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Verfahren zur Herstellung von Vaccinen Die vorliegende Erfindung
betrifft die Herstellung von somatischen Antigenvaccinen.
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Bakterienvaccine sind im allgemeinen Suspensionen von getöteten Bakterien
oder Fraktionen von getöteten Bakterien. Ein typisches Verfahren zur Herstellung
eines derartigen Vaocins besteht darin, eine Kultur des Bakteriums auf Agar zu züchten,
die gewaohaenen geernteten Bakterien mit isotonisoher Natriumchloridlösung in einer
zur Brzielung der gewünschten Bakterienkonzentration euereichenden Menge su mischen
und dann die Bakterien su toton. Die Stufe des Tdtenß der Bakterien kann durch Zueetzen
einee Bakterivida, wie beispielsweise von Formalin, Phenol oder Kresol und Erhitzen
durchgeführt werden. In einigen Füllen kann auch auf dan Erhitzen verzichtet werden.
Von Proben der fertigen Vaccine werden Kulturen angelegt, um sicher zu gehen, daß
die ganzen Bakterien getötet sind.
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Die Bakterienvaccine können aus Bakterienkulturen, die aus dem Laboratorium
stammen, hergestellt werden, und in diesem Fall wird das Vaccin als ein Stammvaccin
bezeichnet. Wahlweise können Vaccine auch aus Bakterien hergestellt werden, die
direkt vom Patienten stammen, und das Vaccin. wird dann als autogenes Vaccin bezeichnet.
Wenn das Vaccin mehrere Stämme der gleichen Species von Bakterien enthält, wird
es als polyvalentes Vaccin bezeichnet.
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Ein Vaccin, das Bakterien enthält, die von zwei oder mehr Species
stammen, wird als ein Mischvaccin bezeichnet. Anstatt die gesamten Bakterien zu
enthalten, kUnnen Vaccine auch antigene Fraktionen der Bakterien enthalten, d. h.
Fraktionen, die die Produktion von Antikdrpern im Patienten anregen. In diesem Fall
werden aie Antigenvaccine genannt. Vaccine, die antigenes Material enthalten, duo
vom gosamten Kdrper des Mikroorganismus stammt, werden ale aomatiaohe Antigenvaooine
bezeichnet.
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So wurde sohon früher festgestellt, daB brauchbare Vaccine durch Iyae
von getöteten Staphylooocaus aureua und Salmonella typhi mit Desoxyribonuolease,
die allgemein ala Dornaae bekannt iat, hergeatellt werden Mnnen. Dieaea Enzyn ist
eine Endonuclease, die fUr polymerisierte Desoxyribonucleinsäure (DNS) spezifisch
ist.
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Auch die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von rosatischen
Antigenvaccinen. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Lyse getöteter @ellen
von pathogenen Bakterien dadurch bewirkt, daß man sie der Einwirkung eines proteolytischen
Enzyme
oder eines Gemisches derartiger Enzyme unterwirft, was die
Lyse der Zellen ohne Zerstörung der Antigenwirkung bewirkt, Vorzugsweise ist das
verwendete Enzym oder sind die verwendeten Enzyme derart, daß sie nach durchgefUhrter
Lyse ohne Zerstörung der Antigenwirkung inaktiviert werden können. Die Stufe der
Inaktivierung des Enzyme, nachdem die Lyse bewirkt ist, ist ein wesentliches Merkmal
der Erfindung, wenn die Bakterien Staphylococci oder Salmonella sind. Wenn die Bakterien
andere als Staphylococci oder Salmonella sind, ist diese Stufe ein bevorzugtes Merkmal.
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Es wurde festgestellt, daß besonders brauchbare somatische Antigenvaccine
erzeugt werden können, indem die Lyse von getöteten Zellen von pathogenen Bakterien
mit Hilfe eines proteolytisohen Enzyms oder eines Gemisches derartiger Enzyme durchgefUhrt
wird, was die Lyse der Zellen ohne Zerstörung der Antigenwirkung bewirkt und das
s ohne Zerstörung der Antigenwirkung und ohne Inaktivierung des Enzyms oder des
Gemisches von Enzymen nach beendeter Lyse inaktiviert werden kann. Die Inaktivierung
der Enzyme fördert die Stabilitant der Vaccine und vermindert das Ausmaß der Impfreaktion
bei geimpften Tieren. Die Reaktion auf Vaccine, die noch aktive Enzyme enthalten,
kann besonders schwer bei Versuchstieren sein, die an irgendwelchen ulceröen Zustdnden
leiden. Die nachteilige Wirkung von verbliebenen Enzymen kdnnte auch durch Entfernen
der Enzyme aus dem lyaierten Produkten auageschaltet werden, anstatt sie zu inaktivierea,
jedoch kurde eine derartige Entfernung verhältnismäßig komplizierts Abtrennverfahren
bedingen, ao daß die Inaktivierung ii allgemeinen bevorzugt wird.
