DE2315563A1 - Biologische zubereitungen und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

DR. BERG DiPi..-ING. STAPF

PATEHTANWÄLT5 8 MÜNCHEN 86. POSTFACH 86O2 48

Dr. Berg Dipl.-Ing. Stapf, 8Mönd»n Si, P.O.Box 860245

Ihr Zeichen Your »f.

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Ourwf. 23 655

• MDNCHEN W

45 28. i-larz 1973

Anwaltsakte-ilr.: 23 655

TIiE IiELLCOI-IE FOUNDATION LIMITED London, H.V/. 1/ Großbritannien

"Biologische Zubereitungen und Verfahren zu ihrer Herstellung"

Die vorliegende Erfindung betrifft Pasteurella multocida- und Pasteurella haeiuolytiea-Antipjene und insbesondere Vasteurella multocida- und Pasteurella haerao^tica-Anti-,enedie für eine Iramunisierun<£ von Säugetieren und Vögeln jeijen häraorrhacische Sepsis und andere Krankheiten

λ/Ii

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und Syndrome von Haustieren, die in Verbindung stehen mit oder verursacht sind durch Pasteurella niultoc.ida oder Pasteurella haeruolytica, geeignet sind.

Die Eigenschaften von gewissen Pasteurella multocida (nachstehend als P. multocida bezeichnet)-Antigene wurden im Verlaufe einer Reihe von Jahren untersucht. Die gegemträrtig verfügbaren Vakzinen sind ganz allgemein Vakzinen mit vollständig abgetöteter Kultur. Zusätzlich wurden verschiedene Fraktionen aus gewissen P. multocida-Zellen isoliert und zur Immunisierung von Tieren mit nicht zufriedenstellenden Ergebnissen angewandt. Unter den.so verwendeten Fraktionen waren- Protein-_s Lipopolysaceharid-Protein-Komp-lex- und Kohlehydrat-Protein-Fraktionenj und es haben verschiedene Autoren zu verschiedenen Zeiten die Immunο^eηIzitat von P. multociua-Typ I (Klassifikation nach R-., 8. Roberts ₃ J. Comp. Path. 57 ₅ 261 (IShJ)j ferner auch die weiter unten folgenden Ausführungen) einer jeden der vorerwähnten Fraktionen und/oder Kombinationen derselben₃ zugeschrieben. Jedoch hat sich bis auf den heutigen Ta.v; gezeigt ₅ daß verfügbare Vakzinen₃ welche Substanzen enthalten, die von Proteinen verschieden sind, toxisch oder in einer=: .,röteren oder i,e- ringerem Ausmaß unwirksam sind.

Es wurde nun _oefunden, daß es möglich ist, eine iminunisie-

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rende Substanz zu schaffen, die für eine Anwendung zur Verleihung von Immunität bei einen Säugetier oder einem Vo^eI ge^en Pasteurellosis_; die von einer Infektion mit P. nultocida oder P. haemolytica herrührt, geeignet -ist, wobei diese Substanz aus kapsulären, bakteriellen, im Wachstum abweichenden Tochterkolonien (Varianten) von P. multocidapder P. haemolytica erhalten werden kann und im wesentlichen frei von der mit Endotoxin verbundenen Toxizität ist.

Endotoxin ist eine Komponente der Zellwand von gramnegativen Organismen, die für viele der nachteiligen pharmakologisehen Effekte bei Säugetieren und Vögeln verantwortlich ist, denen intakte Seilen, gewisse Fraktionen derselben oder gewisse ₅ kommerziell und experimentell eingesetzte Vakzinen injiziert wurden. Die genaue Natur der Endotoxin-Komponente ist Gegenstand von Kontroversen₅ jedoch wird allgemein angenommen, daß sie ein Lipο-ροIysaccharid ist.

Die immunisierende Substanz der vorliegenden Erfindung ist unter anderem durch die nachfolgenden eigenschaften gekennzeichnet :

a) Erhältlich aus einer verkapselten Variante eines Serotypsausgewählt aus P. multocida- und P. haemolytica-Serotypen_s wobei der Serot?/p den Typ entspricht, gegenüber welcliei.; durch die erv/ähnte Substanz Inmunität verliehen werden

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b) nicht-toxisch bei Säugetieren UnU₁ Vögeln bei der immunisierenden Dosis der erwähnten Substanz, welche Dosis eine Immunität gegen eine natürliche Infektion durch P. multocida oder P. haemolytica schafft; " »

c) antigenisch stabil in Wasser bei 1ÖO°C während 10 'Min.;

d) nieht-dialysierfähig;

e) wasserlöslich und vorzugsweise von einer Löslichkeit in destilliertem Wasser von zumindest 20 mg/ml; und

f) im wesentlichen entfernt von nicht verkapselten Varianten von P. inultocida und P. haemolytica.

Wünschenswerterweise hat die immunisierende Substanz eine Toxizität von weniger als einem Zehntel der Toxizität einer Kultur von verkapselter P. multocida oder "P. haemolytica, aus welcher das Endotoxin nicht.entfernt worden ist; vorteilhaft erweise weniger als ein Hundertstel und insbesondere bevorzugt weniger als ein Tausendstel der Toxizität einer solchen erwähnten Kultur. Dementsprechend hat die immunisierende Substanz vorzugsweise ein LD^₀ von mehr als 10 yg in Hühner-Embryos _s wenn sie "nach dem Verfahren von K. L. Milner und R. A. Winkelstein, J. Inf. Pis, ₍ 11&, 529 (1966) bestimmt wird; eine reaktive Dosis von mehr als 2 ug' in der lokalisierten Shwartzman Reaktion (L. Lee & CA. Stetson, J. Exp. Med. 111, 76I (i960); einen pyrögenen Index, bei Kaninchenj von weniger als 20 nach der Bestimmung durch

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.das Verfahren von K. L. Milner & R.A. Pinkelstein, J. Inf. Dis. 116 _s 529 (1966) unter Verwendung einer Dosis von 5 IJg; und eine Letale Dosis für Kaninchen,wenn mehr als 1 mg intravenös injiziert wird. Alle vorstehenden Gewichte beziehen sich auf dialysiertes und gefriergetrocknetes Material.

Ausser der Stabilität der Antigen-Eigenschaften in Wasser während 10 Min. bei 100 C₃als auch der Stabilität der Lös-Iichkeitseigenschaften darin, sind die Antigen-Wirkung und die LösIichkeitseigenschaften der immunisierenden Substanz unter solchen Protein-denaturierenden Bedingungen stabil wie rasches Mischen in 45 % Vol./Vol. wässerigem Phenol bei 66⁰C oder Behandeln im Autoklav 5 Min. lang bei 1,05 kg/ era .

Die immunisierende Substanz hat amen Molekulargewichtsbereich

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zwischen 10 und 10 , und vorzugsweise von mehr als 10 , wenn das ilolekulargewicht durch Gelchromatographie in Sephadex (Handelsname ₃ Pharmacia Ltd. Uppsala, Schweden) bestimmt wird (T.P. Kins* Seite 135, "Ilethods in Immunology and Immunoehemistry" _s Vol.2, Ed. CA. Williams and 'M.W.Chase; 1968 Academic Press, ϊ-Jew York & London). Daß die nicht immunisierende Substanz nicht dialysiorfähiü ist, deutet darauf liin, daß'sie ein Molekulargewicht von größer als 10 besitzt.

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Obwohl P. raultocida- und F.. haemo:lytica--Zellen eines "beliebigen, verkapselten Stammes als Quelle für die immunisierende Substanz eingesetzt werden können_Ä ist der Stamm vorzugsweise ein solcher, der an irgendeinem gegebenen Ort_a in welchem die immunisierende Substanz eingesetzt werden soll, vorherrschend ist. Dementsprechend, ist in den: FaIl₃ wo Vakzinen .für eine Verwendung in Europa und Nordamerika zur Prophylaxe von Geflügelcholera von Vögeln, Schiffsfieber (shipping fever) und Pasteurella pneumonia bei Großvieh, bzw. Rindviehj und anderer Krankheiten oder Syndrome₃ verbunden mit oder verursacht durch Pasteurellae, vorgesehen sind, der als Quelle der kapsulären immunisierenden Substanz ausgewählte PasteureHa-Serotyp ein solcher,, der bereits bei Geflügelcholera, Schiffsfieber, Pasteurella pneumonia oder einer der anderen Krankheiten oder Syndrome_a die durch Pasteurellae-Ärten, der Reihe nach, verursacht werden₃impliziert ist.

Leider liegt noch keine vollständig zufriedenstellende und universell annehmbare Klassifikation von Pasteurella-Serotypen vor. Jedoch wurde gefunden, daß die in Europa und Wordamerika vorherrschenden Serotypen den Typen A und D nach der Klassifikation von G.R. Carter, Amer.. J. Vet. Res. 16_, 481 (1955) entsprechen; Typen III und IV nach der Klassifikation von R.S. Robert, J. Comp. Path. 57, 261 (194?)

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und Typen I und III der Klassifikation von P.A.Little und 3.M. Lyon, Amer. J. Vet. Res. _4, 110-112; (1943). Es wurde festgestellt j daß.die vorherrschenden Serotypen in Afrika und Asien den Typen B und E nach der Klassifikation von G.R. Carter, Amer. J. Vet. Res. 16_₃ 481 (1955) entsprechen. Typ I der Klassifikation von R.S. Robert, J.Comp. Path. 57, 261 (1947), und Typ II der Klassifikation von P.A. Little und B.M. Lyon, Amer. J. Vet. Res. 4_, 110-112, (1943).

