AT395375B - Immunglobulinkonjugate, verfahren zu deren herstellung und anwendung sowie pharmazeutische mittel, die diese enthalten - Google Patents
Immunglobulinkonjugate, verfahren zu deren herstellung und anwendung sowie pharmazeutische mittel, die diese enthalten Download PDFInfo
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Description
AT 395 375 B
Die Erfindung betrifft Immunglobulinkonjugate, Verfahren zu deren Herstellung und Anwendung sowie pharmazeutische Mittel, die diese enthalten.
Das allgemeine Konzept zum direkten Anpeilen von Tumoren mit antineoplastischen Agentien unter Verwen-dungmonoklonaler Antikörper (MoAbs)ist bekannt, unddie therapeutische BedeutungwirddeizeiteinerUntersuchung unterzogen. Im allgemeinen geht man dabei so vor, daß man Konjugate aus einem Antikörper und einem toxischen Agens, die in der Lage sind, sich selektiv an den Tumorzellen zu lokalisieren und diese zu zerstören, herstellt. Ein besonderes Augenmerk galt der Konstruktion von Immuntoxinen aus den A-Ketten pflanzlicher und bakterieller Toxine und Antikörpern, und zwar so, daß es bei der Bindung des Antigens und bei der Einverleibung desselben zum Zelltotkommt. In der Praxis hat sich gezeigt, daß viele MoAbs, von denen man glaubte, daß sie tumor-spezifisch sind, auch mit Subpopulationen normaler Zellen reagieren, so daß es folglich unrealistisch ist, derart potente Toxine einzusetzen, da sie auch normale Gewebe in nennenswerter Weise schädigen. Eine sicherere Alternative zu Pflanzentoxinen stellt die Kopplung von Antikörpern an konventionelle Anti-Krebsmittel, wie Doxorubicin, Vindesin, Chlorambucil, Melphalan und Methotrexat, dar. Aufgrund der nicht-spezifischen toxischen Wirkung der derzeit verwendeten antineoplastischen Agenzien hat man versucht, deren therapeutischen Index zu erhöhen, indem man sie an MoAbs auf Tumorantigene koppelte.
Versuche zur Unterdrückung der Transplantatabstoßung durch T-Zellen aus dem Thymus haben sich häufig darauf fokussiert, dieT-Zellenaktivität durch Einsatz von Antithymocyten-Globulin zu reduzieren. In letzter Zeit ist es durch die Entwicklung monoklonaler Antikörper möglich geworden, T-Zellenuntergruppen entsprechend ihrer Funktion in vitro und das Vorliegen spezifischer Oberflächenantigene, wie sie durch MoAb definiert werden, zu bestimmen. Dies hat die Suche nach einem Mechanismus stimuliert, mit dem T-Zellen die Transplantatabstoßung kontrollieren, wobei man sichaufdiehauptsächlicheUnterteilunginHelfer/Induktions-undcytotoxische/Suppressor-Untergruppen, wie sie durch die L3T4 und Ly-2-Maus-Antigene definiert werden, konzentriert Obwohl sich OKT3 MoAb, ein Anti-Pan-T-Zellenreagens,in vivo als wirksam gezeigt hat, haben wir bei einer kürzlichen Untersuchung festgestellt, daß 20 MoAbsauf20 verschiedene Maus-Lymphocytenantigene in vivo in Mäusen ohne Wirkung waren und daher für in vivo-S tudien nicht von Nutzen sind. Es ist deshalb angezeigt, nach Mitteln zu suchen, mit deren Hilfe diese hochspezifischen MoAbs wirksamer gemacht werden können, so daß eine vollständige Entfernung der target-Zellen »folgt. Eine Methode besteht dabei in der Verwendung cytotoxischer Arzneimittel, die an MoAbs gekoppelt sind.
Das klinische Potential von Arzneimittel-MoAb-Konjugaten umfaßt die Immunchemotherapie von Krebs sowie die Erleichterung verschiedener immunregulativer Störungen und die allo-Transplantatabstoßung. In vielen Untersuchungen konnte die spezifische Cytotoxizität von Toxinen und Arzneimitteln auf Tumorzellen gezeigt werden, wenn diese mitMoAb auf tumor-assoziierte Antigene gekoppeltwerden. Weniger Bedeutunghatman auf diein vivo-Verwendung von Arzneimittel-MoAb-Konjugaten angewendet, um T-Zellen zu zerstören und die T-Zellen-Immunregulierung bei der Transplantatabstoßung zu untersuchen, obwohlToxin-Antikörper-Konjugate in vitro in großem Ausmaß eingesetzt werden, um T-Zellen vor der Knochenmarkstransplantation zu zerstören.
Anthracycline stellen eine wichtige Gruppe antineoplastische Agenzien, die in der Krebschemotherapie verwendet werden, dar, wobei sich Doxorubicin und Daunorubicin gegen feste Tumore als wirksam erwiesen. Eine Kopplung von Daunorubicin und Doxorubicin an Antikörper führt jedoch zu einem wesentlichen Verlust der Wirksamkeit der Pharmaka, wenn die Kopplung über die Aminogruppe erfolgt. In letzter Zeit hat man Daunorubicin an MoAbs über das Kohlenstoffatom 14 unter Verwendung von Bromdaunorubicin gekoppelt Diese Konjugate zeigten sich in vitro als wirksam. Es wurde jedoch von keinen in vivo-Untersuchungen berichtet (Gallego et al, Int. J. Cancer, 1984 744). Außerdem konnte gezeigt werden, daß Daunorubicin-MoAb-Konjugate eine nicht-spezifische Toxizität bei Konzentrationen > 10 pg/ml besitzen.
Die Anmelderin hat nun gefunden, daß Idarubicin (4-Demethoxy-daunorubicin, Ida) an MoAbs gekoppelt werden kann, und daß die Konjugate eine selektive und potente in vitro- und in vivo-Anti-Tumoraktivität besitzen. In vivo zeigten Ida-MoAb-Konjugate bei Dosen von <8,0 mg/kg keine nicht-spezifische Toxizität. Die Ida-MoAb-Konjugate weisen in vitro und in vivo eine größere Wirksamkeit als Daunorubicin-MoAb-Konjugate auf.
Außerdem wurde die Fähigkeit von Ida-MoAb-Konjugaten untersucht, spezifisch Zellpopulationen zu zerstören, indem Ida an MoAbs gekoppelt wurde, von denen bekannt ist, daß sie mit verschiedenen Subpopulationen von Lymphocyten (L3T4+, Ly-2+ und Thy-1+) reagieren. Wirkonnten feststellen, daß dies eine überraschend wirksame Methode zurVerarmungvonZellen darstellt. So kannz.B.Anti-Ly-2.1-MoAb,das in vivoaufLy-2.1+-Zellenkeinen meßbaren Effekt ausübt, durch Kopplung mit dem cytotoxischen Agens Ida zu einem wirksamen cytotoxischen Agens umgewandelt werden.
Unter Verwendung von MoAbs auf Ly-2 und L3T4-Antigene konnten wir nun zeigen, daß Ida-MoAb target-Zellen in vitro und in vivo eliminieren kann. Es können Ida-MoAb-Konjugate zur Verfügung gestellt werden, die sich bei der Verarmung spezifischer T-Zellen-Untergruppen, die für die Transplantatabstoßung verantwortlich sind, als wirksamer erweisen als Antilymphocyten-Globuline oder Anti-Pan-T-Zellen-Reagenzien, wie OKT3 MoAb. -2-
AT395 375 B
Folglich stellt die vorliegende Erfindung Inununglobulinkonjugate zur Verfügung, welche Ida, konjugiert mit einem monoklonalen Antikörper oder einem Fragment davon, welches mindestens eine der Antigenbindungsstellen des Antikörpers aufweist, umfaßt.
Ida wird in US-A-4,077,988 beschrieben. Vorzugsweise werden zwei bis acht Ida-Moleküle kovalent an jenen 5 Antikörper oder jedes Antikörperfragmentmolekül gebunden, besonders bevorzugtzwei bis sechs. Die Ida-Moleküle werden im allgemeinen, jedoch nicht notwendigerweise, in der 14-Stellung an den monoklonalen Antikörper oder das Antikörperfragment konjugiert. Vorzugsweise sind sie direkt gebunden, obwohl es auch möglich ist, einen inerten Träger oder Linker dazwischenzuschieben. Idakann jedoch stattdessen an den monoklonalen Antikörper oder das Antikörperfragment über die Aminogruppe gebunden werden. Dies wird «reicht durch Verwendung eines 10 abbaubaren Peptidspacers, einen Dextranträg«, einen säureempfindlichen Spacer oder Polyglutaminsäure. Zur Kopplung verwendete Gruppen umfassen die Carbonsäuregruppen von synthetischen Polyaminosäuren wie Poly-4glutaminsäure und Poly-Aasparaginsäuie oder inerte Proteine wie menschliches Serumalbumin oder funktionalisierte Dextrane, wie Carboxymethyldextran, können als Träger wirken. Diese Träger können im Größenbereich von 10 bis 60 Kilodalton liegen. 15 Typischerweise ist jeder Antikörper oder jedes Antikörperfragmentspezifisch für ein Antigen auf derZelloberfläche, welche als Ziel von Ida angepeilt werden soll. So kann z. B. der Antikörper oder das Antikörperfragment spezifisch für ein bestimmtes target-Gewebe, wie z. B. menschliches Neoplasma, sein. Beispiele menschlicher Neoplasmen, die mit Ida angepeilt werden sollen, sind Brustkrebs, Colonkrebs, Lungenkrebs, Prostatakrebs, Eierstockkrebs, Thymuskrebs und andere Krebsarten, Sarkomata und Leukämien. Alternativ kann der Antikörper oder das 20 Antikörperfragment spezifisch für ein tierisches Neoplasma sein. Es kann ein Antikörper oder Antikörperfragment eingesetzt werden, das spezifisch für human-Transferrin-Rezeptor (TFR) ist, der auf sich teilenden Zellen, eiythroiden Prekursorzellen und den Zellen einer Vielzahl von Tumoren, vorliegt. Ein geeigneter anti-TFR-monoklonaler Antikörper ist z. B. ein Antikörper auf Transferrin-Rezeptor auf LiCR-LON-HMy-2 (HMy-2)-Zellen.
