JPS62175500A - 修飾糖タンパク質、当該修飾糖タンパク質の製造方法、当該修飾糖タンパク質を含む免疫毒素および当該免疫毒素を有効成分として含む抗ガン剤組成物 - Google Patents

修飾糖タンパク質、当該修飾糖タンパク質の製造方法、当該修飾糖タンパク質を含む免疫毒素および当該免疫毒素を有効成分として含む抗ガン剤組成物

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JPS62175500A
JPS62175500A JP61302888A JP30288886A JPS62175500A JP S62175500 A JPS62175500 A JP S62175500A JP 61302888 A JP61302888 A JP 61302888A JP 30288886 A JP30288886 A JP 30288886A JP S62175500 A JPS62175500 A JP S62175500A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、多糖単位が修飾された糖タンノ４り質（又は
グリコペプチド）から誘導され、かつタンパク質の合成
を阻害するポリペグチド型の成分に共有結合した少くと
も一種の抗体を含有する薬効のある新しい分子に関する
。
（従来の技術） 米国特許第４，３４０，５３５号並びにフランス国特許
第２，５０４，０１０号及び同第２，５１６，７９４号
は、包合体と呼ばれる抗ガン生成物の製法を開示してい
る。
この生成物は、破壊される細胞についている抗原を標的
とする抗体又は抗体断片と、リシンのＡ鎖を共有結合に
よってカップリングすることによシ得られる。この種の
生成物は今まで免疫毒素という包括的な名称によって称
されてきたが、本発明においても同様である。ところで
リジンのＡ鎖を含有する既に公知の免疫毒素に類似する
包合体は知られている。これは抗ガン剤として適してい
るが、％にグロニウムマルティフロルム（欧州生化学ジ
ャーナル′１９８１年、第１１６号、４４７−４５４頁
及び６ガン研究’　１９８４年、第４４号、１２９−１
３３頁）から抽出されたダロニン、又はモモルジカカラ
ンナイス（ＭＯＭ、米国特許第４．３６８，１４９号）
から抽出された阻害剤のようなＩＪ　、ｊ？ソームを不
活性化する他のグリコペプチドと、抗体又は抗体断片を
共有結合によってカップリングさせることにより得られ
る。
上述のり♂ソーム（ＧＰＩＲという略号を使う。）を不
活性にし、またリシンのＡ鎖と同じような性質を有する
塘タンパク質は２０，０００〜３０，０００の分子量を
有する（°′ガン・サーベイ’１９８２年、第１巻、４
８９−５２０頁）。
本明細書で用いる“す、ｙソームを不活性化する糖タン
パク質″は、リデソームを不活性化し、その結果真核細
胞におけるタン／々り質の合成を阻害する巨大な分子量
のｍ類単位を有する物質全指す。
その他にも同じ不活性化特性を有するならば、その物質
の何らかの断片でもよい。す〆ソームを不活性化する前
記糖ｌンパク質は天然のものであるか、又は遺伝子屋が
この目的のために修飾された細胞から生合成によって誘
導して得られる。
これら免疫毒性はアンモニウム塩、種々のアミンのよう
なアジ島パント物質又はモネンシン若しくはナイジェリ
シンのようなある種のカルがキシルイオノフずアーなど
様々な物質によって強化される。
しかしながら免疫ｆ３累の治療効果は、活性化されてい
るものであってもそうでなくても、その免疫毒素がその
抗体部分を通して活性な形態で、破壊される標的細胞上
に生体内局在化することができるという条件（いかなる
免疫毒素活性の発現においても必須の条件）でのみ十分
発揮される。標的細胞上に局在化される免疫毒素の効力
は、まず第一に血流及び細胞外液にある免疫毒素が活性
な形態で一定の時間内に標的細胞に十分な濃度で到達し
、−目的とする゛抗原を高い割合で捕捉する能力に依存
する。
多くの研究によって免疫毒素が様々な動物の静脈内に注
射された場合の血漿からの消失キネティックスが確立さ
れた。その結果注射後には生物学的に活性な免疫毒素の
血漿中の濃度は急速に低下することがわかった。
ヒトの１９７２球の抗原Ｔ６５ｉ標的とするモノクロナ
ル抗体とりシンのＡ鎖をジスルフィド結合を含む連鎖で
カップリングさせて得られる免疫毒素についてウサギを
使ったモデルで調べたところ、注射直後に血流中に存在
する免疫毒素は、３０分後にはその９７％が、１７時間
後にはその９９、９　％が消失した。この免疫毒素の急
速な消失によってその細胞障害力は減じられる。という
のは、免疫毒素と破壊される細胞についた標的細胞との
恒久的な結合が妨げられるからである。さらに免疫毒素
の血漿からの消失キネティックスを対応する非包合抗体
と比較してみたところ、この抗体は血漿中に相対的に長
い時間高い濃度で留まることがわかった。実際どんなに
高度に免疫毒素を精製しても、常に一定量の非包合体は
残留する。
免疫毒素と非包合抗体の消失速度の違いから、最初はご
く少ない割合でしかない非包合抗体は、除徐にその割合
が増え、数時間後には半数を違える割合になる。そのた
め抗体は徐々に、免疫毒素が標的に結合する際の強力な
アンタゴニストになる。
従って血漿中の免疫毒素を高い割合で存続させることは
標的である抗原が結合される割合と持続時間を増加させ
、その結果免疫毒素の治療効果を増進することを意味す
る。
リシンのＡ鎖を含有する免疫毒素の生体内局在化につい
て、免疫毒素を放射標識し、特定の標的をもたない動物
に注射して実験したところ、包合体は注射後数分で肝臓
に特異的に局在化した。同じ表験をカップリングしない
形態のりシンのＡ鎖について行ったところ、同様な結果
が得られた。
これは免疫毒素に包まれる細胞毒性サブユニットが肝臓
と結合することを強く示唆する。
リシンのＡ鎖はそのポリオサン基が、マンノース残基と
Ｎ−アセチルグルコサミン残基からなる糖タンパク質で
ある。そしてそのうちのいくつかのマンノース基は、末
端に位置する（”農英生物化学’　１９７８年、第４２
巻、５０１頁）。またこれら末端に位置するマンノース
残基を含む環タン／Ｊり質を識別する受容体は肝臓内に
あることが発見された。これらの受容体（クツ・ぐ−細
胞中に存する。）はこれらを代謝する細胞と結合するこ
とによって血液中から消失する。これに関してはβ−グ
ルクロニダーゼとリゾヌクレアーゼＢの場合について詳
しい報告がある（“生物化学と生物物理”１９７８年、
１８８号、４１８頁、“酵素学の進歩”マイスター編、
ニューヨーク、１９７４年および゛小児科学研究１１９
７７年、第１１巻、８１６頁）。
これらを総合すると、リシンのＡ鎖を含有する免疫毒素
の急速な消失は、リシンのＡ鎖のマンノース残基が肝細
胞特にクツパー細胞によって認知されるためと説明でき
る。
動物の静脈内に注射した後の他のＧＰＩＲｌ例えばゲロ
ニン又はＭＯＭ、についての血漿からの消失キネティッ
クスの研究が進められた結果、リシンのＡ鎖については
ＧＰＩＲの血漿中濃度は注射後急速に大部分消失するこ
とがわかった。ウサギについて公知（″生化学ジャーナ
ル１１９８０年、２５５号、６９４７−６９５３頁）の
方法によって精製したゲロニンを注射したところ、注射
直後に血流中に存在したゲロニンは、その１時間後には
９３チ、２４時間後には９９．９９％が消失した。
糖タンパクに含有されるものを含む炭水化物構造の、過
ヨード酸塩による酸化は、２つの隣接する炭素原子は第
１又は第２ヒドロキシル基を有する場合には、炭素鎖の
分割を生ぜしめる。２つの隣接するヒドロキシル基が第
２ヒドロキシル基の場合には、　ＧＰＩＲに存在する場
合のように、酸化は、その間に分割が生ずる炭素原子に
２つのアルデヒド基を生成する。
アルデヒド基は第１アミン基に対し極めて活性であシシ
ッフ塩基として知られるイミンを形成する。したがって
、酸化反応の間、形成されるアルデヒド基は環タン／４
’りのにプチド鎖に付随する第１アミンと反応し、好ま
しくない内部共有結合又は分子間共有結合を形成し、こ
れにより酸化生成物を不安定化し、しばしば不溶性ポリ
マーの形成を生じさせる。
さらに、シッフ塩基の形成は過ヨウ素酸塩による酸化で
生じたアルデヒド基が安定な第１アルコールに急速還元
された場合に防止し得ることも知られている。この還元
は水素化ホウ素イオンの如き還元剤によっておこなうこ
とができる。この場合、水素化シアノホウ素イオンが特
に好ましい。
なぜならば水素化シアノホウ素イオンが過ヨウ素酸塩の
酸化力を損失させることなく（その逆も同じ）、過ヨウ
素酸イオンおよび水素化シアノホウ素イオンが共存し得
るからである。
しかるに、　ＧＰＩＲの炭水化物単位が以下に述べる独
特の方法によシ変性されたとき、その生物学的活性を保
持し、かつ高等動物又は人間に注射したとき血流からの
消失が極めて緩慢であるという２重の特性を有する新し
いＧＰＩＲ分子が得られることを意外にも見出した。こ
の新しい変性ＧＰＩＲはりがソームを不活性化する性質
を有するとともに、その変性によシ生体中の作用の持続
性にすぐれている。この変性ＧＰＩＲを以下ＧＰＩＲ−
Ｌａの記号で示す。
上述の独特の方法はＧＰＩＲのオシド単位を水素化シア
ノホウ素イオンおよび過ヨウ素酸塩イオンで反応させる
ものである。この過ヨウ素酸塩で酸化さ几ることによっ
て生じたアルデヒド基は水素化シアノホウ素イオンによ
り還元されて安定な第１アルコール基となる。これによ
りてＧＰＩＲの他のアミノ基との好ましくない反応が回
避され、安定で完全に溶解し得る製品が得らｎる。
さらに、これらの新規な持続性糖タンＡりが抗体又は抗
体分画と結合したとき、得られた抱合体は免疫毒素の公
知の生物学的特性を保持し、血漿排出作用も遅いことが
見出された。
本発明は従って、新規物質としての構造変性ＧＰＩＲに
係わるもので、その炭水化物単位が水素化シアノホウ素
イオンおよび過ヨウ素酸塩イオンの協同作用により変性
されたものである。なお、この水素化シアノホウ素イオ
ンは過ヨウ素酸塩による酸化によシ生じたアルデヒド基
を安定な第１アルコール基に還元するものである。
さらに本発明は天然又は変性された抗体又は抗体分画と
上記の独特の方法で変性された炭化水素単位を有するＧ
ＰＩＲ分子との共有結合によシ得られる免疫毒素に属す
る製品に関する。
本明細書において、「過ヨウ素酸塩」なる語は過ヨウ素
酸塩の水溶液中の■０４−イオン（特にアルカリ金属塩
における）を示し、この語は「メタペリオデート」の名
で文献にも見出される。
”水素化シアノホウ素”とは水素化シアノホウ素の水溶
液に存在するＣＮＢＨ−イオンを意味し、特にそのアル
カリ金属塩から得られる。
°゛抗体″とはすべての抗体又は抗体分画から選ばれる
タン・！り、すべての免疫グロブリン、免疫グロブリン
分画、又はこれらからその官能基（オシド構造を含む）
の一つを人工的に変性して得られるすべての分子であっ
てもよい。但し、この選ばれたタンパクが細胞（特にガ
ン細胞）表面上の抗原を選択的に認識し得るものでなけ
ればならない。
出発抗体はポリクローン又はモノクローンのもの、ある
