepufferte Salzlösung nach Hanks mit Lactalbumin (HAL-Medium) verwendet. Das Medium wird mit 10% foetalem Kälberserum für das Zellwachstum und mit 2% für die Erhaltung ergänzt.

Die Behandlung des FVR mit chemischen Mutagenen wird nach den von Pringle u. Mitarb., Virology, Bd. 55 (1973), S. 495 bis 505 beschriebenen Methoden durchgeführt. Eine Einschicht von NLFK-1-Zellen wird 18 Stunden vor der Virusinfektion mit 5-Fluoruracil (10 µg/ml) in serumfreiem HAL-Medium behandelt.

Nach der 18stündigen Behandlung wird die Einschichtkultur mit serumfreiem HAL-Medium gewaschen. Sodann werden 10² Virus partikel eine Stunde bei 37°C adsorbieren gelassen. Hierauf werden die Zellen mit HAL-serumfreiem Medium mit 10 γ/ml 5-Fluoruracil, 10 γ/ml 5-Fluordesoxyuridin und 5 γ/ml Bromdesoxyuridin versetzt und 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Einschichtkultur wird dann durch rasches abwechselndes Einfrieren und Auftauen aufgebrochen und das gesamte Verfahren wiederholt. Nach jeder Behandlung mit den DNA-Inhibitoren werden die Virussuspensionen bei 31°C einer Klonierung in Kulturschalen mit 24 Löchern unterworfen. Nur diejenigen Klone, die sich bei 31°C gut vermehren, werden zur wiederholten Behandlung eingesetzt. Das Virusmaterial wird nur dann geerntet, wenn nach 7tägiger Inkubation ein Klon fest stellbar ist. Sämtliche isolierten Klone werden bei 31°C in NLFK-1-Zellen in Milchverdünnungsflaschen gezüchtet. Titrationen zur Feststellung irgendwelcher temperaturempfindlicher Eigenschaften (ts-Eigenschaften) werden bei 31°C und 37°C durchgeführt. Nach der ersten mutagenen Behandlung werden keine ts-Eigenschaften festgestellt, und die mutagene Behandlung wird an einem Klon wiederholt. Ein Klon, der sehr geringe ts-Unterschiede zeigt, wird von jedem der vier nachfolgenden Klonierverfahren ausgewählt und einer weiteren Behandlung unterworfen. Von der ersten Behandlung werden 30 Klone, von der zweiten Behandlung 25 Klone, von der dritten Behandlung 50 Klone und von der vierten Behandlung 15 Klone erhalten.

Das geklonte Virusmaterial der vierten mutagenen Behandlung wird an empfänglichen, spezifisch pathogenfreien Katzen untersucht. Jede Katze erhält etwa 0,25 ml (10^5,0 bis 10^8,0 TCID₅₀/Dosis) Virussuspension in jedes Nasenloch sowie einen Tropfen der Virussuspension in jedes Auge. 3 Tage nach der Impfung sind Rachenabstriche positiv für FVR. Dieses Virusmaterial wurde bei der American Type Culture Collection unter der Nr. VR 814 hinterlegt.

Das aus dem 15. Klon der vierten Behandlung mit dem DNA-Inhibitor erhaltene Virusmaterial wird sodann mit einer UV-Lampe (Sterilamp) bestrahlt. Zu diesem Zweck wird das Virusmaterial mit einer Flüssigkeitshöhe von 5 mm in einer Schale in einem Abstand von 15 cm von der Lichtquelle bestrahlt. Während der Bestrahlung wird die Virussuspension mittels eines Magnetstabes mit etwa 50 U/min gerührt. Proben werden in Zeitabständen von 3 Minuten entnommen. Das UV-Licht ist besonders letal gegenüber dem FVR-Virus und innerhalb 8 Minuten vermindert sich der Virusgehalt um etwa 99%. Nach Abtötung von 99% der Viruspopulation werden Klone des mit UV-Licht behandelten Virusmaterials, die sich bei 31°C vermehren, hergestellt. Obwohl sich alle diese Klone für die weitere Verwendung eignen, wird ein Klon mit einem Virustiter von 10^7,50 TCID₅₀ bei 31°C und 10^6,63 TCID₅₀ bei 37°C erneut mit UV-Licht bestrahlt, und es werden bei 31°C Klone entnommen. Ein Klon mit einem Virustiter von 10^8,0 TCID₅₀ bei 31°C und 10^6,68 TCID₅₀ bei 37°C (es können auch andere Klone verwendet werden) wird für die weitere Untersuchung ausgewählt und vor dem Verimpfen bei 31°C Reihenpassagen unterworfen.

