JPS62190200A - 抗腫瘍蛋白複合体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １朶よ至■朋分」 本発明は新規な蛋白複合体とその製造方法に関する。

更に詳しくは、腫瘍組織に多く存在し、正常組織には少
しないしは全く存在しない抗原と特異的に結合しうる免
疫グロブリン、あるいはその抗原結合部位を含むフラグ
メントと、ウサギ腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒ
ｏｔｉｚｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ｏ以下、ＴＮＦと称す
）とを共有結合させることによって得られる、新規な抗
腫瘍性蛋白複合体とその製造方法に関する。

従来の技術 ＴＮＦは１９７５年にり、Ｊ、ＯＩｄ等によって発見さ
れた分子量が約４万の抗腫瘍性蛋白である（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、＋　７
２巻、　３６６６ページ。

１９７５年）。マウス、ウサギ等の動物をＢＣＧで感作
し、さらにエンドトキシンを投与すると、血清中に出現
してくる。第一次刺激剤としては、ＢＣＧの代わりにプ
ロピオンバクテリウム　アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｎｅｓ）　、ザイモサンあるい
は変形体（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）を用いることが出来
る。第二次刺激剤としては、エンドトキシンの代わりに
混合細菌ワクチン、ポリ　（１）ポリ　（Ｃ）あるいは
緑膿菌等も用いることが出来る。一般に、第一次刺激し
た後、１週間から３週間経過した時に第二次刺激を行な
う。第二次刺激の１ないし３時間後に採血を行なうと、
ＴＮＦ活性の高い血清が得られる。また、ＴＮＦはマク
ロファージから産生されるので、マクロファージあるい
はマクロファージ由来の細胞株を培養し、種々の刺激、
例えば、エンドトキシンやレクチンの添加によって、培
養上清中に産出させることも出来る。

こうして得られたＴＮＦには強い抗腫瘍活性がある。例
えば、メチルコランスレンＡ誘導肉腫を始めとする種々
の腫瘍細胞をマウスの皮下に移植し、固形癌を形成させ
てＴＮＦを投与すると、２４時間後には腫瘍部位に出血
性壊死が観察され、最終的には腫瘍の退縮がしばしば認
められる（Ｋ。

ＩＩ　ａ　ｒ　ａ　ｎ　ａ　ｋ　ａ等、Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、３４巻、２６３ペ
ージ、１９８４年）　ｅ　Ｉｎ　ｖｉけ０では、マウス
Ｌ細胞の培養液中にＴＮＦを添加し、その細胞毒性を観
察することによって、抗腫瘍活性を測定することができ
る。

一般に、ＴＮＦの抗腫瘍活性は投与部位によって大きな
影響を受ける。すなわち、’Ｉ’　Ｎ　Ｆを腫瘍部位に
直接投与したときには著しい抗腫瘍活性を発揮するが、
静脈内あるいは腹腔内投与ではその活性が極めて低減し
てしまうｎＴＮＦをしｎ床で使用することを考えたとき
、多くの腫瘍患者において腫瘍的投与は困難である。そ
こで、静脈内投与でも腫瘍的投与と同様にＴＮＦがＩＩ
Ｉ瘍部位に集積するように工夫することは、ＴＮＦの臨
床使用上、大きな意義をもつ。

３明が解決しようとする問題点 本発明は、静脈内投与によっても！ｌｉｌ瘍部位に選択
的に集積する新規なＴＮＦ複合体及びその製造方法を提
供することを目的とする。

問題点を解決するための手段 上記目的を達成するために、本発明では、腫瘍組織に親
和性をもつ免疫グロブリンまたはそのフラグメントとＴ
ＮＦとを共有結合させる。かくして得られる蛋白複合体
はＴＮＦの殺細胞活性および免疫グロブリンの抗原結合
活性とをあわセで保持している。

本発明において、腫ｍＭｉｍに親和性をもつ免疫グロブ
リンとは、腫瘍細胞表面上にある腫瘍関連抗原、癌胎児
性抗原に結合する免疫グロブリンあるいは、組織抗原や
肺癌Ｍｌ織に集積するフィブリンに結合する免疫グロブ
リンである。これらのうち、腫瘍関連抗原や癌胎児性抗
原は腫瘍選択性が高い反面、腫；島組織内の量は極めて
少ない。それに刻し、組織抗原やフィブリンは腫瘍選択
性は低いが、腫瘍組織に多量に存在するという長所があ
る。ＴＮＩ？自身にある程度の肝癌選択性があるので、
本発明においては、組織抗原やフィブリンに対する免疫
グロブリンを使用する方が望ましい。

これら免疫グロブリンとしては、腫瘍細胞あるいはそれ
を含む）、ｕ　織あるいはそれ由来の抗原で免疫された
ヒト、サル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、モル
モット、ハムスター、ラット、マウス等から分離した抗
血清よりエタノール分画、硫安分画、イオン交換あるい
は分子篩カラムクロマ１−フィー等の公知の手段で調製
される免疫グロブリン、あるいは、腫瘍細胞あるいばそ
れを含む組織あるいはそれ由来の抗原で免疫した動物よ
り採取した抗体産生細胞を発癌性のある物質で癌化させ
たり、ミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマとす
ることより産生されるモノクローナル抗体が該当する。

また、抗原−抗体反応を利用するアフィニティーカラム
クロマトグラフィーにより精製された免疫グロブリンも
本発明の免疫グロブリンに含まれる。また、腫瘍細胞に
結合した免疫グロブリンを界面活性剤等で分離して得ら
れる、腫瘍細胞に特異的な免疫グロブリンも本発明の免
疫グロブリンに含まれる。

