DE68913003T2 - An hormone gekoppelte liposome. - Google Patents

An hormone gekoppelte liposome.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Feld der Wirkstoff freisetzenden Systeme und insbesondere gezielt einsetzbare Wirkstoffe, die in Liposomen eingeschlossen sind, welche an Hormone, z.B. Zytokine, gebunden sind.
  • Tierzellen sind durch das Vorhandensein von Rezeptormolekülen auf ihrer Membranoberfläche gekennzeichnet, die eine Stoffwechselreaktion der Zellen bei Anbindung an ihre spezifischen Liganden übertragen. Im menschlichen Körper werden einige dieser Membranrezeptoren durch eine begrenzte Anzahl von Zelltypen exprimiert und können sogar spezifisch für einen bestimmten Zelltyp sein. Falls die biologische Funktion eines speziellen Zelltyps das Wohlergehen eines Patienten beeinträchtigt, kann es wünschenswert sein, Therapeutika einzusetzen, die die unerwünschten Zellen blockieren oder durch Lyse zerstören. Ein spezifisches zielgenaues Ansprechen wird üblicherweise dadurch erreicht, daß Therapeutika an rezeptorspezifische Liganden gekoppelt werden.
  • In der Organtransplantationschirurgie ist es notwendig, das Immunsystem des Transplantatempfängers zu unterdrücken, um die Wahrscheinlichkeit einer Transplantatabstoßung nach dem chirurgischen Eingriff weitmöglichst zu verringern. Zu den immunsuppressiven Mitteln, die in der klinischen Praxis erfolgreich eingesetzt werden, gehören Steroide, Azathioprin und Cyclosporin A. Es wurde auch bereits vorgeschlagen, Antikörper zu einigen besonderen T-Zellmembran-Antigenen zu verwenden, und zwar entweder allein oder als Konjugate mit cytotoxischen Wirkstoffen. In ahnlicher Weise können Immunsystemstörungen wie z.B. Autoimmunkrankheiten, die eine direkte Folge unangemessener Aktivität von T-Zellen sind, mit Hilfe von immunsuppressiven Wirkstoffen behandelt werden.
  • In einigen anderen Fällen kann das Vorhandensein eines speziellen Membranrezeptors auf einem bestimmten Zelltyp auch mit einer bösartigen Erkrankung der Zellen im Beziehung stehen. Tatsächlich werden einige Membranrezeptoren, von denen bekannt ist, daß sie normalerweise in geringen Mengen vorhanden sind, in viel höherer Dichte auf Tumorzellen exprimiert, die deshalb mit Hilfe von spezifisch zielenden zytotoxischen Wirkstoffen eliminiert werden können.
  • Viele der obengenannten Behandlungen haben jedoch unerwünschte Nebenwirkungen, weil sich die zytotoxische Wirkung normalerweise nicht auf den speziellen Zelltyp, der bei der Allotransplantatabstoßung beteiligt ist oder der die Störung verursacht, beschränkt. Zum Beispiel entsteht ein wesentliches Problem bei Verwendung von einigen bekannten immunsuppressiven Wirkstoffen dadurch, daß die immunsuppressive Wirkung den Patienten besonders anfällig für Bakterien- und Virusinfektionen macht, die von einem normalen Immunsystem bewältigt werden. Ein weiteres Problem, das spezieller mit der Zuführung von zytotoxischen Wirkstoffen in Form von Konjugaten mit Antikörpern zusammenhängt, besteht darin, daß der Antikörper nicht in die Zellen eingeschleust werden kann. So kommt es, daß, obwohl das Toxin-Antikörper-Konjugat ein spezifischen Bindungspartner ist, die Einschleusung des Toxins in die unerwünschten Zellen mißlingt. Als Resultat der geringen Einschleusungsrate müssen unnütz hohe Konzentrationen von Toxin-Antikörper-Konjugaten bei entsprechend erhöhtem Risiko der Gesamttoxizität verwendet werden.
  • Folglich gibt es immer noch Bedarf, Therapeutika zu schaffen, die unerwünschte Zellen bei hoher Spezifität und Wirksamkeit blockieren oder durch Lyse zerstören können. Man fand nun heraus, daß diese Forderungen durch das Einschließen eines zytotoxischen Wirkstoffs in Liposomen und das Verbinden dieser wirkstoffhaltigen Liposomen mit Hormonen erfüllt werden können. Mit "Hormon" ist hier ein Protein oder Peptid gemeint, das über eine Zellrezeptorbindungsstelle verfügt und das in der Lage ist, eine Stoffwechselreaktion bei Anbindung an seinen Rezeptor in der Zielzelle hervorzurufen. Dazu gehören z. B. endokrine Hormone, die in vivo vom Blut von einem Organ zum anderen transportiert werden sowie parakrine Hormone und Zytokine, die Mediatoren zwischen den einzelnen Zellen sind.
  • Allgemeine frühere Vorschläge, Liposome an Hormone zu binden existieren im Stand der Technik (siehe zum Beispiel FR-A-2564319 und WO-A-86/04232). Es gibt jedoch keine spezifischen Lehren, wie eine solche Anbindung bei annehmbar hoher Wirksamkeit erreicht werden kann.
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf unserer überraschenden Entdeckung, daß durch Erzeugen eines immunologischen Schutzes der bioaktiven Stelle eines Hormons vor einer Ankopplung des Hormons an das Liposom eine wirksame Beibehaltung der Hormon-Aktivität erreicht werden kann, insbesondere wenn ein oder mehrere Anminosäurereste, die beim Verbinden (Kopplung) beteiligt sein können, sich im Bereich der bioaktiven (rezeptorbindenden) Stelle des Hormons befinden.
  • Das Erzeugen eines chemischen Schutzes einer bioaktiven Stelle von Antikörpern zum Anbinden derselben an Liposome ist bereits beschrieben worden (siehe zum Beispiel Jansons et al, Analytical Biochemistry 111 : 54- 59 (1981)). Diese Schutzverfahren erzeugten jedoch einen recht geringen Grad an beibehaltener Bio-Aktivität und haben sich nicht durchgesetzt.
  • Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung, wie in den beiliegenden Ansprüchen definiert ist, die Verwendung eines immunologischen (Antikörper)-Blockiermittels zum reversiblen Erzeugen eines Schutzes der biologisch aktiven Zellrezeptorbindungsstelle eines Hormons bereit, bevor dieses an ein Liposom gekoppelt wird.
  • Die so hergestellten Liposom-Hormon-Konjugate können als Freisetzungsvehikel zur zielsicheren Zuführung einer diagnostisch oder pharmazeutisch aktiven Substanz, vorzugsweise eines zytotoxischen Mittels, benutzt werden.
