BR112014021256B1 - Composições de conjugado de xten e métodos de produção das mesmas - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES DE CONJUGADO DE XTEN E MÉTODOS DE PRODUÇÃO DAS MESMAS. A presente invenção refere-se a composições de polipeptídeo recombinante estendido (XTEN), as composições de conjugado compreendendo XTEN e o XTEN ligado a reticuladores úteis para conjugação de cargas úteis farmacologicamente ativas, métodos de produção de XTEN altamente purificado, métodos de produção de conjugados de XTEN-ligante e XTEN-carga útil, e métodos de uso das composições de XTEN-reticulador e XTEN-carga útil.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDO RELACIONADO

[001] Este pedido reivindica benefício de prioridade para Pedido Provisório US N° de Série 61/634312 depositado em 27 de fevereiro de 2012, Pedido Provisório US N° de Série 61/690187 depositado em 18 de junho de 2012, e Pedido Provisório US N° de série 61/70 9942 depositado em 04 de outubro, 2012, cujos pedidos são aqui incorporados por referência.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[002] Estendendo a meia-vida de um agente terapêutico, quer seja uma proteína terapêutica, um peptídeo ou molécula pequena, muitas vezes requer formulações especializadas ou modificações para o próprio agente terapêutico. Métodos convencionais tais como a modificação de peguilação, adicionando ao agente terapêutico um fragmento de anticorpo ou uma molécula de albumina, sofrem de um certo número de inconvenientes profundos. Embora estas formas modificadas possam ser preparadas em larga escala, estes métodos convencionais são geralmente atormentados por alto custo dos produtos, processo de fabricação complexo, e baixo grau de pureza do produto final. Muitas vezes, é difícil, se não impossível, purificar a homogeneidade da entidade alvo. Isto é particularmente verdadeiro para peguilação, onde a reação propriamente dita não pode ser controlada com precisão para gerar uma população homogênea de agentes peguilados que carregam o mesmo número ou massa de polietileno-glicol. Além disso, os metabolitos destes agentes peguilados podem ter efeitos colaterais severas. Por exemplo, as proteínas PEGiladas foram observadas causar vacuolização tubular renal em modelos animais (Bendele, A., Seely, J., Richey, C., Sennello,G.&Shopp,G. Short communication: renal tubular vacuolation in animals treated with polyethylene-glycol-conjugated proteins. Toxicol. Sci. 1998. 42, 152-157). Proteínas PEGiladas renalmente liberadas ou os seus metabólitos podem acumular-se no rim, causando a formação de hidratos de PEG que interferem com a filtração glomerular normal. Além disso, os animais e os seres humanos podem ser induzidos a produzir anticorpos para o PEG (Sroda, K. et al. Repeated injections of PEG-PE liposomes generate anti-PEG antibodies. Cell. Mol. Biol. Lett. 2005.10, 37-47).

[003] Assim, continua a haver uma necessidade considerável de métodos alternativos e de composições úteis para a produção de forma altamente pura de agentes terapêuticos, com propriedades de semivida prolongados, a um custo razoável.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[004] A presente invenção aborda esta necessidade e prevê também vantagens relacionadas. As composições e métodos aqui descritos são úteis não só como agentes terapêuticos mas também são particularmente úteis como ferramentas de investigação para o desenvolvimento pré-clínico e clínico de um agente terapêutico candidato. Em alguns aspectos, a presente invenção aborda esta necessidade, em parte, gerando reagentes polipeptídeos recombinantes estendidos (XTEN) que podem ser purificadas até à homogeneidade com um ou alguns passos simples, e/ou que são passíveis de conjugação química, com peptídeos de carga, proteínas e pequenas moléculas com grupos reativos, utilizando uma grande diversidade de métodos de conjugação. A utilização dos reagentes XTEN gera produtos de alto rendimento de agente ligado a XTEN que são superiores em um ou mais aspectos, incluindo elevada homogeneidade, elevada solubilidade, estabilidade longa e uma maior semivida terminal em comparação com o produto não conjugado.

[005] A presente invenção refere-se, em parte, a novas composições compreendendo os polipeptídeos recombinantes prolongados substancialmente homogêneos (XTEN) úteis como parceiros de conjugação para a ligação com um ou mais agentes ativos biologica ou farmaceuticamente, o que resulta em composições de carga XTEN. Num aspecto, a invenção prevê XTEN de engenharia para ligação covalente a uma ou mais cargas, quer diretamente ou através de agentes de reticulação, resultando na composição de carga XTEN que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais moléculas de um, dois, três ou mais tipos de cargas. É um objeto da presente invenção prever tais polipeptídeos XTEN modificadas para utilização na criação de conjugados com agentes de carga de interesse na forma de composições farmacêuticas com propriedades melhoradas, incluindo as propriedades farmacocinéticas melhoradas. A invenção prevê XTEN que são substancialmente homogêneos em comprimento e sequência que são úteis para a preparação dos conjugados que compreendem o XTEN ligada a uma ou mais cargas de tal modo que os conjugados resultantes de carga XTEN têm um elevado grau de pureza. Tais conjugados de elevado grau de pureza são úteis na preparação de composições farmacêuticas para indivíduos com uma condição médica para a qual as uma ou mais cargas têm utilidade na prevenção, tratamento ou melhoramento da doença.

[006] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece composições substancialmente homogêneas XTEN polipeptídicas úteis como parceiros de conjugação para criar intermediários De reticulação XTEN e composições de carga XTEN. Em algumas modalidades, a invenção prevê uma população substancialmente homogênea de polipeptídeos compreendendo um polipeptídeo recombinante prolongada (XTEN), e em que, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% das moléculas polipeptídicas individuais em tal população tem comprimento de sequência idêntica. Em uma modalidade do acima exposto, o XTEN é caracterizado pelo fato de: o total de resíduos de aminoácidos XTEN é pelo menos 36 a cerca de 3000 resíduos de aminoácidos; a soma de resíduos de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) constitui mais do que cerca de 90% do total de resíduos de aminoácidos do XTEN; a sequência XTEN é substancialmente não-repetitiva tal que (i) a sequência XTEN não contém três aminoácidos contíguos que são idênticos a não ser que os aminoácidos sejam serina, (ii) pelo menos cerca de 80%, ou cerca de 90%, ou cerca de 95% da sequência XTEN consiste de motivos de sequências que não se sobreponham, cada um dos motivos de sequência compreendem cerca de 9 a cerca de 14 resíduos de ácidos aminados, em que quaisquer dois resíduos de aminoácidos contíguos não ocorrem mais do que duas vezes em cada um dos motivos de sequência; ou (iii) a sequência de XTEN tem uma subsequência de pontuação inferior a 10; a sequência XTEN tem mais do que 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou maior do que 99% de formação de enrolamento aleatório, como determinado pelo algoritmo de GOR; a sequência XTEN tem menos do que 2% ou 3%, ou de 4%, ou 5% hélices alfa; a sequência XTEN tem menos do que 2% ou 3%, ou de 4%, ou 5% de folhas beta, tal como determinado pelo algoritmo de Chou-Fasman; e a sequência XTEN carece de um epitopo de células T predito quando analisado pelo algoritmo TEPITOPE, em que a predição do algoritmo TEPITOPE para epitopos dentro da sequência de XTEN baseia-se numa pontuação de -8, -9 ou, ou -10. Numa outra modalidade do acima exposto, o XTEN compreende uma sequência que possui pelo menos cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências definidas na Tabela 2, Tabela 3, Tabela 4 e nas Tabelas 2225.

[007] Em outras modalidades, as composições de polipeptídeos substancialmente homogêneas XTEN compreendem um ou mais marcadores de afinidade. Numa modalidade, a invenção prevê uma composição de polipeptídeo XTEN substancialmente homogênea compreendendo um primeiro marcador de afinidade, em que o primeiro marcador de afinidade tem afinidade de ligação para um substrato de cromatografia selecionado a partir do grupo consistindo de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), de troca catiônica, troca aniônica, imobilizada cromatografia de afinidade com íons de metal (IMAC), e do anticorpo imobilizado. Em uma modalidade do acima exposto, o primeiro marcador de afinidade tem, pelo menos, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou, pelo menos, cerca de 95% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências definidas apresentados na Tabela 7 Noutra modalidade da etiqueta de afinidade e XTEN exposto, a composição compreende ainda uma ou mais sequências auxiliares. Numa modalidade, uma sequência auxiliar compreende uma sequência que possui pelo menos cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou, pelo menos, cerca de 95 % de identidade, ou pelo menos cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou 100% de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências apresentadas na Tabela 10 Em outra modalidade, a sequência auxiliar é selecionada a partir do grupo que consiste em: em que X1 é KNPEQAEEQX1EET independentemente S ou R; ANPEQAEEQX1EET em que X1 é S ou R de forma independente; KNPEQAEEQAEEQX1EET em que X1 é S ou R de forma independente; KX2X3EQAEEQAEEQX1EET em que X1 é S ou R de forma independente, X2 é, independentemente, N ou K, e X3 é, independentemente, K, N, T, Q, H, P, E, D, A, R, ou S; KX2 (X3) 10QX1EET em que X1 é S ou R de forma independente, X2 é, independentemente, N ou K, e X3 é, independentemente, K, N, T, Q, H, P, E, D, A, R, ou S; KX2 (X3) 7AEEQX1EET em que X1 é, independentemente, R ou S, X2 é, independentemente, K ou N, e X3 é, independentemente, K, N, T, Q, H, P, E, D, A, R, ou S; KX2X3EQE (X3)3AEEQREET em que X2 é independentemente K ou N, e X3 é, independentemente, K, N, T, Q, H, P, E, D, A, R, ou S; KX2X3EQE(X3)3AEE(X3)5, em que X2 é independentemente K ou N, e X3 é, independentemente, K, N, T, Q, H, P, E, D, A, R, ou S; KKQEQEKEQAEEQ(X4X5)2REET em que X4 é independentemente A ou S e X5 representa, independentemente, K, Q ou E; KKQEQEKEQAEEQ(X4X5)4REET em que X4 é independentemente A ou S e X5 representa, independentemente, K, Q ou E; KKQEQEKEQAEEQ(Z)4REET, em que Z é qualquer que ocorrem naturalmente L-aminoácido; KX2(X3)n, em que n é um número inteiro de 10-40 e X2 é, independentemente, N ou K, e X3 é, independentemente, K, N, T, Q, H, P, E, D, A, R, ou S; (X3)n, em que n é um número inteiro de 10-50 e X3 é, independentemente, K, N, T, Q, H, P, E, D, A, R, ou S; KX2QEQEKEQAEEQ(X4X5)nX1EET em que n é zero ou um número inteiro de 1-10 e X1 é S ou R de forma independente, X2 é, independentemente, N ou K, X4 é independentemente A ou S, e X5 representa, independentemente, K, Q ou E; KX2(X3)n(X4X5)mX1EET, em que n é um número inteiro de 5-20 m é zero ou um número inteiro de 1-10, X1 é, independentemente, R ou S, X2 é, independentemente, N ou K, o símbolo X3 representa, independentemente, K, N, T, Q, H, P, E, D, A, R, ou S, X4 é independentemente A ou S, e X5 representa, independentemente, K, Q ou E; e KX2(X3)n(Z)mX1EET, em que n é um número inteiro de 5-20 m é zero ou um número inteiro de 1-10, X1 é, independentemente, R ou S, X2 é, independentemente, N ou K, o símbolo X3 representa, independentemente, K , N, T, Q, H, P, E, D, A, R, ou S, e Z é qualquer ocorrência natural de L-aminoácido, e quaisquer homólogos de sequência mostrando, pelo menos, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% de identidade de sequência do que precede, quando alinhadas de forma óptima.

[008] Em outras modalidades do acima exposto, substancialmente homogênea XTEN marca de afinidade, e composições auxiliares de sequência, a composição compreende ainda uma primeira sequência de clivagem. Quando desejado, a sequência de clivagem é selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências apresentadas na Tabela 8 e na Tabela 9 Numa modalidade do acima exposto, a composição tem a configuração da fórmula I: (HS)-(AT1)-(CS1)-(XTEN) I onde HS é a sequência auxiliar; AT1 é a primeira marca de afinidade; CS1 é a primeira sequência de clivagem; e XTEN é o polipeptídeo recombinante prolongada. Numa outra modalidade das composições anteriores, a composição compreende ainda uma segunda sequência de clivagem. Quando se desejar, a primeira e segunda sequências de clivagem são capazes de serem clivados por proteases ao mesmo, e em que a composição tem a configuração da fórmula II: (HS)-(CS1)-(XTEN)-(CS2)-(AT1) II onde HS é uma sequência auxiliar; AT1 é a primeira marca de afinidade; CS1 é a primeira sequência de clivagem; CS2 é a segunda sequência de clivagem; e XTEN é o polipeptídeo recombinante prolongada. Numa outra modalidade das composições anteriores, a primeira marca de afinidade compreende a sequência RPRPRPRPRPRPR, HHHHHH, ou qualquer marca de afinidade conhecida na arte ou aqui descrita.

[009] Em outras modalidades das composições XTEN substancialmente homogêneos, as composições compreendem um primeiro e um segundo marcador de afinidade, uma primeira e uma segunda sequência de clivagem, e uma sequência auxiliar, em que o segundo marcador de afinidade é diferente a partir da primeira marca de afinidade e que tem afinidade de ligação para um substrato de cromatografia diferente do que a da primeira marcador de afinidade, em que o substrato é de cromatografia selecionado a partir do grupo consistindo de HIC, de troca catiônica, de troca de ânions, IMAC, e anticorpo imobilizado, e em que a primeira e segunda sequências de clivagem são capazes de ser clivada pela mesma protease, e em que o segundo marcador de afinidade tem, pelo menos, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou, pelo menos, cerca de 95% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências indicados na Tabela 7 Em uma modalidade da composição anterior, a composição tem a configuração da fórmula III: (HS)-(AT1)-(CS1)-(XTEN)-(CS2)-(AT2) III

[010] onde HS é a sequência auxiliar; AT1 é a primeira marca de afinidade; CS1 é a primeira sequência de clivagem; CS2 é a segunda sequência de clivagem; XTEN é o polipeptídeo recombinante prolongada; e AT2 é a segunda marca de afinidade. Numa outra modalidade da composição anterior, a primeira marca de afinidade compreende o RPRPRPRPRPRPR sequência e o segundo marcador de afinidade compreende a sequência HHHHHH. Numa outra modalidade da composição anterior, a primeira marca de afinidade compreende a sequência HHHHHH e a segunda marca de afinidade compreende o RPRPRPRPRPRPR sequência. Numa outra modalidade da composição anterior, a primeira marca de afinidade compreende o RPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPR sequência e o segundo marcador de afinidade compreende a sequência HHHHHHHH.

[011] Em outro aspecto, a invenção prevê composições que compreendem uma população substancialmente homogênea de um polipeptídeo obtido por um processo. Em algumas modalidades, as composições são obtidas pelo processo que compreende: a cultura de uma célula hospedeira que compreende um vector que codifica o polipeptídeo numa reação de fermentação, sob condições eficazes para expressar o polipeptídeo por um produto de expressão em bruto da célula hospedeira, em que o polipeptídeo codificado compreende um XTEN, uma primeira sequência de clivagem e uma primeira marca de afinidade; adsorver o polipeptídeo de o produto de expressão em bruto para um primeiro substrato de cromatografia em condições eficazes para capturar a primeira marcador de afinidade para o primeiro substrato de cromatografia; eluição do polipeptídeo ; e a recuperação do polipeptídeo. Em algumas modalidades, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% dos polipeptídeos da população resultante tem comprimento de sequência idêntica. Em uma modalidade da composição anterior, o primeiro substrato de cromatografia é selecionado a partir do grupo consistindo de HIC, de troca catiônica, de troca de ânions, e IMAC. Numa outra modalidade da composição anterior, a marca de afinidade é selecionada a partir do grupo que consiste nos marcadores de afinidade da Tabela 7 Numa outra modalidade da composição anterior o primeiro substrato de cromatografia de troca catiônica e é a primeira marca de afinidade compreende o RPRPRPRPRPRPR sequência. Numa outra modalidade da composição anterior, o primeiro substrato de cromatografia IMAC e é a primeira marca de afinidade compreende a sequência HHHHHHHH. Em uma modalidade da composição anterior, o vector de codificação codifica qualquer uma das concretizações aqui descritas XTEN compreendendo pelo menos marca de afinidade, pelo menos, uma primeira sequência de clivagem, uma sequência auxiliar, e, opcionalmente, uma segunda sequência de clivagem. Numa outra modalidade da composição anterior, o vector codifica ainda uma segunda sequência de clivagem e uma segunda marca de afinidade, em que os primeiro e o segundo sequências de clivagem são capazes de serem clivados por proteases e a mesma afinidade, em que o segundo marcador de afinidade tem uma ligação ao segundo , substrato de cromatografia diferente da primeira marca de afinidade, e em que a composição é obtida através do processo que compreende ainda: a adsorção do polipeptídeo para um segundo substrato de cromatografia em condições eficazes para capturar o segundo marcador de afinidade para a segunda cromatografia de substrato; eluição do polipeptídeo ; e a recuperação do polipeptídeo , em que pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% dos polipeptídeos da população tem comprimento de sequência idêntica. Em uma modalidade do acima exposto, o primeiro substrato de cromatografia é diferente do segundo substrato de cromatografia e cada um do primeiro e o segundo substrato de cromatografia são selecionados de forma independente a partir do grupo consistindo de HIC, de troca catiônica, de troca de ânions, e IMAC. Numa outra modalidade da composição anterior, o primeiro substrato de cromatografia de troca catiônica e é a primeira marca de afinidade compreende o RPRPRPRPRPRPR sequência ou RPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPR e o segundo substrato é cromatografia IMAC e a primeira marca de afinidade compreende a sequência HHHHHHHH ou HHHHHHHH. Numa outra modalidade da composição anterior, o primeiro substrato de cromatografia IMAC e é a primeira marca de afinidade compreende a sequência HHHHHHHH ou HHHHHHHH e o segundo substrato de cromatografia de troca catiônica e é a primeira marca de afinidade compreende o RPRPRPRPRPRPR sequência ou RPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPR. Numa outra modalidade, as composições anteriores que compreendem um primeiro ou de um primeiro e um segundo marcador de afinidade é ainda processado por tratamento da composição com uma protease, sob condições eficazes para clivar a sequência de clivagem (s), libertando assim o XTEN a partir da etiqueta de afinidade (s ); adsorver o XTEN sobre um substrato de cromatografia em condições eficazes para capturar o XTEN mas não a etiqueta de afinidade (s) ou a protease; eluindo o XTEN; e recuperando o XTEN. Pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% das moléculas individuais de XTEN na composição resultante tem comprimento de sequência idêntica. Em uma modalidade da composição anterior, a sequência (s) de clivagem é capaz de ser clivado por uma protease selecionada a partir do grupo que consiste de proteases de Tabela 9 Numa outra modalidade da composição anterior, a sequência (s) de clivagem é capaz de ser clivado pela tripsina e a protease é a tripsina. Numa outra modalidade da composição anterior, o substrato é de cromatografia de troca aniônica. O substrato de troca aniônica pode ser um substrato selecionado a partir do grupo consistindo de Q macrocap, capto Q, SuperQ 650M, e Poros D. Em alternativa, as composições precedentes, compreendendo uma etiqueta de afinidade ou dois marcadores de afinidade são transformados, por tratamento da composição sob condições eficazes para clivar a sequência de clivagem (s ), libertando assim o XTEN partir das etiquetas de afinidade, um ou dois; adsorver a protease para um substrato de cromatografia em condições eficazes para capturar a protease e os marcadores de afinidade, mas não o XTEN; e recuperar o XTEN do eluato. Em algumas modalidades, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% das moléculas individuais de XTEN do eluato resultante tem comprimento de sequência idêntica. Em uma modalidade da composição anterior, a sequência (s) de clivagem é capaz de ser clivado por uma protease selecionada a partir do grupo que consiste de proteases de Tabela 9 Numa outra modalidade da composição anterior, a sequência (s) de clivagem é capaz de ser clivado pela tripsina e a protease utilizada é a tripsina. O substrato de cromatografia pode ser selecionado a partir de um ou mais de troca de cátions, HIC ou IMAC.

[012] Em outro aspecto, a invenção refere-se, em parte, a composições polipeptídicas que podem ser clivados em segmentos XTEN de igual comprimento e sequência. Numa modalidade, a invenção prevê uma composição compreendendo uma sequência de XTEN, em que a sequência XTEN compreende ainda um ou mais sequências de clivagem capaz de ser clivado pela tripsina e em que o tratamento com tripsina em condições eficazes para clivar todas as sequências de clivagem resulta em uma preparação de fragmentos XTEN, em que cada fragmento XTEN tem, pelo menos, cerca de 99% de identidade de sequência com todos os outros fragmentos na preparação. Em uma modalidade da composição, a sequência de clivagem possui pelo menos 86% de identidade de sequência de ou é idêntica à sequência de SASRSA ou SASKSA. Numa outra modalidade da composição, a sequência de clivagem compreende a sequência de RX ou KX, em que X é qualquer L- aminoácido com exceção de prolina. Numa modalidade das composições anteriores, a composição XTEN tem pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência de as sequências selecionadas a partir do grupo de sequências apresentadas na Tabela 6.

[013] Em outro aspecto, a invenção refere-se, em parte, a métodos para a produção de fragmentos XTEN substancialmente de igual comprimento e sequência. Numa modalidade, a invenção prevê um método para produzir uma população substancialmente homogênea de uma XTEN, o método compreendendo o tratamento de uma população de polipeptidos que compreendem uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências expostas na Tabela 6 com tripsina em condições eficazes para clivar a totalidade da sequência de clivagem (s) resultante numa população substancialmente homogênea XTEN em que, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% das moléculas individuais dos fragmentos XTEN têm comprimento de sequência idêntica. Em uma modalidade do processo anterior, o método compreende ainda a adsorventes os fragmentos XTEN cromatografia sobre um substrato sob condições eficazes para capturar os fragmentos XTEN mas não a protease; eluição dos fragmentos XTEN; e recuperando os fragmentos XTEN em que, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% das moléculas individuais da população têm comprimento de sequência idêntica. Em uma modalidade do método anterior, o substrato é de cromatografia de troca aniônica. O substrato pode ser selecionado a partir do grupo consistindo de Q macrocap, capto Q, SuperQ 650M, e Poros D. Numa outra modalidade do método anterior, o XTEN tem, pelo menos, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências exposto na Tabela 6 Em outra modalidade do processo anterior, o fragmento resultante XTEN tem, pelo menos, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências exposto na Tabela 2 ou 3 Em outra modalidade, a invenção prevê composições XTEN feitos pelo processo das modalidades do método anterior.

[014] Em outro aspecto, a invenção refere-se, em parte, a métodos para a produção XTEN em rendimentos elevados de expressão de uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, a invenção prevê um método que compreende a cultura de uma célula hospedeira que compreende um vector que codifica um polipeptídeo compreendendo a XTEN e uma sequência auxiliar numa reação de fermentação, sob condições eficazes para expressar o polipeptídeo como uma componente de um produto de expressão em bruto, a uma concentração de mais do que cerca de 2 gramas/por litro (g/L), ou cerca de 3 g/L, ou cerca de 4 g/L, ou de cerca de 5 g/L, ou de cerca de 6 g/L, ou cerca de 7 g/L do referido polipeptídeo. Em uma modalidade do processo anterior, os rendimentos de expressão anterior são alcançados quando a reação de fermentação atinge uma densidade óptica de pelo menos 100, ou pelo menos 130, ou pelo menos 150 a um comprimento de onda de 600 nm. Numa outra modalidade, a invenção prevê um método compreendendo a cultura de uma célula hospedeira que compreende um vector que codifica um polipeptídeo compreendendo a XTEN e uma sequência auxiliar numa reação de fermentação, sob condições eficazes para expressar o polipeptídeo como uma componente de um produto de expressão em bruto, a uma concentração de mais do que cerca de 10 miligramas/grama de peso seco de células de acolhimento (mg/g), ou, pelo menos, cerca de 15 mg/g, ou, pelo menos, cerca de 20 mg/g, ou, pelo menos, cerca de 25 mg/g, ou, pelo menos, cerca de 30 mg/g, ou, pelo menos cerca de 40 mg/g, ou, pelo menos, cerca de 50 mg/g do referido polipeptídeo. Em uma modalidade do processo anterior, a expressão de alto rendimento que precede é conseguida quando a reação de fermentação atinge uma densidade óptica de pelo menos 100, ou pelo menos 130, ou pelo menos 150 a um comprimento de onda de 600 nm. Numa outra modalidade, a invenção prevê um método compreendendo a cultura de uma célula hospedeira que compreende um vector que codifica um polipeptídeo compreendendo a XTEN e uma sequência auxiliar numa reação de fermentação, sob condições eficazes para expressar o polipeptídeo como uma componente de um produto de expressão em bruto, a uma concentração de mais de cerca de 10 miligramas/grama de célula hospedeira de peso seco (mg/g), ou, pelo menos, cerca de 250 micromoles/L, ou a cerca de 300 micromoles/L, ou cerca de 350 micromoles/L, ou a cerca de 400 micromoles/L, ou cerca de 450 micromoles/L, ou cerca de 500 micromol/L do referido polipeptídeo. Em uma modalidade do processo anterior, os rendimentos de expressão anterior são alcançados quando a reação de fermentação atinge uma densidade óptica de pelo menos 100, ou pelo menos 130, ou pelo menos 150 a um comprimento de onda de 600 nm. Em uma modalidade dos métodos anteriores, a sequência auxiliar do polipeptídeo expresso é na região N- terminal do polipeptídeo, em que a sequência auxiliar tem, pelo menos, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% de identidade de sequência ou é idêntico a um sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências apresentadas na Tabela 10 Noutra modalidade dos métodos anteriores, vector de expressão codifica ainda uma primeira marca de afinidade e uma sequência de clivagem entre o marca de afinidade e a XTEN, e o método compreende ainda a recuperação produto de expressão em bruto da mistura de reação de fermentação de células hospedeiro; adsorver o polipeptídeo de o produto de expressão em bruto para um primeiro substrato de cromatografia em condições eficazes para capturar a primeira marca de afinidade do polipeptídeo na superfície do substrato, em que a cromatografia em primeiro substrato é selecionado a partir do grupo consistindo de HIC, de troca catiônica, de troca de ânions, e IMAC; eluição e recuperação do polipeptídeo em que, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% dos polipeptídeos têm comprimento de sequência idêntica. Numa outra modalidade dos métodos anteriores, vector de expressão codifica ainda uma primeira marca de afinidade e uma segunda marca de afinidade diferente da primeira marcador e uma sequência de clivagem entre cada etiqueta de afinidade e o XTEN, e o método compreende ainda a recuperação do produto bruto da expressão hospedar mistura de reação de fermentação de células; adsorver o polipeptídeo para um primeiro substrato de cromatografia, sob condições eficazes para capturar a primeira marca de afinidade do polipeptídeo na superfície do substrato, em que a cromatografia em primeiro substrato é selecionado a partir do grupo consistindo de HIC, de troca catiônica, de troca de ânions, e IMAC; eluição do polipeptídeo ; adsorver o polipeptídeo para um segundo substrato de cromatografia em condições eficazes para capturar o segundo marcador de afinidade do polipeptídeo na superfície do substrato, em que a cromatografia em segundo substrato é selecionado a partir do grupo consistindo de HIC, de troca catiônica, de troca de ânions, e IMAC; eluição do polipeptídeo ; e a recuperação do polipeptídeo , em que pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% dos polipeptídeos têm comprimento de sequência idêntica. Em uma modalidade dos métodos anteriores, os métodos compreendem ainda o tratamento do polipeptídeo com uma protease sob condições eficazes para clivar a sequência de clivagem (s), libertando assim o XTEN do polipeptídeo ; adsorver o XTEN sobre um substrato de cromatografia de ânions sob condições eficazes para capturar o XTEN; eluindo o XTEN; e recuperando o XTEN em que pelo menos 90%, ou, pelo menos, 91%, ou, pelo menos, 92%, ou, pelo menos, 93%, ou, pelo menos, 94%, ou pelo menos 95% das moléculas individuais XTEN têm comprimento de sequência idêntica. Nos métodos anteriores, o substrato de troca aniônica pode ser selecionado a partir do grupo consistindo de Q macrocap, capto Q, SuperQ 650M, e Poros D. Numa modalidade dos métodos anteriores, as sequências de clivagem são capazes de ser clivado pela tripsina e a protease é tripsina. Numa outra modalidade dos métodos anteriores, o método compreende adicionalmente o tratamento do polipeptídeo com uma protease, sob condições eficazes para clivar a sequência de clivagem (s), libertando assim o XTEN do polipeptídeo ; adsorver a protease para um substrato de cromatografia em condições eficazes para capturar a protease e os marcadores de afinidade, mas não o XTEN; e recuperando o XTEN no eluato, em que, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% do comprimento XTEN ter sequência idêntica. Em uma modalidade do método anterior, a sequência de clivagem é capaz de ser clivado pela tripsina e a protease utilizada é a tripsina. No processo anterior para capturar a protease e a etiqueta de afinidade, o substrato de cromatografia pode ser selecionado a partir de um ou mais de HIC, de troca catiônica, e IMAC.

[015] Em outro aspecto, a invenção refere-se, em parte, a um suporte sólido compreendendo nele imobilizada uma população de moléculas de polipeptídeos substancialmente idênticos XTEN. Numa modalidade, a invenção prevê um suporte sólido que compreende nele imobilizada uma população de molécula de polipeptídeo substancialmente idênticos, em que o suporte sólido ser constituído por um substrato de cromatografia, polipeptídeos imobilizados compreendendo cada um XTEN, uma primeira marca de afinidade e uma segunda marca de afinidade, em que a primeira afinidade etiqueta está unida à XTEN por uma sequência de clivagem na extremidade N-terminal da XTEN e o segundo marcador de afinidade é ligada à XTEN por uma sequência de clivagem no terminal C e em que o segundo marcador de afinidade é diferente a partir da primeira marca de afinidade , em que o substrato de cromatografia é capaz de se ligar a qualquer das referidas primeira ou segunda dito marcador de afinidade, mas não ambos, e em que, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% das moléculas de polipeptídeo imobilizado têm comprimento de sequência idêntica. Em uma modalidade da XTEN compreende uma sequência que possui pelo menos cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou, pelo menos, cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 96 % de identidade, ou pelo menos cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou 100% de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências apresentadas na Tabela 2, Tabela 3, Tabela 4 e nas Tabelas 22-25, a primeira e a segunda marca de afinidade de cada uma independentemente pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou, pelo menos, cerca de 95% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste das sequências apresentadas na Tabela 7, e a sequência de clivagem é selecionado a partir do grupo que consiste nas sequências apresentadas na Tabela 8 e na Tabela 9 Numa concretização do exposto, a sequência de clivagem possui pelo menos cerca de 86% de identidade de sequência ou para é idêntica à sequência de SASRSA ou SASKSA. Em uma modalidade do acima exposto a sequência de clivagem compreende a sequência de RX ou KX, em que X é qualquer L- aminoácido com exceção de prolina. Em uma modalidade do acima exposto, o suporte sólido é selecionado de entre o grupo que consiste em resina de HIC cromatografia, resina de cromatografia de troca de cátions, resina de cromatografia de troca de ânions, e a resina de cromatografia IMAC. Em uma modalidade do acima exposto, a primeira marca de afinidade compreende o RPRPRPRPRPRPR sequência ou RPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPR e o segundo marcador de afinidade compreende a sequência HHHHHH ou HHHHHHHH. Numa outra modalidade do acima exposto, a primeira marca de afinidade compreende a sequência HHHHHH ou HHHHHHHH e a segunda marca de afinidade compreende o RPRPRPRPRPRPR sequência ou RPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPR.

[016] Em outro aspecto, a invenção refere-se, em parte, para composições de XTEN conjugados com agentes de reticulação. Em algumas modalidades, a invenção fornece composições de qualquer um dos aqui descritos XTEN que está ligado de forma covalente a uma ou mais moléculas de, pelo menos, um primeiro agente de reticulação, em que o agente de reticulação é selecionado a partir do grupo que consiste dos agentes de reticulação apresentados na Tabela 13, os reagentes alcino apresentados na Tabela 15, e os reagentes azida apresentados na Tabela 15 Em uma modalidade, a composição de conjugado o primeiro agente de reticulação é conjugado com a primeira, pelo menos, XTEN a um local selecionado a partir do grupo que consiste em: um grupo alfa-amino de um resíduo de aminoácido N-terminal da XTEN; um grupo epsilon amino de cada resíduo de lisina da XTEN; e um grupo tiol de cada resíduo de cisteína da XTEN. Quando desejado, o XTEN nesta modalidade tem, pelo menos, cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou, pelo menos, cerca de 95% , ou pelo menos cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências exposto na Tabela 2 e Tabela 3 Em outra modalidade da composição de conjugado, o XTEN é selecionado a partir do grupo que consiste em AE144, AE288, AE432, AE576, AE864, Seg 174, Seg 175, Seg 176, Seg 177, Seg 186, Seg 187, Seg 188, Seg 189, Seg 190, Seg 191, Seg 192, Seg 193, Seg 194, Seg 195, Seg 196, Seg 197, Seg 198, e Seg 199, e o agente de reticulação é conjugado com o grupo alfa-amino do aminoácido N-terminal do XTEN. Numa outra modalidade da composição de conjugado, o XTENé selecionado do grupo que consiste de Seg 174, Seg 175, Seg 176, Seg 177, Seg 186, Seg 187, Seg 188, Seg 189, Seg 190, Seg 191, Seg 192, Seg 193, Seg 194, Seg 195, Seg 196, Seg 197, Seg 198, e Seg 199 apresentados na Tabela 3, e o agente de reticulação é conjugado com o grupo tiol de cada resíduo de cisteína da XTEN. Numa outra modalidade da composição de conjugado, o primeiro agente de reticulação é selecionado a partir do grupo que consiste em N-maleimida, iodoacetilo, piridilo e vinil-sulfona, ácido 3-propargiloxipropanoico, (oxietil) n onde n é acetileno 1-10, dibenzilciclooctina (DBCO), ciclooctina (COT), ácido 3-azida-propiônico, ácido 6-azida-hexanóico, e (oxietil) n onde n é azida 1-10. Nas realizações anteriores deste parágrafo, o conjugado tem a configuração de fórmula IV: em que, independentemente, para cada ocorrência é CL1 o agente de reticulação; x é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou de 1 a cerca de 40, ou de 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou cerca de 1 a 5, ou a 9, ou é 3, ou é 2 , ou é 1. Onde desejado, o XTEN nesta modalidade compreende uma sequência que possui pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93% , ou pelo menos cerca de 94%, ou, pelo menos, cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou 100% de identidade com a sequência uma sequência selecionada a partir do grupo das sequências apresentadas nas Tabelas 2 e 3 em uma modalidade do conjugado de fórmula geral IV, CL1 é um agente de reticulação selecionado a partir da Tabela 13 Em outras modalidades das composições de conjugados XTEN-reticulação, as composições ainda compreender um único átomo de resíduo de uma primeira carga de conjugado a cada primeiro agente de reticulação em que o radical é selecionado entre o grupo que consiste em carbono, azoto, oxigénio e enxofre. Em uma modalidade do acima exposto, a primeira carga do resíduo de átomo único pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18, e 21 Em outras modalidades das composições de conjugados XTEN-reticulação, as composições compreendem ainda uma carga selecionada do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11 e 12 conjugados com cada primeiro agente de reticulação.

[017] Em outras modalidades das composições de conjugados XTEN-reticulação, a invenção fornece composições de um XTEN das modalidades aqui descritas, ligados covalentemente a uma ou mais moléculas de um primeiro agente de reticulação e uma ou mais moléculas de um segundo agente de reticulação, Em que o primeiro agente de reticulação é conjugado a qualquer dos grupos tiol de cada resíduo de cisteína da XTEN ou para os grupos epsilon amino de cada resíduo de lisina da XTEN, e o segundo agente de reticulação conjugado com alfa-amino do grupo ácido N- terminal de amino do XTEN em que cada agente de reticulação é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste dos agentes de reticulação apresentados na Tabela 13, os reagentes alcino da Tabela 15, e os reagentes de azida de Tabela 15 Na modalidade precedente , o composição tem a configuração da fórmula V: em que, independentemente, para cada ocorrência; CL1 é o primeiro agente de reticulação conjugada com resíduos de cisteína do XTEN; CL2 é o segundo agente de reticulação conjugado com XTEN no N-terminal; x é um número inteiro de 1 a cerca de 10; y é um número inteiro de 1, com a condição de que x + y é > 2; e XTEN é uma cisteína ou engenharia XTEN compreendendo x número de resíduos de cisteína ou uma lisina engenharia XTEN compreendendo x número de resíduos de lisina. Em outros modalidades das composições de conjugados De reticulação XTEN, as composições compreendem ainda um único átomo de resíduo de uma primeira carga de conjugado a cada um dos primeiros agentes de reticulação, em que o resíduo é selecionada a partir do grupo que consiste em carbono, azoto, oxigénio e de enxofre e um átomo único resíduo de um segundo conjugado de carga para cada uma das segundas reticulantes, em que o resíduo é selecionada a partir do grupo que consiste em carbono, azoto, oxigénio e enxofre. Em uma modalidade do acima exposto, a primeira carga do resíduo de átomo único pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18, e 21 e a segunda carga do resíduo de átomo único pode ser selecionado de forma independente a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18, e 21 Em algumas modalidades da composição resíduo XTEN- reticulante-carga, a composição tem a configuração da fórmula VI: em que, independentemente, para cada ocorrência PR1 é um único átomo de um resíduo de carga, em que o radical é selecionado entre o grupo que consiste em carbono, azoto, oxigénio e enxofre; CL1 é um agente de reticulação; x é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou de 1 a cerca de 40, u de 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou de 1 a cerca de 5, ou é 3, ou é 2 ou é 1. Onde desejado, o XTEN nesta modalidade compreende uma sequência que possui pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou, pelo menos, cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou que tem 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir de o grupo de sequências apresentadas nas Tabelas 2 e 3 em uma modalidade do conjugado de fórmula geral VI, o resíduo de um único átomo de carga é uma carga útil a partir selecionado a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18 , 19, e 21. Numa modalidade do conjugado de fórmula geral VI, CL1 é um agente de reticulação selecionado a partir da Tabela 13 Em uma modalidade do conjugado de fórmula geral VI, cada agente de reticulação está ligado a um átomo de enxofre da cisteína XTEN. Numa outra modalidade do conjugado de fórmula geral VI, cada agente de reticulação está ligado a um grupo amino epsilon da lisina XTEN.Numa outra modalidade do conjugado de fórmula geral VI, x é 1 e o agente de reticulação está ligado ao grupo amino N-terminal do XTEN. Numa outra modalidade do conjugado de fórmula geral VI, CL1 é o produto de reação de um primeiro e um segundo reagente selecionado de clique química Tabela 15 Noutra concretização, a invenção prevê uma preparação do conjugado de fórmula VI, em que, pelo menos, cerca de 80 %, ou pelo menos cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou, pelo menos, cerca de 95% das moléculas de XTEN a preparação de o conjugado ter um comprimento de sequência idêntica. Em outras modalidades das composições de conjugados XTEN-reticulação, as composições ainda compreender uma primeira carga conjugada com cada um dos primeiros agentes de reticulação, em que a carga é selecionada de entre o grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18, e 21, e uma segunda carga útil diferente da primeira carga conjugada com o segundo reticulante, em que a segunda carga é selecionada a partir do grupo consistindo de cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18, e 21 Numa modalidade da composição de conjugado de agente de reticulação XTEN-- carga, a composição compreende uma primeira carga conjugada com cada um dos primeiros agentes de reticulação, em que a carga é selecionada a partir do grupo que consiste moléculas de droga da Tabela 21, e uma segunda carga útil diferente da primeira carga conjugada com o segundo agente de reticulação, em que a segunda carga é selecionada a partir do grupo que consiste em porções de direcionamento da Tabela 21 Em uma modalidade da composição de conjugado XTEN reticulante-carga com uma primeira e uma segunda carga, um único segundo de carga está ligado ao terminal N do XTEN pelo segundo agente de reticulação conjugados por reação de um alcino e um reagente de azida de reagente selecionado de entre o grupo consistindo dos reagentes do Tabela 15 Em algumas modalidades da XTEN- composição de agente de reticulação-carga, a composição tem a configuração da fórmula VII: em que, independentemente, para cada ocorrência: P1 é uma carga selecionada do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18, 19, e 21; CL1 é um agente de reticulação; x é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2, ou é 1; e XTEN é uma sequência que tem pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou que tem 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências exposto na As Tabelas 2 e 3 em uma modalidade do conjugado de fórmula geral VII, CL1 é um agente de reticulação selecionado a partir da Tabela 13 Em uma modalidade do conjugado de fórmula VII, cada agente de reticulação está ligado a um átomo de enxofre da cisteína XTEN. Numa outra modalidade do conjugado de fórmula VII, cada agente de reticulação está ligado a um grupo amino epsilon da lisina XTEN. Numa outra modalidade do conjugado de fórmula geral VII, x é 1 e o agente de reticulação está ligado ao grupo amino N-terminal do XTEN. Numa concretização, o conjugado de fórmula geral VII é selecionado a partir do grupo que consiste em conjugados indicados na Tabela 21 Em outra modalidade do conjugado de fórmula geral VII, CL1 é o produto de reação de um primeiro e um segundo clique química reagente selecionado a partir de Tabela 15 Deve ser entendido por um perito na arte que as composições de acordo com as modalidades anteriores, compreendendo o conjugado a uma carga-reticulante XTEN utilizando os componentes especificados representa o produto de reação de reagentes e, assim, difere da composição exata dos reagentes. Numa outra modalidade, a invenção fornece uma preparação do conjugado de fórmula geral VII na qual, pelo menos, cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou, pelo menos, cerca de 95% das moléculas de XTEN a preparação do conjugado de ter um comprimento de sequência idêntica.

