FI100305B - Menetelmä autoimmuunisairauden hoitoon tai ennaltaehkäisyyn käyttökelp oisen immunotoksiinin valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä autoimmuunisairauden hoitoon tai ennaltaehkäisyyn käyttökelp oisen immunotoksiinin valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI100305B
FI100305B FI895005A FI895005A FI100305B FI 100305 B FI100305 B FI 100305B FI 895005 A FI895005 A FI 895005A FI 895005 A FI895005 A FI 895005A FI 100305 B FI100305 B FI 100305B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
epitope
protein
amino acid
leu
lymphocytes
Prior art date
Application number
FI895005A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI895005A0 (fi
Inventor
Hermanus Antonius Mari Verheul
Original Assignee
Akzo Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akzo Nv filed Critical Akzo Nv
Publication of FI895005A0 publication Critical patent/FI895005A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI100305B publication Critical patent/FI100305B/fi

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A61K47/6825—Ribosomal inhibitory proteins, i.e. RIP-I or RIP-II, e.g. Pap, gelonin or dianthin
    • A61K47/6827—Ricin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

100305
Menetelmä autoimmuunisairauden hoitoon tai ennaltaehkäisyyn käyttökelpoisen immunotoksiinin valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää autoimmuunisairau-5 den hoitoon tai ennaltaehkäisyyn käyttökelpoisten im- munotoksiinien valmistamiseksi.
Immuunijärjestelmä on monimuotoinen ja sisältää itsetunnistuksen vaatimuksen. Immuunijärjestelmän säätely tapahtuu tämän itsetunnistuksen avulla ja siihen voi kuulo lua soluja, vasta-aineita, amplifikaatiosysteemejä (esim.
komplementti) ja näiden osasten yhdistelmiä. Terveillä yksilöillä immuunijärjestelmä vastaa vieraalle aineelle altistumiseen aktivoimalla soluvälitteisen immuunivasteen ja/tai tuottamalla spesifisiä vasta-aineita tätä vierasta 15 ainetta kohtaan. Toisaalta immuunijärjestelmä sietää oman elimistön ainesosia; tätä kutsutaan itsetoleranssiksi. Au-toimmuunisuus voidaan määritellä tämän itsetoleranssin pettämiseksi.
Autoimmuunisairauksiin kuuluvat multippeli skleroo-20 si, jossa kohdekudoksena on myeliini, myasthenia gravis, jossa kohteena on tärkeän hermojen välittäjäaineen, ase-tyylikoliinin, reseptorimolekyyli, nivelreuma, jossa kohteena ovat muun muassa perifeeriset nivelet, tyypin I sokeritauti, jossa tyypissä insuliinia tuottavat solut ovat 25 tuhoutuneet, ja systeeminen lupus erythematosus, jossa verisuonet, iho ja munuaiset ovat kohde-eliminä.
Autoimmuunisairaudet voivat saada alkunsa ilman spesifistä ulkoista tekijää. Toleranssin menetys omaa antigeeniä kohtaan voi olla antigeenin itsensä aiheuttama, 30 epänormaalin immuunivasteen omaa antigeeniä kohtaan aihe uttama tai molempien yhteisvaikutus. Joskus ulkoiset tekijät herättävät immuunivasteen, johon sisältyy vastetta tiettyjä omia antigeenejä kohtaan (epitooppiyhdennäköi-syys) . Isännän immuunivaste infektoivan tekijän spesifistä 35 determinanttia vastaan voi ristireagoida isännän yhdennä- 2 100305 köisen sekvenssin kanssa ja johtaa autoimmuunisuuteen ja mahdollisiin kudosvaurioihin ja sairauteen. Monilla virus-ja bakteeriproteiineilla on isäntäsolun proteiinien kanssa samankaltaisia epitooppeja, jotka ovat riittävän samanlai-5 siä ristireaktioihin, mutta kuitenkin riittävän erilaisia tuhotakseen immunologisen toleranssin.
Omien antigeenien ja/tai ulkoisten antigeenien tunnistus ja sen seurauksena tapahtuva immuunijärjestelmän aiheuttama omaa antigeeniä sisältävän kudoksen vaurio 10 välittyy T- ja B-lymfosyyttien kautta.
US-patentissa 4 634 590 kuvataan sellaisten pitkäikäisinä solulinjoina kasvavien spesifisten T-lymfosyyt-tien kasvatus, jotka aiheuttavat koe-eläimissä autoimmuunisairauksia. Havaittiin, että heikentämällä näitä spe-15 sifisiä T-lymfosyyttejä näitä soluja tai niistä saatavaa membraanimateriaalia voidaan käyttää tehokkaina rokotuksen vaikuttaja-aineina rokotettaessa spesifistä autoimmuunisairautta vastaan.
WO 85/05034 kuvaa mykobakteerin tai sen osan käyt-20 töä koostumuksessa tai rokotteessa nivelsairauksien oirei den lieventämiseksi tai niiden hoidossa tai diagnoosissa. Mykobakteerin spesifiset osat, joilla esiintyy immunologista ristireaktiivisuutta normaalin nivelruston proteo-glykaanien kanssa, identifioidaan. Suoja adjuvanttiar-25 triittia (AA) kohtaan ja autoimmuunisairauden suppression voidaan katsoa liittyvän erääseen mykobakteerin spesifiseen fraktioon, kun taas toinen fraktio saa aikaan haitallisen autoimmuunivasteen.
Lisäksi identifioitiin kaksi T-lymfosyyttikloonia, 30 jotka muodostavat vasteen mainituille kahdelle mykobaktee- rifraktiolle, ja niiden voidaan katsoa liittyvän artrito-geenisyyteen tai niveltulehduksen suppressioon.
Adjuvanttiartriitin T-lymfosyyttiklooneja käytettiin myös tunnistamaan mykobakteeriantigeenissa olevaa, 35 näiden T-solukloonien tunnistamaa antigeeniä. 65 kD:n 3 100305 proteiini identifioitiin T-solukloonien proliferatiivisen vasteen in vitro nostavaksi mykobakteeriantigeeniksi. T-solukloonien tunnistama epitooppi 65 kD:n antigeenissä sijaitsee sekvenssissä aminohappojen 180 - 188 kohdalla.
5 Tämä sekvenssi on samankaltainen rotan proteoglykaanin link-proteiinin osan kanssa [katso van Eden et ai.. Nature 331, (1988) , 171] .
