JPH048411B2 - - Google Patents
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Description
本発明は新規な細胞毒性複合体とその製造法に
関する。更に詳しくは、殺すべき細胞(以下標的
細胞という)のもつ特定の抗原と特異的に結合し
うる免疫グロブリン、あるいはその抗原結合部位
を含むフラグメントからなる構成部分と、細胞毒
性物質を結合した重合体からなる構成部分を有す
る、新規な細胞毒性複合体とその製造方法に関す
るものである。本発明で得られる細胞毒性複合体
は、例えば、ガン細胞に選択的に作用を発現する
抗腫瘍剤として有用である。 ある種の細胞だけを選択的に殺すことを目的と
して、その標的細胞と特異的に結合しうる免疫グ
ロブリンを種々の細胞毒性物質と結合させる試み
がなされてきた。例えば、免疫グロブリンにp−
ビス(2−クロロエチル)アミノ−L−フエニル
アラニン等を結合した複合体(特開昭51−61640
号)、免疫グロブリンにメトトレキセート等を結
合した複合体(特開昭56−65829号)、免疫グロブ
リンにクロラムブシル等を結合した複合体(特開
昭56−65828号)、免疫グロブリンにマイトマイシ
ン−C等を結合した複合体(特開昭55−92325
号)、免疫グロブリンにダウノマイシンを結合し
た複合体(特開昭51−144723号)等が公知であ
る。 更に、特開昭51−126281号には、抗腫瘍免疫グ
ロブリンと、1分子当り制ガン剤を5〜500分子
共有結合している重合体担体(例えば、ポリダル
タミン酸)を、アミド結合によつて結合させて抗
腫瘍剤を得たことが開示されている。 これらの方法で得られた細胞毒性複合体は、腫
瘍細胞と選択的に結合し腫瘍細胞に毒性を発揮す
ることが期待されるものであり、非常に興味のあ
る薬剤である。しかしながら細胞毒性物質を直接
免疫グロブリンに結合する場合は、免疫グロブリ
ンに多数の細胞毒性物質を結合すると、免疫グロ
ブリンの抗原認識活性が低下してしまうので、か
かる困難を回避するためには、少数の細胞毒性物
質を結合するにとどめざるをえない。 一方、重合体を細胞毒性物質の担体として用い
る場合は、上記の難点を改善することができると
考えられる。しかし、特開昭51−126281号記載の
方法は、重合体担体に多数の細胞毒性物質を結合
する反応と、重合体−制ガン剤結合体に免疫グロ
ブリンを結合する反応が同一な反応のため、多数
の免疫グロブリンが重合体担体に結合してしま
い、そのため得られる複合体が均一なものとなり
得ないのみならず、治療剤として用いるのが不適
当な高分子量物質も含む、といつた問題を生じる
のである。 本発明者等は、かかる先行技術の欠点を解決す
べく鋭意研究を行なつた結果、免疫グロブリンと
の結合反応に供する反応基を1コだけ含有し、か
つ、それとは異なる、細胞毒性物質を結合するた
めの、反応基を多数含む重合体担体を用意し、先
づ多数の反応基によつて多数の細胞毒性物質を該
重合体担体に結合した後に、免疫グロブリンとの
反応基によつて免疫グロブリンと結合する、とい
う手順を踏むことによれば、治療剤として用いる
のが不適当な高分子物質を含まず、かつ、多数の
細胞毒性物質を結合した免疫グロブリン−細胞毒
性物質複合体を製造し得ることを見い出し、本発
明に到達した。 すなわち、本発明は殺すべき細胞のもつている
特定の抗原と特異的に結合し得る免疫グロブリン
またはそのフラグメントと、細胞毒性物質をその
側鎖に結合し、反応性基をその未端に含有するア
ミノ酸重合体とを共有結合させてなる細胞毒性複
合体、並びにその製造法である。 本発明において、殺すべき細胞のもつている特
定の抗原と特異的に結合し得る免疫グロブリン
(細胞毒性蛋白複合体の誘導部)とは次のような
ものである。腫瘍細胞あるいは特定のリンパ球等
の標的細胞あるいはそれらを含む組織で免疫され
たヒト,サル,ウマ,ウシ,ヤギ,ヒツジ,ウサ
ギ,モルモツト,ハムスター,ラツト,マウス等
の動物から分離された抗血清より、エタノール分
画、硫安分画、イオン交換あるいは分子篩カラム
クロマトグラフイー等の公知の手段によつて調製
される免疫グロブリン、あるいは標的細胞で免疫
した動物より採取された抗体産生細胞を発癌性の
ある物質で癌化させたり、ミエローマ細胞と融合
させてハイプリドーマにしたりすることによつて
得られるモノクロナルな抗体をいう。また標的細
胞に結合した免疫グロブリンを界面活性剤等で分
離して得られる、標的細胞に特異的な免疫グロブ
リンも本発明の免疫グロブリンに含まれる。 免疫グロブリンにはIgG,IgA,IgM,IgD,
IgEの5つのクラスが知られており、さらに各ク
ラスはいくつかのサブクラスから成つていること
が知られている。しかし、その基本構造は、2本
の重鎖と2本の軽鎖とから成る点、また抗原結合
活性をもつFab部分とエフエクター活性をもつFc
部分から成る点において一致している。ただし、
IgMは5量体、IgAは一部2量体で存在する。 細胞毒性蛋白複合体の誘導部としては、免疫グ
ロブリン分子全体を用いていてもよいが、その抗
原結合部位を含むが、Fc部分をもたないフラグ
メントを用いてもよい。Fc部分を含む複合体に
あつては、Fc部分による標的細胞以外の細胞に
対する非特異的吸着及び細胞膜上のFcリセブタ
ーとの結合が起こり、細胞毒性蛋白質複合体の殺
すべき細胞に対する選択性が減じることがあり、
また免疫グロブリンがヒトにとつて異種蛋白であ
る場合、その抗原性は、Fc部分において特に強
いので、蛋白複合体の抗原性を低下させるため
に、Fc部分のない免疫グロブリンのフラグメン
トが、細胞毒性蛋白複合体の誘導部として望まし
いことがある。一般に、免疫グロブリンをパパイ
ン(papain),トリプシン(trypsin),キモトリ
プシン(chymotrypsin),プラスミン(plasmin)
等の蛋白分解酵素で分解すると、抗原結合部分を
1つもつ、いわゆるFabフラグメントが得られ
る。またペプシン(pepsin)分解、条件によつて
トリプシン分解によつても抗原結合成分を2つも
つ、いわゆるF(ab′)2フラグメントが得られる。
このフラグメントはさらにメルカプタンで処理す
ると、一価のFab′フラグメントになる。さらに
免疫グロブリンを変性させつつ分解させると抗原
結合部分(バリアブル・リージヨンvariable
region)のみが得られる。免疫グロブリン及び免
疫グロブリン由来の例えば上記のフラグメント
は、免疫グロブリンがいかなるクラス、サブクラ
スであれ、いずれも本発明の蛋白複合体の誘導部
として用いることができる。 本発明の免疫グロブリンまたはそのフラグメン
トと、細胞毒性物質を結合せしめた重合体を共有
結合させてなる細胞毒性複合体は、下記式〔〕
で表される。 [式〔〕において、Abは殺すべき細胞のも
つている特定の抗原と特異的に結合し得る免疫グ
ロブリンまたはそのフラグメントを表す。B1は
2価の有機基を表す。S1はイオウ原子を表す。W
は炭素数1〜4のアルキレン基を表す。R1はα
−アミノ酸のα位側鎖(但しカルボキシル基を有
する基は除く)を表す。Yは分子中にアミノ基ま
たはイミノ基を含む細胞毒性物質のアミノ基また
はイミノ基反応残基を表す。Zは水素原子または
1価の陽イオンを表す。mは1〜4の整数を表
す。n、pおよびqは重合体中の各構成単位の数
を表すが、構成単位の配列はランダムであり、
n、p、qに係る各構成単位の全体に占める割合
は、それぞれ5〜50%、40〜95%、0〜10%であ
る。重合度(n+p+q)は10〜1500である。v
は1〜10の整数を表す。] 式〔〕で表わされる細胞毒性複合体におい
て、Yは分子中にアミノ基又はイミノ基を含む細
胞毒性物質のアミノ基又はイミノ基反応残基を表
わす。本発明における細胞毒性物質とは、そのま
まの状態で細胞に毒性を発揮する物質、あるいは
そのままでは毒性を発揮しないが、生体内で細胞
に毒性を発揮し得る物質に転換し得る物質をい
う。これらの例としては、 p−〔N.N−ビス(2−クロロエチル)〕フエ
ニレンジアミン p−〔ビス(2−クロロエチル)アミノ〕L−
フエニルアラニン(メルフアラン) 1−(β−D−アラビノフラノシル)シトシン
またはそのモノホスフエート 1−〔5′−(2−アミノエチルホスホリル)−β
−D−アラビノフラノシル〕シトシン 2−アミノ−N−〔p−ビス(2−クロロエチ
ル)アミノ〕フエニル−3−ヒドロキシ−2−ヒ
ドロキシメチルプロピオンアミド メトトレキセート アクチノマイシンD マイトマイシンC X=H、ダウノマイシン X=OH、アドリアマイシン 等を挙げることができるが、これらに限られるも
のではない。 Zは水素原子又は1価の陽イオン、例えば
