DE3808166C2

DE3808166C2 - Immunglobulinkonjugate, Verfahren zu deren Herstellung sowie pharmazeutische Mittel, die diese enthalten

Info

Publication number: DE3808166C2
Application number: DE3808166A
Authority: DE
Inventors: Ian Farquhar Campbell Mckenzie; Geoffrey Allan Pietersz; Mark John Smyth
Original assignee: University of Melbourne; Pharmacia and Upjohn SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1987-03-11
Filing date: 1988-03-11
Publication date: 1997-08-28
Anticipated expiration: 2008-03-12
Also published as: RU2106147C1; KR880010775A; IT8819746A0; JP2736255B2; DK131588A; AU622105B2; CA1329156C; AU1288188A; NO881105D0; CZ161288A3; ATA67488A; PT86960B; NZ223834A; FI98706C; FR2612074A1; FR2612074B1; JPS63301832A; NO178954C; PT86960A; YU46858B

Description

Die Erfindung betrifft Immunglobulinkonjugate, Verfahren zu deren Herstellung sowie pharmazeutische Mittel, die diese enthalten.

Das allgemeine Konzept zum direkten Anpeilen von Tumoren mit antineoplastischen Agentien unter Verwendung mono klonaler Antikörper (MoAbs) ist bekannt, und die thera peutische Bedeutung wird derzeit einer Untersuchung un terzogen. Im allgemeinen geht man dabei so vor, daß man Konjugate aus einem Antikörper und einem toxischen Agens, die in der Lage sind, sich selektiv an den Tumorzellen zu lokalisieren und diese zu zerstören, herstellt. Ein besonderes Augenmerk galt der Konstruktion von Immuntoxi nen aus den A-Ketten pflanzlicher und bakterieller Toxi ne und Antikörpern, und zwar so, daß es bei der Bindung des Antigens und bei der Einverleibung desselben zum Zelltod kommt. In der Praxis hat sich gezeigt, daß viele MoAbs, von denen man glaubte, daß sie tumor-spezifisch sind, auch mit Subpopulationen normaler Zellen reagieren, so daß es folglich unrealistisch ist, derart potente Toxine einzusetzen, da sie auch normale Gewebe in nen nenswerter Weise schädigen. Eine sicherere Alternative zu Pflanzentoxinen stellt die Kopplung von Antikörpern an konventionelle Anti-Krebsmittel, wie Doxorubicin, Vindesin, Chlorambucil, Melphalan und Methotrexat, dar. Aufgrund der nicht-spezifischen toxischen Wirkung der derzeit verwendeten antineoplastischen Agenzien hat man versucht, deren therapeutischen Index zu erhöhen, indem man sie an MoAbs auf Tumorantigene koppelte.

GB-A-2 158 078 betrifft Konjugate aus Anthracyclinen des Doxorubicin-Typs und einem anionischen Polymer. Diese Konjugate zeigen in Tumormodellen verbesserte Antitumoreigenschaften.

Ein Übersichtsartikel in der Zeitschrift Cell Volume 47, 641- 648, 1986) der Autoren I. Pastan, M. C. Willingham und D. J. P. FitzGerald betrifft Immunotoxine. Darin wird diskutiert, daß es zur Herstellung zellspezifischer Immunotoxine notwendig ist, die Bindung des Toxins an den normalen Zellrezeptor zu verhindern und das Toxin an einen geeigneten Antikörper zu binden, der es zu der Zielzelle führt. Diese Technik wird im Zusammenhang mit der Chemotherapie von Krebs diskutiert.

Das klinische Potential von Arzneimittel-MoAb-Konjuga ten umfaßt die Immunchemotherapie von Krebs. In vielen Untersu chungen konnte die spezifische Cytotoxizität von Toxinen und Arzneimitteln auf Tumorzellen gezeigt werden, wenn diese mit MoAb auf tumor-assoziierte Antigene gekoppelt werden.

Anthracycline stellen eine wichtige Gruppe antineopla stische Agenzien, die in der Krebschemotherapie verwen det werden, dar, wobei sich Doxorubicin und Daunorubi cin gegen feste Tumore als wirksam erwiesen. Eine Kopp lung von Daunorubicin und Doxorubicin an Antikörper führt jedoch zu einem wesentlichen Verlust der Wirksamkeit der Pharmaka, wenn die Kopplung über die Aminogruppe er folgt. In letzter Zeit hat man Daunorubicin an MoAbs über das Kohlenstoffatom 14 unter Verwendung von Bromdauno rubicin gekoppelt. Diese Konjugate zeigten sich in vitro als wirksam. Es wurde jedoch von keinen in vivo-Untersu chungen berichtet (Gallego et al, Int. J. Cancer, 1984 33 737-744). Außerdem konnte gezeigt werden, daß Dauno rubicin-MoAb-Konjugate eine nicht-spezifische Toxizität bei Konzentrationen < 10 µg/ml besitzen.

Die Anmelderin hat nun gefunden, daß Idarubicin (4-Demethoxy-daunorubicin, Ida) an MoAbs gekoppelt werden kann, und daß die Konjugate eine selektive und potente in vitro- und in vivo-Anti-Tumoraktivität besitzen. In vivo zeigten Ida-MoAb-Konjugate bei Dosen von < 8,0 mg/kg keine nicht-spezifische Toxizität. Die Ida- MoAb-Konjugate weisen in vitro und in vivo eine größere Wirksamkeit als Daunorubicin-MoAb-Konjugate auf.

Folglich stellt die vorliegende Erfindung Immunglobulinkonjugate zur Verfügung, welche dadurch gekennzeichnet sind, daß Idarubicin (Ida) an der C14-Position mit einem für menschliches Neoplasma spezifischen monoklonalen Antikörper oder mit einem Fragment des Antikörpers konjugiert ist, welches mindestens eine der Antigenbindungsstellen umfaßt.

Ida wird in US-A-4,077,988 beschrieben. Vorzugsweise wer den zwei bis acht Ida-Moleküle kovalent an jeden Anti körper oder jedes Antikörperfragmentmolekül gebunden, besonders bevorzugt zwei bis sechs. Die Ida-Moleküle werden vorzugsweise direkt gebunden, obwohl es auch möglich ist, einen iner ten Träger oder Linker dazwischenzuschieben.

Beispiele menschlicher Neoplasmen, die mit Ida angepeilt werden sollen, sind Brustkrebs, Colonkrebs, Lungenkrebs, Prostatakrebs, Eierstockkrebs, Thymuskrebs und andere Krebsarten, Sarkomata und Leukämien.

Es kann ein Antikörper oder Antikörperfragment eingesetzt werden, das spezifisch für human-Transferrin-Rezeptor (TFR) ist, der auf sich tellenden Zellen, erythroiden Prekursorzellen und den Zellen einer Vielzahl von Tumoren, vorliegt. Ein geeig neter anti-TFR-monoklonaler Antikörper ist z. B. ein Antikörper auf Transferrin-Rezeptor auf LiCR-LON-HMy-2 (HMy-2)-Zellen.

Vorzugsweise stellt der monoklonale Antikörper oder das Antikörperfragment die gleiche Spezies dar, gegen die das Immunglobulinkonjugat verabreicht wird. Ein Human- oder Maus-monoklonaler Antikörper oder eine entsprechen des Antikörperfragment werden deshalb typischerweise dann eingesetzt, wenn eine Verabreichung des Konjugats am Menschen beabsichtigt ist. Außerdem gehört der Anti körper oder das Antikörperfragment vorzugsweise der IgG-Klasse an. Das Antikörperfragment kann das Fab, Fab′ oder F(ab′ )₂-Fragment darstellen. Eingesetzt werden kann auch das IgM-Monomer, das sich durch die abbauende Wir kung proteolytischer Enzyme aus IgM-Antikörper gewinnen läßt.