いは天然のもの、又は生合成によるものであってもよく
、遺伝子型がこの目的に合うように変性された細胞から
得られるものが用いられる。
特定のヒト標的細胞に対して向けられたモノクローン抗
体の製造は文献上広く記載されており、その多くの抗体
は市場において入手し得る。
記号Ｐは」任意の抗体又は抗体フラグメント、任意の免
疫グロブリン又は免疫グロブリンフラグメント、又はそ
れらの官能基の変性により上記のものから誘導された分
子からなる群から選択されたタンパクを意味し、このよ
うにして選択されたタン・臂りが、その抗原を有する細
胞特に標的細胞の表面において、与えられた抗原を選択
的に認識し得る限シにおいて、上記タンパクを有する炭
水化物構造を含む。出発タンパクは、天然のものでも、
そのゼノタイゾがこの目的のために変性された細胞から
誘導された生物合成されたものでもよい。
記号ＧＰＩＲはＩＪ　ｇソームを不活性する糖タンパク
又はその分画を示す。この分画は発生源のＧＰＩＨの特
性であるリテソーム不活性化特性のすべて又は一部を保
持、する限り、出発物質として使用し得るが、特に天然
のＧＰＩＲが好ましい。
“ＧＰＩＲ−１ａ”は本発明で変性されたＧＰＩＲｌす
なわち、ＧＰＩＲの如＜す？ンームを不活性化する特性
を有する分子であるが、生体中の作用がＧＰＩＲより太
きいものであって、過ヨウ素酸塩等の酸化剤および水素
化シアノホウ素の水溶液でＧＰＩＲを水溶液中で処理し
たものである。
この操作（又は処理）は一般にｐ！（５〜７、温度０〜
１５℃、好ましくは暗所中でおこなわれ、反応は０．２
〜２４時間必要とする。
免疫毒素において、ＧＰＩＲ−１ａ部分は゛細胞障害サ
ブユニット”として表わされる。
記号Ａ−１ａは、遅延作用を有し、リヒンームを不活性
化する糖タンパクを示すが、この糖タンパクは、そのシ
スティン１７）および２５７．のチオール基の少なくと
も１つが任意に保護されているりシンのＡ鎖を過ヨード
酸アルカリ金属および水素化シアノホウ素の水溶液によ
り光の不存在下で０〜１５℃で０．２〜２４時間処理す
ることにより、また必要に応じて上記チオール基の脱保
護により得られる。
記号Ｐ′は、上記タン・母りＰ又はそれを化学的に変性
したものから誘導されたラジカルを表わし、そこからそ
れ自体の基の１つ又はそれ以上が除去され、また他の官
能基が任意に保護されているものである。
記号ＧＰＩＲ−１ａ’は上記タンパクＧＰＩＲ−１ａ又
はそれを化学的に変性したものから誘導されたものを表
わし、そこからそれ自体の基の１つ以上が除去され、他
の官能基が任意に保護されているものである。
記号Ａ−１ａ’は、そのシスティン１７１および２５７
のチオール基の少なくとも１つが除去された、タンパク
Ａ−１ａから誘導されたう・ゾカルを表わす。
記号Ｐ１は、上記タンパクＧＰＩＲ−１ａおよびＰの１
つを表わし、それは上記タンパクに直接又はスペース構
造を介して結合された遊離チオール基を有する。
記号Ｐ２は、タンノ母りＧＰＩＲ−１ａおよびＰのうち
の一方であるがＰｌとは異なるものであり、遊離チオー
ルと反応し得る１種以上の官能基を有するものである。
記号Ｐ１′はタンパクＰ１に属する基に結合したタンパ
クＰ１のラジカルを表わし、特に、（システィンの）　
ＳＨ基、（タンパクの末端位置又はリシンのイプシロン
位置にある）ＮＨ２基、（チロシンの）ＯＨ基、又は（
アルパルチン酸又はグルタミン酸の）ＣＯＯＨ基であり
、又はＰｌが抗体又は抗体フラグメントである場合にの
み、公知の方法によ！１７過ヨード酸との反応によシ炭
水化物構造の開始部から発生するタン／’ＰりＰｌのラ
ジカルである。
記号Ｐ２′は、特徴的官能基（タン・々りの末端位置に
あるか又はリシンのイプシロン位置にある）ＮＨ２、（
チロシンの）　ＯＨ又は（アスパラテン酸およびグルタ
ミン酸）のＣ０ＯＨに結合されたタンパクＰ２のラジカ
ルを表わす。
例えば、Ｐｌ、　−８Ｈは（抗体又は抗体フラグメント
Ｐ又はタンパクＧＰＩＲ−１ａであり得る）タンパクＰ
１を表わすが、このタン／ＪりＰｌは、システィンのＳ
Ｈ基が遊離しておシ、他の官能基は任意に保繰されてい
るものである。
同様に、Ｐｌ、−Ｃｏ−は、その末端カル？キシル基又
はそのグルタミン酸およびアスノＪ？ラチン酸のカル？
キシル基が、ＳＨ基を導入する基と結合されているタン
ノ２りＰｌを表わす。
Ｐ２．−ＮＨ−は（抗体又は抗体フラグメン）Ｐ又はタ
ンパクＧＰＩＲ−１ａであシ得る）タンパクＰ２を表わ
すが、とのタン・やりＰ２は、その末端アミノ基又はそ
のリシンのアミン基がタンパクＰ、のチオールと連結し
得る基に結合しているものである。
「不活性スペーシング構造」なる語は、このプロセスに
用いる反応体に対し不活性な２価の有機ラジカルを示し
、例えば１〜１５の炭素原子を有する直鎖又は側鎖アル
キレン基であり、１つ以上の二重結合を含んでもよく、
また酸素原子によって中断されていてもよく、あるいは
またメトキシ基、遊離の又はエステル化されたカルボキ
シル基、ジアルキルアミン基又はカルバメート基のよう
な１種以上の、不活性官能基によって置換されているも
のであってもよい。同じ語はまた、上でアルキレン基に
ついて示したように、１種以上の不活性官能基によって
置換され得る６〜１５の炭素原子を有するアリレン基を
も示す。
ここでＹおよびＹ′に関して用いられている「共有結合
し得る官能基」という表現は、共有結合を形成するため
にタンパクＰ１およびＰ２に属する基と反応し得るいか
なる基をも意味する。−ＣＯ−基および−（Ｃ＝ＮＨ）
−基は、タンパクの遊離アミン、チオールおよびフェノ
ール性水酸基と結合し得る適当な官能基である。同様に
、−■−基もタンパクの遊離カルボキシル基と結合し得
る適当な官能基である。−Ｎ−基は過ヨウ素酸イオンに
よる酸化のあとにタンパクＰ１およびＰ２の糖鎖の２つ
の炭素原子と結合し得る適当な官能基である。ただしそ
れは、ＰｌおよびＰ２が抗体または抗体断片である場合
に限る。
ここで２及び２′として示されている「蛋白質に属する
基」なる表現は、蛋白質Ｐ、及びＰ２を形成するアミノ
酸の特有な基から作られたラジカルを示す。例示すれば
、チロシンやセリンアミノ酸の水酸基から生ずる酸素原
子、アスパラギン酸やグルタミン酸の末端カルボキシル
や遊離カルがキシルから生じたカル？キシル基、蛋白質
の末端アミンから生じた一間一基（例えばリジン）ある
いはシスティンのチオールから生じた硫黄原子がある。
同様に、この表現は、過ヨウ素酸イオンの処理によシ、
蛋白質Ｐ１及びＰ２の炭水化物構造の一つを酸化した後
得られるジアルデヒド構造から生じた基を示す。しかし
、この場合、Ｐｌ及びＰ２は抗体断片である。
ここでＸで示される「活性ラジカル」なる用語は−５−
８−ブリッジに結合された基を示し、これは遊離チオー
ルと反応してＸ−８Ｈを解放した二硫化物を形成する。
適切な活性ラジカルはピリジン−２−イル及びピリジン
−４−イル基で、これらは置換されていないもの、ある
いは１又は２以上のハロゲノ又はアルキル基、カル？キ
シル基、アルコキシカルがニル基によって置換されたも
のである。フェニル基は置換されていないもの又は好ま
しくは１又は２以上のハロダン基又はニトロ基、アルコ
キシル基、カル？キシル基又はアルコキシルカルゲニル
基によって置換されたものである。
「アルキル」及び「アルコキシ」という用語は、５炭素
原子以下を含む基を示す。
「アルキレン」なる用語は、炭素原子１０以下を含む直
鎖又は分枝した飽和脂肪族基を示す。これらはｌ又は２
以上の不活性官能基（例えばアルコキシカルブニル基）
によって置換されたものでもよい。
す？ソームを不活性化し、過ヨウ素酸塩イオンで酸化す
るため、および還元するために好ましい出発物質として
用いられる糖タン・ぐりはすべてＧＰＩＲであり、たと
えばリシンＡ鎖はそれ自体、細胞に固着しないために細
胞毒性はほとんどないが、特定の細胞を認識し得る抗体
と結合したのちは、抗体が標的を認識するやいなやその
細胞に対して大きい細胞毒性を示すことになる。
代表的な出発化合物は、リシンのＡ鎖、ｒローエン及び
モモルディカカランティス（ＭＯＭ　）からの抽出操作
により得られた抽出物質である。
過ヨウ素酸イオンとの酸化に用いる出発物質として有用
な他のＧＰＩＲ類は、以下の通シである。
０デイアンテン３０　（Ｄｌａｎｔｈｉｎ　３０　）デ
ィアントクスカリョフィルス（ＤｉａｎｔｈｕｓＣａｒ
ｙｏｐｈｙｌｌｕｓ　）から ｏディアンチｙ　３２　（Ｄｉａｎｔｈｉｎ３２　）デ
ィアントウスカリョフイルス（ＤｉａｎｔｈｕｓＣａｒ
ｙｏｐｈｙｌｌｕｓ　）から ０アゲロステインＡ　（Ａｇｒｏ＠ｔｉｎＡ　）アグロ
ステーマジターコ”　（Ａｇｒｏｓｔｅｍｍａｇｉｔｈ
ａｇｏ　）から ＯアゲロスティンＢ　（Ａｇｒｏａｔｉｎ　Ｂ　）アグ
ロステーマジターゴ（Ａｇｒｏｓｔｅｍｍａｇｉｔｈａ
ｇｏ　）から ０アゲロステインＣ（Ａｇｒｏｓｔｉｎ　Ｃ）アグロス
テーマジターゴ（Ａｇｒｏｓｔｅｍｍａｇｉｔｈａｇｏ
　）から ＨＣＩ フラクレピタンス（Ｈｕｒａ　ｃｒｅｐｉｔａｎａ　）
から０アス／４’ラグスオフイチナリス阻害剤アスノク
ラグスオフイテナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓｏｆｆｉｃ
ｌｎａｌｉａ　）から この目的のために遺伝子凰を修飾した細胞で生合成的に
生産された同じ物質も、また適当な化合物である。
上記ＧＰＩＲ類のフラグメントは、もしそれらが元のＧ
ＰＩＲを特徴付ける不活性リコソームの全部または一部
の性質を保持しているとするならば、同様に出発物質と
して用いることができる。
リシンの天然のＡ鎖のうち、チオール基の少なくとも一
つが保護されているものは好ましい出発物質である。
リシンの純粋のＡ鎖の製造については、米国特許第４３
４０５３５号に記載されている。ｒローエン及びＭＯＭ
についても記載されている。
出発物質におけるチオール基の保護は、そのチオール基
が抗体との結合に用いられるものである場合にのみ必要
とされる。例えばチロシンのフェノール性水酸基のよう
な他の感応基が結合に用いられる場合には、前記の保護
は行なわれない。
保護のためのブロッキングは、ＳＨ基を、引続いて還元
反応またはチオール／フスルフィド変換反応で除去でき
るような官能基で置換することができるような試薬、例
えば２．２−ジニトロ−５，５−ジペンゾジ安息香酸（
ＤＴＮＢ　）、或いは３−（ピリジン−２−イルージス
ルファニル）フロピオン酸等との反応によって行なわれ
る。このような試薬が存在しない条件下では、Ａ鎖中の
遊離チオール基は酸化反応中に消失してしまい、たとえ
２−メルカプトエタノールのような還元剤との反応によ
っても全体的に再生することはできない。過剰のブロッ
ク剤は透析、その他の処理により除去する。
チオール基がブロッキングされたＧＰＩＲはついで過ヨ
ウ素酸塩イオンにより酸化反応および水素化シアノホウ
素イオンによるアルデヒド基の還元（その結果、第１ア
ルコールが形成される）がなされる。過ヨウ素酸による
酸化反応および上記還元反応はやや醇性のＰＨ５〜７、
好ましくは６〜６．５の酸性下で実施される。過ヨウ素
酸塩の添加前に水素化シアノホウ素と混合する。過ヨウ
