DE69231663T2 - Polysaccharid-protein-konjugate - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen Polysaccharid-Protein- Konjugate und Impfstoffe. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Polysaccharid-Protein-Konjugate, die Serum-IgG- und IgM-Antikörper sowohl gegen Polyα(2→8)-NeuNAc als auch gegen Poly-α(2→9)-NeuNAc induzieren.
- Neisseriae meningitidis sind wichtige Erreger von systemischen Infektionen, insbesondere von Meningitis, beim Menschen. Kapselpolysaccharid (CP)-Impfstoffe sind für Meningokokken der Gruppen A, C, Y und W135 zugelassen. Krankheiten, die durch Meningokokken der Gruppe B ausgelöst werden, treten immer noch in endemischen und epidemischen Formen auf und sind daher auch heute ein wichtiges Gesundheitsproblem (Gotschlich, E. C., (1984), in: Bacterial Vaccines, Hrsg., Germanier (Academic Press, NY), S. 237-255; Peltola, H., Bev. Infect. Dis. 5 (1983), 71- 91; Poolman; J. T., et al., Lancet, ii (1986), 555-557). Escherichia coli (E. coli) K1 ist ein wichtiger Erreger der Neugeborenen-Meningitis, von Infektionen des oberen Harntrakts und von systemischen Infektionen bei hospitalisierten Patienten und bei Haus- und Versuchstieren (Robbins, J. B., et al., N. Eng. J. Med. 290 (1974), 1216- 1220; Kaijser, B., et al., Lancet i (1977), 663-664; Cross, A. S., et al., J. Infect. Dis. 149 (1984), 184-193; Orskov, L, und Orskov, F., J. Hyg. Camb. 95 (1985), 551-575). Die durch diese zwei pathogenen Keime ausgelöste Meningitis geht trotz der antibiotischen Behandlung und der intensiven Pflege immer noch mit einer hohen Morbidität, einschließlich permanenter Schäden des Zentralnervensystems, und mit einer hohen Mortalität einher (Peltola, H., Rev. Infect. Dis. 5 (1983), 71-91; Schneerson, R., (1988), in: Understanding Mental Retardation, Hrsg., Kavanagh, J. F., (Paul Brookes Publishing Co., Baltimore), S. 237-249; Brandtzaeg, P., et al., J. Infect. Dis. 159 (1989), 195-204; McCraken, G. H., Jr, et al., Lancet ü (1974), 246-250).
- Die CP der Meningokokken der Gruppe B und von E. coli K1 sind identisch (Poly-α(2→8)-NeuNAc) und dienen bei beiden Pathogenen als essentielle Virulenzfaktoren und protektive Antigene (Grados, O., und Ewing, W. H., J. Infect. Dis. 122 (1970), 100-103; Kasper, D. L., et al., J. Immunol. 110 (1973), 262-268; Bhattacharjee, A. K., et al., J. Biol. Chem. 250 (1975), 1926-1932; Robbins, J. B., et al., N. Eng. J. Med. 290 (1974), 1216-1220). Poly-α(2→8)-NeuNAc ist auch ein Oberflächenantigen von Moraxella nonfinquefaciens und Pasteurella haemolytica, Serotyp A-2 (Beute, K., et al., NIHP Annals. 6 (1983), 65-73; Devi, S. J. N., et al., Infect. Immun. 59 (1991), 732-736; Adlam, C., et al., FEMS Microbiol. Lett. 42 (1987), 23-25). Der letztere Mikroorganismus ist der wichtigste Erreger von Pasteurellose bei jungen Lämmern, dies legt nahe, dass Poly-α(2→8)-NeuNAc möglicherweise auch noch bei anderen Bakterienarten als Virulenzfaktor vorkommt.
- Versuche, eine schützende Immunität gegen Meningokokken der Gruppe B und gegen E. coli K1 zu induzieren, schlugen fehl, da Poly-α(2→8)-NeuNAc alleine oder als Komplex mit Proteinen der äußeren Membran nur geringe und vorübergehende (transiente) Spiegel von IgM-Antikörpern induzierte (Kasper, D. L., et al., J. Immunol 110 (1973), 262-268; Wyle, F. A., et al., J. Infect. Dis. 126 (1972), 514-522; Zollinger, W. D., et al., J. Clin. Invest. 63 (1979), 836-842; Moreno, C., et al., Infect. Immun. 47 (1985), 527-533; Frasch, C. E., et al., J. Infect. Dis. 158 (1988), 710-718; Lifely, M. R., et al., Vaccine 9 (1991), 606). Auch eine kovalente Verknüpfung von Periodat-behandeltem (Jennings, H., und Lugowshi, C., J. Immunol. 127 (1981), 1011-1018) oder säurehydrolysiertem Poly-α(2→8)-NeuNAc (Porro, M., et al., Med. Trop. 43 (1983), 129-132) mit einem Protein führte nicht dazu, dass Antikörper gegen dieses Antigen hervorgerufen werden. Außerdem wurde in Erwägung gezogen, dass dieses CP ein "Selbst-Antigen" ist, da α(2→8)-NeuNAc auf Glykoproteinen und Gangliosiden in Erwachsenen als Monomere oder Dimere und in fetalen Geweben, einschließlich N-CAMSs, mit bis zu 11 Resten zu finden ist (Finne, J., et al., Lancet ü (1983), 355-357; Finne, J., et al., J. Immunol. 138 (1987), 4402-4407; Soderstrom, T., et al., N. Eng. J. Med. 310 (1984), 726-727). Aus diesem Grund haben Forscher andere Komponenten, z. B. LPS, Proteine der äußeren Membran und Eisenbindende Proteine, oder chemisch modifiziertes Poly-α(2→8)-NeuNAc getestet, ob sie als Impfstoffe in Frage kommen (Zollinger, W. D., et al., J. Clin. Invest., 63 (1979), 836-842; Moreno, C., et al., Infect. Immun. 47 (1985), 527-533; Frasch, C. E., et al., J. Infect. Dis. 158 (1988), 710-718; Jennings, H. J., et al., Infect. Immun. 43 (1984), 407-412; Jennings, H. J., et al., J. Immunol. 137 (1986), 1708-1713; Frasch, C. E., Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suppl.), (1989), S134-S138).
