DE2710454C2 - Ester von N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin sowie Mono- und Diester von N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsäure, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen - Google Patents

Description

COOR¹

in der R¹ C,- bis C₃-Alkyl bedeutet
2. Mono- und Diester von N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsäure der allgemeinen Formel

CH₂OH

OH, H

NH — COCHi

H₃C-CH-C-NH-Ch-CO-NH-CH-COOR²

COOR³

in der R² C,- bis C₃-Alkyl und R³ Wasserstoff oder C_r bis C₃-Alkyl bedeuten.

3. e-Methylester der N-Acetylmuramyl-L-alanyi-D-glutaminsäure.

4. Dimethylester der N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsäure.

5. Methylester des N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamins.

6. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise ein Derivat von N-Acctylmuramin, dessen Hydroxygruppen gcichützt sind, über die Carboxygruppe mit der zuvor hergestellten Peptidkette kuppelt oder daß man in zwei aufeinanderfolgenden Kupplungsreaktionen anstelle der Peptidkette zuerst ein L-Alaninderival und dann ein Derivat eines Glutaminsäure- bzw. Isoglutaminesters mit dem N-Acetylmuramin verknüpft und nach der Kupplung die Schutzgruppen abspaltet.

7. Arzneimittel und Impfstoffe, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine Verbindung gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 als Wirkstoff bzw. Stimulanz der Immunantwort neben üblichen Zusatz- und Hilfsstoffen enthalten.

Die Erfindung betrifft antiinfektiöse Ester von N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin sowie Mono- und Diester von N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsäure, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbin-65 düngen enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen. Sie betrifft insbesondere in Wasser lösliche Mittel, die als immunologische Adjuvantien zur Begünstigung der Immunreaktionen oder auch als antiinlektiösc Mittel eingesetzt werden können. Sie betrifft ferner ein Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen als Wirkstoffe enthaltende Arzneimittel.

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere e-~Monomethylester, ar-Monoethylester, ff-Monopropylester, Dimethylester, Diethylester oder DipropylesterderN-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsäure oder die Methylsster, Ethylester oder Propylesler von N-Acetylimuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin.

Diese erfindungsgemäßen Verbindungen entsprechen der allgemeinen Formel

CH₂OH

IO

NH—COCH₃

H₃C-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CORi

CH₃ (CH₂J₂

20

in der R¹ eine Gruppe der allgemeinen Formel

25

worin η 1, 2 oder 3 bedeutet, oder eine Aminogruppe (-NH₂) und R₂ eine Gruppe der allgemeinen Formel

worin ρ O, 1,2, eder 3 bedeutet ui-.j nicht gleich O ist, wenn Ri für eine Aminogruppe steht, bedeuten.

Eine bevorzugte Gruppe von erfindungsgemäßen Verbindungen ist die der a-Monomethylester oder der Dimethylester der N-Acetylmuram:';-L-alanyl-D-glutaminsäure und von N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, d. h. die Gruppe der Verbindungen der obigen allgemeinen Formel, in der R| eine Gruppe der folgen- den allgemeinen Formel

in der η den Wert 1 besitzt, darstellt und ρ O oder 1 bedeutet, oder in der R, für eine Aminogruppe steht und ρ den Wert 1 aufweist. Diese letzteren Verbindungen können auch abgekürzt wie folgt bezeichnet werden:

M ur-N Ac-L-AIa-D-GIu-^-OCH₃, MUr-NAc-L-AIa-D-GIu(OCH₃): und MUr-NAc-L-AIa-D-ISo-GIn(OCH₃).

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen führt man in einer ersten Stufe die Synthese eines geeigneten Derivates des Fragmentes, das der Peptidkette entspricht, und des Fragmentes durch, das der abgekürzten Bezeichnung Mur-NAc entspricht, deren funktioaelle Gruppen nicht reagieren dürfen und zuvor geschützt werden, worauf man in einer zweiten Stufe die Kupplung dieser beiden Derivate der genannten Fragmente durchführt. Die Schutzgruppen werden anschließend abgespalten, wodurch die zuvor geschützten oder blockierten funktionellcn Gruppen freigelegt werden.

Es ist weiterhin möglich, die Synthese dieser Verbindungen in der Weise durchzuführen, daß man getrennt ein Derivat der abgekürzten Bezeichnung Mur-N Ac mit einem Derivat von L-Alanin kuppelt und dann das erhaltene Produkt mit dem entsprechenden geeigneten Derivat der Glutaminsäure oder des Isoglutamins kuppelt, wobei man für diese Reaktionen die allgemeinen Verfahrensweisen anwendet, die für Peptidsynthesen üblich sind. Die Erfindung betrifft ferner Arzneimittel, die die genannten Mittel enthalten und insbesondere dazu dienen, die Wirkung von schwachen Immunogenen zu verstärken, oder die zur Behandlung von Infektionserkrankungen verwendet werden. Insbesondere betrifft die Erfindung Zubereitungen, die die genannten Mittel enthalten, und die zur Immunisierung oder zur Behandlung der Menschen oder von Warmblütern verwendet werden können, um Bakterien-, Viren- und Parasiten-Infektionen vorbeugend oder heilend zu behandeln oder verschiedene Gewebcantigenc normalen oder pathologischen Ursprungs zu bekämpfen.

Einer der Vorteile der crfkidungsgemäßcn Produkte beruht auf der Tatsache, daß es nicht notwendig ist, auf |':^: besondere Verubrcichungsmedicn, von denen die pharmakologische Wirkung und insbesondere die Adjuvaiis-

\j wirkung der erllndungsgemüßen Mittel abhängen könnt«:, und auf Bindemittel, Trägermaterialien und/oder

IQ Hillsstoffe zurückzugreifen, die nur dazu verwendet werden können, die Verwendung dieser Produkte zu

gfi erleichtern. Insbesondere ist es nicht erforderlich, wenn die erfindungsgemäßen Wirkstoffe injiziert werden

fe sollen, zu diesem Zweck eine Zubereitung zu verwenden, die eine Ölphase enthält.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen Verbindungen, ob sie nun im Hinblick auf ihre Adjuvanswirkung oder im Hinblick auf ihre antiinfektiöse Wirkung eingesetzt werden, auf oralem oder parenteralem Wege und insbesondere durch Injektion verabreicht werden.