[018] Em outro aspecto, a invenção refere-se, em parte, para composições de um primeiro e um segundo XTEN conjugado com o outro. Em algumas modalidades, a composição de conjugado compreende um primeiro e um segundo XTEN, em que o XTEN são o mesmo ou são diferentes e cada um tem, independentemente, pelo menos, cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou, pelo menos, cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou 100 % de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências exposto na Tabela 3, e na qual o primeiro e o segundo XTEN são conjugadas uma à outra por terminais N da primeira e da segunda XTEN com um agente de reticulação criado por reação de um alcino e um reagente de azida de reagente selecionado de entre o grupo consistindo dos reagentes do Tabela 15, o que resulta num conjugado XTEN dimérica. Em uma modalidade da composição XTEN dimérica, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% das moléculas individuais de cada uma das primeiras XTEN têm comprimento idêntico e sequência de, pelo menos, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, ou 95% das moléculas individuais de cada uma das segundas XTEN têm comprimento de sequência idêntica. Em uma modalidade do conjugado de XTEN dimérica o primeiro XTEN tem, pelo menos, cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou, pelo menos, cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 96 %, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências que consiste em Seg 174, Seg 175, Seg 176, Seg 177 , Seg 186, Seg 187, Seg 188, Seg 189, Seg 190, Seg 191, Seg 192, Seg 193, Seg 194, Seg 195, Seg 196, Seg 197, Seg 198 e Seg 199 apresentadas na Tabela 3 e o segundo XTEN tem, pelo menos, cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou, pelo menos, cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 96% , ou pelo menos cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou 100% de identidade de sequência com uma sequência diferente selecionada de entre o grupo de sequências que consiste em Seg 174, Seg 175, Seg 176, Seg 177, Seg 186, Seg 187, Seg 188, Seg 189, Seg 190, Seg 191, Seg 192, Seg 193, Seg 194, Seg 195, Seg 196, Seg 197, Seg 198 e Seg 199 estabelecidos na Tabela 3 In uma outra modalidade do conjugado de XTEN dimérica, o primeiro e o segundo XTEN são o mesmo e cada um tem, pelo menos, cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências exposto na Tabela 3 Numa outra modalidade do conjugado de XTEN dimérica, o primeiro e o segundo XTEN são as mesmas são, cada um tem pelo menos cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou, pelo menos, cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências que consiste em Seg 174, Seg 175, Seg 176, Seg 177, Seg 186, seg 187, Seg 188, Seg 189, Seg 190, Seg 191, Seg 192, Seg 193, Seg 194, Seg 195, Seg 196, Seg 197, Seg 198, e Seg 199 apresentados na Tabela 3 Em outra modalidade da dimérica conjugado XTEN, o primeiro e o segundo XTEN cada um compreende um ou mais resíduos de cisteína, e compreende ainda um primeiro agente de reticulação conjugado a cada resíduo de cisteína do primeiro XTEN e um segundo agente de reticulação conjugado a cada resíduo de cisteína da segunda XTEN, em que o primeiro e o segundo agentes de reticulação são selecionados de forma independente a partir do grupo que consiste dos agentes de reticulação apresentados na Tabela 13 Em outra modalidade do conjugado de XTEN dimérica o primeiro e o segundo XTEN cada um compreende um ou mais resíduos de lisina, e compreende ainda um agente de reticulação conjugado a cada resíduo de lisina, da primeira e da segunda XTEN do conjugado, em que o agente de reticulação é selecionado a partir do grupo que consiste em o reticuladores estabelecidas no Tabela 13 Numa outra modalidade da XTEN dimérica conjugado com reticuladores, o conjugado compreende ainda um único átomo de resíduo de uma primeira carga de conjugado a cada agente de reticulação da primeira XTEN em que o resíduo é selecionada a partir do grupo que consiste em carbono, azoto, oxigénio e enxofre, e compreende ainda um único átomo de resíduo de uma segunda carga útil conjugado para cada agente de reticulação de segunda XTEN em que o resíduo é selecionada a partir do grupo que consiste em carbono, azoto, oxigénio e enxofre. Na modalidade anterior, a primeira carga do resíduo de átomo único pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18, e 21, e a segunda carga do resíduo de átomo único seja uma carga diferente a partir da primeira carga e pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18, e 21 Em algumas modalidades da composição dimérica resíduo XTEN- reticulante-carga, a composição tem a configuração da fórmula X: em que, independentemente, para cada ocorrência PR1 é um único átomo de um resíduo de carga, em que o primeiro resíduo é selecionada a partir do grupo que consiste em carbono, azoto, oxigénio e enxofre; PR2 é um único átomo de resíduo de uma segunda carga, em que o resíduo é selecionada a partir do grupo que consiste em carbono, azoto, oxigénio e enxofre; CL1 é um agente de reticulação; x é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2, ou é 1; CL2 é um agente de reticulação que é diferente de CL1; y é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, a 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2 , ou é 1, com a condição de que x + y é > 2; 2xCL é alternativamente um agente de reticulação bivalente ou o produto de reação de um primeiro e de um segundo reagente químico clique selecionado a partir da Tabela 15; XTEN1 é um polipeptídeo possuindo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou, pelo menos, cerca de 95 %, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou que tem 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências exposto na Tabela 2 e 3; e XTEN2 é um polipeptídeo possuindo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou pelo menos cerca 95%, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou que tem 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo das sequências apresentadas nas Tabelas 2 e 3 em uma modalidade do conjugado de fórmula geral X, CL1 e CL2 são cada um selecionados de entre o grupo de agentes de reticulação apresentados na Tabela 13 Em outra modalidade do conjugado de fórmula geral X, x é 1 e está ligado a CL1 o grupo amino N-terminal do XTEN. Numa outra modalidade do conjugado de fórmula geral X, CL1 é o produto de reação de um primeiro e um segundo reagente selecionado de clique química Tabela 15 Em outra modalidade do conjugado de fórmula X, C2 é o produto de reação de um primeiro e um azida segundo reagente clique alcino química selecionada a partir do Tabela 15 Numa outra modalidade do conjugado de fórmula geral X, cada CL1 está ligada a um átomo de enxofre da cisteína XTEN1 CL2 e cada um está ligado a enxofre cisteína de XTEN2. Numa outra modalidade do conjugado de fórmula geral X, cada CL1 está ligado a um grupo amino epsilon da lisina XTEN1 CL2 e cada um está ligado ao grupo amino epsilon da lisina XTEN2. Numa outra modalidade do conjugado de fórmula geral X, cada CL1 está ligada a um átomo de enxofre da cisteína XTEN1 CL2 e cada um está ligado ao grupo amino epsilon da lisina XTEN2.Numa outra modalidade do conjugado de fórmula geral X, XTEN1 e XTEN2 são idênticos. Numa outra modalidade do conjugado de fórmula geral X, XTEN1 e XTEN2 são diferentes. Numa outra modalidade, a invenção fornece uma preparação do conjugado de fórmula X, em que, pelo menos, cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93% , ou pelo menos cerca de 94%, ou, pelo menos, cerca de 95% das moléculas de XTEN a preparação do conjugado de ter um comprimento de sequência idêntica. Numa outra modalidade da XTEN dimérica conjugado com reticuladores, a composição compreende ainda uma primeira carga de conjugado a cada agente de reticulação da primeira XTEN em que a primeira carga é selecionada a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18, e 21, e compreende ainda uma segunda carga útil diferente do primeira carga, em que a segunda carga é conjugada com cada agente de reticulação de segunda Xen em que a segunda carga é selecionada a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18, e 21 Noutra modalidade da XTEN dimérica conjugado com agentes de reticulação, a composição compreende ainda uma primeira carga de conjugado a cada agente de reticulação da primeira XTEN em que a primeira carga é selecionada a partir do grupo que consiste em porções de direcionamento as apresentadas na Tabela 18 ou na Tabela 21, e compreende ainda um segunda carga diferente a partir da primeira carga, em que a segunda carga é conjugada com cada agente de reticulação de segunda XTEN em que a segunda carga é selecionada a partir do grupo de toxinas apresentados na Tabela 18 ou na Tabela 21 Em uma outra modalidade do conjugado XTEN dimérica a reticulantes e uma primeira e uma segunda carga, a primeira é XTEN Seg 176 apresentados na Tabela 3 e a segunda XTEN é selecionado a partir do grupo que consiste em Seg 176 e Seg 177 apresentados na Tabela 3 Em algumas modalidades da composição XTEN-reticulante-carga dimérica, a composição tem a configuração da fórmula XI: em que, independentemente, para cada ocorrência, P1 é um primeiro carga selecionado do grupo de cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18, 19, e 21; P2 é uma segunda carga selecionado do grupo de cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18, 19, e 21 e que é diferente de P1; CL1 é um agente de reticulação; x é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2 , ou é 1; CL2 é um agente de reticulação que é diferente de CL1; y é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2 , ou é 1, com a condição de que x + y é > 2; 2xCL é alternativamente um agente de reticulação bivalente ou o produto de reação de um primeiro e de um segundo reagente químico clique selecionado a partir da Tabela 15; XTEN1 é um primeiro XTEN substancialmente homogêneo tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou que tem 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências exposto nas Tabelas 2 e 3; e XTEN2 é um primeiro substancialmente homogêneo tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou que tem 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências exposto Nos quadros 2 e 3 em uma modalidade do conjugado de fórmula geral XI, CL1 e CL2 são cada um selecionados de entre o grupo de agentes de reticulação apresentados na Tabela 13 Em outra modalidade do conjugado de fórmula geral XI, x é 1 e é CL1 ligada ao grupo amino N-terminal do XTEN. Numa outra modalidade do conjugado de fórmula geral XI, CL1 é o produto de reação de um primeiro e um segundo reagente selecionado de clique química Tabela 15 Em outra modalidade do conjugado de fórmula geral XI, C2 é o produto de reação de um primeiro e um segundo clique química reagente selecionado a partir da Tabela 15 Em outra modalidade do conjugado de fórmula geral XI, cada CL1 está ligado a um átomo de enxofre da cisteína XTEN1 CL2 e cada um está ligado a enxofre cisteína de XTEN2. Numa outra modalidade do conjugado de fórmula geral XI, cada CL1 está ligado a um grupo amino epsilon da lisina XTEN1 CL2 e cada um está ligado ao grupo amino epsilon da lisina XTEN2. Numa outra modalidade do conjugado de fórmula geral XI, cada CL1 está ligada a um átomo de enxofre da cisteína XTEN1 CL2 e cada um está ligado ao grupo amino epsilon da lisina XTEN2. Numa outra modalidade do conjugado de fórmula XI, XTEN1 e XTEN2 são idênticos. Numa outra modalidade do conjugado de fórmula XI, XTEN1 e XTEN2 são diferentes. Numa concretização, o conjugado de fórmula geral XI é selecionado a partir do grupo que consiste em conjugados indicados na Tabela 21 Noutra concretização, a invenção prevê uma preparação do conjugado de fórmula geral XI em que pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou, pelo menos, cerca de 95% do respectivo XTEN1 e XTEN2 moléculas da preparação do conjugado tem comprimento de sequência idêntica.

[019] Em outro aspecto, a invenção refere-se, em parte, para composições de um primeiro e um segundo e um terceiro XTEN conjugados uns com os outros, o que resulta em composições de conjugados triméricos. Em algumas modalidades, as composições de conjugado compreende um primeiro e um segundo e um terceiro XTEN em que o XTEN pode ser o mesmo ou podem ser diferentes, e em que o primeiro e o segundo e o terceiro XTEN são conjugados uns com os outros pela N -terminus usando um agente de reticulação trivalente selecionado a partir do grupo que consiste dos agentes de reticulação para trivalentes definidos na Tabela 13 ou na Tabela 14 Em uma modalidade do conjugado de trimérico, o primeiro e o segundo e o terceiro XTEN são iguais ou são diferentes e cada um tem, pelo menos, cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou, pelo menos, cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 96% , ou pelo menos cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências exposto na Tabela 2 ou Tabela 3 ou Noutra modalidade o conjugado trimérico, o primeiro e o segundo e o terceiro XTEN são idênticos ou diferentes e são, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% das moléculas individuais de cada uma das primeira XTEN têm comprimento idêntico e sequência de, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% das moléculas individuais de cada uma das segundas XTEN ter um comprimento idêntico e sequência de, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% das moléculas individuais de cada uma das terceira XTEN têm comprimento de sequência idêntica. Numa outra modalidade do conjugado de trimérico a trivalente de reticulação é selecionado a partir do grupo consistindo de Tris (2- Maleimidoetil) amina (TMEA) e Tris-amino-reativo (TSAT). Numa outra modalidade do conjugado de trimérico, o primeiro e o segundo e o terceiro XTEN são idênticos e cada um tem, pelo menos, cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou, pelo menos, cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada do grupo que consiste de Seg 174, Seg 175, Seg 176, Seg 177, Seg 186, Seg 187, Seg 188, Seg 189, Seg 190, Seg 191, Seg 192, Seg 193, Seg 194, Seg 195, Seg 196, seg 197, Seg 198, e Seg 199 apresentados na Tabela 3 Em outra modalidade do conjugado de trimérico, o primeiro e o segundo e o terceiro são idênticos XTEN e cada um tem, pelo menos, cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou, pelo menos, cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 96% , ou pelo menos cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em Seg 174, Seg 175, Seg 176, Seg 177, Seg 186 , Seg 187, Seg 188, Seg 189, Seg 190, Seg 191, Seg 192, Seg 193, Seg 194, Seg 195, Seg 196, Seg 197, Seg 198 e Seg 199 apresentadas na Tabela 3, e o terceiro XTEN é diferente a partir da primeira e da segunda XTEN e tem, pelo menos, cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou, pelo menos, cerca de 95 %, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em Seg 174, Seg 175, Seg 176, Seg 177, Seg 186, Seg 187, Seg 188, Seg 189, Seg 190, Seg 191, Seg 192, Seg 193, Seg 194, Seg 195, Seg 196, Seg 197, Seg 198 e Seg 199 estabelecido no Tabela 3 Em uma outra modalidade do conjugado de trimérico, cada XTEN compreende pelo menos um primeiro resíduo de cisteína e o conjugado compreende ainda um primeiro agente de reticulação conjugado a cada resíduo de cisteína do primeiro XTEN, um segundo agente de reticulação conjugado a cada resíduo de cisteína da segunda XTEN, e um terceiro agente de reticulação conjugado a cada resíduo de cisteína da terceira XTEN, em que o reticulador é selecionado a partir do grupo que consiste dos agentes de reticulação apresentados na Tabela 13 Em algumas modalidades do conjugado de trimérico, a composição possui a configuração de fórmula XII: em que, independentemente, para cada ocorrência; 3xCL trivalente é a agente de reticulação; CL1 é o primeiro agente de reticulação para XTEN1 conjugado; CL2 é o segundo agente de reticulação conjugado com XTEN2; CL3 é o terceiro agente de reticulação conjugado com XTEN3; x é um número inteiro de 1 a cerca de 10; y é um número inteiro de 1 a cerca de 10; z é um número inteiro de 1 a cerca de 10 com a condição de que x + y + z é > 3; XTEN1 é o primeiro XTEN; XTEN2 é o segundo XTEN; e XTEN3 é o terceiro XTEN. Numa outra modalidade do conjugado de trimérico, o conjugado compreende ainda um único átomo de resíduo de uma primeira carga de conjugado a cada primeiro agente de reticulação da primeira XTEN em que o resíduo é selecionada a partir do grupo que consiste em carbono, azoto, oxigénio e enxofre; um único resíduo de um segundo átomo de carga conjugado a cada segundo reticulante de segunda XTEN em que o radical é selecionado entre o grupo que consiste em carbono, azoto, oxigénio e enxofre; e um único resíduo de um terceiro átomo de carga conjugadas com cada terceiro agente de reticulação do terceiro XTEN em que o radical é selecionado entre o grupo que consiste em carbono, azoto, oxigénio e enxofre. Numa outra modalidade da composição de conjugado trimérico, a composição compreende ainda uma primeira carga de conjugado a cada primeiro agente de reticulação da primeira XTEN selecionado a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18 e 21; uma segunda carga de conjugado a cada segundo reticulante de segunda XTEN selecionado a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18 e 21, em que a carga é o mesmo ou é diferente a partir da primeira carga útil; e uma terceira carga de conjugado a cada terceiro agente de reticulação do terceiro XTEN selecionado a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18 e 21, em que a carga é o mesmo ou é diferente do primeiro ou do segundo carga. Em uma modalidade da composição trimérico conjugado de carga XTEN, a primeira carga é uma porção de direcionamento com afinidade de ligação específica a um alvo, em que a parte de direcionamento é selecionada a partir do grupo que consiste nas porções de direcionamento apresentadas nas Tabelas 17-19 e 21 , e o segundo e o terceiro cargas são uma droga, que pode ser o mesmo ou pode ser diferente e em que o fármaco é selecionado de entre o grupo consistindo das drogas apresentadas na Tabela 11, Tabela 18, e na Tabela 21 Em uma modalidade da composição conjugado de carga XTEN trimérica, em que a primeira carga é uma porção de direcionamento com afinidade de ligação específica a um alvo e a segunda carga e a terceira carga útil é uma droga, a porção de direcionamento é selecionada a partir do grupo consistindo de LHRH e do folato e que a droga é selecionada de entre o grupo que consiste em doxorrubicina, paclitaxel, auristatina, monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F, maitansina, dolastatina, caliqueamicina, alcaloide de vinca, camptotecina , a mitomicina C, epotilona, hTNF, Il-12, bortezomib, Ranpirnase, exotoxina de pseudomonas, SN-38, e rachelmycin. Em uma modalidade da composição de conjugado de carga XTEN trimérica, em que a primeira carga é uma porção de direcionamento com afinidade de ligação específica a um alvo e a segunda carga e a terceira carga útil é uma droga, a porção de direcionamento, e a parte do fármaco corresponde a qualquer um conjugados de 1-290 apresentados na Tabela 21 Noutra modalidade da composição de conjugado de carga XTEN trimérica, em que a primeira carga é uma porção de direcionamento com afinidade de ligação específica a um alvo e a segunda carga e a terceira carga útil é uma droga, o conjugado tem a XTEN, a porção de direcionamento, e a porção de fármaco correspondente a conjugar 71 da Tabela 21 Noutra modalidade da composição trimérico conjugado de carga XTEN, a composição tem a configuração de fórmula geral XIII: em que, independentemente, para cada ocorrência é 3xCL trivalente de reticulação é selecionado de entre o grupo de agentes de reticulação trivalentes apresentadas nas Tabelas 13 e 14; P1 é conjugada com cada agente de reticulação da primeira XTEN e é selecionado a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18 e 21, o símbolo P2 representa uma segunda carga de conjugado a cada agente de reticulação de segunda e XTEN é selecionado a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18 e 21, em que a carga é o mesmo ou é diferente da primeira carga, e P3 é uma terceira carga de conjugado de cada agente de reticulação do terceiro XTEN e é selecionado a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18 e 21, em que a carga é o mesmo ou é diferente a partir da primeira ou da segunda carga útil; CL1 é o primeiro agente de reticulação; x é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2, ou é 1;CL2 é um segundo agente de reticulação; y é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2, ou é 1; e z é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2, ou é 1, com a condição de que x + y + z é> 3; XTEN1 é o primeiro XTEN tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou pelo menos cerca 95%, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou que tem 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo das sequências apresentadas nas Tabelas 2 e 3; XTEN2 é o segundo XTEN tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou pelo menos cerca 95%, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou que tem 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo das sequências apresentadas nas Tabelas 2 e 3; XTEN3 e é o terceiro XTEN tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou que tem 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências exposto na As Tabelas 2 e 3, em que XTEN1, XTEN2, e XTEN3 são o mesmo ou são diferentes sequências XTEN. Em algumas modalidades, o conjugado de fórmula geral XIII, compreende ainda uma primeira carga, em que a carga é uma porção de direcionamento com afinidade de ligação específica a um alvo, em que a parte de direcionamento é selecionada a partir do grupo que consiste nas porções de direcionamento apresentadas nas Tabelas 17-19 e 21, e pelo menos uma outra das cargas é um medicamento em que o fármaco é selecionado de entre o grupo consistindo das drogas apresentadas na Tabela 11, Tabela 19, e na Tabela 21 Em uma modalidade do acima exposto, a porção de direcionamento é LHRH ou folato e o fármaco é selecionado de entre doxorrubicina, paclitaxel, auristatina, monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F, maitansina, dolastatina, caliqueamicina, alcaloide de vinca, camptotecina, mitomicina C, epotilona, hTNF, Il-12, bortezomib, Ranpirnase, pseudomonas exotoxina, SN-38, e rachelmycin. Numa outra modalidade da composição trimérico conjugado XTEN, a composição tem a configuração da fórmula XIV: em que, independentemente, para cada ocorrência; 3xCL trivalente é a agente de reticulação; CL1 é o primeiro agente de reticulação para XTEN1 conjugado; CL2 é o segundo agente de reticulação conjugado com XTEN2; x é um número inteiro de 1 a cerca de 10; y é um número inteiro de 1 a cerca de 10 com a condição de que x + y é > 2; XTEN1 é o primeiro XTEN; XTEN2 é o segundo XTEN; e XTEN3 é o terceiro XTEN em que o XTEN é selecionado a partir do grupo que consiste nas sequências apresentadas na Tabela 2 Em uma modalidade da composição trimérico XTEN conjugado de fórmula XVI, a composição compreende ainda um único átomo de resíduo de uma primeira carga de conjugado para cada primeiro agente de reticulação da primeira XTEN em que o resíduo é selecionada a partir do grupo que consiste em carbono, azoto, oxigénio e enxofre; e um único resíduo de um segundo átomo de carga conjugado a cada segundo reticulante de segunda XTEN em que o radical é selecionado entre o grupo que consiste em carbono, azoto, oxigénio e enxofre. Numa outra modalidade da composição trimérico XTEN conjugado de fórmula XVI, em que a composição compreende ainda uma primeira carga de conjugado a cada primeiro agente de reticulação da primeira XTEN selecionado a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18 e 21 ; e uma segunda carga de conjugado a cada segundo reticulante de segunda XTEN selecionado a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18 e 21, em que a carga é o mesmo ou é diferente a partir da primeira carga. Em uma modalidade do acima exposto, o primeira carga é uma porção de direcionamento com afinidade de ligação específica a um alvo, em que a parte de direcionamento é selecionada a partir do grupo que consiste nas porções de direcionamento apresentadas nas Tabelas 17-19 e 21, e as segundas cargas é um fármaco selecionado a partir do grupo que consiste das drogas apresentadas na Tabela 6, Tabela 18 e Tabela 21 Em uma outra modalidade do acima exposto, a primeira carga é uma segmentação porção é selecionada de entre o grupo consistindo de LHRH e folato, e a segunda é uma carga de droga é selecionada de entre o grupo que consiste em doxorrubicina, paclitaxel, auristatina, monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F, maitansina, dolastatina, caliqueamicina, vinca alcaloide camptotecina, mitomicina C, epotilona, hTNF, Il-12, bortezomib, Ranpirnase, exotoxina de pseudomonas, SN-38, e rachelmycin. Em uma modalidade do acima exposto, a primeira carga é um fármaco selecionado a partir do grupo que consiste em fármacos da Tabela 11 e as proteínas da Tabela 12 e a segunda carga é diferente da primeira carga e é selecionado a partir do grupo que consiste em drogas da Tabela 11 e as proteínas da Tabela 12 Em uma outra modalidade do acima exposto, o primeira carga e a segunda carga útil são idênticos e são selecionados de entre o grupo constituído por drogas da Tabela 11, e as proteínas da Tabela 12 Em uma outra modalidade da composição trimérico conjugado XTEN, a composição tem a configuração da fórmula XV: em que, independentemente, para cada ocorrência; 3xCL é um trivalente de reticulação ligando XTEN1, XTEN2, XTEN3; CL1 é o primeiro agente de reticulação para XTEN1 conjugado; x é um número inteiro de 1 a cerca de 10; XTEN1 é o primeiro XTEN em que o XTEN é selecionado a partir do grupo que consiste nas sequências apresentadas na Tabela 3; XTEN2 é o segundo XTEN em que o XTEN é selecionado a partir do grupo que consiste nas sequências apresentadas na Tabela 2; e XTEN3 é o terceiro XTEN em que o XTEN é selecionado a partir do grupo que consiste nas sequências apresentadas na Tabela 2 Em uma modalidade da composição trimérico conjugado XTEN configurado como fórmula XVII, a composição compreende ainda um único resíduo de um primeiro átomo de carga útil conjugado a cada primeiro agente de reticulação da primeira XTEN em que o resíduo é selecionada a partir do grupo que consiste em carbono, azoto, oxigénio e enxofre. Em uma modalidade da composição trimérico conjugado XTEN configurado como fórmula XVII, as novas composições compreendem uma primeira carga de conjugado a cada primeiro agente de reticulação da primeira XTEN selecionado a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18 e 21.

[020] Em outro aspecto, a invenção refere-se, em parte, para composições de um primeiro, um segundo, um terceiro e um quarto XTEN conjugados uns com os outros, o que resulta em composições de conjugados tetraméricos. Em algumas modalidades, as composições de conjugado compreendem um primeiro e um segundo e um terceiro e um quarto XTEN, em que o XTEN são selecionados a partir do grupo que consiste nas sequências apresentadas na Tabela 3, em que o XTEN pode ser o mesmo ou podem ser diferentes , e em que o primeiro e o segundo e o terceiro e o quarto XTEN são conjugadas uma à outra pelo terminal-N utilizando um agente de reticulação tretravalente em que o tetravalente reticulante é um cluster tetravalente maleimida. Em uma modalidade do conjugado de tetramérica, o primeiro e o segundo e o terceiro e o quarto XTEN são iguais ou são diferentes e cada um tem, pelo menos, cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou, pelo menos, cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou 100% identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências exposto na Tabela 2 ou Tabela 3 ou Numa outra modalidade do conjugado de tetramérica, o primeiro e o segundo e o terceiro XTEN são idênticos ou diferentes e são, pelo menos, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, ou 95% das moléculas individuais de cada uma das primeira XTEN ter um comprimento idêntico e sequência de, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% de as moléculas individuais de cada uma das segundas XTEN ter um comprimento idêntico e sequência de, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% das moléculas individuais de cada uma das terceira XTEN ter comprimento e em sequência idêntica menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95% das moléculas individuais de cada um dos quarto XTEN têm comprimento de sequência idêntica. Numa outra modalidade do conjugado de tetramérica o primeiro, o segundo, o terceiro, e o quarto XTEN são o mesmo e cada um tem, pelo menos, cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou pelo menos cerca 94%, ou, pelo menos, cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo constituído por Seg 174, Seg 175, Seg 176, Seg 177, Seg 186, Seg 187, Seg 188, Seg 189, Seg 190, Seg 191, Seg 192, Seg 193, Seg 194, Seg 195, Seg 196, Seg 197, seg 198, e Seg 199 indicados no Tabela 3 Em uma outra modalidade do conjugado de tetramérica, o primeiro e o segundo XTEN são o mesmo e cada um tem, pelo menos, cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou pelo menos cerca 95%, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em Seg 174, Seg 175 , Seg 176, Seg 177, Seg 186, Seg 187, Seg 188, Seg 189, Seg 190, Seg 191, Seg 192, Seg 193, Seg 194, Seg 195, Seg 196, Seg 197, Seg 198 e Seg 199 conjunto apresentados na Tabela 3, e o terceiro e o quarto XTEN são os mesmos, mas sejam diferentes do primeiro e do segundo XTEN e cada um tem, pelo menos, cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou, pelo menos, cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou 100% identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em Seg 174, Seg 175, Seg 176, Seg 177, Seg 186, Seg 187, Seg 188, Seg 189, Seg 190, Seg 191, Seg 192, Seg 193, Seg 194, seg 195, Seg 196, Seg 197, Seg 198, e Seg 199 apresentados na Tabela 3 Em outra modalidade do conjugado de tetramérica, cada XTEN compreende pelo menos um primeiro resíduo de cisteína e o conjugado compreende ainda um primeiro agente de reticulação conjugado a cada resíduo de cisteína do primeiro XTEN, um segundo agente de reticulação conjugado a cada resíduo de cisteína da segunda XTEN, um terceiro agente de reticulação conjugado para cada resíduo de cisteína da terceira XTEN, e uma quarta reticulante conjugado a cada resíduo de cisteína da quarta XTEN, em que cada agente de reticulação é selecionado a partir do grupo que consiste dos agentes de reticulação apresentados na Tabela 13 Em algumas modalidades das composições de conjugados tetraméricos, a composição possui a configuração da fórmula XVI: em que, independentemente, para cada ocorrência: 4xCL é tetravalente reticulante; CL1 é o primeiro agente de reticulação para XTEN1 conjugado; CL2 é o segundo agente de reticulação conjugado com XTEN2; CL3 é o terceiro agente de reticulação conjugado com XTEN3; CL4 é a quarta reticulante conjugado com XTEN4; v é um número inteiro de 1 a cerca de 10; x é um número inteiro de 1 a cerca de 10; y é um número inteiro de 1 a cerca de 10; z é um número inteiro de 1 a cerca de 10 com a condição de que x + y + z é > 4; XTEN1 é o primeiro XTEN; XTEN2 é o segundo XTEN; XTEN3 é o terceiro XTEN; XTEN3 e é a quarta XTEN. Numa outra modalidade da composição de conjugado tetramérica, a composição compreende ainda um único átomo de resíduo de uma primeira carga de conjugado a cada primeiro agente de reticulação da primeira XTEN em que o resíduo é selecionada a partir do grupo que consiste em carbono, azoto, oxigénio e enxofre; um único resíduo de um segundo átomo de carga conjugado a cada segundo reticulante de segunda XTEN em que o radical é selecionado entre o grupo que consiste em carbono, azoto, oxigénio e enxofre; um único resíduo de um terceiro átomo de carga conjugadas com cada terceiro agente de reticulação do terceiro XTEN em que o radical é selecionado entre o grupo que consiste em carbono, azoto, oxigénio e enxofre; e um único átomo de resíduo de uma quarta carga conjugado a cada quarto de reticulação da quarta XTEN em que o resíduo é selecionada a partir do grupo que consiste em carbono, azoto, oxigénio e enxofre. Numa outra modalidade da composição de conjugado tetramérica, a composição compreende ainda uma primeira carga de conjugado a cada primeiro agente de reticulação da primeira XTEN selecionado a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18, e 21; uma segunda carga de conjugado a cada segundo reticulante de segunda XTEN selecionado a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18, e 21, em que a carga é o mesmo ou é diferente a partir da primeira carga útil; uma terceira carga de conjugado a cada terceiro agente de reticulação do terceiro XTEN selecionado a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18, e 21, em que a carga é o mesmo ou é diferente do primeiro ou do segundo carga útil; e uma quarta carga conjugado a cada quarto de reticulação da quarta XTEN selecionado a partir do grupo que consiste em que as cargas apresentadas nas Tabelas 11, 12, 18, e 21, em que a carga é o mesmo ou é diferente do primeiro ou do segunda ou a terceira carga. Em uma modalidade da composição tetramérica conjugado de carga XTEN, o primeira carga é uma porção de direcionamento com afinidade de ligação específica a um alvo, em que a parte de direcionamento é selecionada a partir do grupo que consiste nas porções de direcionamento apresentadas nas Tabelas 1719 e 21, e pelo menos um outro do segundo, terceiro, e quarto cargas é um medicamento em que o fármaco é selecionado de entre o grupo consistindo das drogas apresentadas nas Tabelas 11, 18 e 21 Numa modalidade da composição tetramérica conjugado de carga XTEN, a primeira carga é uma porção de direcionamento em que a porção de direcionamento é selecionada a partir do grupo consistindo de LHRH e ácido fólico, e, pelo menos, uma das segunda, terceira e quarta carga útil é um fármaco selecionado a partir do grupo que consiste em doxorrubicina, paclitaxel, auristatina, maitansina, dolastatina, caliqueamicina, alcaloide de vinca , camptotecina, mitomicina C, epotilona, hTNF, Il-12, bortezomib, Ranpirnase, exotoxina de pseudomonas, SN-38, e rachelmycin. Numa outra modalidade da composição tetramérica conjugado de carga XTEN, a primeira carga é uma porção de direcionamento com afinidade de ligação específica a um alvo, em que a parte de direcionamento é selecionada a partir do grupo que consiste nas porções de direcionamento apresentadas nas Tabelas 1719 e 21, e pelo menos um outro da segunda, terceira, e quarta cargas é um medicamento em que o fármaco é selecionado de entre o grupo consistindo das drogas apresentadas nas Tabelas 11, 18 e 21, e em que o XTEN, a porção de direcionamento, e a parte do fármaco corresponde a qualquer um dos conjugados de 1-290 conjunto apresentados na Tabela 21.

[021] Em outro aspecto, a invenção refere-se, em parte, para composições compreendendo moléculas multiméricas XTEN configurados de maneira ramificada, em que uma solução da composição tem um reduzido. Numa modalidade, a invenção prevê uma composição que compreende uma solução que compreende um XTEN multimérica tendo, pelo menos, três fragmentos XTEN ligados em conjunto de forma ramificada (por exemplo, forma trimérica), em que a viscosidade da solução é reduzido em pelo menos 5, 6, 7 , 8, 9 ou 10 cP numa solução contendo = 10 0, 130, ou 150 mg/mL da preparação XTEN trimérico em comparação com uma solução contendo = 100, 130, ou 150 mg/ml do correspondente XTEN linear de concentração molar igual. Numa outra modalidade, a invenção prevê uma composição que compreende uma solução que compreende um XTEN multimérica tendo pelo menos quatro fragmentos XTEN ligados em conjunto de forma ramificada (por exemplo, forma tetramérica), em que a composição tem uma viscosidade que é inferior a uma solução compreendendo um linear correspondente XTEN tendo o mesmo número de aminoácidos e a mesma concentração molar, em que a viscosidade da solução é reduzida em, pelo menos, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 cP numa solução contendo ^ 100, 130, ou 150 mg/ml da preparação XTEN trimérico em comparação com uma solução contendo = 100, 130, ou 150 mg/ml do correspondente XTEN linear de concentração molar igual. Numa outra modalidade, a invenção prevê uma composição que compreende uma solução que compreende um XTEN multmérico possuindo pelo menos cinco fragmentos XTEN ligados entre si de uma maneira ramificada (por exemplo, forma pentamérica), em que a composição tem uma viscosidade que é inferior a uma solução compreendendo um linear correspondente XTEN tendo o mesmo número de aminoácidos e a mesma concentração molar, em que a viscosidade da solução é reduzida em, pelo menos, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 cP numa solução contendo = 100, 130, ou 150 mg/ml da preparação XTEN trimérico em comparação com uma solução contendo = 100, 130, ou 150 mg/ml do correspondente XTEN linear de concentração molar igual. Nas realizações anteriores do presente número, o XTEN individual das configurações multiméricos são selecionados a partir do grupo que consiste nas sequências apresentadas na Tabela 2 e Tabela 3.

[022] Numa outra modalidade, a invenção fornece composições de um polipeptídeo possuindo pelo menos cerca de 90%, ou, pelo menos, cerca de 91%, ou, pelo menos, cerca de 92%, ou, pelo menos, cerca de 93%, ou, pelo menos, cerca de 94%, ou pelo menos cerca 95%, ou, pelo menos, cerca de 96%, ou, pelo menos, cerca de 97%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99%, ou 100% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências exposto na Tabela 52.

[023] Numa outra modalidade, a invenção prevê uma composição farmacêutica, que compreende o conjugado de qualquer uma das modalidades de carga conjugadas XTEN-aqui descritos, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Numa modalidade, a composição farmacêutica anterior tem utilidade no tratamento de uma condição selecionada a partir do grupo de condições estabelecidas na Tabela 16 Noutra concretização, a composição farmacêutica anterior tem utilidade para utilização num regime farmacêutica para tratamento de um sujeito, compreendendo o referido regime de composição farmacêutica. Numa outra modalidade, o que precede regime farmacêutico compreende ainda o passo de determinar a quantidade de composição farmacêutica necessária para alcançar um efeito benéfico em um sujeito com uma condição selecionada a partir do grupo de condições estabelecidas na Tabela 16 Noutra concretização, o regime anterior farmacêutica utilizada para o tratamento do sujeito compreende a administração da composição farmacêutica, em duas ou mais doses sucessivas para o sujeito com uma quantidade eficaz, em que a administração resulta em pelo menos um 10%, ou 20%, ou 30%, ou 40%, ou 50%, ou 60%, ou 70%, ou 80%, ou 90% maior melhoria de pelo menos um, dois, ou três parâmetros associados com a condição de comparação a um sujeito não tratado.

[024] Numa outra modalidade, a invenção prevê um conjugado de qualquer uma das modalidades de carga conjugadas XTEN- aqui descritos para uso na preparação de um medicamento para o tratamento de uma condição selecionada a partir do grupo de condições estabelecidas na Tabela 16.

[025] Em algumas modalidades, a invenção prevê métodos de seleção de uma combinação de cargas ligados para XTEN como um agente terapêutico, compreendendo o método prever uma biblioteca de XTENs compreendendo uma pluralidade de sequências de XTEN em que cada uma das referidas sequências XTEN é conjugada com, pelo menos, uma primeira carga e pelo menos uma segunda carga que é diferente a partir da primeira carga útil; a partir da referida biblioteca, selecionando uma sequência XTEN como agente terapêutico, se ele exibe um melhorada in vitro ou in vivo na forma de parâmetro em relação ao de (1) uma sequência de XTEN conjugado com a primeira carga sozinha; e (2) uma sequência de XTEN conjugada com o segundo carga sozinha. Em uma modalidade do método, a primeira carga e a segunda carga útil são terapeuticamente eficazes para a melhoria de uma doença comum (por exemplo, uma doença que ambos o primeiro e o segundo alvos de capacidade). Em uma modalidade do método, primeira e segunda droga são terapeuticamente eficazes para o tratamento de diversos sintomas de uma doença comum. Em uma modalidade do método, a doença comum é selecionada a partir de cancro, o cancro de cuidados de suporte, cardiovascular, sistema nervoso central, doenças endócrinas, gastrointestinal, genito-urinário, hematológicas, a infecção por HIV, doença hormonal, inflamação, doença autoimune, doença infecciosa, doença metabólica, doenças musculoesqueléticas, distúrbios de nefrologia, doenças oftalmológicas, dor e respiratória. Em uma modalidade do método, a primeira carga e a segunda carga de mediar o seu efeito terapêutico através de uma via biológica comum. Em uma modalidade do método, a primeira carga e a segunda carga sejam drogas diferentes selecionados a partir do grupo consistindo das drogas apresentadas na Tabela 11, Tabela 18 e Tabela 21 Em uma modalidade do método, a primeira carga e a segunda carga útil proteínas biologicamente ativas diferentes, selecionados de entre o grupo consistindo de proteínas apresentadas na Tabela 12, Tabela 18 e Tabela 21 Em uma modalidade do método, a primeira carga é um fármaco selecionado a partir do grupo consistindo das drogas apresentadas na Tabela 11 , Tabela 18 e na Tabela 21 e a segunda carga é uma proteína biologicamente ativo selecionado a partir do grupo que consiste em proteínas apresentadas na Tabela 12, Tabela 18 e Tabela 21.

[026] Numa outra modalidade, a invenção prevê um polipeptídeo isolado que compreende um polipeptídeo recombinante estendida que está ligado a uma marca de purificação por afinidade, através de um sítio de clivagem proteolítica que possui uma sequência selecionada a partir SASRSA SASXSA ou em que X é R ou K.

[027] Numa outra modalidade, a invenção prevê um polipeptídeo isolado que compreende um polipeptídeo compreendendo uma XTEN que está ligada na sua extremidade N-terminal de uma primeira marca de purificação por afinidade através de um sítio de clivagem proteolítica que possui uma sequência selecionada a partir SASRSA SASXSA ou em que X é R ou K, e na sua extremidade C-terminal de uma segunda etiqueta de purificação por afinidade, através de um sítio de clivagem proteolítica que possui uma sequência selecionada a partir SASRSA SASXSA ou em que X é R ou K.

[028] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de tratamento de um estado num sujeito, com uma composição de conjugado de carga XTEN. Numa modalidade, a invenção prevê um método de tratamento de um estado num sujeito, que compreende que compreende a administração de uma quantidade eficaz do conjugado de qualquer uma das modalidades de carga XTEN aqui descritos a um sujeito necessitado do mesmo. Numa outra modalidade, a invenção prevê um método de tratamento de um estado num sujeito, que compreende que compreende a administração de uma quantidade eficaz do conjugado do grupo que consiste em conjugados indicados no Tabela 21 a um sujeito com essa necessidade. Em modalidades anteriores do presente parágrafo, o estado a ser tratado inclui, mas não está limitado a, as condições estabelecidas na Tabela 13 Noutra concretização, a invenção prevê uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos modos de realização do conjugado de carga XTEN aqui descritos e um veículo farmaceuticamente aceitável para o uso em um regime de tratamento, que compreende a administração o regime de duas ou mais doses consecutivas da composição farmacêutica.

[029] Numa modalidade, a invenção prevê a utilização de um conjugado de qualquer uma das modalidades de carga XTEN aqui descrito, para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma condição selecionada a partir do grupo de condições estabelecidas na Tabela 16 Noutra concretização, a invenção prevê uma composição farmacêutica para o tratamento de uma condição selecionada a partir do grupo de condições estabelecidas na Tabela 16 que compreende uma quantidade eficaz de um conjugado de qualquer uma das modalidades de carga XTEN aqui descritos.

[030] Numa outra modalidade, a invenção prevê uma composição que tem a estrutura apresentada na FIG. 117.

[031] Está especificamente contemplado que os modos de realização do conjugado pode apresentar um ou mais, ou qualquer combinação das propriedades aqui descritas. Além disso, qualquer uma das composições XTEN aqui divulgados podem ser utilizados em qualquer um dos métodos aqui divulgados.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[032] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados nesta especificação são aqui incorporadas por referência na mesma medida como se cada publicação, patente ou pedido de patente individuais foi específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[033] As características e vantagens da invenção podem ser mais bem explicado com referência à seguinte descrição detalhada e desenhos anexos que define modalidades adiante ilustrativos

[034] FIG. 1 mostra esquemas de XTEN adequados para conjugação com cargas. FIG. 1A mostra XTEN não modificado. FIG. 1B mostra uma cisteína-modificado XTEN com uma cisteína interna com uma cadeia lateral de tiol; a seguir é um XTEN com um grupo amino N-terminal reativo; a seguir é um XTEN com uma cisteína N-terminal com um grupo reativo tiol. FIG. 1C mostra XTEN modificado de cisteína com várias cisteínas internas. FIG. 1D mostra duas variantes de um XTEN modificado de cisteína com uma cisteína interna com uma cadeia lateral de tiol; s e um grupo amino N-terminal reativo e, no fundo, uma mostra uma cisteína e lisina- modificado XTEN com cisteínas internas e lisinas internas.

[035] FIG. 2 mostra uma reação de conjugação utilizando NHS-ésteres e seus análogos solúveis em água, sulfo-NHS- ésteres) que reagem com um grupo amino primário para produzir uma amida estável produto de carga XTEN.

[036] FIG. 3 mostra uma reação de conjugação utilizando grupos tiol e um grupo N-maleimida. O grupo maleimida reage especificamente com grupos sulfidril quando o pH da mistura de reação está entre pH 6,5 e 7,5, a formação de uma ligação tioéter estável que não é reversível.

[037] FIG. 4 mostra uma reação de conjugação utilizando haloacetilos. Os reagentes mais usados haloacetilo contêm o grupo iodoacetilo, que reage com os grupos sulfidril a pH fisiológico. A reação do grupo iodoacetilo com sulfidrilo prossegue por substituição nucleofílica de iodo, com um tiol produzindo uma ligação tioéter estável na carga XTEN.

