PT99067B - Processo para a producao de um conjugado de oligossacarido e de uma proteina veiculo - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 9 9.06 7

REQUERENTE: AMERICAN CYANAMID COMPANY, norte-americana, industrial, eom sede em Wayne, New Jersey Estados Unidos da América do Norte

EPÍGRAFE: processo para a produção de um conjugado de oligossacarido e de UMA PROTEINA· VEICULO

INVENTORES: Massimo Porro

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América do Norte, 28 de Setembro 1990 No.07/590,649

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AMERICAN CYANAMID COMPANY

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM CONJUGADO DE OLIGOSSACÃRIDO E DE UMA PROTEINA VEÍCULO

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O presente invento diz respeito a um processo melhorado para a produção vacinas de conjugado de oligossacárido. Num aspecto adicional deste invento, são produzidas vacinas de oligossacárido que induzem uma resposta imune monoespecífica e homogénea para o polissacãrido capsular. Uma concretização específica do invento proporciona vacinas que induzem a imunidade para serotipos predominantes de Streptococcus pneumoniae.

Mais concrectamente o presente invento diz respeito aum processo para a produção de um conjugado covalente de um oligossacárido e de uma proteína veículo, que compreende a reacção de um oligossacárido tendo um grupo redutor terminal com diaminoetano na presença de piridina-borano de modo a que ocorra aminação redutora; a reacção do produto oligossacárido aminado com uma molécula compreendendo dois grupos funcionais, um que é capaz de reagir com o grupo terminal do oligossacárido activado e o outro que é capaz de reagir com a referida proteína veículo; e a reacção do produto oligossacãrido activado de (ii) com a referida proteína veículo de modo a que ocorra conjugação.

1. INTRODUÇÃO

O presente invento diz respeito a um processo melhorado para a produção de vacinas conjugadas de oligossacárido. Num aspecto adicional do invento, as vacinas de oligossacárido são produzidas com o fim de induzir uma resposta imune monoespecífica e homogénea ao polissacãrido capsular. Uma concretização específica do invento proporciona vacinas que induzem imunidade a serotipos predominantes de Streptococcus pneumoniae que podem ser í

k partícularmente importantes para utilização em pacientes pediãP φ tricôs assiçi como para os idosos e aqueles com imunidade reduzida — devido a enfermidade ou doença (incluindo por exemplo, pacientes com SIDA).

2. ANTECEDENTES DO INVENTO

2.1. DOENÇAS CAUSADAS PELO STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE pneumococos (Streptococcus pneumoniae) é um cocos encapsulado Gram-positivo que cresce normalmente aos pares ou em cadeias pequenas. Na forma diplococal, as margens adjacentes são arredondadas e as extremidades opostas ligeiramente pontiagudas, dando aos organismos uma forma lanceolada(bastonete).

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Os pneumococos podem ser divididos em serotipos com r base no complexo de polissacáridos que forma as suas cápsulas.

Foram identificados 84 serotipos por exposição a antissoro específico de tipo, a reacção de quelação de Neufeld. São todos patogénicos para os seres humanos, mas os tipos 1, 3, 4, 7, 8 e 12 são mais frequentemente encontrados na prática clínica. Os tipos 6, 14, 19 e 23 causam frequentemente pneumonia e otite média nas crianças mas são menos comuns nos adultos (Áustria, 1983, em Harrison's Principies of Internai Medicine¹¹. Petersdorf

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b et al.. eds., 10^a edição McGraw Hill Boock Co., New York pgs. 918-922). Notavelmente, o pneumococos é um dos três principais patogénios responsáveis pela pneumonia, sepsis e meningite em crianças (McMillan, 1982, em Core Textbook of Pedriatics, Kaye et al. , des., Segunda Edição, J. B. Lippincott Co., Philadelphia, p. 498) .

2.2. VACINAS PNEUMOCÓCICAS

Os indivíduos com um risco superior à média para desenvolverem infecções pneumocócicas incluem os pacientes com doenças sistémicas crónicas tais como doença cardíaca, doença broncopulmonar crónica, doença hepática, insuficiência renal e doenças malignas. Recomenda-se que estes indivíduos sejam vacinados contra a infecção pneumocócica. Para este fim, estão disponíveis vinte e três vacinas compreendendo os polissacáridos capsulares de pneumococo dos tipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F (que incluem os serotipos ou grupos responsáveis por 90 por cento das doenças pneumocócicas graves nos Estados Unidos e no resto do

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Mundo) (Pneumovax Merck Sharp & Dohme e Pnuimmune , Lederle Laboratories). A eficácia desta vacina em crianças é questionável, visto que, nas crianças com menos de 6 anos a resposta imunológica a vários antigénios capsulares se desenvolve em diferentes alturas como resultado de características maturacionais do sistema imune, e a protecção pode ser de duração mais curta do que a observada em adultos (Harrisom et al., ibid). Embora se pense que relativamente poucos serotipos de pneumococos contribuam para a maioria das infecções pneumocócicas pediátricas (Gray et al.. 1979, J. Infect. Disease 140: 979-983), estes incluem os tipos para os quais a maturação da resposta dos anticorpos humanos aos polissacáridos capsulares purificados utilizados como vacinas, é mais lenta (Anderson and Betts, 1989,

-5Pediatric Infec. Dis. J. 8.: S50-S53; Borgono et al. , 1978. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 157:148-154).

2.3. VACINAS CONJUGADAS

A resposta imune em recém-nascidos humanos ao polissacárido capsular de Haemophilus influenzae b tem sido alcançada por acoplamento do antigénio capsular a proteínas veículo para produzir uma vacina conjugada; pensa-se que os efeitos dos linfócitos T auxiliares são induzidos pela proteína veículo e são responsáveis pelo desenvolvimento de imunidade (Robbins et al., 1984, em Bacterial Vaccines. Germanier, ed. Academic Press, New York pgs. 289-316). Ver também: Cruse & Lewis, 1989 em Conjugate Vaccines eds. Cruse & Lewis, Karger, Basel, pgs. 1-10. Uma aproximação similar tem sido dirigida para a produção de vacinas pneumocócicas.

2.3.1. POLÍMEROS CAPSULARES INTACTOS COMO ANTIGÊNIOS EM VACINAS

Vários investigadores têm isolado e purificado polímeros capsulares intactos que podem ser úteis em ou como vacinas. Por exemplo, a Patente dos EUA No. 4 220 717 descreve um processo para o isolamento e purificação de fosfato de polirribosilribitol (prp) imunologicamente activo a partir do polímero capsular de H. influenzae b. Adicionalmente, a Patente dos EUA No. 4 210 641 refere-se a extractos de polissacãridos de H. influenzae tendo um peso molecular aparente superior a 200 000 daltons e compostos principalmente por galactose, glucose e manose e contendo uma pequena quantidade de osaminas.

Vários investigadores têm utilizado estes e outros polímeros capsulares intactos em formulações para alcançar

-6melhores respostas imunológicas. Por exemplo, a Patente dos EUA No. 4 196 192 descreve uma vacina contendo PRP intacto purificado e uma formulação de vacina de Bordetella pertussis de célula completa. Esta aproximação para uma imunogenicidade aumentada resultou em níveis aumentados de anticorpos anti-PRP e anti-tosse convulsa em mamíferos jovens.

2.3.2. UTILIZAÇÃO DE PROTEÍNAS VEÍCULO PARA PREPARAR ANTISSO RO PARA HAPTENOS

As proteínas veiculo podem fazer mais do que intensificar a imunogenicidade de polímeros capsulares conjugados; elas podem também dar haptenos imunogénicos. Os haptenos são definidos como moléculas que se podem ligar especificamente a um anticorpo ou receptor de linfócitos mas que não devem induzir, eles próprios, uma resposta imune (i.e. eles não são imunogénicos). Para despertar uma resposta imune, as moléculas de pequeno/baixo peso molecular ou fracamente imunogénicas, denominadas haptenos, devem ser geralmente primeiro acopladas a uma molécula maior, ou veículo, que é normalmente uma proteína heteróloga. A injecção do complexo hapteno-veículo num animal dará então origem à produção, pelos linfócitos B, de anticorpos, alguns dos quais serão capazes de se ligar especificamente à molécula de hapteno não acoplada, livre.

Entre os primeiros haptenos a ser estudados estavam os compostos corantes azo tais como anilina e ácido o-aminobenzóico. Landsteiner e Lampl (1918, Z. Immun. Forsch 26:293) acoplaram estes compostos por diazotização às proteínas do soro. Quando injectados com estas proteínas azo artificialmente preparadas, os coelhos desenvolveram anticorpos precipitantes que eram específicos para as porções químicas ligadas.

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Outros exemplos de compostos hapténicos são o dinitrofenol, que se torna imunogénico após acoplamento como grupo dinitrofenilo (DNP) à albumina de soro de bovino ou à gama globulina de bovino (BGG), e a dietilamida do ácido lisérgico. Até mesmo o formaldeído tem mostrado comportar-se como um hapteno; as pessoas expostas a vapores de formaldeído de produtos ou em laboratórios tornaram-se sensíveis ao composto, a seguir a formilação das suas macromoléculas endógenas, in vivo.

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comportamento hapténico não está limitado a pequenas moléculas orgânicas, e as hormonas polipeptídicas de tamanho até ao da insulina são muitas vezes fracamente, se de todo, imunogénicas. Para se obter elevados títulos de anticorpos para estas hormonas é assim necessário conjugá-las com uma molécula veículo (ou criar maiores moléculas por reticulação de muitos destes péptidos em conjunto).

|ί^: envolvimento da molécula veículo é especialmente interessante visto que o veículo desempenha mais do que um mero papel de transporte. Ovary e Benaceraff (1963, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 114:723) mostraram isto pela injecção de coelhos com DNP-BCG. A injecção de muitos materiais imunogénicos em animais irá produzir uma memória imunológica da exposição. Quando é dada mais tarde uma segunda injecção, há assim uma resposta imune muito mais forte. De facto, quando Ovary e Benaceraff injectaram de novo DNP-BCG, houve uma forte resposta secundária que conduziu a níveis marcadamente elevados de anticorpos dirigidos quer contra DNP quer contra BCG. Mas quando a segunda injecção era, ao contrário, feita de DNP-albumina do ovo, foi observada uma resposta de anticorpo anti-DNP muito mais fraca. A diferença na resposta foi devida ao que tem sido chamado de efeito de veículo, e que parece envolver os linfócitos T auxiliares.