Die Erfindung betrifft damit auch insbesondere Arzneimittelzubereitungen mit Adjuvanswirkung bezüglich der Immunität, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, insbesondere

MUr-NAc-L-AIa-D-GIu-^-OCH₃,
Mur-NAc-L-AIa-D-GIu(OCH₃)₂ oder
MUr-NAc-L-AIa-D-ISO-GIn(OCH₃)

neben einem pharmazeutisch annehmbaren Bindemittel, Trägermaterial und/oder Hilfsstoff enthalten. Besonders bevorzugte Zubereitungen dieser Art umfassen injizierbare Lösungen, die eine wirksame Dosis eines erfindungsgemäßen Produktes enthalten. Vorteilhafterweise verwendet man hierfür sterile Lösungen in wäßriger, vorzugsweise isotonischer Phase, wie isotonische Salzlösungen oder Glucoselösungen. Die Erfindung ist jedoch hierauf nicht beschränkt, so daß man auch eine einfache Lösung in destilliertem Wasser einsetzen kann.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel mit Adjuvanswirkung können auch in verschiedenen anderen Formen vorliegen, zu deren Herstellung man geeignete Hilfsstoffe verwendet, die für den angestrebten Verabreichungsweg geeignet sind. Beispielsweise können diese Arzneimittel in Form von Cachets, Tabletten oder Gelkügeichen für die orale Verabreichung oder in Form von Aerosolen oder Gelen zur Verabreichung über die Schleimhäute vorliegen.

Zur Herstellung der Arzneimktelzubereitungen unmittelbar vor ihrer Verwendung kam« <nan den Wirkstoff mit Adjuvanswirkung auch in gefriergetrockneter Form einsetzen.

Eine vorteilhafte pharmazeutische Zubereitungsform umfaßt Einzeldosierungen mit einem Wirkstofigehalt von 100 bis 800 μg und insbesondere von etwa 400 μg.

Die Erfindung umfaßt ferner Arzneimittelzubereitungen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen zusammen mit einem immunogenen Mittel, insbesondere einem soiiwachen impfenden Antigen enthalten.

Gemäß einer weiteren Ausluhrungsform betrifft die Erfindung Arzneimittel, die die erfindungsgemäßen Verbindungen und insbesondere

}0 Mur-N Ac-L-AIa-D-G I u-a-OCH₃,

MUr-NAc-L-AIa-D-GIu(OCHj)₂ oder
MUr-NAc-L-AIa-D-ISO-GIn(OCH₃)

enthalten, die als antiinfektiöse Mittel geeignet sind. Es hat sich gezeigt, daß diese Produkte, wenn sie als solche verabreicht werden, d. h. ohne ein impfendes Mittel, d. h. insbesondere ohne ein schwaches immunogenes Mittel, eine vorbeugende oder heilende antiinfektiöse Wirkung ausüben. Mit anderen Worten beobachtet man die antiinfektiösen Eigenschaften dann, wenn man diese Verbindungen dann verabreicht, wenn die Infektion erfolgt oder danach.

Diese gegen Infektionen gerichtete Wirkung ist überraschend, wenn man berücksichtigt, daß zuvor Verbindunger bekannt waren, mit denen man die Resistenz des Organismus steigern kann.

So ist es bekannt, daß man die nichtspezifische Resistenz eines Organismus gegen Infektionen dadurch steigern kann, daß man zuvor durch eine Injektion verschiedene immunostimulierende Mittel bakteriellen Ursprungs verabreicht, wie gewisse Stämme von Corynebakterien, Mycobakterien und ihren »Cord-Faktor« oder Lipopolyoside (LPS), die aus gramnegativen Bakterien extrahiert worden sind. Dieser Schutz zeigt sich jedoch nur dann, wenn bestimmte Intervalle zwischen den Verabreichungen dieser immuncstimulierenden Mittel und dem Zeitpunkt der Infektion eingehalten werden. So hat man experimentell zeigen können, daß sich der größte Prozentsatz des Überlebens von Mäusen, die mit KJebsiclla infiziert worden sind, dann ergibt, wenn man das immunostimulierende Mittel im Fall von BCG 14 Tage zuvor, im Fall von Corynebakterien etwa 7 Tage zuvor und im Fall von LPS etwa 6 bis 48 Stunden zuvor verabreicht. In alien diesen Fällen muß die Stimulierung des Immuriosystemi mit Hilfe dieser Mittel der Infektion vorausgehen. Es ist wohlbekannt, daß, wenn man beispielsweise LPS gleichzeitig mit dem infizierenden Bakterium oder danach injiziert, sich eine »negative Reaktion« ergibt, die zu einer Verminderung der Resistenz des Organismus führt, der selbst nach der Verabreichung eines wenig virulenten Bakterienstammes diesem erliegen kann. Wenn man diese Wirkstoffe jedoch unter angemessenen Bedingungen verabreicht, fuhren diese Behandlungen zu einer beträchtlichen Stimulierung der nichtspezifischen Immunität selbst gegenüber Stämmen, die durch Mutation oder durch Plasm idübertragungen gegen Antibiotika resistent geworden sind. Es ist dennoch schwierig oder sogar unmöglich, diese Behandlungen durchzurühren, und zwar wegen Nebenwirkungen, die man nach der Verabreichung von starken Dosierungen von Corynebakterien oder BCG beobachtet, und insbesondere wegen der für den Menschen toxischen Wirkung von LPS, das ein toxisches Antigen für gramnegative Bakterien darstell*.

Angesichts der Ergebnisse, die man mit Hilfe von Adjuvantien bakteriellen Ursprungs erzielt hat, und insbesondere, die man mit LPS gemacht hat, ist es daher als vollständig überraschend anzusehen, daß die erfindungsgemäßen synthetischen Adjuvantien neben ihrer Adjuvanswirkung, die sie im Rahmen von vorbeugenden Immunisierungsbehandlungen ausüben, eine antiinfektiöse Wirkung entfalten, die vorbeugend oder sogar heilend wirkt, ohne daß es erforderlich ist, daß diese Wirkstoffe von impfenden Antigencn begleitet werden.