- Die meisten Neugeborenen und Erwachsenen haben bakterizidie Antikörper gegen die drei Haupt-Serogruppen (A, B, C) der Meningokokken (Goldschneider, L, et al., J. Exp. Med. 129 (1969), 1307-1326); der größte Teil der bakteriziden Aktivität, einschließlich Meningokokken der Gruppe B, wurde durch Adsorption mit dem homologen CP entfernt (Frasch, C. E., et al., J. Infect. Dis. 158 (1988), 710-718; Brandt, B. L., et al., J. Immunol. 108 (1972), 913-920; Kasper, D. L., et al., J. Infect. Dis. 127 (1973), 378-387; Skevakis, L., et al., J. Infect. Dis. 149 (1984), 387-396). Die größte Inzidenz der durch Meningokokken, einschließlich der Gruppe B, verursachten Erkrankung liegt in dem Zeitraum, wenn die von der Mutter stammenden Antikörper abgenommen und die Spiegel von Erwachsenen sich noch nicht entwickelt haben (Gotschlich, E. C., (1984), in: Bacterial Vaccines, Hrsg., Germanier, (Academic Press, NY), S. 237-255; Goldschneider, L, et al., J. Exp. Med. 129 (1969), 1307-1326). Erhöhte Spiegel der Antikörper gegen Poly-α(2→8)-NeuNAc, einschließlich der vom Isotyp IgG, lassen sich in Patienten nachweisen, die von einer Meningokokken-Meningitis der Gruppe B genesen sind (Wyle, F. A., et al., J. Infect. Dis. 126 (1972), 514-522; Zollinger, W. D., et al., J. Clin. Invest. 63 (1979), 836-842; Frasch, C. E., et al., J. Infect. Dis. 158 (1988), 710-718; Skevakis, L., et al., J. Infect. Dis. 149 (1984), 387-396; Craven, D. E., et al., Infect. immun. 37 (1982), 132-137; Mandrell, R. E., und Zollinger, W. D., J. Immunol. 129 (1982), 2172-2178; Leinonen, M., und Frasch, C. E., Infect. Immun. 38 (1982),1203-1207). Polyclonale und monoclonale (mAb) Poly-α(2→8)-NeuNAc-Antikörper wurden in Tieren durch mehrfache intravenöse Injektionen mit den Bakterien induziert (Robbins, J. B.; et al., N. Eng. J. Med. 290 (1974), 1216-1220); Moreno, C., et al., Infect. Immun. 47 (1985), 527-533; Mandrell, R. E., und Zollinger, W. D., J. Immunol. 129 (1982), 2172-2178; Allen, P. Z., et al., J. Clin. Microbiol. 15 (1982), 324-329; Craven, D. E., et al., J. Clin. Microbiol. 10 (1979), 302-307; Frosch, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82 (1985), 1194-1198). Monoclonale Antikörper gegen dieses Antigen wurden in einem gesunden 81 jährigen Mann und in Hybridomkulturen identifiziert (Kabat, E. A., et al., J. Exp. Med. 164 (1986), 64254; Kabat, E. A., et al., J. Exp. Med. 168 (1988), 699-711; Raff, H. V., et al., J. Infect. Dis. 157 (1988), 188-126). Diese Antikörper zeigen biologische Aktivitäten, die mit einer schützenden Immunität in Zusammenhang stehen: 1) Komplement-abhängige Bakteriolyse von Meningokokken der Gruppe B (Gotschlich, E. C., (1984), in: Bacterial Vaccines, Hrsg., Germanier (Academic Press, NY), S. 237-255; Goldschneider, L, et al., J. Exp. Med. 129 (1969), 1307-1326); 2) Schutz gegen eine letale Infektion von Nagern durch E. coli K1 (Robbins, J. B., et al., N. Eng. J. Med. 290 (1974), 1216-1220; Glode, M. P., et al., Infect. Immun. 16 (1977), 75-80; Kim. K. S., et al., Infect. Immun. 50 (1985), 734- 737).
- Es gibt zwei weitere bakterielle NeuNAc-Polymere: 1) das CP von N. meningitidis der Gruppe C, das aus Poly-α(2→9)-NeuNAc besteht; wobei die meisten Stämme variabel am C7 oder am C8 O-acetyliert sind (Bhattacharjee, A. K., et al., J. Biol. Chem. 250 (1975), 1926-1932). Obwohl sich das Poly-α(2→9)-NeuNAc vom Poly-α(2→8)-NeuNAc nur durch eine Bindung unterscheidet, ist das erstere immunogen und als Impfstoff gegen Meningokokken der Gruppe C zugelassen (World Health Organization Expert Committee on Biological Standardization, (1977), Technical Report Series, 610, WHO, Genf, Schweiz); 2) das CP von E. coli K92 (Fig. 1) mit der Disaccharid-Wiederholungseinheit von abwechselnden α(2→8)-, α(2→9)-NeuNAc (wobei die Struktur dieses Polysaccharids als 9)-NeuNac-α(2→8)- NeuNAc-α-(2→.) geschrieben werden kann) (Robbins, J. B., et al., Infect. Immun. 6 (1972), 651-656; Glode, M. P., et al., J. Infect. Dis. 135 (1977), 94-102; Egan, W., et al., Biochem. (USA) 16 (1977), 3687-3692; Glode, M. P., et al., J. Infect. Dis. 139 (1979), 52-59). Sowohl Gruppe-B- als auch Gruppe-C-Meningokoklcen-Antiseren bilden mit dem CP von E. coli K92 einen Niederschlag (Glode, M. P., et al., J. Infect. Dis. 135 (1977), 94-102; Egan, W., et al., Biochem. (USA) 16 (1977), 3687-3692; Glode, M. P., et al., J. Infect. Dis. 139 (1979), 52-59). Mehrfache i. v.-Injektionen mit abgetöteten E. coli K92-Bakterien induzierten Niederschlag-bildende Antikörper gegen Poly-α(2→9)-NeuNAc und gegen Poly-α(2→8)-, α(2→9)-NeuNAc, nicht jedoch gegen Poly-α(2→8)-NeuNAc (Glode, M. P., et al., J. Infect. Dis. 135 (1977), 94-102). Die Injektion des CP von E. coli K92 induzierte bei erwachsenen freiwilligen Testpersonen Poly-α(2→9)-NeuNAc-Antikörper; dagegen wurden keine Antikörper gegen Poly-α(2→8)-NeuNAc festgestellt (Glode, M. P., et al., J. Infect. Dis. 139 (1979), 52-59).
- US-A-4695624 beschreibt Konjugate zwischen einem Protein und einem polyanionischen Kapselpolysaccharid, die in der Lage sind, Antikörper sowohl gegen das Protein als auch gegen das Polysaccharid zu induzieren. Das Protein kann Tetanus-Toxoid sein. Das Polysaccharid kann u. a. aus N. meningitidis Typ B, E. coli K1 oder E. coli K92 stammen.
- Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein aus dem Kapselpolysaccharid von E. coli K92 und einem Trägerprotein bestehendes Konjugat für die Herstellung eines Medikaments verwendet, das zur Vorbeugung vor Infektionen eingesetzt werden kann, die durch bakterielle Nicht-K92-Mikroorganismen, die Polyα(2→8)-NeuNAc-Kapselpolysaccharid-Oberflächenantigene aufweisen, und durch bakterielle Nicht-K92-Mikroorganismen verursacht werden, die Poly-α(2→9)- NeuNAc-Kapselpolysaccharid-Oberflächenantigene aufweisen. Das Konjugat löst die Produktion von Antiseren aus, die (i) Antikörper, die mit den bakteriellen Nicht- K92-Mikroorganismen reaktiv sind, welche Poly-α(2→8)-NeuNAc-Kapselpolysaccharid-Oberflächenantigene aufweisen; (ii) Antikörper, die mit den bakteriellen Nicht-K92-Mikroorganismen reaktiv sind, welche Poly-α(2→9)-NeuNAc-Kapselpolysaccharid-Oberflächenantigene aufweisen; und (iii) Antikörper enthalten, die mit dem Trägerprotein reaktiv sind.
- Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die vorstehend definierten Antiseren für die Herstellung eines Medikaments eingesetzt, das zur passiven Immunisierung gegen eine Infektion durch die vorstehend definierten bakteriellen Nicht-K92-Mikroorganismen verwendet wird.
- Fig. 1: Struktur des Kapselpolysaccharids von Escherichia coli K92: Polyα(2→8)-, α(2→9)-NeuNAc (Egan, W., et al., Biochem. (USA) 13 (1977), 3687-3692).
- Fig. 2: Gelfiltration eines K92-TT (Tetanus-Toxoid)-Konjugats. 1,0 ml von K92-TT wurde durch eine 4B-CL-Sepharose-Säule (2,5 · 90 cm) in 0,2 M NaCl laufen gelassen. Die Größe der Fraktionen betrug jeweils 2,0 ml, und das Eluat wurde durch Test auf NeuNAc (Yao, K., und Ubuka, T., Acta Med. Okayama. 41 (1987), 237-241) und durch Absorption bei 280 nm überwacht (World Health Organization Expert Committee on Biological Standardization, (1977), Technical Report Series, 610, WHO, Genf, Schweiz; Schneerson, R., et al., J. Exp. Med. 152 (1980), 361- 376).
- Fig. 3: Doppelte Immundiffusion mit einem K92-Konjugat: Mittlere Vertiefung - K92-TT, 0,1 mg/ml, Vertiefung A - Kaninchen-Antiserum gegen Escherichia coli K92-Zellen, Vertiefung B - Maus-Tetanustoxin-Antiserum.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polysaccharid-Protein-Konjugat und einen Impfstoff. Dieses Konjugat enthält ein Polysaccharid und ein Trägerprotein und ist in der Lage, in einem Säuger oder einem Vogel Serum-IgG- und IgM-Antikörper gegen Poly-α(2→8)-NeuNAc-, gegen Poly-α(2→9)-NeuNAc- oder gegen sowohl Poly-α(2→8)-NeuNAc- als auch Poly-α(2→9)-NeuNAc-Kapselpolysaccharid-Oberflächenantigene zu induzieren. Der Träger wird mit dem Polysaccharid so verknüpft, dass die Immunogenität des Polysaccharids erhöht wird und es dadurch die Eigenschaften erhält, sowohl eine Booster-Antwort als auch IgG-Antikörper hervorzurufen. Diese immunologischen Eigenschaften sollten durch den Protein-Polysaccharid- Impfstoff alleine induziert werden. Die Zugabe von Adjuvantien, wie Aluminiumsalzen, bakteriellen Mureinstrukturen in Kochsalzlösung oder in Emulsionen, kann dazu beitragen, dass die Poly-α(2→8)-NeuNAc- und Poly-α(2→9)-NeuNAc-Antikörper durch die E. coli K92- und durch die Poly-α(2→8)-NeuNAc-Konjugat-Impfstoffe noch besser induziert werden oder ihre Produktion verstärkt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Trägerprotein kovalent an das Polysaccharid gebunden. Die immunologischen Eigenschaften des nativen Polysaccharids undl des nativen Proteins sollten bei der kovalenten Bindung erhalten bleiben. Einige Proteine, die als wirksame Träger für kovalent gebundene Polysaccharid-Protein-Konjugate dienen könnten, sind Albumine, pharmakologisch aktive Proteine, die durch chemische oder genetische Mechanismen entgiftet wurden, umfassend Diphtheria-, Tetanus-, Pertussis-, Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A und Staphylococcus aureus- Toxine, synthetische Polypeptide, bakterielle Proteine der äußeren Membran und virale Proteine (Schneerson, R., et al., (1980), in: New Developments with Human and Veterinary Vaccines, Hrsg., Mizrahi et al., New York, Alan R. Liss; Schneerson, R., et al., (1987), in: Towards Better Carbohydrate Vaccines, Hrsg., Bell, R., und Torrigiani, G., World Health Organization, John Wiley & Sons, Ltd.). Träger für die K92-NeuNAc-Polysaccharide sollten Proteine sein, die immunogen sind und selbst Booster-Antworten induzieren. Träger sollten die erforderlichen Gruppen aufweisen, so dass Konjugate mit den E. coli K92-Polysacchariden synthetisiert werden können. Durch die Träger sollte E. coli K92 die Eigenschaften einer erhöhten Immunogenität und von Booster-Antworten erhalten, umfassend die Bildung von sowohl IgM- als auch IgG-Antikörpern gegen diese Polysaccharide (Schneerson et al., (1987), in: Towards Better Carbohydrate Vaccines, Hrsg., Bell, R., Torrigiani, G., World Health Organization, John Wiley & Sons, Ltd.). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind das Polysaccharid und das Protein durch einen Linker kovalent verbunden. Als ein wirksamer Linker hat sich Adipinsäuredihydrazid erwiesen. Andere Linker könnten Diaminohexan, Amino-ε-capronsäure, N-Hydroxysuccinimidsäureanhydrid-basierte heterobifunktionelle Linker sein, z. B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)- propionat (SPDP). Für die Synthese des Konjugats können auch andere Vernetzungsmittel eingesetzt werden, mit der Maßgabe, dass sie nicht toxisch sind und ein Konjugat ergeben, das Poly-α(2→8)-NeuNAc- und Poly-α(2→9)-NeuNAc-Antikörper hervorruft (Robbins, J. B., Schneerson, R., J. Infect. Dis. 161 (1990), 821-832). Ein Linker ist ein Molekül, das verwendet werden kann, um das Polysaccarid und das Protein kovalent zu verknüpfen. Durch eine chemische Reaktion mit jedem Ende des Linkers wird die Struktur des Linkers verändert. Nachdem z. B. Adipinsäuredihydrazid sich mit dem Polysaccharid und dem Protein unter Herstellung eines Konjugats chemisch verbunden hat, sind das Polysaccharid und das Protein durch eine Adipinsäuredihydrazido-Bindung verknüpft. Das Polysaccharid des Konjugats umfasst ein Heteropolymer von α(2→8)-, α(2→9)-NeuNAc, d. h. K92-Kapselpolysaccharid-Oberflächenantigen, oder Derivate davon. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Trägerprotein Tetanus-Toxoid. Weitere Trägerproteine, die verwendet werden können, umfassen Albumine (Schneerson, R., et al., J. Exp. Med. 152 (1980), 361-376), Diphtheria-Toxoid (Schneerson, R., et al., J. Exp. Med. 152 (1980), 361-376) und Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A sowie Mutanten dieses Proteins (Fattom, A., et al., Infect. Immun. 58 (1990), 2367-2374).