Die Immunglobulinkonjugate werden gemäß der Erfindung nach einem Verfahren hergestellt, welches die Vernetzung von 14-Halogen-Ida mit dem monoklonalen Antikörper oder einem Fragment davon umfaßt. Der Substituent in 14-Position kann Fluor, Chlor, Brom oder Jod darstellen, vorzugsweise Brom. 14-Brom-Ida wird in US-A-4,125,607 beschrieben. Die Konjugation kann somit durch ein Verfahren erzielt werden, das folgende Schritte umfaßt:

(a) Vermischen des monoklonalen Antikörpers oder eines Fragmentes davon mit einem molaren Überschuß von 4-Halogen-Ida,
(b) Umsetzen des Gemisches bei 18 bis 37°C,
(c) Entfernen jeglichen Niederschlages,
(d) Entfernen von nicht-umgesetzten Ausgangsmaterialien durch Gelfiltration, und
(e) Entfernen von adsorbiertem Arzneimittel (Ida) durch Adsorptionschromatographie oder Ionenaustauschchro matographie.

Schritt (a) wird typischerweise in einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, wie N,N-Dimethylformamid, durchgeführt. Vorzugsweise beträgt der molare Über schuß von 14-Halogen-Ida in Schritt (a) das 0- bis 50-fache. In Schritt (b) wird die Reaktion vorzugsweise in einem Zeitraum von 1 bis 8 h durchgeführt. Typischerweise ist die Reaktionstemperatur die Raumtemperatur.

Es können jedoch auch andere Methoden der Konjugation angewendet werden. Wenn ein Konjugat gewünscht wird, das einen inerten Träger oder Linker, eingeschoben zwischen Ida und dem monoklonalen Antikörper oder dem Antikörper fragment, aufweist, so wird der Träger oder Linker ty pischerweise zunächst an das C-14-Kohlenstoffatom von Ida angebracht und wird dann an den Antikörper oder das Antikörperfragment gebunden.

Die Immunglobulinkonjugate gemäß der Erfindung können zur humanen oder veterinären Behandlung von Krebs eingesetzt werden. Dazu wird eine therapeutisch wirksame Menge des Konjugats verabreicht. Der Krebs kann einen festen Tumor, einen Ascitestumor oder eine Leukämie darstellen. Die zu behandelnden Neoplasmen sind die vorstehend genannten. Es können zwei oder mehrere Konjugate, in denen der mono klonale Antikörper oder das Antikörperfragment jeweils eine unterschiedliche Spezifität aufweisen, verabreicht werden.

Das Konjugat kann durch Injektion verabreicht werden. Es kann parenteral, z. B. intravenös, gegeben werden. Es kann lokal oder direkt in den Tumor verabreicht werden. Die an einen Patienten zu verabreichende Konjugatmenge ist von einer Reihe von Faktoren abhängig, wie z. B. dem zu behandelnden Tumor und dem Zustand des Patienten. Typischerweise wird eine Dosis von 10 bis 200 mg Konju gat pro m² Körperfläche eines Patienten verabreicht. Die Konjugate kön nen mit anderen chemotherapeutischen Agenzien oder mit Agenzien verabreicht werden, die die Aktivität der Kon jugate verstärkt, wie z. B. vasoaktive Agenzien oder Tumor-Necrose-Faktor.

Die Immunglobulinkonjugate werden mit einem pharmazeu tisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel zu phar mazeutischen Mitteln formuliert. Dazu kann jeder geeig nete Träger bzw. Verdünnungsmittel verwendet werden. Geeignete Träger und Verdünnungsmittel umfassen physio logische Kochsalzlösung und Ringer′sche-Dextroselösung.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern. In den beiliegenden Zeichnungen betreffen Fig. 1 bis 12 das Beispiel 1 und Fig. 13 bis 16 das Beispiel 2. Ins besondere stellt

Fig. 1 die Struktur von Anthracyclinderivaten dar;

Fig. 2 stellt die Kopplung von Idarubicin (Ida) an anti-Ly-2.1 (0, 5 mg) dar: Mol Ida inkorporiert pro Mol anti-Ly-2.1 (∎) (linke Ordinate) und Proteinanteil (⚫) (rechte Ordinate) sind als Funktion der Anzahl nMol Ida im Reaktionsgemisch (Abszisse) dargestellt;

Fig. 3 stellt den Antikörpertiter dar, bestimmt als % rosettenbildende Zellen (Ordinate) gegen die Antikörperverdünnung (-1) (Abszisse) von anti- Ly-2.1-Konjugaten auf ITT(1) 75 NS E3 target-Zel len. Serienmäßige Verdünnungen wurden mit einer 0,5 mg/ml-Lösung von entweder anti-Ly-2.1 (▲) oder anti-Ly-2.1 mit 2(⚫) oder 8 (○) Mol Ida/Mol Antikörper durchgeführt.

Fig. 4 zeigt die inhibierende Wirkung von Ida (∎) oder Ida-anti-Ly-2.1, 5 Mol Ida/Mol Antikörper, (⚫) auf E3-Zellen in einem 24-stündigen Assay, wobei die prozentuale Inhibierung der [³H] Thymidin inkorporierung (Ordinate) gegen die Konzentration von Ida(M) (Abszisse) aufgetragen ist;

Fig. 5 gibt die inhibierende Wirkung von Ida (∎), Ida anti-Ly-2.1, 5 Mol Ida/Mol Antikörper (⚫) oder Ida-anti-TFR, 5 Mol Ida/Mol Antikörper (○) auf (Ly-2⁺) E3-Zellen in einem 30-minütigen Inhibie rungsassay wieder, wobei die prozentuale Inhi bierung der [³H] Thymidininkorporierung (Ordinate) gegen die Konzentration von Ida(M) (Abszisse) aufgetragen ist;

Fig. 6 zeigt die inhibierende Wirkung von Ida-anti-Ly- 2.1 , 5 Mol Ida/Mol Antikörper (○) und Konjugat plus anti-Ly-2.1 (⚫) auf E3-target-Zellen in einem 30-minütigen Spezifitätsassay, wobei die prozentuale Inhibierung der [³H] Thymidininkorpo rierung (Ordinate) gegen die Konzentration von Ida(M) (Abszisse) aufgetragen ist;

Fig. 7 zeigt das Wachstum von E3-Thymom in CBF₁-Mäusen, subkutan injiziert mit 2×10⁶ Zellen. Gruppen von 10 Mäusen wurden intravenös behandelt, wie dies durch einen Pfeil angezeigt ist; PBS (), Ida (∎), anti-Ly-2.1 (▲), Ida-anti-TFR (○) oder Ida-anti-Ly-2.1 (⚫). Mittlere Tumorgröße (cm²) (Ordinate) ist gegen Tage nach der Tumorinokula tion (Abszisse) aufgetragen. Die eingetragenen Fehlerabweichungen stellen den ± mittleren Stan dardfehler dar;

Fig. 8 zeigt einzelne Tumorwachstumskurven von CBF₁- Mäusen, subkutan injiziert mit 2,0×10⁶ E3- Tumorzellen und intravenös an den Tagen 4 und 5 mit Ida-anti-Ly-2.1-Konjugat behandelt. Die Tu morgröße (cm²) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen;

Fig. 9 zeigt das Wachstum von E3-Thymom in CBF₁-Mäusen, subkutan injiziert mit 3,0×10⁶ Zellen. Gruppen von 10 Mäusen wurden intravenös behandelt, wie dies durch einen Pfeil angegeben ist; PBS (); anti-Ly-2.1 (▲), Ida (∎) oder Ida-anti-Ly-2.1- Konjugat (⚫). Die mittlere Tumorgröße (cm²) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumor inokulation (Abszisse) aufgetragen. Die Fehler abweichungen stellen den ± mittleren Standard fehler dar; und

Fig. 10 zeigt das Wachstum von E3-Thymom in CBF₁-Mäusen, subkutan injiziert mit 3,0×10⁶ Zellen. An Grup pen von 10 Mäusen wurde eine Intratumorbehandlung durchgeführt, wie dies durch einen Pfeil ange zeigt ist; PBS (); anti-Ly-2.1 (▲), Ida (∎) oder Ida-anti-Ly-2.1-Konjugat (⚫). Die mittlere Tumorgröße (cm²) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse) aufgetra gen. Die Fehlerabweichungen stellen den ± mittle ren Standardfehler dar;