免疫グロブリンにはＩｇＧ、ＩｇＡ、１ｇＭ、ＩｇＤ。

ＩｇＢの５つのクラスが知られており、さらに各クラス
はい（つかのサブクラスからなっていることも知られて
いる。しかし、その基本構造は、２本の重鎮と２本の軽
鎖とから構成されている点、また、抗原結合活性を持つ
Ｆａｂ部分とエフェクター活性を持つＦｃ部分から構成
されている点において一致している。ただし、１ｇＭは
５里体で、ＩｇＡは一部が２量体で存在するが、本発明
の蛋白複合体のＭｉ織浸透性という面から考えると、こ
れらをメルカプタンで還元し、１量体としてから用いる
方が望ましい。

本発明の蛋白複合体の製造にあたっては、免疫グロブリ
ン分子全体を用いてもよいが、それよりも、その抗原結
合部位を含むが、Ｆｃ部分を含まないフラグメントを用
いることが望ましい。それは、Ｆｃ部分を含む複合体に
あっては、Ｆｃ部分による腫瘍細胞以外の細胞に対する
非特異的吸収及び細胞膜上のｌ’ｉ’ｃリセプターとの
結合が起こり、腫瘍細胞に対する選択性が減じるからで
ある。さらに異種タンパクとしての免疫グロブリンの抗
原性が、Ｆｃ部分において特に強いので、蛋白複合体の
抗原性を低下させる点においても、Ｆｃ部分のない免疫
グロブリン由来フラグメントの使用が望ましい。一般に
、免疫グロブリンをパパイン、トリプシン、キモトリプ
シン、プラスミン等の蛋白分解酵素で分解すると、抗原
結合部分を１つ持つ、いわゆるＦａｂフラグメントが得
られる。また、ペプシン分解、条件によってはトリプシ
ン分解によっても抗原結合部分を２つ持つ、いわゆるＦ
（ａｂ’）ｚフラグメントが得られる。このフラグメン
トをさらにメルカプタンて処理すると、−価のＦａｂ’
　フラグメントになる。さらに免疫グロブリンを変性さ
せつつ分解させると抗原結合部分のみが得られる。これ
らの免疫グロブリン由来フラグメントは、原料としての
免疫グロブリンがいかなるクラス、サブクラスに属する
ものであれ、いずれも本発明の蛋白複合体の製造に用い
ることができる。

本発明で使用されるウサギＴＮＦは、例えば次の方法で
製造される。

ウサギをＢＣＧ、プロピオンバクテリウム　アクネス、
ザイモサンあるいは変形体等で第１次刺激し、１ないし
３週間後にエンドトキシン、混合細菌ワクチン、ポリ　
（１）ポリ　（Ｃ）あるいは緑膿菌で第二次刺激する。

第二人刺激後１ないし２４時間以内に採血し、その血清
を分離し、ＴＮＦ原液とする。または、ウサギ由来のマ
クロファージまたはマクロファージから樹立された細胞
株を培養し、培養液中にエンドトキシンやレクチン等を
添加することによってＴＮＦを産生させ、その培養上清
をＴＮＦ原液とする。これらの細胞株より取り出したＤ
ＮＡを組み込んだ微生物から産生される１ＮＦも本発明
で用いられる。かくて得られたＴＮＦは、硫安沈澱、イ
オン交換クロマトグラフィーあるいは分子篩クロマトグ
ラフィーによって精製される。

本発明の蛋白複合体は、免疫グロブリンまたはそのフラ
グメントとウサギＴＮＦとを共有結合することにより製
造される。

縮合剤としてジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ
）　、１−エチル−３−（３−ジメチル７ミノプロピル
）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤ（１）等のカルボジイミ
ド試薬等を用いて画構成々分を直接アミド結合で結合し
てもよいし、または、分子中に複数個の同一の架橋用官
能基を有する架橋試薬により画構成々分を結合してもよ
い。そのような架橋剤としては、例えばグルタルアルデ
ヒド、トルエンジイソシアネート、２，２”　−ジカル
ボキシ−４，４゛　−アゾフェニレンジイソシアネート
、ジエチルマロンイミデートニ塩酸塩等を挙げることが
できる。但し、これらの架橋剤を使用するときには、免
疫グロブリンまたはそのフラグメントとＴＮＦとの間に
共有結合が形成されるだけでなく、同一の分子内での架
橋や、免疫グロブリンあるいはそのフラグメント同志の
架橋、あるいはＴＮＦ同志の架橋も起り、望ましい複合
体は生成しにくい。従って、分子中に互いに異なる２種
の架橋用官能基を複数個（望ましくは各１個）有する架
橋試薬を用いて、免疫グロブリンまたはそのフラグメン
トとＴＮＦとの内の一方を先ずこの架橋剤と反応せしめ
、然る後その生成物と他方とを反応させる方法が望まし
い。この場合、両成分に架橋用官能基を導入した後に上
記の反応に供することもできる。かかる方法によって式
（１）又は（ｎ）で表わされる蛋白複合体が得られる。

Ａｂ−（−（ｘ＋）ｔ−’ｒＮＦ）、　　　・・・　（
１）ＣＡ　ｂ　−（ＸＩ）Ｌ　＋−，、ＴＮ　Ｆ　　　
・・・　（Ｉｔ）上記式中で×１は架橋剤に由来する２
価の有機基である。

上記式（１）、（Ｉｔ）で表される蛋白複合体中では、
下記式（ｎｌ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（■）で表わ
される複合体が、製造、分離精製の便宜上、及び活性上
特に好ましい。

