DE69409237T2

DE69409237T2 - Orale, pharmazeutische zusammensetzungen das ein protein oder peptide, eine antikoerper und polymerkugeln enthalten

Info

Publication number: DE69409237T2
Application number: DE69409237T
Authority: DE
Inventors: Michael Smith
Original assignee: Babraham Institute
Current assignee: Babraham Institute
Priority date: 1993-06-03
Filing date: 1994-06-02
Publication date: 1998-10-29
Anticipated expiration: 2014-06-03
Also published as: WO1994028879A1; EP0707473B1; DK0707473T3; ZA943920B; GB9311454D0; ATE164311T1; AU6804394A; EP0707473A1; ES2117272T3; DE69409237D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte pharmazeutische Zusammensetzungen und insbesondere Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung, die biologisch aktive Materialien, insbesondere Peptide oder Proteine, enthalten.
Proteine und Peptide werden in der Behandlung vieler Erkrankungen oder Leiden verwendet, und Proteinhormone wie Insulin, Calcitonin und Wachstumshormone und auch Proteine wie Erythropoietin, Plasminogenaktivatoren und ihre Vorläufer, Interferone, Interleukine und Blutgerinnungsfaktoren sind nur einige der zahlreichen Beispiele und zusätzlich sind viele Verbindungen, die als Vaccine verwendet werden, Proteine oder Peptide.
Obwohl Proteine und Peptide so umfassend in der Medizin verwendet werden, müssen sie jedoch im allgemeinen durch intravenöse oder intramuskuläre Injektion verabreicht werden, da sie, obwohl sie enterisch überzogen werden können, um den Bedingungen des Magens zu widerstehen, nicht leicht durch die Darmwand adsorbiert werden. Die Injektion ist bei Patienten kein beliebter Verabreichungsweg, und dies führt häufig zu einem schlechten Mitwirken der Patienten. Zusätzlich entstehen bei Leiden wie Diabetes, wo tägliche Injektionen verabreicht werden müssen, häufig Probleme, da mehrere Male in dieselbe Stelle injiziert werden muß. Zur Lösung dieser Probleme wäre die Entwicklung von Möglichkeiten zur Verabreichung dieser Verbindungen über den oralen Weg hilfreich, da dies die einfachste und beliebteste Art für Patienten ist.
Es gab zahlreiche Versuche, eine orale Verabreichung von Proteinen und Peptiden zu ermöglichen, und diese haben verschiedene Formulierungen beinhaltet, in welchen das Protein oder Peptid in Liposomen eingekapselt ist, oder Formulierungen mit Penetrationsverstärkern. Liposome sind jedoch häufig unzuverlässig, und Penetrationsverstärker können die Aufnahme unerwünschter Substanzen verstärken wie auch jener Substanzen, auf die sie wirken sollen.
WO92/17167 offenbart Komplexe und Zusammensetzungen zur oralen Abgabe einer oder mehrerer Substanzen an den Kreislauf oder das lymphatische Dränagesystem eines Wirts. Die Komplexe umfassen ein Mikropartikel, das an mindestens einen Träger gekoppelt ist, wobei der Träger imstande ist, den Transport des Komplexes zu dem Kreislauf oder das lymphatische Dränagesystem über das Schleimhautepithel des Wirts zu ermöglichen, und wobei das Mikropartikel die Substanz(en) umschließt oder einkapselt oder umschließen oder einkapseln kann. Beispiele für geeignete Träger sind Schleimhautbindungsproteine, bakterielle Adhesine, virale Adhesine, Toxinbindungsuntereinheiten, Lectine, Vitamin B&sub1;&sub2; und Analoge oder Derivate von Vitamin B&sub1;&sub2;, die Bindungsaktivität an den Castle-Faktor besitzen.
WO-A-8705505 offenbart orale Zusammensetzungen von Insulin, die auf Partikel aufgetragen und mit einem Lipidüberzug bedeckt sind.
JP-A-55017328 offenbart Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsionen, die Insulin enthalten und zur oralen Verabreichung bestimmt sind.