Wenn die Immunglobulin-Konjugate eingesetzt werden sollen, um eine spezifische T-Lymphocyten-Population 25 zu verarmen, so ist der Antikörper oder das Antikörperfragment spezifisch für ein Zelloberflächenantigen, welches wiederum spezifisch für diese T-Lymphocyten ist Der Antikörper oder das Antikörperfragment können selbst spezifisch für eine Population von Helfer-, Supressor- oder cytotoxischen T-Lymphocyten sein.
Vorzugsweise stellt der monoklonale Antikörper oder das Antikörperfragment die gleiche Spezies dar, gegen die das Immunglobulinkonjugat verabreicht wird. Ein Human- oder Maus-monoklonal« Antikörper oderein entspre-30 chendes Antikörperfragment werden deshalb typischerweise dann eingesetzt, wenn eine V«abreichung des Konjugats am Menschen beabsichtigt ist Außerdem gehört d« Antikörper oder das Antikörperfragment vorzugsweise der IgG-Klasse an. Das Antikörperfragment kann das Fab, Fab' oder Ffab^-Fragment darstellen. Eingesetzt werden kann auch das IgM-Monomer, das sich durch die abbauende Wirkung proteolytischer Enzyme aus IgM-Antikörper gewinnen läßt 35 Die Immunglobulinkonjugate werden gemäß der Erfindung nach einem Verfahren hergestellt welches die
Konjugation von Ida an den monoklonalen Antikörper oder ein Fragment davon umfaßt Vorzugsweise wird ein 14-Halogen-Ida mit dem monoklonalen Antikörper oder ein«n Fragment davon umgesetzt Der Substituent in 14-Position kann Fluor, Chlor, Brom oder Jod darstellen, vorzugsweise Brom. 14-Brom-Ida wird in US -A4,125,607 beschrieben. Die Konjugation kann somit durch ein Verfahren erzielt werden, das folgende Schritte umfaßt: 40 (a) Vermischen des monoklonalen Antikörpers oder eines Fragmentes davon miteinem molaren Überschuß von 14-Halogen-Ida, (b) Umsetzen des Gemisches bei 18 bis 37 °C, (c) Entfernen jeglichen Niederschlages, 45 (d) Entfernen von nicht-umgesetzten Ausgangsmaterialien durch Gelfiltration, und (e) Entfernen (Gewinnen) des adsorbierten Arzneimittels (Ida) durch Adsorptionschromatographie od« Ionenaustauschchromatographie.
Schritt (a) wird typischerweise in einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, wie N,N-50 Dimethylformamid, durchgeführL Vorzugsweise beträgt der molare Überschuß von 14-Halo-Ida in Schritt (a) das 0- bis 50-fache. In Schritt (b) wird die Reaktion vorzugsweise in einem Zeitraum von 1 bis 8 h durchgeführt. Typischerweise ist die Reaktionstemperatur die Raumtemperatur.
Es können jedoch auch andere Methoden der Konjugation angewendet werden. Wenn ein Konjugat gewünscht wird, das einen in«ten Träger od« Link«, eingeschoben zwischen Ida und dem monoklonalen Antikörper oder dem 55 Antikörperfragment, aufweist, so wird derTrägeroderLinker typischerweise zunächstandasC-14-Kohlenstoffatom von Ida angebracht und wird dann an den Antikörper oder das Antikörperfragment gebunden. Wie vorstehend erwähnt, kann d« Antikörper oder das Antikörperfragment auch an Ida üb« die Aminogruppe gebunden werden, -3- 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
AT 395 375 B wobei man einen abbaubaren Peptidspacer, einen Dextranträger, einen säureempfindlichen Spacer oder Polyglutaminsäure verwendet
Die Immunglobulinkonjugate gemäß der Erfindung können zur humanen oder veterinären Behandlung von Krebs eingesetzt werden. Dazu wird eine therapeutisch wirksame Menge des Konjugats verabreicht. Der Krebs kann einen festen Tumor, einen Ascitestumor oder eine Leukämie darstellen. Die zu behandelnden Neoplasmen sind die vorstehend genannten. Es können zwei oder mehrere Konjugate, in denen der monoklonale Antikörper oder das Antiköiperfragment jeweils eine unterschiedliche Spezifität aufweisen, verabreicht werden.
Das Konjugat kann durch Injektion verabreicht werden. Es kann parenteral, z. B. intravenös, gegeben werden. Es kann lokal oder direkt in den Tumor verabreicht werden. Diean einen Patienten zu verabreichende Konjugatmenge ist von einer Reihe von Faktoren abhängig, wie z. B. dem zu behandelnden Tumor und dem Zustand des Patienten. Typischerweise wird eine Dosis von 10 bis 200 mg Konjugat pro m^ Körperoberfläche des Patienten verabreicht. Die Konjugate können mit anderen chemotherapeutischen Agenzien oder mit Agenzien verabreicht werden, die die Aktivität der Konjugate verstärkt, wie z. B. vasoaktive Agenzien oder Tumor-Necrose-Faktor.
Die Immunglobulinkonjugate können auch dazu verwendet werden, spezifisch eine Untergruppe der T-Lymphocyten aus einer Zellpopulation zuverarmen. Dazu wird eine therapeutisch wirksame Menge eines Konjugats, welches einen monoklonalen Antikörper oder ein Antikörperfragment gegen ein Zelloberflächenantigen, das auf den zu verarmenden Lymphocyten vorliegt, eingebaut enthält, an Menschen oder Tiere verabreicht. Alternativ kann eine Zellpopulation in vitro mit einem solchen Konjugat inkubiert werden.
Es kann eine Kombination vonKonjugaten gegen zwei odermehrere Zelloberflächenantigene verwendet werden. Die zu verarmenden Lymphocyten können Helfer·, Suppressor- oder cytotoxische T-Zellen darstellen.
Die Erfindung ist somit geeignet, die Abstoßung von transplantiertem Gewebe in einem Transplantatempfänger zu verhindern. Die Konjugate können als immunsuppressive Agenzien dienen. Dazu wird eine wirksame Konjugatmenge zur Verhinderung der Transplantatabstoßung an den Transplantatempfänger verabreicht. Vorzugsweise sind es in diesem Fall cytotoxische T-Zellen, die verarmt werden sollen. Krebs beim Menschen oder Tier kann durch Verarmung von Suppressor-T-Zellen mittels Verabreichung eines geeigneten Konjugats behandelt werden. Autoimmunerkrankungen können durch Verabreichung eines Konjugats zum Zwecke der Verarmung von Helfer-T-Zellen behandelt werden. Die Verabreichungsweise und die Dosis des Konjugats sind für jeden Fall die vorstehend genannten.
