DE3785033T2

DE3785033T2 - Verfahren zum Erhalten von immunregulierenden Faktoren mittels Säugetierimmunisierung.

Info

Publication number: DE3785033T2
Application number: DE87306455T
Authority: DE
Inventors: Lee R Beck
Original assignee: Stolle Research and Development Corp
Current assignee: Stolle Research and Development Corp
Priority date: 1987-07-21
Filing date: 1987-07-21
Publication date: 1993-10-07
Anticipated expiration: 2007-07-22
Also published as: EP0300102B1; HK112493A; EP0300102A1; AU605159B2; DE3785033D1; AU7608687A; ATE87215T1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immunisierung von Säugetieren mittels Impfung mit Antigensubstanzen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Impfung von Tieren aus der Familie der Bovidae in einer Weise, daß größere Antikörpertiter- und Lymphokinspiegel als durch herkömmliche Impfverfahren erreicht werden können.
Durch neuere Untersuchungen wurde gefunden, daß Milch, die einem Tier aus der Familie der Bovidae, wie einer Kuh, das mit einem Spektrum an bakteriellen Antigenen behandelt worden ist, entnommen wurde, nützlich bei der Schwächung oder Beseitigung einiger krankheitserregender Zustände ist, wenn sie von einem Empfänger aufgenommen wird. Aufgrund der großen Antikörpertiter- oder Lymphokinspiegel der Milch, erhöht ein Subjekt, das die Milch oder ein aus der Milch abgeleitetes Produkt aufnimmt, die Antikörper- oder Lymphokinzahl seines eigenen Systems, wodurch es in der Lage ist, einem gegebenen krankheitserregenden Zustand (Zuständen), gegenüber dem die gegebenen immunregulierenden Faktoren wirksam sind, wirkungsvoller zu widerstehen und ihn zu besiegen.
Zum Beispiel beschreiben die US-A-4.284.623 und EP-A- 0064103 ein Verfahren zur Behandlung einer Entzündung in einem Empfänger, indem der Empfänger, der ein Entzündungsleiden zeigt, Milch oder ein davon abgeleitetes Produkt aufnimmt, das von einem Tier aus der Familie der Bovidae (sog. Bovid), wie einer Kuh, erhalten wurde, das mit einem Spektrum an Antigenen geimpft worden ist. Die Antigene können eine beliebige Kombination aus bakteriellen, viralen oder zellulären Antigenen sein, wobei der einzig wesentliche einschränkende Faktor darin besteht, daß das geimpfte Bovid in der Lage sein muß, der Reizung mit Antigen durch Aufweisen eines Zustands der Immunempfindlichkeit zu antworten. Dieser Zustand der Immunempfindlichkeit wird durch einen hohen Antientzündungsfaktor oder Antikörperfaktor in der von dem Tier erhaltenen Milch widergespiegelt. Der Antientzündungsfaktor oder immunregulierende Faktor ist ein Produkt des sensibilisierten Lymphozyten, allgemeiner als ein Lymphokin bezeichnet. Die auf diese Art erhaltene Milch ist in der Lage, eine Entzündung in einem Subjekt abzuschwächen, das die Milch oder ein von der Milch abgeleitetes Produkt aufnimmt.
Die US-A-4.324.782 beschreibt ein anderes Beispiel der therapeutischen Wirksamkeit einer Antikörper enthaltenden Milch eines Bovids. Kühe, die mit einem oder mehreren Arten von Streptococcus mutans-Antigen immunisiert wurden, produzieren eine Antikörper enthaltende Milch, die, wenn sie von einem Empfänger aufgenommen wird, den Empfänger mit Antikörper versorgt, die gegen das Wachstum von S. mutans- Bakterien in der Mundhöhle wirksam sind, wodurch sie bei der Vorbeugung gegen Karies hilft.
Andere frühere Verfahren auf diesem Gebiet der Technik sind für die Erzeugung von Milch bekannt, die eine Vielzahl therapeutischer Effekte aufweist. Heinbach, hat in der US-A- 3.1 28.230 eine Milch beschrieben, die durch die Impfung einer Kuh mit Antigenmischungen Bestandteile aus α-, β- und γ- Globulinen enthielt. Petersen (US-A-3.376.198 und CA-A- 587.849), Holm, U.S. Anmeldung (veröffentlicht) Seriennummer 628.987 und Tunnak et al, GB-A-1.211.876 haben ebenfalls Antikörper enthaltende Milch beschrieben.
Die WO-A-8503635 beschreibt die Immunisierung eines Säugetiers durch Implantation eines antigentragenden Substrates, bevorzugt in die Bauchhöhle. Das antigentragende Substrat wird durch Lösen eines Antigens in einem entsprechenden Lösungsmittel und Imprägnieren eines porösen, biologisch-verträglichen Substrates, insbesondere Nitrocellulose, mit der entstehenden Lösung hergestellt.
Alle der vorstehenden bekannten Verfahren zur Erlangung einer Antikörper enthaltenden Milch sind als durch Standardimmunisierungsverfahren, die fachkundigen Veterinären wohlbekannt sind, gewinnbare beschrieben. Üblicherweise wird ein Tier aus der Familie der Bovidae durch eine Anfangsinjektion mit einem Antigen enthaltenden Fluid immunisiert, wobei der Anfangsinjektion in bestimmten Zeitabständen Verstärkungsinjektionen folgen, um den Antikörpertiter des Bovids auf einen Immunzustand anzuheben. Wenn das Tier nach einer ersten Serie von Verstärkungsinjektionen sich in keinem ausreichenden Immunzustand befindet, muß das Tier mit einer zweiten Serie von Injektionen geimpft werden, um den gewünschten Immunitätsspiegel zu erreichen.
Angesichts der Probleme, die mit der Impfung eines Tieres aus der Familie der Bovidae zum Erhalt eines Antikörpertiterspiegels, der den gewünschten Zwecken entspricht, in Bezug auf die Häufigkeit der Impfung und des erreichbaren Titerspiegels verknüpft sind, existiert ein fortgesetztes Bedürfnis nach einem Verfahren, durch das hohe Antikörper- und/oder Lymphokinspiegel in einem Tier aus der Familie der Bovidae zur Erlangung der gewünschten Titerspiegel mit minimalen Injektionen mit Antigenmaterial erreicht werden können.
