JPH0742316B2 - オシド単位の酸化およびシツフ塩基の形成により変性されたリボソ−ム不活性化糖タンパク、およびこの糖タンパクを含む生体内持続性免疫毒素 - Google Patents

オシド単位の酸化およびシツフ塩基の形成により変性されたリボソ−ム不活性化糖タンパク、およびこの糖タンパクを含む生体内持続性免疫毒素

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JPH0742316B2 JP61302889A JP30288986A JPH0742316B2 JP H0742316 B2 JPH0742316 B2 JP H0742316B2 JP 61302889 A JP61302889 A JP 61302889A JP 30288986 A JP30288986 A JP 30288986A JP H0742316 B2 JPH0742316 B2 JP H0742316B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、多糖単位が修飾された糖タンパク質（又はグ
リコペプチド）から誘導され、かつタンパク質の合成を
阻害するポリペプチド型の成分に共有結合した少くとも
一種の抗体を含有する薬効のある新しい分子に関する。
（従来の技術） 米国特許第4,340,535号並びにフランス国特許第2504010
号及び同第2516794号は、包合体と呼ばれる抗ガン生成
物の製法を開示している。この生成物は、破壊される細
胞についている抗原を標的とする抗体又は抗体断片と、
リシンのＡ鎖を共有結合によってカップリングすること
により得られる。この種の生成物は今まで免疫毒素とい
う包括的な名称によって称されてきたが、本発明におい
ても同様である。ところでリシンのＡ鎖を含有する既に
公知の免疫毒素に類似する包合体は知られている。これ
は抗ガン剤として適しているが、特にゲロニウムマルテ
ィフロルム（欧州生化学ジャーナル“1981年、第116
号、447-454頁及び“ガン研究"1984年、第44号、129-13
3頁）から抽出されたゲロニン、又はモモルジカカラン
ティス（MOM、米国特許第4,368,149号）から抽出された
阻害剤のようなリボソームを不活性化する他のグリコペ
プチドと、抗体又は抗体断片を共有結合によってカップ
リングさせることにより得られる。
上述のリボソーム（GPIRという略号を使う。）を不活性
にし、またリシンのＡ鎖と同じような性質を有する糖タ
ンパク質は20,000〜30,000の分子量を有する（“ガン・
サーベイ"1982年、第１巻、489-520頁）。
本明細書で用いる“リボソームを不活性化する糖タンパ
ク質”は、リボソームを不活性化し、その結果真核細胞
におけるタンパク質の合成を阻害する巨大な分子量の糖
類単位を有する物質を指す。その他にも同じ不活性化特
性を有するならば、その物質の何らかの断片でもよい。
リボソームを不活性化する前記糖タンパク質は天然のも
のであるか、又は遺伝子型がこの目的のために修飾され
た細胞から生合成によって誘導して得られる。
これら免疫毒性はアンモニウム塩、種々のアミンのよう
なアジュバント物質又はモネンジン若しくはナイジェリ
シンのようなある種のカルボキシルイオノフォアーなど
様々な物質によって強化される。
しかしながら免疫毒素の治療効果は、活性化されている
ものであってもそうでなくても、その免疫毒素がその抗
体部分を通して活性な形態で、破壊される標的細胞上に
生体内局在化することができるという条件（いかなる免
疫毒素活性の発現においても必須の条件）でのみ十分発
揮される。標的細胞上に局在化される免疫毒素の効力
は、まず第一に血流及び細胞外液にある免疫毒素が活性
な形態で一定の時間内に標的細胞に十分な濃度で到達
し、目的とする抗原を高い割合で捕捉する能力に依存す
る。
多くの研究によって免疫毒素が様々な動物の静脈内に注
射された場合の血漿からの消失キネティックスが確立さ
れた。その結果注射後には生物学的に活性な免疫毒素の
血漿中の濃度は急速に低下することがわかった。
ヒトのＴリンパ球の抗原T65を標的とするモノクロナル
抗体とリシンのＡ鎖をジスルフィド結合を含む連鎖でカ
ップリングさせて得られる免疫毒素についてウサギを使
ったモデルで調べたところ、注射直後に血流中に存在す
る免疫毒素は、30分後にはその97％が、17時間後にはそ
の99.9％が消失した。この免疫毒素の急速な消失によっ
てその細胞障害力は減じられる。というのは、免疫毒素
と破壊される細胞について標的細胞との恒久的な結合が
妨げられるからである。さらに免疫毒素の血漿からの消
失キネティックスを対応する非包合抗体と比較してみた
ところ、この抗体は血漿中に相対的に長い時間高い濃度
で留まることがわかった。実際どんなに高度に免疫毒素
を精製しても、常に一定量の非包合体は残留する。免疫
毒素と非包合抗体の消失速度の違いから、最初はごく少
ない割合でしかない非包合抗体は、徐徐にその割合が増
え、数時間後には半数を超える割合になる。そのため抗
体は徐々に、免疫毒素が標的に結合する際の強力なアン
タゴニストになる。
従って血漿中の免疫毒素を高い割合で存続させることは
標的である抗原が結合される割合と持続時間を増加さ
せ、その結果免疫毒素の治療効果を増進することを意味
する。
リシンのＡ鎖を含有する免疫毒素の生体内局在化につい
て、免疫毒素を放射標識し、特定の標的をもたない動物
に注射して実験したところ、包合体は注射後数分で肝臓
に特異的に局在化した。同じ実験をカップリングしない
形態のリシンのＡ鎖について行ったところ、同様な結果
が得られた。これは免疫毒素に包まれる細胞毒性サブユ
ニットが肝臓と結合することを強く示唆する。
リシンのＡ鎖はそのポリオサン基が、マンノース残基と
Ｎ−アセチルグルコサミン残基からなる糖タンパク質で
ある。そしてそのうちのいくつかのマンノース基は、末
端に位置する（“農芸生物化学"1978年、第42巻、501
頁）。またこれら末端に位置するマンノース残基を含む
糖タンパク質を識別する受容体は肝臓内にあることが発
見された。これらの受容体（クッパー細胞中に存す
る。）はこれらを代謝する細胞と結合することによって
血液中から消失する。これに関してはβ−グルクロニダ
ーゼとリボヌクレアーゼＢの場合について詳しい報告が
ある（“生物化学と生物物理"1978年、188号、418頁、
“酵素学の進歩”マイスター編、ニューヨーク、1974年
および“小児科学研究"1977年、第11巻、816頁）。
これらを総合すると、リシンのＡ鎖を含有する免疫毒素
の急速な消失は、リシンのＡ鎖のマンノース残基が肝細
胞特にクッパー細胞によって認知されるためと説明でき
る。
動物の静脈内に注射した後の他のGPIR、例えばゲロニン
又はMOM、についての血漿からの消失キネティックスの
研究が進められた結果、リシンのＡ鎖についてはGPIRの
血漿中濃度は注射後急速に大部分消失することがわかっ
た。ウサギについて公知（“生化学ジャーナル"1980
年、255号、6947-6953頁）の方法によって精製したゲロ
ニンを注射したところ、注射直後に血流中に存在したゲ
ロニンは、その１時間後には93％、24時間後には99.99
％が消失した。
糖タンパクに含有されるものを含む炭水化物構造の、過
ヨード酸塩による酸化は、２つの隣接する炭素原子は第
１又は第２ヒドロキシル基を有する場合には、炭素鎖の
分割を生ぜしめる。２つの隣接するヒドロキシル基が第
２ヒドロキシル基の場合には、GPIRに存在する場合のよ
うに、酸化は、その間に分割が生ずる炭素原子に２つの
アルデヒド基をを生成する。
アルデヒド基は第１アミン基に対し極めて活性でありシ
ッフ塩基として知られるイミンを形成する。したがっ
て、酸化反応の間、形成されるアルデヒド基は糖タンパ
クのペプチド鎖に付随する第１アミンと反応し、好まし
くない内部共有結合又は分子間共有結合を形成し、これ
により酸化生成物を不安定化し、しばしば不溶性ポリマ
ーの形成を生じさせる。
（課題を解決するための手段） しかるに、GPIRの炭水化物単位が以下に述べる独特の方
法により変性されたとき、その生物学的活性を保持し、
かつ高等動物又は人間に注射したとき血流からの消失が
極めて緩慢であるという２重の特性を有する新しいGPIR
分子が得られることを意外にも見出した。この新しい化
学的に修飾されたGPIRはリボソームを不活性化する性質
を有するとともに、その変性により生体中の作用の持続
性にすぐれている。この化学的に修飾されたGPIRを以下
GPIR-laの記号で示す。
上述の独特の方法はGPIRのオシド単位を第１アミン基か
らなる過剰の補助剤の存在下で過ヨウ素酸塩イオンと反
応させるものであって、このGPIRの他の部分はこの操作
条件下ではこの過ヨウ素酸塩イオンと反応することはな
い。この過ヨウ素酸塩で酸化されることによって生じた
アルデヒド基は過剰のエクソゲンアミノ試薬によるシッ
フ塩基の形成により阻止（ブロッキング）される。これ
によってGPIRの他のアミノ基との好ましくない反応が回
避され、安定で完全に溶解し得る製品が得られる。
さらに、これらの新規な持続性糖タンパクが抗体又は抗
体分画と結合したとき、得られた包合体は免疫毒素の公
知の生物学的特性を保持し、血漿排出作用も遅いことが
見出された。
本発明は従って、新規物質としての構造変性GPIRに係わ
るもので、その炭水化物単位が第１アミン基からなる補
助試薬の過剰存在下で過ヨウ素酸塩イオンの作用により
変性されたものである。なお、この補助試薬は過ヨウ素
酸塩による酸化により生じたアルデヒド基をブロッキン
グし得るものである。
さらに本発明は天然又は変性された抗体又は抗体分画と
上記の独特の方法で変性された炭化水素単位を有するGP
IR分子との共有結合により得られる免疫毒素に属する製
品に関する。
本明細書において、「過ヨウ素酸塩」なる語は過ヨウ素
酸塩の水溶液中のIO4 -イオン（特にアルカリ金属塩にお
ける）を示し、この語は「メタペリオデート」の名で文
献にも見出される。
“第１アミン基を有する補助試薬”とは処理条件下では
過ヨウ素酸塩イオンと反応しない単一の第１アミン基を
有する有機質分子を意味する。例えば、この試薬は過ヨ
ウ素酸塩と反応せず、水溶性（すなわち、必要な濃度に
おいて、塩基又は塩の形で、pH:5〜７、温度０〜15℃に
おいて）如何なるアルキルアミンであってもよい。この
試薬は上記条件に合致する限り如何なるα−アミノ酸又
はω−アミノ酸であってもよい（光学活性又はラセミ体
の如何を問わず）。例えば以下の脂肪族アミノ酸、すな
わち、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロ
イシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等
である。この試薬は上記条件に合致する如何なるペプチ
ドであってもよい。
“抗体”とはすべての抗体又は抗体分画から選ばれるタ
ンパク、すべての免疫グロブリン、免疫グロブリン分
画、又はこれらからその官能基（オシド構造を含む）の
一つを人工的に変性して得られるすべての分子であって
もよい。但し、この選ばれたタンパクが細胞（特に標的
細胞）表面上の抗原を選択的に認識し得るものでなけれ
ばならない。
出発抗体は天然のもの、又は生合成によるものであって
もよく、遺伝子型がこの目的に合うように修飾された細
胞から得られるものが用いられる。
特定のヒト標的細胞に対して向けられたモノクローン抗
体の製造は文献上広く記載されており、その多くの抗体
は市場において入手し得る。
記号Ｐは、任意の抗体又は抗体フラゲメント、任意の免
疫グロブリン又は免疫グロブリンフラグメント、又はそ
れらの官能基の変性により上記のものから誘導された分
子からなる群から選択されたタンパクを意味し、このよ
うにして選択されたタンパクが、その抗原を有する細胞
特に標的細胞の表面において、与えられた抗原を選択的
に認識し得る限りにおいて、上記タンパクを有する炭水
化物構造を含む。出発タンパクは、天然のものでも、そ
のゼノタイプがこの目的のために変性された細胞から誘
導された生物合成されたものでもよい。
記号GPIRは糖タンパク又はその分画を示す。この分画は
発生源のGPIRの特性であるリボソーム不活性化特性のす
べて又は一部を保持する限り、出発物質として使用し得
るが、特に天然のGPIRが好ましい。
“GPIR-la"は本発明で変性されたGPIR、すなわち、GPIR
の如くリボソームを不活性化する特性を有する分子であ
るが、生体中の作用がGPIRより大きいものであって、過
剰の第１アミンの存在下で過ヨウ素酸塩等の酸化剤でGP
IRを水溶液中で処理し、その生成したアルデヒド基をイ
ミン基（又はシッフ塩基）に変換して得られるものであ
る。
この操作（又は処理）は一般にpH5〜７、温度０〜15
℃、好ましくは暗所中でおこなわれ、反応は0.2〜24時
間必要とする。
免疫毒素において、GPIR-la部分は“細胞障害サブユニ
ット”として表わされる。
記号A-laは、遅延作用を有し、リボソームを不活性化す
る糖タンパクを示すが、この糖タンパクは、そのシステ
ィン171および257のチオール基の少なくとも１つが任意
に保護されているリシンのＡ鎖を過ヨード酸アルカリ金
属の水溶液により光の不存在下で０〜15℃で0.2〜24時
間処理することにより、また必要に応じて上記チオール
基の脱保護により得られる。
記号Ｐ′は、上記タンパクＰ又はそれを化学的に変性し
たものから誘導されたラジカルを表わし、そこからそれ
自体の基の１つ又はそれ以上が除去され、また他の官能
基が任意に保護されているものである。
記号GPIR-la′は上記タンパクGPIR-la又はそれを化学的
に修飾したものから誘導されたものを表わし、そこから
それ自体の基の１つ以上が除去され、他の官能基が任意
に保護されているものである。
記号A-la′は、そのシスティン171および257のチオール
基の少なくとも１つが除去された、タンパクA-laから誘
導されたラジカルを表わす。
記号P1は、上記タンパクGPIR-laおよびＰの１つを表わ
し、それは上記タンパクに直接又はスペース構造を介し
て結合された遊離チオール基を有する。
記号P2は、タンパクGPIR-laおよびＰのうちの一方であ
るが、P1とは異なるものであり、遊離チオールと反応し
得る１種以上の官能基を有するものである。
記号P1′はタンパクP1に属する基に結合したタンパクP1
のラジカルを表わし、特に、（システィンの）SH基、
（タンパクの末端位置又はリシンのイプシロン位置にあ
る）NH2基、（チロシンの）OH基、又は（アルパルチン
酸又はグルタミン酸の）COOH基であり、又はP1が抗体又
は抗体フラグメントである場合にのみ、公知の方法によ
り過ヨード酸との反応により炭水化物構造の開始部から
発生するタンパクP1のラジカルである。
記号P2′は、特徴的官能基（タンパクの末端位置にある
か又はリシンのイプシロン位置にある）NH2、（チロシ
ンの）OH又は（アスパラチン酸およびグルタミン酸）の
COOHに結合されたタンパクP2のラジカルを表わす。
例えば、P1，−SHは（抗体又は抗体フラグメントＰ又は
タンパクGPIR-laであり得る）タンパクP1を表わすが、
このタンパクP1は、システィンのSH基が遊離しており、
他の官能基は任意に保護されているものである。
同様に、P1，−CO−はその末端カルボキシル基又はその
グルタミン酸およびアスパラチン酸のカルボキシル基
が、SH基を導入する基と結合されているタンパクP1を表
わす。
P2，−NH−は（抗体又は抗体フラグメントＰ又はタンパ
クGPIR-laであり得る）タンパクP2を表わすが、このタ
ンパクP2は、その末端アミノ基又はそのリシンのアミノ
基がタンパクP1のチオールと連結し得る基に結合してい
るものである。
「不活性スペーシング構造」なる語は、このプロセスに
用いる反応体に対し不活性な２価の有機ラジカルを示
し、例えば１〜15の炭素原子を有する直鎖又は側鎖アル
キレン基であり、１つ以上の二重結合を含んでもよく、
また酸素原子によって中断されていてもよく、あるいは
またメトキシ基、遊離の又はエステル化されたカルボキ
シル基、ジアルキルアミン基又はカルバメート基のよう
な１種以上の不活性官能基によって置換されているもの
であってもよい。同じ語はまた、上でアルキレン基につ
いて示したように、１種以上の不活性官能基によって置
換され得る６〜15の炭素原子を有するアリレン基をも示
す。
ここでＹおよびＹ′に関して用いられている「共有結合
し得る官能基」という表現は、共有結合を形成するため
にタンパクP1およびP2に属する基と反応し得るいかなる
基をも意味する。−CO−基および−（Ｃ＝NH）−基は、
タンパクの遊離アミン、チオールおよびフェノール性水
酸基と結合し得る適当な官能基である。同様に、−NH−
基もタンパクの遊離カルボキシル基と結合し得る適当な
官能基である。＝Ｎ−基は過ヨウ素酸イオンによる酸化
のあとにタンパクP1およびP2の糖鎖の２つの炭素原子と
結合し得る適当な官能基である。ただしそれは、P1およ
びP2が抗体または抗体断片である場合に限る。
ここでＺ及びＺ′として示されている「蛋白質に属する
基」なる表現は、蛋白質P1及びP2を形成するアミノ酸の
特有な基から作られたラジカルを示す。例示すれば、チ
ロシンやセリンアミノ酸の水酸基から生ずる酸素原子、
アスパラギン酸やグルタミン酸の末端カルボキシルや遊
離カルボキシルから生じたカルボキシル基、蛋白質の末
端アミンから生じた−NH−基（例えばリジン）あるいは
システィンのチオールから生じた硫黄原子がある。同様
に、この表現は、過ヨウ素酸イオンの処理により、蛋白
質P1及びP2の炭水化物構造の一つを酸化した後得られる
ジアルデヒド構造から生じた基を示す。しかしこの場
合、P1及びP2は抗体又は抗体断片である。
ここでＸで示される「活性ラジカル」なる用語は−Ｓ−
Ｓ−ブリッジに結合された基を示し、これは遊離チオー
ルと反応してX-SHを解放した二硫化物を形成する。適切
な活性ラジカルはピリジン−２−イル及びピリジン−４
−イル基で、これらは置換されていないもの、あるいは
１又は２以上のハロゲン又はアルキル基、カルボキシル
基、アルコキシカルボニル基よって置換されたものであ
る。フェニル基は置換されていないもの又は好ましくは
１又は２以上のハロゲン基又はニトロ基、アルコキシル
基、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基によっ
て置換されたものである。
「アルキル」及び「アルコキシ」という用語は、５炭素
原子以下を含む基を示す。
「アルキレン」なる用語は、炭素原子10以下を含む直鎖
又は分枝した飽和脂肪族基を示す。これらは１又は２以
上の不活性官能基（例えばアルコキシカルボニル基）に
よって置換されたものでもよい。
リボソームを不活性化し、過ヨウ素酸塩イオンで酸化す
るため、および還元するために好ましい出発物質として
用いられる糖タンパクはすべてGPIRであり、たとえばリ
シンＡ鎖はそれ自体、細胞に固着しないために細胞毒性
はほとんどないが、特定の細胞を認識し得る抗体と結合
したのちは、抗体が標的を認識するやいなやその細胞に
対して大きい細胞毒性を示すことになる。
代表的な出発化合物は、リシンのＡ鎖、ゲローニン及び
モモルディカ カランティス（MOM）からの抽出操作に
より得られた抽出物質である。
過ヨウ素酸イオンとの酸化に用いる出発物質として有用
な他のGPIR類は、以下の通りである。
・ディアンチン30（Dianthin30） ディアントゥス カリョフィルス（Dianthus Caryophyl
lus）から ・ディアンチン32（Dianthin32） ディアントゥス カリョフィルス（Dianthus Caryophyl
lus）から ・アグロスティンＡ（Agrostin A） アグロステーマ ジターゴ（Agrostemma githago）から ・アグロスティンＢ（Agrostin B） アグロステーマ ジターゴ（Agrostemma githago）から ・アグロスティンＣ（Agrostin C） アグロステーマ ジターゴ（Agrostemma githago）から ・HCI フラ クレピタンス（Hura crepitans）から ・アスパラグス オフィチナリス阻害剤 アスパラグス オフィチナリス（Asparagus officinali
s）から この目的のために遺伝子型を修飾した細胞で生合成的に
生産された同じ物質も、また適当な化合物である。
上記GPIR類のフラグメントは、もしそれらが元のGPIRを
特徴付ける不活性リボソームの全部または一部の性質を
保持しているとするならば、同様に出発物質として用い
ることができる。
リシンの天然のＡ鎖のうち、チオール基の少なくとも一
つが保護されているものは好ましい出発物質である。
リシンの純粋のＡ鎖の製造については、米国特許第4340
535号に記載されている。ゲローニン及びMOMについても
記載されている。
出発物質におけるチオール基の保護は、そのチオール基
が抗体との結合に用いられるものである場合にのみ必要
とされる。例えばチロシンのフェノール性水酸基のよう
な他の感応基が結合に用いられる場合には、前記の保護
は行なわれない。
保護のためのブロッキングは、SH基を、引続いて還元反
応またはチオール／ジスルフィド変換反応で除去できる
ような官能基で置換することができるような試薬、例え