Das auf die vorstehend beschriebene Weise isolierte Virusmaterial kann unmittelbar zum Impfen von Katzen verwendet werden. Vorzugsweise wird es gefriergetrocknet, zweckmäßig in Kombination mit einem üblichen Stabilisator. Das gefrier getrocknete Produkt wird vor dem Verimpfen mit sterilem Wasser oder einem anderen geeigneten Verdünnungsmittel versetzt.

Das auf die vorstehend beschriebene Weise modifizierte FVR- Virusmaterial (FVR_m) wird bei allen Versuchen bei 31°C vermehrt. Für Stationärkulturen werden Roux-Flaschen und Povitsky-Flaschen und zur Massenvermehrung 10 Liter fassende Roller-Flaschen verwendet. Eine Einschicht-NLFK-1-Zellkultur läßt man in allen Kulturgefäßen vor dem Beimpfen mit dem FVR_m-Virusmaterial auswachsen. Obwohl zum Zellwachstum ein Zusatz von 10% foetales Kälberserum (geprüft auf Freiheit von BVD-Virus) verwendet wurde, wächst die NLFK-1-Zellinie auch sehr gut bei vermindertem Serumgehalt und in Medien mit bis zu etwa 10% anderen homologen oder heterologen Seren. Das FVR_m-Virusmaterial vermehrt sich gut in den NLFK-1-Zellen in Gegenwart von 2% foetalem Kälberserum. Das Virusmaterial wird geerntet, sobald die cytopathischen Veränderungen ein maximales Viruswachstum anzeigen. Das bei dieser Ernte erhaltene Virusmaterial wurde bei der American Type Culture Collection unter der Nr. VR 815 hinterlegt. Dieses Virusmaterial wird auf die nachstehend beschriebene Weise als Impfstoff bei Katzen eingesetzt.

Zur Bestätigung der Identität des Virusmaterials werden Unter suchungen über die Vermehrung in felinen Zellenkulturen mit typischen cytopathischen Veränderungen, begleitet von Ein schlußkörpern des Typs A, fehlendem Wachstum in Zellen anderer Tier-Arten (Wirtsspezifität), Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern, Inaktivierung mit organischen Lösungsmitteln, Wachstumshemmung durch Inhibitoren der DNA-Synthese und Neu tralisation mit spezifischem Antiserum durchgeführt.

Die Wirtsspezifität des FVR-Virus wurde von Andrews u. Mitarb., Viruses of Vertebrates, 1972, S. 348 bis 349 nachgewiesen. Das FVR_m-Virus hat ebenfalls eine Wirtszellenspezifität für Katzen und primäre Zelltypen im Vergleich mit verschiedenen Zelltypen von Kaninchen, Hunden, Rindern, Pferden, Mäusen, Affen und Menschen. Die beim FVR-Virus aufgetretene Mutation, die zur Bildung des FVR_m-Virus führt, hat nicht die Wirts spezifität geändert, sondern nur die Virulenz des Virus bezüglich des natürlichen Infektionswegs. Ein vollvirulentes FVR-Virus ruft keine Art von Erkrankung in empfänglichen Katzen hervor, wenn es intramuskulär oder intravenös verabreicht wird. Der Respirationstrakt muß jedoch während der Injektion ausreichend geschützt werden. Eine intravenöse Impfung von 10^7,5 TCID₅₀ eines virulenten FVR-Virus ruft zwar keine Erkrankung hervor, doch stimuliert sie bei einer Injektion einen hohen Titer von humoralen Antikörpern. Eine intramuskuläre Injektion des gleichen Virus erzeugt nur eine schwache humorale Reaktion bei einmaliger Gabe.