Dementsprechend ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Erlangung eines Immunzustandes in einem Säugetier, insbesondere einem Tier aus der Familie der Bovidae, mit weniger Impfungen mit einer gegebenen Antigensubstanz(en) zur Verfügung zu stellen, als in den herkömmlichen Immunisierungsverfahren erforderlich sind.
Ein andere Aufgabe der Erfindung ist es ein Verfahren zur Erzeugung von Antikörper- und Lymphokinfaktoren in der Milch zur Verfügung zu stellen.
Kurz, diese Aufgabe und andere Aufgaben der Erfindung, wie sie nachstehend leichter klar werden, können durch ein Verfahren erreicht werden, das ein Säugetier durch die Verabreichung einer Menge an Antigensubstanz (nachstehend als "Antigen" bezeichnet), die ausreicht um eine Immunisierungsantwort hervorzurufen, in einen immunisierten Zustand versetzt, wobei die Antigensubstanz in Form von Mikroteilchen aus einem bioverträglichen Matrixmaterials verabreicht wird. In einer alternativen Ausführungsform des Verfahrens wird der immunisierte Zustand schneller durch gleichzeitige Verabreichung der Mikroteilchen an das Säugetier und Impfung des Säugetiers mit flüssigem Antigen erreicht.
Ein besseres Verständnis der Erfindung und vieler der mit ihr verbundenen Vorteile ergibt sich ohne weiteres aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung, in Verbindung mit der beigefügten Zeichnung.
Die Zeichnung ist ein Diagramm, in der optische Dichte und IgG-Titerspiegel als Funktion der Zeit für Rinder, die gegen das S-100-Spektrum bakterieller Antigene immunisiert wurden, aufgetragen sind.
Der Kern der Erfindung besteht in der Entdeckung, daß, wenn in ein Säugetier Mikroteilchen, die mindestens ein Antigen enthalten, implantiert werden, eine Immunisierungsreaktion mit nicht mehr als nur einer Behandlung mit Mikroteilchen erreicht werden kann. Ein zusätzlicher und unerwarteter Aspekt der Erfindung besteht darin, daß bei der Verwendung von Mikroteilchen größere Antikörpertiter- und Lymphokinspiegel erreicht werden können, als sie üblicherweise durch die herkömmlichen Impf- oder Injektionsverfahren erreicht werden.
Jedes Tier kann durch das erfindungsgemäße Verfahren mit einem Antigen behandelt werden. Eine bevorzugte Gruppe von Säugetieren sind die Tiere aus der Familie der Bovidae, die irgendein milchproduzierendes Mitglied der Gattung Bos einschließen, bevorzugt Kühe, Schafe und Ziegen, am meisten bevorzugt Kühe.
Die erfindungsgemäß angewendeten Mikroteilchen können im allgemeinen aus jedem polymeren Material gebildet werden, das bevorzugt bioverträglich und bioabbaubar oder biozersetzbar ist. Der Begriff "bioverträglich" bedeutet, daß das Matrixmaterial mit den Geweben des Säugetiers und insbesondere den Muskelgeweben des Säugetiers verträglich sein muß, so daß es keine Entzündung der Gewebe bewirkt und selbst auch keine Immunreaktion verursacht. Der Begriff "bioabbaubar" bedeutet, daß das Matrixmaterial der Mikroteilchen durch körpereigene Prozesse leicht zu kleineren molekularen Einheiten abbaubar sein muß, die ohne weiteres beseitigt oder ohne weiteres durch den Körper oxidiert werden. Die molekularen Einheiten selbst müssen wie das makromolekulare Matrixmaterial ebenfalls bioverträglich sein. Wenn das Matrixmaterial nicht bioabbaubar ist, muß es mindestens biozersetzbar sein, oder durchlässig porös, um die Freisetzung des eingekapselten Antigens in den Körper zu gestatten.
Weil das erfindungsgemäße System zur Verabreichung eine feste, geformte Masse eines Matrixmaterials und kein Fluidmedium ist, wird das eingekapselte Antigen, wenn die Mikroteilchen einem Säugetier verabreicht werden, nicht sofort in den Körper freigesetzt, wie es bei den Antigenen in einem flüssigen Träger der Fall ist, sondern das Antigen wird in einer gesteuerten Weise über ausgedehnte Zeiträume langsam freigesetzt. Die Geschwindigkeit mit der Antigene in das System freigesetzt werden, hängt neben anderen Faktoren vom verwendeten Matrixmaterial, seiner Porosität und der Geschwindigkeit mit der das Matrixmaterial abgebaut oder zersetzt wird, ab. Natürlich weist jedes einzelne Matrixmaterial seine eigene charakteristische Freisetzungsgeschwindigkeit auf. Die Geschwindigkeit der Freisetzung an Antigen muß hoch genug sein, damit der Körper eine Immunantwort zeigt, aber nicht so hoch, daß das meiste oder alles eingekapselte Antigen innerhalb einer sehr kurzen Zeitspanne freigesetzt wird. Die Freisetzung des Antigens aus den Mikroteilchen kann durch Diffusion des Agens aus dem Matrixmaterial oder durch Zersetzung des Matrixmaterials oder durch eine Kombination beider Faktoren erfolgen.
Geeignete polymere Matrixmaterialien, aus denen die Mikroteilchen gebildet werden können, schließen aliphatische Polyester, Polyorthoester, Polyanhydride, Polyamide, polycyclische Thioether, Copolyoxalate, Polyvinylalkohol, Polypeptide und Polydioxanone ein. Bevorzugte polymere Matrixmaterialien schließen Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Poly(Milchsäure-Co-Glykolsäure), Polycaprolactone, Copolyoxalate und Ethylen-Vinyl-/Acetat-Copolymere mit ein. Andere geeignete polymere Materialien schließen Proteine wie Kollagen, Fettsäureester, wie die Glycerolstearate und Celluloseester, wie Celluloseacetatbutyrat ein.