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Unter den erfindungsgemäB verwendbaren proteolytischen Enzymen seien
Dornase, Trypsin und Lysozym genannt. Nicht alle proteolytiachen Enzyme sind bei
allen Typen von pathogenen Bakterien geeignet, und es sind Versuche notwendig, um
zu gewährleisten, welche Enzyme eine besondere Bakterienart ohne Zerstörung der
Antigenwirkung lysieren, und ansohlieBend ohne Zerstörung der Antigenwirkung inaktiviert
werden können.
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Zu Bakterien, aus welchen erfindungsgemäB brauchbare Vaccine hergestellt
werden können, gehören Streptococci und Pneumococci, è gram-negative Cocci, wie
Gonnococci und Meningococci, aerobe gram-positive Bazillen, wie Corynebacterium
diphtheriae und Baoillus anthracis, anaerobe gram-positive Bazillen, wie Cloatridium
tetani, gram-negative Bazillen, wie Salmonella typhosa. und Salmonella paratyphi,
Shigella, Vibrio comma, Hämophilus influenzae, Bordetella pertussis, Escheriohia
ooli, Brucalla und Pasteuerella und Myobaoterium tuberculosis.
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Domaae ist bei weitem das brauchbarste der bis jetzt geprdften proteolytischen
Enzyme. Es wurde festgestellt, daß es alle Bakterienzellen lysieren kann, mit welchen
bis jetzt Versuche durchgeführt wurden. In jedem Fall wurde dieu ohne Zerstörung
der Antigenwirkung bewerkstelligt, und die anschließende Inaktivierung der Dornaae
durch Erhitzen war ohne Zerstörung der Antigenwirkung durchführbar. Die Inaktivierung
von Dornase kann leicht durch ten durodgeffthrt werden. Eine Wärmebehandlung für
eine Stunde
bei 56°C wurde als brauohbar befunden. Eine derartige
Wärmebehandlung hat keine ernstlioh nachteilige Wirkung auf die Antigeneigenschaften
des Vaocina.
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Eine wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft
ein Mastitisvacoin zur Verwendung für die Immunisierung von KUhen gegen Mastitis.
Ein Staphyloooocenvaocin, das für diesen Zweck brauchbar ist, kann nach einem Verfahren
hergestellt werden, das im allgemeinen hnlioh dem schon vorgeschlagenen ist, jedoch
unter Verwendung von Mengenanteilen von Staphylococcusstämmen, die unterschiedlich
von den in den bekannten Vaccine verwendeten Mengenanteilen sind. Diese Xnderung
der Mengenanteile soll das Vaccin wirksamer gegen die Art von Staphyloeoocen machen,
die für Rindermastitis verantwortlioh ist. In diesem Zusammenhang wurde weiter festgestellt,
daß es äußerst wichtig ist, sich zu vergewissern, daß die Behandlung mit Dornase
fortgesetzt wird, bis praktisch eine 100%ige Lyse erreicht ist, da sonst die Wirksamkeit
des Vaccins vermindart wird. Es wurde auch als wichtig befunden, sich der Inaktivierung
der Dornase vor der Verabreichung des Vaccine an Kuhe zu veraichern, und zwar sowohl,
um irgendeine Verschlechterung ulceröser Zustände bei KUhan zu vermeiden, als auch
um die Stabilität des Vaooins zu erhohen. Bezüglic der Stabilität wurde weiter festgestellt,
daß diese durch Ge-, @ friertrooknen des Vaccine verbessert werden kann. Endlich
wurde gefunden, daß die Bakterien so gezüchtet werden sollten, daß eine große OberflCche
der Luft ausgesetzt ist, um am geeignetsten
für die Herstellung
des Vaccine zu sein.
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Mastitis ist nicht ausschließlich auf Staphylococceninfektionen zuriickzuftihren.
Manchmal wird sie durch Streptococceninfektionen oder durch ein Gemisch von Streptococcen
und Staphylococceninfektionen hervorgerufen. Demgemäß kann das Mastitisvaccin nach
der vorliegenden Erfindung ein Staphylococcenvaccin, ein Streptococcenvaccin oder
ein gemischtes Streptococcen-und Staphyloooocenvaccin sein.
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Das erfindungsgemäße Vaccin kann eine monovalente, polyvalente oder
Mischart sein. Die Vaccine können auch Stammvacoine oder autogene Vaccine sein.
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Die Zellen einiger Bakterien, z. B. von Staphyloooccen, können durch
Aussetzen gegenüber der Einwirkung von Dornase allein lysiert werden. In anderen
Fällen jedoch, beispielsweise bei Salmonella typhi, bewirkt Dornase nicht die Lyse
der Zellen.
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Es wurde jedoch festgestellt, daß nach Behandlung der Zellen von gewissen
Dornase-resistenten Bakterien mit einem Gemisch von Dornase und einer kleinen Menge
eines Netzmittels eine Lyse stattfindet. Wahlweise ist es in einigen Fällen auch
möglich, eine Lyse der Bakterienzellen durch Aussetzen gegenüber Schallschwingungen
vor der Behandlung mit Dornase zu bewirken. Dies zerreißt oder schwächt offensichtlich
die Zellwandungen in einem solchen Ausmaß, dal3 die Dornase ihre lysierende Wirkung
auf das Substrat ausUben kann, das vor dem Aussetzen d-er Zellen gegen
Schallschwing-ungen
der Lyse nicht zugänglich war. Die vorhergehende Stufe des Aussetzens der Bakterienzellen
gegenüber Schallachwingungen kann in einigen Fällen, beispielsweise beim Arbeiten
mit Salmonella typhi, durch Aussetzen der Zellen gegenuber einem alkalischen Reagens,
insbesondere einem Alkali wie Natriumhydroxyd, ersetzt werden.