Der gegenwärtige Erfinder hat jedoch eine Methode gewählt, die sich vollkommen von allen zuvor angewandten unterscheidet, und hat entdeckt, daß es möglich ist, M-Zellen als Route zur Peptidabsorption von dem Darmlumen in den Körper zu nutzen.
M-Zellen treten in der Epithelauskleidung des Peyer-Lymphfollikelhaufens im Darm auf. Es sind dies Epithelzellen, die wahrscheinlich aufgrund ihrer Nähe zu lymphatischem Gewebe rudimentär sind und daher leichter von Makromolekülen penetriert werden als Epithelzellen an einer anderen Stelle im Darm. Obwohl der Darm im allgemeinen so beschaffen ist, daß er zum Schutz vor einer Infektion einer Partikelpenetration widersteht, sind daher M-Zellen zu einer Endozytose kleiner Mengen einer partikulären Substanz aus dem Darmlumen fähig, die an das mit dem Darm eng verbundenen lymphatischen Gewebe ("gut associated lymphoid tissue" -GALT) abgegeben werden. Dadurch kann das Darmimmunsystem auf unerwünschte Antigene reagieren, die im Darmlumen vorhanden sind (Neutra und Kraehenbuhl, Trends in Cell Biology, 2, 134-138 (1992)).
Die Funktion und Wirkungsweise von M-Zellen wurden umfassend untersucht, und semiquantitative Schätzungen der Fähigkeit von M-Zellen, Partikel aus Darmschlingen zu absorbieren, wurden zunächst unter Verwendung fluoreszierender Mikrokügelchen durchgeführt. Aus dieser Arbeit wurde geschlossen, daß sich diese Körner bei der Untersuchung der aufgenommenen Antigenmenge, die auf Polystyrol-Mikropartikel adsorbiert ist, als zweckdienlich erweisen könnten (Pappo und Ermak, Cellular and Experimental Immunology, 76, 144 (1989)). Es wurde schließlich festgestellt, daß die Beschichtung von Partikeln mit einem Anti-M-Zellen-IgM-Antikörper eine dreifache Zunahme der Körneraufnahme bewirkt (Pappo et al., Immunology, 73, 277 (1991)). Zusätzlich wurde gezeigt, daß IgA, das gegen das Brusttumorvirus erzeugt wurde, die Bindung des IgA-Virus-Komplexes an die M-Zellenoberfläche erhöhte und IgG die Bindung hemmte (Weltsin et al., J. Cell Biol., 108, 1673 (1989)). Jüngere Arbeiten haben gezeigt, daß IgA-überzogene Körner viermal leichter binden und zwanzigmal leichter aufgenommen werden als Körner, die mit Albu min überzogen sind (Porta et al., Exp. Physiol., 77, 929 (1992)). Es wurde daher der Schlüß gezogen, daß von einer Bindung von IgG, IgA und IgM an Körner und/oder Partikel eine Erhöhung der Bindung der Körner oder Partikel und ihrer Aufnahme durch M-Zellen erwartet werden kann.
Obwohl in der Vergangenheit nahegelegt wurde, daß M-Zellen als Mittel zur Absorption von Makromolekülen zweckdienlich sein könnten (O'Hagan, Advanced Drug Delivery Reviews, 5, 265-285 (1990)), wurde diese Idee nicht weiter entwickelt, und die gesamte Arbeit in jüngster Zeit hinsichtlich des Transports von Körnern in M-Zellen konzentrierte sich auf die Bindung von Körnern an M-Zellen als Modell für Antigene, deren Aufnahme und Verarbeitung für gewöhnlich die Aufgabe von M-Zellen ist. Die Vorstellung, M-Zellen als möglichen Weg zu verwenden, über den Proteine und Peptide aus dem Darmlumen in den Körper gelangen könnten, wurde anscheinend nicht ernsthaft erwogen, möglicherweise wegen der Probleme, die beim Transport von Makromolekülen aus den M-Zellen in das lymphatische System erwartet wurden.
