DE68927679T2

DE68927679T2 - Immunhilfsmittel aus Liposome enthaltend Lymphokin IL -2

Info

Publication number: DE68927679T2
Application number: DE68927679T
Authority: DE
Inventors: Peter Anderson; Arnold Leonard; Cynthia Loeffler; Augusto Ochoa
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 1988-10-27
Filing date: 1989-10-25
Publication date: 1997-06-26
Anticipated expiration: 2009-10-26
Also published as: ATE147633T1; EP0440742A1; US5409698A; EP0440742B1; JPH04501562A; AU4525589A; JP2955314B2; US5773006A; WO1990004412A1; US5650152A; DE68927679D1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Interleukin-2 (IL-2) enthaltenden Liposomen, die die Immunoadjuvans-Wirksamkeit von IL-2 erhöhen können, wobei das Verfahren das Inkorporieren einer wirksamen Immunoadjuvans-Menge an IL-2 in Liposomen durch Hydratisieren von Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) mit einer wäßrigen Lösung umfaßt, die IL-2 und eine wirksame Menge eines Trägerproteins enthält, um ein wäßriges IL-2/Trägerprotein/DMPC-Gemisch zu erzeugen, wobei das wäßrige Gemisch durch ein Trägerprotein:DMPC-Verhältnis (Gew./Gew.) von 1:2 bis 1:12 in den resultierenden Liposomen gekennzeichnet ist. Ferner betrifft die Erfindung Interleukin-2 (IL-2) enthaltende Liposomen, die nach dem Verfahren hergestellt werden können.

Hintergrund der Erfindung

Die Nützlichkeit von Immunoadjuvantien (oder "Adjuvantien") bei der Verabreichung von immunogenen Substanzen ist seit langem bekannt, und es sind erhebliche Anstrengungen unternommen worden, um Substanzen aufzufinden, die bei Zugabe zu einem Antigen oder einer anderen immunogenen Substanz die antigene Aktivität und damit die Antikörper-stimulierende Fähigkeit verstärken. Bis jetzt sind viele derartige Adjuvantien aufgefunden worden, wie die Anwendung der Alaun-Fällung von Antigenen; die Kombination bestimmter spezifischer Antigene, wobei einige davon die Aktivität von anderen in dem Gemisch verstärken; die Verwendung von Calciumphosphat, insbesondere zur Verstärkung der Influenza-Antikörperbildung, und die entsprechende Verwendung von Staphylococcus-Toxin, das die Antikörperreaktion auf bestimmte Antigene zu verbessern scheint. Mehrere weitere Adjuvans-Substanzen sind ebenfalls in Betracht gezogen worden, wie Tapioca, Calcium- oder Magnesiumsalze, Tannin und dergl., die bei Zugabe zu bestimmten spezifischen Antigenen den Antikörpertiter gegenüber dem, der bei Verabreichung des Antigens allein erzielt werden kann, erhöhen können.
Immunoadjuvantien erhöhen die Menge an gebildetem Antikörper und ver ringern die Menge an Antigen, die für die Injektion erforderlich ist, und damit die Häufigkeit der Injektion. Aluminium-Adjuvantien werden allgemein verwendet, und obwohl sie als sicher beim Menschen angesehen werden, können sterile Abszesse und persistente Knötchen ihrer Verabreichung folgen. Komplettes Freund-Adjuvans, eine Öl-in-Wasser-Emulsion, die Tuberkelbazillen enthält, ist wirksamer als die Aluminium-Adjuvantien. Die schädlichen Nebenwirkungen unter Einschluß der Bildung von schweren Granulomen, allergischer Reaktionen und der Ölretention in Geweben schließen seine Verwendung bei Menschen jedoch aus.
Interleukin-2 (IL-2) nimmt eine zentrale Rolle bei der verstärkung der zellvermittelten Immunreaktionen ein; vgl. K. A. Smith, Science, Bd. 240 (1988), S. 1169. Es ist kürzlich gezeigt worden, daß bei Verwendung eines Vaccin-Adjuvans IL-2 die genetische Nichtansprechbarkeit von Malariasporozoiten-Peptiden überwindet und den Schutz gegen Herpes simplex und Tollwutviren verstärkt; vgl. z. B. M. F. Good et al., J. Immunol., Bd. 141 (1988), S. 972; A. Weinberg et al., J. Immunol., Bd. 140 (1988), S. 294; J. H. Nunberg et al., J. Cell. Biochem., Supp. 128 (1988), S. 12. IL-2 erleichtert auch die nicht-spezifische Tumorabtötung durch aktivierte Makrophagen und die Induktion des Lymphokin-aktivierten Killer-pHänomens (LAK) bei Lymphocyten; vgl. z. B. M. Malkovsky et al., Nature, Bd. 325 (1987), S. 262; E. A. Grimm et al., J. Ext. Med., Bd. 158 (1988), S. 1356; J. J. Mule et al., Science, Bd. 225 (1984), S. 1487; und J. M. Zarling et al., Nature, Bd. 274 (1978), S. 269. Es zeigt antineoplastische Aktivität bei zahlreichen murinen Tumormodellen, wenn es allein oder in Kombination mit adoptiv übertragenen Zellen, d. h. mit IL-2-stimulierte Zellen, die Lymphokin-aktivierte Killeraktivität (LAK) zeigen, verwendet wird. Wenn jedoch dieses Lymphokin allein oder in Kombination mit peripheren mononudearen Blutzellen verwendet wird, die mit IL-2 in Gewebekulturmedien stimuliert worden sind, dann besteht bei Verfahren zur Humankrebsimmuntherapie nur ein begrenzter Erfolg; vgl. R. R. Salup et al., Cancer Immunol. Immunother., Bd. 22 (1986), S. 31; N. Bennstein et al., J. Immunol., Bd. 140 (1988), S. 2839; S. A. Rosenberg et al., N. End. J. Med., Bd. 313 (1985), S. 1485; ebenda, Bd. 316 (1987), S. 889; Ann. of Surg., Bd. 208 (1988), S. 121; Ann. Int. Med., Bd. 108 (1988), 5. 853 und R. 1. Fisher et al., Ann. Int. Med., Bd. 108 (1988), S. 518. Die klinischen Reaktionen von Patienten, die IL-2 und/oder adoptiv übertragene Zellen, die mit IL-2 stimuliert wurden, erhalten, liegen im Bereich von etwa 20% bis 30% für Nierenzellkarzinom, 10% bis 20% für Melanom und 15% oder weniger für Kolonkarzinom.
Schwere systemische Toxizität ist mit der langzeitigen IL-2-Verabreichung in hoher Dosis bei Menschen und mit Protokollen, bei denen adoptiv übertragene Zellen mit LAK-Aktivität in Kombination mit IL-2 verwendet werden, verbunden. Nebenwirkungen umfassen Fieber, Übelkeit, Leber- und Nierendysfunktion, ungünstige Wirkungen auf das zentrale Nervensystem, wie Schläfrigkeit, Desorientierung und Koma, sowie Anasarca in Verbindung mit einem lebensbedrohenden pulmonaren Kapillarlecksyndrom; vgl. S. A. Rosenberg in: Important Advances in Oncology, V. T. DeVita et al. (Hrsg.), J. P. Lippincott Co., Philadelphia, PA (1988) auf den Seiten 217-257. Ferner beträgt die Halbwertszeit von IL-2 in vivo nur etwa 4 Minuten.
Das durch subkutane Injektionen von Dimethylhydrazin in syngenetische C57BL/6-Mäuse induzierte murine MC-38-Kolonadenokarzinom ist zur Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit einer Immuntherapiebehandlung gegen Lebermetastasen von Kolonkrebs verwendet worden. Eine signifikante Tumorverringerung bei diesem Modell ist zuvor mit IL-2-aktivierten Tumorinfiltrationslymphocyten (TIL), einer Unterpopulation von Lymphocyten, die in wachsende Krebse eindringen, in Kombination mit IL-2 und Cyclophosphamid erzielt worden; vgl. S. A. Rosenberg et al., Science, Bd. 233 (1986), S. 1318. Hohe Dosen an IL-2 allein haben jedoch keine signifikante therapeutische Wirkung auf diesen Tumor. Ferner ist im Vergleich mit der Anzahl der erforderlichen TIL-Zellen eine große Anzahl an LAK-Zellen erforderlich, um eine Tumorverringerung zu erzielen. Da die Vermehrung beider Arten von Zellkulturen schwierig ist, sind große Anzahlen an Zellen in den Ausgangskulturen oder lange Kulturzeiten erforderlich, um ausreichende Anzahlen an Zellen für eine wirksame Immuntherapie zu erhalten.
Liposomen mit einer oder mehreren Doppeischichten modifizieren und ändem erheblich die Resorption und Verteilung von eingeschlossenen Arzneimitteln aufgrund der lymphatischen Resorption und der Makrophagenaufnahme. Diese Aufnahme erfolgt hauptsächlich in der Leber und in einem geringeren Maß in anderen Geweben, die reich an Makrophagen sind, unter Einschluß von Lunge, Knochenmark und Milz; vgl. K. J. Hwang: in Liposomes from Biophysics to Therapeutics, M. J. Ostro (Hrsg.), Marcel Decker, NY (1987), auf den S. 109-156. Zum Beispiel ist berichtet worden, daß bei Amphotericin B die Wirkung gegen Pilze erhöht und die systemische Toxizität in einer liposomalen Formulierung verringert wird; vgl. G. Lopez-Berestein, Ann. Int. Med., Bd. 105 (1986), S. 130. Die Wirkung der liposomalen Inkorporation und Abgabe auf die Lokalisierung und Aktivität von Cytokinen und anderen bioaktiven Verbindungen ist jedoch kaum vorhersagbar. Ferner kann die liposomale Stabilität in ungunstiger Weise durch Wechselwirkungen der bioaktiven Verbindung oder ihres Trägers mit der Phospholipidvesikelwand beeinträchtigt werden, was zu geringen Konzentrationen der Inkorporation, Austreten des aktiven Bestandteils oder geringer Stabilität der fertigen Zusammensetzung führt. Es gibt Hinweise darauf, daß unter bestimmten Umständen der Cytokinaustritt aus den Liposomen anstelle der Internalisierung durch Makrophagen mit biologischer Aktivität verbunden ist.
Daher besteht weiterhin ein Bedarf sowohl an Immunoadjuvantien mit erhöhter Wirksamkeit und verringerter Toxizität als auch an einer Verbesserung der Bioaktivität und Bioverfügbarkeit von IL-2 bei gleichzeitiger Abschwächung seiner Toxizität. Ferner besteht weiterhin ein Bedarf sowohl an verbesserten Varietäten von adoptiven Zellen für die Immuntherapie von Krebs als auch an einer verringerten Toxizität, die mit ihrer Anwendung verbunden ist. Zusätzlich sind Verbesserungen hinsichtlich der Arzneimittelabgabe von Cytokinen, wie IL-2, erforderlich, um praktische Behandlungspläne für ambulant behandelte Patienten zu entwickeln.
EP-A-274219 beschreibt auf S. 2, Zeilen 45-46: "Verschiedene Additive können zu dieser IL-2 enthaltenden Pufferlösung gegeben werden, z. B. menschliches Serumalbumin oder Antioxidantien als Stabilisatoren oder Antiadsorbentien". Die Verwendung eines Proteinträgers wird nicht beschrieben.
GB-A-2 157 172 beschreibt die Herstellung von IL-2 enthaltenden Lipesomen, die HSA als einen Stabilisator enthalten, auf S. 3 in den Zeilen 3-5 und lehrt außerdem auf S. 3, Zeilen 4-5, daß der Stabilisator "vorzugsweise... in einer Menge von bis zu 20 Mol-% des Lipids in dem erhaltenen Liposom vorhanden" ist. GB-A-2 157 172 lehrt nicht die Herstellung von Liposomen durch Hydratisierung von Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) mit einer wäßrigen IL-2-Lösung, die einen Proteinträger enthält, so daß das Verhältnis Träger:liposomales Lipid (Gew./Gew.) (Gewicht-zu-Gewicht-Basis) 1:2 bis 1:12 beträgt, und schlägt dies auch nicht vor.

