PT92071B - Processo de preparacao de imunotoxinas e de preparados farmaceuticos para o tratamento ou profilaxia de doencas auto-imunes - Google Patents
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Description
presente invento refere-se ao processo de preparação de imu notoxinas para o tratamento ou profilaxia de uma doença auto-imune e ao processo de preparação de preparados farmacêuticos contendo uma ou mais imunotoxinas.
sistema imune exibe uma complexidade, que inclui um requisito para o auto-reconhecimento. A regulação do sistema imune ocorre atraués deste auto-reconhecimento e pode envolver células, anticorpos, sistemas de amplificação (p.e. complemento) e combina, çães destes elementos. Em indivíduos saudáveis o sistema imune responderá à exposição a uma substância estranha por activação da resposta imune celular e/ou por produção de anticorpos específicos contra esta substância. Por outro lado, o sistema imune é ge. ralmente tolerante aos constituintes do próprio corpo, a assim de. nominado auto-tolerância. A auto-imunidade pode ser definida como um engano desta auto-tolerância.
Entre as doenças auto-imunes podem ser mencionadas: esclerose múltipla, em que o tecido atacado é a mielina; miastenia grave, em que o alvo é uma molécula receptora para o importante neurotransmissor da acetilcolina; artrite reumatóide, em que inter alia são alvejadas as articulaçães periféricas, diabetes mellitus do tipo I, caracterizada por as células produtoras de i_n sulina serem destruídas e lupus eritematoso sistémico em que são atacados os vasos sanguíneos, pele e rim.
As doenças auto-imunes podem ser iniciadas sem o requisito para um agente externo específico. A perda de tolerância aos auto-antigénios pode ser causada pelo próprio auto-antigénio, por uma resposta imune anormal ao auto-antigénio ou por uma combinação de ambos. Algumas vezes os agentes exógenos provocam uma resposta imune, que inclui a sensibilidade a certos auto-antigénios (imi. tação de epítopo). Uma resposta imune elevada pelo hospedeiro con tra um determinante específico de um agente infectante pode reagir cruzadamente com a sequência de hospedeiro imitada, conduzindo à auto-imunidade e à possível lesão e doença do tecido. Muitos epítopos compartilham proteínas bacterianas e virais com protei70 096
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-3nas da célula hospedeira que s2o suficientemente similares para reagirem cruzadamente, contudo suficientemente diferentes para quebrarem a tolerância imunológica.
reconhecimento dos auto-antigénios e/ou antigênios exógenos e do dano que ocorre subsequentemente do auto-antigénio ccn tendo tecido pelo sistema imune é mediado pelos linfócitos T e linfócitos B.
Na patente US 4 634 590 é descrita a cultura de linfócitos T específicos, responsáveis por causarem doenças auto-imunes em animais de laboratório, como linhas de células a longo prazo. Verificou-se que após atenuaçSo destes linfócitos T específicos, as células ou o seu material de membrana podem ser utilizadas como agentes efectivos para a vacinação contra uma doença auto-imune específica.
W0 85/05034 descreve a utilização duma Micobacterium ou duma sua fracção numa composição ou vacina para alívio dos sintomas ou para o tratamento ou diagnóstico das doenças artríticas. São identificadas as fracções específicas de Micobacterium que mostram reactividade cruzada imunológica com proteoglicanos da cartilagem da articulação normal. A protecção contra a artrite adjuvante (AA) e a supressão da doença auto-imune podem ser associadas com uma fracção específica de Micobac terium, enquanto que a outra fracção induz a resposta auto-imune nociva.
Além disso foram identificados dois clones de linfócitos T respondendo às duas fracções de Micobacterium respectivamente, podendo assim ser associados com a artritogenicidade ou com a supressão da artrite.
Foram também utilizados clones de linfócitos T da artrite adjuvante para identificar o antigénio presente na Micobacterium reconhecida por estes clones de células T. Foi identificada uma proteína de 65 KD como o antigénio da Nicobacterium que extrai a resposta proliferativa dos clones de células T in vitro. 0 epitq po reconhecido pelos clones de células T reside na sequência de aminoácidos 180-188 do antigénio de 65 KD. Esta sequência mostra uma semelhança com uma parte da proteína de ligação do proteogli70 096
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-4cano de ratazana (ver van Eden et al. , Nature 331, 171, (1988).
tratamento terapêutico corrente das doenças auto-imunes inclui a administração de drogas não específicas que suprimem a resposta auto-imune mas também produzem várias complicações indesejáveis associadas com a depressão total do sistema imune ou causam outros efeitos laterais tóxicos não desejáveis nos tecidos não linfóides. Exemplos de drogas correntemente utilizadas que combatem as doenças auto-imunes são o naproxeno, auranofina, penicilamina, cloroquina e corticosteróides. Assim numa aproxima ção preferível para o tratamento ou profilaxia de uma doença autji -imune, as drogas têm de ser preparadas duma forma que afecte especif icamente a reactividade imunológica conduzindo aos sintomas da doença.