Die jüngste Arbeit in bezug auf M-Zellen hat sich auf das Überziehen von Körnern oder Partikeln mit Immunglobulinen konzentriert, die gegen eine bestimmte Komponente der M-Zellenoberfläche erzeugt wurden. In einem Versuch, die M-Zellen dazu zu verwenden, Proteine oder Peptide aus dem Darmlumen in lymphatisches Gewebe zu leiten, hat der gegenwärtige Erfinder jedoch einen anderen Weg gewählt.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zusammensetzung zur oralen Verabreichung geschaffen, wobei die Zusammensetzung ein biologisch aktives Material, einen an das biologisch aktive Material spezifisch gebundenen Antikörper und eine Mehrzahl von Polymerkörnern enthält.
Die Theorie, die der Verwendung einer solchen Zusammensetzung lozugrundeliegt, ist, daß ein Antikörper, der gegen ein biologisch aktives Peptid oder Protein erzeugt wird, nicht nur spezifisch an dieses Peptid oder Protein bindet, sondern auch nichtspezifisch an die M-Zellenoberfläche bindet, so daß ein Korn oder ein Partikel, welches das Peptid oder Protein und den Antikörper trägt, in und durch M-Zellen befördert wird. Die doppelte Wirkung einer spezifischen Bindung an das aktive Peptid oder Protein und einer nichtspezifischen Bindung an die M-Zellenoberfläche sollte die Selektivität der Absorption bewahren, während gleichzeitig die Darmpermeabilität in einer Immunglobulin-nichtselektiven Weise erhöht wird. Es sollte jedoch betont werden, daß die Wirksamkeit der Erfindung in keiner Weise dadurch beeinflußt wird, ob diese Theorie korrekt ist oder nicht.
Wie zuvor kurz erwähnt wurde, wäre zu erwarten gewesen, daß, selbst wenn Körner oder Partikel in M-Zellen transportiert werden können, sie dort verblieben und nicht aus den M-Zellen in das lymphatische System gelangten. Überraschenderweise hat es nun jedoch den Anschein, daß dies kein wesentliches Problem darstellt und daß es möglich ist, über M-Zellen Zugang zu dem lymphatischen System zu erlangen.
Der größte Vorteil der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung besteht natürlich darin, daß sie die orale Verabreichung von biologisch aktiven Materialien ermöglicht. Ein weiterer Vorteil besteht jedoch darin, daß das Peptid oder Protein von den M-Zellen in das lymphatische System und nicht in das Blut gelangt, und dies könnte bedeuten, daß die biologische Verfügbarkeit erhöht ist, da der First-Pass-Leberstoffwechsel vermieden wird. Zusätzlich ist die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung relativ kostengünstig und einfach herzustellen.
Der Begriff "biologisch aktives Material" umfaßt pharmazeutisch aktive Materialien und Materialien, welche die biologische Funktion verändern, insbesondere Proteine und Peptide und auch Moleküle, die Proteine oder Peptide umfassen, zum Beispiel Glycoproteine, die sowohl Protein als auch Zuckerreste enthalten. Andere biologisch aktive Materialien, die in den Zusammensetzungen vorhanden sein können, umfassen Nudeinsäuren, zum Beispiel Oligonudeotide wie Antisinn-Oligonucleotide, die zur Beeinflussung der Replikation von Nudeinsäuren in viral infizerten oder krebsartigen Zellen und zur Korrektur anderer Formen einer unangemessenen Zellwucherung zweckdienlich sein könnten. Polysaccharide wie Heparin sind ebenso für den Einschluß in die Zusammensetzungen geeignet wie auch Kombinationen von einem oder mehreren aus Protein, Nudeinsäure oder Polysaccharid.
Das Material kann in der Human- oder Veterinärmedizin zweckdienlich sein und kann entweder zur Behandlung oder zur Prophylaxe von Erkrankungen verwendet werden. Als Alternative können die Materialien für kosmetische oder für diagnostische Zwecke nützlich sein.