Kurze Darstellung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Liposom bereit, das eine wirksame Immunoadjuvans- und/oder antineoplastische Menge an Interleukin-2 (IL-2) enthält. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Erhöhung der Immunoadjuvans- und/oder antineoplastischen Wirksamkeit von Interleukin-2 durch liposomale Inkorporation bereit, wobei ein wirksames Vaccinadjuvans oder Antitumormittel erhalten wird. Zum Beispiel führte die Inkorporation von IL-2 in Liposomen zu einer Zusammensetzung, die eine verlängerte IL-2- Halbwertszeit (68 Minuten) gegenüber der von freiem IL-2 (etwa 4 Minuten) in vivo und eine erhöhte Antitumorwirksamkeit bei einem murinen pulmonalen Metastasemodell zeigte. Signifikante Immunoadjuvans-Eigenschaften von IL-2-Liposomen wurden ebenfalls gezeigt, und zwar unter Verwendung von freiem oder Alaun-adsorbiertem Tetanustoxoid als Modellantigen. Diese Studien zeigen die Eignung der Liposomentechnologie zur Erhöhung der Wirksamkeit von IL-2 und möglicherweise anderer Cytokine als antineoplastische Mittel und als Immuneadjuvantien in immunologischen Zusammensetzungen, wie Vaccinen.
Daher gehören Vaccine, die eine wirksame Adjuvansmenge der vorliegenden Cytokin-Liposomen und eine immunologisch wirksamen Menge an Vaccinantigenen enthalten, ebenfalls zum Umfang der vorliegenden Erfindung. Der Ausdruck "wirksame Immunoadjuvansmenge", wie er hier in bezug auf IL-2 verwendet wird, ist so definiert, daß eine pharmazeutische Einheitsdosis der vorliegenden IL-2-Liposomen eine signifikante Adjuvanswirkung aufgrund des eingeschlossenen IL-2 zeigt, wenn sie mit einer pharmazeutischen Einheitsdosis eines Vaccinantigens und einem physiologisch verträglichen flüssigen Vehikel, um ein fertiges Vaccin zu erhalten, kombiniert wird. Der Grad der Inkorporation von IL-2 in ein gegebenes erfindungsgemäßes Liposom ist also hoch genug, so daß die fertige flüssige Vaccinformulierung ohne weiteres in einer akzeptablen Menge eines flüssigen Vehikels injiziert werden kann. Wahlweise können auch weitere Adjuvantien, wie die, die hier beschrieben werden, mit dem Antigen und den IL-2-Liposomen kombiniert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Interleukin-2 enthaltende Lipesomen bereit, die es möglich machen, wirksam eine Reihe von Krebserkrankungen zu behandeln, die auf das Peritonium und/oder die Leber beschränkt sind, und zwar unter Verwendung einer Kombination aus adoptiv übertragenen Zellen und Liposomen, die eine in vivo wirksame antineoplastische Menge an IL-2 enthalten. Diese adoptiv übertragenen Zellen wurden zuvor mit einem Antikörper gegen einen Lymphocytenoberflächenrezeptor, wie monoklonalem Antikörperanti-CD3, plus IL-2 (anti-CD3 + IL-2) in vitro behandelt. T-Zellen in diesen in vitro-Kulturen entwickeln eine Antikrebsaktivität durch ein nicht-spezifisches pHänomen [z. B. Lymphokin-aktiviertes Killer-Phänomen (LAK)], bei dem die Zellen in einer nicht-MHC-beschränkten Weise lysiert werden; vgl. A. C. Ochoa et al., Cancer Res., Bd. 49 (1989), S. 963.
Da das T-Zellwachstum in Gegenwart von monoklonalem anti-CD3-Antikörper und IL-2 merklich verstärkt wird, kann eine erhöhte Immunspezifität gegen den Tumor unter Verwendung von Tumor-infutrierenden Lymphocyten oder Zellen erzielt werden, die nach der vorherigen Immunisierung mit Tumor-assoziierten Antigenen als Ausgangsmaterial für anti-CD3 + IL-2-stimulierte Kulturen erhalten werden. Es ist kürzlich auch gezeigt worden, daß CD3'CD4'CD8'-T-Zellen mit dem gamma-delta-Typ des spezifischen T-Zellrezeptors zur spezifischen Antigenerkennung ohne die Anforderungen der Hauptgewebeverträglichkeitskomplex (MHC)-Beschränkung imstande sind; vgl. E. M. Janis et al., Science, Bd. 244 (1989), S. 713. Diese Zellen vermehren sich auch rasch in Gegenwart von anti-CD3 + IL-2.
Wie vorstehend erörtert wurde, erhöht die Inkorporation von IL-2 und Liposomen die Wirksamkeit von IL-2 als ein antineoplastisches Mittel gegen murine pulmonare Metastasen mit oder ohne adoptiv übertragene Immunzellen. In einem weiteren murinen Modelisystem, dem MC-38-Kolonadenokarzinom, hat sich die Kombination aus adoptiv übertragen anti-CD3 + IL-2-stimulierten Zellen und IL-2-Liposomen als signifikant antineoplastisch wirksam gegen Lebermetastasen erwiesen. Wenn andererseits als Ersatz freies IL-2 unter Verwendung der gleichen IL-2-Dosis und des gleichen Plans mit oder ohne adoptiv übertragene anti-CD3 + IL-2-stimulierte Zellen eingesetzt wird, dann ist kein signifikanter therapeutischer Vorteil sichtbar.
Die vorstehend genannte antineoplastische Behandlung umfaßt daher sowohl 1) eine wirksame Menge der vorliegenden Cytokinliposomen als auch 2) eine wirksame antineoplastische Menge an adoptiv übertragenen anti-CD3 + IL- 2-stimulierten Zellen. Der Ausdruck "wirksame antineoplastische Menge", wie er hier in bezug auf IL-2 verwendet wird, ist als eine pharmazeutische Einheitsdosis der vorliegenden IL-2-Liposomenformulierung definiert, die eine signifikante Verringerung des Tumors aufgrund von eingeschlossenem IL-2 zeigt. Ebenso ist eine "wirksame Menge an adoptiv übertragenen Zellen und IL-2-Liposomen" als eine Anzahl von Zellen in Kombination mit einer pharmazeutischen Einheitsdosis an IL-2-Liposomen definiert, die eine signifikante Verringerung des Tumors aufgrund der kombinierten Therapie zeigt. Im allgemeinen liegt die bevorzugte Anzahl an Zellen bei der Behandlung von Menschen im Bereich von etwa 1x10&sup8; bis 1x10¹¹ Zellen. Die maximale Dosierung von IL-2 für die Behandlung von menschlichen Patienten beträgt etwa 3x10&sup6; Einheiten pro m² Körperoberfläche pro Tag. Wenn jedoch die therapeutische Dosis direkt an der Quelle des Tumors verabreicht werden könnte, dann könnte die Menge an verabreichtem IL-2 im Bereich von 1x10&sup6; bis 10x10&sup6; Einheiten pro m² Körperoberfläche pro Tag liegen.
Der Grad der Inkorporation von IL-2 in ein gegebenes erfindungsgemäßes Liposom ist hoch genug, so daß die Zubereitung ohne weiteres in vivo in einer akzeptablen Menge an flüssigem Vehikel injiziert werden kann. Der Weg der Injektion kann systemisch, d. h. intravenös oder subkutan, oder lokal in bezug auf den Tumor sein. Die lokale Injektion umfaßt z. B. die Injektion in den Tumor direkt, intralymphatisch, in eine Körperhöhle, die den Tumor enthält, oder in das arterielle Bett oder die Blutzufuhr für den Tumor. Zum Beispiel kann es sich für Menschen mit Lebertumoren bei der Verabreichung um eine intravenöse oder intraperitoneale Injektion oder um einen Katheter direkt in die Leberartene handeln.