- In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel, welches das vorstehend beschriebene Polysaccharid-Protein-Konjugat in einer ausreichenden Menge umfasst, um systemische Infektionen, einschließlich Meningitis, die durch Neisseria meningitidis der Gruppe B oder der Gruppe C, Escherichia coli K1, Moraxella nonliquefaciens, Pasteurella haemolytica oder andere Mikroorganismen, die Poly-α(2→8)-NeuNAc-, Poly-α(2→9)-NeuNAc- oder Polyα(2→8)-, α(2→9)-NeuNAc-Oberflächenantigene enthalten, verursacht werden, zu verhindern, und welches außerdem ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel, einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten umfasst. Das Arzneimittel der Erfindung umfasst das Polysaccharid-Konjugat in einer Menge, die entsprechend der Verabreichungsroute ausgewählt wird. Obwohl subkutane oder intramuskuläre Verabreichungsrouten bevorzugt sind, kann das vorstehend beschriebene Polysaccharid-Protein-Konjugat auch über eine intraperitoneale oder intravenöse Route appliziert werden. Selbstverständlich weiß der Fachmann, dass die mit einem bestimmten Behandlungsprotokoll zu verabreichenden Mengen einfach festgelegt werden können. Man kann davon ausgehen, dass geeignete Mengen im Bereich von 5,0 bis 100,0 ug pro Dosis von entweder dem Polysaccharid oder dem Protein liegen. (Dabei kann das Verhältnis von Polysaccharid zu Protein, das im Konjugat vorliegt, jeweils unterschiedlich sein. Die für jede der Komponenten angegebenen Dosierungen liegen innerhalb des zu erwartenden Bereichs.)
- Außerdem wird ein Verfahren beschrieben, mit dem bei einem Tier systemische Infektionen, die durch Neisseria meningitidis der Gruppen A, B und C ausgelöst werden, verhindert werden können, indem das vorstehend beschriebene Polysaccharid-Protein-Konjugat und ein Gruppe-A-Meningokokken-Polysaccharid-Protein-Konjugat an das Tier unter Bedingungen verabreicht werden, so dass die Infektionen verhindert werden. Die Zusammensetzungen dienen auch als Impfstoffe.
- Der erste Schritt eines Verfahrens zum Herstellen des Konjugats umfasst das Derivatisieren des Polysaccharids unter Verwendung von z. B. Adipinsäuredihydrazid in einer Carbodiimid-Umsetzung oder von anderen Mitteln und Protokollen. Adipinsäuredihydrazid kann in der Carbodümid-Umsetzung mit anderen Dihydrazidverbindungen oder Diaminoverbindungen (z. B.: Diaminohexan) substituiert werden. Andere Derivate der Polysaccharide können hergestellt werden, so dass diese kovalent an Proteine gebunden werden können. Hierbei sind auch Disulfidbindungen enthalten, die durch heterobifunktionelle Reagenzien geknüpft werden (Szu, S. C., et al., lnfect. Immun. 54 (1986), 448-455; Szu, S. C., et al., J. Exp. Med. 166 (1987), 1510- 1524).
- Nachdem das Polysaccharid derivatisiert wurde, umfasst der nächste Schritt des Verfahrens die Konjugation des Derivats an ein Protein. Vorzugsweise wird das Adipinsäurehydrazid-Derivat des Polysaccharids an das Protein konjugiert, indem das Derivat mit dem Trägerprotein in gleichen Konzentrationen gemischt und der pH-Wert im Bereich zwischen 6,1 und 7,0 eingestellt wird. Die Reaktionspartner werden in 0,2 M NaCl gelöst, wobei die Temperatur bei 3 bis 8ºC liegt. Anschließend wird 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodümid (EDAC) bis zu einer Endkonzentration von weniger als 0,3 M zugegeben. Der ursprüngliche pH-Wert wird drei Stunden beibehalten. Als nächstes wird das Reaktionsgemisch drei Tage bei 3 bis 8ºC gegen 0,2 M NaCl dialysiert, wobei die äußere Flüssigkeit mehrfach gewechselt wird. Mit diesem Syntheseschema einer Mehrpunkt-Verknüpfung ("multipoint attachment") wird das Poly-α(2→8)-NeuNAc oder Poly-α(2→8)-, α(2→9)-NeuNAc nicht entscheidend fragmentiert, weshalb das Polysaccharid mit einer stabilen Konformation bereitgestellt werden kann.
- Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen noch ausführlicher beschrieben, wobei die Beispiele die Erfindung jedoch in keiner Weise einschränken sollen.
- In den nachstehenden Beispielen werden die folgenden Protokolle und experimentellen Einzelheiten angesprochen.
- Bakterien: E. coli 07 : H1 : H-Stamm C94, E. coli 016 : K1H : H-, stabil in der O-Acetylnegativen Form (OAc), E. coli 075 : K1 : H-, OAc&spplus; Stamm LH (Lars A. Hanson, Göteborg, Schweden), E. coli 013 : K92 : H4, Stamm N67, wurden beschrieben (Robbins, J. B., et al., Infect. Immun. 6 (1972), 651-656). Meningokokken der Gruppe B, Serotyp 6, Stamm M990 und Stamm B11, und Meningokokken der Gruppe C, Stamm C11, wurden von Carl E. Frasch, FDA, Bethesda, Maryland, zur Verfügung gestellt.
- Polysaccharide und Proteine: Die CP wurden aus Meningokokken der Gruppe B, den Stämmen B11 und M990, den E. coli-Stämmen C94, LH, 016 : K11 : H- und N67 gereinigt (World Health Organization Expert Committee on Biological Standardization, (1977), Technical Report Series, 610, WHO, Genf, Schweiz). Diese CP enthielten < 1,0% Protein und Nucleinsäure, 75 bis 87% NeuNAc (Yao, K., und Ubuk, T., Acta Med. Okayama. 41 (1987), 237-241), < 0,01% LPS und wiesen beim Lauf durch 4B-CL-Sepharose Kd-Werte von etwa 0,5 auf (World Health Organization Expert Committee on Biological Standardization, (1977), Technical Report Series, 610, WHO, Genf, Schweiz). Der OAc-Gehalt war 1,62 uM/mg für LH und 1,39 uM/mg für das CP von Meningokokken der Gruppe C (Bhattacharjee, A. K., et al., J. Biol. Chem. 250 (1975), 1926-1932; World Health Organization Expert Committee an Biological Standardization, (1977), Technical Report Series, 610, WHO, Genf, Schweiz). Die ¹³C- und Protonen-NMR-Spektren des Poly-α(2→8)-NeuNAc und K92- CP waren mit denen identisch, die für diese zwei Polymere beschrieben wurden (Bhattacharjee, A. K., et al., J. Biol. Chem. 250 (1975), 1926-1932; Egan, W., et al., Biochem. (USA) 16 (1977), 3687-3692). Das CP von Meningokokken der Gruppe C wurde von Pat McVerry, Connaught Laboratories Inc., Swiftwater, PA, und das Tetanus-Toxoid (TT), "lot GYA" und CP von Meningokokken der Gruppe A von Dominique Schulz, Pasteur Merieux Serums and Vaccines, Lyon, Frankreich, zur Verfügung gestellt. Das CP von Streptokokken der Gruppe B, Typ III, wurde im Labor gereinigt (Lagergard, T., et al., Infect. & Immun. 58 (1990), 687-694).