Fig. 11 zeigt das Wachstum von COLO 205 Human-Tumor- Xenotransplantat in nackten Mäusen, subkutan in jiziert mit 2×10⁶ Zellen. Gruppen von 10 Mäusen erhielten die folgende intravenöse Behandlung, die durch einen Pfeil angezeigt ist; PBS (∆), freies Ida (⬩), Ida-250-30.6-Konjugat (⚫), Ge misch von Ida und 250-30.6 (⬩) und 250-30.6 (▲). Die mittlere Tumorgröße (cm²) (Ordinate) ist ge gen die Tage nach der Tumorinokulation (Abszis se) aufgetragen. Die Fehlerabweichungen stellen den ± mittleren Standardfehler der Tumorgröße dar;

Fig. 12 gibt einzelne Tumorwachstumskurven von nackten Mäusen mit Fremdtransplantat wieder, wobei die Mäuse i. v. (Pfeil) mit Ida-250-30.6-Konjugat be handelt wurden. Die gestrichelte Linie gibt die mittlere Tumorgröße in PBS-behandelten Mäusen wieder. Die Tumorgröße (cm²) (Ordinate) ist ge gen die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen;

Fig. 13 zeigt die Kopplung von Idarubicin (Ida) an anti- L3T4 (0,5 mg). Mol Ida, inkorporiert pro Mol anti-L3T4 (⬩) (linke Ordinate) und Proteinanteil (⚫) (rechte Ordinate) werden als Funktion der Anzahl nMol Ida im Reaktionsgemisch (Abszisse) wiedergegeben;

Fig. 14 zeigt den Antikörpertiter, gemessen als % Roset ten-bildende Zellen (Ordinate) gegen die Antikör perverdünnung (x 10^-1) (Abszisse) von anti-Thy-1- Konjugaten auf ITT(1) 75NS E3 target-Zellen. Es wurden serienmäßige Verdünnungen mit 1.0 mg/ml Lösung von entweder anti-Thy-1 (⬩) oder Konju gat mit 1 (○), 4 (⚫) oder 7 (⬩) Mol Ida/Mol anti- Thy-1 durchgeführt;

Fig. 15 zeigt die Wirkung einer kombinierten Ida-MoAb- Konjugat-Behandlung auf das Überleben eines P388D1-Tumortransplantats als (across) H-2 und Nicht- H-2-Unterschiede) in CBA-Mäusen. Gruppen von 10 bis 15 Mäusen wurden subkutan 8,0×10⁶ P388D1 Tumorzellen injiziert und erhielten jeweils intravenös (Pfeil): (i) PBS (⬩), (ii) anti-L3T4 und anti-Ly-2.1 (○), (iii) Ida-anti-L3T4 (∎), (iv) Ida-anti-Ly-2.1 (⚫) und (v) Ida-anti-L3T4 und Ida-anti-Ly-2.1 (▲). Die mittlere Tumorgröße (cm²) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tu morinokulation (Abszisse) aufgetragen. Die Fehler abweichungen geben den ± mittleren Standardfeh ler wieder; und

Fig. 16 zeigt die Wirkung von Ida-anti-Thy-1-Konjugat auf das Überleben eines P388D1-Tumortransplan tats in CBA-Mäusen. Gruppen von 10 Mäusen wur den subkutan mit 1,0×10⁷ P388D1 Tumorzellen injiziert und erhielten jeweils intravenös (Pfeil): (i) PBS (), (ii) anti-Thy-1 (⚫) und (iii) Ida-anti-Thy-1 (▲). Die mittlere Tumorgröße (cm²) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen. Die Fehlerkreuze stellen den ± mittleren Standard fehler dar;

Fig. 17 zeigt das Wachstum von COLO 205 (30.6⁺, 17.1⁺) Xenotransplantat in nackten Mäusen, injiziert mit 8×10⁶ Zellen/Maus. Gruppen von 10 Mäusen wurden intraperitoneal behandelt, wie durch einen Pfeil angezeigt, mit PBS (); 17.1- Ida (○); 30.6-Ida (∆) oder einem Gemisch aus 30.6-Ida und 17.1-Ida (⚫). Die mittlere Tumor größe (cm²) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse) auftragen. Die Fehlerkreuze geben den mittleren ± Standardfeh ler wieder. Die Gesamtdosis an Ida betrug 200 µg;

Fig. 18 zeigt das Wachstum von LIM 2210 Human-Colon- Tumor-Xenotransplantat in nackten Mäusen, die mit einem Tumorfragment (1-5 mg) implantiert waren. Gruppen von 10 Mäusen wurden intravenös behan delt, wie durch einen Pfeil angezeigt, mit PBS (); 17.1-Ida (⬩); JGT-13-Ida (▲); 27.1-Ida (⚫), 30.6-Ida (○). Mittlere Tumorgröße (cm²) (Ordi nate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokula tion (Abszisse) aufgetragen. Die Fehlerkreuze geben den ± mittleren Standardfehler wieder. Die Gesamtdosis an Ida betrug 80 µg.

Beispiel 1 Materialien und Methoden Tumorzellen

Die in dieser Studie untersuchten Zellinien umfassen (Ly-2⁺) Mäuse-Thymom ITT(1) 75NS E3 Variante (E3) (Smyth et al, J. National Cancer Inst. 1986 76 503-510), (Ly-2^-, TFR^-) Lyphom EL4 (Horowitz et al, Science 1968 160 533- 535), TFR⁺) Human-Zellinie CEM (Foley et al Cancer 1965 18 522-529) and die (250-30.6⁺) Human-Zellinie COLO 205. Die Zellen wurden in vitro in Dulbecco′s modifiziertem Eagle-Medium (DME) oder RPMI 1640-Medium (Flow Laboratories, Sydney, Australien), ergänzt mit 10% hitze-inaktiviertem Serum von neugeborenen Kälbern (Flow), 2 mM Glutamin (Commonwealth Serum Laboratories, Sydney, Australien); 100 µg/ml Streptomycin (Glaxo, Melbourne, Australien) und 100 I.E./ml Penicillin (Commonwealth Serum Laboratories), gehalten. Der E3-Tumor wurde in vivo mittels Serienpassage in (C57BL/6 × BALB/c)F₁-Mäusen (CBF₁-Mäuse) gehalten. Zellen aus Ascites-Flüssigkeit wurden zweimal in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS), pH 7,3, gewaschen und zentrifugiert (400 g×5 min), in PBS resuspendiert und subkutan (s.c.) in die Abdomenwand von Mäusen injiziert; diese entwickel ten sich vor der Behandlung zu fühlbaren Tumoren. Die Mäuse wurden einer Reihe von intravenösen (i. v.) oder intratumor (i.t.)-Behandlungen unterworfen; die Größe der Tumoren wurde täglich mit einer Schublehre gemes sen, wobei entlang den senkrechten Achsen der Tumore ge messen wurde. Die Daten wurden als mittlere Tumorgröße (Produkt von zwei Durchmessern ± Standardfehler) regi striert.

Mäuse

CBA und (C57BL/6×BALB/c) Mäuse (CBF₁-Mäuse) und nackte (nu/nu) Mäuse wurden vom Department of Pathology, Universität von Melbourne, zur Verfügung gestellt. Expe rimentelle Gruppen von 8 bis 10 Mäusen, alle vom selben Geschlecht und Alter, wurden in jedem Experiment ver wendet.

Monoklonale Antikörper

Verwendete MoAbs: (i) anti-Ly-2.1 (IgG1), reaktiv auf Mäuse-Ly-2.1-Spezifivität (Hogarth et al, Immunology 1982 46 135-144) und (ii) A3C6 (anti-TFR) (IgG1), reaktiv auf human-Transferrinrezeptor (TFR) (Panaccio et al, Immunology and Cell Biology 65, 461-472 (1987)); und (iii) ein Antikörper, bezeichnet als 250-30.6, reaktiv auf ein Antigen, welches auf human-Colon-Karzinomzellen vorkommt.