Zusammenfassende Darstellung der Zeichnung

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Adjuvanswirkung von IL-2- Liposomen bei Verwendung in Kombination mit Tetanustoxoid (TT).
Fig. 2 (Diagramme A-D) ist eine graphische Darstellung des anti-Tetanus-Antikörpertiters, der unter Verwendung von TT in Kombination mit freiem IL-2, IL-2-Liposomen (IL-2-lipo) und ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) erzielt wird.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung von anti-Tetanus-IgG-Antikörpertitern, die mit Tetanustoxoid (TT) und Alaun-adsorbiertem TT mit und ohne IL-2-Liposomen erzielt werden.

Ausführliche Darstellung der Erfindung

Interleukin-2 (IL-2) ist ein im Handel als T-Zell-Wachstumsfaktor (Humaninterleukin-2, rekombinant; T3267) und abgeleitet aus gezüchteten Ratten-Splenocyten (T0892) von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhältlich. Rekombinantes IL-2 kann auch von Genzyme (Boston, MA) oder R & D Systems (Minneapolis, MN) erhalten werden. Es wird angenommen, daß andere Lymphokine, die auf diesem Gebiet verfügbar sind, in der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden können. Diese umfassen IL-4, IL-6, alpha-Interferon und gamma-Interferon. Es wird vorhergesagt, daß diese Lymphokine allein, in Folge oder in Kombination, wie gemeinsam eingeschlossen in das Liposom (z. B. IL-2 und IL-6), verwendet werden können.

Liposomen

Es ist bekannt, daß unter bestimmten Bedingungen Phospholipiddispersionen spontan in Gegenwart von Wasser geschlossene Membransysteme bilden können. Die Elektronenmikroskopie zeigt, daß diese Strukturen aus einer Anzahl von konzentrischen Doppelschichten aus Phospholipidmolekülen aufgebaut sind, und sie werden als Liposomen bezeichnet. Die Eignung von Liposomen als Membranmodellsystem ergibt sich aus der Tatsache, daß, wenn die trockenen Phospholipide einer definierten Abfolge von molekularen Umlagerungen unterliegen, die Möglichkeit für einen unbeschränkten Eintritt von hydrophilen gelösten Stoffen zwischen die Ebenen der hydrophilen Kopfgruppen besteht. Entsprechend tritt eine Maskierung von hydrophoben gelösten Stoffen innerhalb der hydrophoben Doppelschichten auf. Das Ergebnis ist ein Abgabesystem, das variierende Mengen an Cytokinen oder anderen bioaktiven Verbindungen in Abhängigkeit vom Typ der Wechselwirkung zwischen dem gelösten Stoff und dem Phospholipid enthalten kann.
Es sind viele Verfahren für die Herstellung von Liposomen vorgeschlagen worden. Die meisten dieser Verfahren beinhalten eine Form einer wäßrigen Hydratisierung des Lipids, das in pulverisierter Form oder als getrockneter Film vorliegen kann. Eine der am häufigsten angewandten Techniken ist als das Filmverfahren bekannt. Kurz gesagt werden Lipide der gewünschten Zusammensetzung in Lösung mit einem organischen Lösungsmittel in Form eines dünnen Films auf den Wänden eines Rundkolbens getrocknet. Eine bioaktive Verbindung kann in den Film in diesem Stadium eingeschlossen werden. Der trokkene Film wird durch Zugabe einer geeigneten wäßrigen Phase und vorsichtiges Bewegen des Kolbens hydratisiert. Bei einer hydrophilen bioaktiven Verbindung wird eine wäßrige Lösung zur Hydratisierung verwendet. Die nach diesem Verfahren gebildeten Liposomen weisen im allgemeinen eine Anzahl von konzentrischen Doppeischichten auf und werden als multilaminare Vesikel (MLVs) bezeichnet.
Liposomen sind als potentielle Arzneimittelabgabesysteme zur Einführung von biologisch aktivem Material in Zellen untersucht worden; vgl. Poznansky und Juliano, Pharmacol. Rev., Bd. 36 (1984), S. 277-336; B. E. Ryman et al., Essays in Biochemistry, Bd. 16 (1980), S. 49. Mehrere Wege der Verabreichung sind für die Verabreichung von Liposomen verwendet worden, z. B. intravenöse, subkutane, intraperitoneale und orale Abgabe; vgl. Gregoriadis und Allison (Hrsg.), Liposomes in Biological Systems, John Wiley & Sons, New York (1980), auf den S. 153-178. Ein wichtiger Vorteil der liposomalen Abgabe ist die Änderung der Gewebeverteilung und der Bindungseigenschaf ten im Vergleich mit den freien Formen des bioaktiven Bestandteils, was zu einem verbesserten therapeutischen Index und einer verringerten Toxizität führt. Zum Beispiel ist eine verringerte Nephrotoxizität mit der Verwendung von Liposomen, die Amphotericin B oder Cyclosporin A enthalten, verbunden; vgl. G. Lopez-Berestein, Ann. Int. Med., Bd. 105 (1985), S. 130 und Hsieh et al., Transplantation Proceedings&sub1; Bd. XVII (1985), S. 1397-1400. Außerdem sind eine verringerte Kardiotoxizität und Nephrotoxizität mit Liposomen verbunden, die Doxorubicin bzw. cisplatin enthalten, und zwar im Vergleich mit den freien Formen der Arzneimittel; vgl. Rahman et al., Cancer Res., Bd. 42 (1982), S. 1817 und Forssen et al., Cancer Res., Bd. 43 (1983), S. 546.
Liposomen, die für die Abgabe von bioaktiven Mitteln verwendet werden, weisen zwar typischerweise einen Durchmesser im Bereich von 25 nm (250 Å) bis zu mehreren Mikrometern auf; kleine unilamellare Vesikel (SUVs) im Bereich von etwa 25 nm (250 A) bis 30 nm (300 Å) sind jedoch besonders günstig für die Verwendung als Arzneimittelvehikel, und zwar aufgrund ihrer Größe. SUVs scheinen eine erhöhte Verteilung hin zum Knochenmark zu zeigen, und sie zeigen auch eine erhöhte Lebensdauer im Kreislaufsystem bei intravenöser Verabreichung. Es ist auch berichtet worden, daß kleinere Vesikel wirksamer bei subkutanen Injektionen bei der Abgabe von Arzneimitteln an Lymphknoten sind.
Liposomen unter Einschluß von SUVs sind jedoch oftmals während der Langzeitlagerung und bei der Infusion in Säugersysteme instabil. Der Grund für den Mangel an physikalischer Stabilität wird nicht gut verstanden. Im Hinblick auf die Stabilität innerhalb von Säugersystemen ist jedoch bekannt, daß Phospholipide Substrate für Enzyme, wie Phospholipase A&sub2;, Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase (LCAT) und dergl., sind, die in vivo gefunden werden.
Kürzlich hat W. J. Bauman in der US-Patentanmeldung Seriennummer 17 369, die am 24. Februar 1987 eingereicht wurde, ein Verfahren offenbart, um die Phospholipase A&sub2;-artige Spaltung von Liposommembranen zu hemmen. Gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung wurde die Phospholipase A&sub2;-Hydrolyse (PLA&sub2;-Hydrolyse) von kleinen unilamellaren Vesikeln (SUV-Liposomen) mit Membranen, die ein Gemisch aus 1-Palmitoyl-2-oleyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC) und etwa 20-30 Mol-% 1-Palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (lysoPC) enthielten, vollständig gehemmt.
Historisch wurden Liposomen als Suspensionen untersucht und erst kürzlich zu einer Pulverform gefriergetrocknet, so daß die Redispersion zum Zeitpunkt der Verabreichung möglich ist; vgl. Gorden et al., Drug Dev. Ind. Pharm., Bd. 8 (1982), S. 465; Crommelin et al., Pharm. Res., Bd. 1 (1984), S. 159; und Evans et al., US-Patente 4 311 712 und 4 370 349. Eine systematische Optimierung der Gefriertrocknung von Liposomen ist in Gegenwart von verschiedenen Disacchariden und Gefrierschutzmitteln unter Verwendung von Carboxyfluorescein als Marker erfolgt; vgl. Fransen et al., Int. J. Pharm., Bd. 33 (1986), S. 27.
Da die liposomale Instabilität ein Hauptproblem für die Langzeitlagerung ist, ist die Bereitstellung von Liposomen in einer trockenen Pulverform, die ohne weiteres redispergiert werden kann, sehr erwünscht. Das Gefriertrocknen ist zwar zur Herstellung von trockenen Pulverliposomen und Arzneimittelgemischen angewandt worden; Forscher haben jedoch über Probleme des Austretens von Arzneimittel bei der Rekonstitution berichtet. In einigen Fällen sind die Liposomen unter Verwendung von Saccharose oder Trehalose zur Aufrechterhaltung der Integrität der liposomalen Membranen während des Gefriertrocknens stabilisert worden; vgl. Strauss und Hauser, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 83 (April 1986), S. 2422; und Strauss et al., Biochim. Biophys. Acta, Bd. 858 (1986), S. 169.

