JP2736248B2 - 莢膜ポリマーフラグメントの製造方法 - Google Patents
莢膜ポリマーフラグメントの製造方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】１．発明の分野
本発明は、例えば、ヘモフィルス・インフルエンザb 型
［Ｈaemophilus influenzae type b ］、エシェリキ
ア・コリ［Ｅscherichia coli］、ナイセリア・メニン
ギチジス 血清グループＡおよびＣ［Ｎeisseria meni
ngitides serogroups Ａ and Ｃ］、ストレプトコ
ッカス・ニューモニエ血清型３，６，１２，１４，１
９，２３および５１［Ｓtreptococcus preumoniae se
rotypes３，６，１２，１４，１９，２３and ５１］、
ならびにシュードモナス［Ｐseudomonas］などを含む細
菌により引き起こされる感染および疾患に対する、新規
なワクチン組成物、その製造プロセスおよび人類を含む
若い恒温動物の免疫化の方法に利用できる莢膜ポリマー
フラグメントの製造方法に関連するものである。
［Ｈaemophilus influenzae type b ］、エシェリキ
ア・コリ［Ｅscherichia coli］、ナイセリア・メニン
ギチジス 血清グループＡおよびＣ［Ｎeisseria meni
ngitides serogroups Ａ and Ｃ］、ストレプトコ
ッカス・ニューモニエ血清型３，６，１２，１４，１
９，２３および５１［Ｓtreptococcus preumoniae se
rotypes３，６，１２，１４，１９，２３and ５１］、
ならびにシュードモナス［Ｐseudomonas］などを含む細
菌により引き起こされる感染および疾患に対する、新規
なワクチン組成物、その製造プロセスおよび人類を含む
若い恒温動物の免疫化の方法に利用できる莢膜ポリマー
フラグメントの製造方法に関連するものである。
【０００２】
【従来の技術】２．発明の背景
精製された微生物莢膜ポリマー（ＣＰ）は成熟したヒト
および動物において一般的に免疫原性であり、そして相
応する全身性感染に対するワクチンとして用いられ得る
ことが公知である。この適用において用いられた場合、
「莢膜ポリマー」なる用語は、糖のポリマー、糖酸のポ
リマー、アミノ糖のポリマー、多価アルコールのポリマ
ーおよび糖リン酸塩のポリマーなどのような、糖含有ポ
リマーに関するものであり、アミノ酸含有ポリマーに関
するものではない。これらの「莢膜ポリマー」は、グリ
コシド結合以外の結合および上記に列挙したような糖以
外の成分を含むものではあるが、医学上において「莢膜
多糖」と呼称される。 異なる細菌の莢膜ポリマーはヒ
トの第１年における免疫原性において広範に変化する。
いくつかは、ストレプレコッカス・ニューモニエ血清型
３［Ｓtreptococcuspneumoniae serotype ３］および
ナイセリア・メニンギチジス血清グループＡ［Ｎeisser
ia meningitidis serogroup Ａ］などのように穏健
な活性である。被包性細菌［encapsulated bacteria］
による全身性感染に対する感性は、生命体の第１年にお
いてより大きなものである。幼児における多くの細菌莢
膜ポリマーに対する免疫原性応答は、年齢依存である、
すなわち莢膜ポリマー（ＣＰ）に対する免疫適格性は、
約第６年齢までに成人のレベルへ増加する。 不活性な
ＣＰは、ヘモフィルス・インフルエンザb 型、ストレプ
トコッカス・ニューモニエ血清型６および１２、ならび
にナイセリア・メンニギチジス血清グループＣのもので
ある。幼児において中間の応答を与えるＣＰの例として
は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１９およ
び５１がある。
および動物において一般的に免疫原性であり、そして相
応する全身性感染に対するワクチンとして用いられ得る
ことが公知である。この適用において用いられた場合、
「莢膜ポリマー」なる用語は、糖のポリマー、糖酸のポ
リマー、アミノ糖のポリマー、多価アルコールのポリマ
ーおよび糖リン酸塩のポリマーなどのような、糖含有ポ
リマーに関するものであり、アミノ酸含有ポリマーに関
するものではない。これらの「莢膜ポリマー」は、グリ
コシド結合以外の結合および上記に列挙したような糖以
外の成分を含むものではあるが、医学上において「莢膜
多糖」と呼称される。 異なる細菌の莢膜ポリマーはヒ
トの第１年における免疫原性において広範に変化する。
いくつかは、ストレプレコッカス・ニューモニエ血清型
３［Ｓtreptococcuspneumoniae serotype ３］および
ナイセリア・メニンギチジス血清グループＡ［Ｎeisser
ia meningitidis serogroup Ａ］などのように穏健
な活性である。被包性細菌［encapsulated bacteria］
による全身性感染に対する感性は、生命体の第１年にお
いてより大きなものである。幼児における多くの細菌莢
膜ポリマーに対する免疫原性応答は、年齢依存である、
すなわち莢膜ポリマー（ＣＰ）に対する免疫適格性は、
約第６年齢までに成人のレベルへ増加する。 不活性な
ＣＰは、ヘモフィルス・インフルエンザb 型、ストレプ
トコッカス・ニューモニエ血清型６および１２、ならび
にナイセリア・メンニギチジス血清グループＣのもので
ある。幼児において中間の応答を与えるＣＰの例として
は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１９およ
び５１がある。
【０００３】2.1 ワクチンにおける抗原としての完全な莢膜ポリマー
数々の研究者がワクチンにおいてないしはワクチンとし
て有用である完全な莢膜ポリマーを単離し精製してい
る。例えば米国特許第 4,220,717号は、ヘモフィルス・
インフルエンザb の莢膜ポリマーからの免疫学的に活性
なポリリボシルリビトール ホスフェート（ＰＲＰ）の
単離および精製に関するプロセスを述べている。さら
に、米国特許第 4,210,641号は、 200,000ドルトンより
大きな見かけ分子量を有し、そして主としてガラクトー
ス、グリコースおよびマンノースからなり、また少量の
オサミンを含有するヘモフィルス・インフルエンザの多
糖抽出物に関連するものである。
て有用である完全な莢膜ポリマーを単離し精製してい
る。例えば米国特許第 4,220,717号は、ヘモフィルス・
インフルエンザb の莢膜ポリマーからの免疫学的に活性
なポリリボシルリビトール ホスフェート（ＰＲＰ）の
単離および精製に関するプロセスを述べている。さら
に、米国特許第 4,210,641号は、 200,000ドルトンより
大きな見かけ分子量を有し、そして主としてガラクトー
ス、グリコースおよびマンノースからなり、また少量の
オサミンを含有するヘモフィルス・インフルエンザの多
糖抽出物に関連するものである。
【０００４】幾人かの研究者が、よりよい免疫学的応答
を達成するために、これらのおよびその他の完全な莢膜
ポリマーを処方箋において利用している。例えば米国特
許第4,196,192号は、精製された完全ＰＲＰおよび完全
ボルデテラ・パータッシス［Ｂordetella partussis
］細菌を含むワクチンを開示している。免疫原性を増
加させるためのこのアプローチは、若い哺乳動物におい
て、抗ＰＲＰ抗体および抗パータッシス抗体の高められ
たレベルをまねくものであった。
を達成するために、これらのおよびその他の完全な莢膜
ポリマーを処方箋において利用している。例えば米国特
許第4,196,192号は、精製された完全ＰＲＰおよび完全
ボルデテラ・パータッシス［Ｂordetella partussis
］細菌を含むワクチンを開示している。免疫原性を増
加させるためのこのアプローチは、若い哺乳動物におい
て、抗ＰＲＰ抗体および抗パータッシス抗体の高められ
たレベルをまねくものであった。
【０００５】2.2 複合体を含有するワクチン
他の研究者たちは、いわゆる「担体効果［carrier ef
fect］により抗体形成を高める努力において、莢膜ポリ
マーの担体タンパク質への複合［conjugation］を研究
している。例えばシュネールソンら、ジャーナル オブ
エクスペリメンタル メディシン １５２：３６１〜
３７６（１９８０年）［Ｓchneersonet al．， Ｊour
nal of Ｅxperimental Ｍedicine １５２：３６
１−３７６（１９８０）］は、ヘモフィルス・インフル
エンザb ポリマー‐タンパク質複合体［conjugate ］
が、ヘモフィルス・インフルエンザb によって引き起こ
された侵入性疾患に対する免疫性を与えることを明らか
にしたことを述べている。この引用文は、幼児における
莢膜ポリマーの年齢に関連する免疫学的挙動を事実とし
て提供し、また血清アルブミン、カブトガニ ヘモシア
ニン［Ｌimulus polyphemus hemocyanin］およびジフ
テリア毒素を含む種々のタンパク質との完全莢膜ポリマ
ーの複合によりこの年齢依存性を克服しようと努めるも
のである。複合の方法は、アジピン酸ジヒドラジドなど
のような結合剤の使用を包含するものである。
fect］により抗体形成を高める努力において、莢膜ポリ
マーの担体タンパク質への複合［conjugation］を研究
している。例えばシュネールソンら、ジャーナル オブ
エクスペリメンタル メディシン １５２：３６１〜
３７６（１９８０年）［Ｓchneersonet al．， Ｊour
nal of Ｅxperimental Ｍedicine １５２：３６
１−３７６（１９８０）］は、ヘモフィルス・インフル
エンザb ポリマー‐タンパク質複合体［conjugate ］
が、ヘモフィルス・インフルエンザb によって引き起こ
された侵入性疾患に対する免疫性を与えることを明らか
にしたことを述べている。この引用文は、幼児における
莢膜ポリマーの年齢に関連する免疫学的挙動を事実とし
て提供し、また血清アルブミン、カブトガニ ヘモシア
ニン［Ｌimulus polyphemus hemocyanin］およびジフ
テリア毒素を含む種々のタンパク質との完全莢膜ポリマ
ーの複合によりこの年齢依存性を克服しようと努めるも
のである。複合の方法は、アジピン酸ジヒドラジドなど
のような結合剤の使用を包含するものである。
【０００６】ゲーヤーら、メド．ミクロバイオル．イム
ノル．１６５：１７１〜２８８（１９７９年）［Ｇeyer
et al．，Ｍed． Ｍicrobiol． Ｉmmunol．１６
５：１７１〜２８８（１９７９）］は、還元アミノ化に
よってあるクレブシエラ・ニューモニエ［Ｋlebsiella
pneumoniae］莢膜多種フラグメントのニトロ フェニ
ル エチルアミン リンカーへの複合体を調製し、そし
て次に、アゾカップリングを用いてこの誘導体化された
糖はタンパク質に付着された。
ノル．１６５：１７１〜２８８（１９７９年）［Ｇeyer
et al．，Ｍed． Ｍicrobiol． Ｉmmunol．１６
５：１７１〜２８８（１９７９）］は、還元アミノ化に
よってあるクレブシエラ・ニューモニエ［Ｋlebsiella
pneumoniae］莢膜多種フラグメントのニトロ フェニ
ル エチルアミン リンカーへの複合体を調製し、そし
て次に、アゾカップリングを用いてこの誘導体化された
糖はタンパク質に付着された。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するた
めの手段】３．発明の概要 本発明は、細菌莢膜ポリマー由来の莢膜ポリマーフラグ
メントの製造方法に関連し、この莢膜ポリマーフラグメ
ントは、細菌の毒素またはトキソイドと、還元アミノ化
により、共有結合させることができる。本出願において
用いられる場合、「トキソイド」なる用語は、毒素の抗
原性を毒素の毒性なしに有している毒素の形態を意味す
るものである。
めの手段】３．発明の概要 本発明は、細菌莢膜ポリマー由来の莢膜ポリマーフラグ
メントの製造方法に関連し、この莢膜ポリマーフラグメ
ントは、細菌の毒素またはトキソイドと、還元アミノ化
により、共有結合させることができる。本出願において
用いられる場合、「トキソイド」なる用語は、毒素の抗
原性を毒素の毒性なしに有している毒素の形態を意味す
るものである。
【０００８】本発明の免疫原性複合体は、莢膜ポリマー
のフラグメントにおける還元末端基を最初に形成し、そ
してこれらを細菌の毒素またはトキソイドのアミン基と
還元アミノ化によって反応させることによって調製され
る。還元末端基は、選択加水分解（例えば酸または酸素
による）含む任意の適当な方法によって、あるいは酸化
的開裂（例えば過ヨウ素酸塩または同類の酸素酸によ
る）によって形成され得る。この複合体は、シアノボロ
ハイドライド アニオンを含有する水溶液中における還
元アミノ化によって好ましく達せられる。
のフラグメントにおける還元末端基を最初に形成し、そ
してこれらを細菌の毒素またはトキソイドのアミン基と
還元アミノ化によって反応させることによって調製され
る。還元末端基は、選択加水分解（例えば酸または酸素
による）含む任意の適当な方法によって、あるいは酸化
的開裂（例えば過ヨウ素酸塩または同類の酸素酸によ
る）によって形成され得る。この複合体は、シアノボロ
ハイドライド アニオンを含有する水溶液中における還
元アミノ化によって好ましく達せられる。
【０００９】本発明の免疫原性複合体は、ヒトを含む若
い哺乳動物において有効なレベルの抗莢膜抗体形成を引
き出すワクチンを製造するために、薬理学的に許容でき
る担体とともに処方され得る。このワクチンは、免疫応
答可能な量の該複合体を哺乳動物に投与することによっ
て、それぞれの莢膜性細菌によって引き起こされた若い
哺乳動物における全身性感染に対する能動免疫化を誘導
することに利用され得る。
い哺乳動物において有効なレベルの抗莢膜抗体形成を引
き出すワクチンを製造するために、薬理学的に許容でき
る担体とともに処方され得る。このワクチンは、免疫応
答可能な量の該複合体を哺乳動物に投与することによっ
て、それぞれの莢膜性細菌によって引き起こされた若い
哺乳動物における全身性感染に対する能動免疫化を誘導
することに利用され得る。
【００１０】この免疫原性複合体は、莢膜ポリマーのみ
よりも低い年齢依存性であることが見い出されており、
またそれぞれの莢膜性細菌による全身性感染に対する非
常に若い恒温哺乳動物の能動免疫化に役立つ。さらにま
た、本発明の免疫原性複合体は、炭水化物をタンパク質
に複合するのに用いられてきたアジピン酸ジヒドラジド
あるいは P‐ニトロフェニルエチルアミンのような潜在
的に毒性の結合剤を含まないものである。
よりも低い年齢依存性であることが見い出されており、
またそれぞれの莢膜性細菌による全身性感染に対する非
常に若い恒温哺乳動物の能動免疫化に役立つ。さらにま
た、本発明の免疫原性複合体は、炭水化物をタンパク質
に複合するのに用いられてきたアジピン酸ジヒドラジド
あるいは P‐ニトロフェニルエチルアミンのような潜在
的に毒性の結合剤を含まないものである。
【００１１】最後に、本発明の免疫原性複合体は、莢膜
ポリマーのフラグメントを含むものであって、完全な莢
膜ポリマーを含むものではない。莢膜ポリマーの高度な
反復構造は、ある程度、幼児における抗体産生能を拡大
できないことの原因となりうる。完全な（高度に重合さ
れた）ＣＰとタンパク質の複合体は、ＣＰのみの場合の
免疫学的欠点をほんの部分的に克服するにすぎないであ
ろう。
ポリマーのフラグメントを含むものであって、完全な莢
膜ポリマーを含むものではない。莢膜ポリマーの高度な
反復構造は、ある程度、幼児における抗体産生能を拡大
できないことの原因となりうる。完全な（高度に重合さ
れた）ＣＰとタンパク質の複合体は、ＣＰのみの場合の
免疫学的欠点をほんの部分的に克服するにすぎないであ
ろう。
【００１２】一方、担体上の莢膜ポリマーフラグメント
の使用は、反復構造の欠点を避けるものである。さらに
ＣＰフラグメントを有する複合体のＣＰ決定基は、完全
ＣＰを有する複合体のＣＰ決定基よりも平均して担体に
より近接しており、そして担体へのこの近接は、より効
果的な「担体効果」に必要とされうる。タンパク質担体
に関して、さらに利点は、子供が、定型的に予防接種さ
れる、例えば破傷風あるいはジフテリアなどのような、
細菌の毒素またはトキソイドの使用にある。毒素または
トキソイドに対する望まれた免疫は、莢膜ポリマーに関
連した病原体に対する免疫といっしょに導き出される。
の使用は、反復構造の欠点を避けるものである。さらに
ＣＰフラグメントを有する複合体のＣＰ決定基は、完全
ＣＰを有する複合体のＣＰ決定基よりも平均して担体に
より近接しており、そして担体へのこの近接は、より効
果的な「担体効果」に必要とされうる。タンパク質担体