Aus Gründen der Bequemlichkeit und der Kürze wird nachstehend lediglich die Klassifikation nach G.R. Carter angewandt, jedoch sei hierzu bemerkt, daß die Bezugnahme auf die Serotypen der Klassifikation nach G.R. Carter in gleicher Weise auf die entsprechenden Serotypen der anderen Klassifikationssysteme passen, die weiter oben angegeben sind und es können diese nachstehend ebenfalls angewandt werden.

Die immunisierende Substanz kann aus verkapselten P. multocida- oder P. haemolytica-Sellen durch chemische Fraktionierung der verkapselten Zellen von P. multocida oder P. haeiaolytica, oder aus einem Lysat derselben oder aus einem Medium, in welchem die verkapselten Zellen kultiviert worden sind, isoliert werden.

Dementsprechend schafft die vorliejende Erfindung in anderer

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Hinsicht ein Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung, geeignet für die Formulierung als Vakzine zur Immunisierung eines Säugetiers oder eines Vogels gegen Pasteurellosis, wobei das Kultivieren von verkapselten P.multocida- oder P. haernolytica-Zellen zur Ausbildung einer Kultur von verkapselten P. multocida- oder P, haemolytica-Zellen umfaßt wird; die chemische Ausfällung von Endotoxin aus der Kultur, dem Medium oder dem Lysat derselben unter Bildung einer Endotoxin-· freien, überstehenden Flüssigkeit j und Isolierung der Endotoxin-freien, immunisierenden Substanz oder einer Lösung derselben aus der Endotoxin-freien, überstehenden Flüssigkeit. Der vorstehend verxvendete Ausdruck "Endotoxin-frei" "bedeutet im wesentlichen frei von mit dem Endotoxin verbundenen Toxizität.

P. multocida- oder P. haemolytica-Zellen können anfänglich aus dem infizierten Blut, anderen Körperflüssigkeiten und Geweben von Säugetieren und Vögeln,, welche an hämorrhagiseher Sepsis, Schiffsfieber, Geflügelcholera oder anderen zugehörigen Pasteurellosen leiden» erhalten werden. Das infizierte Blut oder andere Körperflüssigkeiten und Gewebe können zum Zwecke der Lagerung bequemerweise gefriergetrocknet werden^ jedoch wird es vorgezogen,sie in flüssigem Stickstoff zu lagern.

Als Ausgangsmaterial für die Herstellung der Fraktion kann

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eine beliebige Kultur der verkapselten Organismen, hergestellt nach bereits bekannten Verfahren, verwendet werden. Vorteilhafterweise wird infiziertes Blut oder passend rekonstituiertes infiziertes Blut anfänglich mehrere Stunden auf der Oberfläche eines Nährmediums ₃ beispielsweise iiähr-Agar, kultiviert. Die verkapselten Zellen von P.multocida oder P. haemolytica können dann durch ihr Irisieren bei der Betrachtung in se'hräg einfallendem Licht identifiziert werden .

Die irisierenden Zellkolonien werden dann von der Oberfläche des iiährraediums entfernt und in einem sterilen Medium wie nachstehend beschrieben kultiviert, bequemerweise bis zum Ende der logarithmischen Wachstumsperiode, oder vorzugsweise bis die maximale Ausbeute an verkapselten! Material erhalten wird.

Das Kultivieren von verkapselten P. multocida- oder P. haemolytica-Zellen kann mittels herkömmlicher Techniken durchgeführt vier den. So können die Zellen in irgendeinem Medium kultiviert werden, welches das Wachstum unterstützt, vorzugsweise jedoch in einem belüfteten Medium, d. h. in einem Medium, durch welches sterile Luft durchgeblasen wird. So können beispielsweise die Zellen auf Agar odeifin einem chemisch definierten Medium, wie es von G.E. Wessman und G.Wessman, Can. J. Microbiol. 6£, 751 (1970) beschrieben wird,

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kultiviert werden. Vorzugsweise wird jedoch ein gepuffertes Medium des Typs angewandt₅ wie es von M. Sterne und I. Hutchinson, Brit. Vet. J. 114 _s 116 (1958) beschrieben wurde,

Um die maximale Ausbeute an Organismen in der minimalen Zeit zu erhalten^ ist es wünschenswert.,. Tochterkulturen der Organismen anzulegen, wobei jede Tochterkultur vorzugsweise in der logarithmischen Phase des Wachstums angelegt wird, wobei jedes Kai das Impfmaterial vorzugsweise 10 Vol.-p der nachfolgenden Kultur beträgt. Wahlweise kann das Kultivieren durch ein kontinuierliches .Verfahren -bewirkt werden., beispielsweise durch ein Verfahren des Typs., wie es von M.Sterne und I. Hutchinson, Brit. Vet. J. 114₃ 116 (1958) beschrieben wurde.

Es ist wünschensxArert, daß die Kultur (welche das Kulturmedium und verkapselte Zellen enthält) yor der Fraktionie- ■ rung auf Reinheit und Dissoziation (das ist die Anwesenheit von nicht verkapselten Varianten), beispielsweise durch makroskopische und mikroskopische überprüfung auf dem Agar untersucht wird.

Wenn man die immunisierende Substanz aus dem Kulturmedium zu· erhalten wünscht, läßt man die Kultur mehrere Tage., nachdem das gewünschte Wachstum erzielt worden ist, stehen, um

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dem kapsulären Material aus den verkapselten Zellen ein Entweichen-in das Kulturmedium zu"gestatten.

Die Fraktionierung des Materials₃ welches eine intakte Zeil-Kultur oder ein Lysat derselben ₃ kultivierte Zellen oder ein Lysat derselben, oder ein zellfreies Kulturmedium enthält, wird wie nachstehend beschrieben durchgeführt.

Das gewünschte. Material wird mit einem hydrophilen Lösungsmittel, vorzugsweise.· einem niederen Alkanol oder einem niederen Alky!keton, behandelt, das so lange zugegeben wird, bis man eine Konzentration an hydrophilem Lösungsmittel erhält, -welche ausreicht, im wesentlichen aas gesamte ;2ndotoxin auszufällen, welche jedoch nicht ausreichend ist, die immunisierende Substanz auszufällen.

Es viird so eine Endotoxin-freie überstehende Lösung erhalten. Bevorzugte niedere Alkanol-Lösungsraittel umfassen primäre Alkohole, insbesondere Äthanol und Methanol. Bevorzugte niedere Alky!ketone schließen Aceton und Methyläthylketon ein.

Die optimale Konzentration an hydrophilem Lösungsmittel kann leicht empirisch bestimmt werden, beispielsweise, indeiu man kleine, aliquote Anteile an hydrophilem Lösungsmittel nach-

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einander zu einem wässerigen Medium., welches das zu" fraktionierende Material enthält ₃ hinzugibt und den gebildeten Miederschlag nach der Zugabe eines jeden aliquoten Anteils entfernt. Die Wiederschläge werden zur Ermittlung ihrer Natur (z.B. Toxizität und Iniinunogenizität) überprüft. Auf diese Weise wird die optimale Konzentration von der Anzahl der aliquoten Anteile an hydrophilem Lösungsmittel, welche zur Ausfällung des gesamten Endotoxins ohne Ausfällung der immunisierenden Substanz benötigt werden, abgeleitet. Die optimalen Bedingungen für die Fraktionierung können je nach Spezies und-Stamm der als Quelle für die immunisierende Substanz eingesetzten Organismen von P. multocida oder P. haemolytiea, variieren. ■

So wird beispielsweise in dem Fall, wo Methanol als hydrophiles Lösungsmittel für die Ausfällung von Endotoxin eingesetzt wurde, die optimale Methanol-Konzentration im Bereich von 50 bis 80 % Vol./Vol. liegen, wenn Zellen der Typen B oder E (nach der Klassifikation von Carter) eingesetzt worden sind, und im Bereich von 30 bis 55 $-'Vol./Vol. liegen, wenn Zellen der Typen A oder D (nach der Klassifikation von Carter)eingesetzt werden. ~

Wahlweise können anstelle der oben beschriebenen hydrophilen Lösungsmittel Salze verwendet werden, welche in den Hofmeister-

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Reihen hoch liegen, d.h. Salze, welche für das Aussalzen von lyophilen Kolloiden aus Lösungen wirksam sind, wobei ein besonders wertvolles Salz, das in den Hofmeister-Reihen hoch liegt, Ammoniumsulfat ist. Die optimale Konzentration des besonderen Salzes kann leicht empirisch in einer ähnlichen Weise zu der vorstehend- beschriebenen bestimmt werden.

Ss ist erwünscht, die Mischung der Kultur mit dem Salz oder dem hydrophilen Lösungsmittel mehrere Stunden lang stehenzulassen, um eine maximale Ausfällung des Endotoxins zu ermöglichen. Die optimale Zeit dafür.wird selbstverständlich von der Hatur des Salzes oder des hydrophilen Lösungsmittels und der Konzentration derselben, abhängen. Im allgemeinen läßt man die Mischung jedoch zwischen 6 und 24 Std., vorzugsweise eine Zeit in der Größenordnung von 18 Std., stehen. Während dieses Zeitraums wird die Temperatur der Mischung vorzugsweise auf einem Wert von unterhalb 10⁰C, beispielsweise auf eine Temperatur im Bereich von 0 bis 10°C_s wie z.D. bei 4⁰C,gehalten.