Bei der Herstellung der Mikroteilchen können Zusammensetzungen mit verschiedenen Geschwindigkeiten der gesteuerten Freisetzung hergestellt werden. Ein geeignetes Verfahren der Zubereitung besteht darin, ein einzelnes Antigen oder eine Mischung aus mindestens zwei Antigenen in eine einzige Matrix einzuarbeiten. Das Verfahren wird ein oder mehrere Male mit einem unterschiedlichen Matrixmaterial wiederholt, das eine von dem zuvor angewendeten Matrixmaterial unterschiedliche Charakteristik der Freisetzung aufwies. Schließlich werden die Mikroteilchen zusammengemischt, um ein antigenfreisetzendes Präparat mit einem Bereich an Freisetzungsgeschwindigkeiten herzustellen. Alternativ dazu können Mikroteilchen durch die Einarbeitung eines einzelnen Antigens oder einer Mischung an Antigenen in eine Mischung von zwei oder mehr unterschiedlichen Matrixmaterialien hergestellt werden, um ein Produkt herzustellen, in dem jedes Mikroteilchen aus einer Mischung aus den in der Zubereitung verwendeten Materialien zusammengesetzt ist.
Bevorzugt enthalten die Mikroteilchen das eingearbeitete Antigen überall im Matrixmaterial der Mikroteilchen. Die Mikroteilchen können von jeder Gestalt sein, da die Gestalt kein mit der Freisetzung des eingeschlossenen Antigens verbundener kritischer Faktor ist. Im allgemeinen werden die Mikroteilchen jedoch von kugeliger Gestalt sein. In einem bevorzugten Verfahren der Herstellung werden kugelförmige Mikroteilchen hergestellt und die Mikrokugeln weisen einen Durchmesser zwischen 1 bis 500, bevorzugt 10 bis 200 Mikrometern auf. Die Freisetzungsgeschwindigkeit des Antigens aus den Mikroteilchen steht in einigen Präparaten in Zusammenhang mit der Größe.
Um die Mikroteilchen in eine verabreichungsfähige Form zu bringen, werden die Mikroteilchen in eine für die Injektion in den Körper geeignete geeignete Trägerflüssigkeit eingebracht, wie eine Salzlösung, die eine kleine Menge an oberflächenaktiven Mitteln enthält.
Das Molekulargewicht des ausgewählten teilchenförmigen Matrixmaterials ist kein kritischer Faktor bei der Herstellung und der Verwendung der Mikroteilchen. Obwohl eine Zunahme des Molekulargewichtes des Polymers die Geschwindigkeit der Freisetzung des Antigens aus dem Matrixmaterial graduell verzögern kann, können diese Faktoren ohne weiteres durch die Bestimmung der Geschwindigkeit der Freisetzung des Antigens aus dem Matrixmaterial durch in vivo- oder in vitro-Messungen und anschießender, unter Berücksichtigung der aus den Freisetzungsmessungen erhaltenen Ergebnisse, Anpassung der Menge der verabreichten Mikroteilchen und anderer Ausführungsparameter, wie Mikroteilchengröße und Gewichtsprozent an Antigen, ausgeglichen werden.
Bei der Herstellung der Mikroteilchen kann jedes herkömmliche Verfahren für die Bildung von Mikroteilchen angewendet werden. Die Auswahl eines bestimmten Verfahrens hängt hauptsächlich von den technischen Erfordernissen des Matrixmaterials und der speziellen Weise, in der die Mikroteilchen verwendet werden sollen, ab.
Im allgemeinen können die Mikroverkapselungsverfahren gemäß den drei prinzipiellen Typen eingeordnet werden: (1) Verfahren zur Phasentrennung, einschließlich Verfahren zur wäßrigen und organischen Phasentrennung, Schmelzdispersion und Sprühtrocknung; (2) Grenzflächenreaktionen, einschließlich Grenzflächenpolymerisation, in situ-Polymerisation und chemische Dampfabscheidung (CVD); und (3) physikalische Methoden, einschließlich Fließbett-Sprühbeschichtung, Multi- und Einzeldüsen-Zentrifugalbeschichtung (multi- and singleorifice centrifugal coating), elektrostatische Beschichtung und physikalische Dampfabscheidung.
Verfahren zur Phasentrennung beruhen, wie der Begriff impliziert, auf unterschiedlichen Löslichkeitscharakteristiken, die ein wand- oder hüllenbildendes Matrixmaterial dazu veranlassen, sich von der Lösung oder Suspension zu trennen und sich auf Teilchen oder Tropfen aus Antigen abzuscheiden und es einzukapseln. Die Trennung selbst kann physikalisch zustande gebracht werden, wie durch Zugabe eines Nicht- Lösungsmittels oder eine Temperaturveränderung oder chemisch, wie eine Veränderung des pH-Wertes.
Ein Verfahren für eine organische Phasentrennung wendet üblicherweise eine Dispersion oder Emulsion des Antigens in einer Lösung oder einem Polymer mit hohem Molekulargewicht in einem organischen Lösungsmittel an. Zu dieser Mischung wird ein Nicht-Lösungsmittel oder flüssiges Polymer hinzugefügt, welches das Polymer mit hohem Molekulargewicht dazu veranlaßt, sich von der Lösung zu trennen und sich um das suspendierte Antigen als Hülle zu sammeln. Die noch mit Lösungsmittel aufgequollene Hülle wird dann durch eine weitere Zugabe eines Nicht-Lösungsmittels oder durch ein anderes Verfahren, das die Hülle stärkt und die Trennwandeigenschaften verbessert, gehärtet
Typischerweise wird eine wäßrige Lösung oder Suspension eines lipophoben Antigens zu einer nichtwäßrigen Lösung eines geeigneten Matrixpolymers hinzugefügt und die Mischung wird gerührt, um die Bildung einer Wasser-in-Öl-Emulsion zu veranlassen. Abhängig von seiner Löslichkeit in Wasser kann das Agens in einer Konzentration von 5 bis 50 Gewichts-% in der wäßrigen Phase vorkommen, die 5 bis 20 Gewichts-% der Gesamtmischung sein kann. Die äußere organische Phase kann 5 bis 10% des Matrixpolymers enthalten. Üblicherweise jedoch ist das Verhältnis von Agens in der inneren Phase (wäßrige Lösung oder Suspension) zu Polymer 2:1 bis 1:4. Das Polymer muß ein guter Filmbildner sein: d. h. es muß eine angemessene Stärke und Zähigkeit besitzen.
