JPS59116232A - 細胞毒性複合体及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な細胞毒性複合体とその製造法に関する。

更に詳しくは、殺すべき細胞（以下標的細胞という）の
もつ特定の抗原と特異的に結合しうる免疫グロブリン、
あるいはその抗原結合部位を含むフラグメントからなる
構成部分と、細胞毒性物質を結合した重合体からなる構
成部分を有する、新規な細胞毒性複合体とその製造方法
に関するものである。本発明で得られる細胞毒性複合体
は、例えば、ガン細胞に選択的に作用を発現する抗Ｍ！
瘍剤として有用である。

ある種の細胞だけを選択的に殺すことを目的として、そ
の標的細胞と特異的に結合しうる免疫グロブリンな種々
の細胞毒性物質と結合させる試みがなされてきた。例え
ば、免疫グロプリク ンｖｃ　ｐ−ｖ（２−りａ　Ｏエチル）　７　ミ／　　
Ｌ＝フェニルアラニン等を結合した複合体（特開昭５１
−６１６４０号）、免疫グロブリンにメトトレキ＝−ト
等を結合した複合体（特開昭５６−６５８２９号）、免
役グロブリンにりσラムグシル等を結付した複合体（特
開昭５６−６５８２８号）。

免疫クロプリンにマイトマイシン−Ｃ等を結合した複合
体（特開昭５５−９２３２５号）、免疫グロブリンにダ
ウ／マイシンを結合した複合体（特開昭５１−１４４７
２３号）等が公知である。

更に、特開昭５１−１２６２８１号には、抗腫瘍免疫グ
ロブリンと、１分子当り制ガン剤を５〜５００分子共有
結合している重合体担体（例えば、ポリグルタミン酸）
を、アミド結合によって結合さセて抗腫瘍剤を得たこと
が開示されている。

これらの方法で得られた細胞毒性複合体は、１ＩＩｒ！
瘍細胞と選択的に結合し腫瘍細胞に密性を発揮すること
が期待されるものであり、非常に興味のある薬剤である
。しかしながら細胞毒性物質を直接免疫グロブリンに結
合する場合は、免疫グロブリンに多数の細胞毒性物質を
結合すると、免疫グロブリンの抗原認識活性が低下して
しまうので、かかる困難を回避するためには、少数の細
胞毒性物質を結合するにとどめざるをえない。

一方、重合体を細胞毒性物質の担体として用いる場合は
、上記の端点な改善することができると考えられる。し
かし、特開昭５１−１２６２８１号記載の方法は、重合
体担体に多数の細胞毒性物質を結合する反応と、重合体
−制ガン剤結合体に免疫グｒｆｆ、７’　ＩＪンを結合
する反応が同一な反応のため、多数の免役グープリンが
重合体担体に結合してしまい、そのため得られる複合体
が均一なものとなり得ないのみならず、治療剤として用
いるのが不適当な高分子！物質も含む、といった問題を
生じるのである。

本発明者等は、かかる先行技術の欠点を解決すべく鋭意
研究を行なった結果、免疫グープリンとの結合反応１／
ｃ供する反応基を１コだけ含有し、かつ、それとは異な
る、細胞離性物質を結合するにめの、反応基を多数言む
重せ体担体？用意し、先づ多数の反応基によって多数の
細胞感性物質を該重せ体担体に結付した後に、免疫グロ
ブリンとの反応基によって免疫グロブリンと結むすイ）
、とい５手頭を踏むことに上れば、治療剤として用いる
のか不適当な高分子物質を含まず、かつ、多数の細胞損
性物質を結合した免役グロブリンー細胞毒性物質複合体
を製造し得ることを見い出し、不発明に到達した。

すなわち、本発明は殺すべき細胞σ）もっている特定の
抗原と特異的に結合し得る免疫クロプリンまたはそのフ
ラグメントと、細胞感性物質をその側鎖に結合し、反応
性基をその末端含有するアミノ酸１合体とを共有結合さ
せてなる細胞毒性複合体、並びにその製造法である。

本発明ＶＣ％いて、殺すべき細胞のもっている特定の抗
原と特異的に結合Ｌ’）る免疫クロ７“リン（細胞毒性
蛋白複合体の誘導部）とは次のようなものである。腫瘍
細胞あるいは特定のりンバ球等の標的細胞あるいはそれ
らを含む組織で免疫されたヒト、サル、ウマ、ウン、ヤ
ギ、ヒツジ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラット
、マウス等の動物から分離された抗血清より、エタノー
ル分画、体安分画、イオン交換あるいは分子篩カラムク
ロマトグラフィー等の公知σ）手段によって調製される
免疫クコプリン・あるいは標的細胞で免疫した動物より
採取された抗体産生細胞を発癌性のある物質で癌化させ
たり、ミエローマ細胞と融合させて／Ｘイブリドーマに
したりすることによって得られるモノクロナルな抗体を
いう。また標的細胞に結合した免疫グロブリンを界面活
性剤等で分離して得られる、標的細胞に特異的な免疫グ
ープリンも本発明の免疫グロブリンに含まれる。

免疫グログリンにはＩｇＧ＋　ＩｇＡ＋　ＩｇＭ＋　Ｉ
ｇＤ＋　ＩｇＨの５つのクラスが知られており、さらに
谷クラスはいくつかのサブクラスθ）ら成っていること
、が知られている。しかし、その基本構造は、２本の重
鎖と２本の軽鎖とから成る点、また抗原結合部位をもつ
Ｆａｂ部分とエフェクター活性をもつＦｃ部分から成る
点において一致している。

ただし、ＩｇＭは５量体、　　ＩｇＡは一部２量体で存
在する。

細胞毒性蛋白複合体の誘導部としては、免疫グロブリン
分子全体を用いてもよいが、その抗原結合部位を含むが
、Ｆｃ部分をもたないフラグメントを用いてもよい。Ｆ
ｃ部分を含む複合体にあっては、Ｆｃ部分による標的細
胞以外の細胞に対する非特異的吸着及び細胞膜上のＦｃ
　Ｕモノクロとの結合が起こり、細胞毒性蛋白複合体の
殺すべき細胞に対する選択性が減じることがあり、また
免疫グロブリンがヒトにとって異種蛋白である場合、そ
の抗原性は、Ｆｃ部分において特に強いので、蛋白複合
体の抗原性を低下させるために、　Ｆｃ部分のない免疫
グロブリンのフラグメン１−が、細胞毒性蛋白複合体の
誘導部として望ましいことがある。一般に、免疫グロブ
リンをバ／：イン（ｐａｐａｉｎ）　＋　　）リブジノ
（ｔｒｙｐｓｉｎ）、キモト１）プシン（ｃｈｙｍｏｔ
ｒｙｐｓｉｎ）　＋　プラスミン（ｐｌａｓｍｉｎ）　
　等の蛋白分解酵素で分解すると、抗原結合部分を１つ
もつ、いわゆるＦａｂフラグメントが得られる。またベ
プンン（ｐｅｐｓｉｎ）分解−条件によってはトリプシ
ン分解によっても抗原結合部分？２つもつ、いわゆるＦ
（ａｂ’）２フラグメントが得られる。このフラグメン
トはさらにメルカプタンで処理すると、−価のＦａｂ’
フラグメントになる。さらに免疫グロブリンを変性させ
つつ分解させると抗原結合部分（バリアプル・リージョ
ンｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ　）のみが得られる
。

免疫グロブリン及び免役グロブリン由来の例えば上記の
７ラグメノトは、免疫グープリンがいかなるクラス、サ
グクラスであれ、いずれも本発明の蛋白複合体の誘導部
として用いることができる。

本発明の免疫グロブリンまたはその７ラグメントと、細
胞毒性物質を結合せしめた重合体を共有結合させてなる
細胞毒性複合体の中では、その製造、Ｓ製及び活性上、
下記式（１）Ｙ ・・・・・−・・・・・・・・・・・・　〔１）で表わ
される複合体が好ましいが、さらに下記で表わされる複
合体、並びに下記式（ｍ）で表わされる複合体が特に好
ましい。