に関して、さらに利点は、子供が、定型的に予防接種さ
れる、例えば破傷風あるいはジフテリアなどのような、
細菌の毒素またはトキソイドの使用にある。毒素または
トキソイドに対する望まれた免疫は、莢膜ポリマーに関
連した病原体に対する免疫といっしょに導き出される。
【００１３】記載された結果を説明するためのいかなる
理論に対する本願明細書を通じての言及も本発明の範囲
を限定するものではないことを理解すべきである。本発
明が作用するための方法に依存することなく、ここに記
載された結果および利点は、下記の詳細な説明を参考に
して達成されうる。４．発明の詳細な説明 本発明の複合体は、莢膜ポリマーフラグメントの還元末
端基を細菌毒素またはトキソイドの第１アミノ基に反応
させて、担体タンパク質に共有結合した莢膜ポリマーの
抗原決定基を得ることによって形成される。該還元基は
選択加水分解または特定の酸化的開裂または両者の組合
せによって形成され得る。
理論に対する本願明細書を通じての言及も本発明の範囲
を限定するものではないことを理解すべきである。本発
明が作用するための方法に依存することなく、ここに記
載された結果および利点は、下記の詳細な説明を参考に
して達成されうる。４．発明の詳細な説明 本発明の複合体は、莢膜ポリマーフラグメントの還元末
端基を細菌毒素またはトキソイドの第１アミノ基に反応
させて、担体タンパク質に共有結合した莢膜ポリマーの
抗原決定基を得ることによって形成される。該還元基は
選択加水分解または特定の酸化的開裂または両者の組合
せによって形成され得る。
【００１４】少なくとも１つの還元末端を有する抗原性
フラグメントは、特定の莢膜ポリマーの構造的特徴に依
存して、種々の方法によって莢膜ポリマーから生成され
ることができる。過ヨウ素酸塩（あるいはパラ過ヨウ素
酸、メタ過ヨウ素酸ナトリウムおよびメタ過ヨウ素酸カ
リウムのような同類試薬）による限定された酸化的開裂
は、アルデヒド末端を残す。このようなアプローチは、
近接のジヒドロキシ基を有するポリマーに限られるであ
ろう。グリコシド結合の加水分解は、還元糖末端を生成
する。このような加水分解は、グリコシダーゼによって
最も特異的に酸素的に行なわれ得るが、この適用は、そ
れに対するグリコシダーゼが知られている、例えばスト
レプトコッカス・ニューモニエ８［Ｓtreptococcus pn
eumoniae８］などのような比較的数の少ない莢膜ポリマ
ーに限定されるであろう。酸による加水分解は、グリコ
シド結合の加水分解に一般的に用いられる。このアプロ
ーチの有用性は、ポリマーが酸感受性非グリコシド結合
を有する場合あるいはポリマーが抗原特異性に重要な酸
感受性分岐結合［branch linkage ］を含有する場合に
は限定される。多糖類がホスフェート、スルフェートま
たはエステル結合のようなグリコシド性炭素に対する塩
基不安定結合を有している場合には、塩基加水分解も使
用できる。この方法の有用性は、該ポリマーが他の塩基
感受性非グリコシド性結合を有している場合には制限さ
れる。
フラグメントは、特定の莢膜ポリマーの構造的特徴に依
存して、種々の方法によって莢膜ポリマーから生成され
ることができる。過ヨウ素酸塩（あるいはパラ過ヨウ素
酸、メタ過ヨウ素酸ナトリウムおよびメタ過ヨウ素酸カ
リウムのような同類試薬）による限定された酸化的開裂
は、アルデヒド末端を残す。このようなアプローチは、
近接のジヒドロキシ基を有するポリマーに限られるであ
ろう。グリコシド結合の加水分解は、還元糖末端を生成
する。このような加水分解は、グリコシダーゼによって
最も特異的に酸素的に行なわれ得るが、この適用は、そ
れに対するグリコシダーゼが知られている、例えばスト
レプトコッカス・ニューモニエ８［Ｓtreptococcus pn
eumoniae８］などのような比較的数の少ない莢膜ポリマ
ーに限定されるであろう。酸による加水分解は、グリコ
シド結合の加水分解に一般的に用いられる。このアプロ
ーチの有用性は、ポリマーが酸感受性非グリコシド結合
を有する場合あるいはポリマーが抗原特異性に重要な酸
感受性分岐結合［branch linkage ］を含有する場合に
は限定される。多糖類がホスフェート、スルフェートま
たはエステル結合のようなグリコシド性炭素に対する塩
基不安定結合を有している場合には、塩基加水分解も使
用できる。この方法の有用性は、該ポリマーが他の塩基
感受性非グリコシド性結合を有している場合には制限さ
れる。
【００１５】ある種の莢膜ポリマーは、過ヨウ素塩（ま
たは同類の酸素酸類）により開裂を受けやすい近接のジ
ヒドロキシ基を欠いていることがある。しかしながら、
このような莢膜ポリマーの酸、塩基または酵素による先
行する加水分解は、通常酸化開裂を受けやすいであろう
近接のジヒドロキシ基を遊離することがある。例えば、
酸加水分解によるピルビン酸、酢酸塩、ギ酸塩等の除去
あるいは酵素開裂によるシアリン酸の除去は、酸化性開
裂工程の前に行なうことができる。もちろん、これは変
性された基が抗原性特異性に対して重要でないこれらの
莢膜ポリマーへの適用に限られる。
たは同類の酸素酸類）により開裂を受けやすい近接のジ
ヒドロキシ基を欠いていることがある。しかしながら、
このような莢膜ポリマーの酸、塩基または酵素による先
行する加水分解は、通常酸化開裂を受けやすいであろう
近接のジヒドロキシ基を遊離することがある。例えば、
酸加水分解によるピルビン酸、酢酸塩、ギ酸塩等の除去
あるいは酵素開裂によるシアリン酸の除去は、酸化性開
裂工程の前に行なうことができる。もちろん、これは変
性された基が抗原性特異性に対して重要でないこれらの
莢膜ポリマーへの適用に限られる。
【００１６】この莢膜ポリマーが加水分解されてただ１
個の官能性アルデヒド基を有する莢膜ポリマーフラグメ
ントを形成する場合には、（少なくとも２個のフリーな
アミン基を有する）多官能タンパク質への複合体化は、
タンパク質の単分子が共有的に結合している１個または
それ以上の莢膜ポリマーフラグメントを有する複合体を
生ずることになる。タンパク質に結合する莢膜ポリマー
フラグメントの数は、タンパク質に対する莢膜ポリマー
フラグメントの相対的濃度および反応体の全濃度を含む
複合化反応の条件の変化により通常規制できることが容
易に判る。もちろん、反応性または反応速度に影響する
あらゆる反応パラメーター、例えば時間、温度、ｐＨ等
の規制により、複合体の最終組成および構造が変わる。
個の官能性アルデヒド基を有する莢膜ポリマーフラグメ
ントを形成する場合には、（少なくとも２個のフリーな
アミン基を有する）多官能タンパク質への複合体化は、
タンパク質の単分子が共有的に結合している１個または
それ以上の莢膜ポリマーフラグメントを有する複合体を
生ずることになる。タンパク質に結合する莢膜ポリマー
フラグメントの数は、タンパク質に対する莢膜ポリマー
フラグメントの相対的濃度および反応体の全濃度を含む
複合化反応の条件の変化により通常規制できることが容
易に判る。もちろん、反応性または反応速度に影響する
あらゆる反応パラメーター、例えば時間、温度、ｐＨ等
の規制により、複合体の最終組成および構造が変わる。
【００１７】莢膜ポリマーフラグメントがフグメント
（例えば非環状残基の近接ジヒドロキシ基の酸化開裂の
結果として）の各端に位置する少なくとも１個の官能性
アルデヒド基を有する場合には、多官能性タンパク質に
対する複合は、種々のタイプの複合体を生じる。例え
ば、このような反応体の複合は、特にタンパク質に多数
の遊離のアミン類があり、かつ莢膜フラグメントがタン
パク質に対して低いモル過剰である場合に格子または網
状構造を形成する能力を有している。架橋度および網状
または格子の全体サイズは、複合反応の条件の通常の変
更により規制できる。莢膜ポリマーフラグメントは、ヘ
モフィルス・インフルエンザb 型、エシェリキア・コ
リ、ナイセリア・メニンギチジス血清型ＡおよびＣを含
むナイセリア・メニンギチジス、ストレプトコッカス・
ニゥモニエ血清型３、６、１２、１４、１９、２３およ
び５１を含むストレプトコッカス・ニゥモニエ、ならび
にシュードモナスのような細菌性病原体の莢膜ポリマー
から誘導できる。
（例えば非環状残基の近接ジヒドロキシ基の酸化開裂の
結果として）の各端に位置する少なくとも１個の官能性
アルデヒド基を有する場合には、多官能性タンパク質に
対する複合は、種々のタイプの複合体を生じる。例え
ば、このような反応体の複合は、特にタンパク質に多数
の遊離のアミン類があり、かつ莢膜フラグメントがタン
パク質に対して低いモル過剰である場合に格子または網
状構造を形成する能力を有している。架橋度および網状
または格子の全体サイズは、複合反応の条件の通常の変
更により規制できる。莢膜ポリマーフラグメントは、ヘ
モフィルス・インフルエンザb 型、エシェリキア・コ
リ、ナイセリア・メニンギチジス血清型ＡおよびＣを含
むナイセリア・メニンギチジス、ストレプトコッカス・
ニゥモニエ血清型３、６、１２、１４、１９、２３およ
び５１を含むストレプトコッカス・ニゥモニエ、ならび
にシュードモナスのような細菌性病原体の莢膜ポリマー
から誘導できる。
【００１８】複合は、シュワルツとグレイ、アーク．バ
イオケム． バイオフィズ． １８１：５４２〜５４９
（１９７７年）［Ｓchwartz and Ｇray 、Ａrch ．
Ｂiochem．Ｂiophys．１８１：５４２−５４９（１９７
７）］の還元アミノ化プロセスによって行なわれる。簡
単に述べると、このプロセスは、還元莢膜ポリマーフラ
グメントと細菌毒素またはトキソイドを、シアノボロハ
イドライドイオン、あるいは、目的の還元末端を還元す
ることもまた毒素またはトキソイドや莢膜ポリマーに悪
影響を及ぼすこともないその他の還元剤の存在下で反応
させることを含むものである。
イオケム． バイオフィズ． １８１：５４２〜５４９
（１９７７年）［Ｓchwartz and Ｇray 、Ａrch ．
Ｂiochem．Ｂiophys．１８１：５４２−５４９（１９７
７）］の還元アミノ化プロセスによって行なわれる。簡
単に述べると、このプロセスは、還元莢膜ポリマーフラ
グメントと細菌毒素またはトキソイドを、シアノボロハ
イドライドイオン、あるいは、目的の還元末端を還元す
ることもまた毒素またはトキソイドや莢膜ポリマーに悪
影響を及ぼすこともないその他の還元剤の存在下で反応
させることを含むものである。
【００１９】シアノボロハイドレートイオン（あるいは
その同等物）は、第１に莢膜ポリマーフラグメントのカ
ルボニル基とタンパク質のアミノ基との間で形成される
シッフ塩基［Ｓchiff base］中間体の緩和な選択的還
元剤として作用する。このようなイオンの第２の影響
は、複合が生じた後に莢膜ポリマーフラグメントに残る
いかなる活性アルデヒド基のより緩慢な還元である。必
要により複合後に、シアノボロハイドレートイオン（ま
たはその同等物）を遊離の未反応アルデヒド基を還元す
るために添加することもできる。残っているカルボニル
基の適切な還元を確実にするために、複合後に、より強
い還元剤であるボロハイドライドイオンを添付すること
が望ましい場合が多い。
その同等物）は、第１に莢膜ポリマーフラグメントのカ
ルボニル基とタンパク質のアミノ基との間で形成される
シッフ塩基［Ｓchiff base］中間体の緩和な選択的還
元剤として作用する。このようなイオンの第２の影響
は、複合が生じた後に莢膜ポリマーフラグメントに残る
いかなる活性アルデヒド基のより緩慢な還元である。必
要により複合後に、シアノボロハイドレートイオン（ま
たはその同等物）を遊離の未反応アルデヒド基を還元す
るために添加することもできる。残っているカルボニル
基の適切な還元を確実にするために、複合後に、より強
い還元剤であるボロハイドライドイオンを添付すること
が望ましい場合が多い。
【００２０】これゆえに、活性な分子が最終製品の一部
を形成する結合剤によって結合される従来用いられてい
た複合法とは異なり、ここで利用された還元アニオン
は、最終製品中に取込まれない。これは最終製品の潜在
的毒性（すなわち、望ましくない免疫原性）を制御する
見地から重要なことである。共有結合の証拠は、例え
ば、ＰＲＰ部分と担体タンパク質との間の会合が、非共
有結合を崩壊する極めて高い能力を有する８Ｍ尿素の存
在下において、タンパク質の塩析にかかわらず持続する
という事実によって示される。
を形成する結合剤によって結合される従来用いられてい
た複合法とは異なり、ここで利用された還元アニオン
は、最終製品中に取込まれない。これは最終製品の潜在
的毒性（すなわち、望ましくない免疫原性）を制御する
見地から重要なことである。共有結合の証拠は、例え
ば、ＰＲＰ部分と担体タンパク質との間の会合が、非共
有結合を崩壊する極めて高い能力を有する８Ｍ尿素の存
在下において、タンパク質の塩析にかかわらず持続する
という事実によって示される。
【００２１】好ましい担体タンパク質は、若い哺乳動物
への投与に安全でありかつ担体として免疫学的に有効な
ものである。安全性は、一次毒性の欠如およびアレルギ
ー性合併症の最小化された危険性を含むものである。ジ
フテリアおよび破傷風トキソイドはこれらの基準を満た
すものである、すなわち適当に調製されると、これらは
非毒性であり、そして、アレルギー性反応の発生率は十
分に実証されている。アレルギー性反応の危険性が成人
に関してかなり重要なものであるにもかかわらず、幼児
に関しては最小化されている。
への投与に安全でありかつ担体として免疫学的に有効な
ものである。安全性は、一次毒性の欠如およびアレルギ
ー性合併症の最小化された危険性を含むものである。ジ
フテリアおよび破傷風トキソイドはこれらの基準を満た
すものである、すなわち適当に調製されると、これらは
非毒性であり、そして、アレルギー性反応の発生率は十
分に実証されている。アレルギー性反応の危険性が成人
に関してかなり重要なものであるにもかかわらず、幼児
に関しては最小化されている。
【００２２】「担体効果」において、弱い抗原は、担体
としてのより強い抗原（すなわち、異種タンパク質）に
結合させることによって、それのみで存在するよりも免
疫原性が高くなる。動物が予め該担体のみで免疫されて
いる場合、担体抗原のみならず結合したより弱い抗原に
対する高められた応答に関して「準備された［prime
d］」ものとなる。幼児は破傷風およびジフテリア ト
キソイドで慣例的に免疫処置される。これゆえに、彼ら
は、これらのトキソイドのいずれかに複合された莢膜ポ
リマー抗原のその後の提示に関して準備されたものであ
ろう。
としてのより強い抗原（すなわち、異種タンパク質）に
結合させることによって、それのみで存在するよりも免
疫原性が高くなる。動物が予め該担体のみで免疫されて
いる場合、担体抗原のみならず結合したより弱い抗原に
対する高められた応答に関して「準備された［prime
d］」ものとなる。幼児は破傷風およびジフテリア ト
キソイドで慣例的に免疫処置される。これゆえに、彼ら
は、これらのトキソイドのいずれかに複合された莢膜ポ
リマー抗原のその後の提示に関して準備されたものであ
ろう。
【００２３】通常、任意の異種タンパク質が担体抗原と
して働き得る。しかしながら、破傷風およびシフテリア
などのようなある種の細菌毒素は、これらが２つの部分
から構成され、その一方（「結合［binding ］」サブユ
ニット）が、哺乳動物細胞表面へ結合するための強い親
和力を有しているということにおいて、さらなる利点を
有する。考えられるところでは、このような「結合」タ
ンパク質への複合は、免疫系の細胞において、運搬され
る抗原により効果的な一次応答をなさせるものであろ
う。
して働き得る。しかしながら、破傷風およびシフテリア
などのようなある種の細菌毒素は、これらが２つの部分
から構成され、その一方（「結合［binding ］」サブユ
ニット）が、哺乳動物細胞表面へ結合するための強い親
和力を有しているということにおいて、さらなる利点を
有する。考えられるところでは、このような「結合」タ
ンパク質への複合は、免疫系の細胞において、運搬され
る抗原により効果的な一次応答をなさせるものであろ
う。
【００２４】莢膜ポリマーが複合される担体タンパク質
は、天然の毒素または脱毒化された毒素（トキソイド）
であり得る。また、比較的最近の変異技術によって、毒
素と抗原性的に類似しているが、非毒性である遺伝的に
変容されたタンパク質が産生されている。これらは「交
差反応物質」またはＣＲＭと呼ばれている。ＣＲＭ19 7
は、これが天然のジフテリア毒素からの単一のアミノ酸
変化を有するものであり、そしてそれと免疫学的に区別
のつかないものであることから、注目すべきものであ
る。
は、天然の毒素または脱毒化された毒素（トキソイド）
であり得る。また、比較的最近の変異技術によって、毒
素と抗原性的に類似しているが、非毒性である遺伝的に
変容されたタンパク質が産生されている。これらは「交
差反応物質」またはＣＲＭと呼ばれている。ＣＲＭ19 7
