JPS61155334A - 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 - Google Patents
殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法Info
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- JPS61155334A JPS61155334A JP27465884A JP27465884A JPS61155334A JP S61155334 A JPS61155334 A JP S61155334A JP 27465884 A JP27465884 A JP 27465884A JP 27465884 A JP27465884 A JP 27465884A JP S61155334 A JPS61155334 A JP S61155334A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規な殺細胞性修飾免疫グミプリンとその製造
方法に関する。更に詳しくは、殺すべき細胞（以下標的
細胞という）のもつ特定の抗原と選択的に結合する免疫
グロブリンあるいはその抗原結合部位を含むフラグメン
ト中のカルボキシル基に、アントラサイクリン系物質を
結合せしめて成る新規な殺細胞性免疫グロブリンとその
製造方法に関する。本発明において得られた殺細胞性修
飾免疫グロブリンは、殺すべき標的細胞に対して特異的
増殖抑制活性を有し、従って癌の治療剤として有用であ
る。
方法に関する。更に詳しくは、殺すべき細胞（以下標的
細胞という）のもつ特定の抗原と選択的に結合する免疫
グロブリンあるいはその抗原結合部位を含むフラグメン
ト中のカルボキシル基に、アントラサイクリン系物質を
結合せしめて成る新規な殺細胞性免疫グロブリンとその
製造方法に関する。本発明において得られた殺細胞性修
飾免疫グロブリンは、殺すべき標的細胞に対して特異的
増殖抑制活性を有し、従って癌の治療剤として有用であ
る。
現在までＫ、アントラサイクリン系物質を直接免疫グミ
プリン（結合させる方法としては、ゲルタールアルデヒ
ドを架橋剤とする方法が行われているが（キャンサー書
リサーチ（ＣｅｒｎｃｅｒＲｓｓｅａｒｃｈ） 、
３５巻、 １１７５−１１８１ｊｊ（１９７５年））
、この方法では、多量の高分子アグリゲートの生成をみ
、且つ、架橋剤と免疫グロブリン分子またはアントラサ
イクリン系物質との間に形成されるシック結合が十分な
安定性を有せず、アントラサイクリン系物質が免疫グロ
ブリンから分離し易いという欠点がある。
プリン（結合させる方法としては、ゲルタールアルデヒ
ドを架橋剤とする方法が行われているが（キャンサー書
リサーチ（ＣｅｒｎｃｅｒＲｓｓｅａｒｃｈ） 、
３５巻、 １１７５−１１８１ｊｊ（１９７５年））
、この方法では、多量の高分子アグリゲートの生成をみ
、且つ、架橋剤と免疫グロブリン分子またはアントラサ
イクリン系物質との間に形成されるシック結合が十分な
安定性を有せず、アントラサイクリン系物質が免疫グロ
ブリンから分離し易いという欠点がある。
本発明者らは、これらの問題点のない、アントラサイク
リン系物質の免疫グロブリンへの結合方法を開発すべく
鋭意研究の結果、免疫グロブリン分子を過剰のヒドラジ
ンの存在下、水溶性カルボジイミドで処理するならば、
免疫グロブリン分子のアグリゲート化を抑制しつつ免疫
グロブリンをヒドラジド誘導体に導き得ること、また、
アントラサイクリン系物質をヒドラジド化した免疫グロ
ブリン（作用させると、免疫グロブリン（結合すること
を、またしかして得られる修飾免疫グロブリンは、その
免疫グロブリンとアントラサイクリン系物質間の結合が
適度に安定であり、すぐれた選択的殺細胞能を有するこ
とを知見し、本発明に到達した。
リン系物質の免疫グロブリンへの結合方法を開発すべく
鋭意研究の結果、免疫グロブリン分子を過剰のヒドラジ
ンの存在下、水溶性カルボジイミドで処理するならば、