  • Vorzugsweise werden die Liposome an Zytokine gekoppelt, d.h. Lymphokine und Monokine, wie z.B. Interleukine 1 bis 7, Interferone α, β und γ, Tumornecrose-Faktoren α und β, T-Zell-Replacing-Faktor, Makrophagen-Inhibitionsfaktor und das Koloniewachstum stimulierende Faktoren z B. G-CSF und GM-CSF. Ein bevorzugtes Zytokin ist IL-2. IL-2 ist ein natürlich vorkommendes mitogenes Zytokin mit einer kurzen Halbwertzeit, das innerhalb von Stunden nach der Stimulation durch Antigene von T-Zellen produziert wird. Es induziert die Proliferation von T-Zellen auf das Anbinden an Rezeptormoleküle, die vorüberübergehend auf den aktivierten T-Zellmembranen als Resultat der Stimulation durch das Antigen exprimiert werden.
  • Ein sehr wirksamer Schutz der Bindungsstelle des Hormons wird durch Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (MAb) erreicht, der für die Bindungsstelle spezifisch ist. Nach der Kopplung der Hormone an die Liposome oder auf jeden Fall nach Ausführung eines Reaktionsschrittes, der ansonsten eine Beeinflussung oder eine Blockierung der Bindungsstelle zur Folge hätte, wird der Antikörper von der Bindungsstelle entfernt, um eine Bindungsstelle zu erhalten, die mit den entsprechenden Zellrezeptoren für das Hormon in Wechselwirkung treten kann.
  • Insbesondere kann die Bindungsstelle des IL-2, die sich zwischen den Aminosäureresten 20-30 des Moleküls befindet, durch einen MAb geschützt werden, der diesen Bereich spezifisch zu erkennen vermag. Solch ein mAb ist kommerziell lieferbar durch Genzyme Inc. unter der Bezeichnung DMS-1. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung wird der MAb mit einer festen Phase gekoppelt, z.B. an ein Harz oder ein Gel. Dann wird IL-2 der MAb-enthaltenden Phase zugesetzt und z.B. durch Succinimidyl-4-(P-Maleimidophenyl)- Butyrat (SMPB) in einem molaren Verhältnis von 5 : 1 bis 50 : 1 chemisch modifiziert. Ein linker-modifiziertes IL-2, das durch einen für die Bindungsstelle spezifischen MAb geschützt ist, weist eine wesentlich höhere Kapazität auf, mit unbehandeltem IL-2 bei der Anbindung an IL-2-Rezeptoren zu konkurrieren, als bindermodifiziertes IL-2, das keinen solchen Schutz erhalten hat. So ist IL-2, das nach dem Herstellen eines Schutzes durch einen geeigneten MAb mit SMPB verbunden wird, ungefähr zweieinhalb Mal wirksamer im Wettbewerb mit ¹²&sup5;I-markiertem IL-2 bei Murin-HT2 T-Zellrezeptoren als IL-2, das ohne Herstellen eines solchen Schutzes mit SMPB verknüpft ist.
  • Rekombinante Formen des menschlichen IL-2 werden bei der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt verwendet, besonders jene, die durch Mutation stabilisiert wurden. Beispielsweise können eine oder mehrere Aminosäuren deletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, um modifiziertes menschliches IL-2 mit einer längeren Halbwertzeit zu schaffen, z.B. IL-2, bei dem das natürlich vorkommende Cystein in Position 125 durch Serin oder Alanin ersetzt wurde. Als Alternative können verkürzte Formen des Moleküls nützliche Liganden schaffen, die an Liposome geknüpft werden können, solange das IL-2- Fragment eine funktionell aktive Bindungsstelle enthält, d.h. die Aminosäuresequenz, die zwischen den Resten 20-30 im natürlichen Human-IL-2 vorhanden ist.
  • Es ist bekannt, daß es zwei verschiedene IL-2-Rezeptoren gibt, die als low-affinity und high-affinity-Rezeptoren bezeichnet werden. Der low-affinity-Rezeptor wird sowohl auf ruhenden als auch auf aktivierten T-Zellen exprimiert, während der high-affinity-Rezeptor nur auf aktivierten T-Zellen vorkommt, und zwar in kleinen Mengen im Vergleich zum low-affinity-Rezeptor. Der größte Teil der biologischen Wirksamkeit des IL-2 wird durch den high-affinity- Rezeptor bewirkt, da dieser Rezeptor als einziger bei der Einschleusung des IL-2 beteiligt ist. Anti-(IL-2-Rezeptor) MAb sind hergestellt worden und an zytotoxische Wirkstoffe gekoppelt worden, um einen möglichen therapeutischen Nutzen daraus zu ziehen, z. B. zur Verhinderung oder Behandlung von Allotransplantat-Abstoßungsschüben, die die Folge des starken Vermehrungsausbruchs von aktivierten T-Zellen sind, der durch das IL-2 induziert worden ist. Es wurde erwartet, daß Anti-(IL-2-Rezeptor)-MAb-Konjugate beim Zerstören von aktivierten T-Zellen wirksam sein könnten, ohne die ruhenden T-Zellen zu beeinträchtigen, die jederzeit für die normale Immunüberwachung benötigt werden, z. B. um Infektionen zu bekämpfen. Diese MAb (normalerweise Anti-TAC MAb genannt) erkennen aber nur die low-affinity- Rezeptoren und können dadurch nicht eingeschleust werden.
  • Wo jedoch das IL-2-Molekül oder ein aktives Fragment davon zum zielgenauen Ansprechen benutzt wird, erfolgt die Kopplung überwiegend an den high-affinity-Rezeptor. Aus diesem Grunde haben Wirkstoff-tragende Liposome, die über Anti-TAC MAb-Konjugate mit IL-2 verknüpft sind, folgende Vorteile: Einschleusen des Wirkstoffs und hochspezifisches zielgenaues Ansteuern von aktivierten T-Zellen.
  • Liposome sind geschlossene kugelförmige schalenartige Strukturen, die eine Zweischichtmembran umfassen, die ein wäßriges Volumen umschließt. Die primären Bestandteile der Zweischichtmembran sind amphipatische Moleküle, die Phospholipide natürlichen oder synthetischen Ursprungs enthalten können. Bei der vorliegenden Erfindung umfassen die Liposomen Phospholipide, deren hydrophile Gruppe Phosphatidylethanolamin ist. Vorzugsweise umfassen sie auch Phospholipide, deren hydrophile Gruppe Phosphatidylcholin ist. Die hydrophoben Gruppen, die mit Phosphatidylethanolamin oder Phosphatidylcholin verbunden sind, können aus einer Reihe von gesättigten und ungesättigten Fettsäurefragmenten bestehen. Phospholipide, dispergiert in wäßriger Lösung, bilden spontan Doppelschichten, bei denen die Kohlenwasserstoff-Schwänze nach innen und die polaren Kopfgruppen nach außen gerichtet sind, um mit Wasser in Wechselwirkung zu treten.
  • Am vorteilhaftesten für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind Liposome, die teilweise oder völlig aus Distearoyl-Phosphatidylethanolamin (DSPE) und/oder Distearoyl-Phosphatidylcholin (DSPC) in unterschiedlichen Mengenverhältnissen zusammengesetzt sind. Es wird ebenfalls bevorzugt, daß ein Sterin wie z.B. Cholesterin in der Liposommembran vorkommt. Geeignete Gewichtsverhältnisse von Lipid zu Sterin können 6:1 bis 1:1 sein.