式（ＩＪで表わされる細胞毒性複合体に２いて、Ｙは分
子中にアミ７基又はイミノ基を含む、細胞毒性物質の７
ミノ基又はイミノ基反ＬＣ′）残基を表わす。本発明に
おける訓胞毒性物質とは、そのままの状態で細胞に心性
を発揮する物質、あるいはそのままでは毒性を発揮しな
いｎ″−１生体内で細胞に４性を発揮し得る物質に転換
し得る物質をいう。これらの例としては、 ｐ　−（Ｎ、Ｎ−ビス（２−クロロエチル）〕フエニＶ
ンジアミン ｐ−（ビス（２−クロロエチル）７ミノ〕Ｌ−フェニル
アラニン（メルフアラン）Ｈ ■−（β−ｐ−７ラビノフラノシル）シトシンまたはそ
のモノホスフェート Ｈ２ Ｈ ｚ　−〔ｓ’　−（２−７ミノエチルホスホリル）−β
−Ｄ−アラビノフラノシル」シトシン２−アミン−Ｎ　
　（ｐ−ヒス（２−クロロエチル）７ミノ〕フェニル−
３−ヒトＯキシ−２−ヒドロキソメナルブロビオンアミ
ＮＨ。

メトトレキセート ＣＨ，ＣＨ。

アドリアマイシンＤ マイトマイシンＣ Ｘ＝Ｈ、ダウノマイシン Ｘ＝ＯＨ、アドリアマイシン 等を挙げることができるが、これらに限られるものでは
ない。

Ｚは水素原子又は１価の陽イオン、例えばＮａ＋＋に＋
＋ＮＨ，十である。

Ｗは２価の有機基を表わし、本発明の原料として用いる
反応性重合体を得る過程で何ら反応に関与しない不活性
な基である限り特に限定されない。これらの基としては
、例えば、２−アミノプロピオン酸残基（−ＣＨ２ＣＨ
２→のｍｌき直鎖の、あるいはＮ−ベンゾイルシスティ
ン残基キレン基、４−メルカプト安息香酸残基Ｃ−Ｑ−
Ｊの如き置換基を有しない、あるいは置換基を有するフ
ェニレン基が挙げられるが、炭素数１〜４のアルキレン
基が特に好ましい。Ｒ，はα−アミノ酸のα位側鎖又は
その誘導体（但しカルボキシル基を有する基は除く）で
あり、例えばα−アミノ酸がグリシンの場合はＲ，＝Ｈ
，アラニ／の場合はＲ，＝ＣＨ３，フェニルアラニンの
場合はＩン＋”ＣＨｔ−Ｑ、セリンの場合はＲ，＝ＣＨ
２０Ｈである。

式（ｉＪの複合体に１６いて、かかるα−アミノ酸から
なる単位は、細胞毒性物質との結合には何ら関与しない
が、複合体の脂溶性や水溶性、あるいは細胞膜との親和
性等を調節するのに役立つものである。従って、脂溶性
や水溶性の調節が格別に必要ない場合には、かかるα−
アミノ酸単位を含有しないものの方（式〔ｌ〕において
ｑ−０）が実用的に有利である。

ｍは１〜４の整数を表わすが、好ましいのはｍが１又は
２の場合である。なお、式り目で表わされる複曾体とし
ては、例えば、ｍ＝１のものとｍ＝２のものが混在して
いる様な本合体も含む。

ｎは細胞毒性物質が結合した構成単位の数を表わし、ｐ
は細胞毒性物質が結合していない構成単位の数を表わし
、ｑは側鎖にカルホキシル基を有しないα−アミノ酸単
位（側鎖は修飾されていてもよい）の数を表わすが、こ
れらの単位の重合体中での配列状態は任意である。即ち
、式ＣＩ〕においては、便宜上プｐツ久重合体の如く表
わしであるが、これに限られるものではなく、通常の方
法で得られるものはランダム配列の重合体である。ｎ＝
５〜１５００．好ましくは１０〜５００であり、ｐ＝＝
Ｑ〜１５００．好ｆＬ＜は０〜５００であり、ｑ＝ｏ〜
１５００゜好ましくはｑ＝Ｑ〜５０υである。

Ｓｌは細胞毒性物質な結合した反応性重合体−トの子オ
ール基又は活性ジスルフィド基に由来する憾黄Ｊｊル子
を表１つす。

Ｂ１は２価の有機基を表わすが、これは細胞毒性物質を
結合した反応性車合体を免疫グｏ　７’　ｌ）／牙たは
そのフラグメントと結合する際に、ｉ訂もつ℃免疫グｏ
　７’　ＩＪン又はそのフラグメントに導入する、架橋
剤に由来する残基な表わす力）、あるいは免疫グロブリ
ンまたをまそσ）フラグメントに所属する千オール基に
由来する硫黄原子を表わす。

上記式（ｎ＋にＳいてｔ２−０σ）場合に（ま、Ｓ、を
ま免疫グロブリンまたはそのフラグメントに由来する硫
黄原子であり、ｔ２−＝１の場合に＋１架橋斉１１によ
り導入された硫黄原子である。式〔■〕においてｔ、＝
００場合には、硫黄原子Ｓ、とＳ、ｉま直接結合しジス
ルフィド基を形成する。

一方ｔ、＝１の場合には、硫黄原子Ｓ、と８２４’！、
２儲の有機基Ｂ３を介して結合するが、Ｂ、は千オール
基と反応する２個の官能基を有する架橋剤、例えば下記
式（［３ 〔式〔■〕においてＢ、は２価σ〕イ】機基である。〕
で表わされる架橋剤ある（・＋−１ペン・）゛・−ノン
ニ［Ｉ］来する２価の有機基である。式ＬＬＩにｉ６１
するＢ。

は、例えばＦ記式しＸ〕、 Ｘ−３−Ｂ、−Ｃ−Ｙ　　　　　・・・・　・・・・・
・−・−〔Ｘ〕で表わされる架橋剤、Ｆ記式ＣＭ）、 Ｘ−５−Ｂ、−Ｃ−Ｚ　　　　　・・・・・・・・・・
・・・・・・・・（Ｘ［〕１ ＮＨ・ＨＱ で表わされる架橋剤、下記式り店」 で表わされる架橋剤（２−イきノチオラクトン〕下記式
（Ｘｌｌ＋　、］・ で表わされる架橋剤（Ｎ−アセチルホモシスティン）、
で表わされる架橋剤に由来する２価の有機基である。

Ｘで表わされる、結合している硫黄原子と共に活性ジス
ルフィド基を形成し得る１価の有機基の具体例としては
、例えば２−ピリジルチオ基（’Ｑ）−３−）　、　４
−ビ１じルチオ基＜　Ｎｐ−５−）。

３−カルボキシ−４−二トロフェニルチオ基只００Ｈ （０２Ｎ−○−３−）、４−カルボキシ−２−ビリＢ、
またはＢ６で表わされる２価の／ｆ機基は、化学的に不
活性であれば特に限定されないが、一般的には分岐を有
するか有しないアルキレン基。

フェニレン基等から適宜選ばれる。Ｙで表わされる活性
エステルのアルコール残基の具体例としては２．４−ジ
ニトロフェノキシ基 仏Ｎ わされるイミドエステルのアルコール残基の具体例とし
てはメトキシ、エトキシ基等を挙げることができる。Ｑ
で表わされるハロゲン原子の具体例としては塩素、果素
等を挙げることｂ−できる。