Nykyiseen terapeuttiseen autoimmuunisairauksien hoitoon kuuluu autoimmuunivastetta vähentävien epäspesi-10 fisten lääkkeiden anto, jotka myös saavat aikaan koko im muunisysteemin lamaantumiseen liittyviä erilaisia ei-toi-vottuja komplikaatioita tai aiheuttavat muita ei-halut-tuja toksisia sivuvaikutuksia ei-lymfoidisille kudoksille. Esimerkkejä nykyään autoimmuunisairauksia vastaan käytä-15 vässä taistelussa käytettävistä lääkkeistä ovat naproksee- ni, auranofiini, penisillamiini, klorokiini ja kortikoste-roidit. Siten edullisessa autoimmuunisairauksien hoidon tai ennaltaehkäisyn lähestymistavassa lääkkeet on kohdistettava tavalla, joka vaikuttaa erityisesti sairauden oi-20 reet aiheuttavaan immunologiseen reaktiivisuuteen.
Kirjallisuudesta tiedetään, että asetyylikoliini-reseptoria, hyökkäyksen kohteena olevaa elimistön omaa antigeeniä myasthenia gravis -autoimmuunisairaudessa, voidaan käyttää spesifisen immuunivasteen suppressioon anti-25 geeniä kohtaan. Risiini- ja geloniinitoksiineihin kiinni tetty asetyylikoliinireseptori voi eliminoida osan anti-geenireaktiivisista lymfosyyteistä [Kilien, J. A. ja Lindström, J. M., Journal of Immunology 133, (1984), 2549 - 2553; Olsberg, C. A. et ai., Journal of Immunology 135, 30 (1985), 3062 - 3067; Burst, S. et ai., Biol. Chem. Hoppe- ‘ Seyler 368, (1987), 991 - 999].
Lisäksi tiedetään, että T-lymfosyytit voivat tunnistaa antigeenin useimmissa tapauksissa ainoastaan sen jälkeen, kun antigeeniä tarjoavat solut (APC) ovat käsi-35 telleet kyseistä antigeeniä yhdessä major histokompatibi- 4 100305 liteettikompleksin (MHC) molekyylien kanssa. Siten yllä mainitulla tekniikan tason mukaisella antigeenitoksiini-lähestymistavalla on se haitta, että antigeeni-toksiini -konjugaatin APC-käsittelyn aikana antigeeniä tarjoavat 5 solut tulevat inaktiivisiksi toksiinin vaikutuksesta ja immuunijärjestelmältä viedään arvokkaita soluja.
Tämä keksintö perustuu siihen tosiasiaan, että spesifiset omat tai ulkoiset epitoopit konjugoidaan sytotok-siseen aineeseen kokonaisen oman tai ulkoisen antigeenin 10 sijaan, jolloin APC-käsittely ei ole tarpeen.
Lisäksi tässä keksinnössä sytotoksiset aineet liitetään siihen antigeenin osaan, jonka T-lymfosyytit suoraan tunnistavat, nimittäin epitooppiin. Tämän tuloksena epitoopin ja sytotoksisen aineen konjugaatin toksinen vai-15 kutus T-lymfosyytteihin on tehokkaampi ja autoim- munogeenisten T-solujen täydelliseksi eliminoimiseksi voidaan käyttää matalampaa pitoisuutta mainitusta epitoopin sytotoksisen aineen konjugaatista.
Lisäksi ulkoisten antigeenien tapauksessa tässä 20 keksinnössä vain ne T-lymfosyytit, jotka ovat vastuussa autoimmuunivasteesta, eliminoidaan, jolloin immuunisysteemi voi herättää immuunivasteen ulkoista antigeeniä kohtaan .
Tämä keksintö koskee menetelmää autoimmuunisairau-·' 25 den hoitoon tai ennaltaehkäisyyn käyttökelpoisen im- munotoksiinin valmistamiseksi. Menetelmälle on tunnusomaista, että T-lymfosyyttien tunnistama, spesifiselle autoimmuunisairaudelle tyypillinen epitooppi tai sen ris-tireagoiva analogi kiinnitetään sytotoksiseen aineeseen 30 suoraan tai kytkijämolekyyIin välityksellä.
Monet T-lymfosyyttien tunnistamat proteiinit ja/tai epitoopit, jotka ovat ominaisia spesifiselle autoimmuunisairaudelle, ovat tunnettuja ja kuvattuja kirjallisuudessa .
5 100305
Adjuvanttiartriitti on krooninen autoimmuunisairaus, joka aiheuttaa nivelruston rappeutumista. Adjuvanttiartriitti rotilla voidaan saada aikaan immunisoimalla tuberkuloosibakteeri (Mycobacterium tuberkulosis, Mt) -an-5 tigeenilla. AA:ssa nähtävä kudostuho on T-lymfosyyteille tyypillistä. T-lymfosyyttejä stimuloidaan tuberkuloosibak-teeriin kuuluvalla antigeenillä, joka muistuttaa hyökkäyksen kohteena olevia omia antigeenejä artriittia sairastavilla rotilla.
10 Spesifisten T-lymfosyyttikloonien on havaittu kyke nevän tunnistamaan sekä vieraan tuberkuloosibakteerin antigeenin että oman antigeenin. Oma antigeeni sijoittuu luultavasti osaan ruston proteoglykaanimolekyyliä, joka on nimeltään link-proteiini. Nämä spesifiset T-lymfosyyt-15 tikloonit reagoivat erityisesti 65 kD:n proteiinin kanssa,
Mt-proteiinin, joka ilmentyy Mt- DNA:11a transfektoidussa E. colissa. Tällä 65 kD:n proteiinilla on tärkeä rooli immuunivasteessa mykobakteerikantoja vastaan.
T-lymfosyyttien tunnistamiksi epitoopeiksi on iden-20 tifioitu 65 kD:n proteiinin aminohapposekvenssissä kohdal la 65 - 85 oleva, 21 aminohappoa sisältävä peptidi sekä peptidi, joka sisältää yhdeksän aminohappoa, Thr-Phe-Gly-Leu-Gln-Leu-Glu-Leu-Thr, ja sijaitsee 65 kD:n proteiinin aminohapposekvenssissä kohdalla 180 - 188. Mainitulla no-25 napeptidillä on yhtäläisyyksiä proteoglykaanimolekyylin link-proteiinin osan kanssa, joka liittää ydinproteiinin tämän molekyylin sokerirunkoon ja jolla on aminohapposekvenssi Thr-Ala-Val-Val-Ala-Leu-Glu-Leu-Gln. Naudan 65 kD:n mykobakteeriproteiini, jolla on identtinen koodausalue 65 30 kD:n Mt-proteiinin kanssa, sisältää myös useita lymfosyyt tien tunnistamia epitooppeja.
Nämä T-lymfosyytti-epitoopit sisältyvät tai sijaitsevat aminohapposekvensseissä paikoilla 1 - 16, 17 - 61, 85 - 108, 112 - 132, 235 - 279 ja 437 - 459 (aminohappo-35 sekvenssit mykobakteerin 65 kD:n proteiinille, katso Thole 6 100305 et ai., Infect. Immun. 55, 1466 - 1475, 1987; Husson et ai., PNAS 84, 1679 - 1683, 1S87; Shinnick et ai., J. Bact. 169, 1080 - 1088, 1987).
