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Verfahren zur Herstellung eines Brucellose-Impfstoffs Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Brucellose-Impfstoffs durch Extraktion
von Bakterien bei 1 bis 5"C während 20 bis 30 Minuten mit einer mindestens 70 bis
950/o Phenol enthaltenden Phenol-Wasser-Mischung, Abtrennung der phenolhaltigen
Wasserphase von der wasserhaltigen Phenolphase, Entfernung niedermolekularer Komponenten
aus der Wasserphase, Konzentrierung der Wasserphase im Vakuum und Fällung mit einem
niedrigen Alkanol oder Alkanon.
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Es ist bekannt, Bakterienantigene dadurch zu gewinnen, daß man die
Bakterien, besonders auch Brucellen, in der Kälte mit Phenol-Wasser-Emulsionen behandelt,
die wäßrige Phase dialysiert, die Lösung der hochmolekularen Anteile einengt und
mit organischen Lösungsmitteln fraktioniert fällt.
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Diese bekannten antigenen Stoffe sind entweder toxisch oder agglugenisch
oder beides, während das nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte
Antigen weder toxisch oder agglugenisch ist.
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Demgemäß ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
eines Brucellose-Impfstoffs durch Extraktion von Bakterien bei 1 bis 5"C während
20 bis 30 Minuten mit einer mindestens 70 bis 950/o Phenol enthaltenden Phenol-Wasser-Mischung,
Abtrennung der phenolhaltigen Wasserphase von der wasserhaltigen Phenolphase, Entfernung
niedermolekularer Komponenten aus der Wasserphase, Konzentrierung der Wasserphase
im Vakuum und Fällung mit einem niedrigen Alkanol oder Alkanon, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß als Bakterien virulente Stämme von Brucella verwendet werden und das wäßrige
Konzentrat mit 2 Volumteilen Alkohol versetzt, der entstandene Niederschlag verworfen
und aus der Lösung durch weitere 2 Volumteile Alkohol die wirksame Fraktion gefällt
wird.
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Auf diese Weise erhält man ein vollkommenes Immunisierungsagens,
das für strenge Standardkontrollen geeignet ist und eine optimale Antigenwirkung
bei dennoch geringster Virulenz und Toxizität besitzt.
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Darüber hinaus wird die Isolierung dieser Komponente durch Verfahren
bewirkt, die verhältnismäßig einfach sind und leicht von anderen wiederholt werden
können.
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Auf diese Weise kann leicht ein reines Antigen in bezug auf die zur
Verleihung einer Immunität erforderliche Dosis hergestellt werden. Die Dosis ist
außerordentlich bedeutsam, wenn eine erfolgreiche Impfung erzielt werden soll.
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Die Konzentration von Phenol in der Phenol-Wasser-Mischung kann etwas
variiert werden, wobei es notwendig ist, darauf zu achten, daß man schließlich ein
Zweiphasensystem erhalten muß, bei dem jede Phase voll mit der anderen gesättigt
ist. Zu diesem Zweck verwendet man gleiche Volumen Wasser und Phenol, wobei das
letztere eine Konzentration von etwa 70 bis etwa 95 °/0 besitzt. Die zweckmäßige
Endkonzentration des Phenols beträgt 75 0/,.
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Die während der Extraktion angewandte Temperatur ist zweckmäßig so
niedrig wie möglich, ohne daß eine Kristallisation erreicht wird. Auf diese Weise
arbeitet man bei einer Temperatur von etwa 1" bis etwa 5"C, zweckmäßig etwa 2"C.
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Als niederes Alkanol für die Fällung des Antigens verwendet man zweckmäßig
Äthanol, obgleich andere Alkohole mit niederem Molekulargewicht, wie z. B.
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Methanol, Propanol, Isopropanol oder Butanol, verwendet werden können.
Alkanone, wie Aceton, sind für diesen Zweck ebenfalls geeignet.
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Die fraktionelle Fällung mit dem niederen Alkohol wird zweckmäßig
nach vorheriger Entfernung von Komponenten mit niederem Molekulargewicht vorgenommen.
Die wäßrige Lösung wird dann auf ein Drittel bis zur Hälfte des ursprünglichen Volumens
verringert. Dann werden etwa 2 Teile Alkanol zugesetzt, der gefällte Niederschlag
wird abgetrennt und der Oberschicht 2 Teile Alkanol zugesetzt und die aktive Antigenfraktion
als Niederschlag erhalten.
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Komponenten mit niederen Molekulargewichten werden aus der wäßrigen
Phase des Phenol-Wasser-Systems durch Dialyse, Ultrazentrifugierung oder durch Adsorption
(z. B. Sephadex) abgetrennt.
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Als Antigenquelle werden die besten Ergebnisse mit virulenten Stämmen
von Brucella abortus, Brucella melitensis und Brucella suis erhalten.
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Mit zur Erfindung gehört selbstverständlich auch die Verwendung von
Stämmen, Varianten und Mutanten der obenerwähnten Brucella-Organismen, die zum Zweck
der Erzielung antigenisch aktiver Komponenten mit Erfolg angewendet werden können.
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Von besonderer Bedeutung in dieser Hinsicht sind Mutanten. Diese können
als Ergebnis besonderer Maßnahmen, wie Hitze, Ultraviolettstrahlung oder vielleicht
auch energiereicher Strahlung, erhalten werden. Es können auch Mutanten durch das
Wachstum von Brucella-Organismen in einem Nährmedium erhalten werden, das infolge
seiner Konstitution das Wachstum normaler Brucella-Organismen unterdrückt, während
es zur selben Zeit die Bildung und Förderung des Wachstums von Mutanten veranlaßt.
