JPH0780903B2 - 修飾糖タンパク質、当該修飾糖タンパク質の製造方法、当該修飾糖タンパク質を含む免疫毒素および当該免疫毒素を有効成分として含む抗ガン剤組成物 - Google Patents

修飾糖タンパク質、当該修飾糖タンパク質の製造方法、当該修飾糖タンパク質を含む免疫毒素および当該免疫毒素を有効成分として含む抗ガン剤組成物

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JPH0780903B2 JP61302888A JP30288886A JPH0780903B2 JP H0780903 B2 JPH0780903 B2 JP H0780903B2 JP 61302888 A JP61302888 A JP 61302888A JP 30288886 A JP30288886 A JP 30288886A JP H0780903 B2 JPH0780903 B2 JP H0780903B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、多糖単位が修飾された糖タンパク質（又はグ
リコペプチド）から誘導され、かつタンパク質の合成を
阻害するポリペプチド型の成分に共有結合した少くとも
一種の抗体を含有する薬効のある新しい分子に関する。
（従来の技術） 米国特許第4,340,535号並びにフランス国特許第2,504,0
10号及び同第2,516,794号は、包合体と呼ばれる抗ガン
生成物の製法を開示している。この生成物は、破壊され
る細胞についている抗原を標的とする抗体又は抗体断片
と、リシンのＡ鎖を共有結合によってカップリングする
ことにより得られる。この種の生成物は今まで免疫毒素
という包括的な名称によって称されてきたが、本発明に
おいても同様である。ところでリジンのＡ鎖を含有する
既に公知の免疫毒素に類似する包合体は知られている。
これは抗ガン剤として適しているが、特にゲロニウムマ
ルティフロルム（欧州生化学ジャーナル“1981年、第11
6号、447−454頁及び“ガン研究"1984年、第44号、129
−133頁）から抽出されたゲロニン、又はモモルジカカ
ランティス（MOM、米国特許第4,368,149号）から抽出さ
れた阻害剤のようなリボソームを不活性化する他のグリ
コペプチドと、抗体又は抗体断片を共有結合によってカ
ップリングさせることにより得られる。
上述のリボソーム（GPIRという略号を使う。）を不活性
にし、またリシンのＡ鎖と同じような性質を有する糖タ
ンパク質は20,000〜30,000の分子量を有する（“ガン・
サーベイ"1982年、第１巻、489−520頁）。
本明細書で用いる“リボソームを不活性化する糖タンパ
ク質”は、リボソームを不活性化し、その結果真核細胞
におけるタンパク質の合成を阻害する巨大な分子量の糖
類単位を有する物質を指す。その他にも同じ不活性化特
性を有するならば、その物質の何らかの断片でもよい。
リボソームを不活性化特性する前記糖タンパク質は天然
のものであるか、又は遺伝子型がこの目的のために修飾
された細胞から生合成によって誘導して得られる。
これら免疫毒素はアンモニウム塩、種々のアミンのよう
なアジュバント物質又はモネンジン若しくはナイジェリ
シンのようなある種のカルボキシルイオノフォアーなど
様々な物質によって強化される。
しかしながら免疫毒素の治療効果は、活性化されている
ものであってもそうでなくても、その免疫毒素がその抗
体部分を通して活性な形態で、破壊される標的細胞上に
生体内局在化することができるという条件（いかなる免
疫毒素活性の発現においても必須の条件）でのみ十分発
揮される。標的細胞上に局在化される免疫毒素の効力
は、まず第一に血流及び細胞外液にある免疫毒素が活性
な形態で一定の時間内に標的細胞に十分な濃度で到達
し、目的とする抗原を高い割合で捕捉する能力に依存す
る。
多くの研究によって免疫毒素が様々な動物の静脈内に注
射された場合の血漿からの消失キネティックスが確立さ
れた。その結果注射後には生物学的に活性な免疫毒素の
血漿中の濃度は急速に低下することがわかった。
ヒトのＴリンパ球の抗原T65を標的とするモノクロナル
抗体とリシンのＡ鎖をジスルフィド結合を含む連鎖でカ
ップリングさせて得られる免疫毒素についてウサギを使
ったモデルで調べたところ、注射直後に血流中に存在す
る免疫毒素は、30分後にはその97％が、17時間後にはそ
の99.9％が消失した。この免疫毒素の急速な消失によっ
てその細胞障害力は減じられる。というのは、免疫毒素
と破壊される細胞についた標的細胞との恒久的な結合が
妨げられるからである。さらに免疫毒素の血漿からの消
失キネティックスを対応する非包合抗体と比較してみた
ところ、この抗体は血漿中に相対的に長い時間高い濃度
で留まることがわかった。実際どんなに高度に免疫毒素
を精製しても、常に一定量の非包合体は残留する。免疫
毒素と非包合抗体の消失速度の違いから、最初はごく少
ない割合でしかない非包合抗体は、徐徐にその割合が増
え、数時間後には半数を超える割合になる。そのため抗
体は徐々に、免疫毒素が標的に結合する際の強力なアン
タゴニストになる。
従って血漿中の免疫毒素を高い割合で存続させることは
標的である抗原が結合される割合と持続時間を増加さ
せ、その結果免疫毒素の治療効果を増進することを意味
する。
リシンのＡ鎖を含有する免疫毒素の生体内局在化につい
て、免疫毒素を放射標識し、特定の標的をもたない動物
に注射して実験したところ、包合体は注射後数分で肝臓
に特異的に局在化した。同じ実験をカップリングしない
形態のリシンのＡ鎖について行ったところ、同様な結果
が得られた。これは免疫毒素に包まれる細胞毒性サブユ
ニットが肝臓と結合することを強く示唆する。
リシンのＡ鎖はそのポリオサン基が、マンノース残基と
Ｎ−アセチルグルコサミン残基からなる糖タンパク質で
ある。そしてそのうちのいくつかのマンノース基は、末
端に位置する（“農芸生物化学"1978年、第42巻、501
頁）。またこれら末端に位置するマンノース残基を含む
糖タンパク質を識別する受容体は肝臓内にあることが発
見された。これらの受容体（クッパー細胞中に存す
る。）はこれらを代謝する細胞と結合することによって
血液中から消失する。これに関してはβ−グルクロニダ
ーゼとリボヌクレアーゼＢの場合について詳しい報告が
ある（“生物化学と生物物理"1978年、188号、418頁、
“酵素学の進歩”マイスター編、ニューヨーク、1974年
および“小児科学研究"1977年、第11巻、816頁）。
これらを総合すると、リシンのＡ鎖を含有する免疫毒素
の急速な消失は、リシンのＡ鎖のマンノース残基が肝細
胞特にクッパー細胞によって認知されるためと説明でき
る。
動物の静脈内に注射した後の他のGPIR、例えばゲロニン
又はMOM、についての血漿からの消失キネティックスの
研究が進められた結果、リシンのＡ鎖についてはGPIRの
血漿中濃度は注射後急速に大部分消失することがわかっ
た。ウサギについて公知（“生化学ジャーナル"1980
年、255号、6947−6953頁）の方法によって精製したゲ
ロニンを注射したところ、注射直後に血流中に存在した
ゲロニンは、その１時間後には93％、24時間後には99.9
9％が消失した。
糖タンパク質に含有されるものを含む炭水化物構造の、
過ヨード酸塩による酸化は、２つの隣接する炭素原子は
第１又は第２ヒドロキシル基を有する場合には、炭素鎖
の分割を生ぜしめる。２つの隣接するヒドロキシル基が
第２ヒドロキシル基の場合には、GPIRに存在する場合の
ように、酸化は、その間に分割が生ずる炭素原子に２つ
のアルデヒド基を生成する。
アルデヒド基は第１アミン基に対し極めて活性でありシ
ッフ塩基として知られるイミンを形成する。したがっ
て、酸化反応の間、形成されるアルデヒド基は糖タンパ
クのペプチド鎖に付随する第１アミンと反応し、好まし
くない内部共有結合又は分子間共有結合を形成し、これ
により酸化生成物を不安定化し、しばしば不溶性ポリマ
ーの形成を生じさせる。
さらに、シッフ塩基の形成は過ヨウ素酸塩による酸化で
生じたアルデヒド基が安定な第１アルコールに急速還元
された場合に防止し得ることも知られている。この還元
は水素化ホウ素イオンの如き還元剤によっておこなうこ
とができる。この場合、水素化シアノホウ素イオンが特
に好ましい。なぜならば水素化シアノホウ素イオンが過
ヨウ素酸塩の酸化力を損失させることなく（その逆も同
じ）、過ヨウ素酸イオンおよび水素化シアノホウ素イオ
ンが共存し得るからである。
しかるに、GPIRの炭水化物単位が以下に述べる独特の方
法により変性されたとき、その生物学的活性を保持し、
かつ高等動物又は人間に注射したとき血流からの消失が
極めて緩慢であるという２重の特性を有する新しいGPIR
分子が得られることを意外にも見出した。この新しい変
性GPIRはリボソームを不活性化する性質を有するととも
に、その変性により生体中の作用の持続性にずぐれてい
る。この変性GPIRを以上GPIR−Laの記号で示す。
上述の独特の方法はGPIRのオシド単位を水素化シアノホ
ウ素イオンおよび過ヨウ素酸塩イオンで反応させるもの
である。この過ヨウ素酸塩で酸化されることによって生
じたアルデヒド基は水素化シアノホウ素イオンにより還
元されて安定な第１アルコール基となる。これによって
GPIRの他のアミノ基との好ましくない反応が回避され、
安定で完全に溶解し得る製品が得られる。
さらに、これらの新規な持続性糖タンパク質が抗体又は
抗体分画と結合したとき、得られた抱合体は免疫毒素の
公知の生物学的特性を保持し、血漿排出作用も遅いこと
が見出された。
本発明は従って、新規物質としての構造変性GPIRに係わ
るもので、その炭水化物単位がシアノボロヒドリドイオ
ンおよび過ヨウ素酸塩イオンの協同作用により化学的に
修飾されたものである。なお、このシアノボロヒドリド
イオンは過ヨウ素酸塩による酸化により生じたアルデヒ
ド基を安定な第１アルコール基に還元するものである。
さらに本発明は天然又は修飾された抗体又は抗体分画と
上記の独特の方法で修飾された炭化水素単位を有するGP
IR分子との共有結合により得られる免疫毒素に属する製
品に関する。
本明細書において、「過ヨウ素酸塩」なる語は過ヨウ素
酸塩の水溶液中のIO4 -イオン（特にアルカリ金属塩にお
ける）を示し、この語は「メタペリオデート」の名で文
献にも見出される。
“シアノボロヒドリド”とは水素化シアノホウ素の水溶
液に存在するCNBH-イオンを意味し、特にそのアルカリ
金属塩から得られる。
“抗体”とはすべての抗体又は抗体分画から選ばれるタ
ンパク、すべての免疫グロブリン、免疫グロブリン分
画、又はこれらからその官能基（オシド構造を含む）の
一つを人工的に修飾して得られるすべての分子であって
もよい。但し、この選ばれたタンパクが細胞（特にガン
細胞）表面上の抗原を選択的に認識し得るものでなけれ
ばならない。
出発抗体はポリクローン又はモノクローンのもの、ある
いは天然のもの、又は生合成によるものであってもよ
く、遺伝子型がこの目的に合うように変性された細胞か
ら得られるものが用いられる。
特定のヒト標的細胞に対して向けられたモノクローン抗
体の製造は文献上広く記載されており、その多くの抗体
は市場において入手し得る。