架橋剤υ）Ｊ４体例としては、式〔■］で表わされる架
橋剤として、Ｉｆ　ＮＩＮ’　−、（１，２−フェニン
を、式Ｃａｌで表わされる架橋剤として、Ｎ−サクシン
イミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ−１・
、Ｎ−サクンンイミ、ジル３　（Ｂ４−ジニトロフェノ
キン）ブチレートを、式（ＸＩ）で表わされる架橋剤と
して、メチル３−（２−ピリジルジチオ）プロピ丁ンイ
ミデートｉＭ酸塩な挙げることができる。

上記式ｊｉｌＢ　ｙ　ｔ６イーｃ　Ｂ、＋ｔ、例りばＦ
　ｉｉｅ　式シＸＪＶ］、で表わされる、マレイミド基
を有する架橋剤に由来する２ｉＩＩＩｉの有機基である
。Ｂ７で表わされる２価の有機基は、化学的に不活性で
あれば特に限定されないが、一般的には分枝を有するか
有しないアルキレン基、フェニレン基等かう適宜選ばれ
る。

〔刈■」で表わされる架橋剤の具体例としては、例えば
メタ−（Ｎ−マレイミド）安息香酸Ｎ−ヒドロキシサク
シンイミドエステル ）’　）　安息（ｆ　Ｗ　２，４−ジニトロフェニルエ
ステル、β−（Ｎ−マンイミ　ド）プロピオン酸Ｎ−ヒ
ドロキノザクンノイミドエステル等を挙ケルコトができ
る。

本発明の細胞毒性複合体は、免疫グロブリンまたはその
フラグリフトと、細胞毒性物質を結合せしめた反応性重
合体を、共有結合させることにより製造することができ
る。例えば、本発明の細胞毒性複合体の内式（ＩＩ−１
）で表わされる複合体は、例えば、発生または４人した
チオール基を・１イする上記式〔■〕 Ａｈ　（−（Ｂ２　）　ｔ２ｓ２町ｖｚ　　　・・・・
−−−−・ａｖ〕で表わされる免疫グロブリンまたはそ
のフラグメントと、下記式ＣＶＩ ・・・・−・・・・−・・・・ＣＶ） で表わされる細胞宿性物質を結合し、かつ分子末端に活
性ジスルフィド基を有する反応性重合体とを反応せしめ
るが、または、誘導または導入した活性ジスルフィド基
を有する下記式［［ＪＡｂモ（Ｂ２　）　ｔ２ｓ２Ｘ　
Ｊ　ｖ　’　　　　　””””””””””叩　　し■
〕で表わされる免疫グロブリンまたはそのフラグメント
と、下記式し■〕 ・・・・・・・・−・・・−・・〔■ｊで表わされる、
細胞毒性物質を結付しかつ分子末端に千オール基を有す
る反応性重合体とを反応せしめることにより製造するこ
とができる。

前記式ＣＩＶＪにおいて、ｔ２＝０の場合には、式〔■
」で表わされる免疫グロブリンまたはその７ラグメント
は、Ｆａｂ　’、ＩｇＭより得られる一量体１ｇＭ５に
よって代表される如くそれ自体チオール基を有するか、
またはジスルフィド基より発生せしめた千オール基を有
する免疫グロブリンまたはそのフラグメントである。ｔ
２＝ｉである式［ＩＶ）で表わされる導入されたチオー
ル基を有する免疫グロブリンまたはそのフラグメントは
、例えば免疫グロブ１；ンまたはそのフラグメントに前
記式〔Ｘ）または（Ｘ［Ｊで表わされる架橋剤を反応さ
せた後、導入された活性ジスルフィド基より還元操作に
より千オール基を発生せしめるか、または、免疫グロブ
リンまたはそのフラグメントに前記式〔刈〕または（Ｘ
ｔＵ）で表わされる架橋剤を反応させることにより製造
することができる。

上記式［［Ｊにおいて、ｔ２＝０の場盆には、かかる活
性ジスルフィド基を有する免疫グロブリンまたはそのフ
ラグメントは、例えば、それ自体のまたは発生せしめた
千オール基を有する免疫グロブリンまたはそのフラグメ
ントに活性ジスルフィド基導入剤を作用させることによ
り製造することができる。

上記の目的に用いることができる活性ジスルフィド化合
物としては、例えば２−ピリジルジルフィト（Ｎ’ＩＪ
Ｓ−３−（）Ｊ　）　、　５　、５　’−ジチオビス（
２−ニトロ安息香酸） ２−　ヒ！Ｉ　シルシスルア　イ）’　（ＨＯＯＣＱ−
５Ｓ　Ｄ−ＣＯＯＨ）、Ｎ−オキシ−２−ピリジルスル
フィド０ ２−ベノゾチアゾイルジスルフイト エニルアミノーＮ′−フェニルイミノメチルジスことが
できる。

また、前述のＦ（ａｂ’）、　　のヒンジ部分のジスル
フ・ｒド結合を、例えば亜硫酸イオンによりスルホ化分
解して分子中にＳ−スルホ基（−Ｓ−ＳＯ，）を有する
Ｆａｂ’を得ることができるが、この物も、式〔■〕で
表わされる細胞毒性物質を結合した反応性重合体と好適
に反応して、式（Ｉｆ−ＩＪで表わされる細胞毒性複合
体を生成する。

式〔■〕または〔■〕で表わされる細胞毒性物質を結合
した反応性重合体の製造方法については後述する。

また、本発明の細胞毒性複合体の内式〔ｎ−工」で表わ
される複合体は、例えば、前記式［ｊで表わされる発生
または導入したチオール基を有する免疫グロブリンまた
はそのフラグメントと、前記式〔■〕で表わされる細胞
毒性物質を結合した反応性重合体を、チオール基と反応
し得る官能基を２個有する架橋剤を用いて結合すること
により製造することができる。本反応を行なう場合は、
２段階の反応として行なうのが好ましい。即ち、最初に
、式ＣＩＶＪで表わされる発生または導入した千オール
基を有する免疫グロブリンまたはそのフラグメントか、
或いは式〔■〕で表わされる細胞毒性物質を結合した反
応性重合体に、過剰の、例えば式（■Ｊで表わされる架
橋剤を反応させ、精製処理をほどこした後、得られた中
間体に他方の蛋白を作用せしめる。以上の反応手順によ
り、目的とする式〔■−２〕で表わされる細胞毒性複合
体な得ることができる。

さらに、本発明の細胞毒性複合体の内式（ＩＩＩＪで表
わされる複合体は、例えば、上記式しνＩ」で表わされ
る細胞毒性物質を結合した反応性重合体と、ト記式〔■
Ｊ （） で表わされる導入されたマレイミド基をもつ免疫グロブ
リンまたはそのフラグメントを反応せしめることにより
製造することができる。

上記式〔■わで表わされる導入されたマレイミド基をも
つ免疫グロブリンまたはそのフラグメントは、例えば、
免疫グロブリンまたはそのフラグメントに前記式ＣＸＩ
ＶＪで表わされるマレイミド基を有する架橋剤を反応せ
しめることにより製造することができる。

次に、本発明の原料として用いられる前記式〔Ｖ）また
はい１〕で表わされる細胞毒性物質を結合した反応性重
合体の製造方法についで述べる。

かかる細胞毒性物質を結合した反応性重合体は各種の方
法により製造できるが、例ボすれば以−ドの通りである
。

例えば、式［Ｖ）又、ｌ旨′■」で表わされる細胞毒性
物質を結合した反応性重合体にＢいて、ｎ１＝２、ｑ”
Ｏ，Ｗご−ＣＨ２ＣＨ２Ｃｏ　、　Ｘ二（ン−ｓ−，ｙ
　＝タウノマイシン残基、Ｚ＝Ｎａの場合を用いて製造
方法を説明すれば先づ、親水性重合体であるポリ−Ｌ−
グルタミン酸（ナトリウム塩＞ＶＣ水溶液中、室温下に
Ｎ−ザクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネートＬ−グルタミン酸のアミノ末端［３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオニル基が導入される。