-8A evidência preliminar indica que todas as proteínas não podem ser proteínas veículo igualmente eficazes para um dado hapteno. Robbins et al. (Infect. Immun. 40:245-256) têm apresentado dados sobre vacinas conjugadas de proteína-polissacãrido, experimentais, nas quais o mesmo hapteno polissacárido foi conjugado com diferentes veículos de proteína e foi quantificada a resposta de anticorpo ao hapteno. Foram observadas diferenças significativas na quantidade de anticorpo anti-hapteno gerada, indicando um papel principal para o veículo.

No que respeita às vacinas pneumocócicas, em particular, Lin e Lee (1982, Immunology 46.:333) estudaram as respostas imunes em adultos e ratinhos novos expostos aos polissacáridos dos tipos 6A e 19F assim como ao 19F conjugado a proteína. Foram induzidos títulos de anticorpos IgM e IgG2 significativamente mais elevados em ratinhos que receberam conjugados de polissacárido 19F-proteína do que no grupo de controlo que só recebeu o polissacárido 19F.

2.3.3. VACINAS CONTENDO CONJUGADOS

Outros inventores estudaram a conjugação de polímeros capsulares a proteínas veículo num esforço para intensificar a formação de anticorpos pelo assim denominado efeito de veículo. Por exemplo, Schneerson et al., Journal of Experimental Medicine 152:361-376 (1980) descreve conjugados de polímero de H. influenzae b-proteína que são descritos conferirem imunidade para doenças invasivas causadas por H. influenzae b. A referência documenta o comportamento imunolõgico relacionado com a idade dos polímeros capsulares em recém-nascidos e procura ultrapassar esta dependência da idade por conjugação do polímero capsular intacto com uma variedade de proteínas, incluindo albuminas do soro, hemocianina de Limulus polyphemus e toxina da difteria. 0 processo de conjugação envolve a utilização de um agente de ligação tal como di-hidrazida adípica.

Geyer et al., Med. Microbiol. Immunol. 165:171-288 (1979), prepararam conjugados de certos fragmentos de polissacárido capsular de Klebsiella pneumoniae a um ligante de nitrofeniletilamina por aminação redutora e o açúcar derivado foi então ligado às proteínas utilizando o acoplamento azo.

A Patente dos EUA No. 4 057 685 de Mclntire, requerida a 9 de Maio de 1974, diz respeito a um lipopolissacárido de Escherichia coli de reduzida toxicidade covalentemente acoplado a um antigénio de proteína por reacção com haleto de haloacilo.

A Patente dos EUA No. 4 356 170 de Jennings et al.. requerida a 27 de Maio de 1981, publicada a 26 de Outubro de 1982, diz respeito à produção de conjugados de polissacãrido-proteína, por aminação redutora.

Anderson (1983, Infection and Immunity 39:233-238) refere-se a conjugados entre oligossacãridos de polissacãrido capsular de Haemophilus influenzae tipo b e CRM_ig7, uma variante não tóxica mas antigenicamente idêntica da toxina da difteria.

Snippe et al. (1983, Infection and Immunity 42:842-844). referem-se a uma vacina semi-sintética para Streptococcus pneumoniae tipo 3 na qual um hexassacarido isolado a partir de um hidrolisado de ãcido parcial do polissacãrido capsular S3 foi acoplado a estearilamina por aminação redutora e depois incorporado em liposomas. Observou-se que a vacina de conjugado/liposoma resultante induz protecção ao S. pneumoniae tipo 3 em ratinhos.

-10A Patente dos EUA No. 4 663 160 de Tsay et al.. requerida a 14 de Março de 1983, publicada a 5 de Maio de 1987, diz respeito a bactérias nas quais um polissacárido destoxifiçado a partir de uma bactéria gram-negativa é covalentemente acoplado a uma proteína destoxifiçada a partir da mesma espécie de bactéria gram-negativa, por meio de uma porção de 4-12 carbonos.

A Patente dos EUA No. 4 619 828 de Gordon, requerida a 5 de Janeiro de 1984, publicada a 28 de Outubro de 1986, diz respeito a conjugados entre moléculas de polissacárido de bactérias patogénicas tais como Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis e Escherichia coli e antigénios dependentes de células T tais como os toxóides da difteria e do tétano.

A Patente dos EUA No. 4 808 700 de Anderson e Clements, requerida a 10 de Agosto de 1984, publicada a 28 de Fevereiro de 1989 e a Patente dos EUA No. 4 761 283 de Anderson, requerida a 28 de Março de 1986, publicada a 2 de Agosto de 1988, dizem respeito à ligação covalente dos fragmentos de polímero capsular a toxinas, toxóides ou subunidades de ligação bacterianos por meio de aminação redutora.

A Patente dos EUA No. 4 711 779 de Porro et al.. requerida a 2 de Julho de 1986, publicada a 8 de Dezembro de 1987, diz respeito a vacinas conjugadas de glicoproteína tendo uma actividade imunogénica trivalente e compreendendo determinantes antigénicos dos polissacáridos capsulares de uma bactéria gram-positiva e de uma bactéria gram-negativa, assim como quer CRM_ig7, toxóide do tétano, quer toxina da tosse convulsa.

-11Ι 2.3.4 . PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE VACINAS- CONJUGADAS !

ír A preparação de vacinas conjugadas, nas quais os

B haptenos de polissacárido capsular estão ligados a proteínas veículo, requer os procedimentos seguintes:

(i) o polissacárido capsular tem de ser preparado (ii) se for utilizado um fragmento do polissacárido, este deve ser separado do polissacárido intacto (iii) o sacárido deve ser activado ou tornado acessível à • conjugação, i.e. tê» de ser geradas ae porções capares de se ligar covalentemente à proteína (iv) o sacárido é conjugado à proteína.

j Os vários processos conhecidos na arte para realizar estes quatro f passos estão registados na Tabela I.

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(Quadro I Continuação)

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3. SUMÁRIO DO INVENTO f'

O presente invento diz respeito à ligação covalente de oligossacáridos derivados de polissacáridos capsulares bacterianos a proteínas veículo utilizando um novo processo.

Este processo permite a síntese eficaz de glicoconjugados a velocidades de produção significativamente mais rápidas do que as dos processos actualmente empregues. Os glicoconjugados do invento podem ser utilizados em formulações de vacinas e têm mostrado ser imunogénicos.

Numa concretização particular, o presente invento diz respeito à produção de glicoconjugados que incorporam oligossacáridos derivados de polissacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae. 0 processo do invento resulta na produção eficaz de elevadas quantidades de glicoconjugados de S. pneumoniae que podem ser utilizados em formulações de vacinas de particular importância para a população pediátrica, na qual uma grande proporção das principais doenças estão associadas com a infecção por S. pneumoniae. Os conjugados imunogénicos têm mostrado ser menos dependentes da idade do que os polímeros capsulares sozinhos, e são úteis para a imunização activa de mamíferos de sanque quente muito novos contra infecções sistémicas pelas respectivas bactérias encapsuladas.

Num aspecto adicional do invento, os glicoconjugados do invento têm mostrado induzir, surpreendentemente, uma resposta imune monoespecífica e homogénea, que pode evitar vantajosamente a produção de reacções autoimunes e sindromas pós-vacinação relacionados.

Essencialmente, os conjugados imunogénicos do invento não contêm agentes de ligação potencialmente tóxicos, tais como di-hidrazida adipica ou p-nitrofeniletilamina, que têm sido utilizados na conjugação de hidrato de carbono a proteína.

3.1. ABREVIAÇÕES E DEFINIÇÕES

CRM₁₉₇ uma proteína não tóxica antigenicamente cruzadamente reactiva com a toxina da difteria

DMSO dimetilsulfóxido

DP grau de polimerização

MIC concentração inibidora mínima

SD grau de substituição

SIDEA succinimidiléster de ácido adípico

SIDES succinimidiléster de ácido succínico

4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Estratégia geral para a síntese de conjugados de oligossacárido-proteína.

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A. Os polissacáridos de elevado peso molecular são hidrolisados com ácido para dar oligossacãridos com um peso molecular . 3 medio de 2,5 x 10 .

B. Os oligossacãridos são (1) activados por reacção com diaminoetano [H₂N(CH₂)NH₂] a pH = 9, reduzidos com boro-hidreto de piridina (PyBH₃), depois (2) feitos reagir com o diéster de succinimidilo e ãcido adípico (SIDEA) em dimetilsulfóxido (DMSO).

C. Os oligossacãridos activados são acoplados à proteína veículo através de resíduos de lisina.

Figura 2. Utilização de um espaçador preparado'no procedimento de acoplamento.

A. Glicoconjugado formado pelo procedimento anterior como descrito por Porro et al. . (1985), Mol. Immunol. 22.:907-919, com ligação amida (seta) entre o oligossacárido e o ligante de quatro carbonos de ácido adípico. 0 comprimento total do espaçador é de aproximadamente 10,4 A.

B. Glicoconjugado formado de acordo com o presente invento no qual existe um resíduo de dois carbonos (seta, formado por diaminoetano) e uma ligação amida entre o oligossacárido e os ligantes de dois carbonos de ácido succínico formados por reacção com SIDES. O comprimento total do espaçador é de aproximadamente 10 A.

C. Glicoconjugado formado de acordo com o presente invento no qual existe um resíduo de dois carbonos (seta, formado por diaminoetano) e uma ligação amida entre o oligossacárido e o resíduo de quatro carbonos de ãcido adípico formado por reacção com SIDEA. O comprimento total do espaçador é de aproximadamente

14,5 A.

Figura 3. Eficácia da conjugação do CRM_1Q7 a oligossacãridos activados contendo espaçadores derivados de ácido adípico versus ácido succínico. Electroforese em gel de SDS-poliacrilamida de produtos de reacções de conjugação (corados com prata).

A. Faixa 1: Padrões de Peso Molecular (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K).

Faixa 2: CRM₁₉₇ (1 pg) de referência.

Faixa 3: Oligossacárido conjugado 6A-CRM._n„ com ãcido ±y / succínico como espaçador (2 μg) (relação de 1:1 de monoéster/grupos amino totais do CRM_ig? em DMSO a 50%).

Faixa 4: Oligossacárido conjugado 6A-CRM_ir._ com ácido j_y / succínico como espaçador (2 yg) (relação: 1:2 de monoéster/grupos amino totais do CRM_ig7 em DMSO a 50%).

Faixa 5: Oligossacárido conjugado 6A-CRM^_g7 com ácido adípico como espaçador (2 yg) (relação: 1:2 de monoéster/grupos amino totais do CRM_ig7 em DMSO a 50%).