  • Liposome können sowohl kleine unilamellare Vesikel (SUV) als auch oligo- oder multilamellare Vesikel (MLV) mit einer zwiebelartigen Form sein, bei denen die konzentrischen Zweischichtmembranen durch eine Wasserschicht voneinander getrennt sind. Liposome, die in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden, sind vorzugsweise SUV mit einem Außendurchmesser von etwa 30 bis etwa 300 Nanometern; am vorteilhaftesten sind SUV mit einem Außendurchmesser zwischen 50 und 100 Nanometern.
  • MLV können durch einfaches Rühren einer Mischung aus Phospholipiden hergestellt werden. Eine Ultraschallbestrahlung (Beschallung) dieser Strukturen führt zur Bildung von kleinen unilamellaren Vesikeln. MLV und SUV können mit Hilfe einer Reihe von verschiedenen Standardmethoden erzeugt werden, wie z.B. in F. Szoka und D. Papahadopoulos, 'Liposomes and their uses in biology and medicine" Ann. N.Y. Acad. Sci. 308, 1-482, (1978), in R.L. Juliano und D. Layton, "Liposomes as a drug delivery System" in Drug Delivery Systems S. 189-236, Oxford University Press, Inc., New York (1980) oder in H. J.Paznanstey und R.L. Juliano, "Biological approaches to the controlled delivery of drugs: A critical review" in Pharmacological Review 36: 277-336 (1984) berichtet wird.
  • Es versteht sich für den Fachmann, daß wirkstoffhaltige Liposome durch einfaches Hinzufügen des Wirkstoffs zu der Lipidmischung hergestellt werden können, die für die Herstellung der Liposome wie oben beschrieben verwendet wird, so daß der Wirkstoff passiv eingeschlossen wird.
  • Der Terminus "Liposome" oder "SUV" soll nachstehend sowohl leere Liposome oder SUV als auch wirkstoffhaltige Liposome oder SUV bezeichnen.
  • Zytotoxische Wirkstoffe zum Einschließen in Liposome umfassen jede beliebige chemische Verbindung, die in der Lage ist, die Stoffwechselaktivität der Zellen zu blockieren oder zu stören, die z. B. nachteilig in die Replikation der DNA oder in die Proteinsynthese eingreifen. Bevorzugte zytotoxische Wirkstoffe sind Mitomycin C, Daunorubicin, Doxorubicin, Cis-Platinium, 6-Mercaptopurin, Mephalan, Actinomycin D, Fluorodesoxyuridin, AZT, Cyclosporin A und Methotrexat; wobei das letztgenannte besonders bevorzugt wird.
  • Bei Cyclosporin A (Sandimmune ) liegt die Dosierung bei intravenös er Verabreichung der pharmazeutischen Verbindung bei der Behandlung von Organtransplantationen oder bei Transplantat-Wirt-Reaktionen normalerweise bei 3-4 mg/kg/Tag. Orale Dosen liegen etwa 3 mal so hoch. Bei Verabreichung der Freisetzungsvehikel gemäß der vorliegenden Erfindung kann erwartet werden, daß geringere Dosierungen vergleichbare Wirkungen erzielen hinsichtlich der gezielten Zuführung des Wirkstoffs zu den Zellen des Immunsystems, die für den Krankheitszustand verantwortlich sind.
  • Methotrexat wurde erfolgreich in Mengen von 20-200 ug/mg Lipid eingeschlossen, dessen Konzentration danach so eingestellt wurde, daß sich 0,3 mMol/l Methotrexat in wäßriger Liposomdispersion zur Verabreichung ergaben.
  • Das eigentliche Verfahren, Liposome an ein Hormon mit einer biologisch aktiven Zellrezeptorbindungsstelle zu koppeln, umfaßt:
  • (a) Fixierung eines Kopplungsagens an Liposome und danach Reaktion mit dem Hormon, oder
  • (b) Fixierung eines Kopplungsagens an ein Hormon und Reaktion mit Liposomen, oder
  • (c) Fixierung eines ersten Kopplungsagens an Liposome, Fixierung eines zweiten Kopplungsagens an das Hormon und danach Reaktion der Kopplungsfragmente miteinander,
  • wobei das alternative Verfahren (c) besonders bevorzugt wird.
  • Es kann ebenfalls wünschenswert sein, einen Linkerarm mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen zwischen dem Liposom und dem Liganden einzuführen, so daß eine sterische Hinderung vermieden werden kann. Dieser Linkerarm kann an das Liposom oder an das Hormon angeheftet werden, vorzugsweise an das Liposom. In diesem Fall wird die Verwendung eines einzelnen Kopplungsagens zur Kopplung des Linkerarms, der entweder am Liposom oder am Hormon fixiert ist, an den übrigbleibenden Bestandteil bevorzugt.
  • Liposome, die Kopplungsagenzien tragen, können dadurch erzeugt werden, daß das Kopplungsagens kovalent mit Phosphatidylethanolamin, vorzugsweise Distearoyl-Phosphatidylethanolamin verbunden wird. Das modifizierte Phospholipid wird dann allein oder in Kombination mit anderen Lipiden und/oder Sterinen zur Herstellung von Liposomen, wie oben beschrieben, verwendet.
  • Kopplungsagenzien zur kovalenten Bindung an Phospholipide sind im Fachwissen bekannt. Vorteilhafterweise sind es heterobifunktionelle Agenzien wie z,B. Succinimidyl-4-(P- Maleimidophenyl)-Butyrat (SMPB) oder Sulpho-Succinimidyl- Verbindungen wie z. B. Succinimidyl-S-acethylthioacetate (SATA) oder N-Hydroxysuccinimidyl-3-(2-Pyridyldithio)-Proprionat (SPDP). Sulpho-Succinimidyl-Verbindungen werden bevorzugt. SATA wird besonders bevorzugt.
  • Kopplungsagenzien können auch durch kovalente Bindung an ein Hormon fixiert werden, bei dem eine funktionelle Gruppe des Aminosäurerests des Hormons beteiligt ist. In vorteilhafter Weise entsteht die Bindung an einem Rest auf dem Hormon, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Lysin, Cystein, Histidin und Arginin besteht. Der Lysinrest wird dabei besonders bevorzugt.
  • Geeignete Kopplungsagenzien zur Bindung an Hormone sind heterobifunktionelle Agenzien. Vorteilhafterweise werden sie aus folgenden Stoffen ausgewählt: Succinimidyl-S-Azetylthioazetat (SATA), Succinimidyl-4-(P-Maleimidophenyl)- Butyrat (SMPB), Sulpho-SMPB, N-(4-Carboxy-Cyclohexyl- Methyl) Maleimid (SMCC), Sulpho-SMCC, M-Maleimidobenzoyl- N-Hydroxysuccinimid-Ester (MBS), Sulpho-MBS, N-Succinimidyl(4-Iodoacetyl)Aminobenzoat (SIAB) und Sulpho-SIAB. Das bevorzugteste Kopplungsagens ist SMPB.
