DE69111168T2

DE69111168T2 - Verbesserte Vakzine auf der Basis von Oligosaccharid-Konjugaten.

Info

Publication number: DE69111168T2
Application number: DE69111168T
Authority: DE
Inventors: Massimo Porro
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-08-06
Publication date: 1996-04-04
Anticipated expiration: 2011-08-07
Also published as: KR920006366A; NO300759B1; KR100217317B1; CN1034054C; CN1060294A; FI104046B1; PT99067A; FI104046B; FI914564A0; CS296991A3; NZ239878A; CZ285650B6; US5306492A; JPH06340550A; IE71671B1; SK280112B6; NO913812L; IL99119A; PL169926B1; IE913399A1

Description

1. EINLEITUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen auf der Basis von Oligosaccharid-Konjugaten. In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Oligosaccharid-Impfstoffe hergestellt, die eine monospezifische und homogene Immunantwort auf kapsuläres Polysaccharid hervorrufen. Eine spezielle Ausführungsform der Erfindung stellt Impfstoffe bereit, die eine Immunität gegen weit verbreitete Serotypen von Streptococcus pneumoniae induzieren und von spezieller Bedeutung bei der Verwendung bei pädiatrischen Patienten sowie älteren Patienten und denjenigen mit verringerter Immunität aufgrund von Gebrechlichkeit oder Krankheit (einschließlich beispielsweise AIDS- patienten) sein können.

2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG

2.1. VON STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE VERURSACHTE KRANKHEITEN

Der Pneumokokkus (Streptococcus pneumoniae) ist ein grampositiver Kapsel-Kokkus, der gewöhnlich in Paaren oder kurzen Ketten wächst. In der Diplokokkus-Form sind die benachbarten Ränder abgerundet und die entgegengesetzten Enden leicht zugespitzt, was dem Organismus eine Lanzettenform verleiht.
Pneumokokken können auf der Basis der komplexen Polysaccharide, die ihre Kapseln bilden, in Serotypen eingeteilt werden. 84 Serotypen sind identifiziert worden, indem man sie typenspezifischem Antiserum aussetzte, der Neufeld-Quellungsreaktion. Alle sind für Menschen pathogen, aber den Typen 1, 3, 4, 7, 8 und 12 begegnet man in der klinischen Praxis am häufigsten. Die Typen 6, 14, 19 und 23 verursachen bei Kindern häufig Lungenentzündung und Mittelohrentzündung, sind aber bei Erwachsenen weniger häufig (Austrian, 1983, in "Harrison's Principles of Internal Medicine", Petersdorf et al., Herausgeber, 10. Auflage, McGraw Hill Book Co., New York, Seiten 918 - 922). Insbesondere ist der Pneumokokkus eines der drei primären Pathogene&sub1; die für Lungenentzündung, Sepsis und Meningitis bei Kindern verantwortlich sind (McMillan, 1982, in "Core Textbook of Pediatrics, Kaye et al., Herausgeber, 2. Auflage, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, Seite 498).

2.2. PNEUMOKOKKEN-IMPFSTOFFE

Individuen, die einem höheren durchschnittlichen Risiko der Entwicklung von Pneumokokkeninfektionen unterliegen, schließen Patienten mit chronischen systemischen Erkrankungen, wie Herzkrankheit, chronischer bronchopulmonaner Krankheit, hepatischer Erkrankung, Niereninsuffizienz und maligner Erkrankung ein. Es wird empfohlen, daß diese Individuen gegen Pneumokokken-Infektionen geimpft werden. Zu diesem Zweck sind 23 Impfstoffe, die die kapsulären Polysaccharide der Pneumokokkus-Typen 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F und 33F (die Serotypen oder Gruppen einschließen, die für 90% von ernsthaften Pneumokokkus-Erkrankungen in den Vereinigten Staaten und dem Rest der Welt verantwortlich sind) erhältlich (Pneumovax Merck, Sharpe & Dome und Pnu-Immune , Lederle Laboratories). Die Wirksamkeit dieses Impfstoffes ist bei Kindern fraglich, da sich bei Kindern in einem Alter von weniger als 6 Jahren die immunologische Empfindlichkeit gegen verschiedene kapsuläre Antigene als Ergebnis von Reifungseigenschaften des Immunsystems zu verschiedenen Zeitpunkten entwickelt, und der Schutz von geringerer Zeitdauer sein kann als diejenige, die man bei Erwachsenen beobachtet (Harrison et al., a.a.O.). Obwohl man annimmt, daß relativ wenige Pneumokokkus-Serotypen für die Mehrzahl der pädiatrischen Pneumokokkus-Infektionen verantwortlich sind (Gray et al., 1979, J. Infect. Disease 140: 979 - 983), schließen diese Typen ein, bei denen die Reifung der menschlichen Antikörperantwort auf gereinigte kapsuläre Polysaccharide, die als Impfstoffe verwendet werden, am langsamsten ist (Anderson und Betts, 1989, Pediatric Infec. Dis. J. 8: S50 - S53; Borgono et al., 1978, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 157: 148 - 154).

2.3. KONJUGAT-IMPFSTOFFE

Die Immunempfindlichkeit bei Kindern für kapsuläres Polysaccharid von Haemophilus influenzae b ist durch Kuppeln des kapsulären Antigens an Trägerproteine zur Erzeugung eines "Konjugat"-Impfstoffs erreicht worden; man nimmt an, daß T-Lymphozyten-Helfer-Wirkungen durch das Trägerprotein induziert werden und für die Entwicklung der Immunität verantwortlich sind (Robbins et al., 1984, in "Bacterial Vaccines", Germanier, Herausgeber, Academic Press, New York, Seiten 289 - 316). Siehe auch: Cruse & Lewis, 1989 in "Conjugate Vaccines" Herausgeber Cruse & Lewis, Karger, Basel, Seiten 1 - 10. Ein ähnliches Vorgehen ist bei der Herstellung von Pneumokokkus-Impfstoffen angestrebt worden.

2.3.1. INTAKTE KAPSULÄRE POLYMERE ALS ANTIGENE IN IMPFSTOFFEN

Verschiedene Forscher haben intakte kapsuläre Polymere isoliert und gereinigt, welche in oder als Impfstoffe(n) nützlich sein können. Z.B. beschreibt das US-Patent Nr. 4,220,717 ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von immunologisch aktivem Polyribosylribitphosphat (PRP) aus dem kapsulären Polymer von H. influenzae b. Zusätzlich betrifft das US-Patent Nr. 4,210,641 Polysaccharid-Extrakte von H. influenzae mit einem scheinbaren Molekulargewicht von mehr als 200000 Dalton und hauptsächlich aus Galaktose, Glukose und Mannose zusammengesetzt und eine kleine Menge an Osaminen enthaltend.
Mehrere Forscher haben diese und andere intakte kapsuläre Polymere in Formulierungen verwendet, um bessere immunologische Antworten zu erhalten. Z.B. offenbart das US-Patent Nr. 4,196,192 einen Impfstoff, der gereinigtes intaktes PRP und eine Ganzzellen-Bordetella pertussis- Impfstofformulierung enthält. Dieser Ansatz zur Steigerung der Immunogenität hatte in jungen Säugern vergrößerte Spiegel an Anti-PRP- und Anti-Pertussis-Antikörpern zu Folge.

2.3.2. VERWENDUNG VON TRAGERPROTEINEN, UM ANTISERUM GEGEN HAPTENE HERZUSTELLEN

Trägerproteine können mehr erreichen, als die Immunogenität von konjugierten kapsulären Polymeren zu steigern; sie können auch Haptene immunogen machen. Haptene sind als Moleküle definiert, die sich spezifisch an eine Antikörper- oder Lymphozytenrezeptor binden können, aber selbst keine Immunantwort induzieren können (d.h. sie sind nicht immunogen). Um eine Immunantwort hervorzurufen, müssen kleine Moleküle mit niedrigem Molekulargewicht oder wenig immunogene Moleküle, die als Haptene bezeichnet werden, im allgemeinen zuerst an ein größeres Molekül oder einen Träger gekuppelt werden, bei dem es sich gewöhnlich um ein heterologes Protein handelt. Die Injektion des Hapten-Träger-Komplexes in ein Tier veranlaßt dann die Produktion von Antikörpern durch B- Lymphozyten, von welchen einige in der Lage sein werden, sich spezifisch an das freie, ungekuppelte Hapten-Molekül zu binden.
Unter den frühesten untersuchten Haptenen befanden sich Azo- Farbstoffverbindungen, wie Anilin und o-Aminobenzoesäure. Landsteiner und Lampl (1918, Z. Immun. Forsch. 26: 293) kuppelten diese Verbindungen durch Diazotierung an Serumproteine. Wenn Kaninchen diese künstlich vorher hergestellten Azoproteine injiziert wurden, entwickelten diese fällende Antikörper, die für die verknüpften chemischen Einheiten spezifisch waren.
Andere Beispiele für Hapten-Verbindungen sind Dinitrophenol, das nach Kuppeln als Dinitrophenyl(DNP)-Gruppe an Rinderserumalbumin oder Rindergammaglobulin (BGG) immunogen wird, und Lysergsäurediethylamid. Selbst von Formaldehyd ist gezeigt worden, daß er sich als Hapten benimmt; Personen, die Formaldehyddämpfen aus Produkten oder in Laboratorien ausgesetzt waren, sind nach erfolgter Formylierung ihrer endogenen Makromoleküle in vivo gegen die Verbindung "sensibilisiert" worden.
Ein Hapten-Verhalten ist nicht auf kleine organische Moleküle beschränkt, und Polypeptid-Hormone bis zur Größe von Insulin sind oft wenig, falls überhaupt, immunogen. Um hohe Antikörpertiter gegen diese Hormone zu erhalten, ist es demgemäß notwendig, sie an ein Trägermolekül zu konjugieren (oder durch Vernetzung von vielen dieser Polypeptide miteinander größere Moleküle zu schaffen).
Die Beteiligung des Trägermoleküls ist insofern von besonderem Interesse, als der Träger mehr als eine bloße Transport-Rolle spielt. Ovary und Benaceraff (1963, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 114: 723) zeigten dies, indem sie Kaninchen DNP-BCG injizierten. Die Injektion von vielen immunogenen Materialien in Tiere erzeugt ein immunologisches "Gedächtnis" der Einwirkung. Wenn später eine zweite Injektion verabreicht wird, findet demgemäß eine viel heftigere Immunantwort statt. In der Tat trat, als Ovary und Benaceraff DNP-BCG wieder injizierten, eine starke sekundäre Antwort auf, die zu beträchtlich erhöhten Spiegeln an Antikörpern führte, die sowohl gegen DNP als auch gegen BCG gerichtet waren. Wenn aber die zweite Injektion stattdessen mit DNP-Ovalbumin vorgenommen wurde, wurde eine viel schwächere Anti-DNP-Antikörperantwort bemerkt. Der Unterschied in der Antwort beruhte auf dem, was Trägereffekt genannt wird, und an diesem scheinen T-Helferlymphozyten beteiligt zu sein.
Vorläufige Anhaltspunkte zeigen, daß nicht alle Proteine gleich wirksame Trägerproteine für ein gegebenes Hapten sein könnten. Robbins et al. (Infect. Immun. 40: 245 - 256) haben Daten über experimentelle Protein-Polysaccharid-Konjugat-Impfstoffe vorgelegt, in denen das gleiche Polysaccharid-Hapten an verschiedene Proteinträger konjugiert war, und die Antikörperantwort gegen das Hapten wurde quantitativ bestimmt. Es wurden signifikante Unterschiede in der Menge an erzeugtem Anti-Hapten-Antikörper bemerkt, was eine wichtige Rolle des Trägers auf zeigt.
Lin und Lee (1982, Immunology 46: 333) untersuchten insbesondere mit Bezug auf Pneumokokkus-Impfstoffe Immunantworten bei erwachsenen und jungen Mäusen, die Polysacchariden vom Typ 6A und 19F sowie 19F, der an Protein konjugiert war, ausgesetzt wurden. Signifikant höhere IgM- und IgG2-Antikörpertiter wurden in Mäusen induziert, die 19F-Polysaccharid- Protein-Konjugate erhielten, als in der Kontrollgruppe, die 19F- Polysaccharid allein erhielt.