素酸塩は過剰に用いる。より望ましくは、過ヨウ素酸ア
ルカリ金属塩の濃度が、酸化さるべきビシナルジオール
の濃度よりも高くなるようにする０例えば、細胞毒サブ
ユニット濃度１−１０−に対し、過ヨウ素酸ナトリウム
濃度はｌ０〜５０−が適している。水素化シアノホウ素
も酸化され得るビシナルジオールの濃度より大きい濃度
で用いることができる。すなわち、細胞毒サブユニット
濃度１〜１Ｏｒｎ９／１ｔｌに対し第１アミ７５０〜５
００ｍＭの濃度である。処理は０〜１５℃、好ましくは
１〜５℃の暗所において、０．２〜２４時間好ましくは
４〜２０時間おこなう。
反応終了後、過剰の過ヨウ素酸塩を消費する試薬、例え
ば過剰のエチレングリコールの添加によって除去し、副
生成物を透析により除去する。反応終了時に得られた生
成物は、通常の手法により単離する。
もし出発物質のチオール基がブロックされていれば、公
知の方法でブロッキングを解除する。例えば２−メルカ
プトエタノールのように、プロツりされる前のチオール
基を遊離させ得る還元剤と反応させればよい。これにエ
リ、す＆ソームラ不活性化する糖蛋白に新規な持続作用
が与えられ、これは抗体と結合して免疫毒素を得るため
に用いることができる。
リシンのＡ鎖の場合、この方法で得られる新しい分子（
以下記号Ａ−１ｍで表わす）は、次の主要な性質を有し
ている。
０分子量は、天然のＡ鎖の分子量とそれほど変らない。
ポリアクリルアミドによる電気泳動で観察する限り、こ
の修飾反応は極〈少量の蛋白質の重合体を生成するだけ
で、分解生成物は何等生じない。
０遊離チオール基の比率は、０．７／ｍｏｌエリも大き
いＯ ＯリシンのＡ鎖を基準とした兎抗体に対する免疫反応特
性は、天然のＡ鎖のそれと区別できない。
０無細胞系における蛋白合成の阻害活性は１等量の天然
人鎖で生じるものの５０チより大きい。
０最後に、兎に約ｏ、　４　ｍｙ／Ａｇ体重の投与量で
一回靜脈注射した後、静注後２４時間での血流中におけ
る長期作用型Ａ鎖（Ａ−１）の血漿レベルは、同一条件
で測定した天然Ａ−鎖の血漿レベルより１００〜３００
倍大きい。
上述の如くして得られたＧＰＩＲは公知の方法により抱
合体又は免疫毒素を製造するのに用いられる。
すなわち、免疫毒素（以下、ＩＴと呼ぶ）を、抗体又は
抗体分画（天然又は正しく変性されたもので、所定の標
的細胞に運ばれた抗原を選択的に認識する能力を有する
もの）と、す？ソームを不活性化する持続性糖タン・ぐ
りＧＰＩＲ（ＧＰＩＲ−１ａ）とを共有結合させること
にエリ得ることができる。２つのタンパクの結合はソス
ルフイド結合、又はチオエーテル結合を介して訃こなわ
れる。
抗体Ｐを長期活性グリコプロチーイン（これはリゼソー
ム、ＧＰＩＲ−Ｌｍを不活性とする）と結合させて形成
されたイムノトキシンは、次の統計的な式％式％ ここでビは蛋白質の基を示し、この蛋白質は抗体又は抗
体断片Ｐであり、あるいはこれらを適宜化学的に修正し
たものである。まな他の官能基は必要によりブロックさ
れており、ＧＰＩＲ−Ｌｍ’はＧＰ　Ｉ　Ｒ−ｔａやこ
れを適宜化学的に修正し九蛋白質のラジカルを示す。他
の官能基は必要によりブロック、され、Ｗはチオエチル
基又は二硫化基を含む２価の共有構造で、これらの基で
は硫黄原子はＰ及びＧＰＩＲ−ムのシスティンのそれで
あり、あるいはＰ及び／又はＧＰＩＲ−Ｌｈに属する上
記基に結合して官能基を持たせ念空間（ｓｐａｃｉｎｇ
）構造によって、Ｐ及び／又はＧＰＩＲ−ＡａＫ属する
基に結合している。
２つの蛋白質間のチオエーテル結合は、以下のタイプの
結合として理解される。
ここでｚ、Ｙ及びＥは以下に定義される。
この発明は、好ましくは下記の統計的な式で示すイムノ
トキシンに関する。
Ｐ’　−Ｗ’　−ＧＰＩＲ−ｔａ’　　　　　　（Ｉｆ
）ここで、Ｐ′及びＧＰＩＲ−Ａｈ’は、先に定義した
通りである。Ｖは以下（１）〜（ｄ）から選ばれ九共有
構造である。
（ｃ）　　　Ｚ−Ｙ−Ｅ−８−８−（Ｅ’　−Ｙ’　−
Ｚ’　）ｎ−（ｄ）　　　−（Ｚ’　−Ｙ’　−Ｅ’　
）ｎ−８−８−Ｅ−Ｙ−Ｚ−これらの式で、２及びＺ’
　（同じ又は異なるもの）は、蛋白質ＧＰＩＲ−ｔｌｌ
及びＰに属する基を示し、チロシン残滓（ｒｅｓｉｄｕ
ｅ３）の一つのヒドロキシルから生じる酸素原子、ＧＰ
ＩＲ−ｔａ及びＰのアスパラギン酸及び／又はグルタミ
ン酸の末端カルボキシル又は遊離カルボキシルの１つか
ら生じるカルブキシル基、ＧＰＩＲ−ｔａ及びＰの末端
アミンの１つ又はリジン残滓の１つのニブシロン位置の
アミンの１つから生じる一■−基から選ばれるものであ
り、更に上記共有構造（ｂ）及び（ｃ）中の２について
のみ、公知の方法でＰの炭水化物構造の一つを過ヨウ素
酸で酸化させ穴後得られるジアルデヒド構造から生じる
基である。
Ｙ及びＹ′は、蛋白質ＧＰＩＲ−２ａ及びｐｏｚ及び２
′基の任意の一つと共有結合可能な官能基を示す。
Ｅ及びＥ′は不活性空間構造を示し、ｎはＯ又は１であ
る。
イムノトキシンは上述の式！及び■によって簡単に表現
できる。しかし、複数の構造−Ｗ−又は−ＶがＧＰＩＲ
−ｔａの１つの同じ分子Ｐに結合される。
したがって、ＧＰＩＲ−１ｍが単一のＰに結合されたり
、又はその道となる。このブリッジの数は結合方法お工
びＰないしＧＰＩＲ−１ａに属する基の数に依存し、統
計的な式（１）　、　（ＩＩ）が下記式からなるこれら
の製品およびその混合物を表わす。
Ｐ’　（Ｖ　−ＧＰＩＲ−１ａ’　）ｍ（ここで、ｍは
整数又は１以上、１以下の混合数を示す） 例えば、リシン自体のサブユニットＡを抗体Ｐ（例えば
抗体Ｔ１ｏ１）に結合してイムノトキシンを形成する際
、２硫化基を持つ２価の共有構造を経て行なう場合（こ
こで２硫化基の一方の硫黄はりシンの長期活性Ａ鎖のシ
スティン２５７に属し、他方の硫黄はオキシプロピル基
によりて抗体Ｐのチロシンのフェノール酸素と結合して
いる。）、下記統計的な式を有する。
Ｐ’　（０−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ　−Ａ−ｔ
ａ’　）　ｔここでｔは結合中に含まれる抗体（例えば
抗体ＴＪ　□Ｊ　）中のチロシンの数を示す。
得られたイムノトキシンは、式■の生産物に対応してい
る。この式中、 Ｐ′は上述した通りであるが、とくに結合中に含まれて
いるチロシンのフェノール基を除去した抗体ＴＪ　０１
のラジカルである。
Ａ−Ｌｍ’はシスティン２５Ｆのチオール基を除去し次
ＩＪシンの長期活性Ａ鎖のラジカルである。
Ｗは下記の（、）基である。
−Ｚ−Ｙ−Ｅ−８−８−（Ｅ’　−Ｙ’　−Ｚ’　）ｎ
−ここで２は結合中に含まれるフェノールハイドロキシ
ルの酸素であり、Ｙは一〇〇−，Ｅは不活性空間構造−
ＣＨ２−ＣＨ２−、ｎは０である。
特に好適なイムノトキシンはりシンの長期活性サブユニ
ットＡと単一抗体Ｐとを含む１又は２以上の構造物によ
って形式され次もので、下式で示される。
Ｐ’　（Ｗ’　−Ａ−ｔａ’　）ｍ　　　　（Ｉｎ）こ
こで−Ｐ’　＊　Ｗ’及びＡ　−ｔａ’は上述した通り
である。
ｍは結合中に含まれる蛋白質Ｐに属する基の数を示す、
ｍの数は０．３〜１２、好ましくは０．５〜１０の範囲
で変化する。
「ｍの数は０．３〜１２、好ましくは０．５〜１０の範
囲で変化する。」とは、ｍの値は統計的な値であるとい
うことである。なぜなら、抗体分子の中では結合は均一
には生じないためである。従ってｍは整数ではない。
ｍの値はとくに使用される抗体にｚす、更には抗体の分
子量による。
従って断片Ｆａｂ又はＦａｂ’を最初の抗体Ｐとして使
用すると、ｍの値は０．３と約２の間で変化する。
断片Ｆ（ａｂ’）２を使用すると、ｍは０．５と約４の
間で変化する。　ＩｇＧタイプの抗体では、ｍは０．５
と約６との間で変化する。抗体ＩｇＭではｍは１と約１
２の間で変化する。
しかし、好ましくは抗体Ｐの置換の程度は、ｍが０．５
以上であり、１０を越えないのがよい。
一般に、上述の構造式Ｉ及び■は、簡略式に記載された
一般式を示す。
同様に以下の式■、■及び■はｎが１のときはいつも統
計的な式である。なぜなら結合反応体は蛋白質Ｐ１及び
Ｐ２中から選択され、これら蛋白質は全て抗体Ｐとして
上述の如く考慮されるものとしてまっ念く同じ性質を有
している。この場合蛋白質Ｐｌ及びＰ２は抗体Ｐ又は蛋
白質ＧＰＩＲ−４ａ自体であることを問わない。
この発明の他の態様としては抗体と、リケソーム不活性
化糖タンノ？りとの間にジスルフィド又はチオエーテル
型の共有結合を有する長期作用型免疫毒素の製造方法で
あって、糖タンパク（そのチオール基を適宜保護して）
を水素化シアノホウ素の存在下で過ヨウ素酸アルカリ金
属塩の水溶液で０〜１５℃で、光の不存在下で０．２〜
２４時間処理して得るようにしたことを特徴とする方法
を提供する。
本発明の好ましい態様は上記構造Ｉの免疫毒素の製造方
法であって、タンパクＰｌ　（リゼソーム不活性化長期
作用型糖タン・やり、ＧＰＩＲ−１ｍ又は抗体もしくは
抗体断片であって、遊離チオール基が直接又は介在原子
団を介して結合したもの）を水溶液中、室温でタンノ々
りＰ２（ＰＩ　と異なり、リゲソーム不活性化長期作用
型糖タン／ｌり、ＧＰＩＲ−１ｍ又は抗体もしくは抗体
断片であってタンパクＰ１の遊離チオール基と結合し得
る基を有するもの）と反応させ、チオエーテル又はジス
ルフィド結合を形成させることを特徴とする方法を提供
するものである。
本発明の特に好ましい態様は上記構造■の免疫毒素の製
造法であって、ｐ’、ｗ’およびＧＰＩＲ−１ａ’が上
記定義のものからなるもので、下記一般式のタン／９り
、すなわち一般式、 ｐ、　’　−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）ｎＳＨ（ＩＶ）のタンパク
を一般式、 ｐ　！／　−ｚｌ−ｙ／−ビーＧ　　　　　（Ｖ）のタ
ン／４りと反応させることを特徴とする免疫毒素の製造
方法、 （ｆｃだし、式中Ｐ１′お工びＰ２′はこれらタンノｔ
りに属する基に結合され次タンパクＰ、およびＰ２のラ
ジカル、又はＰｌおよびＰ８が抗体もしくは抗体断片で
あるときは過ヨウ素酸との反応に工り糖鎖核の開鎖によ
り生じたタンパクＰｌおよびＰ２Ｏう’）カル、　Ｚ　
、　Ｚ’、　Ｙ　＃　Ｙ’、　Ｅ　、　Ｅ’は前記同様
。
Ｇは （ｆｃだし、Ｘは活性化基）である） を提供するものである。
したがって上記ＰおよびＧＰＩＲ−１ｍは下記の基を適
宜含むタンパクである、 （１）結合に関与するチオール基又はその他の基。
（２）　　上記チオール基と反応しジスルフィド又はチ
オエステル結合を形成し得る１以上の官能基。
本発明に工れば上記チオール基および官能基は天然のタ
ン／９りＰ又はＧＰＩＲ−１ｍ、又はこれらを人工的に
導入したものである。
出発物質におけるチオール基の保護は、そのチオール基
が抗体との結合に用いられるものである場合にのみ必要
とされる。例えばチロシンのフェノール注水酸基のよう
な他の感応基が結合に用いられる場合には、前記の保護
は行なわれない。
保護のためのブロッキングは、ＳＨ基を、引続いて還元
反応ｔたはチオール／ジスルフィド変換反応で除去でき
るＬうな官能基で置換することができるような試薬、例
えば２，２−ジニトロ−５，５−ジペンゾジ安息香酸（