Emäksinen myeliiniproteiini (BP) on autoantigeeni 5 eri lajeilla. Immunisaatio BP:llä tai lymfosyyttien pas siivinen siirto BPrllä immunisoiduista eläimistä saa aikaan autoimmuunisairauden, kokeellisen autoimmuunienkefa-lomyeliitin (EAE), useilla lajeilla. EAE aiheuttaa tulehduksellisen halvauksen ja demyelinisaation, joita oireita 10 esiintyy myös multippeli skleroosissa. EAE:ia välittää spesifinen luokka T-lymfosyyttejä. BP :11a tai joillakin sen osilla tehty immunisaatio saa aikaan EAE:n herkillä lajeilla, kuitenkaan jokainen osa ei ole enkefalogeeninen. T-lymfosyyttejä voidaan aktivoida vain intaktilla proteii-15 nilla tai spesifisen epitoopin sisältämillä osilla. Useat BP:n epitoopit tunnetaan jo alalla. BP:n aminohapposekvenssit 1 - 16, 1 - 37, 59 - 74, 68 - 88, 89 - 169 ja 114 - 122 on jo tunnistettu epitoopeiksi tai epitoopin sisältäviksi sekvensseiksi, ja niillä on affiniteettia enkefa-20 logeenisiin T-lymfosyytteihin ja niin ollen multippeli skleroosille tyypillisiin T-lymfosyytteihin, [emäksisen myeliiniproteiinin aminohapposekvenssi, katso Eylar et ai., J.Biol.Chem. 246 (1971) 5570; Gibson et ai., J.Biol.Chem. 259 (1984) 5028; Stoner, G. L., J.Neurochem. 25 43 (1984) 433 - 447; Scoble et ai., J.Neurochem. 47 (1986) 614 - 616].
Myasthenia gravis (MG), toinen autoimmuunisairaus, saa alkunsa asetyylikoliinireseptorin immunogeenisen tekijän esittelemisestä, mikä johtaa autoimmuunilymfosyyttien 30 aktivaatioon. MG:lie ovat tunnusomaisia asetyyliko- liinireseptoria vastaan muodostetut autovasta-aineet ja T-lymfosyytit, josta on tuloksena lisääntyvä reseptorin hajoaminen ja sairauden kliininen ilmeneminen heikkoutena ja tahdonalaisten lihasten väsymisenä. Asetyylikoliiniresep-35 tori sisältää viisi alayksikköä (a2Scd).
li 7 100305
Suurin osa MG-potilaiden soluvälitteisestä autoim-muunivasteesta kohdistuu reseptorin α-osayksikön alueeseen, ts. pääimmunogeeniseen alueeseen. Tällä alueella on tunnistettu useita epitooppeja tai epitoopin sisältäviä 5 aminohapposekvenssejä, kuten aminohapposekvenssit 1 - 30, 73 - 90, 100 - 116, 111 - 126, 146 - 162, 169 - 181, 182 -198, 257 - 271, 351 - 368 [asetyylikoliinireseptorin aminohapposekvenssi, katso Noda et ai., Nature 299 (1982) 793 - 797, ja Nature 302 (1983) 528 - 532, ja Nature 305 10 (1983) 818 - 823, Sumikawa et ai., Nucleic Acid Res. 10 (1982) 5809 - 5822, Devillers-Thiery et ai., PNAS 80 (1983) 2067 - 2071, Hohlfeld et ai., J. Clin. Invest. 81 (1988) 657 - 660].
Tässä yhteydessä käytetty termi epitooppi viittaa 15 immunogeenisen molekyylin immunogeeniseen determinanttiin, immunogeeninen determinantti on immuunijärjestelmän komponentin tunnistama.
Yllä mainitut epitoopit ovat ehdokkaita liitettäviksi sytotoksiseen aineeseen, mikä johtaa tämän keksinnön 20 mukaisesti saataviin epitoopin ja sytotoksisen aineen kon- jugaatteihin.
Alan ammattimiehelle on ilmeistä, että vain osan epitooppia sisältävä peptidi voi myös osoittaa sitoutu-misaffiniteettia T-lymfosyytteihin, kuten on epitoopin 25 viereisiä aminohappoja tai muita osia sisältävien pepti dien tapauksessa. Näiden viereisten osien pituutta rajoittaa vaatimus, ettei APC välttämättä käsittele peptidiä. On selvää, että tällaisia peptidejä sisältävät immunotok-siinit kuuluvat myös tämän keksinnön piiriin.
30 Lisäksi on mahdollista, että samanlaisilla, mutta ei identtisillä polypeptideillä on vastaavia immunologisia ominaisuuksia. Yllä mainitulla tavalla epitooppeihin läheisesti liittyvät polypeptidit sisältyvät myös tähän keksintöön.
8 100305 Tämän keksinnön yhteydessä käytettävät sytotoksiset aineet on valittu ryhmästä aineita, jotka kykenevät pysäyttämään solunjakautumisen ja lopulta aiheuttamaan solu-kuoleman .
5 Edullisesti sytotoksiset aineet on valittu alkupe rältään kasvi-, sieni- tai bakteeriproteiineista, joilla on kyky inhiboida proteiinisynteesiä eukaryoottisoluissa. Nämä toksiinit toimivat erityisesti translaatioprosessissa katalyyttisesti inaktivoiden ribosomeja. Kasvitoksiinit 10 luokitellaan kahteen ryhmään, t.s. joko kaksi tai neljä proteiinialayksikköä sisältäviin toksiineihin ja vain yk-siketjuisiin toksiiniproteiinimolekyyleihin, joihin on usein liittynyt hiilihydraattiosa.
Kahden alayksikön toksiinien molekyylipaino on 60 -15 67 kD, alayksikön A ollessa hiukan pienempi kuin B-alayk- sikön (30 kD vs 32 kD) . Alayksiköt ovat kovalentisti sitoutuneet yhdellä disulfidisidoksella, mutta hydrofobiset vuorovaikutukset ovat merkityksellisiä A:n ja B:n yhdessä pysymiseksi.
20 Alayksikkö B koostuu polypeptidiketjusta ja hiili-
hydraattiketjusta, joka sisältää mannoosia ja N-Ac-gluko-samiinia. Tämä alayksikkö näyttää liittyvän toksiinin ja kohdesolumembraanin galaktoosia sisältävien glykoproteii-nien ja -lipidien väliseen vuorovaikutukseen. Tämä alayk-: 25 sikkö sallii A-alayksikön soluun menemisen. Alayksikkö A
inaktivoi eykaryoottien ribosomeja katalyyttisesti, mistä on seurauksena proteiinisynteesin inhibitio ja solukuole-ma. Tähän ryhmään kuuluvia toksiineja ovat risiini, abrii-ni, modekkiini, volkensiini ja viskumiini.
30 Yksiketjuisten kasvitoksiinien ominaisuudet ovat yllä kuvatun A-alayksikön kanssa samankaltaisia. Ne ovat inaktiivisia intakteja soluja kohtaan, vaikka ovatkin erittäin vahvoja inhibiittoreita soluttomissa systeemeissä. B-alayksikön puutteen takia nämä toksiinit kulkeutuvat 35 vaikeasti kohdesoluihin ja ovat siten paljon vähemmän to- ti 9 100305 ksisia soluille kuin B-alayksikön sisältävät toksiinit. Ne tulevat kuitenkin toksisiksi, jos ne kiinnitetään soluun sitoutuviin tai sisälle meneviin kantajiin, kuten lektii-neihin ja vasta-aineisiin. Seuraavat proteiinit kuuluvat 5 tähän toksiiniluokkaan: geloniini, kermesmarjan antivirus- proteiinit, dodekandriini, diantiinit, luffiini, saporii-nit, Momardica charantia -inhibiittori ja viljainhibiit-torit.
Sieniproteiinitoksiinit, esim. α-sarkiini, restrik-10 tosiini ja mitogilliini ovat toisilleen läheisiä emäksisiä proteiineja. Nämä toksiinit sisältävät yhden polypeptidi-ketjun ja toisin kuin useimmat kasvitoksiinit ne eivät sisällä hiiliihydraattiosaa.