2.3.3. IMPFSTOFFE, DIE KONJUGATE ENTHALTEN

Andere Forscher haben die Konjugation von kapsulären Polymeren an Trägerproteine mit dem Bestreben untersucht, eine Antikörperbildung durch den sogenannten "Trägereffekt" zu verstärken. Beispielsweise beschreiben Schneerson et al., Journal of Experimental Medicine 152: 361 - 376 (1980) H. influenzae b-Polymer-Protein-Konjugate, von denen offenbart wird, daß sie Immunität gegen von H. influenzae b verursachte invasive Erkrankungen verleihen. Die Literaturstelle dokumentiert das altersbezogene immunologische Verhalten von kapsulären Polymeren bei Kindern und versucht diese Altersabhängigkeit durch Konjugation des intakten kapsulären Polymers mit einer Vielzahl von Proteinen, einschließlich Serumalbuminen, Limulus polyphemus-Hämocyanin und Diphteria-Toxin, zu überwinden. Das Konjugationsverfahren beinhaltet die Verwendung eines verknüpfenden Mittels wie Adipinsäuredihydrazid.
Geyer at al., Med. Microbiol. Immunol. 165: 171 - 288 (1979) stellten durch reduktive Aminierung Konjugate von gewissen kapsulären Klebsiella pneumoniae-Polysaccharid-Fragmenten mit einer Nitrophenylethylamin-Verknüpfungsgruppe her, und der derivatisierte Zucker wurde dann unter Verwendung von Azokupplung mit Proteinen verknüpft.
Das US-Patent Nr. 4,057,685 von McIntire, eingereicht am 09.05.1974, betrifft ein Escherichia coli-Lipopolysaccharid mit verringerter Toxizität, das durch eine Reaktion mit Halogenacylhalogenid kovalent an ein Proteinantigen gekuppelt wurde.
Das US-Patent Nr. 4,356,170 von Jennings et al., eingereicht am 27.05.1981, herausgegeben am 26.10.1982, betrifft die Herstellung von Polysaccharid-Protein-Konjugaten durch reduktive Aminierung.
Anderson (1983, Infection and Immunity 39: 233 - 238) betrifft Konjugate zwischen Oligosacchariden aus kapsulärem Haemophilus influenzae Typ b-Polysaccharid und CRM&sub1;&sub9;&sub7;, einer nicht-toxischen, aber antigenisch identischen Variante von Diphtheria-Toxin.
Snippe et al. (1983, Infection and Immunity 42: 842 - 844) betrifft einen halbsynthetischen Impfstoff gegen Streptococcus pneumoniae Typ 3, in dem ein Hexasaccharid, das aus einem Teil-Säurehydrolysat des kapsulären Polysaccharid S3 isoliert worden war, durch reduktive Aminierung an Stearylamin gekuppelt und dann in Liposomen eingebaut wurde. Man beobachtete, daß der resultierende Konjugat-/Liposomenimpfstoff einen Schutz gegen S. Pneumoniae Typ 3 in Mäusen induzierte.
Das US-Patent Nr. 4,663,160 von Tsay et al., eingereicht am 14.03.1983, herausgegeben am 05.05.1987, betrifft Bakterien, bei denen ein detoxifiziertes Polysaccharid aus einem gramnegativen Bakterium mittels einer 4-12-Kohlenstoffeinheit kovalent an ein detoxifiziertes Protein aus der gleichen Art von gramnegativem Bakterium gekuppelt ist.
Das US-Patent Nr. 4,619,828 von Gordon, eingereicht am 05.01.1984, herausgegeben am 28.10.1986, betrifft Konjugate zwischen Polysaccharid- Molekülen aus pathogenen Bakterien wie Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, neisseria meningitidis und Escherichia coli und T-Zellen-abhängigen Antigenen, wie Diphtheria- und Tetanus-Toxoiden.
Das US-Patent Nr. 4,808,700 von Anderson und Clements, eingereicht am 10.08.1984, herausgegeben am 28.02.1989, und das US-Patent Nr. 4,761,283 von Anderson, eingereicht am 28.03.1986, herausgegeben am 02.08.1988, betreffen die kovalente Verknüpfung von kapsulären Polymerfragmenten mit bakteriellen Toxinen, Toxoiden oder bindenden Untereinheiten mittels reduktiver Aminierung.
Das US-Patent Nr. 4,711,799 von Porro et al., eingereicht am 02.07.1986, herausgegeben am 08.12.1987, betrifft Glycoprotein-Konjugat- Impfstoffe mit dreiwertiger immunogener Aktivität und antigene Determinanten aus den kapsulären Polysacchariden eines grampositiven Bakteriums und eines gramnegativen Bakteriums sowie entweder CRM&sub1;&sub9;&sub7;, Tetanus-Toxoid oder Pertussis-Toxin umfassend.

2.3.4. VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON KONJUGAT-IMPFSTOFFEN

Die Herstellung von Konjugat-Impfstoffen, bei denen kapsuläre Polysaccharid-Haptene mit Trägerproteinen verknüpft werden, sind mit den folgenden Verfahren verbunden:
(i) kapsuläres Polysaccharid muß hergestellt werden,
(ii) falls ein Fragment des Polysaccharids verwendet werden soll, muß es aus intaktem Polysaccharid abgetrennt werden,
(iii) Saccharid muß aktiviert oder der Konjugation zugänglich gemacht werden, d.h. Einheiten, die Protein kovalent binden können, müssen geschaffen werden,
(iv) Saccharid wird an Protein konjugiert.
Verschiedene im Stand der Technik bekannte Verfahren zum Bewerkstelligen dieser vier Schritte sind in Tabelle I aufgeführt. Tabelle I Literaturstelle Herstellung von Polysaccharid Spaltung von Polysaccharid Aktivierung von Polysaccharid Konjugation an Protein US-Patent Nr. 4,356,170 von Jennings, eingereicht am 27.05.81, herausgegeben am 25.10.82 US-Patent Nr. 4,663,160 von Tsay et al., eingereicht am 14.03.83, herausgegeben am 05.05.87 US-Patent Nr. 4,619,829 von Gordon, eingereicht am 05.01.84, herausgegeben am 28.10.86 Polysaccharide, durch Wärmebehandlung auf eine Molekülgröße zwischen 200000 und 2000000 Dalton eingestellt verwendete Periodsäure, um Aldehydgruppen zu erzeugen *Bromcyan reduktive Aminierung unter Verwendung von Cyanborhydrid i) 4-12-Kohlenstoff-Einheit, in Anwesenheit eines Kondensationsmittels, z.B. Carbodiimid, mit Protein verknüpft ii) Polysaccharid über eine Schiff-Basen-Reaktion in Answesenheit eines Reduktionsmittels, z.B. Cyanborhydrid, an mit einer 4-12-Kohlenstoff-Einheit derivatisiertes Protein geknüpft *über eine Spacer-Brücke mit 4-8 Kohlenstoffatomen,wie sie in dem Adipinsaürehydrazid-Derivat des Proteins existieren würde, konjugiert Tabelle I (Fortsetzung) Literaturstelle Herstellung von Polysaccharid Spaltung von Polysaccharid Aktivierung von Polysaccharid Konjugation an Protein US-Patent Nr. 4,808,700 von Anderson und Clements, eingereicht am 10.08.84, herausgegeben am 28.02.89 Abschnitt 6.5 des obigen mit dem Titel "Conjugation of Capsular Polymer Fragment of Streptococcus Pneumoniae to CRM&sub1;&sub9;&sub7;" US-Patent Nr. 4,711,779 von Porro und Costantino, eingereicht am 02.07.86, herausgegeben am 08.12.87 Dänischer Typ 6A, Eli Lilly Co. Eine Vielfalt von Methoden wird verwendet, um antigene Fragment mit mindestens einem reduzierenden Ende zu erzeugen, z.B. begrenzte oxidative Spaltung durch Periodat, Hydrolyse durch Glycosidasen oder saure Hydrolyse Saure Hydrolyse in 0,1 N HC1 über 10 Minuten bei 100ºC, um reduzierende Fragmente zu erzeugen Säurehydrolyse bei 100ºC über 6-40 Stunden. Geeignte Haptene weisen ein Molekularwicht von 1000 bis 2000 Dalton auf Aktiviert durch Einführung von primären Aminogruppen in die terminalen reduzierenden Gruppen (z.B. unter Verwendung von Natriumcyanborhydrid) mit anschließender Überführung in Ester (z.B. in Anwesenheit von Adipinsäure-Derivaten) Konjugation über reduktive Aminierung in Gegenwart von Cyanborhydrid (ungefäh 2-3 Wochen) Unter Verwendung von Natriumcyanborhydrid in Phosphatpuffer über 18 Tage bei 37ºC an CRM&sub1;&sub9;&sub7; konjugiert an Toxoid in Anwesenheit von organischem Lösungsmittel, z.B. Dimethylsulfoxid, konjugiert Tabelle I (Fortsetzung) Literaturstelle Herstellung von Polysaccharid Spaltung von Polysaccharid Aktivierung von Polysaccharid Konjugation an Protein für Streptococcus pneumoniae Typ 6A saure Hydrolyse bei 100ºC über 39 Stunden über 2 Wochen in ammoniakalischem Puffer in Anwesenheit von Natriumcyanborhydrid aktiviert (um primäre Aminogruppen einzuführen); über 4 Stunden in entsprechende monofunktionelle Ester in einer wäßrigen Lösung von Dimethylsulfoxid, die Disuccinimidylester von Adinpinsäure enthielt, überführt in Anwesentheit von Dimethylsulfoxid bei Raumtemperatur über 15 Stunden an CRM&sub1;&sub9;&sub7; konjugiert

3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die kovalente Verknüpfung von aus bakteriellen kapsulären Polysacchariden abstammenden Oligosacchariden mit Trägerproteinen unter Verwendung eines neuen Verfahrens.
Dieses Verfahren gestattet die effiziente Synthese von Glycokonjugaten mit Erzeugungsgeschwindigkeiten, die signifikant schneller als die derzeit verwendeten Methoden sind. Die Glycokonjugate der Erfindung können in Impfstofformulierungen verwendet werden, und es ist gezeigt worden, daß sie immunogen sind.
In einer speziellen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung von Glycokonjugaten, die von kapsulären Streptococcus pneumoniae-Polysacchariden abstammende Oligosaccharide enthalten. Das Verfahren der Erfindung hat die effiziente Herstellung von S. pneumoniae-Glycokonjugaten in hohen Ausbeuten zur Folge, die in Impfstofformulierungen von spezieller Bedeutung für die pädiatrische Bevölkerung verwendet werden können, in der ein großer Teil der Haupterkrankungen mit einer S. pneumoniae-Infektion zusammenhängt. Es ist gefunden worden, daß immunogene Konjugate weniger altersabhängig sind als kapsuläre Polymere allein und für die aktive Immunisierung von sehr jungen warmblütigen Säugern gegen systemische Infektionen durch die entsprechenden Kapsel-Bakterien nützlich sind.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung ist überraschenderweise gefunden worden, daß die Glycokonjugate der Erfindung eine monospezifische und homogene Immunantwort hervorrufen, die vorteilhafterweise die Erzeugung von Autoimmunreaktionen und verwandten post-Impfungssyndromen vermeiden kann.
Was wichtig ist, ist, daß die immunogenen Konjugate der Erfindung keine potentiell toxischen verknüpfenden Mittel enthalten, wie Adipinsäuredihydrazid oder p-Nitro-phenylethylamin, die bei der Konjugation von Kohlehydrat an Protein verwendet worden sind.

3.1. ABKÜRZUNGEN UND DEFINITIONEN

CRM&sub1;&sub9;&sub7; ein nicht-toxisches Protein, das antigenisch kreuzreaktiv mit Diphtheria-Toxin ist
DMSO Dimethylsulfoxid
DP Polymerisationsgrad
MIC minimale Hemmkonzentration
SD Substitutionsgrad
SIDEA Succinimidyldiester von Adipinsäure
SIDES Succinimidyldiester von Bernsteinsäure

4. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Figur 1

Allgemeine Strategie für die Synthese von Oligosaccharid-Protein- Konjugaten
A. Polysaccharide mit hohem Molekulargewicht werden mit Säure hydrolysiert, um Oligosaccharide mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 2,5 x 10³ zu liefern.
B. Oligosaccharide werden (1) durch Reaktion mit Diaminoethan [H&sub2;N(CH&sub2;)&sub2;NH&sub2;] bei pH = 9 aktiviert, mit Pyridinborhydrid (PyBH&sub3;) reduziert, dann (2) mit dem Succinimidyldiester von Adipinsäure (SIDEA) in Dimethylsulfoxid (DMSO) umgesetzt.
C. Aktivierte Oligosaccharide werden via Lysinreste an Trägerprotein gekuppelt.