  • In einer bevorzugten Ausführung wird Succinimidyl-S-Azetylthioazetat-Phosphatidylethanolamin verwendet, um aktivierte Liposome herzustellen, die SATA in ihrer Membran enthalten, die dann kovalent an ein SMPB-Hormon-Konjugat gebunden werden, vorzugsweise an SMPB-IL-2-Konjugat.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Figur 1 ist eine schematische Darstellung des IL-2-Moleküls.
  • Figur 2 zeigt eine Methode zum Herstellen eines Schutzes der Rezeptorbindungsstelle des IL-2, wobei sich PA auf Protein-A-Agarose und aIL-2 auf den Antikörper zur Rezeptorbindungsstelle von IL-2 bezieht und PAS IL-2 das an das Harz gebundene IL-2 darstellt.
  • Figur 3 zeigt eine Methode zur Modifizierung von IL-2 mit SMPB, bei dem IL-2 in der Form von PAS IL-2 verwendet wird.
  • Figur 4 zeigt die Reaktion von Phosphatidylethanolamin mit SATA.
  • Figur 5 zeigt eine Methode zur Erzeugung einer kovalenten Bindung zwischen SMPB-modifiziertem IL-2 und SATA-modifizierten Liposomen.
  • Figur 6 zeigt eine Methode zur Herstellung von aktiviertem Phosphatidyiethanolamin, bei dem das Kopplungsfragment einen 4- bis 6- Kohlenstoff- Linkerarm umfaßt.
  • Figur 7 zeigt ein Verfahren zum partiellen Schutz der NH&sub2;-Gruppe von Lysinresten mit Citraconsäure-Succin-Anhydrid vor der Kopplung an SATA.
  • Figur 8 zeigt eine Reaktion zur Kopplung von Phosphatidylethanolamin an Kamphoquinon-10-Sulphonsäure.
    • Beispiel 1: Schutz und Modifikation von IL-2
  • Ein Protein-A Agaroseharz wird mit einem MAb, der spezifisch für die Rezeptorbindungsstelle von IL-2 ist (erhältlich von Genzyme Inc., Katalogbezeichnung DMS-1) zur Reaktion gebracht, wobei das Harz mit PBS-Pufferlösung gewaschen wird, MAb dem Harz zugesetzt wird, Quervernetzung des MAb mit dem Harz in Gegenwart von 12,5%igem Glutaraldehyd in PBS für 60 Minuten bei 4ºC stattfindet und schließlich das Harz nochmals mit der Pufferlösung gewaschen wird.
  • Sodann werden 50 ug IL-2 in 100 ul Pufferlösung dem mit MAb verbundenen Harz zugesetzt und mit SMPB modifiziert, wie in Figur 3 dargestellt ist. SMPB wird dem IL-2 in einem molaren Verhältnis von 25:1 hinzugefügt. SMPB reagiert spezifisch mit den NH&sub2;-Gruppen der Lysinreste. Das modifizierte IL-2 wird dann aus dem Harz mit 2 M NaSCN in 0,05 M Trispuffer, pH 8 ausgewaschen, worauf eine zweite Auswaschungsbehandlung mit 6% Betain in 0,2 N Essigsäure folgt, alles bei 4ºC.
  • Ein IL-2-Rezeptorbindungs-Assay zeigt, daß das resultierende SMPB in der Lage ist, sich mit dem IL-2-Rezeptor der Zielzellen zu verbinden. Weiterhin wird in einem ELISA- Testverfahren SMPB-modifiziertes IL-2 von den monoklonalen Antikörpern als Rezeptorbindungsgebiet des IL-2 erkannt, da unmodifiziertes IL-2 unter den gleichen Bedingungen aus der Säule ausgewaschen wird.
  • In einem alternativen Verfahren wird MBS (Maleimidobenzoyl-N-Hydroxy Succinimidester, ein SMPB-Derivat) ebenfalls verwendet, um IL-2 zu modifizieren. Die Verwendung dieses Reagens erbringt ebenfalls biologisch aktives IL-2, wenn es in einem Rezeptorbindungsassay und im Anti-IL-2- ELISA-Testverfahren bestimmt wird.
    • Beispiel 2: Synthese von SATA-DSPE (siehe Figur 4)
  • 125 mg frisches Succinimidyl-S-Azetylthioazetat (SATA) werden mit 75 mg Distearoyl-Posphatidylethanolamin (DSPE) in einem Rundkolben vermischt. Dann werden 15 ml einer Mischung aus CHCl&sub3;:MeOH (1:1) zugefügt, danach nochmals 100 bis 135 ul Triethylamin. Der Kolben wird dann mit Stickstoff gespült, und die Reaktion findet während einer Dauer von zwei Stunden unter ständigem Rühren statt.
  • Der Fortschritt in der Reaktion wird mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie in CHCl&sub3;:MeOH (7:3) überwacht. Die Abwesenheit eines Positivpunktes für Ninhydrin und das Vorhandensein eines Positivpunktes für Phosphomolybdänsäure mit einem Rf-Wert von 0,57 zeigt das Vorhandensein von SATA-DSPE an. SATA-DSPE kann auch partiell zu der Disulphidform SATA-DSPE-SATA-DSPE oxidiert sein, die einen Rf-Wert von etwa 0,37 aufweist.
  • Das so erhaltene Material wird dann zur Trockne eingedampft und erneut in 1 ml CHCl&sub3;:MeOH (1:1) in Lösung gebracht. Nach Zugabe von 15 ml Azetonnitril wird die Mischung bei -20ºC für etwa 60 Minuten gehalten, um SATADSPE selektiv auszufällen, wobei das nicht an der Reaktion beteiligte DSPE in Lösung verbleibt. Der Niederschlag wird durch Filtration auf einem gesinterten Glasfilter gesammelt und mit Azetonnitril gewaschen. Das gewaschene SATA- DSPE wird dann wieder durch Zugabe von CHCl&sub3;:MeOH (1:1) gelöst, in einer zweiten Filterflasche gesammelt, in einen weiteren Kolben transferiert und dann eingedampft.
  • Während des oben beschriebenen Verfahrens werden alle Teilschritte schnellstmöglich durchgeführt, um eine Oxidation so gering wie möglich zu halten. Kleine Mengen oxidierten SATA-DSPE werden jedoch in der Herstellung durch präparierende Dünnschichtchromatographie auf einer Kieselgel-60-Platte (EM Science) entfernt. Silicagel-Platten mit Alumuniumrücken (kein Fluoreszenzindikator) werden mit CHCl&sub3;:MeOH (7:3) als mobile Phase verwendet. SATA-DSPE wird durch Jodfärbung lokalisiert. Die Streifen, die SATA- DSPE enthalten, werden ausgeschnitten und während einer Dauer von 30 Minuten in CHCl&sub3;:MeOH (1:1) extrahiert. Das SATA-DSPE wird zur Trockne konzentriert, in CHCl&sub3;:MeOH (1:1) gelöst und auf Glasfläschchen verteilt. Jedes Fläschchen wird mit Stickstoff gespült und bei -20ºC gelagert.