Ein Verfahren zur wäßrigen Phasentrennung wendet eine Dispersion oder eine Emulsion eines wasserunlöslichen Antigens in einer wäßrigen Lösung oder Dispersion eines Polymers an. Das Polymer wird veranlaßt, sich als Gelteilchen abzutrennen; diese sammeln sich um das Antigen, um eine Hülle zu bilden; die Hülle wird gehärtet und die Mikroteilchen isoliert. Im Koazervierungsverfahren, welches das gebräuchlichste der Verfahren zur wäßrigen Phasentrennung ist, wird das wasserunlösliche Antigen, das in Form von Teilchen oder Tropfen vorliegen kann, in einem wäßrigen Sol eines hydrophilen Kolloids, das in Wasser ionisiert wird, üblicherweise dispergiert; ein zweites Sol mit entgegengesetzter Ladung wird hinzugefügt; und die Mischung wird durch eine Verdünnung mit Wasser, einer Salzzugabe, einer Einstellung des pH-Wertes, oder einer Temperaturveränderung, oder irgendeine Kombination dieser Verfahren zur Gelbildung veranlaßt. Geeignete Bedingungen für eine Koazervierung werden üblicherweise experimentell ermittelt, weil die verschiedenen, für eine Anwendung möglichen Polymere sich deutlich in den physikalischen und chemischen Eigenschaften, entsprechend ihrer Herkunft und dem Verfahren ihrer Isolation oder Herstellung, unterscheiden. Ein Bereich für die Koazervierung wird durch die Vereinigung zweier Lösungen oder Sole von zwei Polymeren bei verschiedenen Konzentrationen, Temperaturen und pH-Werten und der Beobachtung der für die Gelbildung erforderlichen Bedingungen ermittelt. Aus diesen Ermittlungen kann ein ternäres Phasendiagramm gezeichnet werden, das den Bereich der Verträglichkeit und den Bereich der Koazervierung bei gegebener Temperatur und pH-Wert zeigt. Die Veränderungen der Konzentration, Temperatur oder des pH-Wertes zur Auslösung der Gelbildung werden dann offenkundig.
Jede Herstellung von Mikroteilchen erfordert eine sorgfältige Steuerung der Bedingungen, und für verschiedene einzukapselnde Materialien sind etwas unterschiedliche Bedingungen erforderlich. Das Ausmaß des Rührens beeinflußt beispielsweise die Größe der Tropfen in der Emulsion, und die Oberflächeneigenschaften der Tropfen können Änderungen in den Verfahren erfordern, um eine Abscheidung des Matrixmaterials rund um die Tropfen sicherzustellen und die Bildung von Teilchen, die nicht an der Mikroverkapselung teilhaben, zu verringern. Das Volumen des im Verdünnungsschritt hinzugefügten Wassers ist nicht kritisch, im allgemeinen sind größere Volumina erforderlich, um eine stabile Emulsion aufrecht zu erhalten, wenn größere Tropfen eingekapselt werden.
Die vorstehende Phasentrennung kann an ein Alternativverfahren angepaßt werden, bei dem der erste Schritt der Bildung einer stabilen Emulsion oder Suspension einer Substanz durch Dispergieren des Antigens in einer Lösung des Matrixmaterials erreicht wird. Danach wird die Lösung unter Rühren tropfenweise zu einem Nicht-Lösungsmittel hinzugefügt, um das Material für den Polymerüberzug zur Bildung von Mikroteilchen auszufällen.
Ein anderer Typ von Phasentrennungsverfahren ist das Verfahren für eine Schmelz-Dispersions-Mikroverkapselung Dieses Verfahren kann mit einer großen Vielfalt an zu verkapselnden Substanzen durchgeführt werden. Üblicherweise wird ein mittels Wärme verflüssigbares, wächsernes Überzugsmaterial, bevorzugt ein tiefschmelzendes Wachs, wie Glyceroldistearat, in einer inerten Flüssigkeit, in der weder das Wachs noch das zu verkapselnde Antigen merklich löslich sind, wie ein Silikonöl oder einem Fluorkohlenwasserstoff, suspendiert. Die Mischung wird erhitzt und kräftig gerührt, um das Wachs zu schmelzen und zu emulgieren. Das Antigen, das für den gewünschten Größenbereich gepulvert und gesiebt worden ist, und das wächserne Überzugsmaterial werden mit stark scherendem Rühren dispergiert, und das verflüssigte Wachs überzieht das Antigen um wächserne flüssigüberzogene Mikroteilchen zu bilden. Danach werden die gebildeten Mikroteilchen durch fortgesetztes Rühren, das die Teilchen abkühlt, verfestigt. Die Mikroteilchen werden dann durch Filtration isoliert und getrocknet, wie früher beschrieben.
Das zweite Hauptverfahren zur Bildung von Mikroteilchen ist die Grenzflächen-Mikroverkapselung, die das Zusammenbringen zweier Reaktanten an einer Reaktionsgrenzfläche einschließt, wo eine Polykondensation der Reaktanten, üblicherweise Monomere, erfolgt, um einen dünnen, unlöslichen polymeren Films zu bilden. Ein Verfahren zur Errichtung der Grenzfläche für den Verkapselungsprozeß ist die Dispersion oder Emulgierung des Antigens mit einem der Reaktanten, die in einer den zweiten Reaktanten enthaltenden, kontinuierlichen Phase das Kondensationspolymer bilden.
Die dritte Hauptkategorie von Verfahren zur Verkapselung, die insbesondere auf eine Vielzahl von Antigenen und Überzugsmaterialien anwendbar ist, ist die physikalische Mikroverkapselung. Die Verfahren zur physikalischen Mikroverkapselung sind durch das fortgesetzte Einhüllen von Teilchen oder Tropfen aus Antigen in einem Fluidfilm, wie einer Schmelze oder eine Lösung des Überzugsmaterials, in einer Vorrichtung charakterisiert, die koaxiale oder aufeinanderfolgend positionierte Düsen enthält. Danach wird der Fluidüberzug durch ein Standardkühlverfahren oder durch Lösungsmittelverdampfung gehärtet.