Eine solche Mutante ist als MR-Form von Brucella abortus, Stamm Schaedtbeck oder
auch als LM 61 bezeichnet, identifiziert worden und führt zum ü-Antigen gemäß der
vorliegenden Erfindung. Diese Mutante wird durch Kultivierung von Brucella abortus
erhalten, abgeleitet von der infizierten Nachgeburt einer Kuh auf Albuminagar, und
wurde bereits vorbeschrieben (Doktordissertation von Karl-Ernst von Milc zew ski,
Universität Kiel, Westdeutschland, 1960). Die Mutante ist von bekannten Stämmen
und Formen von Brucella abortus leicht unterscheidbar durch ihre morphologischen,
kulturellen und anderen Kennzeichen, die wie folgt sind: 1. Resistenz gegen Fuchsinsäure,
Thionin und Pyronin; Bildung von Urease und Verfärbung bei Färbungsreaktionen: ähnlich
der S-Form von Brucella abortus Typ I.
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2. Kolonien schleimig-viskoser Konsistenz; Durchmesser 2,10 mm. Rand:
gelb, körnig; Mitte: rötlichgelb, stark konvex.
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3. Mikroskopisch: Abstriche von 4 Tage alten Tryptoseagarkulturen
zeigen kurze Stäbchen, die dazu neigen, Ketten zu bilden (im Gegensatz zu Kulturen
von S-Form-Elternstämmen).
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4. Schnelle und intensive Bildung von Schwefelwasserstoff.
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5. Trypaflavinagglutination: feinkörnig.
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6. Salz: unbeständig.
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7. Serologisch: unterscheidbar von der S-Form von Brucella abortus
durch Inagglutinierbarkeit, d. h. nicht agglutiniert durch besonderes Abortus-Bang-Serum.
Die Versuchstiere wurden einer vorherigen Behandlung mit LM 61 unterworfen und bilden
keine agglutinierenden Antikörper auf S-Antigene, bilden aber solche Antikörper
für den Stamm selbst.
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8. Bei Tierversuchen ist der Stamm nicht krankheitserregend.
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9. Schnelle Serumagglutinationen: negativ.
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Zum Zweck der Kennzeichnung wird ein Impfmaterial der Mutanten in
Tryptoseagar (1,6 0/o Agar, 2°/o Difcotryptose, pH 6,7) mit Hilfe des Glasfadenverfahrens
gebracht, und das Ganze wird bei 37"C 4 Tage im Brutofen gehalten. Die Morphologie
der Kolonien wird mit Hilfe eines zwölffach vergrößernden
Binokularmikroskops bestimmt.
Es wird eine Aypafiavinagglutination gemäß dem Verfahren von Braun und B o n n e
s t e 1 (Am. J. Vet. Res., 8, S. 386 [1947]) vorgenommen. Es findet eine schnelle
Agglutination mit einer 1: 10-Lösung eines agglutinierenden Brucelle-Antiserums
statt. Eine mit Borat gepufferte (0,lmolar, pH 8,0) Salzlösung wird als Verdünnungsmittel
verwendet. Die Mischung der Bakteriensuspension und die Serumlösung wird auf Agglutinierung
auf dem Objektträger des Mikroskops nach 3 Minuten "beobachtet. Die Agglutinierung
mit Salz wird ebenfalls auf dem Objektträger unter Verwendung von 0,90/0iger Salzlösung
durchgeführt. Unter Anwendung des Färbeverfahrens nach H a n s e n wird die Morphologie
der Zellen mit Hilfe des Phasenkontrastmikroskops unter 900facher Vergrößerung bestimmt.
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Brucella abortus, Stamm Schaedtbeck, Form MR, wird aus einer Kultur
von Brucella abortus, Stamm Schaedtbeck, Form R, nach 30 Tagen Inkubationszeit bei
37"C in starker Tryptose als einzige Bakterienabart erhalten. Das Tryptosemedium
hat folgende Zusammensetzung: Tryptose 1,5 O/o, Glukose Q50/0, Natriumchlorid 0,5
O/o, Thiaminhydrochlorid 0,5mg O/o, eingestellt auf ein pH von 6,7 mit Phosphorsäure.
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Die MR-Form Mutante unterscheidet sich vonhder Eltern-R-Form darin,
daß die letztere die folgenden morphologischen und kulturellen Kennzeichen zeigt:
1. Kolonien nach 4 Tagen in Tryptoseagar: klein; 1,70 mm im Durchmesser; Rand: gelb
und körnig; Mitte: rötlichgelb; Konsistenz: körnigklebend.
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2. Trypaflavinagglutination: körnig.
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3. Natriumchlorid: unbeständig.
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4. Schnelle Serumagglutination: negativ.
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5. Hansen-Färbung: ovale Zellen, Neigung zur Bildung langer Ketten.
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Die Mutante unterscheidet sich auch von Brucella abortus, Stamm 19,
S-Form, dadurch, daß die letztere folgende morphologische und kulturelle Kennzeichen
besitzt, wenn sie in dem für die R-Form (oben) verwendeten Medium vermehrt wird,
welches Aufschluß über die MR-Form-Mutante gibt.
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1. Kolonien nach 4 Tagen in Tryptoseagar: klein; 1,4 bis 1,6 mm im
Durchmesser; Rand: grünlichblau; Mitte: schwach rötlichgelb; Konsistenz: butterartig
verschmelzend.
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2. Natriumchlorid: beständig.
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3. Trypaflavinagglutination: negativ.
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4. Schnelle Serumagglutination: schnell positiv.
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5. Hansen-Färbung: Zellen morphologisch einheitlich, rund, einzeln
oder in kurzen Ketten.