    • Beispiel 3 a): Herstellung von leeren Liposomen
  • Liposome mit der Zusammensetzung DSPC : Cholesterin: SATA- DSPE in einem molaren Verhältnis von 1,5 : 1: 0,5 wird werden wie folgt hergestellt:
  • 10 mg der Mischung aus DSPC, Cholesterin und SATA-DSPE im obengenannten Verhältnis werden in 1 ml CHCl&sub3; gelöst, unter Stickstoffeinwirkung zu einem Film getrocknet und dann weiter über Nacht einer Vakuumtrocknung unterzogen.
  • Der Lipidfilm wird in 1 ml PBS-Pufferlösung mit einem pH von 8,3 dispergiert, bei 65ºC für 60 Min. stehen gelassen, mit einer Ultraschallsonde für 6 Min. bei 65ºC beschallt und auf der gleichen Temperatur gehalten, damit sich kleine unilamellare Vesikel bilden. Die SUV werden dann für 10 Min. bei 13 000 x g zentrifugiert, um jegliche Titanteilchen von der Ultraschallsonde zu entfernen.
  • 0,9 ml des SUV-Präparats (etwa 10 mg Lipid) wird dann in eine Sephacryl-S300- Säule eingesetzt, um das freie SATA- DSPE (das nicht in Liposome eingebaut wurde) zu entfernen. Die Säule wird zuerst vorgesättigt mit SUV aus DSPC: Cholesterin (2:1) in PBS, 1 mMol/l EDTA 0,2 mMol/l PMSF, um die Ausbeute an SATA-DSPE-SUVS beim Säulendurchlauf zu maximieren. SATA-DSPE-SUV werden in einem Volumen von 2,4 ml gesammelt, das etwa 3,3 mg/ml Lipide enthält. Die auf diese Weise hergestellten SUV haben einen Durchmesser von etwa 50 nm.
    • Beispiel 3 b): Herstellung von wirkstoffhaltigen Liposomen
  • Das Beispiel 3 a) wird wiederholt mit der Änderung, daß die zur Dispergierung des Lipidfilms verwendete PBS-Pufferlösung 55 mg/ml Methotrexat enthält. Man erhält SATA- DSPE-SUV, die Methotrexat enthalten.
    • Beispiel 4: Anheftung von IL-2 an Liposome
  • Das modifizierte SMPB-IL-2 aus Beispiel 1 wird kovalent durch seine Maleimido-Gruppen mit den SUV aus den Beispielen 3 a) oder 3 b) verbunden. Mit Bezug auf Figur 5, findet die Kopplung folgendermaßen statt:
  • Die SATA-DSPE enthaltenden SUV werden zuerst durch Deacetylierung des SATA-Restes aktiviert, so daß er mit dem SMPB-IL-2 reagieren kann. 10 ul frisch zubereitetes 0,5-molares Hydroxylamin wird 1 ml des SUV-Präparats aus Beispiel 1 (10 mg/ml in PBS) zugesetzt. Es findet eine Inkubation für 30 Min. bei 22ºC in Argon statt.
  • Dann wird der pH-Wert des SMPB-IL-2 Präparats aus Beispiel 1 auf einen pH von 6,5 bis 7 eingestellt. Eine Probe wird dann zu den deacetylierten SUV in einer Größenordnung von 10 bis 20 ug SMPB-IL-2 auf 12 bis 24 ug Lipid zugefügt. Es findet eine Inkubation für 2 Std. bei 22ºC in Argon statt. Dann wird zur Blockierung der nicht von der Reaktion erfaßten -SH-Gruppen NEM zugefügt, um eine Endkonzentration von 20 mMol/l zu erzielen.
  • Der pH der Vesikel-IL-2-Suspension wird auf pH 9 eingestellt. Eine CM-Sepharose Säule (50 mMol/l Tris, pH 9,0) wurde entleert. Die Liposome werden in die Säule eingesetzt, das Harz gerührt, für 10 Min. inkubiert und dann nochmals abgelassen. Radioaktive Proben (0,5 ml) von Pufferlösung werden zugefügt und eine fraktionierende Verteilung wird durchgeführt. Alle trüben oder opalisierenden Fraktionen werden zusammengefaßt und bestimmt.
  • Das erzielte SUV-Präparat enthält SUV, die zwischen 6 und 5040 Moleküle gebundenes IL-2 pro SUV (50 nm Durchmesser) aufweisen.
  • Wenn Beispiel 4 mit methotrexathaltigen Liposomen aus Beispiel 3 b) wiederholt wird, erhält man Liposome, an deren äußerer Oberfläche IL-2 gebunden ist und die Methotrexat enthalten.
    • Beispiel 5: Synthese eines erweiterten Linkerarms, um eine sterische Hinderung zu vermindern
  • Im folgenden wird ein bevorzugter Syntheseweg (Figur 6) zum Erhalt von im allgemeinen nützlichen aktivierten Lipiden beschrieben:
  • Einer Lösung aus Distearoyl-phosphatidylethanolamin (A) und Succinimidyl-gamrna-BOC-Aminopentanoat (B) in Chloroform-Methanol im Verhältnis 9:1 wird ein geringer Überschuß an Triethylamin hinzugefügt. Das Lösungsmittel wird verdampft und die BOC-Gruppe mit einer Lösung aus Trifluoressigsäure in Dichlormethan entfernt. Die Reaktion des SMPB (D) mit dem Distearoyl-Phoshatidyläthyl-gamma- Aminopentanamid (C), der als Rest nach der Reaktion mit Trifluoressigsäure zurückbleibt, wird unter den gleichen Bedingungen ausgeführt wie die erste Kopplungsreaktiön. Das Distearoyl-phosphatidylethyl-4-(P-Maleimidophenyl- Butyramid) Pentanamid (E) wird mit Hilfe der Kieselgelchromatographie gereinigt.
  • Nach der Reinigung wird das aktivierte Lipid in die Liposome eingebaut, wobei der Wirkstoff oder Marker in Standardart eingeschlossen werden. Die Liposome sind dann zur Reaktion mit freien Proteinsulfhydrylen bereit, die entweder auf dem unmodifizierten Protein vorhanden sind oder mit Derivaten, die gemäß nachstehender Beschreibung hergestellt werden.
  • SATA kann zum Beispiel in begrenzender Konzentration verwendet werden. So kann zu einer Lösung von IL-2 bei einem pH von 8 eine Lösung von SATA in DMF oder Dioxan gegeben werden. Die Größenordnung der Substitution kann durch Begrenzung der Reagensmenge kontrolliert werden. Die blockierende Funktion des Sulfhydryls wird dann durch Zugabe von Hydroxylamin aufgehoben und das IL-2 verbindet sich sofort mit den Liposomen, die eine Maleimido-Gruppe an der Oberfläche aufweisen.