Zur Identifizierung des FVR_m-Virus wurde ein fluoreszierender Antikörper verwendet, der vom National Animal Disease Laboratory bezogen wurde. Eine spezifische Färbung wurde bei mit FVR_m-Virus infizierten Zellen, jedoch nicht bei mit Calicivirus infizierten Zellen beobachtet.

Eine 20prozentige Konzentration von Diäthyläther verursacht innerhalb 18 Stunden eine vollständige Inaktivierung des FVR_m-Virus. Zum Vergleich wird ein virulentes FVR-Virus ver wendet. Eine 50prozentige Chloroformkonzentration inaktiviert innerhalb 30 Minuten das FVR_m-Virus vollständig. Diese Versuche zeigen, daß das FVR_m-Virus ein essentielles, mit organischen Lösungsmitteln extrahierbares Lipid enthält, das identisch ist mit dem des nicht-modifizierten FVR-Virus.

Desoxycholsäure, die bekanntlich die DNA-Synthese hemmt, hemmt spezifisch in gleichem Ausmaß das FVR_m- und FVR-Virus.

In Kaninchen hergestelltes Antiserum gegen einen sicher identifizierten Stamm von FVR-Virus hemmt spezifisch das FVR_m-Virus. Dieses Antiserum verursacht keine Hemmung eines Calicivirus-Stammes, der sicher virulent für Katzen ist.

Stabilitätsuntersuchungen unter forcierten Bedingungen wurden an gefriergetrockneten FVR_m-Viren durchgeführt. Zu diesem Zweck werden die FVR_m-Viren mit einer Stabilisatorlösung versetzt und 1, 2 und 3 Wochen bei 37°C inkubiert. Die Stabilisator lösung hat folgende Zusammensetzung:

Lösung A
Durch Pankreasenzym verdaubares Casein40 g Gelatine40 g destilliertes Wasser auf1000 ml

Lösung B
Saccharose150 g destilliertes Wasser auf1000 ml.

Die Lösungen A und B werden im Volumenverhältnis 1 : 1 mit einander vermischt und zu einer Suspension des Virusmaterials bis zu einer Volumenkonzentration von 33¹/₃ gegeben.

Die Ergebnisse der Stabilitätsuntersuchungen sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß das FVR_m-Virus in Gegen wart einer Stabilisatorlösung mindestens 3 Wochen unter den forcierten Bedingungen des Stabilitätstests aktiv bleibt. Dies entspricht etwa 2 Jahren bei Kühlschranktemperatur. Es können auch andere Volumenverhältnisse von FVR_m-Virus suspension und Stabilisatorlösung verwendet werden, sofern der Virustiter im Bereich von etwa 10^5,0 bis 10^8,0 TCID₅₀ bleibt.

Mit dem FVR_m-Virus enthaltenden Impfstoff der Erfindung werden spezifisch pathogenfreie und normal gezüchtete Katzen geimpft. Sodann werden die Katzen mit virulentem Virus belastet. Sämtlichen Katzen wird in jedes Nasenloch etwa 0,25 ml Virussuspension (10^5,0 bis 10^8,0 TCID₅₀/Dosis) eingetropft. Dabei wird der Kopf der Tiere so gehalten, daß die Nase nach oben zeigt. Es kann auch ein Tropfen des Impfstoffes in jedes Auge eingeträufelt und der Rest in die Nasenlöcher getropft werden.