Diphtheria-toksiini ja Pseudonomas-eksotoksiini 15 ovat kaksi esimerkkiä bakteeritoksiineista, joilla on toi minnallisia yhtäläisyyksiä yllä kuvattujen kaksi alayksikköä sisältävien kasvitoksiinien kanssa.
Toinen edullinen sytotoksisten aineiden ryhmä on valittu ryhmästä radioisotooppeja. Nämä radioisotoopit 20 voidaan kohdentaa tiettyihin soluihin. Kohdesoluja vauri oitetaan tai tapetaan isotoopeilla, jotka emittoivat energisiä a- tai β-partikkeleita. Sopivia isotooppeja ovat 90Y, 153Sm, 43Sc, S7Cu, 186Rh, 188Rh, 212Bi, 211At ja 103Pd.
On monia tunnettuja tapoja liittää epitooppi pro-•j 25 teiinitoksiiniin.
Satunnainen epitoopin ja proteiinitoksiinin välinen konjugointi saadaan aikaan esimerkiksi käyttämällä karbo-di-imidiyhdistettä (esim. EDC), joka aktivoi proteiinitoksiinin karboksyyliryhmän siten, että se voidaan kytkeä 30 epitoopin aminoryhmään.
Tämän suoran konjugoinnin lisäksi liittäjiä voidaan käyttää tekemään silta epitoopin ja proteiinitoksiinin välille. Tunnettu homobifunktionaalinen yhteenliitäjä on glutar(di)aldehydi. Se reagoi parhaiten amiinien kanssa.
10 100305
Muita homobifunktionaalisia liittäjiä voivat olla imidoesterit (esim. dimetyyliadipimidaatti, dimetyylisu-berimidaatti) tai N-hydroksisukkinimidiesterit (esim. di-sukkinimidyylisuberaatti, ditiobis(sukkinimidyylipropio-5 naatti), jotka molemmat esterit ovat amiiniryhmäspesifi- siä.
Heterobifunktionaaliset reagenssit ovat edullisia, sillä ne sisältävät kaksi erilaista funktionaalista ryhmää, jotka mahdollistavat konjugaatioreaktion kontrolloin-10 nin sekä selektiivisesti ja sekventiaalisesti. Esimerkki heterobifunktionaalisesta liittäjästä on N-sukkinimidyyli-3 -(2-pyridyyliditio)propionaatti (SPDP) .
Ensiksi 2-pyridyylidisulfidiryhmä viedään epitoop-piin antamalla primaarisen amiinin reagoi SPDP:n kanssa. 15 Derivatisoitu epitooppi voidaan nyt konjugoida tioliryhmän sisältävään proteiinitoksiiniin, jolloin disulfidisidos muodostuu epitoopin ja proteiinitoksiinin välille. Ellei tämä tioliryhmä ole jo olemasssa, se voidaan viedä proteiinitoksiiniin tioloivilla aineilla, kuten 2-iminotiolaa-20 nilla, SPDP:11a tai N-sukkinimidyyli-S-asetyyli-tioasetaa- tilla.
Maleiini-imidiryhmät sekä bromi- tai jodiasetyyli-ryhmät reagoivat miedoissa olosuhteissa melko nopeasti tioliryhmien kanssa ja muodostavat tioeetterityyppisen : 25 sidoksen. Maleiini-imidiryhmä voidaan esimerkiksi viedä epitooppiin, antamalla epitoopin aminoryhmän reagoida suk-kinimidyyli-4 -(N-maleiini-imidometyyli)sykloheksaani-1-karboksylaatin kanssa. Toisessa vaiheessa proteiinitoksiinin sisältämä sulfhydryyliryhmä liitetään maleiini-imidi-30 aktivoituun epitooppiin.
Proteiinitoksiinin hiilihydraattiosaa voidaan myös käyttää epitooppiin liittämisessä. Perjodaattia käytetään muodostamaan aldehydiryhmät hiilihydraattiosaan. Sitten aldehydiryhmien annetaan reagoida epitoopin aminoryhmien 35 kanssa ja Schiffin emäksen muostamiseksi, joka voidaan stabiloida pelkistämällä sekundääriseksi amiiniksi.
Il 11 100305
Radioisotooppien liittäminen epitooppeihin suoritetaan käyttämällä kelaattoria. Kelaattorit on rakennettu siten, että hyvä in vivo kelaattori-isotooppi -kompleksin stabiilisuus varmistetaan.
5 Toinen tapa valmistaa tämän keksinnön mukaisia im- munotoksiineja on yhdistelmä-DNA-tekniikat. Toksiinipoly-peptidejä tai niiden toksisia alueita koodaavat nukleii-nihapposekvenssit genomisesta DNArsta tai mRNA:sta liitetään epitoopin aminohapposekvenssin geneettisen informaa-10 tion sisältäviin nukleotidisekvensseihin. Vaihtoehtoisesti voidaan muodostaa toksiinin ja epitoopin välille käsivarreksi sopivaa aminohapposekvenssiä koodaava liittäjäsek-venssi. Näiden immunotoksiinien tuotanto voidaan saada aikaan joko prokaryoottisessa tai eukaryoottisessa eks-15 pressiosysteemissä.
Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut immunotok-siinit voidaan antaa enteraalisesti tai edullisesti paren-teraalisesti. Tätä tarkoitusta varten ne sekoitetaan yhteen tai useampaan tavalliseen farmaseuttisesti hyväksyt-20 tävään ei-toksiseen kantajaan ja/tai tavallisiin täyteai neisiin, jolloin saadaan farmaseuttinen koostumus.
Mainitut farmaseuttiset koostumukset ovat tabletteja, pillereitä tai päällystettyjä tabletteja enteraali-seen antoon ja liuoksia, suspensioita ja emulsioita oraa-25 liseen tai parenteraaliseen antoon.
Yhdisteiden annos valmisteessa riippuu suuresti potilaan yksilöllisestä tarpeesta. Kuitenkin yhdisteiden suonensisäisissä injektioissa annetaan edullisesti alkuannos 0,1 ng - 1 mg per painokilo, minkä jälkeen tarpeen 30 mukaan annataan yksi tai useampi lisäannos päivässä. In- fuusiona yhdisteitä annetaan yllä mainittuun suonensisäiseen lääkitykseen perustuva annos pitemmän ajan kuluessa.
Tätä keksintöä kuvataan edelleen seuraavissa esimerkeissä .
12 100305
Esimerkki 1
Nonapeptidin Thr-Ala-Val-Val-Ala-Leu-Glu-Leu Gln-OH
(I) synteesi
Kaavan I mukaisen nonapeptidin synteesi tehdään 5 kiinteä faasi -peptidisynteesimenetelmällä, jonka alunpe rin on kuvannut Merrifield [J. Amer. Chem. Soc. 85 (1963) 2149] .
Synteesi suoritetaan Vega Coupler 250 C -laitteella käyttäen p-bentsyylioksibentsyylialkoholi -hartsia (0,6 -10 0,7 mmol/g, Bachem A.G., Sveitsi).
Aminohapot liitetään hartsiin asteittain N“-Fmoc-(Fmoc = 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli-) johdannaisina Glu- ja Thr- sivuketjufunktioiden ollessa suojattuna t-bu-tyyliesterillä ja t-butyylieetterillä, tässä järjestykses-15 sä.
Synteesi aloitetaan liittämällä Fmoc-Gln-OH hartsiin käyttäen DCC:iä (disykloheksyylikarbodi-imidiä) ja DMAP (N,N-dimetyyliaminopyridiiniä) matalassa lämpötilassa ja HOBt:n (N-hydroksibentsotriatsolin) läsnä ollessa, ku-2 0 ten Van Nispen et ai. ovat kuvanneet [Red. Trav. Chim.