    • Beispiel 6: Modifikation von IL-2 an ausgewählten (begrenzten) Lysin-Resten
  • Die zahlreichsten und verfügbarsten Proteinreaktionsstellen sind die Lysin- NH&sub2;-Gruppen. Da sich einige der Lysinreste an der Rezeptorbindungsstelle befinden, muß der Versuch, die Lysinreste zur Kopplung zu benutzen, die Maßnahme umfassen, die Lysinreste zu begrenzen, die tatsächlich an der Reaktion beteiligt sind.
  • Wenn die Reaktionsgeschwindigkeit der kritischen Lysinreste viel höher ist oder zumindest vergleichbar mit derder anderen Lysinreste, kann die Methode in Figur 7 verwendet werden. Bei dieser Methode werden praktisch alle außer ein paar wenigen Lysinresten zuerst mit einem reversiblen Blockiermittel derivatisiert. Bei Verwendung von gerade ausreichender Reagensmenge, so daß die reaktionsfähigsten und verfügbarsten Lysine blockiert werden, oder nach dem Blockieren, dem eine partielle Befreiung folgt, werden dann die verbleibenden Lysinreste durch Verwendung großer Überschußmengen eines Kopplungsmittels, z.B. SATA derivatisiert. Zu einer Lösung von IL-2 in Boratpuffer bei pH 8,8 wird Citraconsäureanhydrid gegeben, wobei der pH-Wert durch Zugabe von 1 N Natriumhydroxidlösung gehalten wird. Die Citraconsäuregruppe kann bei einem pH von 2 entfernt werden und diese Reaktion kann durch Wiederanheben des pH-Wertes unterbrochen werden. SATA wird im Überschuß zur Lösung bei einem pH von 8 zugefügt, wodurch alle freien Amine derivatisiert werden. Das Überschußreagens wird durch Dialyse entfernt und die verbleibenden Citraconsäuregruppen bei einem pH-Wert von 2 entfernt. Die Lösung wird auf einen neutralen pH-Wert gebracht, und es bilden sich Sulfhydrylgruppen durch Zugabe von Hydroxylamin. SMPB-Liposomen werden eingeführt und verbinden sich mit dem Protein.
    • Beispiel 7: Modifikation von IL-2 an Arginin-Resten
  • Es sind vier Arginine in Interleukin-2 vorhanden, von denen nur eines in einem Gebiet zu sein scheint, das eine Bindung beeinflussen könnte. So können Liposome an IL-2 unter Verwendung eines Arginin-spezifischen Reagens gekoppelt werden, z.B. Kamphoquinon-10-Sulphonsäure, wie in Figur 8 gezeigt.
  • Das Kamphersulphonylchlorid, hergestellt unter Verwendung von Thionylchlorid, wird in Gegenwart von Pyridin zu Phosphatidylethanolamin gegeben. Das Kampfersulphonyl-Phosphatidylethanolamin PE wird dann in die Liposome eingebaut und reagiert mit IL-2 im Boratpuffer bei pH 8,8. IL-2, das an Vesikel geknüpft ist, wird von dem nicht an der Reaktion beteiligten Protein in einer Sephadex G-150 Säule getrennt.
    • Beispiel 8: Modifikation an Histidin-Stellen auf einem Liganden
  • Histidin kann chemisch durch Reagenzien wie Bromazetamid- Verbindungen verändert werden. Insbesondere His-70 des IL-2 beeinflußt nicht die Bindungsaktivität. Ein auf Bromazetamid basierendes heterobifunktionelles Reagens kann synthetisiert werden, um einen Anheftungspunkt für Liposome zu bereitzustellen. Spezifisch ist das:
  • Br-CH&sub2;- -NH-CH&sub2;-CH&sub2;-NH- -CH&sub2;-S- -CH&sub3;
  • Diese Verbindung wird durch Zugabe von Bromazetylbromid zu Ethylendiamin (1:1) hergestellt, worauf eine Reaktion des restlichen Amins mit SATA erfolgt. Die Reaktion mit IL-2- Histidin in 1 M Azetatpufferlösung mit pH 5,5 erzeugt an der Histidin-Imidazol-Gruppe das 3'-N-substituierte SATA-Derivat. Die Zugabe von Hydroxylamin deacetylisiert den SATA- Marker, so daß eine freie Sulfhydryl-Gruppe zur Reaktion mit SMPB-Liposomen zur Verfügung steht.
    • Beispiel 9: Assay-Testverfahren zur Überwachung der Rezeptorbindungsaktivität von Liposom/IL-2
  • Anti-Proliferationsmaßnahmen wurden durch die mehrtägige Züchtung von Zellen durchgeführt, die den High-Affinity- Interleukin-2-Rezeptor besitzen, und zwar in
  • a) Kulturmedium in Abwesenheit jeglicher Form von Interleukin-2,
  • b) Kulturmedium, das mit einer wirksamen Dosis von freien zytostatischen Agens ergänzt wurde,
  • c) Kulturmedium, das mit einer Dosis von Liposom/IL-2- Komplexen aus Beispiel 4 ergänzt wurde,
  • d) Kulturmedium, das mit einer Dosis Liposom/IL-2-Kom plexen aus Beispiel 4 ergänzt wurde, die ein zytostatisches Agens aufweisen.
  • Nach einer angemessen Behandlungsdauer, die in vorhergehenden Studien ermittelt wurde, werden die Zellen mit ³H-Thymidin pulsmarkiert. Nach einer 3- bis 4-stündigen Markierungsdauer werden alle Kulturen auf Glasfaserfilterstreifen geerntet und der ³H-Thymidin-Einbau als Index für das Zellwachstum gemessen. Die Wirksamkeit des Liposom/IL-2 enthaltenden zytostatischen Agens-Komplexes wird dabei durch Vergleich mit Zellen bestimmt, die in Abwesenheit jeglicher Form des Wirkstoffs kultiviert wurden. Die in vivo-Verteilung der Liposom/IL-2 Komplexe kann unter Verwendung bekannter Techniken festgestellt werden, die in Beispiel 10 beschrieben werden.
    • Beispiel 10: Biologische Verteilungsstudien
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur Messung der biologischen Verteilung nutzt das Radionuklid Indium-111. Das Liposomen-umschlossene Indium liegt in der Form von einem oder zwei Chelat-Komplexen vor. Um bei biologischen Verteilungsstudien den Verbleib der Liposom/IL-2-Formulierungen in vivo zu messen wird der Chelatbildner Ethylenediamin- Tetraessigsäure (EDTA) bevorzugt benutzt; zur Gesamtaufnahme in vivo durch die Zielzellen wird vorzugsweise Nitrilotriessigsäure (NTA) verwendet.
  • In einer herkömmlichen Bioverteilungs-Studie, werden SUV mit einer bestimmten Zusammensetzung in Gegenwart von Chelatbildner und Indium-111 zur passiven Einschließung von Indium hergestellt, oder von Ionophor A23187 zur nachfolgenden aktiven Umschließung von Indium-111 in vorgeformte Liposome. In jedem Fall werden die Liposomen vom nicht-eingeschlossenen Material durch eine Behandlung mit zusätzlichem EDTA getrennt, worauf eine Säulenchromatographie folgt.