E conhecido da literatura que o receptor da acetilcolina, sendo o auto-antigénio sob ataque na doença auto-imune miastenia grave, pode ser utilizado para a supressão da resposta imune espe cífico contra o antigénio. 0 receptor da acetilcolina ligado às toxinas ricina ou gelonina é capaz de eliminar uma fracção dos linfócitos reactivos ao antigénio (Killen, 3.A. e Lindstrom, J.M., Journal of Immunology 133 (1984), 2549-2553; Olsberg, C.A. et al. Journal of Immunology 135 (1985), 3062-3067; Brust, S. et al,, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368 (19B7), 991-999).
E além disso conhecido que um antigénio na maioria dos c_a sos só pode ser reconhecido pelos linfócitos T após processamento do referido antigénio pelas células que apresentam antigénio (CAA) em combinação com moléculas do complexo de maior his tocompatibil_i dade (CMH). Consequentemente, a aproximação antigénio-toxina da arte anterior notada acima tem a desvantagem de durante o processamento das CAA do conjugado antigénio-toxina as CAA se tornarem inactivas por acção da toxina, privando o sistema imune de células valiosas.
D presente invento reside no facto de que os epitopos auto específicos ou epitopos exógenos estão a ser conjugados com uma substância citotóxica em vez do auto-antigénio inteiro ou antigénio exógeno, enganando a necessidade de processamento pelas CAA .
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-5Além disso, na presente situação a substância citotóxica ê agora ligada ao fragmento do antigênio que é directamente reconhecido pelo linfócito T: o epitopo. Isto resulta numa acção tóxica mais eficiente do conjugado de substância citotóxica-epitopo para os linfócitos que permite a utilização de concentração reduzida do referido conjugado de substância citotóxica-epitopo de forma a alcançar a completa eliminação dos linfócitos T auto-imunogénicos.
Além disso, no caso dos antigénios exógenos, no presente invento,só os linfócitos T responsáveis pela resposta auto-imune são eliminados permitindo ao sistema imune evocar uma resposta imune contra o antigênio exógeno.
A imunotoxina preparada de acordo com o presente invento é assim caracterizada por compreender um epitopo, reconhecido pelos linfócitos T sendo caracteristico para a doença auto-imune es pecífica ou um seu análogo reactivo cruzadamente sendo, o referido epitopo ou seu análogo reactivo cruzadamente acoplado a uma substância citotóxica.
Muitas proteínas e/ou epitopos que são reconhecidos pelos linfócitos T sendo características para a doença auto-imune especifica são conhecidas e descritas na literatura.
A artrite adjuvante (AA) é uma doença auto-imune crónica que causa a degeneração da cartilagem nas articulações. A artrite adjuvante pode ser induzida em ratazanas por imunização com um antigênio de Micobacterium tubérculos is (Mt). 0 dano no tecido observado na AA é caracteristico dos linfócitos T. Os linfócitos T são estimulados por um antigênio pertencente à Micobacterium tuberculosis que imita os auto-antigénios que estão sob ataque nas ratazanas artríticas.
Tem sido verificado que os clones de linfócitos T especí. ficos são capazes de reconhecer quer o antigênio da Micobacterium tuberculosis estranho quer o auto-antigénio. 0 auto-antigénio re side provavelmente numa parte de uma molécula de proteoglicano da cartilagem, denominada a proteína de ligação. Estes· clones de 1 i_Q fócitos T específicos reagem especificamente com uma proteína de
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-665 KD, uma proteína Mt expressada pela E . coli transfectada com ADN Mt. Esta proteína de 65 KD representa um papel importante na resposta imune às estirpes de Micobacte rium.
Um péptido consistindo em 21 aminoácidos residindo na sequência de aminoácidos 65-85 da proteína de 65 KD assim como um péptido consistindo em nove aminoácidos, Thr-Phe-Gly-Leu-Glπ-Leu-Glu-Leu-Thr, residindo na sequência de aminoácidos 180-188 da proteína de 65 KD são identificados como os epitopos que são reco nhecidos pelos linfócitos T. 0 referido nonapéptido mostra uma semelhança com uma parte da proteína de ligação da molécula de proteog1icano que liga a proteína do núcleo ao suporte principal do açúcar desta molécula e tem a sequência de aminoácidos Thr-AlaVal-l/al-Ala-Leu-Glu-Leu-Gln. A proteína de 65 KD da Micobacterium bovis que tem uma região de codificação idêntica à da proteína de 65 KD da Mt contém também vários epitopos que são reconhecidos p_e los 1inf ócitos.
Estes epitopos dos linfócitos T coincidem ou residem nas sequências de aminoácidos 1-16, 17-61, 85-108, 112-132, 235-279 e 437-459 (para as sequências de aminoácidos da proteína de 65 KD da Micobacterium ver Thole et al. , Infect. Immun. 5 5 , 1466-1475, 1967; Husson et al. , PNAS 84 , 1679-1683, 1987; Shinnick et al . , 0. Bact. 169, 1080-1088, 1987).