[038] FIG. 5 mostra uma reação de conjugação utilizando dissulfuretos de piridilo. Dissulfuretos de piridilo reagem com grupos sulfidrilo ao longo de um amplo intervalo de pH (o pH óptimo é de 4-5) para formar ligações de dissulfureto que ligam XTEN para cargas úteis.

[039] FIG. 6 mostra uma reação de conjugação de comprimento zero, utilizando agentes de reticulação, em que os agentes de reticulação são usados para conjugar diretamente grupos funcionais carboxilo de uma molécula (tal como uma carga útil) com a amina primária de uma outra molécula (tal como uma XTEN).

[040] FIG. 7 mostra diferentes configurações dos precursores XTEN que são multifuncionais (ou polivalente), incluindo dedrimeros. Exemplos de ligantes trifuncionais não limitativos são "em forma de Y" sulfidrilo reativo TMEA (Tris-(2-Maleimidoetil) amina) e TSAT amino-reativo. Qualquer combinação de porções reativas pode ser concebida usando um polímero de andaime, quer linear (formando uma configuração "pente") ou ramificada (formando uma configuração "dendrímero"), para exibição multivalente.

[041] FIG. 8 mostra uma reação de conjugação utilizando o Huisgen cicloadição 1,3-dipolar de azidas de alcinos para formar 1,4-disubsituted-1,2,3-triazol, como mostrado.

[042] FIG. 9 mostra uma reação de conjugação com tio-eno baseado clique química que podem prosseguir através da reação de radical livre, denominada reação tiol-eno, ou de reação aniônico, denominado tiol adição de Michael.

[043] FIG. 10 mostra uma reação de conjugação utilizando clique química baseada nas reações entre hidrazidas e aldeídos, resultando na ligação hidrazona ilustrado na de carga XTEN.

[044] FIG. 11 mostra uma reação entre uma acilazida C- terminal e um grupo amino primário, resultando na formação de uma ligação amida.

[045] FIG. 12 mostra uma reação de conjugação utilizando Native Chemical Ligation (NCL) envolvendo um tioéster C- terminal como um electrófilo e cisteína N-terminal como um nucleófilo. O resultado desta reação é uma ligação amida nativa no local de ligação da composição de carga XTEN.

[046] FIG. 13 mostra uma reação de conjugação que utiliza a ligação da proteína expressa metodologia (EPL). O método baseia-se na EPL splicing da proteína, o processo em que uma proteína sofre um rearranjo intramolecular resultando na extrusão de uma sequência interna (intein) e a união das sequências laterais (exteins). No método, a proteína fundida é submetida a uma mudança NS quando a cadeia lateral do primeiro resíduo de cisteína da porção intein da proteína precursora ataca nucleofilicamente da ligação peptídica do resíduo imediatamente a montante (isto é, por exemplo, o resíduo final de XTEN) para formar um intermediário tioéster linear, seguida por um rearranjo para formar para formar uma ligação amida entre o XTEN- agente de reticulação e a carga útil.

[047] FIG. 14 mostra uma reação de conjugação utilizando traceless ligadura Staudinger, como Native Chemical Ligation (NCL), resultando numa ligação amida nativa no local de ligação

[048] FIG. 15 mostra uma reação de conjugação utilizando ligação enzimática. As transglutaminases são enzimas que catalisam a formação de uma ligação entre o grupo isopeptídeo Y-carboxamida de glutamina de um peptídeo ou proteína e carga do grupo ε -amino de uma lisina num XTEN engenharia-lisina (ou um grupo amino N-terminal), criando, assim, ligações cruzadas inter ou intramolecular entre o XTEN e carga útil.

[049] FIG. 16 mostra enzimaticamente composições de carga XTEN, utilizando a enzima Um sortase transpeptidase de Staphylococcus aureus para catalisar a clivagem de um curto espaço de 5-amino ácido reconhecimento sequência LPXTG entre os resíduos de glicina e treonina de protein1 que subsequentemente transfere o acil-fragmento de um N - terminal nucleófilo oligoglicina de protein1. Funcionalizando o Proteína2 para conter um oligoglicina, a conjugação enzimática das duas proteínas é realizada de uma forma específica de sítio para resultar na composição de carga XTEN desejada.

[050] FIG. 17 mostra vários segmentos precursoras De reticulação XTEN que são utilizados como reagentes de ligação para cargas ou para outros reagentes XTEN. FIG. 17A destina-se a mostrar que a 1B representa o grupo reativo restante dos precursores do lado direito. FIG. 17B mostra precursores de reativos semelhantes, com ou múltipla (esquerda) ou (a direita) A carga única moléculas conjugadas ao XTEN.

[051] FIG. 18 mostra exemplos de permutações de segmentos precursoras XTEN-reticulação com dois grupos reativos de agentes de reticulação ou de grupos reativos de um aminoácido incorporadas que são usadas como reagentes de ligação para cargas ou para outros reagentes XTEN. O 1B e 2B representam grupos reativos que, em outras figuras, reagem com um grupo reativo como a numeração; 1 com 1 e 2, com 2, etc

[052] FIG. 19 destina-se a mostrar exemplos de vários reagentes e nomenclatura para as configurações ilustradas em outros lugares nos desenhos. FIG. 19A mostra diversas formas de precursores de segmentos XTEN reativos, cada uma com um grupo reativo diferente do N-terminal. FIG. 19B mostra vários agentes de reticulação com 2, 3 ou 4 grupos reativos. No primeiro caso, o agente de reticulação é um ligante bivalente heterofuncional que reage com dois tipos diferentes de grupos reativos, representada por "2" e "1". No caso de o trivalente e tetravalente de reticulação, cada reage com apenas um tipo de grupo reativo, representado por "1". FIG. 19C ilustra a nomenclatura dos produtos da reação de dois precursores do segmento XTEN. Na versão de topo, um 1A fez-se reagir com um 1B para criar um XTEN dimérica ligada ao terminal N, com o resíduo do agente de reticulação indicado por 1AR-1BR, enquanto que a versão de fundo é também um XTEN dimérica ligada ao N-terminais, com o resíduo do agente de reticulação indicado por 2AR-2BR.

[053] FIG. 20 ilustra a criação de vários precursores XTEN. FIG. 20A mostra os passos de fazer um polipeptídeo XTEN, seguido por reação do N-terminal com o agente de reticulação com os grupos reativos 2B-1A, com a reação com o 1A 1B N-terminal (por exemplo, um aminoácido alfa) para criar o precursor XTEN 2 com o grupo reativo 2B. FIG. 20B mostra a adição sequencial de dois agentes de reticulação com grupos reativos 2A a 2B grupos reativos do XTEN, resultando em XTEN precursor 4, o qual é então feito reagir com um agente de reticulação na região N-terminal 1B reativo e o 1A um agente de reticulação, resultando em XTEN precursor 5, com grupos reativos 4B e 3B. Em tal caso, os precursores de XTEN-5 poderia então servir como um reagente com dois ou XTEN cargas diferentes.

[054] FIG. 21 ilustra exemplos de conjugados multiméricas. FIG. 21A ilustra a forma como três moléculas de um XTEN com uma carga A conjugado pode ser conjugado com um agente de reticulação trimérico, resultando num conjugado de carga XTEN trimérico com três cargas de A. FIG. 21B ilustra como três moléculas de um polipeptídeo com um A carga pode ser conjugado com um agente de reticulação trimérico, resultando num conjugado de carga XTEN trimérico com três polipeptídeos com um A carga útil.

[055] FIG. 22 ilustra exemplos de conjugados polivalentes XTEN que podem originar a partir de precursores XTEN com uma única cisteína. O grupo amino no precursor XTEN atua como grupo reativo 2B e o grupo tiol como 1B grupo reativo. O precursor XTEN pode ser reticulado usando agente de reticulação que podem reagir com o grupo 1B. A valência do reticulante controla a valência do intermediário resultante. Este intermediário de reticulação pode ser feita reagir com uma carga útil de realização de um 2A grupo reativo que pode reagir com o grupo amina que forma a ligação de conjugação 2A-BR. FIG. 22A é um precursor XTEN com grupo tiol único. FIG. 22B é um conjugado bivalente. FIG. 22C é um conjugado trimérico. FIG. 22D é um conjugado tetramérica.

[056] FIG. 23 ilustra exemplos de conjugados polivalentes XTEN que podem originar a partir de precursores XTEN com uma única cisteína. O grupo amino no precursor XTEN actua como grupo reativo 1B e o grupo tiol como 2B grupo reativo. O precursor XTEN pode ser reticulado usando agente de reticulação que podem reagir com o grupo 1B. A valência do reticulante controla a valência do intermediário resultante. Este reticulado intermediário pode ser feito reagir com uma carga que leva uma 2A grupo reativo que pode reagir com o grupo tiol que forma a ligação de conjugação 2A-BR. FIG. 23A ilustra o grupo tiol localizado perto do terminal C de XTEN. Como resultado da carga situa-se nas extremidades distais do conjugado trimérico final. FIG. 23B ilustra que o grupo tiol está localizado perto da extremidade N-terminal de XTEN. Como resultado da carga situa-se nas extremidades proximais do conjugado final, resultando em aumento da carga útil por XTEN blindagem.

[057] FIG. 24 ilustra um exemplo da criação de uma configuração de "pente". FIG. 24A é um precursor de carga XTEN compreendendo ligante 1A grupo reativo. A carga útil pode ser recombinantemente fundido a XTEN ou pode ser conjugado. FIG. 24B ilustra um XTEN-precursor com os agentes de reticulação pente-like. Este pode ser um XTEN que transportam vários grupos reativos B. A FIG. 24C mostra o produto final sob a configuração de "pente", com cinco Payload A. Valency é controlada pelo número de grupos reativos no precursor de pente.

[058] FIG. 25 ilustra várias configurações de conjugados biespecíficos com duas cargas. FIG. 25A ilustra as configurações com uma molécula de cada uma das duas cargas, enquanto que a FIG. 25B ilustra várias configurações com várias cópias de uma ou ambas as cargas úteis.

[059] FIG. 26 ilustra vários exemplos de conjugados com alta valência. Conjugações locais de cargas pode agrupadas (FIG. 26A) ou intercaladas (FIG. 26B).

[060] FIG. 27 ilustra a preparação de conjugados de biespecíficos a partir de um precursor XTEN transporta tanto os grupos amino e tiol em que muitos produtos químicos podem ser usados e a ordem de adição de carga pode variar. Pode-se gerar conjugados de ligantes como precursores. FIG. 27A mostra a criação de um único precursor XTEN para que duas cargas diferentes são unidas. FIG. 27B mostra uma abordagem do segmento a partir de duas moléculas precursoras XTEN. Esta abordagem permite conjugar as duas cargas para XTEN usando o mesmo tipo de ligante química. Neste caso, a figura mostra tiol como o grupo ao qual as cargas úteis são conjugadas, e, em seguida, o N- terminal de cada segmento é modificada com um agente de reticulação para permitir a conjugação do segmento de cabeça-a-cabeça, resultando em, um conjugado biespecífico dimérica produto final.

[061] FIG. 28 mostra exemplos de conjugados multivalentes combinando um anticorpo, XTEN, e uma carga útil. Tais construções podem ter diferentes valências e prever muitos benefícios em que o XTEN podem ter um agente de ligação clivável, pode XTEN prevê solubilidade para a composição, e que pode permitir o ajustamento da carga de droga por IgG, e o XTEN pode ser pré-conjugada com droga para simplificar o fabrico. FIG. 28A ilustra dois XTENs conjugados com IgG a resíduos Cys na região da dobradiça. FIG. 28B ilustra quatro XTEN conjugada com IgG usando Cys na região de charneira. FIG. 28C ilustra XTEN conjugado fora da dobradiça. Isto pode ser feito através da inserção de Cys para controlar local de conjugação ou por conjugação aleatória de cadeias laterais de Lys.

[062] FIG. 29 mostra exemplos de como a construção de conjugados de um anticorpo que combinam, XTEN, e uma carga útil. O anticorpo pode ter um ou vários grupos reativos 1B. XTEN pode ser conjugado com uma ou várias cargas úteis A. Além XTEN pode transportar um grupo reativo 1A que preferencialmente reage com o grupo reativo 1B no anticorpo. A localização dos grupos reativos no anticorpo 1B controla o número e localização de XTENs que são conjugados com o anticorpo, o que resulta no produto final.

[063] FIG. 30 mostra exemplos de conjugados compreendendo uma porção de direccionamento, XTEN, e uma carga útil. Porções de direccionamento podem ser peptídeo s, peptoides ou ligandos do receptor. FIG. 30A mostra 1x (1x3) conjugado. FIG. 30B mostra 1x2 (1x3) conjugado. FIG. 30C mostra uma 3x1 (1x3) conjugado.

[064] FIG. 31 mostra exemplos de conjugados compreendendo vários grupos diferentes de segmentação, XTEN, e uma carga útil. Porções de direccionamento podem ser peptídeo s, peptoides, ligandos do receptor.

[065] FIG. 32 mostra exemplos de conjugados compreendendo uma porção de direccionamento, XTEN, e a várias cargas úteis diferentes.

[066] FIG. 33 mostra exemplos de conjugados XTEN combinatória. Os efeitos destrutivos A, B, C, D e 2A transportar um grupo reativo que reage com o grupo reativo no 2B precursor XTEN. No passo seguinte, Cargas E e F transportar um 1A grupo reativo que reage com o grupo reativo no 1B XTEN, resultando numa biblioteca de permutações diferentes de conjugados biespecíficos. Neste caso, os grupos reativos 1B e 2B são tiol e grupos amino-, respectivamente.

[067] FIG. 34 mostra um exemplo da criação de uma biblioteca combinatória XTEN conjugado. Os efeitos destrutivos A, B, C são conjugados com XTEN realização 1A grupo reativo, que resulta em um conjunto de segmentos XTEN de precursor. Os efeitos destrutivos de E, F e G são conjugados com XTEN realização grupo reativo 1B, resultando em um segundo conjunto de segmentos XTEN de precursor. Estes segmentos são sujeitos a conjugação combinatória e, em seguida, são purificados a partir de reagentes. Isto permite a formação de produtos combinatórios, que pode ser imediatamente submetida a in vitro e testes in vivo. Neste caso, grupos reativos 1A e 1B são os grupos alfa-amino de XTEN com ou sem um agente de reticulação biespecífico. Em um exemplo, o 1A representa uma azida e 1B é um alcino ou vice-versa, enquanto que as cargas estão ligadas a XTEN via grupos tiol em XTEN.

[068] FIG. 35 mostra um exemplo da criação de uma biblioteca combinatória conjugado XTEN que otimiza a relação entre duas cargas. Cada membro da biblioteca transporta uma proporção diferente de carga.

[069] FIG. 36 mostra um exemplo da criação de uma biblioteca combinatória conjugado XTEN que cria combinações de porções de direcionamento e cargas. Os grupos de segmentação 1, 2 e 3 são conjugados a XTEN levando 1A grupo reativo. Cargas E, F e G são conjugados a XTEN levando 1B grupo reativo. Estes segmentos são sujeitos a conjugação combinatória, permitindo a formação de produtos combinatórios, onde cada membro da biblioteca compreende porções de direcionamento e cargas. Todos os segmentos XTEN que transportam cargas e grupos de conjugação pode ser purificado como produtos combinatórios que pode ser imediatamente submetida a in vitro e testes in vivo.

[070] FIG. 37 mostra um exemplo de um conjugado XTEN compreendendo porções de direcionamento e cargas que exercem ação seletiva sobre a superfície de uma célula alvo, tal como uma célula de tumor. A concepção particular do conjugado LHRH compreende XTEN dimérica e doxorrubicina. Este conjugado liga-se ao receptor de LHRH em que é sobre- expressa em muitas células de cancro. Resultados de ligação a receptores em seguida pela internalização proteolítica quebrar e a libertação intracelular de doxorrubicina, que é tóxico para a célula.

[071] FIG. 38 é um fluxograma esquemático das etapas de representação na montagem, a produção e a avaliação de um XTEN.

[072] FIG. 39 é um fluxograma esquemático das etapas representativas no conjunto de uma construção polinucleotídeo XTEN que codifica uma proteína de fusão. Os oligonucleotídeos individuais 501 são recozidos em motivos de sequência 502, tais como um motivo de 12 amino ácidos ("12-mero"), que é ligada a motivos de sequências adicionais a partir de uma biblioteca para criar um conjunto que engloba o comprimento desejado do XTEN 504, bem como ligado a uma menor concentração de um oligo contendo BbsI, e os sítios de restrição Kpnl 503. A piscina resultante dos produtos de ligação é purificada em gel e a banda com o comprimento desejado de XTEN é cortada, o que resulta num gene XTEN isolado com uma sequência de rolha 505 O gene XTEN é clonado num vector de enchimento. Neste caso, o vector codifica uma sequência de CBD opcional 506 e um gene da GFP 508. A digestão é então realizada com BbsI/HindIII para remover 507 e 508. O produto resultante é, em seguida, clonado num BSAI/HindIII digerido vector, resultando no gene que codifica para uma XTEN 5 00.

[073] FIG. 40 é um fluxograma esquemático das etapas representativos da montagem de um gene que codifica XTEN, sua expressão, a conjugação com uma carga e recuperação como um XTEN, e sua avaliação como um produto candidato.

[074] FIG. 41 mostra XTEN generalizado com qualquer N ou C- terminal de etiquetas ou N- e C-terminais sequências optimizadas para a purificação utilizando os métodos ilustrados nas Figs. 42.

[075] FIG. 42 mostra um esquema geral de purificação de XTEN com, nesta modalidade ilustrativa, duas etiquetas em que um método de purificação de dois passos para capturar um primeiro marcador e, em seguida, o segundo pode ser usado para remover XTEN truncada a partir da fermentação, resultando na entidade XTEN alvo altamente purificada.

[076] FIG. 43 mostra um gel de SDS-PAGE do CDB-TEV- XTEN_AE864 local e CBD-TEV construções local-XTEN_AE864-GFP expressa em células a partir de culturas em frascos de agitação de E. coli BL21 DE3 rne-131 e de E. coli BL21 DE3, tal como descrito no Exemplo 10. amostras faixa de gel com os marcadores de PM e as proteínas expressas a partir de construções são: 1) marcadores de PM; 2-5) lisados a partir de 4 frascos independentes expressando CBD-TEV proteína de fusão local-XTEN_AE864-GFP em E. coli BL21 DE3; 6-9) lisados a partir de 4 frascos independentes expressando CBD-TEV proteína de fusão local-XTEN_AE864-GFP em E. coli BL21 DE3 RNE-131; 10-13) lisados a partir de 4 frascos independentes expressando CBD-TEV local-XTEN_AE864 proteína de fusão em E. coli BL21 DE3; 14-17) lisados a partir de 4 frascos independentes expressando CBD-TEV proteína de fusão local-XTEN_AE864 em E. coli BL21 DE3 RNE-131. Spots de proteínas de corpo inteiro aparecem dentro da caixa de contorno. As bandas de peso molecular mais baixo são as proteínas da célula hospedeira.

[077] FIG. 44 mostra a fluorescência de GFP relativa do CDB-TEV-local XTEN_AE864-GFP expressa em células de E. coli BL21 DE3 rne-131 e de E. coli BL21 DE3 de culturas em frascos de agitação como descrito no Exemplo 10.

[078] FIG. 45 mostra um gel de SDS-PAGE das-RC-XTEN_AE864 RH8-CBD (EC682) e CBD-R-XTEN_AE864-RH8 (EC683) construções expressas em fermentações de E. coli como descrito no Exemplo 17, as amostras da faixa de gel com os marcadores de PM e proteínas expressas a partir de construções são: 1) marcadores de PM; E. coli fermentação # EC682 esclarecidos pontos lisados solúveis tempo após a inoculação 2) 16 horas, 3) 24 horas, 4) 40 horas, 5) 45 horas; E. coli fermentação # EC683 esclareceu lisados solúveis em momentos após a inoculação 6) 16 horas, 7) 24 horas, 8) 40 horas, 9) 45 horas; Purificada CDB-R-XTEN_AE864-RH8 padrão de referência 10) 1 micrograma, 11) 2 microgramas, e 12) 4 microgramas. Para os lisados clarificados solúveis de E. coli de fermentação cada faixa representa 3 microlitros da cultura do fermentador. Spots de proteínas de corpo inteiro aparecem dentro da caixa de contorno. As bandas de peso molecular mais baixo são as proteínas da célula hospedeira.

[079] FIG. 46 mostra o resultado do rastreio de Toyopearl Phenyl 650 M cromatografia de interação hidrofóbica, tal como descrito no Exemplo 18.

[080] FIG. 47 mostra uma análise de 4-12% de Bis-Tris de SDS-PAGE não redutor de Toyopearl Phenyl 650 M de interação hidrofóbica frações de cromatografia, tal como indicado na figura e como descrito no Exemplo 18 Os materiais por via são: Faixa 1: marcador; Faixa 2: Carga 7,5 mL; Faixa 3: Fluxo através de uma 1; Faixa 4: Fluxo através de 2; Faixa 5: fração de eluição E1; Faixa 6: Eluição fração E2; Faixa 7: fração de eluição E3; Faixa 8: Eluição fração E4; Faixa 9: Eluição fração E5; A faixa 10: fração de eluição E6; Faixa 11: fração de eluição E7; Faixa 12: fração de eluição E8.

[081] FIG. 48 mostra um 4-12% de Bis-Tris a análise de SDS- PAGE não redutor de cromatografia IMAC Toyopearl fluir através, lavagem (FIG. 48A) e as frações de eluição (FIG. 48B) (não redutor) tal como descrito no Exemplo 18.

[082] FIG. 49 mostra uma análise de SDS-PAGE não redutora da piscina IMAC digerido por tripsina descrita no Exemplo 18.

[083] FIG. 50 mostra o perfil de eluição da cromatografia Q MacroCap descrito no Exemplo 18.

[084] FIG. 51 mostra um 4-12% de Bis-Tris a análise de SDS- PAGE das frações de eluição MacroCap Q, como descrito no Exemplo 18, a FIG. 51A, Coomassie. FIG. 51B, as frações de eluição, de coloração com Coomassie. FIG. 51C, as frações de eluição, coloração de prata.

[085] FIG. 52 mostra os traçados a partir de análise de RP- HPLC C18 de frações de eluição MacroCap Q, como descrito no Exemplo 18.

[086] FIG. 53 mostra um vestígio de um C18 RP-HPLC do MacroCap Q eluição da piscina, tal como descrito no Exemplo 18.

[087] FIG. 54 mostra uma análise de SDS-PAGE não redutora dos Toyopearl Phenyl 650 M frações cromatografia de interação hidrófoba, tal como descrito no Exemplo 19.

[088] FIG. 55 mostra uma análise de SDS-PAGE não redutor de frações de cromatografia IMAC Toyopearl, como descrito no Exemplo 19.

[089] FIG. 56 mostra um 4-12% de Bis-Tris de SDS- PAGE/análise de coloração com prata não redutoras das frações de eluição MacroCap Q conforme descrito no Exemplo 19.

[090] FIG. 57 mostra a análise de vestígios C18 RP-HPLC das frações de eluição MacroCap Q, como descrito no Exemplo 19.

[091] FIG. 58 mostra a análise de rastreio de C18 de RP- HPLC da eluição MacroCap Q descrito no Exemplo 19.

[092] FIG. 59 mostra uma análise de SDS-PAGE de XTEN constrói com etiquetas experimentais após expressão em E. coli como descrito no Exemplo 20. Lisados solúveis foram carregados na 4-12% Bis-Tris em gel de poliacrilamida, com montantes carregados por faixa equivale a 36 μl de suspensão de cultura de células. O gel foi corado com o corante azul de Coomassie, utilizando métodos convencionais.

[093] FIG. 60 mostra uma análise de SDS-PAGE da RP11-XTEN- His8 construto expresso em E. coli, tal como descrito em lisados solúveis tratadas termicamente Exemplo 20 foram carregados na 4-12% Bis-Tris em gel de poliacrilamida com quantidades equivalentes de 1 ou 2 μl de suspensão de cultura de células, respectivamente. O gel foi corado com azul de Coomassie. O gel demonstra que essencialmente toda a proteína RP11-XTEN-His8 expressa foi encontrada na fração sedimentada.

[094] FIG. 61 mostra uma análise de SDS-PAGE da purificação MacroCap SP de RP11-XTEN-His8 polipeptídeo descrito no Exemplo 21. As frações foram analisadas por 4-12% de SDS- PAGE seguido por coloração com Coomassie.

[095] FIG. 62 mostra uma análise de SDS-PAGE da purificação IMAC do polipeptídeo RP11-XTEN-His8 descrito no Exemplo 21 As frações foram analisadas por 4-12% de SDS-PAGE seguido por coloração com Coomassie.

[096] FIG. 63 mostra uma análise de SDS-PAGE da digestão com tripsina da proteína de RP11-XTEN-His8 purificada por duas etapas de cromatografia (SP + IMAC) descritas no Exemplo 21. As preparações foram analisadas por 4-12% de SDS-PAGE seguido por coloração com Coomassie (figura. 63A) e coloração com prata (FIG. 63B).

[097] FIG. 64 mostra os resultados da análise da reação de conjugação de DBCO-Mal o 3xThiol-XTEN como descrito no Exemplo 23 A FIG. 64A mostra a análise de C18 de RP-HPLC da mistura de reação. Uma amostra de 20 μg de proteína foi carregada sobre uma coluna Phenomenex Jupiter C18 300A 5uM 4,6 milímetros x 150 mm coluna. As proteínas foram eluídas com um gradiente de 5-50% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1%. FIG. 64B mostra a purificação do produto da reação de HIC DBCO-XTEN. FIG. 64C mostra o C18 análise de RP-HPLC do produto da reação DBCO-XTEN purificado por HIC.

[098] FIG. 65 mostra os resultados de clivagem de tripsina de um precursor com etiquetas XTEN dupla, tal como descrito no Exemplo 24 A FIG. 65A mostra a análise A4-12% Bis-Tris de SDS-PAGE de amostras de proteínas carregadas a 2 μg por faixa. O gel foi corado com um Invitrogen SimplyBlue SafeStain. FIG. 65B mostra A4-12% Bis-Tris a análise de SDS-PAGE de amostras de proteínas carregadas a 0.5 μg por faixa. O gel foi corado com um Kit Pierce Prata Stain.

[099] FIG. 66 mostra os resultados de uma análise de SDS- PAGE de MacroCap Q purificação de tripsina duplo digeridos com etiquetas precursor, tal como descrito no Exemplo 24 A FIG. 66A mostra a análise A4-12% Bis-Tris de SDS-PAGE de amostras de proteínas carregadas a 3 μg por faixa. O gel foi corado com Invitrogen SimplyBlue SafeStain. FIG. 66B mostra A4-12% Bis-Tris a análise de SDS-PAGE de amostras de proteínas cargas em 0,5 μg por faixa. O gel foi corado com um Kit Pierce Prata Stain. FIG. 66C mostra um 4-12% de BisTris a análise de SDS-PAGE de amostras de proteínas carregadas a 0,5 μg por faixa. O gel foi corado com um Kit Pierce Prata Stain.

[100] FIG. 67 mostra os resultados de um ensaio de RP-HPLC C18 de atividade de tripsina residual. FIG. 67A é a saída de rastreamento de análise sintética [G2] GLP2 peptídeo em forma intacta. FIG. 67B é a saída de rastreamento de análise sintética [G2] GLP2 peptídeo digeridos com tripsina bovina. FIG. 67C é a saída de rastreio de análise de XTEN_AE869_Am1, C2 cravado com [G2] GLP2 e incubadas durante a noite a 37°C, conforme descrito no Exemplo 24.

[101] FIG. 68 mostra a preparação de GLP2-XTEN conjugado de peptídeo Cis-GLP2 e 1xAmino-XTEN como descrito no Exemplo 26. 20 μg amostras de proteína foram carregadas em Phenomenex Jupiter C18 300A 5uM 4,6 milímetros x 150 mm coluna. As proteínas foram eluídas com 5-50% de gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% e detectado pela absorvância a 214 nm (painéis da esquerda AC). 100 μg de amostras de proteína foram dessalinizadas utilizando NanoSep 3K Omega dispositivos centrífugos (Pall Corp). As soluções de proteínas em 50% acetonitrilo, 0,5% ácido fórmico foram infundidas no espectrómetro de massa de alta resolução a uma velocidade de fluxo de 10 ul/min. ESIMS espectros foram adquiridos na faixa de 800-1600 amu e reconstruídas em espectros-carga zero usando Bayesian Software Reconstrução Proteína (painéis da direita A-C). FIG. 68A: inicial proteína 1xAmino-XTEN. FIG. 68B: o produto da reação entre 1xAmino-XTEN e sulfo-SMCC reticulante. FIG. 68C: purificado GLP2-XTEN conjugado após reação entre GLP2-Cys e N-Mal-XTEN.

[102] FIG. 69 mostra a preparação de GLP2-XTEN conjugado de GLP2-Mal-peptídeo e 1xThiol XTEN como descrito no Exemplo 27. 20 μg amostras de proteína foram carregadas em Phenomenex Jupiter C18 300A 5 uM 4,6 milímetros x 150 mm coluna. As proteínas foram eluídas com 5-50% de gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% e detectado pela absorvância a 214 nm (painéis da esquerda A, B). 100 μg de amostras de proteína foram dessalinizadas utilizando NanoSep 3K Omega dispositivos centrífugos (Pall Corp). As soluções de proteínas em 50% acetonitrilo, 0,5% ácido fórmico foram infundidas no espectrómetro de massa de alta resolução a uma velocidade de fluxo de 10 ul/min. ESI- MS espectros foram adquiridos na faixa de 800-1600 amu e reconstruídas em espectros de carga zero, usando Bayesian Software Reconstrução Proteína (painéis da direita A, B). FIG. 69A: inicial proteína 1xThiol-XTEN. FIG. 69B: produto da reação entre GLP2-Mal e 1xThiol-XTEN.

[103] FIG. 70 mostra os resultados da purificação de GLP2- XTEN C4 usando RP-HPLC preparativo como descrito no Exemplo 27 A FIG. 70A mostra um perfil de cromatografia de RP-HPLC preparativa. Uma fração em 56-62 min foi recolhida e evaporada sob vácuo. FIG. 70B mostra uma análise de C18 RP- HPLC para purificado GLP2-XTEN.

[104] FIG. 71 mostra os resultados da conjugação de DBCO- Mal a 1xThiol-XTEN, conforme descrito no Exemplo 28 A FIG. 71A mostra C18 análise por RP-HPLC da mistura de reação. Uma amostra de 20 μg de proteína foram carregadas em coluna Phenomenex Jupiter C18 5uM 300 mm A 4,6 mm x 150 mm. As proteínas foram eluídas com um gradiente de 5-50% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1%. FIG. 71B mostra a purificação de HIC DBCO-XTEN. FIG. 71C mostra a análise por RP-C18 de HPLC da purificado por HIC DBCO-XTEN.

[105] FIG. 72 mostra os resultados de ensaios de análise de XTEN conjugados com ligações cruzadas com FITC, como descrito no Exemplo 31 A FIG. 72A mostra a co-migração de um gel de fotografada pela caixa de luz UV para mostrar a grande PM aparente de FITC contendo espécies conjugadas, também detectadas por SEC, em OD214 (sinal de proteína) e OD495 (sinal de FITC) em uma coluna de SEC, indicando sucedida rotulagem do XTEN com o mínimo de contaminação do corante livre. Os materiais de faixa (esquerda para a direita, depois os padrões de PM são: rotulado FITC-CL-CBD- XTEN; marcado com FITC-CL-XTEN; purificado FITC-CL-XTEN; purificado FITC-CL-XTEN; purificada e FITC-CL -XTEN. O gel foi fotografado por caixa de luz UV para mostrar PM aparente de FITC FITC contendo espécies. FIG. 72B mostra os resultados de análise de SEC-FITC conjugado XTEN, mostrando a sobreposição da saída de materiais detectados em OD214 e OD495, e também o peso molecular aparente grande.

[106] FIG. 73 mostra os resultados de análises de SEC das frações de pico de eluição dos conjugados da GFP reticulado para XTEN e GFP livre, como descrito no Exemplo 32 A reticulação foi confirmada por co-migração do sinal proteína OD214 e OD395 sinal da GFP na coluna SEC.

[107] FIG. 74 mostra os resultados de ensaios de farmacocinética de GFP-X-XTEN e FITC-X-XTEN testados em macacos cinomolgos, como descrito no Exemplo 33.

[108] FIG. 75 mostra o perfil farmacocinético (concentração plasmática) em macacos cynomolgus após doses únicas de diferentes composições de GFP ligadas a polipeptídeos não estruturados de comprimento variável, administrada por via subcutânea ou por via intravenosa, tal como descrito no Exemplo 33 As composições foram GFP-L288, GFP- L576, GFP- XTEN_AF576, GFP-Y576 e XTEN_AD836-GFP. As amostras de sangue foram analisadas em vários momentos após a injecção e a concentração de GFP no plasma foi medido por ELISA usando um anticorpo policlonal contra a GFP para a captura e uma preparação biotinilada do mesmo anticorpo policlonal para detecção. Os resultados são apresentados como a concentração do plasma em função do tempo (h) após doseamento e mostra, em particular, um aumento considerável da semivida para o XTEN_AD836-GFP, a composição com o comprimento da sequência mais longa de XTEN. A construção com o comprimento da sequência mais curta, o GFP-L288 tiveram a sua meia-vida mais curta.

[109] FIG. 76 mostra um gel de SDS-PAGE de amostras a partir de um estudo da proteína de fusão de XTEN_AE864 fundido com o terminal N de GFP estabilidade. A GFP-XTEN foi incubado em plasma cinomolgo e lisado de rim de rato para um máximo de 7 dias a 37°C, tal como descrito no Exemplo 55, Além disso, a GFP-XTEN administrado a macacos Cynomolgus foi também avaliada. As amostras foram retiradas a 0, 1 e 7 dias e analisadas por SDS-PAGE seguido por análise de Western utilizando detecção e detecção com anticorpos contra GFP.

[110] FIG. 77 mostra o espectro de UV próximo dicroísmo circular de Ex4-XTEN_AE864, realizada como descrito no Exemplo 56.

[111] FIG. 78 mostra os resultados de uma análise de cromatografia de exclusão de tamanho de amostras a glucagon XTEN construto medidos contra padrões proteicos de peso molecular conhecido, com a saída do gráfico de absorção versus volume de retenção, tal como descrito no Exemplo 58 As construções de glucagon-XTEN são 1) glucagon Y288; 2) glucagonY-144; 3) glucagon-Y72; e 4) tipo glucagon Y36. Os resultados indicam uma

[112] FIG. 79 é uma representação esquemática do diagrama de fluxo lógico do algoritmo SegScore (Exemplo 59). Na figura a seguinte legenda se aplica: i, j - contadores utilizados nas malhas de controle que percorrem toda a sequência; HitCount- esta variável é um contador que mantém o controle de quantas vezes uma subsequência encontra uma subsequência idênticos em um bloco; SubSeqX - esta variável contém a subsequência que está sendo verificado para redundância;SubSeqY - esta variável contém a subsequência que o SubSeqX é verificado em relação; Blocklen - esta variável contém o comprimento determinado usuário do bloco; Seglen - esta variável possui o comprimento de um segmento. O programa é codificado para gerar pontuações para subsequências de comprimentos de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10; Block - esta variável contém uma cadeia de comprimento blocklen. A cadeia é composta por uma sequência de letras de XTEN entrada e é determinada pela posição do contador de i; SubSeqList - esta é uma lista que contém todas as pontuações subsequência gerados.

[113] FIG. 80 ilustra a aplicação do algoritmo para um SegScore XTEN hipotético de 11 aminoácidos, a fim de determinar a repetitividade. Uma sequência XTEN consistindo de aminoácidos é dividida em N N-S + 1 subsequências de comprimento S (S = 3 neste caso). A comparação de pares de todos os sub-sequências é realizada e o número médio de sub-sequências idênticas é calculado para resultar, neste caso, em uma pontuação subsequência de 1,89.

[114] FIG. 81 preve os resultados do ensaio para medir o sinal de fluorescência de RP11 clones pSD0107 para pSD0118), como descrito no Exemplo 12. Um controlo positivo (pLCW970) e dois controles negativos (pBr322 e pLCW970 + fosfato 10 mM) foram incluídos. O nível de expressão de GFP foi medida utilizando-se amostras 2-3 frascos de agitação por construção.

[115] FIG. 82 mostra os resultados da triagem de bibliotecas LCW1157-1159. FIG. 82A-C preve os histogramas de fluorescência de LCW1157-1159, que mostra o número de colónias identificadas para cada região do sinal de fluorescência, tal como descrito no Exemplo 12. A leitura de fluorescência média do controlo negativo (seta preta) e pSD0116 positivos (seta branca) são marcados nas figuras. FIG. 82D-F fornece a correlação entre a leitura de fluorescência no ensaio inicial e reteste dos clones selecionados.

[116] FIG. 83 mostra os resultados da análise de SDS-PAGE da expressão de topo 8 construir produtos e controlos em condições não reduzidas, como descrito no Exemplo 12. O produto final de comprimento total da proteína desejada RP11-XTEN-GFP é indicado por uma seta, e a banda de maior é o dímero da proteína. Lanes: 1-8: top 8 construções de expressão (nível de expressão de alto a baixo, com base na leitura de fluorescência dos retestes), 1. LCW1159.004, 2, LCW1159.006, 3, LCW1158.004, 4 LCW1157.040, 5 LCW1158.003, 6 LCW1157.039, 7 LCW1157.025, 8 LCW1157.038; C1-C3:Controles: C1. pSD0114, C2. pSD0116, C3. pCW1146 (Controle negativo).

[117] FIG. 84 mostra a avaliação de SDS-PAGE da eficiência de captura de MacroCap SP para o alto da expressão 4 construir produtos sob condições não redutoras, conforme descrito no Exemplo 12 Faixas 1-4: carga, o fluxo através, lavagem e eluição de LCW1159.004, 2. Faixas 5-8: carga, fluir através de, lavagem e eluição de LCW1159.006. Lanes 9-12: carga, o fluxo através, lavagem e eluição de LCW1158.004. 13-16: carga, o fluxo através, lavagem e eluição de LCW1157.040. Lanes 17-20 1-4: carga, o fluxo através, lavagem e eluição de controle negativo. Faixas não marcadas são padrões de peso molecular.

[118] FIG. 85 mostra o resumo de resultados do rastreio da biblioteca LCW1163 com uma comparação entre o sinal de fluorescência dos 4 melhores produtos de expressão e os controlos nos novos testes, tal como descrito no Exemplo 12. Cada amostra teve quatro repetições, representada por quatro pontos individuais na figura.

[119] FIG. 86 mostra o resumo de resultados do rastreio da biblioteca LCW1160, como descrito no Exemplo 12. Fluorescência de LCW1157-1159 histograma, mostrando o número de colónias identificadas para cada região de sinal de fluorescência; leitura média de fluorescência de controle negativo (seta preta), pSD0116 (seta branca), e LCW1159.004 (candidatos alta expressão do rastreio LCW1157- 1159, seta cinza) foram marcados nas figuras.

[120] FIG. 87 mostra de 4-12% de SDS-PAGE/análise de coloração com prata, das frações MacroCap Q conforme descrito no Exemplo 14 A FIG. 87A: Lote 2, a faixa 1: padrão de peso molecular; faixas 2-5: Fluxo MacroCap Q através de frações 1-4, respectivamente; faixas 6-16: MacroCap Q frações de eluição 1-11, respectivamente. FIG. 87B: Lote 1, faixa 1: padrão de peso molecular; faixas 2-6: fluxo MacroCap Q através de frações 1-5, respectivamente; faixas 7-16: MacroCap Q frações de eluição de 1-10, respectivamente.

[121] FIG. 88 mostra os resultados das análises de produtos intermediários e do produto final durante a preparação de 1xDBCO, 3xLHRH-XTEN, conforme descrito no Exemplo 34.

[122] FIG. 89 mostra os resultados de análises de misturas de reação a partir da preparação de conjugados de 1xAzide, 3xMMAE-XTEN analisados por C18-RP-HPLC e espectroscopia de massa, conforme descrito no Exemplo 35 A FIG. 89A é a análise da inicial reagente 1xAmino, 3xThiol-XTEN. FIG. 89B é a análise da modificação da proteína com MMAE-maleimida, que mostra o aumento de massa correspondendo a alterações de três cisteínas com MMAE-Mal. FIG. 89C mostra a análise da modificação da proteína com Azida-PEG4-éster NHS, com o aumento da massa correspondente à única adição da porção azida-PEG4.

[123] FIG. 90 mostra as análises dos produtos da reação em conjugados de 3xLHRH, 3xMMAE-XTEN como descrito no Exemplo 36 A FIG. 90A: análise SDS-PAGE do conjugado de clique. 0,5 μg de proteínas por faixa foram carregados em 12% Bis-Tris NuPAGE mini-gel (Life Technologies). O gel foi corado com Pierce Prata Stain Kit (Thermo Scientific, cat. # 24612). Lane1, 1xAzide, 3xMMAE-XTEN; faixa 2, 1xDBCO, 3xLHRH-XTEN; faixa 3, produtos da reação química do clique. A banda do produto de conjugação é indicada pela seta. FIG. 90B: C4 análise por RP-HPLC dos reagentes e produtos-clique conjugadas (1) 1xDBCO, 3xLHRH-XTEN; (2) 1xAzide, 3xMMAE- XTEN; (3) Os produtos da reação química clique.

[124] FIG. 91 mostra um diagrama de fluxo da reação durante a preparação de conjugados de 1xLHRH, 3xMMAE-XTEN, tal como descrito no Exemplo 37 A FIG. 91A: 1xAmino inicial, 3xThiol-XTEN; FIG. 91B: modificação de proteínas com 2,2 'dipiridilo; FIG. 91C: modificação de proteínas com DBCO- sulfo-NHS; FIG. 91D: desprotecção de cisteínas com TCEP; FIG. 91E: Modificação de três cisteínas com MMAE-Mal; FIG. 91F: Conjugação de LHRH-azida para DBCO N-terminal.

[125] FIG. 92 mostra um diagrama de fluxo da reação durante a preparação de conjugados de 1xMal, 3xPTX XTEN-reagente, tal como descrito no Exemplo 41, a FIG. 92A: 1xAmino inicial, 3xThiol-XTEN; FIG. 92B: A modificação de proteínas com PTX-Mal; FIG. 92C: A modificação de proteínas com Sulfo- SMCC.

[126] FIG. 93 mostra os resultados das análises de misturas de reação de preparação de iodoacetil-XTEN, conforme descrito no Exemplo 42 FIG. 93A: 1xAmino-XTEN analisados por C18-RP-HPLC antes e após a incubação com excesso de 10x de SIA.FIG. 93B: análise de ESI-MS de 1xAmino-XTEN modificado com SIA. FIG. 93C: Amostras analisadas por C18 RP-HPLC- perfil baixo - peptídeo HCKFWW. Perfil Médio - IA- XTEN. Perfil superior - reação de IA-XTEN com excesso de 5x de HCKFWW peptídeo.