Ａ　ｂ−＋（ｘｉ）ｐｓｌ　　（ＸＩ）Ｑ　　Ｓ２−Ｘ
４　　Ｔ　Ｎ　Ｆ　）　、。

・・　（Ｉ［Ｉ） （八ｂ　　（Ｘ２）ｐ　　５１（Ｘ３）ＱＳ２　　Ｘ４
〕−、、ＴＮＦ・・　（■） ０　　　　　　　　・　・　（Ｖ） ０　　　　　　　　・　・　（ＶＩ） 上記式（ＩＩＩ）　−（ＴＶ）においてｐ＝ｏの場合に
は、Ｓ、は免疫グ［Ｉプリンまたはそのフラグメントに
由来する硫黄原子であり、ｐ＝ｘの場合には架橋剤によ
りｍ人された硫黄原子である。Ｓｚ番；！架橋剤によっ
て等大された硫黄原子である。式（ＩＩＩ）および（Ｔ
Ｖ）においてＱ＝Ｏの場合には、硫黄原子Ｓ、と８２は
直接結合しジスルフィ１基を形成する。

一方、Ｑ＝１の場合には、硫黄原子Ｓ、とＳｚｌ！、２
価の有ｉ　基Ｘ　３を介して結合するが、×３はチオー
ル基と反応する２個の官能基を有する架橋剤、例えば式
（■）： （Ｘ６は２価の有機基を表す。〕 で表わされる架橋剤あるいはベンゾキノンに由来する２
価の有ａ基である。式（１）　−（ＴＶ）における×２
および式（ＩＩＩ）、（ｒＶ）における×４は同一でも
異なってもよく、それぞれ下記式（■）：Ｙ−３−３−
Ｘ、−Ｃ−Ｚ　　　・・・　（■）で表わされる架橋剤
、下記式（■）： Ｙ−３−３−Ｘ７−（、−Ｑ　　　・・・（ＩＸ）Ｈ−
ＨＲ で表わされる架橋剤、下記式（Ｘ）： Ｒ−Ｘ７−Ｃ−Ｚ　　　　　　　・・・　（Ｘ）で表わ
される架橋剤、下記式（ＸＩ）：で表わされる架橋剤（
２−イミノチオラクトン）、下記式（ＸＩＩ）　　： で表わされる架橋剤（Ｎ−アセチルホモシスティン）、
下記式（Ｘｎｌ）　　： で表わされる架橋剤（Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸
無水物）または下記式（ＸＩＶ）　　：Ｏ・・　（Ｘｒ
Ｖ） で表わされる架橋剤に由来する２価の有機基である。

Ｙで表わされる、それが結合している硫黄原子と共に活
性ジスルフィド基を形成し得る１価の有等を挙げること
ができる。×６または×７で表わされる２価の有機基は
、化学的に不活性であれば特に制限されないが、一般的
には分岐を有するか有しないアルキレン基、フェニレン
基等から適宜選ばれる。Ｚで表わされる活性エステルの
アルコール残基の具体例としては２，４−ジニトロフェ
ノキシ基 ２Ｎ ○ Ｑで表わされるイミドエステルのアルコール残基の具体
例としてはメトキシ、エトキシ基等を挙げることができ
る。Ｒで表わされるハロゲン原子の具体例としては塩素
、臭素等を挙げることができる。

架橋剤の具体例としては、弐（■）で表わされる架橋剤
としてＮ、Ｎ’　　−（１，２−フェニレン）シマレイ
ミド、Ｎ、Ｎ“　−（１，４−フェニレン）シマレイミ
ド、４．４°　−ビス（マレオイルアミノ）アゾヘンゼ
ン、ビス（Ｎ−マレイミドメチル）エーテルを、弐（■
）で表わされる架橋剤として、Ｎ−サクシンイミジル３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、２．４−ジ
ニトロフェニル　４−（４−ピリジルジチオ）プロピオ
ネートを、式（ＩＸ）で表わされる架橋剤として、メチ
ル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンイミデート塩
酸塩を、式（Ｘ）で表わされる架橋剤として、Ｎ−ザク
シンイミジル３−ブロモプロピオネートを挙げることが
できる。

本発明の蛋白複合体の内式（ＩＩＩ）または（■）で表
わされる複合体を製造するには、例えば蛋白複合体を構
成する免疫グロブリンあるいはそのフラグメントとウサ
ギＴＮＦのどちらか（任意の一方の蛋白をＰｒｏｌで他
方の蛋白をＰｒｏ２で表わす）に活性ジスルフィドを導
入しておき、他方にチオール基を導入あるいは生成させ
ておき、両者をジスフィト結合で結合させるか、あるい
は架橋剤を用いて架橋する方法をとることができる。す
なわち、Ｐｒｏｌに例えば式（■）、あるいは式（ＩＸ
）で表わされる架橋剤を反応せしめる〔反応＋１）、（
２）〕か、（■） Ｐｒｏｌ−→Ｐｒｏｌ＋−Ｃ−Ｘ７−　Ｓ　−Ｓ　−Ｙ
）、　　・　・（１１（ＸＶ） （ＩＸ） Ｐｒｏｌ　　　−”Ｔ’ｒｏｌ−（−−Ｃ−χｔ−３−
３−Ｙ）、　　・　・＋２１Ｈ （ＸＶＩ） 式（Ｘ）で表わされる架橋剤を反応させた後、生成物（
Ｘ■）をチオ亜硫酸イオンで処理〕する〔反応（３）〕
か、 （χ） Ｐｒｏｌ　　　−Ｐｒｏｌ→−Ｃ−Ｘ７−　Ｒ）　ｎ−
Ｐｒｏｌ−＋−Ｃ−Ｘ？　　Ｓ　　５Ｏａ−）　−・・
（３１（ＸＶ−１） あるいは、Ｐｒｏｌを式（ＸＩ）又は（ＸＩＩ）で表わ
される架橋剤と反応せしめて生成した弐（Ｘ■）または
式（ＸＩＸ）で表わされる蛋白、または、Ｐｒｏｌを式
（Ｘｌｌ＋）で表わされる架橋剤と反応せしめ、次いで
型子セチル化して生成した式（ＸＸ）で表わされる蛋白
を、チオール基を活性ジスルフィド基に変換する試薬〔
例えば２．２′　−ジピリジルジスルフィド； ４．４゛　−ジピリジルジスルフィド：５．５゛　−ジ
チオビス（２−二トロ安息香川）：で処理して〔反応（
４）、（６）またはｆ６）：ｌ　、’／ｌ’ｌ性ジスル
フィド基 （Ｘ■） −Ｐｒｏｌ→−Ｃ（ＣＨｚ）３Ｓ　　　５−Ｙ）　　−
・１４１Ｈ （ＸＶＩ−１） →Ｐｒｏｌ−＋−ｃ　　　ＣＨ（ＣＨ２）２　　　Ｓ　
Ｈ）　　ｌ１０　　　Ｎ　ＨＣＯＣＩ（５ （ＸＩＸ） →Ｐｒｏｌ　→−ＣＣＨ（ＣＨｚ）ｚ　　　Ｓ　−Ｓ　
　　Ｙ）　　。