Faixa 6: Oligossacárido conjugado 14-CRM_ig7 com ácido succínico como espaçador (2 yg) (relação: 1:4 de monoéster/grupos amino totais do CRM_ig7 em DMSO a 50%).

Faixa 7: Oligossacárido conjugado 19F-CRM. com ácido ±y / succínico como espaçador (2 yg) (relação: 1:4 de monoéster/grupos amino totais do CRM^_g7 na ausência de DMSO a 50%).

Faixa 8: Oligossacárido conjugado 23F-CRM^_g7 com ãcido succínico como espaçador (2 yg) (relação: 1:2 de monoéster/grupos amino totais do CRM_ig7 em DMSO a 50%).

Faixa 9: CRM_ig7 (1 yg) de referência.

B. Faixa 1: CRM_ig7 (1 yg) de referência.

Faixa 2: CRM_ig7 de referência (1 yg, diferente lote quando comparado com a Faixa 1).

Faixa 3: Oligossacãrido conjugado 23F-CRM_1n„ com ãcido adípico como espaçador (2 Mg) (relação: 1:2 de monoéster/grupos amino totais do CRM_ig7 em DMSO a 50%).

Faixa 4: Padrões de Peso Molecular (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K).

Faixa 5: Oligossacãrido conjugado 23F-CRM_in_ com ãcido adípico como espaçador (2 Mg) (relação: 1:2 de monoéster/grupos amino totais do CRM_ig7 em DMSO a 50%).

Faixa 6: CRM^_g7 (1 MU) de referência.

CRM_ig7 de referência (1 ^g, diferente lote quando comparado com a Faixa 1).

Faixa 7: Oligossacãrido conjugado 6A-CRM^_g7 com ãcido adípico como espaçador (2 m<?) .

C. Faixa 1: Padrões de Peso Molecular (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K).

Faixa 2: CRM_ig7 (1 pg) de referência.

Faixa 3: Oligossacãrido conjugado 6A-CRM_ig7 com ácido adípico como espaçador (2 MÇf).

Faixa 4: Oligossacãrido conjugado 14-CRM_ig7 com ácido adípico como espaçador (2 MU).

Faixa 5: Oligossacãrido conjugado 19F-CRM_ig7 com ãcido adípico como espaçador (2 pg).

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Faixa 6: Oligossacárido conjugado 23F-CRM_ig7 com ãcido adipico como espaçador (2 jug) .

Faixa 7: Marcadores de Peso Molecular (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K).

Figura 4. Resposta da IgG de coelho aos conjugados 6A-CRM._Λ_ de ±y / oligossacárido de S. pneumoniae. Análise ELISA da inibição do valor da afinidade do isótopo de IgG induzido para os polissacáridos capsulares.

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A. Polissacárido capsular tipo 6A.

B. Oligossacárido tipo 6A (DP = 10) na forma livre ou conjugado o CRM_ig7·

C. Oligossacárido tipo 14 (DP = 12) activado por espaçador molecular ou conjugado o CRM₁₉₇·

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

O presente invento diz respeito à ligação covalente de oligossacáridos derivados de polissacáridos capsulares bacteriaφ nos a proteínas veiculo; o processo do invento gera novos glicoconjugados através de um novo processo.

Para clareza da descrição e não com o fim da limitar, a descrição detalhada do invento é dividida nas secções seguintes:

(i) Preparação dos Oligossacáridos (ii) Activação dos Oligossacáridos (iii) Conjugação dos Oligossacáridos à Proteína (iv) Caracterização Imunoquímica dos Glicoconjugados

(v) Formulação e Administração de Vacinas (vi) Utilidade das Vacinas Conjugadas de Oligossacárido Pneumocócico.

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5.1. PREPARAÇÃO DE OLIGOSSACÁRIDOS

O polissacárido capsular de elevado peso molecular pode ser comercialmente adquirido (American Type Culture Collection, ATCC) (Rockville, MD) ou obtido pelos processos descritos por Porro et al. , 1983, J. Biol. Stand. 11:65-71. Pode ser utilizado qualquer polissacárido, incluindo, mas não limitados, àqueles encontrados nas cápsulas de Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisserla meninqitidis, Escherichia coli, Salmonella typhi, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae. Staphvlococcus aureus e Pseudomonas aeruqenosa.

Podem ser gerados fragmentos antigénicos com pelo menos uma extremidade redutora a partir de polímeros capsulares, por uma variedade de processos, dependendo das características estruturais do polímero capsular particular. A clivagem oxidativa limitada por periodato (ou reagentes relacionados) deixará terminais aldeídicos; uma tal aproximação será limitada a polímeros tendo grupos di-hidroxi vizinhos num resíduo não cíclico. A hidrólise de uma ligação glicosídica produz um terminal de açúcar redutor. Tal hidrólise pode ser mais especificamente realizada, enzimaticamente, por glicosidases, mas este Pedido de Patente seria restringido a relativamente poucos polímeros capsulares, por exemplo Streptococcus pneumoniae 8, para os quais são conhecidas as glicosidases. A hidrólise acidica é geralmente utilizada para hidrólise de ligações glicosídicas. A utilidade desta aproximação seria limitada se o polímero tivesse ligações não glicosídicas sensíveis ao ácido ou se o polímero tivesse ligações

ramifiçadas sensíveis ao ácido importantes para a ,especificidade antigénica.

Nas concretizações específicas do invento, o polissacárido capsular de S. pneumoniae tipo 6A pode ser hidrolisado em ácido acético aproximadamente 10 M a cerca de 100°C durante cerca de 30 horas; o polissacárido capsular de S. pneumoniae tipo 14 pode ser hidrolisado em ácido trifluoroacético aproximadamente 0,5 M a cerca de 70°C durante cerca de 7 horas; o polissacárido de S. pneumoniae tipo 19F pode ser hidrolisado em ácido acético . -2 aproximadamente 10 Ma cerca de 50°C durante cerca de 48 horas; e o polissacárido de S. pneumoniae tipo 23F pode ser hidrolisado em ácido trifluoroacético aproximadamente 0,5 Ma cerca de 70°C durante cerca de 3 horas.

De acordo com o invento, os oligossacáridos a ser conjugados à proteína consistem preferivelmente em entre três e seis unidades de repetição (ou entre cerca de dez e trinta resíduos de monossacãrido) e consistem mais preferivelmente em entre três e quatro unidades de repetição (ou cerca de quinze resíduos de monossacãrido) como oligossacáridos deste comprimento, incorporados em glicoconjugados e têm mostrado ser optimamente imunogénicos.

5.2. ACTIVAÇÃO DOS OLIGOSSACÁRIDOS

Os oligossacáridos podem ser activados por um processo de aminação redutora seguida por reacção com uma molécula bifuncional, tal como, mas não limitada a, um diéster. É apresentado na Figura 1 e Tabela II um resumo do processo do invento, que compara o processo do presente invento com o processo descrito por Porro et al.. 1985, Mol. Immunol. 22:907-919. Observar que o tempo de activação utilizando o processo anterior foi de 7-14

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dias; este foi encurtado, de acordo com o presente invento, a 15 minutos. Observar também que o tempo de redução utilizando o procedimento anteriorfoi de 7-14 dias; este foi encurtado, de acordo com o presente invento, a 48 horas. Por consequência, o presente invento requer 12-26 dias menos para ficar completo do que o processo anterior. Esta é uma vantagem importante, pois a exposição dos hidratos de carbono a temperaturas elevadas, tal como 50°C, pode conduzir a degradação.

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TABELA II. Activação Química da Unidade Redutora de Terminal dos Oligossacãridos de S. pneumoniae

Parâmetros		Procedimento Anterior	Procedimento Presente
Grupo Introduzido		NH2	nh(ch2)2nh2
Reagente (pH)	Tampão amoniacal (9)	Diaminoetano (9)
Temperatura Activação	de	50°C	100°C
Tempo de Activação		7-14 dias	15 minutos
Agente de Redução		Cianoboro-hidreto de Na	Borano de piridina
Temperatura Redução	de	50°C	50°C
Tempo de Redução		7-14 dias	48 horas
Produto Resultante		Oligo-NH2	Oligo-NH(CH2)2NH2
Espaçador Bifuncional Activante		SIDEA (diéster de succinimidilo do ácido adípico)	SIDES ou SIDEA (diéster de succinimidilo do ácido succínico ou adípico)
Temperatura Reacção	de	25°C	4°C
Tempo de Reacção		4 horas	2 horas
Produto Resultante		Oligo-NH-Monoêster	Oligo-NH(CH ) NH-Monoéster
Eficácia da Reacção		25-30%	70%

De acordo com o processo do invento, a aminação redutora da unidade redutora de extremidade de um oligossacárido é realizada utilizando uma molécula contendo dois grupos amino. Numa concretização preferida do invento, a aminação redutora é realizada por reacção de uma dada quantidade molar de oligossacárido com uma solução de diaminoetano num excesso molar de 10X em KH₂PO₄ 0,2M a pH aproximadamente = 9, a uma temperatura de aproximadamente 25-100°C, e preferivelmente 100°C, durante entre cerca de 1-60 minutos, e preferivelmente cerca de 15 minutos. Após aquela pode ser adicionada uma quantidade molar de borano de piridina equivalente a 25 vezes a concentração molar do oligossacárido na preparação e a reacção é realizada entre cerca de 25-100°C, e preferivelmente cerca de 50°C, durante entre cerca de 1 e 72, e preferivelmente cerca de 48 horas.

O produto resultante da reacção de aminação redutora pode então ser feito reagir com uma molécula bifuncional, sendo cada grupo funcional capaz de reagir quer com o grupo amino terminal do oligossacárido activado quer com os grupos amino presentes na estrutura da proteína veículo, de modo que a molécula bifuncional possa servir para ligar o oligossacárido e a proteína veículo. Numa concretização preferida do invento, o grupo bifuncional é um diéster, e é, mais particularmente, um diéster de ácido adípico, que tem mostrado estar associado a uma glicosilação da proteína mais eficaz. Numa concretização específica, preferida do invento, um oligossacárido, tendo sido submetido a aminação redutora como descrito supra, é adicionalmente feito reagir com um diéster de succinimidilo de ãcido succínico ou, mais preferivelmente, ácido adípico; esta reacção pode ser melhor realizada com o oligossacárido aminado numa concentração molar (como grupos amino) equivalente a cerca de um quinto da concentração molar de SIDEA (ou SIDES) numa solução de dimetilsulfóxido (DMSO) entre cerca de 0 e 25°C, e preferivelmente cerca de

4°C, durante cerca de 0,5 e 5 horas, e preferivelmente cerca de 2 horas. O oligossacãrido activado pode então ser recolhido por precipitação utilizando 1,4-dioxano (80% v/v), o que deixa também no sobrenadante o excesso de SIDEA (ou SIDES).