A proteína básica de mielina (ΡΘ) é um auto-antigénio em espécies diferentes. A imunização com PB ou a transferência pass_i va de linfócitos dos animais imunizados com PB induz a doença auto-imune encefalomielite auto-imune experimental (EAE) em espécies variadas. A EAE causa a paralisia inflamatória e a des mieiina ção, sintomas que também ocorrem com a esclerose múltipla. A EAE é mediada por uma classe específica de linfócitos T. A imunização com PB ou alguns dos seus fragmentos induz a EAE em espécies susceptíveis, contudo nem todo o fragmento é encef alogénico. 0s linfócitos T só são activados pela proteína intacta ou por fragmentos contendo um epitopo específico. São já bem conhecidos na arte epitopos variados na PB. As sequências de aminoácidos 1-16, 1-37 , 59-74 , 68-88, 89-169 e 114-122 da PB têm'já sido ide_n
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-Ίtificadas como epitopos ou sequências contendo epitopo, mostrando afinidade para os linfòcitos T encefalogénicos e por isso para os linfòcitos T característicos da esclerose múltipla (para as sequências de aminoácidos da proteína básica de mielina uer Eylar et al. , 0. Biol. Chem. 246 , 5770, 1971; Gibson et al., 0. Biol. Chem. 2 59 , 502B, 1984; Stoner, G.L. 0. Neurochem. 4 3, 433-447, 1984; Scoble et al. , 0. Neurochem. 47 , 614-616, 1986).
A miastenia grave (MC), uma outra doença auto-imune, é iniciada pela apresentação de um factor imunogénico do receptor da acetilcolina resultando na estimulação dos linfòcitos auto-imu nes. A MG é caracterizada pelos auto-anticorpos e linfòcitos T dirigidos contra o receptor da acetilcolina resultando na degrad_a ção aumentada do receptor e manifesta-se a si mesma clinicamente por fraqueza e fadiga dos músculos voluntários. 0 receptor da acetilcolina consiste em 5 subunidades (<2^cd).
A maior parte da resposta auto-imune celular dos pacientes sofrendo de MG está dirigida para uma área na subunidade-<< do receptor: a região imunogénica principal. Nesta região têm sido identificados epitopos ou sequências de aminoácidos contendo epitopo variadas tais como as sequências de aminoácidos 1-30, 73-90, 100-116, 111-126, 146-162, 169-181, 182-198, 257-271, 351-368 (para as sequências de aminoácidos do receptor da acetilcolina ver Noda et al., Nature 299, 793-797, 19B2 e Nature 302, 528-532, 1983 e Nature 305, 81S-823, 1983; Sumikawa et al., Nucleic Acid Res. 10, 5809-5822, 1982; Devillers-Thiery et al. , PNAS 8 0, 2067-2071, 1983; Hohlfeld et al., 0. Clin. Invest. 81, 657-660, 1988).
termo epitopo como aqui utilizado indica um determinante imunogénico de uma molécula imunogénica, sendo o determinante imunogénico reconhecido por um componente do sistema imune.
Os epitopos notados acima são condidatos para acoplamento a uma substância citotóxica resultando num conjugado de substância citotóxica-epítopo de acordo com o presente invento.
E óbvio para um pessoa perita na arte que o péptido contendo só uma parte de um epitopo mostrará também uma afinidade de
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7.:
f..
-8ligação para os linfócitos T como será o caso com um péptido contendo adicionalmente ao epítopo, aminoâcidos de flanqueamento ou outros grupos. 0 comprimento destes grupos de flanqueamento está limitada pelo requisito de que o péptido não é necessariamente proces.
z sado pelo CAA. E certo que uma imunotoxina compreendendo esses péptidos está também dentro do âmbito deste invento.
Além disso, é possível que os polipéptidos tendo uma sequência de aminoâcidos similar mas não idêntica mostrem correspojg dentes caracteristicas imunológicas. Os polipéptidos relacionados com um epítopo da forma notada acima são também incluídos no presente invento.
As substâncias citotóxicas a serem utilizadas na estrutura do presente invento são seleccionadas a partir de um grupo de substâncias que são capazes de parar a proliferação de células e causar eventual mente a morte da célula.
De preferência as substâncias citotóxicas são seleccionadas a partir de um grupo de proteínas originárias de plantas, furi gos ou bactérias, tendo a propriedade de exibirem a síntese de proteínas em células eucarióticas. Estas toxinas actuam especi f_i camente no processo de tradução pela inactivação cataiiticamente dos ribossomas. As toxinas das plantas são classificadas em dois grupos i.e. toxinas compostas quer de duas quer de quatro subunidades contendo proteína e toxinas consistindo numa molécui3 de proteína de cadeia única à qual é narmalmente ligado um grupo car bo-hidra to.