Unter den physikalischen Verfahren zur Mikroverkapselung sind diejenigen, die den Durchgang eines flüssigen oder festen Kermaterials aus Antigen durch ein flüssiges Matrixmaterial einschließen. Der Strom wird durch einige Vorrichtungen zur Veranlassung der Bildung von flüssig-überzogenen Tropfen oder Teilchen unterbrochen, und die entstehenden Teilchen werden gekühlt oder anderweitig behandelt, um das Hüllmaterial zu verfestigen. Beispielsweise wird eine wäßrige Lösung eines zu verkapselnden Antigens in einen schnell fließenden Strom aus geschmolzenen Glyceroldistearat gesaugt, und die Mischung wird durch eine feine Düse ausgestoßen. Beim Hervortreten aus der Düse zerfällt der flüssige Strom zu Tropfen, wobei jeder aus einem wäßrigen Kern besteht, der von flüssigem Wachs umgeben ist. Wenn sie durch die Luft fallen, kühlt die Hülle ab und verfestigt sich und es entstehen Mikroteilchen. In einer anderen Version dieses Verfahrens, wird die treibende Kraft von einem rotierenden Teil (rotating member) geliefert, welches das Kernmaterial zentrifugal durch die hüllbildende Flüssigkeit drückt.
Es gibt viele Variationen von diesen und anderen Verfahren. Wie ohne weiteres für den erfahrenen Fachmann ersichtlich, ist weder ein einzelnes Verfahren noch ein einziger Satz an Bedingungen auf alle Substanzen anwendbar, stattdessen wird ein nützliches Verfahren ausgewählt und die Bedingungen optimiert, um das gewünschte Ergebnis für ein bestimmtes Antigen zu erhalten.
In einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln, die ein Antigen enthalten, wird ein Verfahren zur Phasentrennung angewendet, wobei eine Lösung des polymeren Matrixmaterials in einem geeigneten organischen Lösungsmittel hergestellt wird. Zu dieser Lösung wird das in Wasser gelöste oder suspendierte oder allein als feine Teilchen vorliegende Antigen hinzugefügt. Ein Nicht-Lösungsmittel für das polymere Matrixmaterial wird langsam zu der gerührten Dispersion gegeben und veranlaßt das polymere Material sich langsam um das Antigen herum abzuscheiden und Mikroteilchen zu bilden. Die Mikroteilchen werden desweiteren durch die Zugabe eines zweiten Nicht-Lösungsmittels für das polymere Matrixmaterial gehärtet. Die Mikroteilchen werden dann durch Filtration isoliert und getrocknet.
Die zweckmäßigste Weise der Verabreichung von Mikroteilchen ist die durch eine intramuskuläre Injektion, obwohl Mikroteilchen auch subkutan implantiert werden können.
Die gewünschte erfindungsgemaße Aufgabe ist es, ein Säugetier in einen hyperimmunen Zustand zu bringen, ebenso wie Antikörper und Lymphokinfaktoren in der Milch zu erzeugen. In den herkömmlichen Verabreichungsverfahren wird dieser Zustand üblicherweise durch die anfängliche Impfung eines Säugetiers mit einem Antigen oder Mischungen aus Antigenen in einem flüssigen Träger erreicht, gefolgt durch einige Verstärkungsinjektionen mit einer ausreichend hohen Dosis an Antigen oder Mischungen von Antigenen, die notwendig sind, um einen hyperimmunen Zustand zu erreichen. Normalerweise werden Verstärkungsinjektionen in Zwei-Wochen-Intervallen angewendet, um hohe Antikörpertiterspiegel in den Körperflüssigkeiten eines Säugetieres zu erreichen und aufrecht zu erhalten. Nur wenn das Säugetier in einem hyperimmunen Zustand ist, werden die Körperflüssigkeiten des Säugetiers einen ausreichend hohen Antikörpertiter enthalten. Im Falle eines Bovids, wie einer Kuh, wird die Milch einer hyperimmunisierten Kuh einen hohen Spiegel an immunregulierenden Faktoren aufweisen, was die Milch für eine Vielzahl verschiedener Zwecke nützlich macht.
Der erfindungsgemäße Vorteil besteht darin, daß durch eine einzige Implantation eines ein Antigen enthaltenden Mikroteilchens, nicht nur Verstärkungsinjektionen mit dem Antigen nicht benötigt werden, um einen hyperimmunen Zustand zu erreichen, sondern daß ziemlich unerwartet und sogar noch wichtiger, im Vergleich zu den herkömmlichen Impfverfahren höhere Spiegel an immunregulierenden Faktoren, einschließlich Antikörper und Lymphokine, innerhalb des Säugetieres und in der Milch von Kühen erhalten werden können. Weil bei dem vorliegenden Verfahren das Antigen überall in dem Matrixmaterial dispergiert ist, wird es langsam aus dem Matrixmaterial freigesetzt, wodurch eine länger anhaltende ständige Freisetzung an Antigen in das behandelte Säugetier erfolgt. Diese Weise der Verabreichung von Antigen unterscheidet sich ziemlich von der Impfung mit Antigen, wo eine gegebene Menge an Antigen sofort verabreicht wird, gefolgt von der bis zur nächsten Impfung mit Antigen erfolgenden Veringerung des Antigenspiegels im Körper des Säugetiers. Aus diesem Grund ist es ziemlich schwierig anzugeben, wieviel Antigen einem Säugetier verabreicht wird, das mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens immunisiert wird. Möglicherweise kann einem gegebenen Tier Antigen mit einer Rate von 0,01 bis 1,0 mg pro Tag verabreicht werden. Es kann sein, daß die unerwarteterweise hohen Spiegel an immunregulierenden Faktoren, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erreicht wurden, der Tatsache zuzuschreiben sind, daß die Antigenspiegel über ausgedehnte Zeiträume in den Körpergeweben der behandelten Säugetiere auf relativ konstante Niveaus gehalten werden. Es ist offenkundig, daß, in was für einer speziellen Weise das erfindungsgemäße, geformte, Antigen enthaltende Matrixmaterial auch immer verabreicht wird, das System zur Verabreichung genug Antigen enthalten muß, um einen beständigen Antigenspiegel über eine zur Erreichung des hyperimmunen Zustands ausreichende Zeit aufrecht zu erhalten. Beispielsweise können angenähert 10&sup9; abgetötete Bakterienzellen in einer normalen Dosis pro Injektion verwendet werden, aber diese Zahl kann sicherlich mit dem Typ des verwendeten Antigens variieren.