ＤＴＮＢ）、或いは３−（ピリジン−２−イルージスル
ファニル）テロピオン酸等との反応によって行なわれる
。このような試薬が存在しない条件下では、Ａ鎖中の遊
離チオール基は酸化反応および還元反応中に消失してし
まい、たとえ２−メルカプトエタノールのような還元剤
との反応によっても全体的に再生することはできない。
過剰のブロック剤は透析にエリ除去する。
チオール基がブロッキングされ、リデソームを不活性に
する糖タンパクはついで過ヨウ素酸塩イオンで酸化され
、ついで還元される。もし、細胞毒サブユニットがチオ
ール基を含１ない場合は、又はチオールが結合のために
使われないならば上記のブロッキングはおこなわれない
。
ＩＪ　＆ソームを不活性化する長期作用型糖蛋白から抱
合体、即ち免疫毒素を調製するには、米国特許第４３４
０５３５号に記載されている方法のなかから適当に選択
した方法を用いればよい。もし、選択し次細胞毒サブユ
ニットが、結合に適した少なくとも一つのチオール基を
天然に含んでいるならば、この基は活性化されたジスル
フィド基をもった抗体ま念は抗体フラグメントとの反応
に好適に用いられる。もし、選択した細胞毒サブユニッ
トが、結合に適したチオール基を天然には含んでいない
ならば、過ヨウ素酸イオンとの酸化処理の後、遊離チオ
ールをもつ九少なくとも一つの官能基を公知の何等かの
方法で人為的に前記サブユニットに導入し、上記の結合
反応を続行する。
前記官能基の導入は、過ヨウ素酸イオンとの酸化処理又
は還元の前におこりわれる。その場合、酸化および還元
の間、チオール基をブロックしておき、そののちにブロ
ックを解除する必要がある。
本−発明の方法において、ＧＰＩＲ−１ａと抗体（ま念
は抗体フラグメント）との化学的な結合は、結合体の二
つの成分（抗体およびＧＰＩＲ−１ｍ　）の夫々の生物
学的活性を保持し、満足すべき再現性および良好な収率
で結合体が得られ、また得られた結合体中におけるＧＰ
ＩＲ−１ａ　／抗体の比率制御を可能とすると共に、更
には安定且つ水溶性の生成物に導くような方法で行なう
ことができる。
これらの特徴に対応した方法の中で、二つの蛋白の間の
結合形成において、１または２以上のチオール基を含む
ものを優先すべきである。事実、これらのチオール基は
、ジスルフィド結合ま危はチオエーテル結合の形成に特
に適し、両者共に上記の一般的条件を満たす。
同時に免疫毒素の調製についても以下の特徴を有してい
る。
０１ＪシンのＡ鎖と抗体との間の共有結合は、ジスルフ
ィド基を含んでいる。
０ソスルフィド結合を形成している硫黄原子の一つは、
常に、リシンＡ鎖の２５７位置にでのシスティン残基に
属する硫黄原子である。
ｏｔ＋、リシンのＡ鎖を抗体に結合するリンクは、抗体
のＮＨ２側基またはペプチド鎖の末端基に結合しており
、抗体とりシンＡ鎖とのカップリングにより形成される
。これらについては、米国特許第４３４０５３５号に詳
細に記載されている。
同じ方法が、同様の特徴を有し、且つ抗体ｔたは抗体フ
ラグメントとＧＰＩＲ−１ｍとの結合で形成される免疫
毒素類の調製にも適用できる。
抗体または抗体フラグメントとＧＰＩＲ−１ａとの結合
、及び異なった官能基におけるジスルフィドまたはチオ
エーテル型の共有結合により形成される免疫毒素類の調
製について、以下に詳細に説明する。
一般的に、特に交叉結合の乱れを排除して蛋白間にうま
く結合反応を行なうためＫは、安定で且つ明確に定まっ
た共有結合が形成されるように、結合さるべき一方の蛋
白（一方のみ）は使用されるチオールまたはチオール基
だけを有し、他方の蛋白はｐＨ５〜９．３０℃を越えな
い温度の水性媒質中においてチオール類と反応し得る１
または２以上の基のみを有することが重要である。
以下に詳細に説明するように、蛋白Ｐ、およびＰ２の特
徴は出発物質として用いられる。Ｅの立体構造は、よシ
好ましい構造Ｒ−Ｒ，（これは実施例としてのみ与えら
れる）に置代えることができる。
■、タンノ臂りＰ。
このタンｉ４りは、どんな場合も結合に関与する１つか
１つ以上のチオール基を有しているので、生じる状況は
タン／’ＰりＰｌの性質に応じて異なる。
（Ａ）　　天然の状態でタンパクＰ１は、タン／４’り
Ｐ２との結合に関与する１つ以上のチオール基を有して
いる。このことは特に次のような場合に言える。
すなわち、タンパクＰ１が、ペグシンの存在下で抗体を
限定分解し、続いて高分子間のジスルフィド結合を還元
して通常得られるよりなＦ（ａｂ）’として知られる抗
体断片である場合である。このことは、タンパクＰ１が
リシンのＡ鎖またはＡ鎖の誘導体である場合にもあては
まる。この場合、天然リシンの１７１番目のシスティン
残基および２５７番目のシスティン残基に付いている少
なくとも１つのチオール基が未結合であって化学結合を
生じやすい。これらすべての場合において、天然のチオ
ール基を有するタンノ々りＰｌはこのような状態で結合
工程に使用される。
（Ｂ）　　天然の状態でタンパクＰ、は、タンパクＰ２
との結合に関与するチオール基を有していない。
このことは特に次のような場合に言える。すなわち、タ
ン・やりＰｌが天然の免疫グロブリンであって、抗体全
体か抗体の断片性に通常Ｆ（ａｂ）’またはＦ（ａｂ）
と呼ばれる断片の１つである場合。天然の状態でタンノ
４りＰ、が結合に関与する１つのチオール基を持たない
場合のいま１つの例は、このタンパクＰ１が、２つのシ
スティン残基それぞれがアルキル化により保護されてい
るか、または化学修飾を受けないリシンのＡ鎖である場
合である。全ての場合において、結合を可能にする１つ
以上のチオール基をそのような分子に導入することが妥
当といえる。
３つの型の反応がチオール基を導入するために好ましく
用いられる。
（１）最初の型の反応は、Ｓ−アセチルメルカプトコハ
ク酸無水物との反応でちる。この酸無水物は、タン・臂
りのアミノ基のアセチル化を可能にする。その後当該チ
オール基をヒドロキシアミンと反応させることによって
アセチル保護基を除くことができる。この方法はすでに
アーチーブズ・オプ・バイオケミストリー−アンド・パ
イオフイジクス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｅｓ）、１
１９．４ｌ−４９（１９６７）に記載されている。この
ように保護基が導入されたチオール基を続いて活性型ジ
スルフィド基と反応させる場合、ヒドロキシアミンによ
って前もって保護基をはずさなくて済む可能性がある。
事実、この発明の物質を形成する反応体を使ってジスル
フィド結合を形成する反応は、遊離チオール基を使った
場合と同様にＳ−アセチル基を使っても生じる。
文献に記載されている他の方法も、修飾されるタンノＪ
？りにチオール基を導入するために使うことができる。
（２）　　第２の型の反応はタンノ９りをカル−キシル
基を介して以下に示すジスルフィド構造を有する対称的
なジアミノ分子と反応させることである。
Ｈ２Ｎ−Ｒ１−８−Ｓ　−Ｒ１−正２ 上式中、Ｒ１は炭素数２から５の脂肪族原子団である。
この反応では、カルデジイミド特に１−エチル−３ジメ
チルアミノプロピル−３−カルデジイミドのような水溶
性の誘導体の如きカップリング剤の存在下でシスタミン
ＣＲ１＝−（ＣＨ２）　２−：）と反応させ、用いた化
学量論量に応じて次に示す誘導体の１つか双方の混合物
を形成させることが好ましい。
Ｒ１１−Ｃｏ−ＮＨ−Ｒ４−８−８−Ｒ１−ＮＨ２（Ｉ
ａ　）Ｒ４’−Ｃｏ−ＮＨ−Ｒ１−８−８−Ｒ１−ＮＨ
−Ｃｏ−Ｐ１’　　　　（Ｉｂ）この型の反応生成物は
次の２つの工程のいずれかに供される。
（、）　　式１ａｆたはＩｂにおいて、タン／４′りＰ
ｌがリシンのＡ鎖またはその誘導体の１種ならば、得ら
れた反応溶液は分別せずに２−メルカプトエタンールの
ような還元剤との反応に供せられる。それによって次式
の１椎類のタンパク誘導体が得られる。
Ｐ　’−ＣＯＮＨ−Ｒ１−８Ｈ こうして得られた生成物は続いて透析かダル濾過により
精製される。
（ｂ）　　式１ｍおよびｌｂにおいて、ラジカルＰ１′
が抗体またはその断片の１種から成る、タンパクＰのラ
ジカルならば、得られた反応溶液はそのままカップリン
グに用いられ、その場合チオール／ジスルフィド交換法
が用いられる。この交換法は、例えはギリランド（Ｇｉ
　ｌ　１　ｉ　１　ａｎｄ）とコリエール（Ｃｏｌｌｉ
ｅｒ）によってキャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲ
ｅｓａｒｃｈ）　、　４０　、３５６４　（１９８０）
に記載されている。
（３）第３の反応は、導入しようとするチオールを有す
るラジカルを固定するために糖鎖単位を使うことである
。この糖鎖単位は天然の状態で抗体に存在しているもの
である。続いてタンパクは、糖鎖単位にアルデヒド基を
生じさせるために過ヨウ素酸で酸化される。過剰のエチ
レングリコールを加えて反応を停止させ、副産物と過剰
の反応体を透析により除いた後、得られた生成物を次の
一般式を有対称なジアミノ分子で処理する。
Ｈ２Ｎ−Ｒ１−８−８−Ｒ４−ＮＨ２ 上式上式中上１素数２ないし５の脂肪族量である。
得られた付加生成物は、続いて金属水素化物（％には、
水素化ホウ素ナトリウム）との反応によシ第２または第
３アミンに還元される。この反応は水素化ホウ素ナトリ
ウムを用いて実施することが好ましく、用いた化学量論
量に応じて次式の誘導体の１方かその両方の混合物が形
成される。
Ｈ 得られた反応液を、Ｉｍまたはｌｂの構造式で表わされ
る生成物であってＰ１′が抗体または抗体断片であるも
のに関して上記したとおりの処理を行なってもよい。
チオール基を人工的に導入（対称なジアミノジスルフィ
ド反応体を使うタイ７″）するための上に述べた後二者
の反応において、タンノ４りＰｌは遊離ＳＨ基または遊
離アミノ基を持たないことが好ましいＯ ＧＰＩＲ−１ｍの場合には、Ｎ−エチルマレイミドまた
はヨード酢酸のようなチオール基に対する通常の試薬と
の反応によシ天然のＳＨ基をアルキル化し、およびミイ
ーンズ（ＭＥＡＮＳ　）およびフィーニー（ＦＥＥＮＥ
Ｙ）によってバイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔ
ｒｙ）７．２１９２（１９６８）に記載された還元的メ
チル化法に従って天然のＮＨ２基をメチル化することに
よシ常に遊離のチオール本を持たなくさせ得る。このよ
うにして天然リシンのＡ鎖に１モル当り６個までのメチ
ル基を導入することができる。このようにして修飾され
たタンパクには、生物学的な特性（特には、真核細胞の
ＩＪ　＆ソームにおけるタンノクク合成を阻害する能力
）が備わっている。抗体または抗体断片さらに第１群の
すべての物質の場合には、前記したようにそれらは天然
の遊離ＳＨ基を持たないので、還元的メチル化を例えば
ミーンズおよびフィーニーの方法により実施するほうが
よい。このようにして通常抗体１モル当り数十のメチル
基を導入することができる。その場合抗体の細胞表面上
の抗原を認識する能力を変化させない。
■　タンパクＰ２ あらゆる場合、このタンパクは、タンパクＰ１のチオー
ル基と反応してジスルフィドまたはチオエーテル結合を