Die Immunglobulinkonjugate werden mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel zu pharmazeutischen Mitteln formuliert Dazu kann jeder geeignete Träger bzw. Verdünnungsmittel verwendet werden. Geeignete Träger und Verdünnungsmittel umfassen physiologische Kochsalzlösung und Ringer’sche-Dextroselösung.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung «-läutern. In den beiliegenden Zeichnungen betreffen Fig. 1 bis 12 das Beispiel 1 und Fig. 13 bis 17 das Beispiel 2. Insbesondere stellt
Fig. 1 die Struktur von Anthracyclinderivaten dar,
Fig. 2 stellt die Kopplung von Idarubicin (Ida) an anti-Ly-2.1 (0,5 mg) dar Mol Idainkorporiertpro Mol anti-Ly-2.1 () (linke Ordinate) und Proteinanteil (·) (rechte Ordinate) sind als Funktion der Anzahl nMol Ida im Reaktionsgemisch (Abszisse) dargestellt:
Fig. 3 stellt den Antikörpertiter dar, bestimmt als % rosettenbildende Zellen (Ordinate) gegen die Antikörperverdünnung (x 10'1) (Abszisse) von anti-Ly-2.1-Konjugaten auf ITT(1) 75 NS E3 target-Zellen. Serienmäßige Verdünnungen wurden mit einer 0,5 mg/ml-Lösung von entweder anti-Ly-2.1 (▲) oder anti-Ly-2.1 mit 2 (·) oder 8 (o) Mol Ida/Mol Antikörper durchgeführt
Fig. 4 zeigt die inhibierende Wirkung von Ida () oder Ida-anti-Ly-2.1,5 Mol Ida/Mol Antikörper, (·) auf E3-Zellen in einem 24-stündigen Assay, wobei dieprozentualelnhibierung der [^H] Thymidininkorporierung (Ordinate) gegen die Konzentration von Ida(M) (Abszisse) aufgetragen ist;
Fig. 5 gibt die inhibierende Wirkung von Ida (), Ida-anti-Ly-2.1,5 Mol Ida/Mol Antikörper (·) oderlda-anti-TFR, 5 Mol Ida/Mol Antikörper (o) auf (Ly-2+) E3-Zellen in einem 30-minütigen Inhibierungsassay wieder, wobei die prozentuale Inhibierung der [^H] Thymidininkorporierung (Ordinate) gegen die Konzentration von Ida(M) (Abszisse) aufgetragen ist;
Fig. 6 zeigt die inhibierende Wirkung von Ida-anti-Ly-2.1,5 Mol Ida/Mol Antikörper (O) und Konjugat plus anti-Ly-2.1 (·) auf E3-target-Zellen in einem 30-minütigen Spezifitätsassay, wobei die prozentuale Inhibierungder [^H] Thymidininkorporierung (Ordinate) gegen die Konzentration vonIda(M) (Abszisse) aufgetragen ist;
Fig. 7 zeigt das Wachstum von E3-Thymom in CBFj-Mäusen, subkutan injiziert mit2 x 10^ Zellen. Gruppen von 10 Mäusen wurden intravenös behandelt, wie dies durch einen Pfeil angezeigt ist; PBS (O), Ida (), anti-Ly-2.1 (▲), Ida-anti-TFR (O) oder Ida-anti-Ly-2.1 (·). Mittlere Tumorgröße (cm^) (Ordinate) ist -4- 55 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
AT 395 375 B gegen Tagenach der Tumarinoku]ation(Abszisse)aufgetragen.DieeingetragenenFehlerabweichungen stellen den ± mittleren Standardfehler dar, Fig. 8 zeigt einzelne Tumorwachtsumskurven von CBFj-Mäusen, subkutan injiziert mit 2,0 x 10*> E3-Tumorzellen und intravenös an den Tagen 4 und 5 mit Ida-anti-Ly-2.1-Konjugat behandelt Die Tumorgröße (cm^) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen, Fig. 9 zeigt das Wachstum vonE3-Thymom in CBF^-Mäusen, subkutan injiziert mit3,0x 10^ Zellen. Gruppen von 10 Mäusen wurden intravenös behandelt wie dies durch einen Pfeil angegeben ist: PBS (Q); anti-Ly-2.1 (▲), Ida () oder Ida-anti-Ly-2.1-Konjugat (·). Die mittlere Tumorgröße (cnr) (Ordinate) ist gegen dieTage nach der Tumorinakulation (Abszisse) aufgetragen. DieFehlerabweichungen stellen den ± mittleren Standardfehler dar; und Fig. 10 zeigt das Wachstum vonE3-Thymom in CBFj-Mäusen,subkutan injiziert mit3,0x10^ Zellen. AnGmppen von 10 Mäusen wurde eine Intratumorbehandlung durchgeführt wie dies durch einen Pfeil angezeigt ist PBS (□); anti-Ly-2.1 (▲), Ida () oder Ida-anti-Ly-2.1-Konjugat (·). Die mittlere Tumorgröße (cm^) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen. Die Fehlerabweichungen stellen den ± mittleren Standardfehler dar; Fig. 11 zeigt das Wachstum von COLO 205 Human-Tumor-Xenotransplantat in nackten Mäusen, subkutan injiziert mit2x 10^ Zellen. Gruppen von 10 Mäusen erhielten die folgende intravenöse Behandlung, die durch einen Pfeil angezeigt ist PBS (Δ), freies Ida (♦), Ida-250-30.6-Konjugat (·), Gemisch von Ida und 250-30.6 (φ) und250-30.6(▲). Die mittlere Tumorgröße (cm^) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen. Die Fehlerabweichungen stellen den ± mittleren Standardfehler der Tumorgröße dar, Fig. 12 gibt einzelne Tumorwachstumskurven von nackten Mäusen mit Fremdtransplantat wieder, wobei die Mäuse i. v. (Pfeil) mit Ida-250-30.6-Konjugat behandelt wurden. Die gestrichelte Linie gibt die mittlere Tumorgröße in PBS-behandelten Mäusen wieder. Die Tumorgröße (cm^) (Ordinate) ist gegen die Tage nach dar Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen; Fig. 13 zeigt die Kopplung von Idarubidn (Ida) an anti-L3T4 (0,5 mg). Mol Ida, inkorporiert pro Mol anti-L3T4 (♦) (linke Ordinate) und Proteinanteil (·) (rechte Ordinate) werden als Funktion der Anzahl nMol Ida im Reaktionsgemisch (Abszisse) wiedergegeben; Fig. 14 zeigt den Antikörpertiter, gemessen als % Rosetten-bildende Zellen (Ordinate) gegen die Antikörperverdünnung (x 10'*) (Abszisse) von anti-Thy-1 -Konjugaten auf ΓΤΤ(1) 75NS E3 target-Zellen. Es wurden serienmäßige Verdünnungen mit 1.0 mg/ml Lösung von entweder anti-Thy-1 (♦) oder Konjugat mit 1 (O), 4 (·) oder 7 (O) Mol Ida/Mol anti-Thy-l durchgeführt; Fig. 15 zeigt die Wirkung der Ida-MoAb- und MoAb-Behandlung auf die Anzahl von L3T4 und Ly-2 Zellen in der Milz in Ida-anti-L3T4-behandelten (·-·), anti-L3T4-behandelten (a-a), Ida-anti-Ly-2.1-behan-delten (·...·), anti-Ly-2.1-behandelten (A...A) oder unbehandelten (□...□) Mäusen, wobei die % Rosetten-bindenden Zellen (Ordinate) gegen die Zeit in Tagen (Abszisse) aufgetragen sind; Fig. 16 zeigt die Wirkung einer kombinierten Ida-MoAb-Konjugat-Behandlung auf das Überleben eines P388Dl-Tumortransplantats als (across) H-2 und Nicht-H-2-Unterschiede) in CBA-Mäusen. Gruppen von 10 bis 15 Mäusen wurden subkutan 8,0 x 10^ P388D1 Tumorzellen injiziert und erhielten jeweils intravenös (Pfeil): (i) PBS (♦), (ii) anti-L3T4 und anti-Ly-2.1 (O), (iii) Ida-anti-L3T4 (), (iv) Ida-anti-Ly-2.1 (·) und (v) Ida-anti-L3T4 und Ida-anti-Ly-2.1 (a). Die mittlere Tumorgröße (cm^) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen. Die Fehlerabweichungen geben den ± mittleren Standardfehler wieder; und Fig. 17 zeigt die Wirkung von Ida-anti-Thy-l-Konjugat auf das Überleben eines P388Dl-Tumortransplantats in CB A-Mäusen. Gruppen von 10 Mäusen wurden subkutan mit 1,0 x 10^ P388D1 Tumorzellen injiziert und erhielten jeweils intravenös (Pfeil): (i) PBS (□), (ii) anti-Thy-l- (·) und (iii) Ida-anti-Thy (A). Die mittlere Tumorgröße (cm^) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen. Die Fehlerkreuze stellen den ± mittleren Standardfehler dar; Fig. 18 zeigt das Wachstum von COLO 205 (30.6+, 17.1+) Xenotransplantat in nackten Mäusen, injiziert mit 8 x 10^ Zellen/Maus. Gruppen von 10 Mäusen wurden intraperitoneal behandelt, wie durch einen Pfeil angezeigt, mit PBS (O); 17.1-Ida(o);30.6-Ida(A) oder einem Gemisch aus 30.6-Ida und 17.1-Ida(·). Die mittlere Tumorgröße (cm^) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse) auftragen. Die Fehlerkreuze geben den mittleren! Standardfehler wieder. Die Gesamtdosis an Ida betrug 200 pg; Fig. 19 zeigt das Wachstum von LIM 2210 Human-Colon-Tumor-Xenotransplantatin nackten Mäusen, die mit einem Tumorfragment (1-5 mg) implantiert waren. Gruppen von 10 Mäusen wurden intravenös behandelt, wie durch einen Pfeil angezeigt, mit PBS (□); 17.1-Ida (♦); JGT-13-Ida (A); 27.1-Ida (·), -5- 55
AT 395 375 B 30.6-Ida (O). Mittlere Tumorgröße (cm2) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen. Die Fehlerkreuze geben den ± mittleren Standardfehler wieder. Die Gesamtdosis an Ida betrug 80 pg.
PeispM-i
Materialien und Methoden
Tumorzellen
Die in dieser Studie untersuchten Zellinien umfassen (Ly-2+) Mäuse-Thymom ΠΤ(1) 75NS E3 Variante (E3) (Smyth et al, J. National Cancer Inst. 1986 76 503-510), (Ly-2‘, TFR’) Lyphom EL4 (Horowitz et al, Science 1968 160 533-535), TFR+) Human-Zellinie CEM (Foley et al Cancer 1965 18 522-529) and die (250-30.6+) Human-Zellinie COLO 205. Die Zellen wurden in vitro in Dulbecco’s modifiziertem Eagle-Medium (DME) oder RPMI 1640-Medium (Flow Laboratories, Sydney, Australien), ergänzt mit 10 % hitze-inaktiviertem Serum von neugeborenen Kälbern (Flow), 2 mM Glutamin (Commonwealth Serum Laboratories, Sydney, Australien); 100 pg/ml Streptomycin (Glaxo, Melbourne, Australien) und 100 LE7ml Penicillin (Commonwealth Serum Laboratories), gehalten. Da* E3-Tumor wurde in vivo mittels Serienpassage in (C57BL/6 x BALB/c)Fγ-Mäusen (CBFj-Mäuse) gehalten. Zellen aus Ascites-FlQssigkeit wurden zweimal in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS), pH 7,3, gewaschen und zentrifugiert (400 g x 5 min), in PBS resuspendiert und subkutan (s. c.) in die Abdomenwand von Mäusen injiziert; diese entwickelten sich vorder Behandlung zu fühlbaren Tumoren. Die Mäuse wurden einer Reihe von intravenösen (i. v.) oder intranunor (i. ^-Behandlungen unterworfen; die Größe der Tumoren wurde täglich mit einer Schublehre gemessen, wobei entlang den senkrechten Achsen der Tumore gemessen wurde. Die Daten wurden als mittlere Tumorgröße (Produkt von zwei Durchmessern ± Standardfehler) registriert. Mäuse CBA und (C57BL/6xBALB/c) Mäuse (CBFj-Mäuse) und nackte (nu/nu) Mäuse wurden vom Department of Pathology, Universität von Melbourne, zur Verfügung gestellt. Experimentelle Gruppen von 8 bis 10 Musen, alle vom selben Geschlecht und Alter, wurden in jedem Experiment verwendet.