[127] FIG. 94 mostra os resultados da triagem de bibliotecas LCW1171, 1172, 1203, e 1204, tal como descrito no Exemplo 14 A FIG. 94A-D: histograma de fluorescência de LCW1171, 1172, 1203, 1204, que mostra o número de colónias identificadas para cada região de sinal de fluorescência; leitura de fluorescência média de controle negativo (seta preta) e pSD0116 (seta branca) na triagem LCW1171-1172 foram marcados nas FIG. 94A e B; leitura de fluorescência média de controle negativo (seta preta), pSD0116 (seta branca) e controle de CBD (seta cinza) na triagem LCW1203- 1204 são marcadas nas figuras. 94C e D.

[128] FIG. 95 mostra os resultados da triagem de bibliotecas LCW1208-1210, como descrito no Exemplo 12. Figs. 95A-C: histogramas de fluorescência de LCW1208-1210, mostrando o número de colônias identificadas para cada região sinal de fluorescência; leitura média de fluorescência de controle negativo (seta preta) e controle de CBD (seta cinza) são marcadas nas figuras.

[129] FIG. 96 ilustra a produção de segmentos XTEN partir de um precursor que contém três cópias repetidas de XTEN de comprimento e sequência idêntica. Na FIG. 96A, o precursor XTEN compreende três cópias idênticas de XTEN que são ladeadas por sites de protease de clivagem idênticos. Na FIG. 96B, o precursor XTEN compreende ainda C- N e etiquetas de purificação por afinidade do terminal para facilitar a purificação de moléculas precursoras de comprimento completo. Após a purificação do precursor é clivado pela protease que atua em todas as sequências de clivagem para libertar incorporadas as marcas do XTEN, que é seguido por purificação para separar as unidades individuais de XTEN, facilitando a produção de alto rendimento de XTENs com comprimentos curto e intermediário a partir de moléculas precursoras de cadeia longa.

[130] FIG. 97 ilustra diferentes modalidades de trimérico, ramificado conjugados de carga XTEN em que todos os conjugados indicados podem ser preparados a partir de moléculas idênticas XTEN por conjugação ao seu grupo amino N-terminal e um grupo funcional, tais como o tiol da cisteína, que está localizada próximo para o terminal-C. FIG. 97A e B, ilustra conjugados possuindo uma única molécula de carga, com a FIG. 97A utilizando um agente de reticulação de 4 braços, com toda a XTEN conjugado em estreita proximidade com a carga, o que resulta na protecção significativa das interações de carga com outras moléculas. FIG. 97B ilustra uma configuração em que a carga é conjugada com um único braço XTEN que é ramificado na extremidade distal da configuração, resultando na redução da carga de blindagem em comparação com a configuração da FIG. 97A. FIG. 97C ilustra um conjugado com duas cargas que pode resultar no aumento da avidez ou aumento da potência. As FIGS. 97D e E ilustram configurações com três cargas idênticas para aumentar ainda mais a potência e/ou avidez. FIG. 97F ilustra uma configuração com uma carga A e duas cópias idênticas de carga B para ligação de alta avidez ou interações. FIG. 97G mostra uma configuração com três cargas diferentes permitindo a inclusão de três funções diferentes num único conjugado XTEN.

[131] FIG. 98 ilustra um esquema para a síntese de um conjugado entre um XTEN ramificada e uma única molécula de carga útil. Inicialmente, o grupo tiol na XTEN é bloqueado por reação com a iodoacetamida (em alternativa, pode-se iniciar a síntese usando XTEN que carece de um grupo tiol). Em seguida, um grupo DBCO é adicionado ao grupo alfa-amino de XTEN, em seguida, é feito reagir com um agente de reticulação tetrafuncionais que compreende um grupo iodoacetilo e três grupos azida. O XTEN resultante é em seguida feito reagir com uma carga útil que transporta um grupo tiol livre resultante no conjugado final de carga XTEN.

[132] FIG. 99 ilustra um esquema para a síntese de um conjugado entre um XTEN ramificada e uma única molécula de carga útil. Um intermediário é produzido por reação XTEN com um ligante trifuncional compreende duas funções de azida e com uma função de NHS, seguido pela adição de carga A para o grupo tiol via química maleimida (a fim de estas duas etapas podem ser invertidas). Um segundo intermediário é produzir por reação XTEN com uma cisteína com iodoacetamida para bloquear o grupo tiol livre, seguido pela adição de DBCO ao grupo alfa-amino por meio de ativação do NHS (a fim de estas duas etapas podem ser invertidas). Subsequentemente, as duas moléculas intermediárias são conjugadas utilizando uma reação química clique, resultando no conjugado final de carga XTEN.

[133] FIG. 100 ilustra um esquema para a síntese de um conjugado com uma XTEN ramificada e duas moléculas idênticas de carga útil. Um intermediário é produzido pela adição de um grupo DBCO ao grupo alfa-amino de um XTEN através NHS química. Um segundo intermediário produzido através do bloqueio do grupo tiol livre de uma XTEN com iodoacetamida, seguido pela adição de um agente reticulante trifuncional (2 grupos N-maleimida e um grupo carboxilo que é ativada por NHS) para o grupo amino alfa (da ordem destes dois passos pode ser invertida). Os dois intermediários são feitos reagir resultando no conjugado ramificado, e, em seguida, duas moléculas de carga A são adicionados através de uma reação química, resultando clique no produto final conjugado de carga XTEN.

[134] FIG. 101 ilustra um esquema para a síntese de um conjugado com uma XTEN ramificado e três moléculas de carga idênticas. Um intermediário é produzido pela adição de um grupo DBCO ao grupo alfa-amino de um XTEN através NHS química. Outro intermediário é produzido através da conjugação de carga A para o grupo tiol de um XTEN através de um grupo funcional N-maleimida. As três moléculas estão ligadas entre si através de um agente de reticulação trifuncional compreende três funções azida, resultando no conjugado final de carga XTEN.

[135] FIG. 102 ilustra um esquema para a síntese de um conjugado com uma XTEN ramificado e três moléculas de carga idênticas. Um intermediário é produzido pela adição de um grupo DBCO ao grupo tiol de uma XTEN Uma via química N- maleimida. No passo seguinte, uma A carga é conjugada com o grupo alfa-amino do intermediário XTEN através NHS química. Três moléculas do XTEN resultante estão ligadas através de um agente de reticulação trifuncional compreende três funções azida, resultando no conjugado final de carga XTEN.

[136] FIG. 103 ilustra um esquema para a síntese de um conjugado com um XTEN ramificada e dois Payload A e um B por moléculas Payload conjugado. Um intermediário é produzido pela adição de uma A carga útil para o grupo tiol de um XTEN utilizando um grupo funcional N-maleimida, seguido pela adição de um agente de reticulação trifuncional (dois grupos azida e um grupo carboxilo que é ativada por NHS) para o grupo amino alfa -group (a fim de estas duas etapas podem ser invertidas). Um segundo intermediário produzido através da adição de DBCO para o grupo amino alfa de um XTEN através NHS ativação seguiu-se a adição da Carga B para o grupo tiol livre da XTEN usando um grupo N-maleimida (a fim de estas duas etapas podem ser invertido). Duas moléculas do segundo intermediário são feitos reagir com uma molécula do primeiro intermediário para formar o conjugado final de carga XTEN.

[137] FIG. 104 ilustra um esquema para a síntese de um conjugado com uma XTEN ramificado e três cargas diferentes. Um intermediário é produzido pela adição de uma carga útil para o grupo tiol num XTEN utilizando um grupo funcional N- maleimida, seguido pela adição de um agente de reticulação trifuncional (um grupo azida, um grupo N-maleimida e um grupo carboxilo que é ativada por NHS) para o grupo amino alfa (a fim de estas duas etapas podem ser invertidas). Um segundo intermediário produzido através da adição de Carga B para o grupo amino alfa de XTEN através NHS química. Um terceiro intermediário é produzido por adição de DBCO para o grupo amino alfa de um XTEN através NHS ativação seguiu- se a adição de carga de C com o grupo tiol livre da XTEN usando um grupo N-maleimida (a fim de estas duas etapas podem ser invertido). Os três produtos intermédios são feitos reagir um com o outro para formar o conjugado final de carga XTEN.

[138] FIG. 105 ilustra um esquema para a síntese de um conjugado com moléculas diméricas ou tetraméricas ramificada XTEN e Payload A. Um intermediário é produzido pela adição de DBCO ao grupo tiol de um grupo N-maleimida utilizando XTEN funcional, seguido pela adição de A carga útil para o Um grupo amino do XTEN utilizando NHS (a fim de estas duas etapas podem ser invertidas). Subsequentemente, o intermediário é multimerizada por adição de azida de agentes de reticulação. Utilização de um agente de reticulação bivalente produz a configuração dimérica, e um agente de reticulação tetravalente produz a configuração tetramérica do produto final.

[139] FIG. 106 apresenta um esquema para a síntese de um conjugado com uma XTEN ramificado e três cargas diferentes. Um intermediário é produzido pela adição de uma carga útil para o grupo tiol de um XTEN usando grupo funcional N- maleimida, seguido pela adição de um agente de reticulação trifuncional (um grupo azida, um grupo N-maleimida e um grupo carboxilo que é ativada por NHS) para o grupo amino alfa (a fim de estas duas etapas podem ser invertidas). Um segundo intermediário produzido através da adição de Carga B para o grupo tiol livre de uma XTEN através de um grupo funcional N-maleimida. Um terceiro intermediário é produzido por adição de DBCO para o grupo amino alfa de uma ativação através de NHS XTEN seguido pela adição de Carga C para o grupo tiol livre com um grupo N-maleimida (a fim de estas duas etapas podem ser invertidas). Os três produtos intermédios são feitos reagir um com o outro para formar o conjugado final de carga XTEN.

[140] FIG. 107 mostra os resultados de análises de misturas de reação a partir da preparação de conjugados de 1xDBCO, 3xFA (Y) -XTEN analisados por C18-RP-HPLC e espectroscopia de massa, conforme descrito no Exemplo 38 A FIG. 107A é a análise da inicial reagente 1xAmino, 3xThiol-XTEN. FIG. 107B é a análise da modificação da proteína com folato- gama-maleimida, que mostra o aumento de massa correspondendo a alterações de três cisteínas com FA (y) - Mal. FIG. 107C mostra a análise da modificação da proteína com DBCO-sulfo-NHS éster, com o aumento da massa correspondente à única adição da porção DBCO.

[141] FIG. 108 mostra as análises C4 de RP-HPLC dos reagentes e produtos conjugados clique 3xFA (y), 3xMMAE- XTEN, tal como descrito no Exemplo 39 (1) 1xDBCO, 3xFA (y) -XTEN; (2) 1xAzide, 3xMMAE-XTEN; (3) Os produtos da reação química clique.

[142] FIG. 109 mostra as análises de 3xFA final (y), produto 3xMMAE-XTEN purificado por RP-HPLC preparativa, como descrito no Exemplo 39. FIG. 109A mostra a análise por cromatografia de exclusão de tamanho (Phenomenex BioSep SEC-S4000 de 600x 7,80 milímetros de coluna, 50 mM de fosfato de sódio pH 6,5, 300 mM de NaCl, 0,5 ml de taxa de fluxo/min, isocrática 70min eluição). FIG. 109B mostra a análise por RP-HPLC (Phenomenex Jupiter C18 5μM 300Â 150 x 4,60 milímetros de coluna, tampão A: TFA a 0,1% em H2O, tampão B: 0,1% TFA em CAN, taxa de fluxo 1 mL/min, gradiente de 5% a 50% de B em 45min). FIG. 3C mostra a análise ESI-MS (QStar-XL, calculado PM 85.085,4 Da, PM experimental 85.091 Da).

[143] FIG. 110 mostra os resultados da atividade de mobilização de Ca2+ do GPCR recombinante GLP2-2G-XTEN (quadrados a cheio) e conjugado GLP2-2G-XTEN (círculos preenchidos), realizada conforme descrito no Exemplo 62.

[144] FIG. 111 mostra os resultados de uma estabilidade in vitro no plasma humano recombinante de GLP2-2G-XTEN (quadrados a cheio) e conjugado GLP2-2G-XTEN (triângulos a cheio) a vários pontos de tempo a 37°C, efectuada tal como descrito no Exemplo 63.

[145] FIG. 112 mostra os resultados do perfil farmacocinético do recombinante GLP2-2G-XTEN (quadrados a cheio) e conjugado GLP2-2G-XTEN (triângulos a cheio), em ratos, como se descreveu no Exemplo 64.

[146] FIG. 113 FIG. 113A mostra a análise SEC-HPLC dos produtos da reação entre Tris [2-maleimidoetil] amina e 1xAmino, 1xThiol-XTEN432: A FIG. Mistura 113A- conjugação: pico 1 - trimeric XTEN, pico 2 - dimérica XTEN, pico 3 - que não reagiu monomérica XTEN; FIG. 113B- controlo XTEN_1296 linear; FIG. 113C- controlo XTEN_864 linear; FIG. 113D- controlo XTEN_432 linear.

[147] FIG. 114 FIG. 114A mostra a análise por RP-C18 de HPLC de DBCO-sulfo-NHS para conjugação 1xAmino-XTEN_288, como descrito no Exemplo 65 que não reagiu XTEN eluiu a 19 min. 1xDBCO-XTEN_288 eluiu a 27 min. Reagente DBCO-sulfo- NHS e produtos da sua hidrólise eluiu a 41,5 min e 38,5 min, respectivamente. FIG. 114B mostra a análise por RP- HPLC C18 de azido-PEG4-NHS éster conjugação de Tris (2- aminoetil) amina. 3xAzide-PEG4-TAEA foi identificado por MALDI-TOF MS e ESI-MS, como um produto com PM de 966 Da.

[148] FIG. 115 mostra a análise SEC-HPLC, conforme descrito no Exemplo 66, os produtos de reação entre 3xAzide-PEG4- TAEA e 1xDBCO-XTEN_288: (rastreio A) mistura de conjugação: pico 1 - trimérico XTEN, pico 2 - dimérica XTEN, pico 3 - que não reagiu monomérica XTEN, pico 4 - Os compostos de baixo peso molecular;(Traço B) controle XTEN_864 linear; (Traço C) controle XTEN576 linear; (Traço D) controlo XTEN_288 linear.

[149] FIG. 116 mostra os resultados de um ensaio de morte demonstrar a citotoxicidade selectiva de 3xFA (y), 3xMMAE- XTEN em células KB, tal como descrito no Exemplo 69 As curvas de dose-resposta de inibição são mostradas para os grupos de MMAE livre (círculos a cheio); 3xMMAE-XTEN (cheias, triângulos invertidos) e 3xFA ( y), 3xMMAE-XTEN na presença (triângulos a cheio) e ausência (quadrados a cheio) de competidor de ácido fólico em células KB.

[150] FIG. 117 mostra a estrutura do conjugado de de carga XTEN 3xFA (y), 3xMMAE-XTEN. FIG. 117A mostra a dois XTEN ligada por meio da reação da azida de ácido 1-azido- 3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-óico, éster de N- hidroxisuccinimida e o alcino ácido 6-(11,12 didehydrodibenzo-[b,f] azocin-5(6H)-il)-6-oxohexanoico, N- hidroxissuccinimida (ou N-hidroxissulf)éster. FIG. 117B mostra o resíduo de Cys X modificados com folato-y- aminopentil-maleimida. FIG. 117C mostra o resíduo de Cys Z modificado com maleimidocaproil-valina-citrulina-p- aminobenziloxicarbonil-monometilauristatina E.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[151] Antes das modalidades da invenção são descritos, é para ser compreendido que essas modalidades são fornecidas a título de exemplo apenas, e que várias alternativas às modalidades da invenção aqui descritos podem ser empregues na prática da invenção. Numerosas variações, alterações e substituições agora ocorrerão aos peritos na arte sem se afastar da invenção.

[152] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um vulgar perito na arte à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Em caso de conflito, a especificação da patente, incluindo definições, irá controlar. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitativos. Numerosas variações, alterações e substituições agora ocorrerão aos peritos na arte sem se afastar da invenção.

DEFINIÇÕES

[153] No contexto do presente pedido, os termos seguintes têm os significados a eles atribuídos, salvo especificação em contrário:

[154] Tal como utilizado ao longo da especificação e reivindicações, os termos "um", "uma" e "a" são utilizados no sentido que querem dizer "pelo menos um", "pelo menos, uma primeira", "um ou mais" ou "uma pluralidade "dos componentes ou passos referenciados, exceto nos casos em que um limite superior é, em seguida especificamente indicada. Por conseguinte, uma "carga útil", tal como aqui utilizado, significa "pelo menos uma primeira carga útil", mas inclui uma pluralidade de cargas. Os limites operáveis e os parâmetros de combinações, como com as quantidades de qualquer agente único, serão conhecidos dos peritos na arte à luz da presente divulgação.

[155] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são utilizados alternadamente aqui para referir-se a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, que pode compreender os aminoácidos modificados e pode ser interrompido por ácidos não-amino. Os termos também abrangem um polímero de aminoácidos que foi modificado, por exemplo, por formação de ligação dissulfureto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação, tal como conjugação com um componente de marcação.

[156] Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido" refere- se a qualquer aminoácido natural e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo mas não se limitando a, tanto o D ou L isómeros ópticos, e análogos de aminoácidos e peptidomiméticos. Os códigos de uma única letra ou de três padrões são usados para designar os aminoácidos.

[157] Um agente "farmacologicamente ativo" inclui qualquer droga, composto, composição de matéria ou a mistura desejada para ser entregue a um sujeito, por exemplo, agentes terapêuticos, agentes de diagnóstico, ou agentes de entrega de droga, o que fornece ou se espera para prever algum efeito farmacológico, muitas vezes benéfico, efeito que pode ser demonstrado in vivo ou in vitro. Tais agentes podem incluir peptídeo s, proteínas, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, nucleosídeos, oligonucleotídeos, e compostos sintéticos de moléculas pequenas, ou seus análogos.

[158] O termo "ácido L-amino naturais" significa as formas de isómeros ópticos L de glicina (G), prolina (P), alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M), cisteína (C), fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W), histidina (H), lisina (K), arginina (R), glutamina (Q), asparagina (N), ácido glutâmico (E), ácido aspártico (D), serina (S), e treonina (T).

[159] O termo "não natural", tal como aplicado a sequências e, tal como aqui utilizado, significa um polipeptídeo ou de polinucleotídeo sequências que não têm uma contrapartida, não são complementares a, ou não possuem um alto grau de homologia com o tipo selvagem ou sequência encontrada em um mamífero de ocorrência natural. Por exemplo, um polipeptídeo ou fragmento de ocorrência não natural podem partilhar a não mais do que 99%, 98%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50% ou mesmo menos de identidade de sequência de aminoácidos, em comparação com uma sequência natural quando devidamente alinhados.

[160] Os termos "hidrofílico" e "hidrofóbico" refere-se ao grau de afinidade que tem uma substância com água. Uma substância hidrófila tem uma forte afinidade para a água, que tende a dissolver-se em, mistura com, ou ser molhada com água, enquanto que uma substância hidrofóbica substancialmente falta de afinidade para a água, que tende a repelir, não absorvem água e não tende a dissolver-se ou misturar-se com ou ser molhada com água. Os aminoácidos podem ser caracterizados com base na sua hidrofobicidade. Um número de escalas tem sido desenvolvido. Um exemplo é uma escala desenvolvida por Levitt, M, et al, J Mol Biol (1976) 104: 59, que é apresentado na Hopp, TP, et ai, Proc Natl Acad Sci EUA (1981) 78:. 3824. Exemplos de "aminoácidos hidrofílicos" são arginina, lisina, treonina, alanina, asparagina, e glutamina. De particular interesse são os hidrófilos aminoácidos aspartato, glutamato, e serina, e glicina. Exemplos de "aminoácidos hidrófobos" são triptofano, tirosina, fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina, e valina.

[161] Um "fragmento", quando aplicado a uma proteína biologicamente ativa, é uma forma truncada de uma proteína biologicamente ativa que retém pelo menos uma parte da atividade terapêutica e/ou biológica. Uma "variante", quando aplicado a uma proteína biologicamente ativa é uma proteína com homologia de sequência com a proteína biologicamente ativa nativa que retém pelo menos uma porção do agente terapêutico e/ou a atividade biológica da proteína biologicamente ativa. Por exemplo, uma variante da proteína pode partilhar pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência de aminoácidos em comparação com a referência de proteína biologicamente ativa. Tal como aqui utilizado, o termo "variante da proteína biologicamente ativa" inclui proteínas modificadas deliberadamente, como por exemplo, por mutagênese dirigida ao local, a síntese do gene que codifica, inserções, ou acidentalmente através de mutações e que retêm a atividade.

[162] O termo "variante de sequência" significa polipeptídeos que foram modificados em relação à sua sequência nativa ou original por uma ou mais inserções de aminoácidos, deleções ou substituições. As inserções podem ser localizadas em qualquer um ou em ambos os terminais da proteína, e/ou podem ser posicionados no interior das regiões internas da sequência de aminoácidos. Um exemplo não limitativo é a inserção de uma sequência de XTEN dentro da sequência da proteína de carga biologicamente ativo. Outro exemplo não limitativo é a substituição de um aminoácido em um XTEN com um aminoácido diferente. Em variantes de deleção, um ou mais resíduos de aminoácidos de um polipeptídeo como os aqui descritos são removidos. As variantes de deleção incluem, portanto, todos os fragmentos de uma sequência de polipeptídeo de carga. Em variantes de substituição, de um ou mais resíduos de aminoácidos de um polipeptídeo são removidos e substituídos com resíduos alternativos. Num aspecto, as substituições são conservadoras na natureza e substituições conservativas deste tipo são bem conhecidas na arte.

[163] O termo "radical" designa um componente de uma composição ou maior que se destina a ser incorporada numa composição de maior, tal como um grupo funcional de uma molécula de fármaco ou um peptídeo alvo ligado a um polipeptídeo maior.

[164] Tal como aqui utilizado, "XTEN terminal" refere-se a sequências de XTEN que foram fundidas ou na extremidade N ou C-terminal da carga, quando a carga é um peptídeo ou polipeptídeo.

[165] O termo "local de libertação XTEN" refere-se a uma sequência de clivagem em de carga XTEN que pode ser reconhecida e clivada por uma protease, efetuar uma libertação de XTEN ou uma porção de um polipeptídeo a partir de XTEN de carga XTEN. Tal como aqui utilizado, "protease de mamífero" significa uma protease que existe normalmente no corpo fluidos, células ou tecidos de um mamífero. Locais de libertação XTEN pode ser manipulada para ser clivada por várias proteases de mamífero (ou "proteases") XTEN libertação, tais como tripsina, FXIa, FXIIa, calicreína, FVIIIa, FVIIIa, FXa, FIIa (trombina), elastase-2, MMP-12, MMP13, MMP-17, MMP-20, ou qualquer protease que está presente num sujeito. Outras proteases equivalentes (endógenos ou exógenos) que são capazes de reconhecer um local de clivagem definido pode ser utilizado. Os locais de clivagem podem ser ajustados e adaptados para a protease utilizada.

[166] O termo "dentro", quando se refere a um primeiro polipeptídeo ser ligado a um segundo polipeptídeo, engloba ligando que liga o terminal N do primeiro ou do segundo polipeptídeo para o C-terminal do segundo ou do primeiro polipeptídeo, respectivamente, bem como inserção do primeiro polipeptídeo na sequência do segundo polipeptídeo. Por exemplo, quando um XTEN está ligado "dentro de" um polipeptídeo de carga útil, o XTEN pode ser ligado ao terminal N, do terminal C, ou pode ser inserido entre quaisquer dois aminoácidos do polipeptídeo de carga.

[167] "Atividade" como aplicado a forma (s) de uma composição de carga XTEN aqui prevista, refere-se a uma ação ou efeito, incluindo, mas não se limitando ao receptor, a atividade de ligação antagonista, a atividade agonista, uma resposta celular ou fisiológico, ou um efeito geralmente conhecido na arte para a carga, se medida por um in vitro, ex vivo ou in vivo, ou um ensaio de efeito clínico.

[168] Tal como aqui utilizado, o termo "ELISA " refere-se a um ensaio de imunossorvente ligado a enzima, tal como aqui descrito ou como conhecido na arte.

[169] Uma "célula hospedeira" inclui uma célula ou de células de cultura individual que pode ser ou tem sido um receptor para os vectores de sujeitos, tais como aquelas aqui descritas. As células hospedeiras incluem a descendência de uma única célula hospedeira. A progénie pode não ser necessariamente completamente idêntica (em morfologia ou na genômica do complemento de ADN total) à célula parental original devido a mutação natural, acidental, ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com um vector da presente invenção.

[170] "Isolado" quando utilizado para descrever os vários polipeptídeos aqui descritos, significa um polipeptídeo que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que diagnóstico ou terapêuticas para o polipeptídeo, e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteicos ou não proteicos. Como é evidente para aqueles peritos na arte, um que não ocorre naturalmente polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo ou fragmentos destes, não exige o "isolamento" para distingui-lo do seu homólogo de ocorrência natural. Além disso, um "concentrado", "separada" ou "diluída" polinucleotídica, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo, ou seus fragmentos, pode ser distinguida da sua contrapartida que ocorre naturalmente, em que a concentração ou número de moléculas por unidade de volume é geralmente maior do que ao da sua contrapartida que ocorre naturalmente. Em geral, um polipeptídeo feitos por meios recombinantes e expressos numa célula hospedeira é considerada "isolada".

[171] Um ácido nucleico "isolado" é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está normalmente associada na fonte natural do ácido nucleico que codifica polipeptídeo. Por exemplo, uma molécula isolada de ácido nucleico que codifica polipeptídeo é outra que não na forma ou configuração na qual é encontrada na natureza. Isolado moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeo distinguem-se portanto da molécula de ácido nucleico específica que codifica um polipeptídeo como existe em células naturais. No entanto, uma molécula isolada de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo inclui moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeo contidas em células que habitualmente expressam o polipeptídeo onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está numa localização cromossómica ou extra cromossômica diferente daquela das células naturais.

[172] Uma proteína "quimérico " contém, pelo menos, um polipeptídeo de fusão que compreende pelo menos uma região em uma posição diferente na sequência do que o que ocorre na natureza. As regiões podem normalmente existem em proteínas separadas e estão reunidos na polipeptídeo de fusão; ou podem existir normalmente na mesma proteína mas são colocados num novo arranjo no polipeptídeo de fusão. Uma proteína quimérica pode ser criada, por exemplo, por síntese química, ou através da criação e tradução de um polinucleotídeo em que as regiões peptídicas são codificadas na relação desejada.

[173] "Fundida" e "fusão" são aqui usados indiferentemente, e refere-se à junção de duas ou mais sequências peptídicas ou polipeptídicas por meios recombinantes.

[174] "Operacionalmente ligado" significa que as sequências de ADN a serem ligadas são contíguas e em fase de leitura ou em grelha. Uma “fusão em-tabela" refere-se à união de dois ou mais enquadramentos de leitura abertos (ORF), para formar um mais ORF contínua, de uma maneira que mantém a estrutura de leitura correta das ORFs originais. Por exemplo, um promotor ou um potenciador está operativamente ligado a uma sequência de codificação para um polipeptídeo se este afetar a transcrição da sequência polipeptídica. Assim, a proteína de fusão recombinante resultante é uma única proteína que contém dois ou mais segmentos que correspondem aos polipeptídeos codificados pelas ORFs originais (segmentos que não são normalmente assim juntos na natureza).

[175] "Reticulação", “conjugação","ligação" "ligar" e "se juntou a" são aqui usados indistintamente, e referem-se a ligação covalente de duas moléculas diferentes de uma reação química. A reticulação pode ocorrer em uma ou mais reações químicas, como descrito mais completamente, mais adiante.

[176] O termo "parceiro de conjugação", tal como aqui utilizado, refere-se aos componentes individuais que podem ser ligados ou ligados numa reação de conjugação.

[177] O termo "conjugado" pretende referir-se a molécula heterogênea formada como um resultado de ligação covalente dos parceiros de conjugação a um outro, por exemplo, uma carga biologicamente ativo ligado de forma covalente a uma molécula XTEN ou um agente de reticulação de forma covalente ligado a uma XTEN reativo.

[178] "Reticulação" e "ligante" e "agente de reticulação" são usados de forma alternada e no seu contexto mais lato para significar uma entidade química utilizada para unir de forma covalente duas ou mais entidades. Por exemplo, um agente de reticulação junta dois, três, quatro ou mais XTEN, ou se une a uma carga útil a um XTEN, como as entidades que estão aqui definidos. Um agente de reticulação inclui, mas não está limitado a, o produto da reação de molécula pequena de comprimento zero, os compostos de reticulação homo ou hetero-bifuncionais, e multifuncionais, o produto da reação de dois reagentes químicos. Será entendido por um perito na arte que um agente de reticulação pode referir-se o produto da reação covalentemente ligada remanescente, após a reticulação dos reagentes. O agente de reticulação pode também compreender um ou mais reagentes que não reagiram, mas que são capazes de reagir com outra entidade.

[179] No contexto de polipeptídeo s, uma "sequência linear" ou uma "sequência" é uma ordem de aminoácidos num polipeptídeo de um grupo amino a direção do terminal carboxilo, em que os resíduos que são vizinhos na sequência são contíguos na estrutura primária do polipeptídeo. Uma "sequência parcial " é uma sequência linear de uma parte de um polipeptídeo que é conhecido por conter resíduos adicionais em uma ou ambas as direções.

[180] "Heterólogo" significa derivado de uma entidade genotipicamente distinta do resto da entidade à qual está a ser comparada. Por exemplo, uma sequência rica em glicina removido da sua sequência de codificação nativa e operativamente ligado a uma sequência de codificação diferente da sequência nativa é uma sequência rica em glicina heteróloga. O termo "heterólogo", tal como aplicado a um polinucleotídeo, um polipeptídeo, significa que o polinucleotídeo ou polipeptídeo é derivado de uma entidade genotipicamente distinta da do resto da entidade à qual está a ser comparada.

[181] Os termos "polinucleotídeos", "ácidos nucleicos ", "nucleotídeos" e "oligonucleotídeos" são utilizados alternadamente. Eles referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, quer ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos, ou seus análogos. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem desempenhar qualquer função conhecida ou desconhecida. Os seguintes são exemplos de polinucleotídeos não limitativo: codificação ou regiões de um gene ou fragmento de gene, loci (lócus) definida a partir de análise de ligação, éxons, íntrons, ARN mensageiro (ARNm) não-codificante, RNA de transferência, RNA ribossomal, ribozimas, ADNc, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vectores, ADN isolado de qualquer sequência, ARN isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo. Se presente, a modificação da estrutura nucleotidica pode ser transmitida antes ou após montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotidicos. Um polinucleotídeo pode ser adicionalmente modificado após polimerização, tal como por conjugação, com um componente de marcação.

[182] O termo "complemento de um polinucleotídeo" indica uma molécula polinucleotídica tendo uma sequência de bases complementar e orientação inversa em comparação com uma sequência de referência, de tal forma que ele pode hibridar com uma sequência de referência, com total fidelidade.

[183] "Recombinante", tal como aplicado a um polinucleotídeo significa que o polinucleotídeo é o produto de combinações de várias etapas de recombinação, que podem incluir clonagem, restrição e/ou passos de ligação, e outros processos que resultam na expressão de uma proteína recombinante numa célula hospedeira.

[184] Os termos "gene" e "fragmento de gene" são aqui utilizadas indiferentemente. Eles referem-se a um polinucleotídeo contendo pelo menos uma tabela de leitura aberta que é capaz de codificar para uma proteína em particular depois de ter sido transcrito e traduzido. Um gene ou fragmento de gene pode ser genômico ou ADNc, contanto que o polinucleotídeo contém, pelo menos, uma grelha de leitura aberta, que pode cobrir toda a região de codificação, ou um seu segmento. Um "gene de fusão" é um gene composto por pelo menos dois polinucleotídeos heterólogos que são ligadas em conjunto.

[185] "Homologia" ou "homologia" ou "identidade de sequência" refere-se à semelhança de sequências ou permutabilidade entre duas ou mais sequências polinucleotídicas ou entre duas ou mais sequências polipeptidicas. Quando se utiliza um programa tal como o BestFit para determinar a identidade de sequência, de similaridade ou de homologia entre duas sequências de aminoácidos diferentes, as configurações padrão pode ser usado, ou uma matriz de pontuação apropriada, tal como BLOSUM80 blosum45 ou, podem ser selecionados para otimizar a identidade, ou similaridade altas porcentagens de homologia. De preferência, os polinucleotídeos que são homólogas são aquelas que hibridam sob condições rigorosas, tal como aqui definido e tem, pelo menos, 70%, de preferência pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferivelmente 95%, mais preferivelmente 97%, mais preferivelmente 98%, e ainda mais preferivelmente 99% de identidade de sequência em relação a estas sequências. Os polipeptídeos que são homólogos de preferência têm identidades de sequências que são pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos 95-99% de identidade.

[186] O termo "ligação", tal como aplicado a ácidos polinucleico refere-se ao processo de formação de ligações fosfodiéster entre dois fragmentos de ácidos nucleicos ou genes, ligando-os em conjunto. Para ligar os fragmentos de ADN ou genes juntos, as extremidades do ADN têm de ser compatíveis uns com os outros. Em alguns casos, as extremidades serão diretamente compatíveis após digestão com endonuclease. No entanto, pode ser necessário converter primeiro as extremidades coesivas vulgarmente produzidas após digestão com endonuclease em extremidades lisas para as tornar compatíveis para ligação.

[187] Os termos "condições rigorosas" ou "condições de hibridação rigorosas" inclui referência a condições sob as quais um polinucleotídeo vai hibridar com a sua sequência alvo, para um grau de detecção superior a outras sequências (por exemplo, pelo menos duas vezes ao longo do fundo). Geralmente, rigor de hibridação é expressa, em parte, com referência à temperatura e concentração de sal nas quais o passo de lavagem é levado a cabo. Tipicamente, condições restritas serão aquelas em que a concentração de sal é inferior a cerca de 1,5 M de íon Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon Na (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para polinucleotídeos curtos (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para os polinucleotídeos de comprimento (por exemplo, maior do que 50 nucleotídeos) -para exemplo, "condições rigorosas" podem incluir a hibridação em 50% de formamida, 1 M de NaCl, 1 % de SDS a 37°C, e três lavagens de 15 minutos cada em 0,1 x SSC/1% SDS a 60°C e 65°C. Alternativamente, podem ser utilizados a temperaturas de cerca de 65°C, 60°C, 55°C, ou 42°C. Concentração de SSC pode ser variada de cerca de 0,1 a 2 x SSC, com SDS estar presente em cerca de 0,1%. Tais temperaturas de lavagem são geralmente selecionadas para serem cerca de 5°C a 20°C inferior ao ponto térmico de fusão para a sequência especifica, a uma força iônica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) à qual 50% da sequência alvo hibrida com uma sonda perfeitamente correspondente. Uma equação para o cálculo da Tm e as condições de hibridação de ácidos nucleicos são bem conhecidas e podem ser encontradas em Sambrook, J. et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual,". 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 Tipicamente, bloqueando Os reagentes são usados para bloquear a hibridização não-específica. Tais reagentes de bloqueamento incluem, por exemplo, cortado e ADN de esperma de salmão desnaturado a cerca de 100-200 μg/ml. O solvente orgânico, tal como formamida, a uma concentração de cerca de 35-50% v/v, pode também ser usado em circunstâncias particulares, tais como para ARN: hibridações de ADN. Variações úteis nestas condições de lavagem será prontamente aparente para os peritos na arte.

[188] Os termos "percentagem de identidade," percentagem de identidade de sequência "e"% de identidade ", como aplicado a sequências polinucleotídicas, referem-se à percentagem de resíduos de partidas entre, pelo menos, duas sequências polinucleotídicas alinhadas utilizando um algoritmo padronizado. Um tal algoritmo pode inserir, de uma forma normalizada e reprodutível, lacunas nas sequências a serem comparadas, a fim de optimizar o alinhamento entre duas sequências, e por conseguinte alcançar uma relação mais significativa das duas sequências. A percentagem de identidade pode ser medida ao longo do comprimento de uma sequência de polinucleotídeo toda definido, ou pode ser medido ao longo de um comprimento mais curto, por exemplo, ao longo do comprimento de um fragmento tomado a partir de uma sequência de polinucleotídeo maior definido, por exemplo, um fragmento de pelo menos 45, pelo menos 60, pelo menos 90, pelo menos 120, pelo menos 150, pelo menos 210 ou pelo menos 450 resíduos contíguos. Tais comprimentos são apenas exemplos, e é entendido que qualquer comprimento fragmento suportado pelas sequências aqui apresentadas, nas tabelas, figuras e listagem de sequência, pode ser usado para descrever um comprimento sobre o qual a identidade percentual pode ser medida. A percentagem de identidade de sequência é calculada por comparação de duas sequências otimamente alinhadas ao longo da janela de comparação, determinando o número de posições emparelhadas (em que os resíduos idênticos ocorrem em ambas as sequências polipeptídicas), dividindo o número de posições emparelhadas pelo número total de posições na a janela de comparação (ou seja, o tamanho da janela), e multiplicando o resultado por 100 para dar a percentagem de identidade de sequência. Quando as sequências de comprimento diferente são para ser comparado, a sequência mais curta define o comprimento da janela de comparação. As substituições conservadoras não são consideradas no cálculo de identidade de sequência.

[189] "Percentagem (%) de identidade de sequência", em relação às sequências de polipeptídeo aqui identificadas, é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos de uma sequência de pesquisa que são idênticos aos resíduos de aminoácidos de uma segunda sequência polipeptídica de referência ou de uma porção da mesma , após alinhamento das sequências e introdução de hiatos, se necessário, para alcançar a percentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequência, resultando, assim, em alinhamento óptimo. O alinhamento para fins de determinação da identidade de sequência de aminoácidos por cento pode ser conseguido de vários modos que estão dentro da perícia na arte, por exemplo, utilizando programas de computador disponíveis publicamente tais como os programas BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os peritos na arte podem determinar os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para obter um alinhamento óptimo ao longo do comprimento total das sequências a ser comparado. A percentagem de identidade pode ser medida ao longo do comprimento de uma sequência polipeptídica inteira definido, ou pode ser medido ao longo de um comprimento mais curto, por exemplo, ao longo do comprimento de um fragmento tomado a partir de uma sequência maior polipeptídeo definido, por exemplo, um fragmento de pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 70 ou, pelo menos, 150 resíduos contíguos. Tais comprimentos são apenas exemplos, e é entendido que qualquer comprimento fragmento suportado pelas sequências aqui apresentadas, nas tabelas, figuras e listagem de sequência, pode ser usado para descrever um comprimento sobre o qual a identidade percentual pode ser medida.

[190] "Repetitividade" usado no contexto de sequências polinucleotídicas refere-se ao grau de homologia interna na sequência, tais como, por exemplo, a frequência das sequências de nucleotídeos idênticas de um determinado comprimento. Repetitividade pode, por exemplo, ser medida através da análise da frequência de sequências idênticas.

[191] Um "vector" é uma molécula de ácido nucleico, de preferência autorreplicante em um hospedeiro apropriado, que transfere uma molécula de ácido nucleico inserida para e/ou entre células hospedeiras. O termo inclui vectores que funcionam principalmente por inserção de ADN ou de ARN numa célula, replicação de vectores que funcionam principalmente para a replicação de ADN ou ARN, e vectores de expressão que funcionam para transcrição e/ou tradução do ADN ou ARN. Também estão incluídos os vetores que fornecem mais de uma das funções acima. Um "vector de expressão" é um polinucleotídeo que, quando introduzido numa célula hospedeira apropriada, pode ser transcrita e traduzida para um polipeptídeo (s). Um "sistema de expressão" usualmente denota uma célula hospedeira adequada composta por um vector de expressão que pode funcionar para obter um produto de expressão pretendido.

[192] "Resistência à degradação sérica," tal como aplicado a um polipeptídeo, refere-se à capacidade dos polipeptídeos de resistir a degradação no sangue ou os seus componentes, o que tipicamente envolve proteases no soro ou plasma. A resistência à degradação sérica pode ser medida através da combinação com a proteína humana (ou de ratinho, rato, macaco, conforme adequado) de soro ou plasma, tipicamente para um intervalo de dias (por exemplo, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 16 dias), tipicamente a cerca de 37°C. As amostras para esses momentos podem ser executadas em um ensaio de Western blot e a proteína é detectada com um anticorpo. O anticorpo pode ser uma etiqueta na proteína. Se a proteína mostra uma única banda no Western, onde o tamanho da proteína é idêntica à da proteína injetada, em seguida, sem degradação ocorreu. Neste método exemplar, o ponto de tempo em que 50% da proteína é degradada, tal como avaliado por transferências de Western ou técnicas equivalentes, é a semivida de degradação do soro ou "semivida no soro" da proteína.

[193] Os termos "t1/2", "semivida", "semivida terminal ", "semivida de eliminação" e "semivida de circulação" são utilizados aqui indiscriminadamente e, tal como aqui utilizado significa a meia-vida terminal calculada como ln(2)/Kel. Kel é a constante de velocidade de eliminação terminal calculada por regressão linear da porção linear terminal do log da concentração versus a curva do tempo. Meia-vida, tipicamente refere-se ao tempo necessário para que a metade da quantidade de uma substância administrada depositado num organismo vivo para ser metabolizado ou eliminado por processos biológicos normais.

[194] "Folga ativo" significa os mecanismos pelos quais uma proteína é removida da circulação do que a outra por meio de filtração, e o qual inclui a remoção da circulação mediada por células, receptores, metabolismo, ou a degradação da proteína.

[195] "Fator de peso molecular aparente" e "peso molecular aparente" são termos relacionados referem a uma medida do aumento ou diminuição no peso molecular aparente exibido por um determinado aminoácido ou uma sequência de polipeptídeo. O peso molecular aparente é determinado utilizando cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) ou métodos semelhantes, comparando com padrões de proteína globular, e é medido em unidades de "kD aparente". O fator de peso molecular aparente é a razão entre o peso molecular aparente e o peso molecular real; este último previsto pela adição, com base na composição de aminoácidos, o peso molecular calculado de cada tipo de aminoácido na composição ou por estimativa da comparação com padrões de peso molecular em um gel de electroforese SDS. Determinação de tanto o peso molecular aparente e o fator peso molecular aparente de proteínas de representação é descrito nos Exemplos.