は、これが天然のジフテリア毒素からの単一のアミノ酸
変化を有するものであり、そしてそれと免疫学的に区別
のつかないものであることから、注目すべきものであ
る。
【００２５】ＣＲＭ197 タンパク質を産生するコリネバ
クテリウムジフテリア株Ｃ７（Corynebacterium diph
theria strain C7) (β197)は、メリーランド州ロック
ヴィル所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（American Type Culture Collection) に寄託さ
れており、寄託番号ＡＴＣＣ５３２８１が付されてい
る。
クテリウムジフテリア株Ｃ７（Corynebacterium diph
theria strain C7) (β197)は、メリーランド州ロック
ヴィル所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（American Type Culture Collection) に寄託さ
れており、寄託番号ＡＴＣＣ５３２８１が付されてい
る。
【００２６】莢膜ポリマーの天然の毒素への複合は毒性
を低減するであろうが、かなりの毒性が残存している可
能性がある。これゆえにさらに脱毒性化が必要とされ
る。タンパク質毒素の常法の脱毒性化は、タンパク質の
遊離アミノ基と反応するホルマリンを用いるものであ
る。残留毒性が、さらに考慮される。さらにまた自発的
な再毒性化が、ワクチンの任意の個々のロットであり得
るものであり、そしてこのアプローチでの懸念の論争を
残すものである。
を低減するであろうが、かなりの毒性が残存している可
能性がある。これゆえにさらに脱毒性化が必要とされ
る。タンパク質毒素の常法の脱毒性化は、タンパク質の
遊離アミノ基と反応するホルマリンを用いるものであ
る。残留毒性が、さらに考慮される。さらにまた自発的
な再毒性化が、ワクチンの任意の個々のロットであり得
るものであり、そしてこのアプローチでの懸念の論争を
残すものである。
【００２７】あるいはまた、天然の毒素は、莢膜ポリマ
ーへの複合の前に、慣用のトキソイドを生成するために
ホルマリンで脱毒性化され得る。しかしながら、予めの
ホルマリン処理は、莢膜ポリマーフラグメントの還元基
との反応に有効な遊離アミノ基の数を低減する。これゆ
えに、ＣＲＭ類は、それらのアミノ基のいずれもホルマ
リンによって占拠されていない一方、生来の毒性を有し
ていないということにおいて、重要な利点を有する。さ
らなる利点はＣＲＭ類による作用において何ら生物災害
が存在しないことである。
ーへの複合の前に、慣用のトキソイドを生成するために
ホルマリンで脱毒性化され得る。しかしながら、予めの
ホルマリン処理は、莢膜ポリマーフラグメントの還元基
との反応に有効な遊離アミノ基の数を低減する。これゆ
えに、ＣＲＭ類は、それらのアミノ基のいずれもホルマ
リンによって占拠されていない一方、生来の毒性を有し
ていないということにおいて、重要な利点を有する。さ
らなる利点はＣＲＭ類による作用において何ら生物災害
が存在しないことである。
【００２８】免疫学的に天然の毒素と同一であるＣＲＭ
197 の場合、ホルマリンでの処理（しかしながら、脱毒
性化する必要はない。）は免疫学的応答を極めて高める
ものである。これは、からだの機構による分解に対する
分子の安定化および／または架橋による凝集に起因する
ものであると考えられる（粒子の免疫原性は、サイズと
共に増加する）。
197 の場合、ホルマリンでの処理（しかしながら、脱毒
性化する必要はない。）は免疫学的応答を極めて高める
ものである。これは、からだの機構による分解に対する
分子の安定化および／または架橋による凝集に起因する
ものであると考えられる（粒子の免疫原性は、サイズと
共に増加する）。
【００２９】すべての上記の理由により、破傷風および
ジフテリア毒素が、担体タンパク質として最良の候補で
あるが、さらに、同様に適切なその他のものもある。こ
れらのその他のものは、ジフテリアおよび破傷風で見出
された安全性の遍歴を有していないであろうが、これら
を使用するためのその他の圧倒的な理由があるだろう。
例えば、これらが、担体としてさらにより一層効果的で
ある、あるいは製品経済性が著しいなどである。担体と
してのその他の候補は、シュードモナス、スタフィロコ
ッカス、ストレプトコッカス、百日咳菌およびエシェリ
キア・コリの毒素またはトキソイドを含むものである。
ジフテリア毒素が、担体タンパク質として最良の候補で
あるが、さらに、同様に適切なその他のものもある。こ
れらのその他のものは、ジフテリアおよび破傷風で見出
された安全性の遍歴を有していないであろうが、これら
を使用するためのその他の圧倒的な理由があるだろう。
例えば、これらが、担体としてさらにより一層効果的で
ある、あるいは製品経済性が著しいなどである。担体と
してのその他の候補は、シュードモナス、スタフィロコ
ッカス、ストレプトコッカス、百日咳菌およびエシェリ
キア・コリの毒素またはトキソイドを含むものである。
【００３０】ワクチンを処方するための適当な担体媒体
には、リン酸ナトリウム緩衝化食塩水（p Ｈ７．４）あ
るいはp Ｈ６でリン酸ナトリウム緩衝化食塩水中に懸濁
された０．１２５Ｍリン酸アルミニウム ゲルならびの
その他の慣用の媒体が含まれる。ワクチンの使用に適当
な他の医薬用担体も当業界で知られている。一般的に、
約５〜約１００μg 、好ましくは約１０〜５０μg を含
有する本発明のワクチンが、若い恒温哺乳動物において
莢膜ポリマーに対する有効なレベルの抗体を引き出すの
に適当である。もちろん、正確な投与量は、定型的な投
与量／応答実験によって決定されるであろう。連続的に
与えられた数回の少ない投与量が単回注射として与えら
れた複合体の同じ量よりも優れたものであることが予想
される。
には、リン酸ナトリウム緩衝化食塩水（p Ｈ７．４）あ
るいはp Ｈ６でリン酸ナトリウム緩衝化食塩水中に懸濁
された０．１２５Ｍリン酸アルミニウム ゲルならびの
その他の慣用の媒体が含まれる。ワクチンの使用に適当
な他の医薬用担体も当業界で知られている。一般的に、
約５〜約１００μg 、好ましくは約１０〜５０μg を含
有する本発明のワクチンが、若い恒温哺乳動物において
莢膜ポリマーに対する有効なレベルの抗体を引き出すの
に適当である。もちろん、正確な投与量は、定型的な投
与量／応答実験によって決定されるであろう。連続的に
与えられた数回の少ない投与量が単回注射として与えら
れた複合体の同じ量よりも優れたものであることが予想
される。
【００３１】本発明のワクチンは、任意の年齢の恒温哺
乳動物中へ注射によって投与され得、そして特に、ヘモ
フィルス・インフルエンザb 型、エシェリキア・コリ、
肺炎球菌、髄膜炎菌、ストレプトコッカスおよびシュー
ドモナス病原体によって引き起こされる若い哺乳動物に
おける全身性感染に対する能動免疫化を誘導するために
適用される。
乳動物中へ注射によって投与され得、そして特に、ヘモ
フィルス・インフルエンザb 型、エシェリキア・コリ、
肺炎球菌、髄膜炎菌、ストレプトコッカスおよびシュー
ドモナス病原体によって引き起こされる若い哺乳動物に
おける全身性感染に対する能動免疫化を誘導するために
適用される。
【００３２】
【００３３】
５．実施例：ＰＲＰ含有還元末端基の大きな、中ぐらい
のおよび小さなフラグメントの生成ならびにＣＲＭ197
への複合 ヘモフィルス・インフルエンザ b型の莢膜ポリマーは、
繰返し単位［‐ 3β‐D ‐リボシル（ 1‐ 1）リビトー
ル（ 5‐ホスフェート）‐］（ＰＲＰ）を有する線状ポ
リマーである。一般に、ＰＲＰの酸加水分解は、全リボ
ースの還元リボースに対する比が２５ないしそれ以下に
下降するまで行なわれる。得られたサイズ混合フラグメ
ントは、複合のために、望まれるサイズ範囲のフラグメ
ントを単離するために分子ふるいカラムクロマトグラフ
ィーによって分画される。フラグメントを得るための方
法は以下の通りである。 ａ．リボース２８．６mgを含有するナトリウムＰＲＰ
（核酸含量０．００６％）の試料が、蒸溜水で溶解され
て１２５ｍｌ容三角フラスコにおいて全容量９．２ｍｌ
とされ、そして氷中で冷却された。 ｂ．０．１Ｎ Ｈ2 ＳＯ4 １．０２ｍｌが加えられ
た。 ｃ．酸性化ＰＲＰの０．０１ｍｌの二重のサンプルが、
氷上に保持された試験管へ移された（０分）。 ｄ．フラスコは沸騰水浴中へ３分間移され、そして次に
氷水浴中で冷却された。 ｅ．ステップｃが繰返された（３分サンプル）。 ｆ．サンプルは、Ｄ‐リボースで標準化されたアルカリ
性ヘキサシアノ鉄(III)酸塩法によって還元力に関して
検定された。 ｇ．この結果（第１表参照）に基づいて、ステップｄが
繰返された。 ｆ．ステップｃが繰返された（６分サンプル）。 ｉ．ステップｆが繰返された。
のおよび小さなフラグメントの生成ならびにＣＲＭ197
への複合 ヘモフィルス・インフルエンザ b型の莢膜ポリマーは、
繰返し単位［‐ 3β‐D ‐リボシル（ 1‐ 1）リビトー
ル（ 5‐ホスフェート）‐］（ＰＲＰ）を有する線状ポ
リマーである。一般に、ＰＲＰの酸加水分解は、全リボ
ースの還元リボースに対する比が２５ないしそれ以下に
下降するまで行なわれる。得られたサイズ混合フラグメ
ントは、複合のために、望まれるサイズ範囲のフラグメ
ントを単離するために分子ふるいカラムクロマトグラフ
ィーによって分画される。フラグメントを得るための方
法は以下の通りである。 ａ．リボース２８．６mgを含有するナトリウムＰＲＰ
（核酸含量０．００６％）の試料が、蒸溜水で溶解され
て１２５ｍｌ容三角フラスコにおいて全容量９．２ｍｌ
とされ、そして氷中で冷却された。 ｂ．０．１Ｎ Ｈ2 ＳＯ4 １．０２ｍｌが加えられ
た。 ｃ．酸性化ＰＲＰの０．０１ｍｌの二重のサンプルが、
氷上に保持された試験管へ移された（０分）。 ｄ．フラスコは沸騰水浴中へ３分間移され、そして次に
氷水浴中で冷却された。 ｅ．ステップｃが繰返された（３分サンプル）。 ｆ．サンプルは、Ｄ‐リボースで標準化されたアルカリ
性ヘキサシアノ鉄(III)酸塩法によって還元力に関して
検定された。 ｇ．この結果（第１表参照）に基づいて、ステップｄが
繰返された。 ｆ．ステップｃが繰返された（６分サンプル）。 ｉ．ステップｆが繰返された。
【００３４】
第 １ 表
サンプル 還元リボースのナノモル（平均） 全リボース／還元リボース比
０分 ０．４２ ４９３
３分 ６．０８ ３４．０ ６分 ９．６６ ２１．４
結果（第１表参照）は、加水分解の単独モードが（ 1‐
1）グリコシド結合であったと仮定すると、６分後、数
平均鎖長は２１．４モノマー単位、すなわち（リビトー
ル‐ 5‐ホスフェート‐ 3‐リボース）であることを示
した。 ｊ．１Ｎ ＮａＯＨ ０．１０２ｍｌが加えられ、そし
てｐＨが指示紙によって評価された（約ｐＨ６）。 ｋ．中和された加水分解物が凍結乾燥された。 ｌ．バイオ‐ゲルＰ１０［Bio ‐Gel Ｐ１０］（バイオ
ラッドインコーポレーテッド［ Bio‐Rad Inc.］が０．
１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート中で平衡化さ
れ、そして直径１．５cmのクロマトグラフィーカラムに
注がれ、９８cmのゲル床高さを与えた。 ｍ．凍結乾燥化された物質（ステップｋ）は、水２．７
ｍｌで再水和され、そして１Ｍトリエチルアンモニウム
アセテート０．３ｍｌが加えられた。この溶液は該カラ
ムへと適用されそして溶出が３．５ｍｌ画分の採取を行
ないながら実行された。 ｎ．リボシル残余物の溶出は、Ｄ‐リボースを標準とし
て用いるオルシノール反応によるリボース含量に関する
それぞれの画分の０．００５ｍｌサンプルの検定によっ
て測定された。 ｏ．画分は、第２表に示されるようなＬ，ＭおよびＳの
３つのプール中へ合併され、そして該プールは全リボー
スおよび還元リボースに関して検定された。
1）グリコシド結合であったと仮定すると、６分後、数
平均鎖長は２１．４モノマー単位、すなわち（リビトー
ル‐ 5‐ホスフェート‐ 3‐リボース）であることを示
した。 ｊ．１Ｎ ＮａＯＨ ０．１０２ｍｌが加えられ、そし
てｐＨが指示紙によって評価された（約ｐＨ６）。 ｋ．中和された加水分解物が凍結乾燥された。 ｌ．バイオ‐ゲルＰ１０［Bio ‐Gel Ｐ１０］（バイオ
ラッドインコーポレーテッド［ Bio‐Rad Inc.］が０．
１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート中で平衡化さ
れ、そして直径１．５cmのクロマトグラフィーカラムに
注がれ、９８cmのゲル床高さを与えた。 ｍ．凍結乾燥化された物質（ステップｋ）は、水２．７
ｍｌで再水和され、そして１Ｍトリエチルアンモニウム
アセテート０．３ｍｌが加えられた。この溶液は該カラ
ムへと適用されそして溶出が３．５ｍｌ画分の採取を行
ないながら実行された。 ｎ．リボシル残余物の溶出は、Ｄ‐リボースを標準とし
て用いるオルシノール反応によるリボース含量に関する
それぞれの画分の０．００５ｍｌサンプルの検定によっ
て測定された。 ｏ．画分は、第２表に示されるようなＬ，ＭおよびＳの
３つのプール中へ合併され、そして該プールは全リボー
スおよび還元リボースに関して検定された。
【００３５】
【００３６】ｐ．該プールは凍結乾燥され、水１０ｍｌ
で再水和され、再凍結乾燥され、そして水１．５ｍｌで
再水和された。最後の溶液１．２ｍｌがマイクロ遠心分
離管へ移され、そして複合反応のための調製物に凍結乾
燥された。ＰＲＰの還元フラグメントへのＣＲＭ197 の複合 ａ． 凍結乾燥されたフラグメントＬ，ＭおよびＳを含
有するマイクロ遠心分離管ならびに空の遠心分離管（Ｃ
または対照）へ、リン酸カリウム緩衝液ｐＨ８、ＣＲＭ
197 ２．７mgおよびナトリウムシアノボロハイドライド
４mgが添加され、そして最終容量が０．２ｍｌおよびリ
ン酸緩衝液が０．２Ｍとなった。 ｂ． 該管は毎日混合しながら３７℃でインキュベート
された。 ｃ． １８時間後に、該管は７０００Ｇで２分間遠心分
離された。 ｄ． タンパク質の大部分が沈澱物中にあることが測定
された後に、沈澱物は、１ｍｌ以下の水で４回洗浄され
た。 ｅ． 洗浄された沈澱物は、尿素で８Ｍにされて、５０
℃にあためられ、食塩水に対して４℃で１晩透析され、
そして遠心分離された。上澄み液は分離されそして硫酸
アンモニウムで９５％飽和したものとされ、４℃で１晩
保たれ、そして遠心分離された。得られた沈澱物は、９
５％飽和硫酸アンモニウム０．４ｍｌで３回洗浄され、
そして水１ｍｌに懸濁された。これらのコロイド状懸濁
液は、それぞれＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐Ｌ、ＣＲＭ197 ‐
ＰＲＰ‐Ｍ、ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐ＳおよびＣＲＭ197
‐Ｃとラベルされた。 ｆ． 該調製物は、ウシアルブミンを標準として用いる
フォリンフェノール反応によってタンパク質に関して、
またＤ‐リボースを標準として用いるオルシノール反応
によってリボシル残基に関して検定された。結果を第４
表に示す。該調製物は、ＰＲＰ抗原活性に関して、ヒト
抗ＰＲＰ抗体への標識された天然のＰＲＰの結合を阻止
するそれらの能力（５０μｇタンパク質／ｍｌの濃度に
おいて）によって検定された（第３表）。
で再水和され、再凍結乾燥され、そして水１．５ｍｌで
再水和された。最後の溶液１．２ｍｌがマイクロ遠心分
離管へ移され、そして複合反応のための調製物に凍結乾
燥された。ＰＲＰの還元フラグメントへのＣＲＭ197 の複合 ａ． 凍結乾燥されたフラグメントＬ，ＭおよびＳを含
有するマイクロ遠心分離管ならびに空の遠心分離管（Ｃ
または対照）へ、リン酸カリウム緩衝液ｐＨ８、ＣＲＭ
197 ２．７mgおよびナトリウムシアノボロハイドライド
４mgが添加され、そして最終容量が０．２ｍｌおよびリ
ン酸緩衝液が０．２Ｍとなった。 ｂ． 該管は毎日混合しながら３７℃でインキュベート
された。 ｃ． １８時間後に、該管は７０００Ｇで２分間遠心分
離された。 ｄ． タンパク質の大部分が沈澱物中にあることが測定
された後に、沈澱物は、１ｍｌ以下の水で４回洗浄され
た。 ｅ． 洗浄された沈澱物は、尿素で８Ｍにされて、５０
℃にあためられ、食塩水に対して４℃で１晩透析され、
そして遠心分離された。上澄み液は分離されそして硫酸
アンモニウムで９５％飽和したものとされ、４℃で１晩
保たれ、そして遠心分離された。得られた沈澱物は、９
５％飽和硫酸アンモニウム０．４ｍｌで３回洗浄され、
そして水１ｍｌに懸濁された。これらのコロイド状懸濁
液は、それぞれＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐Ｌ、ＣＲＭ197 ‐