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Die Zeitdauer, fUr welche die getöteten Bakterienzellen der Einwirkung
von Dornase ausgesetzt werden, hEngt von einer Reihe von Faktoren ab, inabesondere
der Art der Zellen, der Art des Enzyms und dem Ausmaß, in welchem Zellen einer Vorbehandlung
unterworfen wurden, die die anschließende enzymatische Lyse der Zellen erleichtert.
So bewirkt beiapielsweise Dornase die Lyse von B. C. G.-Zellen innerhalb etwa einer
Stunde, erfordert jedoch etwa 12 Stunden, um Staphylococcuszellen zu lysieren und
lysiert auch über einen Zeitraum von Tagen hin@weg Salmonella typhi nicht in merklichem
Auamaß, falls nicht eine vorherige Behandlung durchgefUhrt wurde. Demgemäß ist es
unpraktisch, Lysezeiten anzugeben, die allgemein für die Heratellung aller erfindungsgemäßen
Vaocine anwendbar sind ; durch Routineversuche läßt sich jedoch leicht feststellen,
welche experimentellen Bedingungen bendtigt werden, um das gewünsohte Ziel zu erreiohen.
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Die anwendung der oben erwähnten vorherigen Behandlungen, die dem
Zweck der Erleiohterung der anschließenden Lyse der Zellen durch die Dornase dienen,
bedingt ebenfalls Routineversuche, um sicherzustellen, welche Behandlungsbedingungen
in einem bwsonderen
Fall am geeignetsten sind. Die Lyse von Salmonella
typhi bildet ein Beispiel dafür. Es wurden mehrere Arten von vorheriger Behand.
lurg angewandt, um die getötaten Salmonella typhi-Zellen im Hinblick darauf vorzubehandeln,
daß das Substrat von Dornase angegriffen vird. Wenn die Zellen irgendeiner dieser
Vorbehandlungen in zu hohem Maße ausgesetzt werden, wird festgestellt, daß die erhaltenen
Vaccine etwas von ihrer antigenen Aktivität verloren haben. Bei Versuchen über die
Vorbehandlungen war es möglich, eine ungefähre Angabe des Ausmaßes abzuleiten, in
welchem ein Abbau der Zellen nach einer gegebenen Zeit stattfand, indem die Abnahme
der TrUbung der zu behandelnden Zellauspension beobachtet wurde. Eine schlüssige
Festatellung, daß die Vorbehandlung nicht bis zu dem Punkt durchgeführt wurde, wo
ein Verluat an antigener Aktivität stattfand,. war jedooh nur möglich, nachdem Tierversuche
mit den Vacoinen durchgeführt wurden. Wenn die vorhergehende Behandlung im Aussetzen
der Zellen gegenUber der Einwirkun von Ultraschallschwingungen bestand, fand man
1 1/2 Stunden als die optimale Behandlungszeit bei Verwendung eines 10 kHz Oszillators,
der mit 1, 05 bis 1, 15 A arbeitete. Wenn die Vorbehandlung mit Natriumhydroxyd
erfolgte, wurde festgentellt, da8 eine Behandlungszeit von etwa 15 Minuten im allgemeinen
ausreichte, wenn 0, 5 ml ln-NaOH zu 10 nl der Zellauspension sugegeben wurden und
der pH-Wert am Ende der Behandlungazeit duroh Zugabe von 0, 4 ml ln-HCl von etwa
11 auf 7, 2 zurückgebracht wurde.
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Im allgemeinen waren entepreohende Bedingungen bei Anwendung einer
dritten Art von Behandlung geeignet, wobei ein alkalisch reagierende@ oder kationisches
Netzmittel, wie Natriumlaurylsulfat,
anstelle von Natriumhydroxyd
verwendet wurde. In allen drei Fällen wurde festgestellt, daß, je länger die getöteten
Zellen vor der Vorbehandlung gelagert waren, um so schneller die Lyse, stattfand.
Es wurde auch festgestellt, daß, wenm die Salmonella typhi auf einem Agarmedium
gezUchtst worden waren, die Zellen leichter lysiert wurden, als wenn die ZUohtung
auf einem rein synthetischen Medium erfolgte.
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Eine andere Durohführungsweise der vorliegenden Erfindung karn die
oben erwähnten Arten der Vorbehandlung zur Schwächung der Zellwandungen unnötig
machen. Bei dieser Verfahrensweise werden die zur Herstellung des Impfstoffes zu
verwendenden Bakterien auf einem Medium gezüchtet, das einen Zusatz erhält, der
die Bildung von Protoplasten anstelle von normalen Bakterien mit vollständigen Zellwandungen
begünstigt. Die getöteten Procoplasten sind leicht der Lyse zugänglich, insbesondere
durch Dornase. Es sind mehrere Arten von Protoplasten produzierenden Zusätzen bekannt.