Die Endotoxin-freie überstehende Flüssigkeit kann nach irgendeinem konventionellen Verfahren, beispielsweise durch Zentrifugieren, Filtrieren, Dekantieren oder Abhebern, abgetrennt werden.

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■ Die überstehende, Endotoxin-freie Flüssigkeit wird dann ■

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mit einem hydrophilen Lösungsmittel wie ,vorstehend aufgeführt , behandelt, wobei das Lösungsmittel so lange zugegeben wird, bis man eine, zur Ausfällung der immunisierenden Substanz ausreichende Konzentration erhält. Die optimale Konzentration an hydrophilem Lösungsmittel kann leicht empirisch, wie oben beschrieben, bestimmt werden.

Ein besonders wertvolles hydrophiles Lösungsmittel für die Ausfällung der immunisierenden Substanz ist Aceton. Es wurde gefunden, daß eine geeignete Konzentration an Aceton im Bereich von-50 bis 80 % Vol./Vol., und vorzugsweise von 75 % Vol./Vol. an Aceton liegt-, wenn man als Ausgangsmaterial Zellen des Typs B oder E einsetzt.

B'dn anderes wertvolles hydrophiles Lösungsmittel für eine Verwendung zur Ausfällung der immunisierenden Substanz ist Methanol, von dem eine geeignete Konzentration im Bereich von 70 bis 80 % Vol./Vol., vorzugsweise etwa 75 % Vol./Voi. liegt, wenn man als Ausgangsmaterial· Zellen der Typen B oder E einsetzt, und von 40 bis 70 % Vol./Vol.,vorzugsweise von etwa 66 % Vol./Vol., wenn Zellen des Typs A als Ausgangsmaterial verwendet wurden. '

Wahlweise kann die immunisierende Substanz aus der Endotoxin-

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freien_a überstehenden Flüssigkeit durch Zugabe eines Salzes, das hoch in den Hofmeister-Reihen liegt, wie vorstehend beschrieben, ausgefällt werden. Es wird eine höhere Konzentration eines gegebenen Salzes zur Ausfällung der immunisierenden Substanz benötigt, als sie zur Ausfällung des Ehdotoxins allein erforderlich ist. Ein besonders wertvolles SaIz₃ das hoch in den Hofmeister-Reihen liegt,, ist*Ammoniumsulfat. Anstelle einer zweiten Ausfällung mit einem Salz oder einem hydrophilen Lösungsmittel zur Gewinnung der immunisierenden Substanz kann das bei der ersten Ausfällung eingesetzte Salz durch Dialyse, beispielsweise gegen destilliertes Wasser, entfernt werden, wodurch man eine wässerige Lösung der immunisierenden Substanz erhält.

Es ist selbstverständlich einzusehen, daß, obwohl man das gleiche hydrophile Lösungsmittel sowohl für die Ausfällung des Endotoxins zur Gewinnung einer Endotoxin-freien, überstehenden Flüssigkeit, als auch für die Ausfällung der immunisierenden Substanz aus der Endotoxin-freien, überstehenden Flüssigkeit, verwenden kann, die Konzentration eines beliebige^ gegebenen,hydrophilen Lösungsmittels für die Zwecke der zuletzt genannten Ausfällung höher sein wird als für . die Zwecke der erstgenannten Ausfällung. Außerdem besitzen die für die erstgenannte Ausfällung ausgewählten hydrophilen Lösungsmittel im allgemeinen, obwohl nicht unbedingt

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notwendig, eine niedrigere Affinität für Wasser als. Salze' oder hydrophile Lösungsmittel, welche für die letztgenannte Ausfällung eingesetzt werden.

Wünschenswertenteise läßt man die Mischung von Endotoxinfreier, überstehender Flüssigkeit und hydrophilem Lösungsmittel (oder Salz) mehrere Stunden lang stehen., um eine maximale Ausfällung der immunisierenden Substanz zu bewirken. Die optimale Zeit wird selbstverständlich von der Natur der immunisierenden Substanz, dem Fällungsmittel und seiner Konzentration abhängen. Im allgemeinen kann man die Mischung 6 bis 18 Std. lang stehen lassen, vorzugsweise in der Größenordnung von-,12 Std., und man hält sie auf einer Temperatur von unterhalb 10°C, beispielsweise auf einer Temperatur im Bereich von 0 bis 10°C_s wie z.B. auf 4°C.

Die überstehende Flüssigkeit kann nach irgendeinem herkömmlichen Verfahren, beispielsweise durch Zentrifugieren, Filtrieren, Dekantieren oder Abhebern, abgetrennt werden. V/ünschenswert erweise werden restliche Spuren von Salz oder hydrophilem Lösungsmittel durch herkömmliche Mittel be- _a seitigt. Im Falle eines flüchtigen hydrophilen Lösungsmittels wie z.B. von Aceton, kann dieses bequemerweise mittels Blasen von steriler Luft über den Miederschlag der immunisierenden Substanz beseitigt werden.

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Der Niederschlag der immunisierenden Substanz wird anschließend in einem Lösungsmittel zur Schaffung einer Vakzine von einer beliebigen gewünschten Konzentration wieder aufgelöst und die Vakzine steril und isotonisch mit dem Blut des zu immunisierenden Säugetieres gemacht.

Vorteilhafterweise wird der Niederschlag in einem sterilen Lösungsmittel unter aseptischen Bedingungen aufgelöst. Die Sterilisierung der Injektionslösung kann durch irgendeine herkömmliche Technik, beispielsweise durch Membranfiltra- ' tion durch ein Millipore (eingetragenes Warenzeichen)-QS-Filter mit einer Porengröße von 0,22 μ bewirkt werden. Die Injektionslosung kann nach irgendeiner herkömmlichen Technik isotonisch gemacht werden, beispielsweise mittels Dialyse ge^en eine Salzlösung* welche mit dem Blut des zu immunisierenden Säugetieres isotonisch ist. Es kann ein beliebiges Lösungsmittel, das für die Verwendung als Immunisationsmediurn geeignet ist, angewandt werden, z.B.. eine Salzlösung (0,35 /» ßexr./Vol. wässeriges natriumchlorid) oder isotonischer Phosphatpuffer.

Die so erzeugte Vakzine kann entweder als Konzentrat, das eine Verdünnung erfordert, oder als Vakzine, die fertig für den Gebrauch ist, hergestellt werden. Im letzteren Fall liegt die Konzentration an immunisierender Substanz wünschenswer-

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terweise im Bereich von 1 bis 100 ing/ml, vorzugsweise in der Größenordnung von 10 rag/ml an immunisierender Substanz in der Immunisationslösung.

Ein geeigneter Dosisbereich'an immunisierender Substanz für die Verwendung bei der Immunisierung gegen Pasteurellosis liegt im Bereich von 1 bis 100 mg, vorzugsweise von 2- bis 20 mg j und im Falle der Typen B und Ξ ist ei'n Viert von mg besonders erwünscht. Wünschenswerterweise liegt das Volumen einer Einzeldosis im Bereich von 0,1 bis 10 ml an immunisierender Lösung, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 5 ml, und besonders bevorzugt bei etwa 2 ml.

Für die Verabreichung der Vakzine der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiger Verabreichungsweg gewählt werden, und es wird selbstverständlich die exakte Natur der Vakzine von dem Wege abhängen,, auf welchem sie zu verabreichen ist. Vorzugsweise wird die Verabreichung durch Injektion bewirkt, bevorzugt durch intramuskuläre oder subkutane Injektion.

Falls gewünscht, kann ein Ädjuvans in der Injektionslösung, enthalten sein. Es können beliebige herkömmliche Adjuvantien eingesetzt werden, obwohl Aluminiumsalze bevorzugt werden, wie z.B. Aluminiumhydroxid-ßel, beispielsweise Alhydrogel (Handelsmarke, Superfos Export Co., Dänemark), das besonders

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wertvoll ist.

Wahlweise kann die immunisierende Substanz als Wasser-inöl-Emulsion formuliert werden, welche die Substanz -in der wässerigen Phase enthält. Wünschenswerterweise enthält eine Vakzine ein lipophiles und/oder ein hydrophiles Emulgiermittel.

Wünschenswerterweise ist in der Injektiönslösung ein Konservierungsmittel, beispielsweise Phenol oder Thiomersalat_s enthalten.

Palis gewünscht, kann die immunisierende Substanz als Komponente einer Vielkomponenten-Vakzine, enthaltend antigenes Material, das aus anderen Organismen herstammt, welche Krankheiten bei Säugetieren und Vögeln verursachen, verwendet werden. So kann die immunisierende Substanz als zusätzliche Komponente in einer Vielkomponenten-Vakzine eingesetzt werden, welche eine Wasser-in-öl-Emulsionszubereitung oder eine Kalialaun-adjuvenierte Zubereitung von einem oder mehreren Clostridium-Antigenen, beschrieben in der britischen Patentschrift 1 143 5^5, enthält. Als weiteres Beispiel kann die immunisierende Substanz als zusätzliche wässerige Komponente in einer Multikomponenten-Vakzine eingesetzt werden, welche eine wässerige Suspension von Rinder-

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Parainf luenzavirus und -Rinder-Adenovirus enthält, re~zeptiert als wasser-in-öl-Emulsionsvakzine.