免疫グロブリン分子のアグリゲート化を抑制しつつ免疫
グロブリンをヒドラジド誘導体に導き得ること、また、
アントラサイクリン系物質をヒドラジド化した免疫グロ
ブリン（作用させると、免疫グロブリン（結合すること
を、またしかして得られる修飾免疫グロブリンは、その
免疫グロブリンとアントラサイクリン系物質間の結合が
適度に安定であり、すぐれた選択的殺細胞能を有するこ
とを知見し、本発明に到達した。
即ち、本発明は一般式〔１〕
で表わされる殺細胞性修飾免疫グロブリン、及び一般式
（Ｉｔ） で表わされるアントラサイクリン系物質ヲ、一般式（１
１１ ％式％（） で表わされる免疫グロブリンまたはそのフラグメントの
ヒドラジド誘導体とを反応させることを特徴とする、一
般式〔１〕で表わされる殺細胞性修飾免疫グロブリンの
製造方法である。
（Ｉｔ） で表わされるアントラサイクリン系物質ヲ、一般式（１
１１ ％式％（） で表わされる免疫グロブリンまたはそのフラグメントの
ヒドラジド誘導体とを反応させることを特徴とする、一
般式〔１〕で表わされる殺細胞性修飾免疫グロブリンの
製造方法である。
式（１）および（ＩＩ）において、Ｒ２およびＲ６は互
に独立に水素原子または有機基を表わし、馬とＲ６が同
時に有機基である場合には、それらは互に連結して環を
形成してもよい。Ｒ，および鳥の有機基としては、アン
トラサイクリン系物質の細胞毒活性と式［ｍ〕で表わさ
れる免疫グロブリンまたはそのフラグメントのヒドラジ
ド誘導体との反応性を著しく損わない限りにおいて特に
制限されず、具体的例として、メチル基、エチル基、２
−ヒドロキシエチル基、ベンジル基。
に独立に水素原子または有機基を表わし、馬とＲ６が同
時に有機基である場合には、それらは互に連結して環を
形成してもよい。Ｒ，および鳥の有機基としては、アン
トラサイクリン系物質の細胞毒活性と式［ｍ〕で表わさ
れる免疫グロブリンまたはそのフラグメントのヒドラジ
ド誘導体との反応性を著しく損わない限りにおいて特に
制限されず、具体的例として、メチル基、エチル基、２
−ヒドロキシエチル基、ベンジル基。
トリフルオロアセチル基等を挙げることができる。また
、Ｒ１およびＲ６が有機基であり、且つ互に連結して環
を形成している場合、馬およびＲｓが結合しているｍｚ
原子を含んだ環構造有機基の具体例として、ビＲリジニ
ル基、４−モルホリニル基、３−シアノ−４−モルホリ
ニル基等を挙げることができる。
、Ｒ１およびＲ６が有機基であり、且つ互に連結して環
を形成している場合、馬およびＲｓが結合しているｍｚ
原子を含んだ環構造有機基の具体例として、ビＲリジニ
ル基、４−モルホリニル基、３−シアノ−４−モルホリ
ニル基等を挙げることができる。
本発明において、免疫グロブリンとは、殺すべき細胞の
もっている特定の抗原と選択的に結合しうる免疫グロブ
リンをいう。かかる免疫グロブリンとしては、例えば、
次の様なものがある。腫瘍細胞で、あるいは特定のリン
パ球等の標的細胞あるいはそれらを含む組織で免疫され
たヒト、サル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、モ
ルモット、ハムスター、ラットマウス等の動物から分離
された抗血清より、エタノール分画、硫安分画、イオン
交換あるいは分子ふるいカラムクロマトグラフィー等の
公知の手段によって調製されるグロブリン（抗体）。ま
た標的細胞で免疫した動物より採取された抗体産生細胞
を発癌性のある物質で癌化させて得られる細胞の培養液
から、あるいは抗体産生細胞を骨髄腫細胞等と細胞融合
させて得られた融合細胞（ハイブリドーマ）から選別さ
れた目的とする抗体産生性のクローンの培養液から、ま
たはこれを動物に接電してその血清または腹腔液からも
本発明の免疫グロブリンを得ることができる。免疫グロ
ブリンには、ＩｇＧ、 ＩｇＡ、 ＩｇＭ、 ＩｇＤ。
もっている特定の抗原と選択的に結合しうる免疫グロブ
リンをいう。かかる免疫グロブリンとしては、例えば、
次の様なものがある。腫瘍細胞で、あるいは特定のリン
パ球等の標的細胞あるいはそれらを含む組織で免疫され