5.3. CONJUGAÇÃO DOS OLIGOSSACÁRIDOS À PROTEÍNA

AS proteínas que podem ser utilizadas de acordo com o invento incluem qualquer proteína que seja segura para administração a mamíferos jovens e que sirva como uma proteína veículo imunologicamente eficaz. Nas concretizações particulares, podem ser utilizadas as proteínas da superfície celular, proteínas de membrana, toxinas e toxóides. Os critérios para segurança irão incluir a ausência de toxicidade primaria e risco mínimo de reacção alérgica. Os toxóides da difteria e do tétano satisfazem estes critérios; isto é, quando adequadamerite preparados, eles não são tóxicos e a incidência de reacções alérgicas é aceitavelmente baixa. Embora o risco de reacção alérgica possa ser significativo para adultos, é mínimo para recém-nascidos. De acordo com concretizações particulares adicionais do invento, as proteínas veículo apropriadas incluem, mas não estão limitadas a, flagelina de Salmoneila, pilina de Hemophilus. proteínas de membrana de 15kDa, 28-30 kDa e 40 kDa de Hemophilus, enterotoxina lãbil ao calor LTB de Escherichia coli, toxina da cólera e proteínas virais incluindo proteínas de rotavírus VP7 e de vírus sincicial respiratório F e G.

No efeito de veículo um antigénio fraco, por estar ligado a um antigénio mais forte como veículo (i.e. uma proteína heteróloga), torna-se mais imunogénico do que se fosse apresentado sozinho. Se um animal for previamente imunizado com o veículo sozinho, o animal pode ser inoculado e produzir uma resposta imune intensificada não só para o antigénio veículo mas também

-27|·

para os grupos hapteno ligados. Os recém-nascidos são normalmente imunizados com os toxóides do tétano e da difteria. Assim, eles seriam inoculados para subsequente apresentação de um antigénio de polímero capsular conjugado com qualquer um destes toxóides.

Em geral, qualquer proteína heteróloga podia servir como um antigénio veículo. Contudo, certas toxinas bacterianas tais como a do tétano e a da difteria podem ter uma vantagem adicional visto que elas são compostas por duas porções, uma das quais (a subunidade de ligação) tem forte afinidade para ligação a superfícies de células de mamíferos. Concebivelmente, a conjugação a uma tal proteína de ligação iria permitir que o antigénio veículo iniciasse mais eficazmente as respostas em células do sistema imune.

As proteínas veículo às quais é conjugado o polímero capsular podem ser a toxina nativa ou a toxina destoxifiçada (toxõide). Por técnicas mutacionais relativamente recentes, podem-se também produzir geneticamente proteínas alteradas que são antigenicamente similares à toxina, mas no entanto não tóxicas. Estas são denominadas materiais de reacção cruzada ou CRMs. 0 CRM^g^ é notável visto que ele tem um único aminoácido mudado da toxina da difteria nativa e é imunologicamente indistinguível dela.

A conjugação do polímero capsular à toxina nativa pode reduzir a toxicidade, mas pode ainda persistir uma toxicidade significativa. Assim, a destoxificação posterior das toxinas de proteína emprega formalina, a qual reage com os grupos amino livres da proteína. A toxicidade residual pode ser ainda um problema. Além disso, a destoxificação espontânea é possível com qualquer lote particular de vacina e persiste um ponto de preocupação com esta aproximação.

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Alternativamente, a toxina nativa pode ser destoxifiçada com formalina para produzir um toxóide convencional antes da conjugação com o polímero capsular. Contudo, o tratamento prévio com formalina reduz o número de grupos amino livres disponíveis para reacção com os grupos redutores do fragmento de polímero capsular. Assim, os CRMs têm vantagens significativas visto que eles não têm qualquer toxicidade inerente, no entanto nenhum dos seus grupos amino estã ocupado pela formalina. Uma vantagem adicional © a de que não existem bio-riscos no trabalho com os CRMs.

No caso do CRM_ig7, que é imunologicamente idêntico à toxina nativa, o tratamento com formalina (embora não haja necessidade de destoxificar) aumenta muito a resposta imunológica. Pensa-se que isto se deve à estabilização da molécula contra a degradação por mecanismos do corpo e/ou agregação por reticulação (a imunogenicidade das partículas aumenta com o tamanho).

Por todas as razões acima, as toxinas do tétano e da difteria são os principais candidatos a proteínas, embora hajam outras que podem ser também adequadas. Embora estas outras possam não ter a história de segurança encontrada com a da difteria e do tétano, podem haver outras razões irresistíveis para as utilizar. Por exemplo, elas podem ser ainda mais eficazes como veículos ou a economia de produção pode ser significativa. Outros candidatos a veículos incluem as toxinas de Pseudomonas, Staphylococcus. Streptococcus, Pertussis e Escherichia coli.

Numa concretização específica do invento, os oligossacáridos activados podem ser ligados à proteíno CRM_in_ que foi purificada como se segue:

CRM₁₉₇, produzido pela estirpe Corynebacterium diohtheriae, pode ser separado do meio de cultura por passagem do

-29ί'

meio bacteriano através de uma membrana Millipore, precipitação da proteína a partir do filtrado e purificação do CRM.por cromatografia de permuta iónica, como descrito na secção 6, infra. Alternativamente, o CRM_ig? substancialmente puro pode ser obtido por qualquer processo conhecido na arte.

oligossacãrido activado pode ser covalentemente ligado à proteína veículo na presença de um solvente orgânico e, opcionalmente, de qualquer outro agente (tal como um agente de condensação) de forma a promover a ligação do grupo funcional terminal do oligossacãrido activado à proteína. Numa concretização preferida, específica do invento, o oligossacãrido activado comportando um grupo éster terminal pode ser covalentemente ligado aos grupos amino presentes na proteína veículo como se segue:

O oligossacãrido activado pode ser dissolvido em dimetilsulfóxido e depois adicionado a uma solução aquosa de proteína veículo (por exemplo, mas não limitada ao CRNL _n„ a uma concentração de cerca de 2 mg/ml) de modo que a relação molar de oligossacárido activado por monoéster/grupos amino totais da proteína veículo seja de cerca de 1:2 e a concentração final de DMSO seja de cerca de 50% v/v. A reacção de conjugação é realizada a 4°c e embora a reacção esteja próxima do fim em cerca de 2 horas, é preferível deixar a reacção prosseguir durante a noite de forma a aumentar o rendimento da reacção para valores mais altos para cada tipo específico de glicoconjugado. Os glicoconjugados assim obtidos são então purificados por cromatografia em gel.

Para a síntese de uma vacina monovalente, os oligossacáridos derivados de um único serotipo de bactéria podem ser conjugados com a proteína. Para a síntese de uma vacina multivalente, os glicoconjugados podem ser produzidos por ligação de uma

mistura de oligossacáridos derivados de bactérias de diferentes espécies ou diferentes serotipos a uma proteína veículo; alternativamente, podem ser misturados os glicoconjugados produzidos por reacção de um único tipo de oligossacárido com a proteína veículo em reacções separadas utilizando diferentes oligossacáridos. Assim, uma vacina multivalente pode compreender uma proteína veículo comportando uma população homogénea ou uma população heterogénea de oligossacáridos ligados.

íl·

Γ’

5.4. CARACTERIZAÇÃO IMUNOQUÍMICA DOS GLICOCONJUGADOS

A verificação da imunogenicidade dos glicoconjugados produzidos pelo processo acima pode ser testada num qualquer sistema animal adequado antes da administração a humanos, incluindo, mas não limitado a coelhos, porcos, cobaias, ratinhos, ratazanas ou cabras. Numa concretização específica do invento, os coelhos (aproximadamente 2 kg em peso) podem ser subcutaneamente inoculados com o conjugado glicoproteínico na presença ou ausência de fosfato ou hidróxido de alumínio. Aproximadamente 2,5 ^g de oligossacárido iriam constituir uma dose apropriada para um coelho de 2 kg. Os títulos dos anticorpos podem então ser avaliados por ensaio de imuno-sorção com enzima ligada (ELISA) ou por um qualquer outro processo conhecido na arte. Visto que os anticorpos gerados contra os glicoconjugados do invento podem ser incapazes de imunoprecipitar antigénios, os ensaios de anticorpos que dependem da imunoprecipitação não são recomendados para determinar os títulos.

5.5. FORMULAÇÃO E ADMINISTRAÇÃO DE VACINAS

Os meios veículo adequados para formular uma vacina

incluem solução salina tamponada com fosfato de sódio (pH 7,4) ou gel de fosfato de alumínio 0,125M suspenso em solução salina tamponada com fosfato a pH 6 e outros meios convencionais.

Geralmente, as vacinas contendo de cerca de 5 a cerca de 100 Mg, preferivelmente cerca de 10 a 50 Mg de oligossacãrido, são adequadas para induzir níveis eficazes de anticorpo contra o polímero capsular em mamíferos de sangue quente, jovens. Claro que a dosagem exacta seria determinada por experimentação de routina da dose/resposta. A concentração dos conjugados glicoproteícos para a preparação de vacinas para crianças está compreendida no intervalo de cerca de 25 a 2 00 m<? de oligossacárido. Podem ser administradas doses superiores com base no peso corporal. Espera-se que várias pequenas doses dadas sequencialmente sejam superiores â mesma quantidade de conjugado dado como uma única injecção.

As vacinas do invento podem ser administradas a mamíferos de sangue quente de qualquer idade e estão especialmente adaptadas para induzir, em mamíferos jovens, imunização activa contra infecções sistémicas causadas pelos patogénios Haemophilus influenzae tipo b, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Neisseria menincfitidis e Pseudomonas aerugenosa.

De acordo com o invento, a vacina pode ser subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, oral ou intranasalmente distribuida. A vacina pode compreender glicoconjugado na forma solúvel ou microparticular, ou incorporado em microsferas ou microvesículas, incluindo liposomas.