Zu ihnen gehören Aminosäuren, beispielsweise Glycin und Alanin, Antibiotica wie
Penicilline und Enzyme wie Trypsin und Lysozym. PUr die vorliegende Erfindung sind
Aminosäuren die bevorzugten Zusätze, da sie mit geringerer Wahrsoheinlichkeit Riokstände
ergeben, die Nebenwirkungen nach Injektion des Vaccins ergeben könnten. Es können
Versuche notwendig sein, um sicherzustellen, ob ein besonderer, bekannter, Protoplasten
produzierender Zusatz RUoksthnde ergibt, die in den Impfatoffen unerwünscht wären.
So kann z.B. die Verwendung von Penicillin als Protoplasten produzierender Zusatz
unerwünscht sein, da
Rückstände von Penicillin schwere Reaktionen
bei einem kleinen Prozentsatz von Personen ergeben können, an welche die Vaccine
verabreicht werden sollen.
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Bei typhoiden Vaccinen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt
sind, wurde festgestellt, dal3 die bevorzugten injizierbaren Formen der Vacoine
durch Adsprbieren der Vaccine an adsorbierendem Material vom Bentonnittyp und anschließendem
Waschen mit Wasser zur Entfernung von anderen Materialien außer den Antigenen hergestellt
werden können. Insbesondere Bentonit scheint eine besondere Affinität für das antigene
Material zu haben das man durch Aussetzen von getöteten typhoiden Zellen gegerilber
Lyse durch ein proteolytisohes Enzym erhält. Neben dem Vorteil, dem Tier ein Präparat
zu injizieren, das praktisch frei von verbliebenen Verunreinigungen ist, dient der
Bentonit als brauchbares Adjuvans, da er eine verhältnismäßig langsame Freigabe
des antigenen Materials in den Körper des Tieres bewirkt, so daß eine prolongierte
lokalisierte Bildur. g von Antikörpern erreicht werden kann. Versuche an M§usen
haben gezeigt, dad ein derartiges injizierbares Präparat einen guten Schutz gegen
typhoide Infektionen verleiht. Die Präparate wurden auch mit Erfolg als Reagentien
fUr das Auffinden von typhoiden Antikörpern verwendet.
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Die folgenden Beispiele dienen zur naheren Erläuterung der Erfindung,
ohne sie zu beschränken.
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Beispiel 1 Polyvalentes somatisches Antigenvaccin zur Verhütung von
StaEhylooocceninfektion ~~~E~y~~~~~~~~~~~~~~~~~ Medium : Jeweils 125 ml 2%iges Nähragar
(R.B.L.) wurden in 50 Roux-Kolben gegossen und härten gelassen. Danach wurden 50
ml 2% iges Agar in destilliertem Wasser zu jedem Kolben zugesetzt und über dem Nähragar
als Schicht abgelagert. Nach Härten wurde jeder Kolben mit 5 ml einer Suspension
von Staph. aureus in physiologischer Salzlösung inoouliert, die durch Waschen der
gesamten Züchtung einer 24-Stunden-Nihragar-S¢hrägkultur erhalten worden war. Getrennte
Nähragarschrägpräparate und getrennte Pipetten wurden fUr jeden Kolben verwendet.
Die Kolben wurden dann 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Überschüssige Feuchtigkeit,
die sich in dem Kolben ansammelte, wurde abgegossen und die Kultur durch Waschen
jedes Kolbens mit 10 ml einer 0, 85%igen Salzlösung bei pH, 7, 0 geerntet. Die Wasehwksser
von jedem Kolben wurden vereinigt (etwa 500 ml) und das Gesamtvolumen wurde mit
Salzlösung auf 1000 ml gebracht. Es wurden Proben für die Zählung der Bakterien
abgenommen. Die durchscnittliche Zählung für die Vaocine betrug 5 x 108 Organismen
je ml. Dann wurde Phenol bia zu einer Konzentration von 0, 5% zugesetzt, und die
Suspension wurde 1 1/2 Stunden in ein heißes Wasserbad bei 5$OC gegeben.
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Proben für die Sterilitätsprüfung wurden abgenommen (0, 2 ml auf jede
von zwei Blutagarplatten und 2, 0 ml in jeden von zwei Kolben, die 250 ml Thioglyoolatmaiaohe
enthielten), und der Impfstoff wurde gekUhlt, bis er bon8tigt wurde. Nach dem Ende
don Sterilitätstestes wurde jeder Aneatz in zwei 500 ml Teile geteilt.
Ein
Teil wurde als Gesamtimpfatoff behalten und aus dem anderen Teil wurde ein somatisches
Antigen nach dem folgenden Verfahren hergestellt: Der Impfstoff wurde auf 37°C gebracht,
100 000 Einheiten Dornase wurden zugesetzt und die Mischung wurde im Wasserbad (oder
einem Brutschrank von 37°C) inkubiert, bis die Lyse beendet war. Die Inkubationszeit
betrug durchschnittlioh 24 Stunden fUr Impfstoffe, die aus Staph. aureus-Stämmen
in den Gruppen I, II und IV hergestellt waren, und zwisohen zwei und vier Tage ftir
StSmme in der Gruppe III. Die Lyse konnte duroh andauerndes Sohütteln oder RUhren
beschleunigt werden. Nach beendeter Lyse hatte der Impfstoff ein klares, bernsteinfarbenes
Aussehen, und eine kleine Menge Debris, die einige ganse Zellen einschloß, hatte
sich am Boden abgesetzt. Die Inaktivierung der Dornase wurde durch einatündigea
Erhitzen auf 56°C bewirkt. Dann wurde der Impfatoff bei 3000 UpM 30 Minuten zentrifugiert
und die überstehende Flüssigkeit gesammelt und bei Eisschranktemperatur golagart.