たヒト、サル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、モ
ルモット、ハムスター、ラットマウス等の動物から分離
された抗血清より、エタノール分画、硫安分画、イオン
交換あるいは分子ふるいカラムクロマトグラフィー等の
公知の手段によって調製されるグロブリン（抗体）。ま
た標的細胞で免疫した動物より採取された抗体産生細胞
を発癌性のある物質で癌化させて得られる細胞の培養液
から、あるいは抗体産生細胞を骨髄腫細胞等と細胞融合
させて得られた融合細胞（ハイブリドーマ）から選別さ
れた目的とする抗体産生性のクローンの培養液から、ま
たはこれを動物に接電してその血清または腹腔液からも
本発明の免疫グロブリンを得ることができる。免疫グロ
ブリンには、ＩｇＧ、 ＩｇＡ、 ＩｇＭ、 ＩｇＤ。
ＩｇＥの５種顛があることが知られているが、そのどれ
でも本発明に用いることができる。
でも本発明に用いることができる。
本発明に於いて免疫グロブリンはそのままでも、或いは
抗原と結合し得る部分を含む限りにおいては、その７ラ
グメント（例えば、Ｆａｂ 。
抗原と結合し得る部分を含む限りにおいては、その７ラ
グメント（例えば、Ｆａｂ 。
Ｆａｂ’、Ｆａｂ’の２量体Ｆ（ａｂ’）、）でも用い
ることができる。又、上記の免疫グロブリンをカルボキ
シル基導入剤１９例えば無水コハク酸で処理することＫ
より、新たにカルボキシル基を導入した後に本発明の方
法に使用することもできない。
ることができる。又、上記の免疫グロブリンをカルボキ
シル基導入剤１９例えば無水コハク酸で処理することＫ
より、新たにカルボキシル基を導入した後に本発明の方
法に使用することもできない。
本発明において式［１１）で表わされるアントラサイク
リン系物質の代表例としては、ダウノマイシン、アドリ
アマイシン、４′−エビアドリアマイシン、４’−０−
テトラヒドロピラニルアドリアマイシン、４−デメトキ
シダウノマイシン。
リン系物質の代表例としては、ダウノマイシン、アドリ
アマイシン、４′−エビアドリアマイシン、４’−０−
テトラヒドロピラニルアドリアマイシン、４−デメトキ
シダウノマイシン。
４−デメトキシアドリアマイシン、３′−デアミノ−３
’−（４−モルホリニル）タウ／フィシ／。
’−（４−モルホリニル）タウ／フィシ／。
３′−デアミノ−３’−（３−シアノ−４−モルホリニ
ル）ダウンマイシン、３′−デアミノ−３′−（３−シ
アノ−４−モルホリニル）アドリアマイシン等を挙げる
ことができる。
ル）ダウンマイシン、３′−デアミノ−３′−（３−シ
アノ−４−モルホリニル）アドリアマイシン等を挙げる
ことができる。
本発明の式（Ｉｌｌで表わされる殺細胞性修飾免疫グロ
ブリンの製造は、本発明の他の一部を構成する次の方法
、すなわち、式（ｎ）で表わされるアントラサイクリン
系物質を、式〔■〕で表わされる免疫グロブリンまたは
そのフラグメントのヒドラジド誘導体とを反応させるこ
とにより行われるが、本反応は、免疫グロブリンまたは
そのフラグメントのヒドラジド誘導体のｐＨ４〜１０の
緩徴液の溶液（蛋白濃度は好ましくは０．５へ１００■
／’ １１１ｔに調製する）に、Ｏへ４０℃で攪拌しな
がら、少量の溶媒、例えば、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムア
ミド、メタノール、エタノール、アセトン等に溶かした
アントラサイクリン系物質（好ましくは前者１モルに対
し１〜５０モル）ｔ−添加し、１５分〜１０日間行われ
る。
ブリンの製造は、本発明の他の一部を構成する次の方法
、すなわち、式（ｎ）で表わされるアントラサイクリン
系物質を、式〔■〕で表わされる免疫グロブリンまたは
そのフラグメントのヒドラジド誘導体とを反応させるこ
とにより行われるが、本反応は、免疫グロブリンまたは
そのフラグメントのヒドラジド誘導体のｐＨ４〜１０の
緩徴液の溶液（蛋白濃度は好ましくは０．５へ１００■
／’ １１１ｔに調製する）に、Ｏへ４０℃で攪拌しな
がら、少量の溶媒、例えば、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムア
ミド、メタノール、エタノール、アセトン等に溶かした
アントラサイクリン系物質（好ましくは前者１モルに対
し１〜５０モル）ｔ−添加し、１５分〜１０日間行われ
る。
その後、反応混合物をゲル濾過あるいは透析することに
よって未反応のアントラサイクリン系物質を除き、殺細
胞性修飾免疫グロブリンを精製することができる。
よって未反応のアントラサイクリン系物質を除き、殺細
胞性修飾免疫グロブリンを精製することができる。
なお、本発明方法の原料化合物の一つである。
式（ＩＩＩ）で表わされる免疫グロブリンまたはそのフ
ラグメントのヒドラジド誘導体は、例えば、免疫グロブ
リンまたはそのフラグメントに、水溶性カルボジイミド
である。１−エチル３−（３−ジメチルアミノプロピル
）カルボジイミド塩酸塩の存在下、ヒドラジン水和物を
反応せしめて製造することができる。
ラグメントのヒドラジド誘導体は、例えば、免疫グロブ
リンまたはそのフラグメントに、水溶性カルボジイミド
である。１−エチル３−（３−ジメチルアミノプロピル
）カルボジイミド塩酸塩の存在下、ヒドラジン水和物を
反応せしめて製造することができる。
次に、本発ＦＩＡｔ−より詳しく説明するために、参考
例、実施例を以下に記載するが、本発明はもとより、こ
れらに限定されるものではない。
例、実施例を以下に記載するが、本発明はもとより、こ
れらに限定されるものではない。
参考例Ｉ
マウスモノクロナル抗ＭＭ４６免疫グロブリンの精製
マウスの乳癌細胞ＭＭ４６に対するマウスのモノクロプ
ル抗体ＩｇＧ２ａ産生性のハイブリドーマ（瀬戸ら、ジ
ャーナルオン１ムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ）第１２８巻、第２０１ページ、
１９８２年参照） ’ｋ ＢＡＬＢ／ ｅ ヌードマウ
スに移植し、１０日後その腹水液を得た。
ル抗体ＩｇＧ２ａ産生性のハイブリドーマ（瀬戸ら、ジ
ャーナルオン１ムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ）第１２８巻、第２０１ページ、
１９８２年参照） ’ｋ ＢＡＬＢ／ ｅ ヌードマウ
スに移植し、１０日後その腹水液を得た。
こうして得られた１ｉＩｔ７に液３ｏ−を０．１ Ｍリ
ン酸緩衝液、ＰＨ８，０に透析した後、同緩衝液に平衡
化したプロティンＡセファロースＣＬ−４Ｂカラム（１
，５Ｘ２２ａｓ）にかけた。同緩衝液でカラムを充分洗
浄し、次に、０．１ Ｍクエン酸緩衝液ＰＨ５，５で非
特異的免疫グロブリンを溶出した後、０．１ Ｍクエン
醸綬衝液、ｐＨ４，５で目的とするマウスモノクロナル
抗ＭＭ４６抗体ＩｇＧ２ａ（６０曙）を溶出した。溶出
した抗体は、５０％飽和硫安により沈澱させ、少量の０
．９％塩化ナトリウム溶ｉ［Ｋ再浴解した後、０．１
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐ）ｌ
７．５ （以下、緩衝液Ａと省略する）に充分透析し
た０実施例Ｉ Ｉ ｇＧ２ ａ ＋ ＮＨＮＨ，→Ｉ ｇＧ（Ｃ０ＮＨ
ＮＨ，）ｍイ）殺細胞性修飾免疫グロブリンの製造■
ヒドラジド化抗体の製造 上記参考例Ｉにおいて精製された、マウスモノクローナ
ル抗体抗ＭＭ４６ ＩｇＧ２ａ 抗体を、Ｏ，１４Ｍ塩
化ナトリウム溶液に充分透析して得られた抗体溶液（９
，０７■／−）０．３３−に、５Ｍヒドラジン溶液（Ｐ
Ｈ５，６）０．１−と水０．５７ｔＲｔを加えてＣＭ終
濃度Ｉ ｇＧ ５ ｑ／ｌｄ、０．５Ｍヒドラジン溶液
ＰＨ５，６）よく攪拌した。＊溶性カルボジイミド （ＥＤＣＩ と表わす）溶液（７，５■、／−）を作
製後、ただちに２の４３ｎｌｆ抗体溶液に攪拌下に滴下
し、４°Ｃ″Ｃ１２〜１８時間放置し反応させた。反応
液金、次に、０．１４Ｍ塩化ナト１７ウム尋液で平衝化
されているセファデックスＧ−２５カラム（１，２Ｘ３
４備）にとおし、ヒドラジド化抗体溶液２．２ ｄ （
１，２■／−）を得た。
ン酸緩衝液、ＰＨ８，０に透析した後、同緩衝液に平衡