Na+,K+,NH4 +である。 Wは炭素数1〜4のアルキレン基を表す。R1
はα−アミノ酸のα位側鎖(但しカルボキシル基
を有する基は除く)であり、例えばα−アミノ酸
がグリシンの場合はR1=H、アラニンの場合は
R1=CH3、フエニルアラニンの場合は
関する。更に詳しくは、殺すべき細胞(以下標的
細胞という)のもつ特定の抗原と特異的に結合し
うる免疫グロブリン、あるいはその抗原結合部位
を含むフラグメントからなる構成部分と、細胞毒
性物質を結合した重合体からなる構成部分を有す
る、新規な細胞毒性複合体とその製造方法に関す
るものである。本発明で得られる細胞毒性複合体
は、例えば、ガン細胞に選択的に作用を発現する
抗腫瘍剤として有用である。 ある種の細胞だけを選択的に殺すことを目的と
して、その標的細胞と特異的に結合しうる免疫グ
ロブリンを種々の細胞毒性物質と結合させる試み
がなされてきた。例えば、免疫グロブリンにp−
ビス(2−クロロエチル)アミノ−L−フエニル
アラニン等を結合した複合体(特開昭51−61640
号)、免疫グロブリンにメトトレキセート等を結
合した複合体(特開昭56−65829号)、免疫グロブ
リンにクロラムブシル等を結合した複合体(特開
昭56−65828号)、免疫グロブリンにマイトマイシ
ン−C等を結合した複合体(特開昭55−92325
号)、免疫グロブリンにダウノマイシンを結合し
た複合体(特開昭51−144723号)等が公知であ
る。 更に、特開昭51−126281号には、抗腫瘍免疫グ
ロブリンと、1分子当り制ガン剤を5〜500分子
共有結合している重合体担体(例えば、ポリダル
タミン酸)を、アミド結合によつて結合させて抗
腫瘍剤を得たことが開示されている。 これらの方法で得られた細胞毒性複合体は、腫
瘍細胞と選択的に結合し腫瘍細胞に毒性を発揮す
ることが期待されるものであり、非常に興味のあ
る薬剤である。しかしながら細胞毒性物質を直接
免疫グロブリンに結合する場合は、免疫グロブリ
ンに多数の細胞毒性物質を結合すると、免疫グロ
ブリンの抗原認識活性が低下してしまうので、か
かる困難を回避するためには、少数の細胞毒性物
質を結合するにとどめざるをえない。 一方、重合体を細胞毒性物質の担体として用い
る場合は、上記の難点を改善することができると
考えられる。しかし、特開昭51−126281号記載の
方法は、重合体担体に多数の細胞毒性物質を結合
する反応と、重合体−制ガン剤結合体に免疫グロ
ブリンを結合する反応が同一な反応のため、多数
の免疫グロブリンが重合体担体に結合してしま
い、そのため得られる複合体が均一なものとなり
得ないのみならず、治療剤として用いるのが不適
当な高分子量物質も含む、といつた問題を生じる
のである。 本発明者等は、かかる先行技術の欠点を解決す
べく鋭意研究を行なつた結果、免疫グロブリンと
の結合反応に供する反応基を1コだけ含有し、か
つ、それとは異なる、細胞毒性物質を結合するた
めの、反応基を多数含む重合体担体を用意し、先
づ多数の反応基によつて多数の細胞毒性物質を該
重合体担体に結合した後に、免疫グロブリンとの
反応基によつて免疫グロブリンと結合する、とい
う手順を踏むことによれば、治療剤として用いる
のが不適当な高分子物質を含まず、かつ、多数の
細胞毒性物質を結合した免疫グロブリン−細胞毒
性物質複合体を製造し得ることを見い出し、本発
明に到達した。 すなわち、本発明は殺すべき細胞のもつている
特定の抗原と特異的に結合し得る免疫グロブリン
またはそのフラグメントと、細胞毒性物質をその
側鎖に結合し、反応性基をその未端に含有するア
ミノ酸重合体とを共有結合させてなる細胞毒性複
合体、並びにその製造法である。 本発明において、殺すべき細胞のもつている特
定の抗原と特異的に結合し得る免疫グロブリン
(細胞毒性蛋白複合体の誘導部)とは次のような
ものである。腫瘍細胞あるいは特定のリンパ球等
の標的細胞あるいはそれらを含む組織で免疫され
たヒト,サル,ウマ,ウシ,ヤギ,ヒツジ,ウサ
ギ,モルモツト,ハムスター,ラツト,マウス等
の動物から分離された抗血清より、エタノール分
画、硫安分画、イオン交換あるいは分子篩カラム
クロマトグラフイー等の公知の手段によつて調製
される免疫グロブリン、あるいは標的細胞で免疫
した動物より採取された抗体産生細胞を発癌性の
ある物質で癌化させたり、ミエローマ細胞と融合
させてハイプリドーマにしたりすることによつて
得られるモノクロナルな抗体をいう。また標的細
胞に結合した免疫グロブリンを界面活性剤等で分
離して得られる、標的細胞に特異的な免疫グロブ
リンも本発明の免疫グロブリンに含まれる。 免疫グロブリンにはIgG,IgA,IgM,IgD,
IgEの5つのクラスが知られており、さらに各ク
ラスはいくつかのサブクラスから成つていること
が知られている。しかし、その基本構造は、2本
の重鎖と2本の軽鎖とから成る点、また抗原結合
活性をもつFab部分とエフエクター活性をもつFc
部分から成る点において一致している。ただし、
IgMは5量体、IgAは一部2量体で存在する。 細胞毒性蛋白複合体の誘導部としては、免疫グ
ロブリン分子全体を用いていてもよいが、その抗
原結合部位を含むが、Fc部分をもたないフラグ
メントを用いてもよい。Fc部分を含む複合体に
あつては、Fc部分による標的細胞以外の細胞に
対する非特異的吸着及び細胞膜上のFcリセブタ
ーとの結合が起こり、細胞毒性蛋白質複合体の殺
すべき細胞に対する選択性が減じることがあり、
また免疫グロブリンがヒトにとつて異種蛋白であ
る場合、その抗原性は、Fc部分において特に強
いので、蛋白複合体の抗原性を低下させるため
に、Fc部分のない免疫グロブリンのフラグメン
トが、細胞毒性蛋白複合体の誘導部として望まし
いことがある。一般に、免疫グロブリンをパパイ
ン(papain),トリプシン(trypsin),キモトリ
プシン(chymotrypsin),プラスミン(plasmin)
等の蛋白分解酵素で分解すると、抗原結合部分を
1つもつ、いわゆるFabフラグメントが得られ
る。またペプシン(pepsin)分解、条件によつて
トリプシン分解によつても抗原結合成分を2つも
つ、いわゆるF(ab′)2フラグメントが得られる。
このフラグメントはさらにメルカプタンで処理す
ると、一価のFab′フラグメントになる。さらに
免疫グロブリンを変性させつつ分解させると抗原
結合部分(バリアブル・リージヨンvariable
region)のみが得られる。免疫グロブリン及び免
疫グロブリン由来の例えば上記のフラグメント
は、免疫グロブリンがいかなるクラス、サブクラ
スであれ、いずれも本発明の蛋白複合体の誘導部
として用いることができる。 本発明の免疫グロブリンまたはそのフラグメン
トと、細胞毒性物質を結合せしめた重合体を共有
結合させてなる細胞毒性複合体は、下記式〔〕
で表される。 [式〔〕において、Abは殺すべき細胞のも
つている特定の抗原と特異的に結合し得る免疫グ
ロブリンまたはそのフラグメントを表す。B1は
2価の有機基を表す。S1はイオウ原子を表す。W
は炭素数1〜4のアルキレン基を表す。R1はα
−アミノ酸のα位側鎖(但しカルボキシル基を有
する基は除く)を表す。Yは分子中にアミノ基ま
たはイミノ基を含む細胞毒性物質のアミノ基また
はイミノ基反応残基を表す。Zは水素原子または
1価の陽イオンを表す。mは1〜4の整数を表
す。n、pおよびqは重合体中の各構成単位の数
を表すが、構成単位の配列はランダムであり、
n、p、qに係る各構成単位の全体に占める割合
は、それぞれ5〜50%、40〜95%、0〜10%であ
る。重合度(n+p+q)は10〜1500である。v
は1〜10の整数を表す。] 式〔〕で表わされる細胞毒性複合体におい
て、Yは分子中にアミノ基又はイミノ基を含む細
胞毒性物質のアミノ基又はイミノ基反応残基を表
わす。本発明における細胞毒性物質とは、そのま
まの状態で細胞に毒性を発揮する物質、あるいは
そのままでは毒性を発揮しないが、生体内で細胞
に毒性を発揮し得る物質に転換し得る物質をい
う。これらの例としては、 p−〔N.N−ビス(2−クロロエチル)〕フエ
ニレンジアミン p−〔ビス(2−クロロエチル)アミノ〕L−
フエニルアラニン(メルフアラン) 1−(β−D−アラビノフラノシル)シトシン
またはそのモノホスフエート 1−〔5′−(2−アミノエチルホスホリル)−β
−D−アラビノフラノシル〕シトシン 2−アミノ−N−〔p−ビス(2−クロロエチ
ル)アミノ〕フエニル−3−ヒドロキシ−2−ヒ
ドロキシメチルプロピオンアミド メトトレキセート アクチノマイシンD マイトマイシンC X=H、ダウノマイシン X=OH、アドリアマイシン 等を挙げることができるが、これらに限られるも
のではない。 Zは水素原子又は1価の陽イオン、例えば
Na+,K+,NH4 +である。 Wは炭素数1〜4のアルキレン基を表す。R1