記号Ｐは、任意の抗体又は抗体フラグメント、任意の免
疫グロブリン又は免疫グロブリンフラグメント、又はそ
れらの官能基の修飾により上記のものから誘導された分
子からなる群から選択されたタンパクを意味し、このよ
うにして選択されたタンパクが、その抗原を有する細胞
特に標的細胞の表面において、与えられた抗原を選択的
に認識し得る限りにおいて、上記タンパクを有する炭水
化物構造を含む。出発タンパクは、天然のものでも、そ
のゼノタイプがこの目的のために修飾された細胞から誘
導された生物合成されたものでもよい。
記号GPIRはリボソームを不活性する糖タンパク又はその
分画を示す。この分画は発生源のGPIRの特性であるリボ
ソーム不活性化特性のすべて又は一部を保持する限り、
出発物質として使用し得るが、特に天然のGPIRが好まし
い。
“GPIR−la"は本発明で修飾されたGPIR、すなわち、GPI
Rの如くリボソームを不活性化する特性を有する分子で
あるが、生体中の作用がGPIRより大きいものであって、
過ヨウ素酸塩等の酸化剤およびシアノボロヒドリドの水
溶液でGPIRを水溶液中で処理したものである。
この操作（又は処理）は一般にpH5〜７、温度０〜15
℃、好ましくは暗所中でおこなわれ、反応は0.2〜24時
間必要とする。
免疫毒素において、GPIR−la部分は“細胞障害サブユニ
ット”として表わされる。
記号Ａ−laは、遅延作用を有し、リボソームを不活性化
する糖タンパク質を示すが、この糖タンパクは、そのシ
スティン171および257のチオール基の少なくとも１つが
任意に保護されているリシンのＡ鎖を過ヨード酸アルカ
リ金属およびシアノボロヒドリドの水溶液により光の不
存在下で０〜15℃で0.2〜24時間処理することにより、
また必要に応じて上記チオール基の脱保護により得られ
る。
記号Ｐ′は、上記タンパクＰ又はそれを化学的に変性し
たものから誘導されたラジカルを表わし、そこからそれ
自体の基の１つ又はそれ以上が除去され、また他の官能
基が任意に保護されているものである。
記号GPIR−la′は上記タンパクGPIR−la又はそれを化学
的に修飾したものから誘導されたものを表わし、そこか
らそれ自体の基の１つ以上が除去され、他の官能基が任
意に保護されているものである。
記号Ａ−la′は、そのシスティン171および257のチオー
ル基の少なくとも１つが除去された、タンパクＡ−laか
ら誘導されたラジカルを表わす。
記号P1は、上記タンパクGPIR−laおよびＰの１つを表わ
し、それは上記タンパクに直接又はスペース構造を介し
て結合された遊離チオール基を有する。
記号P2は、タンパクGPIR−laおよびＰのうちの一方であ
るがP1とは異なるものであり、遊離チオールと反応し得
る１種以上の官能基を有するものである。
記号P1′はタンパクP1に属する基に結合したタンパクP1
のラジカルを表わし、特に、（システィンの）SH基、
（タンパクの末端位置又はリシンのイプシロン位置にあ
る）NH2基、（チロシンの）OH基、又は（アルパルチン
酸又はグルタミン酸の）COOH基であり、又はP1が抗体又
は抗体フラグメントである場合にのみ、公知の方法によ
り過ヨード酸との反応により炭水化物構造の開始部から
発生するタンパクP1のラジカルである。
記号P2′は、特徴的官能基（タンパクの末端位置にある
か又はリシンのイプシロン位置にある）NH2、（チロシ
ンの）OH又は（アスパラチン酸およびグルタミン酸）の
COOHに結合されたタンパクP2のラジカルを表わす。
例えば、P1，−SHは（抗体又は抗体フラグメントＰ又は
タンパクGPIR−laであり得る）タンパクP1を表わすが、
このタンパクP1は、システィンのSH基が遊離しており、
他の官能基は任意に保護されているものである。
同様に、P1，−CO−は、その末端カルボキシル基又はそ
のグルタミン酸およびアスパラチン酸のカルボキシル基
が、SH基を導入する基と結合されているタンパクP1を表
わす。
P2，−NH−は（抗体又は抗体フラグメントＰ又はタンパ
クGPIR−laであり得る）タンパクP2を表わすが、このタ
ンパクP2は、その末端アミノ基又はそのリシンのアミノ
基がタンパクP1のチオールと連結し得る基に結合してい
るものである。
「不活性スペーシング構造」なる語は、このプロセスに
用いる反応体に対し不活性な２価の有機ラジカルを示
し、例えば１〜15の炭素原子を有する直鎖又は側鎖アル
キレン基であり、１つ以上の二重結合を含んでもよく、
また酸素原子によって中断されていてもよく、あるいは
またメトキシ基、遊離の又はエステル化されたカルボキ
シル基、ジアルキルアミン基又はカルバメート基のよう
な１種以上の不活性官能基によって置換されているもの
であってもよい。同じ語はまた、上でアルキレン基につ
いて示したように、１種以上の不活性官能基によって置
換され得る６〜15の炭素原子を有するアリレン基をも示
す。
ここでＹおよびＹ′に関して用いられている「共有結合
し得る官能基」という表現は、共有結合を形成するため
にタンパクP1およびP2に属する基と反応し得るいかなる
基をも意味する。−CO−基および−（Ｃ＝NH）−基は、
タンパクの遊離アミン、チオールおよびフェノール性水
酸基と結合し得る適当な官能基である。同様に、−NH−
基もタンパクの遊離カルボキシル基と結合し得る適当な
官能基である。−Ｎ−基は過ヨウ素酸イオンによる酸化
のあとにタンパクP1およびP2の糖鎖の２つの炭素原子と
結合し得る適当な官能基である。ただしそれは、P1およ
びP2が抗体または抗体断片である場合に限る。
ここでＺ及びＺ′として示されている「蛋白質に属する
基」なる表現は、蛋白質P1及びP2を形成するアミノ酸の
特有な基から作られたラジカルを示す。例示すれば、チ
ロシンやセリンアミノ酸の水酸基から生ずる酸素原子、
アスパラギン酸やグルタミン酸の末端カルボキシルや遊
離カルボキシルから生じたカルボキシル基、蛋白質の末
端アミンから生じた−NH−基（例えばリジン）あるいは
システィンのチオールから生じた硫黄原子がある。同様
に、この表現は、過ヨウ素酸イオンの処理により、蛋白
質P1及びP2の炭水化物構造の一つを酸化した後得られる
ジアルデヒド構造から生じた基を示す。しかし、この場
合、P1及びP2は抗体断片である。
ここでＸで示される「活性ラジカル」なる用語は−Ｓ−
Ｓ−ブリッジに結合された基を示し、これは遊離チオー
ルと反応してＸ−SHを解放した二硫化物を形成する。適
切な活性ラジカルはピリジン−２−イル及びピリジン−
４−イル基で、これらは置換されていないもの、あるい
は１又は２以上のハロゲン又はアルキル基、カルボキシ
ル基、アルコキシカルボニル基によって置換されたもの
である。フェニル基は置換されていないもの又は好まし
くは１又は２以上のハロゲン基又はニトロ基、アルコキ
シル基、カルボキシル基又はアルコキシルカルボニル基
によって置換されたものである。
「アルキル」及び「アルコキシ」という用語は、５炭素
原子以下を含む基を示す。
「アルキレン」なる用語は、炭素原子10以下を含む直鎖
又は分枝した飽和脂肪族基を示す。これらは１又は２以
上の不活性官能基（例えばアルコキシカルボニル基）に
よって置換されたものでもよい。
リボソームを不活性化し、過ヨウ素酸塩イオンで酸化す
るため、および還元するために好ましい出発物質として
用いられる糖タンパクはすべてGPIRであり、たとえばリ
シンＡ鎖はそれ自体、細胞に固着しないために細胞毒性
はほとんどないが、特定の細胞を認識し得る抗体と結合
したのちは、抗体が標的を認識するやいなやその細胞に
対して大きい細胞毒性を示すことになる。
代表的な出発化合物は、リシンのＡ鎖、ゲローニン及び
モモルディカカランティス（MOM）からの抽出操作によ
り得られた抽出物質である。
過ヨウ素酸イオンとの酸化に用いる出発物質として有用
な他のGPIR類は、以下の通りである。
ディアンチン30（Dianthin 30） ディアントゥスカリョフィルス（Dianthus Caryophyllu
s）から ディアンチン32（Dianthin 32） ディアントゥスカリョフィルス（Dianthus Caryophyllu
s）から アグロスティンＡ（Agrostin A） アグロステーマジターゴ（Agrostemmagithago）から アグロスティンＢ（Agrostin B） アグロステーマジターゴ（Agrostemmagithago）から アグロスティンＣ（Agrostin C） アグロステーマジターゴ（Agrostemmagithago）から HCI フラクレピタンス（Hura crepitans）から アスパラグスオフィチナリス阻害剤 アスパラグスオフィチナリス（Asparagusofficinalis）
から この目的のために遺伝子型を修飾した細胞で生合成的に
生産された同じ物質も、また適当な化合物である。
上記GPIR類のフラグメントは、もしそれらが元のGPIRを
特徴付ける不活性リボソームの全部または一部の性質を
保持しているとするならば、同様に出発物質として用い
ることができる。
リシンの天然のＡ鎖のうち、チオール基の少なくとも一
つが保護されているものは好ましい出発物質である。
リシンの純粋のＡ鎖の製造については、米国特許第4340
535号に記載されている。ゲローニン及びMOMについても
記載されている。
出発物質におけるチオール基の保護は、そのチオール基
が抗体との結合に用いられるものである場合にのみ必要
とされる。例えばチロシンのフェノール性水酸基のよう
な他の感応基が結合に用いられる場合には、前記の保護
は行なわれない。
保護のためのブロッキングは、SH基を、引続いて還元反
応またはチオール／ジスルフィド変換反応で除去できる
ような官能基で置換することができるような試薬、例え
ば2,2−ジニトロ−5,5−ジベンゾジ安息香酸（DTNB）、
或いは３−（ピリジン−２−イル−ジスルファニル）プ
ロピオン酸等との反応によって行なわれる。このような
試薬が存在しない条件下では、Ａ鎖中の遊離チオール基
は酸化反応中に消失してしまい、たとえ２−メルカプト
エタノールのような還元剤との反応によっても全体的に
再生することはできない。過剰のブロック剤は透析、そ
の他の処理により除去する。
チオール基がブロッキングされたGPIRはついで過ヨウ素
酸塩イオンにより酸化反応およびシアノボロヒドリドイ
オンによるアルデヒド基の還元（その結果、第１アルコ
ールが形成される）がなされる。過ヨウ素酸による酸化
反応および上記還元反応はやや酸性のpH5〜７、好まし
くは６〜6.5の酸性下で実施される。過ヨウ素酸塩の添
加前にシアノボロヒドリドと混合する。過ヨウ素酸塩は
過剰に用いる。より望ましくは、過ヨウ素酸アルカリ金
属塩の濃度が、酸化さるべきビシナルジオールの濃度よ
りも高くなるようにする。例えば、細胞毒サブユニット
濃度１〜10mg/mlに対し、過ヨウ素酸ナトリウム濃度は1
0〜50mMが適している。シアノボロヒドリドも酸化され
得るビシナルジオールの濃度より大きい濃度で用いるこ
とができる。すなわち、細胞毒サブユニット濃度１〜10
mg/mlに対し第１アミン50〜500mMの濃度である。処理は
０〜15℃、好ましくは１〜５℃の暗所において、0.2〜2
4時間好ましくは４〜20時間おこなう。
反応終了後、過剰の過ヨウ素酸塩を消費する試薬、例え
ば過剰のエチレングリコールの添加によって除去し、副