Vaccinantigene

Die vorliegende Erfindung stellt ein wirksames, gut verträgliches Adjuvans zur Inkorporation in einen weiten Bereich an Vaccinen und Antigenzusammensetzungen für die Verwendungen beim Menschen und bei Tieren bereit.
Das Antigen selbst kann in Form eines gereinigten oder teilweise gereinigten Antigens, das von Bakterien, Parasiten, Viren oder Rickettsien abgeleitet ist, oder als Tumorantigen vorliegen, oder das Antigen kann ein Allergen, wie Pollen, Stäube, "danders" und Extrakte davon, sein, oder das Antigen kann in Form eines Giftes oder Tiergiftes, das aus giftigen Insekten oder Reptilien stammt, vorliegen. Das Antigen kann auch ein Polysaccharid oder ein synthetisches Polypeptid, das durch Festphasensynthese oder durch rekombinante DNA-Techniken erhalten wird, sein. In allen Fällen liegt das Antigen in einer Form vor, die bei Einführung in einen geeigneten Wirt mit oder ohne wirksames Adjuvans eine aktive Immunität durch Stimulierung der Bildung von Antikörpern und/oder zellulären Immunreaktionen gegen das spezifische Antigen induzieren kann oder im Fall eines Allergens dazu beiträgt, die Symptome der Allergie aufgrund des spezifischen Allergens zu lindern. Die Antigene können allein oder in Kombination verwendet werden. Antigene von besonderer Bedeutung sind von Bakterien, wie H. pertussis, Leptospira pomona und icterohaemorrhagiae, S. typhosa, S. paratyphi A und B, C. diphtheriae, C. tetani, C. botulinum, C. perfringens, C. feseri und anderen Gas-Gangrenbakterien, B. anthracis, P. pestis, P. multocida, V. cholerae, Mycobacterien und dergl.; von Viren, wie Poliovirus (mehrere Typen) , Adenovirus (mehrere Typen), Parainfluenzavirus (mehrere Typen) , Masernvirus, Mumpsvirus, "respiratory syncytial virus", Influenzavirus (mehrere Typen), "shipping fever virus" (SF4), Hepatitis B, Retroviren, wie HIV und HTLVI, westliche und östliche Pferde-Encephalomyelitis, japanische B. Encephalomyelitis, russische Frühling/Sommer-Encephalomyelitis, Schweinecholeravirus, Maul- und Klauenseuche, Geflügelpocken, Newcastle-Krankheit-Virus, Tollwutvirus, Katzen- und Hundestaupe und dergl.; von Rickettsien, wie epidemischem und endemischem Typhus, oder anderen Mitgliedern der Fleckfiebergruppe; von verschiedenen Spinnen- und schlangengiften oder beliebigen bekannten Allergenen, wie "ragweed", Hausstaub, Pollenextrakten, Graspollen und dergl., abgeleitet Weitere Antigene von Bedeutung stammen von Parasiten, die mit Lyme- Krankheit, Malaria (Plasmodium falciparum und Plasmodium vivax), Shistomiase, Leichmaniase, Cysticercose (Bandwürmer) und Plattwürmern oder dergl.; und von Tumorantigenen, die von Lungenkrebs, Kolonkrebs, Melanom und Neuroblastom, abgeleitet sind.

Vaccinformulierungen

Die vorliegenden IL-2-Liposomen können als Adjuvans-Zusätze bei im Handel erhältlichen Vaccinformulierungen verwendet werden, oder sie können in Vaccine durch Kombination in einer wirksamen Menge mit einer wirksamen Menge der Vaccinantigenzubereitung in einem pharmazeutisch verträglichen, nicht-toxischen Vehikel, z. B. einem flüssigen Vehikel, wie steriler physiologischer Kochsalzlösung, formuliert werden. Die Abgabe des Vaccins erfolgt durch intramuskuläre, intrapleurale, subkutane oder intradermale Injektion, als Tropfen oder intranasales Aerosol oder durch Kombination dieser Arten zu einem Zeitpunkt oder in einer Mehrzahl von Einheitsdosen.
Das absolute Gewicht des Vaccinantigens und/oder der IL-2-Liposomen, die in einer gegebenen Dosisform des Vaccins enthalten sind, kann stark variieren, und zwar abhängig von Faktoren, wie dem Alter, Gewicht und physischen Zustand des Patienten, für den die Vaccinisierung in Betracht gezogen wird. Derartige Faktoren können ohne weiteres vom Arzt oder Veterinärmediziner unter Anwendung von Tiermodellen oder anderen Testsystemen, die dem Fachmann bekannt sind, bestimmt werden.
Stimulierte Zellen
Lymphocyten können in Gegenwart von IL-2 und einem Antikörper gegen einen Lymphocytenoberf lächenrezeptor gezüchtet werden. Bestimmte monoklonale Antikörper gegen Lymphocytenoberf lächenrezeptoren, wie z. B. monoklonale Antikörper, die an den CD3-Komplex von T-Lymphocyten binden, weisen ein mitogenes Potential auf. Ferner führt die Signalübertragung vom CD3-T-Zellrezeptorkomplex zu einer T-Zellproliferation über einen von Interleukin-2 abhängigen Stoffwechselweg; vgl. S. C. Meuer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81 (1984), S. 1509. Diese Information wurde zur Herstellung von rasch sich vermehrenden Kulturen von peripheren mononudearen Blutzellen oder Splenocyten mit Lymphokin-aktivierter Killeraktivität genutzt, und zwar unter Verwendung einer Kombination aus Lymphocyten, stimuliert mit einem Antikörper gegen einen Zelloberflächenrezeptor in Gegenwart von IL-2. Zum Beispiel induzieren monoklonale anti-CD3-Antikörper und IL-2 ex vivo eine starke Proliferation von Zellen in Gewebekulturmedien; vgl. A. C. Ochoa et al., J. Immunol., Bd. 138 (1987), S. 2728; P. M. Anderson et al., Cancer Immunol. and Immunother., Bd. 27 (1988), S. 82; A. C. Ochoa et al., Cancer Res., Bd. 49 (1989), S. 963; und P. M. Anderson et al., J. Immunol., Bd. 142 (1989), S. 1383.
Mit der Kombination aus anti-CD3 + IL-2 aktivierte Kulturen vermehren sich im allgemeinen etwa 10- bis 100 mal rascher als Kulturen, die allein IL-2 stimuliert werden. Ferner wurde Antitumor-Aktivität in vivo gezeigt, und zwar bei dem pulmonaren Metastasemodell unter Verwendung des MCA 106- Sarkoms. Wenn jedoch diese anti-CD3 + IL-2-aktivierten Zellen adoptiv Mäusen übertragen werden, die MC-38-Lebermetastasen tragen, und die Tiere mit freiem IL-2 1 mal am Tag nach der Zellübertragung behandelt werden, dann ist kein signifikantes therapeutisches Ergebnis sichtbar. Überraschenderweise ergibt sich in Gegenwart von IL-2-Liposomen eine hochgradig signifikante Verringerung der Lebermetastasen durch adoptiv übertragene Zellen, die zuvor mit einem Antikörper gegen ein Lymphocyten-Oberflächenrezeptor plus IL-2 stimuliert wurden.
Die vorliegenden Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgenden ausführlichen Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Herstellung von IL-2 enthaltenden Liposomen, die aus Dimyristoylphosphatidylcholin in Kombination mit Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPC/DMPG) bestehen