Die MoAbs wurden aus Ascites-Flüssigkeit durch Präzipita tion mit 40%igem Ammoniumsulfat isoliert, aufgelöst in PBS und dialysiert gegen den gleichen Puffer. Diese rohen Präparationen wurden entweder an Protein-A-Sepharose (Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey) absorbiert, ein gehend mit PBS (pH 7,3) gewaschen und mit 0,2 M Glycin/ HCl (pH 2.8) eluiert, oder über eine Affigel-Blau-Säule (Bio-Rad Laboratories Pty. Ltd., Sydney) gegeben. Nach Neutralisierung wurden die MoAbs gegen PBS dialysiert, in Teile aufgeteilt und bei -70°C gelagert. A3C6 wurde durch Immunisierung von CBA-Mäusen, intraperitoneal in wöchentlichen Intervallen über drei Wochen mit 2 × 10⁶ LiCR-LON-HMy-2(HMy-2) Zellen (OKT9^+ve), Entfernen der Milz drei Tage nach der letzten Injektion und Verschmel zen mit P3-NSI-AG4-1 (NS-1)-Zellen erhalten.

Herstellung und Quantifizierung von Konjugaten

Intakte anti-Ly-2.1, anti-TFR-MoAb oder 250-30.6 (1-2 mg/ml in Boratpuffer, pH 8,0) wurden mit einem molaren Überschuß (1-50) 14-Brom-4-demethoxydaunorubicin (Br- Ida) in (N,N)-Dimethylformamid (DMF) zu 10 mg/ml aufge löst. Die Reaktion wurde 4 h lang bei Raumtemperatur durchgeführt, dann wurde zentrifugiert (400 g × 5 min), um jeglichen Niederschlag zu entfernen. Freies Br-Ida und andere nicht-umgesetzte Ausgangsmaterialien wurden durch Gelfiltrierungschromatographie unter Verwendung einer Sephadex G-25-Säule (PD-10; Pharmacia) entfernt; die Konjugate wurden dann über eine Säule von Porapak Q (Millipore) zur Entfernung von jeglichem adsorbiertem Arzneimittel gegeben (Niederwieser et al, J. Chromatog. 1971 54 215-223). Die Menge an Ida, die in den Arznei mittel-MoAb-Konjugaten inkorporiert war, wurde durch Extinktionsspektrophotometrie bei 483 mm (E₄₉₈= 3,4 × 10³M^-1cm^-1) und durch Proteinbestimmung (Bradford, Anal. Biochem. 1976 72 248-253), bestimmt.

Antikörperaktivität

Ein Rosettenbildungs-Assay unter Verwendung von Schaf- anti-Maus-Immunglobulin (SAMG) diente zur Bestimmung der Antikörperaktivität von Ida-MoAb-Konjugaten im Vergleich zu freiem MoAb, das den gleichen Verfahren, wie sie bei der Kopplungsmethode angewendet werden, unterzogen worden war (Parish and McKenzie, J. Immunol. Methods 1978 20 173-183).

Arzneimittelaktivität

(a) 24stündiges Inhibierungsassay: 100 µl Zellen (2-5 × 10⁶/ml) wurden in eine Mikrotiterplatte mit flachem Boden gegeben und 1 h bei 37°C inkubiert. Freies Ida rubicin (Ida) (aufgelöst in PBS) und Ida-MoAb-Konju gate wurden aseptisch filtriert und Verdünnungen wurden in sterilem PBS hergestellt; 50 µl freies Ida oder Konjugat wurden zu den Zellen gegeben, wobei für jede Probe zwei Ansätze verwendet wurden; Kontrollansätze erhielten 50 µl PBS; die Zellen wurden bei 37°C, 7% CO₂, 24 h lang kultiviert.
(b) 30minütiges Inhibierungsassay: 200 µl Zellen (2-5× 10⁶/ml) wurden in sterilen Eppendorf-Röhrchen gesam melt, in sterilem Arzneimittel oder Konjugat resus pendiert und 30 min bei 37°C vermischt. Die Zellen wurden dann zentrifugiert (400 g × 5 min), in Wachs tumsmedium resuspendiert; 100 µl aliquote Teile wur den in eine Mikrotiterplatte unter Verwendung von doppelten Ansätzen für jede Probe gegeben und dann 16 bis 24 h inkubiert. Nach der Inkubationsperiode wurden zu beiden Assays 50 µl Wachstumsmedium, wel ches 1 µCi [³H]-Thymidin enthielt (spezifische Aktivität = 5 Ci/mMol; Amersham) zugegeben und die Platten 2 bis 4 h inkubiert. Die Zellen wurden dann geerntet und getrocknet; einzelne Proben wurden ge trennt und auf einem beta-Szintillationszähler ge zählt. Die Inkorporierung von [³H]-Thymidin wurde als Prozentsatz der Inhibierung der Inkorporierung von Kontrollproben ausgedrückt. Der Standardfehler für jeden Punkt wurde durch Doppelbestimmungen ermittelt und überstieg für jeden gegebenen experimentellen Punkt nicht 5%.

Toxizität

Gruppen von 10 bis 20 CBA-Mäusen wurde eine einzige i.v.- Injektion verschiedener Dosen Ida oder Ida-anti-Ly-2.1 verabreicht und das Überleben der Mäuse gegen die Dosis des verabreichten Arzneimittels in mg/kg aufgetragen. Die Organe dieser Mäuse wurden entfernt und vor Formalin fixierung ausgewogen und mit Hämatoxilin und Eosin ange färbt.

Ergebnisse Herstellung und Charakterisierung der Konjugate

Br-Ida (Fig. 1) wurde kovalent an verschiedene MoAbs ge koppelt: MoAbs auf human-TFR, auf ein Antigen, welches auf human-Colonkrebszellen vorkommt (Antikörper 250-30.6) und auf das Mäuse-Ly-2-Alloantigen. Die Reaktionsbedingungen für die Konjugation variierten im Hinblick auf den mola ren Überschuß an Br-Ida, der zu den MoAbs zugegeben wur de, wobei ein Kompromiß zwischen höherer Ida-Inkorporie rung und geringerer Proteinmenge (Proteinanteil) getrof fen wurde. Ida-anti-Ly-2.1 (Fig. 2), Ida-anti-TFR und Ida- 250-30.6 (Daten nicht gezeigt) haben 3 bis 5 Moleküle Ida bei Proteinanteilen von über 50% inkorporiert. Die Umsetzung von Br-Ida mit MoAbs könnte zu zwei Bindungs typen führen (Fig. 1C und D). Um zu bestimmen, welcher Bindungstyp vorlag, wurden die Konjugate 48 h lang einem pH von 4,5 oder 9,0 ausgesetzt; das freigesetzte Arznei mittel wurde an Porapak Q absorbiert und die Proben wur den erneut durch Spektrophotometrie quantifiziert. 50% des gebundenen Arzneimittels wurde bei Einwirkung der Base (pH 9,0) freigesetzt, während sich bei pH 4,5 kein Verlust zeigte. Dies ist ein Hinweis dafür, daß minde stens 50% des Arzneimittels eine Esterbindung aufweist (Fig. 1D), da die Esterbindung gegenüber basischen Be dingungen empfindlich ist, während die Aminbindung sta bil ist.