5.6. UTILIDADE DAS VACINAS CONJUGADAS DE OLIGOSSACÁRIDO

Nas concretizações preferidas do invento, as vacinas de b

glicoconjugado dirigidas contra bactérias patogênicas encapsuladas são utilizadas para proteger indivíduos susceptíveis de desenvolver infecções causadas por estes agentes. Os indivíduos susceptíveis incluem crianças jovens com sistemas imunes imaturos, indivíduos asplénicos, assim como qualquer indivíduo com um sistema imune comprometido ou doença crónica, particularmente sindroma da imunodeficiência adquirida (S.I.D.A.), virulência hematopoiética, diabetes, doença cardíaca crónica, doença pulmonar crónica e anemia celular falciforme. Os glicoconjugados do invento, devido à sua conjugação com uma proteína veículo, aumentam a imunogenicidade dos oligossacãridos que transportam.

Assim, os glicoconjugados do invento podem ser utilizados em vacinações para conferir protecção contra a infecção por quaisquer bactérias que possuam uma cápsula com polissacãrido, incluindo Streptococcus pneumoniae. Haemophilus influenzae. Escherichia coli, Neisseria menincritidis, Salmonella tvphi, Streptococcus routans, Cryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae. Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruqenosa. As estirpes de S. pneumoniae particularmente virulentas em crianças, e especialmente proporcionadas pelo presente invento, incluem os tipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23 e 33F.

Nas concretizações particulares, as vacinas do invento podem ser utilizadas para induzir uma resposta imune monoespecífica e homogénea. Uma resposta imune monoespecífica está associada a um certo número de vantagens, incluindo o fornecimento de anticorpos com (i) especificidade homogénea, em que substancialmente todos os anticorpos estão dirigidos contra um epítopo específico e são caracterizados pelo mesmo valor constante de afinidade; (ii) um elevado valor constante de afinidade com superior actividade anti-bacteriana; (iii) uma especificidade de

h <·

I' i

alvo aumentada e a ausência de reactividade cruzada com os antigênios relacionados com o hospedeiro, resultando numa vacina mais segura; e (iv) uma activação do complemento diminuída devido à actividade precipitante diminuída dos anticorpos monoespecíficos, resultando também numa vacina mais segura.

Nas concretizações adicionais, o presente invento pode ser utilizado para produzir vacinas que reconhecem péptidos ou haptenos de lipooligossacãridos ou de outros oligossacãridos de superfície ligados, por processos do invento, a proteínas veículo. Tais vacinas podem ser utilizadas, por exemplo, na indução de imunidade contra células tumorais ou na produção de anticorpos anti-tumorais conjugados com um agente quimioterapêutico ou bioactivo; tal actividade anti-tumoral podia ser induzida por ligação de um antigênio específico de tumor, ou de um seu epítopo, a uma proteína veículo utilizando os processos do invento.

6. EXEMPLO: DESENVOLVIMENTO DE UMA VACINA CONJUGADA DE OLIGOSSACÁRIDO PNEUMOCÓCICO, MULTIVALENTE

6.1. PREPARAÇÃO DE POLISSACÁRIDOS polissacãrido capsular de S. pneumoniae tipo 6A, o polissacãrido capsular de S. pneumoniae tipo 14, o polissacãrido capsular de S. pneumoniae tipo 19F e o polissacãrido capsular de S. pneumoniae tipo 23F foram obtidos a partir da American Type

Culture Collection.

-346.2. HIDRÓLISE DO POLISSACÁRIDO

6.2.1. HIDRÓLISE DO POLISSACÁRIDO DE S. PNEUMONIAE TIPO 6A

Dois miligramas do polissacárido capsular de S. oneumoniae de Tipo 6A foram dissolvidos em 1 ml de solução aguosa contendo 10 mM de ãcido acético a pH =3,4, depois deixados hidrolisar em ampolas seladas mergulhadas num banho de óleo a uma temperatura de 100°C durante trinta horas. Os oligossacáridos resultantes foram então separados da mistura reaccional por cromatografia sobre Sephadex G15 (Pharmacia, Uppsala) condicionada com uma solução 15 mM de NaCl a pH 7,0 a 4°C.

Os efluentes cromatograficos foram então analisados de acordo com os procedimentos como descrito por Kabat, (1964 em '•Experimental Immunochemistry, Ed. E.A. Rabat and Mayer, pgs 538-541), Chen et al. (1956, Anal. Chem. 28.:1756-1758) e Porro et al. (1981, Anal. Biochem. 118:301-306) para estabilizar a presença de metilpentoses, fósforo e grupos redutores, por exemplo grupos aldeído. A análise revelou uma razão de metilpentose/aldeído de 3,96, uma razão de metilpentose/fósforo de 0,96 e uma razão de fósforo/aldeído de 4,12.

A cromatografia em gel sobre Sephadex G-50 Superfine (Pharmacia) utilizando tampão, revelou uma constante de distribuição (kd) de 0,538 (por hexose), correspondendo a um peso molecular de aproximadamente 2 500.

Verificou-se gue a R.M.N., a cromatografia gasosa e a análise esteguiométrica indicaram gue os oligossacáridos consistiam em cerca de 3-4 unidades de repetição básicas de entre as guais galactose, gue era o açúcar imunodominante.

ί',·

6.2.2. HIDRÓLISE DO POLISSACÁRIDO DE S. PNEUMONIAE TIPO 14

Dois miligramas do polissacárido capsular de S. pneumoniae de Tipo 14 foram dissolvidos em 1 ml de solução aquosa contendo ácido trifluoroacético 0,5 M, depois deixados hidrolisar em ampolas seladas mergulhadas num banho de óleo a uma temperatura de 70°C durante sete horas. Os oligossacáridos resultantes foram então separados da mistura reaccional por cromatografia sobre Sephadex G15 (Pharmacia, Uppsala) condicionada com uma solução 15 mM de NaCl a pH 7,0 a 4°C.

Os efluentes cromatográficos foram então analisados quanto ao teor em hexosamina e aldeído e mostraram ter uma relação de hexosamina para aldeído de 3,17. A cromatografia gasosa e a análise estequiométrica indicaram um tamanho molecular correspondente a três a quatro unidades de repetição básicas. A desramificação da galactose, como determinada por cromatografia gasosa, foi de 10%. A cromatografia em gel sobre Sephadex G-50 Superfine (Pharmacia) utilizando NaCl 15 mM a pH 7,0 revelou, para o oligossacárido, uma constante de distribuição (kd) de 0,30, como determinado para a hexose total.

6.2.3. HIDRÓLISE DO POLISSACÁRIDO DE S. PNEUMONIAE TIPO 19F

Dois miligramas do polissacárido capsular de S. pneumoniae de Tipo 19F foram dissolvidos em 1 ml de solução b aquosa contendo 10 mM de ácido acético a pH = 3,4, depois deixais dos hidrolisar em ampolas seladas mergulhadas num banho de óleo a i' uma temperatura de 50°C durante quarenta e oito horas. Os oligossacáridos resultantes foram então separados da mistura reaccional r por cromatografia sobre Sephadex G15 (Pharmacia, Uppsala) condicionada com uma solução 15 mM de NaCl a pH 7,0 a 4°C.

Os efluentes cromatográficos foram então analisados de acordo com os procedimentos como descrito por Kafoat, (1964 em Experimental Immunochemistry, Ed. E.A. Rabat and Mayer, pgs 538-541), Chen et al. (1956, Anal. Chem. 28:1756-1758) e Porro et al. (1981, Anal. Biochem. 118:301-306) para estabilizar a presença de metilpentoses, fósforo e grupos redutores, por exemplo grupos aldeído. A análise revelou uma razão de metilpentose/metil pentose reduzida de 3,5 e uma razão de metilpentose/fósforo de

3,2.

A cromatografia em gel sobre Sephadex G-50 Superfine (Pharmacia) revelou para o oligossacárido um Kd = 0,46 (por hexose total) e a análise combinada por cromatografia gasosa e estequiometria indicou um tamanho correspondente a de três a quatro unidades de repetição.

6.2.4. HIDRÓLISE DO POLISSACÁRIDO DE S. PNEUMONIAE TIPO 23F

Dois miligramas do polissacárido capsular de S. pneumoniae de Tipo 23F foram dissolvidos em 1 ml de solução aquosa de ácido trifluoroacético a 0,25 M, depois deixados hidrolisar em ampolas seladas mergulhadas num banho de óleo a uma temperatura de 70°C durante três horas. Os oligossacáridos resultantes foram então separados da mistura reaccional por cromatografia sobre Sephadex G15 (Pharmacia, Uppsala) condicionada com uma solução 15 mM de NaCl a pH = 7,0 a 4°C.

Os efluentes cromatográficos foram então analisados de acordo com os procedimentos como descrito por Kabat, (1964 em Experimental Immunochemistry, Ed. E.A. Rabat and Mayer, pgs 538-541), Chen et al. (1956, Anal. Chem. 28.:1756-1758) e Porro et al. (1981, Anal. Biochem. 118:301-306) para estabilizar a

presença de metilpentoses, fósforo e grupos redutores, por exemplo grupos aldeído. A análise revelou uma razão de hexose/aldeído de 4,5-4,5, uma razão de hexose/metilpentose de 2,3 e uma razão de fósforo/aldeído de 2,9.

A cromatografia gasosa e a análise estequiométrica indicaram a presença de entre 3,5 e 4,5 unidades de repetição básicas. A desramificação da ramnose, como determinado por cromatografia gasosa, foi inferior a oito por cento.

A cromatografia em gel sobre Sephadex G-50 Superfine (Pharmacia) revelou uma constante de distribuição (Kd) de 0,38 (por hexose).

6.3. CARACTERIZAÇÃO IMUNOQUÍMICA DOS HAPTENOS DE OLIGOSSACÁRIDO DE S. PNEUMONIAE

A capacidade dos oligossacãridos de S. pneumoniae tipos 6A, 14, 19F e 23F para interagirem com os anticorpos dirigidos contra polissacãridos capsulares foi testada como descrito em Porro et al. (1985, Mol. Immunol. 22.:907-919), utilizando uma técnica que mede a capacidade de um hapteno (i.e. o oligossacárido) para inibir o antigénio homólogo (polissacárido capsular) para a reacção de imunoprecipitação de anticorpos (os haptenos de baixo peso molecular não dão uma reacção de imunoprecipitação quando testados contra anticorpos homólogos).

processo, denominado imunoelectroforese diferencial, foi realizado como se segue: uma placa de plástico de suporte para imunoelectroforese continha três compartimentos com agarose a 1% (p/v) (Agarose M-LKB,Bromma, Suécia). 0 primeiro compartimento continha 0,005% (v/v) de antissoro de referência para o polissacárido capsular. O segundo compartimento continha 0,005% (v/v) de antissoro de referência para o polissacárido capsular que tinha sido previamente incubado com uma quantidade conhecida de polissacárido capsular de referência a 37°C durante 15 minutos. O terceiro compartimento continha 0,005% (v/v) de antissoro de referência para o polissacárido capsular que tinha sido previamente incubado com uma quantidade conhecida de hapteno de oligossacãrido. Foi então realizada uma separação electroforética do polissacárido capsular em quatro séries de diluições a duas vezes a 70 V/cm em tampão de Tris-barbiturato 20 mM, pH = 8,8, durante 90 minutos. Após electroforese, as placas foram coradas com prata, secas e quantificadas. A inibição pelas moléculas de oligossacãrido foi evidenciada por imunoprecipitados foguete superiores que aparecem no compartimento contendo o

antissoro de referência pré-incubado com o hapteno. A concentração inibidora minima de um hapteno foi calculada como

MIC

Hg

onde = concentração do hapteno examinado no gel h^g = intersecção da linha recta como determinado pela altura dos imunoprecipitados foguete obtidos quando o antigénio de referência estava no gel, e

Ha intersecção da linha recta como determinado pela altura dos imunoprecipitados foguete obtidos quando o hapteno examinado estava no gel.