Figur 2

Verwendung von "maßgeschneiderten" Spacern im Kupplungsverfahren
A. Glycokonjugat, das durch ein früheres Verfahren gebildet wurde, wie von Porro et al., (1985) Mol. Immunol. 22: 907 - 919, beschrieben, mit Amidverknüpfung (Pfeil) zwischen Oligosaccharid und der 4- Kohlenstoff-Verknüpfungsgruppe Adipinsäure. Die Gesamtlänge des Spacers beträgt ungefähr 10,4 Å.
B. Glycokonjugat, das gemäß der vorliegenden Erfindung gebildet wurde, in dem ein 2-Kohlenstoff-Rest (Pfeil, gebildet durch Diaminoethan) und eine Amidverknüpfung zwischen Oligosaccharid und der 2- Kohlenstoff-Verknüpfungsgruppe Bernsteinsäure, gebildet durch Reaktion mit SIDES, vorhanden sind. Die Gesamtlänge des Spacers beträgt ungefähr 10 Å.
C. Glycokonjugat, das gemäß der vorliegende Erfindung gebildet wurde, in dem ein 2-Kohlenstoff-Rest (Pfeil, gebildet durch Diaminoethan) und eine Amidverknüpfung zwischen Oligosaccharid und dem 4- Kohlenstoffrest Adipinsäure, gebildet durch Reaktion mit SIDEA, vorhanden ist. Die Gesamtlänge des Spacers beträgt ungefähr 14,5 Å.

Figur 3

Effizienz der Konjugation von CRM&sub1;&sub9;&sub7; an aktivierte Oligosaccharide, die Adipinsäure enthalten, gegenüber Bernsteinsäurederivat-Spacer. SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese der Produkte der Konjugationsreaktionen (mit Silber angefärbt).
A. Bahn 1: Molekulargewicht-Standards (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K).
Bahn 2: CRM&sub1;&sub9;&sub7; (1 ug), Bezug
Bahn 3: Konjugiertes Oligosaccharid 6A-CRM&sub1;&sub9;&sub7; mit Bernsteinsäure als Spacer (2 ug) (Verhältnis 1:1 Monoester/Gesamtaminogruppen von CRM&sub1;&sub9;&sub7; in 50%-igem DMSO).
Bahn 4: Konjugiertes Oligosaccharid 6A-CRM&sub1;&sub9;&sub7; mit Bernsteinsäure als Spacer (2 ug) (Verhältnis 1:2 Monoester/Gesamtaminogruppen von CRM&sub1;&sub9;&sub7; in 50%-igem DMSO).
Bahn 5: Konjugiertes Oligosaccharid 6A-CRM&sub1;&sub9;&sub7; mit Adipinsäure als Spacer (2 ug) (Verhältnis 1:2 Monoester/Cesamtaminogruppen von CRM&sub1;&sub9;&sub7; in 50%-igem DMSO).
Bahn 6: Konjugiertes Oligosaccharid 14-CRM&sub1;&sub9;&sub7; mit Bernsteinsäure als Spacer (2 ug) (Verhältnis 1:4 Monoester/Gesamtaminogruppen von CRM&sub1;&sub9;&sub7; in 50%-igem DMSO).
Bahn 7: Konjugiertes Oligosaccharid 19F-CRM&sub1;&sub9;&sub7; mit Bernsteinsäure als Spacer (2 ug) (Verhältnis 1:4 Monoester/Gesamtaminogruppen von CRM&sub1;&sub9;&sub7; in Abwesenheit von 50%-igem DMSO).
Bahn 8: Konjugiertes Oligosaccharid 23F-CRM&sub1;&sub9;&sub7; mit Bernsteinsäure als Spacer (2 ug) (Verhältnis 1:2 Monoester/Gesamtaminogruppen von CRM&sub1;&sub9;&sub7; in 50%-igem DMSO).
Bahn 9: CRM&sub1;&sub9;&sub7; (1 ug), Bezug.
B. Bahn 1: CRM&sub1;&sub9;&sub7; (1 ug), Bezug.
Bahn 2: CRM&sub1;&sub9;&sub7;, Bezug (1 ug, andere Charge als Bahn 1).
Bahn 3: Konjugiertes Oligosaccharid 23F-CRM&sub1;&sub9;&sub7; mit Adipinsäure als Spacer (2 ug) (Verhältnis 1:2 Monoester/Gesamtaminogruppen von CRM&sub1;&sub9;&sub7; in 50%-igem DMSO).
Bahn 4: Molekulargewicht-Standards (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K)
Bahn 5: Konjugiertes Oligosaccharid 23F-CRM&sub1;&sub9;&sub7; mit Adipinsäure als Spacer (2 ug) (Verhältnis 1:2 Monoester/Gesamtaminogruppen von CRM&sub1;&sub9;&sub7; in 50%-igem DMSO).
Bahn 6: CRM&sub1;&sub9;&sub7; (1 ug), Bezug. CRM&sub1;&sub9;&sub7;, Bezug (1 ug, andere Charge als Bahn 1).
Bahn 7: Konjugiertes oligosaccharid 6A-CRM&sub1;&sub9;&sub7; mit Adipinsäure als Spacer (2 ug).
C. Bahn 1: Molekulargewicht-Standards (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K)
Bahn 2: CRM&sub1;&sub9;&sub7; (1 ug), Bezug.
Bahn 3: Konjugiertes Oligosaccharid 6A-CRM&sub1;&sub9;&sub7; mit Adipinsäure als Spacer (2 ug).
Bahn 4: Konjugiertes Oligosaccharid 14-CRM&sub1;&sub9;&sub7; mit Adipinsäure als Spacer (2 ug).
Bahn 5: Konjugiertes Oligosaccharid 19F-CRM&sub1;&sub9;&sub7; mit Adipinsäure als Spacer (2 ug).
Bahn 6: Konjugiertes Oligosaccharid 23F-CRM&sub1;&sub9;&sub7; mit Adipinsäure als Spacer (2 ug).
Bahn 7: Molekulargewicht-Marker (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K).

Figur 4

Kaninchen-IgG-Antwort auf S. pneumoniae
Oligosaccharid 6A-CRM&sub1;&sub9;&sub7;-Konjugate. ELISA-Hemmanalyse des vom IgG-Isotyp induzierten Affinitätswerts bei kapsulären Polysaccharide.
A. Kapsuläres Polysaccharid vom Typ 6A
B. Oligosaccharid vom Typ 6A ( = 10) in freier Form oder an CRM&sub1;&sub9;&sub7; konjugiert
C. Oligosaccharid vom Typ 14 ( = 12), durch molekularen Spacer aktiviert oder an CRM&sub1;&sub9;&sub7; konjugiert

5. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die kovalente Verknüpfung von aus bakteriellen kapsulären Polysacchariden abstammenden Oligosacchariden an Trägerproteine; das Verfahren der Erfindung erzeugt neue Glycokonjugate über ein neues Verfahren.
Für die Klarheit der Offenbarung und nicht zur Beschränkung ist die genaue Beschreibung der Erfindung in die folgenden Abschnitte eingeteilt:
(i) Herstellung von Oligosacchariden
(ii) Aktivierung von Oligosacchariden
(iii) Konjugation von Oligosacchariden an Protein
(iv) immunchemische Charakterisierung von Glycokonjugaten Impfstofformulierung und Verabreichung
(vi) Nützlichkeit der Pneumokokkus-Oligosaccharid-Konjugat- Impfstoffe

5.1 HERSTELLUNG VON OLIGOSACCHARIDEN

Kapsuläre Polysaccharide mit hohem Molekulargewicht können im Handel erworben werden (American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD)) oder durch die von Porro et al., 1983, J. Biol. Stand. 11: 65 - 71 beschriebenen Verfahren erhalten werden. Irgendein Polysaccharid kann verwendet werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, denjenigen, die in den Kapseln von Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Salmonella typhi, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa gefunden werden.
Antigene Fragmente mit mindestens einem reduzierenden Ende können durch eine Vielfalt von Verfahren aus kapsulären Polymeren erzeugt werden, abhängig von den strukturellen Merkmalen des speziellen kapsulären Polymers. Begrenzte oxidative Spaltung durch Periodat (oder verwandte Reagenzien) hinterläßt Aldehyd-Enden; ein derartiger Ansatz ist auf Polymere beschränkt, die vicinale Dihydroxygruppen an einem nichtcyclischen Rest aufweisen. Die Hydrolyse einer glycosidischen Verknüpfung erzeugt ein reduzierendes Zuckerende. Eine derartige Hydrolyse kann am spezifischsten enzymatisch durch Glycosidasen bewerkstelligt werden, aber diese Anwendung wäre auf relativ wenige kapsuläre Polymere beschränkt, z.B. Streptococcus pneumoniae 8, für die Glycosidasen bekannt sind. Saure Hydrolyse wird gewöhnlich für die Hydrolyse von glycosidischen Verknüpfungen verwendet. Die Nützlichkeit dieses Ansatzes wäre beschränkt, falls das Polymer säureempfindliche, nicht-glycosidische Verknüpfungen enthält oder falls das Polymer säureempfindliche Zweigverknüpfungen enthält, die für die antigene Spezifität wichtig sind.
In speziellen Ausführungsformen der Erfindung kann kapsuläres S. pneumoniae Typ 6A-Polysaccharid in ungefähr 10&supmin;² M Essigsäure bei ungefähr 100ºC über ungefähr 30 Stunden hydrolysiert werden; kapsuläres S. pneumoniae Typ 14-Polysaccharid kann in ungefähr 0,5 M Trifluoressigsäure bei ungefähr 70ºC über ungefähr 7 Stunden hydrolysiert werden; S. pneumoniae Typ 19F-Polysaccharid kann in ungefähr 10.2 M Essigsäure bei ungefähr 50ºC über ungefähr 48 Stunden hydrolysiert werden; und S. pneumoniae Typ 23F-Polysaccharid kann in ungefähr 0,5 M Trifluoressigsäure bei ungefähr 70ºC über ungefähr 3 Stunden hydrolysiert werden.
Gemäß der Erfindung bestehen an Protein zu konjugierende Oligosaccharide vorzugsweise aus zwischen 3 und 6 sich wiederholenden Einheiten (oder zwischen ungefähr 10 und 30 Monosaccharid-Resten) und bevorzugter aus zwischen 3 und 4 sich wiederholenden Einheiten (oder ungefähr 15 Monosaccharid-Resten), da gezeigt wurde, daß Oligosaccharide dieser Länge, in Glycokonjugate eingebaut, optimal immunogen sind.