ば2,2−ジニトロ−5,5−ジベンゾジ安息香酸（DTNB）、
或いは３−（ピリジン−２−イル−ジスルファニル）プ
ロピオン酸等との反応によって行なわれる。このような
試薬が存在しない条件下では、Ａ鎖中の遊離チオール基
は酸化反応中に消失してしまい、たとえ２−メルカプト
エタノールのような還元剤との反応によっても全体的に
再生することはできない。過剰のブロック剤は透析、そ
の他の処理により除去する。
チオール基がブロッキングされたGPIRはついで過ヨウ素
酸塩イオンにより酸化反応に供せられ、さらに第１アミ
ンによりシッフ塩基の形成が同時になされる。
過ヨウ素酸による酸化反応およびシッフ塩基形成による
ブロッキング反応はやや酸性のpH5〜７、好ましくは６
〜6.5の酸性下で実施される。過ヨウ素酸塩の添加前にG
PIRを第１アミンと混合する。過ヨウ素酸塩は過剰に用
いる。より望ましくは、過ヨウ素酸アルカリ金属塩の濃
度が、酸化さるべきビシナルジオールの濃度よりも高く
なるようにする。例えば、細胞毒サブユニット濃度１〜
10mg/mlに対し、過ヨウ素酸ナトリウム濃度は10〜50mM
が適している。第１アミン（たとえば、Ｌ−ロイシン、
Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン酸）も
酸化され得るビシナルジオールの濃度より大きい濃度で
用いることができる。すなわち、細胞毒サブユニット濃
度１〜10mg/mlに対し第１アミン50〜500mMの濃度であ
る。処理は０〜15℃、好ましくは１〜５℃の暗所におい
て、0.2〜24時間行なう。
反応終了後、過剰の過ヨウ素酸塩を過ヨウ素酸塩を消費
する試薬、例えば過剰のエチレングリコールの添加によ
って除去し、副生成物を透析により除去する。反応終了
時に得られた生成物は、通常の手法により単離する。
もし出発物質のチオール基がブロックされていれば、公
知の方法でブロッキングを解除する。例えば２−メルカ
プリエタノールのように、ブロックされる前のチオール
基を遊離させ得る還元剤と反応させればよい。これによ
り、リボソームを不活性化する糖蛋白に新規な持続作用
が与えられ、これは抗体と結合して免疫毒素を得るため
に用いることができる。
リシンのＡ鎖の場合、この方法で得られる新しい分子
（以下記号A-laで表わす）は、次の主要な性質を有して
いる。
・分子量は、天然のＡ鎖の分子量とそれほど変らない。
ポリアクリルアミドによる電気泳動で観察する限り、こ
の修飾反応は極く少量の蛋白質の重合体を生成するだけ
で、分解生成物は何等生じない。
・遊離チオール基の比率は、0.7/molよりも大きい。
・リシンのＡ鎖を基準とした兎抗体に対する免疫反応特
性は、天然のＡ鎖のそれと区別できない。
・無細胞系における蛋白合成の阻害活性は、等量の天然
Ａ鎖で生じるものの50％より大きい。
・最後に、兎に約0.5mg/kg体重の投与量で一回静脈注射
した後、静注後23時間での血流中における長期作用型Ａ
鎖（A-la）の血漿レベルは同一条件で測定した天然Ａ−
鎖の血漿レベルより10〜100倍大きい。
上述の如くして得られたGPIRは公知の方法により包合体
又は免疫毒素を製造するのに用いられる。
すなわち、免疫毒素（以下、ITと呼ぶ）を、抗体又は抗
体分画（天然又は正しく修飾されたもので、所定の標的
細胞に運ばれた抗原を選択的に認識する能力を有するも
の）と、リボソームを不活性化する持続性糖タンパクGP
IR（GPIR-la）とを共有結合させることにより得ること
ができる。２つのタンパクの結合はジスルフィド結合、
又はチオエーテル結合を介しておこなわれる。
抗体Ｐを長期活性グリコプロティン（これはリボソー
ム、GPIR-laを不活性とする）と結合させて形成された
イムノトキシンは、次の統計的な式で示される。
Ｐ′‐W-GPIR-la′ （Ｉ） ここでＰ′は蛋白質の基を示し、この蛋白質は抗体又は
抗体断片Ｐであり、あるいはこれらを適宜化学的に修正
したものである。また他の官能基は必要によりブロック
されており、GPIR-la′はGPIR-laやこれを適宜化学的に
修正した蛋白質のラジカルを示す。他の官能基は必要に
よりブロックされ、Ｗはチオエチル基又は二硫化基を含
む２価の共有構造で、これらの基では硫黄原子はＰ及び
GPIR-laのシスティンのそれであり、あるいはＰ及び／
又はGPIR-laに属する上記基に結合して官能基を持たせ
た空間（spacing）構造によって、Ｐ及び／又はGPIR-la
に属する基に結合している。
２つの蛋白質間のチオエーテル結合は、以下のタイプの
結合として理解される。
ここでZ,Y及びＥは以下に定義される。
この発明は、好ましくは下記の統計的な式で示すイムノ
トキシンに関する。
Ｐ′‐Ｗ′‐GPIR-la′ （II） ここで、Ｐ′及びGPIR-la′は、先に定義した通りであ
る。Ｗ′は以下（ａ）〜（ｄ）から選ばれた共有構造で
ある。
（ｃ）‐Z-Y-E-S-S-（Ｅ′−Ｙ′−Ｚ′）ｎ‐ （ｄ）‐（Ｚ′‐Ｙ′‐Ｅ′）ｎ‐S-S-E-Y-Z- これらの式で、Ｚ及びＺ′（同じ又は異なるもの）は、
蛋白質GPIR-la及びＰに属する基を示し、チロシン残滓
（residues）の一つのヒドロキシルから生じる酸素原
子、GPIR-la及びＰのアスパラギン酸及び／又はグルタ
ミン酸の末端カルボキシル又は遊離カルボキシルの１つ
から生じるカルボキシル基、GPIR-la及びＰの末端アミ
ンの１つ又はリジン残滓の１つのエプシロン位置のアミ
ンの１つから生じる−NH−基から選ばれるものであり、
更に上記共有構造（ｂ）及び（ｃ）中のＺについての
み、公知の方法でＰの炭水化物構造の一つを過ヨウ素酸
で酸化させた後得られるジアルデヒド構造から生じる基
である。
Ｙ及びＹ′は、蛋白質GPIR-la及びＰのＺ及びＺ′基の
任意の一つと共有結合可能な官能基を示す。
Ｅ及びＥ′は不活性空間構造を示し、ｎは０又は１であ
る。
イムノトキシンは上述の式Ｉ及びIIによって簡単に表現
できる。しかし、複数の構造−Ｗ−又は−ＷがGPIR-la
の１つの同じ分子Ｐに結合される。したがって、GPIR-l
aが単一のＰに結合されたり、又はその逆となる。この
結合数は結合方法およびＰないしGPIR-laに属する基の
数に依存し、統計的な式（Ｉ），（II）が下記式からな
るこれらの製品およびその混合物を表わす。
Ｐ′（Ｗ′‐GPIR-la′）ｍ （ここで、ｍは整数又は１以上、１以下の混合数を示
す） 例えば、リシン自体のサブユニットＡを抗体Ｐ（例えば
抗体T101）に結合してイムノトキシンを形成する際、２
硫化基を持つ２価の共有構造を経て行なう場合（ここで
２硫化基の一方の硫黄はリシンの長期活性Ａ鎖のシステ
ィン257に属し、他方の硫黄はオキシプロピル基によっ
て抗体Ｐのチロシンのフェノール酸素と結合してい
る。）、下記統計的な式を有する。
Ｐ′（O-CO-CH2‐CH2‐S-S-A-la′）ｔ ここでｔは結合中に含まれる抗体（例えば抗体T101）中
のチロシンの数を示す。
得られたイムノトキシンは、式IIの生産物に対応してい
る。この式中、 Ｐ′は上述した通りであるが、とくに結合中に含まれて
いるチロシンのフェノール基を除去した抗体T101のラジ
カルである。
A-la′はシスティン257のチオール基を除去したリシン
の長期活性Ａ鎖のラジカルである。
Ｗは下記の（ｃ）基である。
‐Z-Y-E-S-S-（Ｅ′‐Ｙ′‐Ｚ′）ｎ‐ ここでＺは結合中に含まれるフェノールハイドロキシル
の酸素であり、Ｙは−CO−,Eは不活性空間構造−CH2‐C
H2−,nは０である。
特に好適なイムノトキシンはリシンの長期活性サブユニ
ットＡと単一抗体Ｐとを含む１又は２以上の構造物によ
って形式されたもので、下式で示される。
Ｐ′（Ｗ′‐A-la′）ｍ （III） ここでＰ′,W′及びA-la′は上述した通りである。ｍは
結合中に含まれる蛋白質Ｐに属する基の数を示す。ｍの
数は0.3〜12、好ましくは0.5〜10の範囲で変化する。
「ｍの数は0.3〜12、好ましくは0.5〜10の範囲で変化す
る。」とは、ｍの値は統計的な値であるということであ
る。なぜなら、抗体分子の中では結合は均一には生じな
いためである。従ってｍは整数ではない。
ｍの値はとくに使用される抗体により、更には抗体の分
子量による。
従って断片Fab又はFab′を最初の抗体Ｐとして使用する
と、ｍの値は0.3と約２の間で変化する。断片Ｆ（a
b′）２を使用すると、ｍは0.5と約４の間で変化する。
IgGタイプの抗体では、ｍは0.5と約６との間で変化す
る。抗体IgMではｍは１と約12の間で変化する。
しかし、好ましくは抗体Ｐの置換の程度は、ｍが0.5以
上であり、10を越えないのがよい。
一般に、上述の構造式Ｉ及びIIは、簡略式に記載された
一般式を示す。
同様に以下の式IV,V及びIXはｎが１のときはいつも統計
的な式である。なぜなら結合反応体は蛋白質P1及びP2中
から選択され、これら蛋白質は全て抗体Ｐとして上述の
如く考慮されるものとしてまったく同じ性質を有してい
る。この場合蛋白質P1及びP2は抗体Ｐ又は蛋白質GPIR-l
a自体であることを問わない。
この発明の他の態様としては抗体と、リボソーム不活性
化糖タンパクとの間にジスルフィド又はチオエーテル型
の共有結合を有する長期作用型免疫毒素の製造方法であ
って、糖タンパク（そのチオール基を適宜保護して）を
第１アミンの存在下で過ヨウ素酸アルカリ金属塩の水溶
液で０〜15℃で、光の不存在下で0.2〜24時間処理して
得るようにしたことを特徴とする方法を提供する。
本発明の好ましい態様は上記構造Ｉの免疫毒素の製造方
法であって、タンパクP1（リボソーム不活性化長期作用
型糖タンパク、GPIR-la又は抗体もしくは抗体断片であ
って、遊離チオール基が直接又は介在原子団を介して結
合したもの）を水溶液中、室温でタンパクP2（P1と異な
り、リボソーム不活性化長期作用型糖タンパク、GPIR-l
a又は抗体もしくは抗体断片であってタンパクP1の遊離
チオール基と結合し得る基を有するもの）と反応させ、
チオエーテル又はジスルフィド結合を形成させることを
特徴とする方法を提供するものである。
本発明の特に好ましい態様は上記構造IIの免疫毒素の製
造法であって、Ｐ′,W′およびGPIR-la′が上記定義の
ものからなるもので、下記一般式のタンパク、すなわち
一般式、 P1′‐（Z-Y-E）ｎSH （IV） のタンパクを一般式、 P2′‐Ｚ′‐Ｙ′‐Ｅ′‐Ｇ （Ｖ） のタンパクと反応させることを特徴とする免疫毒素の製
造方法、 （ただし、式中P1′およびP2′はこれらタンパクに属す
る基に結合されたタンパクP1およびP2のラジカル、又は
P1およびP2が抗体もしくは抗体断片であるときは過ヨウ