生成物を透析により除去する。反応終了時に得られた生
成物は、通常の手法により単離する。
もし出発物質のチオール基がブロッキングされていれ
ば、公知の方法でブロッキングを解除する。例えば２−
メルカプリエタノールのように、ブロッキングされる前
のチオール基を遊離させ得る還元剤と反応させればよ
い。これにより、リボソームを不活性化する糖蛋白に新
規な持続作用が与えられ、これは抗体と結合して免疫毒
素を得るために用いることができる。
リシンのＡ鎖の場合、この方法で得られる新しい分子
（以下記号Ａ−laで表わす）は、次の主要な性質を有し
ている。
分子量は、天然のＡ鎖の分子量とそれほど変らない。
ポリアクリルアミドによる電気泳動で観察する限り、こ
の修飾反応は極く少量の蛋白質の重合体を生成するだけ
で、分解生成物は何等生じない。
遊離チオール基の比率は、0.7/molよりも大きい。
リシンのＡ鎖を基準とした兎抗体に対する免疫反応特
性は、天然のＡ鎖のそれと区別できない。
無細胞系における蛋白合成の阻害活性は、等量の天然
Ａ鎖で生じるものの50％より大きい。
最後に、兎に約0.4mg/kg体重の投与量で一回静脈注射
した後、静注後24時間での血流中における長期作用型Ａ
鎖（Ａ−１）の血漿レベルは、同一条件で測定した天然
Ａ−鎖の血漿レベルより100〜300倍大きい。
上述の如くして得られたGPIRは公知の方法により抱合体
又は免疫毒素を製造するのに用いられる。
すなわち、免疫毒素（以下、ITと呼ぶ）を、抗体又は抗
体分画（天然又は正しく変性されたもので、所定の標的
細胞に運ばれた抗原を選択的に認識する能力を有するも
の）と、リボソームを不活性化する持続性糖タンパクGP
IR（GPIR−la）とを共有結合させることにより得ること
ができる。２つのタンパクの結合はジスルフィド結合、
又はチオエーテル結合を介しておこなわれる。
抗体Ｐを長期活性グリコプロティン（これはリボソー
ム、GPIR−laを不活性とする）と結合させて形成された
イムノトキシンは、次の統計的な式で示される。
Ｐ′−Ｗ−GPIR−la′ （Ｉ） ここでＰ′は蛋白質の基を示し、この蛋白質は抗体又は
抗体断片Ｐであり、あるいはこれらを適宜化学的に修正
したものである。また他の官能基は必要によりブロック
されており、GPIR−la′はGPIR−laやこれを適宜化学的
に修正した蛋白質のラジカルを示す。他の官能基は必要
によりブロックされ、Ｗはチオエチル基又は二硫化基を
含む２価の共有構造で、これらの基では硫黄原子はＰ及
びGPIR−laのシスティンのそれであり、あるいはＰ及び
／又はGPIR−laに属する上記基に結合して官能基を持た
せた空間（spacing）構造によって、Ｐ及び／又はGPIR
−laに属する基に結合している。
２つの蛋白質間のチオエーテル結合は、以下のタイプの
結合として理解される。
ここでZ,Y及びＥは以下に定義される。
この発明は、好ましくは下記の統計的な式で示すイムノ
トキシンに関する。
Ｐ′−Ｗ′−GPIR−la′ （II） ここで、Ｐ′及びGPIR−la′は、先に定義した通りであ
る。Ｗ′は以下（ａ）〜（ｄ）から選ばれた共有構造で
ある。
（ｃ）−Ｚ−Ｙ−Ｅ−Ｓ−Ｓ−（Ｅ′−Ｙ′−Ｚ′）ｎ
− （ｄ）−（Ｚ′−Ｙ′−Ｅ′）ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｅ−Ｙ−Ｚ
− これらの式で、Ｚ及びＺ′（同じ又は異なるもの）は、
蛋白質GPIR−la及びＰに属する基を示し、チロシン残滓
（reaidues）の一つのヒドロキシルから生じる酸素原
子、GPIR−la及びＰのアスパラギン酸及び／又はクリタ
ミン酸の末端カルボキシル又は遊離カルボキシルの１つ
から生じるカルボキシル基、GPIR−la及びＰの末端アミ
ンの１つ又はリジン残滓の１つのエプシロン位置のアミ
ンの１つから生じる−NH−基から選ばれるものであり、
更に上記共有構造（ｂ）及び（ｃ）中のＺについての
み、公知の方法でＰの炭水化物構造の一つを過ヨウ素酸
で酸化させた後得られるジアルデヒド構造から生じる基
である。
Ｙ及びＹ′は、蛋白質GPIR−la及びＰのＺ及びＺ′基の
任意の一つと共有結合可能な官能基を示す。
Ｅ及びＥ′は不活性空間構造を示し、ｎは０又は１であ
る。
イムノトキシンは上述の式Ｉ及びIIによって簡単に表現
できる。しかし、複数の構造−Ｗ−又は−Ｗ′がGPIR−
laの１つの同じ分子Ｐに結合される。したがって、GPIR
−laが単一のＰに結合されたり、又はその道となる。こ
のブリッジの数は結合方法およびＰないしGPIR−laに属
する基の数に依存し、統計的な式（Ｉ），（II）が下記
式からなるこれらの製品およびその混合物を表わす。
Ｐ′（Ｗ′−GPIR−la′）ｍ （ここで、ｍは整数又は１以上、１以下の混合数を示
す） 例えば、リシン自体のサブユニットＡを抗体Ｐ（例えば
抗体T101）に結合してイムノトキシンを形成する際、２
硫化基を持つ２価の共有構造を経て行なう場合（ここで
２硫化基の一方の硫黄はリシンの長期活性Ａ鎖のシステ
ィン257に属し、他方の硫黄はオキシプロピル基によっ
て抗体Ｐのチロシンのフェノール酸素と結合してい
る。）、下記統計的な式を有する。
Ｐ′（Ｏ−CO−CH2−CH2−Ｓ−Ｓ−Ａ−la）ｔ ここでｔは結合中に含まれる抗体（例えば抗体T101）中
のチロシンの数を示す。
得られたイムノトキシンは、式IIの生産物に対応してい
る。この式中、 Ｐ′は上述した通りであるが、とくに結合中に含まれて
いるチロシンのフェノール基を除去した抗体T101のラジ
カルである。
Ａ−la′はシスティン257のチオール基を除去したリシ
ンの長期活性Ａ鎖のラジカルである。
Ｗは下記の（ｃ）基である。
−Ｚ−Ｙ−Ｅ−Ｓ−Ｓ−（Ｅ′−Ｙ′−Ｚ′）ｎ− ここでＺは結合中に含まれるフェノールハイドロキシル
の酸素であり、Ｙは−CO−,Eは不活性空間構造−CH2−C
H2−,nは０である。
特に好適なイムノトキシンはリシンの長期活性サブユニ
ットＡと単一抗体Ｐとを含む１又は２以上の構造物によ
って形式されたもので、下式で示される。
Ｐ′（Ｗ′−Ａ−la′）ｍ （III） ここでＰ′,W′及びＡ−la′は上述した通りである。ｍ
は結合中に含まれる蛋白質Ｐに属する基の数を示す。ｍ
の数は0.3〜12、好ましくは0.5〜10の範囲で変化する。
「ｍの数は0.3〜12、好ましくは0.5〜10の範囲で変化す
る。」とは、ｍの値は統計的な値であるということであ
る。なぜなら、抗体分子の中では結合は均一には生じな
いためである。従ってｍは整数ではない。
ｍの値はとくに使用される抗体により、更には抗体の分
子量による。
従って断片Fab又はFab′を最初の抗体Ｐとして使用する
と、ｍの値は0.3と約２の間で変化する。断片Ｆ（a
b′）２を使用すると、ｍは0.5と約４の間で変化する。
IgGのタイプの抗体では、ｍは0.5と約６との間で変化す
る。抗体IgMではｍは１と約12の間で変化する。
しかし、好ましくは抗体Ｐの置換の程度は、ｍが0.5以
上であり、10を越えないのがよい。
一般に、上述の構造式Ｉ及びIIは、簡略式に記載された
一般式を示す。
同様に以下の式IV,V及びIXはｎが１のときはいつも統計
的な式である。なぜなら結合反応体は蛋白質P1及びP2中
から選択され、これらの蛋白質は全て抗体Ｐとして上述
の如く考慮されるものとしてまったく同じ性質を有して
いる。この場合蛋白質P1及びP2は抗体Ｐ又は蛋白質GPIR
−la自体であることを問わない。
この発明の他の態様としては抗体と、リボソーム不活性
化糖タンパクとの間にジスルフィド又はチオエーテル型
の共有結合を有する長期作用型免疫毒素の製造方法であ
って、糖タンパク（そのチオール基を適宜保護して）を
水素化シアノホウ素の存在下で過ヨウ素酸アルカリ金属
塩の水溶液で０〜15℃で、光の不存在下で0.2〜24時間
処理して得るようにしたことを特徴とする方法を提供す
る。
本発明の好ましい態様は上記構造Ｉの免疫毒素の製造方
法であって、タンパクP1（リボソーム不活性化長期作用
型糖タンパク、GPIR−la又は抗体もしくは抗体断片であ
って、遊離チオール基が直接又は介在原子団を介して結
合したもの）を水溶液中、室温でタンパクP2（P1と異な
り、リボソーム不活性化長期作用型糖タンパク、GPIR−
la又は抗体もしくは抗体断片であってタンパクP1の遊離
チオール基と結合し得る基を有するもの）と反応させ、
チオエーテル又はジスルフィド結合を形成させることを
特徴とする方法を提供するものである。
本発明の特に好ましい態様は上記構造IIの免疫毒素の製
造法であって、Ｐ′,W′およびGPIR−la′が上記定義の
ものからなるもので、下記一般式のタンパク、すなわち
一般式、 P1′−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）ｎSH （IV） のタンパクを一般式、 P2′−Ｚ′−Ｙ′−Ｅ′−Ｇ （Ｖ） のタンパクと反応させることを特徴とする免疫毒素の製
造方法、 （ただし、式中P1′およびP2′はこれらタンパクに属す
る基に結合されたタンパクP1およびP2のラジカル、又は
P1およびP2が抗体もしくは抗体断片であるときは過ヨウ
素酸との反応により糖鎖核の開鎖により生じたタンパク
P1およびP2のラジカル、Z,Z′,Y,Y′,E,E′は前記同
様、Ｇは （ただし、Ｘは活性化基）である） を提供するものである。
したがって上記ＰおよびGPIR−laは下記の基を適宜含む
タンパクである、 （１）結合に関与するチオール基又はその他の基、 （２）上記チオール基と反応しジスルフィド又はチオエ
ステル結合を形成し得る１以上の官能基。
本発明によれば上記チオール基および官能基は天然のタ
ンパクＰ又はGPIR−la、又はこれらを人工的に導入した
ものである。
出発物質におけるチオール基の保護は、そのチオール基
が抗体との結合に用いられるものである場合にのみ必要
とされる。例えばチロシンのフェノール性水酸基のよう
な他の感応基が結合に用いられる場合には、前記の保護
は行なわれない。
保護のためのブロッキングは、SH基を、引続いて還元反
応またはチオール／ジスルフィド変換反応で除去できる
ような官能基で置換することができるような試薬、例え
ば2,2−ジニトロ−5,5−ジベンゾジ安息香酸（DTNB）、
或いは３−（ピリジン−２−イル−ジスルファニル）プ
ロピオン酸等との反応によって行なわれる。このような
試薬が存在しない条件下では、Ａ鎖中の遊離チオール基
は酸化反応および還元反応中に消失してしまい、たとえ
２−メルカプトエタノールのような還元剤との反応によ
っても全体的に再生することはできない。過剰のブロッ
ク剤は透析により除去する。
チオール基がブロッキングされ、リボソームを不活性に
する糖タンパクはついで過ヨウ素酸塩イオンで酸化さ
れ、ついで還元される。もし、細胞毒サブユニットがチ
オール基を含まない場合は、又はチオールが結合のため
に使われないならば上記のブロッキングはおこなわれな
い。
リボソームを不活性化する長期作用型糖蛋白から抱合
体、即ち免疫毒素を調製するには、米国特許第4340535
号に記載されている方法のなかから適当に選択した方法
を用いればよい。もし、選択した細胞毒サブユニット
が、結合に適した少なくとも一つのチオール基を天然に
含んでいるならば、この基は活性化されたジスルフィド