As toxinas de duas subunidades têm uma massa molecular de 60-65 KD, sendo a subunidade A ligeiramente mais pequena que a subunidade 8 (30 KD vs 32 KD). As subunidades estão covalentemejn te ligadas por uma ligação dissulfureto simples, mas são também importantes as interacçães hidrofóbicas para manterem A e B juntas. A subunidade B consiste numa cadeia de polipéptido e numa cadeia de carbo-hidrato que contém manose e N-Ac-glucosamina. Esta subunidade parece estar envolvida na interacção da toxina com as glicoproteínas e lípidos contendo galactose da membrana de células alvo. Esta subunidade permite à subunidade A entrar na cé70 096
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-9lula A subunidade A inactiua os ribossomas eucarióticos duma forma catalítica, com consequente inibição da síntese de proteínas e morte da célula. Incluídos neste grupo de toxinas estão a ricina, abrina, modecina, volquesina e viscumina.
As toxinas de plantas de cadeia única têm propriedades similares às das subunidades A descritas acima. Elas são inactiuas sobre as células intactas embora sejam inibidores muito potentes em sistemas 1iu res de células. Por causa da ausência de uma subunidade B estas toxinas entram com dificuldade nas células aluo, sendo assim muito menos tóxicas para as células do que as toxinas contendo subunidade B. Contudo, elas podem-se tornar tóxicas se forem ligadas a ueículos capazes de ligação ou entrada nas células tais como lecetinas e anticorpos. As proteínas seguintes per. tencem a esta ciasse de toxinas, p.e. gelonina, proteínas antiuirais erua-dos-cancros, dodecandrina, diantinas, lufina, saporinas, inibidor da Momardica carantia, inibidores de cereais.
As toxinas de proteínas fúngicas, p.e.: oC-Sarcina, restrictocina e mitogilina são proteínas básicas intimamente relaciç} nadas. Estas toxinas contêm uma cadeia de polipéptido única e ao contrário da maioria das toxinas de plantas não contêm um grupo carbo-hidrato.
A toxina da difeteria e a exotoxina daPseudomonas são dois exemplos de toxinas bacterianas que mostram similaridades funcionais com as toxinas de plantas de duas subunidades descritas acima.
Outras substâncias citotóxicas preferidas são seleccionadas a partir do grupo de rádio-isotopos. Estes rádio-isotopos jqo dem ser aluejados para as células especificas. As células aluo são danificadas ou mortas pela utilização de isotopos que emitem partícuias-cZ ou partículas-/^ energéticas. Os isótopos adequados „ 90v 153c 43c
Sao Y , 5 (b j 5 c g 67Cu, 186Rh, 100Rh, 212Bi, 211At, 1Q3Pd.
Há um número bem conhecido de formas para conjugar um epí topo a uma toxina de proteina.
acoplamento ao acaso entre o epitopo e uma toxina de
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-10proteína pode por exemplo ser alcançado pela utilização de um comi posto de carbodiimida (p.e. EDO) que activa o grupo carboxilo duma toxina de proteína de forma a que este seja acoplado ao grupo amino do epítopo.
Aparte deste acoplamento directo podem ser utilizados ligantes para proporcionar uma ponte entre o epítopo e uma toxina de proteína. Um agente de ligação cruzada homobifuncional bem c.o nhecido é o glutar(di)aldeído. Ele reage de preferência com aminas .
Outros ligantes homobifuncionais podem ser seleccionados a partir do grupo de imido-ésteres (p.e. adipimidato de dimetilo, suberimidato de dimetilo) ou ésteres de N-hidroxisuccinimida (p. e. suborato de âi-succinimidilo , ditiobis (sucoinimidil^propionato), tendo ambos especificidade para grupos amina.
São preferidos os reagentes heterofuncionais uma vez que eles contêm dois grupos funcionais diferentes que permitem o controlo da reacção de conjugação quer selectivamente quer sequencialmente. Um exemplo de um ligante heterobifuncional é o N-succinimidil-3(2-piridilditio)propionato (SPDP). Primeiro é introduzi, do um grupo 2-piridi1-dissulfureto no epítopo por reacção de uma amina primária com SPDP. 0 epítopo derivado pode agora ser co n j li gado com uma toxina de proteína contendo um grupo tiol , formando uma ligação dissulfureto entre o epitopo e a toxina de proteína.
Se não estiver já presente este grupo tiol pode ser introduzido na toxina de proteína pelos agentes de tiolação tais como 2-i mi no tiolano, SPDP ou N-succinimidil-S-acetiitioacetato.
Os grupos maleimida assim como os grupos bromo- ou iodoacetilo reagem sob condiçSes suaves razoavelmente rapidamente com grupos tiol para darem uma ligação do tipo tio-éter. 0 grupo maleimida pode, por exemplo, ser introduzido no epitopo por reacção de um grupo amino do epítopo com 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano -1-carboxilato de succinimidilo. No segundo passo é ligado um grupo sulfidrilo contendo toxina de proteína com um epítopo activado com maleimida.