[196] Os termos "raio hidrodinâmico" ou "raio de Stokes" é o raio efetivo (Rh em nm) de uma molécula de uma solução medido assumindo que é um corpo que se move através da solução e resistida por viscosidade da solução. Nas modalidades da invenção, as medições de raio hidrodinâmico dos polipeptídeos XTEN correlacionar com o "fator de peso molecular aparente", que é uma medida mais intuitivo. O "raio hidrodinâmico" de uma proteína afeta a sua velocidade de difusão, em solução aquosa, bem como a sua capacidade para migrar em géis de macromoléculas. O raio hidrodinâmico de uma proteína é determinado pelo seu peso molecular, assim como pela sua estrutura, incluindo a forma e compactação. Os métodos para a determinação do raio hidrodinâmico são bem conhecidos na arte, tal como pela utilização de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), como descrito na Patente US N° 6.406.632 e 7.294.513. A maioria das proteínas têm estrutura globular, o qual é a estrutura tridimensional de uma proteína mais compacto pode ter com o menor raio hidrodinâmico. Algumas proteínas de adoptar uma conformação aleatória e aberto, não estruturada, ou "linear" e como resultado, têm um raio hidrodinâmico muito maior em comparação com proteínas globulares típicos de peso molecular semelhante.

[197] "Condições fisiológicas" refere-se a um conjunto de condições em um hospedeiro vivo, bem como in vitro, incluindo as condições de temperatura, concentração de sais, pH, que imitam as referidas condições de um sujeito vivo. Uma série de condições fisiologicamente relevantes para o uso em ensaios in vitro foram estabelecidas. Geralmente, um tampão fisiológico contém uma concentração de sal fisiológica e é ajustado a um pH neutro, que varia de cerca de 6,5 a cerca de 7,8, e de preferência de cerca de 7,0 a cerca de 7,5. Uma variedade de tampões fisiológicos está listada em Sambrook et al. (2001). Fisiologicamente relevante temperatura varia entre cerca de 25°C a cerca de 38°C, e preferivelmente de cerca de 35°C a cerca de 37°C.

[198] O "resíduo único átomo de carga", o átomo de uma carga que está ligado quimicamente ao XTEN após a reação com o assunto XTEN ou composições XTEN-ligador; tipicamente um átomo de enxofre, um átomo de oxigénio, um átomo de azoto, ou um átomo de carbono. Por exemplo, um átomo de um resíduo de carga pode ser um resíduo de enxofre de um grupo reativo tiol na cisteína de uma carga, uma molécula de azoto de um grupo amino reativo de um peptídeo ou polipeptídeo ou molécula pequena carga, um resíduo de carbono ou de oxigénio ou um reativo carboxil ou aldeído grupo de um peptídeo, proteína ou uma molécula pequena ou sintética, orgânica droga.

[199] Um "grupo reativo" é uma estrutura química que pode ser acoplado a um segundo grupo reativo. Exemplos de grupos reativos são grupos amino, grupos carboxil, grupos sulfidril, grupos hidroxil, grupos aldeído, grupos azida. Alguns grupos reativos podem ser ativados para facilitar a conjugação com um segundo grupo reativo, quer diretamente ou através de um agente de reticulação. Tal como aqui utilizado, um grupo reativo pode ser uma parte de uma XTEN, um agente de reticulação, uma azida/alquino clique-química reagente, ou uma carga, desde que ele tem a capacidade de participar numa reação química. Uma vez reagiu, um vínculo conjugação liga os resíduos da carga ou de reticulação ou XTEN reagentes.

[200] "Agente de libertação controlada", "agente de libertação lenta ", "formulação de depósito" e "agente de libertação prolongada" são utilizados indiferentemente para se referir a um agente capaz de prolongar a duração da libertação de um polipeptídeo da invenção em relação à duração da libertação, quando o polipeptídeo é administrada na ausência do agente. Diferentes modalidades da presente invenção podem ter diferentes velocidades de libertação, resultando em diferentes quantidades terapêuticas.

[201] O termo "carga " como aqui utilizado refere-se a qualquer proteína, peptídeo de sequência, molécula pequena, droga ou composição de matéria que tem uma atividade biológica, farmacológica ou terapêutica ou efeito benéfico quando administrado em um sujeito ou que pode ser demonstrada in vitro. Payload também inclui uma molécula que pode ser usado para imagiologia ou em fins de diagnóstico in vivo. Exemplos de cargas incluem, mas não estão limitados a, citoquinas, enzimas, hormonas, fatores de coagulação do sangue, e fatores de crescimento, agentes quimioterapêuticos, toxinas, compostos antivirais, drogas anticâncer, compostos radioativos, e os agentes de contraste, assim como peptídeos de segmentação, proteínas, anticorpos, fragmentos de anticorpos, ou de compostos usados para se ligar a receptores ou ligandos.

[202] Os termos "antigénio", "antigénio-alvo" e "imunogénio" são aqui utilizados indiferentemente para se referir a estrutura de ligação ou determinante que um fragmento de anticorpo ou um fragmento de anticorpo liga-se à base de terapêuticos ou tem especificidade contra.

[203] O termo "antagonista", tal como aqui utilizado, inclui qualquer molécula que parcial ou completamente bloqueia, inibe ou neutraliza uma atividade biológica de um polipeptídeo nativo aqui descrito. Métodos para a identificação de antagonistas de um polipeptídeo pode compreender o contacto de um polipeptídeo nativo com uma molécula de antagonista candidata e medição de uma alteração detectável em uma ou mais das atividades biológicas normalmente associadas com o polipeptídeo nativo. No contexto da presente invenção, os antagonistas podem incluir proteínas, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, anticorpos, ou quaisquer outras moléculas que diminuem o efeito de uma proteína biologicamente ativa.

[204] Um "meio definido" refere-se a um meio compreendendo requisitos nutritivos e hormonais necessários a sobrevivência e/ou crescimento das células em cultura de tal modo que os componentes do meio são conhecidos. Tradicionalmente, o meio definido foi formulado pela adição de fatores nutritivos e de crescimento necessários para o crescimento e/ou sobrevivência. Tipicamente, o meio definido fornece, pelo menos, um componente de uma ou mais das seguintes categorias: a) todos os aminoácidos essenciais, e normalmente o conjunto básico de vinte aminoácidos, mais cisteína; b) uma fonte de energia, normalmente na forma de um hidrato de carbono tal como glucose; c) vitaminas e/ou outros compostos orgânicos requeridos em baixas concentrações; d) os ácidos gordos livres; e e) os oligoelementos, em que os oligoelementos são definidos como compostos inorgânicos ou elementos de ocorrência natural que são requeridos tipicamente em concentrações muito baixas, normalmente na gama micromolar. A forma definida pode também, opcionalmente, ser suplementado com um ou mais componentes de uma das seguintes categorias: a) um ou mais agentes mitogénicos; b) Os sais e tampões como, por exemplo, cálcio, magnésio, e fosfato; c) Os nucleosídeos e bases, tais como, por exemplo, a adenosina e timidina, hipoxantina; e d) de proteína de tecido e hidrolisados.

[205] O termo "agonista" é utilizado no sentido mais lato e inclui qualquer molécula que mimetiza uma atividade biológica de um polipeptídeo nativo aqui descrito. Moléculas de agonista adequadas incluem especificamente anticorpos agonistas ou fragmentos de anticorpos, fragmentos ou variantes de sequências de aminoácidos de polipeptídeos nativos, peptídeo s, moléculas orgânicas pequenas, etc. Os métodos para identificar agonistas de um polipeptídeo nativo pode compreender o contato de um polipeptídeo nativo com uma molécula candidata e medição agonista uma alteração detectável em uma ou mais das atividades biológicas normalmente associadas com o polipeptídeo nativo.

[206] "Inibição constante", ou "Ki", são usadas intermutavelmente e significam a constante de dissociação do complexo enzima-inibidor, ou o inverso da afinidade de ligação do inibidor à enzima.

[207] Tal como aqui utilizado, "tratar" ou "tratamento", ou "paliar" ou "melhoramento de" são utilizados alternadamente e significam administração de um fármaco ou de um produto biológico para alcançar um benefício terapêutico, para curar ou reduzir a severidade de uma condição existente, ou para alcançar um benefício profilático, prevenir ou reduzir o risco de aparecimento ou a gravidade da ocorrência de uma condição. Por benefício terapêutico é destinado erradicação ou melhoria da patologia subjacente a ser tratada ou um ou mais dos sintomas fisiológicos associados com a doença subjacente, que é uma melhora observada na matéria, apesar de que o sujeito pode ainda ser afetado com a doença subjacente.

[208] Um "efeito terapêutico" ou "efeito terapêutico", tal como aqui utilizado, refere-se a um efeito fisiológico, incluindo mas não se limitando à mitigação, melhoramento ou prevenção de doença em seres humanos ou outros animais, ou para de outro modo melhorar o bem-estar físico ou mental de seres humanos ou animais, resultantes da administração de um polipeptídeo da invenção, diferente da capacidade de induzir a produção de um anticorpo contra um epítopo antigénico possuído pela proteína biologicamente ativa. Para benefício profilático, as composições podem ser administradas a um sujeito em risco de desenvolver uma doença particular, condição ou sintoma de doença (por exemplo, uma hemorragia em um sujeito diagnosticado com hemofilia A), ou a um sujeito de um ou mais relatórios dos sintomas fisiológicos de uma doença, mesmo que o diagnóstico da doença pode não ter sido feita.

[209] Os termos "quantidade terapeuticamente eficaz" e "dose terapeuticamente eficaz", tal como aqui utilizado, referem-se a uma quantidade de uma droga ou uma proteína biologicamente ativa, por si só ou como parte de uma composição polipeptídica, que é capaz de ter o mínimo detectável, efeito benéfico sobre qualquer sintoma, aspecto, parâmetro ou características de um estado de doença ou condição quando administradas em uma ou em doses repetidas a um indivíduo medido. Tal efeito não necessita ser absoluta para ser útil. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro da capacidade dos peritos na arte, especialmente à luz da descrição pormenorizada aqui fornecida.

[210] O termo "regime de dosagem terapeuticamente eficaz", tal como aqui utilizado, refere-se a um calendário de múltiplas doses administradas consecutivamente (isto é, pelo menos, dois ou mais) de uma proteína biologicamente ativa, quer isoladamente ou como parte de uma composição de polipeptídeo, em que o doses são administradas em quantidades terapeuticamente eficazes para resultar no efeito benéfico sustentado em qualquer sintoma, aspecto, parâmetro ou características de um estado de doença ou condição medido.

I). TÉCNICAS GERAIS

[211] A prática da presente invenção emprega, a menos que indicado em contrário, técnicas convencionais de imunologia, de bioquímica, química, biologia molecular, microbiologia, biologia celular, genômica e de DNA recombinante, que estão dentro da perícia na arte. Ver Sambrook, J. et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual,". 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; "Current Protocols in molecular biology", Ausubel FM, et al. eds., 1987; da série "Métodos em Enzimologia," Academic Press, San Diego, CA.; "PCR 2: uma abordagem prática"., MJ MacPherson, BD Hames e GR Taylor eds, Oxford University Press, 1995;"Antibodies, a laboratory manual" de Harlow, E. e Lane, D. eds, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.; "Goodman & Gilman Bases Farmacológicas da Terapêutica", 11 a Edição, McGraw-Hill, 2005; e Freshney, RI, "Culturas de Células Animais: A Manual of Técnica básica", 4a edição, John Wiley & Sons, Somerset, Nova Jersey, 2000, cujos conteúdos são incorporados na sua totalidade como referência.

[212] As células hospedeiras podem ser cultivadas numa variedade de meios. Os meios comercialmente disponíveis tais como F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) são adequados para a cultura de células eucarióticas. Além disso, células animais podem ser cultivadas num meio definido que carece de soro, mas é suplementado com hormonas, fatores de crescimento ou quaisquer outros fatores necessários para a sobrevivência e/ou crescimento de um tipo particular de células. Considerando uma forma definida suporte da sobrevivência de células mantém a viabilidade, morfologia, capacidade de metabolizar e potencialmente, a capacidade da célula para se diferenciar, um meio de promover o crescimento de células definido fornece todos os produtos químicos necessários para a proliferação celular ou de multiplicação. Os parâmetros gerais que regem a sobrevivência de células de mamíferos e de crescimento in vitro estão bem estabelecidos na arte. Parâmetros físico- químicos que podem ser controlados em diferentes sistemas de cultura de células são, por exemplo, pH, pO2, temperatura, e osmolaridade. As necessidades nutricionais de células são normalmente prestadas em formulações de mídia padrão desenvolvidos para prever um ambiente ideal. Os nutrientes podem ser divididos em várias categorias: aminoácidos e seus derivados, hidratos de carbono, açúcares, ácidos gordos, lipídios complexos, derivados de ácido nucleico e vitaminas. Além de nutrientes para manter o metabolismo celular, a maioria das células, também requerem uma ou mais hormonas de, pelo menos, um dos seguintes grupos: esteroides, prostaglandinas, fatores de crescimento, hormonas da pituitária e hormonas peptídicas para proliferar em meio isento de soro (Sato, GH et al. em "Growth of Cells in Hormonally Defined Media ", Cold Spring Harbor Press, NY, 1982). Em adição a hormonas, as células podem necessitar de proteínas de transporte como a transferrina (proteína de transporte de ferro no plasma), ceruloplasmina (uma proteína de transporte de cobre) e lipoproteínas de alta densidade (um transportador de lipídios) a sobrevivência e o crescimento in vitro. O conjunto de hormonas ou proteínas óptimas de transporte variará para cada tipo celular. A maioria destas hormonas ou proteínas de transporte têm sido adicionadas exogenamente ou, num caso raro, uma linha celular mutante foi encontrado que não requer um fator em particular. Os peritos na arte saberão de outros fatores necessários para a manutenção de uma cultura de células, sem experimentação indevida.

[213] O meio de crescimento para o crescimento de células hospedeiras procariotas incluem meios de cultivo (meio nutritivo líquido) ou meio LB (Luria Bertani). Meios adequados incluem definido e mídia indefinido. Em geral, os meios de comunicação contêm uma fonte de carbono tal como glucose necessária para o crescimento de bactérias, água e sais. Os meios podem também incluir uma fonte de aminoácidos e de azoto, por exemplo carne ou extrato de levedura (em uma forma indefinida) ou quantidades conhecidas de aminoácidos (em meio definido). Em algumas modalidades, o meio de crescimento é de caldo LB, por exemplo LB Miller caldo ou caldo LB Lennox. Caldo LB compreende peptona (produto da digestão enzimática de caseína), extrato de levedura e de cloreto de sódio. Em algumas modalidades, um meio seletivo que é utilizado compreende um antibiótico. Neste meio, apenas as células que possuam a resistência desejadas para o antibiótico irá crescer.

II). POLÍMERO DA PROTEÍNA DE XTEN E COMPOSIÇÕES CONJUGADAS

[214] A invenção atual se relaciona, na parte, às composições substancialmente homogêneas que compreendem os polipeptídeos recombinantes prolongados (XTEN). Em um primeiro aspecto, a invenção fornece as composições de XTEN que são substancialmente homogêneas no comprimento. Tais composições são úteis como parceiros de conjugação de reagente para criar intermediários do reticulador de XTEN e composições de carga útil de XTEN. Adicionalmente, é um objeto da invenção atual para fornecer métodos para criar as composições substancialmente homogêneas de XTEN. A invenção atual fornece também métodos para criar tais composições substancialmente homogêneas de XTEN no rendimento elevado.

[215] Em um segundo aspecto, a invenção fornece XTEN. Por exemplo, o XTENs capaz de ligar um ou mais parceiros de conjugação de carga útil, tendo por resultado conjugação da carga de XTEN é projetado especificamente para incorporar números definidos de aminoácidos reativos para ligar às cargas úteis diretamente ou através das reticulações ou dos reagentes de azida/alquino. A invenção atual fornece também métodos para criar tais polímeros projetados de XTEN para o uso na criação de conjugação com os agentes de carga útil do interesse como composições com as propriedades farmacêuticas realçadas, incluindo propriedades farmacocinéticas e farmacológicas realçadas, assim como a toxicidade reduzida.

[216] Em outro aspecto, a invenção fornece os polímeros substancialmente homogêneos de XTEN que compreendem números definidos das reticulações ou dos reagentes de azida/alquino como sócios de conjugação do reagente nas configurações monoméricas e multiméricas e nos métodos da preparação de tais reagentes. Os derivados de XTEN que compreendem reticuladores ou reagentes de azida/alquino são usados como reagentes na conjugação de agentes de carga útil para resultar na conjugação da carga de XTEN que exibe as propriedades físicas, farmacêuticas e farmacológicas desejadas.

[217] Em outro aspecto, a invenção fornece as composições da carga de XTEN em que um ou mais XTEN é ligado quimicamente a uma ou mais cargas úteis, incluindo combinações das cargas diferentes, em números definidos nas configurações monoméricas ou multiméricas para fornecer composições com as propriedades farmacêuticas, farmacocinéticas, e farmacológicas realçadas. Tais composições ligadas a tais cargas úteis podem ter a utilidade, quando administrados a um sujeito, na prevenção, no tratamento ou na melhora das doenças ou das circunstâncias devido a um efeito farmacológico ou biológico da carga útil.

1. XTEN: polipeptídeos recombinantes prolongados

[218] Em um aspecto, a invenção fornece as composições substancialmente homogêneas do polipeptídeo de XTEN que são úteis como sócios da conjugação para ligar uma ou mais cargas úteis, diretamente ou através de um reticulante, reagente tendo por resultado uma conjugação da carga útil de XTEN.

[219] XTEN são polipeptídeos com ocorrência não natural, substancialmente sequências não repetitivas, tendo um baixo grau de ou nenhuma estrutura, secundária ou terciária, sob condições fisiológicas. XTEN tem tipicamente de cerca de 36 para cerca de 3000 aminoácidos, dos quais a maioria ou a totalidade são pequenos aminoácidos hidrofílicos. Como usado aqui, "XTEN" especificamente exclui todo anticorpos ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos de cadeia única e fragmentos de Fc). Os polipeptídeos de XTEN tem a utilidade como sócios de uma conjugação que servem em vários papéis, conferenciando determinadas propriedades desejáveis quando ligadas a uma carga útil. As conjugações resultantes da carga útil de XTEN realçaram propriedades, tais como as propriedades farmacocinéticas, físico-química, farmacológica, e farmacêuticas realçadas comparadas à carga correspondente não ligados a XTEN, fazendo o útil no tratamento de determinadas circunstâncias para que carga seja conhecida na técnica possa ser usada.

[220] A característica não estruturada e propriedades físico-químicas do resultado XTEN, em parte, desde a composição dos aminoácidos totais que é desproporcionalmente limitados aos aminoácidos hidrofílicos dos tipos 4-6, a ligação dos aminoácidos em um projeto não repetitivo quantificável e o comprimento do polipeptídeo XTEN. Em uma característica vantajosa comum para XTEN, mas incomum dos polipeptídeos nativos, as propriedades do XTEN divulgadas neste documento não estão ligadas as sequências primárias do aminoácido absolutas, como evidenciado pela diversidade das sequências exemplares da Tabela 2 que, dentro das diferentes escalas de comprimento, possuem propriedades similares, muitos dos quais estão documentados nos exemplos. Conformemente, XTEN tem propriedades mais como polímeros não proteico, polímeros hidrofílicos que fazem proteínas. O XTEN da atual da invenção exibidos uma ou mais das seguintes propriedades vantajosas: flexibilidade conformacional, reduzida ou falta da estrutura secundária, grau elevado de solubilidade aquosa, grau elevado de resistência à prótese, baixa imunogenicidade, baixa ligação aos receptores de mamífero, um grau definido de carga, e raios hidrodinâmicos aumentados (ou Stokes); as propriedades que são similares a determinados polímeros hidrofílicos (por exemplo, glicol de polietileno) esses os fazem particularmente úteis como parceiros da conjugação.

[221] Os componentes de XTEN das conjugações sujeitas são projetados para comportar-se como sequências desnaturadas do peptídeo sob condições fisiológicas, apesar do comprimento prolongado do polímero. "Desnaturado" descreve o estado de um peptídeo na solução que se caracteriza por uma grande liberdade conformacional da espinha dorsal do peptídeo. A maioria dos peptídeos e proteínas adota uma conformação desnaturada na presença de altas concentrações dos desnaturantes ou a temperatura elevada. Peptídeos tem a conformação desnaturada, por exemplo, espectros dicroísmo circular característicos (CD) e são caracterizados por uma falta de interações de longo alcance, conforme determinado por NMR. "Conformação desnaturada" e "conformação não estruturada" são usados como sinônimos, neste documento. Em algumas modalidades, a invenção fornece as sequências de XTEN que, sob circunstâncias fisiológicas, se assemelham às sequências desnaturadas que são em grande parte desprovidos de estrutura secundária Em outros casos, as sequências de XTEN são substancialmente desprovidas da estrutura secundária sob circunstâncias fisiológicas. "Em grande parte desprovidos", como usado neste contexto, significa que menos de 50% dos resíduos dos aminoácidos XTEN da sequência XTEN não contribuem para a estrutura secundária como medido ou determinado pelos meios aqui descritos. "Substancialmente desprovidas", como usado neste contexto, significa que pelo menos cerca de 60%, ou cerca de 70%, ou cerca de 80%, ou cerca de 95%, ou cerca de 97% ou pelo menos cerca de 99% dos resíduos de aminoácidos XTEN da sequência XTEN não contribuem para a estrutura secundária, como medido ou determinado pelos métodos aqui descritos.

[222] A variedade dos métodos e os ensaios conhecidos na técnica para determinar as propriedades físico-químicas ao sujeito XTEN. Tais propriedades incluem, mas não estão limitadas a estrutura secundária ou terciária, solubilidade, agregação de proteínas, estabilidade, absoluto e aparente peso molecular, pureza e uniformidade, conteúdo de água, contaminação e propriedades de derretimento. Os métodos para medir tais propriedades incluem a centrifugação analítica, o EPR, a troca de íon HPLC, a cromatografia de exclusão do tamanho HPLC (SEC), a fase reversa de HPLC, dispersão da luz, eletroforese capilar, dicroísmo circular, calorimetria de varrimento diferencial, fluorescência, troca de íon HPLC, exclusão do tamanho de HPLC, NMR, espectroscopia Raman, refratometria, e Espectroscopia UV/Visível. Em particular, a estrutura secundária pode ser medida espectrofotometricamente, por exemplo, por espectroscopia de dicroísmo circular na região espectral de "far-UV" (190-250 nm). Elementos de estrutura secundária, tais como alfa-hélice e na folha-beta, cada um dá origem a uma forma característica e magnitude dos espectros de CD, como faz a falta desses elementos estruturais. Estrutura secundária também pode ser prevista por uma sequência do polipeptídeo através de determinados programas de computador ou algoritmos, como o conhecido Chou-Fasman algorithm (Chou, P. Y., et al. (1974) Biochemistry, 13: 222-45) and the Garnier-Osguthorpe-Robson algorithm (“Gor algorithm”) (Garnier J, Gibrat JF, Robson B. (1996), GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequence. Methods Enzymol 266:540-553), as described in US Patent Application Publication No. 20030228309A1. Para uma determinada sequência, os algoritmos podem prever se existem algumas ou nenhuma estrutura secundária, expresso como o total e/ou a percentagem de resíduos da sequência que forma, por exemplo, alfa-hélices ou beta-folhas ou a percentagem dos resíduos da sequência prevista para resultar na formação aleatória de espiral (que carece de estrutura secundária). As sequências do polipeptídeo podem ser analisadas usando o algoritmo de Chou-Fasman usando sites no World Wide Web em, por exemplo, em fasta.bioch. virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=misc1 and the Gor algorithm at npsa-pbil.ibcp.fr/cgi- bin/npsa_automat. pl?page=npsa_gor4.html (ambos acessados em 5 de Setembro de 2012). Métodos adicionais são divulgados no Arnau, et al., Prot Expr and Purif (2006) 48, 1-13.

[223] Em uma modalidade, as sequências de XTEN utilizadas nas conjugações do sujeito tendo uma porcentagem de alfa- hélice variando de 0% a menos de cerca de 5%, conforme determinado pelo algoritmo de Chou-Fasman. Em outra modalidade, as sequências de XTEN tem uma porcentagem da beta-folha variando de 0% menos do que a aproximadamente 5% como determinado pelo algoritmo de Chou-Fasman. Em uma modalidade, as sequências de XTEN dos conjugados tem uma porcentagem da alfa-hélice variando de 0% menos do que a aproximadamente 5% e de uma porcentagem da beta-folha que varia de 0% menos do que a aproximadamente 5% como determinado pelo algoritmo de Chou-Fasman. Em uma modalidade, as sequências de XTEN dos conjugados tem uma percentagem de alfa-hélice menos do que cerca de 2% e uma percentagem de folha-beta inferior a cerca de 2%. As sequências XTEN das composições conjugadas tem um alto grau de percentagem aleatória de espiral, conforme determinado pelo algoritmo GOR. Em algumas modalidades, uma sequência de XTEN tem pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos de aproximadamente 90%, mais preferivelmente pelo menos de aproximadamente 91%, mais preferivelmente pelo menos de aproximadamente 92%, mais preferivelmente pelo menos de aproximadamente 93%, mais preferivelmente pelo menos de aproximadamente 94%, mais preferivelmente pelo menos de aproximadamente 95%, mais preferivelmente pelo menos de aproximadamente 96%, mais preferivelmente pelo menos de aproximadamente 97%, mais preferivelmente pelo menos de aproximadamente 98%, e o mais preferivelmente pelo menos de aproximadamente 99% de enrolamento aleatório, como determinado pelo algoritmo de GOR. Em uma modalidade, as sequências XTEN das composições conjugadas tem uma percentagem de alfa-hélice variando de 0% a menos de cerca de 5% e uma folha-beta variando de 0% a menos de cerca de 5%, conforme determinado pelo algoritmo de Chou-Fasman e pelo menos cerca de 90% aleatório da bobina, conforme determinado pelo algoritmo GOR. Em outra modalidade, as sequências XTEN das composições reveladas tem uma percentagem de alfa-hélice inferior cerca de 2% e uma percentagem de folha-beta menos de cerca de 2% pelo menos cerca de 90% aleatório bobina, conforme determinado pelo algoritmo GOR. Em outra modalidade, as sequências de XTEN das composições estão faltando substancialmente à estrutura secundária como medida pelo dicroísmo circular.

[224] Os critérios de seleção para que o XTEN seja ligado à carga útil usados para criar as composições conjugadas relacionam-se geralmente aos atributos de propriedades físico-químicas e à estrutura conformacional do XTEN isto é, por sua vez, usada para conferenciar as propriedades farmacêuticas, farmacológicas, e farmacocinéticas realçadas às composições.

1. Sequências não repetitivas

[225] Contempla-se especificamente que as sequências do sujeito XTEN incluídas nas modalidades da composição conjugada do sujeito são substancialmente não repetitivas. Em geral, as sequências repetitivas dos aminoácidos tem uma tendência para agregação ou formar estruturas de ordem superiores, como exemplificado pela sequências repetitivas naturais como colágenos e zíperes de leucina. Estes aminoácidos repetitivos também podem tender para formar contatos resultando em estruturas cristalina ou pseudocristalina. Em contraste, a baixa tendência das sequências não repetitivas para agregação permite que o projeto de longa sequência XTENs com uma frequência relativamente baixa dos aminoácidos carregados que seriam susceptíveis para agrega se as sequências forem repetitivas. A não repetitividade de um sujeito XTEN pode ser observada avaliando um ou mais dos seguintes recursos. Em uma modalidade, uma sequência substancialmente não repetitiva de XTEN não tem nenhum dos três aminoácidos contíguos na sequência que são tipos idênticos dos aminoácidos a menos que o aminoácido é serina, que no caso não mais que três aminoácidos contíguos são resíduos da serina. Em outra modalidade, conforme descrito mais detalhadamente abaixo, uma sequência substancialmente não repetitiva de XTEN em que 80-99% compreende motivos de 9 a 14 resíduos de aminoácidos em que os motivos consistem de 3,4,5 ou 6 tipos de aminoácidos, selecionados a partir de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P), e em que a sequência de qualquer dois resíduos dos aminoácidos contíguos em qualquer um motivo não é repetido mais de duas vezes no motivo da sequência.

[226] O grau de repetitividade de um polipeptídeo ou um gene pode ser medido por algoritmos ou programas de computador ou por outros meios conhecidos na técnica. De acordo com a invenção atual, algoritmos a serem utilizados no cálculo do grau de repetitividade de um polipeptídeo específico, tais como um XTEN, são divulgados neste documento, e são fornecidos exemplos de sequências analisadas por algoritmos (ver Exemplos abaixo). Em uma modalidade, a repetitividade de um polipeptídeo de comprimento predeterminado pode ser calculado (a seguir designado "pontuação de subsequência") de acordo com a fórmula fornecida pela Equação I: em que: m = (comprimento do aminoácido do polipeptídeo) - (comprimento do ácido aminado da subsequência) + 1; eContai = número cumulativo de ocorrências de cada subsequência única dentro da sequênciai

[227] Um algoritmo denominado "SegScore" foi desenvolvido para aplicar a equação acima para dosar a repetitividade de polipeptídeos, tais como um XTEN, fornecendo a pontuação de subsequência em que as sequências de comprimento predeterminado do aminoácido "n" são analisados para repetitividade, determinando o número de vezes (uma "contagem") uma subsequência énica de comprimento "s" aparece no comprimento definido, dividido pelo número absoluto das subsequências dentro do comprimento predeterminado da sequência. A FIG. 79 retrata um fluxograma de lógica do algoritmo SegScore, enquanto a FIG. 80 retrata um esquema de como uma pontuação de subsequência é derivada de uma XTEN fictícia com 11 aminoácidos e um comprimento subsequente de 3 resíduos de aminoácidos. Por exemplo, um comprimento de polipeptídeo predeterminado de 200 resíduos de aminoácidos tem 192 sobrepostas subsequências de 9-aminoácidos e 198 subsequências de mer- 3, mas a pontuação de subsequência de qualquer fornecido polipeptídeo dependerá do número absoluto de subsequências exclusivas e como frequentemente cada subsequência única (ou seja, uma sequência de aminoácidos diferentes) aparece no comprimento predeterminado da sequência.

[228] No contexto da presente invenção, "Pontuação de subsequência" designa a soma de ocorrências de cada quadro 3-mer único através de 200 aminoácidos consecutivos do polipeptídeo XTEN cumulativo, dividido pelo número absoluto de subsequências 3-mer única dentro da sequência de 200 aminoácidos. Exemplos de tais pontuações de subsequência derivado dos 200 aminoácidos consecutivos dos polipeptídeos repetitivos e não repetitivos são apresentados no Exemplo 45. Em uma modalidade, a invenção fornece um XTEN de cara útil compreendendo um XTEN no qual o XTEN tem uma pontuação de subsequência inferior a 12, mais de preferência inferior a 10, mais de preferência menos a 9, mais de preferência inferior a 8, mais de preferência inferior a 7, mais de preferência menos de 6 e mais de preferência inferior a 5. Em outra modalidade, a invenção fornece os conjugados reticulantes de XTEN que compreendem um XTEN em que os XTEN têm uma contagem da subsequência menos de 10, mais preferivelmente menos de 9, mais preferivelmente menos de 8, mais preferivelmente menos de 7, mais preferivelmente menos de 6, e o mais preferivelmente menos de 5. Em outra modalidade, a invenção fornece os conjugados de química pressionado de XTEN que compreendem um XTEN em que os XTEN têm uma contagem da subsequência menos de 10, mais preferivelmente menos de 9, mais preferivelmente menos de 8, mais preferivelmente menos de 7, mais preferivelmente menos de 6, e o mais preferivelmente menos de 5. Ainda em outra modalidade, a invenção fornece as composições conjugadas de XTEN que compreendem pelo menos dois XTEN ligados em que cada XTEN individual tem uma contagem da subsequência menos de 10, ou menos de 9, ou menos de 8, ou menos de 7, ou menos de 6, ou menos de 5, ou menos. Ainda em outra modalidade, a invenção fornece as composições conjugadas de XTEN que compreendem pelo menos três XTEN ligados em que cada XTEN individual tem uma contagem da subsequência menos de 10, ou menos de 9, ou menos de 8, ou menos de 7, ou menos de 6, ou menos de 5, ou menos. Nas modalidades das composições de XTEN descritas aqui, um XTEN com uma contagem da subsequência de 10 ou mais menos (isto é, 9, 8, 7, etc.) é caracterizado como substancialmente não repetitiva.

[229] Em um aspecto, a característica não repetitiva de XTEN da invenção atual junto com os tipos particulares de aminoácidos que predominam no XTEN, melhor que a sequência preliminar absoluta, conferencia uma ou mais das propriedades físico-químicas e biológicas realçadas do XTEN e dos conjugados resultantes da carga útil de XTEN. Estas propriedades realçadas incluem um grau mais elevado de expressão da proteína de XTEN na célula hospedeira, de uma estabilidade genética maior do gene que codifica XTEN, de um grau maior de solubilidade, de menos tendência para agregar, e farmacocinéticas melhoradas do conjugado resultante, em comparação com cargas úteis não conjugadas de XTEN ou com cargas conjugadas com proteínas possuindo sequências repetitivas Estas propriedades melhoradas permitem fabricação mais eficiente, uma maior uniformidade do produto final, menor custo dos produtos, e/ou facilitar a formulação de XTEN compreendendo preparações farmacêuticas que contêm concentrações muito elevadas de proteínas, em alguns casos superior a 100 mg/ml. Em algumas modalidades, as sequências de polipeptídeo XTEN das conjugações são projetadas para ter um baixo grau de repetitividade interna a fim de reduzir ou eliminar substancialmente a imunogenicidade quando administrado em um mamífero. Sequências de polipeptídeo compostas de motivos curtos, repetidos em grande parte limitados a apenas três aminoácidos, como a glicina, serina e glutamato, podem resultar em anticorpos relativamente elevados mquando administrados a um mamífero apesar da ausência do previsto epítopos da célula T nestas sequências. Isso pode ser causado pela natureza repetitiva de polipeptídeos, como tem sido demonstrado que imunógenos com resumos repetidos, incluindo agregados de proteínas, imunógenos reticulados, e carboidratos repetitivos são altamente imunogênicos e podem, por exemplo, resultar na ligação cruzada dos receptores de células B, causando a ativação das células B. (Johansson, J., et al. (2007) Vaccine, 25 :1676-82 ; Yankai, Z., et al. (2006) Biochem Biophys Res Commun, 345 :1365-71 ; Hsu, C. T., et al. (2000) Cancer Res, 60:3701-5); Bachmann MF, et al. Eur J Immunol. ((1995) 25(12):3445-3451).

2. Motivos de Sequência Exemplar

[230] A presente invenção compreende XTEN usado como parceiros de conjugação que compreendem várias unidades das sequências mais curtas, ou motivos, em que as sequências de aminoácidos dos temas são substancialmentes não repetitivas. A propriedade não repetitiva pode ser encontrada com mesmo usando de “bloco de construção” usando uma biblioteca dos motivos da sequência que são multimerizado para criar as sequências de XTEN, como mostrado nos FIGS. 18-19. Enquanto uma sequência XTEN pode consistir em várias unidades de apenas quatro tipos diferentes de motivos de sequência, porque os motivos próprios geralmente consistem em sequências de aminoácidos não repetitivas, a sequência XTEN global é projetada para processar a sequência substancialmente não repetitiva.

[231] Em uma modalidade, uma XTEN tem uma sequência substancialmente não repetitiva maior que cerca de 36 até cerca de 3000, ou cerca de 100 até cerca de 2000, ou cerca de 144 até cerca de 1000 resíduos de aminoácidos, em que pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 97%, ou cerca de 99% a cerca de 100% da sequência XTEN consiste em motivos de sequência não sobrepostos e em que cada um dos temas tem cerca de 9 até 36 resíduos de aminoácidos. Tal como aqui utilizado, "não sobreposição" significa que os motivos individuais não partilham resíduos de aminoácidos mas, em vez disso, são fundidos com outros motivos ou os resíduos de aminoácidos de uma forma linear. Em outras modalidades, pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 97%, ou cerca de 99% a cerca de 100% da sequência XTEN consiste em motivos de sequência não sobrepostos em que cada um dos motivos tem de 9 a 14 resíduos de aminoácidos. Em ainda outras modalidades, pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 97%, ou cerca de 99% a cerca de 100% da sequência XTEN consiste em motivos de sequência não sobrepostos em que cada um dos motivos tem 12 resíduos de aminoácidos. Nestas modalidades, é preferível que os motivos de sequência sejam substancialmente (por exemplo, 90% ou mais) ou exclusivamente compostos por pequenos aminoácidos hidrofílicos, de modo que a sequência geral tenha uma característica não estruturada, flexível. Exemplos de aminoácidos que estão incluídos em XTEN são, por exemplo, arginina, lisina, treonina, alanina, asparagina, glutamina, aspartato, glutamato, serina e glicina. Em uma modalidade, as sequências XTEN tem predominantemente de quatro a seis tipos de aminoácidos, selecionados a partir de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) ou prolina (P) que são organizados em uma sequência não repetitiva substancialmente que é cerca de 36 até cerca de 3000, ou cerca de 100 até cerca de 2000, ou cerca de 144 até cerca de 1000 resíduos de aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, uma sequência XTEN é composta de 4, 5 ou 6 tipos de aminoácidos selecionados do grupo constituído por glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) ou prolina (P). Em algumas modalidade, o XTEN tem sequências de cerca de 36 até cerca de 1000, ou cerca de 100 até cerca de 2000, ou cerca de 400 até cerca de 3000 resíduos de aminoácidos, em que pelo menos cerca de 80% da sequência consiste de motivos de sequência não sobrepostos em que cada um dos motivos tem 9 até 36 resíduos de aminoácidos e em que pelo menos 90%, ou pelo menos 91%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 93%, ou pelo menos 94%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97% ou 100% de cada um dos motivos é composto de 4 a 6 tipos de aminoácidos, selecionados a partir de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P), e no qual o conteúdo de qualquer tipo de aminoácido no XTEN completo não ultrapasse 30%. Em outras modalidades, pelo menos cerca de 90% da sequência XTEN consiste de motivos de sequência não sobrepostos em que cada um dos motivos tem 9 até 36 resíduos de aminoácidos em que os motivos consistem de 4 a 6 tipos de aminoácidos, selecionados a partir de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P), e no qual o conteúdo de qualquer tipo de aminoácido do XTEN completo não exceda 40%, ou cerca de 30%, ou 25% ou cerca de 17%, ou cerca de 12%, ou cerca de 8%. Em outras modalidades, pelo menos cerca de 90% da sequência XTEN consiste em motivos de sequência não sobrepostos em que cada um dos motivos tem 12 resíduos de aminoácidos, consistindo de 4 a 6 tipos de aminoácidos, selecionados a partir de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P), e no qual o conteúdo de qualquer tipo de aminoácido no XTEN completo não exceda 40%, ou 30%, ou cerca de 25%, ou cerca de 17%, ou cerca de 12%, ou cerca de 8%. Em ainda outras modalidades, pelo menos cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98% ou cerca de 99%, até cerca de 100% da sequência do XTEN consiste de motivos de sequência não sobrepostos em que cada um dos temas tem 12 resíduos de aminoácidos, consistindo de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P).

[232] Em algumas modalidades, a invenção fornece a carga útil de XTEN, reticulante XTEN, e o reagente do conjugado de química pressionada XTEN compreendendo um, ou dois, ou três, ou quatro ou mais sequências substancialmente não repetitivas de XTEN de aproximadamente 36 a aproximadamente 1000 aminoácidos, ou cumulativa aproximadamente 100 a aproximadamente 3000 resíduos de aminoácidos, em que, pelo menos aproximadamente 80%, ou pelo menos aproximadamente 90%, ou aproximadamente 91%, ou aproximadamente 92%, ou aproximadamente 93%, ou aproximadamente 94%, ou aproximadamente 95%, ou aproximadamente 96%, ou aproximadamente 97%, ou aproximadamente 98%, ou aproximadamente 99% a aproximadamente 100% da sequência consiste em unidades múltiplas os motivos de quatro ou mais motivos das sequências não sobrepostas selecionados a partir das sequências de aminoácidos da Tabela 1, em que a sequência global permanece substancialmente não repetitiva. Em algumas modalidades, o XTEN compreende motivos de sequência não sobrepostos em que cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% ou cerca de 100% da sequência consiste de várias unidades de sequências não sobrepostas selecionadas de uma única família de motivo selecionada da tabela 1, resultando em uma sequência da família. A família, como aplicado para motivos, significa que o XTEN tem os motivos selecionados de uma única categoria do motivo da Tabela 1; isto é, AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC, ou BD. Em outras modalidades, o XTEN compreende várias unidades de sequências de motivo de duas ou mais famílias do motivo da Tabela 1, selecionadas para obter as características físico-químicas desejadas, incluindo propriedades como carga líquida, hidrofobicidade, falta de estrutura secundária ou de repetitividade que pode ser conferida pela composição de aminoácidos dos motivos, descritas mais detalhadamente abaixo. Nas modalidades descritas acima neste parágrafo, os motivos ou porções de motivos incorporados ao XTEN podem ser selecionados e montados usando os métodos descritos neste documento para obter um XTEN de cerca de 36, cerca de 42, cerca de 72, cerca de 144, cerca de 288, cerca de 576, cerca de 864, cerca de 1000, cerca de 2000 até cerca de 3000 resíduos de aminoácidos, ou qualquer comprimento intermediário. Exemplos não limitantes das sequências de família XTEN úteis para a incorporação no sujeito conjugado são apresentados na Tabela 2. Pretende-se que uma sequência especificada mencionada com relação à Tabela 2 tenha esta sequência estabelecida na Tabela 2, enquanto uma referência generalizada em uma sequência de AE144, por exemplo, destina-se a abranger qualquer sequência AE que tenha 144 resíduos de aminoácidos; por exemplo, AE144_1A, AE144_2A, etc., ou uma referência generalizada em uma sequência de AG144, por exemplo, destina-se a abranger qualquer sequência de AG que tenha 144 resíduos de aminoácidos, por exemplo, AG144_1, AG144_2, AG144_A, AG144_B, AG144_C, etc. Tabela 1: Motivos de Sequência XTEN de 12 Aminoácidos e Famílias de Motivo Denota sequência de motivo individual que, quando usados em conjunto em várias permutações, resulta em uma "sequência de família". Tabela 2: XTEN Polipeptídeos

[233] Em algumas modalidades em que o componente XTEN tem menos de 100% dos seus aminoácidos consistindo de 4, 5 ou 6 tipos de aminoácidos selecionados a partir de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) ou menos de 100% da sequência consistindo dos motivos de sequência da Tabela 1 ou sequências de XTEN da Tabela 2,3 e 22-25 ou e outros resíduos de aminoácidos do XTEN são selecionados a partir de qualquer um dos outros 14 L-aminoácido naturais, mas são preferencialmente selecionados de aminoácidos hidrofílicos, de forma que a sequência XTEN contenha pelo menos uns 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos cerca de 99% de aminoácidos hidrofílicos. Um aminoácido individual ou uma sequência curta dos aminoácidos à exceção da glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) podem ser incorporados no XTEN para conseguir uma propriedade necessária, como para permitir a incorporação de um local da limitação pelos nucleotídeos codificando, ou para facilitar a ligação de um componente da carga útil, ou à incorporação de uma sequência de clivagem. Como uma modalidade exemplar, descrita mais inteiramente abaixo, a invenção proporciona XTEN que incorpora de 1 a aproximadamente 20, ou 1 a aproximadamente 15, ou 1 a aproximadamente 10, ou 1 a 5 resíduos de lisina em que as lisinas reativas são utilizadas para ligar os reticulantes às cargas úteis, como descritos aqui. Em outra modalidade, descrita mais inteiramente abaixo, o XTEN incorpora de 1 a aproximadamente 20, ou de 1 a aproximadamente 15, ou a 1 a aproximadamente 10, ou 1 a 5 resíduos da cisteína em que as cisteínas reativas são utilizadas para ligar os reticulantes ou cargas úteis, como descrito aqui. Em outra modalidade, o XTEN incorpora de 1 a aproximadamente 20 resíduos da cisteína e da lisina em que as lisinas e as cisteínas são utilizadas para ligar os reticulantes ou as cargas úteis diferentes, como descrito aqui. Em outra modalidade, as incorporações XTEN 1, 2, 3, 4, 5 ou mais dos resíduos da arginina que não são seguidos pelos resíduos de prolina para fornecer as sequências da clivagem que podem ser clivadas pela tripsina para criar os segmentos de XTEN, aqui descrito mais completamente, mais adiante. Os aminoácidos de XTEN de que não são de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) intercaladas durante todo a sequência de XTEN, são encontrados dentro ou entre os motivos da sequência, ou concentrados em um ou mais estiramento curto da sequência de XTEN como ou perto do n ou o C terminal. Como os aminoácidos hidrofóbicos dão a estrutura a um polipeptídeo, a invenção fornece que o conteúdo de aminoácidos hidrofóbicos no XTEN utilizado nos construtos da conjugação será tipicamente menos de 5%, ou menos de 2%, ou conteúdo de aminoácido hidrofóbico de 1%. Resíduos hidrofóbicos que são menos favorecidos na construção de XTEN incluem triptofano, fenilalanina, tirosina, leucina, isoleucina, valina e metionina. Adicionalmente, se pode projetar as sequências de XTEN para conter menos de 5% ou menos de 4% ou menos de 3% ou menos de 2% ou menos de 1% ou nenhuns dos seguintes aminoácidos: metionina (para evitar a oxidação), asparagina e glutamina (para evitar o desamidação). Em outras modalidades, o conteúdo de aminoácido da metionina e o triptofano no componente de XTEN usado nos construtos da conjugação são tipicamente menos de 5%, ou menos de 2%, e o mais preferivelmente menos de 1%. Em outras modalidades, o XTEN das conjugações to sujeito CFXTEN terá uma sequência que tem menos de 10% de resíduos de aminoácidos com uma carga positiva, ou menos de cerca de 7%, ou menos que cerca de 5%, ou menos de cerca de 2% resíduos de aminoácidos, com uma carga positiva, a soma dos resíduos de metionina e triptofano será inferior a 2%, e a soma dos resíduos asparagina e glutamina será inferior a 5% da sequência XTEN total.