（ＸＩ） Ｐｒｏｌ−→Ｐｒｏｌ−（−Ｃ−ＣＨ−ＣＯＣＨ３）？
１０　　　　　ＣＨ２ＣＯＺ　　　Ｈ −−Ｐ　ｒ　ｏ　１−一←−Ｃ−ＣＨ−３Ｈ）１１０　
　　ＣＨｚ　　ＣＯｚ　　Ｈ が五人されたＰｒｏｌ　Ｃ式（ＸＶ）、（ＸＶＩ）、（
ＸＶ−１）、（ＸＶＩ−１）、（ＸＶ−２）または（Ｘ
Ｖ−３）で表わされる蛋白〕を得る。他方、もう一方の
蛋白Ｔ”ｒｏ２より上記式（１）、（２）または（３）
の如くして作った、下記式　（ＸＸ）、（ＸＩＩ）また
は（ＸＸ−１）で表わされるジスルフィド基がｍ人され
た蛋白のジスルフィド基を、例えば２−メルカプトエタ
ノールまたはジチオスレイト−ル等のチオール試薬で還
元する〔反応（７）、（８）または（９）〕か、 Ｐｒｏ２−→−Ｃ−Ｘ７−３−５−Ｙ）　、１□　　　
　　　　　　（ＸＸＮ −Ｐｒｏ２−→−ＣＬ　　５Ｆ（）　ｌｌ・・（７１（
ＸＸＩＩ） Ｐｒｏ２−→−Ｃ−Ｘ７−３−３−Ｙ）　、。

轟　　　（ＸＸＩＩＩ） 一＋Ｐｒｏ２−→−Ｃ−Ｘ７−　Ｓ　Ｈ）　Ｉｌ・−（
８１１！１Ｈ （Ｘ）ｌ’） Ｐｒｏ２−→−ＣＸ７　　Ｓ　　５Ｏｉ）、１Ｑ　　　
　　　　　（ＸＸＩ−１） −＋Ｐｒｏ２−→−Ｃ−Ｘ７−３Ｈ）、　　　・−（９
）（ＸＸＩＩ） または反応式（４）または（５）の第一段階の反応と同
様にしてチオール基が導入されたＰｒｏ２　Ｃ式（ＸＸ
Ｕ）、（Ｘ　Ｘ　ＩＶ）、（ＸＸＩＶ−１）、（ｘｘｎ
−１＋または（ＸＸＩＩ−２）で表わされる蛋白〕を得
る１Ｐｒｏ２−＋−Ｃ−（ＣＨ’ｚ）ｓ　　　ＳＨ）　
ｒｌ　・・　（ＸＸＩＶ−１）Ｉ！！Ｈ Ｐｒｏ２−→−Ｃ（ＣＨｚ）ａ−３Ｈ）−・・　（ＸＸ
ＩＩ　　１）〔式（ＸＶ）、（ＸＩＶ）または（ＸＶ−
１）中の×７及びＲと式（ＸＸＩＴ）または（ＸＸＲＩ
）中のＸ。

及びＲは同一でも異なっていてもよい〕上記の如（して
製造されたチオール基がｍ人されたｌ’ｒｏ２を、同じ
く上記の如くして製造された活性ジスルフィド基が導入
されたＴ’ｒｏｌと反応せしめて式（Ｉ［ｌ）または（
■）（共にｑ＝０）で表わされる本発明の蛋白複合体を
製造することができる。

式（Ｖ）または（ＴＶ）で表わされる本発明の蛋白複合
体を製造するには、ウサギＴＮＦを例えば（Ｘ　ＩＶ）
で表わされ架橋剤と反応せしめて弐（ＸＸ■）で表わさ
れるマレイミド基が導入された蛋白を得、 これに反応式（７）、（８）、（９）または反応式（４
）、（５）の第一段階の反応または反応式（６）の第二
段階の反応の如くして製造されたチオール基が導入され
た免疫グロブリンまたはそのフラグメントを反応させて
製造することができる。

式（Ｉ［ｌ）、（ＴＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）で表わ
される本発明の蛋白複合体の一つの前駆物質はチオール
基を有する蛋白質であるが、かかる千オール基は化学式
で具体的に記した如く、外部からｍ人されたチオール基
の他、蛋白質自体がもともとチオール基を有している場
合にはそのチオール刀あるいはシスチンに拮づくジスル
フィド結合をもっている場合には、そのジスルフィド基
を還元して生成させることができるチオール基であって
キよい。