5.2. AKTIVIERUNG VON OLIGOSACCHARIDEN

Oligosaccharide können durch das Verfahren der reduktiven Aminierung, gefolgt von einer Reaktion mit einem bifunktionellen Molekül, wie beispielsweise einem Diester, aber nicht beschränkt darauf, aktiviert werden. Ein Schema des Verfahrens der Erfindung ist in Figur 1 und Tabelle II dargestellt, welche das Verfahren der vorliegenden Erfindung mit dem von Porro et al., 1985, Mol. Immunol. 22: 907-919 beschriebenen Verfahren vergleicht. Zu bemerken ist, daß die Aktivierungszeit unter Verwendung des erstgenannten Verfahrens 7 - 14 Tage beträgt. Diese ist gemäß der vorliegenden Erfindung auf 15 Minuten verkürzt worden. Es ist auch zu bemerken, daß die Zeit zur Reduktion, die das erstgenannte Verfahren verwendete, 7 - 14 Tage beträgt; dies ist gemäß der vorliegenden Erfindung auf 48 Stunden verkürzt worden. Demgemäß erfordert die vorliegende Erfindung 12 - 26 Tage weniger zur Beendigung als das erstgenannte Verfahren.
Dies ist ein wichtiger Vorteil, da die Einwirkung höherer Temperaturen, wie 50ºC, auf Kohlehydrate zu einem Abbau führen kann. TABELLE II Chemische Aktivierung der reduzierenden Endeinheit von S. pneumoniae-Oligosacchariden Parameter früheres Verfahren vorliegendes Verfahren eingeführte Gruppe Reagenz (pH) Aktivierungstemperatur Aktivierungszeit Reduktionsmittel Reduktionstemperatur Reduktionszeit resultierendes Produkt aktivierender bifunktioneller Spacer Reaktionstemperatur Reaktionszeit resultierendes Produkt Effizienz der Reaktion ammoniakalischer Puffer (9) Tage Na-Cyanborhydrid Oligo-NH&sub2; SIDEA (Succinimidyldiester von Adipinsäure) Stunden Oligo-NH-Monoester Diaminoethan Minuten Pyridinboran SIDES oder SIDEA (Succinimidyldiester von Bernsteinsäure oder Adipinsäure)
Gemäß dem Verfahren der Erfindung wird die reduktive Aminierung der reduzierenden Endeinheit eines Oligosaccharids unter Verwendung eines zwei Aminogruppen enthaltenden Moleküls durchgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die reduktive Aminierung durch Umsetzung einer gegebenen molaren Menge an Oligosaccharid mit einer Diaminoethan-Lösung in 10-fachem molarem Übeschuß in 0,2 M KH&sub2;PO&sub4; bei ungefähr pH = 9 bei einer Temperatur von ungefähr 25 - 100ºC und vorzugsweise 100ºC über ungefähr 1 - 60 Minuten und vorzugsweise ungefähr 15 Minuten vorgenommen. Danach kann bei der Herstellung eine molare Menge an Pyridinboran zugesetzt werden, die gleich bis zum 25-fachen der molaren Konzentration an Oligosaccharid ist, und eine Reaktion wird bei ungefähr 25 - 100ºC und vorzugsweise ungefähr 50ºC über zwischen ungefähr 1 und 72 und vorzugsweise ungefähr 48 Stunden durchgeführt.
Das resultierende Produkt der reduktiven Aminierungsreaktion kann dann mit einem bifunktionellen Molekül umgesetzt werden, wobei jede funktionelle Gruppe sowohl mit der terminalen Aminogruppe des aktivierten Oligosaccharids als auch den Aminogruppen, die in der Struktur des Trägerproteins vorhanden sind, reagieren kann, so daß das bifunktionelle Molekül dazu dienen kann, das Oligosaccharid und das Trägerprotein zu verknüpfen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die bifunktionelle Gruppe ein Diester und spezieller ein Diester von Adipinsäure, von dem gezeigt wurde, daß er mit einer effizienteren Glycosylierung von Protein verbunden ist. In einer bevorzugten speziellen Ausführungsform der Erfindung wird ein Oligosaccharid, das wie oben beschrieben einer reduktiven Aminierung unterzogen worden ist, weiter mit einem Succinimidyldiester von Bernstein- oder bevorzugter Adipinsäure umgesetzt; diese Reaktion kann am besten mit dem aminierten Oligosaccharid in einer molaren Konzentration (als Aminogruppen), die gleich bis ungefähr 1/5 der molaren Konzentration an SIDEA (oder SIDES) ist, in einer Lösung von Dimethylsulfoxid (DMSO) bei zwischen ungefähr 0 und 25ºC und bevorzugt ungefähr 4ºC über zwischen ungefähr 0,5 und 5 Stunden und vorzugsweise ungefähr 2 Stunden durchgeführt werden. Das aktivierte Oligosaccharid kann dann durch Fällung unter Verwendung von 1,4-Dioxan (80% Vol./Vol.) gesammelt werden, das im Überstand auch den Überschuß von SIDEA (oder SIDES) beläßt.

5.3. KONJUGATION VON OLIGOSACCHARIDEN AN PROTEIN

Proteine, die gemäß der Erfindung verwendet werden, schließen irgendein Protein ein, das bei der Verabreichung an junge Säuger sicher ist und als immunologisch wirksames Trägerprotein dienen kann. In speziellen Ausführungsformen können Zelloberflächenproteine, Membranproteine, Toxine und Toxoide verwendet werden. Kriterien für die Sicherheit würden die Abwesenheit von primärer Toxizität und ein minimales Risiko einer allergischen Reaktion einschließen. Diphtheria- und Tetanus- Toxoide erfüllen diese Kriterien; d.h., geeignet präpariert sind sie nicht-toxisch, und das Auftreten von allergischen Reaktionen ist annehmbar gering. Obwohl das Risiko für eine allergische Reaktion bei Erwachsenen signifikant sein kann, ist es bei Kindern minimal. Gemäß zusätzlichen speziellen Ausführungsformen der Erfindung umschließen geeignete Trägerproteine, ohne darauf beschränkt zu sein, Salmonella-Flagellin, Haemophilus-Pilin, Haemophilus-Membranproteine mit 15 kDa, 28-30 kDa und 40 kDa, wärmelabiles Escherichia coli-Enterotoxin LTB, Cholera-Toxin und virale Proteine, einschließlich Rotavirus VP7 und Respiratory Syncytial Virus F- und G-Proteine.
Beim "Trägereffekt" wird ein schwaches Antigen durch Verknüpfung an ein stärkeres Antigen als Träger (d.h. ein heterologes Protein) immunogener, als wenn es allein vorhanden wäre. Wenn ein Tier zuvor mit dem Träger allein immunisiert worden ist, kann das Tier "sensibilisiert" werden und eine verstärkte Immunantwort nicht nur auf das Trägerantigen, sondern auch auf angeknüpfte Haptengruppen erzeugen. Kinder werden routinemäßig mit Tetanus- und Diphtheria-Toxoiden immunisiert. Dadurch würden sie für eine anschließende Präsentation eines kapsulären Polymerantigens, das an irgendeines dieser Toxoide konjugiert ist, sensibilisiert.
Im allgemeine könnte jedes heterologe Protein als Trägerantigen dienen. Jedoch können gewisse bakterielle Toxine, wie Tetanus und Diphtheria, einen zusätzlichen Vorteil aufweisen, indem sie aus zwei Teilen zusammengesetzt sind, von denen einer (die "bindende" Untereinheit) eine starke Affinität zur Bindung an Säuger-Zelloberflächen aufweist. Es ist denkbar, daß die Konjugation an ein derartiges "bindendes" Protein es gestatten würde, daß das Träger-gebundene Antigen wirksamere Antworten in Zellen des Immunsystems initiiert.
Bei den Trägerproteinen, an die das kapsuläre Polymer konjugiert ist, kann es sich um natives Toxin oder um detoxifiziertes Toxin (Toxoid) handeln. Auch kann man durch relativ neue Mutationstechniken genetisch veränderte Proteine erzeugen, die antigenisch dem Toxin ähnlich, jedoch nicht toxisch sind. Diese werden "kreuzreagierende Materialien" oder CRMs genannt. CRM&sub1;&sub9;&sub7; ist bemerkenswert, da es eine einzige Aminosäurenabänderung vom nativen Diphtheria-Toxin aufweist und immunologisch von diesem ununterscheidbar ist.
Die Konjugation von kapsulärem Polymer an natives Toxin kann die Toxizität verringern, aber eine signifikante Toxizität kann verbleiben. So wird bei einer weiteren Detoxifizierung von Proteintoxinen Formalin verwendet, das mit freien Aminogruppen des Proteins reagiert. Die verbleibende Toxizität kann immer noch bedenklich sein. Weiter ist bei irgendeiner speziellen Impfstoffcharge eine spontane Detoxifizierung möglich und verbleibt bei diesem Ansatz als ein bedenklicher Punkt.
Alternativ kann vor der Konjugation an ein kapsuläres Polymer natives Toxin mit Formalin detoxifiziert werden, wodurch ein herkömmliches Toxoid erzeugt wird. Jedoch verringert die vorherige Formalinbehandlung die Anzahl an freien Aminogruppen, die für eine Reaktion mit den reduzierenden Gruppen des kapsulären Polymerfragments verfügbar sind. CRMs weisen demgemäß signifikante Vorteile auf, indem sie keine inhärente Toxizität besitzen, aber dennoch keine ihrer Aminogruppen durch Formalin besetzt werden. Ein weiter Vorteil besteht darin, daß beim Arbeiten mit CRMs keine biologischen Gefährdungen auftreten.
Im Fall von CRM&sub1;&sub9;&sub7;, das mit nativem Toxin immunologisch identisch ist, verstärkt eine Behandlung mit Formalin (obwohl kein Bedarf für eine Detoxifizierung besteht) stark die immunologische Antwort. Man glaubt, daß dies auf der Stabilisierung des Moleküls gegen Abbau durch Mechanismen des Körpers und/oder auf einer Aggregation durch Vernetzung (die Immunogenität von Teilchen vergrößert sich mit der Größe) beruht.
Aus all den obigen Gründen sind Tetanus- und Diphtheria-Toxine Hauptkandidaten für Trägerproteine, jedoch gibt es andere, die ebenso geeignet sein können. Obwohl diese anderen nicht die Sicherheitstradition aufweisen könnten, die bei Diphtheria und Tetanus gefunden wird, kann es andere überwältigende Gründe geben, sie zu verwenden. Z.B. können sie als Träger noch wirksamer sein, oder die Herstellungswirtschaftlichkeit kann signifikant sein. Andere Kandidaten für Träger schließen Toxine von Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Pertussis und Escherichia coli ein.
In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung können aktivierte Oligosaccharide an CRM&sub1;&sub9;&sub7;-Protein geknüpft werden, das wie folgt gereinigt worden ist:
CRM&sub1;&sub9;&sub7;, das von dem Stamm Corynebacterium diphtheriae erzeugt wird, kann durch Schicken der Bakterienkultur durch eine Millipore-Membran, Fällen von Protein aus dem Filtrat und Reinigen von CRM&sub1;&sub9;&sub7; durch Ionenaustauschchromatographie aus dem Kulturmedium abgetrennt werden, wie in Abschnitt 6 unten beschrieben. Alternativ kann im wesentlichen reines CRM&sub1;&sub9;&sub7; durch irgendein im Stand der Technik bekanntes Verfahren erhalten werden.
Aktiviertes Oligosaccharid kann in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels und gegebenenfalls irgendeines anderen Mittels (wie eines Kondensationsmittels) zur Förderung der Verknüpfung der terminalen funktionellen Gruppe des aktivierten Oligosaccharids mit dem Protein kovalent an ein Trägerprotein geknüpft werden. In einer speziellen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann aktiviertes Oligosaccharid, das eine terminale Estertruppe trägt, wie folgt kovalent mit freien Aminogruppen, die auf dem Trägerprotein vorhanden sind, verknüpft werden.
Aktiviertes Oligosaccharid kann in Dimethylsulfoxid gelöst werden und dann zu einer wäßrigen Lösung vom Trägerprotein (z.B. CRM&sub1;&sub9;&sub7; bei einer Konzentration von ungefähr 2 mg/ml, aber nicht darauf beschränkt) gegeben werden, so daß das Molverhältnis von Monoester-aktiviertem Oligosaccharid/gesamten Aminogruppen des Trägerproteins ungefähr 1:2 beträgt und die Endkonzentration von DMSO ungefähr 50% (Vol./Vol.) beträgt. Die Konjugationsreaktion wird bei 4ºC durchgeführt, und obwohl die Reaktion in ungefähr 2 Stunden nahezu beendet ist, ist es angebracht, die Reaktion über Nacht andauern zu lassen, um die Ausbeute der Reaktion auf den höchsten Wert für jedes typenspezifische Glycokonjugat zu steigern. Die so erhaltenen Glycokonjugate werden dann durch Gelchromatographie gereinigt.
Für die Synthese eines einwertigen Impfstoffs können Oligosaccharide, die von einem einzigen Serotyp eines Bakteriums abstammen, an das Protein konjugiert werden. Für die Synthese eines mehrwertigen Impfstoffs können Glycokonjugate hergestellt werden, indem man eine Mischung von Oligosacchariden, die von Bakterien verschiedener Arten oder verschiedener Serotypen abstammen, an ein Trägerprotein knüpft; alternativ können Glycokonjugate, die durch Umsetzen eines einzigen Oligosaccharid-Typs mit Trägerprotein in gesonderten Reaktionen unter Verwendung verschiedener Oligosaccharide erzeugt wurden, gemischt werden. Demgemäß kann ein mehrwertiger Impfstoff ein Trägerprotein umfassen, das eine homogene oder eine heterogene Population von verknüpften Oligosacchariden trägt.