Similarmente,

MIC

Ag 'Ag

. . . MIC

Especificidade = Ag Ha¹¹

Foram testados os haptenos de oligossacárido de diferentes tamanhos.

A capacidade dos oligossacãridos para bloquear a imunoprecipitação de polissacãridos capsulares pelo anticorpo específico foi também testada pelo processo não electroforético de imunodifusão radial. De acordo com este processo, a inibição por moléculas de oligossacãridos foi evidenciada por um grande raio de imunoprecipitado formado por difusão do antigénio (polissacárido capsular) através de agarose a 1 por cento p/v contendo

o anticorpo específico previamente incubado com uma dada quantidade de inibidor (oligossacárido). Uma vez experimentalmente encontrada a Concentração de Combinação Mínima (MCC) para um dado hapteno, é então calculada a especificidade de acordo com a fórmula previamente mencionada:

Especificidade = Ha ^MCCAg(Ps)

VSÍigo)

TABELA III

Caracterização Imunoquímica dos Haptenos de Oligossacárido de S. pneumoniae

Tipo de Oligossacárido

6A

19F

23F CH₃COOH (hid) TFA (hid)

DP	PM	(MIC /MIC ) por DIEP 1	(MCC /MCC. por IRID'
2	1,5K	io|
3,5 10	2,5K 7,0K	io4 10	10 3
5 15	3,5K 10,4K	n.t. n.t.	10-í 10
3,5	2,2K	IO-3	-4 10
3	2,3K	io“3	10^
6	4,5K	10 4	1θ-3
4,5	3,4K	10-í	5 X 10 ,
9,5	7,2K	10 1	IO-1

n.t. = não testãvel

DIEP = Imunoelectroforese Diferencial IRID = Inibição da Imunodifusão Radial MIC = Cone. Inibidora Mínima

MCC = Cone, de Combinação Mínima

6.4. ACTIVAÇÃO DA UNIDADE REDUTORA DE EXTREMIDADE DE OLIGOSSACÁRIDOS DE S. PNEUMONIAE ¥·

Os haptenos de oligossacárido, obtidos como descrito na secção 6.2, supra, foram dissolvidos em água para uma concentração final de cerca de 5 mg/ml. A cada solução, foi adicionado 0,1 ml de KH₂PO₄ 0,2 M por cada mililitro de volume de solução e o pH foi elevado para 9,2-9,4 pela quantidade requerida de diaminometano (é geralmente requerido, um volume de 2 μΐ de diaminometano por cada mililitro de solução). A mistura foi mantida a 100°C durante 15 minutos, tempo após o qual foi adicionada uma quantidade de cerca de 4 μΐ de borano de piridina por cada mililitro de volume de solução. O pH foi ajustado a 9,2 por NaOH IN. A mistura foi então transferida, numa ampola selada, para um banho de óleo a 50°C durante as 48 horas seguintes. Após isto, a solução de oligossacárido activado por amino foi neutralizada por HC1 IN e purificada em Sephadex G-15 Superfine (NaCl 15 mM, pH 7,01). As fracções cromatograficas recolhidas foram reunidas e congeladas. Depois, o resíduo congelado foi dissolvido a 10 mg/ml em DMSO e adicionado a uma quantidade molar de SIDEA (ou SIDES) correspondendo a uma relação de 5:1 no que diz respeito à quantidade de grupos amino presentes no composto congelado. A reacção prosseguiu à temperatura ambiente durante 4 horas e depois, foram adicionados à solução 4 volumes de 1,4-dioxano (conc. final 80% em 1,4-dioxano) de forma a precipitar o oligossacárido activado por éster. 0 precipitado, recolhido por centrifugação, foi lavado três vezes com 1,4-dioxano e mantido a -20°C ou menos a não ser que utilizado no processo de conjugação. 0 rendimento do processo de activação para cada um dos quatro oligossacáridos é mostrado na Tabela IV.

42TABELA IV

Activação do Oligossacãrido de S. oneumoniae: Rendimento do Processo (% p/p)

Serotino Olicro-NH (CH2) 2NH2	Olicfo-NH (CH„) 2NH-monoéster Total
6A	75	93	70
14	73	90	66
19F	100	100	100
23F	50	90	45
XG (±d.p.	) 74,5 (±20)	93,3 (±4,7) 70	(+23)

»

6.5. CONJUGAÇÃO DO OLIGOSSACÃRIDO ACTIVADO COM A PROTEÍNO

6.5.1. PREPARAÇÃO DA PROTEÍNO CRM^,.,

CRM_1P7, produzida por Corynebacterium diphtheriae C7 tx—197 .

(B ), foi separada do meio de cultura por filtração molecu. . . . -4 lar utilizando uma membrana Millipore XM-50 (NMWL 5x10 ). A proteína foi então precipitada por adição ao filtrado de uma solução saturada de sulfato de amónio (atê 65% p/v). A proteína precipitada foi recolhida por centrifugação e redissolvida em tampão de fosfato 0,01 M (pH = 7,2).

Foi realizada uma purificação adicional do CRM_in„ por cromatografia de permuta iónica utilizando uma coluna de DEAE-Sepharose 6B/CL de 2,5 x 100 cm (Pharmacia, Uppsala) condicionada em tampão de fosfato 0,01 M a pH 7,2, utilizando NaCl 0,09 M em tampão de fosfato 0,01 M como eluente.

A electroforese em gel de SDS poliacrilamida sob condições de redução (Pappenheimer et al.. 1972, Immunochem.

9:891-906) indicou que 80% do CRM_ig7 obtida estava na sua forma

nativa. A pureza da proteína foi verificada ser de 400 limite de floculação (Lf) por miligrama.

6.5.2. CONJUGAÇÃO DOS OLIGOSSACÁRIDOS ACTIVADOS procedimento de conjugação consistiu no acoplamento dos haptenos de oligossacárido activado por éster de succinimidilo ao grupo epsilon-amino dos resíduos de lisina da proteína veículo CRM₁₉^.

Foi então adicionado, dimetilsulfóxido contendo oligossacáridos activados por éster de succinimidilo (ou ácido adípico) de polissacáridos capsulares de S. pneumoniae tipos 6A, 14, 19F e 23F, a uma solução de bicarbonato 0,1 M pH = 8,0 contendo 2 mg/ml de CRM_ig7 para produzir uma solução que era 50% em água e na qual a relação molar de oligossacárido activado por éster para os grupos amino totais da proteína é de 1:2.

A mistura assim obtida foi mantida, sob agitação suave, a 4°C durante 15 horas. Os oligossacáridos de cada um dos quatro serotipos foram conjugados com a proteína em reacções separadas. Um sumário da caracterização fisicoquímica dos glicoconjugados obtidos é apresentado na Tabela V.

6.5.2.1. COMPARAÇAO DA EFICACIA DE CONJUGACAO UTILIZANDO COMO LIGANTE O DIÉSTER DE SUCCINIMIDILO DO ÁCIDO ADÍPICO VERSUS O

DIÉSTER DE SUCCINIMIDILO DO ÁCIDO SUCCÍNICO

Os oligossacáridos activados formados por reacção com o diéster de succinimidilo do ãcido succínico (SIDES) eram da estrutura

Oligosacárido

II

-NH(CH₂)₂NH-C(CH

enquanto que aqueles formados por reacçao com o éster de succinimidilo do ácido adípico (SIDEA) eram da estrutura

Oligosacárido

-NH(CH₂)₂NH-C(CH

e produzem assim ligantes de diferentes tamanhos entre o oligossacãrido e a proteína conjugada (ver Figura 2). Foi avaliada a eficácia de conjugação utilizando oligossacáridos activados por SIDES versus SIDEA. Como mostrado na Figura 3A, B e C, só quando o ligante era derivado de SIDEA é que fazia a proteína parecer estar na forma totalmente glicosilada (onde foi detectada pouca ou nenhuma banda livre de CRM₁₉₇).

6.6. IMUNOGENICIDADE DOS GLICOCONJUGADOS DE S. PNEUMONIAE

Foram preparadas várias formulações dos quatro antigénios de glicoconjugado e testadas em coelhos (de acordo com o esquema delineado na Tabela VI): glicoconjugados específicos de tipo em formulação monovalente (2,5 ou 5,0 /xg de oligossacárido por dose) ou formulação multivalente (2,5 Mg de cada oligossacárido por dose) com e sem hidróxido de alumínio [Al(OH)₃] como adjuvante mineral (só foi administrado na formulação multivalente a 1 mg por dose). A absorção completa dos quatro glicoconjugados a A1(OH)₃ ocorreu sob as condições adoptadas, uma vez que o processamento do sobrenadante da formulação multivalente quer por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida quer por imunoelectroforese de foguete não revelou qualquer quantidade de proteína livre. Uma dose média de cada glicoconjugado continha aproximadamente 2,5 MU ύθ oligossacárido e 13 MU de proteína veículo CRM_1Q_ (comparável com a dose de vacinação humana média de toxóide da difteria). O esquema de imunização incluiu uma dose de inoculação e duas doses de reforço separadas por quatro semanas. Os sangramentos foram realizados na semana 0, 4, 6 e 10.

í;

TABELA VI

Esquema de Imunização Para Coelhos e Ratinhos e Doses das Vacinas

Imunização na semana 0, 4, 8 Sangramento na semana 0, 4, 6, 10

A. Formulação Monovalente (tipo simples) Solúvel dose (0,5 ml): 2,5 /zg de oligossacárido e 13 /zg (5 Lf) de CRM₁₉₇ dose (0,5 ml): 5,0 μg de oligossacárido e 26 μg (10 Lf) de CRM_ig?