はα−アミノ酸のα位側鎖(但しカルボキシル基
を有する基は除く)であり、例えばα−アミノ酸
がグリシンの場合はR1=H、アラニンの場合は
R1=CH3、フエニルアラニンの場合は
【式】セリンの場合はR1=
CH2OHである。式〔〕の複合体において、か
かるα−アミノ酸からなる単位は、細胞毒性物質
との結合には何ら関与しないが、複合体の脂溶性
や水溶性、あるいは細胞膜との親和性等を調節す
るのに役立つものである。従つて、脂溶性や水溶
性の調節が格別に必要ない場合には、かかるα−
アミノ酸単位を含有しないものの方(式〔〕に
おいてq=0)が実用的に有利である。 mは1〜4の整数を表わすが、好ましいのはm
が1又は2の場合である。なお、式〔〕で表わ
される複合体としては、例えば、m=1のものと
m=2のものが混在している様な重合体も含む。 nは細胞毒性物質が結合した構成単位の数を表
わし、pは細胞毒性物質が結合していない構成単
位の数を表わし、qは側鎖にカルボキシル基を有
しないα−アミノ酸単位(側鎖は修飾されていて
もよい)の数を表わすが、これらの単位の重合体
中での配列状態はランダム配列の重合体である。
n=5〜1500、好ましくは10〜500であり、p=
0〜1500、好ましくは0〜500であり、q=0〜
1500、好ましくはq=0〜500である。n、p、
qに係る各構成単位の全体に占める割合は、それ
ぞれ5〜50%、40〜95%、0〜10%である。重合
度(n+p+q)は10〜1500である。 S1は細胞毒性物質を結合した反応性重合体上の
チオール基又は活性ジスルフイド基に由来する硫
黄原子を表わす。 B1は2価の有機基を表わすが、これは細胞毒
性物質を結合した反応性重合体を免疫グロブリン
またはそのフラグメントと結合する際に、前もつ
て免疫グロブリン又はそのフラグメントに導入す
る、架橋剤に由来する残基を表わすか、あるいは
免疫グロブリンまたはそのフラグメントに所属す
るチオール基に由来する硫黄原子を表わす。 上記式〔〕においてB1は、例えば下記式 [Yは活性エステルのアルコール残基を表す。
B2は2価の有機基である。] で表わされる、マレイミド基を有する架橋剤に由
来する2価の有機基である。B2で表わされる2
価の有機基は、化学的に不活性であれば特に限定
されないが、一般的には分枝を有するか有しない
アルキレン基、フエニレン基等から適宜選ばれ
る。 〔〕で表わされる架橋剤の具体例としては、
例えばメタ−(N−マレイミド)安息香酸N−ヒ
ドロキシサクシンイミドエステル メタ−(N−マレイミド)安息香酸2,4−ジニ
トロフエニルエステル、β−(N−マレイミド)
プロピオン酸N−ヒドロキシサクシンイミドエス
テル等を挙げることができる。 本発明の細胞毒性複合体は、抗体と細胞毒性物
質を結合した重合体が、ジスルフイド基より安定
なスルフイド基により結合されている安定性の高
い複合体である。 本発明の細胞毒性複合体は、免疫グロブリンま
たはそのフラグメントと、細胞毒性物質を結合せ
しめた反応性重合体を、共有結合させることによ
り製造することができる。 すなわち、本発明の式〔〕で表される細胞毒
性複合体は、下記式〔〕 [式〔〕において、AbおよびB1の定義は式
〔〕に同じ。v′は1〜10の整数を表す。] で表される導入されたマレイミド基をもつ免疫グ
ロブリンまたはそのフラグメントと、下記式
〔〕 [式〔〕において、S1、W、R1、Y、Z、
m、n、pおよびqの定義は式〔〕の場合と同
じである。] で表される、細胞毒性物質を結合しかつ分子末端
にチオール基を有する反応性重合体とを反応せし
めることにより製造することができる。 上記式〔〕で表される導入されたマレイミド
基をもつ免疫グロブリンまたはそのフラグメント
は、例えば、免疫グロブリンまたはそのフラグメ
ントに前記式〔〕で表わされるマレイミド基を
有する架橋剤を反応せしめることにより製造する
ことができる。 次に、本発明の原料として用いられる前記式
〔〕で表わされる細胞毒性物質を結合した反応
性重合体の製造方法について述べる。かかる細胞
毒性物質を結合した反応性重合体は各種の方法に
より製造できるが、例示すれば以下の通りであ
る。 例えば、式〔〕で表わされる細胞毒性物質を
結合した反応重合体において、m=2、q=0、
W=−CH2CH2CO−、Y=ダウノマイシン残基、
Z=Naの場合を用いて製造方法を説明すれば先
づ、親水性重合体であるポリ−L−グルタミン酸
(ナトリウム塩)に水溶液中、室温下にN−サク
シンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピ
オネート
かるα−アミノ酸からなる単位は、細胞毒性物質
との結合には何ら関与しないが、複合体の脂溶性
や水溶性、あるいは細胞膜との親和性等を調節す
るのに役立つものである。従つて、脂溶性や水溶
性の調節が格別に必要ない場合には、かかるα−
アミノ酸単位を含有しないものの方(式〔〕に
おいてq=0)が実用的に有利である。 mは1〜4の整数を表わすが、好ましいのはm
が1又は2の場合である。なお、式〔〕で表わ
される複合体としては、例えば、m=1のものと
m=2のものが混在している様な重合体も含む。 nは細胞毒性物質が結合した構成単位の数を表
わし、pは細胞毒性物質が結合していない構成単
位の数を表わし、qは側鎖にカルボキシル基を有
しないα−アミノ酸単位(側鎖は修飾されていて
もよい)の数を表わすが、これらの単位の重合体
中での配列状態はランダム配列の重合体である。
n=5〜1500、好ましくは10〜500であり、p=
0〜1500、好ましくは0〜500であり、q=0〜
1500、好ましくはq=0〜500である。n、p、
qに係る各構成単位の全体に占める割合は、それ
ぞれ5〜50%、40〜95%、0〜10%である。重合
度(n+p+q)は10〜1500である。 S1は細胞毒性物質を結合した反応性重合体上の
チオール基又は活性ジスルフイド基に由来する硫
黄原子を表わす。 B1は2価の有機基を表わすが、これは細胞毒
性物質を結合した反応性重合体を免疫グロブリン
またはそのフラグメントと結合する際に、前もつ
て免疫グロブリン又はそのフラグメントに導入す
る、架橋剤に由来する残基を表わすか、あるいは
免疫グロブリンまたはそのフラグメントに所属す
るチオール基に由来する硫黄原子を表わす。 上記式〔〕においてB1は、例えば下記式 [Yは活性エステルのアルコール残基を表す。
B2は2価の有機基である。] で表わされる、マレイミド基を有する架橋剤に由
来する2価の有機基である。B2で表わされる2
価の有機基は、化学的に不活性であれば特に限定
されないが、一般的には分枝を有するか有しない
アルキレン基、フエニレン基等から適宜選ばれ
る。 〔〕で表わされる架橋剤の具体例としては、
例えばメタ−(N−マレイミド)安息香酸N−ヒ
ドロキシサクシンイミドエステル メタ−(N−マレイミド)安息香酸2,4−ジニ
トロフエニルエステル、β−(N−マレイミド)
プロピオン酸N−ヒドロキシサクシンイミドエス
テル等を挙げることができる。 本発明の細胞毒性複合体は、抗体と細胞毒性物
質を結合した重合体が、ジスルフイド基より安定
なスルフイド基により結合されている安定性の高
い複合体である。 本発明の細胞毒性複合体は、免疫グロブリンま
たはそのフラグメントと、細胞毒性物質を結合せ
しめた反応性重合体を、共有結合させることによ
り製造することができる。 すなわち、本発明の式〔〕で表される細胞毒
性複合体は、下記式〔〕 [式〔〕において、AbおよびB1の定義は式
〔〕に同じ。v′は1〜10の整数を表す。] で表される導入されたマレイミド基をもつ免疫グ
ロブリンまたはそのフラグメントと、下記式
〔〕 [式〔〕において、S1、W、R1、Y、Z、
m、n、pおよびqの定義は式〔〕の場合と同
じである。] で表される、細胞毒性物質を結合しかつ分子末端
にチオール基を有する反応性重合体とを反応せし
めることにより製造することができる。 上記式〔〕で表される導入されたマレイミド
基をもつ免疫グロブリンまたはそのフラグメント
は、例えば、免疫グロブリンまたはそのフラグメ
ントに前記式〔〕で表わされるマレイミド基を
有する架橋剤を反応せしめることにより製造する
ことができる。 次に、本発明の原料として用いられる前記式
〔〕で表わされる細胞毒性物質を結合した反応
性重合体の製造方法について述べる。かかる細胞
毒性物質を結合した反応性重合体は各種の方法に
より製造できるが、例示すれば以下の通りであ
る。 例えば、式〔〕で表わされる細胞毒性物質を
結合した反応重合体において、m=2、q=0、
W=−CH2CH2CO−、Y=ダウノマイシン残基、
Z=Naの場合を用いて製造方法を説明すれば先
づ、親水性重合体であるポリ−L−グルタミン酸