Pays-Bas 104 (1985) 99 - 100]. Vapaat alkoholiryhmät muodostuvassa Fmoc-Gln-hartsissa (0,3 - 0,4 mmol/g) estetään asetylaatiolla.
Fmoc-suojaryhmä poistetaan käsittelemällä hartsia 25 25-%:isella piperidiinillä DMF:ssä (dimetyyliformamidi) 10 minuuttia, jota seuraa kolme pesua (yksi minuutti kukin) DMFrllä ja CH2Cl2:lla. Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Val-OH (kaksi kertaa), Fmoc-Ala-OH ja Fmoc-Thr(tBu)-OH liitetään peräkkäin käyt-30 täen kolmea ekvivalenttia jokaista suojattua aminohappoa, DCC:tä ja HOBt:tä 6-7 ml:ssa DMF grammaa kohti hartsia kahden tunnin ajan. Sen jälkeen suoritetaan kolme pesua (yksi minuutti kukin) etanolilla, DMF:llä ja CH2Cl2:lla. Jokaisen asetylaation onnistuminen tarkastetaan Kaiserin 35 et al.'n ninhydriinitestillä [Anal. Biochem. 34 (1970) 595 il 13 100305 - 598]. Testin ollessa positiivinen asiaankuuluva liitos-vaihe toistetaan yhdellä ekvivalentilla jokaista Fmoc-aminohappoa, DCC:tä ja HOBt:tä yhden tunnin ajan. Jos Kaiserin testi on yhä positiivinen, jäljelle jäävät vapaat 5 aminoryhmät asetyloidaan käsitelemällä hartsia etikkahap- poanhydridi-pyridiinillä (2:1; v/v; 6-7 ml/g) kymmenen minuutin ajan, jota seuraa kolme pesua DMF:llä ja CH2Cl2:lla yksi minuutti kummallakin. Fmoc-suojaryhmän poiston jälkeen käsittelemällä 25-%:isella piperidiinillä, 10 kuten yllä on kuvattu, liitetään seuraava aminohappo.
Synteesin lopputuloksena, kun viimeinen F-moc-suo-jaavaryhmä on poistettu, on nonapeptidiresiini II
tBu OtBu 15 H-Thr-Ala-Val-Val-Ala-Leu-Glu-Leu-Gln-hartsi
II
Vapaa peptidi I saadaan nonapeptidihartsi II:sta 20 kolmen tunnin trifluorietikkahappo-diklorometaani -käsittelyllä (1:1; v/v).
Tämä happokäsittely saa samanaikaisesti aikaan t-butyyliperäisten suojaryhmien poistumisen ja peptidin irtoamisen hartsista. Hartsi poistetaan suodattamalla. Suo-· 25 dos haihdutetaan sen jälkeen vakuumissa. Jäännös liuote taan t-butanoli-vesi -seokseen (1:1; v/v). Jäljelle jäänyt TFA vaihdetaan sitten etikkahappoon Dowex 2x8 (OAc) ioninvaihtohartsilla. Lopputuloksena olevan liuoksen kyl-mäkuivaus tuottaa nonapeptidi I:tä (asetaattisuolana).
30 Esimerkki 2
Nonapeptidijohdannai sten synteesi A. S-asetyylit ioasetyylij ohdannainen Peptidi I liuotetaan DMF-H20:hon (2:1; v/v) . Liuoksen pH nostetaan arvoon 7,5 - 8,0 lisäämällä N-etyyli-N,N-35 di-isopropyyliamiinia. Sitten lisätään 1,2 ekvivalenttia 14 100305 N-sukkinimidyyli-S-asetyylitioasetaattia (SATA) DMF:ssä. Reaktioseoksen pH pidetään arvossa 7,5 - 8,0 lisäämällä mainittua tertiääristä emästä. Liuoksen oltua 30 minuuttia huoneenlämpötilassa liuoksen pH säädetään 5,0:aan lisää-5 mällä etikkahappoa. Tätä seuraa liuottimien poisto haih duttamalla vakuumissa, ja jäännös jauhetaan etyyliasetaat-tieetterin kanssa. Peptidijohdannainen III liuotetaan sitten t-butanoli-vesi -seokseen (1:1; v/v) ja eristetään kylmäkuivaamalla.
10 0 0
CH3-C-S-CH2-C-Thr-Ala-Val-Val-Ala-Leu-Glu-Leu-Gln-OH
III
15 B. Maleiini-imidijohdannainen I :n N^-aminoryhmän asetylaatio käytettäessä esimerkissä 2A kuvattua menetelmää N-sukkinimidyyli-4-(N-maleii-ni-imidometyyli)-sykloheksaani-l-karboksylaatilla (SMCC, "Pierce") tuottaa maleiini-imidijohdannaisen IV.
20 C. Bromiasetyylijohdannainen I :n N“-aminoryhmän asetylaatio käyttäen esimerkissä 2A kuvattua menetelmää N-sukkinimidyylibromiasetaatilla tuottaa bromiasetyylijohdannaisen V.
D. Pyridyylisulfidijohdannainen ' 25 Yhdisteen I N“-aminoryhmän asetylaatio käyttäen esi merkissä 2A kuvattua menetelmää N-sukkinimidyyli-3-(2-py-ridyyliditio)propionaatilla (SPDP, "Pierce") tuottaa pyri-dyylidisulfidijohdannaisen VI.
Esimerkki 3 30 Geloniinijohdannaisten synteesi A. Iminotiolaanijohdannainen
Vapaat SH-ryhmät liitetään geloniiniin derivatisoi-malla 2-iminotiolaanilla (Trauts-reagenssi) .
50-kertainen molaarinen ylimäärä 2-iminotiolaania 35 (0,4 M 2-iminotiolaani 0,1 M fosfaattipuskurissa, pH 8,0, 15 100305 joka sisältää 1 mM EDTA; loppukonsentraatio 2-iminotiolaania on 5 mmol/1) lisätään 4 ml:aan ge-loniiniliuosta (3 mg/ml; 100 μπκ>1/1) yllä mainittussa puskurissa. Reaktioseosta inkuboidaan 30 minuuttia 30 °C:ssa.
5 Sitten seos lisätään Sephadex G25 -pylvääseen, joka on tasapainotettu 0,1 M fosfaattipuskurilla, pH 7,5, joka sisältää 0,1 M NaClra ja 1 mM EDTA:ta, reagenssiylimäärän ja pienimolekyylipainoisten reaktiotuotteiden poistamiseksi. Tämän derivatisaatiovaiheen saanto oli 92 %, ja tok-10 siini sisälsi keskimäärin 1-2 SH-ryhmää geloniinimole- kyyliä kohti.
B. Pyridyylidisulfidijohdannainen
Pyridyylidisulfidi (PDP) -ryhmät liitetään gelonii-niin liuottamalla geloniini 0,1 M fosfaattipuskuriin, pH 15 7,5, joka sisältää 0,1 M NaCl:a ja 1 mM EDTA:ta (3 g gelo- niinia/1) . 5-kertainen molaarinen ylimäärä sukkinimidyyli-pyridyyliditiopropionaattia (40 mM SPDP etanolissa; SPDP:n loppukonsentraatio on 500 μιηοΐ/ΐ) lisätään 4 ml:aan gelo-niiniliuosta (3 g geloniinia/1) 0,1 M fosfaattipuskurissa 20 pH 7,5, joka sisältää 0,1 M NaCl:a ja 1 mM EDTA:ta, ja in kuboidaan 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Sitten seos lisätään edellä mainitulla puskurilla tasapainotettuun Sephadex G25 -pylvääseen reagenssiylimäärän ja pienimolekyylisten reaktiotuotteiden poistamiseksi. Toksiinisaanto • 25 oli 95 %, ja toksiinimolekyylit sisälsivät keskimäärin 1 - 2 pyridyylidisulfidiryhmää geloniini-molekyyliä kohti.
Esimerkki 4
Nonapeptidijohdannaisen liittäminen geloniinijohdannaiseen 30 A. Nonapeptidi IV:n liittäminen geloniini-iminotio- / lääni johdannaiseen 8 ml geloniinijohdannaisen liuosta (1,4 mg/ml) inkuboidaan huoneenlämpötilassa 2,5-kertaisen molaarisen ylimäärän kanssa nonapeptidiä IV (jonka loppukonsentraatio 35 on 115 μιτιοΐ/ΐ) kaksi tuntia. Inkubaatiopuskuri on fosfaat- 16 100305 tipuskuri pH 7,5, joka sisältää 0,1 M NaCl:a ja 1 mM ED-TA:ta. Sitten reaktioseos siirretään inkubaatiopuskurilla tasapainotettuun Sephadex G50 -pylvääseen regenssiylimää-rän ja pienimolekyylisten reaktiotuotteiden poistamiseksi.