3. Sequências de XTEN Projetadas de Lisina e Cisteína

[234] Em outro aspecto, a invenção fornece XTEN com os números definidos de resíduos incorporados de cisteína ou de lisina; “XTEN projetado de cisteína” e “XTEN projetado de lisina", respectivamente. É um objeto da invenção para fornecer XTEN com números definidos de resíduos de cisteína e/ou de lisina para permitir a conjugação entre o grupo de tiol de cisteína ou o grupo amino epsilon de lisina e um grupo reativo em uma carga útil ou uma reticulação a ser conjugada à estrutura principal XTEN. Em uma modalidade do acima exposto, o XTEN da invenção tem entre 1 a cerca de 100 resíduos de lisina, ou cerca de 1 a cerca de 70 resíduos de lisina, ou cerca de 1 a cerca 50 resíduos de lisina, ou cerca de 1 a cerca de 30 resíduos de lisina, ou cerca de 1 a cerca de 20 resíduos de lisina, ou cerca de 1 a cerca de 10 resíduos de lisina, ou cerca de 1 a cerca de 5 resíduos de lisina, ou, cerca de 1 a cerca de 3 resíduos de lisina, ou alternativamente, apenas um único resíduo de lisina. Em outra modalidade do antecedente, o XTEN da invenção tem entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 resíduos de cisteína, ou aproximadamente 1 a aproximadamente 70 resíduos de cisteína, ou aproximadamente 1 a aproximadamente 50 resíduos de cisteína, ou aproximadamente 1 a aproximadamente 30 resíduos de cisteína, ou aproximadamente 1 a aproximadamente 20 resíduos de cisteína, ou aproximadamente 1 a aproximadamente 10 resíduos de cisteína, ou aproximadamente 1 a aproximadamente 5 resíduos de cisteína, ou 1 a aproximadamente 3 resíduos de cisteína, ou alternativamente somente a um único resíduo de cisteína. Em outra modalidade do antecedente, o XTEN da invenção tem aproximadamente 1 a aproximadamente 10 resíduos de lisina e aproximadamente 1 a aproximadamente 10 resíduos de cisteína. Usando a lisina e/ou a cisteína antecedente contendo XTEN, conjugados podem ser construídos que compreendem XTEN, um reticulante opcional, mais uma carga útil no tratamento de uma condição em um sujeito em que o número máximo das moléculas do agente da carga útil ligada ao componente de XTEN é determinado pelos números das lisinas, das cisteínas ou dos outros aminoácidos com um grupo lateral reativo (por exemplo, um amino ou um tiol terminal) incorporado no XTEN.

[235] Em uma modalidade, a invenção fornece XTEN projetado de cisteína onde os nucleotídeos que codificam um ou mais aminoácidos de um XTEN são substituídos com um aminoácido da cisteína para criar o gene de XTEN projetado de cisteína. Em outra modalidade, a invenção fornece XTEN projetado de cisteína onde os nucleotídeos que codificam um ou mais aminoácidos da cisteína são introduzidos no gene codificando do para criar o gene XTEN projetado de cisteína. Em outros casos, em oligonucleotídeos codificando um ou os mais motivos de aproximadamente 9 a aproximadamente 14 aminoácidos que compreendem os códons que codificam uma ou mais cisteínas são ligados no frame com outros oligos que codificam motivos de XTEN ou XTEN de comprimento total para criar o gene de XTEN projetado de cisteína. Em uma modalidade do antecedente, onde uma ou os mais cisteínas são introduzidos em uma sequência de XTEN durante a criação do gene de XTEN, os nucleotídeos que codificam a cisteína podem ser ligados aos códons que codificam os aminoácidos usados em XTEN para criar um motivo de XTEN da cisteína com as cisteínas em uma posição definida usando os métodos descritos aqui (veja o Exemplo 61 e as FIGS. 40-41), ou por técnicas molecular padrão da biologia, e pelos motivos montados subsequentemente no gene que codifica o XTEN projetado de cisteína de comprimento total. Nesses casos, onde, por exemplo, os nucleotídeos que codificam uma única cisteína são adicionados ao DNA que codifica um motivo selecionado da Tabela 1, o motivo resultante teria 13 aminoácidos, quando incorporando duas cisteínas resultaria em um motivo que tem 14 aminoácidos, etc. Em outros casos, um motivo de cisteína pode ser criado de novo e ser de um comprimento e de um número predefinidos de aminoácidos da cisteína ligando os nucleotídeos que codificam a cisteína aos nucleotídeos que codificam um ou mais resíduo do aminoácido usado em XTEN (por exemplo, G, S, T, E, P, A) em uma posição definida, e os motivos codificando os montados subsequentemente pelo recozimento com outras sequências de motivos de XTEN codificando no gene que codifica o XTEN de comprimento total, como descrito aqui e ilustrado nas FIGS. 7-8. Nos casos onde um XTEN projetado de lisina é utilizado para fazer os conjugados da invenção, as abordagens descritas acima seriam executadas com os códons que codificam a lisina em vez da cisteína. Assim, pelo antecedente, um motivo novo de XTEN pode ser criado que poderia compreender aproximadamente 9-14 resíduos de aminoácidos e ter um ou mais aminoácido reativos; isto é, cisteína ou lisina. Exemplos não limitantes dos motivos apropriados para o uso em um XTEN projetado que contenha uma única cisteína ou lisina são: GGSPAGSCTSP GASASCAPSTG TAEAAGCGTAEAA GPEPTCPAPSG GGSPAGSKTSP GASASKAPSTG Entretanto, a invenção contempla motivos de comprimentos diferentes, tais como aqueles da Tabela 5 e da Tabela 11, para a incorporação em XTEN.

[236] Nesses casos onde um gene que codifica um XTEN com motivos de uma ou mais cisteínas e/ou de lisina deve ser construído dos motivos existentes ou dos segmentos de XTEN, o gene pode ser projetado e construído pela ligação existente “blocos de construção” da codificação de polinucleotídeos de XTENs tanto de curto e longo comprimentos; por exemplo, AE48, AE144, AE288, AE432, AE576, AE864, AM48, AM875, AE912, AG864, ou os nucleotídeos que codificam os 36' mers dos Exemplos 1-4, e Tabelas 2225, que pode ser fundido no frame com os nucleotídeos que codificam a cisteína e/ou lisina contendo motivos ou, alternativamente, a cisteína e/ou lisina codificando nucleotídeos podem ser PCR' ed em uma sequência existente de XTEN (como descrito mais inteiramente abaixo e nos exemplos) que usam, por exemplo, nos nucleotídeos que codificam as ilhas das Tabelas 4 e 5 para construir um XTEN projetado em que a cisteína e/ou as lisinas reativas são colocadas em uma ou em mais posições projetadas na sequência à quantidade desejada. Exemplos não limitantes de tal XTEN projetado são fornecidos na Tabela 3. Assim, em uma modalidade, a invenção fornece uma sequência de XTEN que tem pelo menos a identidade da sequência de aproximadamente 80%, ou pelo menos a identidade da sequência de aproximadamente 90%, ou de aproximadamente 91%, ou de aproximadamente 92%, ou de aproximadamente 93%, ou de aproximadamente 94%, ou de aproximadamente 95%, ou de aproximadamente 96%, ou de aproximadamente 97%, ou de aproximadamente 98%, ou de aproximadamente 99%, ou é idêntica a uma sequência ou a um fragmento de uma sequência selecionada da Tabela 3, quando alinhada otimamente. Entretanto, a aplicação da metodologia da metodologia projetada de cisteína ou lisina para criar XTEN de resíduos abrangendo os resíduos de cisteína ou de lisina não se destina a ser limitada às composições específicas ou variedade de identidades da composição das modalidades anteriores. Como será apreciado por aqueles versados na técnica, a posição e os números precisos de resíduos de cisteína ou de lisina incorporadas em um XTEN podem ser variados sem partir da invenção como descritos. Tabela 3: XTEN projetado de cisteína e lisina

[237] Em outra modalidade, a invenção fornece inserções da lisina como parte de uma sequência mais longa definida como uma ilha de lisina. Os exemplos da ilha de lisina são mostrados na Tabela 4. O benefício de flanquear todos os resíduos de lisina em um XTEN com sequência similar ou idêntica é que resulta em uma reatividade química mais uniforme para cada lisina. Outro benefício resulta da habilidade de executar o peptídeo que traça para medir o grau de ligação da carga útil. Os exemplos incluem as ilhas I_L6, I_L7, e I_L8 da Tabela 4. Estas ilhas compreendem os resíduos do glutamato que facilitam o peptídeo de mapeamento usando a prótese de GluC. Em outra modalidade, a invenção fornece inserções de cisteína como parte de uma sequência mais longa definida como uma ilha de cisteína. Os exemplos da ilha de cisteína são mostrados na Tabela 5. O benefício de flanquear todos os resíduos de cisteína em um XTEN com sequência similar ou idêntica é que resulta em uma reatividade química mais uniforme para cada cisteína. Outro benefício resulta da habilidade de executar o peptídeo que traça para medir o grau de conjugação da carga útil. Os exemplos incluem as ilhas I_C4, I_C7, I_C8, e I_C9 da Tabela 5. Estas ilhas compreendem os resíduos do glutamato que facilitam o peptídeo de mapeamento usando a prótese de GluC. As ilhas podem ser introduzidas nos construtos que codificam o XTEN existente por métodos convencionais de PCR, como descrito acima e nos exemplos. Os oligonucleotídeos que codificam as ilhas podem ser introduzidos nos construtos que codificam o XTEN existente por métodos convencionais de PCR. Por exemplo, em uma modalidade, onde um gene de XTEN com comprimento total existindo deve ser modificado com os nucleotídeos que codificam resíduos de uma ou mais cisteínas reativas ou de lisina, um oligonucleotídeo pode ser criado a que codifiquem uma cisteína ou uma lisina e a que exiba o homologia parcial e pode hibridizar com uma ou mais sequências curta do XTEN, tendo por resultado um evento de recombinação e uma substituição de uma cisteína ou o códon de lisina para um códon existente do gene de XTEN (veja, por exemplo, os Exemplos 6 e 7 para uma descrição dos métodos gerais). Em uma modalidade exemplar, a recombinação resulta em uma recolocação com a sequência GGSPAGSCTSP do aminoácido da ilha I _C1. Entretanto, os oligonucleotídeos podem ser projetados para colocar a cisteína (ou a lisina) em uma posição diferente no motivo ou incluir uma segunda cisteína (ou a lisina) no motivo. Os oligonucleotídeos de codificação da cisteína ou lisina podem ser projetados para hibridizar com um fornecido de segmento da sequência em pontos diferentes ao longo da sequência conhecida de XTEN para permitir sua inserção em um gene de codificação XTEN. Assim, a invenção contempla que os construtos múltiplos do gene de XTEN podem ser criados com as cisteínas ou as lisinas introduzidas em posições diferentes dentro da sequência de XTEN pela seleção de sítios da limitação dentro da sequência de XTEN e do projeto dos oligonucleotídeos apropriados para a localização fornecida e que codifica um cisteína ou uma lisina, incluindo o uso dos oligonucleotídeos projetados que resultam em inserções múltiplas na mesma sequência de XTEN. Pelo projeto e pela seleção de um ou de mais tais oligonucleotídeos na consideração da sequência conhecida do XTEN, e pelo uso apropriado dos métodos da invenção, do número potencial da cisteína reativa substituída ou dos resíduos de lisina introduzidos no XTEN de comprimento total podem ser estimados e então confirmados pela sequência do gene resultante de XTEN. Tabela 4: Exemplos das ilhas de lisina Tabela 5. Exemplos das ilhas de cisteínas

[238] XTEN pode ser concebido para incluir ambos os resíduos de cisteína e lisina para conjugação, tal como ilustrado na figura 1D. Isto permite que se conjugar duas cargas úteis diferentes para o mesmo polímero XTEN utilizando métodos de conjugações adaptados para reagir com o grupo funcional ou ligante ligado à cisteína ou lisina. Tais cargas úteis mistas podem ter efeitos aditivos e/ou sinérgicos efeitos farmacológicos quando administradas a um indivíduo em uma única composição. Alternativamente, as cargas úteis mistas podem ser uma combinação de uma parte de direcionamento e uma carga útil ativa, a fim de proporcionar o farmacóforo para uma localização desejada no indivíduo. Ao controlar o número e a posição de lisina e cisteína resíduos podem-se controlar o número e posição das cargas úteis conjugadas. Isto permite que se ajuste a potência relativa ou a seletividade das cargas úteis no conjugado da carga útil de XTEN resultante.

[239] O projeto, a seleção, e os métodos da preparação da invenção permitem a criação de XTEN projetados que são reativos com a funcionalidade eletrofílico. Os métodos para fazer os sujeitos conjugados fornecidos aqui para permitir a criação dos conjugados da carga útil de XTEN, dos conjugados do reticulador de XTEN, e de conjugados do reagente de azida/alquina de XTEN com as moléculas do ligante ou da carga útil adicionadas em uma forma quantificada em locais designados, como ilustrado esquematicamente na FIG. 1. As cargas úteis, os reticuladores, e os reagentes de azida/alquina podem ser específico do sítio e ligado eficientemente ao terminal N ou C de XTEN, a XTEN projetada de cisteína com um reagente reativo de tiol, ou a XTEN projetada de lisina da invenção com um reagente reativo de amina, e um grupo amino alfa no terminal N de XTEN, como descritos mais inteiramente, purificados e são caracterizados abaixo, e então como mostrado esquematicamente na FIG. 40 usando, por exemplo, os métodos não limitantes descritos mais especificamente nos Exemplos.

4. Comprimento da Sequência

[240] Em outro aspecto, a invenção fornece XTEN de diversos comprimentos para incorporação em composições de CFXTEN, em que o comprimento das sequências do XTEN é escolhido com base na propriedade ou função a ser obtida na composição. Dependendo da propriedade ou a função pretendida, os conjugados da carga útil de XTEN compreendem de XTEN de comprimento intermediário ou curto ou sequências de XTEN mais longas, ou multimêros de XTEN curto, intermediário ou mais longo que pode servir como transportadores. Enquanto não se destina a ser um fator limitante, o XTEN ou fragmentos de XTEN incluem segmentos curtos de cerca de 6 a cerca de 99 resíduos de aminoácidos, comprimentos intermediários de cerca de 100 a cerca de 399 resíduos de aminoácidos, e comprimentos mais longos de cerca de 400 a cerca de 1000 e de até cerca de 3000 resíduos de aminoácidos. Assim, os XTEN utilizados como parceiros da conjugação para a incorporação nos conjugados sujeitos abrangem XTEN ou fragmentos de XTEN com comprimentos de aproximadamente 6, ou aproximadamente 12, ou aproximadamente 36, ou aproximadamente 40, ou aproximadamente 48, ou aproximadamente 72 ou aproximadamente 96, ou aproximadamente 144, ou aproximadamente 288, ou aproximadamente 400, ou aproximadamente 432, ou aproximadamente 500, ou aproximadamente 576, ou aproximadamente 600, ou aproximadamente 700, ou aproximadamente 800, ou aproximadamente 864, ou aproximadamente 900, ou aproximadamente 1000, ou aproximadamente 1500, ou aproximadamente 2000, ou aproximadamente 2500, ou até aproximadamente 3000 resíduos de aminoácido no comprimento. Em outros casos, as sequências de XTEN podem ser aproximadamente 6 a aproximadamente 50, aproximadamente 50 a aproximadamente 100, aproximadamente 100 a 150, aproximadamente 150 a 250, aproximadamente 250 a 400, aproximadamente 400 a aproximadamente 500, aproximadamente 500 a aproximadamente 900, aproximadamente 900 a 1500, aproximadamente 1500 a 2000, ou aproximadamente 2000 a aproximadamente 3000 resíduos de aminoácido no comprimento. O comprimento preciso de um XTEN incorporado nos conjugados sujeitos da carga útil XTEN pode variar sem adversamente afetar a atividade biológica do conjugado. Em uma modalidade, uma ou mais do XTEN podem ser selecionadas de uma das sequências da família de XTEN; por exemplo, AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC, ou BD. Em algumas modalidades, o XTEN utilizado para criar os conjugados sujeitos compreende XTEN selecionado de qualquer uma das sequências na Tabela 2, na Tabela 3, e nas Tabelas 22-25, que pode ser ligado ao componente da carga útil diretamente ou através dos reticuladores divulgados aqui. Em outras modalidades, um ou os mais XTEN utilizado para criar os conjugados sujeitos compreende individualmente uma sequência de XTEN que tem pelo menos a identidade da sequência de aproximadamente 80%, ou a alternativamente identidade da sequência de 81%, de 82%, de 83%, de 84%, de 85%, de 86%, de 87%, de 88%, de 89%, de 90%, de 91%, de 92%, de 93%, de 94%, de 95%, de 96%, de 97%, de 98%, de 99%, ou de 100% comparada a um XTEN selecionado das Tabelas 2, 3, 22-25 ou um fragmento deste, quando alinhado otimamente com uma sequência do comprimento comparável. Em algumas modalidades, os conjugados sujeitos compreendem 2, 3, 4, ou mais sequências de XTEN, em que o comprimento cumulativo dos resíduos nas sequências de XTEN é maior do que aproximadamente 100 a aproximadamente 3000, ou aproximadamente 400 a aproximadamente 2000, ou os aproximadamente resíduos 800 a 1000 do aminoácido e o XTEN podem ser idênticos ou podem ser diferentes na sequência ou no comprimento. Como usado aqui, o comprimento cumulativo está pretendido para abranger o comprimento total, em resíduos do aminoácido, quando mais de um XTEN é incorporado no conjugado.

[241] Como descrito mais inteiramente abaixo, os métodos são divulgados em que os conjugados da carga útil de XTEN são projetados pela seleção do comprimento de XTEN e um método de ligar com um reagente de reticulação ou a carga útil a conferenciar uma propriedade físico-química (por exemplo, estabilidade ou solubilidade) ou a resultar em uma meia vida do alvo ou em uma retenção da atividade quando um conjugado da carga útil de XTEN é administrado a um sujeito.

[242] XTEN são usados como um transportador nas composições, a invenção que faz exame da vantagem da descoberta que aumentando o comprimento dos polipeptídeos não repetitivos, desestruturado realça a natureza desestruturada do XTENs e realça correspondentemente as propriedades físico-químicas e farmacocinéticas dos construtos compreendendo o transportador de XTEN. No general, XTEN como monômeros ou como multimêros com os comprimentos cumulativos mais longos que aproximadamente 400 resíduos incorporaram nos conjugados resultam em uma meia vida mais longo comparado a uns comprimentos cumulativos mais curtos, por exemplo, mais logo do que aproximadamente 280 resíduos. Como descrito mais inteiramente nos Exemplos, aumentos proporcionais no comprimento do XTEN, mesmo se criado por um pedido repetido dos únicos motivos da sequência da família (por exemplo, os quatro motivos de AE da Tabela 1), resulta em uma sequência com uma porcentagem mais elevada da formação aleatória da bobina, como determinado pelo algoritmo de GOR, ou no índice reduzido das alfa-hélices ou das beta-folhas, como determinado pelo algoritmo de Chou-Fasman, comparado a uns comprimentos mais curtos de XTEN. Além disso, aumentar o comprimento do parceiro não estruturado da fusão do polipeptídeo, como descrito nos Exemplos, resulta em um construto com um aumento desproporcional na meia vida terminal comparado aos polipeptídeos com os parceiros não estruturados do polipeptídeo com os comprimentos mais curtos da sequência. Em algumas modalidades, onde o XTEN servem principalmente como um transportador, a invenção abrange as composições conjugadas de XTEN que compreendem dois, três, quatro ou mais XTEN em que o comprimento cumulativo da sequência de XTEN das proteínas de XTEN é maior do que aproximadamente 100, 200, 400, 500, 600, 800, 900, ou 1000 a aproximadamente 3000 resíduos do aminoácido, em que o construto exibe propriedades farmacocinéticas realçadas quando administrada a um sujeito comparado a uma carga útil não ligada ao XTEN e não administrado em uma dose comparável. Em uma modalidade do antecedente, os dois ou o mais XTEN arranjam em sequência cada exibição pelo menos aproximadamente 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, ou 98% ou mais identidades a uma sequência selecionada de qualquer da Tabela 2, Tabela 3, ou Tabelas transportadora contendo pelo menos aminoácidos hodrófilicos de 90% e menos do que aproximadamente 2% da sequência total consistindo em aminoácido ou em cisteína hidrofóbica ou aromática. As propriedades farmacocinéticas realçadas do conjugado da carga útil de XTEN, na comparação com a carga útil não ligado ao XTEN, são descritas mais inteiramente, abaixo.

5. Segmentos de XTEN dos Precursores de XTEN

[243] Em um outro aspecto, a invenção fornece métodos para criar XTEN de comprimentos curtos ou intermediários das sequências longas "doadoras” de XTEN, em que a sequência mais longa do doador XTEN é truncada no terminal N, ou do terminal C, ou os segmentos são criados pela proteólise de XTEN que compreende as sequências da clivagem, desse modo tendo por resultado um comprimento curto ou intermediário XTEN. Em exemplos não limitantes, uma sequência AG864 de 864 resíduos do aminoácido pode ser truncada para render um AG144 com 144 resíduos, um AG288 com 288 resíduos, um AG576 com 576 resíduos, ou outros comprimentos intermediários, quando a sequência AE864 puder ser truncada para render as sequências AE144 múltiplas, uma sequência AE288 ou uma sequência AE576 com 288 ou 576 resíduos ou outros comprimentos mais curtos ou intermediários. Similarmente, o DNA que codifica as sequências “doadoras” mais longas podem ser manipuladas para incorporar os resíduos da cisteína ou de lisina pretendidas para o uso nos conjugados com comprimento curto ou intermediário de XTEN. Isso é especificamente contemplado de forma que tal abordagem possa ser utilizada com qualquer uma das modalidades XTEN sequências listadas nas Tabelas 2,3, 21 ou 22 para resultar em um XTEN com um comprimento desejado.

[244] Em outro aspecto, a invenção fornece XTEN com as sequências de clivagem incorporadas no interior a sequência em intervalos definidos tais que o XTEN pode ser processado pela clivagem em 2, 3, 4, 5, ou 6 XTEN mais curtos de comprimentos uniformes. Como ilustrado na FIG. 96A, um XTEN monomérico é projetado com duas sequências internas da clivagem que, quando tratado com uma prótese sob as circunstâncias eficazes resultam na clivagem de todo a sequência de clivagem, resultam em três segmentos de XTEN do comprimento uniforme. Além disso, os XTEN são projetados com uma sequência tais que os segmentos resultantes de XTEN tem também a sequência idêntica do aminoácido, inclusivo da sequência residual da clivagem. Em uma modalidade, a invenção fornece um XTEN com um definido, sequência que compreende 1, 2, 3, 4, ou 5 arginina (R) resíduos internos ao XTEN em sequência e espaçaram em intervalos uniformes ao longo da sequência de XTEN que constrói uma ponte sobre segmentos idênticos de XTEN em que o tratamento com tripsina resulta na clivagem do XTEN em segmentos de XTEN a tem um comprimento e uma sequência idênticas. Na modalidade antecedente, o resíduo da arginina não tem um resíduo de prolina na posição adjacente de P1'. Assim, pelo tratamento do antecedente com tripsina, um XTEN com 1 arginina interna resultaria em 2 segmentos idênticos de XTEN, um XTEN com as 2 argininas internas resultaria em 3 segmentos de XTEN idênticos, etc. Em uma outra modalidade, cada arginina das modalidades antecedentes é substituída com os resíduos de lisina. Em outra modalidade, a invenção fornece um XTEN com uma sequência definida que compreende 1, 2, 3, 4, ou 5 sequências da clivagem internas para a sequência XTEN e espaçados em intervalos uniformes ao longo da sequência da XTEN, em que cada sequência da clivagem é SASRSA, e em que o tratamento com tripsina resulta na clivagem do XTEN em segmentos de XTEN a ter um comprimento e uma sequência idênticos. Em outra modalidade, a invenção fornece um XTEN com pelo menos o aproximadamente 90%, ou pelo menos aproximadamente 91%, ou pelo menos de aproximadamente 92%, ou pelo menos de aproximadamente 93%, ou pelo menos de aproximadamente 94%, ou pelo menos de aproximadamente 95%, ou pelo menos de aproximadamente 96%, ou pelo menos de aproximadamente 97%, ou pelo menos de aproximadamente 98%, ou pelo menos de aproximadamente 99% a uma sequência selecionada do grupo das sequências determinadas na Tabela 6. Em outra modalidade, a invenção fornece um XTEN com pelo menos aproximadamente 90%, ou pelo menos de aproximadamente 91%, ou pelo menos de aproximadamente 92%, ou pelo menos de aproximadamente 93%, ou pelo menos de aproximadamente 94%, ou pelo menos de aproximadamente 95%, ou pelo menos de aproximadamente 96%, ou pelo menos de aproximadamente 97%, ou pelo menos de aproximadamente 98%, ou pelo menos de aproximadamente 99% a uma sequência selecionada do grupo das sequências determinadas na Tabela 6, em que o XTEN adicional compreende um primeiro e um segundo Tão da afinidade em que cada afinidade do Tag é ligado ao XTEN por uma sequência da clivagem no terminal C e N do XTEN, respectivamente, em que cada sequência da clivagem é capaz de ser clivado perto da tripsina, e em que o primeiro Tag da afinidade é diferente do segundo Tag da afinidade e cada um são selecionados independentemente do grupo que consiste nos Tag da afinidade determinados na Tabela 7. A modalidade antecedente é ilustrada na FIG. 96B, em que o tratamento com o protease do XTEN com duas sequências internas da clivagem e um terminal N e um terminal C a afinidade de Tag que cada uma ligou ao XTEN por resultados da sequência de clivagem na clivagem do construto em três segmentos de XTEN do comprimento uniforme e em liberação dos dois Tag da afinidade, a preparação resultante de que pode subsequentemente ser processada em XTEN substancialmente homogêneo como descrito aqui, abaixo. As variações de XTEN que compreende tais sequências de clivagem do uniforme e sua distribuição na sequência são contempladas pela invenção. Tabela 6: O Precursor de XTEN com Sequência de Clivagem Interna

6. Carga líquida

[245] Em outras modalidades, os polipeptídeos de XTEN tem uma característica não estruturada fornecida pela incorporação dos resíduos do aminoácido com uma carga líquida e contendo uma porcentagem baixa ou de nenhum dos aminoácidos hidrofóbicos na sequência de XTEN. A carga líquida total e a densidade da carga líquida são controladas modificando o teor de aminoácidos carregados nas sequências XTEN, tanto positivos quanto negativos, com a carga líquida normalmente representada como a porcentagem de aminoácidos no polipeptídeo contribuindo para um estado de carga além desses resíduos que são cancelados por um resíduo com uma carga oposta. Em algumas modalidades, a densidade de carga líquida do XTEN das conjugações podem estar acima de +0,1 ou abaixo de -0,1/resíduos de cargas. Por "densidade de carga líquida" de uma proteína ou peptídeo neste documento entende-se como a carga líquida dividida pelo número total de aminoácidos na proteína. Em outras modalidades, a carga líquida de um XTEN pode ser cerca de 0%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 19%, ou cerca de 20% ou mais. Com base na carga líquida, alguns XTENs têm um ponto isoelétrico (pI) de 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, ou, até mesmo, 6,5. Em uma modalidade, o XTEN terá um ponto isoelétrico entre 1.5 e 4,5 e carregar uma carga negativa líquida sob condições fisiológicas.

[246] Uma vez que a maioria dos tecidos e superfícies em um ser humano ou animal possui uma carga negativa, em algumas modalidades as sequências XTEN são projetadas para ter uma carga negativa líquida para minimizar as interações não específicas entre o XTEN contendo composições e as várias superfícies, tais como vasos sanguíneos, tecidos saudáveis ou diversos receptores. Para não ser vinculado por uma teoria particular, um XTEN pode adotar conformações abertas devido à repulsão eletrostática entre aminoácidos individuais do polipeptídio XTEN que carregam individualmente uma carga negativa e que são distribuídos em toda a sequência do polipeptídio XTEN. Em algumas modalidades, a sequência XTEN destina-se a pelo menos 90% para 95% dos resíduos carregados separados por outros resíduos não carregados como serina, alanina, treonina, prolina ou a glicina, que leva a uma distribuição mais uniforme da carga, melhor expressão ou comportamento de purificação. Uma distribuição tão uniforme da carga negativa líquida nos comprimentos prolongados da sequência de XTEN contribui também à conformação não estruturada do polímero que, por sua vez, pode resultar em um aumento eficaz no raio hidrodinâmico. Em modalidades preferenciais, a carga negativa do sujeito XTEN é conferida pela incorporação de resíduos de ácido glutâmico. Geralmente, os resíduos glutâmicos são espaçados uniformemente em toda a sequência XTEN. Em alguns casos, o XTEN pode conter cerca de 10-80, ou cerca de 15-60 ou cerca de 20-50 resíduos glutâmicos por 20 kDa de XTEN que pode resultar em um XTEN com resíduos carregados que teria um pKa muito semelhante, o que pode aumentar a homogeneidade de carga do produto e aguçar seu ponto isoelétrico, melhorando as propriedades físico-químicas da proteína de fusão resultante da XTEN para, e, portanto, simplificar os processos de purificação. Por exemplo, onde um XTEN com uma carga negativa é desejado, o XTEN pode ser selecionado unicamente a partir de uma sequência de família AE, que tem aproximadamente uma carga líquida de 17% devido ao ácido glutâmico incorporado, ou pode incluir diferentes proporções de ácido glutâmico, contendo os motivos da Tabela 1 para fornecer o grau desejado de carga líquida. Exemplos não limitantes de AE XTEN inclua, mas não são limitados as sequências a AE36, AE42, AE144, AE288, AE432, AE576, AE624, AE864, e AE912 das Tabelas 2 e 21 ou fragmentos deste. Em uma modalidade, uma sequência XTEN das Tabelas 2 ou 3 pode ser modificada para incluir resíduos adicionais de ácido glutâmico para obter a carga negativa líquida desejada. Desta forma, em uma modalidade, a invenção fornece XTEN no qual as sequências XTEN contêm cerca de 1%, 2%, 4%, 8%, 10%, 15%, 17%, 20%, 25% ou até mesmo cerca de 30% de ácido glutâmico. Em alguns casos, o XTEN pode conter cerca de 10-80, ou cerca de 15-60 ou cerca de 20-50 resíduos glutâmicos por 20kDa de XTEN que pode resultar em um XTEN com resíduos carregados que teria um pKa muito semelhante, o que pode aumentar a homogeneidade de carga do produto e aguçar seu ponto isoelétrico, melhorando as propriedades físico-químicas da proteína de fusão resultante da composição conjugada de XTEN, e, portanto, simplificando os processos de purificação. Em uma modalidade, a invenção contempla a incorporação de até 5% resíduos de ácido aspártico no XTEN além do ácido glutâmico para obter uma carga negativa líquida.

[247] Sem estar vinculada por uma teoria específica, o XTEN das composições de carga útil de XTEN com a maior carga líquida deverão ter menos interações não específicas com várias superfícies de carga negativa, tais como os vasos sanguíneos, tecidos, ou vários receptores, o que contribuiria adicionalmente para reduzir a depuração ativa. Inversamente, acredita-se que o XTEN dos conjugados da carga útil de XTEN com baixa (ou nenhuma) carga líquida teria um grau mais elevado de interação com superfícies que podem potencializar a atividade do conjugado associado na vasculatura ou nos tecidos.

[248] Em outras modalidades, onde não é desejado qualquer carga líquida, o XTEN pode ser selecionado em, por exemplo, componentes de AG XTEN, tais como os motivos AG da Tabela 1, ou os motivos AM da Tabela 1 que não possuem carga líquida. Exemplos não limitante de AG XTEN incluem, mas não estão limitados a 36, 42, 144, 288, 576, e 864 sequências de família AG das Tabelas 2 e 22 ou fragmentos destes. Em outra modalidade, o XTEN pode incluir diferentes proporções de motivos AE e AG para ter uma carga líquida que seja considerada ideal para um determinado uso ou manter uma determinada propriedade físico-química.

[249] O XTEN dos conjugados da presente invenção geralmente não tem ou tem um baixo teor de aminoácidos carregados positivamente. Em algumas modalidades, o XTEN pode ter menos de cerca de 10% resíduos de aminoácidos com uma carga positiva, ou menos de cerca de 7%, ou menos de cerca de 5% ou menos de cerca de 2%, ou menos de cerca de 1% de resíduos de aminoácidos com uma carga positiva. Entretanto, a invenção contempla os construtos onde um número definido dos aminoácidos com uma carga positiva, tal como a lisina, é incorporado em XTEN para permitir a conjugação entre a amina epsilon da lisina e de um grupo reativo em uma carga útil ou um reticulador ao conjugado à estrutura principal de XTEN. Em uma modalidade do acima exposto, o XTEN do sujeito conjugado tem entre 1 a cerca de 100 resíduos de lisina, ou cerca de 1 a cerca de 70 resíduos de lisina, ou cerca de 1 a cerca 50 resíduos de lisina, ou cerca de 1 a cerca de 30 resíduos de lisina, ou cerca de 1 a cerca de 20 resíduos de lisina, ou cerca de 1 a cerca de 10 resíduos de lisina, ou cerca de 1 a cerca de 5 resíduos de lisina, ou cerca de 1 a cerca de 3 resíduos de lisina, ou, alternativamente, apenas um único resíduo de lisina. Usando o XTEN contendo lisina antecedente, os conjugados podem ser construídos que compreendem XTEN, um ligante opcional, mais uma carga útil no tratamento de uma condição em um sujeito em que o número máximo das moléculas do agente da carga útil ligado ao componente de XTEN é determinado pelos números das lisinas com um grupo lateral reativo (por exemplo, uma amina terminal) incorporado no XTEN.

7. Baixa imunogenicidade

[250] Em outro aspecto, a invenção fornece as composições de XTEN que tem um grau baixo de munogenicidade ou é substancialmente não imunogênico. Vários fatores podem contribuir para a baixa imunogenicidade do XTEN, por exemplo, a sequência não repetitiva, a conformação não estruturada, o alto grau de solubilidade, o baixo grau ou falta de auto-agregação, o baixo grau ou falta de locais proteolíticos dentro da sequência e o baixo grau ou falta de epítopos na sequência XTEN.

[251] Epítopos conformacionais são formados por regiões da superfície de proteínas que são compostas de várias sequências de aminoácidos descontínuos do antígeno de proteína. O dobramento exato da proteína traz essas sequências em configurações espaciais bem definidas e estáveis, ou epítopos, que podem ser reconhecidos como "estrangeiros" pelo sistema imunológico humoral hospedeiro, resultando na produção de anticorpos para a proteína ou a ativação da resposta imune mediada por célula. Neste último caso, a resposta imune a uma proteína em um indivíduo é fortemente influenciada pelo reconhecimento de epítopo de célula T que é uma função da especificidade de ligação peptídica do alotipo HLA-DR daquele indivíduo. Engajamento de um complexo de peptídeo-MHC Classe II por um receptor de células T cognato na superfície da célula T, juntamente com a ligação cruzada de outros co-receptores específicos como a molécula CD4, pode induzir a um estado ativado dentro da célula-T. Ativação leva à liberação de citocinas, ativando adicionalmente outros linfócitos como as células B para produzir anticorpos ou ativando células T como uma resposta imune celular completa.

[252] A capacidade de um peptídeo de ligar a uma determinada molécula MHC Classe II para apresentação na superfície de um APC (célula de apresentação de antígeno) é dependente de uma série de fatores; mais notavelmente sua sequência primária. Em uma modalidade, um grau menor de imunogenicidade é alcançado através da concepção de sequências XTEN que resistem ao processamento de antígeno em células de apresentação de antígeno e/ou escolhendo sequências que não se ligam bem aos receptores MHC. A invenção fornece a carga útil de XTEN, reticulação de XTEN, e o reagente da química pressionada de XTEN conjugados com os polipeptídeos substancialmente não repetitiva de XTEN projetados para reduzir a ligação com os receptores de MHC II, assim como evitando a formação dos epítopos para o emperramento do receptor ou do anticorpo da célula T, tendo por resultado um grau baixo de imunogenicidade. A evasão de imunogenicidade pode ser atribuída, pelo menos em parte, como um resultado da flexibilidade conformacional das sequências XTEN; ou seja, a falta de estrutura secundária devido à seleção e ordem dos resíduos de aminoácidos. Por exemplo, são particularmente interessantes as sequências com uma baixa tendência para adaptar conformações dobradas compactas em solução aquosa ou sob condições fisiológicas que poderiam resultar em epítopos conformacionais. A administração dos polipeptídeos que compreendem XTEN, usando práticas terapêuticas convencionais e dosagem, geralmente não resultaria na formação de anticorpos neutralizando a sequência de XTEN, e também na redução da imunogenicidade da carga útil nos conjugados.

[253] Em uma modalidade, as sequências XTEN utilizadas nos polipeotídeos sujeitos podem ser substancialmente isentas de epítopos reconhecidos por células T humanas. A eliminação destes epítopos com a finalidade de gerar menos proteínas imunogênicas foi divulgada anteriormente; ver, por exemplo, WO 98/52976, WO 02/079232 e WO 00/3317 que são incorporados por referência neste documento. Ensaios para epítopos da célula T humana foram descritos (Stickler, M., et al. (2003) J Immunol Methods, 281: 95-108). São particularmente interessantes as sequências de peptídeos que podem ser oligomerizadas sem gerar epítopos de célula T ou sequências não humanas. Isto é conseguido através do teste de repetições diretas destas sequências para a presença de epítopos de célula T e a ocorrência de 6 a 15 - mer e, em particular, sequências de 9-mer que não são humanas e alterando depois o design da sequência XTEN para eliminar ou interromper a sequência de epítopo. Em algumas modalidades, as sequências de XTEN são substancialmente não imunogênicas pela restrição do número de epítopos do XTEN previstos para se ligarem aos receptores MHC. Com uma redução do número de epítopos capazes de se ligarem aos receptores MHC, há uma redução concomitante no potencial de ativação de célula T, assim como função auxiliar da célula T, ativação da Célula B reduzida ou supra-regulação e produção reduzida de anticorpos. O baixo grau de epítopos previstos de célula T pode ser determinado por meio de algoritmos de predição de epítopo tais como, por exemplo, TEPITOPE (Sturniolo, T., et al. (1999) Nat Biotechnol, 17: 555-61), conforme mostrado no Exemplo 46. A pontuação de TEPITOPE de um determinado frame de peptídeo dentro de uma proteína é o log doKd (dissociação constante, afinidade, off-rates) da ligação daquele frame de peptídeo a diversos dos alelos MHC humanos mais comuns, conforme divulgado em Sturniolo, T. et al. (1999) Nature Biotechnology 17:555). A pontuação varia sobre pelo menos de 20 registros, de aproximadamente 10 a aproximadamente -10 (correspondendo às restrições obrigatórias de 10e10 Kd a 10e-10 Kd), e pode ser reduzida evitando os aminoácidos hidrofóbicos que servem enquanto resíduos da escora durante a exposição do peptídeo em MHC, tal como M, I, L, V, F. Em algumas modalidades, um componente de XTEN incorporado em uma carga útil de XTEN, o reticulador de XTEN, ou o conjugado do reagente de química pressionada de XTEN não tem um epítope predito da célula T em uma pontuação do ponto inicial de TEPÍTOPE de aproximadamente -5, ou -6, ou -7, ou -8, ou -9, ou em uma pontuação de TEPÍTOPE de -10. Como usado neste documento, uma pontuação de "-9" é um limite TEPITOPE mais rigoroso do que uma pontuação de -5.