So kann beispielsweise die immunisierende Substanz,' erhalten aus verkapselten Zellen der Typen B oder E₅ in einer-Anthrax-Spores-Vakzine, wie z.B. "Blanthax" (Handelsname) oder einer Clostridium chauvoei-Vakzine, enthalten sein; oder es kann die immunisierende Substanz, erhalten aus verkapselten Zellen der Typen A oder D, als besondere Komponente in einer Clostridium chauvoei-Vakzine, einer Clostridium septicum-Vakzine, oder einer Vakzine wie z.B. "Plurovax" (Handelsname), enthalten sein.

Dementsprechend schafft daher die vorliegende Erfindung in anderer Hinsicht ein Verfahren zur Immunisierung von Säugetieren und Vögeln gegen Pasteurellosis, welches die Verabreichung einer wirksamen Dosis einer Vakzine wie vorstehend beschrieben, umfaßt. .

Unter gewissen Umständen kann die Ausfällung der immunisierenden Substanz aus der Endotoxin-freien, überstehenden Flüssigkeit, wie vorstehend definiert, weggelassen werden. Beispielsweise kann dort, wo Äthanol für die Ausfällung des Endotoxins zur Gewinnung einer Endotoxin-freien, überstehenden Flüssigkeit, angewandt worden ist, die überstehende Flüs-

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sluice it konzentriert oder von einer vre sent lichen rien^e des ursprünglich anlesenden Äthanols befreit werden, un eine Lösung;, der iiair.unisiarenden Substanz au liefern,, welche nach Verdünnung zur Herstellung einer Injektionslösung wie vorstehend beschriebenj ohne die Isolieruni; der festen, immunisierenden Substanz durch Ausfällung verwendet werden kann.

Außerdem kann der Fachmann ohne weiteres ersehen, daß die rindotoxin-freie, immunisierende Substanz der vorliegenden Erfindung aus einer Kultur von verkapselten P. multocida- oder P. haeraolytica-Zellen durch andere herkömmliche Verfahren isoliert x%^rerden kann.

So kann beispielsweise im Falle der Typen B und E das Zentrifugieren einer Kultur, vorteilhafterweise bevor die ZeIl-Lysis in der Kultur eingesetzt hat, zur Entfernung der Zellen und anderer unlöslicher Bestandteile, gefolgt von selektiver Ausfällung der immunisierenden Substanz unter Verwendung einer langkettigen, quartären Ammoniumverbindung, beispielsweise von Cetrimoniumbromid, angewandt werden. Ebenso kann man ein Verfahren verwenden, welches das Zentrifugieren einer Kultur wie oben beschrieben, umfaßt, gefolgt von einer elektrophoretischen Fraktionierung der, durch das Zentrifugieren erhaltenen, überstehenden Flüssigkeit.

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Die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen immunisierenden Substanzen können zu Vakzinen für prophylaktische Verwendung formuliert werden., ohne die Notwendigkeit irgendeiner weiteren Reinigung, insbesondere als eine weitere Reinigung die Kosten, der endgültig hergestellten Vakzinen merklich beeinflussen könnte. Jedoch kann eine weitere Reinigung, falls gewünscht, vor der Formulierung au einer Vakzine' durchgeführt werden, oder zum Zwecke einer Analyse des aktiven Bestandteils der immunisierenden Substanzen.

Vorteilhafterweise können auch zur Reinigung der immunisierenden Substanz j die nach anderen Verfahren isoliert worden ist j .beispielsweise durch Lösungsmittelfraktionierung wie vorstehend beschrieben vorteilhafterweise langkettige, quartäre Ammoniumverbindungen verwendet werden. Eine besonders. wertvoMe quartäre Ammoniumverbindung ist Cetylpyridiniumchlorid. Die langkettige Ammoniumverbindung wird zu einer dialysierten, salzfreien, wässerigen Lösung der irnmunisi er enden Substanz zugegeben, bis sich ein niederschlag bildet. Der Niederschlag wird dann durch herkömmliche Verfahren,· wie z.B. durch Zentrifugieren, abgetrennt. Der Niederschlag kann dann in einer starken Salzlösung,, wie z.B. einer 3™ molaren wässerigen Natriumchlorid-Lösung aufgelöst werden; die Mischung wird dann gekühlt, bis die langkettige, quartäre Ammoniumverbindung auskristallisiert, der kristalline Rück-

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stand anschließend, beispielsweise durch Filtration, entfernt," wodurch man eine Lösung der gereinigten, imunisierten Substanz erhält.

Die gereinigte immunisierende Substanz kann dann aus der Lösung durch herkömmliche Verfahren isoliert werden, wie s.3. durch solche» wie sie vorstehend unter Bezugnahme auf die Herstellung der ungereinigten immunisierenden Substanz beschrieben sind, beispielsweise durch die Zugabe eines primären Alkohols, vorzugsweise von ilethanol, bis zur Ausfällung der immunisierenden Substanz.

Dementsprechend schafft die vorliegende Erfindung noch in anderer Hinsicht:

eine sterile Vakzine, geeignet für die Immunisierung eines Säugetiers oder eines Vogels gegen Pasteurellosis aus einer Infektion mit P. multocida oder P. haemolytica, enthaltend eine immunisierende Substanz mit den vorstehend definierten Eigenschaften, in Verbindung mit einem physiologisch annehmbaren Träger, wobei die Vakzine steril und isotonisch mit dem Blut des zu immunisierenden Säugetieres oder Vogels ist;

ein Verfahren zur Herstellung einer sterilen Vakzine, geeignet für die Immunisierung eines Säugetiers oder ,eines Vogels, das die Stufen des Zusammenbringens einer immunisierenden Substanz mit den oben definierten Eigenschaften mit einem

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physiologisch annehmbaren Träger und das Sterilisieren der Vakzine und das Isotonisieren mit dem Blut des zu immunisierenden Säugetiers oder Vogels> umfaßt; ; eine sterile Vakzine, geeignet für die Immunisierung eines Säugetiers oder eines Vogels gegen Pasteurellosis aus einer Infektion mit,einem Serotyp, ausgewählt aus P. multocida-Typen A und D (Carter), äLen Typen III und IV (Roberts), oder den Typen I und III (Little and Lyon), und P. haemolytica, enthaltend eine immunisierende Substanz mit den oben definierten Eigenschaften, wobei die immunisierende Substanz aus einer verkapselten Variante des genannten Serotyps erhältlich ist; und

eine sterile Vakzine,'enthaltend eine immunisierende Substanz mit den oben definierten Eigenschaften, worin die immunisierende Substanz aus einer verkapselten Variante von P. multocida-Typ A (Klassifikation nach Carter) erhältlich ist, in Verbindung mit einem physiologisch annehmbaren Träger, wobei die Vakzine steril und isotonisch mit dem Blut des zu immunisierenden Säugetiers oder Vogels ist.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung, sollen diese jedoch nicht beschränken.

Beispiel 1

Isolierung von immunisierender Substanz aus verkapselten P. multocida-Zellen vom Typ B

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Eine Ampulle Rinderblut von einem infizierten Tier, das
an hämorrhagischer Sepsis litt, ,mit einem Gehalt von lebenden Zellen von Pasteurella multocida, Stamm 52, Typ B,
wurde aus flüssigem Stickstoff, in welchen sie gelagert
war, entnommen. Die Ampulle wurde aufgetaut und auf Dextrose-Stärke-Agar (Difco) ausgestrichen. Nach Prüfung, daß die
Kolonien bei Schrägbeleuchtung durch das transparente Agar und Betrachtung von oben irisierend waren, wurden von einigen xfenigen Kolonien Tochterkolonien in 10 ml Nährbouillon
(Oxoid) angelegt. Nach einem Wachstum von 6 Std. bei 37 C unter gelegentlichem Schütteln wurde die Kultur (1 ml) als Tochterkultur auf Nährbouillon (100-ml) weitergeimpft. Nach einem Wachstum von 9 Std. wurde diese zu einem sterilen
Medium (5 1) zugegeben, enthaltend die nachstehend genannten Bestandteile:
Medium für das Wachstum:

Autodigest von Ochsen-Pankreas 125 ml

Glucose 3 g

Eisen(III)-citrat.6H₂O 0,1 g

NaH₂PO₄.12H₂O ' 19 g

(wasserfrei) 2,5 g

₂₄ (wasserfrei) 9,2 g

Nährbouillon auf 1 Liter

P_H-Wert 7,1-7,4

Sterilisiert durch EKS-Filterkörper

30.9841/1086

Die Kultur wurde durch eine Durchblasvorrxchtung rait einer Geschwindigkeit von 2 l/Hin, belüftet und das Schäumen durch ein Silikon-Antischaummittel: Antifoam A (20 ml) verhindert. Das Wachstum wurde bei 6-_s 7 und 8 Std. überprüft und, wenn die Geschwindigkeit des Anstieges₃ durch Trübungsmessung gemessen (in OD57O nm), zu fallen begann (bei 8 Std.) das VJachstum durch Abstellen der Luftzufuhr beendet und auf eine Temperatur von 4 C gebracht. Die Kultur (3 D itfurde mit 1 Teil in 10 000 Gew./Vol. Thiomersalat abgetötet, gegen destilliertes Wasser (I50 ml) dialy.siert und gefriergetrocknet. Das Produkt wurde dann in destilliertem Wasser (200 ml) erneut suspendiert und mit Methanol (600 ml) ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Filtration mittels Whatman No. 1 Filterpapier entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit Aceton (2,4 1) gemischt und der sich bildende Miederschlag über Nacht bei 4 C.absitzen gelassen.