  • Bioverteilungsmessungen werden durch intravenöses Injizieren des ¹¹¹In-Liposom/IL-2-Komplexes in Versuchstiere durchgeführt. Mehrmals nach der Injektion (z.B. nach 1, 3, 6 und 24 Stunden) werden Tiere getötet und Gewebe zur Strahlenmessung gesammelt. Liposome, die mit ¹¹¹In-EDTA beladen sind, können für die ersten Bioverteilungsstudien verwendet werden. Dieser fest verbundene Chelatkomplex erlaubt die Messung der in vivo-Verweilzeiten der Liposome. Experimente, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, haben gezeigt, daß ¹¹¹In-EDTA allein schnell in vivo aufgenommen wird. Aus diesem Grunde kann jede gemessene Indium-111-Aktivität als ein Vorhandensein von ¹¹¹In-Liposom/IL-2 interpretiert werden.
  • Die Aufnahme von Liposom/IL-2 durch Lymphozyten in einem Versuchstier kann bei Verwendung des ¹¹¹In-NTA-Komplexes studiert werden. Es wurde gezeigt, daß dieser relative schwache Chelatkomplex Indium-111 im wäßrigen Reaktionsund Speicherraum von Liposomen festhält, aber Indium-111 schnell freisetzt, sobald sich das Chelat in der Nähe von Protein- oder Kohlenhydratmolekülen befindet. Aus diesem Grunde stellt die Behandlung von Versuchstieren mit ¹¹¹In-NTA-Liposom/IL-2-Formulierungen ein Mittel bereit, die kumulative Aufnahme durch Lymphozyten zu messen.
  • Dies kann durch die Behandlung von Tieren mit ¹¹¹In-NTA- Formulierungen erreicht werden. Den Versuchstieren kann eine einzige oder mehrere (2-3) Injektionen mit ¹¹¹In-NTA-Liposomen auf intravenöse Art oder über die Bauchhöhle verabreicht werden. Mehrmals nach der Behandlung werden Tiere getötet und Lymphozyten z.B. aus dem Blut, der Milz und dem Bauchfell durch Zentrifugation nach Ficoll-Gradienten isoliert. Die isolierten Lymphozyten werden dann im Gammastrahlendetektor auf Indium-111 abgesucht. Bioverteilungsstudien an gesunden Ratten haben gezeigt, daß der ¹¹¹In-Liposom/IL-2-Komplex aus Beispiel 4 eine verlängerte Umlaufhalbwertzeit hat, und daß er sich nicht an Makrophagen oder nicht-aktivierten T-Zellen anheftet.
  • In vivo-Bioverteilungsstudien können, zusätzlich zur direkten Messung der Liposomeninteraktion mit T-Lymphozyten, auch zur Bewertung des Ausmaßes der Aufnahme von Liposom/IL-2-Formulierungen durch das Reticulo-endotheliale-System (RES), insbesondere bei der Leber, Milz und Lymphknotenstellen verwendet werden. Es ist allgemein bekannt, daß viele Phospholipid-Vesikel-Typen rasch in der Leber und der Milz abgebaut werden, wodurch sie aus dem Blut entfernt werden. Große Liposome und Vesikel, die mit verschiedenen Kohlenhydrat- und Proteingruppen verbunden sind, sind dabei zwei besonders empfängliche Typen. Daher ist die Art und Weise der RES-Aufnahme von Wichtigkeit für die Praktizierung der vorliegenden Erfindung. Geeigneten Dosierungen können durch einen derartigen Test unter Verwendung von Standardverfahren festgelegt werden.
  • Um einen nicht-spezifischen Abbau durch das RES zu vermeiden und unter Beteiligung primär von Makrophagen, in dem Ausmaß, in dem es eine Behinderung der Liposomen/Lymphozyten-Interaktion für eine bestimmte Liposom/Interleukin-2- Formulierung darstellt, kann eine RES Blockierung durch vorherige Behandlung mit Liposomen, die auf RES-Stellen gerichtet sind, angewandt werden. Alternativ kann auch eine zusätzliche Modifizierung der Oberfläche der Liposom/Interleukin-2-Formulierungen beispielsweise unter Verwendung eines Verfahrens, das der Opsonisierung ähnelt, um die Liposomen-Interaktion mit Blutlymphozyten durch verlängerte Umlaufzeiten zu verstärken. Weiterhin kann der Abbau durch das RES durch lokale Verabreichung des Interleukin-2-Liposom-Präparats als Depot an der kritischen Stelle verabreicht werden, z.B. am Transplantat oder an einem Organ, das einem Autoimmunangriff ausgesetzt ist.
    • Beispiel 11: Spezifität von aktivierten T-Zellen
  • Die Wirksamkeit von Liposom/IL-2-Präparaten kann mit Hilfe von Tiermodellen demonstriert werden, bei denen T-Lymphozyten reversibel aktiviert werden können. Zwei leicht erhältliche Modelle sind das Rattenfelltransplantat-Modell und das Rattenverbrennungsmodell (30 % der Körperoberfläche). Bei Benutzung eines dieser Modelle erhalten Tiergruppen entweder Liposom/IL-2, das einen immunosuppressiven Wirkstoff enthält, oder nur Liposom/IL-2. Die Nicht- Abstoßung des Allotransplantats wird dann im Verlauf derprotokollierten Behandlung mit Liposom/IL-2 gemessen. Jene, die Liposom/IL-2 ohne den in die Liposomen eingebauten Wirkstoff erhalten hatten, stoßen das Transplantat auf Grund von T-Zellen und deren zytolytischer Aktivität im Transplantatgebiet leicht wieder ab. Als Alternative kann das Liposom/IL-2-Präparat einen Wirkstoff nach Wahl enthalten und in Anwendung entweder des Ratten- oder Maus-Leukämie-Modells verwendet werden. In Versuchen hat sich gezeigt, daß der Liposom/IL-2-Komplex aus Beispiel 4 in vitro von aktivierten T-Zellen angezogen wird.