5 72 % geloniinijohdannaisesta muuttui konjugaatiksi SDS- PAGE-testauksen mukaan; pääkomponentti sisälsi 1 gelonii-nimolekyylin peptidiä kohti. Vapaa geloniini poistetaan ioninvaihtokromatografiällä Mono Q -pylväällä (0,05 M Tris-puskuri, pH 8,0). Konjugaatti eluoidaan 0,5 M 10 NaCl:11a.
B. Nonapeptidi VI:n liittäminen geloniini-iminotio-laanij ohdannaiseen.
Yllä mainitun konjugaatin valmistus suoritetaan käyttäen kohdassa A kuvattua menetelmää.
15 C. Nonapeptidi V:n liittäminen geloniinipyridyyli- disulf idij ohdannaiseen.
Yllä mainitun konjugaatin valmistus suoritetaan käyttäen kohdassa A kuvattua menetelmää.
Esimerkki 5 20 Nonapeptidi III liittäminen geloniinipyridyyli- disulfidijohdannaiseen 0,5 ml geloniinijohdannaista (1,4 mg/ml) inkuboi-daan yön yli huoneenlämpötilassa 2,5-kertaisen molaarisen ylimäärän nonapeptidi III:a (loppukonsentraatio 115 · 25 μπ\ο1/1) kanssa yllä mainitussa fosfaattipuskurissa, johon on lisätty hydroksyyliamiinia (10 mM). Reaktion päätyttyä seos siirretään inkubaatiopuskurilla tasapainotettuun Sephadex G50 -pylvääseen reagenssiylimäärän ja pienimolekyylisten reaktiotuotteiden poistamiseksi. 67 % gelonii-30 nijohdannaisesta muuttuu konjugaatiksi SDS-PAGE-testauksen mukaan. Vapaa geloniini poistetaan ioninvaihtokromatogra-fialla Mono Q -pylväässä (0,05 M Tris-puskuri, pH 8,0). Konjugaatti eluoidaan 0,5 M NaCl:lla.
17 100305
Esimerkki 6
Tuberkuloosibakteerin 65 kD:n proteiinin aminohapposekvenssin paikkojen 65 - 85 sisältämän 20 aminohapon epitoopin (RdVl) liittäminen risiini-5 A: hän.
Peptidi, jonka sekvenssi on Lys-Thr-Ile-Ala-Tyr-Asp-Glu-Glu-Ala-Arg-Gly-Leu-Glu-Arg-Gly-Ala-Val-Arg-Asn-Ala-Lys, laimennetaan DMF/H20:llä (1:2) . 0,4 M SPDP DMS: ssä lisätään (moolisuhde 1:1), ja seosta inkuboidaan 30 min 10 vallitsevassa lämpötilassa. Inkuboinnin jälkeen kaksi ti lavuutta etyyliasetaattia lisätään ja seosta sentrifugoi-daan 5 min eppendorf-sentrifuugilla maksiminopeudella. Sakka pestään eetterillä ja sentrifugoidaan uudelleen 5 min maksiminopeudella. Sitten sakka kuivataan typpikaasul-15 la. Kuiva sakka liuotetaan 0,1 M NaP:iin (pH = 7,3) niin
pienessä tilavuudessa kuin mahdollista. Risiini-A (0,1 M NaP, pH = 7,3) pelkistetään lisäämällä 1 M DTT-.tä 10 mM:n konsentraatioksi, ja seosta inkuboidaan 30 min vallitsevassa lämpötilassa. Sitten liuoksesta poistetaan suola PD 20 10:llä 0,1 M NaP:ssa (pH = 7,3). Pelkistetty risiini-A
lisätään SPDP-käsiteltyyn peptidiin molaarisessa suhteessa 1:5. Seosta inkuboidaan ympäröivässä lämpötilassa 1 h.
Saatu konjugaattiliuos voidaan säilyttää 4 °C:ssa. Suurimolekyylipainoiset epäpuhtaudet voidaan poistaa tar-25 vittaessa kromatografisesti (Fractogel HW 55 (s) PBS:ssä).
Esimerkki 6B
RA-potilaan humaania T-solukloonia stimuloidaan 65 kD proteiinilla (antigeenispesifinen) antigeeniä tarjoavan solujen läsnäollessa (APC). Useita konsentraatioita risii-30 ni-A:ta, 65 kD -risiini-A:ta tai RdVl-risiini-A:sta lisä tään. Kolmen päivän kuluttua solujen proliferäätio mitataan 3H-tymidiinin sisäänotolla. Tulokset esitetään alla sisäänottoprosentteina stimuloiduista viljelmistä ilman toksiinin (konjugaatin) lisäystä.
18 100305 a ja b ovat järjestyksessä ensimmäinen ja toinen koe.
μ9/τη1 toksiinia risiini-A risiini-A-65 kD risiini-A
sisäänotto % sisäänotto % RdV^ si-5 säänotto a b ab ab a 0 (0) 100 (100) 100 (100) 100 10 0,1 (0,02) 71 (96) 45 (86) 30 0,3 (0,2) 90 (64) 32 (78) 26 1.0 (2,0) 80 (22) 47 (76) 24 3.0 (20,0) 24 (6) 31 (59) 17 10.0 11 44 18 15 30,0 7 19 7 LD50 arvot yllä esitetyille kokeille ovat risiini-A 65 kD-risiini-A RDV^risiini-A LD50 1,1 33 <0,1 20 Tästä voidaan vetää johtopäätös, että epitooppi-ri- siini-A konjugaatti on toksisempi näille soluille kuin toksiini yksin tai toksiini-65 kD -konjugaatti.
Esimerkki 6C
Samat kokeet kuin esimerkissä 6B toistetaan, paitsi, 25 että läsnä ei ole antigeeniä tarjoavia soluja ja että T- soluja stimuloitiin IL-2:lla (ei antigeenispesifinen).
ti 19 100305
Tulokset esitetään alla.
μg/ml toksiinia risiini-A risiini-A-65 kD risiini-A
5ababab a 0 (0) 100 (100) 100 (100) 100 0,1 (0,02) 105 (100) 96 (107) 93 0,3 (0,2) 92 (93) 89 (90) 90 10 1,0 (2,0) 85 (80) 73 (81) 75 3.0 (20,0) 82 (1) 31 (17) 27 10.0 47 17 25 30.0 41 2 15 Keskimääräiset LD50-arvot ovat: toksiini toksiini-65 kD toksiini-RdVl LD50 keskiarvot 6,8 3,9 1,7
Voidaan vetää johtopäätös, että RdVi-risiini-A konju-gaatit ovat tehokkaimpia estämään tämän T-solukloonin jakau-20 tumista.
Esimerkki 7
Adjuvanttiartriitti indusoitiin Lewis-urosrotissa mycobacterium byturiumilla (100 mg/ml parafiiniöljyssä). Kuutta viiden rotan ryhmää kutakin käsiteltiin injektioilla ; 25 päivinä 0 - 5 ja 8 - 12 seuraavasti: ryhmä 1 plasebo ryhmä 2 65 kD-risiini-A -konjugaatti (katso esimerkki 6) (1 mg/kg) ryhmä 3 peptidi I-risiini-A -konjugaatti (katso esimerkki 30 5) (0,25 mg/kg) ryhmä 4 risiini-A (0,25 mg/kg) ryhmä 5 65 kD:n proteiini (0,5 mg/kg) ryhmä 6 peptidi I (0,01 mg/kg).
Päivänä 22 10 /xg 65 kD:n proteiinia injisoidaan korvaan.
35 Päivänä 24 korvan turvotus määritetään.
20 100305
Tulokset ovat keskiarvoja ryhmää kohti ja ilmoitetaan turvotusprosentteina.
ryhmä Turvotus % (1) 5,0 ± 2,6 5 (2) 8,1 ± 2,8 (3) -0,2 ± 2,5 (4) 8,1 ± 3,0 (5) 5,8 ± 2,9 (6) 2,8 ± 3,4 10 Voidaan tehdä johtopäätös, että nonapeptidi-risiini - konjugaatti estää DTH:ta 65 kD:n proteiinia vastaan rotilla.
tl