Vor der Verwendung wurde jeder Impfstoff auf die Gesamttoxizität gepriift, indem
Mäusen und Meerschweinchen 0,5 ml bzw. 5, 0 al intramuskulär eingespritzt wurde.
Die PrUfung auf erythrogene und dermonecrotische Toxine erfolgte, indem Kaninchan
0, 1 al Anteile intracutan injiziert erhielten. Das Vorliegen von Hämolysinen im
Impfstoff wurde an Kaninchen- und Schaforythrooyten geprüft. Alle Impfstoffe bestanden
die Toxizitätsprüfung und bei keinem wurden Toxine festgestellt.
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Beispiel 2 Herstellung von typhoidem somatischen Antigenvaccin
1)
Bl22SlscheUnerauchungYonSal;monJ;ayphlaen Herstellung von Standardimpfstoff Salmonella
typhi, Stamm Ty 2, vom International Laboratories for Biological Standards in Kopenhagen,
wurde für alle diese Versuche verwendet. Jeder Ansatz von Impfstoff wurde durch
16stündiges Züchten von S.typhi in 25 Roux-Kolben, die 150 ml 2, 5% iges Nähragar
enthielten, bei 37 C hergestellt. Die Kultur wurde durch Waschen der Oberfläche
jedes Roux-Kolbens mit 10 ml gepufferter Salzlösung vom pH 7, 2 geerntet. Die Bakteriensuspensionen
wurden vereinigt und das Volumen mit gepufferter Salzlösung auf 1000 ml gebracht.
Die Dichte der Suspension war gleich dem etwa 20-fachen des internationalen Bezugspräparates
auf Trübung (10 Trdbungseinheiten), und sie enthielt etwa 20 x 109 Zellen je ml.
Die Zellen wurden 6 Stunden bei Zimmertemperatur mit 1 : 5000 Merthiolat in Salzlösung
(Endkonzentration) stehengelassen und dann vier Tage im Kuhlraum. Nach den vier
Tagen wurden Untersuchungen auf lebende Bakterien auf Nähragarschalen und in Kalbfleichinfusionsbrühe
durchgefuhrt.
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Herstell von saten -0-Vorangehende Untersuchungen zeigten, dab Desoxyribonuclease
getötete Typhoidorganismen nicht merklich während der Beobachtungszeit von 1 Monat
lysierte, wie sich durch Messung der Triibung und durch Gramfleckenprüfung zeigte.
Es wurde daher ein physikalisches Zerreißen der Zellen mittels Schallsohwingungen
vor der Behandlung mit dem Enzym durchgefuhrt.
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Gleiche Volumina der Standard Vaccinsuspension wurden unterschiedlich
behandelt. Eine Probe wurde 1 1/2 Stunden Schallschwingungen im Raytheon 10 kHz
Schalloszillator ausgesetzt. Diese Probe wurde in zwei gleiche Volumina geteilt.
Der pH-Wert des einen Teils wurde auf 7, 2 eingestellt und 100 000 Einheiten Dornase
je 100 ml Flüssigkeit wurden zugegeben und die andere Probe wurde unbehandelt gelasse.
Beide Proben wurden bei Zimmertemperatur drei Tage inkubiert, und danach wurden
sie bei 4000 UpM 30 Minuten zentrifugiert. Die überstehenden Lösungen wurden vor
der Verwendung bei 4°C gelagert.
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Andere Proben von Standardvaccinen wurden mit Tween 80, Triton (eingetragene
Warenzeichen für oberflächenaktive Mittel), insbesondere Triton WR 1339, das ein
oxyäthyliertes tert.-Octylphenolformaldehydpolymerisat ist, und Natriumdesoxycholat
behandelt, um den Versuch zu machen, die bakterielle Zersetzung mit oder ohne Dornase
zu beschleunigen. Keine dieser Substanzen allein ergab die Lyse der getöteten Typhoidorganismen.
Jedoch in Kombination mit Dornase ergab jede von ihnen eine Lyse innerhalb einer
Zeit von 10 bis 14 Tagen. In jedem Fall, wo Dornase verwendet wurde, wurde das Enzym
nach beendeter Lyse durch einstündiges Erhitzen auf 56°C inaktiviert. Da die schnellste
und vollständigste Lyse durch 1% Triton plus Dornase bewirkt wurde, sind anschließend
nur die mit dem Triton-Dornase-Gemisch erhaltenen Ergebnisse angegeben.