Rekombinantes IL-2 mit einer spezifischen Aktivität von 3,6x10&sup6; Einheiten/mg Protein wurde von Cetus Corporation, Emeryville, CA bezogen. Wäßriges IL-2 (1 mg IL-2/ml H&sub2;O; 1 ml IL-2-Lösung pro 300 mg Lipid) wurde zu Lipidpulver gegeben, das zuvor mit 150 Gy (15 000 rad) gamma-strahlung aus einer ¹³&sup7;Cs-Quelle sterilisiert worden war. Bei den verwendeten Lipiden handelte es sich um Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) und Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG) in einem Verhältnis von 7:3. Diese stabilen synthetischen Phospholipide wurden von Avanti, Birmingham, AL bezogen und getrocknet bei -20ºC gelagert.
Für multilamellare Vesikel (MLVs), die durch Hydratisierung gebildet wurden, wurde das Lipid/wäßriges IL-2-Gemisch gründlich für 1 Minute unter Verwendung eines Vortex-Gerätes gemischt. Die Detergensanalyse erfolgte unter Verwendung von Natriumchlorat, Lipiden und IL-2 in einem Verhältnis von 50:1; Detergens wurde dann 36 Stunden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung in einem Liposomal -Gerät (Dianorm-Geräte, München, Deutschland) dialysiert. Dieses Verfahren wird von O. Zumbuehl et al., Biochem. Biophys. Acta, Bd. 640 (1981), S. 252 beschrieben. Gefrieren/Auftauen der hydratisierten MLVs mit einem Gehalt an IL-2 erfolgte unter Anwendung von drei 5 Minuten- Zyklen in einem Trockeneis/Propanol-Bad und einem Wasserbad bei 37ºC.
Der Einschluß von IL-2 wurde durch einen Fluorescamin-Protein-Assay des Liposomenpellets und des Überstands von IL-2-MLV-Zubereitungen, zentrifugiert bei 1000 g für 10 min, bestimmt und durch Gelfiltrationschromatographie zur Abtrennung von freiem Arzneimittel (MW 15 000) von den großen Liposomen (Größe 0,2 bis 4 µm) bestätigt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der nachstehenden Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1
Die Detergensdialysetechnik führte zu unilamellaren Vesikeln mit 42% eingeschlossenem IL-2. Einfrieren/Auftauen der MLVs mit einem Gehalt an IL-2 führte jedoch zu 70% bis 80% IL-2-Proteineinschluß gemäß Messung sowohl durch IL-2-Bioassay als auch durch Fluorescamin-Protein-Assay. Mindestens 95% Einschluß, z. B. 95% bis 98%, wurde erzielt, wenn die Lipidzusammensetzung Dimyristoylphosphatidylcholin oder Dipalmitoylphosphatidylcholin allein war (vgl. Beispiel 2). Zum Verfahren des IL-2-Bioassays und des Fluorescamin-Protein-Assays vgl. S. Gillis et al., J. Immunol., Bd. 120 (1978), s. 2027 bzw. P. M. Anderson et al., J. Biol. Chem., Bd. 254 (1979), S. 6924.
Diese Ergebnisse stimmen mit einem Bericht überein, das das Einfrieren/Auftauen den wäßrigen Raum, der in multilamellaren Vesikeln zur Verfügung steht, 5- bis 10-fach vergrößert. Liposomen-IL-2-Zubereitungen waren mindestens 3 Monate bei Lagerung bei 4ºC stabil. Bei Herstellung in Gegenwart von 125 mM Saccharose oder Trehalose konnten verdünnte IL-2-Liposomenzubereitungen ohne Verlust des Vesikelinhalts beim Auftauen eingefroren werden. IL-2-Liposomen konnten durch die Technik aus Hydratisierung und Einfrieren/Auftauen in 30 Minuten hergestellt und bei 4ºC gelagert werden.
Die Liposomen können weiter mit ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) oder 0,9% wäßrigem NaCl verdünnt werden. Wenn z. B. ein 1 mg-Fläschchen mit wäßrigem IL-2 zu Liposomen verarbeitet und dann auf 3,6 ml verdünnt wird [IL-2 - 1x10&sup6; Cetus-Einheiten/ml], dann kann diese Dosis leicht über eine Spritze bei in vivo-Untersuchungen verabreicht werden.

Beispiel 2

Synthese von IL-2 enthaltenden Liposomen, die aus Dimyristoylphospha. tidylcholin (DMPC) bestehen

Die Einflüsse von Lipid- und Proteinkonzentrationen, Einfrieren/Auftauen und Badbeschallung auf die Inkorporation von IL-2 in Lipide wurden untersucht, wobei IL-2 verwendet wurde, das frei von Natriumdodecylsulfat (SDS) ist (im Gegensatz zu Cetus-IL-2, das in Beispiel 1 verwendet wurde. Diese rekombinante IL-2 wurde von Hoffmann-Laroche (Nutley, NJ) mit einer spezifischen Aktivität von 1,5x10&sup7; Einheiten/mg bezogen. Die Untersuchungen erfolgten sowohl mit IL-2 mit einem Gehalt an Humanserumalbumin-Träger (HSA) (25 mg/l X 10&sup6; µl IL-2) als auch mit trägerfreiem IL-2. Eine wäßrige Lösung von IL-2 in ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) wurde mit Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC; Avanti Polar Lipids, Pelham, AL; 300 mg Lipid/ml an IL-2) für 1 Minute unter Verwendung eines Vortex-Mischers gemischt, im Bad für 30 Sekunden beschallt, in einem Trockeneis/Ethanol-Bad eingefroren (5 Minuten) und in einem Wasserbad von 37ºC aufgetaut (5 Minuten) . Das DMPC war zuvor mit 150 Gy (15 000 rad) gamma-Strahlung aus einer ¹³&sup7;Cs-Quelle sterilisiert worden. Nach 3 Zyklen von Einfrieren/Auftauen/Beschallung wurde das in der Liposomenfraktion vorhandene IL-2 durch CTLL-20-Bioassay und Fluorescamin-Protein-Assay des Liposomenpellets und des Überstands von Zubereitungen, die bei 1000 g für 10 min zentrifugiert worden waren, bestimmt. Die angewandten Assays wurden bereits in Beispiel 1 beschrieben; vgl. S. Gillis et al., J. Immunol., a.a.O.; P. M. Anderson et al., J. Biol. Chem., a.a.O. Mit HSA-Trägerprotein betrug das Lipid-zu-Protein-Verhältnis 2:1, und das Lipid-zu-IL-2-Verhältnis betrug 750:1 in 50 mg DMPC/ml. In 300 mg DMPC/ml betrug das Lipid-zu-Protein-Verhältnis 12:1, und das Lipid-zu-IL-2-Verhältnis betrug 4500:1. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 2 zusammengefaßt und zeigen, daß die Liposomen in diesen Versuchen nach einem Verfahren hergestellt wurden, das eine hohe Konzentration an IL-2 in den Lipidvesikeln sicherstellt. Tabelle 2

Beispiel 3

Bioverfügbarkeit von IL-2 in Liposomen

Die Bioverfügbarkeit von IL-2 in den gefrorenen/aufgetauten MLV-Liposomen von Beispiel 1 war mindestens so gut wie die des freien Lymphokins in einem IL-2-Bioassay gemäß Messung durch ³H-Thymidin-Inkorporation in DNA der IL-2-abhängigen CTLL-2-Zellinie. Die Halbwertszeit von subkutanen IL-2-Liposomen in C57BL/6-Mäusen betrug 68 Minuten im Vergleich mit 4 Minuten für das freie Arzneimittel. IL-2 war im Serum von Mäusen 72 Stunden nach einer einzigen subkutanen (sc) Injektion von 250 000 Einheiten IL-2-Liposomen nachweisbar, während freies Arzneimittel 24 Stunden nach der Injektion nicht nachgewiesen werden konnte.