□ grupo carbo-hidrato de uma toxina de proteína pode tam7C 096
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-11bém ser utilizado para ligação ao epítopo. 0 periodato é utiliza, do para gerar grupos aldeído no grupo carbo-hidrato. Subsequente mente os grupos aldeído são deixados reagir com grupos amino de epltopo para formarem uma base de Schiff que pode ser estabilizada por redução para dar uma amina secundária.
acoplamento de rádio-isótopos aos epítopos é alcançado pela utilização dum quelante. Os quelantes são construídos duma forma tal que é assegurada a boa estabilidade in vivo do complexo isotopo-quelante.
Uma outra forma para a construção de imunotoxinas de aco_r do com o presente invento é a preparação através de técnicas de ADN recornbinante. As sequências de ácido nucleico importantes d_e rivadas do AON genómico ou ARNm que codificam para os polipéptidos da toxina ou seus domínios tóxicos estão ligadas com sequências de nucleótidos transportadores de informação genética para a sequência de aminoácidos do epítopo. Opcionalmente pode ser incorporada uma sequência de ligação que codifica uma sequência de aminoácidos que é adequada como o separador entre a toxina e o epítopo. A produção destas imunotoxinas pode ser alcançada quer em sistemas de expressão procarióticos quer eucarióticos.
As imunotoxinas do presente invento podem ser administradas entericamente ou de preferência parentericamente. Para este fim elas são misturadas com um ou mais veículos usuais e/ou excipientes usuais não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, resultari do numa composição farmacêutica.
A referida composição farmacêutica inclui comprimidos, p.í lulas e comprimidos revestidos para administração entérica e solu ções, suspensões e emulsões para administração oral ou parentérica.
A dosagem dos compostos no preparado de acordo ccm o presente invento depende muito do requisito individual do paciente. Contudo, para injecção intravenosa os compostos são de preferência administrados numa dosagem inicial entre 0,1 e 1 mg por kg de peso corporal, seguida se necessário, por uma ou mai6 dosagens suplementares por dia. Para infusão os compostos são administra70 096
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-12dos durante um período de tempo prolongado a uma dosagem que é b£ seada na administração intravenosa notada acima.
presente invento é posteriormente ilustrado por meio dos exemplos seguintes.
Exemplo 1
Sintese do nonapéptido Thr-A1 a-Val-Val-Ala-Leu-Glu-Lgu-Gln-OH (i)
A síntese do nonapéptido com a fórmula I é realizada pelo processo de síntese de péptido de fase sólida, como originalmente descrito por Marrifield (0. Amer. Chem. Soc. 8 5 , 2149, 1963).
A síntese é realizada num aparelho Vega Coupler 250 C, utilizando uma resina de álcool p-benziloxibenzílico (0,6-0,7 mrrol/ /g, Bachem A.G., Suiça).
Qs aminoácidos são acoplados à resina duma maneira a passo e passo como os seus N^-Fmoc-(Fmoc=9-fluorenilmetiloxicarbonil-) derivados, enquanto que as funçBes da cadeia lateral de Glu e Thr são protegidas com um t-butiléster e um t-butiléter, respectivairente.
A síntese começa pelo acoplamento de Fmoc-Gln-OH à resina, utilizando DCC (diciclo-hexilcarbodiimida) e DMAP ( N , l\l-di me til am_i nopiridina) a baixa temperatura e na presença de HOBt (N-hidroxibenzotriazol), como descrito por Uan Nispen et al. (Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 104, 99-100, 19B5). Os grupos álcool livres de r_e síduos na Fmoc-Gln-resina resultante (0,3-0,4 mmol/g) sao bloquea. dos por meio de acetilação.
Fmoc-grupo protector é removido por tratamento da resina com piperidina a 25% em DMF (dimetilformamida) durante 10 minjj tos, seguido por 3 lavagens (de um minuto cada) com DMF e Ct^C^.
Bão sucessivamente acoplados Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-0H, Fmoc-Leu-0H, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Val-0H (2 vezes), Fmoc-Ala-0H e Fmoc-Thr(tBu)-0H utilizando 3 equivalentes cada do aminoácido protegido, DCC e HOBt em 6-7 ml de DMF por grama de resina durante 2 horas. Depois são realizadas 3 lavagens de um minuto cada com etanol, DMF e CH2CI2. A perfeição de cada acilação é contro70 096
ΟΑ/2587-511
-13lada por monitor pelo teste da minidrina de Kaiser et al. (Anal. Biochem. 34, 595-59S, 1970). No caso de um teste positivo o passa de acoplamento pertinente é repetido com um equivalente cada do Fmoc-aminoácido, DCC e HOBt durante uma hora. Se o teste de Kaiser é então ainda positivo, os grupos amino livres restantes são acetilados por um tratamento da resina com anidrido acético-piridina (2:1; v/v; 6-7 ml/g) durante 10 minutos, seguido por lavagens com DMF e durante um minuto cada. A seguir à remoç3o da Fmoc-grupo protector por tratamento com piperidina 25'a em DMF, como descrito acima, é acoplado o aminoácido seguinte.
A síntese resulta após remoção do Fmoc-grupo protector na nonapéptido-resina II tBu tBu
H-Thr-Ala-Val-Val-Ala-Leu-Glu-Leu-Clnres i na
II péptido livre I é obtido a partir do nonapéptido-resina II a seguir a um tratamento em ácido trifluoroacótico-diclorometa no (1:1; v/v) durante três horas.