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Eine weitere Probe des Standardvaccins wurde mit Pyridin nach dem
von Iabsofflaky und Mitarbeitern, Can. J. Microbiol. 6, 453 bis 462 (1960) beschriebenen
Verfahren behandelt mit dem Unterschied, daß 8 Volumina Pyridin je 1 Volumen S.
typhi Standardauspension verwendet wurden. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei Zimmertemperatur
stehengelassen und dann bei 3000 UpM 2o Minuten zentrifugiert. Nach der Dialyse
wurde die Flüssigkeit durch Vordampfen wieder auf das gleiche Volumen wie die ursprûüngliche
Standardsuspension gebracht. Natriumohlorid wurde bis zu einer Endkonzentration
von 0, 85% zugegeben und die Lösung bei 4°0 gelagert.
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Anschließend werden die Lysate und der Pyridinextrakt der tUrse halber
wie naohfolgend angegeben bezeichnet und insgesamt Iyeate genannt : SO-typhi: Fraktion,
die mit dem Sohalloszillator behandelt wurde SOD-typhit Fraktion, die mit dem Sohalloszillator
und Dornase behandelt wurde TRD-typhi: Fraktion, die mit Triton und Dornase behandelt
wurde PY-typhi : Fraktion, die mit Pyridin extrahiert wurde Standard-typhis unbehandelte
Kontrollstandardfraktion.
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Die Sohutzwirkung jedes Lysats wurdeals E.D.-Werte nach dem Verfahren
von Reed und Nunoh, Am, J. Hyg. 27, 493 bis 497 (1938), berechnet, wobei berücksichtigt
wurde, day die unverdünnten Lysate 20 x 109 Bakterien je ml äquivalent waren.
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Aktiver Schutztest an der maus Mäuse, die mit SO-typhi, SOD-typhi,
THD-typhi und PY-typhi immunisiert
waren, wurden auf ihre Fähigkeit,
einer Infektion mit typhoiden Bazillen standzuhalten, untersucht. Die Ergebnisse
in der Tabelle I zeigen, daß die Schutzwirkung von SO-typhi und SOD-typhi gleich
derjenigen der ursprunglichen Standardsuspension war. Dem PY-typhi-Präparat konnte
keine Schutzwirkung zugeschrieben werden und den WHO-Vaccinen K und L sowie dem
TRD-typhi-Prdparat lediglich eine minimale AktivitEt. Die Mäuse in der nicht-immunisierten
Kontrollgruppe starben innerhalb 24 Stunden.
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Die SOD-und TRD-Vaccine zeigten sich als weniger toxisch als die Zentralvaooine.
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Tabelle I Schutzwirkung von S. typhi-Lysaten, gezeigt durch den Aktivschutztest
an der Me. us Injizierte Verdünnungen der injizierten Fraktionenxx E.D. 50 (in Fraktion
1:3 1:15 1:75 1:375 Millionen) Versuch I SO-typhi 8/8"8/8 2/8 0/8 214 272 SOD-typhi
8/8 6/8 2/8 2/8 195 120 TRD-typhi 4/8 2/8 0/8 0/8 1 999 920 PY-typhi 0/8 0/8 0/8
0/8 -Standard-typhi 8/8 8/8 2/8 0/8 214 272 Vaccin K+ 3/12 2/12 2/12 1/12 Vaccin
L++ 4/12 2/12 1/12 0/12 Versuch II su-typha 10/10 5/10 3/10 0/10 315 360 SOD-typhi
8/10 5/10 4/10 0/10 407 280 TRD-typhi 8/10 4/10 1/10 0/10 752 160 PY-typhi 0/10
0/10 0/10 0/10 -Standard-typh. 10/10 5/10 1/10 0/10 486 720 x Überlebende/Behandelte
+ Vaooin K, von der Wor Health Organisation geliefert ++ Vaooin L, von der World
Health Organization geliefert xx die Nullverdünnung bezieht sich auf die Standard-typhi-Suspension,
die 20 x 109 Organismen je ml enthält, sowie die davon abgeleiteten Lysate
Beispiel
3 Meningococcus Vaccin Stämme von Neisseria intracellularis (meningococcua) wurden
in einem modifizierten Frantzmedium (Watson and Scherp, J. Immunol.) 81, Seite 331,
(1958)), das einen Zusatz von 0, 1% Hefeextrakt zur Ergänzung des Kohlendioxydgehaltes
enthielt, gezüchtet. Die Inkubation wurde bei 57°C durchgeführt. Das Wachstum erreichte
innerhalb 24 bis 30 Stunden ein Maximum.
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Die Flaschen wurden vom Inkubator entfernt, 0, 5% Phenol wurden zugesetzt
und die Abtötung durch Hitze wurde bei 56°C bewirkt.
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Dann wurde der pH-Wert auf 7, 2 eingestellt und Dornase wurde zugefügt
(100 000 Einheiten je 500 ml). Der Fortschritt der Lyse wurde mikroskopisch gegen
eine Kontrollprobe verfolgt.
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Nach der Desaktivierung der Dornase durch Erhitzen wurde das Vaccin
4 Wochen oder mehr unter Kühlung zur Verminderung seiner Toxizität gelagert.
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Vorhergehende Versuche an Mäusen zeigten, daB ein so hergestelltes
Vaccin einen 50% igen Schutz gegen einen letalen Angriff im Vergleich zu einem 30%
igen Schutz durch ein nichtlysiertes Vaccin ergibt.