化したプロティンＡセファロースＣＬ−４Ｂカラム（１
，５Ｘ２２ａｓ）にかけた。同緩衝液でカラムを充分洗
浄し、次に、０．１ Ｍクエン酸緩衝液ＰＨ５，５で非
特異的免疫グロブリンを溶出した後、０．１ Ｍクエン
醸綬衝液、ｐＨ４，５で目的とするマウスモノクロナル
抗ＭＭ４６抗体ＩｇＧ２ａ（６０曙）を溶出した。溶出
した抗体は、５０％飽和硫安により沈澱させ、少量の０
．９％塩化ナトリウム溶ｉ［Ｋ再浴解した後、０．１
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐ）ｌ
７．５ （以下、緩衝液Ａと省略する）に充分透析し
た０実施例Ｉ Ｉ ｇＧ２ ａ ＋ ＮＨＮＨ，→Ｉ ｇＧ（Ｃ０ＮＨ
ＮＨ，）ｍイ）殺細胞性修飾免疫グロブリンの製造■
ヒドラジド化抗体の製造 上記参考例Ｉにおいて精製された、マウスモノクローナ
ル抗体抗ＭＭ４６ ＩｇＧ２ａ 抗体を、Ｏ，１４Ｍ塩
化ナトリウム溶液に充分透析して得られた抗体溶液（９
，０７■／−）０．３３−に、５Ｍヒドラジン溶液（Ｐ
Ｈ５，６）０．１−と水０．５７ｔＲｔを加えてＣＭ終
濃度Ｉ ｇＧ ５ ｑ／ｌｄ、０．５Ｍヒドラジン溶液
ＰＨ５，６）よく攪拌した。＊溶性カルボジイミド （ＥＤＣＩ と表わす）溶液（７，５■、／−）を作
製後、ただちに２の４３ｎｌｆ抗体溶液に攪拌下に滴下
し、４°Ｃ″Ｃ１２〜１８時間放置し反応させた。反応
液金、次に、０．１４Ｍ塩化ナト１７ウム尋液で平衝化
されているセファデックスＧ−２５カラム（１，２Ｘ３
４備）にとおし、ヒドラジド化抗体溶液２．２ ｄ （
１，２■／−）を得た。
■ アドリアマインン複合体の製造
ヒドラジド化抗体１Ｃ１■／−の濃度ＫＯ，１４Ｍ１Ｊ
化ナトリウムで調製後、ミＩＪボアフィルターに通し、
その溶液ＩＩ＋１／に水に溶かしたアドリ゛Ｔマイシン
（ＡＭと省略する） （１２，１ｔＩｍａ１ｇａｍ／
） １２．４ ｍｌ （抗体に対して３０倍量）ｔ−加
えて、２３℃で３日間〜７日間放置し反応させ、０．１
４ Ｍ塩化ナトリウム溶液で平衡化されているセファデ
ックスＧ−２５カラムで未反応のＡＭを分離し、高分子
分画に求めるＡＭ複合体２．０ｄｔ−得た。組成は抗Ｍ
Ｍ４６ＩｇＧ２ａ ０．２ｍｇ／ｍ１． ＡＭｌ、３
ｎｍｏｌｅ／ｍｌ！で抗体一分子当り１．１分子のＡＭ
が結合していた。この組成については、ＡＭは特異吸収
４９５ ｎｍ、抗体は蛋白の吸収２８０ ｎｍの吸光度
より濃度を決定した。
化ナトリウムで調製後、ミＩＪボアフィルターに通し、
その溶液ＩＩ＋１／に水に溶かしたアドリ゛Ｔマイシン
（ＡＭと省略する） （１２，１ｔＩｍａ１ｇａｍ／
） １２．４ ｍｌ （抗体に対して３０倍量）ｔ−加
えて、２３℃で３日間〜７日間放置し反応させ、０．１
４ Ｍ塩化ナトリウム溶液で平衡化されているセファデ
ックスＧ−２５カラムで未反応のＡＭを分離し、高分子
分画に求めるＡＭ複合体２．０ｄｔ−得た。組成は抗Ｍ
Ｍ４６ＩｇＧ２ａ ０．２ｍｇ／ｍ１． ＡＭｌ、３
ｎｍｏｌｅ／ｍｌ！で抗体一分子当り１．１分子のＡＭ
が結合していた。この組成については、ＡＭは特異吸収
４９５ ｎｍ、抗体は蛋白の吸収２８０ ｎｍの吸光度
より濃度を決定した。
口）殺細胞性修飾免疫グロブリンのｉｎ ｙｉｔｒ。
癌細胞増殖抑制活性の測定
マウス乳癌ＭＭ４６のｉｎ ｖｉｔｒｏ 培養細胞に
対し、上記イ）で製造した殺細胞性修飾免疫グロブリン
を、ＡＭ相当の濃度で０〜０ 、８ ｎｍｏｌｅ／−に
なるように添加して７２時間培養後、トリバンプルー染
色法により生細胞数を顕微鏡下Ｋ １ｌｌｌ定した。こ
の時、比較として、ＭＭ４６細胞に対して何ら特異的な
親和性全もだない無関係の蛋白質であるウサギ免疫グロ
ブリンを、上記イ）と同様にしてウサギＩｇＧ−ヒドラ
ゾンーＡＭ複合体を製造し用いた。第１図よりウサギＩ
ｇＧ−ヒドラゾンーＡＭ複合体く修飾非特異的免疫グロ
ブリン）はほとんど活性ｔ 示すナイＫ ＋１ カカワ
ラス、ＭＭ４６ｍｊｉ！に’ＴＩ異的な親和性をもつ抗
体を使用して製造された抗ＭＭ４６ ＩｇＧ２ ｍ−ヒ
ドラジド−ＡＭ複合体（本発明の殺細胞性修飾免疫グロ