- Hyperimmunseren: Antiseren, die durch intravenöse Injektionen mit abgetöteten Zellen von Meningokokken der Gruppe B, Stamm B11 (horse 46), der Gruppe C, Stamm C11 (burro 211), und Kaninchen-E. coli-K92 hergestellt wurden (Drs. Ida und Frits Orskov, Statens Seruminstitut, Kopenhagen, Dänemark), wurden beschrieben (Orskov, L, und Orskov, F., J. Hyg. Camb. 95 (1985), 551-575; Allen, P. Z., et al., J. Clin. Microbiol. 15 (1982), 324-329; Golde, M. P., et al., J. Infect. Dis. 135 (1977), 94-102; Orskov, F., et al., J. Exp. Med. 149 (1979), 669-685). Mäuse erhielten Injektionen mit Formalin-abgetöteten Zellen, undl anschließend wurden ihre Seren wie beschrieben geerntet (Orskov, L, und Orskov, F., J. Hyg. Camb. 95 (1985), 551-575; Lagergard, T., et al., Infect & Immun. 58 (1990), 68794). Die Antiseren für die Standards wurden in allgemein verwendeten NIH-Mäusen durch i. p.-Injektionen von 5,0 ug TT oder K1-TT&sub1; in Freundschem Adjuvans hergestellt (Lagergard, T., et al., Infect. & Immun. 58 (1990), 687-694).
- Serologie: Doppelte Immundiffusion wurde in 0,6% Agarose durchgeführt. ELISA erfolgte unter Verwendung eines biotinylierten CP (Sutton, A., et al., J. Immunol. Meth. 82 (1985), 215-224). Murine Seren wurden auf Poly-α(2→8)-NeuNAc- und Poly-α(2→9)-NeuNAc- sowie TT-Antikörper getestet, indem mit alkalischer Phosphatase markierte, gegen Maus gerichtete Immunglobuline der Ziege verwendet wurden (Kirkgaard & Perry Inc., Gaithersburg, MD) (Lagergard, T., et al., Infect. & Immun. 58 (1989), 687-694; Sutton, A., et al., J. Immunol. Meth. 82 (1985), 215-224). Ein muriner IgM-mAb gegen Poly-α(2→8)-NeuNAc (Wendell Zollinger, Walter Reed Army Institute of Research, Washington, D. C.) und murine IgM- und IgG-mAb gegen Polyα(2→9)-NeuNAc (Kathryn Stein, FDA, Rockville, MD) wurden als Referenzstandards eingesetzt (Mandrell, R. E., und Zollinger, W. D., J. Immunol 129 (1982), 2172-2178; Rubinstein, L. J., und Stein, K. E., J. Immunol. 141 (1988), 4357-4362). Menschliche Poly-α(2→8)-NeuNAc-Antikörper wurden wie beschrieben getestet (Claesson, B. O., et al., J. Pediatr. 112 (1988), 695-702). Ein menschlicher IgM-mAb (Elvin Kabat, Columbia University, NY) (Kabat, E. A., et al., J. Exp. Med. 164 (1986), 642-654; Kabat, E. A., et al., J. Exp. Med. 168 (1988), 669-711) und ein menschliches Serum mit hohem Titer (GH) wurden als Referenzen für menschliche Poly-α(2→8)-NeuNAc- Antikörper verwendet, wobei die Werte für IgM als ug/ml und für IgG als prozentualer Anteil des Standards ausgedrückt sind.
- Die Wirkung der Temperatur auf die Bindung von IgG an Poly-α(2→8)- NeuNAc und Poly-α(2→9)-NeuNAc wurde mit Seren aus Mäusen getestet, denen Bakterien oder dreimal 10,0 ug der Konjugate injiziert worden waren. Die Werte sind als prozentuale Bindung bei 37ºC im Vergleich zur Bindung bei 22ºC angegeben. Synthese der Konjugate: Es wurde bestätigt, dass eine Behandlung bei einem pH- Wert von < 6,0 oder mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodümid (EDAC) bei Konzentrationen > 0,3 M sogar bei einem neutralen pH-Wert zum Verlust der Antigenität von Poly-α(2→8)-NeuNAc führte (Lifely, M. R., Gilbert, A. S., und Moreno, C., Carb. Res. 94 (1981), 193-201). Demgemäß wurden die CP (5,0 mg/ml in 0,2 M NaCl) mit 0,5 M Adipinsäuredihydrazid (ADH), 0,1 M EDAC, pH 6,1 bis 7,0, bei Raumtemperatur drei bis vier Stunden derivatisiert. Der pH-Wert wurde mit 0,25 N HCl konstant gehalten. Das Reaktonsgemisch wurde bei 3 bis 8ºC zwei Tage gegen 0,2 M NaCl dialysiert, wobei die äußere Flüssigkeit dreimal ausgetauscht wurde, und sodann wurde es in diesem Lösungsmittel über eine 4B-CL-Sepharose®-Säule laufen gelassen. Die CP-enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, gegen steriles pyrogenfreies Wasser dialysiert und gefriergetrocknet. Der Gehalt an Adipinsäurehydrazid (AH) wurde durch Umsetzung mit TNBS bestimmt (Inman, J. K., und H. M. Dintzis, Biochem. (USA) 8 (1969), 4074-4080; Schneerson, R., et al., J. Exp. Med. 152 (1980), 361-376).
- AH-CP und TT wurden bei gleichen Konzentrationen von 7,5 bis 20 mg/ml in 0,2 M NaCl mit 0,1 N HCl auf einen pH-Wert zwischen 6,1 und 7,0 eingestellt. Danach wurde 0,1 M EDAC zugegeben und dieser pH-Wert bei 3 bis 8ºC drei Stunden beibehalten. Das Reaktionsgemisch wurde bei 3 bis 8ºC gegen 0,2 M NaCl dialysiert und anschließend im gleichen Lösungsmittel über eine 4B-CL-Sepharose®-Säule laufen gelassen. Die Fraktionen des Leervolumens wurden vereinigt, auf NeuNAc und Protein getestet und in 0,01% Thimerosal bei 3 bis 8ºC gelagert.