素酸との反応により糖鎖核の開鎖により生じたタンパク
P1およびP2のラジカル、Z,Z′,Y,Y′,E,E′は前記同
様、Ｇは （ただし、Ｘは活性化基）である） を提供するものである。
したがって上記ＰおよびGPIR-laは下記の基を適宜含む
タンパクである、 （１）結合に関与するチオール基又はその他の基、 （２）上記チオール基と反応しジスルフィド又はチオエ
ステル結合を形成し得る１以上の官能基。
本発明によれば上記チオール基および官能基は天然のタ
ンパクＰ又はGPIR-la、又はこれらを人工的に導入した
ものである 出発物質におけるチオール基の保護は、そのチオール基
が抗体との結合に用いられるものである場合にのみ必要
とされる。例えばチロシンのフェノール性水酸基のよう
な他の感応基が結合に用いられる場合には、前記の保護
は行なわれない。
保護のためのブロッキングは、SH基を、引続いて還元反
応またはチオール／ジスルフィド変換反応で除去できる
ような官能基で置換することができるような試薬、例え
ば2,2−ジニトロ−5,5−ジベンゾジ安息香酸（DTNB）、
或いは３−（ピリジン−２−イル−ジスルファニル）プ
ロピオン酸等との反応によって行なわれる。このような
試薬が存在しない条件下では、Ａ鎖中の遊離チオール基
は酸化反応およびアミン存在下での還元反応中に消失し
てしまい、たとえ２−メルカプトエタノールのような還
元剤との反応によっても全体的に再生することはできな
い。過剰のブロック剤は透析により除去する。
チオール基がブロッキングされ、リボソームを不活性に
する糖タンパクはついで過ヨウ素酸塩イオンで酸化さ
れ、アミンの存在下で還元される。もし、細胞毒サブユ
ニットがチオール基を含まない場合は、又はチオールが
結合のために使われないならば上記のブロッキングはお
こなわれない。
リボソームを不活性化する長期作用型糖蛋白から抱合
体、即ち免疫毒素を調製するには、米国特許第4340535
号に記載されている方法のなかから適当に選択した方法
を用いればよい。もし、選択した細胞毒サブユニット
が、結合に適した少なくとも一つのチオール基を天然に
含んでいるならば、この基は活性化されたジスルフィド
基をもった抗体または抗体フラグメントとの反応に好適
に用いられる。もし、選択した細胞毒サブユニットが、
結合に適したチオール基を天然には含んでいないなら
ば、過ヨウ素酸イオンとの酸化処理の後、遊離チオール
をもった少なくとも一つの官能基を公知の何等かの方法
で人為的に前記サブユニットに導入し、上記の結合反応
を続行する。
前記官能基の導入は、過ヨウ素酸イオンとの酸化処理又
はアミン存在下の還元の前におこなわれる。その場合、
酸化および還元の間、チオール基をブロックしておき、
そののちにブロックを解除する必要がある。
本発明の方法において、GPIR-laと抗体（または抗体フ
ラグメント）との化学的な結合は、結合体の二つの成分
（抗体およびGPIR-la）の夫々の生物学的活性を保持
し、満足すべき再現性および良好な収率で結合体が得ら
れ、また得られた結合体中におけるGPIR-la/抗体の比率
制御を可能とすると共に、更には安定且つ水溶性の生成
物に導くような方法で行なうことができる。
これらの特徴に対応した方法の中で、二つの蛋白の間の
結合形成において、１または２以上のチオール基を含む
ものを優先すべきである。事実、これらのチオール基
は、ジスルフィド結合またはチオエーテル結合の形成に
特に適し、両者共に上記の一般的条件を満たす。
同時に免疫毒素の調製についても以下の特徴を有してい
る。
・リシンのＡ鎖と抗体との間の共有結合は、ジスルフィ
ド基を含んでいる。
・ジスルフィド結合を形成している硫黄原子の一つは、
常に、リシンＡ鎖の257位置にでのシスティン残基に属
する硫黄原子である。
・また、リシンのＡ鎖を抗体に結合するリンクは、抗体
のNH2側基またはペプチド鎖の末端基に結合しており、
抗体とリシンＡ鎖とのカップリングにより形成される。
これらについては、米国特許第4340535号に詳細に記載
されている。
同じ方法が、同様の特徴を有し、且つ抗体または抗体フ
ラグメントとGPIR-laとの結合で形成される免疫毒素類
の調製にも適用できる。
抗体または抗体フラグメントとGPIR-laとの結合、及び
異なった官能基におけるジスルフィドまたはチオエーテ
ル型の共有結合により形成される免疫毒素類の調製につ
いて、以下に詳細に説明する。
一般的に、特に交叉結合の乱れを排除して蛋白間にうま
く結合反応を行なうためには、安定で且つ明確に定まっ
た共有結合が形成されるように、結合さるべき一方の蛋
白（一方のみ）は使用されるチオールまたはチオール基
だけを有し、他方の蛋白はpH5〜９、30℃を越えない温
度の水性媒質中においてチオール類と反応し得る１また
は２以上の基のみを有することが重要である。
以下に詳細に説明するように、蛋白P1およびP2の特徴は
出発物質として用いられる。Ｅの立体構造は、より好ま
しい構造Ｒ〜RB（これは実施例としてのみ与えられる）
に置代えることができる。
I.タンパクP1 このタンパクは、どんな場合も結合に関与する１つか１
つ以上のチオール基を有しているので、生じる状況はタ
ンパクP1の性質に応じて異なる。
（Ａ）天然の状態でタンパクP1は、タンパクP2との結合
に関与する１つ以上のチオール基を有している。このこ
とは特に次にような場合に言える。すなわち、タンパク
P1が、ペプシンの存在下で抗体を限定分解し、続いて高
分子間のジスルフィド結合を還元して通常得られるよう
なＦ（ab）′として知られる抗体断片である場合であ
る。このことは、タンパクP1がリシンのＡ鎖またはＡ鎖
の誘導体である場合にもあてはまる。この場合、天然リ
シンの171番目のシスティン残基および257番目のシステ
ィン残基に付いている少なくとも１つのチオール基が未
結合であって化学結合を生じやすい。これらすべての場
合において、天然のチオール基を有するタンパクP1はこ
のような状態で結合工程に使用される。
（Ｂ）天然の状態でタンパクP1は、タンパクP2との結合
に関与するチオール基を有していない。このことは特に
次のような場合に言える。すなわち、タンパクP1が天然
の免疫グロブリンであって、抗体全体か抗体の断片特に
通常Ｆ（ab）′またはＦ（ab）と呼ばれる断片の１つで
ある場合。天然の状態でタンパクP1が結合に関与する１
つのチオール基を持たない場合のいま１つの例は、この
タンパクP1が、２つのシスティン残基それぞれがアルキ
ル化により保護されているか、または化学修飾を受けな
いリシンのＡ鎖である場合である。全ての場合におい
て、結合を可能にする１つ以上のチオール基をそのよう
な分子に導入することが妥当といえる。
３つの型の反応がチオール基を導入するために好ましく
用いられる。
（１）最初の型の反応は、Ｓ−アセチルメルカプトコハ
ク酸無水物との反応である。この酸無水物は、タンパク
のアミノ基のアセチル化を可能にする。その後当該チオ
ール基をヒドロキシアミンと反応させることによってア
セチル保護基を除くことができる。この方法はすでにア
ーチブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオ
フィジクス（Archives of Biochemistry and Biophysic
s）、119,41-49（1967）に記載されている。このように
保護基が導入されたチオール基を続いて活性型ジスルフ
ィド基と反応させる場合、ヒドロキシアミンによって前
もって保護基をはずさなくて済む可能性がある。事実、
この発明の物質を形成する反応体を使ってジスルフィド
結合を形成する反応は、遊離チオール基を使った場合と
同様にＳ−アセチル基を使っても生じる。
文献に記載されている他の方法も、修飾されるタンパク
にチオール基を導入するために使うことができる。
（２）第２の型の反応はタンパクをカルボキシル基を介
して以下に示すジスルフィド構造を有する対称的なジア
ミノ分子と反応させることである。
H2N-R1‐S-S-R1-NH2 上式中、R1は炭素数２から５の脂肪族原子団である。こ
の反応では、カルボジイミド特に１−エチル−３ジメチ
ルアミノプロピル−３−カルボジイミドのような水溶性
の誘導体の如きカップリング剤の存在下でシスタミン
〔R1＝−(CH2)2−〕と反応させ、用いた化学量論量に応
じて次に示す誘導体の１つか双方の混合物を形成させる
ことが好ましい。
P1′‐CO-NH-R1-S-S-R1-NH2 （Ia） P1′‐CO-NH-R1-S-S-R1-NH-CO-P1 （Ib） この型の反応生成物は次の２つの工程のいずれかに供さ
れる。
（ａ）式IaまたはIbにおいて、タンパクP1がリシンのＡ
鎖またはその誘導体の１種ならば、得られた反応溶液は
分別せずに２−メルカプトエタノールのような還元剤と
の反応に供せられる。それによって次式の１種類のタン
パク誘導体が得られる。
P1′‐CONH-R1‐SH こうして得られた生成物は続いて透析かゲル瀘過により
精製される。
（ｂ）式IaおよびIbにおいて、ラジカルP1′が抗体また
はその断片の１種から成る、タンパクＰのラジカルなら
ば、得られた反応溶液はそのままカップリングに用いら
れ、その場合チオール／ジスルフィド交換法が用いられ
る。この交換法は、例えばギリランド（Gilliland）と
コリエール（Collier）によってキャンサー・リサーチ
（Cancer Reserch）,40,3564（1980）に記載されてい
る。
（３）第３の反応は、導入しようとするチオールを有す
るラジカルを固定するために糖鎖単位を使うことであ
る。この糖鎖単位は天然の状態で抗体に存在しているも
のである。続いてタンパクは、糖鎖単位にアルデヒド基
を生じさせるために過ヨウ素酸で酸化される。過剰のエ
チレングリコールを加えて反応を停止させ、副産物と過
剰の反応体を透析により除いた後、得られた生成物を次
の一般式を有対称なジアミノ分子で処理する。
H2N-R1-S-S-R1-NH2 上式中R1は炭素数２ないし５の脂肪族量である。得られ
た付加生成物は、続いて金属水素化物（特には、水素化
ホウ素ナトリウム）との反応により第２または第３アミ
ンに還元される。この反応はシスタミン〔R1＝−(CH2)2
−〕を用いて実施することが好ましく、用いた化学量論
量に応じて次式の誘導体の１方かその両方の混合物が形
成される。
得られた反応液を、IaまたはIbの構造式で表わされる生
成物であってP1′が抗体または抗体断片であるものに関
して上記したとおりの処理を行なってもよい。
チオール基を人工的に導入（対称なジアミノジスルフィ
ド反応体を使うタイプ）するための上に述べた後二者の
反応において、タンパクP1は遊離SH基または遊離アミノ
基を持たないことが好ましい。GPIR-laの場合には、Ｎ