B. Formulação Polivalente (4 tipos misturados) Solúvel dose (0,5 ml): 2,5 μg de oligo específico de tipo (Tot = 10 [ig de oligos) e um total de 52 μg (20 Lf) de CRM_ig?

C. Formulação Polivalente (4 tipos misturados) ads de Al(OH)₃ dose (0,5 ml): 2,5 μg de oligo específico de tipo (Tot = 10 μg de oligos) e um total de 52 μg (20 Lf) de CRM_qq7 com 1 mg de A1(OH)₃

A Tabela VII mostra a quantidade estimada por RIA (processo FARR) de anticorpos específicos de tipo assim como o número de respondedores sobre o número de animais imunizados. A razão (R) indica o aumento atingido após cada dose de imunização.

A Tabela VIII mostra os títulos de ELISA em termos de Ac isotipo de IgG assim como o número de respondedores versus o número de animais imunizados. As razões -R^ -R^ -Rg indicam o aumento nos títulos após cada dose de imunização, enquanto que as razões -R^ -Rg, -Rg, indicam o aumento nos títulos para uma dada dose de imunização relativamente ao pré-título. A Tabela IX descreve os resultados qualitativos em termos de funcionalidade

dos anticorpos IgG induzidos no reconhecimento do polissacãrido da cápsula em estreptococos vivos (reacção de Quellung ou teste de Neufeld).

A Tabela X mostra os títulos neutralizantes da toxina da difteria induzidos em coelhos pela proteína veículo CRM_ig?, como estimado pelo ensaio de células Vero. Uma vez gue foi utilizado como controlo o antissoro de de referência, foram também incluídos títulos expressos em μ/ml.

B

ΙΛ

co c

co ε

ω cn

QUADRO VII cn

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unidade de proteina veiculo (mole/mole) igual a 7.

SD para o glicoconjugado tipo 14 foi de 6; para o tipo 19F foi de 4 e para o tipo 23F foi de

TABELA VIII

Resultados ELISA dos títulos* de Ac isotipos de IgG induzidos por uma vacina multivalente incluindo os glicoconjugados dos oligossacáridos capsulares de S. pneumoniae DP=3+6 tipos 6A, 14, 19F, 23F adsorvidos ao adjuvante mineral A1(OH)₃

Pré-título Inoculação ISReforço 2SReforço (Semana 0) (semana 4) (semana 6) (semana 11)

tipo	6A	<50 (0/5) R1>96,0	4 800 (5/5) R =10, R2'>1 027	51 200 (5/5) 130 000 (5/5) 7 (a<0,01) R_=2,5 (a<0,01) R3'>2 500
tipo	14	<50 (0/5) R1>7,2	360 (5/5) R =12, R2'>8973	4 480 (5/5) 19 000 (5/5) 4 (a<0,01) R =4,4 (a<0,01) R3'>395,0
tipo	19F	<50 (0/5) R >41,6	2 080 (5/5) R =9,0 R '>371,2	18 560 (5/5) 35 200 (5/5) (a<0,01) R =1,9 (a<0,01) R3'>704,0
tipo	23F	<50 (0/5)	880 (5/5)	1 280 (5/5) 11 880**

R >17,6 R =1,5 (a<0,01) R =9,3 (a<0,01)

R₂'>25,5 R₃ ^z>237,6 * Títulos expressos como a média geométrica do recíproco da mais alta diluição de soro gue mostra um valor ABS duplo do do fundo da reacção. Em parêntesis indica-se o número de animais (respondedores sobre todos os injectados).

** O valor inclui o título de um coelho respondedor anormalmente alto. Regeitando dois dos cinco coelhos imunizados, o melhor e o pior respondedor, agui estão os resultados dos 3 coelhos restantes para o serotipo 23F:

(semana 0) <50 (0/5)

R >13,3 (semana 4, 667 (3/3)

R =2,0 (a<0,01) R₂'>26,7 (semana 6)

333 (3/3)

R =2,0 R₃'>53 (semana 11) 2 667 (3/3) (a<0,01)

t.

TABELA IX

Oligo-conjugado o CRM,DP=3-6

Funcionalidade Imunológica dos Ac do Soro de Coelho 197 ao

Anãlise Qualitativa (Reacção de Quellung* para o Reconhecimento Capsular)

Tipo 6A	S. pneumoniae:	Reacção	Positiva
Tipo 14	S. pneumoniae:	Reacção	Positiva
Tipo 19F	S. pneumoniae:	Reacção	Positiva
Tipo 23F	S. pneumoniae:	Reacção	Positiva
* Realizada	de acordo com o	processo de	Austrian (1976)
Sinai J. Med.	43:699-709.

Mt.

TABELA X

Títulos* antidifteria utilizando o ensaio de células vero induzido em coelhos imunizados pelos glicoconjugados multivalentes sintetizados com oligossacáridos de S. pneumoniae covalentemente ligados à proteína veículo CRM^g?

Pré-título Inoculação íeReforço 22Reforço (semana 0) (semana 4) (semana 6) (semana 11)

Ι

Forma solúvel <10 <10

R=2,5 (0,019 Mg/ml)

R=77,0

920 (1,4 Mg/ml)

Al(OH)₃~ads <10 (0,015 1 280 (0,96 3 840 (2,9

Mg/ml)

R=64,0

Mg/ml) R=3,0

Mg/ml) antissoro de ref. da FDA continha 6 M<?/^ml ® deu uma protecção de 50% à diluição de 1/8 000.

* Títulos expressos como o recíproco da diluição à qual o conjunto dos antissoros mostrou uma protecção de 50% para as células, como calculado por incorporação da ^JH-Leucina após exposição das células à toxina da difteria.

Os números em parêntesis indicam os títulos em yg/tal como determinado utilizando o antissoro de referência da FDA como controlo.

ί,··

L

6.7. OS OLIGOSSACÁRIDOS DE COMPRIMENTO DE CADEIA DP = 10-20

SÃO SUBOPTIMAMENTE IMUNOGÉNICOS

Os dois grupos de vacinas de glicoconjugados foram sintetizados de acordo com o esquema de síntese descrito supra mas utilizando os sacãridos de S. pneumoniae tipos 6A, 14, 19F e 23F com dois valores de intervalo diferentes de comprimento de cadeia, nomeadamente DP = 3-5 e DP = 10-20. A questão tornou-se então a de se um oligossacárido com um comprimento de cadeia de DP = 20 ou maior seria também o imunogénio óptimo (após

conjugação com a proteína veículo seleccionado CRM_lg7) em termos da capacidade de inoculação e de reforço quando comparado com um com um comprimento de cadeia muito mais pequeno, tal como um oligossacárido de DP = 3.

Os coelhos foram imunizados utilizando o protocolo realçado na Tabela XI. Como mostrado por comparação dos resultados apresentados nas Tabelas XII e XIII, que se referem aos resultados ELISA de títulos de anticorpos isotipos de IgG induzidos por oligossacáridos de S. pneumoniae com DP = 10-14 e DP = 3-6, respectivamente, assim como aqueles apresentados nas Tabelas XIV e XV, que se referem aos resultados ELISA de títulos de anticorpos isotipos de IcrG induzidos por oligossacáridos de S. pneumoniae com DP = 10-14 e DP = 3-6, respectivamente, adsorvidos a A1(OH)₃, uma DP = 10-14 não estava associada a imunogenicidade aumentada. De facto, as actividades de inoculação e reforço do IgG de conjugados de oligossacárido de DP = 3-5 foram bastante superiores às actividades observadas utilizando conjugados de oligossacárido de DP = 10-14. Não casualmente, todas as quatro estruturas de hidrato de carbono investigadas estavam associadas a resultados similares. Além disso, a neutralização da toxina da difteria por glicoconjugados com DP = 10-14 mostrou ser menos eficaz do que a alcançada utilizando glicoconjugados com DP = 3-6 (Tabela XVI). Assim, os oligossacáridos de comprimento de cadeia DP = 10-20 são funcionais em conjugados do presente invento embora os oligossacáridos de DP = 3-6 induzam títulos de anticorpos mais elevados.

-54TABELA XI

Os modelos de glicoconjugados foram injectados a uma dose de

2,5 μg de hidrato de carbono. Visto que os modelos testados só diferem no comprimento de cadeia dos oligossacãridos covalentemente ligados, a correspondente quantidade de proteína veículo foi de:

Dose de Hidrato de Carbono (Mg)

Dose de Proteína Veículo (M9)

Relação em Peso (P/P)

Oligo-CRM₁₉₇ 2,5 12,5 0,2

DP = 3-6

Oligo-CRM_19? 2,5 2,5 1,0

DP = 10-14

Imunização nas semanas 0, 4 e 8. Sangramento nas semanas 0, 4 e 10.

TABELA XII

Resultados ELISA dos Títulos de Ac Isotipos de IgG Induzidos por uma Vacina Multivalente que Inclui os Glicoconjugados dos Oligossacãridos Capsulares de S. pneumoniae de DP = 10-14

Tipos 6A, 14, 19F, 23F na Forma Solúvel
		Pré-título	Inoculação	l^Reforço	22Reforço
		(semana 0)	(semana 4)	(semana 6)	(semana 10)
tipo	6A	<100	<100	<100	500 (2/5)
tipo	14	<100	300	2 400 (3/5)	4 600 (3/5)
tipo	19F	<100	<100	<100	<100
tipo	23F	<100	<100	<100	<100

TABELA XIII

Resultados ELISA dos Títulos de Ac Isotipos de IgG Induzidos por uma Vacina Multivalente que Inclui os Glicoconjugados dos Oligossacáridos Capsulares de S. pneumoniae de DP = 3-6 Tipos 6A, 14, 19F, 23F na Forma Solúvel

Pré-título (semana 0)

Inoculação (semana 4) lsReforço (semana 6)

22Reforço (semana 11)

F

Tipo	6A	<50	<200
Tipo	14	<50	1 800
Tipo	19F	<50	<50
Tipo	23F	<50	<50

967 (6/6) 8 500 (6/6)

R₃ = 8,8 (a<0,01)

3 266	(3/6)	3 650	(4/6)
675	(4/6)	1 750	(6/6)
<50		<50

-57TABELA XIV

Resultados ELISA dos Títulos de Ac Isotipos de IgG Induzidos por uma Vacina Multivalente gue Inclui os Glicoconjugados dos Oligossacáridos Capsulares de S. pneumoniae de DP = 10-14 Tipos 6A, 14, 19P, 23F Adsorvidos ao Adjuvante Mineral A1(OH)₃