上記の免疫グロブリンまたはそのフラグメントとＴＮＦ
の架橋反応において、免疫グロブリンまたそのフラグメ
ント、或いはウサギＴＮＩに架橋剤を反応させる場合は
、架橋剤を反応せしめる蛋白１モルに対し、架橋剤１〜
１００モル用ｌ／）るの力（好ましい。反応は免疫グロ
ブリンまたはそのフラグメント、或いはウサギＴＮＦの
、ｐＨ４〜９の緩衝液中蛋白濃度が０．５〜１００ｍｇ
／ｍｌ　（より好ましくは１〜２０ｍｇ／ｍｌ）になる
ように８周製されたン容液に、０〜５０℃で攪拌しなが
ら架橋剤の水溶液または架橋剤が水に溶けない場合には
、架橋剤を少量の有ｊＰｊ−？９　媒、例えばＮ、Ｎ−
ジメチルホルムアミドジメチルスルホキシド、１，２−
ジメトキシエタン、メタノール、エタノール、アセトン
等に？容力１した溶液を添加して行なわれる。反応時間
Ｇま反応、　　スケール、反応条件によるが、一般Ｇこ
２日間以内である。反応終了後、透析または分子篩ツノ
ラムクロマトグラフィーにより未反応の架橋剤を除し）
た後、得られた架橋剤が再入された蛋白ン容液に？Ｍ合
体のもう一方の成分である蛋白（ま之こしま架橋斉１１
番こより架橋用官能基が導入された蛋白）のｐＨ４〜９
の緩衝溶液（好ましい蛋白深度の範囲は上に記載したの
と同じである）を添加して、０〜５０℃で反応せしめる
。複合体の反応混合物からの分離、精製は通常用いられ
る操作、例えば分子篩カラムクロマトグラフィーによっ
て行なうことができる。

なお、複合体の一方の成分の蛋白の溶液に、架橋剤が導
入された他方の成分の蛋白の溶液を添加して複合体を製
造することもできる。さらに、架橋剤が導入された蛋白
を、低分子の試薬で処理して特定の架橋用官能基を有す
る蛋白に変換する場合（例えば架橋剤によって導入され
た活性ジスルフィド基をチオール基に変換する場合）、
或いは免疫グロブリンまたはそのフラグメント、或いは
低分子試薬を用いウサギＴＮＦを直接活性化誘導体に変
換する場合（例えば免疫グロブリンのＦａｂ’フラグメ
ントのチオール基を活性ジスルフィドに変換する場合）
の反応条件も上記の蛋白に架橋剤を反応せしめる場合の
反応条件と同様である。

かくて製造される本発明の蛋白複合体は凍結乾燥して保
存する。使用時には水に熔かして、ＴＮＦ換算で１００
〜１００００単位（成人）を１回静脈内投与すればよい
。

以下実施例により本発明を詳述する。

実施例１ （イ）ウサギＴＮＦの作製 ウサギにＢＣＧを怒作し、２週間後にエンドトキシン（
リポポリサッカライド）を投与した。さらに２時間後に
ウサギより採血し、その血清を分離した。この血清に硫
安を、６０％飽和になるように添加した。生じた沈澱を
遠心分離し、１２０ｍＭ食塩を含む５０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、同緩衝液で充分
に透析した。この透析内液を同しリン酸緩衝液で平衡化
したＤＥＡＥセファデックスにかけた。２００ｍＭ食塩
を含む同リン酸緩衝液でカラムを洗滌後、３５０ｍＭ食
塩を含む同リン酸緩衝液でＴＮＦを流出させた。このＴ
ＮＦ画分を、Ｑ、ｌＫＣｌを含む５０ｍＭ　ｔ−リス・
１（Ｃ１（ｐ）ｌ　７　）緩行ｉ液で透析した後、同緩
衝液で平衡化したブルーセファロース６Ｂカラムにかけ
た。未吸着画分を取ることによって、混入していたアル
ブミンを除去した。最終的に、１１，０００倍もＴＮＦ
比活性が上昇し、その活性の回収率は２２％であった。

ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（以下、５ＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけると、分子１１
８０００のところに蛋白バンドが一本観察され、ＴＮＦ
活性もその部位からのみ回収された。

（ロ）Ｎ−Ｃ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル
〕−ウサギＴＮＦの調製 上記（イ）の如く抽出精製されたウサギＴＮＦ２．６ｍ
ｇを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液−０，１４Ｍ塩化ナト
リウム−１ｆｆｌＩ′！工チレンジアミン四酢Ｍ、（以
下ＥＤＴＡと略す）　？ａ液（ｐＨ７，５）　１．２ｍ
ｌ　に、９ｍＭのＮ−サクシンイミジル−３−（２−ピ
リジルジチオ）プロピオネート　（ＳＰＤＰ）を含むエ
タノール溶液を０．０３ｍ１加え、室温で３０分間反応
させた。

過剰の試薬を除去するために、上記リン酸緩衝液（ｐｌ
＋７．５）中でフセアデソクスＧ２５カラムクロマトグ
ラフィーにかけた。かくて、Ｎ−（３−（２−ピリジル
）ジチオプロピオニル〕基が平均として約３個導入され
たウサギＴＮＦを得た。

（ハ）フィブリンに特異的な免疫グロブリン１ｇＭの銅
製 ヒトフィブリンに親和性をもち、かつヒトフィブリノー
ゲンには親和性のないマウスモノクローナル抗体を、以
下の如く調製した。

まず、Ｂａ１ｂ／Ｃマウスの腹腔内にヒトフィブリン１
■／ｍｌとフロイント完全アジュバントと同容量混合エ
マルジョンを０．２ｍｌ投与した。さらに３週間後、１
■／ｍｌのヒトフィブリン溶液０．２ｍｌをｌｌ！腔内
に投与した。４日後に免疫マウスから肺臓を取り出し、
その肺細胞とマウスミエローマ細胞５Ｐ２１０とをポリ
エチレングリコール存在下で細胞融合させた。この処理
ののち、細胞をＨＡＴ（ヒボキサンチン−アミノプテリ
ン−チミジン）選択培地中で、９６穴プレート上で、２
ないし３週間培養した。増殖してくる細胞は肺細胞とミ
エローマ細胞の融合したハイブリドーマである。ハイブ
リドーマ培養上清中の抗体活性をスクリーニングした。