Das Aceton wurde abgegossen, das restliche Aceton mittels Blasen von steriler Luft über die immunisierende Substanz entfernt und der niederschlag'erneut in destilliertem Wasser aufgelöst und gefriergetrocknet, wodurch man den Extrakt erhielt, von dem die Eigenschaften nachstehend beschrieben werden.

Eigenschaften

1.. Allgemeines - Der Extrakt war ein blaßgelbes Pulver mit

309841/108 5

~ 27 -

einer Löslichkeit in destilliertem Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung (0,85 % Gew./Vol. wässerigem Natriumchlorid) von zumindest 200 mg/ml und lieferte eine klare gelbe Lösung. Diese hatte eine optische Dichte bei 280 nm von weniger als 0,05 und keinen Peak oder Biegung, gelöst in destilliertem Wasser mit 0,5 mg/ml. In Polyacrylamid-Gel (30 mg/ml Polysaccharid in 7 % Polyacrylamid-Gel) inkorporiert zeigte das Antigen keine Verfärbung mit Färbemitteln wie z.B. Coomassie-Brilliant Blau oder Naphthalin-Schwarz, jedoch verfärbte es sich mit Orthoperjodsäure-Schiff-Färbemittel (ein Kohlehydrat färbemittel) und Aleian*- Blau (ein Färbemittel, das sieh mit Polyanionen kombiniert).

In einem Immunodiffusionstest lieferte dieses Antigen eine Reaktion von vollständig gleicher Identität mit dem gleichen Extrakt, der auch noch mit 45 % Phenol in Wasser bei 66⁰C 20 ilin. lang behandelt worden war und mit Extrakten» die

10 Hin. lang in Wasser zum Sieden erhitzt worden waren.

2. Toxizität - Der Extrakt wurde zur Untersuchung der Toxizität in steriler, Pyrogen-freier Salzlösung in einer Menge von 50 mg/ml gelöst.

Verschiedene Verdünnungen der Lösung wurden intravenös an

11 Tage alte Hühnerembryos injiziert und die Todesfälle nach

309841/1085

- 28 -

18 Std. aufgezeichnet. Es wurde gefunden, daß die LD₁-Q 2,2 mg betrug.

In ähnlicher Weise wurden Verdünnungen in Pyrogen-freier Salzlösung (0,85 % Gew./Vol. wässerigem Natriumchlorid) intradermal weißen Kaninchen injiziert, und 24 Std. später wurden diese durch eine intravenöse Injektion von 100 μg Endotoxin, extrahiert nach der Westphal-Phenol-Wasser-Methode (0. Westphal, Ann. Inst. Pasteur, Paris, £8, 789 (I960)), herausgefordert. Das Vorhandensein oder das Nicht-" vorhandensein von dermalen hämorrhagisehen Nekrosen wurde während der ersten 24 Std. aufgezeichnet.

Es wurde gefunden, daß die sensibxlxsierende Dosis 0,25 g betrug. ·

Die geeignete pyrogene Dosis wurde durch intravenöse Injektion von Verdünnungen wie vorstehend beschrieben, an Kaninchen bestimmt; die rektale Temperatur wurde 5 Std. lang überwacht. Die annähernde pyrogene Dosis betrug etwa 0,1 mg.

3. Antigenizi.tät-Immunogeriizität - Der Extrakt absorbierte 96 % der Maus-schützenden Antikörper aus intakten ZeIl-Antiserum, erzeugt beim Rindvieh durch Immunisierung mit intakter Zeil-Vakzine. Dies, zeigte, den potentiellen Schutz-

309841/1085 . - 29 -

effekt des Extraktes an. Die Absorption wurde durch Inkorporieren von Antigen (250 mg) in Polyacrylamid-Gel nach dem Verfahren von S. Carrel und S. Barundun, Immunochemistry, j3, 39 (1971) bewirkt. Es wurden 12,5 ml Serum absorbiert.

Die Imraunogenizität des Extraktes wurde beim Großvieh (Rindvieh) getestet. 12,5 mg Extrakt wurden in steriler physiologischer Kochsalzlösung (1,5 ml) gelöst und 0,5 ml 25 #-iges steriles Alhydrogel (eingetragene Schutzmarke) zugegeben. Die erhaltene Dosis von 2 ml wurde subkutan in jeweils 2 Kälber und 2 Kühe injiziert. Zwei Wochen später wurden die Injektionen mit der gleichen Dosis vom gleichen Material wiederholt und zwei Wochen später die Immunität der Tiere durch Aderlaß und Verwendung ihrer Sera zur Schützung von Hausen gegen eine Herausforderung untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß auf die vorerwähnte Weise beide Kühe und ein Halb eine beträchtliche Immunität entwickelt hatten.

Die Immunogenizität des Materials bei der Haus wurde ebenso erforscht. Es wurde gefunden, daß eine Dosis von 10 μg Extrakt, ohne Adjuvans subkutan injiziert mit 2 Injektionen, die Io Tage voneinander lagen, und eine intraperitoneale Herausforderung mit annähernd 100 lebenden Organismen, lh Ta^e nach der zweiten Injektion, einen Schutz für 80 % der Mäuse gaben.

309841/1085

- 30 -

Beispiel 2

Herstellung von immunisierender Substanz aus Zellen des· Typs ß ' Die immunisierende Substanz wurde in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme-, daß die Stufen der. Zugabe von Thiomersalat, Dialyse der abgetöteten Kultur und die Gefriertrocknung der dialysierten Kultur, alle weggelassen wurden, da die Zugabe des Methanols selbst ausreichte, die Organismen abzutöten. Die Stufen des Wiederauflösen in destilliertem Wasser, die endgültige Ausfällstufe durch Aceton-Pällung und die Gefriertrocknung der erhaltenen Lösungen, wurden ebenso weggelassen.

Eigenschaften

Der Extrakt hatte die gleichen "Allgemein"-Eigenschaften wie

der Extrakt von Beispiel 1. ' ·

Beispiel 5

Herstellung von immunisierender Substanz aus Zellen des Typs E Die immunisierende Substanz wurde in der gleichen Weise wie die immunisierende Substanz aus Zellen des Typs B, wie dies im vorstehenden Beispiel 2 beschrieben ist, hergestellt, jedoch unter Verwendung lebender Zellen von P. multocida. Stamm E 11, Typ E, als Ausgangsmaterial anstelle der Zellen vom Typ B.

309841H085 - 31 -

2315561

Eigenschaften

Der Extrakt war ein blaßgelber Peststoff. In einem Immunodiffusionstest lieferte dieses Antigen eine Reaktion, die mit der des gleichen Extraktes, der 10 Min. lang in Wasser gekocht worden war, vollständig identisch war.

Beispiel 4 Herstellung und Eigenschaften einer Vakzine

A. Herstellung der Vakzine

Die immunisierenden Substanzen der Beispiele 3 und 1 wurden jede für sich in physiologische^ Kochsalzlösung (10 mg immunisierender Substanz pro ml wässeriger 0,85 % Gew./VoI.-Natriumehlorid-Lösung), enthaltend Thiomersalat (0,013 % Gew./Vol.) als Konservierungsmittel, aufgelöst. Gleiche Volumina der zwei erhaltenen Lösungen wurden gemischt und anschließend durch ein steriles "Millipore" (eingetragenes Warenzeichen)-Celluloseacetat-GS-Filter mit einer Porengröße von 0,22 μ in einen sterilen Behälter filtriert. Anschließend wurde zu der filtrierten Lösung steriles Alhydrogel (Handelsmarke) (bis zu einer Konzentration von 25 % Vol./Vol.) zugegeben, die erhaltene Mischung sorgfältig gerührt und anschließend in sterile Ampullen unter aseptischen Bedingungen eingefüllt.

B. Eigenschaften der Vakzine

Sterilität, Toxizität und Sicherheit. Proben der Vakzine

309841/1085

- "32 -

wurden auf Sterilität, Nicht-Toxizität für LabOratoriumstiere j und Sicherheit für zu immunisierende Säugetiere oder Vögel gemäß den Verfahren der Seiten 81 bis 82 des 1970 Supplement of the British Veterinary Codex (herausgegeben von der Pharmaceutical Society₅ 1965) untersucht, wobei die Proben der Vakzine (2 ml) subkutan verabreicht wurden. Die untersuchten Proben entsprachen allen vorerwähnten Anforderungen, die in dem British Veterinary Codex Supplement niedergelegt sind.

Beispiel 5

Immunisierung von Großvieh (Rindvieh) mit Vakzinen, enthaltend immunisierende Substanzen, isoliert aus verkapselten P. multocida-Zellen des Typs B und.des Typs E

A. Herstellung der Vakzinen - Drei Vakzinen wurden wie in Beispiel 4 hergestellt₃ mit der Ausnahme_s daß die Konzentrationen der immunisierenden Substanzen derart variiert . wurden, daß die fertiggestellten Vakzinen I₉ 5 oder 25 mg von jedem der immunisierenden Substanzen des Typs B und des Typs E pro ml Vakzine enthielten α

B. Immunisierung - An drei Gruppen von jeweils 10 Stück Großvieh wurden" subkutane Injektionen mit einer Dosis (2 ml) aus einer der drei Vakzinen verabreichte

~ 33 -

C. Heraus förderung - Drei '-/ochen nach der Immunisierung' erhielten alle Tiere, als auch eine Gruppe von 10 nicht immunisierten Kontrolltieren jedes eine intravenöse Injektion, welche annähernd ein hundertstel der mittleren letalen Dosis eines virulenten Stammes von P. multocida, Typ E enthielt, d.h. eine Herausforderung ₃ vondsr angenommen wird, daß sie beträchtlich stärker als eine natürlich zugezogene Herausforderung ist. (Die mittlere letale Dosis wurde durch eine vorhergehende Herausforderung von nicht immunisiertem Vieh bestimmt).