形成し得る１つ以上の官能基を有するタンパクである。
これらの官能基は、常にタン／４りＰ２に人工的に導入
されるが、それがジスルフィド結合によりカップリング
されるのかチオエーテル結合によりカップリングされる
のかに応じて異なっている。具体的には以下に記載する
。
この場合、包合体の調部は以下の式で表わされる。
Ｐ、’−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）ｎ−８Ｈ＋Ｐ２’−Ｚ’−Ｙ’
−１４’−８−８−Ｘ　　→Ｒ’−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）　−
８−８−Ｌ’−Ｙ’−Ｚ’−Ｐ２’＋Ｘ−８Ｈ。
１　　　　　　　　　　　ｎ 活性イオウ原子により置換されるタンパクＰ２はタン・
ぐりＰ２または適切に保護されたタン・そりＰ２からそ
れ自体活性イオウ原子を有する試薬による置換により得
られる。これは次の式で示される。
Ｐ　＋Ｌ−Ｙ’−Ｒ−８−８−Ｘ　−＋　Ｐ２’−Ｚ／
−Ｙ’−Ｒ’−８−８−Ｘ上式中、Ｒ２は置換されるべ
きタンノ４りを示し、Ｌ−Ｙ’は試薬をタンパクに共有
結合させる基を示す。
官能基Ｌ−Ｙ’は、置換されるべきタンパクの構成アミ
ノ酸の側鎖に付いているいずれか１つの基と共有結合し
得る基である。これらの基の中で、特に次のものが選び
出せる。
（、）　　ペプチド鐸の末端アミノ基またはタンノぐり
に含まれるリシン残基のアミノ基。この場合、Ｌ−Ｙ’
は特に次のように表わせる。
・カルデジイミド、特に１−エチル−３−ジメチルアミ
ノプロピル−３−カルデジイミド、３−（２−ピリディ
ルジスルファニル）グロビオン酸（上記カルデジイミド
で活性化された）の如き水溶性誘導体のようなカップリ
ング剤の存在下でタンパクのアミン基と結合し得るカル
がキシル基。
・アミノ基と直接反応して、それをアシル化し得るカル
ボン酸塩化物。
・オルト−またはノぐラーニトロフェニルまたは一ジニ
トロフェニルエステル、’！たはＮ−ヒドロキシコハク
酸イミドエステル（たとえばＮ−スクシンイミディル−
３−（２−ｆリゾイル−ジチオ）プロピオネート）のよ
うないわゆる「活性型」エステル。これはアミノ基と直
接反応して、それをアシル化し得る。
・コハク酸無水物のようなジカルデン酸の内部無水物。
これはアミノ基と自然に反応して、アミド結合を形成さ
せる。または ・イミドエステル基 上式中、Ｒ２はアルキル基で、次式のようにタンパクＰ
２のアミノ基と反応する。
上式中、Ｒ３は−Ｒ−８−８Ｘ基を示す。
（ｂ）　　タンパクに含まれるチロシン残基のフェノー
ル基。この場合、Ｌ−Ｙ’は特にイミダゾール−１−イ
ルカルゲニル基を示すことがある。それは次の式に従っ
てタンパクりのフェノール基と反応する。
上式中、Ｌがイミダゾール−１−イルで、Ｙ′がＣＯ基
で、Ｒ４が−Ｒ−８−８−Ｘ基である。−５−ｓ−ｘは
遊離チオール基と反応し得る活性型ジスルフィドを示す
。特に、このジスルフィドにおいて、Ｘは１つ以上のア
ルキル、ハロダンまたはカルボキシ基で置換されている
ことのあるピリジン−２−”イルまたはピリジン−４−
イル基を指すことがある。
Ｘもまた１つ以上のフェニル基またはカルブキシル基で
好ましくは置換されているフェノール基を指すことがあ
る。またはＸはメトキシカルボニル基のようなアルコキ
シカルボニル基を指すこともある。
Ｒ基は、置換基ＹおよびＳ−５−Ｘを同時に結合し得る
介在分子（前式中のＥのような）を示す。それは、後の
反応において、使用される反応物質と合成される生成物
を妨害するような基を含まないようなものでなければな
ら々い。特に、Ｒ基は−（ＣＨ２）−でもあシ得（ｎは
１ないし１０）、また次の基でもあり得る。
Ｒ−ＣＨ−ＣＨ−Ｒ６ 上式中、Ｒ６は水素または炭素数１々いし８のアルキル
基を指し、Ｒ５は続いて使われる次式のカルカルバメイ
ト基のような反応体に不活性な置換基を指す。
上式中、Ｒ７は炭素数１から５の直鎖または分枝アルキ
ル基、特に第３ブチル基を示す。化合物Ｌ−Ｙ’−Ｒ−
８−８−ＸとタンパクＰ２　との反応は均質な液相、最
も一般的には水または緩衝液中で進行する。
反応体の溶解性を高めるためには、水に可溶性の有機溶
媒を反応溶液に加えることができる。その最終濃度を、
第３ブタノールのような第３アルコールの場合には容量
比で２０％までにすることができ、ジメチルホルムアミ
ドまたはテトラヒドロフランの場合には容量比で１０チ
までにすることができる。
反応を、室温にて数分から数時間の時間をかけて実施す
る。その後、低分子量の生成物および特には過剰の反応
体を透析またはグル濾過によって除去することができる
。この方法により、タン・臂り１モルあたシ１ないし１
５の置換基を導入することが可能となる。そのような化
合物を用いる場合、タンパクＰ１とのカップリングは、
ｐＨ６から８の溶液中にて３０℃を越えない温度で、１
時間から２４時間かけておこなう。低分子量の生成物を
除くために適宜、得られた水溶液を透析する。ついで包
合体を既知の方法の変法によシ精裂できる。
この場合、包合体をＰ、’−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）ｎ−８Ｈと
前もって１つ以上のマレイミド基を導入しておいたタン
パクＰ２とを反応させることにより調製する。１例とし
て、反応を次の式で示す。
上式中、Ｒ８は炭素数１ないし１５の脂肪族または芳香
族介在分子を示す。それは、続いて使用される反応体に
対して不活性である。２′は、結合に関与するタンパク
Ｐ２の官能基の種類に従って変化し得る基を示す。すな
わち、２′は、酸素（チロシン残基（チロシル基）のフ
ェノール基のエステルの場合）、ＮＨ（タンノ母りのア
ミノ基と活性型カルブキシル基のカップリングの場合）
またはＮＨ−ＣＨ２（タンノぐりのアミン基とクロロメ
チルケトンの場合）である。
マレイミドで置換されたタンパクＰ２は、それ自体マレ
イミド基を有する試薬によってタンパクの適当な基を置
換することによって、タンパクＰ２自体からまたは適当
に保護されたタンパクＰ２がら得られる。これらに適し
た基のうち、特に次のものが選ばれる。
ａ）ペプチド鎖の末端アミノ基またはタンパクに含まれ
るリシン残基（リシル基）の側鎖アミノ基。
この場合、マレイミド基を有する試薬は次のようなもの
がある。
ア）次の一般式の試薬 上式中、Ｌ−Ｃｏ−は次のとおシである。
・カルブキシル基。その場合、カルがジイミドのような
カップリング剤および特には１−エチル−３−ジメチル
アミノプロピル−３−カルがジイミドのような水溶性誘
導体の存在下でカルブキシル基を活性化したのち、反応
が進行する。
・またはオルト−若しくはパラ−ニトロフェニルまたは
ジニトロフェニルエステルまたはＮ−ヒドロキシコハク
酸イミドエステル。
これは直接アミノ基と反応し、それをアシル化する。こ
のような試薬の調製は、特にヘルペティカ嶺ケミカ拳ア
クタ（Ｈｅｌｖｅｔｉｅａ　ＣｈｉｍｉｃａＡｅｔａ）
、５８，５３１−５４１（１９７５）Ｉｃ記載されてい
る。同じようなりラスの他の薬剤は市販品として手に入
る。
ィ）次の一般式の試薬 υ これは次の反応式に従ってタンパクＰ２のアミン基と反
応し得る。
ｂ）　　タンノ２りに含まれるチロシン残基のフェノー
ル基。この場合、マレイミド基を有する試薬は次の一般
式で示される。
これは次の反応式に従ってタンパクのフェノール基と反
応する。
マレイミドを有する試薬とタンパクＰ２との反応は均質
な液相、最も一般的には水または緩衝液中で進行する。
反応体の溶解性を高めるには、水に可溶性の有機溶媒を
反応溶液に加えることができる。
その最終濃度を、第３ブタノールのような第３アルコー
ルの場合には容量比で２０チまでにすることができ、ジ
メチルホルムアミドまたはテトラヒドロフランの場合に
は容量比で１０％までにすることができる。反応は室温
にて数分から数時間かけておこなう。
そののち、低分子量生成物、特に過剰の反応物を透析、
又はダル濾過によシ取シ除く。
この方法によυ、通常、タン／４’り１モル当り１〜１
３の置換基を導入することができる。
こΩような化合物を用いる場合、タンノ４り質Ｐとのカ
ップリングは、２つのタンｉＪ？り質ヲＰ）（６〜８の
水溶液中に３０℃以下の温度で１ないし２４時間かけて
溶解することによっておこなう。得られた溶液を、所望
に応じて透析して低分子量生成物を除去し、抱合体を種
々の既知の手法によって精琴する。
一式 （ここで、ＥおよびＧは上記の通り）で示される化１合
物は、式 ％式％ （ここで、ＧおよびＥは上記の通シ）で示される化合物
を、有機溶媒中１０ないし４０℃の温度で、式 で示されるカルブニルジイミダゾールと反応させること
によって得られる。
弐■の化合物は、タンパク質ＧＰＩＲ−１ａおよびＰの
チロシンの水酸基とのカップリング用試薬として特に有
用である。
この発明は、また、統計式 ％式％ ＧＰＩＲ−１ａ’は、タンパク質ＧＰＩＲ−１ａの残基
もしくはその官能基のいずれか１つを修飾することによ
ってＧＰＩＲ−１ａから誘導された分子であつて、チロ
シンのフェノール水酸基が１つ以上除去されているもの
を表し、 酸素原子は、残基ＧｐＩＲ−１ａ″から離脱した上記フ
ェノール水酸基に属するものを表し、およびＥおよびＧ
は上記の通りである）で示される新規生成物にも関する
。
特に好ましい化合物は、式■で示される化合物であって
Ｅが、基−→ＣＨ，−）−−（ここで、ｐは２ないし７
の整数）または基 　ＣＨ− ＣＨ２Ｃ０ＯＨ であり、かつＧが式−８−８−Ｘ　（ここで、Ｘは、１
つ以上ノハロｒン、アルキル基、カルブキシル基、アル
コキシカルボニル基、１つ以上のノーログン、ニトロ、
アルコキシ、カルボキシ４Ｌ＜ｔｄアルコキシカルボニ
ルで置換されもしくは置換されていないフェニル基もし
くはアルコキシカルボニル基でそれぞれ置換されまたは
置換されていないピリジン−２−イルおよびピリジン−
４−イルよシなる群の中から選ばれた活性基であるもの
である。
式■の生成物は、式 ＧＰＩＲ−１ａ”−０Ｈ （ここで、ＧＰＩＲ−１ａ’は上記の通り、および水酸
基は残基ＧＰＩＲ−１ｍ″のチロシンから脱離するフェ
ノール水酸基である）で示される化合物を、場合に応じ
て水混和性有機溶媒（例えばジオキサンやテトラヒドロ
フランのようなエーテル系溶媒）を含有する水系溶媒中
、１０ないし４０℃の温度で、弐■の化合物と反応させ
ることによって得られる。
にｐＩＲ−１ｍかりシンの長期作用型Ａ鎖である場合、
得られた免疫毒素ＩＴ（Ａ−１ａ）の性質は以下の通り
である。
（１）　　抗体１モル当りの修飾人類のモル数で表現さ
れる平均カップリング度は、通常、０．５ないし５であ
り、特に工ないし３である。
（２）　　ポリアクリルアミドダル電気泳動法によって
ＩＴ（Ａ−１ａ）を分離すると、抗体の分子量とは３０
０００ダルトンづつ連続的に異なる分子量を有する生成
物に相当する一連のノ々ンドに分れる。
（３）　　サイトフルオロメトリーによって、抗体は活
性化およびカップリング反応中にどのような実質的な劣
化をも受けてい々いことおよび抱合体自体の内部におい