ヒトフィブリンあるいはフィブリノーゲンを固定したプ
レートに培養上清を０．０５ｍ１加えて１時間、室温で
反応させた。０．０５％ツイーンを含むリン酸緩衝液で
３回洗ったのち、アルカリ・フォスファターゼ標識ヤギ
抗（マウス免疫グロブリン）抗体の２０００倍希釈液０
．０５ｍ１を加えた。

室温で１時間反応させたのち、０．６ｍｇ／ｍｌのｐ−
ニトロフェニルリン酸溶液０．１ｍｌを加えた。室温で
１時間酵素反応させたのち、４０５ｎｍでの吸光度から
、マウス抗（ヒトフィブリン）抗体の１を測定した。か
なり多くの穴の培養上清の中に、抗フィブリン抗体が認
められた。しかし、それらのほとんどのフィブリンとも
フィブリノーゲンとも反応する抗体であった。フィブリ
ンのみに反応し、フィブリノーゲンに反応しない抗体を
含む培養上清はほんの２．３穴にしか得られなかった。

これらのハイブリドーマを限界希釈法によってクローニ
ングした。１つのハイプリドーマ株だけがクローニング
に成功した。このハイブリドーマはヒトフィブリンに親
和性をもち、ヒトフィブリノーゲンには親和性をもたな
いマウス１ｇＭを産仕する。

このハイブリドーマ約１０６個を、−週間以上前に０．
５ｍｌプリスタンを腹腔的投与しておいたＢａ１ｂ／Ｃ
マウスに腹腔内注射した。１ないし２週間後にこれらの
マウスから貯留した腹水液を取り出した。

こうして集めた腹水液３０ｍ１に硫安を、５０％飽和に
なるように加えた。生じた沈殿を遠心分針したのち、沈
殿をリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳ）に溶解し、
ＰＢＳで平衡化したセファクリル３３００分子篩カラム
クロマトグラフィーにかけて、抗フィブリン抗体活性画
分を採取した。

かくて調製された抗フィブリン抗体１■を含むＰＢ　Ｓ
　ｉ８液ｌ容と３容の人血光あるいは精製フィブリノー
ゲン４■を含むＰＢＳン容液あるいはコントロール は３７℃で１時間混合したものをＰＢＳで１０，０００
倍に希釈し、前述の方法で抗体活性を測定した。４０５
ｍｍでの吸光度（Ａ４。、）は以下の表に示す通りであ
った。

Ａ４。。

上表に示された結果は、上記抗体はフィブリノーゲンな
らびに他の大血漿成分とは結合せず、フィブリンに特異
的に結合する抗体であることを示している。

同様にして、ヒト、ウマ、ブタ、イヌ、ウサギ、モルモ
ット、ラットのフィブリンあるいはフィブリノーゲンを
固定したプレートを用いて、上記抗体の種特異性を検討
したところ、ウサギのフィブリンにのみヒトフィブリン
と同程度に親和性を示し、他の動物のフィブリンあるい
はフィブリノーゲンにはほとんど反応しなかった。

（二）　　１ｇＭ抗フシフイブリン抗体ＩＨＭｓの作製
１ｇＭは分子量８０万で、ペンタマーの構造をもってい
る。これを以下のようにメルカプトエタノールで還元し
、システィン残基を有する１ｇＭｓ　（モノマー）を作
製した。

上記実施例１の（ハ）の如くして得られた１ｇＭ２６■
を含む０．０１Ｍ　）リス・ＨＣＩ＋０．１４Ｍ食塩＋
２ｍｔ’ｌＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ’＜９？ｆｆｌ（ｐ）１８．
３）３．２ｍＸに、１５０ｍＭの２−メルカプトエタノ
ール水溶液を０．０３ｎ＋１加えて、３７℃で１時間還
元した。反応後、その溶液を５ｍＭ酢酸緩衝液−０．１
４Ｍ塩化ナトリウム−１　ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ？８液（
ｐ）１５．５）　（以下、ＡＮＥｌＩ衝液と略す）で平
衡化したセファデックス０２５カラムクロマトグラフイ
ー（１．０ｃｍ　ｘ２０ｃｍ）にかけて２−メルカプト
エタノールを除去した。

元の１ｇＭと還元した１ｇＭとをＰＢＳで平衡化したセ
ファクリルＳ−３００カラムクロマトグラフイーで分析
した結果、未還元の１ｇＭはボイドーボリュ−Ｊ、直後
の位置に、還元された１ｇＭは、より小さい、分子量約
１８万の位置に流出した。さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥでは
モノマーの１ｇＭｓと、若干のＨ鎖とＬ鎖が認、められ
、ｒこ。このようにして作製されたＩ　ｇＭｓはそのＦ
ｃ部分に２個以上のシスティン残基を有していた。

（ホ）１ｇＭｓとウサギＴＮＦとのジスルフィド結合を
含む蛋白複合体の調製。

Ｎ−Ｃ３−（２−ピリジル）ジチオプロピオニル）−Ｔ
ＮＦ　１．４■を含む０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液−０，１４Ｍ塩化ナトリウム−１ｍ１’１ＥＤＴＡ溶
液（ｐ！（７，５）２．０ｍｌと、還元された１ｇＭｓ
　７．Ｏｎｗを含む上記と同一のリン酸緩衝液１．９ｍ
ｌとを混合し、室温で１８時間反応させた。反応液を０
．１４Ｍ食塩水、で平衡化したセファクリルＳ−３００
（２，０ｃｍ　Ｘ　１４８ｃｍ）にかけた。その結果、
分子量約２０万の位置と４万の位置に蛋白が流出した。