即ち、 さらに＃製工程を経て得られた、活性ジスルフイＦ＆を
末端に含ゼするボ’Ｊ　−Ｌ−グルタミン酸（すｌ−１
）ラム、Ｉａ）に、水溶液中室温下に水溶性カルボジイ
ミドの存在下ダウンマイシンを反応せしめれば、ダウン
マイシンを側鎖に結合し、活性ジスルフィド基を末端に
含有する式（Ｖ）に相当する反応性重合体が得られる３
、即ち、（タウ／マイシン塩酸塩／水溶性カルボジイミ
ド）さらに活性ジスルフィド基を、例えば、２−メルカ
プトエタノールを作用して還元的に切断すれば、ダウン
マイシンを側鎖に結合し、チオール基を末端に含有する
、式〔■〕に相当する反応性重合体を得ることができる
。即ち、 本発明の細胞毒性複合体の製造方法を例示すれば次の通
りである。

＋１＋　　式ＣＩＶＪで表わされる発生または導入した
チオール基を有する免疫グロブリンまたはそのフラグメ
ントと、式〔■〕で表わされる細胞毒性物質を結合しか
つ分子末端に活性ジスルンイド基を有する反応性重合体
を反応させる力・、式［）で表わされる活性ジスノしフ
ィト基を・汀する免役グロブリンまたはそσ）フラグメ
ントと式〔ν■〕で表わされる細胞毒性物質な結合した
反応性重合体を反応させる方法。

これらの方法にＲいては、式Ｌ　＋ｖ　Ｊで表わされる
チオール基を有する免疫グログ１ノンまたはそのフラグ
メント１七ルに対し、式〔■］で表わされる細胞付性物
質を結付した活性ンスルフイド基な有する反応性重合体
キな０．３〜２０モルの割合で使用するのが好ましし・
。反応は、蛋白ｉ６よび重合体をｐＨケ〜１０の緩衝ｔ
Ｌｖｃ’＝計の濃度がｏ、ｓ　〜１ｏ　ｏ　−／　ｍｌ
　（より好ましくは１〜２０　ｒｒｂ９／ｍｌ　）　Ｖ
Ｃなるように混じ、０〜６０℃で静置、もしくは反応混
液と同じｐＨの緩衝液に対し透析することにより行なう
ことができる。反応時間は反応スケール、反応条件によ
るが、一般には４時間〜３日間である。得られた細胞毒
性複合体の、反応混合物からの分離、精製は通常用いら
れる操作、例えば透析１分子ふるいのカラムクロマドグ
シフイーによって行なうことができる。

（２）　　式ＵＪで表わされるチオール基を有する免疫
グロブリンまたはそのフラグメントと、式（Ｖ＋Ｕで表
わされる細胞毒性物質を結合しかつ分子末端にチオール
基を有する反応性重合体とを、両者の千オール基と反応
しうる前述した式（ＩＸＪの架橋剤を用いて結合する方
法。

この方法において、反応は千オール基を有する免疫グロ
ブリンまたはそのフラグメント。

架橋剤、ａ胞毒性物質を結合したチオール基な有する反
応性重合体三者を同時に接触させて行なうこともできる
が、好ましくはどちらか一方の蛋白に架橋剤を反応させ
た後、次いで、その生成物に他方を反応せしめることに
より製造させる。まず架橋剤を反応させる蛋白又は反応
性重合体１モルに対し、好ましくは、架橋剤及び他方の
蛋白又は反応性重合体がそれぞれ０．８〜５０モル、０
．８〜１０モル用いられる。反応はヱず、千オール基を
有する免役グロブリンまたはそのフラグメント或いは細
胞毒性物質を結合した反応性重合体のｐＨ６〜ｌＯの緩
衝液の溶液（蛋白及び重合体の濃度は好ましくは０．５
〜１００　ｍｌ　／　ｍｌ　。

より好ましくは１〜２０　ｍｊＪ　／　ｍｌに調製する
）に、０〜６０“Ｃで撹拌しながら、少量の溶媒、例え
ば、　Ｎ、Ｎ’−ジメチルホルムアミド、ジメチルスル
ホキシド、１，２−ジメトキシエタン、メタノール、エ
タノール、アセトン等に溶かした架橋剤を添加して行な
われる。次いで、透析ま１こは分子ふるいのカラムクロ
マトグラフィーにより、未反応の架橋剤を除いた後、も
つ一方の舐白又は重合体ｐＨ９〜１０の緩衝液の溶液（
好ましい蛋白によびｊＦ重合体濃度の範囲は上に記載し
たのと同じである）。

を添加して、０〜６０゛Ｇで反応せしめる。上記方法（
（より−Ｃ、＋４られる細胞毒性複合体の、反応混合物
からの分離、精製は通常用いられる操作１例えば分子ふ
るいのカラムクロマトグラフィーによって行なうことが
できる。

（，３）　　式い・■〕で表わされる細胞毒性物質を結
合した反応性重合体と式〔■〕で表わされる導入された
７１／イきド基をもつ免疫グロブリンまたはその７ラグ
メントを反応さ一忙る方法。

この方法においては、式〔ＭＩｌ〕で表わされる導入さ
れたマレイミド基をもつ免疫グロブリンまたはそのフラ
グメント１モルに対し、式〔〜Ｉ　Ｊで表わされろ細胞
毒性物質な結合した反応性重合体を０．３〜１０モルの
割合で使用するのがＧましい。反応は、蛋白又は重合体
をｐＨζ〜１０の緩衝液に合計の蛋白及び重合体の濃度
がｏ、５〜ｔ　ｏ　ｏｍ、９／ｍｌ（より好ましくは１
〜２０−／　ｒ＋Ｊ　）になるように混じ、０〜６０℃
で静置して行なうことができる。反応時間は反応スケー
ル、反応条件によるが、一般には４時間〜３日間である
。４られた細胞与件複合体・の、反応混合物からの分離
、精製は通常用いられる操作、例えば透析２分子ふるい
のカラムクロマトグラフ１−によって行１、［うことか
できる。

以下実施例により本発明を詳述する。

β考例 は）　抗マウス白血病Ｌ１２１０１ｇＧ　の洲製マウス
白血病Ｌ１２１ｏＭＢ胞ｔ　ｘ　ｔｏｅ個をフロイント
児全アジュバントとのエマルジョンとし、尿先に静ル尺
注射した。その後更に、１週間間隔で３回、それぞれ約
Ｉ　Ｘ　１０’個のＬ１２１０細胞゛？−ｒシュハンド
と共に皮Ｆ注射し、最終投与１ヨから８１」後に採皿し
た。得られた血液をプールし、血清を分離し、その血清
を５６℃、７３０分間加熱、非動化した。こうして得ら
れた抗Ｌ１２１０血清２００　ｍｌに、硫安の飽和水溶
液２０ＯｍＪな加えて、生じた沈澱な遠心分離によって
分取した。この沈澱を０．ＯＩＭＩＪン酸緩衝液（ｐｌ
（７，６ン５０ｍ１ｌに溶解し、更に同緩衝液に対して
十分な透析した。二の透析内液を同じ緩ｉｉで平衡化し
たＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフィー（カラ
ムサイズ３　ｃｍ　Ｘ　９４　ＣｒｒＬ）にかけて、未
吸着分面として抗ＬＩ２１ｏＩｇＧを含む溶液を得た。

（ロ）　免疫グロブリンよりＦ（ａｂ’）ｔ　　フラグ
メントの分離 上記ｑンのｙ目くして得られた抗Ｌ１２１０１ｇＧの＋
、２ｙを０．１Ｍ酢酸緩衝Ｗ　（ｐＨ４，５）　４０　
ｍｌ　ＫＭ解し、２４吋のペプシンを添加して、３７℃
で約１８時間分解した後、分解生成物を生理食塩水中で
セファデックスＧ２００カラムクロマトグラフイー（カ
ラムサイズ３．５ＣＴＬ×１４ｏｃｆｒＬ）にかけて、
分子量約１０万のところに流出する蛋白として純粋なＦ
（ａｂ’）２　フラグメントを得た。