てそれが指向された抗原をなお認識し得ることが示され
得る。
（４）修飾され抗体とカップリングしたＡ鎖の、タンノ
々り質合成に対する阻害活性は、２−メルカグトエタノ
ールの存在下において無細胞モデルで測定すると、全体
的に保持されている。
免疫毒素ＩＴ（Ａ−１ａ）の細胞毒性活性は、活性化剤
の存在下において標的抗原を有する細胞について細胞モ
デル中でのタン・やり合成試験で測定したとき、標的抗
原を持たない細胞について同一条件でおこなったときよ
りも１００倍以上大きい。
例えば、ジス・ルフィド架橋を含む結合によってリシン
の修飾Ａ鎖を、ある種のマウお白血病細胞表面に存在す
る抗原’ｒｈｙ　１．２に指向される単一クローン抗体
（抗体ＡＴ１５Ｂで表示）とカップリングして得た免疫
毒素（ＩＴ（Ａ−１ａ）で表示）は、陰性’ｒｈｙ　１
．２細胞に対してよりも約１０００倍、陽性’ｒｈｙ　
１．２細胞に対して細胞毒性である。さらに、ＩＴ（Ａ
ｌａ）ＡＴＬ５Ｅの活性は同じ抗体ＡＴ１５Ｅおよびそ
の天然類から得られるＩＴによるものと同様である。
Ａ鎖として換算してＩＴ（Ａ−１ｍ）をウサギに０、４
　ｍ９７に９体重のオーダーで血管内投与した後、投与
から２４時間後の血液流に存在するＩＴ（Ａ−１ｍ）の
血漿中レベルは、同一条件で測定した通常のＩＴの血漿
中レベルよりも５０ないし１００倍高い。かくして、ウ
サギが関与する典型的な例において、投与２４時間後の
血液流中−の１．Ｔ（Ａ−１ａ）ＡＴ１５Ｅの血漿中レ
ベルは、時間Ｏのときに存在するレベルの９％であり、
同一時間における通常のＩＴ　ＡＴ１５ｇの場合の０，
０８％と比べて、１１０倍であることがわかる。
これによって、薬理的性質に関して新たな性質が付与さ
れた修飾免疫毒素が得られるのである。
さらに詳細には、細胞毒性サブユニット−を適当に修飾
することによって、免疫毒素の特異的細胞毒性に、これ
を阻害することなく、新たな固有の性質すなわち高等動
物又はヒトに注射したのち、遅延された血漿中における
消失キネティックを示す能力を付与できるのである。
リシンおよび抗体−リシン抱合体、さらに抗体−リシン
抱合体人鎖の薬理学的特性を改良する方法として以下の
文献が知られている。
（１）　　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９８５）。
１４７　、１９８−２０６　： （２）　　Ｂｉｏｃｈｅｍｌｃｍ　ＢｉｏｐｈｙｓＩｃ
ａ　Ａｃｔｓ　（１９８５）、　８４２゜１２−２１　
； （３）　　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｌｖｅｒｇ
　（１９８５）＋　３．１９１−１９８゜しかし、これ
ら公知のものは以下に説明する如く本発明のものと較べ
て劣るものである。
（４）方法論的考察 上記公知の方法において、リシン、抗体−リシン抱合体
、抗体−リシン抱合体人鎖の生体中における消失速度を
遅らす方法はｐＨ３，５で、メタ過ヨウ素酸塩と水素化
シアノホウ素ナトリウムとの混合物で全リシン前のオシ
ド単位を短時間（最大１時間）で変性することからなる
。したがって、以下の点で異なる。
（１）変性（又は修飾）はりシンの精製され九人鎖の分
子のみに対しておこなわれる。
（２）反応声は非常に高く中性に近い。
（３）　　処理の最適時間は可成υ長く４〜２０時間で
ある。
上記文献の方法は精製リシンのＡ鎖に直接適用され、そ
の結果、急速かつ非可逆的にほぼ完全に変質し、後の使
用に好ましくない、したがりて上記文献の方法はりシン
人鎖の分子に直接適用されないため、本発明のＡ鎖の修
飾方式と全く異なる。
（Ｂ）　　結果について： （、）　　修飾リシンの特性 上記文献による方法で得たりラットクシ／は以下の特性
を有する。
培養細胞に対する修飾リシンの試験管内での生物学的特
性、即ち細胞毒の能力は処理によシタ０チ程度まで失わ
れる。
マウスおよびラットに対して変性リシンをテストしたと
ころ全体的毒性は逆に３〜４倍増大する。
これら２つの特性は抗体とりシンのそのような結合の仕
方によって得られる抱合体のためであシ、免疫毒素で期
待されるものと逆である。即ち、標的細胞に対して最大
の細胞毒性を示し、他においては毒性が最低と々らなけ
ればならない。
リシンの肝細胞の摂取（血流中からの消失の最大原因）
は変性の結果、因数２はど減少した。これはりシンが変
性されな−い場合に対して２．３倍血漿中濃度が増大し
たにすぎない。
又、オシド単位の変性によシ得られるリシンの肝細胞の
摂取の抑止度は過剰のオバルプミンとともに天然リシン
を投与した場合より小さい。このようなことから上記文
献の方法は肝細胞の摂取の原因となるリシンの糖を完全
に破壊させるのには不適当である。
（ｂ）　　変性リシンから得られるＡ鎖免疫毒素の生物
学的特性。
上記文献においては変性リシンを精製したりシン人鎖を
用いて免疫毒素を得ている。この変性リシンは天然リシ
ンを過ヨウ素酸ナトリウムおよび水素化シアノホウ素ナ
トリウムでｐＨ３，５で６０分間処理している。この条
件はりシンの血漿レート（ｒａｔｓ　）の増大と生物学
的活性の減少との妥協である（この条件では血漿レード
はファクター２〜２．３で増大し、活性はファクター４
．７で減少する）。
この変性リシンからのＡ鎖はジスルフィドブリッジを介
してガン細胞用抗体に結合される。この免疫毒素の生物
学的特性はこれら文献によると可成シ小さい。標的細胞
に対するこの抱合体の細胞毒性は天然のりシン人鎖によ
る同じ抱合体よシもファクタ−３〜４程度小さい。この
ことは上記文献にょろりシンの処理はりシンの生物学的
活性を著しく損い、さらにその人類により得られる免疫
毒素の特性を著しく損うことになる。
しかるに、本発明による得られるＡ−１ａ鎖でつくられ
る免疫毒素は標的細胞に対する細胞毒性は天然リシンの
Ａ鎖で得られる免疫毒素と同等である。
（ｃ）変性リシンからのＡ鎖およびこれに対応する免疫
毒素の薬理運動学的特性 上記文献によればその方法で得られる変性リシンからの
Ａ鎖を用いて得られる免疫毒素は血中消失速度が遅く、
薬理運動学的特性が改良されるとしている。しかし、実
験によシそのことが十分に証明されていない。
これは以下の理由から明らかである。
まず、その薬理運動学的結果は全体的毒性（リシンおよ
び変性リシン）によるものであシ、対応するＡ鎖による
もので逢い。リシントクシンはＢ鏡上のオリゴ糖単位を
含んでいる。これらオシド単位はすべて末端マンノース
を有するため、認識能力を有するリセグターを有する柔
細胞によシ認識され易い。実際上、リシン消失に関与す
るオシド単位がＡ鎖によるものか、Ｂ鎖によるものか双
方によるものかの判定は困難である。したがりてＡ鎖の
急速消失の原因となるオシド単位がリシンの消失に関与
するものと同じか否かは知シ得ない。
したがって、上記文献でのりシンの肝細胞摂取抑制は全
リシンに対して得九人鎖のオシド単位の変性を意味する
ものでなく、一部修飾されたものに過ぎない。
本発明者は上記文献の方法で変性したりシンから分離し
たＡ鎖および対応する免疫毒素の薬理運動学的特性をテ
ストした。このテストにおいてリシンの変性（１）、Ａ
鎖の分離（２）およびＡ鎖と抗体との結合（３）は上記
文献に忠実に従った。その結果を比較として本発明によ
るＡ−１ａ鎖および天然Ａ鎖とともに表１に示す。
表　■ この結果から変性リシンのＡ鎖は遊離チオール基および
分子量についてはＡ−１ａ鎖のものと同等であるが、以
下の生物学的特性においては著しく異なるものであった
。
（１）固有的生物学的活性であるタン・臂り合成能は変
性リシンからのＡ鎖についてはファクター１０はど減少
したが、Ａ−１ａ鎖ではほとんど変らない。
（２）注射後２４時間目の血漿濃度は変性リシンからの
Ａ鎖よりもＡ−１ａ鎖のものは１２５倍大きい。変性リ
シンからのＡ鎖のものは天然Ａ鎖のものに比較してファ
クター２．６だけ改良されたにすぎない。
この変性リシンからのＡ鎖でつくられた免疫毒素の生物
学的活性について、表■に天然Ａ鎖および本発明のＡ−
１ａ鎖による免疫毒素の場合と比較して示す。
表　　■ この結果から、 （１）変性リシンからのＡ鎖による免疫毒素の生体中残
留能はＡ−１ａ鎖によるものより著しく小さい。注射２
４時間後の場合はその差はファクター１５に等しい。
（２）変性リシンからのＡ鎖の免疫毒素の標的細胞に対
する細胞毒性は天然Ａ鎖又はＡ−１ｍによるものより２
０分の１程度である。
上記テスト結果からも本発明のＡ−１ａ鎖による改良お
よびその免疫毒素の効果は上記文献からは到底予想し得
ないものであることが理解されよう。
以下、本発明の実施例を示す。
実施例　１ この実施例は過ヨウ素酸ナトリウムおよび水素化シアノ
ホウ素ナトリウムで修飾したりシン人鎖を静脈注射した
場合の消失の遅延性を証明するためのものである。
リシン人鎖を米国特許Ａ４，３４０，５３５に記載され
ている方法で製造、精製した。２．２′−ジニトｏ　−
ｓ、ｓ′−シーｙ−第２安息香酸（ＤＴＮＢ）　（Ｄ溶
液２０当量、すなわち、ｐＨ７の１２５　ｍＭ　ＩＪン
酸塩緩衝液に溶かしたＤＴＮＢの溶液、（この溶液は水
酸化ナトリウムでＰＨＨ２Ｏ調節した）を、１２５ｍＭ
のＰＢＳ緩衝液に溶かした６４似の割合で含むり／ン人
鎖（チオール基金人鎖１モル当ｊ）０．８１含む）２０
属溶液に加えた。培養は２０℃で２０分間続けた。この
溶液を４℃でＰＢＳ緩衝緩衝液酸塩については２０　ｍ
Ｍ　、　ＮａＣ２については１５０ｍＭのＰＨＨ２Ｏ緩
衝液を用いて透析し、１０．０００Ｘ、９．３０分の遠
心分離ののち、チオール基をブロッキングしたＡ鎖を１
０７ｒｎ９を５．５乎包の割合で含む溶液として得た。
この処理はすべて４℃でおこなった。ｆｌ、　２　Ｍ　
。
ｐＨ６，５の酢酸塩緩衝液１９Ｍをチオール基ブロッキ
ング済みＡ鎖１９．５ｍｉ含む溶液１０７ｇに加えた。
この溶液を０．２　Ｍ　、　ｐＨ３，５の酢酸塩緩衝液
でｐＨ６，５に調整した。つぎに、水素化シアノホウ素
ナトリウムを１６０ｍＭ含む溶液をｐＨ６，５の酢酸塩
を用いてつくった。他方、ｐＨ６，５の酢酸塩を用いて
、８０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム溶液をつくり、これ
を暗所にて保存した。ついで、暗所にてこの過ヨウ素酸
ナトリウム溶液１９ゴを水素化シアノホウ素ナトリウム
溶液１９ｄと混合し、さらに１０分後暗所にて上記入鎖
溶液３８Ｍを加えた。
培養は暗所で４℃で１７時間おこなった。酸化反応停止
はエチレングリコールの２０　％　（ｖ／ｖ）水溶液（
酢酸塩緩衝液０．２Ｍ、ＰＨ６，５）　２．７ｍｌを加
えること【よりおこなった。４℃、２０時間の培養後、
反応媒体を４℃で４８時間ＰＢＳ緩衝液（ｊＯｍＭ　、
　ｐＨ７，８）で透析した。これを３０分間、１０．０
００ＸＧで遠心分離し除去し、チオール基がブロッキン
グされオシド残渣が酸化、還元で変性されたＡ＠’に０
．８２Ｉｎ９７ｔＩＬｌの濃度で７４ｔｒｔｌ得た。
オシド単位を変性し、ブロッキングされ１Ａ−１ａ鎖Ｏ
Ｏ，８２ｍ９Ａｎｌ溶液７４ｍ１を濃縮により１６．８
’ｄに戻し、５０％の２−メルカプトエタノール０．４
０６ｄを加えた。培養を２０℃で１時間おこない！つい