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Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von
Antigenen aus verschiedenen Brucella-Arten, aus ihren bekannten Stämmen, Varianten
und Mutanten. Sie umfaßt auch die nach diesem Verfahren gewonnenen wertvollen Antigene,
wobei besondere Aufmerksamkeit auf die bisher nicht erhaltenen antigenischen Komponenten
gelegt wird, die eine besonders wertvolle Bedeutung als Immunisierungsagenzien gegen
Brucellose haben. Solche Antigene fallen mit unter die Erfindung und werden nachstehend
näher beschrieben.
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Es gibt keine zwingende Grundlage für die Wechselbeziehung zwischen
dem Titer des Agglutinins und dem Grad der gewünschten Immunität bei der Tmmunisierung
gegen Brucellose. Die agglutinogenen Kennzeichen der Brucellose-Impfstoffe sind
nicht identisch mit immunisierenden I(ennzeichen. Deshalb können Tiere gegen Brucellose
immunisiert werden ohne gleichzeitige Bildung von Agglutininen. Tatsächlich kann
die Agglutininbildung als eine vermeidbare und unerwünschte Nebenreaktion betrachtet
werden.
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Dies ist so, weil erstens die agglutinogenischen und immunisierenden
Antigene unterschiedlich voneinander sind oder zweitens weil beide, die agglutinogenischen
und immunisierenden Antigene auf ein und demselben Antigenkomplexmolekül kombiniert
werden, aber verschieden bestimmbare Gruppen darstellen. Dieses Problem wird mit
Hilfe der Herstellung gereinigter Antigene im Hinblick auf die Trennung von Agglutinogenen
und Impfstoffen behandelt. So betrifft die Erfindung die Trennung eines gereinigten,
immunisierenden Antigens aus Brucella abortus, das als Prophylaktikum gegen die
Krankheit verwendet werden kann.
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Extraktion und Isolation des Antigens Al Für die Herstellung der
Antigene wird ein virulenter Stamm von Brucella abortus, Stamm Schaedtbeck, Form,
verwendet. Die Bakterien werden in einem Zeitabschnitt von 48 Stunden auf einem
Leberextraktagarboden gezüchtet, der in folgender Weise bereitet wurde: 1 kg Leber
wird gehäutet und in Stücke geschnitten. Es wird 1 1 Wasser zugesetzt und die Mischung
2 Stunden in einem Dampftopf erhitzt. Die Oberschicht wird dekantiert und sterilisiert
durch Erhitzen in einem Dampftopf an jedem der drei darauffolgenden Tage. 45 g )>Merk-Standard-I-Agar«
werden 150 ml der so erhaltenen Brühe zugesetzt.
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Es wird genug Wasser zugegeben, um 1 1 Endprodukt zu erhalten. Die
auf dem Leberextrakt wie vorbeschrieben gewachsenen Zellen werden mit einer Phenol-Salz-Lösung
(0,5 0/o Phenol, 0.85 0/o Natriumchlorid) abgewaschen und durch Zentrifugieren sedimentiert.
Die Zellen werden zweimal mit physiologischer Salzlösung gewaschen, wieder suspendiert
und durch eine G-2-Filterfritte zur Entfernung grober Teilchen aus der Bakterien-Zellen-Suspension
filtriert.
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Die Suspension wird in Aceton geschüttet, die Zellen durch Zentrifugieren
sedimentiert und unter verringertem Druck nach mehrmaligem Waschen mit Aceton getrocknet.
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2 bis 3 g der in Aceton getrockneten Bakterien werden in gleicher
Weise in 80 ml destilliertem Wasser suspendiert und auf eine Temperatur von +2°C
gekühlt. Dieser Suspension werden 130 ml einer 75%igen Mischung aus Phenol-Wasser
(100 g Phenol + 32 ml Wasser), vorher auf +3°C gekühlt, zugesetzt. Die Mischung
wird sorgfälltig geschüttelt und 20 bis 30 Minuten unter gelegentlichem Schütteln
in der Kälte gehalten. Die Phenol-Wasser-Suspension wird nun durch Zentrifugieren
getrennt. Die darüberstehende Wasserphase wird dekantiert. Nahezu 60 ml Wasser werden
der übrigbleibenden Phenolschicht und dem Niederschlag zugesetzt, der nach sorgfältigem
Schütteln zentrifugiert wird. Beide Wasserschichten werden gesammelt. Dies ist die
Fraktion A.
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Die Wasserphase des Phenolauszugs (Fraktion A) wird während einer
Zeitdauer von 3 Tagen gegen
Leitungswasser und 1 Tag gegen destilliertes Wasser dialysiert.
Das Volumen von A wird auf 30 bis 40 ml durch Vakuumdestillation bei nahezu 30°
C vermindert.
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Die so erhaltene Lösung zeigt schwache Opaleszens.
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Die Lösung wird einer Zentrifugierung mit hoher Geschwindigkeit unterworfen.
Der oberen Schicht wird genug gekühlter Äthanol zugesetzt, so daß man eine Endkonzentration
von 700/o Äthylalkohol erhält.
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Eine Substanz fällt aus, die später als Fraktion A1 (Antigen A1) bezeichnet
wird. Diese Fraktion wird durch Zentrifugieren sedimentiert, mit Äthylalkohol, Aceton
und Äther gewaschen, unter vermindertem Druck getrocknet und ergibt eine Ausbeute
von einer Menge, die gleich etwa 20/o der getrockneten Bakteriensubstanz ist.
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Extrahierung und Isolierung des Antigens A12 21 g der in Aceton getrockneten
Bakterien werden in 320 ccm destilliertem Wasser suspendiert und auf 2°C gekühlt.
Dieser Suspension wird eine Mischung aus 400 g Phenol und 130 ccm Wasser zugesetzt
und auf 2°C gekühlt. Die weitere Aufarbeitung erfolgt, wie für das Antigen A1 beschrieben,
mit der Ausnahme, daß die erhaltene wäßrige Lösung des rohen Antigens mit 2Volumteilen
Äthanol behandelt wird. Das niedergeschlagene Sediment wird abzentrifugiert und
aus der darüberstehenden Phase das gereinigte Antigen mit weiteren 2 Volumteilen
Äthanol gefällt. Dieses Verfahren führt zur Fraktion A12 (Antigen Al2).