ＰＲＰ‐Ｍ、ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐ＳおよびＣＲＭ197
‐Ｃとラベルされた。 ｆ． 該調製物は、ウシアルブミンを標準として用いる
フォリンフェノール反応によってタンパク質に関して、
またＤ‐リボースを標準として用いるオルシノール反応
によってリボシル残基に関して検定された。結果を第４
表に示す。該調製物は、ＰＲＰ抗原活性に関して、ヒト
抗ＰＲＰ抗体への標識された天然のＰＲＰの結合を阻止
するそれらの能力（５０μｇタンパク質／ｍｌの濃度に
おいて）によって検定された（第３表）。
【００３７】
第 ３ 表
抗原活性
試験された 結合した （ng PRP 調製物当量／調製物
抗原の％ μｇタンパク質）
なし ２８．１ −
＞天然のPRP 0.5ng/ ｍｌ ６．７ −
＞天然のPRP 5ng/ ｍｌ ０．９４ −
ＣＲＭ197 ‐Ｃ ３４．３ ０．０
ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐Ｓ ２．０ ０．１
ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐Ｍ ２．５ ０．０８
ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐Ｌ ３．９ ０．００６
このようにＣＲＭ197 がＰＲＰフラグメントの不存在下
でシアノボロハイドライドにさらされた対照調製物が予
想通りに不活性であったのに対し、ＰＲＰフラグメント
とのＣＲＭ197 の複合体の試験されたすべてのものは、
抗原性的に活性であった。
でシアノボロハイドライドにさらされた対照調製物が予
想通りに不活性であったのに対し、ＰＲＰフラグメント
とのＣＲＭ197 の複合体の試験されたすべてのものは、
抗原性的に活性であった。
【００３８】調製物は、高分子量精製ＰＲＰと比較し
て、ウサギにおける免疫原性に関し検定され、そして結
果は第４表に示される。ＰＲＰ対照またはＣＲＭ197 ‐
Ｃ対照を与えられたウサギは、抗ＰＲＰ抗体におけるか
ろうじて検知できる増加をもたらした。３種のＣＲＭ
197 ‐ＰＲＰ複合体のいずれかを与えられたウサギは、
それぞれの注射の後に進行性の増加をもたらし、３度回
の注射の後の力価は、免疫化前よりも１０００倍も大き
なものであった。示されていない実験において、ＣＲＭ
197 とＰＲＰフラグメント調製物Ｌの単なる混合物がウ
サギにおいて検定され、そして抗ＰＲＰ抗体を誘導しな
いことが見出された。
て、ウサギにおける免疫原性に関し検定され、そして結
果は第４表に示される。ＰＲＰ対照またはＣＲＭ197 ‐
Ｃ対照を与えられたウサギは、抗ＰＲＰ抗体におけるか
ろうじて検知できる増加をもたらした。３種のＣＲＭ
197 ‐ＰＲＰ複合体のいずれかを与えられたウサギは、
それぞれの注射の後に進行性の増加をもたらし、３度回
の注射の後の力価は、免疫化前よりも１０００倍も大き
なものであった。示されていない実験において、ＣＲＭ
197 とＰＲＰフラグメント調製物Ｌの単なる混合物がウ
サギにおいて検定され、そして抗ＰＲＰ抗体を誘導しな
いことが見出された。
【００３９】
【００４０】複合体によって誘導された抗ＰＲＰ抗体の
防御能は、第４表のウサギ血清の殺菌活性を試験するこ
とによって評価された。殺菌価は、アンダーソンら、ジ
ャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション
第65巻、第 885〜 891頁（1980年）［Anderson et a
l. Journal of Clinical Investigation, Volume 65,pa
ges885-891(1980)］の方法によってヘモフィルス・イン
フルエンザｂ株Ｅａｇ［H. Influenzae b strain Eag］
に対して測定された。第５表は、予防接種前は、血清は
細菌を殺すことができないものであった（逆数力価＜
２）ことを示す。３回の注射の後、ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ
複合体を与えられたウサギの逆数力価は１６ないしそれ
以上に上昇したが、一方ＣＲＭ197 対照を与えられたウ
サギの力価は２にとどまった。
防御能は、第４表のウサギ血清の殺菌活性を試験するこ
とによって評価された。殺菌価は、アンダーソンら、ジ
ャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション
第65巻、第 885〜 891頁（1980年）［Anderson et a
l. Journal of Clinical Investigation, Volume 65,pa
ges885-891(1980)］の方法によってヘモフィルス・イン
フルエンザｂ株Ｅａｇ［H. Influenzae b strain Eag］
に対して測定された。第５表は、予防接種前は、血清は
細菌を殺すことができないものであった（逆数力価＜
２）ことを示す。３回の注射の後、ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ
複合体を与えられたウサギの逆数力価は１６ないしそれ
以上に上昇したが、一方ＣＲＭ197 対照を与えられたウ
サギの力価は２にとどまった。
【００４１】
第 ５ 表
ＣＲＭ197 、またはＰＲＰのオリゴ糖Ｓ，ＭおよびＬとのＣＲＭ197 の複合体で
予防接種* された離乳ウサギの血清のヘモフィルス・インフルエンザｂ株Ｅａｇ に対する細菌価
90％を超える殺菌のための
血清希釈の逆数
予防 ３回ウサギ
与えられたワクチン 接種前 注射後
３ ＣＲＭ197 対照 ＜２ ＜２
４ ＣＲＭ197 対照 ＜２ ＜２
５ ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐Ｓ ＜２ １２８
６ ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐Ｓ ＜２ ≧２５６
７ ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐Ｍ ＜２ １６
８ ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐Ｍ ＜２ ６４
９ ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐Ｌ ＜２ ６４
１０ ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐Ｌ ＜２ ３２ *
第４表において述べたものと同様の予防接種。
６．実施例：ＣＲＭ197 に対するＰＲＰフラグメント比
の変化 この実施例において、ＣＲＭ197 に対するＰＲＰフラグ
メントＳの比率は変えられ、そしてＣＲＭ197 成分の抗
原活性の維持がＰＲＰ成分への添加において調べられ
た。ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐Ｓ♯２のＡおよびＢの調製 ａ． マイクロ遠心分離管ＡおよびＢに、上記で述べた
（すなわちステップｏおよびｐ）フラグメントＳの溶液
０．１５ｍｌがそれぞれ加えられた。該溶液は凍結乾燥
された。 ｂ． 管Ａは、２Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８の０．
０１５ｍｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７
中の５mg／ｍｌのＣＲＭ197 の０．１ｍｌ、および２０
０mg／ｍｌナトリウムシアノボロハイドライドの０．０
１５ｍｌを与えられた。 ｃ． 管Ｂは該ｐＨ８の緩衝液０．００２ｍｌおよび該
ＣＲＭ197 溶液０．１ｍｌを与えられた。得られた溶液
は凍結乾燥された。この固体は、水０．０１５ｍｌで懸
濁され、そして該ｐＨ８の緩衝液０．００２ｍｌが加え
られた。 ｄ． 管ＡおよびＢは３７℃で１３日間インキュベート
された。管Ｂに対してシアノボロハイドライド０．００
２ｍｌがさらに添加された。双方の管は、３７℃でさら
に３日間インキュベートされた。（減少した反応容量に
よって、Ｂにおける反応体の濃度はＡのものよりも高く
なったことをしるす。） ｅ． Ａに、水０．０６ｍｌおよび飽和硫酸アンモニウ
ム（ＳＡＳ）０．８ｍｌが加えられた。Ｂには、水０．
１７５ｍｌおよびＳＡＳ０．８ｍｌが加えられた。 ｆ． 該管は、０℃で１時間インキュベートされ、そし
て８０００Ｇで２０分間遠心分離された。上澄み液が除
去された。 ｇ． 沈澱物は、８０％ＳＡＳ１ｍｌ中への懸濁、８０
００Ｇで２０分間の遠心分離そして上澄み液の除去によ
って洗浄された。 ｈ． 沈澱物は、水０．１ｍｌで懸濁され、そしてＳＡ
Ｓ０．４ｍｌが添加された。 ｉ． ステップｆと同じ。 ｊ． ステップｇと同じ。 ｋ． Ｂにおける沈澱物は、９．５Ｍ尿素０．０８４ｍ
ｌで溶解され（最終濃度は８Ｍと見積られた。）、水
０．１ｍｌおよびＳＡＳ０．８ｍｌが添加され、そして
沈澱物がステップｆにおけるようにして単離された。こ
の沈澱物はステップｇにおけるようにして洗浄された。 ｌ． ＡおよびＢにおける沈澱物は、水０．２ｍｌで懸
濁された。懸濁液は８０００Ｇで３０分間の遠心分離に
よって可溶性（ｓ）画分および不溶性（ｉ）画分へ分離
され、そしてｓ画分（上澄み液）は、０．０１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液ｐＨとされそして貯蔵された。 ｍ． ｉ画分（沈澱物）は、以下のようにしてより可溶
性にされた：ｉ画分は尿素で８Ｍとされ、そしてこれは
０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７に対しての透
析によって段階的に除去された。得られた溶液はそれぞ
れのｓ画分と再び合わせた。 ｎ． 調製物ＡおよびＢは、フォリンフェノール試薬で
タンパク質含量に関して、また上記した検定法によって
ＰＲＰ抗原活性に関して試験された。以下に示すよう
に、双方ともＰＲＰ活性を有するが、ＢはＡよりも約１
３倍優れていた。
の変化 この実施例において、ＣＲＭ197 に対するＰＲＰフラグ
メントＳの比率は変えられ、そしてＣＲＭ197 成分の抗
原活性の維持がＰＲＰ成分への添加において調べられ
た。ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐Ｓ♯２のＡおよびＢの調製 ａ． マイクロ遠心分離管ＡおよびＢに、上記で述べた
（すなわちステップｏおよびｐ）フラグメントＳの溶液
０．１５ｍｌがそれぞれ加えられた。該溶液は凍結乾燥
された。 ｂ． 管Ａは、２Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８の０．
０１５ｍｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７
中の５mg／ｍｌのＣＲＭ197 の０．１ｍｌ、および２０
０mg／ｍｌナトリウムシアノボロハイドライドの０．０
１５ｍｌを与えられた。 ｃ． 管Ｂは該ｐＨ８の緩衝液０．００２ｍｌおよび該
ＣＲＭ197 溶液０．１ｍｌを与えられた。得られた溶液
は凍結乾燥された。この固体は、水０．０１５ｍｌで懸
濁され、そして該ｐＨ８の緩衝液０．００２ｍｌが加え
られた。 ｄ． 管ＡおよびＢは３７℃で１３日間インキュベート
された。管Ｂに対してシアノボロハイドライド０．００
２ｍｌがさらに添加された。双方の管は、３７℃でさら
に３日間インキュベートされた。（減少した反応容量に
よって、Ｂにおける反応体の濃度はＡのものよりも高く
なったことをしるす。） ｅ． Ａに、水０．０６ｍｌおよび飽和硫酸アンモニウ
ム（ＳＡＳ）０．８ｍｌが加えられた。Ｂには、水０．
１７５ｍｌおよびＳＡＳ０．８ｍｌが加えられた。 ｆ． 該管は、０℃で１時間インキュベートされ、そし
て８０００Ｇで２０分間遠心分離された。上澄み液が除
去された。 ｇ． 沈澱物は、８０％ＳＡＳ１ｍｌ中への懸濁、８０
００Ｇで２０分間の遠心分離そして上澄み液の除去によ
って洗浄された。 ｈ． 沈澱物は、水０．１ｍｌで懸濁され、そしてＳＡ
Ｓ０．４ｍｌが添加された。 ｉ． ステップｆと同じ。 ｊ． ステップｇと同じ。 ｋ． Ｂにおける沈澱物は、９．５Ｍ尿素０．０８４ｍ
ｌで溶解され（最終濃度は８Ｍと見積られた。）、水
０．１ｍｌおよびＳＡＳ０．８ｍｌが添加され、そして
沈澱物がステップｆにおけるようにして単離された。こ
の沈澱物はステップｇにおけるようにして洗浄された。 ｌ． ＡおよびＢにおける沈澱物は、水０．２ｍｌで懸
濁された。懸濁液は８０００Ｇで３０分間の遠心分離に
よって可溶性（ｓ）画分および不溶性（ｉ）画分へ分離
され、そしてｓ画分（上澄み液）は、０．０１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液ｐＨとされそして貯蔵された。 ｍ． ｉ画分（沈澱物）は、以下のようにしてより可溶
性にされた：ｉ画分は尿素で８Ｍとされ、そしてこれは
０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７に対しての透
析によって段階的に除去された。得られた溶液はそれぞ
れのｓ画分と再び合わせた。 ｎ． 調製物ＡおよびＢは、フォリンフェノール試薬で
タンパク質含量に関して、また上記した検定法によって
ＰＲＰ抗原活性に関して試験された。以下に示すよう
に、双方ともＰＲＰ活性を有するが、ＢはＡよりも約１
３倍優れていた。
【００４２】 調製物 ngＰＲＰ当量／μｇタンパク質
ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐Ｓ♯２，Ａ ０．０３８
ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐Ｓ♯２，Ｂ ０．５０
ｏ． 調製物ＡおよびＢは、マサチューセッツ デパー
トメント オブ パブリック ヘルスによって供給され
た精製ジフテリアトキソイドのサンプルへの抗体の結合
の阻止によってＣＲＭ抗原性（ジフテリアトキソイド
（ＤＴ）としての活性）に関して試験された。以下に示
すように、双方とも、重量にもとづいた場合、概ねＤＴ
と等しい活性を有するが、ＢはＡよりも約４倍近く優れ
ていた。 試験された 結合した抗体， タンパク質１μｇ インヒビター Ａ400 当りのμｇDT当量 なし ２．４３ ＤＴ， 0.5μg/ｍｌ ２．５６ ＤＴ， 5μg/ｍｌ １．９３ ＤＴ，50μg/ｍｌ ０．９６ CRM197‐PRP ‐S ♯2,A,50μg/ｍｌ １．２５ ０．５２ CRM197‐PRP ‐S ♯2,B, 5μg/ｍｌ １．６７ ２．０ ｐ． 調製物ＡおよびＢは、１６μｇタンパク質１ｍ
ｌでミョウバン中に懸濁され、そして第４表に述べられ
た処方（しかしながら動物は、着手時に８週齢であり、
またジフテリアトキソイドの予めの注射によって前処理
されていなかった。）において、３回の０．５ｍｌ注射
がウサギに与えられた。血清はステップｏに記載の結合
検定法において抗体に関して試験された。ＡおよびＢの
双方とも、第６表に示すように、ＤＴに対するならびに
ＰＲＰに対する抗体を誘導するものであった。別個の対
照実験は、ＣＲＭ197 調製物で注射されない状態におい
て同じ宿舎の同様のウサギが抗ＤＴ抗体価におけるこの
ような増加が発現しなかったことを示した。
トメント オブ パブリック ヘルスによって供給され
た精製ジフテリアトキソイドのサンプルへの抗体の結合
の阻止によってＣＲＭ抗原性（ジフテリアトキソイド
（ＤＴ）としての活性）に関して試験された。以下に示
すように、双方とも、重量にもとづいた場合、概ねＤＴ
と等しい活性を有するが、ＢはＡよりも約４倍近く優れ
ていた。 試験された 結合した抗体， タンパク質１μｇ インヒビター Ａ400 当りのμｇDT当量 なし ２．４３ ＤＴ， 0.5μg/ｍｌ ２．５６ ＤＴ， 5μg/ｍｌ １．９３ ＤＴ，50μg/ｍｌ ０．９６ CRM197‐PRP ‐S ♯2,A,50μg/ｍｌ １．２５ ０．５２ CRM197‐PRP ‐S ♯2,B, 5μg/ｍｌ １．６７ ２．０ ｐ． 調製物ＡおよびＢは、１６μｇタンパク質１ｍ
ｌでミョウバン中に懸濁され、そして第４表に述べられ
た処方（しかしながら動物は、着手時に８週齢であり、
またジフテリアトキソイドの予めの注射によって前処理
されていなかった。）において、３回の０．５ｍｌ注射
がウサギに与えられた。血清はステップｏに記載の結合
検定法において抗体に関して試験された。ＡおよびＢの
双方とも、第６表に示すように、ＤＴに対するならびに
ＰＲＰに対する抗体を誘導するものであった。別個の対
照実験は、ＣＲＭ197 調製物で注射されない状態におい
て同じ宿舎の同様のウサギが抗ＤＴ抗体価におけるこの
ような増加が発現しなかったことを示した。