基をもった抗体または抗体フラグメントとの反応に好適
に用いられる。もし、選択した細胞毒サブユニットが、
結合に適したチオール基を天然には含んでいないなら
ば、過ヨウ素酸イオンとの酸化処理の後、遊離チオール
をもった少なくとも一つの官能基を公知の何等かの方法
で人為的に前記サブユニットに導入し、上記の結合反応
を続行する。
前記官能基の導入は、過ヨウ素酸イオンとの酸化処理又
は還元の前におこなわれる。その場合、酸化および還元
の間、チオール基をブロックしておき、そののちにブロ
ックを解除する必要がある。
本発明の方法において、GPIR−laと抗体（または抗体フ
ラグメント）との化学的な結合は、結合体の二つの成分
（抗体およびGPIR−la）の夫々の生物学的活性を保持
し、満足すべき再現性および良好な収率で結合体が得ら
れ、また得られた結合体中におけるGPIR−la/抗体の比
率制御を可能とすると共に、更には安定且つ水溶性の生
成物に導くような方法で行なうことができる。
これらの特徴に対応した方法の中で、二つの蛋白の間の
結合形成において、１または２以上のチオール基を含む
ものを優先すべきである。事実、これらのチオール基
は、ジスルフィド結合またはチオエーテル結合の形成に
特に適し、両者共に上記の一般的条件を満たす。
同時に免疫毒素の調製についても以下の特徴を有してい
る。
リシンのＡ鎖と抗体との間の共有結合は、ジスルフィ
ド基を含んでいる。
ジスルフィド結合を形成している硫黄原子の一つは、
常に、リシンＡ鎖の257位置にでのシスティン残基に属
する硫黄原子である。
また、リシンのＡ鎖を抗体に結合するリンクは、抗体
のNH2側基またはペプチド鎖の末端基に結合しており、
抗体とリシンＡ鎖とのカップリングにより形成される。
これらについては、米国特許第4340535号に詳細に記載
されている。同じ方法が、同様の特徴を有し、且つ抗体
または抗体フラグメントとGPIR−laとの結合で形成され
る免疫毒素類の調製にも適用できる。
抗体または抗体フラグメントとGPIR−laとの結合、及び
異なった官能基におけるジスルフィドまたはチオエーテ
ル型の共有結合により形成される免疫毒素類の調製につ
いて、以下に詳細に説明する。
一般的に、特に交叉結合の乱れを排除して蛋白間にうま
く結合反応を行なうためには、安定で且つ明確に定まっ
た共有結合が形成されるように、結合さるべき一方の蛋
白（一方のみ）は使用されるチオールまたはチオール基
だけを有し、他方の蛋白はpH5〜９、30℃を越えない温
度の水性媒質中においてチオール類と反応し得る１また
は２以上の基のみを有することが重要である。
以下に詳細に説明するように、蛋白P1およびP2の特徴は
出発物質として用いられる。Ｅの立体構造は、より好ま
しい構造Ｒ〜RB（これは実施例としてのみ与えられる）
に置代えることができる。
I.タンパクP1 このタンパクは、どんな場合も結合に関与する１つか１
つ以上のチオール基を有しているので、生じる状況はタ
ンパクP1の性質に応じて異なる。
（Ａ）天然の状態でタンパクP1は、タンパクP2との結合
に関与する１つ以上のチオール基を有している。このこ
とは特に次のような場合に言える。すすなわち、タンパ
クP1が、ペプシンの存在下で抗体を限定分解し、続いて
高分子間のジスルフィド結合を還元して通常得られるよ
うなＦ（ab）′として知られる抗体断片である場合であ
る。このことは、タンパクP1がリシンのＡ鎖またはＡ鎖
の誘導体である場合にもあてはまる。この場合、天然リ
シンの171番目のシステイン残基および257番目のシステ
イン残基に付いている少なくとも１つのチオール基が未
結合であって化学結合を生じやすい。これらすべての場
合において、天然のチオール基を有するタンパクP1はこ
のような状態で結合工程に使用される。
（Ｂ）天然の状態でタンパクP1は、タンパクP2との結合
に関与するチオール基を有していない。このことは特に
次のような場合に言える。すなわち、タンパクP1が天然
の免疫グロブリンであって、抗体全体が抗体の断片特に
通常Ｆ（ab）′またはＦ（ab）と呼ばれる断片の１つで
ある場合。天然の状態でタンパクP1が結合に関与する１
つのチオール基を持たない場合のいま１つの例は、この
タンパクP1が、２つのシステイン残基それぞれがアルキ
ル化により保護されているか、または化学修飾を受けな
いリシンのＡ鎖である場合である。全ての場合におい
て、結合を可能にする１つ以上のチオール基をそのよう
な分子に導入することが妥当といえる。
３つの型の反応がチオール基を導入するために好ましく
用いられる。
（１）最初の型の反応は、Ｓ−アセチルメルカプトコハ
ク酸無水物との反応である。この酸無水物は、タンパク
のアミノ基のアセチル化を可能にする。その後当該チオ
ール基をヒドロキシアミンと反応させることによってア
セチル保護基を除くことができる。この方法はすでにア
ーチーブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイ
オフィジクス（Archives of Biochemistry and Biophys
ics）、119,41−49（1967）に記載されている。このよ
うに保護基が導入されたチオール基を続いて活性型ジス
ルフィド基と反応させる場合、ヒドロキシアミンによっ
て前もって保護基をはずさなくて済む可能性がある。事
実、この発明の物質を形成する反応体を使ってジスルフ
ィド結合を形成する反応は、遊離チオール基を使った場
合と同様にＳ−アセチル基を使っても生じる。
文献に記載されている他の方法も、修飾されるタンパク
にチオール基を導入するために使うことができる。
（２）第２の型の反応はタンパクをカルボキシル基を介
して以下に示すジスルフィド構造を有する対称的なジア
ミノ分子と反応させることである。
H2N−R1−Ｓ−Ｓ−R1−NH2 上式中、R1は炭素数２から５の脂肪族原子団である。こ
の反応では、カルボジイミド特に１−エチル−３ジメチ
ルアミノプロピル−３−カルボジイミドのような水溶性
の誘導体の如きカップリング剤の存在下でシスタミン
〔R1＝-(CH2)2-〕と反応させ、用いた化学量論量に応じ
て次に示す誘導体の１つか双方の混合物を形成させるこ
とが好ましい。
R1′−CO−NH−R1−Ｓ−Ｓ−R1−NH2 （Ia） R1′−CO−NH−R1−Ｓ−Ｓ−R1−NH−CO−P1′ （Ib） この型の反応生成物は次の２つの工程のいずれかに供さ
れる。
（ａ）式IaまたはIbにおいて、タンパクP1がリシンのＡ
鎖またはその誘導体の１種ならば、得られた反応溶液は
分別せずに２−メルカプトエタノールのような還元剤と
の反応に供せられる。それらによって次式の１種類のタ
ンパク誘導体が得られる。
P1′−CONH−R1−SH こうして得られた生成物は続いて透析かゲル濾過により
精製される。
（ｂ）式IaおよびIbにおいて、ラジカルP1′が抗体また
はその断片の１種から成る、タンパクＰのラジカルなら
ば、得られた反応溶液はそのままカップリングに用いら
れ、その場合チオール／ジスルフィド交換法が用いられ
る。この交換法は、例えばギリランド（Gilliland）と
コリエール（Collier）によってキャンサー・リサーチ
（Cancer Reserch）,40,3564（1980）に記載されてい
る。
（３）第３の反応は、導入しようとするチオールを有す
るラジカルを固定するために糖鎖単位を使うことであ
る。この糖鎖単位は天然の状態で抗体に存在しているも
のである。続いてタンパクは、糖鎖単位にアルデヒド基
を生じさせるために過ヨウ素酸で酸化される。過剰のエ
チレングリコールを加えて反応を停止させ、副産物と過
剰の反応体を透析により除いた後、得られた生成物を次
の一般式を有対称なジアミノ分子で処理する。
H2N−R1−Ｓ−Ｓ−R1−NH2 上式中R1は炭素数２ないし５の脂肪族量である。得られ
た付加生成物は、続いて金属水素化物（特には、水素化
ホウ素ナトリウム）との反応により第２または第３アミ
ンに還元される。この反応は水素化ホウ素ナトリウムを
用いて実施することが好ましく、用いた化学量論量に応
じて次式の誘導体の１方かその両方の混合物が形成され
る。
得られた反応液を、IaまたはIbの構造式で表わされる生
成物であってP1′が抗体または抗体断片であるものに関
して上記したとおりの処理を行なってもよい。
チオール基を人工的に導入（対称なジアミノジスルフィ
ド反応体を使うタイプ）するための上に述べた後二者の
反応において、タンパクP1は遊離SH基または遊離アミノ
基を持たないことが好ましい。
GPIR−laの場合には、Ｎ−エチルマレイミドまたはヨー
ド酢酸のようなチオール基に対する通常の試薬との反応
により天然のSH基をアルキル化し、およびミィーンズ
（MEANS）およびフィーニー（FEENEY）によってバイオ
ケミストリー（Biochemstry）7,2192（1968）に記載さ
れた還元的メチル化法に従って天然のNH2基をメチル化
することにより常に遊離のチオール基を持たなくさせ得
る。このようにして天然リシンのＡ鎖に１モル当り６個
までのメチル基を導入することができる。このようにし
て修飾されたタンパクには、生物学的な特性（特には、
真核細胞のリボソームにおけるタンパク合成を阻害する
能力）が備わっている。抗体または抗体断片さらに第１
群のすべての物質の場合には、前記したようにそれらは
天然の遊離SH基を持たないので、還元的メチル化を例え
ばミーンズおよびフィーニーの方法により実施するほう
がよい。このようにして通常抗体１モル当り数十のメチ
ル基を導入することができる。その場合抗体の細胞表面
上の抗原を認識する能力を変化させない。
II タンパクP2 あらゆる場合、このタンパクは、タンパクP1のチオール
基と反応してジスルフィドまたはチオエーテル結合を形
成し得る１つ以上の官能基を有するタンパクである。こ
れらの官能基は、常にタンパクP2に人工的に導入される
が、それがジスルフィド結合によりカップリングされる
のかチオエーテル結合によりカップリングされるのかに
応じて異なっている。具体的には以下に記載する。
（１）ジスルフィド結合 この場合、包合体の調製は以下の式で表わされる。
P1′−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）ｎ−SH＋P2′−Ｚ′−Ｙ′−Ｅ′
−Ｓ−Ｓ−Ｘ→ R1′−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｅ′−Ｙ′−Ｚ′−
P2′＋Ｘ−SH. 活性イオウ原子により置換されるタンパクP2はタンパク
P2または適切に保護されたタンパクP2からそれ自体活性
イオウ原子を有する試薬による置換により得られる。こ
れは次の式で示される。
P2＋Ｌ−Ｙ′−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｘ→P2′−Ｚ′−Ｙ′−
Ｒ′−Ｓ−Ｓ−Ｘ 上式中、P2は置換されるべきタンパクを示し、Ｌ−Ｙ′
は試薬をタンパクに共有結合させる基を示す。官能基Ｌ
−Ｙ′は、置換されるべきタンパクの構成アミノ酸の側
鎖に付いているいずれかの１つの基と共有結合し得る基
である。これらの基の中で、特に次のものが選び出せ
る。
（ａ）ペプチド鎖の末端アミノ基またはタンパクに含ま