- Immunisierung von Mäusen: Vier bis fünf Wochen alte, allgemein verwendete Mäuse erhielten dreimal, jeweils mit zwei Wochen Abstand, Injektionen mit 2,5 ug NeuNAc in 0,1 ml Kochsalzlösung, entweder als CP alleine oder als Konjugat (Schneerson, R., et al., J. Exp. Med. 152 (1980), 361-376). Zehn Mäuse aus jeder Gruppe wurden sieben Tage nach jeder Injektion ausgeblutet. Keine der Mäuse, denen Kochsalzlösung injiziert worden war (Kontrollen), besaß Antikörper gegen das CP oder gegen das TT (Werte nicht gezeigt).
- Adsorption: Die Spezifität der Poly-α(2→8)-NeuNAc- und Poly-α(2→9)-NeuNAc- IgG-Antikörper wurde anhand eines ELISA bestimmt. Verdünnungen von Seren, die im oberen linearen Bereich der Kurve eine A. ergaben (1,0 bis 1,4), wurden mit 100 ug von entweder Poly-α(2→8)-NeuNAc, Poly-α(2→9)-NeuNAc oder K92-CP gemischt und zwei Stunden bei 22ºC und sodann über Nacht bei 3 bis 8ºC inkubiert. Als Kontrollen dienten CP von Meningokokken der Gruppe A und CP von Streptokokken der Gruppe B, Typ III, (die pro Wiederholungseinheit einen α(2→8)- gekoppelten NeuNAc-Rest enthielten). Die Adsorption durch das CP wurde als prozentuale A. im Vergleich zu den nicht-adsorbierten Seren berechnet.
- Menschliche Seren: Zusammengehörige Proben von mütterlichen und Nabelschnur-Seren wurden von James C. Parke Jr., Charlotte Memorial Hospital and Medical Center, Charlotte, NC, und Eyal Schiff und Justin Passwell, Sheba Medical Center, Israel, zur Verfügung gestellt.
- Statistische Verfahren: Die Auswertung der Daten erfolgte unter Verwendung des "Statistical Analysis System" (SAS). Für alle statistischen Berechnungen wurden die Logarithmen der Konzentrationen verwendet. Antikörper-Konzentrationen, die unter der Empfindlichkeitsgrenze des ELISA lagen, wurden als Werte angegeben, die der Hälfte dieses Werts entsprachen. Ein Vergleich der geometrischen Mittel erfolgte mit dem zweiseitigen T-Test und dem paarweisen T-Test.
- Die Werte repräsentativer Konjugate sind in Tabelle 1 dargestellt. Der prozentuale Anteil der Derivatisierung der CP mit AH lag im Bereich von 0,8 für K1-TT&sub1; bis 10,2 für K92-TT&sub2;. Alle AH-Derivate, mit Ausnahme des letzteren, ergaben mit dem nativen CP bei der doppelten Immundiffusion eine identische Reaktion. Das native CP bildete über diesem K92-AH-Derivat einen Sporn (nicht gezeigt).
- Die Protein/NeuNAc-Verhältnisse wurden auf den prozentualen Anteil der Derivatisierung des CP mit AH bezogen. K1-TT&sub1; hatte das höchste Protein/NeuNAc- Verhältnis (12,8) und enthielt ein CP mit 0,8% AH, K92-TT&sub2; mit dem niedrigsten Verhältnis (1,4) enthielt ein CP mit 10,2% AH. Die höchsten Ausbeuten der Konjugate wurden erhalten, wenn im Konjugations-Reaktionsgemisch TT und AH-CP in Konzentrationen von 7,5 bis 10 mg/ml vorlagen.
- Alle Konjugat-Präparate wurden aus der CL-4B-Sepharose®-Säule mit dem Leervolumen eluiert, was auf eine Mehrpunkt-Verknüpfung zwischen dem AH-CP und dem TT hinweist (Fig. 2). Fig. 3 zeigt den serologischen Beweis für die kovalente Verknüpfung des CP mit dem Trägerprotein (TT). Die Antiseren gegen jede der Komponenten bildeten mit dem repräsentativen Konjugat K1-TT&sub1; identische Linien. Wenn man diese Antiseren mit Gemischen aus CP und TT reagieren ließ, entstanden nicht-identische Niederschlagslinien (nicht gezeigt). Tabelle 1 Charakterisierung von Kapselpolysaccharid-Protein-Koniugaten
- * Konzentration der Reaktionspartner während des Konjugations-Verfahrens.
- ** Die K1-CP für diese Konjugate waren OAc&supmin;.
- *** K1-CP der OAc&spplus;-Variante von Escherichia coli, Stamm LH.
- Die vier CP induzierten keinen Anstieg der IgM- oder IgG-Antikörper. Alle vier α(2→8)-NeuNAc-Konjugate (K1-TT&sub1;, K1-TT&sub2;, MenB-TT&sub1; und MenB-TT&sub2;) bewirkten statistisch signifikante Anstiege von IgM-Antikörpern. Eine IgM-Booster-Antwort wurde durch diese Konjugate nach der zweiten Injektion hervorgerufen; die Spiegel, die durch K1-TT&sub1; und MenB-TT&sub1; induziert wurden, waren höher als die durch die anderen zwei Poly-α(2→8)-NeuNAc-Konjugate induzierten Spiegel (p < 0,001). Nur K1-TT&sub2; und MenB-TT&sub2; induzierten nach der dritten Injektion IgM-Booster-Antworten.
- Die vier Poly-α(2→8)-NeuNAc-Konjugate brachten nach den zweiten und dritten Injektionen statistisch signifikante Anstiege von IgG-Antikörpern zustande. Die durch die dritte Injektion von MenB-TT&sub2; hervorgerufenen IgG-Spiegel (4,29 U/ml) waren höher als diejenigen, die durch die anderen drei Konjugate induziert wurden, wobei sie jedoch nicht signifikant waren (NS). Eine Maus in dieser Gruppe wies einen Wert von 240 U/ml auf, wobei das geometrische Mittel ohne dieses Tier bei 2,74 U/ml lag.
- K1OAC+-TT, hergestellt aus E. coli Stamm LH, hatte hohe Spiegel von IgM- und IgG-Antikörpern gegen die OAc&spplus;-Variante dieses CP und niedrige Antikörper- Spiegel gegen Poly-α(2→8)-NeuNAc zur Folge.