【００４３】
第 ６ 表
表示物に対する抗体 週齢での抗体価 ウサギ
注射物 に関する検定 8週 9週 10週 11週
５ Ａ ＰＲＰ，ng／ｍｌ 47 60 210 13,500
ＤＴ，Ａ400 0.136 0.168 1.28 3.81
６ Ａ ＰＲＰ 21 25 19 420
ＤＴ 0.072 0.049 0.262 3.23
７ Ａ ＰＲＰ ＜ 20 20 2000 10,500
ＤＴ 0.155 0.134 0.155 0.676
３ Ｂ ＰＲＰ ＜ 20 27 1600 4900
ＤＴ 0.075 0.061 0.227 2.45
８ Ｂ ＰＲＰ 23 ＜ 20 2900 26,000
ＤＴ 0.065 0.023 0.231 2.07
７．実施例：ＰＲＰの非常に小さなフラグメントのジフ
テリア毒素、ジフテリアトキソイドおよびＣＲＭ197 へ
の複合 還元末端基を有するＰＲＰの非常に小さなフラグメント
の生成 ａ． ＰＲＰロット２０の溶液１２ｍｌが、０℃でＨ
Ｃｌで０．１Ｍとされ、ガラス製フラスコ中に封じ込め
られた（０分）。 ｂ． 該フラスコは沸騰水浴中に４分間移され、次に
氷水浴中に冷やされた。 ｃ． 小量の生成した白色のコロイドは、エーテルで
の抽出によって除去され、得られた透明な溶液は凍結乾
燥された。 ｄ． バイオ‐ゲルＰ１０（バイオ ラッド インコ
ーポレーテッド）は０．０１Ｍ酢酸アンモニウム中で平
衡化され、そして直径１．５cmのクロマトグラフィーカ
ラム中に注がれ、９８cmのゲル床高さを与えた。 ｅ． 凍結乾燥された物質は水１．５ｍｌで再水和さ
れそしてＮＨ4 ＯＨで中和された。この溶液が該カラム
にかけられ、溶出が行なわれた。 ｆ． ２．０〜２．４のＶｅ／Ｖｏ比で溶出するフラ
グメントが集められ、画分ｖｓと命名された。 ｇ． 画分ｖｓの供給を二倍とするために、ａ〜ｆの
ステップが繰返された。 ｈ． 合わせた画分ｖｓは、Ｄ‐リボースで標準化さ
れたアルカリ性ヘキサシアノ鉄（III ）酸塩法によって
検定された場合に総計４７μmol の還元糖活性を含む４
ｍｌの溶液を得るために、凍結乾燥され再水和された。ＰＲＰ‐ｖｓフラグメントの天然ジフテリア毒素、天然
ジフテリアトキソイドおよびＣＲＭ197 との複合体の調
製 以下のタンパク質は、本実施例において担体として用い
られる。 （１）ＤＴｘ−精製ジフテリア毒素、ロット１ マサチューセッツ パブリック ヘルス バイオロジッ
ク ラボラトリーズ［Massachusettes Public Health
Biologic Laboratories ］から得られた。部分的脱毒性
化がＰＲＰvsへの結合によって行なわれる。残留毒性は
パペンヘイマーら，イムノケミストリー，９： 891（19
72年）［Pappenheimer et al., Immunochem.９： 891
（1972）］の方法によってリシンの存在下におけるホル
マリン処理によって除去される。 （２）ＤＴｄ−慣用の（正式な）トキソイド、ロットＤ
ＣＰ−２７ 上記マサチューセッツ ラボラトリーズ よりまた得ら
れた。 （３）ＣＲＭ197 −毒素タンパク質の抗原性的に変異さ
れたバージョン毒素と抗原性的に同一であるが非毒性で
ある。
テリア毒素、ジフテリアトキソイドおよびＣＲＭ197 へ
の複合 還元末端基を有するＰＲＰの非常に小さなフラグメント
の生成 ａ． ＰＲＰロット２０の溶液１２ｍｌが、０℃でＨ
Ｃｌで０．１Ｍとされ、ガラス製フラスコ中に封じ込め
られた（０分）。 ｂ． 該フラスコは沸騰水浴中に４分間移され、次に
氷水浴中に冷やされた。 ｃ． 小量の生成した白色のコロイドは、エーテルで
の抽出によって除去され、得られた透明な溶液は凍結乾
燥された。 ｄ． バイオ‐ゲルＰ１０（バイオ ラッド インコ
ーポレーテッド）は０．０１Ｍ酢酸アンモニウム中で平
衡化され、そして直径１．５cmのクロマトグラフィーカ
ラム中に注がれ、９８cmのゲル床高さを与えた。 ｅ． 凍結乾燥された物質は水１．５ｍｌで再水和さ
れそしてＮＨ4 ＯＨで中和された。この溶液が該カラム
にかけられ、溶出が行なわれた。 ｆ． ２．０〜２．４のＶｅ／Ｖｏ比で溶出するフラ
グメントが集められ、画分ｖｓと命名された。 ｇ． 画分ｖｓの供給を二倍とするために、ａ〜ｆの
ステップが繰返された。 ｈ． 合わせた画分ｖｓは、Ｄ‐リボースで標準化さ
れたアルカリ性ヘキサシアノ鉄（III ）酸塩法によって
検定された場合に総計４７μmol の還元糖活性を含む４
ｍｌの溶液を得るために、凍結乾燥され再水和された。ＰＲＰ‐ｖｓフラグメントの天然ジフテリア毒素、天然
ジフテリアトキソイドおよびＣＲＭ197 との複合体の調
製 以下のタンパク質は、本実施例において担体として用い
られる。 （１）ＤＴｘ−精製ジフテリア毒素、ロット１ マサチューセッツ パブリック ヘルス バイオロジッ
ク ラボラトリーズ［Massachusettes Public Health
Biologic Laboratories ］から得られた。部分的脱毒性
化がＰＲＰvsへの結合によって行なわれる。残留毒性は
パペンヘイマーら，イムノケミストリー，９： 891（19
72年）［Pappenheimer et al., Immunochem.９： 891
（1972）］の方法によってリシンの存在下におけるホル
マリン処理によって除去される。 （２）ＤＴｄ−慣用の（正式な）トキソイド、ロットＤ
ＣＰ−２７ 上記マサチューセッツ ラボラトリーズ よりまた得ら
れた。 （３）ＣＲＭ197 −毒素タンパク質の抗原性的に変異さ
れたバージョン毒素と抗原性的に同一であるが非毒性で
ある。
【００４４】複合方法は以下の通りである。
ａ． タンパク質、リン酸カリウム緩衝液（２５℃で
ｐＨ８．０）およびＰＲＰvsが、次に示す様式において
ガラス製遠心分離管中で合わされた。溶液 タンパク質 緩衝液 ＰＲＰvs (1) 30mg ＤＴｘ 0.24μmol 20μmol (2) 30mg ＤＴｄ 0.24μmol 20μmol (3) 10mg ＣＲＭ197 0.08μmol 6.7μmol ｂ． 溶液は凍結乾燥され、そして凍結乾燥物は、以
下に表として示されるように、２％w/v ＮａＣＮＢＨ
3 水溶液で溶解された。
ｐＨ８．０）およびＰＲＰvsが、次に示す様式において
ガラス製遠心分離管中で合わされた。溶液 タンパク質 緩衝液 ＰＲＰvs (1) 30mg ＤＴｘ 0.24μmol 20μmol (2) 30mg ＤＴｄ 0.24μmol 20μmol (3) 10mg ＣＲＭ197 0.08μmol 6.7μmol ｂ． 溶液は凍結乾燥され、そして凍結乾燥物は、以
下に表として示されるように、２％w/v ＮａＣＮＢＨ
3 水溶液で溶解された。
【００４５】溶 液
２％ ＮａＣＮＢＨ3
（１） １．２ｍｌ
（２） １．２ｍｌ
（３） ０．４ｍｌ
ｃ． 該管は３７℃でインキュベートされた。
ｄ． １４日後に、飽和硫酸アンモニウムの４容量当
量が添加された。これらの懸濁液は０℃で３時間保た
れ、次に９０００Ｇで２０分間遠心分離された。 ｅ． 沈澱物は、中性の７０％飽和硫酸アンモニウム
１０ｍｌをそれぞれ用いて２回洗浄された。 ｆ． 洗浄された沈澱物は、９．５Ｍ尿素の最小の容
量で溶解され、そして０．０６７Ｍリン酸ナトリウム緩
衝液ｐＨ７．８に対して透析された。
量が添加された。これらの懸濁液は０℃で３時間保た
れ、次に９０００Ｇで２０分間遠心分離された。 ｅ． 沈澱物は、中性の７０％飽和硫酸アンモニウム
１０ｍｌをそれぞれ用いて２回洗浄された。 ｆ． 洗浄された沈澱物は、９．５Ｍ尿素の最小の容
量で溶解され、そして０．０６７Ｍリン酸ナトリウム緩
衝液ｐＨ７．８に対して透析された。
【００４６】複合体のホルマリン処理
ａ． 複合体はさらに０．０２５Ｍリシンをまた含む
ものであるリン酸ナトリウム緩衝液に対してさらに透析
された。（少量のサンプルが、ホルマリン化の前に毒性
試験のために取って置かれた。） ｂ． ホルマリンが０．２％v/v の最終濃度まで添加
された。 ｃ． 約２４℃で１７日間のインキュベーションの
後、溶液は、リン酸ナトリウム緩衝液に対して広範に透
析された。 ｄ． 遠心分離が少量の不溶性物質を除去するために
行なわれた。
ものであるリン酸ナトリウム緩衝液に対してさらに透析
された。（少量のサンプルが、ホルマリン化の前に毒性
試験のために取って置かれた。） ｂ． ホルマリンが０．２％v/v の最終濃度まで添加
された。 ｃ． 約２４℃で１７日間のインキュベーションの
後、溶液は、リン酸ナトリウム緩衝液に対して広範に透
析された。 ｄ． 遠心分離が少量の不溶性物質を除去するために
行なわれた。
【００４７】最終的容器製品を得るための手順
ａ． 等張性リン酸ナトリウム緩衝液における抗原溶
液（１）〜（３）は、０．２２ミクロン「ミレックス
［Millex］」フィルターユニット（ミリポア コーポレ
ーション［Millipore Corp. ］）を通過させられ、そし
て滅菌リン酸緩衝食塩水を含有する瓶中に注入された。 ｂ． 調製物はローリー法［Lowry method］を用いて
タンパク質に関して検定された。 ｃ． チメロサールが濾過されてそして新たに作られ
た１％w/v 溶液の１／ 100容量となるように溶液中に注
入された。１０ｍｌのサンプルが殺菌試験のために取ら
れた。瓶が、手動の滅菌単回使用充填具（マルチプル
アディッティブセット，トラベノール ラボラトリーズ
［Multiple Additive Set, Travenol Laboratories］）
へ取付けられた。２ｍｌガラス瓶が満たされ、栓をさ
れ、密封され、そして４℃で貯蔵するために迅速に移さ
れた。
液（１）〜（３）は、０．２２ミクロン「ミレックス
［Millex］」フィルターユニット（ミリポア コーポレ
ーション［Millipore Corp. ］）を通過させられ、そし
て滅菌リン酸緩衝食塩水を含有する瓶中に注入された。 ｂ． 調製物はローリー法［Lowry method］を用いて
タンパク質に関して検定された。 ｃ． チメロサールが濾過されてそして新たに作られ
た１％w/v 溶液の１／ 100容量となるように溶液中に注
入された。１０ｍｌのサンプルが殺菌試験のために取ら
れた。瓶が、手動の滅菌単回使用充填具（マルチプル
アディッティブセット，トラベノール ラボラトリーズ
［Multiple Additive Set, Travenol Laboratories］）
へ取付けられた。２ｍｌガラス瓶が満たされ、栓をさ
れ、密封され、そして４℃で貯蔵するために迅速に移さ
れた。
【００４８】複合体調製物における検定
ａ．タンパク質画分のホスフェート含量
ＰＲＰはリボシル‐リビトール‐ホスフェートの繰返し
単位から構成される。これゆえに、５％トリクロロ酢酸
（ＴＣＡ）によって沈澱可能な画分におけるホスフェー
トの比色検定は、タンパク質中のＰＲＰフラグメントの
取り込みの敏感な指針である。タンパク質１００μｇを
含有するサンプルが３ｍｌの容量においてＴＣＡ５％に
作成 され、氷上に２０分間保持され、そして４℃にお
いて２０００×ｇで１５分間遠心分離された。沈澱物
は、５％ＴＣＡの別の３ｍｌで洗浄され、次にエタノー
ル５ｍｌで洗浄された。洗浄された沈澱物は、有機ホス
フェートを無機ホスフェート（Ｐｉ）に変換するために
灰化され、そして該Ｐｉは、チェンら，アナル．ケ
ム．，28：1756（1956年）［Chen et al., Anal. Che
m., 28:1756(1956)］の方法によって定量された。結果
は以下の通りである。
単位から構成される。これゆえに、５％トリクロロ酢酸
（ＴＣＡ）によって沈澱可能な画分におけるホスフェー
トの比色検定は、タンパク質中のＰＲＰフラグメントの
取り込みの敏感な指針である。タンパク質１００μｇを
含有するサンプルが３ｍｌの容量においてＴＣＡ５％に
作成 され、氷上に２０分間保持され、そして４℃にお
いて２０００×ｇで１５分間遠心分離された。沈澱物
は、５％ＴＣＡの別の３ｍｌで洗浄され、次にエタノー
ル５ｍｌで洗浄された。洗浄された沈澱物は、有機ホス
フェートを無機ホスフェート（Ｐｉ）に変換するために
灰化され、そして該Ｐｉは、チェンら，アナル．ケ
ム．，28：1756（1956年）［Chen et al., Anal. Che
m., 28:1756(1956)］の方法によって定量された。結果
は以下の通りである。
【００４９】
ｂ．電気泳動的分析
複合抗原のサンプルが、メルカプトエタノール‐ドデシ
ル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＭＥ‐ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）により、それぞれの出発担
体タンパク質調製物と並んで同じゲルにおいて分析され
た。
ル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＭＥ‐ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）により、それぞれの出発担
体タンパク質調製物と並んで同じゲルにおいて分析され
た。
【００５０】ＤＴｄ‐ＰＲＰvsは、ＤＴｄと同様に、分
子量６１，０００ダルトンでの分散バンドを示した。こ
れに対し、ＤＴｘ‐ＰＲＰvsおよびＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ
vsは、出発タンパク質とはかなり異なるものであった。
これら２つの複合体のタンパク質は、スタッキングゲル
（４％アクリルアミド）の始めにもしくは中にあるいは
分離ゲル（１０％アクリルアミド）の始めに集められ
た。これゆえ、複合体は、恐らくホルマリン処理からの
架橋結合による、高分子凝集体に転化していると思われ
る。ＤＴｄ‐ＰＲＰvsはまたいくらかの凝集した物質を
含んでいる。 ｃ．タンパク質１単位当りのＰＲＰ抗原当量 抗ＰＲＰ抗体を結合するための複合体の能力が、ＰＲＰ
ロット１９で較正された、ヒト抗ＰＲＰ抗血清による標
識化ＰＲＰ結合の阻止によって測定された。（タンパク
質結合ポリマーフラグメントは、高分子量ポリマーに対
する重量‐当量形式において抗体に結合することが仮定
できないゆえに、定量的化学組成はこれらのデータから
推論され得ない。） 3H-PRP 結合 ng PRP当量／ サンプル の阻止％ μｇタンパク質 PBS 対照 （０） − PRP19, 0.5ng/ ｍｌ ６．７ − PRP19, 5ng/ ｍｌ ３２ − PRP19,50ng/ ｍｌ ９０ − DTx-PRPvs, ２４ ０．５ 5μg タンパク質／ｍｌ DTd-PRPvs, ４８ ２．２ 5μg タンパク質／ｍｌ CRM 197 -PRPvs, ３８ １．４ 5μg タンパク質／ｍｌ ｄ．タンパク質１単位当りのジフテリアトキソイド抗原
当量 抗ＤＴｄ抗体と反応する調製物の能力の維持が、精製Ｄ
Ｔｄが検定管（固相）に付着される酵素結合イムノソル
ベント検定法（ＥＬＩＳＡ）の阻止によって測定され
た。付着ＤＴｄへの抗体結合の阻止は、流体層において
用いた同じＤＴｄによって較正される。
子量６１，０００ダルトンでの分散バンドを示した。こ
れに対し、ＤＴｘ‐ＰＲＰvsおよびＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ
vsは、出発タンパク質とはかなり異なるものであった。
これら２つの複合体のタンパク質は、スタッキングゲル
（４％アクリルアミド）の始めにもしくは中にあるいは
分離ゲル（１０％アクリルアミド）の始めに集められ
た。これゆえ、複合体は、恐らくホルマリン処理からの
架橋結合による、高分子凝集体に転化していると思われ
る。ＤＴｄ‐ＰＲＰvsはまたいくらかの凝集した物質を
含んでいる。 ｃ．タンパク質１単位当りのＰＲＰ抗原当量 抗ＰＲＰ抗体を結合するための複合体の能力が、ＰＲＰ
ロット１９で較正された、ヒト抗ＰＲＰ抗血清による標
識化ＰＲＰ結合の阻止によって測定された。（タンパク
質結合ポリマーフラグメントは、高分子量ポリマーに対
する重量‐当量形式において抗体に結合することが仮定
できないゆえに、定量的化学組成はこれらのデータから
推論され得ない。） 3H-PRP 結合 ng PRP当量／ サンプル の阻止％ μｇタンパク質 PBS 対照 （０） − PRP19, 0.5ng/ ｍｌ ６．７ − PRP19, 5ng/ ｍｌ ３２ − PRP19,50ng/ ｍｌ ９０ − DTx-PRPvs, ２４ ０．５ 5μg タンパク質／ｍｌ DTd-PRPvs, ４８ ２．２ 5μg タンパク質／ｍｌ CRM 197 -PRPvs, ３８ １．４ 5μg タンパク質／ｍｌ ｄ．タンパク質１単位当りのジフテリアトキソイド抗原
当量 抗ＤＴｄ抗体と反応する調製物の能力の維持が、精製Ｄ
Ｔｄが検定管（固相）に付着される酵素結合イムノソル
ベント検定法（ＥＬＩＳＡ）の阻止によって測定され