この２つの蛋白分画について、抗フィブリン抗体活性と
殺細胞活性を調べた。

抗フィブリン抗体活性の測定には、実施例１の（ハ）に
記載した酵素抗体法を用いた。分子量約２０万の蛋白に
は著しい抗フィブリン抗体活性があったが、分子量約４
万の蛋白には全く゛活性がなかった。

ウサギＴＮＦの殺細胞活性は次のように測定した。マウ
ス上９２９細胞を９６穴プレートに１０４個ずつ蒔いて
おき、２００ｎｇ／ｍｌアクチノマイシンＤと被検体を
添加して、１８時間培！、プレートに付着した生細胞数
をクリスタルハイオレソト（０，２％）染色法によって
観察した。その結果、分子量約２０万の蛋白分画にも、
分子量約４万の蛋白分画にも殺細胞活性が認められた。

次に、この分子量約２０万の蛋白分画の一部３ｍｌを取
り、２ｍＭメルカプトエタノールを含む０．０１Ｍトリ
ス・ＨＣ１＋０．１４Ｍ食塩＋２ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐ
Ｈ８，３）を１　ｍ’ｌ加えて、３７℃で１時間還元し
た。

これを再び同しセファクリルＳ−３００カラムクロマト
グラフイーにかけた。その結果、再び分子量約２０万と
約４万の蛋白が流出した。これに対して、メルカプトエ
タノール処理しなかった分子量約２０万の蛋白は同一の
セファクリルＳ−３００にかけたとき、分子量約２０万
の蛋白のみで、分子量約４万の蛋白は出現しなかった。

以上の結果より、この分子量約２０万の蛋白分画は抗フ
ィブリン活性をもっ１ｇＭｓとウサギＴＮＦとがジスル
フィド結合によって架橋された蛋白複合体であることが
判明した。

また、この架橋によって、ウサギＴＮＦの殺細胞活性も
１ｇＭｓの抗フィブリン抗体活性も失われることがなか
った。

なお、上記複合体をリン酸緩衝住理食塩水中でヒトフィ
ブリン塊あるいは人血禁中でトロピンを添加して作製し
たフィブリン塊と混合し、４℃で１日あるいは３７°Ｃ
で１時間後に、混合液の遠心上清（フィブリン塊を含ま
ない）中の抗フィブリン抗体を実施例１　（ハ）に記載
した酵素抗体法を用いて測定したところ、抗フィブリン
抗体活性はほとんど残存しなかった。

これは上記複合体がフィブリンに非常に親和性の高いこ
とを示している。

実施例２ （イ）　チオール基を導入したウサギＴＮＦの調製 前記実施例１　（ロ）に記載した方法で調製された、Ｎ
−（３−（２−ピリジル）ジチオプロピオニル〕−ウサ
ギＴＮＦ１．９■を含む０．１Ｍ）リス・塩酸−２ｍＭ
　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐｌ！８．３）緩衝液１．５ｍｌ
に、２−メルカプトエタノールを最終濃度１ｍＭになる
ように加えて３７℃で１時間還元した後、ＡＮＥ緩衝液
で平衡化されたセファデックスＧ２５カラムクロマトグ
ラフイーにかけて、低分子生成物を除去し、チオール基
を約３個をもったウサギＴＮＦを得た。

（ロ）　マレイミド基を導入した１ｇＭｓの調製実施例
１の（ニ）で調製された１ｇＭｓ　６．７■を含ムＡ　
Ｎ　Ｅ　ｆｆｔ衝液１．７ｍｌと、０−フェニレンジマ
レイミドを飽和溶解させたＡＮＥ緩衝液１．７ｍｌとを
混合し、室温で３０分間反応させた後、ＡＮＥ緩衝液で
平衡化されたセファデックス０２５カラムクロマトグラ
フイーにかけて、未反応の試薬を除去し、マし・イミド
基２ないし４個をもつＩＢＭｓを得た。

（ハ）　千オール基をもつウサギＴ　ｈ４　Ｆとマレイ
ミド基をもつ１ｇＭｓの架橋による蛋白？と合体の８周
一°１ チオール基をもつウサギＴＮＦ１．３■を含むへＮＥ緩
衝液２．１ｍｌとマレイミド基を持つ１ｇＭｓ　４．１
■を含むＡＮＥ緩衝液２．２ｍｌと、０．３Ｍリン酸緩
衝液−１０ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ６，５）　０．４ｍｌ
を混合し、４゛Ｃで２２時間反応させた。この反応液を
実施例１の（ホ）で用いられたセファクリルＳ−３００
カラムクロマトグラフイーにかけて、分子量約２０万の
蛋白両分を採取した。

実施例１の（ホ）と同様にしてこの両分の抗フィブリン
抗体活性と殺細胞活性を測定すると、両活性とも存在す
ることが判明した。

調製された蛋白複合体を、０．ＯＩＭ　）リス・ＨＣＩ
十０．１４Ｍ食塩＋２ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８，３）
中で、０．５ｍＭメルカプトエタノールによって、３７
°Ｃで１時間還元した。ついでセファクリルＳ−３００
カラムクロマトグラフイーにかけたとき、すべての蛋白
は分子量約２０万の位置に流出すると共に、抗フィブリ
ン抗体活性と殺細胞活性もこの分子量が約２０万の両分
に出現した。以上の結果から、１ｇＭｓとウサギＴＮＦ
とは還元的に切断し得ない共有結合によって架橋されて
いることが判明した。