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Kennzeichnung des Antigens A, Das Antigen A1 ist ein graubraunes
Pulver mit verhältnismäßig guter Löslichkeit in Wasser. Es zeigt die nachfolgend
genannten Reaktionen: Molisch-Reaktion für Kohlehydrate .... + Xanthoprotein-Reaktion
für Aminosäuren mit aromatischer Struktur .... + Biuret-Reaktion für Proteine und
Polypeptide ............ ............ + Nach der Ultrazentrifugierung zeigt das
Antigen Al eine glatte Verteilung mit fehlerfreiem Gefälle. Die Spektralanalyse
im Bereich des Ultraviolettlichts zeigt das Fehlen von Absorptionsbanden bei 260mµ,
was charakteristisch ist für Nukleinsäuren. Die Substanz ist also frei von Nukleinsäuren
und kann als verhältnismäßig reines Glycolipoprotein betrachtet werden. Die Hydrolyse
bestimmter Mengen mit n-HCl bei 100°C für eine Zeitdauer von einer Stunde mit anschließender
Entfernung des Proteins mit Hilfe 100i0iger meta-Phosphorsäure entbehrt eines Hilfsmittels
zur Bestimmung des Zuckergehalts der Proben in der Oberschicht nach der Anthron-Schwefelsäuremethode.
Die Berechnung auf Grund einer Standardkurve, gemessen an reiner Glukose, ergibt
einen Polysaccharidgehalt von 21,5 bis 24,8 »Glukoseeinheiten«. 50 mg des Antigens
Al werden 4 Stunden in 25 mol n-Schwefelsäure bei 100°C gehalten. Das hydrolysierte
Material wird mit Bariumhydroxyd zur Fällung der Schwefelsäure und des phosphorylierten
Zuckers neutralisiert. Das neutralisierte Hydrolysat wird der Zentrifugierung unterworfen,
das Volumen der Oberschicht auf etwa 201o von derjenigen des Ausgangsmaterials verringert
und für eine chromatographische
Trennung verwendet. Es wurden folgende
Zuckerreste identifiziert: Galaktose, Glukose, Mannose, Xylose, Aminozucker (nachgewiesen
mit dem Elson-Morgan-Reagens).
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Die Anwesenheit von Lipoidkomponenten im Antigen A1 wird durch Färben
mit Sudanschwarz bestimmt. Der Test wird wie folgt durchgeführt: Das Antigen wird
in 0,5%iger Dinatriumphosphatlösung in einer Menge suspendiert, daß sich eine 1°/Oige
Lösung des Antigens ergibt. Aliquote Mengen der Suspension, entsprechend 20, 50
und 100y der Testverbindung, werden auf Filterstreifen aufgebracht.
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Es wird eine Reihe von Flecken erhalten. Man läßt die Filterstreifen
3 Stunden in einer Äthanollösung von Sudanschwarz (eine heiße Lösung von 600/o Äthanol,
gesättigt mit Sudanschwarz B und filtriert) vollsaugen. Nach dem Färben werden die
Filterstreifen zweimal 15 Minuten lang in 500/0 Äthanol gewaschen. Das Auftreten
von braunschwarzen oder grauschwarzen Verfärbungen der Flecken zeigt die Anwesenheit
von Lipoiden an. Entsprechend dem Test ergibt das Antigen A1 eine + + +-Reaktion.
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Kennzeichnung des Antigens A12S Das Antigen A12S ist ein Glycolipoprotein,
das im wesentlichen frei ist von Nukleinsäuren (etwa 10/o Gehalt) und das den unten
angegebenen Reaktionen gemäß der nachfolgenden Tabelle entspricht:
| A12S |
| Löslichkeit in Wasser ........................... >1 g/100
ml |
| Nukleinsäureghalt .................................. # 1,1
% |
| Lipoidgehalt (Sudansuchwarzmethode) ++++ |
| Zuckergehalt (Glucosseiinheiten) .......... 43 bis 46 % |
| Galactose .......................................... etwa 10
% |
| Glucose .......................................... etwa 2 % |
| Mannose .......................................... etwa 1,5
% |
| Xylose .......................................... etwa 1 % |
| Aminozucker (dargestellt mit |
| Elson-Morgan-Reagenz) ............... + |
| Mollish-Reaktion für Kohlenwasser- |
| stoffe .......................................... ++ |
| Xanthoprotein-Reaktion für Amino- |
| Säuren mit aromatischer Struktur .. ++ |
| Biuret-Reaktion für Proteine und |
| Polypeptide .............................. + |
Zur Bestimmung des Nukleinsäuregehalts werden spektrophotometrische Messungen von
einer 0,10/igen oder einer 0,010/»igen Lösung des Antigens in gefüllten Quarzbehältern
von 1 cm Tiefe (E°260 - E°290 = E° Nukleinsäure) gemacht. Die Konzentration der
Nukleinsäure wird bestimmt durch Vergleich mit Adenosintriphosphat-Standardkurven.
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Zur qualitativen Bestimmung der Zuckerreste werden 40 mg des Antigens
in 2 ml Imolarer H2SO4 gelöst und in einer verschmolzenen Ampulle 4 Stunden bei
100°C unter gelegentlichem Schütteln hydrolysiert.