Beispiel 4

Antitumoraktivität von IL-2 in Liposomen

Bei Bewertung der in vivo-Antitumoraktivität von IL-2-Liposomen gegen pulmonare Metastasen von MCA 106-Sarkom unter Verwendung des intraperitonealen (ip) Wegs bei C57BL/6-Mäusen war keine therapeutische Wirkung sichtbar. Eine Heilung wurde jedoch durch lokale Injektion von IL-2-Liposomen in den subkutanen Tumor erzielt. Daher wird die Wirksamkeit von lokal [intrapleural/intrathorakal (itx)] als freie oder liposomale Formulierung gegebenem IL-2 gegen pulmonare Metastasen bewertet.
Gruppen von 8 bis 10 C57BL/6-Mäusen wurden gemäß den University of Minnesota Research Animal Resources-Richtlinien gehalten und ad libitum, d. h. ohne Beschränkung, gefüttert. Pulmonare Metastasen wurden durch intravenöse Schwanzveneninjektion von 5x10&sup5; MCA 106-Sarkomzellen in 0,4 ml (cm³) ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) induziert. An den Tagen 5, 6 und 7 nach der Tumorinokulation erhielten die Mäuse eine Etheranästhesie und therapeutische Injektionen von IL-2 auffolgenden Wegen: subkutan (sc), zerstäubt, intravenös (iv), intraperitoneal (ip) oder intrapleural/intrathorakal (itx). Bei Versuch A wurden den Mäusen 50 000 Einheiten freies IL-2 1 mal pro Tag an den Tagen 5, 6 und 7 auf dem sc- oder itx-Weg oder 50 000 Einheiten liposomales IL-2 auf dem sc-, iv- oder itx-Weg gegeben. Die Anzahl der pulmonaren Metastasen wurde am Tag 14 durch Töten in einer CO&sub2;-Gaskammer und tracheale Instillation von Zeichentusche und Lagerung der gewonnenen Lungen in Fekete-Lösung (300 ml (cm³) 70% Ethanol, 30 ml (cm³) Formaldehyd, 15 ml (cm³) Eisessig) bestimmt. In den Versuchen B und C erhielten die Mäuse 100 000 Einheiten 1 mal pro Tag an den Tagen 5, 6 und 7 jeweils der folgenden Mittel: freies IL-2 auf dem ip- oder itx-Weg, zerstäubtes freies IL-2 oder liposomales IL-2 auf dem itx-Weg. Diese Mäusen wurden im Hinblick auf ihr Überleben bewertet. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3 Wirkung des lokalen Wegs der Behandlung im murinen Modell von pulmonaren Metastasen vom MCA 106-Sarkom
aAnzahl der Mäuse in jeder Gruppe
bBehandlungsergebnisse wurden mit der Kontrollgruppe (keine Therapie) unter Anwendung des gepaarten Student-T-Tests (p) verglichen.
Wie die in Tabelle 3 zusammengefaßten Daten zeigen, war der itx-Weg signifikant besser als die ip-, sc- oder iv-Wege. Mehrere Versuche, die die Wirksamkeit der lokalen Wege der Behandlung von Lungenmetastasen zeigen, wurden durchgeführt und sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Pulmonare Metastasen wurden in Gruppen von 8 bis 10 C57BL/6-Mäusen durch intravenöse Schwanzveneninjektion von 5x10&sup5; MCA 106-Sarkomzellen in 0,4 ml (cm³) ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) induziert. An den Tagen 5, 6 und 7 nach der Tumorinokulation erhielten die Mäuse eine Etheranästhesie und therapeutische Injektionen von IL-2 auf dem lokalen itx-Weg unter Verwendung von freien oder liposomalen IL-2 -Formulierungen.
In den fünf getrennten Versuchen, über die in Tabelle 4 berichtet wird, führten IL-2-Liposomen, die auf dem itx-Weg gegeben wurden, zu einem verlängerten Überleben und/oder weniger pulmonaren Metastasen im Vergleich mit freiem Lymphokin beim murinen Lungenmetastasemodell. Tabelle 4 Antitumorwirkung von lokalen IL-2-Liposomen auf pulmonare Metastasen
aHydratisierte gefrorene/aufgetaute IL-2-Liposomen wurden in allen Versuchen verwendet.
bDie Behandlungsergebnisse wurden unter Anwendung des Student-T- Tests mit den Kontrollgruppen (keine Therapie) verglichen.
Wie die in Tabelle 5 zusammengefaßten Daten zeigen, wurde bei Verabreichung auf dem itx-Weg mit adoptiv übertragenen anti-CD3 + IL-2- stimulierten Zellen eine noch größere Verringerung der Anzahl der pulmonaren Metastasen unter Verwendung von IL-2-Liposomen festgestellt. Adoptive Zellen waren murine Splenocyten, die in vitro 8 Tage mit anti-CD3-monoklonalem Antikörper und IL-2 stimuliert und gezüchtet worden waren. Gruppen von C57BL/6-Mäusen wurden mit 10 000 Eiheiten lokalem intrathorokalem (itx) IL-2 als freier oder Liposomenformulierung an den Tagen 5, 6 und 7 nach der Tumorinokulation behandelt. Am Tag 6 wurden 20 Millionen Zellen itx mit den IL-2-Formulierungen verabreicht. Tabelle 5 Wirkung von adoptiven Zellen bei der lokalen itx-IL-2-Therapie von pulmonaren Metastasen
aHydratisierte gefrorene/aufgetaute IL-2-Liposomen
bDie Behandlungsergebnisse wurden unter Anwendung des Student-T- Tests mit der Kontrollgruppe (keine Therapie) verglichen.
Der Versuch wurde wiederholt, und die Ergebnisse wurden im Hinblick auf die Überlebenszeit bewertet. Gruppen von Mäusen wurden mit 3x10&sup4; Einheiten itx-IL-2 als freie oder liposomale Formulierungen mit oder ohne adoptiv übertragene Zellen nach dem gleichen Behandlungsplan, wie er vorstehend erörtert wurde, behandelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben. Tabelle 6 Wirkung von adoptiven Zellen und XL-2-Liposomen auf die Überlebenuzeit
aHydratisierte gefrorene/aufgetaute IL-2 -Liposomen
bDie Behandlungsergebnisse wurden unter Anwendung des Student-T- Tests mit der Kontrollgruppe (keine Therapie) verglichen.
Schließlich wurde ein Versuch durchgeführt, um das Dosisansprechverhalten von IL-2 zu bestimmen. Gruppen von 10 tumortragenden C57BL/6-Mäusen wurden 1 mal pro Tag an 5 aufeinanderfolgenden Tagen mit verschiedenen Dosen von IL-2 unter Verwendung von itx-freien IL-2- oder itx-Liposomen-IL-2-Formulierungen an den Tagen 4-8 nach der iv MCA-106-Sarkomtumorinokulation behandelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben. Diese Ergebnisse zeigen sowohl ein Dosisansprechverhalten als auch die Überlegenheit von IL-2 in Liposomen im Vergleich mit freiem IL-2 bei Dosen von 10 000 Einheiten, 25 000 Einheiten und 50 000 Einheiten itx für 5 aufeinanderfolgende Tage. Tabelle 7 Dosisansprechverhalten von lokalem IL-2 in Liposomen Anzahl von MC-106-Sarkom-Lungenmetastasen
aIL-2-Formulierungen wurden auf dem lokalen intrathorokalem Weg in 0,2 cm³ gegeben.
bVergleiche der Behandlungsergebnisse zwischen freien und liposomalen IL-2-Formulierungen erfolgten unter Anwendung des Student-T-Tests.
Es wird angenommen, daß die Überlegenheit der lokalen intrapleuralen (itx) IL-2-Liposomen gegenüber freiem IL-2 ihren Grund in der längeren IL-2- Halbwertszeit, der wirksameren Verarbeitung des IL-2 durch Makrophagen oder der lymphatischen Aufnahme und Präsentation des Lymphokins gegenüber den Immunzellen, die am LAK-pHänomen oder einer zellvermittelten Immunreaktion teilnehmen, hat.
Bei den vorstehenden untersuchungen an Mäusen wurden keine Zeichen der Toxizität, was an gekräuseltem Fell oder verringertem Aktivitätsgrad festgestellt wurde, bei täglichen itx- oder ip-Dosen von Liposomen mit einem Gehalt an IL-2 beobachtet. Auch Studien an Hunden mit täglichen intrapleuralen IL-2-Liposomen dokumentierten eine akzeptable Toxizität, wenn ein irischer Wolfshund von 60 kg nach Resektion eines Vorderbein-Osteosarkoms und eine deutsche Dogge mit bis zu 10x10&sup6; Einheiten IL-2-Liposomen täglich für 3 bis 5 aufeinanderfolgende Tage pro Woche über einen subkutanen Zugang mit einer Katheterspitze im pleuralen Raum behandelt wurden. Ein Anstieg der Temperatur um 1ºC wurde ungefähr 3 Stunden nach jeder Dosis an IL-2-Liposomen beobachtet. Diese Hunde zeigten keinen signifikanten Anstieg der Atemfrequenz oder eine Gewichtszunahme, und ihr Appetit und ihr Aktivitätsniveau schienen nicht beeinträchtigt.