D. Ergebnisse

Tabelle I

Schutz von Großvieh gegen experimentelle Herausforderung durch Vakzinen ₃ enthaltend immunisierende Substanzen, erhalten aus verkapselten Zellen von P. multocida der Typen

B und E

Dosis einer jeden Anzahl der die Anzahl der immunisierenden Herausforderung Großtiere Substanz in mg überlebenden Tiere

7 IG

Kontroll gruppe	10	-
Gruppe 1	10	2
Gruppe 2	10	10
Gruppe 3	10	50

309841/1085

- Xl, -

... 34 - . ■

Die Tabelle I zeigte daß die durch die Erfindung geschaffenen Vakzinen ein bemerkenswertes Ausmaß an'Schutz gegenüber einer experimentellen Herausforderung ergeben, wobei angenommen wird, daß diese Herausforderung stärker als eine natürlich zugezogene ist.

Bei -s pie I " 6

Reinigung einer immunisierenden Substanz/ isoliert aus verkapselten Zellen von P. multocida, Typ B

Der Extrakt von Beispiel 1 (500 mg) wurde in destilliertem Wasser (10 ml) gelöst und sorgfältig gegen destilliertes _: Wasser zur Entfernung irgendwelcher vorhandenen Salze dialysiert. Eine wässerige Lösung von Cetylpyridiniumchlorid ' (1 % Gew./Vol.) wurde zugegeben, bis ein flockiger Niederschlag gebildet wurde (0,11 ml der 1 % Gew./Vol.-Lösung wurde bei 25°C benötigt). Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren entfernt, 2 mal in destillierteia Wasser gewaschen und anschließend in wässeriger Watriumchlorid-Lösung (10 ml einer 3 -molaren Lösung) aufgelöst. Die erhaltene Lösung wurde auf 4°C abgekühlt, wonach das Cetylpyridiniumchlorid auskristallisierte und durch Filtration bei 4 C entfernt wurde. Das erhaltene Piltrat wurde mit Methanol (-90 ml) gemischt und über Nacht bei 4°C stehengelassen. Sin Niederschlags enthaltend das Natriumsalz der immunisierenden

309841/1Q8S - - .' - 35 -

Substanz wurde nach Zentrifugieren erhalten und anschließend in destilliertem Was»ser gelöst, und darauf gefriergetrocknet .

Beispiel 7 Extraktion von P. multoeida Typ A und -Typ D

Extrakte aus diesen zwei Typen wurden in der gleichen Weise aus Kulturen der entsprechenden Organismen erhalten, die unter ähnlichen Bedingungen ^szüchtet worden waren. Der Typ A hatte die Ueybridge-Kultur-Wr. 229 und war"CN 4022 der Wellcome Research Laboratorien und Typ D₃ CM 5337 der gleichen Quelle.

Die- 'Zellen in der irisierenden Phase wurden durch Inkubation bei 37°C auf frisch hergestelltem Dextrose-Stärkeagar (Difco) in einer flachen Flasche Hit den Abmessungen 6 χ 10 in. (15,24 χ 25j4 cm) gezüchtet. Die Züchtung wurde vom Agar mit O.l-molarer tris-Acetat-gepufferter 2,5 % Gew./*Vol.-Kochsalzlösung, p_TT-„"ert 8,0, 10 ml für jeweils 300 ml Agar, abgewaschen. Die Zeil-Suspension wurde 10 Min. lang auf 56 C erhitzt und die Zellen durch 30 Ilinuten langes Zentrifugieren bei 10 000 g entfernt (nicht wesentlich, da sie durch 'die erste Zugabe von Lösungsmittel ausgefällt würden). Methanol wurde zu der überstehenden Flüssigkeit" bis zu einer

309841 / 1085 - 36 -

Konzentration von k2 % Vol./Vol. zugegeben und der Niederschlag; der sich nach 10 Min..langen Stehenlassen bei Raumtemperatur gebildet hatte,' durch Zentrifugieren während eines Seitraums von 10 Min. bei 5000 g entfernt.

Anschließend wurde weiteres !!ethanol zugesetzt bis zu einer endgültigen Konzentration von 48 % Vol. /VoL₃ und der Niederschlag in ähnlicher Weise, durch Zentrifugieren entfernt. Dieses 2 late rial wurde getrocknet und man erhielt eine Ausbeute von 19 mg aus 15 ml der ursprünglichen überstehenden Flüssigkeit" _ ■

Eigenschaften der Extrakte des Typs A und D

1. Allgemeines. Beide Extrakte waren weiße Pulver mit einer Löslichkeit in destilliertem Wasser von zumindest 20 mg/ml. Die Extrakte waren ebenso nach- 10 Min. in Wasser bei 100 antigenisch stabil und sie waren nicht dialysierbar.

²· Toxizität« Bei den in Beispiel 1 beschriebenen Pyrogenizitätstests an Hühnerembryos und Kaninchen wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

0 9841 / 10SS ' . ■ ' - 37 -

Tabelle II

LD Kaninchen

Extrakt Hühnerembryo Pyrogene Dosis

Typ A 5 μ£ 5 yg

D 5 με 5 yg

unter Verwendung einer Dosis von 5 μ& wurde ein pyrogener Index von weniger als 20 nach dem Verfahren von I-Iilner und Winkelstein, J. Inf. Dis. 11_6_₃ 529 (1966) für die Typen A und D erhalten.

3· Antigenizität-Iiiimunogenizität. Das Serum war bei Großvieh gegen verkapselte Zellen von beiden Serotypen überlegen, und ein beträchtlicher Anteil eines jeden Typs mit entsprechenden nicht verkapselten Zellen adsorbiert. Sowohl die nicht adsorbierten Sera und die adsorbierten Sera schützten Mäuse gegen eine Herausforderung durch die entsprechenden verkapselten intakten lebenden Organismen.

Die Immunogenizität der zwei Extrakte wurde beim Großvieh wie in Beispiel 1 beschrieben₃ untersucht, mit der Ausnahme, daß 6 mg eines jeden Extraktes mit drei Kälbern eingesetzt wurden. Die erhaltenen Sera schützten Mäuse gegenüber Herausforderung.

309841/1085 " ³⁸ "

Beispiel 8

Die in Beispiel 7 beschriebenen Organismen wurden in Flüssigkultur (wie in Beispiel 1) gezüchtet und auf einen p^-Wert nach der Züchtung eingestellt und anschließend die Kultur IO Min. lang auf 5o°C erhitzt. Es wurde dann das in Beispiel 7 beschriebene Extraktionsverfahren durchgeführt.

? „Α- i s ρ i e JL_ 9

Reinigung einer immunisierenden Substanz_a isoliert aus .P. multocida-Zellen vom kapsulären Typ B

Die immunisierende Substanz des Beispiels 6 (5 mg) wurde in 1-molarem wässerigem Natriumchlorid aufgelöst und der Gel-Chromatographie an einer Säule von Agarose₃ Biogel A-5 (Handelsname;, Bio-Rad Laboratories ₀ Richmond, California, "Methods in Immunology « ImmunocheEiistry", Vol. I₃ S. 135 (1968)) unterworfen. Die- Fraktionen, welche immunisierende Substanz enthielten ₃ wie dies durch die Geldiffusion gezeigt wurde j wurden gesammelt ₀ gegen destilliertes Wasser dialysiert, mit dera ilaterial aus vier Parallelansätzen gemischt .und anschließend gefriergetrocknet.

Beispiel 10

Reinigung einer immunisierenden Substanz -₃ isoliert aus P.

30984171085

Tiultocida-r'ellen vom !;apsul",ren Typ E

Zwei Ansätze des Extraktes aus Beispiel 3 wurden getrennt _fcereini_ot unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie in Beispiel 5, wobei jedoch der Extrakt des Beispiels 3 an die Stelle des Extraktes aus Beispiel 1 gesetzt wurde ₃ wodurch man yy-iel Ansätze von gereinigter immunisierender Substanz erhielt, die nachfolgend als E 1 und S 2 Bezeichnet werden.

Beispiel 11

VJeitere Kennzeichnung der iramunisierenden Substanzen der vorhergehenden Beispiele

In der folgenden Beschreibung werden die immunisierenden Substanzen der Beispiele 6 und 9 als B2 bzw. als Bl und die immunisierenden Substanzen des Typs A und B der P. multocida-Sellen des Beispiels 7 als A 1 bzw. D bezeichnet.

1. Infrarot-Spektroskopie

Proben der immunisierenden Substanz (in der Größenordnung von I₃5 rag einer jeder der Proben Al , D, Bl ., E I₃ B2 und E 2) wurden jeweils in eine Kaliumhalogenidscheibe (16 mm Durchmesser) inkorporiert und ihre Infrarot-Spektra aufgezeichnet. Die Infrarot-Spektra von Al, D, Bl, El, B2 und E2

309841/1085 - 40 -

■■■.■;- ifO - ■ ' · ■

23155?!

werden in den'anliegenden Fig· 1, Pig. 2, Pig. 3, Fig. 4, Fig. 5 bzw. Fig. 6 gezeigt.