Este tratamento ácido efectua-se simultaneamente ã remoção dos grupos protectores à base de t-butilo e ao corte do pép t_i do da resina. A resina é removida por filtração. 0 filtrado é subsequentemente evaporado in vacuo. 0 resíduo é dissolvido em t-butanol-água (l:l; v/v). 0 TFA restante é então permutado por ácido acético por adição de resina permutadora iónica (OAc) Doujex 2x8.
A liofilização da solução resultante proporciona o nonapéptido I (como o sal de acetato).
Exemplo 2
Síntese de derivados do nonapéptido
A. Derivado S-acetiltioacetilo péptido I é dissolvido em DMF-H^O (2:1; v/v). 0 pH da solução é aumentado para 7,5-8,0 por adição de N-etil-N,N-diisa70 096
0Α/25Β7-511
-'«vcv.»
-14propilamina. E então adicionada uma solução de 1,2 equivalentes de N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA) em DMF. 0 pH da mistura reaccional ê mantido a 7,5-8,0 por adição da base terciária referida. Após 30 minutos à temperatura ambiente o pH da solução é baixado para 5,0 por adição de ácido acético. A seguir à remoção dos solventes por evaporação in vacuo, o resíduo é triturado com acetato de etilo-éter. 0 derivado do pêptido III é subsequejn temente dissolvido em t-butanol-água (l:l ; v/v) e isolado por liofilização.
0
II II
CH^-C-S-CH2-C-Thr-Ala-Ual-Ual-Ala-Leu-Glu-Leu-Gln-0H
III
B. Derivado maleimida
A acilação do grupo N -amino em I, utilizando o procedimento descrito no exemplo 2A, com N-succinimidil-4-(N-maleimidome til)ciclo-hexano-l-carboxilato (SMCC, Pierce) proporciona o derivado maleimida II/.
C. Derivado bromoacetilo
A acilação do grupo N -amino em I, utilizando o procedimento descrito no exemplo 2A, com N-succinimidilbromoacetato, prç porciona o derivado bromoacetilo V.
D. Derivado dissulfureto de piridilo
A acilação do grupo N^-amino em I, utilizando o procedimento descrito no exemplo 2A, com N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP, Pierce), proporciona o derivado dissulfureto de piridilo VI.
Exemplo 3
Síntese de derivados da qelonina
A. Derivado iminotiolano
Os grupos SH livres são introduzidos na gelonina por der_i vatizaçao da toxina com 2-iminotiolano (reagente de Trauts).
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-150 adicionado um excesso molar 50 vezes maior de 2-iminotiolano (2-iminotiolano a 0,4 M em tampão de fosfato a 0,1 M pH 8,0, contendo EDTA a 1 mM; concentração final do 2-iminotiolano é da 5 mmol/l) a 4 ml de solução de gelonina (3 mg/ml; lOO^mol/ /1) no tampão notado acima. A mistura reaccional é incubada durante 30 minutos a 3090. Subsequentemente a mistura é aplicada a uma coluna de Sephadex G25, equilibrada com tampão de fosfato a 0,1 M, pH 7,5, NaCl a 0,1 M, EDTA a 1 mM, para remover o excesso de reagente e produtos reaccionais de baixo peso molecular. 0 ren dimento deste passo de derivatização foi de 92;L e a toxina continha uma média de 1-2 grupos SH por molécula de gelonina.
0. Derivado dissulfuretD de piridilo
Os grupos dissulfureto de piridilo (PDP) são introduzidos na gelonina por dissolução da gelonina num tampão de fosfato a 0,1 M pH 7,5, NaCl a 0,1 M, EDTA a 1 mM (3 g de gelonina/l). E adicionado um excesso molar 5 vezes maior de succinimidilpiridilditiopropionato (SPDP a 40 mM em etanol; a concentração final de SPDP é de 500^mol/l) a 4 ml de solução de gelonina (3 g de gelonina/l) em tampão de fosfato a 0,1 M pH '7,5, NaCl a 0,1 M, EDTA a 1 mM e incubados 30 minutos à temperatura ambiente. Subsequentemente a mistura é aplicada a uma coluna de Sephadex G25, equilibrada no tampão notado acima para remover o excesso de reagente e os produtos reaccionais de baixo peso molecular. 0 rendimento da toxina foi de 95/ e as moléculas de toxina continham uma média de 1-2 grupos dissulfureto de piridilo por molécula de gelonina.
Exemplo 4
Ligação do derivado do nonapéptido ao derivado da gelonina
A. Ligação do nonapéptido IV ao derivado iminotiolano da gelonina ml de solução de derivado de gelonina (l,4 mg/ml) são incubados à temperatura ambiente com um excesso molar 2,5 vezes maior de nonapéptido IV (concentração final 115^umol/l) durante 2 horas. 0 tampão de incubação é um tampão de fosfato pH 7,5, NaCl a D,1 M, EDTA a 1 mM. Subsequentemente a mistura reaccional é aplicada a uma coluna de Sephadex G50, equilibrada com tampão de
096
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Λ-16incubação para remover o excesso de reagente e produtos reaccionais de baixo peso molecular. 0 derivado da gelonina a 72% é convertido no conjugado como testado por SDS-PAGE, contendo o componente principal uma molécula de gelonina por péptido.