8. Raio Hidrodinâmico Aumentado

[254] Em um outro aspecto, um sujeito de XTEN útil como um terceiro da fusão tem um raio hidrodinâmico elevado; uma propriedade que confere um aumento do peso molecular aparente correspondente à composição de carga útil de XTEN em comparação com a carga sem XTEN. Conforme detalhado no Exemplo 26, a ligação do XTEN para resultados de sequências de proteínas terapêuticas em composições de XTEN que podem ter aumentado os raios hidrodinâmicos, aumentado o peso molecular aparente e aumentado o fator de peso molecular aparente em comparação a uma proteína terapêutica não ligada a um XTEN. Por exemplo, em aplicações terapêuticas em que a meia vida prolongada é desejada, as composições em que uma ou os mais XTEN com um raio hidrodinâmica elevada conjugado a uma carga útil pode eficazmente ampliar o raio hidrodinâmico do conjugado além do tamanho glomerular do pore de aproximadamente 3-5 nanômetro (que correspondem a um peso molecular aparente do kDa aproximadamente 70) (Caliceti. 2003. Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates. Adv Drug Deliv Rev 55:1261-1277), resultando em depuração renal reduzida de proteínas circulantes com um aumento correspondente na meia-vida terminal e outras propriedades farmacocinéticas melhoradas. O raio hidrodinâmico de uma proteína é conferido pelo seu peso molecular, assim como pela sua estrutura, incluindo a forma ou a compacidade. Para não ser limitado por uma teoria particular, o XTEN pode adotar conformações abertas devido à repulsão eletrostática entre as cargas individuais dos resíduos carregados incorporados na XTEN assim como por causa da flexibilidade inerente transmitida pelos aminoácidos específicos na sequência que não possuem potencial para conferir estrutura secundária. A conformação aberta, estendida e não estruturada do polipeptídeo XTEN pode ter um raio hidrodinâmico proporcional maior em comparação com os polipeptídeos com um comprimento de sequência e/ou peso molecular comparável que têm estrutura secundária e/ou terciária, tais como proteínas globulares típicas. Métodos para determinar o raio hidrodinâmico são bem conhecidos na técnica, tanto pelo uso de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC), conforme descrito na Patente U.S. Nos. 6,406,632 e 7,294,513. O exemplo 26 demonstra que o aumento de comprimento XTEN resulta em aumento proporcional do raio hidrodinâmico, do peso molecular aparente e/ou do fator de peso molecular aparente e, desta forma, permite a confecção de XTEN para os valores de corte de pesos moleculares aparentes ou raios hidrodinâmicos desejados. Conformemente, em determinadas modalidades, a carga útil de XTEN pode ser configurado com um XTEN tais que o conjugado resultante pode ter um raio hidrodinâmico pelo menos de aproximadamente 5 nanômetro, ou pelo menos aproximadamente 8 nanômetro, ou pelo menos aproximadamente 10 nanômetro, ou aproximadamente 12 nanômetro, ou aproximadamente 15 nanômetro, ou aproximadamente 20 nanômetro, ou aproximadamente 30 nanômetro ou mais. Nas modalidades antecedentes, o raio hidrodinâmico grande conferenciado pelo XTEN em um conjugado da carga útil de XTEN pode conduzir ao afastamento reduzido do conjugado resultante, a um aumento na meia vida terminal, e a um aumento no tempo de residência médio. Como descrito nos Exemplos, quando os pesos moleculares das composições contendo XTEN são derivados das análises de cromatografia da exclusão do tamanho, a conformação aberta do XTEN devido ao grau baixo de estrutura secundária resulta em um aumento no peso molecular aparente dos conjugados em que são incorporados. Em uma modalidade, a invenção atual emprega a descoberta que o aumento no peso molecular aparente pode ser realizado para ligar não somente um único XTEN de um comprimento dado, mas também ligar 2, 3, de 4 ou mais XTEN de uns comprimentos proporcionais mais curtos, ou na forma linear ou como uma configuração trimérica ou tetramérica, ramificada, como descritas mais inteiramente, abaixo. Em algumas modalidades, o XTEN, compreendendo uma carga útil e um ou mais XTEN apresenta um peso molecular aparente de pelo menos cerca de 400 kD, ou pelo menos cerca de 500 kD, ou pelo menos cerca de 700 kD, ou pelo menos cerca de 1000 kD, ou pelo menos cerca de 1400 kD, ou pelo menos cerca de 1600 kD, ou pelo menos cerca de 1800kD, ou pelo menos cerca de 2000 kD. Conformemente, o conjugado da carga útil de XTEN exibe um peso molecular aparente que seja aproximadamente 1.3 vezes maior, ou aproximadamente 2 vezes maior, ou aproximadamente 3 vezes maior ou aproximadamente 4 vezes maior, ou aproximadamente 8vezes maior, ou aproximadamente 10 vezes maior, ou aproximadamente 12 vezes maior, ou aproximadamente 15 vezes maior, ou aproximadamente 20 vezes maior que o peso molecular real do conjugado. Em uma modalidade, o conjugado isolado da carga útil de XTEN de algumas das modalidades divulgadas aqui exibem um fator aparente do peso molecular sob circunstâncias fisiológicas que sejam maiores do que aproximadamente 1.3, ou aproximadamente 2, ou aproximadamente 3, ou aproximadamente 4, ou aproximadamente 5, ou aproximadamente 6, ou aproximadamente 7, ou aproximadamente 8, ou aproximadamente 10, ou maior do que aproximadamente 15. Em uma outra modalidade, a carga útil de XTEN tem, sob circunstâncias fisiológicas, um fator aparente do peso molecular que seja aproximadamente 3 a aproximadamente 20, ou é aproximadamente 5 a aproximadamente 15, ou é aproximadamente 8 a aproximadamente 12, ou é aproximadamente 9 a aproximadamente 10 relativo ao peso molecular real do conjugado. Geralmente, o peso molecular aparente aumentado dos conjugados dos sujeitos da carga útil de XTEN realça as propriedades farmacocinéticas da composição por uma combinação dos fatores, que incluem o afastamento ativo reduzido, afastamento renal reduzido, e a perda reduzida através das junções capilares e venosas.

9. Composições e métodos de purificação de XTEN como preparações substancialmente homogêneas

[255] É um objeto da invenção para fornecer composições de XTEN e métodos de fazer preparações que compreendem XTEN com uma elevação no nível da pureza e da uniformidade no comprimento e a composição de XTEN descrita aqui.

[256] A expressão da proteína recombinante de XTEN ou de uma proteína recombinante da fusão que compreende XTEN em uma célula hospedeira normalmente, como toda a proteína globular, resulta em uma mistura dos compostos diferentes em que uma parcela são versões truncadas do comprimento desejado da proteína. O truncamento pode ser o resultado da terminação adiantada da tradução, da instabilidade do mRNA, ou da proteólise na célula hospedeira. Porque as proteínas globulares têm geralmente dobramento eficiente ou completo na sua estrutura tridimensional, enquanto as versões truncadas não, os processos de purificação e de recuperação típicos podem com sucesso separar e remover as versões truncadas de modo a que um elevado nível de homogeneidade do produto é conseguido numa determinada preparação de proteínas globulares. Entretanto, os polímeros da proteína tais como XTEN são originais naquele, dado sua natureza não estruturada, faltam geralmente estruturas tridimensionais. Foi difícil obter uma preparação homogênea de XTENs de comprimento total devido a uma ou a mais das razões acima mencionadas. Isto é porque as correntes incompletas ou truncadas de XTEN diferem somente ligeiramente em suas propriedades físico-químicas das sequências de comprimento total desejadas tais que os processos tradicionais que seriam suficientes para a purificação das proteínas globulares não são eficazes na remoção de XTEN truncado do produto da expressão a fim obter uma preparação substancialmente homogênea das sequências de comprimento total. Quando o sujeito XTEN da invenção, incluindo XTEN ligado à carga útil, puder purificar um grau moderado de homogeneidade pelos meios convencionais usados para proteínas, tais como o fracionamento de sal, a cromatografia de troca de íon, o cromatografia da exclusão do tamanho, cromatografia de adsorção em hidroxiapatita, a cromatografia de interação hidrofóbica ou a electroforese em gel, estes métodos sozinhos não resultam nas preparações em que os XTEN estão em ordem a um comprimento substancialmente homogêneo.

[257] Os métodos sujeitos fornecem aqui a produção da licença da preparação substancialmente homogênea de XTENs através de uma ou alguma etapa simples de purificação. Em uma modalidade, a prática de alguns de tais métodos da invenção atual pode utilizar um XTEN projetado para compreender ainda, como uma proteína da fusão, os Tag da afinidade situados em qualquer um ou ambos o terminal N ou C de XTEN tais que o produto expressado pode ser sujeito aos métodos de purificação para capturar seletivamente o polipeptídeo expressado de comprimento total, removendo desse modo os subprodutos truncados de XTEN (veja FIGS. 4142). Exemplos não limitantes dos Tag da afinidade que podem ser adicionados aos terminais de XTEN são apresentados na Tabela 7. Exemplos não limitantes dos métodos do projeto, a expressão, e os métodos de purificação para conseguir o XTEN substancialmente homogêneo são descritos nos Exemplos.

[258] Em algumas modalidades, a invenção fornece composições substancialmente homogêneas do polipeptídeo com o XTEN fundido diretamente a um Tag da afinidade (como, mas não limitado aos Tag da Tabela 7) ligado ao terminal N ou C de XTEN. Em outras modalidades, a invenção fornece composições substancialmente homogêneas do polipeptídeo com o XTEN fundido a um Tag da afinidade (como, mas não limitado aos Tag da Tabela 7) por uma sequência de clivagem ligada ao terminal C ou N de XTEN. Em outras modalidades, a invenção fornece composições substancialmente homogêneas do polipeptídeo com o XTEN fundido diretamente a um ou dois Tag diferentes da afinidade (como, mas não limitado aos Tag da Tabela 7) ligados ao terminal C e/ou N de XTEN, como mostrado na FIG. 41. Em outras modalidades, a invenção fornece composições substancialmente homogêneas com o XTEN fundido a uma ou duas sequências de clivagem (como, mas não limitado às sequências de clivagem da Tabela 8 ou da Tabela 9) em que, por sua vez, é cada uma fundida aos Tag diferentes da afinidade (como, mas não limitado aos Tag da Tabela 7) ligados ao terminal C ou N ou ambos terminais C e N de XTEN, como mostrado. 41. Ainda em outras modalidades, a invenção fornece composições substancialmente homogêneas do polipeptídeo com o XTEN fundido diretamente a um ou dois Tag diferentes da afinidade (como, mas não limitado aos Tag da Tabela 7) ligados ao terminal C e/ou N dos XTEN que compreendem ainda uma sequência do ajudante (como, mas não limitado às sequências da Tabela 12) fundida ao terminal N da proteína. Como usado no contexto das proteínas descritas aqui, “substancialmente homogêneos” significa que pelo menos aproximadamente 85%, ou pelo menos aproximadamente 90%, ou pelo menos aproximadamente 91%, ou pelo menos aproximadamente 92%, ou pelo menos aproximadamente 93%, ou pelo menos aproximadamente 94%, ou pelo menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mesmo mais elevados das sequências do polipeptídeo da preparação tem o comprimento idêntico da sequência. Os valores das porcentagens são baseados na porcentagem da área de cromatograma da preparação analisada por HPLC ou na porcentagem da área da varredura da preparação analisada por SDS-PAGE, ou por outros tais procedimentos padrão conhecidos na técnica para avaliar a pureza das proteínas.

[259] Em uma modalidade, a invenção fornece um polipeptídeo substancialmente homogêneo que tem a configuração da fórmula I: (HS)-(AT1)-(CS1)-(XTEN) I em que HS é a sequência do ajudante, AT1 é o primeiro Tag da afinidade, CS1 é a primeira sequência da clivagem, e XTEN é o polipeptídeo recombinante prolongado.

[260] Em outra modalidade, a invenção fornece um polipeptídeo substancialmente homogêneo que tem a configuração da fórmula II: (HS)-(CS1)-(XTEN)-(CS2)-(AT1) II em que HS é a sequência do ajudante, AT1 é o primeiro Tag da afinidade, CS1 é a primeira sequência de clivagem, CS2 é a segunda sequência de clivagem e XTEN é o polipeptídeo recombinante prolongado.

[261] Em outra modalidade, em que a composição tem a configuração da fórmula III: (HS)-(AT1)-(CS1)-(XTEN)-(CS2)-(AT2) III em que HS é a sequência do ajudante, AT1 é o primeiro Tag da afinidade, AT2 é o segundo Tag da afinidade, CS1 é a primeira sequência de clivagem, CS2 é a segunda sequência de clivagem e XTEN é o polipeptídeo recombinante prolongado.

[262] O construto de polipeptídeo compreende Tag da afinidade tendo a propriedade vantajosa, comparada ao XTEN não ligado aos Tag da afinidade, podendo ser purificado ao comprimento substancialmente homogêneo pelo uso dos substratos da cromatografia a que os Tag da afinidade serão ligados. Em algumas modalidades, as categorias dos substratos da cromatografia usada no método de purificação são selecionadas dos substratos da cromatografia determinadas na Tabela 7, que são utilizadas para a purificação de XTEN ligado ao tag de afinidade indicada nas tabelas correspondentes. Como será apreciado por um versado na técnica, as categorias do substrato da cromatografia podem abranger os grupos químicos diferentes ligados às matrizes ou às resinas diferentes; por exemplo, os substratos da troca de anion incluem o trimetilamónia quaternária e a ligação de dietilaminoetil às resinas, os substratos da troca de cátion incluem o sulfo ou o sulfopropil ou os grupos de carboximetil ou do fosfato limitados às resinas, os substratos de HIC incluem os grupos do etil, do isopropil, do butil, do fenil ou do octil limitados às resinas, e os substratos de IMAC incluem o ácido iminodiacético e os grupos ácidos nitriloacéticos limitados às resinas. Os substratos antecedentes são listados para finalidades ilustrativas e não pretendidas pata limitar o escopo dos substratos que podem ser empregados para praticar a invenção.

[263] Em algumas modalidades, a invenção fornece XTEN substancialmente homogêneo preparado de um polipeptídeo que compreende um XTEN fundido a um primeiro ou primeiro e segundo Tag da afinidade pelas sequências de clivagem (como, mas não limitado às sequências de clivagem da Tabela 8) capazes de ser clivado por um prótese, em que a preparação é tratada com o prótese para clivar as sequências de clivagem para liberar o XTEN do polipeptídeo, seguido por uma etapa de cromatografia ao ligamento e para eluição, e então recupera o XTEN substancialmente homogêneo. Em uma modalidade do antecedente, a prótese é tripsina e as sequências de clivagem são capazes de serem clivadas pela tripsina, exemplos não limitantes de que são alistados nas Tabelas 11 e 15. Em outra modalidade do antecedente, a prótese é TEV e as sequências de clivagem são capazes de serem clivadas por TEV. Em outra modalidade do antecedente, o XTEN clivado é purificado pela ligação do substrato da cromatografia do SP de MacoCap seguido pelo eluição com uma solução de sal ou de tampão como, mas não limitado ao fosfato de sódio/NaCl, tendo por resultado o XTEN substancialmente homogêneo. Como usado no contexto de XTEN e/ou polipeptídeos que compreendem XTEN, uma preparação que seja “substancialmente purificada” significa que pelo menos aproximadamente 85%, e mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 90%, e mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 91%, e mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 92%, e mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 93%, e mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 94%, e mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 95% ou mais das moléculas individuais de uma preparação dada tem o comprimento idêntico da sequência; ou seja o mesmo número dos aminoácidos. Os métodos que podem ser utilizados para o ensaio para a homogeneidade do comprimento incluem a espectroscopia, a exclusão do tamanho da cromatografia/HPLC, ou SDS-PAGE seguido por coloração com prata; os métodos podem ser usados individualmente ou coletivamente para quantificar o grau de homogeneidade. Um esquema generalizado para a purificação dos polipeptídeos que compreendem XTEN com as sequências do Tag da afinidade otimizada para a purificação é mostrada nas FIGS. 41-42. Depois que a purificação dos Tag pode ser proteoliticamente clivada (FIG. 41B) ou retido (FIG. 41C). O XTEN pode ser purificado dos contaminadores devido à composição de aminoácido original de XTEN, como ilustrado na FIG. 42.

[264] Em uma modalidade, a invenção fornece um método para produzir uma preparação substancialmente purificada de um polipeptídeo que compreende um XTEN, compreendendo as etapas de projetar um gene que codifica um XTEN e um primeiro Tag da afinidade, criando um vetor da expressão apropriado para transformar uma célula hospedeira que compreende o gene codificando ligado operacionalmente às sequências de controle, transformando a célula hospedeira com o vetor da expressão, cultivando a célula hospedeira sob as circunstâncias apropriadas para a expressão do XTEN com o Tag ligado da afinidade, sujeitando o produto cru da expressão a um processo de purificação que compreenda uma etapa de purificação da afinidade em que o produto cru da expressão é carregado em um primeiro substrato da cromatografia que ligue seletivamente o primeiro Tag da afinidade, lavando o substrato da cromatografia para eluição do material não limitado ao substrato da cromatografia, eluindo a proteína retida sob circunstâncias apropriadas e recuperando a eluição em que o polipeptídeo recuperado é substancialmente homogêneo no comprimento. Em outra modalidade, a invenção fornece um método para produzir uma preparação substancialmente homogênea de um polipeptídeo que compreende um XTEN, compreendendo as etapas de projetar um gene que codifica um XTEN que compreende uma primeira e um segunda Tag da afinidade, criando um vetor da expressão apropriado para transformar uma célula hospedeira que compreende o gene codificado ligado operacionalmente às sequências de controle, transformando a célula hospedeira com o vetor da expressão, cultivando a célula hospedeira sob as circunstâncias apropriadas para a expressão do polipeptídeo, sujeitando o produto cru da expressão a um processo de purificação que compreenda uma etapa de purificação da afinidade em que o lisato é carregado em um primeiro substrato da cromatografia que ligue seletivamente o primeiro Tag da afinidade, lavando o substrato de cromatografia para eluição do material não limitado ao substrato da cromatografia, eluindo a proteína retida sob circunstâncias apropriadas e recuperando a eluição, carregando o polipeptídeo recuperado de XTEN em um segundo substrato da cromatografia sob as circunstâncias eficazes para capturar o polipeptídeo com o segundo Tag da afinidade no substrato da cromatografia, lavando a carcaça de cromatografia para eluição do material não limitado à carcaça de cromatografia, eluindo o polipeptídeo de XTEN sob as circunstâncias eficazes para eluir o polipeptídeo de XTEN com o segundo Tag da afinidade, recuperando a eluição que contém o polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de XTEN com o primeiro e o segundo Tag da afinidade em que o polipeptídeo recuperado é substancialmente homogêneo no comprimento. Ainda em outra modalidade, a invenção fornece um método para produzir uma preparação substancialmente homogênea de um polipeptídeo que compreende um XTEN, compreendendo as etapas de projetar um gene que codifica um XTEN que compreende um primeiro Tag da afinidade ligado por uma sequência de clivagem ao terminal N do XTEN codificado e um segundo Tag da afinidade ligado por uma sequência de clivagem ao terminal C do XTEN codificado, criando um vetor da expressão apropriado para transformar uma célula hospedeira que compreende o gene codificando ligado operacionalmente às sequências de controle, transformando a célula hospedeira com o vetor da expressão, cultivando a célula hospedeira sob as circunstâncias apropriadas para a expressão do polipeptídeo, sujeitando o produto cru da expressão a um processo de purificação deste compreende uma etapa de purificação da afinidade em que o lisato é carregado em um primeiro substrato da cromatografia que ligue seletivamente o primeiro Tag da afinidade, lavando o substrato de cromatografia para eluir o material não limitado ao substrato da cromatografia, eluindo a proteína retida sob circunstâncias apropriadas e recuperando a eluição, carregando o polipeptídeo recuperado em um segundo substrato da cromatografia sob as circunstâncias eficazes para capturar o polipeptídeo com o segundo Tag da afinidade no substrato da cromatografia, lavando o substrato da cromatografia para eluir o material não ligado ao substrato da cromatografia, eluindo o polipeptídeo sob as circunstâncias eficazes de eluir o polipeptídeo com o segundo Tag da afinidade, tratando então o polipeptídeo recuperado com uma prótese sob as circunstâncias eficazes para liberar o XTEN do polipeptídeo e do carregamento do material em um substrato da cromatografia capaz de capturar o XTEN mas não o Tag da afinidade, lavando o substrato da cromatografia para eluir o material não ligado ao substrato da cromatografia, eluindo o XTEN, recuperando a eluição que contém o polipeptídeo de XTEN em que o XTEN recuperado é substancialmente homogêneo no comprimento. Em uma modalidade dos métodos antecedentes descritos neste parágrafo, os primeiros e segundos Tag da afinidade são selecionados do grupo dos Tag da afinidade determinados na Tabela 7. Em uma modalidade do método, o primeiro Tag da afinidade ligado ao XTEN como uma proteína da fusão compreende a sequência RPRPRPRPRPRPR e o substrato da cromatografia usada para ligar o polipeptídeo é SP de MacroCap. Em outra modalidade dos métodos antecedentes, o primeiro Tag da afinidade ligado a um primeiro terminal do XTEN como uma proteína da fusão compreende a sequência RPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPR, o segundo Tag da afinidade ligado a um segundo terminal do XTEN compreende a sequência HHHHHHHH, o primeiro substrato da cromatografia usada para ligar o polipeptídeo é SP de MacroCap, e o segundo substrato da cromatografia usada para ligar o polipeptídeo é um metal imobilizado no substrato da afinidade (IMAC). Em outra modalidade dos métodos antecedentes, o primeiro Tag da afinidade fundido para uma sequência de clivagem fundida a um primeiro terminal do XTEN como uma proteína da fusão compreende a sequência RPRPRPRPRPRPR ou RPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPR, o segundo Tag da afinidade fundida a uma sequência de clivagem a um segundo terminal do XTEN compreende a sequência HHHHHH ou HHHHHHHH, o primeiro substrato da cromatografia usada para ligar o polipeptídeo é SP de MacroCap, o segundo substrato da cromatografia usada para ligar o polipeptídeo é um metal imobilizado no substrato de afinidade (IMAC), as sequências de clivagem compreendem uma arginina ou uma lisina (que incluem, mas não estão limitadas às sequências das Tabelas 8 e 9) e são clivadas pela tripsina, e Macrocap Q é o substrato da cromatografia usado para ligar o XTEN livre dos Tag da afinidade ou, na alternativa, o XTEN livre é captado como fluxo através da passagem da preparação tratada da prótese com uma ou mais da troca de cátion, do HIC e/ou do IMAC para capturar os produtos e a prótese da clivagem, deixando o XTEN no fluxo através, que é recuperado então como uma preparação substancialmente homogênea.

[265] Será apreciado por um versado na técnica que a ordem e as condições específicas das etapas do método variarão dependendo da composição do polipeptídeo do Tag da afinidade XTEN assim como o nível da expressão e o grau começando da contaminação de contaminadores truncados. Por exemplo, com determinadas composições de XTEN, o uso de um único Tag da afinidade ligado ao XTEN será suficiente para conseguir uma preparação em que as moléculas do polipeptídeo são substancialmente homogêneas no comprimento. Nesses casos, em uma modalidade o único Tag da afinidade é selecionado dos Tag da afinidade determinados na Tabela 7. Com outras composições de XTEN, o uso de um primeiro e um segundo Tag da afinidade serão suficientes para conseguir uma preparação em que as moléculas do polipeptídeo são substancialmente homogêneas no comprimento e nesses casos, em uma modalidade, os primeiros e segundos Tag da afinidade são diferentes e cada um é selecionado dos Tag da afinidade determinados na Tabela 7. Será apreciado ainda por um versado na técnica que uma vez que os polipeptídeos que compreendem sequências de clivagem purificadas, o polipeptídeo recuperado pode subsequentemente ser tratado por proteólises para liberar os um ou dois Tag da afinidade, seguidos pela passagem do XTEN tratado através de um substrato da cromatografia para recuperar o XTEN sem os Tags de finidade ligados. Um diagrama esquemático do método é ilustrado na FIG. 42 e as metodologias exemplares são descritas nos Exemplos. Muitas próteses diferentes podem ser utilizadas para a liberação de Tag terminais da purificação, dependendo da sequência que liga o Tag da afinidade ao XTEN, incluindo mas não sendo limitados a uma prótese selecionada da Tabela 9. Em uma modalidade, a prótese é selecionada da tripsina do grupo consistindo de tripsina, quimo tripsina, prótese do vírus do mosaico do tabaco etch (TEV), FXa, e enteroquinase. Em outra modalidade , a sequência de clivagem incorporada no polipeptídeo compreende um resíduo da arginina que possa ser clivada e o Tag da afinidade ser removido pelo tratamento com a tripsina, liberando desse modo o XTEN que subsequentemente é recuperado na forma substancialmente purificada pela cromatografia tal como, pela captação usando a troca de anion (que inclui mas não limitada o MacroCap Q) ou recuperado como fluxo através de, em que os produtos e a prótese de clivagem de não XTEN são capturados por um ou mais de HIC, da troca de cátion, ou da cromatografia de IMAC, deixando XTEN substancialmente homogêneo no fluxo. Tabela 7. Marcadores de Afinidade e Categorias de Substrato de Cromatografia que Ligam Marcadores de Afinidade Tabela 8: Sequências de Clivagem de Tripsina * X = qualquer L-aminoácido diferente de prolina Tabela 9: Proteases e sequências de clivagem de Protease ↓indica o local de clivagem *a listagem de vários aminoácidos antes, entre ou após uma barra indica os aminoácidos alternativos que podem ser substituídos na posição; "-" indica que qualquer aminoácido pode substituir o aminoácido correspondente indicado na coluna do meio **x é qualquer L-aminoácido diferente de prolina

[266] Em outra modalidade, XTEN pode ser projetado tal que uma ou ambas as marcações de afinidade ligadas aos terminais e usadas para facilitar a purificação podem continuar a fazer parte do produto final, eliminando a exigência de uma etapa de lançamento de protease. Se as marcações de purificação são projetadas para permanecer uma parte de uma droga, logo são selecionadas as sequências de marcação que não eliciem uma resposta imune pronunciada. A imunogenicidade pode ser prevista usando algoritmos de predição computacionais ou ensaios experimentais. Sequência, que evita que epítopos das células T e células B sejam preferidos. Exemplos, não limitados a esses, de sequências incorporadas ao terminal de sequências XTEN, que facilitam a captura e que opcionalmente podem permanecer associados às construções conjugadas, são fornecidos na tabela 7.

10. Composições para o Aumento da Expressão de XTEN

[267] Em outro aspecto, a invenção fornece construções compreendendo sequências de ácido polinucleico que codificam o XTEN e métodos de fazer o XTEN para uso nos conjugados do objeto, nos quais mais sequências auxiliares polinucleotídicas são adicionadas à extremidade 5' dos polinucleótidos codificando o XTEN ou são adicionadas à extremidade 5' de sequências que codificam uma marcação de afinidade ligada à extremidade 5' de sequências que codificam um XTEN para melhorar e facilitar a expressão do XTEN ou XTEN com sequências clivadas ligadas a polipeptídeos com marcação de afinidade em células hospedeiras transformadas, tais como bactérias. Exemplos de tais sequências codificadas auxiliares são dadas no Quadro 10 e nos Exemplos. Em uma encarnação, a invenção fornece uma construção de sequência polinucleotídica codificando um polipeptídeo composto por uma sequência auxiliar com pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência para uma sequência selecionada da Tabela 10 ligada ao terminal N de uma primeira marca de afinidade selecionada do grupo de sequências estabelecido na Tabela 7 que, por sua vez, ou é ligado a uma sequência de clivagem descrita neste documento ou é diretamente ligado ao terminal N de um XTEN com pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93% ou pelo menos cerca de 94% de identidade de sequência, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade com uma sequência selecionada do grupo das sequências definidas nas Tabelas 2 e 3. A invenção fornece vetores de expressão que codificam as construções úteis em métodos para produzir preparações substancialmente homogêneas de polipeptídeos e XTEN em níveis de alta expressão de vetores de expressão. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para a produção de uma população substancialmente homogênea de polipeptídeos que compreende um XTEN e uma primeira e uma segunda marca de afinidade e uma sequência auxiliar, o método composto por cultivo, em uma reação de fermentação, uma célula hospedeira que é composta por um vetor que codifica um polipeptídeo compreendendo um XTEN e a primeira e a segunda marcas de afinidade em condições eficazes para expressar o polipeptídeo tal que mais do que aproximadamente 2 g/L, ou mais de cerca de 3 g/L, ou mais de cerca de 4 g/L, ou mais de cerca de 5 g/L ou mais de cerca de 6 g/L, ou mais do que cerca de 7 gramas por litro (7 g/L) do polipeptídeo seja produzido como um componente de um produto cru de expressão da célula hospedeira, quando a reação de fermentação atinge uma densidade óptica pelo menos 130 num comprimento de onda de 600 nm. Em uma modalidade, o método compreende ainda as etapas de adsorção do polipeptídeo sobre um primeiro substrato de cromatografia sob condições eficazes para capturar a primeira marca de afinidade do polipeptídeo sobre o substrato de cromatografia; eluir e recuperar o polipeptídeo; fixar o polipeptídeo sobre um substrato de cromatografia sob condições eficazes para capturar segunda marca de afinidade do polipeptídeo sobre o substrato de cromatografia; eluir o polipeptídeo; e recuperar o polipeptídeo substancialmente homogêneo. Em uma modalidade do método acima, o vetor mais compreende ainda nucleotídeos que codificam uma seqüência de auxiliar no terminal N do polipeptídeo codificado em que a sequência de auxiliar tem pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade de sequência para uma sequência estabelecida no Quadro 10. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para a produção de uma população substancialmente homogênea de polipeptídeos que compreende um XTEN e uma primeira e uma segunda marca de afinidade e uma sequência auxiliar, o método composto por cultivo, em uma reação de fermentação, de uma célula hospedeira que é composta por um vetor que codifica um polipeptídeo compreendendo um XTEN e a primeira e a segunda marcas de afinidade em condições eficazes para expressar o produto de polipeptídeo numa concentração de mais do que aproximadamente 10 miligramas/grama de peso seco de célula hospedeira (mg/g), ou pelo menos cerca de 250 micromols/L, ou cerca de 300 micromols/L, ou cerca de 350 micromols/L ou cerca de 400 micromols/L, ou cerca de 450 micromols/L, ou cerca de 500 micromols/L do referido polipeptídeo quando a reação de fermentação atinge uma densidade óptica pelo menos 130 num comprimento de onda de 600 nm. Em uma modalidade do acima exposto, o método compreende ainda as etapas de adsorção do polipeptídeo sobre um primeiro substrato de cromatografia sob condições eficazes para capturar a primeira marca de afinidade do polipeptídeo sobre o substrato de cromatografia; eluir e recuperar o polipeptídeo; adsorver o polipeptídeo sobre um substrato de cromatografia sob condições eficazes para capturar a segunda marca de afinidade do polipeptídeo sobre o substrato de cromatografia; eluir o polipeptídeo; e recuperar o polipeptídeo substancialmente homogêneo. Em uma modalidade do método acima, o vetor mais compreende ainda nucleotídeos que codificam uma seqüência de auxiliar no terminal N do polipeptídeo codificado em que a sequência de auxiliar tem pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade de sequência para uma sequência estabelecida no Quadro 10. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para a produção de uma população substancialmente homogênea de polipeptídeos que compreende um XTEN e uma primeira e uma segunda marca de afinidade e uma sequência auxiliar, o método composto por cultivo, em uma reação de fermentação, de uma célula hospedeira que é composta por um vetor que codifica um polipeptídeo compreendendo um XTEN e a primeira e a segunda marca de afinidade em condições eficazes para expressar o produto de polipeptídeo numa concentração de mais do que aproximadamente 10 miligramas/grama de peso seco de célula hospedeira (mg/g), ou pelo menos cerca de 15 mg/g, ou pelo menos cerca de 20 mg/g, ou pelo menos cerca de 25 mg/g, pelo menos cerca de 30 mg/g, ou pelo menos cerca de 40 mg/g, ou pelo menos cerca de 50 mg/g do referido polipeptídeo quando a reação de fermentação atinge uma densidade óptica de pelo menos 130 em um comprimento de onda de 600 nm. Em uma modalidade do acima exposto, o método compreende ainda as etapas de adsorção do polipeptídeo sobre um primeiro substrato de cromatografia sob condições eficazes para capturar a primeira marca de afinidade do polipeptídeo sobre o substrato de cromatografia; eluir e recuperar o polipeptídeo; adsorver o polipeptídeo sobre um substrato de cromatografia sob condições eficazes para capturar a segunda marca de afinidade do polipeptídeo sobre o substrato de cromatografia; eluir o polipeptídeo; e recuperar o polipeptídeo substancialmente homogêneo. Em uma modalidade do método acima, o vetor mais compreende ainda nucleotídeos que codificam uma seqüência de auxiliar no terminal N do polipeptídeo codificado em que a sequência de auxiliar tem pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade de sequência para uma sequência estabelecida no Quadro 10. Em uma outra modalidade, as construções dos métodos antecedentes do parágrafo compreendem ainda os nucleotídeos que codificam sequências de clivagem do protease entre as marcas de afinidade e o XTEN e o método prevê que os polipeptídeos recuperados da preparação sejam tratados com um protease capaz de clivar as sequências de clivagem, tais como a tripsina, mas não limitados a ela, liberando desse modo o XTEN do polipeptídeo; o XTEN adsorvido sobre um substrato de cromatografia sob as circunstâncias eficazes para capturar o XTEN; o XTEN eluído e é recuperado então como um XTEN substancialmente homogêneo. Tabela 10: Exemplos de sequências de auxiliares para facilitar a expressão, a secreção e o processamento da proteína em bactérias * onde n ou m=0, os aminosácidos adjacentes são contíguos ** indica os aminoácido(s) que pode(m) ser utilizados na posição determinada nas entradas de sequência de aminoácidos, com as alternativas que separados por "/"

111) . CARGAS ÚTEIS

[268] A presente invenção refere-se em parte a conjugados XTEN ligados a uma ou mais moléculas de carga útil. Contempla-se que o XTEN pode ser ligado a uma grande diversidade de moléculas de carga útil, inclusive a peptídeos biologicamente ativos, proteínas, polímeros, pequenas moléculas farmologicamente ativas, ácidos polinucleicos direcionados a peptídeos e proteínas, direcionados a moléculas pequenas, anticorpos e fragmentos de anticorpo, e carga útil de imagem de moléculas pequenas, assim como combinações destes tipos de carga útil que têm por resultado composições com 2, 3, 4 ou mais tipos de carga útil. A invenção aborda uma necessidade antiga de aumentar a semivida terminal de carga útil de diagnóstico e terapêuticas exogenamente administradas a um sujeito que precisasse delas, assim como combinações de carga útil que podem incluir um componente terapêutico e um componente de direcionamento.

[269] Exemplos de classes funcionais dos agentes de carga útil de substâncias farmacologicamente ativas para uso em ligações a um XTEN da invenção podem ser qualquer um ou mais dos seguintes, mas não se limitam a estes: tranquilizantes hipnóticos e sedativos, médium energéticos, drogas respiratórias, anticonvulsivantes, relaxantes musculares, agentes antiparkinson (antagnonistas de dopamina), analgésicos, anti-inflamatórios, drogas anti- ansiedade (ansiolíticos), inibidores de apetite, agentes anti-enxaqueca, contratores musculares, anti-infecciosos (antibióticos, antivirais, antifúngicos, vacinas), antiartríticos, antimaláricos, antieméticos, anti- epilépticos, broncodilatadores, fatores de coagulação, citocinas, quimiocinas, interleucinas, fatores de crescimento, hormônios de crescimento, hormônios do sistema endócrino, hormônios exócrinos, insulina, peptídeos reguladores de glicose, agentes anticâncer, agentes anticoagulantes, anti-hipertensivos, drogas cardiovasculares, antiarrítmicos, antioxidantes, agentes anti-asma, agentes hormonais (incluindo contraceptivos), simpatomiméticos, diuréticos, agentes reguladores de lipídios, agentes anti-androgênica, antiparasitários, anticoagulantes, neoplásticos, antineoplásticos, hipoglicemiantes, agentes nutricionais e suplementos, suplementos de crescimento, agentes anti-enteríticos, vacinas, anticorpos, agentes de diagnóstico, agentes de contraste e agentes de imagem radioativos.

[270] Mais particularmente, a carga útil ativa pode se encaixar em uma dentre algumas classes estruturais, incluindo, mas não se limitando a estas, drogas de molécula pequena, proteínas biologicamente ativas (peptídeos, polipeptídeos, proteínas, proteínas recombinantes, anticorpos e glicoproteínas), esteroides, nucleotídeos, oligonucleotídeos, polinucleotídeos, gorduras, eletrólitos e semelhantes. Para as composições de conjugação XTEN-carga útil, contempla-se especificamente que uma carga útil pode ser um agente farmacologicamente ativo que possui um grupo funcional devidamente reativo, incluindo, mas não limitado a um grupo amino nativo, um grupo sulfidril, um grupo carboxil, um grupo aldeído, um grupo cetona, um grupo alqueno, um grupo alquino, um grupo azida, um grupo álcool, um heterociclo, ou, alternativamente, que é modificada para conter pelo menos um dos grupos reativos precedentes apropriados para acoplamento a qualquer XTEN, reticulador XTEN ou reagente de química pressionada XTEN da invenção usando qualquer um dos métodos de conjugação descritos neste documento, ou que sejam conhecidos por serem úteis na técnica de conjugar esses grupos reativos. Frações funcionais específicas e suas reatividades são descritas em Organic Chemistry, 2nd Ed. Thomas Sorrell, University Science Books, Herndon, VA (2005). Além disso, compreender- se-á que toda carga útil que contém um grupo reativo ou que está modificada para conter um grupo reativo conterá também um resíduo após a conjugação a que o XTEN, o reticulador XTEN, ou o reagente de química pressionada XTEN será ligado.

[271] Modelos de cargas úteis apropriados para a ligação covalente a um polímero de XTEN, ao reticulador XTEN, ou ao reagente de química pressionada XTEN incluem proteínas biolgicamente ativas e drogas de moléculas pequenas farmacologicamente ativas com atividade. Os modelos de drogas apropriados para as composições inventivas podem ser encontrados como determinados na oficial United States Pharmacopeia, na oficial Pharmacopeia Homeopathic of the United States, ou no oficial National Formulary, na Physician's Desk Reference (PDR) e no Orange Book, mantido pela U.S. Food and Drug Administration (FDA). As drogas preferidas são aquelas que têm o grupo funcional reativo necessário ou aquelas que podem ser prontamente derivadas para fornecer o grupo funcional reativo para a conjugação e reterão pelo menos uma parcela da atividade farmacológica da carga útil não conjugada quando conjugada ao XTEN.

1. Drogas como cargas úteis

[272] Em algumas modalidades, a carga útil da droga para conjugação ao objeto XTEN, ou aos reticuladores XTEN, ou aos reagentes de química pressionada do XTEN descritos neste documento é um ou mais agentes descritos neste documento ou selecionados das cargas úteis da Tabela 11, ou um sal, um ácido ou um derivado farmaceuticamente aceitável ou um agonista do mesmo. Em uma modalidade, a droga é derivada para introduzir um grupo reativo para a conjugação ao objeto XTEN, aos reticuladores XTEN, ou aos reagentes de química pressionada XTEN descritos neste documento. Em uma outra modalidade, a droga para a conjugação é derivada para introduzir um ligante clivável como, mas não limitado à PAB-valina-citrulina, em que o ligante é passível de ser clivado por meio de uma protease circular ou intracelular após a administração a um sujeito, livrando desse modo a droga do conjugado. Tabela 11: Drogas para a Conjugação ao XTEN

2. Proteínas Biologicamente Ativas como Cargas Úteis

[273] Em outro aspecto, a invenção fornece composições carga -XTEN em que a carga é uma proteína biologicamente ativa, como um peptídeo ou polipeptídeo. Em algumas modalidades de conjugados carga-XTEN, a carga é qualquer peptídeo farmacologicamente ativo ou polipeptídeo que possa ser expresso de maneira recombinante como uma proteína de fusão ligada a um ou mais XTEN. Em outras modalidades de conjugados carga-XTEN, a carga útil é qualquer peptídeo farmacologicamente ativo ou polipeptídeo que pode ser conjugado a um ou mais XTEN. Os conjugados podem estar em uma configuração como descrito neste documento, abaixo. O exemplo de peptídeo ou de cargas úteis de polipeptídeo destinam-se a englobar os análogos, agonistas, antagonistas, inibidores e isômeros. Compreender-se-á que os peptídeos e proteínas do sujeito englobam formas sintéticas, semi-sintéticas, recombinantes, nativas, glicosiladas e não glicosiladas, bem como fragmentos biologicamente ativos, variantes de sequência, variantes de espécies, homólogos e respectivas mutações, contanto que a proteína variante resultante mantenha uma parte da atividade da proteína parente ou nativa.

[274] Sequências de proteínas biologicamente ativas podem ser obtidas a partir de bancos de dados disponíveis publicamente, patentes, ou referências bibliográficas e outras fontes que são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, sequências podem ser obtidas a partir do Universal Protein Resourse (UniProt) /Swiss-Prot, Instituto Europeu de Bioinformática (EBI), do SIB, Swiss Institute of Bioinformatics, do Protein Information Resource (PIR). Os Números de Registro Chemical Abstracts Services (CAS) (publicados pela American Chemical Society) e/ou os números GenBank Accession (por exemplo, AAA-AZZ, HAA-HZZ, JAA-JZZ), identificadores do Modelo da Proteína, disponibilizados pelo site do National Center for Biotechnology Information (NCBI), disponível na World Wide Web em ncbi.nlm.nih.gov, que corresponde às entradas no CAS Registry ou no banco de dados do GenBank que contêm uma sequência de aminoácido da proteína ou fragmento ou variante da proteína de interesse. Para tal sequência de identificadores fornecidos neste documento, as páginas de resumo, associadas a cada um destes números CAS e GenBank e GenSeq Accession, bem como as publicações em periódicos citadas (por exemplo, PubMed ID number (PMID)) são todos incorporados em inteireza por referência, particularmente no que diz respeito às sequências de aminoácidos descritas neste documento.