(ナトリウム塩)に水溶液中、室温下にN−サク
シンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピ
オネート
【式】を反
応させれば、ポリ−L−グルタミン酸のアミノ末
端に3−(2−ピリジルジチオ)プロピオニル基
が導入される。即ち、 さらに精製工程を経て得られた、活性ジスルフ
イド基を末端に含有するポリ−L−グルタミン酸
(ナトリウム塩)に、水溶液中室温下に水溶性カ
ルボジイミドの存在下ダウノマイシンを反応せし
めれば、ダウノマイシンを側鎖に結合し、活性ジ
スルフイド基を末端に含有する反応性重合体が得
られる。即ち、 (ダウノマイシン塩酸塩/水溶性カルボジイミ
ド) さらに活性ジスルフイド基を、例えば、2−メ
ルカプトエタノールを作用して還元的に切断すれ
ば、ダウノマイシンを側鎖に結合し、チオール基
を末端に含有する、式〔〕に相当する反応性重
合体を得ることができる。即ち、 本発明の細胞毒性複合体の製造方法を例示すれ
ば次の通りである。 式〔〕で表わされる導入されたマレイミド基
をもつ免疫グロブリンまたはそのフラグメント1
モルに対し、式〔〕で表わされる細胞毒性物質
を結合した反応性重合体を0.3〜10モルの割合で
使用するのが好ましい。反応は、蛋白又は重合体
をPH5〜10の緩衝液に合計の蛋白及び重合体の濃
度が0.5〜100mg/ml(より好ましくは1〜20mg/
ml)になるように混じ、0〜60℃で静置して行な
うことができる。反応時間は反応スケール、反応
条件によるが、一般には4時間〜3日間である。
得られた細胞毒性複合体の、反応混合物からの分
離、精製は通常用いられる操作、例えば透析、分
子ふるいのカラムクロマトグラフイーによつて行
なうことができる。 以下実施例により本発明を詳述する。 参考例 (イ) 抗マウス白血病L1210IgGの調製 マウス白血病L1210細胞1×106個をフロイン
ト完全アジユバンドとのエマルジヨンとし、家兎
に静脈注射した。その後更に、1週間間隔で3
回、それぞれ約1×106個のL1210細胞をアジユ
バンドと共に皮下注射し、最終投与日から8日後
に採血した。得られた血液をプールし、血清を分
離し、その血清を56℃、30分間加熱、非働化し
た。こうして得られた抗L1210血清200mlに、硫
安の飽和水溶液200mlを加えて、生じた沈澱を遠
心分離によつて分取した。この沈澱を0.01Mリン
酸緩衝液(PH7.6)50mlに溶解し、更に同緩衝液
に対して十分な透析した。この透析内液を同じ緩
衝液で平衡化したDEAEセルロースカラムクロマ
トグラフイー(カラムサイズ3cm×94cm)にかけ
て、未吸着分面として抗L1210IgGを含む溶液を
得た。 (ロ) 免疫グロブリンよりF(ab′)2フラグメントの
分離 上記(イ)の如くして得られた抗1210IgGの1.2gを
0.1M酢酸緩衝液(PH4.5)40mlに溶解し、24mgの
ペプシンを添加して、37℃で約18時間分解した
後、分解生成物を生理食塩水中でセフアデツクス
G200カラムクロマトグラフイー(カラムサイズ
3.5cm×140cm)にかけて、分子量約10万のところ
に流出する蛋白として純粋なF(ab′)2フラグメン
トを得た。 (ハ) Fab′フラグメントの調製 上記(ロ)の如くして得られたF(ab′)2フラグメン
ト18.4mgを含む0.01Mトリス・塩酸−0.14M塩化
ナトリウム−2mMEDTA溶液(PH8.3)2.0mlに、
150mMの2−メルカプトエタノール水溶液を
0.02ml加えて、37℃で1時間還元した。反応後、
その溶液を5mM酢酸緩衝液−0.14M塩化ナトリ
ウム−1mMEDTA溶液(PH5.5)(以下、ANE緩
衝液と略す)で平衡化したセフアデツクスG25カ
ラムクロマトグラフイー(1.0cm×20cm)にかけ
て2−メルカプトエタノールを除去し、チオール
基1個を有するFab′フラグメントを得た。 (ニ) IgMの精製 (イ)の如くして、得られた抗L1210抗血清100ml
に飽和硫安100mlを添加し、生じた沈澱を遠心分
離した。沈澱の少量を0.9%塩化カリウム水溶液
に溶解し、遠心して生じた不溶物を除いたのち、
0.9%塩化ナトリウム水溶液で平衡化したセフア
デツクG−200カラムクロマトグラフイー(2.2cm
×102cm)にかけ、第1ピークにIgM画分をえた。
得られたIgM画分に同容積の飽和硫安を加え、生
じた沈澱を遠心分離した後、少量の0.9%塩化ナ
トリウム水溶液に溶かし、同じ溶液に対し充分に
透析した。 (ホ) IgMsの調製 0.9%塩化ナトリウム水溶液に溶解したウサギ
IgM(9.5mg/ml)1.8mlに、1Mトリス塩酸緩衝液
(PH8.6)に溶解した0.2Mシステイン0.2mlを混合
し、室温で16時間還元した後、セフアデツクスG
−25(0.8×43cm)を用いるゲル濾過(溶媒は緩衝
液A)により、過剰のシステインを除いた。 (ヘ) ラツトのα−フエトプロテインに特異的な免
疫グロブリンの調製 精製したラツトα−フエトプロテイン(以下
AFPと省略する)1mgを、フロイント完全アジ
ユバントとのエマルジヨンとし、馬に週1回皮下
注射して、過免疫とした。この馬から採血し、血
清を分離した。血清を硫安分画し、ラツトAFP
を結合したセフアロース6Bカラムを使用するア
フイニテイクロマトグラフイー、およびセフアデ
ツクスG−200を使用するゲル濾過等により精製
し、純粋な抗ラツトAFP馬免疫グロブリンを得
た。 (ト) 側鎖にダウノマイシンを結合し、末端に2−
ピリジルジチオ基又はチオール基を含有するポ
リ−L−グルタミン酸の製造。 ポリ−L−グルタミン酸のナトリウム塩226.5
mgの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(PH7.5)(15
ml)中溶液に、N−サクシイミジル3−(2−ピ
リジルジチオ)プロピオネート(以下SPDPと省
略する)68.8mgのエタノール(6ml)溶液を撹拌
下、2度に分けて加え、1.5時間室温下に反応さ
せた。反応液をセロフアン透析チユーブに入れ、
0.01Mリン酸緩衝液(PH7.5)に対して4゜で2日間
透析した後(低分子物を除去)回収液(50ml)
に、ジチオスレイトール17mgの0.1Mリン酸ナト
リウム(PH6.0)緩衝液2.0ml中溶液を加え、室温
下に80分間反応させた。次いで塩酸酸性とし、生
じた沈澱を遠心分離した。得られたポリ−L−グ
ルタミン酸の、沈澱物(末端にチオール基を有す
るポリ−L−グルタミン酸(1)〜と有しないポリ−L
−グルタミン酸を含む。)は、0.01NHClで洗浄
した。 一方、チオプロピルセフアロース6Bゲル
(Thiopropyl Sepharse 6B、フアルマシア社
製)15mlを0.1Mリン酸ナトリウム(PH6.0)−
1mMエチレンジアミンテトラ酢酸(以後EDTA
と省略する)(PH6.0)緩衝液40mlに分散し、得ら
れた分散溶液に、前記で得られたポリ−L−グル
タミン酸を同一緩衝液10mlに溶解して得られる溶
液を加え、室温下、窒素雰囲気中でゆるやかに1
夜撹拌した。これで末端にチオール基を有するポ
リ−L−グルタミン酸が樹脂に結合する。次いで
樹脂を口別し、0.01Mリン酸緩衝液PH7.5で充分
洗浄した。 かくして得られた樹脂を0.1Mトリス−塩酸−
1mMEDEA(PH8.5)緩衝液50mlに分散し2−メ
ルカプトエタノール1.17gを加え、室温下窒素雰
囲気中で10時間ゆるやかに撹拌した。これで末端
がチオール基のポリ−L−グルタミン酸(1)〜が樹脂
から遊離する。 樹脂を濾別し、0.01Mトリス−塩酸−
0.1mMEDTA(PH8.5)緩衝液でよく洗浄し、次い
で濾液と洗液を氷冷下塩酸でPH1.8とし、生じた
末端にチオール基を有するポリ−L−グルタミン
酸の沈澱を遠心分離した。 得られた沈澱を、再び0.4Mリン酸ナトリウム
−1mMEDTA(PH7.5)緩衝液1mlに溶解し、得
られた溶液を2−ピリジルジスルフイド(以下2
−PDSと省略する)23mgのエタノール(4ml)
溶液0.1Mリン酸ナトリウム−1mMEDTA(PH6.0)
10mlに加えて得られた溶液に加え、室温下で30分
間反応させた後、(ポリ−L−グルタミン酸の末
端が活性ジスルフイド基となる)反応液をセロフ
アンチユーブに入れ、0.01Mリン酸ナトリウム
(PH7.5)緩衝液に対して6時間、純れに対して、
1日透析した。回収液を減圧で30mlに減少し、透
結乾燥すると、末端に2−ピリジルジチオ基が導
入されたポリ−L−グルタミン酸(ナトリウム
塩)(2)〜の綿状固体35.4mgが得られた(重量収率
15.6%)。 3の末端2−ピリジルジチオ基定量 一定量のサンプルを精秤し(1.895mg)、3.00ml