Diese Präparate sind ferner frei von einer mitogenen Wirkung (einer blastiachen Transformation der Lymphozytcn). Sie üben ferner keine antigene Wirkung aus In der Tat verursachen sie keine verzögerte Sensibilitätsreaktion am Meerschweinchen, das zuvor mit Hilfe des vollständigen Freund'schen Adjuvans sensibilisiert worden ist. Sie verursachen keine hyperthermische Wirkung am Kaninchen bei Dosierungen, die wesentlich

größer sind als die Dosierungen, in denen sie ihre antiinfektiöse Wirkung ausüben. Sie zeigen eine negative Reaktion beim Limulus-Test und führen nach der Injektion an Mäusen, denen man die Nebennieren entnommen hat, nicht zu einer Abtötung der Tiere, trotzdem diese Tiere durch diese Operation extrem empfindlich sind gegen die tödliche Wirkung von Endotoxinen. Diese Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen vollständig frei sind von endotoxischen Wirkungen. Sie besitzen den Vorteil, daß sie selbst in Ab-Wesenheit einer Ölphase wirksame antiinfektiöse Mittel darstellen, und zwar unabhängig davon, ob die Verabreichung auf parentcralem oder oralem Wege erfolgt, während die Adjuvantien vom Typ LPS nur bei parenteralcr Verabreichung wirksam sind.

l-in sehr wesentlicher Vorteil der unliinfckliöscn erfindungsgciruilkn Verbindungen ist darin zu sehen, daß man mit ihnen pathogcnc Keime bekämpfen kann, die durch Behandlung mit üblichen Antibiotika gegen die Antibiotika resistent geworden sind.

Es ist weiterhin daraufhinzuweisen, daß die heilende antiinfektiöse Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen um so bemerkenswerter und überraschender ist, als die Untersuchungen zeigen, daß sie in vitro keine bakterizide oder bakteriostatische Wirkung ausüben.

Wie im Fall der Mittel, die zur Begünstigung der Immunreaktionen verwendet werden, können die Arzneimittel, die die oben erwähnten Wirkstoffe enthalten und in der Therapie als antiinfektiöse Mittel eingesetzt werden, in der unterschiedlichsten Form vorliegen, da die Eigenschaften des Wirkstoffes sich sowohl bei oraler ais auch bei parciiicfaicf Verabreichung manifestieren. Die Arzneimittel kör.r.er. insbesondere in Form vcrs SnJizierbaren Lösungen (insbesondere in Form von isotonischen wäßrigen Lösungen), in Form von trinkbaren Lösungen, in Form von Cachets, Gelkügelchen, Aerosolen, Gelen etc. vorliegen.

Weitere Ausiuhrungsformen und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der weiteren Beschreibung, die die Herstellung der erfindungsgemäßen Produkte verdeutlicht sowie den Untersuchungen, aus denen die pharmakologischen Eigenschaften der genannten Produkte hervorgehen.

Im folgenden werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

Mur-NAc	= 2-Acetamido-2-desoxy-3-0-(D-2-propionyl)-D-glucopyranose	Beispiel 1
AIa	= Alanin
GIu	= Glutaminsäure
iso-Gln	= Isoglutamin
4,6-O-bzi	= 4,6-O-Benzyliden
/t-bzl	= >Benzyl
BOC	= Tert.-Butyloxycarbonyl
OBzI	= Benzylester
OSu	= Succinimidester
BzI	= Benzyläther

ff-Methylester der 2-(2-Acetamido-2-desoxy-3-0-D-giucopyranose)-D-propionyl-L-alanyl-D-gIutaminsäure a) a-Benzylester der tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-D-glutaminsäure (I)

Man löst 4 g (14 mMol) des Succinimidesters von BOC-L-alanin, den man nach der Verfahrensweise von E. Schnabel (Justus Liebig's Ann. Chem. 702 (1967) 188) bereitet hat, in 15 ml Tetrahydrofuran. Diese Lösung gibt man zu 25 ml einer wäßrigen Lösung von 3,3 g (14 mMol) des y-Benzylesters der D-Glutaminsäure, den man nach dem Verfahren von S. Guttmannund R. A. Boissenas (HeIv. Chim. Acta4I (1958) 1864) erhalten hat, und 1,4 g (14 mMol) Kaliumbicarbonat. Nach dem Stehenlassen über Nacht stellt man den pH-Wert der Reaktionsmischung auf 8,5 ein und extrahiert mit Athylacetat. Man stellt die wäßrige Phase in der Kälte mit einer 4 n-Chlorwasserstoiisäurelösung auf einen pH-Wert von 3,5 sauer, worauf man mit Athylacetat extrahiert. Dann wäscht man die organische Phase mit Wasser, trocknet sie und engt sie ein. Das Produkt wird aus einer Äthylacetat/Petroläther-Mischung umkristallisiert, wobei man 4,77 g des Produktes erhält (Ausbeute = 87,8%).