でこの溶液を４℃でＰＢＳ緩衝液を用いて透析した。そ
の結果修飾きれたＡ−１ｍ鎖１２．ａ７ゆｊの濃度で４
５■得た。
ＤＴＮＢ法（Ｆ：ｎｘｙｍｏｌｏｇｙ　、　１９７２　
、２５　、４５７Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）を用
い、この修飾されたＡ鎖が１モル当り０．７０の遊離チ
オール基を有することが判明した。この修飾Ａ鎖の分子
量はげデ／ルサルフェートの存在下でのポリアクリルア
ミド勾配電気泳動により３０，０００±３，０００であ
ることか判明した。
この得られたＡ−１ａ鎖を、タンパク質合成の抑止にお
ける酵素活性および薬理学的特性について研究した。
測定 リシン人鎖の基本的生物学的特性はリボンーマルサブユ
ニット６０Ｓの劣化によりタンパク合成を抑制すること
である。
試験管内プロトコールにおいて、人工的メクセン−）ヤ
ーＲＮＡ−１なわちポリウリディリル酸の存在下で　Ｃ
−フェニルアラニンを導入し得るラットの肝そうの適当
に補足したサブセル分画を用いる。
サブセル分画の製法および１４Ｃ−フェニルアラニンの
導入の測定法は文献”　ＨｉｏｃｈｅｍｉｃａＢｉｏｐ
ｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　１９７３．３１２．６０８−
６１５に従い、ラットの肝細胞のミクロンーム分画およ
びサイドシル分画を用いておこなった。
Ａ鎖を含むサンプルを、０．２％２−メルカプトエタノ
ールおよびウシ血清アルブミン１５μに包を含むＰＨ７
，６の５０ｍＭトリスＨＣ１緩衝液中に希釈させた溶液
の形で用いた。
データは抑止剤なしの参照媒体との関連において、す／
ン人鎖を含む各反応媒体におけるタンパク中への１４Ｃ
−７エニルアラニンの導入の抑止率で計算した。
得られた曲線からＡ鎖（天然又は変性）のＩＣ５゜の濃
度（放射能マーク付き先駆物質の導入を抑制する）を計
算することができる。すなわち、１．２×１０１０モル
／ｌに相当するＩＣを変性、ブロッキングＡ−１ｍ鎖に
ついて調べた。参照鏡のＩＣ５ｏは１０１０モル／ｌで
ある。測定誤差を考えると、変性によるＡ鎖の活性損失
は認められなかった。
Ｃ多糖単位を変性した持続性Ａ鎖（Ａ鎖）の薬理効果 この天然又は変性Ａ鎖をラビットに耳を介して静脈投与
した。この人類投与量は０．４１５Ｉｎｇ／ｋｆであり
た。血液サンプルをへ７４　リン上に間隔をおいて採取
した。この血漿を下記にＲＩＭ　−１の記号で示したラ
ジオイムノアッセイテストで分析した。
この方法はＡ鎖を修飾することなしに判定し得る利点全
有する。この判定をマイクロ滴定プレート（たとえば、
ＮＵＮＣ−ＴＳＰＳタスクリーニングテム。
Ｐｏ１ｙ　Ｌａｂｏ’　Ｂｌｏｃｋ製）ｔｌ−用いてお
こなった。このプレートの蓋体には過吸収剤ス・ｆイク
が設けられていて、これがペース中の穴に浸入するよう
になっている。これらのスｔ４イクは固体相からなるも
のである。リシンのＡ鎖を示し、親和性クロマトグラフ
ィで精製された雌羊抗体（以下にｋｃｌの記号で示す）
をこの固体相上に吸収させた。この目的のため、ＰＢＳ
緩衝液中に１０μｂ旬含むＡｅ　１の溶液を上記穴に分
けて注入した。上記ス／ｆイク１に４℃で２４時間、Ａ
Ｃ１溶液と最初に接触させ、ついで２０℃で３時間、胎
児ウシ血清と接触させ、全ての固定部位を飽和させた。
この飽和した免疫吸収剤を２０℃、３時間、種々の濃度
の血漿サンプル、又は既知の濃度のＡ鎖溶液と接触させ
、目盛曲線を作成した。ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、この免
疫吸収剤をリシン人鎖を示す雌羊抗体（親和クロマトグ
ラフィで精製し、放射能ラベルを施したもの、以下Ａｅ
　２と記す）と２０℃で２時間接触させた。このＡｃ　
２の放射能ラベルはクロラミンＴの存在下でヨウ素１２
５を用い、ＧｒｅｅｎｗｏｏｄおよびＨｕｎｔｅｒの方
法（Ｂｉｏｅｈｅｍ、　Ｊ、、　１’９６３　、８９　
、１１４）でおこなった。このラベルしたＡＣ３抗体は
５〜１０マイクロキューリー／μ、Ｖｆｔ、示した。こ
のラベル化Ａｃ２１０ｅｐｍを２００μｔとして、０．
１チウ７血清アルブミンを含むＰＢＳ緩衝液中に導入し
た。
ＰＢＳ緩衝液中で洗浄ののち、上ス・母イクを取りはず
し、結合したＡｃ　２の量を放射能測定によシ計量した
。サンプル中のＡ鎖の濃度は、異なる既知の濃度でＡ鎖
を導入することによって作られた目盛曲線に対して参照
することにより測定した。持続性Ａ鎖を動物に注射した
際、同じＡ鎖を用い相当する目盛曲線を作成した。
この方法で測定された血漿中のＡ鎖の濃度は再現性があ
り、信頼できるものである。この探矧し゛きい値はｌ　
（１ｇ／ｍｌである。各実験間の再現性の検討の結果、
変化関数が１〜２００　ｎｇ７ｒｎｌの濃度について１
０％以下であった。
これらの実験の結果は曲線で示され、時間は横軸に、零
時の血漿濃度理論値に対する記録された生成物の血漿濃
度の％’ｉｉｌｏｇスケールで縦軸に示した。この値、
すなわち、“相対血漿濃度”　（ＲＰＣ）は下記の式で
計算される。
注射！−／血漿量 血漿量は動物の体重のｌ　ｋｙ当り３６Ｍで考えられて
いる。
第１図は天然リシン人鎖および変性Ａ−１ａ鎖を静脈注
射した場合の血漿における消失曲線を時間の関数として
示したものである。この曲線（１）は２つの相を示して
いる。第１にこの天然リシン人鎖を注射後３時間で血漿
中に残る率はわずか０．１％（投与量に対して）であり
、血液から急激に消失することを示している。第２の相
においてはこの消失がよりゆるやかである。
しかし、オンド単位を変性したＡ鎖（Ａ−１ａ鎖、曲線
２）においては、この消失性は著るしく改められる。す
なわち、Ａ鎖製品の大部分が消失するもととなる第１の
消失相は著るしく抑制され、その結果、Ａ鎖の血漿にお
ける残留レベルが著るしく増大する。注射２０時間後で
は酸化Ａ鎖の！！度は修飾されていないＡ鎖（曲線２）
の場合の３３０倍にもなる。
これらの結果から、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化反
応および水素化シアノホウ素ナトリウムによるアルデヒ
ド基の還元（第１アルコールを形成して消失する）によ
って、Ａ鎖の消失原因となる糖の変性がおこなわれて、
Ａ鎖の生物学的活性が失われることなく、その消失を防
止することができることが証明された。
実施例　２ この実施例は、酸化処理時間が酸化、還元Ａ鎖の薬物動
態学的性質に及ぼす重要性を検討するものである。
過ヨウ素酸ナトリウムによる処理時間を変えた以外は実
施例１の手法を用いて５種の酸化Ａ−１ａ鎖の製剤を調
製した。処理時間は次の通ってあった。すなわち、０（
エテレンダリコールを用いて反応を直ちに停止）、２０
分、４０分、２．５時間、４時間、および１６時間であ
った。
これら６種の製剤をウサギに注射し、２４時間経過後の
Ａ−１ａ鎖の血漿中相対濃度を実施例１の手法により測
定し念。
結果全第２図に示す。ここで２４時間後のＲＰＣを縦軸
に、過ヨウ素酸塩−水素化シアノホウ素による処理時間
を横軸に示す。この結果から、１）Ａ鎖の血漿中濃度の
増加は、確かに、過ヨウ素酸塩による酸化に基づくこと
（反応を直ちに停止したときは、Ａ鎖の血漿中濃度は生
のＡ鎖についてのものと同一であるからである）、およ
び２）最適の効果を得るためには、反応処理時間を比較
的長くすることが必要であることがわかる。
実施例　３ 活性化ジスルフィド基で置換したマウスＴ細胞に対する
抗体（Ｔｈｙ　１．２抗原に対する抗体）と、リシンＡ
−１ｍ鎖とにより得られる免疫毒Ｘ（ＩＴと略称する）
。
ａ）マウスＴｍ胞に対する抗体（ＡＴ　１５　Ｅ抗体）
：この抗体は免疫学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第１２２巻、　２４９１−２４
９８頁、１９７９年において説明された方法によって準
備した。
ｂ）　リシンのＡ−１＆鎖 リシンのＡ−１ａ鎖は実施例１で説明した方法によって
準備した。
Ｃ）マウスＴ細胞を阻害する活性化抗体Ｎ−スクシンイ
ミディル−３−（２−ビリディルージチオ）−プロピオ
ネ−）　４．２５　ｍ９を９５％エタノール０．５　ｌ
１ｌｌ！に溶かしたものを、ｐＨ８，３のホウ酸塩緩衝
液０．１Ｍに抗体５．８３　＋＋２帥／　ｅ溶かした溶
液１０ｍ［添加した。この混合物ｔ−２０’Ｃで３０分
攪拌した。１２５ｍＭりん酸塩緩砺液（Ｐｌ（７）を用
いて透析後、タンパク質浴液ｔｌＯ，ｏ００Ｘｇ、４℃
で３０分、遠心分離した結果、活性抗体５７．３〜を４
．６６号４の濃度で得た。
２−メルカプトエタノールとの交換反応によって放出さ
れた２−ピリジンチオンの３４３ｎｍにおける吸収をみ
ると、この抗体はｌ　ｍｏｌ当ｆｉ　３．７５個の活性
化された混合ジスルフィド基を有してＡることかわかっ
た。
ｄ）持続作用のあるり７ンＡ−１ａ鎖を含有する免疫毒
素の準備 実施例１で得た２、８７ｍ＃ｆＬｌ濃度のＡ−１ａ鎖８
．９ゴを６．５Ｍの上記活性抗体溶液（濃度４．６６　
ｍＶ＆ＬＡ、即ち３０．３ａ７の活性化抗体ンに加え、
２５℃で２０時間培養した。この溶液を遠心分離し、つ
Ａでｒル（ＡｃＡ　４４　’ｙ’ル）でろ過精製した。
これを光学密度２８０ｎｍで測定した。抗体と変性Ａ鎖
の両方を含む分画を合わせると免疫毒素全１ｄ当り０、
４　ｍ９含む溶液３２Ｍ（即ち免疫毒素は１２．８ｍ９
）が得られた。この溶液は抗体とカップリングされた変
性Ａ−１＆鎖をＩＩｎＩ！当りＯ，１０７ａ７含有する
。
従ってこの方法による平均力ラグリング度は抗体１ｍｏ
ｌにつきＡ−１ａ鎖１．８　ｍｏｌである。
上記の方法で得たり７ンＡ−１ａ鎖を含む免疫毒累につ
いて、その薬物動態学的特性と標的細胞に対する細胞毒
性を調べた。
実施例　４ 本実施例は、持続作用上もつり７７Ａ鎖を含む免疫毒素
（ＩＴ（Ａ−１ｍ）と略す）の血漿中濃度がゆっくシと
減少するという性質の獲得の様子を示す。
（Ａ）　　方法 実施例３で説明した手続で準備された抱合体をうさぎの
耳の血管に一度注射した。投与された量はＡ鎖について
体重ｌ　ｋｇ当たｐｏ、４１５〜である。
ヘパリンの存在下で血液を時々採血した。血漿を放射線
免疫試験（ＲＩＭ−３と略す）によって（２箇所）分析
した。
この試験はＲＩＭ−４と同じ技術（実施例１）を用いて
行われた。但しＡｃ　２溶液は本試験においてはＲＩＭ
−１の技術を用いてアフィニティークロマトグラフィー
によって精製され、放射標識されたマウスのＩｇＧ’ｉ
阻害するヤギの抗体である。このサンプルにおける修飾
された免疫毒素の濃度は既却の異った濃度から導いた検
量線を用、いて決定した。
ＲＩＭ−、？試験はＲＩＭ−１と同じ信頼性及び再現性
全有する。
比較対照のため、生のり／ン人鎖を活性化されたノスル
フィト°基で買換した抗体の反応から得られたＩＴ−Ａ
Ｔ１５Ｅ抱合体と同じ条件下で比較例の試験を行った。
この抱合体の準備と細菌毒性は実施例３で説明した方法
によりて行りた。これらの実験結果は実施例１でカップ
リングされていないＡ鎖について行ったのと同じ方法で
示した。　　−（Ｂ）　　結果 図３は静脈注射された従来のＩＴ　Ａｒｘ５ｒ：　（曲