の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(PH7.2)に溶解
し、ジチオスレイトールの小片を加え、遊離した
2−メルカプトピリジンに由来する吸収
(343nm、(分子吸光係数)ε=8080)を測定した
(A=0.286)。精秤されたサンプル中の末端基量
は0.1062μmole、従つて、同サンプル中の末端活
性ジスルフイド含有ポリ−L−グルタミン酸分子
の分子量は17800、又、同分子中のグルタミン酸
(ナトリウム塩)のユニツト数は、1ユニツトの
質量数が151であることより、118と計算された。 次いで、末端に2−ピリジルチオ基を含有する
ポリ−L−グルタミン酸(ナトリウム塩)(分子
量17800)25mg(1.40μmole)を、5%食塩水6
mlに溶解し、ダウノマイシン塩酸塩11.2mgと、1
−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)
カルボジイミド塩酸塩(以下EDCI,HClと省略
する)38.1mgを加え、室温下にて一夜反応した。
反応液をセロフアンチユーブに入れ、水に対して
4゜で充分透析し、回収液を減圧で10.5mlに濃縮す
ると、目的物である末端に2−ピリジルチオ基を
含有し、側鎖にダウノマイシンを結合したPLGA
(ナトリウム塩)(4)〜の水溶液が得られた。490nm
吸収より結合したダウノマイシンの量を、前記(ト)
の場合と同様にして、ジチオスレイトールを添加
して遊離する2−メルカプトピリジルに由来する
343nmの吸収により、末端基量をそれぞれ定量す
ると、以下結果を得た。ダウノマイシン量1.16×
10-5mole、末端基量1.36×10-6、PLGA鎖に結合
したダウノマイシンの数は平均8.53個、PLGAの
回収率は97%。 実施例 1 1−(イ) マレイミド基を導入した免疫グロブリン
調製、参考例(ヘ)のごとき手段で得られた抗
AFP馬免疫グロブリン(IgG)37.4mgを含む
0.1Mリン酸緩衝液(PH6.5)1.60mlに、N−ヒ
ドロキシサクシンイミジル−m−マレイミドベ
ンゾエート(以下SMBと省略する)1.57mgを
溶解したN,N−ジメチルホルムアミド(以下
DMFと省略する)0.1mlを添加し、室温で30分
反応させた。これに1Mトリス塩酸緩衝液(PH
6.9)を50μ加えて反応を止めた後、反応液を
セフアデツクスG−25のカラム(0.8×42cm)。
(5mM酢酸緩衝液−0.14M塩化ナトリウム(以
下NaClと省略)−1mMエチレンジアミン四酢
酸(以下EDTAと省略)(PH5.5))に通し、過
剰の試薬を除くと、マレイミド基を導入された
抗AFP馬IgGを含む溶液2.96mlが得られた。 1−(ロ) マレイミド基を導入した免疫グロブリン
(1−1〜)と、チオール基を末端に含有し側鎖
にダウノマイシンを結合したポリ−L−グルタ
メート(1−2〜)との反応による、細胞毒性複
合体(1−3〜)の製造。 上記1−(イ)の如くして得られたm−マレイミ
ドベンゾイル基を導入されたIgG(1−1〜)29.4
mgを含む溶液(5mM酢酸緩衝液−0.14MNaCl
−1mMEDTA(PH5.5))2.96mlに参考例(ト)のご
とくして得られた、末端にチオール基を含有し
側鎖にダウノマイシンを結合したポリ−Lグル
タミン酸(ナトリウム塩)(1−2〜)(末端チオ
ール基相当3.88×10-7mole/ml)を含む、
5mM酢酸緩衝液−0.14MNaCl1mMEDTA(PH
5.5)5.05ml及び0.5M酢酸緩衝液(PH6.5)2.0ml
を加え、4゜で1夜反応させた。こうして得られ
た複合体(1−3〜)に、等容積の50%飽和硫安
溶液を加え、5分後遠心分離した。生じた沈澱
に、10mMリン酸緩衝液−0.14MNaCl(PH7.4)
4mlを加えて溶解した後、同緩衝液に充分透析
した。 1−(ハ) ラツト肝癌AH66細胞に対する複合体
(1−3〜)の細胞毒性。 上記1−(ロ)のごとくして得られた複合体1〜
3〜の、標的細胞AH66に対する細胞毒性を検討
した。 96穴の培養プレートに、1×103個のAH66
細胞を含む、10%馬血清を添加したイーグル
MEM培地を分注し、更に種々の被検サンプル
を加えて、全量を0.2mlとし、5%CO2雰囲気
下、37゜で48時間培養後、トリパンブルー染色
法により生細胞数を測定した。培養は3系列行
ない、値はその平均値で示した。結果を第一表
に示した。
端に3−(2−ピリジルジチオ)プロピオニル基
が導入される。即ち、 さらに精製工程を経て得られた、活性ジスルフ
イド基を末端に含有するポリ−L−グルタミン酸
(ナトリウム塩)に、水溶液中室温下に水溶性カ
ルボジイミドの存在下ダウノマイシンを反応せし
めれば、ダウノマイシンを側鎖に結合し、活性ジ
スルフイド基を末端に含有する反応性重合体が得
られる。即ち、 (ダウノマイシン塩酸塩/水溶性カルボジイミ
ド) さらに活性ジスルフイド基を、例えば、2−メ
ルカプトエタノールを作用して還元的に切断すれ
ば、ダウノマイシンを側鎖に結合し、チオール基
を末端に含有する、式〔〕に相当する反応性重
合体を得ることができる。即ち、 本発明の細胞毒性複合体の製造方法を例示すれ
ば次の通りである。 式〔〕で表わされる導入されたマレイミド基
をもつ免疫グロブリンまたはそのフラグメント1
モルに対し、式〔〕で表わされる細胞毒性物質
を結合した反応性重合体を0.3〜10モルの割合で
使用するのが好ましい。反応は、蛋白又は重合体
をPH5〜10の緩衝液に合計の蛋白及び重合体の濃
度が0.5〜100mg/ml(より好ましくは1〜20mg/
ml)になるように混じ、0〜60℃で静置して行な
うことができる。反応時間は反応スケール、反応
条件によるが、一般には4時間〜3日間である。
得られた細胞毒性複合体の、反応混合物からの分
離、精製は通常用いられる操作、例えば透析、分
子ふるいのカラムクロマトグラフイーによつて行
なうことができる。 以下実施例により本発明を詳述する。 参考例 (イ) 抗マウス白血病L1210IgGの調製 マウス白血病L1210細胞1×106個をフロイン
ト完全アジユバンドとのエマルジヨンとし、家兎
に静脈注射した。その後更に、1週間間隔で3
回、それぞれ約1×106個のL1210細胞をアジユ
バンドと共に皮下注射し、最終投与日から8日後
に採血した。得られた血液をプールし、血清を分
離し、その血清を56℃、30分間加熱、非働化し
た。こうして得られた抗L1210血清200mlに、硫
安の飽和水溶液200mlを加えて、生じた沈澱を遠
心分離によつて分取した。この沈澱を0.01Mリン
酸緩衝液(PH7.6)50mlに溶解し、更に同緩衝液
に対して十分な透析した。この透析内液を同じ緩
衝液で平衡化したDEAEセルロースカラムクロマ
トグラフイー(カラムサイズ3cm×94cm)にかけ
て、未吸着分面として抗L1210IgGを含む溶液を
得た。 (ロ) 免疫グロブリンよりF(ab′)2フラグメントの
分離 上記(イ)の如くして得られた抗1210IgGの1.2gを
0.1M酢酸緩衝液(PH4.5)40mlに溶解し、24mgの
ペプシンを添加して、37℃で約18時間分解した
後、分解生成物を生理食塩水中でセフアデツクス
G200カラムクロマトグラフイー(カラムサイズ
3.5cm×140cm)にかけて、分子量約10万のところ
に流出する蛋白として純粋なF(ab′)2フラグメン
トを得た。 (ハ) Fab′フラグメントの調製 上記(ロ)の如くして得られたF(ab′)2フラグメン
ト18.4mgを含む0.01Mトリス・塩酸−0.14M塩化
ナトリウム−2mMEDTA溶液(PH8.3)2.0mlに、
150mMの2−メルカプトエタノール水溶液を
0.02ml加えて、37℃で1時間還元した。反応後、
その溶液を5mM酢酸緩衝液−0.14M塩化ナトリ
ウム−1mMEDTA溶液(PH5.5)(以下、ANE緩
衝液と略す)で平衡化したセフアデツクスG25カ
ラムクロマトグラフイー(1.0cm×20cm)にかけ
て2−メルカプトエタノールを除去し、チオール
基1個を有するFab′フラグメントを得た。 (ニ) IgMの精製 (イ)の如くして、得られた抗L1210抗血清100ml
に飽和硫安100mlを添加し、生じた沈澱を遠心分
離した。沈澱の少量を0.9%塩化カリウム水溶液
に溶解し、遠心して生じた不溶物を除いたのち、
0.9%塩化ナトリウム水溶液で平衡化したセフア
デツクG−200カラムクロマトグラフイー(2.2cm
×102cm)にかけ、第1ピークにIgM画分をえた。
得られたIgM画分に同容積の飽和硫安を加え、生
じた沈澱を遠心分離した後、少量の0.9%塩化ナ
トリウム水溶液に溶かし、同じ溶液に対し充分に