F. 68 bis 70°C. [atf = -12° (Methanol).

Analyse: C₂₀H^O₇N₂ (408,45) berechnet: C 58,81, H 6,9, N 6,85;
gefunden: C 58,7, H 6,4, N 6,8.

b) ür-Methyl-y-benzyl-ester der tert-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-D-glutaminsäure (II)

Man löst 408 mh (1 mMol) der in der Stufe a) erhaltenen Verbindung I in 100 ml wasserfreiem Methanol. Dann gibt man im Verlauf von 15 Minuten bei 0⁰C eine Lösung von Diazomethan (etwa 10 mMol) in Äther zu. Nach 2stündigem Stehenlassen bei Raumtemperatur engt man die Reaktionsmischung zur Trockne ein und nimmt dann mit 25 ml Athylacetat auf. Man wäscht die organische Phase nacheinander mit einer 10%igen wäßrigen Zitronensäurelösung, mit einer 1 m-Natriumbicarbonat-Lösung und dann mit Wasser bis zu einem neutralen pH-Wert. Man trocknet die Athylacetatphase über Magnesiumsulfat, filtriert und engt ein. Man erhält ein nichtkristallisierendes Öl (385 mg, was einer Ausbeute von 91% entspricht).

c) Hydrochloric! des tf-Methyl-y-benzyl-esters der L-Alanyl-D-glutaminsiiure (III) 4J

Man behandelt 385 mg (0,91 mMol) der in der Stufe b) erhaltenen Verbindung Il während 30 Minuten mit ifi

3 ml einer l-Chlorwasserstoffsäure-Lösung in Eisessig. Man engt die Reaktionsmischung zur Trockne ein und & trocknet das erhaltene Öl, das man in einer Menge von 330 mg (Ausbeute = 100%) erhält.

=>;) o-Methyl-y-benzyl-ester der 2-(2-Benzyl-acetamido-4,6-0-benzyliden-2-desoxy-3-0-a-D-glucopyranosyl)-

D-propionyl-L-alanyl-D-glutaminsäure (IV)

Man löst 473 mg (I mMol) 2-Beii2yl-acetamido-4,6-benzyliden-3-O-(D-carboxyäthyl)-2-desoxy-a-D-gluco- f;

pyranosid, das man nach der Verfahrensweise von Flowers und R. W. Jeanloz (J. Org. Chem. 28 (1963) 2983) ^'

erhalten hat, in 5 ml auf -I5°C abgekühltem Dimethylformamid. Dann gibt man nacheinander 0,11 ml J.

(1 mMol) N-Methylmorpholin und 0,13 ml (1 mMol) Chlorkohlensäureisobutylester zu. Ii

Zu dieser Reaktionsmischung gibt man eine zuvor auf -15°C abgekühlte Lösung vor. 330 mg (0,9 mMol) der !;]

in Stufe c) erhaltenen Verbindung III und 0,1 ml (0,9 mMol) N-Methylmorpholin in 5 ml Dimethylformamid. £|

Nach dem Aufbewahren über Nacht bei -15°C gibt man 1 ml einer 2,5n-Kaliumbicarbonatlösung zu. Nach §

30 Minuten wird das Produkt durch Zugabe von 40 ml destilliertem Wasser ausgefällt, abfiltriert und getrocknet. |

Man erhält 667 mg der gewünschten Verbindung (Ausbeute = 95,5%). i

1

e) ar-Methylester der 2-(2-Acetamido-2-desoxy-3-0-D-glucopyranose)- ij

D-propionyl-L-alanyl-D-glutaminsäure (V) /j

Man hydriert 305 mg (0,39 mMol) der in Stufe d) erhaltenen Verbindung IV in Form einer Lösung in 50 ml ?!

Eisessig während 15 Stunden in Gegenwart von 300 mg eines Palladiumkatalysators (5 % Palladium aufKohlen- j

stoff). Nach dem Abfiltrieren des Katalysators und dem Verdampfen der Essigsäure fällt man das Produkt aus ; j

einer Methanol/Aceton/Äther-Mischung aus und zentrifugiert es ab. Man erhält 140 mg (Ausbeute = 70%) der ?i

Verbindung. Das Produkt wird durch Chromatographie über eine mit einem Ionenaustauscherharz in der Ace- ifl

)0 tatform (AG 1 X-2, erhältlich von der Firma Biorad) beschickte Säule (2 x 10 cm) gereinigt. Man eluiert mit ·4

„•iner 0,2 m-Essigsäurelösung, worauf man die interessanten Fraktionen vereinigt und gefriertrocknet. Man §|

erhält 117 mg (Ausbeute - 83,5%) einer Verbindung mit einem Drehwert von: '''i

[σ];,' = +39° (Methanol). ·;

Man erhält das Produkt schließlich durch Überführen über eine Säule (2 x 80 cm), die mit einem Ionenaus- ^!-i

tauscherharz gefüllt ist (Scphadex G.15, erhältlich von der Firma Pharmacia Uppsala), wobei man mit 0,2 m J>

Essigsäure eluiert, und durch Gefriertrocknen der interessanten Fraktionen. Man erhält schließlich 94 mg <']

(Ausbeute = 80%) der Verbindung V. u

Drehwert: [α]% = +39° (Methanol). ;.;

Analyse: C₂₀H₃₃O₁₂N., · 1 H₂O (525,50) -;■

berechnet: C 45,7, H 6,7, N 7,99; 'i

gefunden: C 44,93, H 6,32, N 7,91. "j

Beispiel 2 §

Dimethylester der 2-(2-Acetamido-2-desoxy-3-O-D-glucopyranose)- <■'.)

D-propionyl-L-alanyl-D-glutaminsäure Ά

In einer ersten Stufe be-eitet man die Verbindung Mur-NAc-L-Ala-D-Glu wie folgt: ;'s

a) Herstellung des Dibenzylesters der BOC-L-alanyl-D-glutaminsäure (A) fj

Unter Rühren gibt man 2,3 g (8 mMol) des Succinimidesters von tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanin, dessen i'

Amin-Gruppe man durch eine tert.-Butyloxycarbonyl-Gruppe geschützt hat (BOC-L-AIa-OSu) zu einer Lösung P|

von 4,5 g (9 mMol) des p-ToluolsuIfonats des Dibenzylesters der D-Glutaminsäure und 1 ml (9 mMol) fc

N-Methylmorpholin in Dimethylformamid. Man läßt die Reaktionsmischung während 12 Stunden bei Raum- S

temperatur stehen und engt dann bis zur Trockne ein. Man nimmt die trockene Verbindung mit 50 ml Äthylace- § tat auf und wäscht nachein, nder mit einer 10%igen Zitronensäurelösung in Wasser, mit einer 1 n-Natriumbicarbonatlösung und schließlicn mit Wasser. Man trocknet die Äthylacetatphase über Magnesiumsulfat, filtriert und
engt ein. Durch Umkristaliisation aus einer Äthylacetat/Hexan-Mischung erhält man 2,50 g (67,5%) des Produktes mit folgenden physikalischen Kenndaten:

F. 105 bis 106⁰C.

Analyse: C₃₇H₁₄O₇N, (498,5)
berechnet: C 65, H 6,9, N 5,6;
gefunden: C 64,85, H 7,0, N 5,5.

b) Dibon/.ylcsler ilcr 2-(2-Ui;n/yliiccUimiil<)-4,6-bi:n/.ylidcn-2-dcsoxy-j-O-l)-glucupyrano.syl)-

D-propionyl-(0-bcnzyl)-L-alanyl-D-glutaminsäure(B)

Man behandelt 500 mg (1 mMol) der in Stufe a) erhaltenen Verbindung A mit 5 ml einer 1 n-Chlorwasserstoffsäurelösung ir. Eisessig. Nach 30 Minuten engt man die Reaktionsmischung bis zur Trockne ein und nimmt das erhaltene Öl in 25 ml einer Acetonitril/Dimethylformamid-Mischung auf (2/1, Volumen/Volumen). Man kühlt die Mischung auf 0⁰C ab und gibt 0,141 ml (1 mMol) Triäthylamin zu. Man gießt die erhaltene Lösung unter Rühren bei 0⁰C in eine Suspension, die man 1,5 Stunden zuvor bereitet und aus472 mg(l mMol) 2-Benzylacetamido-A.o-O-benzylidenO-O-iD-l-carboxyäthylH-desoxy-jS-D-glucopyranosid und 0,141 ml (1 mMol) Triäthylamin in 25 ml einer Acetonitril/Dimethylformamid-Mischung (2/1, Volumen/Volumen) gebildet hat.

Man läßt die Mischung während 12 Stunden bei Raumtemperatur stehen, engt sie dann ein und fallt den Rückstand aus einer 10%igen Zitronensäurelösung aus. Man filtriert den Niederschlag ab, wäscht ihn gut mit Wasser und trocknet ihn. Man erhält 800 mg (94%) des gewünschten Produktes, das folgende physikalische Kenndaten aufweist:

I·. IW bis 199°C. '>

[a\-i = 4,92% (Dimethylformamid).

Nach der Umkristallisation aus Äthanol schmilzt das Material bei 22O⁰C.

Analyse: C₄₇H^O)₂N₃ (851,96)

berechnet: C 66,26, H 6,27, N 4,93; gerunden: C 66,34, H 6,45, N 4,92.

c) 2-(2-Acetamido-2-desoxy-3-0-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-L-alanyl-D-glutaminsäure(C)

oder Mur-NAc-L-Ala-D-Glu

Man behandelt 700 mg (0,8 mMol) der in der Stufe b) erhaltenen Verbindung B mit 40 ml einer 60%igen Essigsäurelösung während 1 Stunde auf einem siedenden Wasserbad. Anschließend engt man die Reaktionsmischung bis zur Trockne ein, nachdem man über Magnesiumsulfat getrocknet hat. Man nimmt den Rückstand mit 1 ml einer Chloroform/Methanol-Mischung (3/3, Volumen/Volumen) auf und trägt die Lösung auf eine mit 35 g Siliziumdioxid beschickte und zuvor mit der gleichen Lösungsmittelmischung äquilibrierten Säule auf. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden aufgefangen und bis zur Trockne eingeengt (wobei ihre Homogenität dünnschichtchromatographisch über Kieselgel unter Verwendung der gleichen Lösungsmittelmischung überprüft wird). Man erhält 185 mg (30%) des Derivates.

Man löst 76 mg dieses Derivates in 15 ml Eisessig und hydriert es in Gegenwart eines Palladiumkatalysators (5 % Palladium auf Kohle). Nach dem Abfiltrieren engt man die Mischung bis zur Trockne ein und fällt aus einer JS Methanol/Aceton/Äther-Mischung aus. Man erhält in dieser Weise 45 mg (92%) des gewünschten Produktes, das folgende physikalische Kenndaten besitzt:

F. 150 bis 155°C.

[a)% = +33° (Eisessig).

Analyse: C₉H₃IO₁₂N₃ · 1 H₂O (511,48)
berechnet: C 44,6, H 8,2, N 6,5;
gefunden: C 44,7, H 8,1, N 6,4.

In einer zweiten Stufe verestert man die zuvor bereitete Verbindung Mur-NAc-L-Ala-D-Glu wie folgt:

Man löst 100 mg (0,2 mMol) Mur-NAc-L-Ala-D-Glu in 10 ml absol. Methanol. Im Verlauf von 15 Minuten gibt man 10 ml einer Lösung von Diazomethan in Äther (die etwa 0,7 mMol Diazomethan pro ml enthält) zu. Nach 90 Minuten gibt man einen Tropfen Essigsäure zu und engt die Reaktionsmischung zur Trockne ein. Den erhaltenen Rückstand reinigt man über eine mit Kieselgel beschickte Säule (1x16 cm), wozu man eine Chloroform/Methanol-Mischung (6/2, Volumen/Volumen) als Elutionsmittel verwendet. Die reinen Fraktionen werden vereinigt und eingeengt. Das Produkt wird in einer Methanol/Aceton/Äther-Mischung ausgefällt. Man erhält 83 mg (Ausbeute = 80%) der gewünschten Verbindung, die folgende physikalische Kenndaten besitzt: ⁰C

F. 137 bis 142° C. ^

[a\o =+31,6° (Eisessig).

Analyse: C₂₁Hj₅O₁₂N₃ (521,53)
berechnet: C 48,36, H 6,76, N 8,57;
gefunden: C 48,0, H 7,0, N 8,2.