れるリシン残基のアミノ基。この場合、Ｌ−Ｙ′は特に
次のように表わせる。
・カルボジイミド、特に１−エチル−３−ジメチルアミ
ノプロピル−３−カルボジイミド、３−（２−ピリディ
ルジスルファニル）プロピオン酸（上記カルボジイミド
活性化された）の如き水溶性誘導体のようなカップリン
グ剤の存在下でタンパクのアミノ基と結合し得るカルボ
キシル基。
・アミノ基と直接反応して、それをアシル化し得るカル
ボン酸塩化物。
・オルト−またはパラ−ニトロフェニルまたは−ジニト
ロフェニルエステル、またはＮ−ヒドロキシコハク酸イ
ミドエステル（たとえばＮ−スクシンイミディル−３−
（２−プリディル−ジチオ）プロピオネート）のような
いわゆる「活性型」エステル。これはアミノ基と直接反
応して、それをアシル化し得る。
・コハク酸無水物のようなジカルボン酸の内部無水物。
これはアミノ基と自然に反応して、アミド結合を形成さ
せる。または ・イミドエステル基 上式中、R2はアルキル基で、次式のようにタンパクP2の
アミノ基と反応する。
上式中、R3は−Ｒ−Ｓ−SX基を示す。
（ｂ）タンパクに含まれるチロシン残基のフェノール
基。この場合、Ｌ−Ｙ′は特にイミダゾール−１−イル
カルボニル基を示すことがある。それは次の式に従って
タンパクのフェノール基と反応する。
上式中、Ｌがイミダゾール−１−イルで、Ｙ′がCO基
で、R4が−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｘ基である。−Ｓ−Ｓ−Ｘは遊
離チオール基と反応し得る活性型ジスルフィドを示す。
特に、このジスルフィドにおいて、Ｘは１つ以上のアル
キル、ハロゲンまたはカルボキシ基で置換されているこ
とのあるピリジン−２−イルまたはピリジン−４−イル
基を指すことがある。Ｘもまた１つ以上のフェニル基ま
たはカルボキシル基で好ましくは置換されているフェノ
ール基を指すことがある。またはＸはメトキシカルボニ
ル基のようなアルコキシカルボニル基を指すこともあ
る。
Ｒ基は、置換基Ｙ′およびＳ−Ｓ−Ｘを同時に結合し得
る介在分子（前式中のＥのような）を示す。それは、後
の反応において、使用される反応物質と合成される生成
物を妨害するような基を含まないようなものでなければ
ならない。特に、Ｒ基は−（CH2）−でもあり得（ｎは
１ないし10）、また次の基でもあり得る。
上式中、R6は水素または炭素数１ないし８のアルキル基
を指し、R5は続いて使われる次式のカルカルバメイト基
のような反応体に不活性な置換基を指す。
上式中、R7は炭素数１から５の直鎖または分枝アルキル
基、特に第３ブチル基を示す。化合物Ｌ−Ｙ′−Ｒ−Ｓ
−Ｓ−ＸとタンパクP2との反応は均質な液相、最も一般
的には水または緩衝液中で進行する。反応体の溶解性を
高めるためには、水に可溶性の有機溶媒を反応溶液に加
えることができる。その最終濃度を、第３ブタノールの
ような第３アルコールの場合には容量比で20％までにす
ることができ、ジメチルホルムアミドまたはテトラヒド
ロフランの場合には容量比で10％までにすることができ
る。
反応を、室温にて数分から数時間の時間をかけて実施す
る。その後、低分子量の生成物および特には過剰の反応
体を透析またはゲル濾過によって除去することができ
る。この方法により、タンパク１モルあたり１ないし15
の置換基を導入することが可能となる。そのような化合
物を用いる場合、タンパクP1とのカップリングは、pH6
から８の溶液中にて30℃を越えない温度で、１時間から
24時間かけておこなう。低分子量の生成物を除くために
適宜、得られた水溶液を透析する。ついで包合体を既知
の方法の変法により精製できる。
（２）チオエーテル結合 この場合、包合体をP1′−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）ｎ−SHと前も
って１つ以上のマレイミド基を導入しておいたタンパク
P2とを反応させることにより調製する。１例として、反
応を次の式で示す。
上式中、R8は炭素数１ないし15の脂肪族または芳香族介
在分子を示す。それは、続いて使用される反応体に対し
て不活性である。Ｚ′は、結合に関与するタンパクP2の
官能基の種類に従って変化し得る基を示す。すなわち、
Ｚ′は、酸素（チロシン残基（チロシル基）のフェノー
ル基のエステルの場合）、NH（タンパクのアミノ基と活
性型カルボキシル基のカップリングの場合）またはNH−
CH2（タンパクのアミノ基とクロロメチルケトンの場
合）である。
マレイミドで置換されたタンパクP2は、それ自体マレイ
ミド基を有する試薬によってタンパクの適当な基を置換
することによって、タンパクP2自体からまたは適当に保
護されたタンパクP2から得られる。これらに適した基の
うち、特に次のものが選ばれる。
ａ）ペプチド鎖の未端アミノ基またはタンパクに含まれ
るリシン残基（リシル基）の側鎖アミノ基。この場合、
マレイミド基を有する試薬は次のようなものがある。
ア）次の一般式の試薬 上式中、Ｌ−CO−は次のとおりである。
・カルボキシル基。その場合、カルボジイミドのような
カップリング剤および特には１−エチル−３−ジメチル
アミノプロピル−３−カルボジイミドのような水溶性誘
導体の存在下でカルボキシル基を活性化したのち、反応
が進行する。
・またはオルト−若しくはパラ−ニトロフェニルまたは
ジニトロフェニルエステルまたはＮ−ヒドロキシコハク
酸イミドエステル。
これは直接アミノ基と反応し、それをアシル化する。こ
のような試薬の調製は、特にヘルベティカ・ケミカ・ア
クタ（Helvetica Chimica Acta）,58,531−541（1975）
に記載されている。同じようなクラスの他の薬剤は市販
品として手に入る。
イ）次の一般式の試薬 これは次の反応式に従ってタンパクP2のアミノ基と反応
し得る。
ｂ）タンパクに含まれるチロシン残基のフェノール基。
この場合、マレイミド基を有する試薬は次の一般式で示
される。
これは次の反応式に従ってタンパクのフェノール基と反
応する。
マレイミドを有する試薬とタンパクP2との反応は均質な
液相、最も一般的には水または緩衝液中で進行する。反
応体の溶解性を高めるには、水に可溶性の有機溶媒を反
応溶液に加えることができる。その最終濃度を、第３ブ
タノールのような第３アルコールの場合には容量比で20
％までにすることができ、ジメチルホルムアミドまたは
テトラヒドロフランの場合には容量比で10％までにする
ことができる。反応は室温にて数分から数時間かけてお
こなう。
そののち、低分子量生成物、特に過剰の反応物を透析、
又はゲル濾過により取り除く。
この方法により、通常、タンパク１モル当り１〜13の置
換基を導入することができる。
このような化合物を用いる場合、タンパク質Ｐとのカッ
プリングは、２つのタンパク質をpH6〜８の水溶液中に3
0℃以下の温度で１ないし24時間かけて溶解することに
よっておこなう。得られた溶液を、所望に応じて透析し
て低分子量生成物を除去し、抱合体を種々の既知の手法
によって精製する。
式 （ここで、ＥおよびＧは上記の通り）で示される化合物
は、式、 Ｇ−Ｅ−COOH VII （ここで、ＧおよびＥは上記の通り）で示される化合物
を、有機溶媒中10ないし40℃の温度で、 式 で示されるカルボニルジイミダゾールと反応させること
によって得られる。
式VIの化合物は、タンパク質GPIR−laおよびＰのチロシ
ンの水酸基とのカップリング用試薬として特に有用であ
る。
この発明は、また、統計式 GPIR−la″−Ｏ−CO−Ｅ−Ｇ IX （ここで、 GPIR−la″は、タンパク質GPIR−laの残基もしくはその
官能基のいずれか１つを修飾することによってGPIR−la
から誘導された分子であって、チロシンのフェノール水
酸基が１つ以上除去されているものを表し、 酸素原子は、残基GPIR−la″から離脱した上記フェノー
ル水酸基に属するものを表し、および ＥおよびＧは上記の通りである）で示される新規生成物
にも関する。
特に好ましい化合物は、式IXで示される化合物であって
Ｅが、基CH2 ｐ（ここで、ｐは２ないし７の整数）
または基 であり、かつＧが式−Ｓ−Ｓ−Ｘ（ここで、Ｘは、１つ
以上のハロゲン、アルキル基、カルボキシル基、アルコ
キシカルボニル基、１つ以上のハロゲン、ニトロ、アル
コキシ、カルボキシもしくはアルコキシカルボニルで置
換されもしくは置換されていないフェニル基もしくはア
ルコキシカルボニル基でそれぞれ置換されまたは置換さ
れていないピリジン−２−イルおよびピリジン−４−イ
ルよりなる群の中から選ばれた活性基であるものであ
る。
式IXの生成物は、式 GPIR−la″−OH （ここで、GPIR−la″は、上記の通り、および水酸基は
残基GPIR−la″のチロシンから脱離するフェノール水酸
基である）で示される化合物を、場合に応じて水混和性
有機溶媒（例えばジオキサンやテトラヒドロフランのよ
うなエーテル系溶媒）を含有する水系溶媒中、10ないし
40℃の温度で、式VIの化合物と反応させることによって
得られる。
GPIR−laがリシンの長期作用型Ａ鎖である場合、得られ
た免疫毒素IT（Ａ−la）の性質は以下の通りである。
（１）抗体１モル当りの修飾Ａ鎖のモル数で表現される
平均カップリング度は、通常、0.5ないし５であり、特
に１ないし３である。
（２）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によってIT
（Ａ−la）を分離すると、抗体の分子量とは3000ダルト
ンづつ連続的に異なる分子量を有する生成物に相当する
一連のバンドに分れる。
（３）サイトフルオロメトリーによって、抗体は活性化
およびカップリング反応中にどのような実質的な劣化を
も受けていないことおよび抱合体自体の内部においてそ
れが指向された抗原をなお認識し得ることが示され得
る。
（４）修飾され抗体とカップリングしたＡ鎖の、タンパ
ク質合成に対する阻害活性は、２−メルカプトエタノー
ルの存在下において無細胞モデルで測定すると、全体的
に保持されている。
免疫毒素IT（Ａ−la）の細胞毒性活性は、活性化剤の存
在下において標的抗原を有する細胞について細胞モデル
中でのタンパク合成試験で測定したとき、標的抗原を持
たない細胞について同一条件でおこなったときよりも10
0倍以上大きい。例えば、ジスルフィド架橋を含む結合
によってリシンの修飾Ａ鎖を、ある種のマウス白血病細
胞表面に存在する抗原Thy1.2に指向される単一クローン
抗体（抗体AT15Eで表示）とカップリングして得た免疫
毒素（IT（Ａ−la）で表示）は、陰性Thy1.2細胞に対し
てよりも約1000倍、陽性Thy1.2細胞に対して細胞毒性で
ある。さらに、IT（Ａ−la）AT15Eの活性は同じ抗体AT1
5Eおよびその天然鎖から得られるITによるものと同様で
ある。
Ａ鎖として換算してIT（Ａ−la）をウサギに0.4mg/kg体
重のオーダーで血管内投与した後、投与から24時間後の
血液流に存在するIT（Ａ−la）の血漿中レベルは、同一
条件で測定した通常のITの血漿中レベルよりも50ないし
100倍高い。かくして、ウサギが関与する典型的な例に
おいて、投与24時間後の血液流中のIT（Ａ−la）AT15E
の血漿中レベルは、時間０のときに存在するレベルの９
％であり、同一時間における通常のIT AT15Eの場合の0.