た。付着ＤＴｄへの抗体結合の阻止は、流体層において
用いた同じＤＴｄによって較正される。
【００５１】
抗体結合 μｇ DTd当量／ サンプル
の阻止％ μｇタンパク質
PBS 対照 （０） −
DTd, 5μg タンパク質／ｍｌ ２４ −
DTd,50μg タンパク質／ｍｌ ５０ −
DTx-PRPvs, ４６ ０．６８
50μg タンパク質／ｍｌ
DTd-PRPvs, ５８ ２．１
50μg タンパク質／ｍｌ
CRM197 -PRPvs, ２６ ０．１１
50μg タンパク質／ｍｌ
ｅ．ジフテリア毒性活性
本来のＤＴｘならびにホルマリン処理前および後の複合
体ＤＴｘ‐ＰＲＰvsが、非免疫成体ウサギの皮膚中への
注射によって毒性活性に関し力価評価された。０．００
２μｇおよび０．０２μｇの投与量で、ＤＴｘは予期さ
れた皮膚病変をもたらした。ホルマリン処理前のＤＴｘ
‐ＰＲＰvsは０．２μｇがＤＴｘ ０．００２μｇとほ
ぼ等しい（複合による毒性における１００倍の低減）と
いうような投与量依存性病変をもたらした。ホルマリン
処理の後、病変は２μｇ程も高い投与量によっても発生
しなかった（ＤＴｘと比較して少なくとも１０００倍の
低減）。複合体ＤＴｄ‐ＰＲＰvsおよびＣＲＭ197 ‐Ｐ
ＲＰvsの最高２μｇまでの投与量が同様に試験された
が、病変は発生しなかった。 ｆ．放射線抗原結合により計測された、離乳ウサギにお
ける抗ＰＲＰ抗体応答の誘導 抗原は、リン酸アルミニウムアジュバンド（０．０１２
５Ｍ Ａｌ，ｐＨ６）と混合され、０．５ｍｌ投与量が
タンパク質２５μｇを含むようにされた。２匹のウサギ
（それぞれの抗原に関して）は第７週齢で始められる３
回の週間注射を与えられたが、該ウサギは仮定の「担体
初回免疫［carrier priming ］」効果のために第５週齢
でＤＴｄのみでの注射をされていた。すべての動物（ウ
サギ１〜７）は３回目の予防接種の後に、少なくとも１
０μｇ／ｍｌの力価を有して、既往パターンにおける抗
ＰＲＰ上昇を有した。抗原ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰvs、およ
びＤＴｄ‐ＰＲＰvsは、ＤＴｄで「初回免疫され」てい
なかった２匹のウサギにおいてさらに試験された。これ
ら（ウサギ７〜１０）は「初回免疫された」ウサギにお
けるものと同様な強力な抗ＰＲＰ応答を起こした。 ｇ．ＥＬＩＳＡによって計測された、離乳ウサギにおけ
る抗ＤＴｄ抗体応答の誘導 前述の分節の同様の「初回免疫されていなかった」ウサ
ギ（７〜１０）の抗ＤＴｄ抗体応答は次の通りである：
上昇は２回目の注射の後概ね１０倍および３回目の注射
の後さらに２〜５倍であった。 ｈ．サンプル調製物の生殖不能 サンプルは、増殖培地としてフルイド チオグリコレー
ト［Fluid Thioglycollate］（ビービーエル カタログ
ナンバー 11260，ロットＤ４Ｄ ＬＫＬ［ＢＢＬ ca
t. no. 11260, lot Ｄ４Ｄ ＬＫＬ］）を用いて測定さ
れた場合生殖不能であることが見出された。
体ＤＴｘ‐ＰＲＰvsが、非免疫成体ウサギの皮膚中への
注射によって毒性活性に関し力価評価された。０．００
２μｇおよび０．０２μｇの投与量で、ＤＴｘは予期さ
れた皮膚病変をもたらした。ホルマリン処理前のＤＴｘ
‐ＰＲＰvsは０．２μｇがＤＴｘ ０．００２μｇとほ
ぼ等しい（複合による毒性における１００倍の低減）と
いうような投与量依存性病変をもたらした。ホルマリン
処理の後、病変は２μｇ程も高い投与量によっても発生
しなかった（ＤＴｘと比較して少なくとも１０００倍の
低減）。複合体ＤＴｄ‐ＰＲＰvsおよびＣＲＭ197 ‐Ｐ
ＲＰvsの最高２μｇまでの投与量が同様に試験された
が、病変は発生しなかった。 ｆ．放射線抗原結合により計測された、離乳ウサギにお
ける抗ＰＲＰ抗体応答の誘導 抗原は、リン酸アルミニウムアジュバンド（０．０１２
５Ｍ Ａｌ，ｐＨ６）と混合され、０．５ｍｌ投与量が
タンパク質２５μｇを含むようにされた。２匹のウサギ
（それぞれの抗原に関して）は第７週齢で始められる３
回の週間注射を与えられたが、該ウサギは仮定の「担体
初回免疫［carrier priming ］」効果のために第５週齢
でＤＴｄのみでの注射をされていた。すべての動物（ウ
サギ１〜７）は３回目の予防接種の後に、少なくとも１
０μｇ／ｍｌの力価を有して、既往パターンにおける抗
ＰＲＰ上昇を有した。抗原ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰvs、およ
びＤＴｄ‐ＰＲＰvsは、ＤＴｄで「初回免疫され」てい
なかった２匹のウサギにおいてさらに試験された。これ
ら（ウサギ７〜１０）は「初回免疫された」ウサギにお
けるものと同様な強力な抗ＰＲＰ応答を起こした。 ｇ．ＥＬＩＳＡによって計測された、離乳ウサギにおけ
る抗ＤＴｄ抗体応答の誘導 前述の分節の同様の「初回免疫されていなかった」ウサ
ギ（７〜１０）の抗ＤＴｄ抗体応答は次の通りである：
上昇は２回目の注射の後概ね１０倍および３回目の注射
の後さらに２〜５倍であった。 ｈ．サンプル調製物の生殖不能 サンプルは、増殖培地としてフルイド チオグリコレー
ト［Fluid Thioglycollate］（ビービーエル カタログ
ナンバー 11260，ロットＤ４Ｄ ＬＫＬ［ＢＢＬ ca
t. no. 11260, lot Ｄ４Ｄ ＬＫＬ］）を用いて測定さ
れた場合生殖不能であることが見出された。
【００５２】８．実施例：幼児におけるワクチンとして
のジフテリアトキソイドおよびＣＲＭ197 に複合したＰ
ＲＰフラグメントの使用 １〜２才の年齢範囲の８人の幼児の２つのグループ、
（および第１８カ月齢でジフテリアトキソイドタンパク
質での定型的予防接種を受ける特に免除される幼児）
は、以下のように最初のおよび第２回目の予防接種を受
けた。グループI は、前述の節において述べるように調
製されたＣＲＭ197 ‐ＰＲＰvsの注射を受け（食塩水中
にタンパク質２５μｇ、皮下的）、グループIIは、前述
の節において述べるように調製されたＤＴｄ‐ＰＲＰvs
の注射を受けた（食塩水中にタンパク質２５μｇ、皮下
的）。
のジフテリアトキソイドおよびＣＲＭ197 に複合したＰ
ＲＰフラグメントの使用 １〜２才の年齢範囲の８人の幼児の２つのグループ、
（および第１８カ月齢でジフテリアトキソイドタンパク
質での定型的予防接種を受ける特に免除される幼児）
は、以下のように最初のおよび第２回目の予防接種を受
けた。グループI は、前述の節において述べるように調
製されたＣＲＭ197 ‐ＰＲＰvsの注射を受け（食塩水中
にタンパク質２５μｇ、皮下的）、グループIIは、前述
の節において述べるように調製されたＤＴｄ‐ＰＲＰvs
の注射を受けた（食塩水中にタンパク質２５μｇ、皮下
的）。
【００５３】最初の臨検においては、予防接種前血液標
本が採取され、幼児が予防接種され、次にアナフィラキ
シー反応の徴候に関して２０分間観察された。第２の臨
検においては、第１の臨検における手順が繰返された。
第３の臨検においては、２回目以降の血液標本が採取さ
れた。それぞれのグループからひとりの、２人の幼児
は、親との相談の後に、ＰＲＰに対する抗体を防御レベ
ルへ高めることを試みるために第３回目の予防接種を与
えられた。予防接種の間の間隔は１±1/2 カ月であっ
た。
本が採取され、幼児が予防接種され、次にアナフィラキ
シー反応の徴候に関して２０分間観察された。第２の臨
検においては、第１の臨検における手順が繰返された。
第３の臨検においては、２回目以降の血液標本が採取さ
れた。それぞれのグループからひとりの、２人の幼児
は、親との相談の後に、ＰＲＰに対する抗体を防御レベ
ルへ高めることを試みるために第３回目の予防接種を与
えられた。予防接種の間の間隔は１±1/2 カ月であっ
た。
【００５４】グループIII は、別の部位でのジフテリア
トキソイドタンパク質と同時にワクチンを受ける約１８
カ月齢の幼児から構成されたいた。このグループは、一
方がＣＲＭ197 ‐ＰＲＰvsワクチンを受け、他方がＤＴ
ｄ‐ＰＲＰvsワクチンを受ける２人の幼児を含むもので
あった。徴候が体温の測定、全身性疾病の挙動指示の表
記、および注射部位での炎症の観察によって、連続する
４日の間記録された。これらの徴候は第７表に要約され
る。
トキソイドタンパク質と同時にワクチンを受ける約１８
カ月齢の幼児から構成されたいた。このグループは、一
方がＣＲＭ197 ‐ＰＲＰvsワクチンを受け、他方がＤＴ
ｄ‐ＰＲＰvsワクチンを受ける２人の幼児を含むもので
あった。徴候が体温の測定、全身性疾病の挙動指示の表
記、および注射部位での炎症の観察によって、連続する
４日の間記録された。これらの徴候は第７表に要約され
る。
【００５５】
第 ７ 表
ＰＲＰvsのＣＲＭ197 および正式
ジフテリアトキソイドへの複合体に対する副反応
注 射 ワクチン
徴 候 初 回 ２回目 ３回目
CRM197-PRPvs 熱 1/8 0/8 0/1
正常でない挙動 0/8 0/8 0/1
局部的炎症 1/9 * 2/9 0/1
局部的痛み 1/9 * 1/9 0/1
DTd-PRPvs 熱 0/8 0/8 0/1
正常でない挙動 0/8 0/8 0/1
局部的炎症 1/9 * 0/9 0/1
局部的痛み 1/9 * 0/9 0/1
*
同時的に別の部位でのジフテリアトキソイドタンパク質を受けたひとりの幼児
を含むものである。局部的徴候は見られなかった。全身性徴候は、ジフテリアト
キソイドタンパク質ワクチンの効果と区別することができないゆえに書留められ
ない。
【００５６】ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰvs予防接種後、ひとり
の幼児が初回予防接種の晩に、軽い熱（９９．８Ｆ°）
を有し、またそれぞれ初回の１つ、２回目の１つおよび
３回目の１つの予防接種の直後に軽い局部的炎症の例が
あった。ＤＴｄ‐ＰＲＰvs予防接種後、初回の１つ、２
回目の１つの予防接種の直後に局部的炎症の例があっ
た。該ワクチンの投与は、他の点では副反応のないもの
であるらしかった。
の幼児が初回予防接種の晩に、軽い熱（９９．８Ｆ°）
を有し、またそれぞれ初回の１つ、２回目の１つおよび
３回目の１つの予防接種の直後に軽い局部的炎症の例が
あった。ＤＴｄ‐ＰＲＰvs予防接種後、初回の１つ、２
回目の１つの予防接種の直後に局部的炎症の例があっ
た。該ワクチンの投与は、他の点では副反応のないもの
であるらしかった。
【００５７】血清抗体応答
ＰＲＰに対する抗体ならびにジフテリアトキソイドに対
するＩｇＧ抗体が測定された。ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰvsで
の予防接種後、一貫した抗ＰＲＰ応答パターンが見られ
た。第８表を参照のこと。初回の注射の後にはっきりと
した上昇が、２回目の注射の後に通常わずかにより大き
な上昇が、そして１つの３回目の注射の後に大きな上昇
があった。最終的力価は、ＰＲＰのみでの予防接種によ
ってもたらされるものをかなり超えた、および０．１５
μｇ／ｍｌの許容される見積り防御最小レベルをかなり
超えたものであった。高められた応答は、ＰＲＰのみに
対する応答が防御に関し通常不十分である１８カ月齢未
満の４人の幼児において特に明白であり、そしてこれら
の４人における最終力価の重量平均（８．４μｇ／ｍ
ｌ）は、ＰＲＰワクチンのみでの１２〜１７カ月齢幼児
の予防接種後に見られるものの１７５倍である。ジフテ
リアトキソイドタンパク質での同時に初回予防接種を受
けた幼児はまた優れた応答を有した。
するＩｇＧ抗体が測定された。ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰvsで
の予防接種後、一貫した抗ＰＲＰ応答パターンが見られ
た。第８表を参照のこと。初回の注射の後にはっきりと
した上昇が、２回目の注射の後に通常わずかにより大き
な上昇が、そして１つの３回目の注射の後に大きな上昇
があった。最終的力価は、ＰＲＰのみでの予防接種によ
ってもたらされるものをかなり超えた、および０．１５
μｇ／ｍｌの許容される見積り防御最小レベルをかなり
超えたものであった。高められた応答は、ＰＲＰのみに
対する応答が防御に関し通常不十分である１８カ月齢未
満の４人の幼児において特に明白であり、そしてこれら
の４人における最終力価の重量平均（８．４μｇ／ｍ
ｌ）は、ＰＲＰワクチンのみでの１２〜１７カ月齢幼児
の予防接種後に見られるものの１７５倍である。ジフテ
リアトキソイドタンパク質での同時に初回予防接種を受
けた幼児はまた優れた応答を有した。
【００５８】ジフテリアトキソイドに対するＩｇＧ抗体
は、８人の幼児のうち６人（ならびに、処置の一部とし
てジフテリアトキソイドをまた受けた第９番目の幼児）
において増加した。該抗体レベルは、しばしば非常に大
きく増加したので、用いられた予防接種後の血清の希釈
（１／1000）は、上昇の最大範囲を示すのに不十分なも
のとなった。
は、８人の幼児のうち６人（ならびに、処置の一部とし
てジフテリアトキソイドをまた受けた第９番目の幼児）
において増加した。該抗体レベルは、しばしば非常に大
きく増加したので、用いられた予防接種後の血清の希釈
（１／1000）は、上昇の最大範囲を示すのに不十分なも
のとなった。
【００５９】ＤＴｄ‐ＰＲＰvsでの予防接種後、抗ＰＲ
Ｐ応答は、一般的に初回および２回目の双方の予防接種
後に増加した。（第９表参照）。しかしながら、全く応
答が検知されなかった２人の幼児（１２カ月齢および１
４カ月齢）があり、そしてひとりの幼児は、３回目の注
射が与えられるまで防御的レベルに近づかなかった。ジ
フテリアトキソイドタンパク質での同時的な初回予防接
種を受ける幼児は優れた応答を有した。ジフテリア成分
に対するＩｇＧ抗体における上昇はすべての幼児におい
て見られた。
Ｐ応答は、一般的に初回および２回目の双方の予防接種
後に増加した。（第９表参照）。しかしながら、全く応
答が検知されなかった２人の幼児（１２カ月齢および１
４カ月齢）があり、そしてひとりの幼児は、３回目の注
射が与えられるまで防御的レベルに近づかなかった。ジ
フテリアトキソイドタンパク質での同時的な初回予防接
種を受ける幼児は優れた応答を有した。ジフテリア成分
に対するＩｇＧ抗体における上昇はすべての幼児におい
て見られた。
【００６０】
【００６１】
【００６２】この実施例は、ヘモフィルス・インフルエ
ンザ b型莢膜ポリマーフラグメントのジフテリアトキソ
イドおよびＣＲＭ197 への複合体の注射は危険性のない
ものらしいことを示すものである。ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ
vs予防接種は、高い力価によるもののみならず２回目の
予防接種の後の上昇により察知される、担体効果による
抗ＰＲＰ応答の高まりを明白に示すものである。
ンザ b型莢膜ポリマーフラグメントのジフテリアトキソ
イドおよびＣＲＭ197 への複合体の注射は危険性のない
ものらしいことを示すものである。ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ
vs予防接種は、高い力価によるもののみならず２回目の
予防接種の後の上昇により察知される、担体効果による
抗ＰＲＰ応答の高まりを明白に示すものである。
【００６３】ＤＴｄ‐ＰＲＰvsは印象のより薄い高まり
を有した。有望な説明は、ＣＲＭ19 7 ‐ＰＲＰvsが多分
子凝集であるのに対し、ＤＴｄ‐ＰＲＰvsは、もとのト
キソイドと類似の単一分子形態において主に存在すると
いうことである。 ９．実施例：ストレプトコッカス・ニューモニエの莢膜
ポリマーフラグメントのＣＲＭ197への複合 いくつかのその他細菌は、これらが敗血症および髄膜炎
を引き起こす、特に乳児において引き起すことにおい
て、これらが、それに対する抗体が防御的である莢膜ポ
リマーを有することにおいて、そしてこれらの莢膜ポリ
マーが成熟したヒトにおいては免疫原性であるが乳児に
おいて免疫原性でないことにおいて、ヘモフィルス・イ
ンフルエンザｂと類似している。その重要な一例はスト
レプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｐ）血清型６［Stre
ptococcus pneumoniae（Sp）serotype 6］である。こ
れは上述したような生命を脅かす感染を引き起すのみな
らず、幼児における中耳炎のかなり有力な原因である。
（グレイら，ジャーナル オブ インフェクシャス デ
ィジィーズ，第 142巻、第 923〜 933頁、1980年［Gray
et al., Journal of Infectious Diseases, Volume 14
2, pages923-33,1980］）。
を有した。有望な説明は、ＣＲＭ19 7 ‐ＰＲＰvsが多分
子凝集であるのに対し、ＤＴｄ‐ＰＲＰvsは、もとのト