Beispiel 3

Methylester des 2-(2-Acetaniido-2-dE5Oxy-3-O-D-glucopyranose)-

D-propioeyl-L-alanyl-D-isoglutamins

Zur H Erstellung dieser Verbindung verwendet man Mur-N Ac-L-Ala-D-iso-Gln, das man nach der Verfahrensweise erhalten hat, die in der FR-PS 22 92 486 beschrieben ist

Man behandelt 100 mg (0,2 mMol) Mur-NAc-L-Ala-D-iso-Gln in der Weise, die bezüglich der Veresterung von Mur-NAc-L-Ala-D-Glu beschrieben ist. Man reinigt das Material mit Hilfe einer Chloroform/Methanol-Mischung (5/5, Volumen/Volumen). Man erhält SO mg des Produktes (Ausbeute = 80%), das folgende physikalische Kenndaten besitzt:
F. 201⁰C.

[artf = +44,2° (Eisessig).
Analyse: C₂₀H₃₄O_nN₄ (506,52) berechnet: C 47,52, H 6,76, N 11,06; gefunden: C 47, H 6,5, N 10,3.

B e i s ρ i e I 4

Pharmakologische Eigenschaften l.Toxizität

Man untersucht die Toxizität der erfindungsgemäßen Produkte durch parenterale Verabreichung der Verbindungen an Mäuse und an Kaninchen. Man beobachtet, daß die toxischen Dosierungen um eine Größenordnung größer sind als die Dosierungen, in denen die Verbindungen ihre angestrebte Wirkung ausüben. So zeigen die :o Verbindungen eine gute Verträglichkeit bei Mäusen in Dosierungen von gleich oder mehr als 100 mg/kg Körpergewicht des Tieres und bei Kaninchen in Dosierungen von gleich oder mehr als 5 mg/kg Körpergewicht des Tieres.

2. Adjuvanswirkung von Mur-NAc-L-Ala-D-Glu-a-OCH,, Mur-NAc-L-Ala-D-G!u(OCH₃)₂ und Mur-NAc-L-Ala-D-iso-Gln(Och₃) in wäßriger Phase

Bei einer Untersuchungsreihe, deren Ergebnisse weiter unten angegeben sind, wurde der Einfluß des erfindungigemäßen Wirkstoffes auf den Gehalt der Antialbumin-Antikörper unter den folgenden Bedingungen untersucht.

Man verabreicht Gruppen von jeweils acht Mäusen des Stammes Swiss mit einem Alter von 2 Monaten durch subeutane Injektion (s. c.) oder auf oralem Wege (ρ. ο.) 0,5 mg des Antigens, das durch Rinderserumalbumin (BSA) gestellt wird, mit oder ohne die zu untersuchende Substanz in Form einer Lösung in einer isotonischen Salzlösung. Diese erhöhte Antigendosis führt, da sie in der Nähe der paralysierenden Dosis gegenüber der Immunreaktion liegt, nur bei den Kontrolltieren zu einer geringen Antigenreaktion oder keine Antigenreaktion, und stellt daher ein strenges Kriterium zum Nachweis der Wirkung einer Substanz mit Adjuvanswirkung dar. 30 Tage später verabreicht man den Mäusen über den gleichen Verabreichungsweg 0,1 mg des gleichen Antigens.

Der Antikörpergehäit wird durch passive Hämaggiuiination bestimmt, wobei man die roten Blutkörperchen von Schafsblut verwendet, die mit Formaldehyd behandelt und mit dem nach der Methode von A. A. Hirata und

M. W. Brandiss (J. Immunol. 100 (1968) 641 bis 648) untersuchten Antigen bedeckt worden sind. Die Probennahnien erfolgen 14, 28, 34 und 36 Tage nach der ersten Injektion.

Zu Vergleichszwecken behandelt man die Mäuse statt mit den erfindungsgemäßen Verbindungen entweder mit Lipopolysacchariden (LPS) (Extrakt von S. enteritidis mit Hilfe der Wasser/Phenol-Methode) oder mit dem von Adam und KoIl. (Infect. Immun. 7 (1973) 855 bis 861) beschriebenen und unter der Bezeichnung .'.VSA" bekannten Adjuvans. Die Kontrollmäuse werden lediglich mit dem Antigen behandelt.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt. Die Antikörpertiter stehen für die maximale Serumverdünnung, die eine gegebene Zahl von roten Blutkörperchen von Schafen agglutiniert.

50 Tabelle I

Ver- Antikörpertiter

abreichungs-

wcg 14. Tag 28. Tag 34. Tag .16. Tag

Kontrolle BSA
BSA + LPS (100 ,uig)
BSA + WSA (300 .ag)

BSA + Mur-NAc-L-Ala-D-Glu-a-OCH, (100 ,_ig) BSA + Mur-NAc-L-Ala-D-Glu-ff-OCH, (10 ag) BSA + Mur-NAc-L-Ala-D-Glu-ff-OCHj (2000 ag) ₆₅ BSA + MUr-NAc-L-AIa-D-ISO-GIn(OCH₃) (100 μg)

BSA+ MUr-NAc-L-AIa-D-GIu(OCH₃), (100 ag) s. c. 50 50 400 1800

BSA-Dosis = 0,5 mg/Tier.

S. C.	<3	3	3	20
S. C.	<3	6	50	1310
S. C.	<3	<3	<3	6
S. C.	12	12	200	400
S. C.	6	6	200	400
p.o.	6	6	50	200
S. C.	12	12	100	800

Diese Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Produkte, die in Form einer isotonischen Salzlösung verabreicht werden, einen erheblichen Anstieg des Gehaltes der gebildeten Antikörper verursachen, und dies auch dann, wenn das Adjuvans auf oralem Wege verabreicht wird. Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe erzielen die gleichen Wirkdngen. wie mail sie mit »LPS« erzielt, wobei festzustellen ist. daß sie im Gegensatz zu dem letzleren Material frei sind von toxischen Wirkungen.