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform können durch eine Modifizierung des Implantationsverfahrens sogar noch höhere Antikörpertiter erreicht werden, wobei gleichzeitig mit der Implantation eines Mikroteilchens dem Empfängersäugetier unverkapseltes Antigen verabreicht wird. Mit anderen Worten, das Empfängersäugetier kann zur Zeit der Implantation auf irgendeine Weise mit unverkapseltem Antigen geimpft werden, wodurch das Empfängersäugetier in einen Zustand mit sofortigem hohen Antigenspiegel versetzt wird. Dieses Verfahren hat die wünschenswerte Wirkung, höhere Antikörpertiter schneller in dem Empfängersäugetier zur Verfügung zu stellen als die Geschwindigkeit mit der hohe Titerspiegel durch das grundlegende Implantationsverfahren alleine erreicht werden können. In der erfindungsgemäßen Ausführungsform, in der Mikroteilchen subkutan oder intramuskulär injiziert werden, können Antigensubstanzen in einem flüssigen Träger zusammen mit den Mikroteilchen oder an einer anderen Stelle des Empfängersäugetieres eingeimpft werden. Wenn die Mikroteilchen in ein Empfängertier implantiert werden, kann unverkapseltes Antigen mit den Mikroteilchen implantiert werden, oder es kann auf einer unterschiedlichen Seite des Empfängertieres eingeimpft werden.
Es ist notwendig festzustellen, ob das geimpfte Säugetier für das Antigen empfindlich geworden ist oder nicht. Dem erfahrenen Fachmann der Immunologie sind eine Reihe von Verfahren bekannt, um die Empfindlichkeit zu testen (Methods in Immunology and ImmunoChemistry, William, C. A., Chase, W. M., Academic Press, N. Y., London, Vol. 1-5, 1977). Beispiele dieser Tests schließen Tests der Hautempfindlichkeit, Tests des Serums auf die Anwesenheit von Antikörpern für die stimulierenden Antigene und Tests, die entwickelt wurden, um die Fähigkeit der Immunzellen des Empfängers, dem Antigen zu antworten, zu bewerten. Der Typ des angewendeten Tests hängt in großem Ausmaß von der Natur des verwendeten Antigens ab. Das bevorzugte Verfahren ist, einen polyvalenten Impfstoff zu verwenden, der aus vielfältigen Bakterienarten als dem Antigen besteht, und das Vorkommen an agglutinierenden Antikörpern im Serum des Säugetiers vor und nach der Reizung mit dem Impfstoff zu testen. Im Falle eines Bovids zeigt das Auftreten von Antikörpern in der Milch nach der Immunisierung mit dem Impfstoff die Empfindlichkeit an, und an diesem Punkt kann die vom Bovid erzeugte Antikörper enthaltende Milch für den gewünschten Zweck genutzt werden.
Irgendein bestimmtes Antigen oder eine Kombination derselben kann in den Mikroteilchen angewendet werden. Die Antigene können bakterielle, virale, zelluläre oder irgendwelche andere Substanzen sein, auf die das Immunsystem des Säugetiers antwortet. Bevorzugt ist das Antigen oder Mischungen des Antigens bakteriell oder viral, wobei polyvalente Antigene ebenfalls bevorzugt sind. Geeignete bakterielle Antigene schließen ein: Neisseria gonorrhea, Mycobacterium tuberculosis, Haemophilus vaginalis, Gruppe b Streptococcus ecoli, Microplasma hominis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyrogenes, Streptococcus mutans, Aerobacter aerogenes, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium, Haemophilus influenzae, Streptococcus viridans, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Streptococcus Gruppe B, Diplococcus pneumoniae, Corynebacterium Acne Typen 1 und 2, Hemophilus ducreyi, Granuloma inguinale, Lymphopathia venereum, Treponem, pallidum, Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella canis, Campylobacter fetus, Campylobacter fetus intestinalis, Leptospira pomona, Listeria monocytogenes, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Escherichia coli, Actinobacillus equuli, Salmonella abortus ovis, Salmonella abortus equi, Corynebacterium equi, Corynebacterium pyrogenes, Actinobacillus seminis, Mycoplasma Bovigenitalium, Clostridium tetani, Pseudomonas maltophiia, Streptococcus equisimili, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus bovis, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Moraxella bovis, Actinobacillus lignieresi, Corynebacterium renale, Fusobacterium necrophorum, Bacillus cereus, Salmonella dublin, Salmonella heidelberg, Salmonella paratyphi und Yersinia enterocolitica. Geeignete virale Antigene schließen ein: Pferde-Herpesvirus, Pferde- Arteritisvirus, IBR-IBP Virus, BVD-MD Virus und Herpesvirus (humonis Typen 1 und 2).
Das erfindungsgemäße Verfahren kann dazu verwendet werden, einen hohen Immunitätsspiegel in einem Säugetier zu erzeugen. Dementsprechend können milcherzeugende Tiere aus der Familie der Bovidae durch das vorliegende Verfahren hyperimmunisiert werden, um eine Antikörper und Lymphokin enthaltende Milch zu erzeugen. Die Lymphokinfaktoren sind wirksam gegen Entzündungen, wie in der US-A-4.284.623 beschrieben, und gegen andere Leiden, wie die schwächenden kardiovaskulären und Lungenleiden, wie in der US-A-4.636.384 beschrieben. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch angewendet werden, um die bestimmte Antikörper enthaltende Milch zu erzeugen, die gegen die Bakterien wirksam ist, die die Bildung von Karies an den Zähnen, die Bildung von Plaque und Zahnfleischentzündung fördern, wie in der US-A-4.324.782 beschrieben, oder um die Antikörper enthaltende Milch zu erzeugen, die gegen die Geruch und Krankheiten verursachenden Hautbakterien wirksam ist.
Nachdem die Erfindung im allgemeinen beschrieben wurde, kann ein besseres Verständnis durch die Bezugnahme auf bestimmte spezielle Beispiele erreicht werden, wie sie nachstehend nur zum Zwecke der Erläuterung und in keinerlei einschränkender Hinsicht, solange nicht anders angegeben, gegeben werden.