Wenn das biologisch aktive Material ein Protein oder Peptid ist, kann es eine Substanz sein, die natürlich im menschlichen oder tierischen Körper vorkommt, zum Beispiel ein Proteinhormon wie Insulin, Calcitonin oder ein Wachstumshormon oder ein Protein wie Erythropoietin, Plasminogenaktivatoren und ihre Vorläufer, z.B. t-PA Urokinase, pro-Urokinase und Streptokinase, ein Interferon, z.B. menschliches α-Interferon, oder ein Interleukin wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-4 oder IL-5, bzw. ein Blutfaktor wie Faktor VIII.
Als Alternative kann das Protein oder Peptid für den Gebrauch als Vaccine bestimmt sein, in welchem Fall es antigen ist, und kann das gesamte oder ein Teil eines Proteins sein, das von einem pathogenen Organismus stammt, zum Beispiel ein bakterielles Protein oder ein virales Hüliprotein. In jedem Fall kann das Protein oder Peptid von natürlichen Quellen isoliert werden, die durch genetisch veränderte Organismen erzeugt werden, oder kann vollständig oder teilweise durch automatisierte Mittel synthetisiert werden.
Für Vaccine ist es ein besonderer Vorteil, daß bei Verwendung der Zusammensetzung der Erfindung das biologisch aktive Material direkt in das lymphatische Gewebe geleitet wird, da es rasch für das Immunsystem verfügbar ist, das dann Antikörper erzeugen kann, die für das verabreichte Peptid oder Protein spezifisch sind, und dadurch dem Körper Immunität gegen den Organismus verleihen kann, von dem das Peptid oder Protein abgeleitet ist.
Der Antikörper kann vom IgG-, IgA- oder IgM-Isotyp sein, obwohl IgG bevorzugt ist. Wie zuvor erwähnt, ist er für das biologisch aktive Material spezifisch und kann durch herkömmliche Mittel zubereitet werden. Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern sind den Fachleuten allgemein bekannt.
Das biologisch aktive Material wird im allgemeinen an der Oberfläche der Körner adsorbiert, und der Antikörper wird zur Bildung eines Komplexes zwischen dem Material und dem Antikörper zugegeben, wobei ein Teil des Antikörpers zur nichtspezifischen Bindung an die M-Zellen frei bleibt. Vielleicht einer der überraschendsten Aspekte der vorliegenden Erfindung ist, daß es nicht notwendig ist, das aktive Material und den Antikörper in gleichen Mengen der Oberfläche der Körnern zuzugeben. Statt dessen ist es möglich, einen deutlichen Überschuß des aktiven Materials zu verwenden, und dies ermöglicht natürlich, daß eine größere Menge des Materials eine Endozytose mit den Körnern erfährt, als zu erwarten wäre.
Das Verhältnis von aktivem Material zu Antikörper kann deutlich schwanken, kann aber von bis zu etwa 750:1 bis 1:1 betragen. Allgemeiner beträgt das Verhältnis etwa 500:1 bis 10:1, und ein typischer Wert ist etwa 100:1.
Die Körner können entweder massiv oder hohl sein und können wahlweise biologisch abbaubar sein. Biologisch abbaubare Körner können aus Homo- oder Co-Polymeren natürlich vorkommender Materialien zubereitet werden, und zu Beispielen für solche Polymere zählen Poly(D,L-Lactid-Co-Glycolide), bei welchen die Anteile von Lactid und Glycolid in Übereinstimmung mit den genauen erforderlichen Eigenschaften verändert werden können. Biologisch aktive Materialien wie Proteine können in biologisch abbaubare Körner eingearbeitet werden, zum Beispiel in die Hohlräume hohler Körner, und werden freigesetzt, wenn sich die Körner zersetzen. Die Körner können so gewählt werden, daß sie sich nach einer vorgegebenen Zeit zersetzen - zum Beispiel nachdem die Körner durch die M-Zellen in das lymphatische System gegangen sind.
Die Körner werden aus einem nicht-immunogenen polymeren Material wie Polystyrol, Latex oder anderen Polymeren hergestellt und haben einen Durchmesser im Bereich von 0,05 um bis 10 um. Ein besonders geeigneter Korndurchmesser ist 100,1 bis 0,5 um.