3. Adjuvanswirkung von MUr-NAc-L-AIa-D-GIu-Ur-OCH₃, Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(OCH_;.)₂ und Mur-NAc-L-Ala-D-iso-GlniOCHj) in Gegenwart einer Olphase

Bei dieser Untersuchung verfolgt man das Ansteigen des Gehaltes der für ein gegebenes Antigen spezifischen io gj Antikörper, wenn das Antigen in Form einer Wasser-in-Ol-EmuIsion mit oder ohne die erfindungsgemäße Ver- Jy

bindung injiziert wird. ^!Jj

Die Untersuchungen erfolgen an Gruppen von jeweils 6 weiblichen Meerschweinchen des Stammes Hartley *!

mit einem Gewicht von 350 g. Die Verabreichung erfolgt durch intradermale Injektion in die Fußsohle einer wi

jeden Hinterpfote. Man bringt Ovalbumin (den Antigenbestandteil) in einer Menge von 1 mg oder 0,5 mg in is JS

0,1 ml einer Emulsion einer isotonischen Salzlösung in einer Olphase ein, die entweder das unvollständige §|

Freund'sche Adjuvans (FIA) oder das vollständige Freund'sche Adjuvans (FCA, das aus dem unvollständigen £| Freund'schen Adjuvans besteht, das mit 0,1 ml von ganzen Zellen von Mycobacterium smegmatis versetzt I*

worden ist) enthält. Die erfindungsgemäße Verbindung wird in einer Menge von 0,1 mg verabreicht, und zwar in tj

der das unvollständige Freund'sche Adjuvans enthaltenden Emulsion. 20 \;

18 Tage nach dieser Immunisierung unlcrsucl.i man etwaige verzögerte Hypersensibilitätsreaklionen gegen- ή

über dem Antigen, indem man auf intradcrmalem Wege 0,01 mg oder 5 pg Ovalbumin den Tieren in die Seite _; '■■]

injiziert, worauf man 48 Stunden später die Injektionsstelle untersucht. Man mißt den Durchmesser (in mm) der '

in dieser Weise verursachten Reaktion. *

21 Tage nach der Injektion werden die Tiere getötet und ausgeblutet In dem gewonnenen Serum bestimmt 25 ': man den Gehalt an für Ovalbumin spezifischen Antikörpern durch Ausfällen des Antikörper-Antigen-Komplexes in der Äquivalenzzone. Dann bestimmt man nach der Methode von Folin den Proteinstickstoffgehalt in ι dem Niederschlag. Die Mittelwerte der Antikörpergehalte sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt Diese Werte stehen für die Werte des durch das Antigen ausfallbaren Stickstoffs in Mikrogramm (ug) pro Millimeter Serum. Bei gewissen Untersuchungen wurde auch der Antikörpergehalt durch passive Hämagglutination 30 (PHA) gemäß der weiter oben beschriebenen Methode ermittelt

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle II angegeben. Tabelle II i

Emulsionszubercilung enthaltend das Antigen

Antikörpertiter	Agglutination	Hauttest
Ausfällung ^g/ml)	-	(Durchmesser in mm)
<500	-	0
3200	-	IO±1,5
2600	900	6±3
<500	3600	0
2100	3000	13,5
2100	12

Ovalbumin (I mg) + FIA Ovalbumin (I mg) + FCA (100 ^g)

Ovalbumin (I mg)+ FIA 2600 - 6±3 45

+ Mur-NAc-L-Ala-D-Glu-ff-OCH, (100 rxg) Ovalbumin (0,5 mg) + FIA Ovalbumin (0,5 mg) + FCA (100 μg)

Ovalbumin (0,5 mg) + FlA 2100 3000 12 ^>0

+ Mur-NAc-L-Ala-D-iso-GlnfOCHj) (100 ng)

Ovalbumin (0,5 mg) + FIA 950 2600 6,2

+ Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(OCH,)₂ (l00_;ig)

Die Ergebnisse der obigen Tabelle lassen erkennen, daß die erfindungsgemüßen Verbindungen nach der Verabreichung in Gegenwart einer Olphase das Ansteigen des Gehaltes der gebildeten Antikörper begünstigen und daß sie eine verzögerte Hypersensibilitatsreaktion gegen dasselbe Antigen induzieren.

4. Antiinfektiöse Eigenschaften 60

Die folgenden Untersuchungen verdeutlichen die antiinfektiösen Wirkungen von Mur-NAc-L-Ala-D-Glua-OCHj, Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(OCH,)₂ und Mur-NAc-L-Ala-D-iso-GlniOCH,).

Bei Voruntersuchungen wurde eine experimentelle Methode ermittelt, die den Nachweis des antiinfektiösen Verhaltens der Produkte ermöglicht. So hat sich gezeigt, daß eine Dosis von \0⁴ Zellen von Klebsieila pneumo- 65 niae, die Mäusen durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden, das Absterben eines erheblichen Anteils, wenn nicht sämtlicher Tiere, in der der Inokulation folgenden Woche verursachen. Nach 8 Tagen ist das Überleben der Tiere definitiv gesichert.

Man beobachtet eine Gruppe von Mäusen, die unter Anwendung der oben beschriebenen Bedingungen infiziert und mit Hilfe der zu untersuchenden Verbindungen behandelt worden sind. Zu Vergleichszwecken behandelt man Gruppen von Mäusen mit BCG und mit LPS. Bei den letzteren Verbindungen handelt es sich bekanntlich um ein extrem wirksames immunostimulierendes Mittel, wenn es 24 Stunden vor der Injektion verabreicht wird.

Für diese Untersuchungen verwendet man Hybridmäuse (C57 B1/6 x AKR)Fl, die im Institut Pasteur gezüchtet worden sind, ausgehend von Stämmen, die von dem Institut C. N. R. S. in Orleans stammen. Das Endotoxin oder LPS wurde nach der Phenol/Wasser-Methode aus Salmonella enterilidis variete Danysz (Hinterlegungs-Nummer 5629 des Institut Pasteur) extrahiert Das BCG stammt aus dem Stamm Mycobacterium ίο tuberculosius var. bovis (Hinierlegungs-Nummer 1173 P₂ des Institut Pasteur), der aufeinem Sauton-Medium gezüchtet und mit einer 2%igen Phenollösung abgetötet worden isL

Die Infektion durch Klebsiella pneumoniae, Stamm des Kapseltyps 2, Biotyp d, erfolgt mit Hilfe einer Kultur, die 16 Stunden in einem Medium für Pneumokokken gezüchtet worden ist (Nr. 53515, Institut Pasteur). Die Präparate, die vor oder im Augenblick der Infektion injiziert werden, werden stets mit einer pyrogenfreien, physiologischen Lösung auf 0,2 ml bei parenteraler Verabreichung und auf 0,5 ml bei oraler Verabreichung verdünnt, wobei die Kontrolltiere lediglich mit der Lösung behandelt werden.