Die Antikörpertiter werden durch Mikrotiter-Methoden bestimmt. Serumverdünnungen werden in zweifacher Abstufung durchgeführt, mit 50 TCID₅₀ virulentem Virus vermischt, 1 Stunde inkubiert und mit einer ausreichenden Menge NLFK-1-Zellen vermischt. Sodann werden 8 Vertiefungen in einer 96 Vertiefungen enthaltenden Mikrotiterplatte beschickt. Die Zell- Antikörper-Virus-Titrationen werden 6 Tage bei 37°C inkubiert und täglich unter einem umgekehrten Mikroskop beobachtet. Ferner werden andere virologische Methoden zur Inkubation und Bestimmung der Antikörpertiter angewendet.

3 Wochen nach der Impfung werden die Tiere einem Aerosol des virulenten Virus ausgesetzt. Das Aerosol wird mittels eines DeVilbiss-Atomisiergerät mit Preßluft hergestellt. Das Aerosol wird gegen das Gesicht des Tieres gerichtet. Es enthält 10^7,3 TCID₅₀ virulentes Virus. Zur Kontrolle werden nicht geimpfte Tiere in gleicher Weise behandelt. Zur Erkennung klinischer Symptome werden die Tiere täglich untersucht. 3 Tage nach der Belastung werden aus dem Rachenraum zur Isolierung von Viren Abstriche entnommen.

Das aus der zweiten Behandlung mit UV-Licht erhaltene FVR_m- Virusmaterial wird vor der Reihenpassage zwei spezifisch pathogenfreien Katzen intranasal verimpft. Obwohl diese Tiere während 1 bis 4 Tagen die Symptome einer Pyrexie zeigten, konnten keine anderen Symptome von FVR beobachtet werden.

Das Virusmaterial der Reihenpassage 10 wird vier 3 Wochen alten Katzen intranasal verimpft. Über einen Zeitraum von 9 Wochen konnten bei keinem der Tiere klinische Symptome beobachtet werden. Obwohl die vier jungen Katzen erhebliche Antikörpertiter aufweisen, die vermutlich vom Muttertier herrührten, wurden diese Titer nach intranasaler Verimpfung um einen Faktor von 2 bis 4 erhöht.

Spezifisch pathogenfreie Katzen wurden auf ihre Reaktion nach intranasaler Verimpfung des Virusmaterials der Passage 10 untersucht. Diese Tiere waren 12 Wochen alt und hatten einen Serum-Antikörpertiter von <1 : 2. In jedes Nasenloch wurden 0,25 ml FVR_m-Virussuspension sowie in jedes Auge ein Tropfen eingeträufelt. Die Serum-Antikörperreaktionen reichten von 1 : 5 bis 1 : 25 nach der Impfung. Nach der Impfung oder der Nachbelastung konnten keine klinischen Symptome beobachtet werden. Die spezifisch pathogenfreien Tiere sind sehr empfänglich gegen FVR-Infektion und sie werden nach intranasaler Impfung mit FVR_m-Virus ausreichend geschützt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle II

Zum Nachweis der Booster-Wirkung einer zweiten intranasalen Impfung wird fünf empfänglichen Tieren eine Dosis und einen Monat später eine weitere Dosis gegeben. Nach der zweiten intranasalen Impfung wird ein deutlicher Booster-Effekt beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.

Tabelle III

Serum-Antikörperreaktion nach zwei intranasalen FVR_m-Impfungen

Vierzehn etwa 12 Wochen alte pathogenfreie Katzen werden intranasal mit dem Impfstoff der FVR_m-Passage 11 geimpft. Sämtliche Tiere hatten eine Serum-Antikörper-Reaktion von <1 : 2. FVR_m wird auf 10^5,0 TCID₅₀/Tier eingestellt. Bei allen Tieren beträgt die Serum-Antikörper-Reaktion nach der Impfung 1 : 8 bis 1 : 24. Keines der Tiere zeigte klinische Symptome der Krankheit.