Geeignete Körner können von Polysciences, Inc. (400 Valley Road, Warrington, PA18976, USA) erhalten werden.
Die Zusammensetzung kann in Form von Tabletten formuliert werden und kann andere Träger, zum Beispiel Füllmittel, Bindemittel oder Farb- oder Geschmackstoffe enthalten. Da die Zusammensetzung die Form von Körnern aufweist, wird jedoch bevorzugt, daß sie in Kapseln eingeschlossen wird, die entweder vom hartschaligen oder weichschaligen Typ sein können.
Vorzugsweise ist die Zusammensetzung enterisch überzogen, so daß sie durch den Magen gehen kann, ohne zersetzt zu werden, damit die größtmögliche Anzahl von Körnern das Peyer-Plaques-Gewebe erreicht. Geeignete enterische Überzugsmaterialien sind den Fachleuten gut bekannt.
Die Dosierung der Zusammensetzung kann einfach vom Fachmann bestimmt werden und ist den Dosierungen von Proteinen und Peptiden gleich, die gegenwärtig über andere Wege verabreicht werden.
In einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach dem ersten Aspekt geschaffen, wobei das Verfahren das Adsorbieren des biologisch aktiven Materials an Polymerkörner und das Reagieren des Materials mit einem Immunglobulin, das spezifisch an dieses bindet, umfaßt.
Die Schritte können in jeder Reihenfolge durchgeführt werden - das heißt, ein Antikörperkomplex kann hergestellt und dann an der Oberfläche der Körner adsorbiert werden, oder aber das biologisch aktive Material kann an der Oberfläche der Körner adsorbiert werden, wonach die Körner mit einem Immunglobulin inkubiert werden, das spezifisch an das Peptid oder Protein bindet. Im allgemeinen wird jedoch bevorzugt, daß die Körner mit dem biologisch aktiven Material inkubiert werden, zur Entfernung ungebundenen Materials gewaschen werden und dann getrennt mit dem Antikörper inkubiert werden.
Die Menge des biologisch aktiven Materials, die an die Oberfläche der Körner adsorbiert wird, ändert sich abhängig von der Konzentration des aktiven Materials in der Lösung, in welcher die Körner inkubiert werden. Es hat sich gezeigt, daß eine geeignete Konzentration des aktiven Materials etwa 3 bis etwa 10 mg/ml und vorzugsweise 4 bis 6 mg/ml beträgt. Für Proteine wie bGH, bSA und higg hat sich gezeigt, daß eine Sättigung der Körner bei Verwendung von Lösungen mit einer Konzentration von mehr als etwa 5 mg/ml erreicht wird.
Die Menge an biologisch aktivem Material, die adsorbiert wird, hängt natürlich auch von der Größe der verwendeten Körner ab. Je kleiner die Körner sind, um so größer ist natürlich der Oberflächenbereich pro Einheitsgewicht des Korns.
Wenn das zuvor beschriebene Verfahren zur Zubereitung der Formulierung verwendet wird, kann es notwendig sein, die Körner ein zweites Mal in einer Lösung aus aktivem Material vor der Inkubation mit der Antikörperlösung zu inkubieren, um die Menge an aktivem Material zu erhöhen, die an die Oberfläche der Körner adsorbiert wird. Wenn dieser zweite Inkubationsschritt angewendet wird, ist es häufig zweckdienlich, eine viel höhere Konzentration an aktivem Material in der Inkubationslösung zu verwenden, und eine geeignete Konzentration kann zum Beispiel 30 bis 80 mg/ml, für gewöhnlich etwa 50 mg/ml, betragen.
Das Verfahren kann die zusätzlichen Schritte der Einkapselung der Körner und der Beschichtung mit einem enterischen Überzug beinhalten.
Die Erfindung wird nun mit Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und auf die beiliegende Zeichnung näher beschrieben.
FIGUR 1 ist eine Darstellung der Proteinmenge, die an eine bestimmte Anzahl von Körnern bindet, gegenüber der Proteinkonzentration in der Inkubationsiösung.