−エチルマレイミドまたはヨード酢酸のようなチオール
基に対する通常の試薬との反応により天然のチオール基
をアルキル化し、およびミィーンズ（MEANS）およびフ
ィーニー（FEENEY）によってバイオケミストリー（Bioc
hemistry）7,2192（1968）に記載された還元的メチル化
法に従って天然のNH2基をメチル化することにより常に
遊離のチオール基を持たなくさせ得る。このようにして
天然リシンのＡ鎖に１モル当り６個までのメチル基を導
入することができる。このようにして修飾されたタンパ
クには、生物学的な特性（特には、真核細胞のリボソー
ムにおけるタンパク合成を阻害する能力）が備わってい
る。抗体または抗体断片さらに第１群のすべての物質の
場合には、前記したようにそれらは天然の遊離SHを持た
ないので、還元的メチル化を例えばミーンズおよびフィ
ーニーの方法により実施するほうがよい。このようにし
て通常抗体１モル当り数十のメチル基を導入することが
できる。その場合抗体の細胞表面上の抗原を認識する能
力を変化させない。
IIタンパクP2 あらゆる場合、このタンパクは、タンパクP1のチオール
基と反応してジスルフィドまたはチオエーテル結合を形
成し得る１つ以上の官能基を有するタンパクである。こ
れらの官能基は、常にタンパクP2に人工的に導入される
が、それがジスルフィド結合によりカップリングされる
のかチオエーテル結合によりカップリングされるのかに
応じて異なっている。具体的には以下に記載する。
（１）ジスルフィド結合 この場合、包合体の調製は以下の式で表わされる。
P1′‐(Z-Y-E)n-SH+P2′‐Ｚ′‐Ｙ′‐Ｅ′‐S-S-X→ P1′‐(Z-Y-E)n‐S-S-E′‐Ｙ′‐Ｚ′‐P2′＋X-SH。
活性イオウ原子により置換されるタンパクP2はタンパク
P2または適切に保護されたタンパクP2からそれ自体活性
イオウ原子を有する試薬による置換により得られる。こ
れは次の式で示される。
P2＋L-Y′‐R-S-S-X→P2′‐Ｚ′‐Ｙ′‐Ｒ′‐S-S-X 上式中、P2は置換されるべきタンパクを示し、Ｌ−Ｙ′
は試薬をタンパクに共有結合させる基を示す。官能基Ｌ
−Ｙ′は、置換されるべきタンパクの構成アミノ酸の側
鎖に付いているいずれか１つの基と共有結合し得る基で
ある。これらの基の中で、特に次のものが選び出せる。
（ａ）ペプチド鎖の末端アミノ基またはタンパクに含ま
れるリシン残基のアミノ基。この場合、Ｌ−Ｙ′は特に
次のように表わせる。
・カルボジイミド、特に１−エチル−３−ジメチルアミ
ノプロピル−３−カルボジイミド、３−（２−ピリディ
ルジスルファニル）プロピオン酸（上記カルボジイミド
で活性化された）の如き水溶性誘導体のようなカップリ
ング剤の存在下でタンパクのアミノ基と結合し得るカル
ボキシル基。
・アミノ基と直接反応して、それをアシル化し得るカル
ボン酸塩化物。
・オルト−またはパラ−ニトロフェニルまたは−ジニト
ロフェニルエステル、またはＮ−ヒドロキシコハク酸イ
ミドエステル（たとえばＮ−スクシンイミディル−３−
（２−プリディル−ジチオ）プロピオネート）のような
いわゆる「活性型」エステル。これはアミノ基と直接反
応して、それをアシル化し得る。
・コハク酸無水物のようなジカルボン酸の内部無水物。
これはアミノ基と自然に反応して、アミド結合を形成さ
せる。または ・イミドエステル基 上式中、R2はアルキル基で、次式のようにタンパクP2の
アミノ基と反応する。
上式中、R3は−Ｒ−S-SXを示す。
（ｂ）タンパクに含まれるチロシン残基のフェノール
基。この場合、Ｌ−Ｙ′は特にイミダゾール−１−イル
カルボニル基を示すことがある。それは次の式に従って
タンパクのフェノール基と反応する。
上式中、Ｌがイミダゾール−１−イルで、Ｙ′がCO基
で、R4が−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｘ基である。−Ｓ−Ｓ−Ｘは遊
離チオール基と反応し得る活性型ジスルフィドを示す。
特に、このジスルフィドにおいて、Ｘは１つ以上のアル
キル、ハロゲンまたはカルボキシ基で置換されているこ
とのあるピリジン−２−イルまたはピリジン−４−イル
基を指すことがある。Ｘもまた１つ以上のフェニル基ま
たはカルボキシル基で好ましくは置換されているフェノ
ール基を指すことがある。またはＸはメトキシカルボニ
ル基のようなアルコキシカルボニル基を指すこともあ
る。
Ｒ基は、置換基Ｙ′およびＳ−Ｓ−Ｘを同時に結合し得
る介在分子（前式中のＥのような）を示す。それは、後
の反応において、使用される反応物質と合成される生成
物を防害するような基を含まないようなものでなければ
ならない。特に、Ｒ基は−（CH2）−でもあり得（ｎは
１ないし10）、また次の基でもあり得る。
上式中、R6は水素または炭素数１ないし８のアルキル基
を指し、R5は続いて使われる次式のカルカルバメイト基
のような反応体に不活性な置換基を指す。
上式中、R7は炭素数１から５の直鎖または分枝アルキル
基、特に第３ブチル基を示す。化合物Ｌ−Ｙ′−Ｒ−Ｓ
−Ｓ−ＸとタンパクP2との反応は均質な液相、最も一般
的には水または緩衝液中で進行する。反応体の溶解性を
高めるには、水に可溶性の有機溶媒を反応溶液に加える
ことができる。その最終濃度を、第３ブタノールのよう
な第３アルコールの場合には容量比で20％までにするこ
とができ、ジメチルホルムアミドまたはテトラヒドロフ
ランの場合には容量比で10％までにすることができる。
反応を、室温にて数分から数時間の時間をかけて実施す
る。その後、低分子量の生成物および特には過剰の反応
体を透析またはゲル濾過によって除去することができ
る。この方法により、タンパク１モルあたり１ないし15
の置換基を導入することが可能となる。そのような化合
物を用いる場合、タンパクP1とのカップリングは、pH6
から８の溶液中にて30℃を越えない温度で、１時間から
24時間かけておこなう。低分子量の生成物を除くために
適宜、得られた水溶液を透析する。ついで包合体を既知
の方法の変法により精製できる。
（２）チオエーテル結合 この場合、包合体をP1′‐(Z-Y-E)n‐SHと前もって１つ
以上のマレイミド基を導入しておいたタンパクP2とを反
応させることにより調製する。
１例として、反応を次の式で示す。
上式中、R8は炭素数１ないし15の脂肪族または芳香族介
在分子を示す。それは、続いて使用される反応体に対し
て不活性である。Ｚは、結合に関与するタンパクP2の官
能基の種類に従って変化し得る基を示す。すなわち、
Ｚ′は、酸素（チロシン残基（チロシル基）のフェノー
ル基のエステルの場合）、NH（タンパクのアミノ基と活
性型カルボキシル基のカップリングの場合）またはNH-C
H2（タンパクのアミノ基とクロロメチルケトンの場合）
である。
マレイミドで置換されたタンパクP2は、それ自体マレイ
ミド基を有する試薬によってタンパクの適当な基を置換
することによって、タンパクP2自体からまたは適当に保
護されたタンパクP2から得られる。これらに適した基の
うち、特に次のものが選ばれる。
ａ）ペプチド鎖の末端アミノ基またはタンパクに含まれ
るリシン残基（リシル基）の側鎖アミノ基。この場合、
マレイミド基を有する試薬は次のようなものがある。
ア）次の一般式の試薬 上式中、L-CO-は次のとおりである。
・カルボキシル基。その場合、カルボジイミドのような
カップリング剤および特には１−エチル−３−ジメチル
アミノプロピル−３−カルボジイミドのような水溶性誘
導体の存在下でカルボキシル基を活性化したのち、反応
が進行する。
・またはオルト−若しくはパラ−ニトロフェニルまたは
ジニトロフェニルエステルまたはＮ−ヒドロキシコハク
酸イミドエステル。
これは直接アミノ基と反応し、それをアシル化する。こ
のような試薬の調製は、特にヘルベティカ・ケミカ・ア
クタ（Helvetica Chimica Acta）,58,531-541（1975）
に記載されている。同じようなクラスの他の薬剤は市販
品として手に入る。
イ）次の一般式の試薬 これは次の反応式に従ってタンパクP2のアミノ基と反応
し得る。
ｂ）タンパクに含まれるチロシン残基のフェノール基。
この場合マレイミド基を有する試薬は次の一般式で示さ
れる。
これは次の反応式に従ってタンパクのフェノール基と反
応する。
マレイミドを有する試薬とタンパクP2との反応は均質な
液相、最も一般的には水または緩衝液中で進行する。反
応体の溶解性を高めるには、水に可溶性の有機溶媒を反
応溶液に加えることができる。その最終濃度を、第３ブ
タノールのような第３アルコールの場合には容量比で20
％までにすることができ、ジメチルホルムアミドまたは
テトラヒドロフランの場合には容量比で10％までにする
ことができる。反応は室温にて数分から数時間かけてお
こなう。
そののち、低分子量生成物、特に過剰の反応物を透析、
又はゲル濾過により取り除く。
この方法により、通常、タンパク１モリ当り１〜13の置
換基を導入することができる。
このような化合物を用いる場合、タンパク質Ｐとのカッ
プリングは、２つのタンパク質をpH6〜８の水溶液中に3
0℃以下の温度で１ないし24時間かけて溶解することに
よっておこなう。得られた溶液を、所望に応じて透析し
て低分子量生成物を除去し、抱合体を種々の既知の手法
によって精製する。
式 （ここで、ＥおよびＧは上記の通り）で示される化合物
は、式 G-E−COOH VII （ここで、ＧおよびＥは上記の通り）で示される化合物
を、有機溶媒中10ないし40℃の温度で、 式 で示されるカルボニルジイミダゾールと反応させること
によって得られる。
式VIの化合物は、タンパク質GPIR-laおよびＰのチロシ
ンの水酸基とのカップリング用試薬として特に有用であ
る。
この発明は、また、統計式 GPIR-la″‐O-CO-E-G IX （ここで、 GPIR-la″は、タンパク質GPIR-laの残基もしくはその官
能基のいずれか１つを修飾することによってGPIR-laか
ら誘導された分子であって、チロシンのフェノール水酸
基が１つ以上除去されているものを表し、 酸素原子は、残基GPIR-la″から離脱した上記フェノー
ル水酸基に属するものを表し、および ＥおよびＧは上記の通りである）で示される新規生成物
にも関する。
特に好ましい化合物は、式IXで示される化合物であって
Ｅが、基CH2 Ｐ（ここで、ｐは２ないし７の整数）
または基 であり、かつＧが式−Ｓ−Ｓ−Ｘ（ここで、Ｘは、１つ
以上のハロゲン、アルキル基、カルボキシル基、アルコ
キシカルボニル基、１つ以上のハロゲン、ニトル、アル
コキシ、カルボキシルもしくはアルコキシカルボニルで
置換されもしくは置換されていないフェニル基もしくは