  • Die vorliegenden Freisetzungs-Vehikel können in vielen verschiedenen therapeutischen Zusammenhängen, einschließlich der Therapie von Krankheiten in Säugetieren und in vivo-Diagnosen Verwendung finden, wobei Bioverteilungsstudien signifikante Vorteile gezeigt haben. Wenn in der Praxis kleine unilamellare Liposome verwendet werden, die sich sowohl beim gezielten Angriff auffeste Tumore als nützlich erwiesen haben als auch größere Umlaufzeiten als andere Vehikel haben, können die vorliegenden Freisetzungsvehikel dazu benutzt werden, Arzneimittel oder diagnostische Marker (wie z.B. radioaktive Marker, Fluoreszenzmoleküle, und NMR-spektroskopische Agenzien wie z.B. Magnetit) zu neoplasmatischen Zellen oder zu speziellen Körperorganen wie der Leber zu transportieren. Gemäß den hier gemachten Ausführungen können die vorliegenden Freisetzungs-Vehikel benutzt werden, um einer Zellpopulation, die durch einen Zellrezeptor wie dem Interleukin-2-Rezeptor gekennzeichnet ist, cytotoxische, regulative, diagnostische oder andere Moleküle in gezielter Weise zuzuführen. So können im Fall des Liposom/IL-2-Freisetzungsvehikels der vorliegenden Erfindung aktive Agenzien zu Lymphozyten transportiert werden, um auf diese Weise Erkrankungen, an denen Funktionsstörungen des Immunsystems beteiligt sind (einschließlich genetischer oder nichtgenetisch bedingter Autoimmunkrankheit wie z.B rheumatische Arthritis, juvenile Diabetes, systemischer lupus erythamatodes und andere sowie Transplantationsreaktionen wie die Transplantat-Wirt-Reaktion), Lymphozyten-bedingten Krebs (einschließlich Lymphomatosen und Leukämie wie die Erwachsenen- oder chronische myeloische Leukämie und Haarzellenleukämie) und Helfer-T-Zellen-Störungen (einschließlich Viruserkrankungen wie jene, die mit HIV-infizierten T-Zellen verbunden sind, zu behandeln, zu beeinflussen oder zu diagnostizieren.

Claims (30)

1. Liposome, die kovalent an ein Hormon mit einer Zellrezeptorbindungsstelle gekoppelt sind, die reversibel durch einen für die Bindungsstelle spezifischen Antikörper geschützt ist.
2. Liposome nach Anspruch 1, bei denen der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
3. Liposome nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei denen das Hormon ein zytokines Hormon ist.
4. Liposome nach Anspruch 3, bei denen das zytokine Hormon ein Interleukin 1 bis 7 ist.
5. Liposome nach Anspruch 4, bei denen das zytokine Hormon Interleukin 2 (IL-2) ist.
6. Liposome nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die zumindest einen cytotoxischen Wirkstoff einschließen.
7. Liposome nach einem der Ansprüche 1 bis 6, deren Membran Phosphatidylethanolamin enthält.
8. Liposome nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die an das Hormon durch ein Kopplungsfragment gebunden sind, das einen SATA- und einen SMPB-Rest umfaßt, wobei der genannte SATA-Rest mit den Liposomen verbunden ist und der genannte SMPB-Rest mit dem Hormon verbunden ist.
9. Liposome nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die mit dem Hormon durch ein Kopplungsfragment verbunden sind, das einen 4- bis 6-Kohlenstoff-Linkerarm umfaßt.
10. Liposome nach einem der Ansprüche 1 bis 9, die kleine unilamellare Vesikel sind.
11. Liposome nach einem der Ansprüche 1 bis 10, die an das Hormon über einen Aminosäurerest des Hormons gebunden sind, der nicht an der Rezeptor-Bindungsstelle lokalisiert ist und der aus Resten aus Lysin, Cystein, Arginin und Histidin ausgewählt wird.
12. Liposome nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei denen die Ankopplung an einem Lysin-Rest des Hormons stattfindet.
13. Methode zur Herstellung von Liposomen, die kovalent an ein Hormon gekoppelt sind, das eine biologisch aktive Zellrezeptorbindungsstelle aufweist, wobei die Methode das Freimachen der geschützten Zellrezeptorbindungsstelle des Hormons, das an Liposome nach einem der Ansprüche 1 bis 12 gekoppelt ist, umfaßt.
14. Verfahren zur Bindung von Liposomen an ein Hormon mit einer biologisch aktiven Zellrezeptorbindungsstelle, wobei die Bindung an einer Stelle des Hormons erfolgt, die nicht die genannte biologisch aktive Bindungsstelle ist, bei der die genannte Bindungsstelle vor der Ankopplung durch einen für diese Bindungsstelle spezifischen Antikörper umkehrbar geschützt wird und nach Durchführung eines beliebigen Reaktionsschrittes, der andernfalls zu einer Beeinflussung oder einem Blockieren der genannten Bindungsstelle führen könnte, freigemacht wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das Freimachen nach Anbindung des Hormons an die Liposome stattfindet.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder Anspruch 15, bei dem der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, bei dem das Hormon ein zytokines Hormon ist.
18. Verfahren nach Anspruch 17, bei den das zytokine Hormon ein Interleukin 1 bis 7 ist.
19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem das zytokine Hormon Interleukin 2 (IL-2) ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, bei dem die Liposome zumindest einen zytotoxischen Wirkstoff einschließen.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 20, bei dem die Liposommembran Phosphatidylethanolamin enthält.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 21, welches das Fixieren eines Kopplungsfragmentes an die Liposome umfaßt, wobei das Fragment der Bindungsrest eines Kopplungsmittels ist, das aus Succinimidyl-4-(P- Maleimidophenyl)Butyrat (SMPB) und Sulpho-Succinimidyl-Verbindungen ausgewählt ist.
23. Verfahren nach Anspruch 22, welches das Fixieren von Kopplungsfragmenten an Liposome umfaßt, wobei das Fragment ein Bindungsrest von Succinimidyl-S-Azetylthioazetat (SATA) ist.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 23, welches das Fixieren eines Bindungsfragmentes an das Hormon umfaßt, wobei das Fragment der Bindungsrest eines Kopplungsmittels ist, das aus Succinimidyl-4-(P- Maleimidophenyl)Butyrat (SMPB), Sulpho-SMPB, N-(4-Carboxy-Cyclohexyl-Methyl)Maleimid (SMCC), Sulpho-SMCC, N-Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimidester (MBS), Sulpho-MBS, N-Succinimidyl-(4-Iodoacetyl)-Aminobenzoat (SIAB) und Sulpho-SIAB ausgewählt ist.
25. Verfahren nach Anspruch 24, welches das Fixieren eines Kopplungsfragmentes, das ein Bindungsrest von Succinimidyl-4-(P-Maleimidophenyl)Butyrat (SMPB) ist, an das Hormon umfaßt.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 25, welches das Fixieren eines Kopplungsfragmentes, das ein Bindungsrest von Succinimidyl-S-Azetylthioazetat (SATA) ist, an die Liposome und das Fixieren eines Kopplungsfragmentes, das ein Bindungsrest von SMPB ist, an das Hormon sowie die Reaktion der Kopplungsfragmente miteinander umfaßt.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 26, bei dem die Zellrezeptorbindungsstelle des Hormons reversibel geschützt wird, bevor das Fixieren des Kopplungsfragmentes erfolgt.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 27, bei dem die Liposome kleine unilamellare Vesikel sind.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 28, bei dem die Liposome über einen Aminosäurerest auf dem Hormon an das Hormon gebunden werden, der nicht an der Rezeptorbindungsstelle lokalisiert ist und der aus Resten von Lysin, Cystein, Arginin und Histidin ausgewählt ist.
30. Verfahren nach Anspruch 29, bei dem die Kopplung an einen Lysin-Rest des Hormons stattfindet.
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