Beispiel 1

Herstellung überzogener Körner

FLUORESBRITE , glatte 0,5 um Polystyrol-Mikrokügelchen Polysciences, Inc., Nr.17152, gelb-grün und Nr.19507, rot), wurden getrennt in pH 11,0 Puffer, eingestellt auf pH 7,4, in Gegenwart von 5 mg/ml Rinderserumalbumin (bSA), menschlichem Immunglobulin G (hIgG) oder Rinderwachstumshormon (bGH) 90 Min. bei 37ºC inkubiert. Proteinüberzogene Körner wurden dann zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und ungebundene Oberflächenstellen durch eine zweite Inkubation in einer 50 mg/ml bSA-Lösung 30 Min. bei 37ºC blockiert. Diese Körner wurden dann dreimal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung vor der Weiterverwendung gewaschen. Die Bindung des spezifischen IgG-Antikörpers, der gegen bGH erzeugt wurde, an die bGH-überzogenen Körner beinhaltete eine weitere Inkubation mit diesem Antikörper über 3 Stunden bei 37ºC. Das Anheften des Antikörpers an bGH wurde in getrennten Experimenten durch Schätzen der Menge an I¹²&sup5;-markiertem Antikörper, der an gleiche bGH-überzogene Körner gebunden ist, verifiziert.
Dann wurden Suspensionen von roten oder gelb-grünen Proteinkörnern, die mit verschiedenen Proteinen überzogen waren, in gleichen Anteilen vermischt, um eine Endsuspension, die 7,2 x 10¹¹ Körner/ml enthielt, herzustellen, die in Mausdarmschlingen, welche Peyer-Plaques-Gewebe enthielten, einzuträufeln.
Es wurden Experimente zur Optimierung der Proteinmenge, die an die Körner in der ersten Inkubation gebunden werden, durchgeführt, und es wurde eine Kurve von gebundenem Protein gegenüber der Proteinkonzentration in der Inkubationsiösung erstellt, um die optimale zu verwendende Proteinkonzentration zu berechnen. Diese Kurve ist in Figur 1 dargestellt. Die Inkubation von 0,5 um Körner wurde unter Verwendung von drei verschiedenen Proteinen, bGH, bSA und higg in Lösungen durchgeführt, deren Konzentration von 1 bis 10 mg/ml schwankte. Bei einer Standardanzahl von 3,65 x 11¹¹ 0,5 um Körnern zeigte sich, daß die maximale Protein menge, die gebunden werden konnte, von etwa 0,2 bis 1,5 mg reichte, und daß die Sättigung der Körner unter Verwendung von Lösungen mit einer Konzentration von mehr als etwa 5 mg/ml erreicht wurde.