ブリン）は濃度依存性の強い増殖抑制が認められ、この
修飾免疫グロブリンがその標的細胞であるＭＭ４６１１
胞１ｃ４１異的に障害を与えたことがわかる。尚、培養
条件は、以下の通りであった。
対し、上記イ）で製造した殺細胞性修飾免疫グロブリン
を、ＡＭ相当の濃度で０〜０ 、８ ｎｍｏｌｅ／−に
なるように添加して７２時間培養後、トリバンプルー染
色法により生細胞数を顕微鏡下Ｋ １ｌｌｌ定した。こ
の時、比較として、ＭＭ４６細胞に対して何ら特異的な
親和性全もだない無関係の蛋白質であるウサギ免疫グロ
ブリンを、上記イ）と同様にしてウサギＩｇＧ−ヒドラ
ゾンーＡＭ複合体を製造し用いた。第１図よりウサギＩ
ｇＧ−ヒドラゾンーＡＭ複合体く修飾非特異的免疫グロ
ブリン）はほとんど活性ｔ 示すナイＫ ＋１ カカワ
ラス、ＭＭ４６ｍｊｉ！に’ＴＩ異的な親和性をもつ抗
体を使用して製造された抗ＭＭ４６ ＩｇＧ２ ｍ−ヒ
ドラジド−ＡＭ複合体（本発明の殺細胞性修飾免疫グロ
ブリン）は濃度依存性の強い増殖抑制が認められ、この
修飾免疫グロブリンがその標的細胞であるＭＭ４６１１
胞１ｃ４１異的に障害を与えたことがわかる。尚、培養
条件は、以下の通りであった。
培養条件
実施例２
イ）殺細胞性修飾免疫グロブリンの製造■ サクシニル
化抗体の製造 参考例１において精製されたマウスモノクローナル抗体
抗ＭＭ４６ＩｇＧ２ｍ抗体を、０．２Ｍリン酸緩衝液％
７．６ Ｋ透析し、その抗体溶液（２０■／ゴ）１．
０Ｗ１ｔに無水フハク酸の１Ｍジメチルホルムアミド溶
液１３．３■／を攪拌下に添加し、反応液の州を７．２
〜７．６にコントａ−ルしながら室温で１時間反応させ
た。反応液を、ｌｏｍＭ’Ｊン酸緩衝液（ＰＨ７，０）
−０，１４Ｍ塩化ナトリウムの溶液で平衡化されている
セファデックスＧ−２５カラム（Ｉ Ｘ ３０ ｃｍ
）にかけ、低分子の未反応無水コ・・り酸等を除き、高
分子分画にサクシニル化抗体（８，０■／−）２．２−
を得た＠ ■ サクシニル・ヒドラジド化抗体の製造上記で得られ
たサクシニル化抗体を、 ０．１４Ｍ塩化ナトリウム溶液に充分透析したのち、サ
クシニル化抗体溶液（７■／−）！、０ＷｔＫ、５Ｍヒ
ドラジン（ＰＨ５，６）溶液０．１−と水１０．１８６
−加えてよく攪拌した。
化抗体の製造 参考例１において精製されたマウスモノクローナル抗体
抗ＭＭ４６ＩｇＧ２ｍ抗体を、０．２Ｍリン酸緩衝液％
７．６ Ｋ透析し、その抗体溶液（２０■／ゴ）１．
０Ｗ１ｔに無水フハク酸の１Ｍジメチルホルムアミド溶
液１３．３■／を攪拌下に添加し、反応液の州を７．２
〜７．６にコントａ−ルしながら室温で１時間反応させ
た。反応液を、ｌｏｍＭ’Ｊン酸緩衝液（ＰＨ７，０）
−０，１４Ｍ塩化ナトリウムの溶液で平衡化されている
セファデックスＧ−２５カラム（Ｉ Ｘ ３０ ｃｍ
）にかけ、低分子の未反応無水コ・・り酸等を除き、高
分子分画にサクシニル化抗体（８，０■／−）２．２−
を得た＠ ■ サクシニル・ヒドラジド化抗体の製造上記で得られ
たサクシニル化抗体を、 ０．１４Ｍ塩化ナトリウム溶液に充分透析したのち、サ
クシニル化抗体溶液（７■／−）！、０ＷｔＫ、５Ｍヒ
ドラジン（ＰＨ５，６）溶液０．１−と水１０．１８６
−加えてよく攪拌した。
ＥＤＣＩ溶液（７，５■／−）を作製後、ただちにその
４３μｔｙ＜サクシニル化抗体溶液に攪拌下漬下し、４
℃で１２時間〜１８時間反応させた。反応液は、０．１
４ Ｍ塩化力トリウムで平衡化されたセファデックスＧ
−２５カラム（Ｉ Ｘ ３０ ｃｓ ）を通してサクシ
ニルヒドラジド化抗体（２，６■／ ｖｔｔ ） ２．
０−を得た＠ ■ ダウノマイシン複合体の製造 サクシニル・ヒドラジド化抗体を１■／ゴになるように
０．１４Ｍ塩化ナトリウムで調製し、ミリポアフィルタ
−で滅菌後、１．０−のこの抗体溶液に水に溶かしたダ
ウノマイシン（ＤＭ） （１２，１ａｍｏｌｅ／１ｎｔ
） １２．４μ！（この抗体に対して３０倍量）を攪拌
下に加えて、２３℃で３日〜７日間放置し反応させた。
４３μｔｙ＜サクシニル化抗体溶液に攪拌下漬下し、４
℃で１２時間〜１８時間反応させた。反応液は、０．１