Antikörperaktivität

Die Antikörpertiter vor und nach der Konjugation wurden nach der Rosettenbildungsmethode gemessen und wurden be stimmt als die Verdünnung, bei der 50% der Zielzellen Rosetten zeigten. Ida-anti-Ly-2.1-Konjugate, die 2 und 8 Moleküle Ida enthielten, wiesen Antikörpertiter gegen E3-Zellen von jeweils 1 : 56.000 und 1 : 33.000 auf, wäh rend der Titer von nicht-konjugiertem Antikörper 1 : 80.000 betrug (Fig. 3). Ida-250-30.6-Konjugate, die 2 und 6 Moleküle Ida enthielten, zeigten Antikörpertiter gegen COLO 205-Zellen von jeweils 1 : 16.000 und 1 : 11.000, während der Titer von nicht-konjugiertem Antikörper 1 : 33.000 betrug. Somit ergibt sich aufgrund des Konjugationsver fahrens ein Verlust der Antikörperaktivität; Konjugate mit weniger als 6 Molekülen Ida pro MoAb wurden für in vitro und in vivo Untersuchungen eingesetzt. Es wurde festgestellt, daß die Löslichkeit und Antikörperaktivität von Ida-anti-Ly-2.1-Konjugaten über diese Niveaus der Ida- Inkorporierung hinaus deutlich abnahm (Daten nicht wieder gegeben). Die maximale Anzahl an Ida-Molekülen, die ein gebaut werden kann, variiert in Abhängigkeit von dem jeweiligen Antikörper.

in vitro Aktivität von Idarubicin und Idarubicin-MoAb-Konjugaten

Die in vitro Cytotoxizität von Ida und zwei Ida-MoAb-Kon jugaten auf Mäuse-ITT(1)75NS E3-Zellinie (Ly-2⁺TFR^-) und die menschliche CEM-Zellinie (Ly-2^-TFR⁺) wurde in einem 24stündigen Inhibierungsassay gemessen und die Werte für I.D₅₀ (50%ige Inhibierung der [³H]-Thymidin-Inkorporie rung der Kontrollproben) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 und Tabelle 1 wiedergegeben. I.D₅₀ für Ida lag im Bereich von 1,0 bis 2,5 × 10^-7 M für beide der unter suchten Zellinien (Fig. 4, Tabelle 1). I.D₅₀ für Ida- anti-Ly-2.1 auf E3 war viermal größer (Fig. 4); für Ida- anti-TFR auf CEM waren die I.D₅₀-Werte 1-2 mal größer als die für freies Ida (Tabelle 1). Somit ist freies Ida toxischer sowohl auf E3 als auch auf CEM als jeweils Ida- anti-Ly-2.1 und Ida-anti-TFR. Diese Ida-MoAb-Konjugate zeigen jedoch eine zehnfach niedrigere Cytotoxizität als nicht-reaktive Zellinien (Tabelle 1) und geben damit an, daß ihre cytotoxische Wirkung spezifisch war und sich aus der Beibehaltung der Antikörperaktivität ergab (Fig. 3).

Tabelle 1

Wirkung von Idarubicin-monoklonalen Antikörper-Konjugaten auf Tumorzellen¹

Die Ida-250-30.6-Konjugate waren etwas weniger aktiv als freies Ida. Freies Ida zeigte einen I.D.₅₀-Wert von 6×10^-8M, während das Konjugat ein I.D.₅₀ von 3,5 × 10^-7M auf die target-Zellinie COLO 205 ergab.

Zur Bestimmung, ob die Konjugate eine Selektivität in ihrer cytotoxischen Wirkung auf target-Zellen ausüben, wurden Ida-anti-Ly-2.1 und Ida-anti-TFR 30 min lang mit E3 (Ly-2⁺)-Zellen inkubiert und dann das nicht-gebun dene Konjugat weggewaschen und die Cytotoxizität bestimmt. Das Ida-anti-Ly-2.1-Konjugat hatte ein I.D.₅₀ von 6,2 × 10^-7M im Vergleich zu einem I.D.₅₀ von 5,2 × 10^-7M für freies Ida (Fig. 5). Im Gegensatz dazu zeigte das nicht reaktive Ida-anti-TFR-Konjugat ein I.D.₅₀ von 5,0 × 10^-6M, i.e. zehnmal größer als das für freies Ida, wobei gezeigt wird, daß die Antikörper-bindende Aktivität von Ida-anti-Ly-2.1-Konjugat in einer selektiven Cytotoxizi tät resultiert. In gleicher Weise wurden Ida-250-30.6- Konjugat und freies Arzneimittel 30 min mit COLO 205 (250-30 +ve) und E3 (250-30.6 -ve)-Zellinien inkubiert und dann gewaschen, sowie anschließend ein Cytotoxizi tätsassay durchgeführt. Beide Zellinien zeigten eine ähnliche Dosisresponse auf freies Arzneimittel, i.e. 9,2×10^-7 M für COLO 205 und 9,8×10^-7M für E3. Das Ida-250-30.6-Konjugat war viermal toxischer auf COLO 205 als die Antikörper-nicht-reaktive E3-Zellinie. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung der CEM-Zellinie und Ida-anti-Ly-2.1 als eine nicht-reaktive Kontrolle erhal ten (Daten nicht gezeigt). Um im weiteren sicherzustel len, daß die Cytotoxizität von Ida-MoAb-Konjugaten auf target-Zellen spezifisch war und an der Antikörper- Bindungsstelle erfolgte, haben wir Untersuchungen zur Inhibierung der Konjugat-Cytotoxizität unter Verwendung von freiem MoAb durchgeführt. Bei einer Ida-Konzentra tion von 4,0×10^-6M (2 µg anti-Ly-2.1) war die Cytotoxi zität von anti-Ly-2.1-Konjugat auf E3-Zellen durch Zugabe von 50 µg (250 µg/ml) anti-Ly-2.1 um 70% reduziert (Fig. 6), was darauf hinweist, daß die Cytotoxizität des Ida-anti-Ly-2.1-Konjugats in direktem Zusammenhang zu dessen Antikörper-Bindungsfähigkeit steht. Ähnliche Kon trollergebnisse wurden mit 250-30.6 erhalten. Es ist darauf hinzuweisen, daß in sämtlichen Assays freies anti- Ly-2.1, anti-TFR und 250-30.6 nicht-cytotoxisch waren (Daten nicht gezeigt).

in vitro Behandlung von Mäusethymom ITT(1)75NS E3

Zur Ermittlung der Wachstumsinhibierung von festen Tumo ren wurden Gruppen von CBF₁-Mäusen (10 pro Gruppe), die mit 2,0×10⁶ E3-Zellen im Abdominalbereich inokuliert waren, mit einer der folgenden i. v. Injektionen behan delt: (i) PBS; (ii) anti-Ly-2.1; (iii) Ida; (iv) Ida- anti-TFR; oder (v) Ida-anti-Ly-2.1. Die Mäuse erhielten jeweils 20 µg Ida und/oder 1.200 µg anti-Ly-2.1 an den Tagen 4 und 5 (Tumorgröße = 0,1 cm²) nach der Tumorinoku lation.

Innerhalb 24 h der ersten Behandlung wiesen die mit Ida- anti-Ly-2.1 behandelten Mäuse eine mittlere Tumorgröße von 20% derjenigen Mäuse auf, die mit PBS behandelt wurden (i. e. eine 80%ige Abnahme der Tumormasse (Fig. 7)); es war offensichtlich, daß anti-Ly-2.1 allein und Ida, welches kovalent an nicht-spezifischen anti-TFR-MoAb ge bunden war, nicht das E3-Tumorwachstum beeinflußte. Die Tumoren von Mäusen, die nur Ida erhielten, waren bis zu 50% reduziert; drei von diesen Mäusen starben jedoch und die anderen zeigten eine 25%ige Verringerung des Körpergewichts. Die einzelnen Tumorwachstumskurven von Mäusen, die Ida-anti-Ly-2.1 erhielten, zeigten eine Regression bei 9 aus 10 Tumoren im Laufe der Behandlung (Fig. 8); in der Tat gingen 5 von 10 Tumoren vollständig zurück und traten auch nicht wieder auf (< 200 Tage); die Tumoren, die nach Abschluß der Behandlung weiter wuchsen (5 von 10), wuchsen mit langsameren Geschwindig keiten als die Tumoren der mit PBS und Ida-anti-TFR be handelten Mäuse. Es wurde ein weiteres Experiment durch geführt, um die i.v. Behandlung von größeren Tumoren mit Hilfe von Ida-anti-Ly-2.1 zu beurteilen. Gruppen von CBF₁-Mäusen (10 pro Gruppe) wurden mit 3,0 × 10⁶ E3- Zellen inokuliert; die Mäuse erhielten dann jeweils 15 µg und 900 µg Ida und anti-Ly-2.1 an den Tagen 6 (Tumor größe = 0,2 cm²) und 7 nach Tumorinokulation (Fig. 9). Die mit Ida-anti-Ly-2.1 behandelten Mäuse hatten eine mittlere Tumorgröße von 50% derjenigen der mit PBS be handelten Mäuse und 66% derjenigen mit Ida behandelten Mäuse am Tag 7; dieser Trend setzte sich bis zum Ab schluß der Studie fort (Tag 18). Die einzelnen Tumor wachstumskurven der 10 CBF₁-Mäuse, die Ida-anti-Ly-2.1 erhielten, zeigten, daß vier Regressionen und eine voll ständige Entfernung der Tumormasse (< 200 Tage; Daten nicht gezeigt) vorlag. Somit war Ida-anti-Ly-2.1 wirksam gegen große Tumoren; in beiden Experimenten war die anti-Tumoraktivität von Ida merklich verbessert, wenn dieses an anti-Ly-2.1-MoAb gekoppelt war.

in vivo Behandlung von menschlichem Colontumor COLO 205

Die Wirkung von Ida-anti-250-30.6-Konjugat wurde in nackten (nu/nu) Mäusen mit Xenotransplantaten, unter sucht.