5.4. IMMUNCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG VON GLYCOKONJUGATEN

Die Verifizierung der Immunogenität der durch das obige Verfahren hergestellten Glycokonjugate kann vor der Verabreichung an Menschen in irgendeinem geeigneten Tiersystem getestet werden, einschließlich Kaninchen, Schweinen, Meerschweinchen, Mäusen, Ratten oder Ziegen, aber nicht darauf beschränkt. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung können Kaninchen (mit ungefähr 2 kg Gewicht) subkutan mit Glycoproteinkonjugat in Anwesenheit oder Abwesenheit von Aluminiumphosphat oder -hydroxid geimpft werden. Ungefähr 2,5 ug Oligosaccharid würden eine geeignete Dosis für ein Kaninchen mit 2 kg darstellen. Antikörpertiter können dann durch einen Enzym-verknüpften Immunsorbensassay (ELISA) oder durch andere im Stand der Technik bekannte Verfahren ausgewertet werden.
Da die Antikörper, die gegen die Glycokonjugate der Erfindung erzeugt werden, nicht zu einer Immunfällung von Antigen in der Lage sein können, werden Antikörperassays, die auf Immunfällung beruhen, nicht für die Bestimmung der Titer empfohlen.

5.5. IMPFSTOFFORMULIERUNG UND VERABREICHUNG

Geeignete Trägermedien zur Formulierung eines Impfstoffs schließen Natriumphosphat-gepufferte Kochsalzlösung (pH 7,4) oder 0,125 M Aluminiumphosphat-Gel, suspendiert in Natriumphosphat-gepufferter Kochsalzlösung bei pH 6, und andere übliche Medien ein.
Im allgemeinen sind Impfstoffe, die ungefähr 5 bis ungefähr 100 ug, vorzugsweise ungefähr 10 bis 50 ug Oligosaccharid enthalten, geeignet, um in jungen warmblütigen Säugern wirksame Spiegel an Antikörper gegen das kapsuläre Polymer hervorzurufen. Selbstverständlich würde die genaue Dosis durch routinemäßige Dosis-/Antwortexperimente bestimmt werden. Die Konzentration der Glycoproteinkonjugate zur Herstellung von Impfstoffen für Kinder liegt im Bereich von ungefähr 25 bis 200 ug Oligosaccharid. Größere Dosen können auf der Grundlage des Körpergewichts verabreicht werden. Man wird erwarten, daß mehrere kleine Dosen, die hintereinander verabreicht werden, der gleichen Menge an Konjugat, die als einzelne Injektion verabreicht wird, überlegen sind.
Die Impfstoffe der Erfindung können warmblütigen Säugern jeden Alters verabreicht werden und sind besonders angepaßt, eine aktive Immunisierung gegen systemische Infektionen bei jungen Säugern zu induzieren, welche von den Pathogenen Haemophilus influenzae Typ b, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis und Pseudomonas aeruginosa verursacht werden.
Gemäß der Erfindung kann der Impfstoff subkutan, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, oral oder intranasal zugeführt werden. Der Impfstoff kann Glycokonjugat in gelöster oder in Mikroteilchen-Form oder in Mikrokügelchen oder Mikrovesikel, einschließlich Liposomen, eingebaut umfassen.

5.6. NÜTZLICHKEIT DER OLIGOSACCHARID-KONJUGAT-IMPFSTOFFE

In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden Glycokonjugat- Impfstoffe, die gegen pathogene Kapsel-Bakterien gerichtet sind, verwendet, um empfängliche Individuen davor zu schützen, durch diese Agenzien verursachte Infektionen zu entwickeln. Empfängliche Individuen schließen junge Kinder mit unreifen Immunsystemen, Individuen ohne Milz sowie irgendwelche Individuen mit einem gestörten Immunsystem oder einer chronischen Erkrankung, insbesondere dem erworbenen Immundeffizienzsyndrom (AIDS), hämatopoetischer maligner Erkrankung, Diabetes, chronischer Herzkrankheit, chronischer Lungenkrankheit und Sichelzellenanämie ein. Die Glycokonjugate dieser Erfindung verstärken aufgrund ihrer Konjugation an ein Trägerprotein die Immunogenität der Oligosaccharide, die sie tragen.
Demgemäß können die Glycokonjugate der Erfindung bei Schutzimpfungen verwendet werden, die Schutz gegen eine Infektion mit irgendwelchen Bakterien verleihen, die eine Polysaccharid-Kapsel besitzen, einschließlich Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa. Stamme von S. pneumoniae, die insbesondere in Kindern virulent sind und für die die vorliegende Erfindung speziell vorgesehen ist, schließen die Typen 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 158, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23 und 33F ein.
In speziellen Ausführungsformen können die Impfstoffe der Erfindung verwendet werden, um eine monospezifische und homogene Immunantwort zu induzieren. Eine monospezifische Immunantwort bringt eine Anzahl von Vorteilen mit sich, einschließlich der Bereitstellung von Antikörpern mit (i) homogener Spezifizität, bei der im wesentlichen alle Antikörper gegen ein spezifisches Epitop gerichtet sind und die durch den gleichen Wert der Affinitätskonstanten gekennzeichnet sind; (ii) eines hohen Werts der Affinitätskonstanten mit überlegener antibakterieller Wirkung; (iii) vermehrter Zielspezifität und Abwesenheit von Kreuzreaktivität mit Antigenen, die mit dem Wirt in Beziehung stehen, was einen sichereren Impfstoff zur Folge hat; und (iv) verringerter Komplementaktivierung aufgrund einer verringerten Fällungsaktivität von monospezifischen Antikörpern, was ebenso einen sichereren Wirkstoff zur Folge hat.
In zusätzlichen Ausführungsformen kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um Impfstoffe zu erzeugen, die Peptide oder Lipooligosaccharide oder andere Oberflächenoligosaccharid-Haptene erkennen, die durch Verfahren der Erfindung an Trägerproteine geknüpft sind. Derartige Impfstoffe können z.B. bei der Induktion von Immunität gegen Tumorzellen oder bei der Herstellung von Antitumor-Antikörpern, die an ein chemotherapeutisches oder bioaktives Mittel konjugiert sind, verwendet werden; eine derartige Anti-Tumoraktivität könnte durch Verknüpfen eines tumorspezifischen Antigens oder Epitops desselben an ein Trägerprotein unter Verwendung von Verfahren der Erfindung induziert werden.

6. BEISPIEL: ENTWICKLUNG EINES MEHRWERTIGEN PNEUMOKOKKUS-OLIGOSACCHARID- KONJUGAT-IMPFSTOFFES

6.1. HERSTELLUNG VON POLYSACCHARID

Kapsuläres S. pneumoniae Typ 6A-Polysaccharid, kapsuläres S. pneumoniae Typ 14-Polysaccharid, kapsuläres S. pneumoniae Typ 19F- Polysaccharid und kapsuläres S. pneumoniae Typ 23F-Polysaccharid wurden von der American Type Culture Collection erhalten.

6.2. HYDROLYSE VON POLYSACCHARID

6.2.1. HYDROLYSE VON S. PNEUMONIAE TYP 6A-POLYSACCHARID

2 mg kapsuläres Typ 6A S. pneumoniae-Polysaccharid wurden in 1 ml wäßriger Lösung gelöst, die 10 mM Essigsäure bei pH = 3,4 enthielt, dann ließ man in verschlossenen Ampullen hydrolysieren, die 30 Stunden in ein Ölbad bei einer Temperatur von 100ºC getaucht wurden. Die resultierenden Oligosaccharide wurden dann durch Chromatographie über Sephadex G15 (Pharmacia, Uppsala), das mit einer 15 mM NaCl-Lösung konditioniert war, bei pH 7,0 bei 4ºC aus der Reaktionsmischung abgetrennt.
Die chromatographischen Eluate wurden dann gemäß den von Kabat (1964 in "Experimental Immunochemistry", Herausgeber E.A. Rabat und Mayer, Seiten 538 - 541), Chen et al. (1956, Anal. Chem. 28: 1756 - 1758) und Porro et al. (1981, Anal. Biochem. 118: 301 - 306) beschriebenen Verfahren analysiert, um die Anwesenheit von Methylpentosen, Phosphor und reduzierenden Gruppen, z.B. Aldehydgruppen, festzustellen. Die Analyse ergab ein Methylpentose/Aldehyd-Verhältnis von 3,96, ein Methylpentose/Phosphor-Verhältnis von 0,96 und ein Phosphor/Aldehyd- Verhältnis von 4,12.
Gelchromatographie auf Sephadex G-50 Superfine (Pharmacia) unter Verwendung von Puffer zeigte eine Verteilungskonstante (Kd) von 0,538 (durch Hexose), was einem Molekulargewicht von ungefähr 2500 entsprach.
NMR, Gaschromatographie und stöchiometrische Analyse zeigten, daß die Oligosaccharide aus 3 - 4 sich wiederholenden Grundeinheiten bestanden, unter denen Galaktose gefunden wurde, der der immundominante Zucker war.

6.2.2. HYDROLYSE VON S. PNEUMONIAE TYP 14-POLYSACCHARID

2 mg kapsuläres Typ 14 S. pneumoniae-Polysaccharid wurden in 1 ml einer wäßrigen Lösung gelöst, die 0,5 M Trifluoressigsäure enthielt, dann ließ man in verschlossenen Ampullen hydrolysieren, die 7 Stunden in ein Ölbad bei einer Temperatur von 70ºC getaucht wurden. Die resultierenden Oligosaccharide wurden durch Chromatographie über Sephadex G15 (Pharmacia, Uppsala), das mit einer 15 mM Nacl-Lösung konditioniert war, bei pH 7,0 bei 4ºC aus der Reaktionsmischung abgetrennt.
Die chromatographischen Eluate wurden dann auf Hexosamin- und Aldehydgehalt analysiert, und man fand, daß sie ein Hexosamin-zu-Aldehyd- Verhältnis von 3,17 aufwiesen. Gaschromatographie und stöchiometrische Analyse zeigten eine Molekülgröße, die 3 bis 4 sich wiederholenden Grundeinheiten entsprach. Die Aufhebung der Verzweigung von Galaktose, wie durch Gaschromatographie bestimmt, lag innerhalb von 10%. Gelchromatographie auf Sephadex G-50 Superfine (Pharmacia) unter Verwendung von 15 mM NaCl bei pH 7,0 zeigte für das Oligosaccharid eine Verteilungskonstante (Kd) von 0,30, wie durch Gesamthexose bestimmt.

6.2.3. HYDROLYSE VON S. PNEUMONIAE TYP 19F-POLYSACCHARID

2 mg kapsuläres Typ 19F S. pneumoniae-Polysaccharid wurden in 1 ml wäßriger Lösung gelöst, die 10 mM Essigsäure bei pH = 3,4 enthielt, dann ließ man in verschlossenen Ampullen hydrolysieren, die 48 Stunden in ein Ölbad bei einer Temperatur von 50ºC getaucht wurden. Die resultierenden Oligosaccharide wurden dann durch Chromatographie über Sephadex G-15 (Pharmacia, Uppsala), das mit einer 15 mM NaCl-Lösung konditioniert war, bei pH 7,0 bei 4ºC aus der Reaktionsmischung abgetrennt.
Die chromatographischen Eluate wurden dann gemäß den von Kabat (1964 in "Experimental Immunochemistry", Herausgeber E.A. Rabat und Mayer, Seiten 538 - 541), Chen et al. (1956, Anal. Chem. 28: 1756 - 1758) und Porro et al. (1981, Anal. Biochem. 118: 301 - 306) beschriebenen Verfahren analysiert, um die Anwesenheit von Methylpentosen, Phosphor und reduzierenden Gruppen, z.B. Aldehydgruppen, festzustellen. Die Analyse zeigte ein Methylpentose/reduzierte Methylpentose-Verhältnis von 3,5 und ein Methylpentose/Phosphor-Verhältnis von 3,2.
Gelchromatographie auf Sephadex G-50 Superfine (Pharmacia) zeigte für das Oligosaccharid eine Kd = 0,46 (durch Gesamthexose) und die kombinierte Analyse durch Gaschromatographie und Stöchiometrie zeigte eine Größe, die 3 bis 4 sich wiederholenden Grundeinheiten entsprach.