４ Ｍ塩化力トリウムで平衡化されたセファデックスＧ
−２５カラム（Ｉ Ｘ ３０ ｃｓ ）を通してサクシ
ニルヒドラジド化抗体（２，６■／ ｖｔｔ ） ２．
０−を得た＠ ■ ダウノマイシン複合体の製造 サクシニル・ヒドラジド化抗体を１■／ゴになるように
０．１４Ｍ塩化ナトリウムで調製し、ミリポアフィルタ
−で滅菌後、１．０−のこの抗体溶液に水に溶かしたダ
ウノマイシン（ＤＭ） （１２，１ａｍｏｌｅ／１ｎｔ
） １２．４μ！（この抗体に対して３０倍量）を攪拌
下に加えて、２３℃で３日〜７日間放置し反応させた。
さらにこの反応液を、０．１４Ｍ塩化ナトリウムで平衡
化されているセファデックスＧ−２５カラムＫかゆ、未
反応のダウノマイシンと分離し、高分子分画にサクシニ
ル化抗ＭＭ４６ ＩｇＧ２ａ−ヒト２シン−〇Ｍ複合体
２．０−を得た。ダウノマイシンの１！＃異的吸収４８
５ｎｍ、蛋、白の吸収２８０ｎｍの吸光度よｊ５ＩｇＧ
とＤＭの濃度を決定したところ、ＩｇＧｏ、２ｍｇ／ｄ
、ＤＭｌ、６ ｎｍｏｌｅ／１Ｒ１゜であった。
化されているセファデックスＧ−２５カラムＫかゆ、未
反応のダウノマイシンと分離し、高分子分画にサクシニ
ル化抗ＭＭ４６ ＩｇＧ２ａ−ヒト２シン−〇Ｍ複合体
２．０−を得た。ダウノマイシンの１！＃異的吸収４８
５ｎｍ、蛋、白の吸収２８０ｎｍの吸光度よｊ５ＩｇＧ
とＤＭの濃度を決定したところ、ＩｇＧｏ、２ｍｇ／ｄ
、ＤＭｌ、６ ｎｍｏｌｅ／１Ｒ１゜であった。
第１図は、本発明の殺細胞性修飾免疫グロブリンのマウ
ス乳癌ＭＭ４６細胞に対する障害活性を示す図である。
ス乳癌ＭＭ４６細胞に対する障害活性を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、一般式〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔 I 〕 〔式中、Ａｂは免疫グロブリンまたは、そのフラグメン
トを表わしＡｂに隣接して示 されているＣＯは免疫グロブリンまたはそ のフラグメントに固有又は導入された カルボキシル基に由来するカルボニル基 を表わす。Ｒ＿１は水素原子またはメトキシ基を、Ｒ＿
２およびＲ＿３は互に独立に水素原子または水酸基を、
Ｒ＿４は、Ｒ＿３が水素原子のときは水酸基または２−
テトラヒドロピ ラノキシ基を、Ｒ＿３が水酸基のときは水素原子を表わ
す。Ｒ＿５およびＲ＿６は互に独立に水素原子または有
機基を表わし、Ｒ＿５とＲ＿６が同時に有機基である場
合には、それら は互に連結して環を形成してもよい。ｎ は１〜１５の整数を表わす。〕 で表わされる殺細胞性修飾免疫グロブリン ２、式〔 I 〕において、Ｒ＿１がメトキシ基、Ｒ＿２
およびＲ＿３が水素原子、Ｒ＿４が水酸基である、特許
請求の範囲第１項記載の殺細胞性修飾免疫グロブリン。 ３、式〔 I 〕において、Ｒ＿１がメトキシ基、Ｒ＿２
およびＲ＿４が水酸基、Ｒ＿３が水素原子である、特許
請求の範囲第１項記載の殺細胞性修飾免疫グロブリン。 ４、一般式〔II〕 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔II〕 式中、Ｒ＿１は水素原子またはメトキシ基をＲ＿２およ
びＲ＿３は互に独立に水素原子または水酸基を、Ｒ＿４
は、Ｒ＿３が水素原子のときは水酸基または２−テトラ
ヒドロピラノキ シ基を、Ｒ＿３が水酸基のときは水素原子を表わす。Ｒ
＿５およびＲ＿６は互に独立に水素原子または有機基を
表わし、Ｒ＿５とＲ＿６が同時に有機基である場合には
、それらは互に 連結して環を形成してもよい。 で表わされるアントラサイクリン系物質を 一般式〔III〕 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔III〕 〔式中、Ａｂは免疫グロブリンまたは、そのフラグメン
トを表わし、Ａｂに隣接して示 されているＣＯは免疫グロブリンまたはそ のフラグメントに固有の、又は導入され たカルボキシル基に由来するカルボニル 基を表わす。〕 で表わされる免疫グロブリンまたはそのフラグメントの