透析した。 (ホ) IgMsの調製 0.9%塩化ナトリウム水溶液に溶解したウサギ
IgM(9.5mg/ml)1.8mlに、1Mトリス塩酸緩衝液
(PH8.6)に溶解した0.2Mシステイン0.2mlを混合
し、室温で16時間還元した後、セフアデツクスG
−25(0.8×43cm)を用いるゲル濾過(溶媒は緩衝
液A)により、過剰のシステインを除いた。 (ヘ) ラツトのα−フエトプロテインに特異的な免
疫グロブリンの調製 精製したラツトα−フエトプロテイン(以下
AFPと省略する)1mgを、フロイント完全アジ
ユバントとのエマルジヨンとし、馬に週1回皮下
注射して、過免疫とした。この馬から採血し、血
清を分離した。血清を硫安分画し、ラツトAFP
を結合したセフアロース6Bカラムを使用するア
フイニテイクロマトグラフイー、およびセフアデ
ツクスG−200を使用するゲル濾過等により精製
し、純粋な抗ラツトAFP馬免疫グロブリンを得
た。 (ト) 側鎖にダウノマイシンを結合し、末端に2−
ピリジルジチオ基又はチオール基を含有するポ
リ−L−グルタミン酸の製造。 ポリ−L−グルタミン酸のナトリウム塩226.5
mgの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(PH7.5)(15
ml)中溶液に、N−サクシイミジル3−(2−ピ
リジルジチオ)プロピオネート(以下SPDPと省
略する)68.8mgのエタノール(6ml)溶液を撹拌
下、2度に分けて加え、1.5時間室温下に反応さ
せた。反応液をセロフアン透析チユーブに入れ、
0.01Mリン酸緩衝液(PH7.5)に対して4゜で2日間
透析した後(低分子物を除去)回収液(50ml)
に、ジチオスレイトール17mgの0.1Mリン酸ナト
リウム(PH6.0)緩衝液2.0ml中溶液を加え、室温
下に80分間反応させた。次いで塩酸酸性とし、生
じた沈澱を遠心分離した。得られたポリ−L−グ
ルタミン酸の、沈澱物(末端にチオール基を有す
るポリ−L−グルタミン酸(1)〜と有しないポリ−L
−グルタミン酸を含む。)は、0.01NHClで洗浄
した。 一方、チオプロピルセフアロース6Bゲル
(Thiopropyl Sepharse 6B、フアルマシア社
製)15mlを0.1Mリン酸ナトリウム(PH6.0)−
1mMエチレンジアミンテトラ酢酸(以後EDTA
と省略する)(PH6.0)緩衝液40mlに分散し、得ら
れた分散溶液に、前記で得られたポリ−L−グル
タミン酸を同一緩衝液10mlに溶解して得られる溶
液を加え、室温下、窒素雰囲気中でゆるやかに1
夜撹拌した。これで末端にチオール基を有するポ
リ−L−グルタミン酸が樹脂に結合する。次いで
樹脂を口別し、0.01Mリン酸緩衝液PH7.5で充分
洗浄した。 かくして得られた樹脂を0.1Mトリス−塩酸−
1mMEDEA(PH8.5)緩衝液50mlに分散し2−メ
ルカプトエタノール1.17gを加え、室温下窒素雰
囲気中で10時間ゆるやかに撹拌した。これで末端
がチオール基のポリ−L−グルタミン酸(1)〜が樹脂
から遊離する。 樹脂を濾別し、0.01Mトリス−塩酸−
0.1mMEDTA(PH8.5)緩衝液でよく洗浄し、次い
で濾液と洗液を氷冷下塩酸でPH1.8とし、生じた
末端にチオール基を有するポリ−L−グルタミン
酸の沈澱を遠心分離した。 得られた沈澱を、再び0.4Mリン酸ナトリウム
−1mMEDTA(PH7.5)緩衝液1mlに溶解し、得
られた溶液を2−ピリジルジスルフイド(以下2
−PDSと省略する)23mgのエタノール(4ml)
溶液0.1Mリン酸ナトリウム−1mMEDTA(PH6.0)
10mlに加えて得られた溶液に加え、室温下で30分
間反応させた後、(ポリ−L−グルタミン酸の末
端が活性ジスルフイド基となる)反応液をセロフ
アンチユーブに入れ、0.01Mリン酸ナトリウム
(PH7.5)緩衝液に対して6時間、純れに対して、
1日透析した。回収液を減圧で30mlに減少し、透
結乾燥すると、末端に2−ピリジルジチオ基が導
入されたポリ−L−グルタミン酸(ナトリウム
塩)(2)〜の綿状固体35.4mgが得られた(重量収率
15.6%)。 3の末端2−ピリジルジチオ基定量 一定量のサンプルを精秤し(1.895mg)、3.00ml
の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(PH7.2)に溶解
し、ジチオスレイトールの小片を加え、遊離した
2−メルカプトピリジンに由来する吸収
(343nm、(分子吸光係数)ε=8080)を測定した
(A=0.286)。精秤されたサンプル中の末端基量
は0.1062μmole、従つて、同サンプル中の末端活
性ジスルフイド含有ポリ−L−グルタミン酸分子
の分子量は17800、又、同分子中のグルタミン酸
(ナトリウム塩)のユニツト数は、1ユニツトの
質量数が151であることより、118と計算された。 次いで、末端に2−ピリジルチオ基を含有する
ポリ−L−グルタミン酸(ナトリウム塩)(分子
量17800)25mg(1.40μmole)を、5%食塩水6
mlに溶解し、ダウノマイシン塩酸塩11.2mgと、1
−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)
カルボジイミド塩酸塩(以下EDCI,HClと省略
する)38.1mgを加え、室温下にて一夜反応した。
反応液をセロフアンチユーブに入れ、水に対して
4゜で充分透析し、回収液を減圧で10.5mlに濃縮す
ると、目的物である末端に2−ピリジルチオ基を
含有し、側鎖にダウノマイシンを結合したPLGA
(ナトリウム塩)(4)〜の水溶液が得られた。490nm
吸収より結合したダウノマイシンの量を、前記(ト)
の場合と同様にして、ジチオスレイトールを添加
して遊離する2−メルカプトピリジルに由来する
343nmの吸収により、末端基量をそれぞれ定量す
ると、以下結果を得た。ダウノマイシン量1.16×
10-5mole、末端基量1.36×10-6、PLGA鎖に結合
したダウノマイシンの数は平均8.53個、PLGAの
回収率は97%。 実施例 1 1−(イ) マレイミド基を導入した免疫グロブリン
調製、参考例(ヘ)のごとき手段で得られた抗
AFP馬免疫グロブリン(IgG)37.4mgを含む
0.1Mリン酸緩衝液(PH6.5)1.60mlに、N−ヒ
ドロキシサクシンイミジル−m−マレイミドベ
ンゾエート(以下SMBと省略する)1.57mgを
溶解したN,N−ジメチルホルムアミド(以下
DMFと省略する)0.1mlを添加し、室温で30分
反応させた。これに1Mトリス塩酸緩衝液(PH
6.9)を50μ加えて反応を止めた後、反応液を
セフアデツクスG−25のカラム(0.8×42cm)。
(5mM酢酸緩衝液−0.14M塩化ナトリウム(以
下NaClと省略)−1mMエチレンジアミン四酢
酸(以下EDTAと省略)(PH5.5))に通し、過
剰の試薬を除くと、マレイミド基を導入された
抗AFP馬IgGを含む溶液2.96mlが得られた。 1−(ロ) マレイミド基を導入した免疫グロブリン
(1−1〜)と、チオール基を末端に含有し側鎖
にダウノマイシンを結合したポリ−L−グルタ
メート(1−2〜)との反応による、細胞毒性複
合体(1−3〜)の製造。 上記1−(イ)の如くして得られたm−マレイミ
ドベンゾイル基を導入されたIgG(1−1〜)29.4
mgを含む溶液(5mM酢酸緩衝液−0.14MNaCl
−1mMEDTA(PH5.5))2.96mlに参考例(ト)のご
とくして得られた、末端にチオール基を含有し
側鎖にダウノマイシンを結合したポリ−Lグル
タミン酸(ナトリウム塩)(1−2〜)(末端チオ
ール基相当3.88×10-7mole/ml)を含む、
5mM酢酸緩衝液−0.14MNaCl1mMEDTA(PH
5.5)5.05ml及び0.5M酢酸緩衝液(PH6.5)2.0ml
を加え、4゜で1夜反応させた。こうして得られ
た複合体(1−3〜)に、等容積の50%飽和硫安
溶液を加え、5分後遠心分離した。生じた沈澱
に、10mMリン酸緩衝液−0.14MNaCl(PH7.4)
4mlを加えて溶解した後、同緩衝液に充分透析
した。 1−(ハ) ラツト肝癌AH66細胞に対する複合体
(1−3〜)の細胞毒性。 上記1−(ロ)のごとくして得られた複合体1〜
3〜の、標的細胞AH66に対する細胞毒性を検討
した。 96穴の培養プレートに、1×103個のAH66
細胞を含む、10%馬血清を添加したイーグル
MEM培地を分注し、更に種々の被検サンプル
を加えて、全量を0.2mlとし、5%CO2雰囲気
下、37゜で48時間培養後、トリパンブルー染色
法により生細胞数を測定した。培養は3系列行
ない、値はその平均値で示した。結果を第一表
に示した。
【表】
第1表から、本発明の細胞毒性複合体(No.