アルコキシカルボニル基でそれぞれ置換されまたは置換
されていないピリジン−２−イルおよびピリジン−４−
イルよりなる群の中から選ばれた活性基であるものであ
る。
式IXの生成物は、式 GPIR-la″‐OH （ここで、GPIR-la″は上記の通り、および水酸基は残
基GPIR-la″のチロシンから脱離するフェノール水酸基
である）で示される化合物を、場合に応じて水混和性有
機溶媒（例えばジオキサンやテトラヒドロフランのよう
なエーテル系溶媒）を含有する水系溶媒中、10ないし40
℃の温度で、式VIの化合物と反応させることによって得
られる。
GPIR-laがリシンの長期作用型Ａ鎖である場合、得られ
た免疫毒素IT（A-la）の性質は以下の通りである。
（１）抗体１モル当りの修飾Ａ鎖のモル数で表現される
平均カップリング度は、通常、0.5ないし５であり、特
に１ないし３である。
（２）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によってIT
（A-la）を分離すると、抗体の分子量とは30000ダルト
ンづつ連続的に異なる分子量を有する生成物に相当する
一連のバンドに分れる。
（３）サイトフルオロメトリーによって、抗体は活性化
およびカップリング反応中にどのような実質的な劣化を
も受けていないことおよび抱合体自体の内部においてそ
れが指向された抗原をなお認識し得ることが示され得
る。
（４）修飾され抗体とカップリングしたＡ鎖の、タンパ
ク質合成に対する阻害活性は、２−メルカプトエタノー
ルの存在下において無細胞モデルで測定すると、全体的
に保持されている。
免疫毒素IT（A-la）の細胞毒性活性は、活性化剤の存在
下において標的抗原を有する細胞について細胞モデル中
でのタンパク合成試験で測定したとき、標的抗原を持た
ない細胞について同一条件でおこなったときよりも100
倍以上大きい。例えば、ジスルフィド架橋を含む結合に
よってリシンのA-la鎖を、ある種のマウス白血病細胞表
面に存在する抗原Thy1.2に指向される単一クローン抗体
（抗体AT15Eで表示）とカップリングして得た免疫毒素
（IT（A-la）で表示）は、陰性Thy1.2細胞に対してより
も約1000倍、陽性Thy1.2細胞に対して細胞毒性である。
Ａ鎖として換算してIT（A-la）をウサギに0.4mg/Kg体重
のオーダーで血管内投与した後、投与から24時間後の血
液流に存在するIT（A-la）の血漿中レベルは、同一条件
で測定した通常のITの血漿中レベルよりも10ないし200
倍高い。かくして、ウサギが関与する典型的な例におい
て、投与24時間後の血液流中のIT（A-la）AT15Eの血漿
中レベルは、時間０のときに存在するレベルの10％であ
り、同一時間における通常のIT AT15Eの場合の0.08％と
比べて、120倍であることがわかる。
これによって、薬理的性質に関して新たな性質が付与さ
れた修飾免疫毒素が得られるのである。
さらに詳細には、細胞毒性サブユニットを適当に修飾す
ることによって、免疫毒素の特異的細胞毒性に、これを
阻害することなく、新たな固有の性質すなわち高等動物
又はヒトに注射したのち、遅延された血漿中における消
失キネティックスを示す能力を付与できるのである。
この発明はさらに活性物質としての上記の変性された免
疫毒素を、他の薬理学的に許容し得るビヒクル（注射、
特に血管内注射に適したもの）ととも用いた薬剤を提供
する。
以下、この発明の実施例を記載する。
実施例１ この実施例はＬ−ロイシンの過剰存在下で過ヨウ素酸ナ
トリウムによる酸化反応で修飾したリシンＡ鎖を動物に
静脈注射した場合の消失の遅延性を証明するためのもの
である。
Ｉ過ヨウ素酸ナトリウムおよびＬ−ロイシンによるリシ
ンＡ鎖の修飾 （１）DTNBを用いたＡ鎖の天然SHのブロッキングリシン
Ａ鎖を米国特許No.4,340,535に記載されている方法で製
造、精製した。2,2′−ジニトロ−5,5′−ジチオ２安息
香酸（DTNB）の溶液20当量、すなわち、pH7の125mMリン
酸塩緩衝液に溶かしたDTNB 1ml（この溶液は水酸化ナト
リウムでpH:7に調節した）を、PBS緩衝液に溶かした7.2
mg/mlの割合で含むリシンＡ鎖（1A鎖当り0.84チオール
基を含む）23ml溶液に加えた（りん酸塩については20m
M,NaClについては150mMのpH:7の緩衝液）。この溶液を
４℃でPBS緩衝液を用いて透析し、チオール基をブロッ
キングしたＡ鎖を162mgを6.9mg/mlの割合で含む溶液と
して得た。
（２）チオール基がブロッキングされたＡ鎖の過ヨウ素
酸塩による酸化およびＬ−ロイシンによるシッフ塩基形
成 りん酸塩緩衝液30mM中にＬ−ロイシンを52mg/ml含む溶
液12ml（pH6.5）、過ヨウ素酸ナトリウムの0.5M水溶液
0.5mlを、酢酸でpH:6.5に調整したチオール基ブロッキ
ング済みＡ鎖を79.4mg含む溶液11.5ml中に加えた。培養
は暗所で４℃で17時間おこなった。
酸化反応停止はエチレングリコールの1M水溶液2.8mlを
加えることによりおこなった。培養後、20℃で15分間、
反応媒体を４℃でPBS緩衝液で48時間透析した。これを3
0分間、10,000×Ｇで遠心分離したのち、チオール基が
ブロッキングされ、シッフ塩基形成酸化によりオシド残
基が変性されたＡ鎖を1.9mg/mlの濃度で28ml得た。
（３）チオール基のブロッキング解放 オシド基残渣をブロッキング、変性させたＡ鎖の1.9mg/
ml溶液25mlを10.5mlに濃縮し、これに50％２−メルカプ
トエタノール0.214mlを加えた。培養を20℃で１時間お
こない、ついでこの溶液を４℃でPBS緩衝液を用いて透
析した。その結果酸化されたＡ鎖を2.65mg/mlの濃度で2
6.5mg得た。
DTNB法（Enzymology,1972,25,457 Academic Press）を
用い、この修飾されたＡ鎖が１モル当り0.89の遊離チオ
ール基を有することが判明した。この修飾Ａ鎖の分子量
はドデシルサイフェートの存在下でのポリアクリルアミ
ド勾配電気泳動により30,000±3,000であることが判明
した。
オシド単位が変性されたＡ鎖を、タンパク質合成の抑上
における酵素活性および薬理学的特性について研究し
た。
II持続性Ａ鎖の酵素活性の非細胞モデルによる測定 リシンＡ鎖の基本的生物学的特性はリボソーマルサブユ
ニット60Sの劣化によりタンパク合成を抑制することで
ある。
試験管内プロトコールにおいて、人工的メッセンジャー
RNAすなわちポリウリディリル酸の存在下で14C−フェニ
ルアラニンを導入し得るラットの肝ぞうの適当に捕足し
たサブセル分画を用いる。
サブセル分画の製法および14C−フェニルアラニンの導
入の測定法は文献Biochemica Biophysica Acta1973,31
2,608-615に従い、ラットの肝細胞のミクロソーム分画
およびサイドゾル分画を用いておこなった。Ａ鎖を含む
サンプルを、0.2％２−メルカプトエタノールおよびウ
シ血清アルブミン15μg/mlを含むpH7.6の50mMトリスHCl
緩衝液中に希釈させた溶液の形で用いた。
データは抑止剤なしの参照媒体との関連において、リシ
ンＡ鎖を含む各反応媒体におけるタンパク中への14C−
フェニルアラニンの導入の抑止率で計算した。
得られた曲線からＡ鎖（天然または変性）のIC50の濃度
（放射能マーク付き先駆物質の導入を抑制する）を計算
することができる。すなわち、3.1010モル/lに相当する
IC50を変性、ブロッキングA-la鎖について調べた。参照
鎖のIC50は1010モル/lである。測定誤差を考えると、変
性によるＡ鎖の活性損失は認められなかった。
IIIオシド単位を変性した持続性Ａ鎖（A-la鎖）の薬理
効果 この天然又は変性Ａ鎖をラビットに耳を介して静脈投与
した。このＡ鎖投与量は0.415mg/Kgであった。血液サン
プルをヘパリン上に間隔をおいて採取した。この血漿を
下記にRIM-1の記号で示したラジオイムノアッセイテス
トで分析した。
この方法はＡ鎖を修飾することなしに判定し得る利点を
有する。この判定をマイクロ滴定プレート（たとえば、
NUNC-TSPスクリーニングシステム,Poly Labo Block製）
を用いておこなった。このプレートの蓋体には過吸収剤
スパイクが設けられていて、これがベース中の穴に浸入
するようになっている。これらのスパイクは固体相から
なるものである。リシンのＡ鎖を示し、親和性クロマト
グラフィで精製された雌羊抗体（以下にAc1の記号で示
す）をこの固体相上に吸収させた。この目的のため、PB
S緩衝液中に10μg/ml含むAc1の溶液を上記穴に分けて注
入した。上記スパイクを４℃で24時間、Ac1溶液と最初
に接触させ、ついで20℃で３時間、胎児ウシ血清と接触
させ、全ての固定部位を飽和させた。この飽和した免疫
吸収剤を20℃、３時間、種々の濃度の血漿サンプル、又
は既知の濃度のＡ鎖溶液と接触させ、目盛曲線を作成し
た。PBS緩衝液で洗浄後、この免疫吸収剤をリシンＡ鎖
を示す雌羊抗体（親和クロマトグラフィで精製し、放射
能ラベルを施したもの、以下Ac2と記す）と20℃で２時
間接触させた。このAc2の放射能ラベルはクロラミンＴ
の存在下でヨウ素125を用い、GreenwoodおよびHunterの
方法（Biochem.J.,1963,89,114）でおこなった。このラ
ベルしたAc2抗体は５〜10マイクロキューリー／μｇを
示した。このラベル化Ac2 106cpmを200μｌとして、0.1
％ウシ血清アルブミンを含むPBS緩衝液中に導入した。P
BS緩衝液中で洗浄ののち、上スパイクを取りはずし、結
合したAc2の量を放射能測定により計量した。サンプル
中のＡ鎖の濃度は、異なる既知の濃度でＡ鎖を導入する
ことによって作られた目盛曲線に対して参照することに
より測定した。持続性Ａ鎖を動物に注射した後、同じＡ
鎖を用い相当する目盛曲線を作成した。
この方法で測定された血漿中のＡ鎖の濃度は再現性であ
り、信頼できるものである。この探知しきい値は1ng/ml
である。各実験間の再現性の検討の結果、変化関数が１
〜200ng/mlの濃度について10％以下であった。
これらの実験の結果は曲線で示され、時間は横軸に、零
時の血漿濃度理論値に対する記録された生成物の血漿濃
度の％をlogスケールで縦軸に示した。この値、すなわ
ち、“相対血漿濃度”（RPC）は下記の式で計算され
る。
血漿量は動物の体重の1kg当り36mlで考えられている。
第１図は天然リシンＡ鎖を静脈注射した場合の血漿にお
ける消失曲線を時間の関数として示したものである。こ
の曲線（１）は２つの相を示している。第１にこの天然
リシンＡ鎖を注射後３時間で血漿中に残る率はわずか0.