Die subkutane Injektion von 2 × 10⁶ Zellen in die Abdomi nalwand ergab innerhalb von 4 Tagen einen fühlbaren Klumpen (ca. 0,1 cm²). Gruppen von 10 Mäusen wurden dann mit einer der folgenden i.v. Injektionen behandelt: (i) PBS; (ii) 250-30.6; (iii) Ida plus 250-30.6 (nicht konjugiert); (iv) Ida; (v) Ida-250-30.6-Konjugat. Insge samt wurden 275 µg Ida in einer Reihe von 5 intravenö sen Injektionen an den Tagen 4, 5, 6, 10 und 12 nach Tumorinokulation gegeben.

In den Gruppen von Mäusen, die mit PBS oder mit nicht konjugierten 250-30.6 behandelt worden waren, zeigte sich kein therapeutischer Effekt. Mit Ida allein über lebten 2 von 10 Mäusen, während sämtliche Mäuse der Gruppe, die nicht-konjugiertes Ida plus 250-30.6 erhiel ten, am siebten Tage tot waren, wobei sie vorher Toxi zitätssymptome zeigten, wie z. B. Gewichtsverlust. Die Mäuse, die Ida-250-30.6-Konjugat erhielten, zeigten eine dramatische Reaktion der Tumorgröße. Diese Ergebnisse sind in Fig. 11 wiedergegeben. Tumorwachstumskurven für die einzelnen Mäuse (Fig. 12) zeigten, daß 5 von 7 Mäu sen Tumoren aufwiesen, die am siebten Tag zurückgegangen waren; diese Tumoren wuchsen weiter fort, wobei 2 von 10 Mäusen ohne Tumoren verblieben. Diese Mäuse zeigten keine Toxizitätseffekte.

Intratumor-Behandlung

Die Intratumor-Therapie hat sich als eine nützliche Methode der Immuntherapie von tierischen und menschli chen Tumoren erwiesen. Im folgenden wurden Untersuchungen durchgeführt, um die anti-Tumoraktivität von Ida-anti- Ly-2.1-Konjugaten, wenn diese direkt in den festen E3- Tumor verabreicht wurden, zu charakterisieren. Gruppen von 10 CBF₁-Mäusen, denen s.c. 3,0 × 10⁶ E3-Zellen im plantiert worden waren, entwickelten 5 Tage nach der Tumorinokulation Tumoren (0,1 bis 0,2 cm²). Die Behand lungen bestanden aus 2 Injektionen an den Tagen 5 und 6 nach der Tumorimplantation, wobei die Mäuse eine der fol genden Behandlungen erhielten: (1) PBS; (2) Ida; (3) anti-Ly-2.1; oder (4) Ida-anti-Ly-2.1 (Gesamt-Ida = 30 µg). Ida-anti-Ly-2.1 zeigte die größte anti-Tumorak tivität; freies Ida und anti-Ly-2.1 allein beeinflußten das Tumorwachstum nicht, wenn sie direkt in den Tumor verab reicht wurden. Die mit Ida-anti-Ly-2.1 behandelten Mäu se wiesen eine mittlere Tumorgröße von 60% derjenigen der mit PBS behandelten Mäuse am Tag 8 auf, und 30% derjenigen der mit PBS behandelten Mäuse am Tag 13 (Fig. 10). Die einzelnen Tumorwachstumskurven (Daten nicht ge zeigt) von Ida-anti-Ly-2. 1-behandelten Mäusen ergaben eine vollständige Regression, während sich bei den rest lichen Mäusen eine verzögerte Reduktion des Tumorwachs tums 3 Tage nach Abschluß der Behandlung zeigte.

Toxizität

In den Experimenten zur akuten Toxizität wurde Gruppen von 10 CBA (Ly2.1⁺)-Mäusen eine einzige Injektion ver schiedener Dosen von entweder Ida, Ida-anti-Ly-2.1 oder Ida-anti-TFR verabreicht. Alle Mäuse, die mit Ida inji ziert wurden, zeigten anfangs einen Gewichtsverlust von bis zu 25% des ursprünglichen Gewichtes; bei den mit Ida-MoAb-Konjugat behandelten Mäusen wurde kein Ge wichtsverlust beobachtet. Tabelle 2 gibt die Toxizität von Ida und Ida-MoAb-Konjugaten als LD₅₀- und LD₁₀-Werte wieder. Wie gezeigt, beträgt LD₁₀ von Ida-anti-Ly-2.1 10,0 mg/kg, bezogen auf Ida, im Vergleich zu nur 0,75 mg/kg für freies Ida. Außerdem zeigte das Ida-anti-TFR- Konjugat ein LD₁₀ von 8,0 mg/kg. Ida-MoAb-Konjugate wurden nicht im Hinblick auf die LD₅₀-Dosis getestet. Diese Ergebnisse zeigen den größeren therapeutischen Index von Ida-MoAb-Konjugaten im Vergleich zu freiem Ida.

Tabelle 2

Wirkung von Idarubicin-monoklonale Antikörper-Konjugate auf CBA-Mäuse

Histopathologische Ergebnisse

Akute Wirkung: Die intravenöse Verabreichung von freiem Ida (1,0 mg/kg) führte zu einer Atrophie der weißen Pulpa der Milz 15 Tage nach Behandlung und einer gewissen Hypertrophie der Herzmuskelfasern (Daten nicht angegeben). Im Gegensatz dazu ergab eine einzelne Dosis von Ida-anti- Ly-2.1 (2,4 mg/kg) keine nicht-spezifische Gewebetoxizi tät nach 15 und 30 Tagen, obwohl eine geringe Schwellung der Hepatocyten am Tag 15 beobachtet wurde.

Beispiel 2 Materialien und Methoden Mäuse

(DBA/2 × BALB/c)F₁ und CBA-Mäuse wurden vom Department Pathology, University of Melbourne, zur Verfügung ge stellt. Experimentelle Gruppen von 10 bis 20 Mäusen, von gleichem Geschlecht und Alter, wurden in jedem Experi ment verwendet.

Tumorzellen

Die in dieser Studie untersuchten Zellinien umfaßten die (Ly-2⁺) Mäusethymom ITT(1)75NS E3-Variante (E3), (L3T4⁺) Lymphom EL4 (Horowitz et al, Science 1968 160 533-535), menschliches Colon-Karzinom Colo 205 (Semple et al, Cancer Res. 1978 38 1345-1355) und (Ly-2^-, L3T4^-) menschliche T-Zellenleukämie CEM (Foley et al, Cancer 1965 18 522-529). In vitro wurden die Zellen gehalten, wie dies in Beispiel 1 beschrieben wird. Die P388D1 Makrophagen-Zellinie wurde in vivo durch serienmäßige Passage in (DBA/2 × BALB/c)F₁-Mäusen erhalten. Zellen aus der Ascitesflüssigkeit wurden zweimal in phosphat gepufferter biologischer Kochsalzlösung (PBS, pH 7,3) ge waschen und zentrifugiert (400 g × 5 min), in PBS resuspen diert und s. c. in die Abdominalwand von Mäusen inji ziert, wo diese fühlbare Tumortransplantate entwickelten. Die Mäuse wurden dann einer Reihe von i. v. Behandlungen unterworfen, und die Größe der Tumoren wurde täglich mit einer Schublehre gemessen, wobei entlang der senkrech ten Achse der Tumoren ausgemessen wurde. Die Daten wur den als mittlere Tumorgröße (Produkt von zwei Durchmes sern ± Standardfehler) registriert.