Monoklonale Antikörper
Verwendete MoAbs: (i) anti-Ly-2.1 (IgGl), reaktiv auf Mäuse-Ly-2.1-Spezifivität (Hogarth et al, Immunology 1982 46135-144) und (ii) A3C6 (anti-TFR) (IgGl), reaktiv auf human-Transfeninrezeptor (TFR) (Panaccio et al, Immunology and Cell Biology £5. (1987)461-672); und (iii) ein Antikörper, bezeichnet als 250-30.6, reaktiv auf ein Antigen, welches auf human-Colon-Karzinomzellen vorkommL
Die MoAbs wurden aus Ascites-Flüssigkeit durch Präzipitation mit 40 %igem Ammoniumsulfat isoliert, aufgelöst in PBS und dialysiert gegen den gleichen Puffer. Diese rohen Präparationen wurden entweder an Protein-A-Sepharose (Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey) absorbiert, eingehend mitPBS (pH 7,3) gewaschen und mit 0*2 M Glycin/HCl (pH 2.8) eluiert, oder über eine Affigel-Blau-Säule (Bio-Rad Laboratories Pty. Ltd., Sydney) gegeben. Nach Neutralisierung wurden die MoAbs gegen PBS dialysiert, in Teile aufgeteilt und bei -70 °C gelagert. A3C6 wurde durch Immunisierung von CBA-Mäusen, intraperitoneal in wöchentlichen Intervallen über drei Wochen mit 2x10^ LiCR-LON-HMy-2(HMy-2) Zellen (OKT9+ve), Entfernen der Milz drei Tage nach der letzten Injektion und Verschmelzen mitP3-NSI-AG4-l (NS-l)-Zellen erhalten.
Herstellung und Quantifizierung von Konjugaten
Intakte anti-Ly-2.1, anti-TFR-Mo Ab oder250-30.6 (lmg/ml in Boratpuffer, pH8,0) wurden mit einem molaren Überschuß (1 · 50) 14-Brom-4-demethoxydaunorubicin (Brlda) in (N,N)-Dimethylformamid (DMF) zu 10 mg/ml aufgelöst. Die Reaktion wurde 4 h lang bei Raumtemperatur durchgeführt, dann wurde zentrifugiert (400 g x 5 min), um jeglichen Niederschlag zu entfernen. Freies Br-Ida und andere nicht-umgesetzte Ausgangsmaterialien wurden durch Geinitrierungschromatographie unter Verwendung einer Sephadex G-25-Säule (PD-10; Pharmacia) entfernt; die Konjugate wurden dann über eine Säule von Porapak Q (Millipore) zur Entfernung von jeglichem adsorbiertem Arzneimittel gegeben (Niederwieser et al, J. Chromatog. 1971 54 215-223). Die Menge an Ida, die in den Aizneimittel-MoAb-Konjugaten inkorporiert war, wurde durch Extinktionsspektrophotometrie bei 483 mm ¢493=3,4 x lO^M'^cm*!) und durch Proteinbestimmung (Bradford, Anal. Biochem. 1976 72 248-253), bestimmt.
Antikörperaktivität
Ein Rosettenbildungs-Assay unter Verwendung von Schafanti-Maus-Immunglobulin (SAMG) diente zur Bestimmung der Antikörperaktivität von Ida-MoAb-Konjugaten im Vergleich zu freiem MoAb, das den gleichen Verfahren, wie siebei der Kopplungsmethode angewendet werden, unterzogen worden war (Parish and McKenzie, J. Immunol. Methods 1978 20 173-183). -6-
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Arzneimittelaktivität (a) 24-stiindiges Inhibierungsassay: 100 μΐ Zellen (2-5 x lOfyml) wurden in eine Mikrotiterplatte mit flachem Boden gegeben und 1 h bei 37 °C inkubiert. Freies Idarubicin (Ida) (aufgelöst in PBS) und Ida-MoAb-Konjugate wurden aseptisch filtriert und Verdünnungen wurden in sterilem PBS hergestellt; 50 μΐ freies Ida oder Konjugat 5 wurden zu den Zellen gegeben, wobei für jede Probe zwei Ansätze verwendet wurden; Kontrollansätze erhielten 50 μΐ PBS; die Zellen wurden bei 37 °C, 7 % 0¾. 24 h lang kultiviert (b) 30-minütiges Inhibierungsassay: 200 μΐ Zellen (2-5 x lofyml) wurden in sterilen Eppendorf-Röhrchen gesammelt in sterilem Arzneimittel oder Konjugat resuspendiert und 30 min bei 37 °C vermischt. Die Zellen wurden 10 dann zentrifugiert (400 g x 5 min), in Wachstumsmedium resuspendiert; 100 μΐ aliquote Teile wurden in eine Mikrotiterplatte unter Verwendung von doppelten Ansätzen für jede Probe gegeben und dann 16 bis 24 h inkubiert. Nach der Inkubationsperiode wurden zu beiden Assays 50μ1 Wachstumsmedium, welches 1 pCi [%]-Thymidin enthielt (spezifische Aktivität=5 Ci/mMol; Amersham) zugegeben und die Platten 2 bis 4 h inkubiert. Die Zellen wurden dann geerntet und getrocknet; einzelne Proben wurden getrennt und auf einem beta-Szintillationszähler gezählt. Die 15 Inkorporierung von [^HJ-Thymidin wurde als Prozentsatz der Inhibierung der Inkorporierung von Kontrollproben ausgedrückt. Der Standardfehler für jeden Punkt wurde durch Doppelbestimmungen ermittelt und überstieg für jeden gegebenen experimentellen Punkt nicht 5 %.
Toxizität 20 Gruppen von 10 bis 20 CBA-Mäusen wurde eine einzige i. v.-Injektion verschiedener Dosen Ida oder Ida-anti-
Ly-2.1 verabreicht und das Überleben der Mäuse gegen die Doris des verabreichten Arzneimittels in mg/kg aufgetragen. Die Organe dieser Mäuse wurden entfernt und vor Formalinfixierung ausgewogen und mit Hämatoxilin und Eosin angefarbt 25 Ergebnisse Herstellung und Charakterisierung der Konjugate
Br-Ida (Fig. 1) wurde kovalent an verschiedene MoAbs gekoppelt: MoAbs auf human-TFR, auf ein Antigen, welches auf human-Colonkrebszellen voikommt (Antikörper250-30.6) und auf das Mäuse-Ly-2-Alloantigen. Die Reaktionsbedingungen für die Konjugation variierten im Hinblick auf den molaren Überschuß an Br-Ida, der zu den MoAbs zugegeben wurde, wobei ein Kompromiß zwischen höherer Ida-Inkorporierung und geringerer Protein-30 menge (Proteinanteil) getroffen wurde. Ida-anti-Ly-2.1 (Fig. 2), Ida-anti-TFR und Ida-250-30.6 (Daten nicht gezeigt) haben 3 bis 5 Moleküle Ida bei Proteinanteilen von über 50 % inkorporiert. Die Umsetzung von Br-Ida mit MoAbs könnte zu zwei Bindungstypen führen (Fig. IC und D). Um zu bestimmen, welcher Bindungstyp vorlag, wurden die Konjugate 48 h lang einem pH von 4,5 oder 9,0 ausgesetzt; das freigesetzte Arzneimittel wurde an Porapak Q absorbiert und die Proben wurden erneut durch Spektrophotometrie quantifiziert 50 % des gebundenen 35 Arzneimittels wurde bei Einwirkung der Base (pH 9,0) freigesetzt während sich bei pH 4,5 kein Verlust zeigte. Dies ist ein Hinweis dafür, daß mindestens 50 % des Arzneimittels eine Esterbindung aufweist (Fig. ID), da die Esterbindung gegenüber basischen Bedingungen empfindlich ist, während die Aminbindung stabil ist
Antiköroeraktivität 40 Die Antikörpertiter vor und nach der Konjugation wurden nach der Rosettenbildungsmethode gemessen und wurden bestimmt als die Verdünnung, bei der 50 % der Zielzellen Rosetten zeigten. Ida-anti-Ly-2.1-Konjugate, die 2 und 8 Moleküle Ida enthielten, wiesen Antikörpertiter gegen E3-Zellen von jeweils 1:56.000 und 1:33.000 auf, während der Titer von nicht-konjugiertem Antikörper 1:80.000 betrug (Fig. 3). Ida-250-30.6-Konjugate, die 2 und 6 Moleküle Ida enthielten, zeigten Antikörpertiter gegen COLO 205-Zellen von jeweils 1:16.000 und 1:11.000, 45 während der Titer von nicht-konjugiertem Antikörper 1:33.000 betrug. Somit ergibt sich aufgrund des Konjugationsverfahrens ein Verlust der Antikörperaktivität; Konjugate mit weniger als 6 Molekülen Ida pro MoAb wurden für in vitro und in vivo Untersuchungen eingesetzt Es wurde festgestellt, daß die Löslichkeit und Antikörperaktivität von Ida-anti-Ly-2.1-Konjugaten über diese Niveaus der Ida-Inkorporierung hinaus deutlich abnahm (Daten nicht wiedergegeben). Die maximale Anzahl an Ida-Molekülen, die eingebaut werden kann, variiert 50 in Abhängigkeit von dem jeweiligen Antikörper. in vitro Aktivität von Idarubicin und Idarubicin-MoAb-Koniugaten
Die in vitro Cytotoxizität von Ida und zwei Ida-MoAb-Konjugaten auf Mäuse-ITT(1)75NS E3-Zellinie (Ly-2+11¾-) und die menschliche CEM-Zellinie (Ly-2TFR+) wurde in einem 24-stündigen Inhibierungsassay 55 gemessen und die Werte für I.D50 (50 %ige Inhibierung der [^Hj-Thymidin-Inkorporierung der Kontrollproben) bestimmt Die Ergebnisse sind in Fig. 4 und Tabelle 1 wiedergegeben. I.D50 für Ida lag im Bereich von 1,0 bis 2,5 x 10-7 M für beide der untersuchten Zellinien (Fig. 4, Tabelle 1). I.D50 für Ida-anti-Ly-2.1 auf E3 war viermal -7-
AT 395 375 B größer (Fig. 4); für Ida-anti-TFR auf CEM waren die II>50-Werte 1 - 2 mal größer als die für freies Ida (Tabelle 1). Somit ist freies Ida toxischer sowohl auf E3 als auch auf CEM als jeweils Ida-anti-Ly-2.1 und Ida-anti-TFR, Diese Ida-MoAb-Konjugate zeigen jedoch eine zehnfach niedrigere Cytotoxizität als nicht-reaktive Zellinien (Tabelle 1) und geben damit an, daß ihre cytotoxische Wirkung spezifisch war und sich aus der Beibehaltung der Antikörper-S aktivität ergab (Fig. 3).