Beispiel 2

Absorption von Körnern in M-Zellen

Acht bis zehn Wochen alte Balb/c-Mäuse wurden mit 0,4 ml Avertin (2,5% Gew.-Vol.) anästhesiert, das intraperitoneal injiziert wurde, und geschlossene Schlingen des distalen Ileums gebildet, die 7,2 x 10¹¹ Körner pro ml Krebs-Henseleit-Puffer, pH 7,4, enthielten. Peyer-Plaques-Gewebe, das von diesen Schlingen 45 Minuten später entfernt wurde, wurde dann in Puffer gewaschen und in 4% (Vol.-Vol.) Glutaraldehyd fixiert. Dieses Gewebe wurde dann mit 5% (Gew.-Vol.) Propidiumjodid gefärbt, um eine spätere Identifizierung von M-Zellen unter Verwendung konfokaler Mikroskopie zu erleichtern. Konfokale Bilder, die seriell in 4 um Abständen durch das Epithel gemacht wurden, wurden unter Bedingungen aufgenommen, die eine getrennte Zählung der roten und gelb-grünen fluoreszierenden Körner ermöglichten. Bei Anwendung dieser Methode war es auch möglich, die Anzahl von Körnern, die an die Oberfläche von M-Zellen banden, getrennt von jenen zu zählen, die bereits in die M-Zellen eingedrungen waren.
Es wurden Experimente durchgeführt, um die Wechselwirkung von Mikrokörnern mit Mausdarm-M-Zellen zu untersuchen. Es wurden drei verschiedene Experimente durchgeführt. Im ersten Experiment wurde die Aufnahme von freiem Rinderwachstumshormon (bGH) mit der Aufnahme von Rinderserumalbumin (bSA) verglichen. Im zweiten Experiment wurde die Aufnahme von bSA mit der Aufnahme von menschlichem Immunglobulin (hIgH) verglichen, und im dritten Experiment wurde die Aufnahme von freiem bGH mit der Aufnahme von bGH, das an einen spezifischen Antikörper gebunden war, verglichen. Die in diesem Experiment erhaltenen Ergebnisse, sind in den folgenden Tabellen 1 und 2 dargestellt. Tabelle 1 Tabelle 2
Alle Werte, die in den Tabellen 1 und 2 angeführt sind, sind Mittel ± SEM, geschätzt über 3 x 10&sup4; um² Darmfollikeloberfläche. Die in den Klammern angegebenen Werte stellen die Anzahl der analysierten Follikel dar.
Die in Tabelle 1 und 2 angegebenen Verhältnisse wurden getrennt für jedes analysiertes Follikel berechnet und entsprechen somit nicht exakt dem Verhältnis der Zahlen in der ersten und zweiten Spalte.
Das erste Experiment zeigt, daß Körner, die mit bSA überzogen sind, etwa zweimal so leicht an M-Zellen binden und in diese eindringen wie jene, die mit bGH überzogen sind, nachdem beide Sätze von Körnern gleichzeitig demselben Gewebestück in einer Darmschlinge präsentiert wurden. Das zweite Experiment zeigt, daß unter identischen Bedingungen Körner, die mit higg überzogen sind, mehr als fünfmal leichter an M-Zellen binden und in diese eindringen wie jene, die mit bSA überzogen sind. Diese Art einer nichtselektiven Wirkung wurde zuvor unter Verwendung von IgG-, IgA- und IgM-Proteinen beobachtet.
Das dritte Experiment zeigt, daß Körner, die mit bGH überzogen sind, an welche ein spezifischer Antikörper später gebunden wird, etwa zehnmal leichter aufgenommen werden, als Körner, die nur mit bGH überzogen sind, obwohl die erhöhte Bindungseffizienz nur das Dreifache beträgt. Dies war ein besonders unerwartetes Ergebnis, und der Mechanismus, der zu dieser selektiven Erhöhung in der Zellaufnahme führt, bleibt unbekannt.
Die statistische Bedeutung der in Tabelle 1 und 2 angeführten Ergebnisse wurde bewertet, und die Ergebnisse dieser Bewertung sind in Tabelle 3 angeführt. Tabelle 3
Tabelle 3 zeigt die statistische Bedeutung proteinselektiver Wirkungen auf die Mikrokombindung und Aufnahme durch Mausdarm-M-Zellen.
Die folgenden Ergebnisse werden angezeigt:
Oberflächenbindung bGH < bSA < higg; bGH < bGH-Ab
Zelluläre Aufnahme: bGH < bSA < higg; bGH < bGH-Ab
Selektivität: Aufnahme > Bindung: bGH = bSA = hIgG; bGH < bGH-Ab.
(NS) = statistisch nicht signifikant
Das verwendete Versuchsprotokoll ermöglicht die Bewertung der Signifikanz von Differenzen, die in Tabelle 1 angegeben sind, unter Verwendung eines gepaarten t-Test. Dies beseitigt wiederum jeden Fehler, der durch Unterschiede beim Tier oder Gewebe auftreten könnte. Alle der proteinabhängigen Differenzen in der Kombindung und Aufnahme waren statistisch signifikant, und die zusätzlich Erhöhung in der Kornaufnahme, die durch Bindung eines spezifischen Antikörpers an bGH herbeigeführt wurde, erwies sich ebenso als statistisch signifikant (P = 0,009).
Aus den Ergebnissen der vorangehenden Versuche ist ersichtlich, daß die Menge von Protein, welche in die M-Zellen eintritt, signifikant erhöht ist, wenn ein Antikörper, der mit dem Protein einen Komplex bildet, an den Körnern adsorbiert ist.