- Die zwei K92-TT induzierten sowohl IgM- als auch IgG-Poly-α(2→8)-NeuNAc- Antikörper; die IgG-Spiegel waren höher als die Spiegel, die durch K1-TT&sub1; (p = 0,01), K1-TT&sub2; (p = 0,0001), MenB-TT&sub1; (p = 0,0002) und MenB-TT&sub2; (p < 0,05) induziert wurden. Auch K92-TT&sub2;, welches das stark-derivatisierte K92-CP enthielt, induzierte höhere IgG-Antikörperspiegel als die K1-TT- und MenB-TT-Konjugate.
- Durch MenC-TT wurden in keiner der Mäuse Poly-α(2→8)-NeuNAc-Antikörper induziert.
- Die Spezifität der Antikörper wurde durch Adsorptions-Experimente gezeigt, wobei Seren aus Mäusen verwendet wurden, denen abgetötete Bakterien injiziert worden waren oder die drei Injektionen des Konjugats erhalten hatten (Werte nicht gezeigt). Poly-α(2→8)-NeuNAc und Poly-α(2→9)-NeuNAc adsorbierten aus den Antiseren homologe IgG-Antikörper (50 bis 89%). Das K92-CP adsorbierte sowohl Poly-α(2→8)- als auch Poly-α(2→9)-NeuNAc-Antikörper (69 bis 89%). Die zwei Kontrollen (CP von Meningokokken der Gruppe A und CP von Streptokokken der Gruppe B, Typ III) adsorbierten sowohl von Poly-α(2→8)- als auch von Polyα(2→9)-NeuNAc-Antikörpern nur weniger als 10%. Tabelle 2 Serum IgG- und IgM-Antikörper gegen das Kapselpolysaccharid von Neisseria meningitidis der Gruppe B und Escherichia coli K1 (Poly-α(2→8)-NeuNAc)
- bzua P < 0,001, h zu i: p = 0,007, h zu g: p < 0,05, h zu f, e: p < 005, h zu d: p = 0,01
- * Der zweite Satz von Werten für das Konjugat K1OAc+-TT wurde bestimmt, indem OAc&spplus;-K1-CP als Antigen eingesetzt wurde.
- Das homologe CP induzierte niedrige Spiegel von Poly-α(2→9)-NeuNAc-IgM- Antikörpern. Weder das homologe noch das heterologe CP induzierte IgG- Antikörper.
- Alle Konjugate induzierten nach der ersten injektion IgM-Antikörper. Diese Spiegel nahmen nach den 2. und 3. Injektionen der MenC-TT- und K92-TT- Konjugate ab und stiegen nur nach den ersten zwei Injektionen der K1-TT-Konjugate an.
- Nur das MenC-TT induzierte nach der ersten Injektion Poly-α(2→9)-NeuNAc- IgG-Antikörper; alle Konjugate induzierten nach den zweiten und dritten Injektionen Anstiege. Die höchsten Spiegel wurden durch MenC-TT > K92-TT > K1-TT hervorgebracht. Ähnlich wie bei den Poly-α(2→8)-NeuNAc-Antikörpern waren die durch K92-TT&sub1; induzierten IgG-Antikörperspiegel höher als die durch K92-TT&sub2; induzierten Spiegel, sie waren jedoch nicht signifikant.
- TT-Antikörper wurden nach jeder Injektion durch alle Konjugate mit Booster- Antworten induziert, ähnlich wie das bei anderen Konjugaten der Fall war, bei denen dieses Protein als Träger verwendet wurde (Werte nicht angegeben) (Robbins, J. B., und Schneerson, R., J. Infect. Dis. 161 (1990), 821-832; Lagergard, T., et al., Infect. & Immun. 58 (1990), 687-694). Tabelle 3 Serum-IgG- und IgM-Antikörper (ug/ml) gegen das Kapselpolysaccharid von Neisseria meningitidis der Gruppe C (Poly-α(2→9)-NeuNAc)
- b zu a: p = 0,0001, d zu c: p = 0,0004, c zu a: p < 0,001, f, g, h zu e: p < 0,0001, g zu f, h: p < 0,001
- Die Bindung der zwei CP durch IgG-Antikörper, die durch K92-TT, K1-TT und MenC-TT-Konjuate sowie E. coli K92- und M. nonliquefaciens-Zellen hervorgerufen worden waren, wurde bei 22ºC und bei 37ºC getestet. Die Bindung von Poly-α(2→8)- NeuNAc-Antikörpern, die durch K1-TT&sub2;, M. nonliquefaciens und K92-TT&sub1; induziert worden waren, war bei 37ºC in ähnlichem Ausmaß herabgesetzt (etwa 40%). Im Gegensatz dazu war die Bindung von Poly-α(2→9)-NeuNAc-Antikörpern, die durch K1-TT&sub2;, K92-TT&sub1;, MenC-TT und E. coli K92-Zellen hervorgerufen worden waren, nur um 10% reduziert. Diese Werte stimmen mit anderen Ergebnissen überein (Mandrell, R. E., und Zollinger, W. D., J. Immunol. 129 (1982), 2172-2178). Tabelle 4 Temperatur-abhängige Bindung von murinen Poly-α(2→8)- und Poly-α(2→9)- NeuNAc-IgG-Antikörpern (prozentuale Bindung bei 37ºC im Vergleich zu 22ºC)
- * N. D. = Nicht nachweisbar
- Die meisten Frauen hatten zum Zeitpunkt der Entbindung nachweisbare IgM- und IgG-Poly-α(2→8)-NeuNAc-Antikörper. Die IgM- und IgG-Spiegel der israelischen Frauen waren höher als die der Frauen in Charlotte, NC, (p + 0,0001). Wie erwartet waren die IgM-Poly-α(2→8)-NeuNAc-Antikörper in der Nabelschnur nur in Spuren vorhanden oder nicht nachweisbar. Die GM-Spiegel von IgG-Antikörpern waren in beiden Regionen in den Nabelschnur-Seren signifikant höher als bei den Müttern. Die meisten Poly-α(2→8)-NeuNAc-IgG-Antikörper lagen in den Nabelschnur-Seren mit einem höheren Titer vor als in den entsprechenden mütterlichen Seren (69/81). Tabelle 5 IgG- und IgM-Antikörper gegen Poly-α(2→8)-NeuNAc in zusammengehörigen menschlichen Seren von Müttern und Neugeborenen (Nabelschnur) (geometrisches Mittel)
- Die Spiegel von IgM-Antikörpern sind als ug Antikörper pro ml und die Spiegel von IgG-Antikörper als prozentualer Anteil eines Erwachsenen-Serums mit hohem Titer (GH) in ELISA-Einheiten angegeben.