IaMM 10 Wirkung von Idarubicin-monoklonalen Antikörper-Konjugaten auf Tumorzellen1
Tumor- mittlere I.D.50-Werte bestimmt für Zellinie Ida Ida-anti-Ly-2.1 Ida-anti-TFR E3 l,2xl0-7 4,3 x IO*7 2,3 x IO'6 (5)2 (3) (2) CEM 2,2x10-7 2,0 x IO'6 3,0x10-7 (5) (2) (3) 25 1 = I.D.50 = 50 %ige Inhibierung der [^Hj-Thymidin-Inkorporierung von Kontrollproben 2 = Anzahl der untersuchten Präparationen 30 35 40 45 50
Die Ida-250-30.6-Konjugate waren etwas weniger aktiv als freies Ida. Freies Ida zeigte einen I.D.5Q-Wert von 6 x 10‘8 M, während das Konjugat ein ID.50 von 3,5 x 10"7 M auf die target-Zellinie COLO 205 ergab. Zur Bestimmung, ob die Konjugate eine Selektivität in ihr» cytotoxischen Wirkung auf target-Zellen ausüben, wurden Ida-anti-Ly-2.1 und Ida-anti-TFR 30 min lang mit E3 (Ly-2+)-Zellen inkubiert und dann das nicht-gebundene Konjugat weggewaschen und die Cytotoxizität bestimmt Das Ida-anti-Ly-2.1-Konjugat hatte ein I.D.5Q von 6.2 x 10*' M im Vergleich zu einem I.D.5Q von 5,2 x 10*7 M für freies Ida (Fig. 5). Im Gegensatz dazu zeigte das nichtreaktive Ida-anti-TFR-Konjugat ein LD.50 von 5,0 x 10*6 M, i. e. zehnmal grüß» als das für freies Ida, wobei gezeigt wird, daß die Antikörper-bindende Aktivität von Ida-anti-Ly-2.1-Konjugat in einer selektiven Cytotoxizität resultiert. In gleicher Weise wurden Ida-250-30.6-Konjugat und freies Arzneimittel 30 min mit COLO 205 (250-30 +ve) und E3 (250-30.6 -ve)-Zellinien inkubiert und dann gewaschen, sowie anschließend ein Cytotoxizitätsassay durchgeführt. Beide Zellinien zeigten eine ähnliche Dosisresponse auf freies Arzneimittel, i. e. 9.2 x 10-7 M für COLO 205 und 9,8 x 10"7 M für E3. Das Ida-250-30.6-Konjugat war viermal toxischer auf COLO 205als die Antikörper-nicht-reaktiveE3-Zellinie. ÄhnlicheErgebnise wurden unter Verwendung der CEM-Zellinie und Ida-anti-Ly-2.1 als eine nicht-reaktive Kontrolle erhalten (Daten nicht gezeigt). Um im weiteren sicherzustellen, daß die Cytotoxizität von Ida-MoAb-Konjugaten auf target-Zellen spezifisch war und an der Antikörper-Bindungsstelle erfolgte, haben wir Untersuchungen zur Inhibierung der Koniugat-Cytotoxizität unter Verwendung von freiem MoAb durchgeführt Bei einer Ida-Konzentration von 4,0 x 10*° M (2 pg anti-Ly-2.1) war die Cytotoxizität von anti-Ly-2.1-Konjugat auf E3-Zellen durch Zugabe von 50 pg (250 pg/ml) anti-Ly-2.1 um 70 % reduziert (Fig. 6), was daraufhinweist, daß die Cytotoxizität des Ida-anti-Ly-2.1 -Konjugats in direktem Zusammenhang zu dessen Antikörper-Bindungsfähigkeit steht Ähnliche Kontrollergebnisse wurden mit 250-30.6 erhalten. Es ist darauf hinzuweisen, daß in sämtlichen Assays freies anti-Ly-2.1, anti-TFR und 250-30.6 nicht-cytotoxisch waren (Daten nicht gezeigt). in vitro Behandlung von Mäusethvmom nT(lV75NS E3 Zur Ermittlung der Wachstumsinhibierung von festen Tumoren wurden Gruppen von CBFj-Mäusen (10 pro Gruppe), die mit 2,0 x 10^ E3-Zellen im Abdominalbereich inokuliert waren, mit einer der folgenden i. v. Injektionen behandelt: (i) PBS; (ii) anti-Ly-2.1; (iii) Ida; (iv) Idaanti-TFR; oder (v) Ida-anti-Ly-2.1. Die Mäuse erhielten jeweils 20jlgldaund/oder 1.200pg anti-Ly-2.1 an denTagen4 und 5 (Tumorgröße=0,1 cm^) nach der Tumorinokulation. Innerhalb 24 h der ersten Behandlung wiesen die mit Ida-anti-Ly-2.1 behandelten Mäuse eine mittlere -8- 55
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Tumoigröße von 20 % deijenigen Mäuse auf, die mit PBS behandelt wurden (L e. eine 80 %ige Abnahme der Tumormasse (Fig 7)); es war offensichtlich, daß anti-Ly-2.1 allein und Ida, welches kovalent an nicht-spezifischen anti-TFR-MoAb gebunden war, nicht das E3-Tumorwachstum beeinflußte. Die Tumoren von Mäusen, die nur Ida erhielten, waren bis zu SO % reduziert; drei von diesen Mäusen starben jedoch und die anderen zeigten eine 25 %ige S Verringerung des Körpergewichts. Die einzelnen Tumorwachstumskurven von Mäusen, die Ida-anti-Ly-2.1 erhiel ten, zeigten eine Regression bei 9 aus 10 Tumoren im Laufe der Behandlung (Fig. 8); in der Tat gingen S von 10 Tumoren vollständig zurück und traten auch nicht wieder auf (> 200Tage); die Tumoren, die nach Abschluß der Behandlung weiterwuchsen (5 von 10), wuchsen mit langsameren Geschwindigkeiten als die Tumoren der mitPBS und Ida-anti-TFR behandelten Mäuse. Es wurde ein weiteres Experiment durchgeführt, um die i. v. Behandlung von 10 größeren Tumoren mit Hilfe von Ida-anti-Ly-2.1 zu beurteilen. Gruppen von CBFj-Mäusen (10 pro Gruppe) wurden mit 3,0 x 10^ E3-Zellen inokuliert; die Mäuse erhielten dann jeweils 15 pg und 900 pg Ida und anti-Ly-2.1 an den Tagen 6 (Tumorgröße=0,2 cm^) und 7 nach Tumorinokulation (Fig. 9). Die mit Ida-anti-Ly-2.1 behandelten Mäuse hatten eine mittlere Tumorgröße von 50 % derjenigen der mit PBS behandelten Mäuse und 66 % derjenigen mit Ida behandelten Mäuse am Tag 7; dieser Trend setzte sich bis zum Abschluß der Studie fort (Tag 18). Die einzelnen 15 Tumorwachstumskurven der 10 CBFj-Mäuse, die Ida-anti-Ly-2.1 erhielten, zeigten, daß vier Regressionen und eine vollständige Entfernung der Tumormasse (> 200 Tage; Daten nicht gezeigt) vorlag. Somit war Ida-anti-Ly-2.1 wirksam gegen große Tumoren, in beiden Experimenten war die von Ida merklich verbessert, wenn dieses an anti-Ly-2.1-MoAb gekoppelt war. 20 in vivo Behandlung von menschlichem Colontumor COLO 205
Die Wirkung von Ida-anti-250-30.6-Konjugat wurde in nackten (nu/nu) Mäusen mit Xenotransplantaten, untersucht
Die subkutane Injektion von 2 x 10^ Zellen in die Abdominalwand ergab innerhalb von 4 Tagen einen fühlbaren Klumpen (ca. 0,1 cm^). Gruppen von 10 Mäusen wurden dann mit einer der folgenden i. v. Injektionen behandelt: 25 (i) PBS; (ii) 250-30.6; (iii) Ida plus 250-30.6 (nichtkonjugiert); (iv) Ida; (v) Ida-250-30.6-Konjugat Insgesamt wurden 275 pg Ida in einer Reihe von 5 intravenösen Injektionen an den Tagen 4, 5, 6, 10 und 12 nach Tumorinokulation gegeben.