Beispiel 3

Bewegung von Körnern durch M-Zellen

Das in Beispiel 2 beschriebene Experiment wurde unter Verwendung von Ratten anstelle von Mäusen wiederholt. In diesem Experiment wurde 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 7,2 x 10¹¹ Körner pro ml enthielt, in das proximale Darmlumen von 11 Ratten eingeträufelt. Der Darminhalt wurden dann unter möglichst physiologischen Bedingungen distal fließen gelassen.
Bei fünf der Ratten wurde Peyer-Plaques-Gewebe von dem Darmlumen nach 90 Minuten entfernt und gewaschen und getarbt, bevor konfokale Bilder in 4 um Abständen durch das Epithel gemacht wurden, um die Anzahl von Körnern zu bestimmen, die an M-Zellen banden, sowie die Anzahl von Körnern, die bereits in die M-Zellen eingedrungen waren.
Bei den verbleibenden sechs Ratten wurde in die mesenterialen Lymphkanäle eine Kanüle eingeführt, bevor die Kornsuspension in das proximale Darmlumen eingeträufelt wurde, und Lymphproben wurden in Abständen von 5 Minuten 90 Minuten lang entnommen. Die Proben wurden dann unter Verwendung eines Fluoreszenzsortiergeräts (FACS-Analyse) abgetastet, um die Gegenwart von roten und grünen Körnern zu bestimmen.
In diesem Experiment wurden die Aufnahme und der Durchsatz von freiem Rinderwachstumshormon (bGH) mit ähnlichen Ergebnissen für an einen spezifischen Antikörper (bGH-Ab) gebundenes bGH verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4
Die in Tabelle 4 dargestellten Ergebnisse bestätigen die Ergebnisse von Beispiel 2, indem sie einmal mehr zeigen, daß Körner, die mit bGH überzogen sind, an das ein spezifischer Antikörper später gebunden wird, besser an M-Zellen binden
als Körner, die nur mit bGH überzogen sind. Ferner ist die Aufnahme der mit bGH-Ab überzogenen Körner noch signifikanter, wobei in diesem Fall etwa fünfmal so viele mit bGH-Ab überzogene Körner in M-Zellen eindrangen wie mit bGH überzogene Körner. Die Ergebnisse zeigen jedoch auch, daß etwa dreimal so viele Körner, die mit bGH-Ab überzogen waren, das lymphatische System erreichten im
Vergleich zu Körnern, die nur mit bGH überzogen waren. Dies legt nahe, daß die Bioverfügbarkeit einer pharmazeutisch aktiven Substanz durch ihren Einschluß in eine Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung signifikant verbessert ist, da die aktive Substanz vorzugsweise in das lymphatische System gelangen kann, wodurch der First-Pass-Stoffwechsel vermieden wird, der eintritt, wenn die aktiven Substanzen in der Leberpfortader absorbiert werden und direkt zu der Leber geleitet werden.

Claims

1. Pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zusammensetzung zur oralen Verabreichung, wobei die Zusammensetzung ein biologisch aktives Material, einen an das biologisch aktive Material spezifisch gebundenen Antikörper und eine Mehrzahl von Polymerkörnern enthält.

2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei welcher das biobgisch aktive Material ein Peptid oder ein Protein ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, bei welcher das Protein oder Peptid ein solches ist, das im menschlichen oder tierischen Körper natürlich vorkommt, z. B. ein Proteinhormon wie Insulin, Calcitonin oder ein Wachstumshormon, oder ein Protein wie Erythropoietin, Plasminogenaktivatoren und ihre Vorläufer, z.B. t-PA Urokinase, pro-Urokinase und Streptokinase, ein Interferon, z.B. menschliches α-Interferon, oder ein Interleukin wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-4 oder IL-5 bzw. ein Blutfaktor wie Faktor VIII.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 2, bei welcher das Protein oder Peptid für den Gebrauch als Vaccine geeignet ist und das gesamte oder Teile eines Protein enthält, das von einem pathogenen Organismus stammt.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welcher der Antikörper ein IgG, IgA oder IgM Isotyp ist.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei welcher die Körner aus Polystyrol bestehen.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei welcher die Körner in der Größenordnung von 0,5 um bis 10 um sind.

8. Zusammenfassung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei welcher das aktive Material und der Antikörper einen Komplex bilden, der an der Oberfläche der Körner adsorbiert ist.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei welcher das Verhältnis von aktivem Material zu Antikörper von 750:1 bis 1:1 beträgt.

10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei welcher die Körner biologisch abbaubar sind.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, bei welcher die biologisch abbaubaren Körner zusätzlich ein Protein oder Peptid enthalten.

12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, welche einen enterischen Überzug besitzt.

13. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein aktives Material, einen spezifisch an das aktive Material gebundenen Antikörper und eine Mehrzahl von Polymerkörnern aufweist; wobei das Verfahren das Adsorbieren des biologisch aktiven Materials an die Polymerkörner und das Reagieren des aktiven Materials mit dem Antikörper umfaßt.

14. Verfahren zur Herstellung einer phamazeutischen Zusammensetzung, die ein aktives Material, einen spezifisch an das aktive Material gebundenen Antikörper und eine Mehrzahl von Polymerkörnern aufweist; wobei das Verfahren das Binden des Antikörpers an das biologisch aktive Material und das nachfolgende Adsorbieren des gebundenen Antikörpers an die Körner umfaßt.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, welches weiters das enterische Überziehen der Zusammensetzung umfaßt.