←９　Ｆａｂ′フラグメントの調製 」１記（ロ）の如くして得られたＦ（ａｂ’）２フラグ
メント１８．４ｒｎ！ｉｔを含む０．０１　Ｍ　）リス
・塩酸−０，１４Ｍ塩化ナトリウム−２ｍＭＥＤＴＡ溶
液（ｐＨ８，３）　２．０　ｍｌに、１５０ｍＭの２−
メルカプトエタノール水溶液を０．０２ｍＪ加えて、３
７℃で１時間還元した。反応後、その溶液を５ｍＭ酢酸
緩衝液−０，１４Ｍ塩化ナトリウム−１ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ
　Ａ浴液（ｐＨ５，５）　（以下、ＡＮＥ緩備液と略す
）で平衡化したセファデックスＧ２５カラムクロマトグ
ラフイー（１，Ｏｃ！ｒＬＸ　２０ｃｍ　）にかけて２
−メルカプトエタノールを除去し、チオール基１個を有
するＦａｂ’フラグメントを得た。

（匂　ＩｇＭの精製 （イ）の如くして、得られた抗Ｌ１２１０抗血清１００
ｍＪＫ飽和硫安１００ｍＡ！を添加し、生じた沈澱を遠
心分離した。沈澱の少量を０．９係塩化カリウム水溶液
に溶解し、遠心して生じた不溶物を除いたのち、０．９
　％塩化ナトリウム水溶液で平衡化したセファデックＧ
−２ｏｏ力ラムクロストダラフィー（２，２に１１　Ｘ
　Ｉ　０２　ｃｍ　）にかけ、第１ピークにＩｇＭ画分
なえた。得られたＩｇＭ画分に同容積の飽和硫安を加え
、生じた沈澱を遠心分離した後、少量の０．９％塩化ナ
トリウム水溶液に溶かし、同じ溶液に対し充分に透析し
た。

（ホ）　ＩｇＭｓの調製 ０．９チ塩化すｌ−ＩＪウム水溶液に溶解したウサギＩ
ｇＭ　（９，５ｍｌ　／　ｍｌ　）　１　、ｓ　ｍｌに
、ＩＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，６）に溶解した０、
２　Ｍシスティン０．２ｍｌを混合し、室温で１６時時
間光した後、セファデックスＧ　−２５（０，８Ｘ　４
３（ｚ）を用いるゲルｍＡ（溶媒は緩衝液Ａ）により、
過剰のシスティンを除いた。

（へ）　ラットのα−フェトプロティンに特異的な免疫
グロブリンの調製 精製したラットのα−フェトプロティン（以下ＡＦＰと
省略する）１ｍｌを、フロイント完全アジュバントとの
エマルジョンとし、馬に週１回皮下注射して、過免疫と
した。この馬から採血し、血清を分離した。血清を硫安
分画し、ラットＡＦＰを結合したセファロース６Ｂカラ
ムを使用するアフィニテイクロマトグラフィー、Ｒよび
セファデックスＧ−２００を使用するゲル濾過等により
精製し、純粋な抗うッ）ＡＦＰ馬免疫グａプリンを得た
。

（ト）　　側鎖にタウノマイシンを結合し、末端に２−
ピリジルジチオ基又は千オール基を含有スルポリ−Ｌ−
グルタミン酸の製造。

ポリ−Ｌ−グルタミン酸のナトリウム塩２２６．５ｍ７
の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）　（
１５ｍｌ　）中溶液に、Ｎ−ザクシイミジル３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオネート（以下５ＰＤＰと省略
する）　６８．８−のエタノール（６Ｈｔｌ）溶液を攪
拌下、２度に分けて加え、１．５時間室温下に反応させ
た。反応液をセロファン透析チューブに入れ、０．ＯＩ
Ｍｌｊノ酸緩衝液（ｐＨ７，５）　ＩＣ対して４°で２
日間透析した後（低分子物を除去−）回収液（５０ｍｌ
）に、ジチオスレイトール１７ｍＪｉの０．１　Ｍ　Ｉ
Ｊン酸ナトリウム（ｐＨ６，０）緩衝液２．０ｍ１Ｉ中
溶液を加え、室温ドレこ８０分間反応させた。次いで塩
酸酸性とし、生じた沈澱を遠心分離した。得られたポリ
−Ｌ−グルタミン酸の、沈澱物（末端に千オール基を有
するボＩＪ　−Ｌ−グルタミン酸（１）と有しないポリ
〜Ｌ−グルタミン虚な含む。）は、０．０１　ＮＨＣＪ
！’で洗浄した。

一方、チオプロピルセファロース誓６Ｂゲル（Ｔｈ１ｏ
ｐｒｏｐｙｌ　５ｅｐｈａｒｓｅ　＠　６　Ｂ　、　７
アルマシア社製　）１５ｍｌを、０．１　Ｍ　リン酸ナ
ト　リ　ラム　（ｐＨ６，０）１ｍＭエチレンジアミン
テトラ酢酸（以後ＥＤＴＡと省略する）　（ｐＨｓ、ｏ
　）緩衝液４０ｍ１！に分散し、得られた分散溶液に、
前記で得られたポリ　Ｌ−グルタミン酸を同一緩衝液１
０ｍＪに溶解して得られる溶液な加え、室温下、窒素雰
囲気中でゆるやかに１夜攪拌した。これで末端ニチオー
ル基を有スるボＩＪ　　Ｌ−グルタミン酸が樹脂に結合
する。次いで樹脂を日別し、０．０１ＭＩＪン酸緩衝液
ｐＨ７，５で充分洗浄した。

か（して得られた樹脂を０．１Ｍ）！ｊスス−酸−１ｍ
ＭＥＤＥＡ　（ｐＨ８，５）緩衝液５０ｍ１ｌに分散し
２−メルカプトエタノール１．１７　、ｌｉｔを加え、
室温上窒素雰囲気中で１０時間ゆるやかに攪拌した。こ
れで末端がチオール基のポＩＪ　　Ｌ−グルタミン酸（
１）が樹脂から遊離する。

樹脂を濾別し、０．０１　Ｍ　トリス−塩酸−〇’−１
ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐＨ８，５）緩衝液でよく洗
浄し、次いで濾液と洗液を水冷下塩酸でｐ　ＨＬ、Ｓと
し、生じた末端に千オール基を有するポリ−Ｌ−グルタ
ミン酸の沈澱を遠心分離した。

得られた沈澱を、再び０−４　Ｍ　ＩＪン酸すトリウム
−１ｍＭＥ　ＤＴＡ　（ｐ　Ｈ７，５）緩衝液１　ｍｌ
に溶解し、得られた溶液を２−ピリジルジスルフィド（
以下２−ＰＤＳと省略する）２３−のエタノール（４ｍ
ｌ　）溶液を０．Ｉ　Ｍリン酸ナトリウム−１ｍＭＥＤ
ＴＡ（ｐＨ６，０）　　１０ｍ１ＴＩＣ加えて得られた
溶液に加え、室温Ｆで３０分間反応させた後、（ポＩＪ
　−Ｌ−グルタミン酸の末端が活性ジスルフィド基とな
る）反応液をセロファンチュ゛−プに入れ、ｏ、ｏ　Ｉ
　Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，５）緩衝液に対して６
時間、純れに対して、１日透析した。回収液を減圧で３
０ｙｙＩＪに減少し、送結乾燥すると中性≠≠墳福、末
端［２−ピリジルジチオ基が導入されたポＩＪ−Ｌ−グ
ルタミン酸（ナトリウム塩〕（２）の綿状固体３５．４
ｍ＆が得られた（車量収率１５．６受）。