Beispiel 5

Adjuvanswirkung von IL-2 -Liposomen

A. Immunisierung von Mäusen

Da bekannt ist, daß IL-2-Liposomen rasch von Makrophagen aufgenommen werden und IL-2 sowohl T- als auch B-Lymphocyten zusätzlich zu Makrophagen beeinflußt, wurde die Eignung von DMPC/DMPG-IL-2-Liposomen aus Beispiel 1 [Tabelle 1 (3)], als ein Vaccinadjuvnas zu wirken, bewertet. Tetanustoxoid wurde als ein Modellantigen für diese Studien gewählt. C57BL/6-Mäusen wurden sc-Injektionen von 0,2 ml Tetanustoxoid (0,8 Lf-Einheiten, Connaught Lab. (Swiftwater, PA)), gemischt mit keinem Adjuvans (ausgewogene Hank-Salzlösung, HBSS), 33 000 Einheiten freiem IL-2 oder 33 000 Einheiten IL-2-Liposomen, gegeben. Eine Auffrischungsimmunisierung mit der halben Dosis von 0,1 ml der gleichen Formulierungen wurde sc am Tag 28 verabreicht. Antikörpertiter wurden an den Tagen 14, 28, 42 und 56 unter Anwendung einer Verdünnungsreihe und des passiven Hämagglutinierungsverfahrens zum Nachweis nach der Methode von O. O. Stravitsky, J. Immunol., Bd. 72 (1954), S. 360 bewertet.
Wie in Fig. 1 gezeigt ist, können zwar sowohl freies als auch liposomales IL-2 höhere Antikörpertiter als Tetanustoxoid allein stimulieren, sie waren also in der Tat Adjuvantien; es war jedoch nur die IL-2-liposomale Formulierung mit einem hohen dauerhaften Anstieg des Antikörpertiters gemäß Bestimmung durch passive Hämagglutinierung verbunden.
Sodann wurden Mäuse ohne Adjuvans (HBSS) mit freiem IL-2 oder IL-2-Liposomen immunisiert, wie es vorstehend beschrieben wurde, und spezifische anti-Tetanus-Antikörpertiter wurden unter Anwendung eines ELISA-Assays bestimmt. Um den ELISA durchzuführen, wurde eine Lösung von 0,6 µg/100 ml Poly-d-lysin (Sigma Chemical Co.) in wäßrigem Carbonatpuffer (NaHCO&sub3;, Na&sub2;CO&sub3;; pH-Wert: 9,6) in die Vertiefungen einer 96 Vertiefungen umfassenden Assayplatte gegeben und für 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden 5 mal mit Dulbecco-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS, GIBCO, Grand Island, NY) gewaschen und getrocknet. Eine Lösung von 50% wäßrigem Glutaraldehyd, verdünnt auf 0,5% in DPBS (100 µl/Vertiefung) wurde für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, und die Vertiefungen wurden 5 mal mit DPBS gewaschen. Eine 1:4-Verdünnung von Tetanustoxoid (TT) in DPBS (pH-Wert: 9,6) wurde durch Verdünnen von 22,5 ml TT-Stammlösung (Connaught Lab.) (8 Lf-Einheiten/ml) mit 67,5 ml Puffer hergestellt. Das verdünnte TT wurde in die Vertiefungen (100 µl/Vertiefung) gegeben und für 2 Stunden bei 37ºC und für 18 Stunden bei 4CC inkubiert. Die Vertiefungen wurden 5 mal mit DPBS gewaschen. Eine Lösung von Natriumborhydrid, 0,19 g/100 ml Carbonatpuffer, wurde in die Vertiefungen (150 µl/Vertiefung) gegeben und für 5 Minuten bei 25ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden 5 mal mit DPBS gewaschen.
Seren von positiven und negativen Kontrollmäusen oder Kaninchen oder von Tieren, die untersucht werden sollten, wurden in NFDM/DPBS (3 g fettfreie Trockenmilch/100 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung plus 5 µl 0,1% Thimersol-Lösung/ml an NFDM/DPBS-Lösung) verdünnt, und 100 pl des verdünnten Serums wurden in jede Vertiefung gegeben. Die Inkubationszeit betrug 1 Stunde bei 37ºC (IgG) und 2 Stunden bei 37ºC (IgM) . Die Serumproben wurden aus den Vertiefungen entfernt, die dann 10 mal mit DPBS gewaschen wurden.
Anti-IgM (Meerrettichperoxidase-markiertes Ziegen-IgG gegen Mäuse- oder Kaninchen-IgM) wurde 1:250 in NFDM/DPBS verdünnt. Anti-IgG (Meerrettichperoxidase-markiertes Ziegen-IgG gegen Kaninchen-IgG oder Meerrettichperoxidase-markiertes Ziegen-IgG gegen Mäuse-IgG) wurde 1:4000 in NFDM/DPBS (anti-Kaninchen-IgG) oder 1:500 für anti-Mäuse-IgG verdünnt. Inkubationen mit diesen zweiten Antikörpern (100 µl/Vertiefung) wurden für 1 Stunde bei 37ºC durchgeführt. Die Vertiefungen wurden dann 10 mal mit DPBS gewaschen.
Substratpuffer (100 µl/Vertiefung; hergestellt durch Mischen von 11,5 ml Tris-Citrat-Puffer, 0,0375 ml o-Phenylendiamin 2HCl, 0,01 ml 30% H&sub2;0&sub2; und 1 ml H&sub2;O) wurden in die Vertiefungen gegeben und für 5 Minuten (Kaninchen IgG-Bestimmung), 10 Minuten (Kaninchen-IgM-Bestimmung oder Mäuse-IgG-Bestimmung) oder 30 Minuten (Mäuse-IgM-Bestimmung) bei 37ºC inkubiert. Abbruchlösung (50 µl von 53 ml 0,3 M H&sub3;PO&sub4; plus 21 ml 015 M HCl, verdünnt mit Wasser auf 500 ml) wurde in jede Vertiefung gegeben, und die Extinktion (A) wurde unter Verwendung eines 490 nm-Filters bestimmt.
Die in Fig. 2, Diagramme A-D zusammengefaßten Daten bestätigen die Überlegenheit der IL-2-Liposomenformulierungen im Hinblick auf ihre Eignung zur Erhöhung der anti-Tetanustoxoid-Antikörpertiter an den Tagen 14, 28, 42 und 56 nach der anfänglichen Injektion.

B. Immunisierung von Kaninchen

1. Antigenadsorption

Alaun (0,05 mg) als Al(OH)&sub3; (Abello Labs., Madrid, Spanien) wurde mit 1 Lf-Einheit Tetanustoxoid (Stammlösung, 8 Lf-Einheiten/ml, Connaught Lab.) gemischt. Die Adsorption wurde für 30 Minuten durchgeführt (10 Minuten Bewegen und 20 Minuten Stehen bei 25ºC)

2. Immunisierungsprotokol

Das Immunisierungsprotokol ist in der nachstehenden Tabelle 8 zusammengefaßt. Den Kaninchen wurden an den Tagen 0 und 28 0,74 ml/Kaninchen jeder der vier Dosisformen injiziert. Tabelle 8 Kaninchenimmunisierungsprotokoll

4000 0

Den Kaninchen wurde an den Tagen 56 und 70 Blut abgenommen, um das Niveau und die Dauerhaftigkeit der Antikörperreaktion zu bestimmen. Das Serum wurde 1:80 mit NFDM/DPBS verdünnt und über das vorstehend beschriebene ELISA-Verfahren untersucht. Die Ergebnisse der Untersuchung, die einen hohen und dauerhaften anti-TT-Antikörpertiter sowohl am Tag 56 als auch am Tag 70 nach der anfänglichen Injektion zeigen, sind in Fig. 3 zusammengefaßt.

Beispiel 6

Adjuvanswirksamkeit von IL-2-Liposomen bei Verabreichung an Mäuse in Kombination mit Hepatitis B-Antigen

Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg) wurde von Merck, Inc. bezogen. A/J-Mäuse wurden mit 0,1 µg (mcg) HBsAg im Gemisch mit IL-2-Liposomen (50 000 Einheiten pro Immunisierung) am Tag 0, 5 und 19 immunisiert; die Mäuse erhielten 0,05 ml (cm³) in jede Hinterpfote. Antkörpertiter gemäß Bestimmung durch Radioimmunoassay (Abbott) zeigten signifikant höhere Antikörpertiter unter Verwendung von IL-2-Liposomen. Die zelluläre Immunreaktion, wie sie durch verzögerte Hypersensibilität (DTH) angezeigt wird, war ebenfalls signifikant höher, wenn IL-2-Liposomen verwendet wurden. Die DTH gegenüber HBsAg wurde durch Injektion von 1 µg (mcg) HBsAg in 0,9% NaCl (0,05 ml (cm³) = Volumen) in das rechte Ohr und 0,9% NaCl allein in das linke Ohr bestimmt. Die Ohrdicke wurde 24 Stunden nach der Injektion unter Verwendung eines Mikrometers gemessen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 9 zusammengefaßt und zeigen eine signifikante Verbesserung der Immunreaktion bei Inokulationen von Hepatitis B/Liposom IL-2-Vaccinformulierungen im Vergleich mit Hepatitis B-Antigen allein. Tabelle 9 Adjuvanswirkungen von IL-2-Lipoßomen unter Verwendung von Hepatitis B- Antigen (HBsAg)
aAnzahl der Mäuse in der Gruppe
bMilli-internationale Einheiten an spezifischem anti-HBsAg -Antikörper gemäß Bestimmung unter Verwendung des Referenzstandards, der in der Abbott-RIA-Testpackung bereitgestellt wird
cungepaarter Student-T-Test; ¹gepaarter T-Test (innerhalb der Gruppe); ²ungepaarter T-Test (zwischen Gruppen)
dmittlere Ohrdickendifferenz

Beispiel 7

Adjuvanswirksamkeit von IL-2-Liposomen bei Verabreichung an Mäuse in Kombination mit Humanimmunschwächevirus-Antigenen (HIV-Antigenen)

Humanimmunschwächevirus-Antigene (HIV-Antigene), wurden als ein gereinigtes virales Lysat (1 mg) von BioDesign, Inc. (Kennebunkport, ME) erhalten. Das virale Lysat enthielt kleine Mengen an gp41 und Kernproteinen, jedoch kein nachweisbares gp120. Es wurden signifikante Adjuvanswirkungen von IL-2-Liposomen auf humorale und zelluläre Immunreaktionen in Balb C-Mäusen, die mit HIV-Antigenen immunisiert wurden, gezeigt. Gruppen von 10 Mäusen wurden mit 0,1 µg (mcg), 0,5 µg (mcg) und 2,5 µg (mcg) HIV-Antigen im Gemisch mit HBSS oder IL-2-Liposomen (75 000 Einheiten pro Immunisierung) intradermal (Pfote) an den Tagen 0, 7 und 21 immunisiert. In jede Hinterpfote wurden 0,05 ml (cm³) nach Anästhesie mit 1,2 mg Pentobarbital injiziert. Am Tag 33 wurde Serum aus 5 Mäusen erhalten, und anti-HIV-Titer wurden unter Verwendung der Testpackung Genetic Systems EIA bestimmt. Zelluläre Immunreaktionen gegen HIV-Antigene wurden durch Injektion von 1 µg (mcg) HIV-Antigen in 0,9% NaCl (0,05 cm³ = Volumen) in das rechte Ohr und 0,9% NaC1 allein in das linke Ohr bestimmt. Die Ohrdicke wurde 24 Stunden nach der Injektion unter Verwendung eines Mikrometers gemessen. Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen 10 und 11 angegeben und zeigen eine signifikante Erhöhung der humoralen und zellulären Immunreaktion bei der Inkorporation von IL-2 -Liposomen in HIV-Vaccinformulierungen. Tabelle 10 Humorale anti-HIV-Immunreaktion, verstärkt durch IL-2-Liposomen
aOptische Dichte bei 450 nm mit einem Genetic Systems-Plattenablesegerät. Serumproben von einzelnen Mäusen wurden 1:75 vor der Bestimmung der spezifischen anti-HIV-Antikörper unter Verwendung des Genetic Systems-Enzymimmunoassays (EIA) verdünnt.
bUngepaarter Student-T-Test zwischen Gruppen von Mäusen, die mit der gleichen Dosis Antigen immunisiert wurden. Tabelle 11 Zelluläre anti-HIV-Immunreaktion, verstärkt durch IL-2-Liposomen
amittlere Ohrdickendifferenz in Millimeter gemäß Bestimmung mit einem Mikrometer
bungepaarter Student-T-Test zwischen Gruppen von Mäusen, die mit der gleichen Dosis Antigen immunisiert wurden
cgepaarter Student-T-Test (innerhalb einer Gruppe) zum Vergleich von HIV-Testohr und kontralateralem Kochsalzlösung - Kontrol lohr