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Das so erhaltene Hydrolysat wird mit gleichem Volumen Wasser verdünnt,
und das pH wird auf 7,0 (neutral) mit lmolarem Bariumhydroxyd eingestellt. Nach
50 Minuten wird die Probe zentrifu-
giert. Die Oberschicht wird abgesaugt und ihr
Volumen auf etwa 0,9 ml durch Abdampfen im Vakuum verringert. Dann wird ein gleiches
Volumen Aceton zugesetzt. Das so erhaltene Hydrolysat ist fertig für die chromatographische
Untersuchung. Die ib! trennung der Zuckerkomponenten wird mit Hilfe der Papierchromatographie
erreicht. Folgende Materialien sind für diesen Zweck geeignet: Papier: Schleicher-Schüll,
2043 b Mgl; Lösungsmittel: I. n-Butanol - Aceton-Wasser (5: 5:1), II. n-Butanol
- Pyridin-Wasser (6: 4: 3); Entwickelt mit a) Anilinphthalat (für Aldehydzucker),
b) 4-Dimethylaminobenzaldehyd (für Aminozucker), c) Naphtholresorcinoltrichloressigsäure
(für Ketozucker).
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Die Versuchslaufzeiten betragen allgemein 17 bis 20 Stunden. DasLösungsmittel
Butanol -Aceton -Wasser dient zur Prüfung des Gehalts an Ketozuckern sowie zur besseren
Trennung der Pentosen. Andererseits wird eine bessere Trennung der Aldehydzucker
durch das Lösungsmittel Butanol - Pyridin - Wasserer zielt Das letztere führt auch
zu besseren Ergebnissen bei der Abtrennung der Desoxyzucker.
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Annäherungen der quantitativen zuckergehafte werden gehalten durch
Vergleich bestimmter bekannter Mengen von entsprechenden Zuckern, die gleichzeitig
der Chromatographie unterworfen werden. Offenbar werden nur jene Zuckerreste des
antigenischen Glycolipoproteins nach diesem Verfahren bestimmt, die vollständig
zu Monosacchariden gespalten werden.
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Es wird jedoch eine Vorstellung der quantitativen Beziehungen erzielt.
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Während der chromatographischen Bestimmung wird auch eine nicht identifizierbare
Komponente, die chromatographisch schnell durchläuft, beobachtet.
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Die nachfolgende Tabelle gibt die Daten wieder, die man bei einer
Elementaranalyse von Antigen gJS (zwei Extraktionen) erhält:
| A12S A12S |
| C ................... 30,62 bis 30,970/o 32,40 bis 32,45% |
| H 5,40 bis 5,42 0/o 5,14 bis 5,16 O/o |
| N 2,11 bis 2,25 0/o 2,44 bis 2,48 0'o |
| P 1,90bis 1,96 0/o 1,78 bis 1,830/0 |
| Na 5,87 bis 5,98 O/o 5,97 bis 6,03% |
| H2O ................ 2,70 bis 2,78 % |
| Flüchigtes ......... 5,74 bis 5,74 % |
Die gemessene optische Drehung des Antigens A12S (1,14 0/o in destilliertem Wasser)
beträgt [a]0'0: = +12° (+ 1,20).
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Die UV-Licht-Spektralanalyse zeigt nur ein schwarz ches Absorptionsmaximum
bei 258 mµ, und im Infrarotbereich (s, F i g. 1) werden keine charakteristischen
scharfen Banden beobachtet (5 mg Als in 1 g KBr.) Bei 50 000 U/Min. ist die Sedimentationskonstante
einer 1%igen Lösung in 1/15molarem Phosphat
(pH 7,0): s20 = 1,4
bis 1,5 S (Swedberg-Einheiten).
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Das Präparat ist über einen Zeitraum von 4 Stunden monodispers und
zeigt eine einzige sehr scharfe Steigung.
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Immunogene Eigenschaften des Antigens Al Das Antigen Al wird im Vergleich
zu in Aceton getrockneter Brucellae auf seine Fähigkeit, eine bestehende Immunität
gegen Brucella abortus zu verstärken, geprüft. Zur Erzeugung der ersten Immunität
werden CFW-Mäuse nur einmal mit einem wirksamen Depotimpfstoff injiziert. Die zweite
Injektion wird dann mit einer Lösung oder Suspension von Antigen Al oder mit in
Aceton getrockneter Brucellae in physiologischer Kochsalzlösung durchgeführt. Sowohl
für die zu prüfenden Antigene als auch für die Vergleichsinjektion mit in Aceton
getrockneter Brucellae wird eine Testreihe von 60 Tieren benutzt, wobei jede Reihe
der Testgruppen aus 15 Tieren besteht, die gleichzeitig gemäß dem folgenden Schema,
in welchem a Mikrogramm bedeutet, behandelt werden: Testgruppe I: Erste Impfung
mit 0,05 ccm Depotimpfstoff pro Maus intrakutan. 10 Tage später eine zweite Impfung
mit 20 γ des zu prüfenden Antigens intraperitoneal in 0,2 ccm Flüssigkeit.
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Testgruppe II: Erste Impfung wie in Gruppe I. 10 Tage später eine
zweite Impfung mit 10y des zu prüfenden Antigens intraperitoneal in 0,1 ccm Flüssigkeit.
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Testgruppe III: Erste Impfung wie in Gruppe I. 10 Tage später Impfung
mit 5 γ des zu prüfenden Antigens intraperitoneal in 0,05 ccm Flüssigkeit.
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Testgruppe IV: Erste Impfung wie in Gruppe 1. Keine weitere Impfung.
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22 Tage nach der ersten Impfung, also 12 Tage nach der zweiten Impfung,
werden die Testtiere jeder Versuchsreihe versuchsmäßig infiziert. Für die Infizierung
wird eine 60 Stunden alte Tryptoseagarkultur von Brucella abortus, Form, Stamm Schaedtbeck,
verwendet.