Herstellung des S-100-Impfstoffes

Eine Bakterienkultur, die das in Tabelle 1 nachstehend gezeigte Bakterienspektrum enthält, wie sie von der American Type Culture Collection erhalten wurde, wurde mit 15 ml Medium verdünnt und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Sobald ein gutes Wachstum erreicht wurde, wurde ungefähr die Hälfte der bakteriellen Suspension zur Impfung eines Liters Nährlösung verwendet, wobei die angeimpfte Nährlösung bei bei 37ºC inkubiert wurde. Die verbliebene Suspension wurde in sterile Glykolröhren überführt und bei -20ºC bis zu sechs Monate aufbewahrt.
Nachdem in der Literkultur ein gutes Wachstum erkennbar war, wurden die Bakterienzellen mittels zwanzigminütigen Zentrifugierens der Suspension, um das Medium zu entfernen, geerntet. Das erhaltene Bakterienpellet wurde wieder in steriler Salzlösung suspendiert und die Bakterienprobe wurde drei Mal zentrifugiert, um das Medium von den Zellen zu waschen. Nach dem dritten Waschen mit steriler Salzlösung, wurde das durch Zentrifugieren erhaltene Bakterienpellet wieder in einer kleinen Menge doppelt destillierten Wassers suspendiert.
Die mediumfreie Bakteriensuspension wurde mittels Einbringens der Suspension in einem Glaskolben in ein Wasserbad von 80ºC über Nacht durch Hitze abgetötet. Die Lebensfähigkeit der Bakterien in der Probe wurde durch Impfung der Nährlösungskultur mit einer kleinen Menge der durch Hitze abgetöteten Bakterien ermittelt. Die Nährlösung wurde fünf Tage bei 37ºC inkubiert und täglich auf Wachstum überprüft, da die Bakterien für die Verwendung in dem Impfstoff abgetötet sein müssen.
Die durch Hitze abgetöteten Bakterien wurden gefriergetrocknet bis sie trocken waren. Die trockenen Bakterien wurden dann mit steriler Salzlösung zu einer Konzentration von 2,2 · 108 Bakterienzellen/ml Salzlösung (1,0 optische Dichte, abgelesen bei 660 nm) gemischt. Tabelle 1 S-100 Bakterienliste Name Gram Medium +oder- ATCC Staph. aureus Staph. epidermitis Strep. pyrogenes, A. Typ Aerobacter aerogenes Escherichia coli Salmonella enteritidis Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumoniae Salmonella typhimurium Haemophilus influenzae Strep. mitis Proteus vulgaris Shigella dysenteriae Diplococcus pneumoniae Propionibacter acnes-Actinomyces (anaerobe) Nährlösung Strep. sangius Strep. salivarius Strep. mutans Strep. agalactiae

Beispiel 1

Acht, durch die Nummer in nachstehender Tabelle 2 identifizierten Kühen wurden täglich Injektionen mit 5 ml Proben des polyvalenten flüssigen Impfstoffes verabreicht. Antikörpertiterspiegel (IgG) für die Rinder, die eine Injektion erhalten hatten, wurden periodisch ermittelt. Die Antikörpertiterspiegel (IgG) wurden unter Verwendung eines "enzyme linked"-Immuntestverfahrens (ELISA) (enzyme linked immuno-assay system) ermittelt, der Endpunkt war eine Anzeige der optischen Dichte bei 410 nm der Antikörper enthaltenden, aus Kuhmilch gewonnenen Fluidproben; die von jeder Kuh erhaltenen individuellen Skalenwerte sind in nachstehender Tabelle gezeigt. Je höher die Anzeige der optischen Dichte, um so höher der Titer. Die Tabelle zeigt auch die aus den erhaltenen individuellen Werten der optischen Dichte ermittelte durchschnittliche optische Dichte. Der durchschnittliche IgG-Antikörperspiegel, wie er aus dem Wert der durchschnittlichen optischen Dichte für jede Meßperiode ermittelt wurde, ist in Tabelle 2 ebenfalls gezeigt. Die Fig. ist eine Darstellung der in Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse. TABELLE 2 Kuh-Nr. Probendatum Durchschnitt IgG-Konz
Bemerkungen:
Ablesung der optischen Dichte bei 410 nm.
Täglich verabreichte Injektionen 2. 9. 82 - 22. 2. 83 und 18. 5. 83 - 12. 10. 83 TABELLE 2 Kuh-Nr. Probendatum Durchschnitt IgG-Konz
Bemerkungen: TABELLE 2 Kuh-Nr. Probendatum Durchschnitt IgG-Konz
Bemerkungen:

Beispiel 2

Durch Hitze abgetötete Bakterien wurden in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellt. Die erhaltene polyvalente Antigenprobe (S-100) wurde mittels eines herkömmlichen Phasentrennungsverfahrens mikroverkapselt, um ein polyvalentes, Antigen enthaltendes Mikroteilchenprodukt herzustellen. Das verwendete polymere Matrixmaterial war bioabbaubares Poly(lactid-coglycolid). Die Mikroteilchen waren im Durchmesser kleiner als 250 Mikrometer. Ungefähr 750 mg der Mikroteilchen, die 22% (16,5 mg) polyvalentes Antigen enthielten, wurden dann in ungefähr 3 cc. eines Trägers (1 Gew.-% Tween 20R und 2 Gew.-% Carboxymethylcellulose in Wasser) suspendiert.
Eine kleine Gruppe von Rindern wurde aus einer größeren Rinderherde ausgewählt. Fünf dieser zufällig ausgewählten Rinder wurden zur Kontrolle ausgewählt. Vier, in nachstehender Tabelle 3 als Nummer 398, 408, 414 und 400 identifizierte Rinder wurden mit einer Injektion aus einer, wie vorstehend beschrieben hergestellten, Mikroteilchen enthaltenden Lösung behandelt.
Den vier Kühen wurden am 23. April 1982 intramuskulär die das polyvalente Antigen enthaltenden Mikroteilchen injiziert. Die Mikroteilchenproben B022-41-1 und B022-41-2 wurden mit 2,0 mRad Gammastrahlung sterilisiert, während die Proben B022-41-3 und B022-41-4 unsterilisiert waren. Antikörpertiterspiegel wurden periodisch aus Proben von Kuhmilch ermittelt, die sowohl von den geimpften, als auch von den Kontrollkühen erhalten wurden; die erhaltenen Werte werden in Tabelle 3 gezeigt.
Die aus den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße Verfahren zur Erreichung eines Immunzustandes in einem Tier, besonders in einem Tier aus der Familie der Bovidae, mittels weniger Impfungen mit Antigen enthaltenden Mikroteilchen der herkömmlichen Methodik zur Erreichung eines Immunzustandes in einem Tier mittels Impfung mit herkömmlichen, Antigen enthaltenden, injizierbaren Lösungen überlegen ist.
Nachdem die Erfindung nun vollständig beschrieben wurde, wird für den Fachmann auf diesem Gebiet der Technik klar, daß an der Erfindung viele Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne sich von ihr zu entfernen. Tabelle 3 Elektroimmunproben- & Mikrotiterergebnisse der Serumproben von mikroverkapselten gegenüber zufälligen S-100 Kühen. Datum 13. 7. 82 Experimentelle Gestaltung: Kuh Antigen Träger Mit mikroverkapselten Antigen behandelte Kühe Kontrollkühe IgG-Spiegel Mikroliter
Anmerkung: 1. Fünf Kontrollkühe wurden zufällig aus der S-100-Herde ausgewählt.
2. Mikroverkapselte Kühe: 393 gekalbt am 28-5-82
408 gekalbt am 27-5-82
414 gekalbt am 15-5-82
400 gekalbt am 20-5-82