In den Gruppen von Mäusen, die mit PBS oder mit nichtkonjugierten 250-30.6 behandelt worden waren, zeigte sich kein therapeutischer Effekt. Mit Ida allein überlebten 2 von 10 Mäusen, während sämtliche Mäuse der Gruppe, 30 die nicht-konjugiertes Ida plus 250-30.6 erhielten, am siebten Tage tot waren, wobei sie vorher Toxizitätssymptome zeigten, wie z. B. Gewichtsverlust. Die Mäuse, die Ida-250-30.6-Konjugat erhielten, zeigten eine dramatische Reaktion der Tumorgröße. Diese Ergebnisse sind in Hg. 11 wiedergegeben. Tumorwachstumskurven für die einzelnen Mäuse (Fig. 12) zeigten, daß 5 von 7 Mäusen Tumoren aufwiesen, die am siebten Tag zurückgegangen waren; diese Tumoren wuchsen weiter fort, wobei 2 von 10 Mäusen ohne Tumoren verblieben. Diese Mäuse zeigten 35 keine Toxizitätseffekte.
Intratumor-Behandlung
Die Intratumor-Therapie hat sich als eine nützlicheMethode der Immun therapie von tierischen und menschlichen Tumoren erwiesen. Im folgenden wurden Untersuchungen durchgeführt, um die anti-Tumoraktivität von Ida-anti-40 Ly-2.1-Konjugaten, wenn diese direkt in den festen E3-Tumor verabreicht wurden, zu charakterisieren. Gruppen von 10 CBF}-Mäusen, denen s. c. 3,0 x 10*> E3-Zellen implantiert worden waren, entwickelten 5 Tage nach der Tumorinokulation Tumoren (0,1 bis 0,2 cm'2). Die Behandlungen bestanden aus 2 Injektionen an den Tagen 5 und 6 nach der Tumorimplantation, wobei die Mäuse eine der folgenden Behandlungen erhielten; (1) PBS; (2) Ida; (3) anti-Ly-2.1; oder (4) Ida-anti-Ly-2.1 (Gesamt-Ida=30 pg). Ida-anti-Ly-2.1 zeigte die größte anti-Tumoraktivität; 45 freies Ida und anti-Ly-2.1 allein beeinflußten das Tumorwachstum nicht, wenn sie direkt in den Tumor verabreicht wurden. Die mit Ida-anti-Ly-2.1 behandelten Mäuse wiesen eine mittlere Tumorgröße von 60 % derjenigen der mit PBS behandelten Mäuse am Tag 8 auf, und 30 % deijenigen der mit PBS behandelten Mäuse am Tag 13 (Fig. 10). Die einzelnen Tumorwachstumskurven (Daten nichtgezeigt) von Ida-anti-Ly-2.1 -behandelten Mäusen ergaben eine vollständige Regression, während sich bei den restlichen Mäusen eine verzögerte Reduktion des Tumorwachstums 50 3 Tage nach Abschluß der Behandlung zeigte.
Matat
In den Experimenten zur akuten Toxizität wurde Gruppen von 10 CBA (Ly2.1+)-Mäusen eine einzige Injektion verschiedener Dosen von entweder Ida, Ida-anti-Ly-2.1 oder Ida-anti-TFR verabreicht Alle Mäuse, die mit Ida 55 injiziert wurden, zeigten anfangs einen Gewichtsverlust von bis zu 25 % des ursprünglichen Gewichtes; bei den mit
Ida-MoAb-Konjugat behandelten Mäusen wurde kein Gewichtsverlust beobachtet Tabelle 2 gibt die Toxizität von Ida und Ida-MoAb-Konjugaten als LD5Q- und LD jQ-Werte wieder. Wie gezeigt, beträgt LDjg von Ida-anti-Ly-2.1 -9-
AT 395 375 B 10,0 mg/kg, bezogen auf Ida, im Vergleich zu nur 0,75 mg/kg für freies Ida. Außerdem zeigte das Ida-anti-TFR-Konjugat ein LDjq von 8,0 mg/kg. Ida-MoAb-Konjugate wurden nicht im Hinblick auf die LD5Q-Dosis getestet. DieseErgebnisse zeigen den größeren therapeutischen Index von Ida-MoAb-Konjugaten im Vergleich zu freiem Ida.
Tabelle 2
Wirkung von Idarubicin-monoklonale Antikörper-Konjugate auf CBA-Mäuse
Ida (mg/kg) L.D.10 L.D.; Ida 0,75 3,00 Ida-ant-Ly-2.1 10,00 n.b. Ida-anti-TFR 15,00 n.b. n. b. - nicht bestimmt
Histopathologische Ergebnisse
Akute Wirkung: Die intravenöse Verabreichung von freiem Ida (1,0 mg/kg) führte zu einer Atrophie der weißen Pulpa der Milz 15 Tage nach Behandlung und einer gewissen Hypertrophie der Herzmuskelfasem (Daten nicht angegeben). Im Gegensatz dazu ergab eine einzelne Dosis von Ida-anti-Ly-2.1 (2,4 mg/kg) keine nicht-spezifische Gewebetoxizität nach 15 und 30 Tagen, obwohl eine geringe Schwellung der Hepatocyten am Tag 15 beobachtet wurde.
Beispiel 2
Materialien und Methoden Mäuse (DBA/2 x BALB/c)Fi und CBA-Mäuse wurden vom Department Pathology, University of Melbourne, zur Verfügung gestellt Experimentelle Gruppen von 10 bis 20 Mäusen, von gleichem Geschlecht und Alter, wurden in jedem Experiment verwendet.
Tumorzellen
Die in dieser Studie untersuchten Zellinien umfaßten die (Ly-2+) Mäusethymom ITT(1)75NS E3-Variante (E3), (L3T4+) Lymphom EL4 (Horowitz et al, Science 1968 160 533-535), menschliches Colon-Karzinom Colo 205 (Semple et al, Cancer Res. 1978 381345-1355) und (Ly-2', L3T4') menschliche T-Zellenleukämie CEM (Foley et al, Cancer 1965 18 522-529). In vitro wurden die Zellen gehalten, wie dies in Beispiel 1 beschrieben wird. Die P388D1 Makrophagen-Zellinie wurde in vivo durch serienmäßige Passage in (DBA/2 x BALB/c)Fj-Mäusen erhalten. Zellen aus der Ascitesflüssigkeit wurden zweimal in phosphatgepufferter biologischer Kochsalzlösung (PBS, pH 73) gewaschen und zentrifugiert (400 g x 5 min), in PBS resuspendiert und s. c. in die Abdominalwand von Mäusen injiziert, wo diese fühlbare Tumortransplantate entwickelten. Die Mäuse wurden dann einer Reihe von i. v. Behandlungen unterworfen, und die Größe der Tumoren wurde täglich mit einer Schublehre gemessen, wobei entlang der senkrechten Achse der Tumoren ausgemessen wurde. Die Daten wurden als mittlere Tumorgröße (Produkt von zwei Durchmessern ± Standardfehler) registriert
Monoklonale Antiköroer
Monoklonale Antikörper auf Mäuse-Zelloberflächenantigene L3T4, Ly-2 und Thy-1, die bestimmte Subpopulationen von Lymphocyten charakterisieren, wurden als Modellsystem verwendet.