7)は、ラツト肝癌AH66細胞に対し著しい細
胞毒性を示していることがわかる。 実施例 2 2−(イ) 活性チオール基を導入したIgGの調製。 参考例(イ)の如くして得られた。IgG20mgを含
む0.1Mリン酸緩衝液(0.1M塩化ナトリウムを
含む、PH7.5)4mlに、N−サクシンイミジル
3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート
5mMエタノール溶液100μを添加し、時々撹
拌しながら室温30分反応させた。次いで、上記
緩衝液で平衡化したセフアデツクスG−25のカ
ラム(0.8cm×40cm)にその反応液をかけ、過
剰の試薬を除去した。こうして1分子当り1.9
ケの3−(2−ピリジル)ジチオプロピオニル
基を含むIgGが得られた。 2−(ロ) ジチオプロピオニルIgG(2−1〜)と、
チオール基を有しマイトマイシンCを結合した
ポリ−L−グルタメート(2−2〜)との反応に
よる、細胞毒性複合体(2−3〜)の製造。 上記(イ)の如くして得られた3−(2−ピリジ
ル)ジチオプロピオニルIgG(2−1〜)2.8mgを
含む溶液2.5mlに、チオール基を有し、マイト
マイシンCを結合したポリ−L−グルタメート
(2−2〜)の溶液(末端SH相当5.3×
10-7mole/ml)40μ添加し、室温で16時間反
応させた。用いた緩衝液は上記(イ)と同じであ
る。こうして得られた複合体(2−3〜)は、限
外ろ過法により濃縮し、0.9%塩化ナトリウム
溶液に透析した。 2−(ハ) L1210細胞に対する複合体の細胞毒性上
記(ロ)の如くして得られた複合体(2−3〜)の、
標的細胞L1210に対する細胞毒性を検討した。 24穴の培養プレートに、5×104個のL1210
細胞を含むRPMI1640培地(10%牛胎児血清、
20μMの2−メルカプト−エタノールと0.1mg/
mlのカナマイシンを含む)0.9mlを分注し、更
に種々の濃度の被検サンプル0.1mlを加え、5
%CO2雰囲気下で37℃で48時間培養後、トリパ
ンブルー染色法により生細胞数を測定した。 その結果、第2表に示す如く、複合体(2−
3)は、標的細胞L1210に対し濃度依存的に、
著しく細胞増殖抑制効果を示した。尚、培養は
2系列行い、値はその平均で示した。
7)は、ラツト肝癌AH66細胞に対し著しい細
胞毒性を示していることがわかる。 実施例 2 2−(イ) 活性チオール基を導入したIgGの調製。 参考例(イ)の如くして得られた。IgG20mgを含
む0.1Mリン酸緩衝液(0.1M塩化ナトリウムを
含む、PH7.5)4mlに、N−サクシンイミジル
3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート
5mMエタノール溶液100μを添加し、時々撹
拌しながら室温30分反応させた。次いで、上記
緩衝液で平衡化したセフアデツクスG−25のカ
ラム(0.8cm×40cm)にその反応液をかけ、過
剰の試薬を除去した。こうして1分子当り1.9
ケの3−(2−ピリジル)ジチオプロピオニル
基を含むIgGが得られた。 2−(ロ) ジチオプロピオニルIgG(2−1〜)と、
チオール基を有しマイトマイシンCを結合した
ポリ−L−グルタメート(2−2〜)との反応に
よる、細胞毒性複合体(2−3〜)の製造。 上記(イ)の如くして得られた3−(2−ピリジ
ル)ジチオプロピオニルIgG(2−1〜)2.8mgを
含む溶液2.5mlに、チオール基を有し、マイト
マイシンCを結合したポリ−L−グルタメート
(2−2〜)の溶液(末端SH相当5.3×
10-7mole/ml)40μ添加し、室温で16時間反
応させた。用いた緩衝液は上記(イ)と同じであ
る。こうして得られた複合体(2−3〜)は、限
外ろ過法により濃縮し、0.9%塩化ナトリウム
溶液に透析した。 2−(ハ) L1210細胞に対する複合体の細胞毒性上
記(ロ)の如くして得られた複合体(2−3〜)の、
標的細胞L1210に対する細胞毒性を検討した。 24穴の培養プレートに、5×104個のL1210
細胞を含むRPMI1640培地(10%牛胎児血清、
20μMの2−メルカプト−エタノールと0.1mg/
mlのカナマイシンを含む)0.9mlを分注し、更
に種々の濃度の被検サンプル0.1mlを加え、5
%CO2雰囲気下で37℃で48時間培養後、トリパ
ンブルー染色法により生細胞数を測定した。 その結果、第2表に示す如く、複合体(2−
3)は、標的細胞L1210に対し濃度依存的に、
著しく細胞増殖抑制効果を示した。尚、培養は
2系列行い、値はその平均で示した。
【表】
実施例 3
3−(イ) マレイミド基を導入したF(ab′)2の調製
参考例(ロ)の如くして得られたF(ab′)210mgを
含む10mMリン酸緩衝液(PH6.5)1.14mlに、N
−ヒドロキシサクシンイミジル−m−マレイミ
ドベンゾエート0.42mgを含むN,N−ジメチル
ホルムアミド0.05mlを添加し、室温で40分反応
させた。反応後は、セフアデツクスG−25のカ
ラム(1cm×30cm、緩衝液は上に同じ)を用い
て過剰の試薬を除き、m−マレイミドベンゾイ
ル基を導入したF(ab′)2の溶液を得た。 3−(ロ) m−マレイミドベンゾイル基を導入した
F(ab′)2(3−1〜)と、チオール基を有しメル
フアランを結合したポリ−L−グルタメート−
L−アラニン共重合体(3−2〜)との反応によ
る、細胞毒性複合体(3−3〜)の製造。 上記(イ)の如くして得られたm−マレイミドベ
ンゾイル基の導入されたF(ab′)2(3−1〜)4.7
mgを含む溶液4.0mlに、チオール基を有し、メ
ルフアランを結合したポリ−L−グルタメート
−L−アラニン共重合体(3−2〜)(末端SH相
当1.6×10-7mole/ml)を含む上記(イ)リン酸緩
衝液の溶液0.40mlを添加し、4℃で16時間反応
させた。こうして得られた複合体(3−3〜)
は、限外ろ過により濃縮し、0.9%塩化ナトリ
ウム溶液に透析した。 3−(ハ) L1210細胞に対する複合体の細胞毒性上
記3−(ロ)の如くして得られた複合体(3−3〜)
の標的細胞L1210に対する細胞毒性を検討し
た。 遠心管に、5×104個のL1210細胞を含む
RPMI1640培地(10%牛胎児血清、20μM2−メ
ルカプトエタノールと0.1mg/mlのカナマイシ
ンを含む)0.9mlを分注し、更に種々の濃度の
被検サンプル0.1mlを加え、37℃で20分プレイ
ンキユベーシヨンした後、遠心して上清を除
き、新たに、上記の培地1mlを添加して、更に
CO2雰囲気下に37℃で48時間培養した。培養
後、トリパンブルー染色法により生細胞数を測
定した。 その結果、第3表に示す如く、メルフアラン
相当100μMの複合体でプレインキユベーシヨ
ンした時、L1210細胞に対する増殖抑制効果が
現れた。20分のブレインキユベーシヨンで試薬
を除いているにも拘らず、効果が現れているこ
とから、初期の20分で、複合体と細胞の結合が
相当程度おこつているものと考えられる。尚、、
培養は2系列行い、値は、その平均で示した。
含む10mMリン酸緩衝液(PH6.5)1.14mlに、N
−ヒドロキシサクシンイミジル−m−マレイミ
ドベンゾエート0.42mgを含むN,N−ジメチル
ホルムアミド0.05mlを添加し、室温で40分反応
させた。反応後は、セフアデツクスG−25のカ
ラム(1cm×30cm、緩衝液は上に同じ)を用い
て過剰の試薬を除き、m−マレイミドベンゾイ
ル基を導入したF(ab′)2の溶液を得た。 3−(ロ) m−マレイミドベンゾイル基を導入した
F(ab′)2(3−1〜)と、チオール基を有しメル
フアランを結合したポリ−L−グルタメート−
L−アラニン共重合体(3−2〜)との反応によ
る、細胞毒性複合体(3−3〜)の製造。 上記(イ)の如くして得られたm−マレイミドベ
ンゾイル基の導入されたF(ab′)2(3−1〜)4.7
mgを含む溶液4.0mlに、チオール基を有し、メ
ルフアランを結合したポリ−L−グルタメート
−L−アラニン共重合体(3−2〜)(末端SH相
当1.6×10-7mole/ml)を含む上記(イ)リン酸緩
衝液の溶液0.40mlを添加し、4℃で16時間反応
させた。こうして得られた複合体(3−3〜)
は、限外ろ過により濃縮し、0.9%塩化ナトリ
ウム溶液に透析した。 3−(ハ) L1210細胞に対する複合体の細胞毒性上
記3−(ロ)の如くして得られた複合体(3−3〜)
の標的細胞L1210に対する細胞毒性を検討し
た。 遠心管に、5×104個のL1210細胞を含む
RPMI1640培地(10%牛胎児血清、20μM2−メ
ルカプトエタノールと0.1mg/mlのカナマイシ
ンを含む)0.9mlを分注し、更に種々の濃度の
被検サンプル0.1mlを加え、37℃で20分プレイ
ンキユベーシヨンした後、遠心して上清を除
き、新たに、上記の培地1mlを添加して、更に
CO2雰囲気下に37℃で48時間培養した。培養
後、トリパンブルー染色法により生細胞数を測
定した。 その結果、第3表に示す如く、メルフアラン
相当100μMの複合体でプレインキユベーシヨ
ンした時、L1210細胞に対する増殖抑制効果が
現れた。20分のブレインキユベーシヨンで試薬
を除いているにも拘らず、効果が現れているこ
とから、初期の20分で、複合体と細胞の結合が
相当程度おこつているものと考えられる。尚、、
培養は2系列行い、値は、その平均で示した。
【表】
実施例 4
4−(イ) マレイミド基を導入したFab′の調製
参考例(ハ)の如くして得られた、遊離チオール
基1ケを有するFab′10mgを含む5mM酢酸緩衝
液(0.14M塩化ナトリウム、1mM EDTAを含