08％と比べて、110倍であることがわかる。
これによって、薬理的性質に関して新たな性質が付与さ
れた修飾免疫毒素が得られるのである。
さらに詳細には、細胞毒性サブユニットを適当に修飾す
ることによって、免疫毒素の特異的細胞毒性に、これを
阻害することなく、新たな固有の性質すなわち高等動物
又はヒトに注射したのち、遅延された血漿中における消
失キネティックを示す能力を付与できるのである。
リシン及び抗体−リシン抱合体、さらに抗体−リシン抱
合体Ａ鎖の薬理学的特性を改良する方法として以下の文
献が知られている。
（１）European Journal of Biochemistry（1985），14
7,198−206; （２）Biochemica Biophysica Acta（1985），842,12−
21; （３）Cancer Drug Deliverg（1985），3,191−198。
しかし、これら公知のものは以下に説明する如く本発明
のものと較べて劣るものである。
（Ａ）方法論的考察 上記公知の方法において、リシン、抗体−リシン抱合
体、抗体−リシン抱合体Ａ鎖の生体中における消失速度
を遅らす方法はpH3.5で、メタ過ヨウ素酸塩と水素化シ
アノホウ素ナトリウムとの混合物で全リシン毒のオシド
単位を短時間（最大１時間）で修飾することからなる。
したがって、以下の点で異なる。
（１）変性（又は修飾）はリシンの精製されたＡ鎖の分
子のみに対しておこなわれる。
（２）反応pHは非常に高く中性に近い。
（３）処理の最適時間は可成り長く４〜20時間である。
上記文献の方法は精製リシンのＡ鎖に直接適用され、そ
の結果、急速かつ非可逆的にほぼ完全に変質し、後の使
用に好ましくない。したがって上記文献の方法はリシン
Ａ鎖の分子に直接適用されないため、本発明のＡ鎖の修
飾方式と全く異なる。
（Ｂ）結果について： （ａ）修飾リシンの特性 上記文献による方法で得たリシントクシンは以下の特性
を有する。
培養細胞に対する修飾リシンの試験管内での生物学的特
性、即ち細胞毒の能力は処理により90％程度まで失われ
る。
マウスおよびラットに対して変性リシンをテストしたと
ころ全体的毒性は逆に３〜４倍増大する。
これら２つの特性は抗体とリシンのそのような結合の仕
方によって得られる抱合体のためであり、免疫毒素で期
待されるものと逆である。即ち、標的細胞に対して最大
の細胞毒性を示し、他においては毒性が最低とならなけ
ればならない。
リシンの肝細胞の摂取（血流中からの消失の最大原因）
は修飾の結果、因数２ほど減少した。これはリシンが修
飾されない場合に対して2.3倍血漿中濃度が増大したに
すぎない。
又、オシド単位の修飾により得られるリシンの肝細胞の
摂取の抑止度は過剰のオバルブミンとともに天然リシン
を投与した場合より小さい。このようなことから上記文
献の方法は肝細胞の摂取の原因となるリシンの糖を完全
に破壊させるのには不適当である。
（ｂ）修飾リシンから得られるＡ鎖免疫毒素の生物学的
特性。
上記文献においては修飾リシンを精製したリシンＡ鎖を
用いて免疫毒素を得ている。この修飾リシンは天然リシ
ンを過ヨウ素酸ナトリウムおよび水素化シアノホウ素ナ
トリウムでpH3.5で60分間処理している。この条件はリ
シンの血漿レート（rate）の増大と生物学的活性の減少
との妥協である（この条件では血漿レートはファクター
２〜2.3で増大し、活性はファクター4.7で減少する）。
この修飾リシンからのＡ鎖はジスルフィドブリッジを介
してガン細胞用抗体に結合される。この免疫毒素の生物
学的特性はこれら文献によると可成り小さい。標的細胞
に対するこの抱合体の細胞毒性は天然のリシンＡ鎖によ
る同じ抱合体よりもファクター３〜４程度小さい。この
ことは上記文献によるリシンの処理はリシンの生物学的
活性を著しく損い、さらにそのＡ鎖により得られる免疫
毒素の特性を著しく損うことになる。
しかるに、本発明による得られるＡ−la鎖でつくられる
免疫毒素は標的細胞に対する細胞毒性は天然リシンのＡ
鎖で得られる免疫毒素と同等である。
（ｃ）修飾リシンからのＡ鎖およびこれに対応する免疫
毒素の薬理運動学的特性 上記文献によればその方法で得られる修飾リシンからの
Ａ鎖を用いて得られる免疫毒素は血中消失速度が遅く、
薬理運動学的特性が改良されるとしている。しかし、実
験によりそのことが十分に証明されていない。
これは以下の理由から明らかである。
まず、その薬理運動学的結果は全体的毒性（リシンおよ
び変性リシン）によるものであり、対応するＡ鎖による
ものでない。リシントクシンはＢ鎖上のオリゴ糖単位を
含んでいる。これらオシド単位はすべて末端マンノース
を有するため、認識能力を有するリセプターを有する柔
細胞により認識され易い。実際上、リシン消失に関与す
るオシド単位がＡ鎖によるものか、Ｂ鎖によるものか双
方によるものかの判定は困難である。したがってＡ鎖の
急速消失の原因となるオシド単位がリシンの消失に関与
するものと同じか否かは知り得ない。
したがって、上記文献でのリシンの肝細胞摂取抑制は全
リシンに対して得たＡ鎖のオシド単位の変性を意味する
ものでなく、一部修飾されたものに過ぎない。
本発明者は上記文献の方法で修飾したリシンから分離し
たＡ鎖および対応する免疫毒素の薬理運動学的特性をテ
ストした。このテストにおいてリシンの修飾（１）、Ａ
鎖の分離（２）およびＡ鎖と抗体との結合（３）は上記
文献に忠実に従った。その結果を比較として本発明によ
るＡ−la鎖および天然Ａ鎖とともに表Ｉに示す。
この結果から修飾リシンのＡ鎖は遊離チオール基および
分子量についてはＡ−la鎖のものと同等であるが、以下
の生物学的特性においては著しく異なるものであった。
（１）固有的生物学的活性であるタンパク合成能は修飾
リシンからのＡ鎖についてはファクター10ほど減少した
が、Ａ−la鎖ではほとんど変らない。
（２）注射後24時間目の血漿濃度は修飾リシンからのＡ
鎖よりもＡ−la鎖のものは125倍大きい。修飾リシンか
らのＡ鎖のものは天然Ａ鎖のものに比較してファクター
2.6だけ改良されたにすぎない。
この修飾リシンからのＡ鎖でつくられた免疫毒素の生物
学的活性について、表IIに天然Ａ鎖および本発明のＡ−
la鎖による免疫毒素の場合と比較して示す。
この結果から、 （１）修飾リシンからのＡ鎖による免疫毒素の生体中残
留能はＡ−la鎖によるものより著しく小さい。注射24時
間後の場合はその差はファクター15に等しい。
（２）修飾リシンからのＡ鎖の免疫毒素の標的細胞に対
する細胞毒性は天然Ａ鎖又はＡ−laによるものより20分
の１程度である。
上記テスト結果からも本発明のＡ−la鎖による改良およ
びその免疫毒素の効果は上記文献からは到底予想し得な
いものであることが理解されよう。
以下、本発明の実施例を示す。
実施例１ この実施例は過ヨウ素酸ナトリウムおよびナトリウムシ
アノボロヒドリドで修飾したリシンＡ鎖を静脈注射した
場合の消失の遅延性を証明するためのものである。
Ｉ 過ヨウ素酸ナトリウムおよびナトリウムシアノボロ
ヒドリドによるリシンＡ鎖の修飾 （１）DTNBを用いた天然SHのブロッキング リシンＡ鎖を米国特許No.4,340,535に記載されている方
法で製造、精製した。2,2′−ジニトロ−5,5′−ジチオ
２安息香酸（DTNB）の溶液20当量、すなわち、pH7の125
mMリン酸塩緩衝液に溶かしたDTNBの溶液、（この溶液は
水酸化ナトリウムでpH:7に調節した）を、125mMのPBS緩
衝液に溶かした6mg/mlの割合で含むリシンＡ鎖（チオー
ル基をＡ鎖１モル当り0.81含む）20ml溶液に加えた。培
養は20℃で20分間続けた。この溶液を４℃でPBS緩衝液
りん酸塩については20mM,NaClについては150mMのpH:7の
緩衝液を用いて透析し、10,000×ｇ、30分の遠心分離の
のち、チオール基をブロッキングしたＡ鎖を107mgを5.5
mg/mlの割合で含む溶液として得た。
（２）ブロッキングされたＡ鎖の過ヨウ素酸塩およびナ
トリウムシアノボロヒドリドによる酸化および還元 この処理はすべて４℃でおこなった。0.2M,pH6.5の酢酸
塩緩衝液19mlをチオール基ブロッキング済みＡ鎖19.5ml
を含む溶液107gに加えた。この溶液を0.2M,pH3.5の酢酸
塩緩衝液でpH6.5に調整した。つぎに、水素化シアノホ
ウ素ナトリウムを160mM含む溶液をpH6.5の酢酸塩を用い
てつくった。他方、pH6.5の酢酸塩を用いて、80mMの過
ヨウ素酸ナトリウム溶液をつくり、これを暗所にて保存
した。ついで、暗所にてこの過ヨウ素酸ナトリウム溶液
19mlをナトリウムシアノボロヒドリド溶液19mlと混合
し、さらに10分後暗所にて上記Ａ鎖溶液38mlを加えた。
培養は暗所で４℃で17時間おこなった。酸化反応停止は
エチレングリコールの20％（v/v）水溶液（酢酸塩緩衝
液0.2M,pH6.5）2.7mlを加えることによりおこなった。
４℃、20時間の培養後、反応媒体を４℃で48時間PBS緩
衝液（50mM,pH7.8）で透析した。これを30分間、10,000
×Ｇで遠心分離し除去し、チオール基がブロッキングさ
れオシド残渣が酸化、還元で変性されたＡ鎖を0.82mg/m
lの濃度で74ml得た。
（３）チオール基のブロッキング解放 オシド単位を変性し、ブロッキングされたＡ−la鎖の0.