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Fünf Mäuse erhalten 2,5-105 Mikroorganismen pro Maus, weitere fünf
Mäuse erhalten 5 10G Mikroorganismen pro Maus, und fünf Mäuse erhalten schließlich
1 106 Mikroorganismen pro Maus intravenös in jedem Fall. 4 Tage nach der versuchsmäßig
durchgeführten Infektion wurden alle Testtiere getötet, ihre Milz herausgeschnitten
und zur erneuten Isolierung der Mikroorganismen auf Agarschalen aufgetragen. Es
wird die Anzahl der erfolgreich infizierten Tiere und die Anzahl der erneut isolierten
Mikroorganismen pro Milz bestimst und klassifiziert gemäß den Daten der Impfung
und der Testinfektion.
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Als Kriterium wurde der durchschnittliche-Logarithmus der Anzahl der
erneut isolierten Mikroorganismen pro Milz für jede Testinfektionsdosis und jede
Impfungsdosis bestimmt. Diese Anzahl, der »Infektionsgrad«, ist in einer entsprechenden
Tabelle neben der Anzahl der voll geschützten Tiere (= keine erneute Isolierung
von Brucella abortus aus der Milz) angegeben (s. Daten der Tabellen I bis III).
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Dies zeigt, daß das Antigen A1 in Dosen von 20, 10 und 5 γ
eine bestehende Immunität verstärken kann. Die Impfung mit A1 verleiht vollständigen
Schutz bei einer Anzahl von Testtieren gegen eine Testinfektion mit 2,5 105, 5.
106 bzw. 1 106 Brucellae. Die Gesamtzahl der geschützten Tiere gegen alle Impfdosen
und Testinfektionsdosen beträgt 26 von 45, d. h. beinahe 58 %.
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Im Gegensatz dazu beträgt die Gesamtanzahl geschützter Tiere gegen
alle Impfdosen und Testinfektionsdosen unter Verwendung der mit Aceton getrockneten
Brucellae als immunisierendes Agens 13 von 45, d. h. etwa 290/o.
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Tabelle I
| Tostgruppe |
| I II III IV |
| Antigendosis |
| 20γMaux 10γ/Maus 5γ/Maus 0γ/Maus |
| Testinfektionsdosis (Br. pro Maus) |
| 2,5 # 105 5 # 106 1 # 106 2,5 # 105 5 # 105 1 # 106 2,5 # 105
5 # 105 1 # 106 2,5 # 105 5 # 105 1 # 105 |
| Anzahl der geprüften Tiere 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 |
| Anzahl der geschützten |
| Tiere 3 2 1 0 2 2 3 0 0 0 0 0 |
| 0/o der geschützten Tiere .. 60 40 20 0 40 40 60 0 0 0 0 0 |
| Infektionsgrad: |
| log der erneuten Iso- |
| lierung pro Milz - 0,99 1,87 2,13 1,66 1,68 2,04 0,96 2,36
2,17 3,20 3,31 3,28 |
| Anzahl der geprüften Tiere 15 15 15 15 |
| Anzahl der geschützten |
| Tiere 6=4001o 4=26,7Gb 3 = 20°/0 0=00/o |
Gesamtanzahl der geschützten Tiere nach Impfüng mit in Aceton getrockneter Br. =
13 von 45 / 28,9 0Io.
Tabelle II
| Testgruppe |
| I II III IV |
| Antigendosis |
| 20γ/Maus 10γ/Mous 5γ/Maus 0γ/Maus |
| Testinfektionsdosis (Br. pro Maus) |
| 2,5 # 105 5 # 106 1 # 106 2,5 # 106 5# 106 1 # 105 2,5 # 105
5 # 106 1 # 106 2,5 # 105 5 # 105 1 # 106 |
| Anzahl der geprüften Tiere 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 |
| Anzahl der geschützten |
| Tiere ............................... 5 2 3 4 4 3 3 0 2 1 0
0 |
| %der geschütztn Tiwere .. 100 40 60 80 80 60 60 0 40 20 0 0 |
| Infektionsgrad: |
| log der erneuten Iso- |
| lierung pro Milz 0 1,72 0,78 0,51 0,47 1,32 0,74 1,58 0,83
1,26 2,79 2,7 |
| Anzahl der geprüften Tiere 15 15 15 15 |
| Anzahl der geschützten |
| Tiere.. . 10 = 66,70/o 11 = 73,50/o 5 = 33,3% 1 = 6,7% |
Gesamtzahl der geschützten Tiere nach Impfung mit Antigen A1 = 26 von 45 / 57,8
0/o.
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Tabelle III
| antigenfraktion |
| Br.abortus A1 Kontrolle |
| Mit Testinfektionsdosis |
| von 2,5 106 Br.: voll geschützte Tiere (6/15) [1] (12/15) (2/25) |
| 40% 805 13% |
| Infektionsgrad (log der erneuten Isolierung pro Milz) 1,20
i 0,31 [2] 0,41 i 0,24 2,03 i 0,23 |
| Mit Testinfektionsdosis |
| von 5 106 Br.: voll geschützte Tiere ... .. (4/15) (6/15) (0/25) |
| 270/o 400/o oolo |
| Infektionsgrad (log der erneuten Isolierung pro Milz) 1,91
i 0,37 1,25 i 0,32 2,78 i 0,23 |
| Mit Testinfektionsdosis |
| von 1# 106 Br.: voll geschützte Tiere .................. (3/15)
(8/15) (0/25) |
| 20 0/o 53 0/o 00/o |
| Infektionsgrad (log der erneuten Isolierung pro Milz) 2,12
i 0,38 0,95 i 0,33 3,10 i 0,19 |
| Gesamtsumme aller Testinfektionsdosen ................... (13/15)
(26/45) (2/75) |
| % der geschützten Tiere. . 28,8% 57,8% 2,7% |
[1] Anzahl der geschützten Tiere 1 AnzahldergeprüftenTiere.