Bei den Untersuchungen, deren Ergebnisse in den folgenden Tabellen HI und IV zusammengestellt sind, wurde der Einfluß der Behandlung in Abhängigkeit von der Art, der Dosis und dem Augenblick der Verabreichung des untersuchten Produktes ermittelt. Der Prozentsatz der Schutzwirkung steht für die Differenz des Prozentsatzes der überlebenden Tiere in der Gruppe der behandelten Tiere zu dem Prozentsatz der überlebenden Tiere in der Kontrollgruppe.

Die Ergebnisse zeigen, daß die untersuchten Produkte eine antiinfektiöse Wirkung entfalten, gleichgültig, ob sie aufparenleralcm Wege oder auforalcm Wege gegeben werden. Im Gegensatz dazu ist LPS bei oraler Verabreichung inaktiv, selbst bei sehr hohen Dosierungen (wobei 100 ;zg LPS der lOOOOfachen antiinfektiösen Dosis bei oraler Verabreichung entsprechen).

Andererseits sind die Ergebnisse dieselben, ob man die Produkte nun 24 Stunden vor oder lediglich 1 Stunde vor der die Infektion verursachenden intramuskulären Injektion verabreicht.

30 Tabelle III

Antiinfektiöse Wirkung gegenüber einer intramuskulären Infektion durch 10⁴ Zellen von Klebsiella pneumoniae, wobei die Behandlung 24 Stunden vor der Infektion erfolgt

45

55

Anzahl der	Anzahl der überlebenden	%
behandelten	Tiere am Tage	Schulz
Tiere
	3 5 8

35

40

Verabreichungsweg i. v.

Kontrolle LPS. ! ag

Konirolle BCG, 100 ag

Kontrolle Mur-NAc-L-Ala-D-Glu-ff-OCHj, 100 ag

50 Kontrolle Mur-NAc-L-Ala-D-Gln-OCH.,, 100 ag

Kontrolle MUr-NAc-L-AIa-D-GIu(OCHj)₂, 100 ag

Verabreichungweg p. o.

Kontrolle MUr-NAc-L-AIa-D-GIu-^-OCH₃, 2000 ag

Kontrolle Mur-NAc-L-Ala-D-GlufOCH,).', 2000 ag

Kontrolle LPS, 100 ag

24 24	12 24	8 22	2 22	83
24 24	11 24	9 24	6 21	63
24 24	15 24	11 24	7 23	67
24 24	13 2!	9 13	4 Il	29
24 24	13 21	9 19	4 15	46
12 12	6 11	4 9	2 6	40,5
12 12	6 10	5 9	2 8	50
24 24	14 13	10 10	7 8

Tabelle IV

Antiinfektiöse Schutzwirkung gegenüber einer intramuskulären Infektion durch 10⁴ Zellen von Klebsieila pneumoniae, Behandlung 1 Stunde nach der Infektion

Anzahl der	Anzahl der überlebenden	%
behandelten	Tiere am Tage	Schutz
Tiere
	3 5 8

16	6	2	1	88
16	16	16	14
8	6	5	1	88
8	8	8	8
16	10	6	1	50
16	14	13	10

Verabreichungsweg i. v.

Kontrolle

M ur-N Ac-L-AIa-D-GIu-UT-OCH₃, 100 ?g

Kontrolle MUr-NAc-L-AIa-D-GIu(OCHj)₂, 100 ug

Kontrolle BCG 100 μ"

Bei einer weiteren Untersuchungsreihe wurden die antiinfektiösen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Produkte gegenüber einer sehr heftigen Infektion untersucht, die durch intravenöse Injektion von 10"^: Zellen von Klcbsiclla pneumoniae verursacht wurde.

Bei diesen Untersuchungen, die ebenfalls an Mäusen durchgeführt wurden, erfolgten die Behandlungen 24 Stunden vor der Infektion. Die Bchandlungswcisc und die Dosierungen sind in der folgenden Tabelle V angegeben, in der auch die Ergebnisse dieser Untersuchungen aufgeführt sind.

Tabelle V

Antiinfektiöse Schutzwirkiaig gegen sine intravenöse Infektion durch 10³ Zellen von Klebsiella pneumoniae. Behandlung 24 Stunden vor der Inf'ition

	Anzahl der behandelten Tiere	Anzahl der überlebenden Tiere am Tage 3 5 8	16	12	Schutz	40
Verabreichungsweg i. v.			12	IO
MUr-NAc-L-AIa-D-GIu-O-OCH3, 100 ^g	16	■ 16	16	16	65
Mur-N Ac-L-AIa-D-GIu(OCI l.,)2	16	15	16	16	52,5	45
LPS, 1 μg	16	16			90
IJCG, 100 [tg	16	16	0		TO
Verabreichungsweg p. o.					50
BCG, 2000 ;xg	16	3

Aus den Ergebnissen ist zu ersehen, daß sich bei den mit den erfindungsgemäßen Produkten behandelten Mäusen eine erhebliche Schutzwirkung ergibt.

Somit wird erfindungsgemäß ein neues Adjuvansmittel für Immunitätsreaktionen zur Verfugung gestellt, das in Wasser löslich ist und selbst in Abwesenheit einer Ölphase wirksam ist, sowie Mittel zur Behandlung von Infektionskrankheiten, die frei sind von toxischen Wirkungen, die auf parenteralem oder oralem Wege gegeben werden können und die selbst gegen pathogene Keime wirken, die gegen Antibiotika resistent sind.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Ester von N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin der allgemeinen Formel CH₂OH

OH, H

NH-COCH₃

H₃C-CH-C—NH—CH- CO—NH—CH-CONH₂

I
(CH₂)?