6.2.4. HYDROLYSE VON S. PNEUMONIAE TYP 23F-POLYSACCHARID

2 mg kapsuläres Typ 23F S. pneumoniae-Polysaccharid wurden in 1 ml einer wäßrigen Lösung gelöst, die 0,5 M Trifluoressigsäure enthielt, dann ließ man in verschlossenen Ampullen hydrolysieren, die 3 Stunden in ein Ölbad bei einer Temperatur von 70ºC getaucht wurden. Die resultierenden Oligosaccharide wurden durch Chromatographie über Sephadex G15 (Pharmacia, Uppsala), das mit einer 15 mM NaCl-Lösung konditioniert war, bei pH 7,0 bei 4ºC aus der Reaktionsmischung abgetrennt.
Die chromatographischen Eluate wurden dann gemäß den von Kabat (1964 in "Experimental Immunochemistry", Herausgeber E.A. Rabat und Mayer, Seiten 538 - 541), Chen et al. (1956, Anal. Chem. 28: 1756 - 1758) und Porro et al. (1981, Anal. Biochem. 118: 301 - 306) beschriebenen Verfahren analysiert, um die Anwesenheit von Methylpentosen, Phosphor und reduzierenden Gruppen, z.B. Aldehydgruppen, festzustellen. Die Analyse zeigte ein Hexose/Aldehyd-Verhältnis von 4,5 - 4,5, ein Hexose/Methyl pentose-Verhältnis von 2,3 und ein Phosphor/Aldehyd-Verhältnis von 2,9.
Gaschromatographie und stöchiometrische Analysen zeigten die Anwesenheit von zwischen 3,5 und 4,5 sich wiederholenden Grundeinheiten. Die Aufhebung der Verzweigung von Rhamnose, wie durch Gaschromatographie bestimmt, betrug weniger als 8%.
Gelchromatographie auf Sephadex G-50 Superfine (Pharmacia) zeigte eine Verteilungskonstante (Kd) von 0,38 (durch Hexose).

6.3. IMMUNCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG VON S. PNEUMONIAE OLIGOSACCHARID-HAPTENEN

Die Fähigkeit von S. pneumoniae Typ 6A-, 14-, 19F- und 23F- Oligosacchariden, mit Antikörpern wechselzuwirken, die gegen intakte kapsuläre Polysaccharide gerichtet sind, wurde wie bei Porro et al. (1985, Mol. Immunol. 22: 907 - 919) beschrieben unter Verwendung einer Technik getestet, die die Fähigkeit eines Haptens (d.h. des Oligosaccharids) mißt, die homologe Antigen(kapsuläres Polysaccharid) zu Antikörper- Immunpräzipitationsreaktion zu hemmen (Haptene mit niedrigem Molekulargewicht ergeben keine Immunpräzipitationsreaktion, wenn sie gegen homologe Antikörper getestet werden).
Das Verfahren, daß als "differenzielle Immunelektrophorese" bezeichnet wird, wurde wie folgt durchgeführt: Ein Kunststoffplattenträger für Immunelektrophorese enthielt drei Abteile mit 1% (Gew./Vol.) Agarose (Agarose M-LKB, Bromma, Schweden). Das erste Abteil enthielt 0,05% (Vol./Vol.) Bezugsantiserum gegen kapsuläres Polysaccharid. Das zweite Abteil enthielt 0,05% (Vol./Vol.) Bezugsantiserum gegen kapsuläres Polysaccharid, das zuvor mit einer bekannten Menge an kapsulärem Bezugspolysaccharid bei 37ºC 15 Minuten lang inkubiert worden war. Das dritte Abteil enthielt 0,05% (Vol./Vol.) Bezugsantiserum gegen kapsuläres Polysaccharid, das zuvor mit einer bekannten Menge an Oligosaccharid- Hapten inkubiert worden war. Eine elektrophoretische Auftrennung von kapsulärem Polysaccharid in 4 zweifachen Verdünnungsreihen wurde dann bei 70 V/cm in 20 mM Tris-Barbiturat-Puffer, pH = 8,8, über 90 Minuten durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurden die Platten mit Silber angefärbt, getrocknet und quantitativ überprüft. Die Hemmung durch die Oligosaccharid-Moleküle wurde durch höhere "Raketen"-Immunpräzipitate nachgewiesen, die in dem Abteil auftraten, das das mit Hapten vorinkubierte Bezugsantiserum enthielt. Die minimale Hemmkonzentration eines Haptens wurde berechnet als
MICHa = CHa hAg/hHa
worin CHa = Konzentration des überprüften Haptens im Gel
hAg = Achsenabschnitt der Geraden, die durch die Höhe der erhaltenen "Raketen"-Immunpräpizitate bestimmt wurde, wenn Bezugsantigen im Gel war und
hHa = Achsenabschnitt der Geraden, die durch die Höhe der erhaltenen "Raketen"-Immunpräpizitate bestimmt wurde, wenn das überprüfte Hapten im Gel war.
Ähnlich MICAg = CAg . hAg
Spezifität = MICAg/MICHa
Oligosaccharid-Haptene mit verschiedenen Größen wurden getestet.
Die Fähigkeit von Oligosacchariden, die Immunpräzipitation von kapsulären Polysacchariden durch spezifische Antikörper zu blockieren, wurde auch durch das nicht-elektrophoretische Verfahren der radialen Immundiffusion getestet. Gemäß diesem Verfahren wurde die Hemmung durch Oligosaccharid-Moleküle durch einen größeren Radius des Immunpräzipitats nachgewiesen, das durch die Fusion von Antigenen (kapsulärem Polysaccharid) durch 1% (Gew./Vol.) Agarose gebildet wurde, welche den spezifischen Antikörper enthielt, der zuvor mit einer gegebenen Menge an Inhibitor (Oligosaccharid) inkubiert worden war. Wenn einmal die minimale Kombinationskonzentration (MCC) für das gegebene Hapten experimentell gefunden ist, wird die Spezifität dann gemäß der vorstehend erwähnten Formel berechnet:
Spezifität = MCCAg(Ps)/MCCHa(Oligo) Tabelle III Immunchemische Charakterisierung von S. pneumoniae-Oligosaccharid-Haptenen Oligosaccharid-Typ (MICPa/MICHp) mittels DIEP (MCCPa/MCCHP) mittels IRID n.t. = nicht testbar DIEP = differentielle Immunelektrophorese IRID = Hemmung der radialen Immundiffusion MIC = minimale Hemmkonzentration MCC = minimale Kombinationskonzentration

6.4. AKTIVIERUNG DER REDUZIERENDEN ENDEINHEIT VON S. PNEUMONIAE-OLIGOSACCHARIDEN

Oligosaccharid-Haptene, die wie in Abschnitt 6.2 oben beschrieben erhalten wurden, wurden in Wasser zu einer Endkonzentration von ungefähr 5 mg/ml gelöst. Zu jeder Lösung wurden 0,1 ml 0,2 M KH&sub2;PO&sub4; für jeden Milliliter Lösungsvolumen hinzugefügt, und der pH wurde durch die erforderliche Menge an Diaminomethan auf 9,2 - 9,4 angehoben (im allgemeinen ist ein Volumen von 2 ul Diaminomethan für jeden Milliliter Lösung erforderlich). Die Mischung wurde 15 Minuten bei 100ºC gehalten, wonach eine Menge von ungefähr 4 ul Pyridinboran für jeden Milliliter Lösungsvolumen hinzugefügt wurde. Der pH wurde durch 1N NaOH auf 9,2 eingestellt. Die Mischung wurde dann in einer verschlossenen Ampulle 48 Stunden in ein Ölbad bei 50ºC überführt. Danach wurde die Lösung des Amino-aktivierten Oligosaccharids durch 1N HCl neutralisiert und auf Sephadex G-15 Superfine (15 mM NaCl, pH 7,01) gereinigt. Die gesammelten chromatographischen Fraktionen wurden zusammengegeben und gefriergetrocknet. Dann wurde der gefriergetrocknete Rückstand zu 10 mg/ml in DMSO gelöst und zu einer molaren Menge SIDEA (oder SIDES) gegeben, die einem Verhältnis von 5:1 Mol/Mol bezüglich der Menge an Aminogruppen entsprach, welche in der gefriergetrockneten Verbindung vorhanden waren. Die Reaktion schritt vier Stunden bei Raumtemperatur fort, und dann wurden 4 Volumina 1,4-Dioxan dazugegeben (Endkonzentration 80% in 1,4-Dioxan), um das Ester-aktivierte Oligosaccharid zu fällen. Der durch Zentrifugation gesammelte Niederschlag wurde dreimal mit 1,4-Dioxan gewaschen und bei -20ºC oder darunter aufbewahrt, falls er nicht im Konjugationsverfahren verwendet wurde. Die Ausbeute des Aktivierungsverfahrens für jedes der vier Oligosaccharide wird in Tabelle IV gezeigt. TABELLE IV S. Pneumoniae-Oligosaccharid-Aktivierung: Verfahrensausbeute (% Gew./Gew.) Serotyp Oligo-NH(CH&sub2;)&sub2;NH&sub2; Oligo-NH(CH&sub2;)&sub2;NH-Monoester Gesamt

6.5. KONJUGATION VON AKTIVIERTEM OLIGOSACCHARID AN CRM&sub1;&sub9;&sub7;-PROTEIN

6.5.1. HERSTELLUNG VON CRM&sub1;&sub9;&sub7;-PROTEIN

CRM&sub1;&sub9;&sub7;, von Corynebacterium diphtheriae C7 (Btx-197) erzeugt, wurde durch Molekularfiltration unter Verwendung einer Millipore XM-50(NMWL 5x10&supmin;&sup4;)-Membran aus Kulturmedium abgetrennt. Das Protein wurde dann durch Zugabe einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung (bis zu 65% Gew./Vol.) zum Filtrat gefällt. Das gefällte Protein wurde durch Zentrifugation gesammelt und in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) wieder gelöst.
Eine weitere Reinigung von CRM&sub1;&sub9;&sub7; wurde durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer 2,5 x 100 cm DEAE- Sepharose 6B/CL-Säule (Pharmacia, Uppsala), die in 0,01 M Phosphatpuffer bei pH 7,2 konditioniert war, unter Verwendung von 0,09 M NaCl in 0,01 M Phosphatpuffer als Eluens erreicht.
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen (Pappenheimer et al., 1972, Immunochem. 9: 891-906) zeigte, daß 80% des erhaltenen CRM&sub1;&sub9;&sub7; in dessen nativer Molekülform vorlag. Man fand, daß die Reinheit des Proteins ungefähr 400 Flockulationsgrenze (Lf) pro Milligramm war.

6.5.2. KONJUGATION VON AKTIVIERTEN OLIGOSACCHARIDEN

Das Konjugationsverfahren bestand in der Kupplung des Monosuccinimidylester-aktivierten Oligosaccharid-Haptens an die epsilon- Aminogruppe des Lysinrestes des Trägerproteins CRM&sub1;&sub9;&sub7;.
Dimethylsulfoxid enthaltende Monosuccinimidylester (von Adipinsäure)aktivierte Oligosaccharide aus kapsulären S. pneumoniae Typ 6A-, 14-, 19F- und 23F-Polysacchariden wurden dann zu einer 0,1 M Bicarbonatlösung, pH = 8,0, die 2 mg/ml CRM&sub1;&sub9;&sub7; enthielt, gegeben, um eine Lösung herzustellen, die 50% Wasser enthielt und in der das Molverhältnis von Ester-aktiviertem Oligosaccharid zu gesamten Aminogruppen des Trägerproteins 1:2 betrug.
Die so erhaltene Mischung wurde 15 Stunden bei 4ºC unter sanftem Rühren gehalten. Oligosaccharide aus jedem der vier Serotypen wurden in gesonderten Reaktionen an Protein konjugiert. Eine Zusammenfassung der physiochemischen Charakterisierung der erhaltenen Glycokonjugate wird in Tabelle V gegeben. TABELLE V Glycokonjugat-Charakterisierung Serotyp Oligo Oligo Konjugat (SDS-PAGE) SD (Mol Oligo/Mol Prot.) % (Gew./Gew.) Konj. Prot.