-
[2] Standardabweichung.
-
Immunogene Eigenschaften des Antigens A12 Das Antigen A12 wird an
CFW-Mäusen auf seine immunisierende Wirkung geprüft. Im Gegensatz zu dem Test mit
dem Antigen A1 wird die unmittelbare Immunisierungswirkung von A12 ohne vorherige
Impfung mit Depotimpfstoff geprüft. Zu diesem Zweck werden 40 Versuchstiere aus
jeder Versuchsgruppe gleichzeitig gemäß dem folgenden Schema behandelt: Testgruppe
I: Erste Impfung mit 20 y A12 pro Maus intrakutan in 0,05 ccm Flüssigkeit. 10 Tage
später zweite Impfung mit derselben Dosis intrakutan.
-
Testgruppe II: Erste Impfung mit 2 y A12 pro Maus intrakutan in 0,05
ccm Flüssigkeit. 10 Tage später zweite Impfung mit derselben Dosis intrakutan.
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Testgruppe III: Keine Impfung.
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24 Tage nach der ersten Impfung, also 14 Tage nach der zweiten Impfung,
werden die Testtiere jeder Testgruppe versuchsmäßig infiziert. Für diese Infektion
wird eine 48 Stunden alte Tryptoseagarkultur von Brucella abortus, S-Form, Stamm
Schaedtbeck, verwendet. Zehn Mäuse aus jeder Testgruppe erhalten 5 # 104 Mikroorganismen
pro Maus, weitere zehn Mäuse erhalten 1 # 105 Mikroorganismen pro Maus, zehn Mäuse
erhalten 2 # 105 Mikroorganismen pro Maus und schließlich zehn Mäuse 5. 106 Mikroorganismen
pro Maus, alle intravenös.
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4 Tage nach der Testinfektion werden alle Versuchstiere getötet,
ihre Milz herausgeschnitten und die Teste wie beschrieben für das Antigen A1 durchgeführt
(s. hierzu Tabelle IV).
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Insgesamt kann festgestellt werden, daß das Antigen A1 und das Antigen
A12 starke immunogene Eigenschaften im Vergleich zur in Aceton getrockneten Brucella
besitzen. Die Antigene sind im wesentlichen reine Glycolipoproteine, die dazu verwendet
werden können, eine Immunität gegen Brucelluloseinfektion zu verleihen.
Tabelle
IV
| Testgruppe |
| I II II |
| Antigendosis |
| 20γ/Maus 2γ/Maus 0γ/Maus |
| Mit Testinfektionsdosis |
| von 5. 104 Br.: voll geschützte Tiere ................. 500/o
(5/10) 1000/o (10/10) 60% (6/10) |
| Mit Testinfekfektionsadosis |
| von 1 # 105 Br.: voll geschützte Tiere ............... 90 %
(9/10) 100 % (10/10) 40 % (4/10) |
| Mit Testinfektionsdosis |
| von 2 # 105 Br.: voll geschützte Tiere Do °/0 900/o (9/10)
900/o (9/10) 200/o (2/10) |
| Mit Testinfektionsdosis |
| von 5 # 105 Br.: voll geschützte Tiere ................. 00/o
(0/10) 20 20°/o (2/10) 0% (0/10) |
| Gesamtzahl der geschützten Tiere gegen alle Test- - |
| infektionsdosen ................................ 57% (23/40)
77% (31/40) 30% (12/40) |
Tabelle IV zeigt deutlich, daß Antigen A12 eine aktive Immunisierungswirkung hat.
2γ sind wirksamer als 20 y von A12.
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Vergleichende Agglutinationstiter Die agglugenische Wirkung des Antigens
A12S wird an Kaninchen erprobt, und die Agglutinationstiter werden nach einer Dosis
Antigen bestimmt Kaninchen von demselben Wurf und einem Alter von 10 Wochen mit
einem Gewicht von 2 kg dienen als Versuchstiere. Ein Kaninchen wird für jede Dosis
des zu prüfenden Antigens verwendet. Die Antigene
werden in steriler physiologischer
Kochsalzlösung gelöst und dann in die Ohrrandvene der Versuchstiere injiziert. Die
Blutentnahme, die Herstellung des Serums und die Bestimmung des Agglutinationstiters
geschehen in üblicher Weise. Die Versuchsergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle
aufgeführt. Zum Zweck des Vergleichs enthält diese Tabelle auch Werte, die mit in
Aceton getrockneter Br. abortus S und mit Antigen A1 bestimmt wurden.
| Agglutinationsitier |
| Dosis |
| (Tage nach Injektion von Antigen) |
| y/kg 6 Tage l 7 Tage l 10 Tage # 11 Tage |
| 50 1:50 |
| 25 1:50 0 |
| A12S .......................................... # |
| 5 0 0 |
| 40 1:320 1:320 |
| Mit Aceton getrocknete Br. abortus S ... # |
| 100 1:1280 1:1280 |
| 10 1:80 1:160 |
| A1 .......................................... |
| 50 1:1280 1:1280 |
Die Verabreichung von # 10 γ von A12S pro Kilogramm Kaninchen führt nicht
zur Bildung von Agglutininen.
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Eine geringe und schnell verschwindende Agglutininbildung wird beobachtet,
wenn 25y von A12 5 pro Kilogramm verabreicht werden. Eine Injektion von 50y A12S
pro Kilogramm führt zu einem Titer von nur 1: 50 am 7. Tag. Andererseits führen
50 γ A1 pro Kilogramm zu einem Agglutinationstiter von 1: 1280 am 6. Tag.