1％（投与量に対して）であり、血液から急激に消失す
ることを示している。第２の相においてはこの消失がよ
りゆるやかである。
しかし、オシド単位を変性したＡ鎖（A-la鎖、曲線２）
においては、この消失性は著るしく改められる。すなわ
ち、Ａ鎖製品の大部分が消失するもととなる第１の消失
相は著るしく抑制され、その結果、Ａ鎖の血漿における
残留レベルが著るしく増大する。注射20時間後では酸化
Ａ鎖の濃度は修飾されていないＡ鎖（曲線２）の場合の
460倍にもなる。
これらの結果から、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化反
応およびＬ−ロイシンによるシック塩基の形成によるブ
ロッキングによって、Ａ鎖の消失原因となる糖の変性が
おこなわれて、Ａ鎖の生物学的活性が失われることな
く、その消失を防止することができることが証明され
た。
実施例２ この実施例は過酸化ナトリウムによる酸化およびＬ−ア
アニン、Ｌ−グルタミン酸又はＬ−アルギニンの存在下
でのシッフ塩基の形成により変性されたリシンＡ鎖の遅
い消失が、静脈注射において得られることを示す。
（Ａ）手順 実施例１の方法によりＡ鎖を変性した、但しこの場合、
シッフ反応はロイシンの代りにグルタミン酸、アルギニ
ン、アラニンの存在下でおこなった。これらアミノ酸の
導入量はそれぞれＡ鎖のモル量に対し、103、５×103、
104倍とした。
（Ｂ）結果 表１はこれらの異なる変性A-la鎖の特性を示すもので、
天然Ａ鎖、過ヨウ素酸ナトリウムおよびＬ−ロイシンに
よる変性A-la鎖を比較のため用いた。
これらの結果は、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化反応
およびＬ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン
酸によるシッフ塩基の形成におけるアルデヒド基のブロ
ッキングによって、生体中でのＡ鎖の消失原因となる糖
の変化がおこなわれ、Ａ鎖の消失が防止され、しかもＡ
鎖のリボソーム不活性化作用の消失、あるいは、のちの
結合に用いられるチオール基の消失が生ずることがない
ことを証明している。
実施例３ 活性化ジスルフィド基で置換したマウスＴ細胞に対する
抗体（Thy1.2抗原に対する抗体）と、リシンA-la鎖とに
より得られる免疫毒素（ITと略称する）。
ａ）マウスＴ細胞に対する抗体（AT15E抗体）： この抗体は免疫学ジャーナル（Journal of Immunolog
y）第122巻,2491-2498頁、1979年において説明された方
法によって準備した。
ｂ）リシンのA-la鎖 リシンのA-la鎖は実施例１で説明した方法によって準備
した。
ｃ）マウスＴ細胞を阻害する活性化抗体 Ｎ−スクシンイミディル−３−（２−ピリディル−ジチ
オ）−プロピオネート3.62mgを95％エタノール0.326ml
に溶かしたものを、pH7のリン酸塩緩衝液125mMに抗体溶
液7mg/mlを溶かした溶液43.7mlに添加した。この混合物
を20℃で30分攪拌した。125mMりん酸塩緩衝液（pH7）を
用いて透析後、タンパク質溶液を10,000×ｇ、４℃で30
分、遠心分離した結果、活性抗体96.8mgを2.42mg/mlの
濃度で得た。
２−メルカプトエタノールとの交換反応によって放出さ
れた２−ピリジンチオンの343nmにおける吸収をみる
と、この抗体は1mol当り6.7個の活性化された混合ジス
ルフィド基を有していることがわかった。
ｄ）持続作用のあるリシンA-la鎖を含有する免疫毒素の
準備 実施例１で得た2.65mg/ml濃度のA-la鎖10mlを14.8mlの
上記活性抗体溶液（濃度2.42mg/ml、即ち35.8mgの活性
化抗体）に加え、25℃で20時間培養した。この溶液を遠
心分離し、ついでゲル（AcA44ゲル）でろ過精製した。
これを光学密度280nmで測定した。抗体と変性Ａ鎖の両
方を含む分画を合わせると免疫毒素を1ml当り0.315mg含
む溶液52ml（即ち免疫毒素は18.25mg）が得られた。こ
の溶液は抗体とカップリングされた変性Ａ鎖を1ml当り
0.076mg含有する。
従ってこの方法による平均カップリング度は抗体1molに
つきA-la鎖1.6molである。
上記の方法で得たリシンA-la鎖を含む免疫毒素につい
て、その薬物動態学的特性と標的細胞に対する細胞毒性
を調べた。
実施例４ 本実施例は、持続作用をもつリシンＡ鎖を含む免疫毒素
（IT（A-la）と略す）の血漿中濃度がゆっくりと減少す
るという性質の獲得の様子を示す。
Ｉ方法 実施例３で説明した手続で準備された抱合体をうさぎの
耳の血管に一度注射した。投与された量はＡ鎖について
体重1kg当たり0.415mgである。ヘパリンの存在下で血液
を時々採血した。血漿を放射線免疫試験（RIM-3と略
す）によって（２箇所）分析した。
この試験はRIM-1と同じ技術（実施例１）を用いて行わ
れた。但しAc2溶液は本試験においてはRIM-1の技術を用
いてアフィニティークロマトグラフィーによって精製さ
れ、放射標識されたマウスのIgGを阻害するヤギの抗体
である。このサンプルにおける修飾された免疫毒素の濃
度は既知の異った濃度から導いた検量線を用いて決定し
た。RIM-3試験はRIM-1と同じ信頼性及び再現性を有す
る。
比較対照のため、生のリシンＡ鎖を活性化されたジスル
フィド基で置換した抗体の反応から得られたIT-AT15E抱
合体と同じ条件下で比較例の試験を行った。この抱合体
の準備と細菌毒性は実施例３で説明した方法よって行っ
た。これらの実験結果は実施例１でカップリングされて
いないＡ鎖について行ったのと同じ方法で示した。
II結果 図２は静脈注射されたIT AT15E（曲線１）及びIT（A-l
a）AT15E（曲線２）の血漿中濃度曲線を示している。投
与24時間後にIT（A-la）AT15E活性細胞毒素はIT AT15E
の120倍になっていた。この事実は酸化されたＡ鎖の薬
物動態学的特性は抗体とカップリングされた後も保持さ
れていることを示している。
実施例５ 本実施例においてはIT（A-la）AT15Eの陽性標的細胞Thy
1.2に対する細胞毒素特性の保存について述べる。
リシンＡ鎖の基本的な生物学的特性は細胞中のタンパク
質合成をリボソームの60Sサブユニットの分解によって
阻害することである。
この方法は培養中のガン細胞に14Cで標識したロイシン
（以下14C−ロイシンをいう）を取り込ませて研究され
ている物質の効果を測定する細胞系を用いる。
用いられる細胞は、抗原Thy1.2を運ぶ人間のＴ白血病か
ら誘導されるT2細胞系に属する。この細胞は目的の物質
の存在下で保温した後、細胞への14C−ロイシンの取り
込みの程度を測定した。この測定には生物化学ジャーナ
ル（Journal of Biological Chemistry）第249巻11号,3
557-3562頁で説明された、タンパク質合成量を測定する
のに14C−ロイシンのトレーサーを用いる方法によって
行う。取り込まれた放射能はろ過した細胞の全体につい
て測定した。
定量の基準として線量／効果曲線を描くことができる。
この曲線横軸には目的物質中のＡ鎖のモル濃度、縦軸に
は、タンパク質合成を阻害する物質の存在しない比較細
胞における14C−ロイシンの取り込み量に対する百分率
をプロットして得られる。
こうしてそれぞれの物質について14C−ロイシン取り込
み量を50％阻害する濃度または50％阻害濃度（IC50）を
決定することができる。
下記表IIはIT-（A-la）‐AT15EおよびIT AT15Eで、さら
に天然Ａ鎖および非結合A-la鎖で同一実験条件で得られ
たIC50の値を示す。
この表からIT（A-la）AT15Eは天然Ａ鎖を含む対応する
免疫毒素と同様の強い細胞毒活性を示し、これは同一条
件での非結合変性A-la鎖のものより約1000倍の値を示し
ている。
実施例６ 本実施例において生のゲロニンを動物に静脈注射した
場合のその急消失と、過ヨウ素酸ナトリウムによって
変性させたゲロニンを同様に注射した後のそのゆっくり
とした消失について説明する。
Ａ）過ヨウ素酸ナトリウムおよびＬ−ロイシンによるゲ
ロニンの修飾 ゲロニンをゲロニウムムルチフロールム（Geloniummult
iflorum）から生化学ジャーナル，第255巻,6947-6953
頁、1980年に述べてある方法で抽出し、精製した。実施
例２でリシンＡ鎖について述べたのと同じ方法で酸化反
応を行った。しかしチオール基のDTNBによるマスクは行
っていない。
実際ゲロニンの天然のチオール基を用いてゲロニンと抗
体をカップリングさせることはあまり行なわれていない
ので、チオール基は、酸化後、ガン研究（Cancer Re
s.），第44巻、129-133頁、1984年において説明された
技術を用いて人工的に導入した。pH6.5の30mMのりん酸
塩緩衝液中にＬ−ロイシンの52mg/ml溶液を溶かしたも
の1mlと、さらに過ヨウ素酸ナトリウム0.5M水溶液40μ
ｌを1ml当たり3mgのゲロニンを含むPBS緩衝溶液1mlに加
え、1M酢酸でpHを６にした。これを暗所で16時間４℃に
保った。反応は1Mエチレングリコール水溶液を210μｌ
加えて終結させた。これを20℃で４分間保温した後、反
応物を４℃でリン酸緩衝液中において透析した。30分間
10,000×ｇで遠心分離にかけると、ここから濃度2.5mg/