ヒドラジド誘導体とを反応させることを特徴とする、一
般式〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔Ｉ〕 〔式中、Ａｂは免疫グロブリンまたは、そのフラグメン
トを表わし、Ａｂに隣接して示 されているＣＯは免疫グロブリンまたはそ のフラグメントに固有の、又は導入され たカルボキシル基に由来するカルボニル 基を表わす。Ｒ＿１は水素原子またはメトキシ基を、Ｒ
＿２およびＲ＿３は互に独立に水素原子または水酸基を
、Ｒ＿４は、Ｒ＿３が水素原子のときは水酸基または２
−テトラヒドロ ピラノキシ基を、Ｒ＿３が水酸基のときは水素原子を表
わす。Ｒ＿５およびＲ＿６は互に独立に水素原子または
有機基を表わし、Ｒ＿５とＲ＿６が同時に有機基である
場合には、それらは互に連結して環を形成してもよい。 ｎは１〜１５の整数を表わす。 で表わされる殺細胞性修飾免疫グロブリンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27465884A JPS61155334A (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27465884A JPS61155334A (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61155334A true JPS61155334A (ja) | 1986-07-15 |
Family
ID=17544754
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27465884A Pending JPS61155334A (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61155334A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0294294A2 (en) * | 1987-06-05 | 1988-12-07 | Cytogen Corporation | Amine derivatives of anthracycline antibiotics |
| US5122368A (en) * | 1988-02-11 | 1992-06-16 | Bristol-Myers Squibb Company | Anthracycline conjugates having a novel linker and methods for their production |
| US5798097A (en) * | 1987-03-11 | 1998-08-25 | Pharmacia & Upjohn S.P.A. | Immunogobulin conjugates |
-
1984
- 1984-12-28 JP JP27465884A patent/JPS61155334A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5798097A (en) * | 1987-03-11 | 1998-08-25 | Pharmacia & Upjohn S.P.A. | Immunogobulin conjugates |
| EP0294294A2 (en) * | 1987-06-05 | 1988-12-07 | Cytogen Corporation | Amine derivatives of anthracycline antibiotics |
| US5122368A (en) * | 1988-02-11 | 1992-06-16 | Bristol-Myers Squibb Company | Anthracycline conjugates having a novel linker and methods for their production |
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