一定撒のサンプルを精秤しく　１．ｓ　９５ｒＪ　）　
。

３．００ｍ１の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝＊（ｐＨ
７，２）に溶解し、ジチオスレイトールの小りを加え、
遊離した２−メルカプトピリジンに出来する吸収（３４
３ｎｍ、（分子吸光係数〕ε＝８０８０）を測定した（
Ａ＝０．２８６）。精秤されたサンプル中の末端基量は
０．１０６２μｍｏｌｅ。

従って、同ザンブル中の末端活性ジスルフィド含有ボＩ
Ｊ　−Ｌ−グルタミン酸分子の分子鎗は１７．８　Ｑ　
Ｑ、又、同分子中のグルタミン酸（ナトリウム塩）のユ
ニ７ト数は、１ユニツトの質量数が１５１であることよ
り、１１８と計算された。

次いで、末端に２−ピリジルジチオ基を含有するポリ−
Ｌ−グルタミン酸（ナトリウム塩）（分子蓋ｚ　７，８
　ｏ’　ｏ　）　２　ｓｍ　＜　１．４ｏｐｍｏ＋ｅ＞
を、５％食塩水６ｍｌに溶解し、ダウノマイシン塩酸塩
１１．２−と、１−エチル−３−（３−ジメ千ルアミノ
プロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下ＥＤｃｔ、Ｈｃ
ｌ　と省略する）　３８．１■を加え、室温下にて一皮
反応した。反応液をセロファン千ユーズに入れ、水に対
して４０で充分透析し、回収液な減圧で１０．５ｍ４に
濃縮すると、目的物である末端に２−ピリジル今オ基を
含有し、側鎖にダウノマイシンを結合したＰＬＧＡ（ナ
トリウム塩）蝮の水溶液が得られた。４９０ｎｍ吸収よ
り結合したダウノマイシンの量を、前記（ト）の場合と
同様にして、ジチオスレイトールを砲加して遊離する２
−メルカプトピリジンに由来する３　４３　ｎｍの吸収
により、末端基量なそれぞれ足置すると、以下の結果を
得た。ダウノマイシン３ｉ　１．１６　Ｘ　１０−’　
ｍｏ　ｌｅ　、末端基量１−３６Ｘ　１０〜６、ＰＬＧ
Ａ鎖に結合したダウンマイシンの数は秤均８．５３個、
ＰＬＧＡの回収車は９７係。

実施例Ｉ Ｊ−に＋　　マレイミド基な導入した免疫グミプリンの
調製、診考例（へ）のごとき手段で得られた抗ＡＦＰ馬
免疫グロブリン（ＩｇＧ　）　３７．４■を言む０．Ｉ
Ｍリン酸Ｍ衝液（ｐｉ４６．５　）１．６０ｍＡ’に、
Ｎ−ヒドロキシサクンンイミジルーｍ−マレイミ　ドベ
ンゾエート（以下ＳＭＢと省略する）　１．５７■を溶
解したＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下ＤＭＦと省
略する）Ｏ，］ｍＪを添加し、室温で３０分反応させた
。これにＩ　Ｍ　ト１７ス塩酸緩衝液（ｐＨ６−９）を
５０μｌ加えて反応を止めた後、反応液をセファデック
スＧ−２５のカラム（ｏ、８Ｘ　４２ｃｒｎ　）。（５
ｍＭ酢酸緩衝液−０，１４Ｍ塩化ナトリウム（以下Ｎａ
Ｃ１と省略）−１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（以下Ｅ
ＤＴＡと省略）　（ｐＨ５，５”）　）に通し、過剰の
試薬を除くと、マレイミド基ヲ導入された抗ＡＦＰ馬Ｉ
ｇＧを會む溶液２．９６ｍ１が得られた。

１−（ロ）　マンイミド基を導入した免疫グｏ　７’　
＋）　７（１−１）と、千オール基を末端に含有し側鎖
にダウノマイシンを結合したボＩＪ−Ｌ−グルタメート
（’ｔ−ｚ）との反応による、細胞毒性複合体（１−３
）の製造。

Ｃｏ−Ｙ、　　　ＣＯ２Ｎａ −Ｚ ｃ、ｉ（、Ｃ，Ｈ。

ＣＩＨ，Ｃ，Ｈ・ 叩　　　Ｃ０２Ｎａ Ｙ。

−３ 上記１−ｋｌの如くして得られたｒｌｌ　−−−ＩＦレ
イミドベンツ゛イル基を導入されたＩｇＧ（１−Ａ）２
９．４Ｉｎｇ’に−ａ’む溶液（５ｍＭ［ｎ酸緩衝液−
ｏ、１４ＭＮａＣ１−１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ５，５）　
）　２．９６ｍ１Ｖｃ参考例（ト）のごとくして得られ
た、末端に千オール基ヲ含有し側鎖にダウノマイシンを
結合したポリ−Ｌ−グルタミン酸（ナトリウム塩）（１
−２）（末端チオール基相当３．ｓｓｘｌｏ−７ｍｏ＋
ｅ／ｍｌ）を含む、５ｍＭ酢酸緩衝液−ｏ、１４ＭＮａ
ＣＡ！１ｍＭＥＤＴＡ（ｐｉ（５，５）５、ｏ５ｍｌ及
び０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６，５）２．０ｍｌを加え
、４ｏで１夜反応させた。こうして得られた複合体（１
−３）Ｉｃ、等容積の５０％飽和硫安溶液を加え、５分
後遠心分離した。生じた沈＃Ｋ、１０　ｍ　Ｍ　ＩＪン
酸緩衝液−０，１４ＭＮａＣ１（ｐＨ７，４）　４　ｍ
ｌを加えて溶解した後、同緩衝液に光分透析した。

ｌ−（ハ）　ラ叫肝癌ＡＨ６６ａ胞に対する複せ体（１
−３）の細胞毒性。

上記１−（ロ）のごとくして得られた複合体１〜３の、
標的細胞ＡＨ６６に対・する細胞毒性を検討した。

９６穴の培養プレートに、Ｉ　Ｘ　１０３個のＡＨ’＋
６細胞を含む、１ｏ％馬血清を添加したイーグルＭＥＭ
培地を分注し、更に種々の被検サンプルを加えて、全量
を０．２ｍｌとし、５％ＣＯ２雰囲気下、３７″′會で
４８時間培養後、トリバンブルー染色法により生細胞数
を測定した。培養は３系列行ない、値はその平均値で示
した。結果を第−表に示した。

第１表 第１表から、本発明の細胞毒性複合体 （ム７）は、ラット肝癌ＡＨ６６細胞に対し著しい細胞
毒性を示していることがわかる。

実施例２ −（イ）　活性チオール基を導入したＩｇＧの調製。

参考例（イ）の如くして得られた、ＩｇＧ　２０■を含
む０．１　Ｍ　！Ｉン酸緩衝液（ｏ、１Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む、ｐＨ７，５）４ｄに、Ｎ−サクシンイミジル
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートの５ｍＭエ
タノール溶液１００μｌを添加し、時々攪拌しながら室
温３０分反応させた。次いで、上記緩衝液で平衡化した
セファデックスＧ−２５のカラム（０，８ｃＩｎＸ　４
　ｏｃＩｎ）にその反応液をかけ、過剰の試薬を除去し
た。こうして１分子当り１．９ケの３−（２−ピリジル
）ジチオプロピオニル基を含むＩｇＧが得られた。

〜（Ｃ１１ジチオプロピオニルＩｇＧ　（２−え）と、
チオール基を有しマイトマイシンＣを結合したポリーＬ
−グルタメート（２−２）との反応による、細胞毒性複
合体（２−口の製造。

（２−１） ６Ｈ２６Ｈ２ さ０　　　　　６０２Ｎ８ ’　　（１−３） 上記（イ）の如くして得られた３−（２−ピリジル）ジ
チオプロピオニルＩｇＧ　（２−ｊ　）２．８１ｎ９を
含む溶液２．５ｍｌに、チオール基を有し、マイトマイ
シンＣを結合したポリーＬ−グルタメート（２−２）の
溶液（末端ＳＨ相当５，３　Ｘ　１ｏ　’　ｍｏｌｅ／
ｍｌ）　４０　ｐｌＪ添加し、室温で１６時間反応させ
た。用いた緩衝液は上記（イ）と同じである。こうして
得られた複合体（２−３）は、限外ろ適法により濃縮し
、０．９係塩化ナトＩＪウム溶液に透析した。