Claims (12)

100305
1. Menetelmä autoimmuunisairauden hoitoon tai ennaltaehkäisyyn käyttökelpoisen immunotoksiinin valmistamiseksi, 5 tunnettu siitä, että T-lymfosyyttien tunnistama, spesifiselle autoimmuunisairaudelle tyypillinen epitooppi tai sen ristireagoiva analogi kiinnitetään sytotoksiseen aineeseen suoraan tai kytkijämolekyyIin välityksellä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että epitooppi tai sen ristireagoiva analogi on nivelruston proteiinin epitooppi.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiinnitettävällä epitoopilla on aminohapposekvenssi Thr-Ala-Val-Val-Ala-Leu-Glu-Leu-Gln.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että epitooppi tai sen ristireagoiva analogi on mykobakteerin 65 kD:n proteiinin epitooppi.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että epitooppi on mykobakteerin 65 20 kD:n proteiinin fragmentti, joka vastaa mainitun mykobaktee- riproteiinin aminohapposekvenssejä 1 - 16, 17- 61, 65 - 85, 85 - 108, 112 - 132, 180 - 188, 235 - 279 tai 437 - 459.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että epitoopilla on aminohapposek- ·’· 25 venssi Thr-Phe-Gly-Leu-Gln-Leu-Glu-Leu-Thr (mykobakteerin 65 kD:n proteiinin aminohapposekvenssi 180 - 188).
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että epitooppi on emäksisen myelii-niproteiinin epitooppi.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että epitooppi on emäksisen myelii-niproteiinin fragmentti, joka vastaa mainitun emäksisen mye-liiniproteiinin aminohapposekvenssejä 1-16, 1-37, 59 - 74, 68 - 88, 89 - 169 tai 114 - 122. 100305
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että epitooppi on asetyylikoliinin reseptorin epitooppi.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että epitooppi on asetyylikoliinin reseptorin fragmentti, joka vastaa mainitun asetyylikoliinin reseptorin aminohapposekvenssejä 1 - 30, 73 - 90, 100 - 116, 111 - 126, 146 - 162, 169 - 181, 182 - 198, 257 - 271 tai 351 - 368.
11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että sytotoksinen aine on ribosomeja inaktivoiva proteiini.
12. Jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sytotoksinen aine on 15 radioisotooppi. 100305
FI895005A 1988-10-21 1989-10-20 Menetelmä autoimmuunisairauden hoitoon tai ennaltaehkäisyyn käyttökelp oisen immunotoksiinin valmistamiseksi FI100305B (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP88202349 1988-10-21
EP88202349 1988-10-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI895005A0 FI895005A0 (fi) 1989-10-20
FI100305B true FI100305B (fi) 1997-11-14