A gelonina livre é removida por cromatografia de permuta iónica em Mono Q (tampão-Tris a 0,05 M, pH 8,0). 0 conjugado é eiuido com NaCl a 0,5 M.
B. Ligação do nonapéptido UI ao derivado iminotiolano da gelonina
A preparação do conjugado notado acima é realizada utilizando o procedimento descrito sob A.
C. Ligação do nonapéptido V ao derivado dissulfureto de piridilo da gelonina
A preparação do conjugado notado acima é realizada utilizando o procedimento descrito sob A.
Exemplo 5
Ligação do nonapéptido III ao derivado dissulfureto de piridilo da gelonina
0,5 ml de derivado da gelonina (l,4 mg/ml) são incubados durante a noite a temperatura ambiente com um excesso molar 2,5 vezes maior de nonapéptido III (concentração final de 115y*mol/l) no tampão de fosfato notado acima ao qual é adicionada hidroxilami na (10 mM).
Após estar completa a reacção a mistura é aplicada a uma coluna de Sephadex G50, equilibrada em tampão de incubação para remover o excesso de reagente e produtos reaccionais de baixo peso molecular. 0 derivado da gelonina a 67% é convertido no conjjj gado como testado por SDS-PAGE. A gelonina livre é removida por cromatografia de permuta iónica em Mono Q (tampão-Tris a 0,05 M, pH 8,0). 0 conjugado é eluído com NaCl a 0,5 M.
Exemplo 6
Ligação de um epitopo (RdV^) consistindo em 20 aminoácidos da sequãncia de aminoácidos 65-85 da proteína de 65 kD da Micobacterium
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-17tuberculosis (MT) a Ricina-A péptido com a sequência Lys-Thr-Ile-Ala-Tyr-Asp-Clu-Glu-Ala-Arg-Arg-Gly-Leu-Glu-Arg-Gly-Ala-Val-Arg-Asn-Ala-Lys é diluído em DMF/H^O (l:2). E adicionado SPDP a 0,4 M em DMF (relação molar l:l) e a mistura é incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente.
Após incubação são adicionados dois volumes de acetato de etilo e a mistura é centrifugada durante 5 min numa centrifuga eppendorf à velocidade máxima. 0 precipitado é lavado com éter e centrifugado outra vez durante 5 min à velocidade máxima. 0 pre cipitado é então seco sob gás de azoto.
precipitado seco é dissolvido em NaP a 0,1 M (pH = 7,3) num volume tão pequeno quanto possível.
A ricina-A (em NaP a 0,1 M pH =7,3) é reduzida por adição de DTT a 1 M para uma concentração de 10 mM e incubação da mistura durante 30 min à temperatura ambiente. A solução é então dessalinizada sobre PD 10 em NaP a 0,1 M (pH = 7,3).
A ricina-A reduzida é adicionada ao péptido tratado com SPDP numa relação molar de 1:5. A mistura é incubada à temperat_u ra ambiente durante 1 hr.
A solução conjugada resultante pode ser armazenada a 4 9 C. Se necessário, as impurezas com elevado peso molecular podem ser removidas cromatograficamente (Fractogel HvV 55 (s) em POS).
Exemplo 60
Um clone de células T humanas de um paciente AR é estimulado com o antigénio específico da proteína de 65 kD na presença de Células Apresentando Antigénio (CAA). São adicionadas concentrações variadas de ricina-A, Ricina-A de 65 kD ou RdV -ricina-A. Passados três dias a proliferação das células é medida 3través da incorporação de H3-timidina. Qs resultados são representados abaixo como percentagens da incorporação nas culturas estimuladas sem adição de toxina (conjugados).
a e b são uma primeira e uma segunda experiência respect_i_ v ame nte.
096
ΟΑ/2587-511 /?
| ^.g/ ml de toxina | de incorpora ção de Ricina A | /ó de incorpora ção de Ricina A de 65 kD | /□ de incorpora ção de Ricina-A- -RdU a | |||
| a | b | |||||
| a | b | a | b | |||
| 0 | (o) | 100 | (100) | 100 | (100) | 100 |
| 0,1 | (0,02) | 71 | (96) | 45 | (86) | 30 |
| 0,3 | (0,2) | 90 | (64) | 32 | (78) | 26 |
| 1,0 | (2,0) | 80 | (22) | 47 | (76) | 24 |
| 3,0 | (20,0) | 24 | (6) | 31 | (59) | 17 |
| 10,0 | 11 | 44 | 18 | |||
| 30,0 | 7 | 19 | 7 |
0s valores de LD^-q para as experiências acima mostradas são
Ricina-A Ricina-A de 65 kD RdV^-Ricina-A
LD50 1,1 33 <0,1
Por consequência podemos concluir que o conjugado de epítopo-Ricina-A é mais tóxico para estas células que a toxina sozinha ou que o conjugado de toxina de 65 kD.