6.5.2.1. VERGLEICH DER KONJUGATIONSEFFIZIENZ BEI VERWENDUNG DES SUCCINIMIDYLDIESTERS VON ADIPINSÄURE ALS VERKNÜPFUNGSGRUPPE GEGENÜBER DEM SUCCINIMIDYLDIESTER VON BERNSTEINSÄURE

Die durch die Reaktion mit dem Succinimidyldiester von Bernsteinsäure (SIDES) gebildeten aktivierten Oligosaccharide wiesen die Struktur auf: Oligosaccharid
während diejenigen, die durch die Reaktion mit dem Succinimidyldiester von Adipinsäure (SIDEA) gebildet waren, die Struktur Oligosaccharid
aufwiesen, wodurch Verknüpfungsgruppen mit verschiedenen Größen zwischen Oligosaccharid und konjugiertem Protein erzeugt wurden (siehe Figur 2). Die Wirksamkeit der Konjugation unter Verwendung von SIDES- gegenüber SIDEA-aktivierten Oligosacchariden wurde ausgewertet. Wie in Figur 3A, B und C gezeigt, schien nur dann, wenn die Verknüpfungsgruppe von SIDEA abgeleitet war, das Protein in voll glycosylierter Form vorzuliegen (wobei eine schwache oder keine freie Bande von CRM&sub1;&sub9;&sub7; nachzuweisen war).

6.6. IMMUNOGENITÄT VON S. PNEUMONIAE-GLYCOKONJUGATEN

Mehrere Formulierungen der vier Glycokonjugat-Antigene wurden hergestellt und in Kaninchen getestet (gemäß dem in Tabelle VI umrissenen Verabreichungsschema): typenspezifische Glycokonjugate in einwertiger Formulierung (2,5 oder 5,0 ug Oligosaccharid pro Dosis) oder mehrwertiger Formulierung (2,5 ug von jedem Oligosaccharid pro Dosis) mit und ohne Aluminiumhydroxid [Al(OH)&sub3;] als Mineral-Adjuvans (nur in der mehrwertigen Formulierung wurde es zu 1 mg pro Dosis verabreicht). Unter den gewählten Bedingungen fand eine vollständige Absorption der vier Glycokonjugate auf Al(OH)&sub3; statt, da eine Verarbeitung des Überstandes der mehrwertigen Formulierung sowohl durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese als auch durch Raketen-Immunelektrophorese keine nachweisbare Menge an freiem Protein zeigte. Eine durchschnittliche Dosis jedes Glycokonjugats enthielt ungefähr 2,5 ug Oligosaccharid und 13 ug Trägerprotein CRM&sub1;&sub9;&sub7; (vergleichbar mit der durchschnittlichen Human-Schutzimpfungsdosis von Diphtheria- Toxoid). Der Immunisierungsplan schloß eine Erstimpfungsdosis und zwei Auffrischungsimpfdosen in vierwöchigem Abstand ein. Blutentnahmen wurden in den Wochen 0, 4, 6 und 10 vorgenommen. Tabelle VI Immunisierungsschema für Kaninchen und Mäuse und Impfstoffdosen Immunisierung in den Wochen Blutentnahme in den Wochen A. Lösliche einwertige (Einzeltyp)-Formulierung 1 Dosis (0,5 ml): 2,5 ug Oligosaccharid und 13 ug (5 Lf) CRM&sub1;&sub9;&sub7; 1 Dosis (0,5 ml): 5,0 ug Oligosaccharid und 26 ug (10 Lf) CRM&sub1;&sub9;&sub7; B. Lösliche mehrwertige (gemischte 4-Typen-)Formulierung 1 Dosis (0,5 ml): 2,5 ug typenspezifisches Oligo (Ges. = 10 ug Oligos) und insgesamt 52 ug (20 Lf) CRM&sub1;&sub9;&sub7; C. Mit Al(OH)&sub3;-versetzte mehrwertige (gemischte 4-Typen-)Formulierung 1 Dosis (0,5 ml): 2,5 ug typenspezifisches Oligo (Ges. = 10 ug Oligos) und insgesamt 52 ug (20 Lf) CRM&sub1;&sub9;&sub7; mit 1 mg Al(OH)&sub3;
Tabelle VII zeigt die durch RIA (FARR-Verfahren) abgeschätzte Menge an typenspezifischen Antikörpern sowie die Zahl der reagierenden Tiere über der Zahl der immunisierten Tiere. Das Verhältnis (R) zeigt den -fachen Zuwachs, der nach jeder Immunisierungsdosis erreicht wurde.
Tabelle VIII zeigt die ELISA-Titer als IgG-Isotyp-Ab sowie die Zahl von reagierenden Tieren gegen die Zahl von immunisierten Tieren. Die Verhältnisse -R&sub1; -R&sub2; -R&sub3; zeigen den -fachen Zuwachs in den Titern nach jeder Immunisierungsdosis, während die Verhältnisse -R1' -R2' -R3' den -fachen Zuwachs in den Titern bei einer gegebenen Immunisierungsdosis in Bezug auf den Vortiter anzeigen. Die Tabelle IX zeigt die qualitativen Ergebnisse als Funktionalität der induzierten IgG-Antikörper bei der Erkennung der Polysaccharid-Kapsel bei lebenden Streptokokken (Quellungsreaktion oder Neufeld-Test).
Tabelle X zeigt die Diphtheria-Toxin neutralisierenden Titer, die in Kaninchen durch das Trägerprotein CRM&sub1;&sub9;&sub7; induziert wurden, wie durch den Vero-Zellenassay abgeschätzt. Da ein FDA-Bezugsantiserum als Kontrolle verwendet wurde, sind Titer, die als u/ml ausgedrückt wurden, ebenso eingeschlossen worden. TABELL VII Mit RIA abgeschätzte Titer* von Kaninchen, immunisiert** mit Oligosacchariden*** von S. Pneumoniae Typ 6A, 14, 19F, 23F, die kovalent an das Trägerprotein CRM&sub1;&sub9;&sub7; gebunden waren****Lösliche Form mit Al(OH)&sub3; versetzte Form Woche
* Die Daten sind als geometrisches Mittel dr Titer in ngNAb/ml ausgedrückt. Reagierende Tiere gegen geamte immunisierte Tiere sind in Klammern.
** Mehrwertige Formulierungen der vier Glycokonjugate in lösliche und auf Al(OH)&sub3;-adsorbierte (1 mg/Dosis) Form. Jedes Glycokonjugat enthielt durchschnittlich 2,5 ug Oligosaccharid und durchschnittlich 13 ug Protein CRM&sub1;&sub9;&sub7;. Immuisierung in Woche 0, 4 und 9. Blutabnahme in Woche 0, 4, 6 und 11.
*** Typ 6A- und 19F-Oligosaccharide wiesen ein durchschnittliches = 3 auf. Typ 14- und 23F-Oligosaccharide wiesen ein durchschnittliches = 5 auf.
**** Glycokonjugate vom Typ 6A wiesen einen durchschnittlichen Substitutionsgrad (SD) von Oligosacchariden pro Einheit Trägerprotein (Mol/Mol) gleich 7 auf. SD für Typ 14 Glycokonjugat betrug 6; für Typ 19F betrug er 4 und für Typ 23F betrug er 5. Tabelle VIII ELISA-Ergebnisse der IgG-Isotyp-Ab-Titer*, induziert durch einen mehrwertigen Impfstoff, der Glycokonjugate von kapsulären Oligosacchariden Typ 6A, 14, 19F, 23F von S. pneumoniae mit = 3+6 auf dem Mineral-Adjuvants Al(OH)&sub3; adsorbiert enthielt Vortiter (Woche) Erstimpfung (Woche) erste Auffrischimpfung (Woche) zweite Auffrischimpfung (Woche)
* Titer sind als geometrisches Mittel des reziproken Wertes der höchsten Serumverdünnung ausgedrückt, die einen ABS-Wert zeigt, der der zweifache des Reaktionshintergrunds ist. In Klammern wird die Zahl der Tiere angegeben (reagierende Tiere über gesamte geimpfte Tiere).
** Der Wert beinhaltet den Titer eines Kaninchen mit ungewöhnlich hoher Antwort. Wenn man zwei der fünf immunisierten Kaninchen, die mit der besten und schlechtesten Antwort, vernachlässigt, sind die Ergebnisse der verbleibenden drei Kaninchen für den Serotyp 23F: TABELLE IX Immunologische Funktionalität von Kaninchenserum-Ab auf =3-6 Oligo konjugiert an CRM&sub1;&sub9;&sub7; Qualitative Analyse (Quellungsreaktion für Kapsel-Erkennung) S. pneumoniae: positive Reaktion * Durchgeführt nach dem Verfahren von Austrian (1976), Mt. Sinai J. Med. 43: 699 - 709. TABELLE X Antidiphtheria-Titer* unter Verwendung des Verozellen-Assays, welche in Kaninchen induziert wurden, die mit den mehrwertigen synthetisierten Glycokonjugaten immunisiert wurden, wobei Oligosaccharide von S. pneumoniae kovalent an das Trägerprotein CRM&sub1;&sub9;&sub7; geknüpft waren Vortiter (Woche) Erstimpfung (Woche) erste Auffrischimpfung (Woche) zweite Auffrischimpfung (Woche) Lösliche Form
FDA-Bezugsantiserum enthielt 6 u/ml und ergab 50%-igen Schutz bei einer Verdünnung 1/8000.
* Titer sind als reziproke Werte der Verdünnung ausgedrückt, bei denen der Pool von Antisera einen 50%-igen Schutz der Zellen zeigte, wie durch ³H-Leucin-Einbau nach dem Behandeln der Zellen mit Diphtheria- Toxin abgeschätzt.
Zahlen in Klammern zeigen die Titer in u/ml an, wie unter Verwendung des FDA-Bezugsantiserums als Kontrolle bestimmt.