- Anhand der vorstehend beschriebenen Konjugat-Impfstoffe können monoclonale oder polyclonale Antikörper menschlicher oder tierischer Herkunft hergestellt werden, die für die passive Immunisierung zur Vorbeugung vor oder als zusätzliche Therapie von systemischen Infektionen mit Organismen, die Poly-α(2→8)-NeuNAc- oder Poly-α(2→9)-NeuNAc-Oberflächenantigene aufweisen, bei einem Tier, einschließlich Menschen, eingesetzt werden können. Die passive Immunisierung für therapeutische und auch für prophylaktische Zwecke wurde schon seit der Jahrhundertwende durchgeführt. Nun hat man die passive Immunisierung wieder in Erwägung gezogen, und zwar zur Vorbeugung vor systemischen Infektionen mit Meningokokken der Gruppe B, einschließlich Meningitis, und außerdem anderen eingekapselten bakteriellen Pathogenen, die systemische Infektionen auslösen, einschließlich Infektionen durch Pneumokokken, Hämophilus influenza Typ b, Streptokokken der Gruppe B und E. coli, bei Wirten mit einem gegenüber der allgemeinen Bevölkerung erhöhten Risiko, umfassend Feten, Neugeborene und Patienten mit angeborener oder erworbener Immunschwäche (Patenten mit Immunschwäche sind möglicherweise nicht in der Lage, schützende Antikörperspiegel zu produzieren, wenn ihnen K92- und/oder Poly-α(2→8)-NeuNAc-Konjugat-Impfstoffe injiziert werden). Die Technik der passiven Immunisierung wird beschrieben von: Flexner, J. Exp. Med. 17 (1913), 553-570; Brahahm, Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 30 (1938), 348; Raifet al., J. Infect. Dis. 157 (1988), 118-126; Kim et al., Infect. Immuno. 50 (1985), 734-737; und Latson et al., Pediatr. Infect. Dis. 7 (1988) 747-752.
- Eine aktive Immunisierung gegen die drei Haupt-Serogruppen von Neisseria meningitidis besteht aus Konjugat-Impfstoffen der Gruppe A in Kombination mit den vorstehend beschriebenen Konjugat-Impfstoffen. Durch dieses Verfahren kann unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Konjugate und eines Gruppe-A-Meningokokken-Konjugats ein dreiwertiger Polysaccharid-Protein-Konjugat-Impfstoff hergestellt werden, der in der Lage ist, Serum-Antikörper gegen Meningokokken-Meningitis der Gruppen A, B und C zu induzieren und dadurch die meisten systemischen Infektionen, einschließlich Meningitis, die durch Neisseria meningitidis ausgelöst werden, zu verhindern. Konjugate, die aus dem Polysaccharid von Meningokokken der Gruppe A und aus Protein bestehen, wurden gemäß einem veröffentlichten Verfahren synthetisiert (Chu et al., lnfect. Immun. 40 (1983), 245-256). Es wurde gezeigt, dass durch eine gleichzeitige Injektion von mehr als einem Polysaccharid-Protein-Konjugat in Tiere und Menschen schützende Antikörperspiegel gegen jede der Komponenten und genauso große Spiegel induziert werden, wie wenn jedes Konjugat getrennt injiziert wird (Schneerson et al., lnfect. Immun. 52 (1986), 501-518).
Claims (14)
1. Verwendung eines Konjugats aus Escherichia coli K92-Kapselpolysacharid
und einem Trägerprotein für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung
in der Vorbeugung einer Infektion, die durch Nicht-K92 bakterielle
Mikroorganismen mit Poly
α(2→8)-NeuNAc-Kapselpolysacharid-Oberlflächenantigenen und durch Nicht-K92 bakterielle Mikroorganismen mit Poly α(2→9)-
NeuNAc-Kapselpofysacharid-Oberflächenantigenen verursacht wird, wobei das
Konjugat die Produktion von Antiseren anregt, enthaltend (i) Antikörper, die mit
den Nicht-K92 bakteriellen Mikroorganismen mit Poly α(2→8)-NeuNAc-
Kapselpolysacharid-Oberflächenantigenen reagieren, (ii) Antikörper, die mit den
Nicht-K92 bakteriellen Mikroorganismen mit Poly
α(2→9)-NeuNAc-Kapselpolysacharid-Oberflächenantigenen reagieren und (iii) Antikörper, die mit dem
Trägerprotein reagieren.
2. Verwendung von Antiseren, die durch ein Konjugat aus Escherichia coli K92-
Kapselpolysacharid und einem Trägerprotein angeregt werden, und enthalten: (i)
Antikörper, die mit Nicht-K92 bakteriellen Mikroorganismen mit Poly α(2→8)-Neu
NAc-Kapselpolysacharid-Oberflächenantigenen reagieren, (ii) Antikörper, die mit
den Nicht-K92 bakteriellen Mikroorganismen mit Poly α(2→9) NeuNAc-
Kapselpolysacharid-Oberflächenantigenen reagieren und (iii) Antikörper, die mit
dem Trägerprotein reagieren, für die Herstellung eines Medikaments zur
Verwendung in der passiven Immunisierung gegen eine Infektion durch Nicht-K92
bakterielle Mikroorganismen mit Poly α(2→8)-NeuNAc-Kapselpolysacharid-
Oberflächenantigenen und durch Nicht-K92 bakterielle Mikroorganismen mit Poly
α(2→9)-NeuNAc-Kapselpolysacharid-Oberflächenantigenen.
3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Antiseren Antikörper enthalten, die
aus den IgM-und IgG-Klassen ausgewählt sind.
4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament ein Impfstoff ist.
5. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei (i) die
Antikörper reaktiv sind mit Escherichia coli K1 oder Gruppe B-N. meningitidis mit
Poly α(2→8) NeuNAc-Polysacharid-Oberflächenantigenen, und (ii) mit der Gruppe
C-N. meningitidis mit Poly α(2→9)-NeuNAc-PolysacharidOberflächenantigenen.
6. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das
Trägerprotein immunogen ist und ausgewählt ist aus Albumin, entgiftetem
Diphterietoxin, Tetanustoxoid, entgiftetem Exotoxin A von Pseudomonas
aeruginosa, entgiftetem Staphylococcus aureus-Toxin, synthetischen
Polypeptiden, bakteriellen Außenmembranproteinen und viralen Proteinen.
7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Trägerprotein Tetanustoxoid ist.
8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das
Konjugat erhältlich ist durch kovalentes Kuppeln des Kapselpolysacharids und
des Trägerproteins mit einem Linker, ausgewählt aus Dihydrazidverbindungen,
Diaminoverbindungen, Amino-ε-capronsäure und
N-Hydroxysuccinimidsäureanhydrid-basierenden heterobifunktionellen Molekülen.
9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei der Linker eine Dihydrazidverbindung
ist.
10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Linker Adipinsäuredihydrazid ist.
11. Verwendung nach Anspruch 8, wobei der Linker Diaminohexan ist.
12. Verwendung nach Anspruch 8, wobei der Linker N-Succinimidyl-3-(2-
pyridyldithio) propionat ist.
13. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Vorbeugung
einer Infektion durch N. meningitidis-Gruppe B-Mikroorganismen.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Vorbeugung einer
Infektion durch E. coli K1-Mikroorganismen.
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