キソイドと類似の単一分子形態において主に存在すると
いうことである。 ９．実施例：ストレプトコッカス・ニューモニエの莢膜
ポリマーフラグメントのＣＲＭ197への複合 いくつかのその他細菌は、これらが敗血症および髄膜炎
を引き起こす、特に乳児において引き起すことにおい
て、これらが、それに対する抗体が防御的である莢膜ポ
リマーを有することにおいて、そしてこれらの莢膜ポリ
マーが成熟したヒトにおいては免疫原性であるが乳児に
おいて免疫原性でないことにおいて、ヘモフィルス・イ
ンフルエンザｂと類似している。その重要な一例はスト
レプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｐ）血清型６［Stre
ptococcus pneumoniae（Sp）serotype 6］である。こ
れは上述したような生命を脅かす感染を引き起すのみな
らず、幼児における中耳炎のかなり有力な原因である。
（グレイら，ジャーナル オブ インフェクシャス デ
ィジィーズ，第 142巻、第 923〜 933頁、1980年［Gray
et al., Journal of Infectious Diseases, Volume 14
2, pages923-33,1980］）。
【００６４】ＰＲＰに関して述べられたアプローチがま
た、抗原特異性を維持しつつ、選択的加水分解により還
元基を生成され得る任意の莢膜ポリマーに対して適用可
能である。以下の非限定的実施例においては、莢膜ポリ
マーフラグメントは、選択的酸加水分解によってＳｐ．
６（ストレプトコッカス・ニューモニエ 血清型６）か
ら生成され、そしてＣＲＭ197 へ複合された。該製品は
Ｓｐ莢膜ポリマーおよびＣＲＭ197 成分の双方に関する
抗原特異性を維持していた。
た、抗原特異性を維持しつつ、選択的加水分解により還
元基を生成され得る任意の莢膜ポリマーに対して適用可
能である。以下の非限定的実施例においては、莢膜ポリ
マーフラグメントは、選択的酸加水分解によってＳｐ．
６（ストレプトコッカス・ニューモニエ 血清型６）か
ら生成され、そしてＣＲＭ197 へ複合された。該製品は
Ｓｐ莢膜ポリマーおよびＣＲＭ197 成分の双方に関する
抗原特異性を維持していた。
【００６５】莢膜ポリマー（ＣＰ）からの還元フラグメ
ントの生成 １． Ｓｐ．６のＣＰのサンプル（ダニッシュ タイ
プ６Ａ，イーライ リリー カンパニー［Danish type
6A, Eli Lilly Co. ］）が、Ｄ‐グルコースで標準化さ
れたフェノール‐硫酸法によって全ヘキソースに関し
て、およびＤ‐グルコースでまた標準化されたアルカリ
性ヘキサシアノ鉄（III ）酸塩法によって還元能に関し
て検定された。 ２． パイレックス管が、水０．６６ｍｌで溶解され
たＳｐ．６ＣＰ ３．３mgを与えられた。このサンプル
は０℃に冷やされ、０．１Ｎ ＨＣｌ ０．０７３ｍｌ
が加えられ、そして該管は密封された。 ３． 該管は沸騰水浴中へ１０分間浸され、次に０℃
に再び冷やされた。少量のサンプルがステップ１で述べ
るような還元能に関して検定された。
ントの生成 １． Ｓｐ．６のＣＰのサンプル（ダニッシュ タイ
プ６Ａ，イーライ リリー カンパニー［Danish type
6A, Eli Lilly Co. ］）が、Ｄ‐グルコースで標準化さ
れたフェノール‐硫酸法によって全ヘキソースに関し
て、およびＤ‐グルコースでまた標準化されたアルカリ
性ヘキサシアノ鉄（III ）酸塩法によって還元能に関し
て検定された。 ２． パイレックス管が、水０．６６ｍｌで溶解され
たＳｐ．６ＣＰ ３．３mgを与えられた。このサンプル
は０℃に冷やされ、０．１Ｎ ＨＣｌ ０．０７３ｍｌ
が加えられ、そして該管は密封された。 ３． 該管は沸騰水浴中へ１０分間浸され、次に０℃
に再び冷やされた。少量のサンプルがステップ１で述べ
るような還元能に関して検定された。
【００６６】
ＣＰ 全ヘキソース／
Ｓｐ．６ １００℃で加熱された時間 還元ヘキソース
０分 ＞３５０
１０分 ６．５
４． 加水分解された調製物（検定に用いられた２％
を除く）は凍結乾燥された。乾燥物は、水０．１ｍｌで
溶解され、マイクロ遠心分離管に移され、そして再度凍
結乾燥された。
を除く）は凍結乾燥された。乾燥物は、水０．１ｍｌで
溶解され、マイクロ遠心分離管に移され、そして再度凍
結乾燥された。
【００６７】ＣＲＭ197 への複合
１． 再乾燥された加水分解物に、２Ｍリン酸カリウ
ム緩衝液ｐＨ８の０．００４ｍｌ、および０．０１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７の０．２ｍｌ中に溶解され
たＣＲＭ197 の１mgが加えられた。得られた混合物は、
凍結乾燥され、そして水０．０５ｍｌで再懸濁された
（見積り全容量０．０６３ｍｌ）。 ２． 該管に、２００mg／ｍｌナトリウムシアノボロ
ハイドライド０．００７ｍｌが加えられ、そして該調製
物は３７℃で１８日間インキュベートされた。 ３． ８０％飽和硫酸アンモニウム（ＳＡＳ）０．６
ｍｌが添加された。 ４． 該管は０℃で１時間インキュベートされ、そし
て８０００Ｇで１５分間遠心分離された。上澄み液が除
去された。 ５． 沈澱物は、０．０１Ｍリン酸ナトリウムでｐＨ
８に緩衝された８０％ＳＡＳ０．６ｍｌ中への懸濁、お
よびこれに続く８０００Ｇで１５分間の遠心分離によっ
て洗浄された。 ６． 沈澱物は０．５Ｍ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ０．０２
ｍｌおよび９．５Ｍ尿素０．２ｍｌで懸濁された。 ７． ＳＡＳ１ｍｌが加えられ、沈澱物がステップ４
と同様にして単離されそしてステップ６と同様にして約
８Ｍで尿素中に懸濁された。 ８． 懸濁液は８０００Ｇで１５分間遠心分離され
た。 ９． 上澄み液は分離されそして０．０１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液ｐＨ７に対して４℃で透析された。 １０． ＣＲＭ197 ‐Ｓｐ．６と呼称される、この透析
された調製物は以下に関して、検定された。 −フォリン フェノール反応によりタンパク質 −放射線標識されたＳｐ ＣＰへの抗体の結合の阻止に
よりＳｐ抗原性（第３表においてＰＲＰに関して述べた
ものと同様） −ジフテリアトキソイド（ＤＴ）への抗体結合の阻止に
よりＣＲＭ197 抗原性（ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐Ｓ♯２の
記載のステップｏにおいて述べたものと同様）、ならび
に −ジフテリアトキソイド（ＤＴ）への抗体結合の阻止に
より抗ＣＰ免疫原性に関して（ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐Ｓ
♯２の記載のステップｐにおいて述べたものと同様）。
第７表を参照のこと。
ム緩衝液ｐＨ８の０．００４ｍｌ、および０．０１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７の０．２ｍｌ中に溶解され
たＣＲＭ197 の１mgが加えられた。得られた混合物は、
凍結乾燥され、そして水０．０５ｍｌで再懸濁された
（見積り全容量０．０６３ｍｌ）。 ２． 該管に、２００mg／ｍｌナトリウムシアノボロ
ハイドライド０．００７ｍｌが加えられ、そして該調製
物は３７℃で１８日間インキュベートされた。 ３． ８０％飽和硫酸アンモニウム（ＳＡＳ）０．６
ｍｌが添加された。 ４． 該管は０℃で１時間インキュベートされ、そし
て８０００Ｇで１５分間遠心分離された。上澄み液が除
去された。 ５． 沈澱物は、０．０１Ｍリン酸ナトリウムでｐＨ
８に緩衝された８０％ＳＡＳ０．６ｍｌ中への懸濁、お
よびこれに続く８０００Ｇで１５分間の遠心分離によっ
て洗浄された。 ６． 沈澱物は０．５Ｍ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ０．０２
ｍｌおよび９．５Ｍ尿素０．２ｍｌで懸濁された。 ７． ＳＡＳ１ｍｌが加えられ、沈澱物がステップ４
と同様にして単離されそしてステップ６と同様にして約
８Ｍで尿素中に懸濁された。 ８． 懸濁液は８０００Ｇで１５分間遠心分離され
た。 ９． 上澄み液は分離されそして０．０１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液ｐＨ７に対して４℃で透析された。 １０． ＣＲＭ197 ‐Ｓｐ．６と呼称される、この透析
された調製物は以下に関して、検定された。 −フォリン フェノール反応によりタンパク質 −放射線標識されたＳｐ ＣＰへの抗体の結合の阻止に
よりＳｐ抗原性（第３表においてＰＲＰに関して述べた
ものと同様） −ジフテリアトキソイド（ＤＴ）への抗体結合の阻止に
よりＣＲＭ197 抗原性（ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐Ｓ♯２の
記載のステップｏにおいて述べたものと同様）、ならび
に −ジフテリアトキソイド（ＤＴ）への抗体結合の阻止に
より抗ＣＰ免疫原性に関して（ＣＲＭ197 ‐ＰＲＰ‐Ｓ
♯２の記載のステップｐにおいて述べたものと同様）。
第７表を参照のこと。
【００６８】
ngＣＰ当量／ μｇＤＴ当量／
調 製 物 μｇタンパク質 μｇタンパク質
ＣＲＭ197 ‐Ｓｐ．６ ０．４ ０．３６
第 １０ 表
対照およびＣＲＭ197 と
ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型６
フラグメントとの複合体による離乳ウサギの抗ＣＰ免疫原性応答
年齢でのサンプルにおいて結合した
14Ｃ‐ＣＰのパーセント** ウサギ
予防接種物* ６週齢 ８週齢 10週齢 11週齢
１ Sp6 CP, 25μg ６ ６ ７ ７
２ 〃 ６ １３ １３ １１
３ Sp6 細菌, 25μg ４ １０ １２ １６
４ 〃 ８ １２ ２２ ２１
５ CRM 197 ‐Sp6,25μg ４ ６ ３０ ４９ ６ 〃
４ ８ ３０ ５４ *
血清サンプルを採取する直前に皮下的に注射された。血清サンプルは第６，８
および１０週齢で採取された。 **血清２５μｌが14Ｃ‐標識化Ｃｐ ２ｎＣｉとインキュベートされた。
１０．実施例：ＣＲＭ197に対する酸化開裂により産生
するＰＲＰフラグメントの複合 本実施例では、最終複合体は、２成分よりなる。すなわ
ち、非毒性の免疫原性ジフテリア毒素ＣＲＭ197に共有
結合してよく定義された鎖長のＰＲＰのフラグメント類
である。本実施例では、過ヨウ素酸塩酸化および限外濾
過による単離の条件は莢膜ポリマー（ＰＲＰ）フラグメ
ント類の鎖長をコントロールする。
するＰＲＰフラグメントの複合 本実施例では、最終複合体は、２成分よりなる。すなわ
ち、非毒性の免疫原性ジフテリア毒素ＣＲＭ197に共有
結合してよく定義された鎖長のＰＲＰのフラグメント類
である。本実施例では、過ヨウ素酸塩酸化および限外濾
過による単離の条件は莢膜ポリマー（ＰＲＰ）フラグメ
ント類の鎖長をコントロールする。
【００６９】複合体は、フラグメントの両端にアルデヒ
ド基を有する莢膜ポリマーフラグメントより構成され
る。かくして、各フラグメントは、両端において、恐ら
くＣＲＭのリジン残基においてＣＲＭと共有結合し得
る。かくして、産生物の構造は、「格子」と考えられ
る。複合体の組成および恐らく構造は、複合の化学反応
において２成分の濃度を変えることにより変えることが
できる。
ド基を有する莢膜ポリマーフラグメントより構成され
る。かくして、各フラグメントは、両端において、恐ら
くＣＲＭのリジン残基においてＣＲＭと共有結合し得
る。かくして、産生物の構造は、「格子」と考えられ
る。複合体の組成および恐らく構造は、複合の化学反応
において２成分の濃度を変えることにより変えることが
できる。
【００７０】ＰＲＰ‐ＣＲＭ複合体ワクチン用のＰＲＰ
フラグメント産生するために使用されるＰＲＰは、つぎ
の仕様を有している。 タンパク質含量 ＜１．０％ 核酸含量 ≦１．０％ エンドトキシン（ＬＡＬ） ＜１．０EU/ μg PRP 分子サイズ（Ｋｄ） ＜0.3(セファロースCL-48) ＜0.6(セファロースCL-28)ＰＲＰフラグメントの産生方法 ａ． ＰＲＰ（５〜７ｍｇ／ｍｌ）の溶液を４℃に冷
却しかつ２Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し
て最終濃度を０．２Ｍのリン酸塩とした。 ｂ． メタ過ヨウ素酸ナトリウム（０．２〜０．３モ
ルＩＯ4 ／モル ＰＲＰ）を急速に混合しながら添加
し、この溶液を暗所にて一夜４℃でインキュベートし
た。 ｃ． 反応溶液をＨ１Ｐ30中空糸（アミコン，３０，
０００Mwカットオフ）を用いて限外濾過した。保持物を
２５０ｍｌの食塩水で４回洗浄した。濾液を合わせ、Ｈ
１Ｐ10中空糸（アミコン，１０，０００Mwカットオフ）
を用いて限外濾過した。保持物を２５０ｍｌの食塩水で
４回洗浄した。ついで保持物をｍｌ当りＰＲＰ３５ｍｇ
以上に濃縮した。 ｄ． 保持物をオルシノール検定によりリボースを、
またアルカリ性フェリシアン化物検定により還元性基を
分析した。少量の保持物を、溶出液として０．１５Ｍの
食塩水を用いかつオルシノールおよびアルカリ性フェリ
シアン化物検定による画分のそれぞれを分析することに
よりバイオゲル（Biogel) Ｐ−１００カラム（０．７×
２５ｃｍ）上で分析した。分析結果は、保持物質が重量
平均ＤＰ約２０でＤＰ１５〜３０を有する多糖類よりな
ることを示した。
フラグメント産生するために使用されるＰＲＰは、つぎ
の仕様を有している。 タンパク質含量 ＜１．０％ 核酸含量 ≦１．０％ エンドトキシン（ＬＡＬ） ＜１．０EU/ μg PRP 分子サイズ（Ｋｄ） ＜0.3(セファロースCL-48) ＜0.6(セファロースCL-28)ＰＲＰフラグメントの産生方法 ａ． ＰＲＰ（５〜７ｍｇ／ｍｌ）の溶液を４℃に冷
却しかつ２Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し
て最終濃度を０．２Ｍのリン酸塩とした。 ｂ． メタ過ヨウ素酸ナトリウム（０．２〜０．３モ
ルＩＯ4 ／モル ＰＲＰ）を急速に混合しながら添加
し、この溶液を暗所にて一夜４℃でインキュベートし
た。 ｃ． 反応溶液をＨ１Ｐ30中空糸（アミコン，３０，
０００Mwカットオフ）を用いて限外濾過した。保持物を
２５０ｍｌの食塩水で４回洗浄した。濾液を合わせ、Ｈ
１Ｐ10中空糸（アミコン，１０，０００Mwカットオフ）
を用いて限外濾過した。保持物を２５０ｍｌの食塩水で
４回洗浄した。ついで保持物をｍｌ当りＰＲＰ３５ｍｇ
以上に濃縮した。 ｄ． 保持物をオルシノール検定によりリボースを、
またアルカリ性フェリシアン化物検定により還元性基を
分析した。少量の保持物を、溶出液として０．１５Ｍの
食塩水を用いかつオルシノールおよびアルカリ性フェリ
シアン化物検定による画分のそれぞれを分析することに
よりバイオゲル（Biogel) Ｐ−１００カラム（０．７×
２５ｃｍ）上で分析した。分析結果は、保持物質が重量
平均ＤＰ約２０でＤＰ１５〜３０を有する多糖類よりな
ることを示した。
【００７１】酸化開裂よりつくられた莢膜ポリマーフラ
グメントについては、鎖長（ＤＰ）は（リボース単位／
還元基）×２として定義される。過ヨウ素酸で酸化され
たＰＲＰの二つのバッチは、ｄ項と同様に分画され、か
つ下記のように特徴づけられる。 糖 鎖 長 画分番号 画分のDP 合計% バッチ#2 バッチ#3 バッチ#2 バッチ#3 14 36.5 41.0 12.7 5.9 15 24.1 32.5 11.0 9.4 16 25.3 24.5 13.2 11.8 17 25.4 22.8 14.4 14.3 18 23.2 20.2 13.6 14.6 19 20.2 19.0 11.9 14.2 20 20.4 17.7 9.3 12.4 21 16.1 16.0 6.7 10.0 22 11.7 12.3 7.2 7.1 ＣＲＭ−ＰＲＰ複合 ａ． ＣＲＭタンパク質を、０．２Ｍのリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、最終濃度１００ｍ
ｇ/ ｍｌとした。 ｂ． 凍結乾燥したオリゴ糖類を蒸留水中で再構成
し、適量（平均ＤＰ２０）をＣＲＭタンパク質に添加
し、かつ溶液を混合した。 ｃ． ナトリウムシアノボロハイドライド（０．５ｇ
／ｍｌ）（１０×モル過剰）を添加し、溶液を混合し、
３７℃で３日間インキュベートした。 ｄ． ナトリウムボロハイドライド（１００×還元
基）を添加し、かつこの溶液を室温で２時間放置した。 ｅ． 複合体を１０倍の６Ｍの尿素で希釈して沈澱を
溶解し、この溶液をＹＭ−３０（３０，０００Mwカット
オフ）膜を有するアミコン攪拌セルを用いて限外濾過し
た。 ｆ． 溶液を滅菌食塩水を用いて濾液がペントースお
よびシアン化物イオンが陰性になるまで繰返し限外濾過