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Beispiel 4 Pertussivvaooin Stkmme von Bordetella pertussis wurden
in herkbmmlioher Weise gezüchtet
und die Bakterien durch Behandeln
mit Merthiolat in einer Konzentration von 1 : 10 000 getötet.
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Es wurde festgestellt, daß Dornase allein die getöteten Bakterien
nicht merklich lysierte, und daher wurde eine vorherige Behandlung durchgeführt.
In einem Fall bestand diese vorherige Behandlung in einstündigem Aussetzen gegenüber
Ultraschallschwingungen unter Verwendung eines 10 kHz-Osziliators, der bei 1, 0
bis 1, 15 A betrieben wurde. In einem anderen Fall umfaßte die Vorbehandlung eine
Behandlung der Bakterien mit Natriumlaurylsulfat in einer Konzentration von 0, 625,
; dies bewirkte ein schnelles Aufbrechen der Bakterien und lieferte eine gelatinöse
Masse.
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Dann wurde Dornase zu dem vorbehandelten Material in einer Menge,
die 100 000 Einheiten je 500 ml entsprach, gegeben, und eine drei-bis sechsstiindige
Inkubierung bei 37°C vorgenommen. Dann wurde die Dornase durch Erhitzen desaktiviert.
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In dem Fall, wo eine Vorbehandlung mit Natriumlaurylaulfat durchgeführt
wurde, wurde festgestellt, daß beim Stehen des Produktes unter Kiihlung das Natriumlaurylaulfat
auskristallisierte und durch Zentrifugieren entfernt werden konnte.
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Beispiel 5 Somatisches Antigenvaccin zur Verhütung von Streptococceninfektionen
~~~~~~~~~~...~~~~....~~....~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ Dieses Vaooin wurde
wie folgt hergestellt :
Ein synthetisches Medium wurde zur Herstellung
von Kulturen der Streptococcenstämme T 12, T 19 und T 36 verwendet, die dann zur
Herstellung von sowohl monovalenten als auch polyvalenten Vaccinen verwendet wurden.
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Das Inoculum für jeweils 500 ml Medium waren 0,5 ml einer rekonstituierten
gefriergetrockneten Kultur, die etwa 5 x 108 Organismen je ml enthielt. Die Kolben
wurden 24 Stunden bei 37°0 inkubiert. Proben zur Untersuchung der Gesamtbakterienzahl
und des Vorhandenseins von Toxinen wurden abgenommen und zum Rest wurde Phenol bis
zu einer Konzentration von 0, 5% zugefügt. Dann wurde der Ansatz 1 Stunde in ein
Wasserbad bei 56°C gegeben. Danach wurden Proben fUr die Sterilitätsprüfung abgenommen
(0, 5 ml jeweils auf 3 Blutagarschalen und 0, 5 ml jeweils in 6 Gläsern, die Thioglycolatmedium
und Tryptioasesojamaischemedium mit einem Gehalt von Fleischteilchen enthielten,
und 7 Tage bei 30 bis 32°C inkubiert), und das Vaccin wurde, bis es benötigt wurde,
bei 4°C gekühlt.
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Die Gesamtzahl an Streptoooooen schwankte von 5 x 106 bis 15 x 10
Organismen, der Durchschnitt betrug 10 x 10 Organismen je ml.
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Nachdem festgestellt war, daß die Sterilitätsprüfungen zufriedenatellend
waren, wurde das mit Phenol versetzte und duroh Hitze abgetötete Vaooin auf 37°C
gebracht, 50 000 Einheiten Dornase wurden fUr jeweile 500 ml Vaooin zugesetzt und
das Vaccin wurde etwa 12 Stunden bei 37°C inkubiert, wodurch eine praktisch vllständige
Lyse der Streptoooooen erzielt wurde. Dann wurde die Dornase duroh
einstündiges
Erhitzen auf 56°C inaktiviert.
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Bei der Prüfung an Kaninohen unter Verwendung verschiedener Bakterienstamme
wurde festgestellt, daB die so erhaltenen Vaccine einen guten Schutz gegen Streptocooceninfektion
ergaben.
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Beispiel 6 Somatisches Antigen-BCG-Vaccin Dieses Vaccin wurde durch
Behandeln einer BCG-Suspension (30 mg Mol pro ml) mit einem 10 kHz Raytheon Schalloszillator
fUr 1 1/2 Stunden und anschließender Zugabe von Dornase (100 000 Dornaseeinheiten
je 500 ml BCG-Suspension), um die Lyse der BCG-Zellen zu bewirken, hergestellt.
Nach 4 Tagen bei Zimmertemperatur wurde die Dornase durch einstündiges Erhitzen
auf 56°O inaktiviert. Das erhaltene Lysat wurde dann zentrifugiert und die Uberßtehende
Flüssigkeit wurde 2 Tage gegen Leitungswasser dialysiert, was das Vacoin ergab.
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Beispiel 7 Somatisches typhoides Antigenvaccin Typhuavacoine wurden
nach einem Verfahren hergestellt, das im allgemeinen antaprechend dem im Beispiel
2 besohriebonen ist.