		Pré-título	Inoculação	lsReforço 22Reforço
		(semana 0)	(semana 4)	(semana 6) (semana 10)
Tipo	6A	<100	240 (5/5)	900 (5/5) 500 (5/5)
		R^ > 2,4	R2 '	= 3,8 (a<0,01)
				R2'> 9,0
Tipo	14	<100	300 (5/5)	1 040 (5/5) 8	480 (5/5)
		R.]>3,0	R2 = 3,5	(a<0,01) R3 = 8,2	(a<0,01)
			R2'>10,4	R3'>84,9
Tipo	19F	<100	<100	400 (1/5)	800 (1/5)
Tipo	23F	<100	<100	<100	200 (1/5)

TABELA XV

Tabela IV. Resultados ELISA dos Títulos* de AB Isotipos de IgG Induzidos por uma Vacina Multivalente que Inclui os Glicoconjugados dos Oligossacáridos Capsulares de S. pneumoniae de DP = 3-6 Tipos 6A, 14, 19F, 23F Adsorvidos ao Adjuvante

Mineral AlíOH)^

Pré-título Inoculação lRReforço 22Reforço (semana 0) (semana 4) (semana 6) (semana 11)

Tipo

6A <50 (0/5) 4 800 (5/5) 51

R >96,0 R =10,7 (a<0,01)

R^ >1 027

200 (5/5) 130 000 R =2,5 (a<0,01)

Rg >2 600 (5/5)

Tipo 14 <50 (0/5) 360 (5/5)

R >7,2 R =12,4 (a<0,01)

R^'>89,3

Tipo 19F <50 (0/5) 2 080 (5/5)

R >41,6 R =9,0 (a<0,01) ¹ R2^Z>371,2

Tipo 23F <50 (0/5) 880 (5/5)

R >17,6 R =1,5 (a<0,01) ¹ >25,6

480 (5/5) 19 800

R =4,4 (a<0,01) Rg'>396,0 (5/5)

560 (5/5) 35 200 (5/5)

R =1,9 (a<0,01) Rg'>704,0

280 (5/5) 11 880 (5/5)

R =9,3 (a<0,01) Rg'>237,6 * Títulos expressos como a média geométrica do recíproco da mais alta diluição de soro que mostra um valor ABS duplo do do fundo da reacção. Em parêntesis indica-se o número de animais (respondedores sobre todos os injectados).

-59TABELA XVI

Neutralização* In vitro da Toxina da Difteria Com Soros de Coelhos Imunizados com Glicoconjugados CRM_ig7-Oligossacãrido de S. pneumoniae

Pré-título Inoculação lsReforço 22Reforço

(semana 0)	(semana	4)	(semana	6) (semana 11)
Oliqo-CRM	, DP = 3-	6:
19 z Solúvel	<1/10	<1/10		1,20	1/1 280
			(0,03	φ/ml)	(2,05 φ/ml)
Al(OH)_ads	<1/10	<1/10		1/640	1/2 560
	(0,016	0/ml)	(1,02	</>/ml)	(4,10 φ/ml)
01íqo-CRM13„	, DP = 10	-14:
Solúvel	<1/10	<1/10		<1/10	1/10
				(0,	016 φ/ml)
Al(OH) ads	<1/10	<1/10		1/40	1/80
			(0,06	φ/ml)	(0,13 φ/ml)

* Títulos expressos como o recíproco da diluição à qual o conjunto dos antissoros de coelho mostrou uma protecção₃de 50% para as células, como calculado por incorporação da ^JH-leucina após exposição das células à toxina da difteria. Os números em parêntesis indicam os títulos em Mg/ml como determinado pelo antissoro de referência da FDA como controlo.

MPL calculado em humanos: 0,01 m9/®1·

6.8 A RESPOSTA IMUNE AOS GLICOCONJUGADOS É MONOESPECÍFICA E HOMOGÉNEA

A comparação dos resultados descritos nas Tabelas VII e VIII, que se referem aos títulos dos anticorpos determinados por radioimunoensaio (RIA) e ensaio de imuno-sorção com enzima ligada (ELISA), revela que os títulos calculados por RIA eram comparativamente mais baixos do que os títulos calculados por ELISA. Esta

-60ί· ίΐ ί*

1'

observação, juntamente com a ausência de imunoprecipitados nos geles de agarose utilizados para as análises de imunodifusão radial e de electroforese de foguete do antissoro anti-glicoconjugado, prova que os antissoros de coelho para os conjugados de CRM_ig7-oligossacãrido de S. pneumoniae continham anticorpos isotipos de IgG altamente específicos que eram incapazes de precipitar bs respectivos polímeros de hidrato de carbono purificados utilizados para gerar os oligossacãridos.

A ausência de anticorpos precipitantes num antissoro é indicativa de monoespecificidade, i.e., o reconhecimento por anticorpo de um único epítopo no repertório antigénico de uma dada molécula (Berzofsky-Schechter, 1981, Molecular Immunol. 18.:751-763). A precipitação dos complexos de antigénio-anticorpo requer a formação de reticulado para gerar uma rede ramificada tridimensional de moléculas de antigénio e anticorpo ligadas. Para isto ocorrer, é necessária a multivalência quer do antigénio quer do anticorpo, visto que mais do que um anticorpo deve ser capaz de se ligar simultaneamente a uma única molécula de antigénio. Assim, a falta de imunoprecipitação observável que ocorre entre o antissoro de coelho para conjugados de CRM^_g7-oligossacárido de S. pneumoniae e o polissacárido capsular de elevado peso molecular purificado, homólogo, é fortemente indicativa de que os antissoros continham anticorpos específicos para o polímero de hidrato de carbono (como mostrado pelas análises de ELISA e ELISA de inibição) mas só dirigidos para um determinante (epítopo) do polissacárido.

Adicionalmente a exibir actividade imunoprecipitante, uma população de anticorpos está também geralmente associada â propriedade seguinte: um único epítopo do antigénio utilizado para induzir a resposta ao anticorpo não pode inibir completamente a ligação da população total de anticorpos ao antigénio

-61completo, mas só irá inibir aqueles anticorpos que se ligam àquele mesmo epítopo, deixando os outros anticorpos livres para se ligarem aos restantes epítopos presentes no antigénio completo. Uma população de anticorpos pode ser avaliada quanto à heterogeneidade por um ensaio de inibição de ELISA. Neste ensaio, a capacidade de uma população de anticorpos para se ligar ao antigénio completo pode ser medida na presença de inibidores da ligação antigénio/anticorpo, tais como epítopos isolados do antigénio. Graficamente representando, quando a ligação dos anticorpos ao antigénio completo marcado é medida na presença de concentrações crescentes de antigénio completo não marcado, é gerada uma curva sigmoidal, que pode ser utilizada como uma curva padrão para a ligação anticorpo/antigénio. Se a população de anticorpos for heterogénea, a ligação entre o anticorpo e o antigénio completo não pode ser completamente inibida pela adição de um único epítopo antigénico e a curva padrão da ligação anticorpo/antigénio só está parcialmente deslocada (parcialmente sobreposta ou parcialmente paralela) visto que predominam outras interacções antigénio/anticorpo, distintas daquelas associadas ao epítopo a ser testado. Reciprocamente, a ligação de uma população homogénea de anticorpos ao antigénio pode ser completamente inibida pela adição de um epítopo isolado; a curva sigmoidal padrão da ligação antigénio/anticorpo será sobreposta ou paralela à curva gerada pela adição do epítopo isolado correspondendo à especificidade da população.

Experimentalmente, analisando desta forma a IgG de coelho induzida por glicoconjugado de S. pneumoniae, foi observado um modelo de afinidade correspondente àquele previsto para uma população homogénea de anticorpos (Figura 4). 0 oligossacárido de S. pneumoniae 6A, (quer na forma não conjugada quer na forma conjugada), foi associado à curva sigmoidal de inibição da ligação aproximadamente paralela à de um derivado que utiliza o

polissacárido capsular de elevado peso molecular serotipo 6A. Como esperado, um oligossacárido heterólogo (tipo 14), quer na forma livre (activada por ligante) quer na forma conjugada, não inibiu a população de isotipos de IgG específica para o antigénio de tipo 6A.

Claims (5)

1. Reivindicações

   I^a. - Processo para a produção de um conjugado covalente de um oligossacãrido e de uma proteína veículo, caracterizado por compreender os seguintes passos:

   (i) reacção de um oligossacãrido tendo um grupo redutor terminal com diaminoetano na presença de piridina-borano de modo a que ocorra aminação redutora; e (ii) reacção do produto oligossacãrido aminado de (i) com uma molécula compreendendo dois grupos funcionais, um que é capaz de reagir com o grupo terminal do oligossacãrido activado e o outro que é capaz de reagir com a referida proteína veículo; e (iii) reacção do produto oligossacãrido activado de (ii) com a referida proteína veículo de modo a que ocorra conjugação.
2. 2^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a aminação redutora ser realizada a uma temperatura de cerca de 100°C.
3. 3^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a reacção com piridina-borano ser realizada a uma temperatura de cerca de 50°C.
4. 4®. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula compreendendo dois grupos funcionais do passo (ii) ser um diéster.
5. 5δ. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula compreendendo dois grupos funcionais do passo (ii) ser um diéster de ácido adípico ou um diéster de ácido succínico.

   68. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado por o oligossacárido ser derivado do polissacárido capsular de Streptococcus pneumoniae.

   78, - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o oligossacárido ser derivado de Streptococcus pneumoniae tendo um serotipo seleccionado, seleccionado de entre o grupo consistindo nos tipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F.

   88. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizado por o oligossacárido ser derivado do polissacárido capsular de uma bactéria seleccionada de entre o grupo consistindo em Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aerucrinosa, Salmonella typhi, Escherichia coli, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae e Staphilococcus aureus.

   98. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizado por a proteína veículo ser CRM_in„.

   108. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizado por a proteína veículo ser seleccionada de entre o grupo consistindo em flagelina de Salmonella, pilina de Haemophilus, proteína de membrana de 15 kDa, 28-30 kDa ou 40 kDa de Haemophilus, enterotoxina lábil ao calor de Escherichia coli LTB, toxina da difteria, toxina do tétano,

   -65toxina da cólera, proteína do rotavírus VP7 e proteína F ou G vírus sincicial respiratório.

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