Family

ID=8199870

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI895005A FI100305B (fi) 1988-10-21 1989-10-20 Menetelmä autoimmuunisairauden hoitoon tai ennaltaehkäisyyn käyttökelp oisen immunotoksiinin valmistamiseksi

Country Status (15)

Country Link
EP (1) EP0365087B1 (fi)
JP (1) JP2807506B2 (fi)
KR (1) KR0151851B1 (fi)
AT (1) ATE78407T1 (fi)
AU (1) AU625802B2 (fi)
CA (1) CA2000999A1 (fi)
DE (1) DE68902212T2 (fi)
DK (1) DK523589A (fi)
ES (1) ES2051989T3 (fi)
FI (1) FI100305B (fi)
GR (1) GR3006048T3 (fi)
IE (1) IE61831B1 (fi)
NZ (1) NZ231095A (fi)
PT (1) PT92071B (fi)
ZA (1) ZA897895B (fi)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU3423293A (en) * 1991-12-19 1993-07-19 Baylor College Of Medicine Pva or peg conjugates of peptides for epitope-specific immunosuppression
US6613330B1 (en) 1998-08-11 2003-09-02 Rush University Methods and compositions for preventing anti-Gal production in xenograft recipients
KR100346059B1 (ko) * 1999-12-30 2002-07-24 주식회사 효성 폴리에스테르 섬유의 제조방법
PL2096914T3 (pl) * 2006-11-23 2012-02-29 Cadila Pharmaceuticals Ltd Antagonista poli-TLR
WO2018031947A1 (en) * 2016-08-12 2018-02-15 Immunowork, Llc Diagnosis, prevention, and/or treatment of autoimmune diseases

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL69686A (en) * 1983-09-11 1988-03-31 Yeda Res & Dev Compositions containing cell membrane proteins and process for their preparation
DE3513572A1 (de) * 1985-04-16 1986-10-16 Karl Prof. Dr.med. 7302 Ostfildern Theurer Herstellung von praeparaten zur spezifischen beeinflussung der humoralen und zellulaeren immunreaktion
NL8701163A (nl) * 1986-09-09 1988-04-05 Nederlanden Staat Gebruik van een peptide voor de bereiding van preparaten voor het verlichten, het behandelen en de diagnose van autoimmuunziekten, in het bijzonder arthritische toestanden, verbindingen die met dit peptide verwant zijn, alsmede farmaceutische en diagnostische preparaten en testkits.

Also Published As

Publication number Publication date
ZA897895B (en) 1990-07-25
GR3006048T3 (fi) 1993-06-21
AU4359589A (en) 1990-04-26
CA2000999A1 (en) 1990-04-21
EP0365087A1 (en) 1990-04-25
JP2807506B2 (ja) 1998-10-08
PT92071A (pt) 1990-04-30
AU625802B2 (en) 1992-07-16
JPH02169523A (ja) 1990-06-29
IE893324L (en) 1990-04-21
DK523589A (da) 1990-04-22
FI895005A0 (fi) 1989-10-20
NZ231095A (en) 1992-03-26
DE68902212T2 (de) 1993-05-27
IE61831B1 (en) 1994-11-30
DK523589D0 (da) 1989-10-20
KR900005996A (ko) 1990-05-07
ATE78407T1 (de) 1992-08-15
ES2051989T3 (es) 1994-07-01
EP0365087B1 (en) 1992-07-22
DE68902212D1 (de) 1992-08-27
KR0151851B1 (ko) 1998-10-15
PT92071B (pt) 1995-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9687561B2 (en) Peptide-dendrimer conjugates and uses thereof
JP7100617B2 (ja) 新規安定型抗体薬物複合体の作製およびその応用
US7361347B2 (en) Cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates
JPS6069033A (ja) 免疫毒素複合体
WO2016074093A1 (en) Conjugates including an antibody moiety, a polypeptide that traverses the blood-brain barrier, and a cytotoxin
US11583569B2 (en) PSMA-targeting amanitin conjugates
US20160106856A1 (en) Conjugates including an antibody moiety, a polypeptide that traverses the blood-brain barrier, and a cytotoxin
CA1222694A (en) Immunochemotherapy for malignant tumors, particularly pancreatic cancer
WO2009059309A2 (en) Furin-cleavable peptide linkers for drug-ligand conjugates
FI100305B (fi) Menetelmä autoimmuunisairauden hoitoon tai ennaltaehkäisyyn käyttökelp oisen immunotoksiinin valmistamiseksi
US5728383A (en) Treatment of tumors of the central nervous system with immunotoxins
CA2216210A1 (en) Novel anti-aids immunotoxins
EP0234151B1 (fr) Glycoprotéines modifiées par oxydation et formation de base de Schiff, inhibant les ribosomes, procédé d&#39;obtention et immunotoxines comprenant une telle glycoprotéine
FR2577135A1 (fr) Immunotoxines a longue duree d&#39;action comportant un constituant glycopeptidique inactivant les ribosomes modifie sur ses motifs polysaccharidiques
EP0229564B1 (fr) Glycoprotéines modifiées par oxydation puis réduction, inhibant les ribosomes, procédé d&#39;obtention et immunotoxines comprenant une telle glycoprotéine
NZ225372A (en) Immunotoxin composition comprising purified ricin-a-chain species
CA1338818C (en) Immunotoxins
Colombatti Ricin A: structure, function and its clinical applications
IE75719B1 (en) Target specific antibody-superantigen conjugates and their preparation
FR2602683A1 (fr) Immunotoxines a longue duree d&#39;action in vivo comportant une glycoproteine inhibant les ribosomes, modifiee par oxydation des motifs osidiques puis reduction

Legal Events

Date Code Title Description
MM Patent lapsed

Owner name: AKZO N.V.