mlの酸化ゲロニン2.9mgが得られた。
リシンＡ鎖と同じように、ゲロニンの基本的特性はリボ
ソームの60Sサブユニットの分解によって真核細胞にお
けるタンパク質合成を阻害することである（バイオケミ
カルジャーナル，第207巻,505〜509頁,1982年）。ゲロ
ニンの場合にも過ヨウ素酸酸化による修飾は、活性の実
質的損失を生じさせないことがわかった。
Ｂ）ゲロニンにおける薬物動態学的特性の維持生の、或
いは上述の手続で修飾されたゲロニンをうさぎの耳の血
管から一回注射した。投与したゲロニンの量は0.3ない
し0.4mg/kgであった。ヘパリンの存在下で血液を時々採
取した。血漿は以下RIM-2と略称する放射線免疫試験を
用いて分析した。
この試験はRIM-1試験と同じ技術を用いる。ただしAc1溶
液が本例ではアフィニティークロマトグラフィーで精製
された抗ゲロニンウサギ抗体溶液である。Ac2抗体はRIM
-1試験と同じ抗体を放射性同位体で標識したものであ
る。同一標本中の生のゲロニンと修飾したゲロニンの濃
度をそれぞれ標本とは異った既知の濃度の検量線と比較
することによって決定した。放射標識の技術はRIM-1で
説明したものと同じである。RIM-2試験はRIM-1試験と同
等の信頼性と再現性を示した。本実験の結果は実施例２
でリシンのＡ鎖について示したのと同じ方法で示す。
生の及び修飾したゲロニンを静脈注射した場合の血漿中
濃度曲線を時間の関数として表わす曲線に示すように、
生のゲロニンは99.99％が24時間で消失し、生のリシン
Ａ鎖と同じように血中から非常に急速に消失することが
わかる。ゲロニンのポリサッカリド単位が変性されてい
る場合は曲線形が大きく違う。投与24時間後に変性した
ゲロニンの濃度は生のゲロニンの300倍ある。
従ってこれらの結果は、リシンＡ鎖において、過ヨウ素
酸ナトリウムによる酸化反応およびＬ−ロイシンに基づ
くシッフ塩基の形成によるブロッキング反応がゲロニン
の消失に原因する認識方法における糖をその認識を妨げ
る程度まで変性させることを示している。
これからの修飾免疫毒素はガン性又は非ガン性の病気で
あって、上記免疫毒素を製造するのに用いられた抗体に
より標的細胞が認識し得る場合に有効となる。投与条件
および時間についての最適条件は病気の種類に応じて適
宜決定し得る。この発明の新薬は注射用投与、特に静脈
投与に適している。
【図面の簡単な説明】
第１図ないし第２図は本発明の糖タンパク質の特性を示
す線図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ０７Ｋ 19/00 8318−4Ｈ (72)発明者 ザビエル・カナ フランス国、34680 サン−ジョルジュ− ドルケ、リュ・デ・カリナン ４

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】天然のGPIRと同様のリボソーム抑制活性
    と、より長い生体内持続性を有する化学的に修飾された
    GPIRであって、過剰の第１アミンの存在下でGPIRを過ヨ
    ウ素酸イオンで処理して得られたものであることを特徴
    とする修飾GPIR。
  2. 【請求項２】過ヨウ素酸イオンでの処理の間、GPIRのチ
    オール基の少なくとも一つが保護されていることを特徴
    とする特許請求の範囲第１項記載の修飾GPIR。
  3. 【請求項３】過ヨウ素酸イオンによる処理をpH5〜７の
    水溶液中で、温度０〜15℃、暗所で0.2〜24時間に渡っ
    て行うことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の修
    飾GPIR。
  4. 【請求項４】該水溶液が反応性Ａ−鎖を１〜10mg/ml、
    アルカリ性過ヨウ素酸塩を10〜50mM、第１アミンを50〜
    500mM含む特許請求の範囲第１項記載の修飾GPIR。
  5. 【請求項５】第１アミンがアルキルアミン、アミノ酸、
    水溶性ペプチドから選ばれる脂肪族アミンである特許請
    求の範囲第１項記載の修飾GPIR。
  6. 【請求項６】アミノ酸がグリシン、アラニン、バリン、
    ロイシン、イソロイシン、アルギニン、アスパラギン
    酸、グルタミン酸のラセミ体又は鏡像異性体から選ばれ
    るものである特許請求の範囲第５項記載の修飾GPIR。
  7. 【請求項７】天然GPIRと同様のリボソーム抑制活性と、
    より長い生体内持続性を有する化学的に修飾されたGPIR
    であって、過剰の第１アミンの存在下でGPIRを過ヨウ素
    酸イオンで処理して得られたものであることを特徴とす
    る修飾GPIRの製造方法であって、過剰のアルカリ性過ヨ
    ウ素酸塩と第１アミンをGPIRと水溶液中で反応させるこ
    とを特徴とする方法。
  8. 【請求項８】過ヨウ素酸イオンによる処理をpH5〜７の
    水溶液中で、温度０〜15℃、暗所で0.2〜24時間に亘っ
    て行うことを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の方
    法。
  9. 【請求項９】該水溶液が反応性Ａ−鎖を１〜10mg/ml、
    アルカリ性過ヨウ素酸塩を10〜50mM、第１アミンを50〜
    500mM含む特許請求の範囲第８項記載の方法。
  10. 【請求項１０】酸化反応に先立ち、GPIRをSH基を保護す
    る試薬で処理し、IO4 -イオンおよび第１アミンにより処
    理ののち、このSH基を解放することを特徴とする特許請
    求の範囲第７項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】SH基の保護試薬が2,2′−ジニトロ−5,
    5′−ジチオ−ジベンゾイン酸又は３−（２−ピリジル
    ジスルファニル）プロピオン酸であり、SH基の脱保護を
    ２−メルカプト−エタノールによっておこなうことを特
    徴とする特許請求の範囲第10項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】天然のGPIRと同様のリボソーム抑制活性
    と、より長い生体内持続性を有する化学的に修飾された
    GPIRであって、過剰の第１アミンの存在下でGPIRを過ヨ
    ウ素酸イオンで処理して得られたものであることを特徴
    とする修飾GPIRと、抗体又は抗体分画との結合により得
    られる生体中での持続性を有する免疫毒素。
  13. 【請求項１３】特許請求の範囲第12項に記載の免疫毒素
    であって、過ヨウ素酸イオンの処理の間、GPIRのチオー
    ル基の少なくとも一つが保護されていることを特徴とす
    る免疫毒素。
  14. 【請求項１４】特許請求の範囲第12項に記載の免疫毒素
    であって、過ヨウ素酸イオンによる処理をpH5〜７の水
    溶液中で、温度０〜15℃、暗所で0.2〜24時間に亘って
    行うことを特徴とする免疫毒素。
  15. 【請求項１５】特許請求の範囲第12項に記載の免疫毒素
    であって、該水溶液が反応性Ａ−鎖を１〜10mg/ml、ア
    ルカリ性過ヨウ素酸塩を10〜50mM、第１アミンを50〜50
    0mM含むことを特徴とする免疫毒素。
  16. 【請求項１６】特許請求の範囲第12項に記載の免疫毒素
    であって、第１アミンがアルキルアミン、アミノ酸、水
    溶性ペプチドから選ばれる脂肪族アミンであることを特
    徴とする免疫毒素。
  17. 【請求項１７】特許請求の範囲第16項に記載の免疫毒素
    であって、第１アミンがグリシン、アラニン、バリン、
    ロイシン、イソロイシン、アルギニン、アスパラギン
    酸、グルタミン酸のラセミ体又は鏡像異性体から選ばれ
    るものであることを特徴とする免疫毒素。
  18. 【請求項１８】上記結合がジスルフィド結合によって行
    われている特許請求の範囲第12項記載の免疫毒素。
  19. 【請求項１９】上記結合を１−エチル−３−（３−ジメ
    チルアミノプロピル）カルボジイミドによる活性化され
    た３−（２−ピリジルジスルファニル）プロピオン酸、
    又はＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチ
    オ）プロピオン酸塩から選ばれるヘテロ２官能性反応性
    剤を用いて行う特許請求の範囲第18項に記載の免疫毒
    素。
  20. 【請求項２０】天然のGPIRと同様のリボソーム抑制活性
    と、より長い生体内持続性を有する化学的に修飾された
    GPIRであって、過剰の第１アミンの存在下でGPIRを過ヨ
    ウ素酸イオンで処理して得られたものであることを特徴
    とする修飾GPIRと、抗体又は抗体分画との結合により得
    られる生体中での持続性を有する免疫毒素を有効成分と
    して含む抗ガン剤組成物。
  21. 【請求項２１】特許請求の範囲第18項記載の免疫毒素を
    有効成分として含む抗ガン剤組成物。
  22. 【請求項２２】特許請求の範囲第19項記載の免疫毒素を
    有効成分として含む抗ガン剤組成物。
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