Beispiel 8

Kultur von anti-CD3 + IL-2-Zellen

Splenocyten aus 6-12 Wochen alten C57BL/6-Mäusen wurden durch vorsichtige Zerkleinerung der Milzen mit einem sterilen Glasstopfen und Suspendieren des Gewebekulturmediums, das aus RPMI 1640-Ergänzung (GIBCO, Grand Island, NY) mit 25 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 5% fötalem Kälberserum, 100 Einheiten pro ml Penicillin, 100 µg pro ml Streptomycin, 10 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 10 mM Natriumpyruvat (GIBCO, Grand Island, NY) und 25 mikromolar 2-Mercaptoethanol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) bestand, erhalten. Mononudeare Zellen, die aus den Splenocyten-Zellsuspensionen erhalten wurden, wurden durch ein Nytex-Sieb filtriert und dann über Ficoll- Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ) zentrifugiert, um eine mononudeare Zellzubereitung zu erhalten. Grenzflächenzellen wurden aufgefangen und mit Gewebekulturmedium 2 mal gewaschen und dann in Kolben übertragen, die Gewebekulturmedium, angereichert mit 145-2C11, einem murinen anti-CD3-Antikörper, und IL-2 (300 Einheiten pro ml) enthielten; vgl. 0. Leo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), S. 1374. Die Dichte der Zellen betrug anfänglich 0,5x10&sup6; Zellen pro ml. Sie wurden bei 37ºC in einer befeuchteten 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre inkubiert. Die Zellen wurden an den Tagen 5, 7 und 9 geerntet und verabreicht, d. h. adoptiv übertragen, und zwar unter Anwendung des intraperitonealen Wegs in einem Volumen von 0,2 ml (cm³) für jede tumortragende Maus. Diese Mäuse hatten zuvor intrasplenische Injektionen von 0,5x10&sup6; MC-3e-Kolonadenokarzinomzellen am Tag 0 erhalten und wurden mit adoptiven Zellen ip an den Tagen 3, 5 und 7 behandelt. Einige Mäuse wurden auch mit IL-2-Liposomen 1 mal am Tag (Dosisbereich von 10 000 bis 50 000 Einheiten) in 0,2 ml (cm³) ip an den Tagen 3 bis 7 behandelt. 11 Tage nach der Tumorinokulation wurden die Mäuse auf das Vorhandensein von Lebermetastasen durch Injektion von Zeichentusche in die obere mesenterische Vene und direkte Zählung der Lebermetastasen bewertet. Tiere, die mit leeren Liposomen, Zellen allein, Zellen plus freiem IL-2 oder IL-2-Liposomen allein behandelt worden waren, zeigten keine signifikante Verringerung der Anzahl der Lebermetastasen. Nur wenn die Kombination aus anti-CD3 + IL-2-Zellen und IL- 2-Liposomen verwendet wurde, war eine signifikante Verringerung der Lebermetastasen sichtbar. Ein Dosisansprechmuster war sowohl für die Liposomen als auch für die zellulären Bereiche der Therapie vorhanden, d. h. eine überlegene Verringerung der Metastasen war bei Erhöhung der Dosen von IL-2-Liposomen und Zellen sichtbar; vgl. Tabellen 12-14. Tabelle 12 Synergistische antineoplastische Wirkung von anti-CD3 + IL-2-stimulierten Zellen und IL-2-Liposomen Anzahl an MC-38-Lebermetastasen
aGruppen von Mäusen mit MC-38-Lebermetastasen wurden 1 mal am Tag behandelt: an den Tagen 3 bis 7 mit leeren Liposomen (Kontrolle) oder nur IL-2-Liposomen; an den Tagen 3, 5 und 7 mit Zellen allein; an den Tagen 3 bis 7 mit freiem IL-2 plus an den Tagen 3, 5 und 7 mit Zellen; an den Tagen 3 bis 7 mit IL-2-Liposomen plus an den Tagen 3, 5 und 7 mit Zellen.
bDie Behandlungsergebnisse wurden unter Anwendung des Student-T- Tests verglichen.
NS = nicht signifikant Tabelle 13 Dosisanaprechverhalten von IL-2-Liposomen Anzahl an MC-38-Lebermetastasen
aC57BL/6-Mäuse (Gruppen von 10), die MC-38-Lebermetastasen trugen, wurden mit 5x10&sup7; anti-CD3 + IL-2-Zellen ip an den Tagen 3, 5 und 7 nach der Tumorinokulation behandelt. Die Mäuse erhielten auch IL-2 in Liposomen ip 1 mal pro Tag an den Tagen 3 bis 7 in den vorstehend angegebenen Dosierungen.
bDie Behandlungsergebnisse wurden unter Verwendung des Student-T- Tests mit der Kontrollgruppe (leere Liposomen) verglichen. Tabelle 14 Dosisansprechverhalten von anti-CD3 + IL-2 Anzahl an MC-38-Lebermetastaben
aMäuse, die MC-38-Lebermetastasen trugen, wurden 1 mal pro Tag an den Tagen 3 bis 7 mit 50 000 Einheiten IL-2-Liposomen ip und mit adoptiv übertragenen anti-CD3 + IL-2-stimulierten Zellen in verschiedenen Anzahlen gemäß den Angaben in der Tabelle behandelt.
bDie Behandlungsergebnisse wurden unter Anwendung des Student-T- Tests verglichen.
Der Einschluß von IL-2 in Liposomen führt also zu einer Zusammensetzung mit sowohl signifikanter Antitumorwirksamkeit als auch Adjuvanswirksamkeit. Da zahlreiche rekombinante Cytokine&sub1; die von IL-2 verschieden sind, erhältlich sind, können ähnliche Ansätze unter Verwendung von Liposomen möglicherweise genutzt werden, um die therapeutische Eignung von Mitteln, die die Immunreaktion modifizieren, sowohl bei Krebs als auch in der Vaccinforschung zu erhöhen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von lnterleukin-2 (IL-2) enthaltenden Liposomen, die die Immunoacjuvans-Wirksamkeit von IL-2 erhöhen können, wobei das Verfahren das Inkorporieren einer wirksamen Immunoadjuvans-Menge an IL-2 in Liposomen durch Hydratisieren von Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) mit einer wässrigen Lösung umfaßt, die IL-2 und eine wirksame Menge eines Trägerproteins enthält, um ein wässriges IL-2/Trägerproteinldmpc-Gemisch zu erzeugen, wobei das wässrige Gemisch gekennzeichnet ist durch ein Trägerprotein DMPC- Verhältnis (Gew./Gew.) von 1:2 bis 1:12 in dem resultierenden Liposom.

2. Verfahren zur Herstellung von Interleukin-2 (IL-2) enthaltenden Liposomen, die die antineoplastische Wirksamkeit von IL-2 erhöhen können, wobei das Verfahren das Inkorporieren einer wirksamen antineoplastischen Menge an IL-2 in Liposomen durch Hydratisieren von Dimynstoylphosphatidylcholin (DMPC) mit einer wässrigen Lösung von IL-2 und einer wirksamen Menge eines Trägerproteins zur Erzeugung eines wässrigen IL-2/Trägerprotein/DMPC-Gemischs umfaßt, wobei das wässrige Gemisch gekennzeichnet ist durch ein Trägerprotein DMPC-Verhältnis (Gew./Gew.) von 1:2 bis 1:12 in dem resultierenden Liposom.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Trägerprotein menschliches Serumalbumin ist.

4. IL-2 enthaltende Liposomen, die durch das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 herstellbar sind.

5. IL-2 enthaltende Liposomen nach Anspruch 47 wobei das Trägerprotein menschliches Serumalbumin ist.

6. Vakzine enthaltend eine auf immunogene Weise wirksame Menge eines nichtliposomal eingeschlossenen Vakzine-Antigens und eine wirksame Immunoadjuvans-Menge an liposomal eingeschlossenem IL-2, das durch das Verfahren nach Anspruch 1 oder 3 herstellbar ist, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen flüssigen Vehikel.

7. Verwendung einer wirksamen antineoplastischen Menge an IL-2 enthaltenden Liposomen, die durch das Verfahren nach Anspruch 2 oder 3 herstellbar sind, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von pulmonären Metastasen.

8. Verwendung einer wirksamen antineoplastischen Menge an IL-2 enthaltenden Liposomen, die durch das Verfahren nach Anspruch 2 oder 3 herstellbar sind, und Zellen, die durch Stimulation mit IL-2 und einem Antikörper gegen einen Lymphozytenobertlächenrezeptor aktiviert worden sind, zur Herstellung eines Arzneimittels zur antineoplastischen Behandlung von Metastasen.

9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei der Antikörper gegen einen Lymphozytenobertlächenrezeptor, der zur Stimulation der Zellen verwendet wird, ein monoklonaler Antikörper ist, der einen CD-3-Komplex bindet.

10. Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Metastasen pulmonäre oder hepatische Metastasen sind.