線１）及びＩＴＣＡ−１ａ）ＡＴ１５Ｅ　（曲線２）の
血漿中濃度曲線を示してＡる。投与２４時間後にＩＴ（
Ａ−１ａ）　ＡＴＩＩ活性細胞毒素は従来のＩＴ　ＡＴ
ＩＩの１１０倍になってい次。この事実は酸化されたＡ
鎖の薬物動態学的特性は抗体とカップリングされた後も
保持されていることを示している。
実施例　５ 本実施例においてはＩＴ（Ａ−１轟）ＡＴＩ５にの陽性
標的細胞’ｒｈｙ　１．２に対する細胞毒素特性の保存
について述べる。
す／ン人鎖の基本的な生物学的特性は細胞中のタンノぐ
り質合成ｔ−りがンームの６ＯＳサブユニツトの分解に
よって阻害することである。
この方法は培養中のがン細胞に　Ｃで標識したロイシン
（以下１４Ｃ−ロイシンをいう）を取り込ませて研究さ
れている物質の効果を測定する細胞系を用いる。
用いられる細胞は、抗原Ｔｂｙ１．２を運ぶ人間のＴ白
血病から誘導されるＴ２細胞系に属する。この細胞は目
的の物質の存在下で保温した後、細胞への１４０−ロイ
シンの取り込みの程度を測定した。
この実験は１０ｍＭの塩化アンモニウムの存在又は非存
在下でおこなわれた（免疫毒素の活性を促すため）。こ
の測定には生物化学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉａｔｒｙ）第２４
９巻１１号、３５５７−３５６２頁で説明された、タン
パク質合成ｔｈｔヲ測定するのに　Ｃ−ロイシンのトレ
ーサーを用いる方法によって行う。取シ込まれた放射能
はろ過した細胞の全体について測定した。
定量の基準として線量／効果曲線を描くことかできる。
この曲線横軸には目的物質中のＡ鎖のモル濃度、縦軸に
は、タンパク質合成を阻害する物質の存在しない比較細
胞における１４ｃｍロイ７ンの取ｐ込み量に対する百分
率をプロットして得られる。
こうしてそれぞれの物質について１４Ｃ−ロ１シン取シ
込み量を５０％阻害する濃度または５０チ阻害濃度（Ｉ
Ｃ５ｏ）　を決定することができる。
下記表■はＩＴ−（Ａ−１ａ　）　−ＡＴＩ　５Ｅおよ
びＩＴＡＴ１５Ｅで、さらに天然Ａ鎖および非結合Ａ−
１ａ鎖で同一実験条件で得られｆｃ、　ＩＣ５ｏの１！
［を示す。
この表からＩＴ　（Ａ−１ａ　）ＡＴ　１５Ｅ　は天然
Ａ鎖を含む対応する免疫毒素と同様の強い細胞毒活性を
示し、これは同一条件での非結合変性Ａ−１ａ鎖のもの
よシ約１０００倍の値を示している。さらにＩＴ　（Ａ
　−１ａ　）　ＡＴ　１５Ｆ　は塩化アンモニウムによ
シ活性が促されることも見出された。
表　　　■ 実施例　６ 本実施例においては■生のゲロニンを動物に静脈注射し
た場合のその急消失と、■過ヨウ素酸ナトリウムによる
酸化および水素化シアノホウ素ナトリウムによる同時還
元反応によって変性させたゲロニンを同様に注射しｔ後
のそのゆりくりとした消失について説明する。
Ａ）過ヨウ素酸ナトリウムおよび水素化シアノホウ素ナ
トリウムによるゲロニンの修飾ゲロニンをグロニウムム
ルチフロールム（Ｇｅｌｏｎｉｕｍｍｕｌｔｉｆｌｏｒ
ｕｍ　）から生化学ジャーナル、第２５５巻、６９４７
−６９５３頁、１９８０年に述べである方法で抽出し、
精製した。実施例２でリシン大鏡について述べたのと同
じ方法で酸化反応を行り九。しかしチオール基のＤＴＮ
Ｂによるマスクは行っていない。
実際ゲロニンの天然のチオール基を基いてゲロニンと抗
体金カップリングさせることはｓｔｂ行なわれていない
ので、チオール基は、酸化後、ガン研究（Ｃａｎｃｅｒ
　ＥＬｅｓ、　）　、第４４巻、１２９−１３３頁、１
９８４年において説明された技術を用いて人種的に導入
し友。０．２Ｍ、ｐ）１６．５の酢酸塩緩衝液１ｍｌを
ＰＢＳ緩衝液中５■／ｄのゲロニンを含む溶液１Ｍ中に
添加した。この溶液’ｌ−０，２Ｍ　。
ｐＨ３，５の酢酸塩緩衝液で−、６．５に調整した。つ
ぎに、水素化シアノホウ素ナトリウムを１６０ｍＭ含む
溶液をＰＨ６，５の酢酸塩を用いてつくった。他方、ｐ
Ｈ６，５の酢酸塩を用いて、８０　ｍＭの過ヨウ素酸ナ
トリウム溶液をつくり、これを暗所にて保存した。゛つ
いで、暗所にてこの過ヨウ素酸ナトリウム溶液１ｍｌを
水素化シアノホウ素ナトリウム浴液１ｒＩＬ！！と混合
し、さらに１０分後暗所にて上記ゲロニンｍ液２ｍｌを
加え喪。培養は暗所で４℃で１７時間おこなった。酸化
反応停止はエチレングリコールの２０　％　（ｖ／ｖ）
水溶′ｇ、（酢ｔＩ＆塩緩衝液０．２Ｍ。
ｐｉ−１６，５）１４２μｔｔ−加えることによシおこ
なった。
４℃、２０時間の培養後、反応媒体を４℃で４８時間Ｐ
ＢＳ緩衝液（５０ｍＭ、、　ｐ）１７．８）で透析した
。
これを３０分間１０，０ＯＯＸｐで遠心分離にかけると
、ここから濃度２．５　ｍ９／ｒｆＬｌ　の酸化ゲロニ
ン２．９ダが得られた。
リシン大鏡と同じように、ゲロニンの基本的特性はリポ
ソームの６ＯＳサブユニツトの分解によって真核細胞に
おけるタンノ９り質合成を阻害することで゛ある（バイ
オケミカルジャーナル、第２０７巻、５０５〜５０９頁
、１９８２年）。ゲロニンの場合にも過ヨウ素酸酸化に
よる修飾は、活性の実質的損失を生じさせないことがわ
かっ之。
Ｂ）ゲロニンにおける薬物！１２Ｉ態学的特性の維持生
の、或いは上述の手続で修飾されたゲロニンをうさぎの
耳の血管から一回注射し友。投与したゲロニンの童は０
．３ないし０．４■／ゆであった。
ヘパリンの存在下で血液を時々採取した。血漿は以下Ｒ
ＩＭ　−２と略称する放射線免疫試験を用いて分析した
。
この試験はＲＩＭ　−１試験と同じ技術を用いる。
ただしＡｃ２ｍ液が本例ではアフィニティークロマトグ
ラフィーで精製された抗ｒロニンウサギ抗体溶液である
。Ａｃ　２抗体はＲＩＭ　−１試験と同じ抗体を放射性
同位体で標識したものである。同一標本中の生のゲロニ
ンと修飾したゲロニンの濃度全それぞれ標本とは異った
既知の濃度の検−ｉ線と比較することによって決定しｔ
０放射標識の技術はＲＩＭ　−１で説明したものと同じ
である。ＲＩＭ　−２試験はＲＩＭ　−１試験と同等の
信頼性と再現性を示した。本実験の結果は実施例２でリ
シンのＡ鎖について示し念のと同じ方法で示す。
生の及び修飾したゲロニンを静脈注射した場合の血漿中
濃度曲縁全時間の関数として弄わした場合、生のゲロニ
ンは９９．９９１が２４時間で消失し、生のリシン大鏡
と同じように血中から非常に急速に消失することがわか
った。ゲロニンのポリサツカリド単位が変性されている
場合は曲線形が大きく違う。投与２４時間後に変性した
ゲロニンの濃度は生のゲロニンの２５０倍ある。
従ってこれらの結果は、リシン大鏡において、過ヨウ素
酸ナトリウムによる酸化反応および水素化シアノホウ素
ナトリウムの作用によシ生成アルデヒド基の還元反応（
これによシ第１アルコールが形成される）がゲロニンの
消失に原因する認識方法における糖をその認Ｒを妨げる
程度まで変性させることを示している。
これらの変性免疫毒素はガン性又は非ガン性の病気であ
って、上記免疫毒素を製造するのに用いられた抗体によ
シ標的細胞が認識し得る場合に有効となる。投与条件お
よび時間についての最適条件は病気の種類に応じて適宜
決定し得る。この発明の新薬は注射用投与、特に静脈投
与に適している。
【図面の簡単な説明】
第１図ないし第３図は本発明の糖タンパク質の特性を示
す線図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、天然のＧＰＩＲと同様のリボソーム抑止活性と生体
    内持続性を有する変性ＧＰＩＲであって、ＧＰＩＲを過
    ヨウ素酸塩水溶液および水素化シアノホウ素の水溶液で
    処理して得られたものであることを特徴とする変性ＧＰ
    ＩＲ。 ２、過ヨウ素酸塩および水素化シアノホウ素での処理の
    間、ＧＰＩＲのチオール基の少なくとも一つが保護され
    ていることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の変
    性ＧＰＩＲ。 ３、上記処理をｐＨ５〜７の水溶液中で、温度０〜１５
    ℃、暗所で０．２〜２４時間に亘っておこなうことを特
    徴とする特許請求の範囲第１項記載の変性ＧＰＩＲ。 ４、該反応水溶液が反応性Ａ−鎖を１〜１０ｍｇ／ｍｌ
    、アルカリ性過ヨウ素酸塩を１０〜５０ｍＭ、水素化シ
    アノホウ素を１０〜２００ｍＭ含む特許請求の範囲第１
    項記載の変性ＧＰＩＲ。 ５、天然のＧＰＩＲと同様のリボソーム抑止活性と生体
    内持続性を有する変性ＧＰＩＲの製造方法であって、Ｇ
    ＰＩＲを過ヨウ素酸塩水溶液および水素化シアノホウ素
    の水溶液で処理することを特徴とする方法。 ６、上記処理をｐＨ５〜７の水溶液中で、温度０〜１５
    ℃、暗所で０．２〜２４時間に亘っておこなうことを特
    徴とする特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、該反応水溶液が反応性Ａ−鎖を１〜１０ｍｇ／ｍｌ
    、アルカリ性過ヨウ素酸塩を１０〜５０ｍＭ、水素化シ
    アノホウ素を１０〜２００ｍＭ含む特許請求の範囲第５
    項記載の方法。 ８、上記処理に先立ち、ＧＰＩＲをＳＨ基を保護する試
    薬で処理し、ＩＯ＿４＾−イオンおよび水素化シアノホ
    ウ素による処理ののち、このＳＨ基を解放することを特
    徴とする特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、ＳＨ基の保護試薬が２，２′−ジニトロ−５，５′
    −ジチオ−ジベンゾイン酸又は３−（２−ピリディルジ
    スルファニル）プロピオン酸であり、ＳＨ基の脱保護を
    ２−メルカプト−エタノールによっておこなう特許請求
    の範囲第８項記載の方法。 １０、特許請求の範囲第１項ないし第４項のうちのいず
    れかの変姓ＧＰＩＲと、抗体又は抗体分画との結合によ
    り得られる生体中での持続性を有する免疫毒素。 １１、上記結合がジスルフィドブリッジによっておこな
    われている特許請求の範囲第１０項記載の免疫毒素。 １２、上記結合を１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
    ノプロピル）カルボジイミドにより活性化された３−（
    ２−ピリディルジスルファニル）プロピオン酸、又はＮ
    −スクシンイミディル−３−（２−ピリディルジチオ）
    プロピオン酸塩から選ばれるヘテロ２官能性反応性剤を
    用いておこなう特許請求の範囲第１１項記載の免疫毒素
    。 １３、特許請求の範囲第１０ないし第１２項のいずれか
    の免疫毒素を有効成分として含む抗ガン剤組成物。
JP61302888A 1985-12-20 1986-12-20 修飾糖タンパク質、当該修飾糖タンパク質の製造方法、当該修飾糖タンパク質を含む免疫毒素および当該免疫毒素を有効成分として含む抗ガン剤組成物 Expired - Lifetime JPH0780903B2 (ja)

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