Es wurden folgende monoklonale Antikörper (MoAbs) verwendet: (i) anti-Ly-2.1 (Mäuse-IgG2a), reaktiv mit Mäuse-Ly-2.1-Spezifität(Horgarthetal,Immunology 198246135-144), (ii) H129.19 (anti-L3T4) (Ratten-IgG2b) reaktiv mit Mäuse-L3T4-Spezifität (Pierres et al, J. Immunology 1984 132 2775-2782) und (iii) anti-Thy-1 (Ratten IgG2b) reaktiv mit Mäuse-T-Zellen (Marshak-Rothstein et al, J. Immunology 1979122 2491-2497). Die Antikörper -10-
AT 395 375 B wurden isoliert, gereinigt und wie im Beispiel 1 beschrieb«! gelagert. Die Antikörperaktivität wurde durch ein Rosettenbildungsassay mit Schaf-anti-Mäuse-Immunoglobulin (SAMG), wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist, bestimmt 5 Herstellung von Idarubicin-monoklonale Antikörper-Konjugate
MoAb (1-2 mg/ml) wurde mit einem 5 bis 20 molaren Überschuß von 14-Brom-4-demethoxydaunorubicin (Br-Ida), aufgelöst in (N,N>Dimethylfbrmamid (10 mg/ml), 4 h lang bei pH 8,0 (0,05 M Boratpuffer) und Raumtemperatur vermischt Dabei erfolgte die Umsetzung, es wurde eine Reinigung durchgeführt, und die Menge an Ida, die in dem erhaltenen Konjugat eingebaut war, wurde, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist, bestimmt 10
Arzneimittelaktivität
Es wurden zwei Assays (24 h und 30 min) durchgefiihrt um die Arzneimittelaktivität zu bestimmen (die Bestimmung erfolgte wie im Beispiel 1 beschrieben), wobei Zellen in einer Konzentration von 1 bis 5 x lofyml eingesetzt wurden. 15
Serologie
Bei sämtlichen Experimenten wurde eine Rosettenbildungs-Methode angewendet um den Antikörpertiter und die Anzahl an 1,374+ und Ly-2+-Zellen zu bestimmen. Diese Methode involvierte die Bindung von SAMG, mit dem auch Ratten-Immunglobulin (lg) nachgewiesen werden kann, gekoppelt an rote Blutzellen von Schaf (SRC), zum 20 Nachweis von Antikörpern auf der Oberfläche lymphoider Zellen. Bei lg* -Milzzellen war das Oberflächen-Ig durch
Maskieren (capping) mit SAMG entfernt (75 |d und 2 ml Zellen bei Kr/μΙ); Zellen wurden dann auf Eis in einem Medium gehalten, das 0,01 % Natriumazid enthielt, um die Resynthese von Immunglobulin zu verhindern.
Ergebnisse 25 Die Untersuchung wurde in separaten Phasen durchgeführt: (a) in vitro Charakterisierung von drei verschiedenen Ida-MoAb-Konjugaten, und (b) Nachweis ihrer Nützlichkeit bei der aktiven Verarmung von T-Zellen-Untergruppen vor oder nach dem 30 Abstoßen eines Tumorzellen-Allotransplantats.
Herstellung und Charakterisierung von Konjugaten
Br-Ida wurde kovalent an monoklonale Antikörper auf Mäuse-L3T4, Ly-2 und Thy-l-Antigene gekoppelt Die Reaktionsbedingungen für die Konjugate variierten im Hinblick auf molaren Überschuß von Br-Ida, der zu dem 35 monoklonalen Antikörper (MoAb) zugegeben wurde; dabei wurde ein Kompromiß zwischen einer höheren Ida-Inkorporierung und einem niedrigeren Proteinanteil getroffen. Ida-anti-L3T4 (Fig. 13), Ida-anti-Ly-2.1 und Ida-anti-Thy-1 (Daten nicht gezeigt) inkorporierten 3 bis 6 Moleküle Ida, wobei der Proteinanteil über 50 % lag.
Antiköroeraktivität 40 Die Antikörpertiter vor und nach der Konjugation wurden mit Hilfe der Rosettenbildungsmethode gemessen und wurden bestimmt als die Verdünnung, bei der 50 % der target-Zellen Rosetten zeigten: Ida-anti-Thy-l-Konjugate, die 1,4 und 7 Moleküle Ida enthielten, zeigten Antikörpertiter von jeweils 1:425.000,1:170.000 und 1:130.000, während der nicht-modifizierte Antikörpertiter 1:550.000 betrug (Fig. 14). Somit führte die Konjugation an Ida zu einem gewissen Verlust der Antikörperaktivität; es wurden jedoch Konjugate mit weniger als 4 Molekülen Ida pro 45 MoAb für die in vitro und in vivo Untersuchungen eingesetzt. Die Antikörperaktivität für sowohl Ida-anti-Ly-2.1 und
Ida-anti-L3T4-Konjugate (Daten nicht gezeigt) nahm in gleicher Weise mit der Inkorporierung von mehr als 6 Molekülen Ida pro MoAb signifikant ab. in vitro-Arzneimittelaktivität 50 Die Cytotoxizität von Ida-MoAb-Konjugaten wurde an verschieden reaktiven target-Zellen getestet, wobei ein 24-stündiges Assay angewendet wurde und ein Vergleich mit freiem Ida «folgte. Die Aktivität von freiem Ida war 4 bis 10 mal größer als die von Ida-MoAb-Konjugaten, bei einem I.D.5Q (50 %ige Inhibierung der [^Hj-Thymidininkorporierung von Kontrollproben) für freies Idabeiö,6 bis9,0xl0"^Mgegen die getestetenTumorzellinien. Es war klar, daß Ida-anti-Ly-2.1-Konjugat das cytotoxischste Konjugat darstellte (I.D.50=4,3 xlO'^M) bei einem 55 Test gegen ITT(1)75NS E3-Zellinie, die eine im Hinblick auf Ly-2-Antigen angereicherte Variante der nativen Zellinie darstellt. Um die Selektivität der Konjugatwirkung auf target-Zellen zu bestimmen, wurden Ida-MoAb-Konjugate 3 min lang mit den target-Zellen inkubiert, bevor das nicht-gebundene Konjugat ausgewaschen und die -11-
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Cytotoxizität bestimmt wurde. Bei Anwendung dieses 30-minütigen Assays zeigten die nicht-reaktiven Ida-MoAb-Konjugate ein I.D.50, das 10 bis 50 ml größer war als das von freiem Ida, was wiederum zeigt, daß die Antikörperbindung für die Ida-MoAb-Konjugat-Cytotoxizität essentiell ist Es ist darauf hinzuweisen, daß keiner der bei dieser Untersuchung verwendeten MoAb auf target-Zellen in vitro in Abwesenheit von Komplement eine cytotoxische Wirkung zeigte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.
Msllfi1
Wirkung von Idarubicin-monoklonalen Antikörper-Konjugaten Mittleres ID50 aufTumorzellen1
Tumor zelllinie Assay Mittlere I.D.5Q-Werte (Ida(M)) bestimmt für Ida Ida-anti- Ida-anti- Ida-anti-Ly-2.1 L3T4 Thy-1 E3 24h 7,8 x IO'8 43 x IO’7 n. b. 9,0 x 10*7 30 min ^ 1,8 x IO-7 4,3 x IO’7 n. b. 13 x IO*6 EL4 24 h 6,6 xlO’8 n. b. 6,0 x 10*7 n.b. 30 min 1,6 xlO*7 n. b. 63 x IO*7 n.b. CEM 24 h 9,0 x 10"8 n.b. n.b. n.b. 30 min 2,2 x IO*7 ό,ΟχΙΟ*6 n. b. n. b. Colo 205 24h 8,0 x IO'8 n.b. n.b. n.b. 30 min 13 x io-7 n.b. 4,0 x1ο*6 5,8 x IO*6 1 I.D.50 = 50 %ige Inhibierung der [^H] -Thymidininkorporierung von Kontrollproben ^ Verwendung eines 24-stündigen Cytotoxizitätsassays 3 Verwendung eines 30-minütigen Assays n. b. = nicht bestimmt in vivo-Wirksamkeit von Idarubicin-monoklonalen Antikömer-Koniugaten
Die in vivo-immunsuppressive Wirksamkeit von Ida-MoAb-Konjugaten wurde mit der von MoAb allein verglichen, wobei die Fähigkeit der Konjugate getestet wurde, selektiv L3T4+ oder Ly-2+-Zellen in der Milz zu eliminieren. CBA-Mause erhielten 4 i. v. Injektionen von anti-Ly-2.1- oder anti-L3T4-Konjugat (30 pg Ida/1,5 mg MoAb) an den Tagen 0, 2, 5 und 10; die Zahl der Ly-2+ oder L3T4+-Zellen in der Milz wurde mit Hilfe des Rosettenbildungsassays verfolgt. Für jede Behandlung wurden täglich die Milzzellen von zwei behandelten Mäusen untersucht und die Ergebnisse gemittelt (Fig. 15). Es wurde eine deutliche Abnahme der Zahl derL3T4+-Zellen von ca. 30 % der gesamten Milzzellen in normalen Mäusen am Tag 0 auf ca. 4 % bei Ida-anti-L3T4-behandelten Mäusen am Tag 20 beobachteL Diese L3T4+-Zellen verblieben mehr als 60 Tage lang in diesem verarmten Zustand, bevor eine allmähliche Zunahme festgestellt wurde. Die Verarmung nach in vivo-Behandlung mit anti-L3T4 allein führte ebenfalls zu einer steilen Abnahme der Anzahl an L3T4+-Zellen (30 % auf 5 %).