82mg/ml溶液74mlを濃縮により16.8mlに戻し、50％の２
−メルカプトエタノール0.406mlを加えた。培養を20℃
で１時間おこない、ついでこの溶液を４℃でPBS緩衝液
を用いて透析した。その結果修飾されたＡ−la鎖を2.87
mg/mlの濃度で45mg得た。
DTNB法（Enzymology,1972,25,457Academic Press）を用
い、この修飾されたＡ鎖が１モル当り0.70の遊離チオー
ル基を有することが判明した。この修飾Ａ鎖の分子量は
ドデシルサルフェートの存在下でのポリアクリルアミド
勾配電気泳動により30,000±3,000であることが判明し
た。
この得られたＡ−la鎖を、タンパク質合成の抑止におけ
る酵素活性および薬理学的特性について研究した。
Ｂ 持続性Ａ鎖の酵素活性の非細胞モデルによる測定 リシンＡ鎖の基本的生物学的特性はリボソーマルサブユ
ニット60Sの劣化によりタンパク合成を抑制することで
ある。
試験管内プロトコールにおいて、人工的メッセンジャー
RNAすなわちポリウリディリル酸の存在下で14C−フェニ
ルアラニンを導入し得るラットの肝ぞうの適当に補足し
たサブセル分画を用いる。
サブセル分画の製法および14C−フェニルアラニンの導
入の測定法は文献“Biochemica Biophysica Acta 1973,
312,608−615に従い、ラットの肝細胞のミクロソーム分
画およびサイトゾル分画を用いておこなった。
Ａ鎖を含むサンプルを、0.2％−メルカプトエタノール
およびウシ血清アルブミン15μg/mlを含むpH7.6の50mM
トリスHCl緩衝液中に希釈させた溶液の形で用いた。
データは抑止剤なしの参照媒体との関連において、リシ
ンＡ鎖を含む各反応媒体におけるタンパク中への14C−
フェニルアラニンの導入の抑止率で計算した。
得られた曲線からＡ鎖（天然又は変性）のIC50の濃度
（放射能マーク付き先駆物質の導入を抑制する）を計算
することができる。すなわち、1.2×1010モル/lに相当
するIC50を変性、ブロッキングＡ−la鎖について調べ
た。参照鎖のIC50は1010モル/lである。測定誤差を考え
ると、変性によるＡ鎖の活性損失は認められなかった。
Ｃ 多糖単位を変性した持続性Ａ鎖（Ａ鎖）の薬理効果 この天然又は変性Ａ鎖をラビットに耳を介して静脈投与
した。このＡ鎖投与量は0.415mg/kgであった。血液サン
プルをヘパリン上に間隔をおいて採取した。この血漿を
下記にRIM−１の記号で示したラジオイムノアッセイテ
ストで分析した。
この方法はＡ鎖を修飾することなしに判定し得る利点を
有する。この判定をマイクロ滴定プレート（たとえば、
NUNC−TSPスクリーニングシステム,Poly Labo Block
製）を用いておこなった。このプレートの蓋体には過吸
収剤スパイクが設けられていて、これがベース中の穴に
侵入するようになっている。これらのスパイクは固体相
からなるものである。リシンのＡ鎖を示し、親和性クロ
マトグラフィで精製された雌羊抗体（以下にAc1の記号
で示す）をこの固体相上に吸収させた。この目的のた
め、PBS緩衝液中に10μg/ml含むAc1の溶液を上記穴に分
けて注入した。上記スパイクを４℃で24時間、Ac1溶液
と最初に接触させ、ついで20℃で３時間、胎児ウシ血清
と接触させ、全ての固定部位を飽和させた。この飽和し
た免疫吸収剤を20℃、３時間、種々の濃度の血漿サンプ
ル、又は既知の濃度のＡ鎖溶液と接触させ、目盛曲線を
作成した。PBS緩衝液で洗浄後、この免疫吸収剤をリシ
ンＡ鎖を示す雌羊抗体（親和クロマトグラフィで精製
し、放射能ラベルを施したもの、以下Ac2と記す）と20
℃で２時間接触させた。このAc2の放射能ラベルはクロ
ラミンＴの存在下でヨウ素125を用い、Greenwoodおよび
Hunterの方法（Biochem.J.,1963,89,114）でおこなっ
た。このラベルしたAc2抗体は５〜10マイクロキューリ
ー／μｇを示した。このラベル化Ac2106cpmを200μｌと
して、0.1％ウシ血清アルブミンを含むPBS緩衝液中に導
入した。PBS緩衝液中で洗浄ののち、上スパイクを取り
はずし、結合したAc2の量を放射能測定により計量し
た。サンプル中のＡ鎖の濃度は、異なる既知の濃度でＡ
鎖を導入することによって作られた目盛曲線に対して参
照することにより測定した。持続性Ａ鎖を動物に注射し
た際、同じＡ鎖を用い相当する目盛曲線を作成した。
この方法で測定された血漿中のＡ鎖の濃度は再現性があ
り、信頼できるものである。この探知しきい値は1ng/ml
である。各実験間の再現性の検討の結果、変化関数が１
〜200ng/mlの濃度について10％以下であった。
これらの実験の結果は曲線で示され、時間は横軸に、零
時の血漿濃度理論値に対する記録された生成物の血漿濃
度の％をlogスケールで縦軸に示した。この値、すなわ
ち、“相対血漿濃度”（RPC）は下記の式で計算され
る。
血漿量は動物の体重の1kg当り36mlで考えられている。
第１図は天然リシンＡ鎖および変性Ａ−la鎖を静脈注射
した場合の血漿における消失曲線を時間の関数として示
したものである。この曲線（１）は２つの相を示してい
る。第１にこの天然リシンＡ鎖を注射後３時間で血漿中
に残る率はわずか0.1％（投与量に対して）であり、血
液から急激に消失することを示している。第２の相にお
いてはこの消失がよりゆるやかである。
しかし、オシド単位を変性したＡ鎖（Ａ−la鎖、曲線
２）においては、この消失性は著るしく改められる。す
なわち、Ａ鎖製品の大部分が消失するもととなる第１の
消失相は著るしく抑制され、その結果、Ａ鎖の血漿にお
ける残留レベルが著るしく増大する。注射20時間後では
酸化Ａ鎖の濃度は修飾されていないＡ鎖（曲線２）の場
合の330倍にもなる。
これらの結果から、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化反
応およびナトリウムシアノボロヒドリドによる酸化反応
およびナトリウムシアノボロヒドリドによるアルデヒド
基の還元（第１アルコールを形成して消失する）によっ
て、Ａ鎖の消失原因となる糖の変性がおこなわれて、Ａ
鎖の生物学的活性が失われることなく、その消失を防止
することができることが証明された。
実施例２ この実施例は、酸化処理時間が酸化、還元Ａ鎖の薬物動
態学的性質に及ぼす重要性を検討するものである。
過ヨウ素酸ナトリウムによる処理時間を変えた以外は実
施例１の手法を用いて５種の酸化Ａ−la鎖の製剤を調製
した。処理時間は次の通りであった。すなわち、０（エ
チレングリコールを用いて反応を直ちに停止）、20分、
40分、2.5時間、４時間、および16時間であった。
これら６種の製剤をウサギに注射し、24時間経過後のＡ
−la鎖の血漿中相対濃度を実施例１の手法により測定し
た。
結果を第２図に示す。ここで24時間後のRPCを縦軸に、
過ヨウ素酸塩−水素化シアノホウ素による処理時間を横
軸に示す。この結果から、１）Ａ鎖の血漿中濃度の増加
は、確かに、過ヨウ素酸塩による酸化に基づくこと（反
応を直ちに停止したときは、Ａ鎖の血漿中濃度は生のＡ
鎖についてのものと同一であるからである）、および
２）最適の効果を得るためには、反応処理時間を比較的
長くすることが必要であることがわかる。
実施例３ 活性化ジスルフィド基で置換したマウスＴ細胞に対する
抗体（Thy1.2抗原に対する抗体）と、リシンＡ−la鎖と
により得られる免疫毒素（ITと略称する）。
ａ）マウスＴ細胞に対する抗体（AT15E抗体）： この抗体は免疫学ジャーナル（Journal of Immunolog
y）第122巻,2491−2498頁、1979年において説明された
方法によって準備した。
ｂ）リシンのＡ−la鎖 リシンのＡ−la鎖は実施例１で説明した方法によって準
備した。
ｃ）マウスＴ細胞を阻害する活性化抗体 Ｎ−スクシンイミディル−３−（２−ピリディル−ジチ
オ）−プロピオネート4.25mgを95％エタノール0.5mlに
溶かしたものを、pH8.3のホウ酸塩緩衝液0.1Mに抗体5.8
3mg/mlを溶かした溶液10mlに添加した。この混合物を20
℃で30分攪拌した。125mMりん酸塩緩衝液（pH7）を用い
て透析後、タンパク質溶液を10,000×ｇ、４℃で30分、
遠心分離した結果、活性抗体57.3mgを4.66mg/mlの濃度
で得た。
２−メルカプトエタノールとの交換反応によって放出さ
れた２−ピリジンチオンの343nmにおける吸収をみる
と、この抗体は1mol当り3.75個の活性化された混合ジス
ルフィド基を有していることがわかった。
ｄ）持続作用のあるリシンＡ−la鎖を含有する免疫毒素
の準備 実施例１で得た2.87mg/ml濃度のＡ−la鎖8.9mlを6.5ml
の上記活性抗体溶液（濃度4.66mg/ml、即ち30.3mgの活
性化抗体）に加え、25℃で20時間培養した。この溶液を
遠心分離し、ついでゲル（AcA 44ゲル）でろ過精製し
た。これを光学密度280nmで測定した。抗体と変性Ａ鎖
の両方を含む分画を合わせると免疫毒素を1ml当り0.4mg
含む溶液32ml（即ち免疫毒素は12.8mg）が得られた。こ
の溶液は抗体とカップリングされた変性Ａ−la鎖を1ml
当り0.107mg含有する。
従ってこの方法による平均カップリング度は抗体1molに
つきＡ−la鎖1.8molである。
上記の方法で得たリシンＡ−la鎖を含む免疫毒素につい
て、その薬物動態学的特性と標的細胞に対する細胞毒性
を調べた。
実施例４ 本実施例は、持続作用をもつリシンＡ鎖を含む免疫毒素
（IT（Ａ−la）と略す）の血漿中濃度がゆっくりと減少
するという性質の獲得の様子を示す。
（Ａ）方法 実施例３で説明した手続で準備された抱合体をうさぎの
耳の血管に一度注射した。投与された量はＡ鎖について
体重1kg当たり0.415mgである。ヘパリンの存在下で血液
を時々採血した。血漿を放射線免疫試験（RIM−３と略
す）によって（２箇所）分析した。
この試験はRIM−１と同じ技術（実施例１）を用いて行
われた。但しAc2溶液は本試験においてはRIM−１の技術
を用いてアフィニティークロマトグラフィーによって精
製され、放射標識されたマウスのIgGを阻害するヤギの
抗体である。このサンプルにおける修飾された免疫毒素
の濃度は既知の異った濃度から導いた検量線を用いて決
定した。RIM−３試験はRIM−１と同じ信頼性及び再現性
を有する。
比較対照のため、生のリシンＡ鎖を活性化されたジスル
フィド基で置換した抗体の反応から得られたIT−AT15E
抱合体と同じ条件下で比較例の試験を行った。この抱合
体の準備と細菌毒性は実施例３で説明した方法によって
行った。これらの実験結果は実施例１でカップリングさ
れていないＡ鎖について行ったのと同じ方法で示した。
（Ｂ）結果 図３は静脈注射された従来のIT AT15E（曲線１）及びIT
（Ａ−la）AT15E（曲線２）の血漿中濃度曲線を示して
いる。投与24時間後にIT（Ａ−la）AT15E活性細胞毒素
は従来のIT AT15Eの110倍になっていた。この事実は酸
化されたＡ鎖の薬物動態学的特性は抗体とカップリング
された後も保持されていることを示している。
実施例５ 本実施例においてはIT（Ａ−la）AT15Eの陽性標的細胞T
hy1.2に対する細胞毒素特性の保存について述べる。
リシンＡ鎖の基本的な生物学的特性は細胞中のタンパク
質合成をリボソームの60Sサブユニットの分解によって
阻害することである。
この方法は培養中のガン細胞に14Cで標識したロイシン
（以下14C−ロイシンをいう）を取り込ませて研究され
ている物質の効果を測定する細胞系を用いる。
用いられる細胞は、抗原Thy1.2を選ぶ人間のＴ白血病か
ら誘導されるT2細胞系に属する。この細胞は目的の物質
の存在下で保温した後、細胞への14C−ロイシンの取り
込みの程度を測定した。この実験は10mMの塩化アンモニ
ウムの存在又は非存在下でおこなわれた（免疫毒素の活
性を促すため）。この測定には生物化学ジャーナル（Jo
urnal of Biological Chemistry）第249巻11号,3557−3
562頁で説明された、タンパク質合成量を測定するのに
14C−ロイシンのトレーサーを用いる方法によって行
う。取り込まれた放射能はろ過した細胞の全体について