Drei 6 Wochen alte Katzen und das Muttertier werden ebenfalls intranasal mit dem Impfstoff der FVR_m-Passage 11 geimpft. Die Kätzchen und das Muttertier waren empfindlich gegen FVR (Serum-Antikörper-Reaktion <1 : 2). 3 Wochen nach der Impfung hatten sämtliche Tiere einen Serum-Antikörpertiter von 1 : 20 oder größer. Obwohl das Muttertier nicht als sero- negatives Tier ausgewählt wurde, zeigt das Ergebnis, daß FVR_m-Virus 6 Wochen alte empfindliche Kätzchen vollständig immunisiert, ohne daß ungünstige Nebenwirkungen beobachtet werden.

Fünf Rückpassagen des Virusmaterials von FVR_m-Passage 11 in vollständig empfänglichen pathogenfreien Tieren zeigten in keinem Fall eine Reversion der Virulenz. Den Tieren werden etwa 10^6,5 TCID₅₀/Tier jeder Rückpassage verimpft. Klinische Symptome sowie Pyrexie konnten nicht beobachtet werden. Das Virusmaterial wird intranasal und in die Augen von jeweils 2 Tieren bei jeder Passage gegeben.

Die Erfindung betrifft ferner eine Impfstoffkombination aus dem FVR_m-Virusmaterial enthaltenden Impfstoff der Erfindung sowie einem natürlich vorkommenden modifizierten Calicivirus, das Immunität erzeugt (vgl. Anspruch 5).

Das eingesetzte Calicivirus wurde aus dem Nasen-Rachenraum einer 6 Monate alten Katze isoliert und kultiviert und ruft keine Krankheitserscheinungen in empfänglichen Tieren hervor. Die Untersuchungen zur Bestätigung der Identität des Virus betrafen die rasche Vermehrung in felinen Zellkulturen mit für Calicivirus typischen cytopathischen Veränderungen und der Abwesenheit von Einschlußkörpern in gefärbten Präparaten, keiner Inaktivierung durch organische Lösungsmittel und Neutralisation durch spezifisches Antiserum.

Der FVR_m-Virus enthaltende Impfstoff und der Calicivirus enthaltende Impfstoff werden mit dem Stabilisator in folgenden Mengen vereinigt:

0,25 ml FVR_m-Virussuspension
0,25 ml Calicivirus-Suspension
0,50 ml Stabilisatorlösung.

Je 0,25 ml der Virensuspensionen enthalten jeweils 10^6,5 TCID₅₀ oder mehr. Die Stabilisatorlösung hat folgende Zusammensetzung:

Lösung A
Durch Pancreasenzym verdaubares Casein4,0 g Gelatine4,0 g destilliertes Wasser auf100 ml

Lösung B
Saccharose15,0 g destilliertes Wasser auf100 ml

Zur Herstellung der Stabilisatorlösung werden die Lösungen A und B in gleichem Volumenverhältnis miteinander vermischt. Der pH-Wert wird auf 7,0 eingestellt.

Stabilitätsuntersuchungen unter forcierten Bedingungen wurden an gefriergetrockneten Proben des Kombinationsimpfstoffes durchgeführt. Die Proben werden 1 Woche bzw. 2 Wochen bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation werden die Proben mit Wasser versetzt und in NLFK-1-Zellen titriert. Es können auch andere Mengenverhältnisse von FVR_m-Virus, Calicivirus und Stabilisator verwendet werden, sofern der Virustiter im Bereich von etwa 10^5,0 bis 10^8,0 TCID₅₀ bleibt.