した。
グメントについては、鎖長（ＤＰ）は（リボース単位／
還元基）×２として定義される。過ヨウ素酸で酸化され
たＰＲＰの二つのバッチは、ｄ項と同様に分画され、か
つ下記のように特徴づけられる。 糖 鎖 長 画分番号 画分のDP 合計% バッチ#2 バッチ#3 バッチ#2 バッチ#3 14 36.5 41.0 12.7 5.9 15 24.1 32.5 11.0 9.4 16 25.3 24.5 13.2 11.8 17 25.4 22.8 14.4 14.3 18 23.2 20.2 13.6 14.6 19 20.2 19.0 11.9 14.2 20 20.4 17.7 9.3 12.4 21 16.1 16.0 6.7 10.0 22 11.7 12.3 7.2 7.1 ＣＲＭ−ＰＲＰ複合 ａ． ＣＲＭタンパク質を、０．２Ｍのリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、最終濃度１００ｍ
ｇ/ ｍｌとした。 ｂ． 凍結乾燥したオリゴ糖類を蒸留水中で再構成
し、適量（平均ＤＰ２０）をＣＲＭタンパク質に添加
し、かつ溶液を混合した。 ｃ． ナトリウムシアノボロハイドライド（０．５ｇ
／ｍｌ）（１０×モル過剰）を添加し、溶液を混合し、
３７℃で３日間インキュベートした。 ｄ． ナトリウムボロハイドライド（１００×還元
基）を添加し、かつこの溶液を室温で２時間放置した。 ｅ． 複合体を１０倍の６Ｍの尿素で希釈して沈澱を
溶解し、この溶液をＹＭ−３０（３０，０００Mwカット
オフ）膜を有するアミコン攪拌セルを用いて限外濾過し
た。 ｆ． 溶液を滅菌食塩水を用いて濾液がペントースお
よびシアン化物イオンが陰性になるまで繰返し限外濾過
した。
【００７２】最終複合体の性質
第１１表は、酸化されたＰＲＰの種々のバッチからのＰ
ＲＰ−ＣＲＭ197 および種々の複合物から得られるロッ
トの種々の性質を表わす。 第 １１ 表 ＣＲＭ−ＰＲＰ複合体の生産物 反応混合物中の 最終複合体中の Kd * PRP PRP/CRM比 PRP/CRM 比 (セファロース ワクチンロット番号 糖類のバッチ （μg/ug) （μg/ug) CL-4B) 5 2番 1.0 0.25 0.27 6 2番 2.0 0.62 0.31 7 3番 1.0 0.38 0.36 8 3番 2.0 0.57 0.44 9 6番 1.0 0.60 0.48 10 6番 2.0 0.42 0.48 11 7番 1.0 0.27 0.30 12 7番 2.0 0.42 0.48 * ５０％の物質（タンパク質）が溶出するときのＫd ボトリング ａ． ＣＲＭ−ＰＲＰ複合体を０．８ミクロンついで
０．２２ミクロンのフィルターを用いて滅菌濾過して秤
量した滅菌容器に移した。 ｂ． 試料を無菌的に除去し、ローリー検定によりタ
ンパク質を分析した。 ｃ． 濾過した物質の容量を容器を秤量することによ
り測定し、最終容量を計算したところ、ｍｌ当たり５０
μｇのタンパク質が得られた。 ｄ． 滅菌食塩水中の１％チメロサル（Thimerosal)
の量を０．２２ミクロンの滅菌フィルターを通じて添加
し、最終溶液中の０．０１％のチメサロールを得た。 ｅ． ワクチンを０．２２ミクロンのフィルターを通
じて濾過した滅菌食塩水で最終容量にした。 ｆ． 溶液を混合し、かつ５．５ｍｌを、（ブチルグ
レイゴム，Wheator ）で密栓し、密閉して２〜８℃で貯
蔵した滅菌して発熱物質のない１０ｍｌのガラスビンに
移した。
ＲＰ−ＣＲＭ197 および種々の複合物から得られるロッ
トの種々の性質を表わす。 第 １１ 表 ＣＲＭ−ＰＲＰ複合体の生産物 反応混合物中の 最終複合体中の Kd * PRP PRP/CRM比 PRP/CRM 比 (セファロース ワクチンロット番号 糖類のバッチ （μg/ug) （μg/ug) CL-4B) 5 2番 1.0 0.25 0.27 6 2番 2.0 0.62 0.31 7 3番 1.0 0.38 0.36 8 3番 2.0 0.57 0.44 9 6番 1.0 0.60 0.48 10 6番 2.0 0.42 0.48 11 7番 1.0 0.27 0.30 12 7番 2.0 0.42 0.48 * ５０％の物質（タンパク質）が溶出するときのＫd ボトリング ａ． ＣＲＭ−ＰＲＰ複合体を０．８ミクロンついで
０．２２ミクロンのフィルターを用いて滅菌濾過して秤
量した滅菌容器に移した。 ｂ． 試料を無菌的に除去し、ローリー検定によりタ
ンパク質を分析した。 ｃ． 濾過した物質の容量を容器を秤量することによ
り測定し、最終容量を計算したところ、ｍｌ当たり５０
μｇのタンパク質が得られた。 ｄ． 滅菌食塩水中の１％チメロサル（Thimerosal)
の量を０．２２ミクロンの滅菌フィルターを通じて添加
し、最終溶液中の０．０１％のチメサロールを得た。 ｅ． ワクチンを０．２２ミクロンのフィルターを通
じて濾過した滅菌食塩水で最終容量にした。 ｆ． 溶液を混合し、かつ５．５ｍｌを、（ブチルグ
レイゴム，Wheator ）で密栓し、密閉して２〜８℃で貯
蔵した滅菌して発熱物質のない１０ｍｌのガラスビンに
移した。
【００７３】
最終投薬配合例*
ワクチンロット タンパク質 ＰＲＰ 番 号
（μg/ｍｌ) (μg/ｍｌ) Kd **
5 50 12.5 0.27
6 50 31.0 0.31
7 50 19.0 0.36
8 50 28.5 0.44
9 50 30.0 0.48
10 50 21.0 0.48
11 50 13.5 0.30
12 50 21.0 0.48 *
配合例は全て０．９％ ＮａＣｌおよび０．０１％の
チメロサル内で調製した。**
50% の物質（タンパク質）が溶出するときのＫd 試験管内抗原性試験
ＰＢＳ０．０５％トウィーン中のワクチンの一連の希釈
物を、ジフテリアトキソイドで予め被覆したマイクロタ
イマープレートのウェルに２個ずつ添加した。ついで、
プールされた高力価のポリクローナルヒトジフテリア抗
毒素血清またはヒトポリクローナル抗ＰＲＰ血清をウェ
ルに添加し、このプレートを２０℃で２４時間インキュ
ベートした。抗体結合を、酵素で標識した抗ヒト免疫グ
ロブリンでウェルのインキュベーションし、さらに酵素
基質とともに６０分間インキュベーションして、光学密
度を定量することにより測定した。結果を第１２表に示
す。
物を、ジフテリアトキソイドで予め被覆したマイクロタ
イマープレートのウェルに２個ずつ添加した。ついで、
プールされた高力価のポリクローナルヒトジフテリア抗
毒素血清またはヒトポリクローナル抗ＰＲＰ血清をウェ
ルに添加し、このプレートを２０℃で２４時間インキュ
ベートした。抗体結合を、酵素で標識した抗ヒト免疫グ
ロブリンでウェルのインキュベーションし、さらに酵素
基質とともに６０分間インキュベーションして、光学密
度を定量することにより測定した。結果を第１２表に示
す。
【００７４】
* マサチューセッツ・パブリック・ヘルス・バイオロジ
ック・ラボラトリーズから提供されたジフテリアトキソ
イド，ロットＤcp２７ 第１２表のデータは、ワクチンの種々のロットが試験管
内抗原性を保有することを示している。すなわち、これ
らはＰＲＰおよびジフテリアトキソイドに対するポリク
ローナル抗体と競合する。このデータはまた、ＰＲＰ抗
原が比較的露出しており、一方、ジフテリアトキソイド
エピトープはあまり露出しておらず、また変わりやすく
露出していることを示す。動物における免疫原性 ａ． ウサギ 第１３表は、２５μｇのワクチンで０，１および２週間
で若いウサギにワクチン投与した三つの実験を示す。全
てのワクチンは、免疫原性でありかつＥＬＩＳＡ検定に
より測定されたようにブースター可能な抗ＰＲＰ応答を
与えることを示す。適度な抗ＰＲＰ応答が２５μｇの複
合体ワクチンの１回の注射後でもみられた。 ｂ． マウス 若いスイスウェブスターマウスのワクチン投与により得
られた結果は、再びブースター可能な抗ＰＲＰ応答（デ
ータは示さず）を示した。
ック・ラボラトリーズから提供されたジフテリアトキソ
イド，ロットＤcp２７ 第１２表のデータは、ワクチンの種々のロットが試験管
内抗原性を保有することを示している。すなわち、これ
らはＰＲＰおよびジフテリアトキソイドに対するポリク
ローナル抗体と競合する。このデータはまた、ＰＲＰ抗
原が比較的露出しており、一方、ジフテリアトキソイド
エピトープはあまり露出しておらず、また変わりやすく
露出していることを示す。動物における免疫原性 ａ． ウサギ 第１３表は、２５μｇのワクチンで０，１および２週間
で若いウサギにワクチン投与した三つの実験を示す。全
てのワクチンは、免疫原性でありかつＥＬＩＳＡ検定に
より測定されたようにブースター可能な抗ＰＲＰ応答を
与えることを示す。適度な抗ＰＲＰ応答が２５μｇの複
合体ワクチンの１回の注射後でもみられた。 ｂ． マウス 若いスイスウェブスターマウスのワクチン投与により得
られた結果は、再びブースター可能な抗ＰＲＰ応答（デ
ータは示さず）を示した。
【００７５】
第 １３ 表
ＰＲＰ−ＣＲＭ複合体の種々のロットに対する
離乳ウサギにおける抗ＰＲＰ応答
０週間 １週間 ３週間
ワクチンロット μｇ/ ｍｌ μｇ/ ｍｌ μｇ/ ｍｌ 番 号
（GMT) （GMT) (GMT)
5 0.1 0.23 7.56
6 0.1 0.38 2.86
7 0.2 0.86 9.70
8 0.1 0.87 7.61
9 0.1 0.36 3.88
10 0.1 0.92 1.84
11 0.1 0.21 5.01
12 0.1 0.31 2.33ヒト幼児における免疫原性
幼児被験者は健康であり、かつヒブ（Ｈｉｂ）ワクチン
によるさきの免疫は有しておらずまたワクチンに対する
重大な副反応の既応も有していなかった。第１４表（そ
れぞれ１８，７および２ヶ月）に示す齢の始めに、これ
らを採血し、ＰＲＰ−ＣＲＭ複合体の２５μｇの皮下第
１注射を与え、少なくとも２０分間観察し、かつ観察の
ためにその両親にわたし、可能な局部的および全身的副
反応を記録した。
によるさきの免疫は有しておらずまたワクチンに対する
重大な副反応の既応も有していなかった。第１４表（そ
れぞれ１８，７および２ヶ月）に示す齢の始めに、これ
らを採血し、ＰＲＰ−ＣＲＭ複合体の２５μｇの皮下第
１注射を与え、少なくとも２０分間観察し、かつ観察の
ためにその両親にわたし、可能な局部的および全身的副
反応を記録した。
【００７６】７ケ月および２ケ月のグループについて
は、第１４表に示す時間の経過後に、同一ワクチンによ
る第２免疫化のためにこの方法を繰返した。さらに時間
が経過したのち（第１４表参照）これらは再び第２応答
測定のために採血された。第１４表からわかるように、
単一注射は、１８ケ月および７ケ月齢のグループにおけ
る抗体増加に有効であり、一方、２ケ月齢の幼児では
（母方のＩｇＧ抗体の減少が期待されているにもかかわ
らず）抗体の適度の増加が観察された。全ての幼児で、
抗ＰＲＰ抗体の適当なレベルが第２免疫化後１〜２ケ月
で観察された。２回の免疫化後の６ケ月齢の幼児におい
て観察された応答は、抗体の保護レベルを誘発するに充
分であった。
は、第１４表に示す時間の経過後に、同一ワクチンによ
る第２免疫化のためにこの方法を繰返した。さらに時間
が経過したのち（第１４表参照）これらは再び第２応答
測定のために採血された。第１４表からわかるように、
単一注射は、１８ケ月および７ケ月齢のグループにおけ
る抗体増加に有効であり、一方、２ケ月齢の幼児では
（母方のＩｇＧ抗体の減少が期待されているにもかかわ
らず）抗体の適度の増加が観察された。全ての幼児で、
抗ＰＲＰ抗体の適当なレベルが第２免疫化後１〜２ケ月
で観察された。２回の免疫化後の６ケ月齢の幼児におい
て観察された応答は、抗体の保護レベルを誘発するに充
分であった。
【００７７】
第 １４ 表
２５μｇのワクチンに対する抗ＰＲＰ抗体応答
ワクチン 小児の 抗 体 μｇ／ｍｌ* 投与齢(月) 数 前 １回後 ２回後
18-23 84 0.40 1ケ月 6.53
7-15 88 0.15 1〜2ケ月 4.54 1〜2ケ月 18.9
2-6 30 0.17 2ケ月 0.25 2ケ月 1.23*
幾何平均力価
１１．実施例：ジフテリアトキソイドに対する過ヨウ素
酸塩で酸化された肺炎球菌多糖類のカップリング 第１５表は、過ヨウ素酸塩で酸化された型の肺炎球菌多
糖類がジフテリアトキソイドにカップリングされている
種々の実験の概略を示す。この表に示された型の肺炎球
菌莢膜多糖類（ＰｎＰＳ）は、表示された量の過ヨウ素
酸ナトリウムと３７℃で９０分間反応させ、ついでセン
トリコン−１０（Centricon-10) 限外濾過装置（アミコ
ン）で濾過することにより回収された。
酸塩で酸化された肺炎球菌多糖類のカップリング 第１５表は、過ヨウ素酸塩で酸化された型の肺炎球菌多
糖類がジフテリアトキソイドにカップリングされている
種々の実験の概略を示す。この表に示された型の肺炎球
菌莢膜多糖類（ＰｎＰＳ）は、表示された量の過ヨウ素
酸ナトリウムと３７℃で９０分間反応させ、ついでセン
トリコン−１０（Centricon-10) 限外濾過装置（アミコ
ン）で濾過することにより回収された。
【００７８】酸化されたＰＳは、全容量０．７５ｍｌ中
の４ｍｇの精製トキソイドロットＤcp２７および１０ｍ
ｇのＮａＣＮＢＨ3 ３７℃でｐＨ８で３日間反応させ
た。タンパク質画分を沈澱により回収し、９０％の飽和
硫酸アンモニウムで洗浄した。ＰｎＰＳ抗原当量は、Ｐ
ｎＰＳおよび14Ｃ標識ＰｎＰｓに対するヒト血清を用い
て放射性抗原結合阻害により検定した。
の４ｍｇの精製トキソイドロットＤcp２７および１０ｍ
ｇのＮａＣＮＢＨ3 ３７℃でｐＨ８で３日間反応させ
た。タンパク質画分を沈澱により回収し、９０％の飽和
硫酸アンモニウムで洗浄した。ＰｎＰＳ抗原当量は、Ｐ
ｎＰＳおよび14Ｃ標識ＰｎＰｓに対するヒト血清を用い
て放射性抗原結合阻害により検定した。
【００７９】
第 １５ 表
還元アミノ化によるジフテリアトキソイドに
対する過ヨウ素酸塩で酸化された肺炎球菌
多糖類（ＰｎＰＳ）のカップリング
PnPS 10ｍｇPSと反応するIO4 カップリング反応後のタンパク質画分
タイプ μmol において回収されたPnPS抗原活性
(μｇPS/ μｇタンパク質)
3 50 0.1
6A 4 0.2
12 4 0.1
14 6 0.1
23 4 0.1
ある具体例に対する特定のものについて本発明を記述し
たので、本発明の理解後には本発明が関連する当業者に
とっては、種々の変更ないし変性は添付の請求の範囲に
より定義されているような本発明の精神および範囲を逸
脱しない限りなされ得る。
たので、本発明の理解後には本発明が関連する当業者に
とっては、種々の変更ないし変性は添付の請求の範囲に
より定義されているような本発明の精神および範囲を逸
脱しない限りなされ得る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 39/102 Ａ６１Ｋ 39/102
39/104 39/104
39/108 39/108
(56)参考文献 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．127，Ｎｏ.
３（1981）ｐｐ．1011−1018
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．細菌性病原体の莢膜ポリマーを酸、塩基または酵素
で処理すること、および酸化剤で処理してカルボニル基
を生成させることからなる、架橋された免疫原性複合体
の製造において使用するのに適した、少なくとも２個の
カルボニル基を有する莢膜ポリマーフラグメントの製造
方法。免疫原性複合体
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|---|---|---|---|
| US859975 | 1986-05-05 | ||
| US06/859,975 US4902506A (en) | 1983-07-05 | 1986-05-05 | Immunogenic conjugates |
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| JP2736248B2 true JP2736248B2 (ja) | 1998-04-02 |
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|---|---|---|---|
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| JP8022882A Expired - Lifetime JP2736248B2 (ja) | 1986-05-05 | 1996-02-08 | 莢膜ポリマーフラグメントの製造方法 |
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