Eine Injektion von 40 y in Aceton getrockneter Brucella pro Kilogramm führt zu einem
Titer von 1: 320. Gemäß diesen Versuchsergebnissen zeigt Antigen A12S eine viel
weniger ausgeprägte agglugenische Wirkung als entweder A1 oder acetongetrocknete
Brucella. Ähnliche Ergebnisse werden erhalten für das Antigen A12Ü wie für das A12S.
Dies zeigt, daß das Glycolipoidprotein A12 von agglugenischen Komponenten umfassend
befreit ist.
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Bei einem anderen Versuch werden Kaninchen intravenös injiziert mit
5 bis 80 Mg A12S pro Kaninchen, wie in untenstehender Tabelle angeführt, und die
Agglutinationstiter werden mit jenen verglichen, die man aus acetongetrockneten
Brucella abortus-S-Zellen erhält. Die Versuchstiere sind 4 Monate alt und gehören
zum Stamm der »Weißen Wiener«. Die zweiten intravenösen Injektionen werden 3 Wochen
nach der ersten Impfung mit 5 ,ug desselben Antigens pro Tier durchgeführt. Zur
Bestimmung der Agglutinationstiter wird Blut von der Ohrrandvene der Tiere in nachfolgend
genannten Zeitabständen abgenommen: 14 Tage nach der ersten Impfung und 2 und 3
Wochen nach der zweiten Impfung.
| Agglutinationstiter |
| Tiergewicht - Antigen Erste Impfdosis 2 Wochen 2 Wochen 3 Wochen |
| nach der ersten nach der zweiten nach der zweiten |
| Impfung Impfung* Imprung* |
| 2850 A12S 5 -1:25 1: 10 1: 10 |
| 2765 A12S 10 1:25 1:10 1:10 |
| 2735 A12S 20 1 : 25 1: 10 1: 10 |
| 2735 A12S 40 1:25 1:10 1:10 |
| 2500 A12S 80 1:25 1:10 1:10 |
| 3075 getrockneteBr. abortus S 20 1: 400 1: 640 1: 640 bis 1280 |
| 3175 getrocknete Br. abortus S 40 1 : 400 bis 800 1: 320 bis
640 1: 320 bis 640 |
| 3170 getrocknete Br. abortus S 80 1: 1600 1: 640 1: 320 |
* Eine Einheitsdosis von 5 yg des entsprechenden Antigens wird, auf die zweite Impfung
jedem der Versuchstiere auf dem Wege der intravenösen Verabreichung gegeben.
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Wie aus den aufgeführten Werten geschlossen werden kann, führt eine
einzige Injektion von A12 in Mengen von 5 bis 80 y pro Kaninchen nicht zur Bildung
von bedeutsamen Agglutinationstitern. Im Gegenteil, eine einzelne Injektion von
entsprechenden Dosen getrockneter Br. abortus S führt zu Agglutinationstitern bis
zu 1: 1600. Des weiteren ergeben sich unbedeutende Agglutinationstiter in den Seren
von Kaninchen, die eine zweite Impfung (5y) von A12S 3 Wochen nach der ersten Impfung
erhalten.
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Die neuen Antigene nach dem Verfahren der Erfindung werden je nach
Bedarf in Form steriler Lösungen oder Suspensionen in bekannten Behältnissen verwendet,
wie sie zur Anwendung biologischer Produkte in Form injizierbarer Substanzen benutzt
werden.
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Dies kann z. B. destilliertes Wasser oder physiologische Salzlösung,
d. h. Natriumchlorid in Wasser in einer Konzentration von etwa 0,85 bis etwa 0,90
0/o, sein.
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Wäßrige Mischungen aus Wasser und Benzylalkohol können ~ als partielle
Träger in Kombination mit anderen Salzen benutzt werden, wie sie allgemein bei der
Herstellung injizierbarer Lösungen Anwendung finden, wie z. B. Alkali- und Erdalkalimetallsalze
mit einem Anion, wie Phosphat, Chlorid, Sulfat usw., die natürlich nicht toxisch
und voll verträglich in physiologischer Hinsicht mit dem Tierkörper sind. Das wesentliche
Erfordernis bei der Herstellung injizierbarer Substanzen mit den neuen Antigenen
besteht darin, daß man das Endpräparat isotonisch macht, obgleich dies kein außerordentlich
bedeutsamer Faktor ist, wenn die Injektionen an großen Tieren vorgenommen werden.
Im Fall der Anwendung bei kleinen Tieren ist dieser Faktor jedoch zu beachten. In
dieser Beziehung ist es zweckmäßig, das Antigen mit einer geringen Menge eines Lokalanästhetikums
zu kombinieren, das mit den antigenischen Komponenten verträglich ist, wie z. B.
Novocain. Die Konzentration des Antigens im Endpräparat wird nach bekannten Standardmethoden
bestimmt. Es ist wichtig zu beachten, daß die Antigendosis einen bedeutsamen Faktor
zur Verleihung der Immunität darstellt.
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Es wurden Maßnahmen beschrieben, die die Isolierung des immunogenen
Faktors in einer im wesentlichen reinen Form bewirken, abgetrennt von den weniger
wünschenswerten agglugenischen und toxischen Komponenten, die keine Faktoren zur
Herbeiführung der Immunität im Tier darstellen. Deshalb wird der Reinheitsgrad der
immunisierenden Substanz, die bei der Durchführung des Verfahrens der Erfindung
erhalten wird, in großem Maße maßgeblich sein für die Antigenkonzentration des Endpräparats.
Deshalb ist es klar, daß Standardisierungsmaßnahmen erforderlich sind und schließlich
auch der Bestimmungsfaktor bei der Herstellung des Erzeugnisses. Die Beispiele für
wertvolle Antigenpräparate sind zwecks Erläuterung angegeben und sollen die Erfindung
in keiner Weise, auch nicht in bezug auf die Konzentration des Antigens, beschränken.