Monoklonale Antikörper

Monoklonale Antikörper auf Mäuse-Zelloberflächenantigene L3T4, Ly-2 und Thy-1, die bestimmte Subpopulationen von Lymphocyten charakterisieren, wurden als Modellsystem verwendet.

Es wurden folgende monoklonale Antikörper (MoAbs) ver wendet: (i) anti-Ly-2.1 (Mäuse-IgG2a), reaktiv mit Mäuse- Ly-2.1-Spezifität (Horgarth et al, Immunology 1982 46 135- 144), (ii) H129.19 (anti-L3T4) (Ratten-IgG2b) reaktiv mit Mäuse-L3T4-Spezifität (Pierres et al, J. Immunology 1984 132 2775-2782) und (iii) anti-Thy-1 (Ratten IgG2b) reaktiv mit Mäuse-T-Zellen (Marshak-Rothstein et al, J. Immunology 1979 122 2491-2497). Die Antikörper wurden isoliert, gereinigt und wie im Beispiel 1 beschrieben gelagert. Die Antikörperaktivität wurde durch ein Roset tenbildungsassay mit Schaf-anti-Mäuse-Immunoglobulin (SAMG), wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist, bestimmt.

Herstellung von Idarubicin-monoklonale Antikörper- Konjugate

MoAb (1-2 mg/ml) wurde mit einem 5 bis 20 molaren Über schuß von 14-Brom-4-demethoxydaunorubicin (Br-Ida), auf gelöst in (N,N)-Dimethylformamid (10 mg/ml), 4 h lang bei pH 8,0 (0,05 M Boratpuffer) und Raumtemperatur ver mischt. Dabei erfolgte die Umsetzung; es wurde eine Rei nigung durchgeführt, und die Menge an Ida, die in dem erhaltenen Konjugat eingebaut war, wurde, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist, bestimmt.

Arzneimittelaktivität

Es wurden zwei Assays (24 h und 30 min) durchgeführt, um die Arzneimittelaktivität zu bestimmen (die Bestimmung erfolgte wie im Beispiel 1 beschrieben), wobei Zellen in einer Konzentration von 1 bis 5 × 10⁶/ml eingesetzt wur den.

Serologie

Bei sämtlichen Experimenten wurde eine Rosettenbildungs- Methode angewendet, um den Antikörpertiter und die Anzahl an L3T4⁺ und Ly-2⁺-Zellen zu bestimmen. Diese Methode involvierte die Bindung von SAMG, mit dem auch Ratten- Immunglobulin (Ig) nachgewiesen werden kann, gekoppelt an rote Blutzellen von Schaf (SRC), zum Nachweis von Anti körpern auf der Oberfläche lymphoider Zellen. Bei Ig⁺- Milzzellen war das Oberflächen-Ig durch Maskieren (capping) mit SAMG entfernt (75 µl und 2 ml Zellen bei 10⁷µl); Zellen wurden dann auf Eis in einem Medium ge halten, das 0,01% Natriumazid enthielt, um die Resynthe se von Immunglobulin zu verhindern.

Ergebnisse

Die Untersuchung wurde in separaten Phasen durchgeführt:

(a) in vitro Charakterisierung von drei verschiedenen Ida-MoAb-Konjugaten, und
(b) Nachweis ihrer Nützlichkeit bei der aktiven Verar mung von T-Zellen-Untergruppen vor oder nach dem Abstoßen eines Tumorzellen-Allotransplantats.

Herstellung und Charakterisierung von Konjugaten

Br-Ida wurde kovalent an monoklonale Antikörper auf Mäuse-L3T4, Ly-2 und Thy-1-Antigene gekoppelt. Die Reaktionsbedingungen für die Konjugate variierten im Hinblick auf molaren Überschuß von Br-Ida, der zu dem monoklonalen Antikörper (MoAb) zugegeben wurde; dabei wurde ein Kompromiß zwischen einer höheren Ida-Inkorpo rierung und einem niedrigeren Proteinanteil getroffen. Ida-anti-L3T4 (Fig. 13), Ida-anti-Ly-2.1 und Ida-anti- Thy-1 (Daten nicht gezeigt) inkorporierten 3 bis 6 Moleküle Ida, wobei der Proteinanteil über 50% lag.

Antikörperaktivität

Die Antikörpertiter vor und nach der Konjugation wurden mit Hilfe der Rosettenbildungsmethode gemessen und wur den bestimmt als die Verdünnung, bei der 50% der target- Zellen Rosetten zeigten: Ida-anti-Thy-1-Konjugate, die 1,4 und 7 Moleküle Ida enthielten, zeigten Antikörper titer von jeweils 1 : 425.000, 1 : 170.000 und 1.130.000, während der nicht-modifizierte Antikörpertiter 1 : 550.000 betrug (Fig. 14). Somit führte die Konjugation an Ida zu einem gewissen Verlust der Antikörperaktivität; es wur den jedoch Konjugate mit weniger als 4 Molekülen Ida pro MoAb für die in vitro und in vivo Untersuchungen eingesetzt. Die Antikörperaktivität für sowohl Ida- anti-Ly-2.1 und Ida-anti-L3T4-Konjugate (Daten nicht ge zeigt) nahm in gleicher Weise mit der Inkorporierung von mehr als 6 Molekülen Ida pro MoAb signifikant ab.

in vitro-Arzneimittelaktivität

Die Cytotoxizität von Ida-MoAb-Konjugaten wurde an ver schieden reaktiven target-Zellen getestet, wobei ein 24-stündiges Assay angewendet wurde und ein Vergleich mit freiem Ida erfolgte. Die Aktivität von freiem Ida war 4 bis 10 mal größer als die von Ida-MoAb-Konjugaten, bei einem I.D.₅₀ (50%ige Inhibierung der [³H]-Thymidin inkorporierung von Kontrollproben) für freies Ida bei 6,6 bis 9,0 × 10^-8 M gegen die getesteten Tumorzellinien. Es war klar, daß Ida-anti-Ly-2.1-Konjugat das cytotoxisch ste Konjugat darstellte (I.D.₅₀ = 4,3 × 10^-7 M) bei einem Test gegen ITT(1)75NS E3-Zellinie, die eine im Hinblick auf Ly-2-Antigen angereicherte Variante der nativen Zell linie darstellt. Um die Selektivität der Konjugatwirkung auf target-Zellen zu bestimmen, wurden Ida-MoAb-Konju gate 3 min lang mit den target-Zellen inkubiert, bevor das nicht-gebundene Konjugat ausgewaschen und die Cyto toxizität bestimmt wurde. Bei Anwendung dieses 30-minü tigen Assays zeigten die nicht-reaktiven Ida-MoAb-Konju gate ein I.D.₅₀, das 10 bis 50 ml größer war als das von freiem Ida, was wiederum zeigt, daß die Antikörper bindung für die Ida-MoAb-Konjugat-Cytotoxizität essentiell ist. Es ist darauf hinzuweisen, daß keiner der bei dieser Untersuchung verwendeten MoAb auf target-Zel len in vitro in Abwesenheit von Komplement eine cyto toxische Wirkung zeigte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.

Tabelle 3

Wirkung von Idarubicin-monoklonalen Antikörper-Konjugaten

Mittleres ID₅₀ auf Tumorzellen¹

Wirkung von Ida-anti-L3T4, Ida-anti-Ly-2.1 und Ida-anti-Thy-1 auf das Überleben von Tumortransplantat

Bei diesen Experimenten wurden Ida-anti-L3T4, Ida-anti- Ly-2.1 und Ida-anti-Thy-1-Konjugate verwendet, um die Überlebenszeit von P388D1-Tumortransplantaten in CBA- Mäusen zu erhöhen, wobei die Allotransplantate den H-2 (Klasse I und II) und Nicht-H-2-Barrieren entgegenge richtet waren (being across).