2. Aminosäure-Analyse

Proben der immunisierenden Substanz (von bekanntem Gewicht in der Größenordnung von 5 mg" von jeweils Al, D, B2 und E2) wurden in"6^n-Chlorwasserstoffsäure (1 ml) bei 110⁰C 24 Std. lang hydrolysiert. Anschließend wurden alle Spuren von Wasser und Chlorwasserstoffsäure durch Verdampfen entfernt und der Rückstand auf 1 ml mit einer Pufferlösung, die einen p_H~Wert von 2,2 aufwies, auf 1 ml aufgefüllt.

Ein Anteil (0,2 ml) der gepufferten Lösung des Rückstandes wurde anschließend in einem Beckmann-Aminosäure-Analysiergerät analysiert. .

Die Aminosäure-Analysen von Al, D, B2 und E2 werden in der Tabelle III angegeben.

Tabellen!

Aminosäure-Analysen der immunisierenden Substanzen von Al, D, B2 und E2

Aminosäure Al D B2 E2

Tryptophan .6,42 14,^%27 ' 16,90

Lysin. 11,94 27,51, 54,40 \ 34,11

^Hi3tldin 30

-I₁₁-

Tabelle III (Fortsetzung)

Aminosäure Al D B2 E2

Arginin	23,72	54,21	19,59	17,73
Asparaginsäure	18,72	40,07	58,93	39,41
Threonin	5,74	12,32	16,46	11,25
Serin	10,13	23,21	20,01	12,61
Glutaminsäure	34,01	74,19	110,24	75,40
Pralin	38,72	85,07	25,14	15,63
Glycin	70,78	165,85	31,28	19,75
Alanin	26,04	53,10	25,35	19,66
Valin	7,49	16,70	19,23	13,67
Methionin	3,28	7,23	8,96	6,97
Isoleucin	4,12	9,78	15,24	11,27
Leucin	9,48	20,17	32,04	23,65
Tyrosin	' 3,04	7,58	13,64	8,66
Phenylalanin	6,58	13,70	14,90	9,99

Gesamtgewicht der ) Aminosäuren in Mikro-)_282f6 gram/mg an immunisie-) render Substanz )

3. Pyrolyse und GasChromatographie

Es ist heute klar erwiesen, daß völlig komplexe biologische

309841/1085

Materialien■durch sorgfältig geregelte Pyrolyse, gefolgt von einer gaschromatographischen Analyse, definiert werden können. Charakteristische Pyrolyse-"Pingerabdrücke" von normalen und pathologischen Zellen wurden von E.Reiner _et- al, Chromatographia, 5,, S. 525 (1972) bereits erhalten. Andere Forscher haben gezeigt, daß Proteine, Lipide und Kohlehydrate Pyrogramme liefern, die mit der Eerkunftsquelle der Verbindungen verwandt sind (A.Myers et al, Chromatographia 5, Seite 321 (1972))·

Proben von immunisierender Substanz wurden mit Hasser gemischt (jede Probe enthielt 1 mg einer immunisierenden Substanz, ausgewählt aus Al₅ D, B2, El und E2 pro 100 ul Wasser). Aliquote Teile (5 μΐ) der Mischung aus immunisierender Substanz und Wasser wurden anschließend auf eine· Spulenaonde aufgebracht und die Probe in den Injektionsteil der Pyrolyse-Apparatur eingeschoben (Pyroprobe 190, Chemical Date Systems Inc.) und 6 Min. lang dort belassen, bevor das Pyrolyse- und Temperatur-Programm begonnen wurde, um Wasser und irgendwelche flüchtigen Komponenten abzudampfen.

Der Ablauf der Pyrolyse wurde dann unter Anwendung einer Temperatur von 85O⁰C, einem Intervall von 20 Sek. begonnen, und die Vorrichtung so eingestellt, daß der schnellste Temperaturanstieg gewährleistet war. Anschließend wurde die

309841/1086

- 43 ...

-H₃-

GasChromatographie mit dem pyrolysierten Material in einem Perkiri-Elmer 900-Gaschromatographie-Apparat unter Verwendung der folgenden Bedingungen und Einstellungen durchgeführt:

Detektor Säule

Stationäre Phase Träger

Trägergas Eingangsdruck Strömung

Temperaturprogramm

: F.I.D. (Flammenionisationsdetektor)

: 6 ft χ 1/8 inch (1,83 m χ 3,175 mm) rostfreier Stahl

: 0.V.225 (Cyanopropylmethylphenylmethyl-silikon ) (5 %)

: Phasesep Universal 85-100 B.S. mesh (0,178 bis 0,152 mm)

: Stickstoff

: HO pBig (3,81 kg/cm²)

: 25 ml/Min., gemessen am Säulenausgang bei Umgebungstemperatur

: 30⁰C während 2 Min., anschließend auf 200⁰C bei 16⁰C/Min. und bei 200 C 10 Min. lang gehalten

Inj ektor-Temperatur	. 1400C	,52	kg/cm
Inj ektor-Einstellung	5	,55	kg/cm
Manx fοId-Temperatur	230°C	16	χ 10
Manifold-Einsteilung	5	rvoj	ächrei
Luft ■ :	50 psig (4
Wasserstoff :	22 psig (2
Dämpfungseinstellungen	1 χ 10 bis
Schreiber	2-Kanal-Se

Smith mit 2 Parallel-Schreib-Schreibstiften. Grüner Schreibstift eingestellt auf 5 mv auf

309841/1085

vollen Skala-Ausschlag (ν.S.A.) und der schwarze Schreibstift bei 50 mv auf v.S.A. Papiergeschwindigkeit bei 600 mm/Std.

Die mit den pyrolysierten Proben der immunisierten Substanzen erhaltenen Gaschromatogramme werden in den anliegenden Zeichnungen gezeigt, in welchen in jedem Fall die Zeitskala mit der Einführung der Probe in den Injektorteil beginnt. In den Zeichnungen zeigt: · ;.. Fig. 7 das Chromatogramm für Al₃ bei welchem die Dämpfung 16 χ 10 betrug.

Fig. 8 das Chromatogramm für Al (Wiederholung), wobei die Dämpfung von 8 χ 10 zu 1.6 x 10 nach etwa 8 Min. verändert und die Verstärkung auf das Doppelte erhöht wurde. Fig. 9 das Chromatogramm für El, wobei die Dämpfung 1 χ 10 ,war.

Fig. 10 das Chromatogramm für E2, wobei die Dämpfung 1 χ und die Verstärkung auf das Doppelte erhöht war. Fig. 11 das Chromatogramm für D, wobei die Dämpfung 1 χ 10 war. · .

Fig. 12 das Chromatogramm für B2, wobei die Dämpfung von 4 χ 10 auf 1 χ 10 bei etwa 6,8 Min. verändert und die Verstärkung auf das Doppelte erhöht wurde. ■

4. Mikroanalyse

Die folgenden Bestimmungen wurden an einigen oder allen der 309841/1085

2315553

Proben Al₅ Bl, D und El durchgeführt.

a) der Gesamtstickstoff wurde nach der Mikro-Kjeldahl-Methode (Ilethods in Immunology & Immunochemistry", VoI II, S. 257 (1958)) durchgeführt.

b) Die gesamten Kohlehydrate wurden nach dem Anthron-Test (Methods in Carbohydrate Chemistry, VoI I, S. 389 (1969)) durchgeführt.

^c) Zuckeranalyse. Eine Probe der immunisierten Substanz

(2 bis 4 mg) wurde in 0,2 n-Chlorwasserstoffsäure (1 ml) gelöst, in ein Glasrohr eingeschlossen und 30 Min, lang auf 100 C erhitzt. Das erhaltene Hydrolysat wurde im Vakuum getrocknet, in destilliertem Wasser (0,1 ml) gelöst und der Chromatographie auf Whatman No. 4-Filterpapier unterworfen. Das entwickelnde Lösungsmittel war die obere Phase einer Gleichgewi chtsmis.chung von Butanol : Essigsäure : Wasser (in welcher die relativen Anteile 25 : 6 : 25 betrugen). Nach Entwicklung der Chromatogramme wurde jedes mit einem der folgenden Reagentien (beschrieben in "Data for Biochemical Research", Ed, R.M.C. Dawson et al, Oxford (1959)) besprüht: (i) Anilinphthalat für die Detektion der Aldose-Zucker ("Data for Biochemical Research", Ed. R.M.C. Dawson et al, Oxford, (1959), Seite 238 [Verfahren (a)]) mit einer Empfindlichkeit von 2 mg für Glucose, (ii) Naphthoresorcinol für die Detektion der Keton-Zucker und der Pentosen ("Data for Biochemical Research",

309841/1085

16 -

231556

Ed. R.M.C. Dawson et al., Oxford (1959) S. 239) mit einer Empfindlichkeit von IO mg für Fruktose.

(iii) Diphenylamin für die Detektion der Aldose-Zucker ("Data for Biochemical Research", Ed. R.M.C. Dawson, et. al, Oxford, (1959) S. 239). Das verwendete. Reagenz bestand aus Anilin in Aceton (50 ml einer 2 % Gew./Vol.-Lösung) und Diphenylamin in Aceton (50 ml von 2 % Gew./VoI-.<■-Lösung) mit unmittelbar vor der Verwendung zugegebener Phosphorsäure (10 ml 88 % Gew.7VoI.-wässerig).

(iv) Acetylaceton-p-dimethylaminobenzaldehyd für die Detektion von Hexosaminen und N-Acetylhexosaminen ("Data for Biochemical Research, Ed. R.M.C. Dawson et al, Oxford, (1959), 'S. 243). Die mikroanalytischen Ergebnissen sind in der -Tabelle IV niedergelegt.