Der lyophilisierte Impfstoff wird mit sterilem Verdünnungsmittel auf 0,5 ml versetzt und sämtliche Katzen werden mit etwa 0,25 ml Virussuspension in jedes Nasenloch geimpft. Ein Tropfen der Virussuspension wird häufig in jedes Auge eingeträufelt, um die Sicherheit des Impfstoffes zu unter suchen und Reizungen der Schleimhäute zu erkennen. Beim Verimpfen wird der Kopf der Tiere mit der Nase nach oben gehalten.

Katzen werden mit 0,5 ml der 1 : 1-Kombination von FVR_m- und Calicivirus-Suspension geimpft. Die FVR_m-Virussuspension hat einen Titer von 10^7,5 TCID₅₀ und die Calicivirus-Suspension einen Titer von 10^8,6 TCID₅₀. Sämtlichen Tieren wurden vor der Impfung Blutproben entnommen und das Serum von jeder Tiergruppe gepoolt. Jede Tiergruppe besteht aus mindestens fünf Tieren. Die Ergebnisse der Serum-Neutralisationsversuche sind in Tabelle IV zusammengefaßt.

Tabelle IV

Die Impfstoffkombination beeinflußt die Serum-Neutralisations titer sehr stark ohne irgendwelche Anzeichen einer Interferenz bei intranasaler Verabfolgung. Sämtliche Tiere werden sorgfältig auf Anzeichen einer Infektion des oberen Respirationstrakts nach der Impfung beobachtet. Es konnten keine Symptome festgestellt werden. Eine identische Kontrollgruppe von Katzen, die in einem dem Stallgang gegenüber liegenden Käfigen lebten, zeigte keine Infektion des oberen Respirationstrakts während dieses Zeitraumes.

31 in einer Kolonie gezogene Katzen in einem Alter von 2 Wochen bis 5 Monaten werden mit dem Kombinationsimpfstoff geimpft. Der Impfstoff enthält 10^6,0 TCID₅₀ jedes Virus/ Dosis. Mit Ausnahme eines Falles konnte in sämtlichen anderen Fällen ein signifikanter Anstieg des Serum-Neutralisations titers beobachtet werden.

Die abortigene Wirkung der Impfstoffkombination der Erfindung wird an vier spezifisch pathogenfreien trächtigen Katzen untersucht. Die Katzen waren etwa 30 Tage trächtig. Es wurde ihnen eine volle Dosis des Impfstoffes (10^6,5 TCID₅₀ jedes Virus) intranasal verimpft. Vor der Impfung enthielten die Katzen keine Antikörper gegen die Viren. Sämtliche Katzen entwickelten signifikante Antikörpertiter vor dem Werfen. Jedes Muttertier gebar normale Kätzchen, die während der Untersuchungen auch normal blieben. Es ist ersichtlich, daß die Impfstoffkombination der Erfindung somit auch an trächtige Katzen sicher verabfolgt werden kann.

Die Impfstoffkombination der Erfindung wurde vier 2 Wochen altzen Kätzchen, die von spezifisch pathogenfreien ungeimpften Katzen geworfen waren, verimpft. Die Kätzchen hatten gegen keines der Viren Antikörper entwickelt, 3 Wochen nach der Impfung hatte sich jedoch gegen beide Viren ein aus reichend schützender Antikörpertiter gebildet. Somit kann die Impfstoffkombination der Erfindung auch sehr jungen Kätzchen sicher verimpft werden.

Claims

1. Felines Rhinotracheitis Virus, ATCC-Nr. VR 814

2. Modifiziertes felines Rhinotracheitis Virus, ATCC-Nr. VR 815

3. Impfstoff gegen die Rhinotracheitis der Katze, gekenn zeichnet durch einen Gehalt an modifizierten Rhinotracheitis- Viren ATCC-Nr. VR 815 als Wirkstoff.

4. Impfstoff nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch einen Virus-Titer von 10^5,0 bis 10^8,0 TCID₅₀ pro Dosis.

5. Impfstoff nach Anspruch 3 oder 4, gekennzeichnet durch einen zusätzlichen Gehalt an einem felinen Calicivirus.