Exemplo 60
São repetidas as mesmas experiências como no exemplo 6B com a condição de que não estão presentes células apresentando a_n tigénio e que as células T são estimuladas com IL-2 (antigénio não específico). Os resultados são mostrados abaixo.
096
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| M,g/ml de toxina | Ricina-A | Ricina-A de 65 kD | Ricina-A-RdV^ a | |||
| a | b | a | b | a | b | |
| 0 | (o) | 100 | (100) | 100 | (100) | 100 |
| 0,1 | (0,02) | 105 | (100) | 96 | (107) | 93 |
| 0,3 | (0,2) | 92 | (93) | 89 | (90) | 90 |
| 1,0 | (2,0) | 85 | (80) | 73 | (81) | 75 |
| 3,0 | (20,0) | 82 | (D | 31 | (17) | 27 |
| 10,0 | 47 | 17 | 25 | |||
| 30,0 | 4 | 1 | 2 |
Α média dos valores de LD^q são:
toxina toxina de 65 kD toxina-RdU^
LD<-q médio 6,8 3,9 1,7
Pode ser concluído que os conjugados de RdV^-Ricina-A s3o os mais efectiuos na inibição da proliferação deste clone de cél_u las T.
E xemplo 7
Em ratazanas de Leuis machos é induzida a artrite adjuvaç te pela Micobacterium butiricum (100 mg/ml em querosene).
Cada 6 grupos de 5 ratazanas são tratados aos dias 0-5 e aos dias 8-12 com injecções do seguinte: grupo 1 placebo grupo 2 conjugado de Ricina-A de 65 kD (ver exemplo 6) (1 mg/kg) grupo 3 conjugado de péptido I-Ricina-A (ver exemplo 5) (0,25 mg/kg) grupo 4 Ricina-A (0,25 mg/kg) grupo 5 proteína de 65 kD (0,5 mg/kg) grupo 6 péptido I (0,01 mg/kg)
096
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-20Νο dia 22 são injectados lOy^g de proteína de 65 kD no ouvido.
No dia 24 é determinada a tumefacção do ouvido.
Os resultados médios são calculados por grupo e represen tados como percentagens de tumefacção.
| grupo | /o de tumefacção |
| (1) | 5,0 +_ 2,6 |
| (2) | 8,1 ± 2,8 |
| (3) | -0,2 + 2,5 |
| (4) | 8,1 +. 3,0 |
| (5) | 5,8 +. 2,9 |
| (6) | 2,8 +. 3,4 |
Pode ser concluído que o conjugado de nonapéptido-Ricina exibe o DTH contra a proteína de 65 kD em ratazanas.
096
ΟΑ/2587-511
.£
Claims (9)
- R Ε I U I Ν D I C fl Ç ί Ε S1 - Processo de preparação de uma imunotoxina para o tratamento ou profilaxia de uma doença auto-imune, compreendendo a imunotoxina um epítopo, reconhecido pelos linfócitos T, sendo característico para a doença auto-imune específica ou um seu análogo reactivo cruzadamente, caracterizado por o referido epítopo ou o seu análogo reactivo cruzadamente ser acoplado a uma substância citotóxica quer directamente quer por meio de um ligante.
- 2 - Processo de preparação de uma imunotoxina para o tratamento ou profilaxia da artrite reumatóide de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o epítopo residir na proteína da cartilagem da articulação.
- 3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza do por o epítopo ter a sequência de aminoácidos Thr-Ala-Val-WalAla-Leu-Glu-Leu-Gln.
- 4 - Processo de preparação de uma imunotoxina para o tratamento ou profilaxia da artrite reumatóide de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o epítopo residir na proteína de 65 KD de Mycobacterium.
- 5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizja do por o epítopo ter a sequência de aminoácidos Thr-Phe-Gly-Leu-Gln-Leu-Glu-Leu-Thr.
- 6 - Processo de preparação de uma imunotoxina para o tratamento ou profilaxia da esclerose múltipla de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por □ epítopo residir na proteína básica de mielina.
- 7 - Processo de preparação de uma imunotoxina para o tratamento ou profilaxia da miastenia grave de acordo com a reivindq. cação 1, caracterizado por o epítopo residir no receptor da acetilcolina.
- 8 - Processo de acordo com as reivindicações 1-7, caracterizado por a substância citotóxica ser uma proteína inactivante do ribossoma.70 096ΟΑ/2587-511-229 - Processo de acordo com as reivindicações 1-7, caracte rizado por a substância citotóxica ser um radio-isótopo.
- 10 - Processo de preparação de um preparado farmacêutico, caracterizado por se associar, como componentes biologicamente ac tivos, uma ou mais imunotoxinas preparadas de acordo ccm as reivindicações 1-9, com veículos ou diluentes farmaceuticamente ace_i táveis .
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