測定した。
定量の基準として線量／効果曲線を描くことができる。
この曲線横軸には目的物質中のＡ鎖のモル濃度、縦軸に
は、タンパク質合成を阻害する物質の存在しない比較細
胞における14C−ロイシンの取り込み量に対する百分率
をプロットして得られる。
こうしてそれぞれの物質について14C−ロイシンの取り
込み量を50％阻害する濃度または50％阻害濃度（IC50）
を決定することができる。
下記表IIはIT−（Ａ−la）−AT 15EおよびITAT15Eで、
さらに天然Ａ鎖および非結合Ａ−la鎖で同一実験条件で
得られたIC50の値を示す。
この表からIT（Ａ−la）AT15Eは天然Ａ鎖を含む対応す
る免疫毒素と同様の強い細胞毒活性を示し、これは同一
条件での非結合変性Ａ−la鎖のものより約1000倍の値を
示している。さらにIT（Ａ−la）AT 15Fは塩化アンモニ
ウムにより活性が促されることも見出された。
実施例６ 本実施例においては生のゲロニンを動物に静脈注射し
た場合のその急消失と、過ヨウ素酸ナトリウムによる
酸化および水素化シアノホウ素ナトリウムによる同時還
元反応によって変性させたゲロニンを同様に注射した後
のそのゆっくりとした消失について説明する。
Ａ）過ヨウ素酸ナトリウムおよび水素化シアノホウ素ナ
トリウムによるゲロニンの修飾 ゲロニンをゲロニウムムルチフロールム（Geloniummult
iflorum）から生化学ジャーナル、第255巻、6947−6953
頁、1980年に述べてある方法で抽出し、精製した。実施
例２でリシンＡ鎖について述べたものと同じ方法で酸化
反応を行った。しかしチオール基のDTNBによるマスクは
行っていない。
実際ゲロニンの天然のチオール基を基いてゲロニンと抗
体をカップリングさせることはあまり行なわれていない
ので、チオール基は、酸化後、ガン研究（Cancer Re
s.）、第44巻、129−133頁、1984年において説明された
技術を用いて人謹的に導入した。0.2M、pH6.5の酢酸塩
緩衝液1mlをPBS緩衝液中5mg/mlのゲロニンを含む溶液1m
l中に添加した。この溶液を0.2M、pH3.5の酢酸塩緩衝液
でpH6.5に調整した。つぎに、水素化シアノホウ素ナト
リウムを160mM含む溶液をpH6.5の酢酸塩を用いてつくっ
た。他方、pH6.5の酢酸塩を用いて、80mMの過ヨウ素酸
ナトリウム溶液をつくり、これを暗所にて保存した。つ
いで、暗所にてこの過ヨウ素酸ナトリウム溶液1mlを水
素化シアノホウ素ナトリウム溶液1mlと混合し、さらに1
0分後暗所にて上記ゲロニン溶液2mlを加えた。培養は暗
所で４℃で17時間おこなった。酸化反応停止はエチレン
グリコールの20％（v/v）水溶液（酢酸塩緩衝液0.2M,pH
6.5）142μｌを加えることによりおこなった。４℃、20
時間の培養後、反応媒体を４℃で48時間PBS緩衝液（50m
M,pH7.8）で透析した。これを30分間10,000×ｇで遠心
分離にかけると、ここから濃度2.5mg/mlの酸化ゲロニン
2.9mgが得られた。
リシンＡ鎖と同じように、ゲロニンの基本的特性はリボ
ソームの60Sサブユニットの分解によって真核細胞にお
けるタンパク質合成を阻害することである（バイオケミ
カルジャーナル、第207巻、505〜509頁、1982年）。ゲ
ロニンの場合にも過ヨウ素酸酸化による修飾は、活性の
実質的損失を生じさせないことがわかった。
Ｂ）ゲロニンにおける薬物動態学的特性の維持生の、或
いは上述の手続で修飾されたゲロニンをうさぎの耳の血
管から一回注射した。投与したゲロニンの量は0.3ない
し0.4mg/kgであった。ヘパリンの存在下で血液を時々採
取した。血漿は以下RIM−２と略称する放射線免疫試験
を用いて分析した。
この試験はRIM−１試験と同じ技術を用いる。ただしAc1
溶液が本例ではアフィニティークロマトグラフィーで精
製された抗ゲロニンウサギ抗体溶液である。Ac2抗体はR
IM−１試験と同じ抗体を放射性同位体で標識したもので
ある。同一標本中の生のゲロニンと修飾したゲロニンの
濃度をそれぞれ標本とは異った既知の濃度の検量線と比
較することによって決定した。放射標識の技術はRIM−
１で説明したものと同じである。RIM−２試験はRIM−１
試験と同等の信頼性と再現性を示した。本実験の結果は
実施例２でリシンのＡ鎖について示したのと同じ方法で
示す。
生の及び修飾したゲロニンを静脈注射した場合の血漿中
濃度曲線を時間の関数として表わした場合、生のゲロニ
ンは99.99％が24時間で消失し、生のリシンＡ鎖と同じ
ように血中から非常に急速に消失することがわかった。
ゲロニンのポリサッカリド単位が変性されている場合は
曲線形が大きく違う。投与24時間後に変性したゲロニン
の濃度は生のゲロニンの250倍ある。
従ってこれらの結果は、リシンＡ鎖において、過ヨウ素
酸ナトリウムによる酸化反応およびナトリウムシアノボ
ロヒドリドの作用により生成アルデヒド基の還元反応
（これにより第１アルコールが形成される）がゲロニン
の消失に原因する認識方法における糖をその認識を妨げ
る程度まで修飾させることを示している。
これらの修飾免疫毒素はガン性又は非ガン性の病気であ
って、上記免疫毒素を製造するのに用いられた抗体によ
り標的細胞が認識し得る場合に有効となる。投与条件お
よび時間についての最適条件は病気の種類に応じて適宜
決定し得る。この発明の新薬は注射用投与、特に静脈投
与に適している。
【図面の簡単な説明】
第１図ないし第３図は本発明の糖タンパク質の特性を示
す線図である。
フロントページの続き (72)発明者 ザビエル・カナ フランス国、34680 サン・ジョルジュ・ ドルケ、リュ・デ・カリナン ４

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】リボソームを不活化する天然の糖タンパク
    質と同様のリボソーム抑制活性を有し、前記天然の糖タ
    ンパク質よりも長い生体内持続性を有する、リボソーム
    を不活化する修飾糖タンパク質であって、前記修飾糖タ
    ンパク質が、分子量20,000〜30,000のリボソームを不活
    化する糖タンパク質を過ヨウ素酸塩水溶液およびシアノ
    ボロヒドリド水溶液でpH5〜７の水溶液中で、温度０〜1
    5℃、暗所で0.2〜24時間に亘って処理することにより得
    られることを特徴とするリボソーム不活化する修飾糖タ
    ンパク質。
  2. 【請求項２】過ヨウ素酸塩およびシアノボロヒドリドで
    の処理の間、糖タンパク質のチオール基の少なくとも一
    つが保護されていることを特徴とする特許請求の範囲第
    １項記載のリボソームを不活化する修飾糖タンパク質。
  3. 【請求項３】該水溶液が反応性Ａ−鎖を１〜10mg/ml、
    アルカリ性過ヨウ素酸塩を10〜50mM、シアノボロヒドリ
    ドを10〜200mM含む特許請求の範囲第１項記載のリボソ
    ームを不活化する修飾糖タンパク質。
  4. 【請求項４】リボソームを不活化する天然の糖タンパク
    質と同様のリボソーム抑制活性を有し、前記天然の糖タ
    ンパク質よりも長い生体内持続性を有する、リボソーム
    を不活化する修飾糖タンパク質の製造方法であって、分
    子量20,000〜30,000のリボソームを抑制する糖タンパク
    質を、過ヨウ素酸塩水溶液およびシアノボロヒドリド水
    溶液でpH5〜７の水溶液中で温度０〜15℃、暗所で0.2〜
    24時間に亘って処理することを特徴とするリボソームを
    不活化する修飾糖タンパク質の製造方法。
  5. 【請求項５】該水溶液が反応性Ａ−鎖を１〜10mg/ml、
    アルカリ性過ヨウ素酸塩を10〜50mM、シアノボロヒドリ
    ドを10〜200mM含む特許請求の範囲第４項記載の方法。
  6. 【請求項６】上記処理に先立ち、糖タンパク質をSH基を
    保護する試薬で処理し、IO4 -イオンおよびシアノボロヒ
    ドリドによる処理ののち、このSH基を解放することを特
    徴とする特許請求の範囲第５項記載の方法。
  7. 【請求項７】SH基の保護試薬が2,2′−ジニトロ−5,5′
    −ジチオ−ジベンゾイン酸又は３−（２−ピリジルジス
    ルファニル）プロピオン酸であり、SH基の脱保護を２−
    メルカプト−エタノールによっておこなうことを特徴と
    する特許請求の範囲第６項記載の方法。
  8. 【請求項８】リボソームを不活化する天然の糖タンパク
    質と同様のリボソーム抑制活性を有し、前記天然の糖タ
    ンパク質よりも長い生体内持続性を有し、分子量20,000
    〜30,000のリボソームを不活化する糖タンパク質を過ヨ
    ウ素酸塩水およびシアノボロヒドリド水溶液で、pH5〜
    ７の水溶液中で、温度０〜15℃、暗所で0.2〜24時間に
    亘って処理することにより得られる前記修飾糖タンパク
    質と、抗体又は抗体分画との結合により得られる生体中
    での持続性を有する免疫毒素。
  9. 【請求項９】過ヨウ素酸塩およびシアノボロヒドリドで
    の処理の間、糖タンパク質のチオール基の少なくとも一
    つが保護されていることを特徴とする特許請求の範囲第
    ８項記載の免疫毒素。
  10. 【請求項１０】該水溶液が反応性Ａ−鎖を１〜10mg/m
    l、アルカリ性過ヨウ素酸塩を10〜50mM、シアノボロヒ
    ドリドを10〜200mM含む特許請求の範囲第８項記載の免
    疫毒素。
  11. 【請求項１１】上記結合がジスルフィドブリッジによっ
    ておこなわれている特許請求の範囲第８項ないし第10項
    のいずれか一項記載の免疫毒素。
  12. 【請求項１２】上記結合を１−エチル−３−（３−ジメ
    チルアミノプロピル）カルボジイミドによる活性化され
    た３−（２−ピリジルジスルファニル）プロピオン酸、
    又はＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチ
    オ）プロピオン酸塩から選ばれるヘテロ２官能性反応性
    剤を用いておこなう特許請求の範囲第８項ないし第10項
    のいずれか一項記載の免疫毒素。
  13. 【請求項１３】リボソームを不活化する天然の糖タンパ
    ク質と同様のリボソーム抑制活性を有し、分子量20,000
    〜30,000のリボソームを不活化する糖タンパク質を過ヨ
    ウ素酸塩水およびシアノボロヒドリド水溶液でpH5〜７
    の水溶液中で、温度０〜15℃、暗所で0.2〜24時間に亘
    って処理することにより得られる前記修飾糖タンパク質
    と、抗体又は抗体分画との結合により得られる生体中で
    の持続性を有する免疫毒素を有効成分として含む抗ガン
    剤組成物。
  14. 【請求項１４】過ヨウ素酸塩およびシアノボロヒドリド
    での処理の間、糖タンパク質のチオール基の少なくとも
    一つが保護されていることを特徴とする特許請求の範囲
    第13項記載の抗ガン剤組成物。
  15. 【請求項１５】該水溶液が反応性Ａ−鎖を１〜10mg/m
    l、アルカリ性過ヨウ素酸塩を10〜50mM、シアノボロヒ
    ドリドを10〜200mM含む特許請求の範囲第13項記載の抗
    ガン剤組成物。
  16. 【請求項１６】上記結合がジスルフィドブリッジによっ
    ておこなわれている特許請求の範囲第13項ないし第15項
    のいずれか一項記載の抗ガン剤組成物。
  17. 【請求項１７】上記結合を１−エチル−３−（３−ジメ
    チルアミノプロピル）カルボジイミドによる活性化され
    た３−（２−ピリジルジスルファニル）プロピオン酸、
    又はＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチ
    オ）プロピオン酸塩から選ばれるヘテロ２官能性反応性
    剤を用いておこなう特許請求の範囲第13項ないし第15項
    のいずれか一項記載の抗ガン剤組成物。
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