Ida-anti-Ly-2.1-Konjugat führte zu einer Abnahme der Milz-Ly-2+-Zellen von 25 % auf 5 % bis zum Tag 10; die Anzahl derLy-2+-Zellenerholtesichjedochbiszum Tag 15und war dann biszum Tag 40 bis 50auf dem normalen Niveau. Es ist interessant, daß anti-Ly-2.1 -MoAb allein nicht in der Lage ist, Ly-2+-Zellen signifikant zu verarmen; Schwankungen in der Zahl der Ly-2+ und L3T4+-Zellen in nicht behandelten Kontrollmäusen wurden auf die natürliche Schwankung zwischen Mäusen zurückgeführt. Es war somit klar, daß sowohl Ida-anti-L3T4 und Ida-anti-Ly-2.1 zu einer wesentlich wirksameren Verarmung an jeweils L3T4+ oder Ly-2+-Zellen der Milz von behandelten Mäusen führte als MoAb allein. Die Wirkung des Ida-anti-Ly-2.1-Konjugats ist von Bedeutung, da anti-Ly-2.1- -12-
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MoAb ohne jegliche Wirkung ist, wenn es allein verwendet wird; es kann jedoch zu einem wirksamen immunsuppressiven Agens umgewandelt werden, wenn es an Ida gekoppelt wird. Die durch Arzneimittel-MoAb-Konjugate herbeigeführte Verarmung war daher geeignet für eine in vivo-Untersuchung der Rolle von Ly-2 und L3T4+-Zellen im Hinblick auf die Wirkung der Transplantatabstoßung. 5
Wirkung von Ida-anti-L3T4. Ida-anti-Lv-2.1 und Ida-anti-Thv-1 auf das Überleben von Tumortransplantat
Bei diesen Experimenten wurden Ida-anti-L3T4, Ida-anti-Ly-2.1 und Ida-anti-Thy-l-Konjugate verwendet, um die Überlebenszeit von P388Dl-Tumortransplantaten in CBA-Mäusen zu erhöhen, wobei die Allotransplantate den H-2 (Klasse I und II) und Nicht-H-2-Barrieren entgegengerichtet waren (being across). 10 fal Kombinierte Koniugat-Behandlung
Gruppen von 10 bis IS CBA-Mäusen wurde s. c. mit 8,0 x 10° P388Dl-Tumorzellen injiziert und erhielten i. v. an den Tagen-1,0 (= Tag der Tumorinokulation), 3, S und 10 eine der folgenden: (i) PBS, (ii) anti-L3T4 und anti-Ly-2.1,(iii)Ida-anti-L3T4,(iv)Ida-anti-Ly-2.1und(v)Ida-anti-L3T4undIda-anti-Ly-2.1.DieerhalteneGesamtmenge 15 an Ida und MoAb betrug jeweils 125 pg und S7S mg. Die Tumortransplantate von sowohl PBS- und MoAb-behandelten Mäusen überlebten 14 bis 17 Tage mit einer maximalen mittleren Tumorgröße von 0,31 cm2, was zeigt, daß beide nicht-konjugierten MoAb zusammen unfähig waren, L3T4+ und Ly-2+-Zellen wirksam zu verarmen, so daß das Tumortransplantat überleben konnte (Fig. 16). Außerdem konnten Ida-anti-Ly-2.1 oder Ida-anti-L3T4 allein das Überleben des Transplantats nur verlängern (Tag 20 bis 28) mit maximalen mittleren Tumorgrößen von 0,40 cm2 20 bis 0,50 cm2. Es ist wahrscheinlich, daß Ida-anti-Ly-2.1 oder Ida-anti-L3T4 allein nicht alle T-Zellen entfernten und aufgrund einer starken antigenen Wirkung (wie sich dies bei MHC-Unterschieden ergibt) die verbleibenden Ly-2+ und L3T4+-Zellen zum Wachstum stimuliert wurden und eine Abstoßung auslösten. Demgegenüber bewirkte eine Kombination von sowohl Ida-anti-Ly-2.1 und Ida-anti-L3T4-Konjugaten bei 14/15 P388D1 Tumortransplantaten eine Verhinderung der Abstoßung und eine Zunahme der Größe, bis die Mäuse getötet wurden (Tag 50 - 2,00cm2). 25 Es wurde festgestellt, daß einige dieser Konjugat-behandelten P388Dl-Tumoren in den Tagen 8 bis 16 eine gewisse
Größenregression zeigten; aufgrund einer kontinuierlichen Verarmung der L3T4+ und Ly-2+-Zellen (Tag 10) kam es zu einem konsistenten Tumorwachstum der P388Dl-Tumortransplantate. (b) Ida-anti-Thv-l-Koniugat 30 Gruppen von 10 CBA-Mäusen wude s. c. mit 10' P388Dl-Tumorzellen injiziert und erhielten an den Tagen -1, 0. 5 und 6 eine der folgenden i. v.-Behandlungen: (i) PBS, (ii) anti-Thy-1 und (iii) Ida-anti-Thy-1. Die Gesamtmenge an Ida und anti-Thy-1 betrug jeweils 130 pg und 5,4 mg; die Tumortransplantate von PBS-behandelten Mäusen überlebten 15 Tage. anti-Thy-1 -MoAb allein führte zu einem 28- bis 32-tägigem Überleben des Tumortransplantats bei einer maximalen mittleren Tumorgröße von 0,58cm2 (Tag 6) (Füg. 17). Bei den Ida-anü-Thy-l-behandelten 35 Mäusen wurden 30 % der Tumortransplantate bis zum Tag 40 vollständig abgestoßen, während die restlichen 70 % weiterwuchsen, wodurch schließlich (Tag 32) die mittlere Tumorgröße der Gruppe zunahm. Somit führten Ida-anti-Thy-1, sowie die Kombination von Ida-anti-Ly-2.1 und Ida-anü-L3T4 zu einer Verarmung an Ly-2 undL3T4-Zellen, so daß die Mehrheit der P388Dl-Tumortransplantate in CBA-Mäusen in Abwesenheit einer normal schnellen Abstoßungswirkung überlebten. 40
Beispiel 3
Es wurden Konjugate nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt, und zwar aus Ida und monoklonalem Antikörper 17.1 (Thompson et al, Proc. Natl. Cancer Inst. 2Ü (1983) 409-419, Mäuse Igg 2a) und; aus Ida und monoklonalem Antikörper 30.6. (Thompson et al, Br. J. Cancer 42 (1983) 595-605, Mäuse Igg 2b). 45 Menschliche Colonkarzinom Colo 205-Zellen (30.6+, 17,1+) wurden s. c. in nackte Mäuse mit 8xl0°Zellen/
Maus inokuliert, wie dies im Beispiel 2 beschrieben ist Die inokulierten Mäuse wurden dann einer Reihe von 1. p.-Behandlungen unterzogen. Die Größe der Tumoren wurde mit ein» Schublehre gemessen, wobei entlang der senkrechten Achsen der Tumoren ausgemessen wurde. Die Daten wurden als mittlere Tumorgröße registriert (Produkt von zwei Durchmessern + Standardfehler). Die Ergebnisse sind in Fig. 18 wiedergegeben. 50
Beispiel 4
Es wurden Konjugate nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt, und zwar aus Ida und monoklonalem Antikörper 17.1, aus Ida und monoklonalem Antikörper JGT-13 (Mäuse Igg 1, welches mit carzinomembryonischem Antigen am Coloncarcinom reagiert, jedoch nicht mit normalen Geweben) aus Ida und 55 monoklonalem Antikörper 27.1 (Mäuse Igg 1, welches mit menschlichem Milchfettkügelchen-Antigen an einer Anzahl von Colontumoren reagiert und aus Ida und monoklonalem Antikörper 30.6. Ein LIM2210 menschliches Colontumor-Xenotransplantat (1-5 mg) wurde s. c. in nackte Mäuse implantiert. Die implantierten Mäuse wurden -13-
Claims (10)
- 5 AT 395 375 B dann einer Reihe von i. v.-Behandlungen unterzogen. Die Größe der Tumoren wurde mit einer Schublehre gemessen, wobei entlang den senkrechten Achsen der Tumoren ausgemessen wurde. DieDaten wurden als mittlereTumorgröße registriert (Produkt von zwei Durchmessern ± Standardfehler). Die Ergebnisse sind in Fig. 19 wiedergegeben. PATENTANSPRÜCHE 10 1. Immunglobulinkonjugat, gekennzeichnet durch Idarubicin (Ida), welches mit einem monoklonalen Antikörper oder einem Fragment davon, welches mindestens eine der Antigenbindungsstellen des Antikörpers umfaßt, 15 konjugiert ist
- 2. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper oder das Fragment davon spezifisch für ein bestimmtes target-Gewebe (Zielgewebe) ist.
- 3. Konjugat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das target-Gewebe menschliches Neoplasma darstellt.
- 4. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper oder das Fragment davon spezifisch für ein T-Lymphocyten-Zelloberflächen-Antigen ist.
- 5. Konjugat nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß 2 bis 8 Ida- Moleküle kovalent an jedes Antikörpermolekül gebunden sind.
- 6. Konjugat nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Ida mit dem monoklonalen Antikörper oder dem Antikörperfragment in C-14-Stellung von Ida konjugiert ist 30
- 7. Verfahren zur Herstellung eines Immunglobulinkonjugates nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Ida mit dem monoklonalen Antikörper oder einem Fragment davon zu einem Konjugat verbindet.
- 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß 14-Halogen-Ida mit dem monoklonalen Antikörper oder einem Fragment davon umgesetzt wird.
- 9. Pharmazeutisches Mittel, gekennzeichnet durch einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein entsprechendes Verdünnungsmittel und, als Wirkstoff, ein Immunglobulinkonjugat nach einem oder mehreren der 40 Ansprüche 1 bis 6 oder wie es im Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8 hergestellt wird.
- 10. Verfahren zur spezifischen Verarmung einer Untergruppe von T-Lymphocyten einer Zellpopulation, gekennzeichnet durch Inkubieren der Zellen in vitro mit einem Immunglobulinkonjugat nach Anspruch 1, wobei der monoklonale Antikörper oder das Fragment davon spezifisch für ein Zelloberflächenantigen ist, welches auf den zu 45 verarmenden Lymphocyten vorliegt. 50 Hiezu 10 Blatt Zeichnungen -14- 55
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