(a) Kombinierte Konjugat-Behandlung

Gruppen von 10 bis 15 CBA-Mäusen wurde s.c. mit 8,0 × 10⁶ P388D1-Tumorzellen injiziert und erhielten i. v. an den Tagen -1, 0 (= Tag der Tumorinokulation), 3, 5 und 10 eine der folgenden: (i) PBS, (ii) anti-L3T4 und anti-Ly- 2.1, (iii) Ida-anti-L3T4, (iv) Ida-anti-Ly-2.1 und (v) Ida-anti-L3T4 und Ida-anti-Ly-2.1. Die erhaltene Gesamt menge an Ida und MoAb betrug jeweils 125 µg und 575 mg. Die Tumortransplantate von sowohl PBS- und MoAb-behan delten Mäusen überlebten 14 bis 17 Tage mit einer maxi malen mittleren Tumorgröße von 0,31 cm², was zeigt, daß beide nicht-konjugierten MoAb zusammen unfähig waren, L3T4⁺ und Ly-2⁺-Zellen wirksam zu verarmen, so daß das Tumortransplantat überleben konnte (Fig. 6) Außerdem konnten Ida-anti-Ly-2.1 oder Ida-anti-L3T4 allein das Überleben des Transplantats nur verlängern (Tag 20 bis 28) mit maximalen mittleren Tumorgrößen von 0,40 cm² bis 0,50 cm². Es ist wahrscheinlich, daß Ida-anti-Ly-2.1 oder Ida-anti-L3T4 allein nicht alle T-Zellen entfernten und aufgrund einer starken antigenen Wirkung (wie sich dies bei MHC-Unterschieden ergibt) die verbleibenden Ly-2⁺ und L3T4⁺-Zellen zum Wachstums stimuliert wurden und eine Ab stoßung auslösten. Demgegenüber bewirkte eine Kombina tion von sowohl Ida-anti-Ly-2.1 und Ida-anti-L3T4-Konju gaten bei 14/15 P388D1 Tumortransplantaten eine Verhinderung der Abstoßung und eine Zunahme der Größe, bis die Mäuse getötet wurden (Tag 50 - 2,00 cm²). Es wurde festgestellt, daß einige dieser Konjugat-behandelten P388D1-Tumoren in den Tagen 8 bis 16 eine gewissen Größenregression zeig ten; aufgrund einer kontinuierlichen Verarmung der L3T4⁺ und Ly-2⁺-Zellen (Tag 10) kam es zu einem konsistenten Tumorwachstum der P388D1-Tumortransplantate.

(b) Ida-anti-Thy-1-Konjugat

Gruppen von 10 CBA-Mäusen wurde s.c. mit 10⁷ P388D1-Tumor zellen injiziert und erhielten an den Tagen -1, 0, 5 und 6 eine der folgenden i.v.-Behandlungen: (i) PBS, (ii) anti-Thy-1 und (iii) Ida-anti-Thy-1. Die Gesamtmenge an Ida und anti-Thy-1 betrug jeweils 130 µg und 5,4 mg; die Tumortransplantate von PBS-behandelten Mäusen über lebten 15 Tage. anti-Thy-1-MoAb allein führte zu einem 28- bis 32-tägigem Überleben des Tumortransplantats bei einer maximalen mittleren Tumorgröße von 0,58cm² (Tag 6) (Fig. 16). Bei den Ida-anti-Thy-1-behandelten Mäusen wur den 30% der Tumortransplantate bis zum Tag 40 vollstän dig abgestoßen, während die restlichen 70% weiterwuchsen, wodurch schließlich (Tag 32) die mittlere Tumorgröße der Gruppe zunahm. Somit führten Ida-anti-Thy-1, sowie die Kombination von Ida-anti-Ly-2.1 und Ida-anti-L3T4 zu einer Verarmung an Ly-2⁺ und L3T4⁺-Zellen, so daß die Mehrheit der P388D1-Tumortransplantate in CBA-Mäusen in Abwesenheit einer normal schnellen Abstoßungswirkung überlebten.

Beispiel 3

Es wurden Konjugate nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt, und zwar aus Ida und monoklonalem Antikörper 17.1 (Thomson et al, Proc. Natl. Cancer Inst. 70, 409-419 (1983)) Mäuse-IgG2a und aus Ida und monoklo nalem Antikörper 30.6 (Thomson, et al, Br. J. Cancer 47, 595-605 (1983)) Mäuse-IgG2a. Menschliche Colonkarzinom Colo 205-Zellen (30.6⁺, 17,1⁺) wurden s.c. in nackte Mäuse mit 8 × 10⁶ Zellen/Maus inokuliert, wie dies im Beispiel 2 beschrieben ist. Die inokulierten Mäuse wurden dann einer Reihe von i.p.-Behandlungen unterzogen. Die Größe der Tu moren wurde mit einer Schublehre gemessen, wobei entlang der senkrechten Achsen der Tumoren ausgemessen wurde. Die Daten wurden als mittlere Tumorgröße registriert (Produkt von zwei Durchmessern ± Standardfehler). Die Ergebnisse sind in Fig. 17 wiedergegeben.

Beispiel 4

Es wurden Konjugate nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt, und zwar aus lda und monoklonalem Antikörper 17.1, aus Ida und monoklonalem Antikörper JGT-13 (Maus-IgG1, reaktiv mit carcino-embryonischem Antigen auf Coloncarcinom, jedoch nicht mit Gewebe), aus Ida und monoklonalem Antikörper 27.1 (Maus-IgG1, reaktiv mit menschlichem Milchfettglobulantigen auf einer Reihe von Colontumoren) und aus Ida und monoklo nalem Antikörper 30.6. Ein LIM2210 menschliches Colon tumor-Xenotransplantat (1-5 mg) wurde in nackte Mäuse s.c. implantiert. Die implantierten Mäuse wurden dann einer Reihe von i.v.-Behandlungen unterzogen. Die Größe der Tumoren wurde mit einer Schublehre gemessen, wobei entlang den senkrechten Achsen der Tumoren ausgemessen wurde. Die Daten wurden als mittlere Tumorgröße regi striert (Produkt von zwei Durchmessern ± Standardfehler). Die Ergebnisse sind in Fig. 18 wiedergegeben.

Claims

1. Immunoglobulinkonjugat, dadurch gekennzeichnet, daß Idarubicin (Ida) an der C14-Position mit einem für menschliches Neoplasma spezifischen monoklonalen Antikörper oder mit einem Fragment des Antikörpers konjugiert ist, welches mindestens eine der Antigenbindungsstellen umfaßt.

2. Konjugat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß 2 bis 8 Ida-Moleküle kovalent an jedes Antikörpermolekül gebunden sind.

3. Konjugat gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder das Fragment davon für den menschlichen Transferinrezeptor spezifische sind.

4. Konjugat gemäß der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder das Fragment davon spezifisch für Neoplasma der Brust, des Kolons, der Lunge, der Prostata oder der Ovarien sind.

5. Verfahren zur Herstellung eines Immunoglobulinkonjugats gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren die Umsetzung eines 14-Halogen-Ida mit dem monoklonalen Antikörper oder Fragment davon umfaßt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das 14-Halogen-Ida ein 14-Brom-Ida ist.

7. Verfahren gemäß der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

a) das Mischen des Antikörpers oder Fragments davon mit einem molaren Überschuß des 14-Halogen-Idas;
b) das Umsetzen der Mischung bei 18 bis 37°C;
c) das Entfernen jeglichen Niederschlags;
d) das Entfernen nicht umgesetzten Ausgangsmaterials durch Gelfiltration und
e) das Entfernen des adsorbierten Idarubicins durch Adsorptions-Chromatografie oder Ionenaustausch- Chromatografie.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel und als aktiven Bestandteil ein Immunoglobulinkonjugat, wie beansprucht in einem der Ansprüche 1 bis 4.