発明の効果 以上述べた通り、本発明により、腫瘍！ＩＪＩ織に選択
的に集積する新規な抗腫瘍蛋白複合体及びその製造方法
が提供される。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）免疫グロブリンまたはそのフラグメントと、ウサ
   ギ腫瘍壊死因子とを共有結合させることによって得られ
   る蛋白複合体。
2. （２）免疫グロブリンまたはそのフラグメントがヒトフ
   ィブリンに反応し、ヒトフィブリノーゲンには反応しな
   い活性をもつ、特許請求の範囲第１項記載の蛋白複合体
   。
3. （３）免疫グロブリンが１ｇＭである、特許請求の範囲
   第１項または第２項に記載の蛋白複合体。
4. （４）下記式（ I ）または（II）で表わされる、特許
   請求の範囲第１項、第２項または第３項に記載の蛋白複
   合体。 Ａｂ−〔（Ｘ＿１）＿ｔ−ＴＮＦ〕＿ｎ・・（ I ）〔
   Ａｂ−（Ｘ＿１）＿ｔ〕−＿ｎＴＮＦ・・（II）［Ａｂ
   は免疫グロブリンまたはそのフラグメントを表わし； ＴＮＦはウサギ腫瘍壊死因子を表わし； Ｘ＿１は２価の有機基を表わし； ｔは０または１を表わし； ｎは整数１〜５を表わす。］
5. （５）下記式（III）または（IV）で表わされる、特許
   請求の範囲第１項、第２項または第３項に記載の蛋白複
   合体。 Ａｂ−〔（Ｘ＿２）＿ｐ−Ｓ＿１−（Ｘ＿３）＿ｑ−Ｓ
   ＿２−Ｘ＿４−ＴＮＦ〕＿ｎ・・（III） 〔Ａｂ−（Ｘ＿２）＿ｐ−Ｓ＿１−（Ｘ＿３）＿ｑ−Ｓ
   ＿２−Ｘ＿４〕−＿ｎＴＮＦ・・（IV） Ａｂは免疫グロブリンまたはそのフラグメ ントを表わし； ＴＮＦはウサギ腫瘍壊死因子を表わし； Ｘ＿２、Ｘ＿３及びＸ＿４は同一でも異なってもよく、
   それぞれ２価の有機基を表わし； Ｓ＿１及びＳ＿２はイオウ原子を表わし； ｐ及びｑは同一でも異なってもよく、それ ぞれ整数０または１を表わし； ｎは整数１〜５を表わす。
6. （６）下記式（Ｖ）又は（VI）で表わされる、特許請求
   の範囲第１項、第２項または第３項に記載の蛋白複合体
   。 ▲数式、化学式、表等があります▼・・（Ｖ） ▲数式、化学式、表等があります▼・・（VI） ［Ａｂは免疫グロブリンまたはそのフラグメントを表わ
   し； ＴＮＦはウサギ腫瘍壊死因子を表わし； Ｘ＿２及びＸ＿５は同一でも異なってもよく、それぞれ
   ２価の有機基を表わし； Ｓ＿１はイオウ原子を表わし； ｐは整数０または１を表わし； ｎは整数１〜５を表わす。］
7. （７）免疫グロブリンまたはそのフラグメントと腫瘍壊
   死因子とのいずれか一方の蛋白にジスルフィド基を導入
   し、他方の蛋白に生成または導入したチオール基を反応
   せしめることを特徴とする、下記式（III−１）または
   （IV−１）で表わされる蛋白複合体の製造方法。 Ａｂ−〔（Ｘ＿２）＿ｐ−Ｓ＿１−Ｓ＿２−Ｘ＿４−Ｔ
   ＮＦ〕＿ｎ・・（III−１） 〔Ａｂ−（Ｘ＿２）＿ｐ−Ｓ＿１−Ｓ＿２−Ｘ＿４〕−
   ＿ｎＴＮＦ・・（IV−１） ［Ａｂは免疫グロブリンまたはそのフラグメントを表わ
   し； ＴＮＦはウサギ腫瘍壊死因子を表わし； Ｘ＿２及びＸ＿４は同一でも異なってもよく、それぞれ
   ２価の有機基を表わし； Ｓ＿１及びＳ＿２はイオウ原子を表わし； Ｐは整数０または１を表わし； ｎは整数１〜５を表わす。］
8. （８）生成または導入されたチオール基を有する免疫グ
   ロブリンまたはそのフラグメントと、導入されたチオー
   ル基を有するＴＮＦとを、チオール基と反応し得る官能
   基を２個有する架橋剤を用いて結合することを特徴とす
   る下記式（III−２）または（IV−２）で表わされる、
   蛋白複合体の製造方法。 Ａｂ−〔（Ｘ＿２）＿ｐ−Ｓ＿１−Ｘ＿３−Ｓ＿２−Ｘ
   ＿４−ＴＮＦ〕＿ｎ・・（III−２） 〔Ａｂ−（Ｘ＿２）＿ｐ−Ｓ＿１−Ｘ＿３−Ｓ＿２−Ｘ
   ＿４〕−＿ｎＴＮＦ・・（IV−２） ［Ａｂは免疫グロブリンまたはそのフラグ メントを表し； ＴＮＦはウサギ腫瘍壊死因子を表わし； Ｘ＿２、Ｘ＿３及びＸ＿４は同一でも異なってもよく、
   それぞれ２価の有機基を表わし； Ｓ＿１及びＳ＿２はイオウ原子を表わし； ｐは整数０または１を表わし； ｎは整数１〜５を表わす。］
9. （９）生成または導入されたチオール基を有する免疫グ
   ロブリンまたはそのフラグメントと、導入されたマレイ
   ミド基を有するＴＮＦとを反応させることを特徴とする
   下記式（Ｖ）または（VI）で表わされる、蛋白複合体の
   製造方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼・・（Ｖ） ▲数式、化学式、表等があります▼・・（VI） ［Ａｂは免疫グロブリンまたはそのフラグメントを表わ
   し； ＴＮＦはウサギ腫瘍壊死因子を表わし； Ｘ＿２及びＸ＿５は同一でも異なってもよく、それぞれ
   ２価の有機基を表わし； Ｓ＿１はイオウ原子を表わし； ｐは整数０または１を表わし； ｎは整数１〜５を表わす。］