Claims

1. Verfahren zum Erhalten eines immunregulierenden Faktors mittels Immunisierens eines Säugetieres und Sammlung oder Gewinnung einer Substanz mit einem immunregulierenden Faktor daraus, dadurch gekennzeichnet, daß das Säugetier durch Implantierung einer Menge einer Antigensubstanz in das Säugetier, die ausreicht um eine Immunantwort hervorzurufen, immunisiert wird, wobei die Antigensubstanz innerhalb der Mikroteilchen aus einem bioverträglichen Matrixmaterial eingearbeitet ist, was eine gesteuerte Freisetzung der Antigensubstanz verursacht, wodurch die Antigenwirkung in dem behandelten Säugetier verlängert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroteilchen in das Säugetier durch eine intramuskuläre Injektion implantiert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroteilchen in das Säugetier durch eine subkutane Injektion implantiert werden.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Matrixmaterial ein bioverträgliches, bioabbaubares polymeres Matrixmaterial ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Material eine Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Poly(Milchsäure-Co-Glykolsäure), Polycaprolacton, Polyoxalsäure, Polydioxanon, Polyorthoester oder die Salzform dieser Polymere ist.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroteilchen durch Einarbeitung der Antigensubstanz(en) in eine Mischung aus mindestens zwei unterschiedlichen, bioabbaubaren und bioverträglichen Polymeren, von denen jedes eine unterschiedliche Geschwindigkeit des Bioabbaus aufweist, hergestellt werden, wodurch einzelne Mikroteilchen hergestellt werden, die aus einer Mischung aus polymeren Matrixmaterialien zusammengesetzt sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroteilchen durch folgende Schritte gebildet werden:

(a) Einarbeitung der Antigensubstanz(en) in ein einziges polymeres Matrixmaterial, (b) getrenntes Wiederholen des Verfahrensschritts (a) mindestens einmal mit einem unterschiedlichen polymeren Matrixmatrial, das eine vom ersten verwendeten Matrixmaterial aus Schritt (a) unterschiedliche Geschwindigkeit des Bioabbaus aufweist, und dann (c) Vollenden der Herstellung der Mikroteilchenbildung durch Mischen der getrennt hergestellten Mikroteilchenansätze.

8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigensubstanz ein einzelnes bakterielles Antigen oder eine Mischung aus mindestens zwei bakteriellen Antigenen ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigensubstanz mindestens ein einzelnes bakterielles Antigen ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Neisseria gonorrhea, Mycobacterium tuberculosis, Haemophilus vaginalis, Gruppe b Streptococcus ecoli, Microplasma hominis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyrogenes, Streptococcus mutans, Aerobacter aerogenes, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium, Haemophilus influenzae, Streptococcus viridans, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae Streptococcus Gruppe B, Diplococcus pneumoniase, Corynebacterium Acne Typen 1 und 2, Hemophilus ducreyi, Granuloma inguinale, Lymphopathia venereum, Treponema pallidum, Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella canis, Campylobacter fetus, Campylobacter fetus intestinalis, Leptospira pomona, Listeria monocytogenes, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Escherichia coli, Actinobacillus equuli, Salmonella abortus ovis; Salmonella abortus equi, Corynebacterium equi, Corynebacterium pyrogenes, Actinobacillus seminis, Mycoplasma bovigenitalium, Clostridium tetani, Pseudomonas maltophiia, Streptococcus equisimili, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus bovis, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Moraxella bovis, Actinobacillus lignieresi, Corynebacterium renale, Fusobacterium necrophorum, Bacillus cereus, Salmonella dublin, Salmonella heidelberg, Salmonella paratyphi und Yersinia enterocolitica.

10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Säugetier ein Bovid ist und die den immunregulierenden Faktor enthaltende Substanz eine Antikörper und/oder Lymphokin enthaltende Milch ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Tier aus der Familie der Bovidae eine Kuh ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Kuh zu einem hyperimmunisierten Zustand mit einer Antigensubstanz immunisiert wird, die ausreicht, um folgendes zu erzeugen: (a) Milch, die einen höheren Spiegel als normal an Lymphokinen enthält, die entzündungshemmende Faktoren einschließen; (b) Milch, die Faktoren enthält, die schwächenden Zuständen des kardiovaskulären Systems und des Lungensystems entgegenwirken; (c) Milch, die einen Antikörperfaktor enthält, der gegen Zahnkaries, Plaque und Zahnfleischentzündung verursachende Bakterien wirksam ist; oder (d) Milch, die einen gegen Geruch oder Krankheit verursachende Hautbakterien wirksamen Antikörperfaktor enthält.

13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Immunzustand durch das gleichzeitige Implantieren des die Antigensubstanz enthaltenden, geformten Matrixmaterials in das Säugetier und Impfen des Säugetiers mit einem die Antigensubstanz enthältenden Fluid erreicht wird.