２−（ハ）　Ｌ１２１０細胞に対する複合体の細胞毒性
上記（ロ）の如くして得られた複合体（？−土）の、標
的細胞Ｌ１２１０に対する細胞毒性を検討した。

２４穴の培養プレートに、５　Ｘ　Ｉ　０４個のＬ１２
１０細胞を含むＲＰＭ１１６４０培地（１０飴牛脂児血
清、２０μＭの２−メルカプト−エタノールとｏ、１ｍ
ｙ／ｍｌのカナマイシンを含む）０．９１ｎｌを分注し
、更に種々の濃度の被検サンプル０．１　ｍｌを加え、
５　％　Ｃｏ２雰囲気下で３７℃で４８時間培養後、ト
リバンブルー染色法により生細胞数を測定した。

その結果、第２表に示す如く、複合体 （２−え）は、標的細胞Ｌ１２１０に対し濃度依存的に
、著しい細胞増殖抑制効果を示した。尚、培養は２系列
行い、値はその平均で示した。

第２表 実施例３ ３−ビ）　マレイミド基を導入したＦ（ａｂ′）２の調
製参考例（ロ）の如（して得られたＦ（ａｂ’）２１０
〜を含むｔｏｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）１．１４
　ｍ１Ｖｃ、　Ｎ−ヒドロキシザクシンイミジル−ｍ−
マレイミドベンゾエート０．４２■ヲ含むＮ、Ｎ−ンメ
チルホルムアミド０．０５ｐｌを添加し、室温で４０分
反応させた。反応後は、セファデックスＧ−２５のカラ
ム（１ｃｒｎＸ３０ｃｎ、緩衝液は上に同じを用いて過
剰の試薬を除き、ｍ−７１フイミドベンゾイル基を導入
したＦ（ａｂ’）２の溶液な得た。

３−（ロ）　ｍ−マレイミドベンゾイル基を導入したＦ
（ａｂ’）２（３−走）と、チオール基を有しメルフア
ランを結合したボＩＪ−Ｌ−グルタメートーＬ−アラニ
ン共重合体（３−２）との反応による、細胞毒性複合体
（３−゛う）の製造。

） Ｕ、（Ｊ　　　　ＣＯ・Ｎａ ３ 上記（イ）の如くして得られたｍ−マンイミドベンゾイ
ル基の導入されたＦ（ａｂ’）２（３−１）　４．７〜
を含む溶液４．０ｍｌに、千オール基を有し、メルクア
ランを結合したポリ〜Ｌ−グルタノートーＬ−アラニン
共重合体（３−２）（末端ＳＨ相当１．６　Ｘ　１０−
７ｍｏｌｅ　／ａｔ　）　　を含む上記（イ）のリン酸
緩衝液の溶液０．４０℃ノを添加し、４°Ｃで１６時間
反応させた。こうして得ら−れた複合体（３−見）は、
限外ろ過により濃縮し、０，９％塩化ナトリウム溶液に
透析した。

３−←→　Ｌ、　１２１０細胞に対する複合体の細胞毒
性上記３−（ｏ＋の如くして得られた複合体（３二口の
標的細胞Ｌ１２１０に対する細胞毒性を検討した。

遠心管に、５Ｘ１０’個のＬ１２１０細胞を含むＲＰＭ
工１６４０培地（１０チ牛脂児血清。

２０μＭの２−メルカプトエタノールと０．１ｒｑ）　
／　ｍｌの−ｈ　す−？イシンを含む）ｏ、ｃ＋Ｉｎ！
！を分注し、更に種々の濃度の被検サンプル０．１ｄを
加え、３７′Ｃで２０分ブレインキュベーションした後
、遠心して上清を除き、新たに、上記の培地１ｍｌを添
加して、更にＣ０２雰囲気下に３７℃で４８時間培養し
た。

培養後、トリパンブルー染色法により生細胞数を測定し
た。

その結果、第３表に示す如く、メルフアラン相当１００
μＭの複合体でブレインキュベーションした時、Ｌ１２
１０細胞に対する増殖抑制効果が現れた。２０分のブレ
インキュベーションで試薬を除いているにも拘らず、効
果が現れていることから、初期の２０分で、複合体と細
胞の結合が相当程度おこっているものと考えられる。尚
、培養は２系列行い、値は、その平均で示した。

第３表 実施例４ ４−（イ）　マレイミド基を導入したＦａｂ’の調製参
考例（ハ）の如（して得られた、遊離チオール基１ケを
有するＦａｂ’　１０■を含む５ｍ反応させた後、セフ
ァデックスＧ−２５を用いたゲルｆ４過カラムクロマト
グラフィー（１ｃｕＸ　３０６１ｎ、、同一緩衝液使用
）により、過剰の試薬を除いた。

４−（ロ）　マレイミド基を導入したＦａｂ’　（４−
尤）と、チオール基を有しアラ−Ｃを結合したポリーＬ
−グルタメート（４−２）との反応による、細胞毒性複
合体（４−３）の製造。

（４−１） （４−之） 」１記の如くして得られた０−フェニレンジマレインル
Ｆａｂ’　（４−１）　３．７ｒｎ９を含む手記（イ）
の緩衝液５．１Ｍに、チオール基を有しアラ−Ｃを結合
したポリーＬ−グルタメート（４−２）（末端ＳＨ相当
２．８　Ｘ　］　］Ｏ−７ｍａｒｅ／ｍｌ）を含む同ｙ
：衝液ｏ、ｘｏｍ及び０．４Ｍリン酸緩衝ｉ　（ＴＮＴ
（６，５）　１．ｏ　ｍｌを添加し、４　’Ｃで一夜反
応させた。こうして得られた複合体（４−３）は、限外
ろ過により濃縮し、更に０．９％塩化ナトリウム溶液に
透析した。

４−（ハ）　Ｔ、＋２１０細胞に対するグ合体の細胞毒
性上記４−（ｏ）の如くして得られた複合体（４−リの
標的細胞Ｌ１２１０に対する紀胞窮性を、上記実施例３
の（ハ）に示した方法に従って検討した。

その結果、第４表に示す如（、Ａｒａ　Ｃ相当１０　／
（Ｍの複合体でブレインキュベーションした時、Ｌ１２
１０細胞に対し細胞毒性を示　し　ブこ　。

第４表 実施例５ ＩｇＭｓフラグメント（５−］）と活性ジスルフィド基
を有し、ダウノマイシンを結合したポリーＬ−グルクメ
ー　）（５−２）との反応による、細胞毒性複合体（５
−３）の製造。

参考例（ホ）の如くして得られたＩｇＭｓフラグメント
（ｓ−１）　　の溶液（ｒ、ｓｍｑ／罰）】属に、活性
ジスルフィド基を有し、ダウノマイシンを結合したポリ
ーＬ−グルタメートのナトリウム塩（５＼すの溶液（活
性ンスルノイド当（Ｊｉ：４．６Ｘ　Ｉ　Ｏ’　ｍｏｌ
ｅ　７ｍｌ　）　０．１　ｍＡを添加し、０．１Ｍ塩化
ナトリウム、２ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む５０ｍＭグリッ
ツ　プｌ−リウ７＋塩緩衝液（ｐＨ９，２）に、４°Ｃ
で、４８時間透析しつつ反応させ、目的とする複合体（
５−ｊ）を得た。反応物は、更に、０．９チ塩化す）　
リウム溶液に透析した。