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Jedooh wurden die Bakterien auf einem modifizierten Frantzmedium
(Wataon and Scherp, J. Immunol. 81, Sedte 331, (1958)), gezüchtet, das einen Zusatz
von 1, 5% Glyoin enthielt. Dites begünstigte die Bildung von Protoplasten anstelle
von normalen Bakterien mit
Zellwandungen. Diese Protoplasten wurden
durch Zugabe von Merthiolat in Salzlösung getötet und mit Dornase, wie im Beispiel
2 beschrieben, lysiert, jedoch ohne Behandlen mit Schallschwingungen, oberflächenaktiven
Mitteln oder irgendeine andere Behandlung zur Schwächung der Zellwandungen. Vollstandige
Lyse erfolgte innerhalb von 24 Stunden. Untersuchungen zeigten, daß das Vaccin bei
Laboratoriumstieren wirksam war.
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Das beim vorhergehenden Verfahren verwendete Glycin kann durch andere
Aminosäuren, beispielsweise Alanin, oder durch andere Mittel ersetzt werden, die
zur Bildung von Protoplasten fUhren. Derartige protoplastproduzierende Mittel sind
bekannt. Dazu gehören beispielsweise Antibiotika, z. B. Penicillin, oder Enzyme,
wie Lysozym oder Trypein. Im allgemeinen aind Aminosäuren die bevorzugten protoplastproduzierenden
Mittel, da sie weniger wahrscheinlich Rückstände hinterlassen, die Nebenwirkungen
während der Anwendung der Vaccine bewirken kdnnten. NatUrlich sollte jedes protoplastproduzierende
Mittel, das bei dieser Durchfffhrungsform erfindungsgemäß verwendet werden kann,
gopruft werden, um nicher zu gehen, daß es keine unerwünschten RUckatknde dieser
Art hinterläßt.
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Die Menge an protoplaatproduzierendem Zusatz, die mit Nutzen in das
Medium eingebraoht werden kann, kann durch den Versuoh beatimmt werden. Bei der
Züchtung von S. typhi wurde festgestellt, dB die Mengenanteile von Glycin im Medium
von 0, 5 bis 3% betragen können.
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Beispiel 8 Immunisierung von Kühen gegen Mastitis Rindermastitis ist
im allgemeinen auf Staphylococcen-und/oder Streptococceninfektion zurückzuführen.
din polyvalentes somatisches Antigenvaccin wurde auf seine Verwendbarkeit zur Verhütung
von Staphylococcenmastitis bei Kühen untersucht. Dieses Vaccin wurde nach einem
Verfahren erhalten, bei welchem durch Dornase die Lyse einer Anzahl von auegewählten
Stämmen von Staphylococcus aureus bewirkt wurde, und das im allgemeinen entsprechend
dem in Beispiel 1 beschriebenen war.
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Die Stämme und Mengenanteile von Staphylococcus aureus, aus welchen
dieses Vaccin hergestellt wurde, sind im folgenden angegeben : Stamm Phagentypus
Mengenanteil an Vaccin ; @ 584763 (Gruppe I) 80/81 25 596535 (Gruppe II) 3A/3B/3C/
25 596510 (Gruppe III) 7/47/53/54/75+ 20 591714 (Gruppe IV) 42D 25 6032 Gruppe I)
KS 6 5 Bei der Herstellung dieses Vaccins wurde darauf geachtet, eine 100% ige Lyse
zu erhalten, woduroh ein Vacoin von maximale Wirksamkeit erhalten wurde. Vor der
Verwendung des Vaccins wurde die Dornase durch Hitze inaktiviert, indem das Vacoin
auf eine Temkperatur von etwa 56°C für 1 Stunde erwärmt wurde. Dies wurde durchgeführt,
um die Stabilität zu erhöhen und auch mögliche schädliche Wirkungen in den zu untersuchenden
Rindern auszuschalten.
AuBerdem wurde eine Bakterienkultur unter
Bedingungen durchgeführt, wo eine große Oberfläche der Iuft ausgesetzt war.
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Endlich wurde das Vaccin gefriergetrocknet, um seine Stabilität zu
verbessern.
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Versuche, die an mit Staphylococcenmastitis infizierten Fällen durchgeführt
wurden, zeigten, daß die Staphylococcenmastitis in Kühen durch vorherige Impfung
mit einem nach dem erfindungagemäßen Verfahren hergestellten Vaccin verhindert werden
kann. Die Primärimpfung bestand aus zwei Dosen von Antigen (5 ml) mit einmonatigem
Abatand. Eine Untersuchung der Antikörperbildung zeigt an, daß nach 6 Monaten eine
Wiederholungsimpfung erforderlich sein kann.
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Wenn Rindermastitis durch eine Streptococoeninfektion hervorgerufen
ist, wird ein Vaccin entsprechend dem oben beschriebenen verwendet, das jedoch aus
getöteten Streptococcen hergestellt ist. Wenn Mastitis durch eine gemisohte Staphylococcen-Streptococcen-Infektion
hervorgerufen ist, wird ein Mischvaocin verwendet.