	Tab e	lie IV	-	El
Mikroanalytische	Ergebnisse
		von immunisierenden Substanzen	4,7
	... ■. Al -
a) Gesamt		Bl D	10,2
Stickstoff %	Nv
b) Gesamt		5,5 Nv	Spuren
Kohlehydrat %	46,3
c) Zucker		9,76 13,5	Spuren
i) Aldosen	+		Spuren.
ii) Pentosen und		Spuren +
Keton-Zucker
iii) Aldosen	-	Spuren
Spuren +

309841/1085

Tabelle IV (Portsetzung)

Al Bl D El

iv) Hexosamine

N-Acetylhexosamine

Anmerkung: + bedeutet positiv; - bedeutet negativ; und Nv bedeutet "nicht verfügbar".

Die entdeckten Aldosen hatte R_f-Werte welche anzeigten, daß sie Hexosen waren. Außerdem war ein gewisser Hinweis auf die Anwesenheit von Oligosacchariden am Beginn der Chromatogramme im Falle von allen immunisierenden Substanzen i vorhanden.

5· Ultraz entri fugierung

Proben der immunisierenden Substanz (Al, Bl, D und El) wur~ den in destilliertem Wasser gelöst und der Ultrazentrifugation unterworfen. S-Werte wurden dann berechnet^ (H.K.Schachman, "Ultrazentrifugation in Biochemistry", Academic Press j London, New York; (1959)). In jedem Falle wurde gefunden, daß die immunisierende Substanz homogen war, mit der Ausnahme des Falles von D, welche zwei Peaks lieferte. Die erhaltenen S-Werte waren die folgenden:

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- 1(8 -

T a b e 1 1-e V

Immunisierende Substanz Al Bl D El

S-Wert(e) . . .2,52 3,19 1,69 3,8

10,6

Literaturverzeichnis ■ -

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5. G.R. Carter, Vet. Record 73, 1052 (196I);

β. K.L. Milner und R.A. Finkelstein, J.Inf. Dis. 116, (1966);

7. L. Lee und CA. Stetson, J. Exp. Med. Ill, 76I (i960);

8. E. Atkins,' Physiol. Revs.. 4θ, 58Ο (i960);

9. S. Carrel und S. Barundun, Immuno chemistry, j8, 39 (I97I);

10. 0. Westphal, Ann. Inst. Pasteur, Paris, £8, 789 (i960): .11. T.P. King, S. 135 "Methods in Immunology and Immuno-, chemistry",. Vol. 2,Ed. CA. Williams und M.W.Chase;

pub. 1968 Academic Press, New York und London; ~ 12. P.A.. Little und B.M. Lyon, Amer. J.Vet. Res., '4_, 110 -112, (1943); 309841/1085

- I₁₉ -

13. H.K. Schachman, "Ultracentrifugation in Biochemistry", Academic Press, London, New York, (1959) ;

14. Methods'in Carbohydrate Chemistry, Vol. I, S. 389 (1969);

15. "Methods in Immunology and Immunochemistry", Vol. II, S. 257 (1968);

16. "Data for Biochemical Research", Ed. R.M.C. Dawson et al, Oxford, (1959);

17. ibidem, S. 238 [Verfahren (a)];.

18. ibidem, S. 239;

19. ibidem, S. 239;

20. ibidem, S. 2^3;

21. E. Reiner et al, Chromatograph!a 5., S. 525 (1972);

22. A. Myers et al, ibidem, S. 321;

23. "Methods in Immunology and Immunochemistry", VoI I,

s. 135 (1968).

309841/1003

Claims (1)

1. - 50 - ■ ■ ■ .

   Pa te η t. a η s ρ ν ü c. h. e.' . .-

   (Q. Immunisierende Substanz_a. geeignet für die Anwendung zur Verleihung von Immunität für Säugetiere oder Vögel gegen Pasteurellosis, herrührend von- einer Infektion mit Pasteurella multocida oder Pasteurella haemolytioa, erhält* lieh aus einer verkapselten Variante eines Serotyps, ausgewählt aus P. multocida- und P.-haemolytica-Serotypen, wobei der erwähnte Serotyp dem Serotyp .entspricht_s gegen welchen durch die immunisierende Substanz Immunität verliehen werden soll, wobei die immunisierende Substanz in der immunisierenden Dosis nicht toxisch gegenüber Säugetieren und Vögeln ist,· nach 10 Min. in Wasser von 100 antigenisch stabil ist-., nicht dialysierfähig ist, wasserlöslich ist und im wesentlichen frei (absent from) nicht verkapselten Varianten von P. multocida und P, haemolytica ist.

   2. Immunisierende Substanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet j daß eine immunisierendeDosis der Substanz eine Toxizitä't von weniger als einem Zehntel der Toxizität besitzt, die in einer immunisierenden Dosis einer Kultur von verkapselten P. multocida oder P. haemolytica verbunden ist, aus welcher das Endotoxin nicht entfernt,worden ist.

   3. Immunisierende Substanz nach Anspruch 1, dadurch gekenn-

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   zeichnet, daß eine immunisierende Dosis der Substanz eine Toxizität von weniger als ein Hundertstele der Toxizität aufweist, die mit einer immunisierenden Dosis einer Kultur von verkapselten P. multocida oder P. haemolytica verbunden ist, aus welcher das Endotoxin nicht entfernt worden ist.

   4. Immunisierende Substanz nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz eine LD von mehr als 5 ug bei Hühnerembryos nach dem Verfahren von K.L. Milner und R.A. Pinkelstein, J. Inf. Dis. 116, 529 (1966) besitzt, eine reaktive Dosis von mehr als 100 \ig in der lokalisierten Schwärtzman-Reaktion aufweist, einen pyrogenen Index bei Kaninchen von weniger als 20nach dem Verfahren von Milner und Finkelstein bei Verwendung einer Dosis von 5 Pg zeigt, oder eine letale Dosis bei Kaninchen bei intravenöser Verabreichung von mehr als 1 mg aufweist.

   5. ImmunisierendeSubstanz nach einem der Ansprüche 1 bis

   4, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz ein Molekulargeil 7
   wicht im Bereich von 10 bis 10 besitzt.

   6. Immunisierende Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 5s dadurch gekennzeichnet, daß die verkapselte Variante P. multocida, Typ A (Carter) oder Typ D (Carter) ist.

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   7. Immunisierende Substanz naeh einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die verkapselte Variante ein Serotyp ist, ausgewählt aus P. multocida-Typ B und -Typ E (Carter);

   8. Immunisierende Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die verkapselte Variante ein P. haemolytica-Serotyp ist.

   9. Immunisierende Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die immunisierende Substanz eine Löslichkeit in destilliertem Wasser von zumindest 20 mg/ ml aufweist . . " ■

   10. Sterile Vakzine, geeignet für die Immunisierung eines Säugetiers oder eines Vogels gegen Pästeurellosis von einer Infektion mit P. multocida oder P. haemolytica, enthaltend eine immunisierende Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in Verbindung mit einem physiologisch annehmbaren Träger, wobei die Vakzine steril und isotonisch mit dem Blut des zu immunisierenden_tSäugetiers oder Vogels ist.

   11. Vakzine nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß. die Vakzine in einer gefriergetrockneten Form für die Rekonstitution mit Pyrogen-freiem Wasser vorliegt.

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   ■12. Vakzine nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger Pyrogen-freies Wasser enthält.

   13· Vakzine nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Vakzine ein Adj'uvans enthält.

   14. Vakzine nach Anspruch 13> dadurch gekennzeichnet, daß das Adjuvans ein Aluminiumsalz oder -base.ist.

   15. Vakzine nach einem der Ansprüche 10 und 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Vakzine eine Wasser-in-öl-Emulsion enthält, in welcher die immunisierende Substanz in der wässerigen Phase zugegen ist.

   16. Vakzine nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Vakzine ein lipophiles und/oder hydrophiles Emulgiermittel enthält.

   17. Vakzine nach einem Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Einheitsdosis-Porm vorliegt.

   18. Vakzine nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Einheitsdosis von 1 bis 100 mg an dialysierter und gefriergetrockneter immunisierender Substanz enthält.

   19. Vakzine nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß 309841/1085

   die Einheitsdosis von 2 bis 20 mg an dialysierter und gefriergetrockneter immunisierender Substanz enthält.

   20. Vakzine nach einem der Ansprüche 10 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Vakzine eine zusätzliche immunisierte Substanz bakteriellen oder viralen Ursprungs enthält.

   21. Vakzine nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der andere aktive Bestandteil eine Clostridium chauvoei-Vakzine ist.

   22. Vakzine nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die verkapselte Variante P. multocida-Typ B oder -Typ E (Carter)-Zellen und der andere aktive Bestandteil eine Anthrax spores Vakzine ist.

   23· Vakzine nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet,- daß die verkapselte Variante P.multocida-Typ A oder -Typ D(Carter)-Zellen und der. andere aktive Bestandteil eine Clostridium septicum-Vakzine ist.

   24. Verfahren zur Herstellung einer Vakzine nac-h einem der Ansprüche 10 bis 23, geeignet für die^ Immunisierung eines Säugetiers oder eines Vogels gegen Pasteurellosis, dadurch gekannzeichnet, daß man eine immunisierende Substanz, nach

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   einem der Ansprüche 1 bis 9 in Verbindung mit einem physiologisch annehmbaren Träger bringt und die Vakzine steril und isotonisch mit dem Blut des zu immunisierenden Säugetiers oder Vogels macht.

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