む、PH5.5)5.7mlと、1.2mgのo−フエニレンジ
マレイミドを含む同緩衝液2mlとを混合し、30
℃で60分反応させた後、セフアデツクスG−25
を用いたゲル過カラムクロマトグラフイー
(1cm×30cm、同一緩衝液使用)により、過剰
の試薬を除いた。 4−(ロ) マレイミド器を導入したFab′(4−1〜)
と、チオール基を有しアラーCを結合したポリ
ーL−グリタメート(4−2〜)との反応によ
る、細胞毒性複合体(4−3〜)の製造。 上記の如くして得られたo−フエニレンジマ
レイジルFab′(4−1)3.7mgを含む上記(イ)の緩
衝液5.1mlに、チオール基を有しアラーCを結
合したポリーL−グリタメート(4−2)(末
端SH相当2.8×10-7mole/ml)を含む同緩衝液
0.10ml及び0.4Mリン酸緩衝液(PH6.5)1.0mlを
添加し、4℃で一夜反応させた。こうして得ら
れた複合体(4−2)は、限外ろ過により濃縮
し、更に0.9%塩化ナトリウム溶液に透析した。 4−(ハ) L1210細胞に対する複合体の細胞毒性上
記4−(ロ)の如くして得られた複合体(4−3)
の標的細胞L1210に対する細胞毒性を、上記実
施例3の(ハ)に示した方法に従つて検討した。 その結果、第4表に示す如く、AraC相当
10μMの複合体でプレインキユベーシヨンした
時、L1210細胞に対し細胞毒性を示した。
基1ケを有するFab′10mgを含む5mM酢酸緩衝
液(0.14M塩化ナトリウム、1mM EDTAを含
む、PH5.5)5.7mlと、1.2mgのo−フエニレンジ
マレイミドを含む同緩衝液2mlとを混合し、30
℃で60分反応させた後、セフアデツクスG−25
を用いたゲル過カラムクロマトグラフイー
(1cm×30cm、同一緩衝液使用)により、過剰
の試薬を除いた。 4−(ロ) マレイミド器を導入したFab′(4−1〜)
と、チオール基を有しアラーCを結合したポリ
ーL−グリタメート(4−2〜)との反応によ
る、細胞毒性複合体(4−3〜)の製造。 上記の如くして得られたo−フエニレンジマ
レイジルFab′(4−1)3.7mgを含む上記(イ)の緩
衝液5.1mlに、チオール基を有しアラーCを結
合したポリーL−グリタメート(4−2)(末
端SH相当2.8×10-7mole/ml)を含む同緩衝液
0.10ml及び0.4Mリン酸緩衝液(PH6.5)1.0mlを
添加し、4℃で一夜反応させた。こうして得ら
れた複合体(4−2)は、限外ろ過により濃縮
し、更に0.9%塩化ナトリウム溶液に透析した。 4−(ハ) L1210細胞に対する複合体の細胞毒性上
記4−(ロ)の如くして得られた複合体(4−3)
の標的細胞L1210に対する細胞毒性を、上記実
施例3の(ハ)に示した方法に従つて検討した。 その結果、第4表に示す如く、AraC相当
10μMの複合体でプレインキユベーシヨンした
時、L1210細胞に対し細胞毒性を示した。
【表】
実施例 5
IgMsフラグメント(5−1〜)と活性ジスル
フイド基を有し、ダウノマイシンを結合したポ
リーL−グリタメート(5−2〜)との反応によ
る、細胞毒性複合体(5−3〜)の製造。 参考例(ホ)の如くして得られたIgMsフラグメン
ト(5−1〜)の溶液(7.5mg/ml)1mlに、活性
ジスルフイド基を有し、ダウノマイシンを結合し
たポリーL−グリタメートのナトリウム塩(5−
2〜)の溶液(活性ジスルフイド当量4.6×
10-7mole/ml)0.1mlを添加し、0.1M塩化ナトリ
ウム、2mM EDTAを含む50mMグリシン・ナト
リウム塩緩衝液(PH9.2)に、4℃で、48時間透
析しつつ反応させ、目的とする複合体(5−3〜)
を得た。反応物は、更に、0.9%塩化ナトリウム
溶液に透析した。
フイド基を有し、ダウノマイシンを結合したポ
リーL−グリタメート(5−2〜)との反応によ
る、細胞毒性複合体(5−3〜)の製造。 参考例(ホ)の如くして得られたIgMsフラグメン
ト(5−1〜)の溶液(7.5mg/ml)1mlに、活性
ジスルフイド基を有し、ダウノマイシンを結合し
たポリーL−グリタメートのナトリウム塩(5−
2〜)の溶液(活性ジスルフイド当量4.6×
10-7mole/ml)0.1mlを添加し、0.1M塩化ナトリ
ウム、2mM EDTAを含む50mMグリシン・ナト
リウム塩緩衝液(PH9.2)に、4℃で、48時間透
析しつつ反応させ、目的とする複合体(5−3〜)
を得た。反応物は、更に、0.9%塩化ナトリウム
溶液に透析した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 殺すべき細胞のもつている特定の抗原と特異
的に結合し得る免疫グロブリンまたはそのフラグ
メントと、細胞毒性物質をその側鎖に結合し、反
応性基をその未端に含有する重合体とを共有結合
させてなる下記式〔〕で表される細胞毒性複合
体。 [式〔〕において、Abは殺すべき細胞のも
つている特定の抗原と特異的に結合し得る免疫グ
ロブリンまたはそのフラグメントを表す。B1は
2価の有機基を表す。S1はイオウ原子を表す。W
は炭素数1〜4のアルキレン基を表す。R1はα
−アミノ酸のα位側鎖(但しカルボキシル基を有
する基は除く)を表す。Yは分子中にアミノ基ま
たはイミノ基を含む細胞毒性物質のアミノ基また
はイミノ基反応残基を表す。Zは水素原子または
1価の陽イオンを表す。mは1〜4の整数を表
す。n、pおよびqは重合体中の各構成単位の数
を表すが、構成単位の配列はランダムであり、
n、p、qに係る各構成単位の全体に占める割合
は、それぞれ5〜50%、40〜95%、0〜10%であ
る。重合度(n+p+q)は10〜1500である。v
は1〜10の整数を表す。] 2 下記式〔〕 [式〔〕において、Abは殺すべき細胞のも
つている特定の抗原と特異的に結合し得る免疫グ
ロブリンまたはそのフラグメントを表す。B1は
2価の有機基を表す。v′は1〜10の整数を表す。] で表される導入されたマレイミド基をもつ免疫グ
ロブリンまたはそのフラグメントと、下記式 [式〔〕において、S1はイオウ原子を、Wは
炭素数1〜4のアルキレン基を、R1はα−アミ
ノ酸のα位側鎖(但しカルボキシル基を有する基
は除く)を、Yは分子中にアミノ基またはイミノ
基を含む細胞毒性物質のアミノ基またはイミノ基
反応残基を表す。Zは水素原子または1価の陽イ
オンを表す。mは1〜4の整数を表す。n、pお
よびqは重合体中の各構成単位の数を表すが、構
成単位の配列はランダムであり、n、p、qに係
る各構成単位の全体に占める割合は、それぞれ5
〜50%、40〜95%、0〜10%である。重合度(n
+p+q)は10〜1500である。] で表される、細胞毒性物質を結合しかつ分子末端
にチオール基を有する反応性重合体とを反応せし
めることを特徴とする下記式〔〕 [式〔〕において、AbおよびB1の定義は式
〔〕の場合と同じであり、S1、W、R1、Y、
Z、m、n、pおよびqの定義は式〔〕の場合
と同じであり、vは1〜10の整数を表す。] で表される細胞毒性複合体の製造法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP57226237A JPS59116232A (ja) | 1982-12-24 | 1982-12-24 | 細胞毒性複合体及びその製造法 |
EP83307810A EP0112720B1 (en) | 1982-12-24 | 1983-12-21 | Conjugate having cytotoxicity and process for the preparation thereof |
US06/563,858 US4543211A (en) | 1982-12-24 | 1983-12-21 | Conjugate having cytotoxicity and process for the preparation thereof |
DE8383307810T DE3381531D1 (de) | 1982-12-24 | 1983-12-21 | Konjugat mit zytotoxizitaet und verfahren zu seiner herstellung. |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP57226237A JPS59116232A (ja) | 1982-12-24 | 1982-12-24 | 細胞毒性複合体及びその製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59116232A JPS59116232A (ja) | 1984-07-05 |
JPH048411B2 true JPH048411B2 (ja) | 1992-02-17 |
Family
ID=16842036
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP57226237A Granted JPS59116232A (ja) | 1982-12-24 | 1982-12-24 | 細胞毒性複合体及びその製造法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4543211A (ja) |
EP (1) | EP0112720B1 (ja) |
JP (1) | JPS59116232A (ja) |
DE (1) | DE3381531D1 (ja) |
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