（５−１）　　　　　　　　Ｃｏ　　　　Ｃｏ２ＮａＹ
。

（５−芝） ６Ｈ，６Ｈ。

δ０　　さＯ，Ｎａ （５−之）　÷５ 手続補正書 昭和５８年２月１ＬＩ−日 特許庁長官殿 １　事件の表示 特願昭　５７　−　２２６２３７　　号２、発明の名称 細胞毒性複合体及びその製造法 ３　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 大阪市東区南本町１丁目１１番地 （３００）帝人株式会社 代表者　徳　末　知　夫 ５　補正の対象 明細書の「％許請求っ範囲」及び［発明の詳細な説明Ｊ
の欄６　補正の内容 （１＋　　明細毎の′ｔ♀許請求の範囲を別紙の通り訂
正する。

（２）　　同第１５頁の式〔■〕、第１６頁の式〔■〕
と式（Ｉｌｉ）　、第２９頁の式〔Ｖ〕及び第３０頁の
式〔■１〕の構造式中、Ｉ−Ｓ、−Ｗ（７ＮＩ（−１と
あるな、いずれもｒ　Ｓ、−Ｗ−ＣＯｆＮＨＪ　　と訂
正する。

「−〇 １ （３）　　同第１８頁の真ん中の構造式中、　　　　と
　Ｐ　− １」 １　」 以　　上 特許請求の範囲 （１）　　殺すべき細胞のもつ−（いる特定の抗原と特
異的に結合し得る免疫グロブリンまたはそのフラグメン
トと、細胞狙性物冥をその側鎖に結合し、反応性基をそ
の末端に含有する重合体とを共有結合させてなる却ｊ胞
カ性複合体。

（２）　　下記式〔Ｉ　１３ ・・・・・・・・・〔Ｉ〕 で表わされる、特許請求の範囲第１項記載の細胞毒性複
合体。

（３）　　下記式Ｃ１１） ・・・・・・・・・（ｎ） で表わされる、特許請求の範囲第１項および第２項記載
の細胞毒性複合体。

（４）　　下記式〔■〕 ・・・・・・・・〔１■〕 で表わされる、特許請求の範囲第２項および第２項記載
の細胞毒性複合体。

（５）　　式〔１３９式〔旧、および式〔１■〕におい
てＷが炭素数１〜４のフルキレン基である、特許請求の
範囲第２項、第３．ｒＪｉ又は第４項記載の細胞毒性複
合体。

（６）　　発生または導入したチオール基を有する下記
式〔１ｖＪ Ａｂ−Ｅ−（Ｂ、）　　−８２Ｈ）、　　　　・・・山
・・・（’ＩＶ〕２ １式（ｆＶ）　においてＡｂの定義は式ＣＩ）に同じ。

１で表わされろ免疫グロブリンまたはそのフラグメン］
・、下記式〔■〕 ・・・・・・・〔Ｖ〕 で表わされる、細胞毒性物質を結合し、かつ分子末端に
活性ジスルフィド基を有する反応性重合体とを反応せし
めることを特徴とする、下記式（ＩＩ−１） ・・・−・（１１−１） で表わされる細胞毒性複合体の製造法。

（７）　　誘導または導入した活性ジスｌレフイド基を
有する下記式〔ＶＩ’ｌ Ａｂ　（７（Ｂ２）１２Ｓ２Ｘ：’ｖ”・・・・・・−
ＣＶＤで表わされる免疫グロブリンまたはそのフラグメ
ントと、下記式〔■１〕 ・・・・・・・・・ＣＶｌｌ） する。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｊで表
わされる細胞毒性物質を結合し、かつ分子末端にチオー
ル基を有する反応性重合体とを反応せしめることを特徴
とする。前記式　　（９）（ｎ−１）で表わされる細胞
毒性複合体の製造法。

（８）　　前記式（ＩＶ）で表わされる発生または導入
したチオール基を有する免疫グロブリンまたはそのフラ
グメントと、前記式〔■〕で表わされる、細胞毒性物質
を結合しかつ分子末端にチオール基を有する反応性重合
体とを、チオール基と反応し得る官能基を２個有する架
橋剤を用いて結合することを特徴とする、下記式％式％
） ） で表わされる細胞毒性複合体の製造法。

下記式〔咀〕 で表わされる導入されたマレイミド基をもつ免疫グロブ
リンまたはそのフラグメントと、上記式〔■〕で表わさ
れる、細胞毒性物質を結合しかつ分子末端にチオール基
を有する反応性重合体とを反応せしめることを特徴とす
る前記式（ＩＩＩ）で表わされる細胞感性複合体の製造
法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ＋ｌ）　　殺すべき細胞のもっている特定の抗原と特異
   的に結合し得る免疫グロブリンまたはそのフラグメント
   と、細胞毒性物質をその側鎖に結合し、反応性基をその
   末端に含有する重合体とを共有結合させてなる細胞毒性
   複合体。 （２）　　下記式［１） ％式％（１） で表わされる、特許請求の範囲第１項記載の細胞毒性複
   合体。 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・（
   ｎＪ・で表わされる、特許請求の範囲第１項２よび第２
   項記載の細胞毒性複合体。 ・・・・・・・・・・・・−・・・・［１１１）で表わ
   される、特許請求の範囲第１項５よび第２項記載の細胞
   毒性複合体。 （５）　　式〔１３２式〔■〕、および式（ＩＩＤにお
   いてＷが炭素数１〜４のアルキレン基である、特許請求
   の範囲第２項、第３項又は第４項記載の細胞毒性複合体
   。 （６）　　発生または導入したチオール基を有するＦ記
   式１］■〕 Ａｂ　＋（Ｂ２）ｔ２−３２Ｈ）ｖ／　　　・・・・・
   ・・・・・・・・・・・・・・・・Ｃｒｌ／）で表わさ
   れる免役グロブリンまたはそのフラグメントと、下記式
   ＣＶ〕 （ＣＨ，）ｍ（ＣＨ２）ｍＲ＋ １／１ ｃｏ　　　　　　　ｃｏｏｚ □ ・・・・・・・・・・・・−・・・［ＶＪで表わされる
   、細胞毒性物質を結合し、かつ分子末端に活性ジスルフ
   ィド基を有する反応性重合体とを反応せしめることを特
   徴とする、ドお〔シ式Ｌ　ＩＩ　−Ｉ　Ｊ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・（（
   １−１３で表わされる細胞毒性複合体の製造法。 （７）　　誘導または導入した活性ジスルフィド基を有
   する下記式ＣＶ＋〕 Ａｂｔ（Ｂｔ）ｔ２　　ｓ、ｘ３　／　　　　・・曲・
   ・・曲・・・曲・　（Ｖｌ　）で表わされる免役グロブ
   リンまたはそのフラグメントと、Ｆ記式〔■〕 ・・・・・・・・・・　−・・・・・〔■〕で表わされ
   る細胞毒性物質な結合し、かつ分子末端に千オール基を
   有する反応性重合体とを反応せしめることを特徴とする
   、前記式Ｕ−Ｘ）で表わされる細胞毒性複合体の製造法
   ・ （８）　　前記式ＣＩＶ）で表わされる発生または導入
   したチオール基を有する免疫グロブリンまたはそのフラ
   グメントと、前記式（■〕で表わされる、細胞毒性物質
   を結合し、かつ分子末端に千オール基を有する反応性Ｎ
   合体とを、チオール基と反応し得る官能基を２個有する
   架橋剤を用いて結合することを特Ｗとする、下記式（ｌ
   −２Ｊ で表わされる細胞毒性複合体の製造法。 （９）　　下記式〔■〕 で表わされる導入されたマレイミド基をもつ゛　　免疫
   グロブリンまたはそのフラグメントと、上記式〔■Ｊで
   表わされる、細胞毒性物質を結合しかつ分子末端に千オ
   ール基を有する反応性重合体とな反応せしめることを特
   徴とする前記式（ＩＩＩＪで表わされる細胞毒性複合体
   σ〕ｍ造法。