6.7. OLIGOSACCHARIDE DER KETTENLÄNGE = 10-20 SIND SUBOPTIMAL IMMUNOGEN

Zwei Gruppen von Glycokonjugat-Impfstoffen wurden gemäß dem oben beschriebenen Syntheseschema, aber unter Verwendung von Sacchariden von Typ 6A, 14, 19F und 23F S. pneumoniae mit zwei verschiedenen "Bereichswerten" der Kettenlänge, nämlich = 3-5 und = 10-20, synthetisiert. Die Frage war dann, ob ein Oligosaccharid mit einer Kettenlänge von = 20 oder größer auch das optimale Immunogen (nach Konjugation an das gewählte Trägerprotein CRM&sub1;&sub9;&sub7;) bezüglich Erstimpfungsund Auffrischimpfungsfähigkeit im Vergleich zu einer viel kürzeren Kettenlänge wäre, wie beispielsweise ein Oligosaccharid mit = 3.
Kaninchen wurden unter dem in Tabelle XI umrissenen Protokoll immunisiert. Wie durch Vergleich der in den Tabellen XII und XIII aufgeführten Ergebnisse gezeigt, welche sich auf die ELISA-Ergebnisse von IgG-Isotyp-Antikörpertitern beziehen, die durch lösliche S. pneumoniae- Oligosaccharide mit = 10-14 bzw. = 3-6 induziert wurden, sowie derjenigen, die in den Tabellen XIV und XV aufgeführt sind, die sich auf ELISA-Ergebnisse von IgG-Isotyp-Antikörpertitern beziehen, die durch S. pneumoniae-Oligosaccharide mit = 10-14 bzw. = 3-6, auf Al(OH)&sub3; adsorbiert, induziert wurden, war ein DP = 10-14 nicht mit einer verstärkten Immunogenität verbunden. In der Tat waren die IgG- Erstimpfungs- und Auffrischimpfungswirkungen von Oligosaccharid-Konjugaten mit = 3-5 bei weitem größer als die Wirkungen, die unter Verwendung von Oligosaccharid-Konjugaten mit = 10-14 beobachtet wurden. Nicht zufällig waren alle vier untersuchten Kohlehydrat-Strukturen mit ähnlichen Ergebnissen verbunden. Weiter fand man, daß die Neutralisierung von Diphtheria-Toxin durch Glycokonjugate mit = 10-14 weniger wirksam war als diejenige, die unter Verwendung von Glycokonjugaten mit = 3-6 erreicht wurde (Tabelle XVI). Demgemäß sind Oligosaccharide der Kettenlänge = 10-20 in Konjugaten der vorliegenden Erfindung funktionstüchtig, obwohl Oligosaccharide mit = 3-6 höhere Antikörpertiter hervorrufen. TABELLE XI Immunisierungsschema für Kaninchen Die Glycokonjugat-Modelle wurden mit einer Dosis von 2,5 ug Kohlehydrat injiziert. Da die getesteten Modelle sich nur in der Kettenlänge der kovalent angeknüpften Oligosaccharide unterschieden, war die entsprechende Menge an Trägerprotein: Kohlehydrat-Dosis (ug) Proteinträger-Dosis (ug) Gewichtsverhältnis (Gew./Gew.) Oligo-CRM&sub1;&sub9;&sub7; Immunisierung in den Wochen 0, 4 und 8. Blutabnahme in den Wochen 0, 4 und 10. TABELLE XII ELISA-Ergebnisse der IgG-Isotyp-Ab-Titer, die von einem mehrwertigen Impfstoff induziert wurden, der Glycokonjugate von kapsulären Oligosacchariden Typ 6A, 14, 19F, 23F mit = 10-14 von S. pneumoniae in löslicher Form enthieltVortiter (Woche) Erstimpfung (Woche) erste Auffrischimpfung (Woche) zweite Auffrischimpfung (Woche) TABELLE XIII ELISA-Ergebnisse der IgG-Isotyp-Ab-Titer, die von einem mehrwertigen Impfstoff induziert wurden, der Glyqokonjugate von kapsulären Oligosacchariden Typ 6A, 14, 19F, 23F mit = 3-6 von S. pneumoniae in löslicher Form enthielt Vortiter (Woche) Erstimpfung (Woche) erste Auffrischimpfung (Woche) zweite Auffrischimpfung (Woche) Typ TABELLE XIV ELISA-Ergebnisse der IgG-Isotyp-Ab-Titer, die von einem mehrwertigen Impfstoff induziert wurden, der Glycokonjugate von kapsulären Oligosacchariden Typ 6A, 14, 19F, 23F mit = 10-14 von S. pneumoniae auf dem Mineral-Adjuvans Al(OH)&sub3; adsorbiert enthielt Vortiter (Woche) Erstimpfung (Woche) erste Auffrischimpfung (Woche) zweite Auffrischimpfung (Woche) Typ TABELLE XV ELISA-Ergebnisse der IgG-Isotyp-Ab-Titer*, die von einem mehrwertigen Impfstoff induziert wurden, der Glygokonjugate von kapsulären Oligosacchariden Typ 6A, 14, 19F, 23F mit = 3-6 von S. pneumoniae auf dem Mineral-Adjuvans Al(OH)&sub3; adsorbiert enthielt Vortiter (Woche) Erstimpfung (Woche) erste Auffrischimpfung (Woche) zweite Auffrischimpfung (Woche) Typ *Titer sind als geometrisches Mittel des reziproken Werts der höchsten Serumverdünnung ausgedrückt, die einen ABS-Wert vom Zweifachen des Reaktionshintergrundes zeigt. In Klammern wird die Zahl der Tiere (Tiere mit Antwort über insgesamt geimpfte Tiere) angegeben. TABELLE XVI In-Vitro-Neutralisierung* von Diphtheria-Toxin mit Seren aus Kaninchen, die mit S. pneumoniae-Oligosaccharid-CRM&sub1;&sub9;&sub7;-Glycokonj ugaten immunisiert worden waren. Vortiter (Woche) Erstimpfung (Woche) erste Auffrischimpfung (Woche) zweite Auffrischimpfung (Woche) *Titer sind als reziproker Wert der Verdünnung ausgedrückt, bei der der Pool von Kaninchenantisera einen 50%-igen Schutz der Zellen zeigte, wie durch ³H-Leucin-Einbau nach Behandeln der Zellen mit Diphtheria-Toxin abgeschätzt. Zahlen in Klammern zeigen die Titer in ug/ml an, wie durch das FDA-Bezugsantiserum als Kontrolle bestimmt. Geschätztes MPL bei Menschen: 0,01 ug/ml

6.8. DIE IMMUNANTWORT AUF DIE GLYCOKONJUGATE IST MONOSPEZIFISCH UND HOMOGEN

Ein Vergleich der in den Tabelle VII und VIII angegebenen Ergebnisse, die durch Radioimmunassay (RIA) und Enzym-verknüpften Immunosorbensassay (ELISA) bestimmte Antikörpertiter betreffen, zeigt, daß die durch RIA abgeschätzten Titer konsistent niedriger waren als die durch ELISA abgeschätzten Titer. Diese Beobachtung beweist zusammen mit der Abwesenheit von Immunpräzipitaten in Agarosegelen, die für die radiale Immundiffusions- und Raketen-Elektrophoreseanalyse von Anti-Glycokonjugat- Antiserum verwendet wurden, daß die Kaninchen-Antisera gegen S. pneumoniae-Oligosaccharid-CRM&sub1;&sub9;&sub7;-Konjugate hochspezifische IgG-Isotyp- Antikörper enthielten, die nicht in der Lage waren, die entsprechenden gereinigten Kohlehydrat-Polymere zu fällen, die verwendet wurden, um die Oligosaccharide herzustellen.
Die Abwesenheit von fällenden Antikörpern in einem Antiserum zeigt eine Monospezifität an, d.h. eine Antikörpererkennung von nur einem Epitop in dem Antigen-Repertoire eines gegebenen Moleküls (Berzofsky-Schechter, 1981, Molecular Immunol. 18: 751-763). Die Fällung von Antigen-Antikörper- Komplexen erfordert eine Gitterbildung zur Erzeugung eines dreidimensional verzweigten Netzwerks von verknüpften Antigen- und Antikörper-Molekülen. Damit dies stattfindet, ist eine Mehrwertigkeit sowohl von Antigen als auch von Antikörper erforderlich, da mehr als ein Antikörper in der Lage sein muß, sich gleichzeitig an ein einzelnes Antigenmolekül zu binden. Demgemäß ist die Abwesenheit einer beobachtbaren Immunpräzipitation, die zwischen Kaninchen-Antiserum gegen S. pneumoniae-Oligosaccharid-CRM&sub1;&sub9;&sub7;- Konjugate und homologem gereinigtem kapsulärem Polysaccharid mit hohem Molekulargewicht beobachtet wird, ein starkes Indiz dafür, daß die Antisera Antikörper enthielten, die für das Kohlehydrat-Polymer spezifisch waren (wie durch ELISA- und Hemm-ELISA-Analysen gezeigt), aber nur gegen eine Determinante (ein Epitop) des Polysaccharids gerichtet waren.
Zusätzlich zum Vorhandensein einer immunfällenden Aktivität ist eine heterogene Population von Antikörpern im allgemeinen auch mit den folgenden Eigenschaften verbunden: Ein einzelnes Epitop des Antigens, das verwendet wird, um die Antikörperantwort hervorzurufen, kann nicht vollständig das Binden der gesamten Population von Antikörpern an vollständiges Antigen verhindern, sondern verhindert nur, daß dieser Antikörper sich an das eine Epitop bindet, wobei die anderen Antikörper frei verbleiben, um sich an die verbleibenden Epitope, die auf dem vollständigen Antigen anwesend sind, zu binden. Eine Population von Antikörpern kann durch einen ELISA-Hemmassay auf Heterogenität ausgewertet werden. In diesem Assay kann die Fähigkeit einer Population von Antikörpern, sich an ein vollständiges Antigen zu binden, in Anwesenheit von Inhibitoren der Antigen-/Antikörper-Bindung, wie isolierten Epitopen des Antigens, gemessen werden. In einer grafischen Darstellung wird, wenn die Bindung von Antikörper an markiertes vollständiges Antigen in Anwesenheit von steigenden Konzentrationen an unmarkiertem vollständigem Antigen gemessen wird, eine S-förmige Kurve erzeugt, die als Standardkurve für die Antikörper-/Antigen-Bindung verwendet werden kann. Wenn die Antikörperpopulation heterogen ist, kann die Bindung zwischen Antikörper und vollständigem Antigen durch die Zugabe eines einzigen antigenen Epitops nicht vollständig gehemmt werden, und die Standardkurve der Antikörper-/Antigen-Bindung ist nur teilweise verschoben (teilweise überlappend oder teilweise parallel verlaufend), da andere Antigen/- Antikörper-Wechselwirkungen, die von denen verschieden sind, die mit dem getesteten Epitop verbunden sind, vorherrschen. Umgekehrt kann das Binden einer homogenen Population von Antikörpern an Antigen durch die Zugabe eines isolierten Epitops vollständig gehemmt werden; die S-förmige Standard-Antigen-/Antikörper-Bindungskurve für eine homogene Population von Antikörpern wird von der Kurve überlappt oder in paralleler Form wiedergegeben, die durch die Zugabe von isoliertem Epitop erzeugt wird, das der Spezifität der Population entspricht.
Experimentell wird beim Testen des S. pneumoniae-Glycokonjugatinduzierten Kaninchen-IgG auf diese Weise ein Affinitätsmuster beobachtet, das demjenigen entspricht, daß für eine homogene Population von Antikörpern vorhergesagt wird (Figur 4). Das S. pneumoniae 6A- Oligosaccharid (entweder in nicht-konjugierter oder in konjugierter Form) war mit einer S-förmigen Bindungshemmungskurve verbunden, die ungefähr parallel zu derjenigen verlief, die unter Verwendung von kapsulärem Polysaccharid Sero Typ 6A mit hohem Molekulargewicht abgeleitet wurde. Wie erwartet, hemmte ein heterologes (Typ 14) Oligosaccharid entweder in freier (mit Verknüpfungsgruppe aktivierter) oder konjugierter Form die IgG-Isotyp-Population nicht, die für das Typ 6A-Antigen spezifisch ist.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines kovalenten Konjugats eines Oligosaccharids und eines Trägerproteins, das die folgenden Schritte umfaßt:

(i) Umsetzen eines Oligosaccharids mit einer terminalen reduzierenden Gruppe mit Diaminoethan in Anwesenheit von Pyridinboran, so daß eine reduktive Aminierung stattfindet; und

(ii) Umsetzen des aminierten Oligosaccharid-Produkts von (i) mit einem Molekül, das zwei funktionelle Gruppen umfaßt, von denen eine in der Lage ist, mit der terminalen Gruppe des aktivierten Oligosaccharids zu reagieren, und von denen die andere in der Lage ist, mit dem Trägerprotein zu reagieren; und

(iii) Umsetzen des aktivierten Oligosaccharid- Produkts von (ii) mit dem Trägerprotein, so daß eine Konjugation stattfindet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Molekül von Stufe (ii), das zwei funktionelle Gruppen umfaßt, ein Diester ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Molekül von Stufe (ii), das zwei funktionelle Gruppen umfaßt, ein Diester von Adipinsäure oder ein Diester von Bernsteinsäure ist.

4. Kovalentes Konjugat zwischen Oligosacchariden und einem Trägerprotein, erhältlich durch ein Verfahrene das die Schritte umfaßt:

(i) Hydrolysieren eines Polysaccharids, um Oligosaccharide zu erzeugen, die mindestens eine terminale reduzierende Gruppe aufweisen; und

(ii) Umsetzen der Oligosaccharide mit Diaminoethan in Anwesenheit von Pyridinboran, so daß eine reduktive Aminierung stattfindet; und

(iii) Umsetzen des aminierten Oligosaccharid-Produkts von (i) mit einem Moleküle das zwei funktionelle Gruppen umfaßt, von denen eine in der Lage ist, mit der terminalen Gruppe des aktivierten Oligosaccharids zu reagieren, und von denen die andere in der Lage ist, mit dem Trägerprotein zu reagieren; und

(iv) Umsetzen des aktivierten Oligosaccharid- Produkts von (ii) mit dem Trägerprotein, so daß eine Konjugation stattfindet.

5. Kovalentes Konjugat nach Anspruch 4, in dem das Molekül von Schritt (iii), das zwei funktionelle Gruppen umfaßt, ein Diester ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, in dem das Oligosaccharid von kapsulärem Polysaccharid von Streptococcus pneumoniae abgeleitet ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 6, in dem das Trägerprotein CPM&sub1;&sub9;&sub7; ist.

8. Kovalentes Konjugat zwischen Oligosaccharid und Trägerprotein nach Anspruch 4 oder 5, in dem das Oligosaccharid von kapsulärem Polysaccharid von Streptococcus pneumoniae abgeleitet ist.

9. Kovalentes Konjugat nach Anspruch 8, in dem das Oligosaccharid abgeleitet ist von Streptococcus pneumoniae mit einem Serotyp, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Typen 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F und 33F besteht.

10. Impfstoff, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 6 oder 7.