[275] Em uma modalidade, a composição de carga-XTEN, seja em forma recombinante ou conjugada, é composta por uma ou mais moléculas de um peptídeo biologicamente ativo ou proteína que inclui, mas não apenas esses, a um peptídeo ou polipeptídeo selecionados a partir das cargas ativas estabelecidas na Tabela 12 ou uma variante de sequência respectiva que mantém pelo menos uma parte da atividade da proteína biologicamente ativa. Por "variante de sequência," se quer dizer que a proteína biologicamente ativa exibe pelo menos cerca de 80%, ou 90%, ou 91%, ou 92%, ou 93%, ou 94%, ou 95%, ou 96% ou 97%, ou 98% ou 99% de identidade de sequência, perfeitamente alinhadas, do peptídeo conhecido ou polipeptídeo, tais como são listadas na tabela 12. Tabela 12: Proteínas biologicamente ativas para ligação ao XTEN

3. Exemplos de Proteínas biologicamente ativas como cargas úteis

[276] Compostos proteináceos que são especificamente contemplados como cargas úteis nas composições do sujeito são os peptídeos e proteínas a seguir:

[277] "Peptídeo Natriurético de tipo C" ou "CNP" significa que a proteína humana (UniProt No. P23582) codificada pelo gene NPPC que é clivada para o peptídeo natriurético de C- tipo de 22 aminoácidos (CNP), tendo a sequência GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC, bem como espécies e variações sintéticas das mesmas, tendo pelo menos uma parte da atividade biológica do peptídeo nativo. CNP é um agonista seletivo para o receptor natriurético de tipo B (NPRB) e é relatado como um potente estimulador de crescimento de osso endocondral. CNP liga-se ao seu receptor, inicia sinais intracelulares &, finalmente, inibe a via FGFR3 hiperativa. O uso do CNP é indicado para acondroplasia, uma forma comum de displasia esquelética ou nanismo de membros curtos, e distúrbios humanos causados por mutações FGFR3, inclusive síndromes que afetam o desenvolvimento esquelético; por exemplo, hipocondroplasia [HCH], ACH, displasia tanatofórica [TD]), a pele (nevos epidérmicos, queratose seborreica, acantose nigricans) e câncer (mieloma múltiplo [MM], carcinoma da próstata e da bexiga, seminoma) (Foldynova-Trantirkova S. Hum Mutat. (2012) 33:29). A meia- vida do CNP-22 é relatada como de 2,6 min, sendo rapidamente metabolizada pela endopeptídase neutra & desmarcada por um receptor de apuramento (Prickett T., 2004, ciência clínica, 106:535), assim limitando sua utilidade.

[278] "Hormônio liberador do hormônio luteinizante" ou "LHRH" significa que a proteína humana (UniProt No. P01148) codificada pelo gene GNRH1 é processada no hipotálamo anterior pré-óptico a partir de um pré-hormônio de 92 aminoácidos para o produto linear de extremidade em decapeptídeo tendo a sequência pyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly- Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, bem como de espécies e variações sintéticas tendo pelo menos uma porção da atividade biológica do peptídeo nativo. LHRH desempenha um papel central na regulação do eixo hipófise/gonadal e, portanto, na reprodução. LHRH exerce seus efeitos através da ligação a receptores de alta afinidade sobre as células gonadotrofinas pituitárias e consequente liberação de FSH e LH. LHRH é encontrado em órgãos fora do hipotálamo e pituitária e porque uma percentagem elevada de certos tecidos de câncer têm locais obrigatórios de LHRH e porque esteroides sexuais têm sido implicados no desenvolvimento da mama e câncer de próstata, terapia hormonal com agonistas LHRH são aprovados ou são considerados para o tratamento condições dependentes do esteroide sexual, tais como câncer de mama dependente do estrogênio, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de bexiga e carcinoma da próstata dependente do andrógeno. Porque a meia-vida é relatada como menos de 4 minutos, (Redding TW, et al. The Half-life, Metabolism and Excretion of Tritiated Luteinizing Hormone-Releasing Hormone (LH-RH) in Man. J Clin Endocrinol. Metab. (1973) 37:626-631), sua utilidade como uma terapêutica é limitada.

[279] "Cilengitide" significa o sintético pentapeptide RGD cíclica, tendo a sequência Arg-Gly-Asp-Dphe-NmeVal ou o nome do químico 2-[(2S,5R,8S,11S)-5-benzil-11-{3- [(diaminomethilidene)amino] propil}-7-methil-3,6,9,12,15- pentaoxo-8-(propano-2-yl)-1,4,7,10,13- pentaazaciclopentadecano-2-yl]ácido acético (CAS N° 18896851-6). Cilengitide é seletivo para αv integrinas, que são importantes na angiogênese (formação de novos vasos sanguíneos). A ligação de tais ligantes ativa as integrinas para regular a invasão de células do tumor, migração, proliferação, sobrevivência & angiogênese. Portanto, o uso de cilengitide está sob investigação para o tratamento do glioblastoma por inibição da angiogênese (Burke P, et al. Cilengitide targeting of αvβ 3 integrin receptor synergizes with radioimmunotherapy to increase efficacy and apoptosis in breast cancer xenografts". Cancer Res (2002) 62(15): 4263 - 4272) . Porque cilengitide tem uma meia-vida curta de 3-5 h, e pouca solubilidade, limitando a concentração de fármaco máxima de 15 mg/mL (PH O'Donnell. A phase I study of continuous infusion cilengitide in patients with solid tumors. Invest New Drugs (2012) 30:604), sua utilidade como uma terapêutica é limitada.

[280] "Hormônio liberador do hormônio de crescimento" ou "HLHC" (também conhecido como fator liberador de hormônio de crescimento, FLHC, GHRF, somatoliberina ou somatocrinina", significa o hormônio peptídio de 44 aminoácidos produzido no núcleo arqueado do hipotálamo tendo a sequência YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARL, , bem como espécies e variações sintéticas dos mesmos, tendo pelo menos uma parte da atividade biológica do peptídeo nativo, incluindo o biologicamente ativo peptídeo de truncamento de 1-29 aminoácidos YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSR. GHRH é liberado de terminais nervosos neurosecretórios e é carregada pelo sistema portal hipotálamo-hipofisário à glândula pituitária anterior, onde atua no receptor GHRH para estimular a liberação de hormônio de crescimento pulsátil. O tesamorelin analógico GHRH é um medicamento aprovado para o tratamento da lipodistrofia em pacientes HIV sob terapia antirretroviral altamente ativa, e também é considerado para o uso em caquexia, obesidade abdominal em pacientes deficientes de hormônio de crescimento, perda muscular relacionada a determinadas doenças crônicas, transtorno cognitivo leve e reposição de hormônio de crescimento em pacientes deficientes de hormônio de crescimento. Porque a meia-vida é relatada para ser menos de 15 minutos, (Chapman IM. J Endocrinol (1991) 128:369374), sua utilidade como uma terapêutica é limitada.

[281] "Peptídeo YY" e "PYY" significam polipeptídeo peptídeo YY humano (UniProt No. P10082), versões sintéticas e espécies e variantes de sequência não naturais, tendo pelo menos uma parte da atividade biológica de PYY maduro. Como usado neste documento, "PYY" inclui as formas principais de toda a extensão humana, peptídeo de 36 aminoácidos, PYY1-36 e a forma PYY 3-36 predominante circular ("PYY3-36") que têm motivo estrutural de dobra de PP. PYY3- 36 tem a sequência IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2. PYY é produzido por células endócrinas especializadas (células-L) no intestino, depois que uma pessoa come e inibe a motilidade gástrica e aumenta a absorção de água e eletrólitos no cólon. PYY também pode suprimir a secreção pancreática. O PYY3-36 que ocorre naturalmente é um agonista não seletivo Y1, Y2, & Y5. Proteínas de fusão da invenção que contêm PPY podem encontrar uso específico no tratamento da diabetes para regulação de glicose, distúrbios de resistência à insulina e obesidade. Os análogos da PYY foram preparados, conforme descrito nas Patentes U.S. Nos. 5.604.203, 5.574.010 e 7.166.575. Porque a meia-vida é relatada como menor que 1 h, (ML de Addison. A role for metalloendopeptidases in the breakdown of the gut hormone, PYY 3-36. Endocrinology (2011) 152(12):4630- 4640) e é normalmente administrada por via intranasal, três vezes diariamente, sua utilidade como uma terapêutica é limitada.

[282] "Leptina" significa a leptina que ocorre naturalmente (UnitProt No. P41159) codificada pelo gene Ob(Lep), versões sintéticas e espécies e variantes de sequência não naturais tendo pelo menos uma parte da atividade biológica da leptina madura. Leptina tem a sequência de VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLA VYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASG YSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC e tem uma ponte dissulfeto entre os resíduos 97 e 147. Leptina desempenha um papel fundamental na regulação da ingestão energética e no gasto de energia, inclusive no apetite, metabolismo e peso corporal. Polipeptídeos da invenção contendo leptina podem encontrar uso específico no tratamento da diabetes para regulação de glicose, distúrbios de resistência à insulina, obesidade, lipodistrofia congênita/adquirida, lipodistrofia induzida por TAAA, amenorreia hipotalâmica. Leptina foi clonada, conforme descrito em U.S. Pat. N° 7,112,659 e os análogos de leptina e fragmentos em U.S. Pat. No. 5,203,886, U.S. Pat. N° 5.532.336, PCT/US96/22308 e PCT/US96/01471. Porque a forma comercialmente disponível, metreleptina, tem uma meia-vida relatada de 8-30 min (Klein, S., et al. Adipose tissue leptin production and plasma leptin kinetics in humans. Diabetes 45:984-987) e a maioria das terapias atuais de leptina requerem dosagem de 1 x-2x /dia, sua utilidade como uma terapêutica é limitada.

[283] "Pramlintide" significa a amilina sintética mimética tendo a sequência KCNTATCATNRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY- NH2, e variantes de sequência tendo pelo menos uma parte da atividade biológica de pramlintide ou amilina nativa. O pramlintide tem uma sequência em que aminoácidos da sequência de amilina de rato são substituídos por aminoácidos na sequência de amilina humana. Amilina é um peptídeo de 37aa secretado pelas células-b pancreáticas que é coliberado com a insulina de forma pulsátil, geralmente em uma relação molar de insulina de 100 para 1 amilina. Amilina tem a função de inibir o esvaziamento gástrico, a secreção de glucagon, promove saciedade & término de refeição (Kong MF, et al. Infusion of pramlintide, a human amylin analogue, delays gastric emptying in men with IDDM. Diabetologia. (1997) 40:82-88) . Pramlintide é usado como auxiliar à terapia de insulina em T1D e T2D e mostra melhora no controle glicêmico e na redução nas necessidades de insulina e também demonstra a modesta redução no peso corporal (MT Neary, Batterham RL.: Implications for the treatment of obesity. Pharmacology & Therapeutics (2009)124:44-56). Porque a pramlintida tem uma meia-vida relatada de 20 min (McQueen, J. Pramlintide acetate. Am. J. Health-System Pharmacy (2005) 22:2363-2372) e requer uma dosagem de 2-3x/dia, sua utilidade como uma terapêutica é limitada.

[284] "Ocitocina" significa o peptídeo hormonal de mamíferos (UniProt No. P01178) tendo a sequência CYIQNCPLG- NH2 e uma ponte dissulfeto entre os resíduos 1 e 6 e versões sintéticas, tais como a oxitocina. Ocitocina age principalmente como um neuromodelador no cérebro, tendo uma estrutura muito semelhante da vasopressina, que são os únicos hormônios conhecidos liberados pela hipófise humana posterior que agem à distância. A ocitocina tem propriedades contratoras do útero, mediadas por receptores de ocitocina específicos e de alta afinidade expressos na glândula mamária e útero; daí, portanto, seu papel no parto e lactação. Polipeptídeos contendo oxitocina da invenção podem encontrar uso específico no tratamento de autismo, síndrome do X frágil, cefaléia crônica diária e infertilidade masculina.

[285] "Relaxina" significa que o hormônio de proteína que é um heterodímero de duas cadeias peptídicas de 24 & 29 aminoácidos ligados por pontes dissulfeto, criados a partir da proteína do precursor de 185 aminoácidos (UniProt n. ° P04090); a cadeia B tendo a sequência DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS e a cadeia A, tendo a seqüência QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC, com pontes dissulfeto entre B10-A10 e B23-A24 e inclui versões sintéticas e recombinantes. Relaxina é produzida pelo corpo lúteo durante o ciclo menstrual e gravidez em mulheres e pela próstata nos homens. Relaxina organiza muitas das respostas fisiológicas maternas à gravidez, age como um vasodilator sistêmico e renal, é um protetor cardíaco & agente antifibrótico. Relaxina liga-se ao receptor de relaxina (GPCR), aumenta o cAMP & ativa PKC, PI3K & receptor de endotelina de tipo B, resultando em aumento da produção de óxido nítrico, e também ativa MAPK, que pode desempenhar um papel na expressão de VEGF relaxina induzida. Polipeptídeos contendo relaxina da invenção pode encontrar utilidade no tratamento da insuficiência cardíaca descompensada aguda (ICDA). Porque a meia-vida relatada de relaxina em seres humanos é menos de 10min (Dschietzig T, et al. Intravenous recombinant human relaxin in compensated heart failure: a safety, tolerability, and pharmacodynamic trial. J Card Fail. 2009;15:182-190), a utilidade da proteína não modificada como uma terapêutica é limitada.

[286] "Cenderitida" e "CD-NP" significa um peptídeo natirético humano tipo-C peptídeo-(32-53)-peptídeo (CNP-22) com mamba-verde-oriental (Dendroaspis angusticeps) peptídeo natriurético-(24-38)-peptídeo tendo a sequência GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGCPSLRDPRPNAPSTSA, com pontes dissulfeto entre os resíduos 6 e 22. O peptídeo quimérico tem ações vasoprotetoras e supressoras de RAAS através da ativação dos receptores de ciclase de guanilil (GC)-A e GC- B, e pode potencializar a melhoria renal e descarga cardíaca tendo efeitos hipotensores mínimos. Nesse sentido, pode ter uso no tratamento da doença cardiorrenal, tais como insuficiência cardíaca descompensada aguda (ADHF) e infarto agudo do miocárdio (IAM), particularmente durante o período de tratamento "pós-agudo ".

[287] "Peginesatide" ou "hematide" é um peptídeo composto de dois sintéticos 21 aminoácidos peptídeos tendo a seqüência GlyGlyLeuTyrAlaCysHisMetGlyProIleThr1NalValCysGlnProLeuArgS arLys que estão vinculadas em lisina com um glicol de polietileno ramificado. Peginesatide é um novelo análogo de eritropoietina que tem propriedades eritropoiéticas e está sendo desenvolvido para o uso médico como um tratamento para anemia devido a doença renal crônica (DRC) em pacientes que não estão em diálise.

[288] "Oxintomodulina" ou "OXM" significa oxyntomodulina humana, versões sintéticas e variantes de sequência da mesma tendo pelo menos uma parte da atividade biológica de oxintomodulina madura. Oxintomodulina é um peptídeo de 37 aminoácidos tendo a sequência HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA, é produzido pós- prandialmente de células-L intestinais no cólon e contém a sequência de 29 aminoácidos de glucagon, seguida por uma extensão carboxi-terminal de 8 aminoácidos. Oxintomodulina é uma agonista nos receptores de glucagon e nas BPL-1R, com seus efeitos anorexígenos provavelmente mediados via o último receptor. Foi descoberto que o OXM suprime o apetite. Polipeptídeos da invenção que contêm OXM podem encontrar uso particular no tratamento da diabetes para regulação de glicose, distúrbios de resistência à insulina, obesidade e podem ser usados como um tratamento de perda de peso. Como a oxintomodulina nativa teve uma meia-vida relatada de ~ 12 min no plasma humano (medida com um ensaio de glucagon de reação cruzada; Schjoldager BT. Oxintomodulina: um potencial hormônio do intestino distal. Farmacocinética e efeitos sobre a secreção gástrica de ácido e insulina no homem. EUR J Clin Invest. (1988) 18(5):499-503.),), a utilidade da proteína não modificada como uma terapêutica é limitada.

[289] "POT4" ou "APL-1" significa que o peptídeo cíclico sintético que tem a sequência H-Ile-[Cys-Val-Val-Gln-Asp- Trp-Gly-His-His-Arg-Cys]-Thr-NH2. POT4 é um inibidor de complemento C3 mais potente do que a compstatina, que inibe a clivagem de C3 nativo para seus fragmentos ativos C3a e C3b e estendeu-se numa meia-vida in vivo de 8 horas de circulação. Considera-se para uso para evitar a inflamação, danos e regulação positiva de fatores angiogênicos como VEGF em doenças como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI), a hemoglobinúria paroxística noturna (HPN), asma e DPOC.

[290] "Interferon-lambda", "IFN-À", interleucina-29 "e"IL- 29"significam a interleucina humana (UniProt No. Q8IU54 (20-200)), codificada pelo gene IL29 que têm a sequência GPVPTSKPTTTGKGCHIGRFKSLSPQELASFKKARDALEESLKLKNWSCSSPVFPGNWD LRLLQVRERPVALEAELALTLKVLEAAAGPALEDVLDQPLHTLHHILSQLQACIQPQPT AGPRPRGRLHHWLHRLQEAPKKESAGCLEASVTFNLFRLLTRDLKYVADGNLCLRTSTH PEST, uma recombinação dela e versões sintéticas e respectivas variantes de sequência, tendo pelo menos uma parte da atividade biológica de IL-29 maduro. Um interferon de tipo III, IL-29 sinais através de um complexo de receptor heterodímero (cadeias dedo receptor IL-10R2 & IL- 28Rα) distinto do tipo I IFN (complexo receptor IFNAR1/IFNAR2) e desempenha um papel importante na imunidade anti-viral. De maneira notável, o receptor de IL- 29 é altamente expresso em hepatócitos, o primeiro local de infecção por VHC, mas se não expressa significativamente em células imunes ou da medula óssea. Versões peguiladas versões têm uma meia-vida estimada de 50-70 h.

[291] "Interferon beta" ou "IFN-β" significa que aproteína humana codificada pelo gene IFNB1 tendo a seqüência, MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTI YEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMS SLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN eversões e variantes de sequência da mesma, recombinadas e sintetizadas tendo pelo menos uma parte da atividade biológica de IFN-β maduro. IFN-β é produzido por vários tipos de células, incluindo fibroblastos & macrófagos e medeia atividades antiviais, antiproliferativas & imunomoduladoras em resposta à infecção viral & outros indutores biológicos. A ligação do IFN-β a receptores específicos na superfície de células humanas inicia uma cascata de eventos intracelulares que leva à expressão de numerosos produtos de gene induzidos por interferon, como sintetase de 2', 5'-oligoadenilato, β2-microglobulina e neopterina. Estes produtos de genes são rotineiramente usados como biomarcadores em ambiente clínico. IFN-β é utilizado no tratamento de várias formas de esclerose múltipla (EM), incluindo recaída de EM remitente, EM progressiva secundária, MS progressiva primária, início juvenil de EM e síndromes clinicamente isoladas sugestivas de EM. Formulários de IFN-β comercialmente disponíveis relataram a meia-vida de 4 a 67h e exigem dosagem frequente, tal que sua utilidade como uma terapêutica é limitada.

[292] "Peptídeo-C" significa que a proteína humana do pâncreas que tem a sequência EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ, e versões e variantes de sequência da mesma, recombinadas e sintetizadas tendo pelo menos uma parte da atividade biológica do peptídeo-C nativo. Peptídeo-C é o segmento médio de proinsulina que está entre a cadeia-B do terminal-N e a cadeia-A do terminal-C, e é clivado da preproinsulina, como a insulina secretada. O peptídeo-C circular vincula-se a um receptor que é provável de se ligar à proteína-G, e o sinal ativa caminhos dependentes de Ca2 + intracelulares, sinalizando caminhos como MAPK, PLCy e PKC, levando a regulação positiva de uma gama de fatores de transcrição, bem como atividades eNOS e Na+K+ATPase. O peptídeo-C é considerado para o uso em complicações diabéticas e na nefropatia diabética. Já que a meia-vida relatada é de cerca de 30 minutos (Matthews DR.The half-life of endogenous insulin and C-peptide in man assessed by somatostatin suppression. Clin Endocrinol (Oxf). (1985) 23(1):71-79), a utilidade da proteína não modificada como uma terapêutica é limitada.

[293] "Grelina" significa que o hormônio humano que tem a sequência GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR em versões truncadas, em versões sintéticas e recombinantes e variantes de sequência da mesma tendo pelo menos uma parte da atividade biológica de grelina nativa, incluindo a sequência de 27 ou 28 aminoácidos nativos e processados e sequências homólogas. Grelina induz à saciedade, ou espécies e de variantes de sequência não naturais que têm pelo menos uma parte da atividade biológica de grelina madura, incluindo a sequência nativa e processada de 27 ou 28 aminoácidos e sequências homólogas. Grelina é produzida principalmente pelas células P/D1 que revestem o fundo do estômago humano e pelas células epsilon do pâncreas que estimulam a fome e é considerada como o hormônio homólogo à leptina. Os níveis de grelina aumentar antes das refeições e diminuir após as refeições e podem resultar no aumento da ingestão de alimentos e aumentar a massa gorda por meio de uma ação exercida no nível do hipotálamo. Grelina também estimula a liberação de hormônio do crescimento. Grelina é acilada em um resíduo de serina por ácido octanóico-n; esta acilação é essencial para a ligação ao receptor de GHS1a e para a atividade agonista e à capacidade de liberação de GH de grelina. Polipeptídeos contendo Ghrelin da invenção podem encontrar uso particular como agonistas; por exemplo, para estimular seletivamente a motilidade do trato GI em distúrbio de motilidade gastrointestinal, para acelerar o esvaziamento gástrico, ou para estimular a liberação de hormônio do crescimento. A invenção também contempla formas incicladas e variantes de sequência de grelina, que atuam como antagonistas. Análogos de grelina com substituições de sequência ou variantes truncadas, como descritas em U.S. Pat. N° 7.385.026, pode encontrar uso particular como parceiros de fusão para XTEN para uso como antagonistas para melhor homeostase de glicose, tratamento da resistência à insulina e tratamento da obesidade, caquexia de câncer, íleo pós-operatório, distúrbios do intestino e distúrbios gastrointestinais. O isolamento e caracterização de grelina foram relatados (Kojima M, et al., Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 1999; 402 (6762): 656-660) e análogos sintéticos foram preparados por síntese de peptídeo, como descritos na U.S. Pat. N° 6.967.237. Porque o ghrelin tem uma meia-vida terminal relatada de 10-30 minutos (Akamizu T, et al. Farmacocinética, segurança e efeitos endócrinos e do apetite da administração do ghrelin em sujeitos jovens e saudáveis. EUR J. Endocrinology (2 004)150(4) :447-455), a utilidade da proteína não modificada como uma terapêutica é limitada, com os seus análogos, na posição 3, o aminoácido serina nativo com um grupo lateral de octil, em vez do grupo lateral de octanoil nativo, pode conferir mais resistência às proteases.

[294] "Folistatina," também conhecida como "proteína de ligação de activina" ou "proteína de supressão de FSH (FSP)," significa proteínas que, em seres humanos, é codificada pelo gene FST . Como usado neste documento, "folistatina " inclui homólogos, variantes de espécies, variantes de sequência e respectivos fragmentos. O formulário maduro da proteína nos seres humanos tem 315 aminoácidos, é referido como FS-315 e foi clonado (US Pat Nos. 5,041,538 e 5,182,375). Folistatina contém dois locais potenciais de glicosilação N, Asn95 e Asn259, no entanto, foi demonstrado que a mutação nesses locais, seguido de teste do produto recombinante da sua capacidade de inibir a secreção de FSH e de fazer ligação de activina resultou em cada mutante ter uma propriedade semelhante como a não mutação recombinante hFS-315, sugerindo que a glicosilação da molécula folistatina não tem efeito nessas funções (InouyeS., et al. Mutagênese de folistatina humana de local específico. 179(1):352-358) BBRC (1991). Folistatina porcina é divulgada em Ueno et al., PNAS:USA 84:8282-8286 (1987) e folistatina bovina é divulgada em Robertson et al, em Biochem. Biophys. Res. Commun. 149:744-749 (1987). Como as proteínas morfogenéticas de osso e fatores de crescimento/diferenciação tais como a activina e a miostatina têm a capacidade de induzir o crescimento, a formação, diferenciação e manutenção de vários tecidos, incluindo ossos, cartilagem, ligamento/tendão, músculo, neural e vários órgãos, sua neutralização por folistatina e agonistas folistatina têm valor terapêutico (U.S. Pat. N°s 5.545.616, 5.041.538 e AU9675056). Como a folistatina administrada a um sujeito é rapidamente eliminada da circulação, com uma meia-vida terminal de apenas 2 horas em ratos (Kogure K, et al. Administração intravenosa de folistatina: entrega para o fígado e o efeito sobre a regeneração hepática após hepatectomia parcial. Hepatologia. (1996) 24(2):361-366), a utilidade da proteína não modificada como uma terapêutica é limitada.

[295] "Peptídeo intestinal vasoativo" e "VIP" significam que o hormônio peptídeo de 28 aminoácidos (UniProt n. ° P01282 (125-152)) codificada pelos resíduos de gene VIP que têm a sequência HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH2 e recombinantes e sintéticas versões e variantes sequenciais dos mesmos que tenham pelo menos uma parte da atividade biológica do VIP nativo. O peptídeo VIP é produzido em muitos tecidos, inclusive no intestino, pâncreas e no núcleo supraquiasmático do hipotálamo do cérebro. VIP estimula a contratilidade no coração, provoca vasodilatação, aumenta a glicogenólise, reduz a pressão arterial e relaxa a musculatura lisa da traquéia, estômago e vesícula. Mudanças na concentração estão associadas a fibrose do miocárdio, insuficiência cardíaca, cardiomiopatia e hipertensão pulmonar, e sua deficiência no sistema respiratório é considerada um fator patogênico na doença pulmonar (Said SI, 2007, circulação, 115: 1260; Said SI, 2008, Ann N Y Acad Sci, 1144:148; Petkov V et.al., 2003, J Clin Invest, 111:1339). VIP é considerado para uso no tratamento da hipertensão resistente, hipertensão arterial pulmonar primária (HAP), asma, DPOC, diabetes, disfunção erétil e a disfunção sexual feminina. Como sua meia-vida é relatada como de aproximadamente 1 minuto (Domschke S, et al. Peptídeo vasoativo intestinal no homem: farmacocinética, efeitos metabólicos e circulatórios. Gut (1978) 19:1049-1053), a utilidade da proteína não modificada como uma terapêutica é limitada.

[296] "Fuzeon" significa o peptídeo de 36 aminoácidos derivado da gp41 do HIV, uma proteína viral envolvida na fusão do HIV às células CD4+ T, tendo a sequência YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF, e versões e variantes de sequência da mesma, recombinadas e sintetizadas, tendo pelo menos uma porção da atividade de ligação de gp41 nativo. Fuzeon e respectivos multímeros oriundos ou conjugados com peptídeos relacionados são utilizados ou estão sendo considerados para uso no tratamento de formas resistentes de infecção pelo HIV. Como fuzeon tem uma meia- vida de 3,8 h em pacientes, que requerem administrações freqüentes injeção, sua utilidade é limitada.

[297] "KAI-4169" significa que o agonista do peptídeo receptor da superfície sensória de cálcio da célula humana (CaSR) sob desenvolvimento por KAI Pharma para o tratamento de hiperparatireoidismo secundário (SHPT) em pacientes com doença renal e pacientes com transtorno ósseo (CKD-MBD).

[298] “Pasireotide” significa um análogo da somatostatina tendo o nome químico [(3S,6S,9S,12R,15S,18S,20R)-9-(4- aminobutyl)-3-benzil-12-(1H-indol-3-ylmethyl)- 2,5,8,11,14,17-hexaoxo-15-fenil-6-[(4- fenilmetoxifenil)metil]-1,4,7,10,13,16- hexazabiciclo[16.3.0]henicosan-20-yl] N-(2- aminoetil)carbamato usado para o tratamento da doença de Cushing. Pasireotide é um análogo da somatostatina multirreceptor com afinidade de ligação alta para subtipos somatostatina-R R1, 2, 3 & 5 que suprime a secreção de hormônio de crescimento, IGF-1 e do hormônio adrenocorticotrófico. Além do tratamento da doença de Cushing, é também considerado para o uso na acromegalia, doença neuroendócrina, doença hepática, doença hepática policística sintomática, tumor neuroendócrino, linfangioleiomiomatose, hiperinsulinismo congênito, meningioma recorrente ou progressivo e outras doenças endócrinas. Como uma forma comercialmente disponível tem uma meia-vida relatada de 12 a 17 h (Petersenn, S. et al. Tolerability and Dose Proportional Pharmacokinetics of Pasireotide Administered as a Single Dose or Two Divided Doses em: Healthy Male Volunteers: A Single-Center, Open-Label, Ascending-Dose Study. Clinical Therapeutics (2012) 34:677-688), sua utilidade é limitada.

[299] "Irisina" significa que o produto de clivagem da proteína codificada pelo gene FNDC5, tendo a sequência DSPSAPVNVTVRHLKANSAVVSWDVLEDEVVIGFAISQQKKDVRMLRFIQEVNTTTRSC ALWDLEEDTEYIVHVQAISIQGQSPASEPVLFKTPREAEKMASKNKDEVTMKE, e recombinante, e versões sintéticas e variantes de sequência da mesma, tendo pelo menos uma parte da atividade biológica de irisina nativa. Irisina medeia efeitos benéficos do exercício muscular e induz o escurecimento do tecido adiposo branco por meio da regulação positiva da expressão de UCP1através da ativação do receptor nuclear PPARA. Níveis de irisina levemente aumentados têm mostrado ocasionar o aumento do gasto de energia, reduzir peso corporal e melhorar a resistência à insulina induzida pela dieta (Bostrom P, 2012, natureza, 481:463). Irisina é considerada para uso no tratamento da obesidade, diabetes e distúrbios metabólicos.

[300] "TXA127" e "PanCyte" são análogos de angiotensina (17), com TXA127 composto da sequência NRVYIHP e PanCyte é um análogo cíclico que liga as 4a e 7 a resíduos com dAla e Ala, respectivamente, com o resultado que é mais resistente à degradação e tem uma meia-vida mais longa. Os análogos ligam ao receptor MAS e estimulam células precursoras hematopoéticas no início da medula óssea e também tem vasodilatação, antitrófico, hiperreatividade, natriurese, efeitos anti-inflamatórios, antitrombótica. Os compostos são considerados para uso na aceleração da recuperação de plaquetas após transplante de células-tronco para pacientes com cânceres hematológicos como leucemia mielóide aguda (LMA), síndrome mielodisplásica (MDS), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mielóide crônica (LMC), leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de Hodgkin (HL), ou não- Hodgkin Linfoma (NHL) e mieloma múltiplo e uso no tratamento da fibrose pulmonar, lesão pulmonar aguda, hipertensão arterial pulmonare fibrose do fígado e rim.

[301] "Interleucina-7" e "IL-7" significa que a interleucina humana (UniProt No. P13232 (26-177)), codificada pelo gene IL7 que tem a sequência DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRA ARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKS LKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH, e sintéticos e recombinantes versões e variantes de sequência que tenha pelo menos uma parte da atividade biológica de IL-7 nativo. IL-7 IL-7 estimula a diferenciação de células-tronco hematopoiéticas multipotentes (pluripotentes) em células progenitoras linfoides, incluindo a expansão de células T CD4/CD8. IL-7 limita a produção de células T supressoras reguladoras e de anergia de células T através do antagonismo de TGF-B e apoia a produção de células T de memória central. IL-7 é considerado para o uso em de tratamento de linfopenia no HIV, oncologia, transplante, infecção pelo VHB e VHC, bem como no tratamento de doença residual mínima ou tumores avançados e pode ter funções na reconstituição imunológica ou no aperfeiçoamento da imunoterapia. Como a meia vida relatada de IL-7 em seres humanos é de aproximadamente 10 h (Sportès, C. et al. Phase I Study of Recombinant Human Interleukin-7 Administration in Subjects with Refractory Malignancy. Clin Cancer Res 2010; 16:727-735), sua utilidade na forma não modificada é limitada.

[302] "Fator fibroblástico do crescimento 18" ou "FGF-18" significa que a proteína humana (n° UniProt No. O76093(28- 207)) codificado pelo gene FGF1 8, tendo a sequência EENVDFRIHVENQTRARDDVSRKQLRLYQLYSRTSGKHIQVLGRRISARGEDGDKYAQL LVETDTFGSQVRIKGKETEFYLCMNRKGKLVGKPDGTSKECVFIEKVLENNYTALMSAK YSGWYVGFTKKGRPRKGPKTRENQQDVHFMKRYPKGQPELQKPFKYTTVTKRSRRIRPT HPA e recombinante e versões sintéticos e variantes de sequência respectivos, tendo pelo menos uma porção da atividade biológica de nativo FGF-18. FGF-18 é um membro de proteína da família do fator de crescimento de fibroblasto (FGF). Os membros da família FGF possuem atividades de sobrevivência mitogênica e da célula ampla e estão envolvidos em uma variedade de processos biológicos, desenvolvimento embrionário, crescimento celular, morfogênese, reparação dos tecidos, o crescimento do tumor e invasão. Ficou demonstrado in vitro que esta proteína é capaz de induzir a consequência natural do axônio em células PC12. O FGF-18 estimula a proliferação dos condrócitos & osteoblastos (células que produzem e mantêm ossos e cartilagens) e seu uso é considerado para a reparação e a geração da cartilagem, por exemplo nas articulações do joelho (Ellsworth JL. Fibroblast growth factor 18 is a trophic factor for maturechondrocytes and their progenitors. Osteoarthritis Cartilage (2002) 10:308320).

[303] “Hormônio Estimulante de Alfa-Melanócito” ou "α-MSH" é o ácido 13-amino peptídeo gerado como um produto de clivagem proteolítico de ACTH (1-13), que por sua vez um produto de clivagem da proopiomelanocortina (POMC), tendo a sequência N-Ac-SYSMGFRWGLPV e versões sintéticas e variantes de sequência do mesmo tendo pelo menos uma porção da atividade biológica do α-MSH nativo. O alfa-MSH é um agonista não seletivo dos receptores de melanocortina MC1, MC3, MC4 & MC5 mas não MC2 (que é exclusivo para o ACTH). O alfa-MSH estimula os melanócitos para produzir e liberar a melanina, que tem um efeito de foto-protetor; ela sinaliza ao cérebro, que tem efeitos sobre o apetite e excitação sexual. Considera-se para uso no tratamento da Protoporfiria eritropoiética (EPP, intolerante ao sol), de vitiligo não segmentar (descoloração da pele), ceratose actínica (AK, queratose solar, precursor ao câncer da pele), erupção polimorfa à luz (PLE/PMLE), danos nos rins pós-cirúrgico, disfunção erétil e disfunção sexual. Porque sua meia-vida é de meros segundos, sua utilidade em forma não modificada é limitada.

[304] A "Endostatina" significa o fragmento-terminal 20-kDa C que ocorre naturalmente derivado do colágeno do tipo XVIII (UniProt. N° P39060(1572-1754)) tendo a sequência HSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYS IVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKS VWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENS FMTASK, e recombinantes e sintéticos versões e variantes de sequência do mesmo tendo pelo menos uma porção da atividade biológica de endostatina nativa. A endostatina é um inibidor de angiogênese e pode interferir na ação de pro- angiogênico de fatores de crescimento tal como fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF/FGF-2) e VEGF. Considera-se para uso em certos tipos de câncer. Porque sua meia-vida é de 13 h (Thomas, JP et al. Phase I Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Study of Recombinant Human Endostatin in Patients With Advanced Solid Tumors. J. Clin. Oncol. (2003) 21:223-231), sua utilidade em forma não modificada é limitada.

[305] "Humanin" significa o peptídeo (UniProt n.° Q8IVG9(1- 24)) codificado pelo gene MT-RNR2, tendo a sequência MAPRGFSCLLLLTSEIDLPVKRRA, e recombinante e sintéticos versões e variantes de sequência dos mesmos tendo pelo menos uma porção da atividade biológica de humanin nativo. Humanin tem um papel na neuro-proteção contra morte celular associada com a doença de Alzheimer (AD), insultos AD- específicos, apoptose induzida por príon e dano neuronal quimicamente induzido (Hashimoto, Y, um fator de resgate abolindo a morte celular neuronal por um amplo espectro de genes da doença de Alzheimer familial e umβ . PNAS (2001) 98:6336-6341). Mais recentemente, descobriu-se que o humanin ajuda a melhorar a ação da insulina e níveis mais baixos de glicose de sangue (Muzumdar RH, Humanin: A Novel Central Regulator of Peripheral Insulin Action. PLoS One(2009) 4:e6334). O humanin é considerado para uso no tratamento da doença de Alzheimer, diabetes e doenças cardiovasculares & vasculares.

[306] "Glucagon "significa que o peptídeo de regulação de glucose humano glucagon tendo a sequência HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT e recombinante e sintéticos versões e variantes de sequência dos mesmos tendo pelo menos uma porção da atividade biológica de glucagon nativo. O termo "glucagon " como usado aqui também inclui peptídeos miméticos de glucagon. O glucagon nativo é produzido pelo pâncreas, lançado quando os níveis de glicose no sangue começam a cair muito baixo, fazendo com que o fígado converta o glicogênio armazenado em glicose e liberá-lo para a corrente sanguínea. Enquanto a ação do glucagon está oposta da insulina, o que sinaliza as células do corpo para levar na glicose do sangue, o glucagon também estimula a liberação de insulina, para que recentemente disponível glicose na corrente sanguínea pode ser pego e utilizado pelos tecidos insulinodependentes. O glucagon que contém polipeptídeos da invenção pode encontrar uso particular em aumentar os níveis de glicose do sangue em indivíduos com Glicogênio hepático existente e a manutenção da homeostase de glicose no diabetes. O glucagon foi clonado, conforme divulgado na Patente U.S N. ° 4,826,763.

[307] A "proteína-1 semelhante ao glucagon " ou "GLP-1" significa que o peptídeo-2 semelhante ao glucagon humano e sequência variantes e respectivos, tendo pelo menos uma porção da atividade biológica de GLP-1 nativo. O termo "GLP-1" inclui GLP-1(1-37) humano, tendo a amida de GLP- 1(7-36), GLP-1(7-37) e HDEFERHAEGTFTSDVSSTLEGQAALEFIAWLVKGRG de sequência. GLP-1 estimula a secreção de insulina, mas apenas durante os períodos de hiperglicemia. A segurança de GLP-1, em comparação à insulina é reforçada por esta propriedade e pela observação de que a quantidade de insulina secretada é proporcional à magnitude da hiperglicemia. A meia-vida biológica de GLP-1(7-37) OH é de apenas 3 a 5 minutos (Pat. US. N. ° 5,118,666). Os polipeptídeos que contém GLP-1 da invenção podem encontrar uso específico no tratamento de transtornos de diabetes e insulino-resistência para regulação de glicose. O GLP-1 tem sido clonado e derivados preparados, conforme descrito na Patente U.E. N. ° 5,118,666.

[308] A "proteína-2 semelhante ao glucagon " ou "GLP-2" significa, coletivamente no mesmo, peptídeo-2 semelhante ao glucagon humano tendo a sequência HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD, espécies homologas humanas GLP-2 e variantes de sequência não naturais, tendo pelo menos uma porção da atividade biológica de GLP-2 madura incluindo variantes tais como, mas não se limitando a, uma variante com glicina substituída por alanina na posição 2 da sequência madura resultante em HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD ("2G"), bem como ValGlu, Lis, Arg, Leu ou Ile substituído por alanina na posição 2. GLP-2 ou sequência variantes foram isoladas, sintetizado, caracterizadas ou clonadas, conforme descrito na Patente U.S ou Pedido n ° 5,789,379; 5,834,428; 5,990,077; 5,994,500; 6,184,201; 7,186,683;7,563,770; 20020025933; e 20030162703.

[309] A "Insulina", significa insulina humana ou um homólogo, variantes de espécies ou variantes de sequência destes o que inclui, mas não é limitado a, proteína da insulina humana madura, composta por 51 aminoácidos com um peso molecular de 5808 Da e o precursor de pró--insulina de 110 aminoácidos. A proteína do precursor é processada a insulina madura que tem uma cadeia com sequência AGIVEQCCTSICSLYQLENYCN e uma corrente B com sequência FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT ligados juntos por pontes dissulfeto.

[310] A cadeia de “Fator XIII”, “FXIIIA” ou “F13A” significa que a proteína de coagulação (UniProt N° P00488(2-732)) tendo a sequência SETSRTAFGGRRAVPPNNSNAAEDDLPTVELQGVVPRGVNLQEFLNVTSVHLFKERWDT NKVDHHTDKYENNKLIVRRGQSFYVQIDFSRPYDPRRDLFRVEYVIGRYPQENKGTYIP VPIVSELQSGKWGAKIVMREDRSVRLSIQSSPKCIVGKFRMYVAVWTPYGVLRTSRNPE TDTYILFNPWCEDDAVYLDNEKEREEYVLNDIGVIFYGEVNDIKTRSWSYGQFEDGILD TCLYVMDRAQMDLSGRGNPIKVSRVGSAMVNAKDDEGVLVGSWDNIYAYGVPPSAWTGS VDILLEYRSSENPVRYGQCWVFAGVFNTFLRCLGIPARIVTNYFSAHDNDANLQMDIFL EEDGNVNSKLTKDSVWNYHCWNEAWMTRPDLPVGFGGWQAVDSTPQENSDGMYRCGPAS VQAIKHGHVCFQFDAPFVFAEVNSDLIYITAKKDGTHVVENVDATHIGKLIVTKQIGGD GMMDITDTYKFQEGQEEERLALETALMYGAKKPLNTEGVMKSRSNVDMDFEVENAVLGK DFKLSITFRNNSHNRYTITAYLSANITFYTGVPKAEFKKETFDVTLEPLSFKKEAVLIQ AGEYMGQLLEQASLHFFVTARINETRDVLAKQKSTVLTIPEIIIKVRGTQVVGSDMTVT VQFTNPLKETLRNVWVHLDGPGVTRPMKKMFREIRPNSTVQWEEVCRPWVSGHRKLIAS MSSDSLRHVYGELDVQIQRRPSM, e recombinantes e sintéticos versões e as suas variantes de sequência tendo pelo menos uma parte de atividade biológica do FXIIIA nativo. O Fator XIII é a última cascata de coagulação e é responsável pelo grupo de ligação de moléculas de fibrina um para o outro em um coágulo de sangue recentemente formado. Através da formação de ligações covalentes intermoleculares entre monômeros de fibrina e por ligação cruzada alfa-2 antiplasmin, fibrinogen, fibronectin, colágeno, e outras proteínas para aumentar a força mecânica do coágulo de fibrina, proteger contra a degradação proteolítica, e fornecer estabilidade à matriz extracelular. O Plasma FXIII circula como um heterotetrâmero composto de subunidades 2A e subunidades 2B não covalentemente ligadas juntas e vinculadas a fibrinogênio. A subunidade B, que aparece para estabilizar a estrutura da subunidade A e para proteger a subunidade de proteólise, está normalmente presente em excesso no plasma como subunidade livre FXIII-B. A maioria dos pacientes com deficiência de FXIII têm mutações na subunidade FXIII-A; alguns casos de pacientes com mutações de subunidades FXIII-B foram relatados (Mikkola, H, 1996, Semin Thromb Hemost, 22:393; Ichinose A, 1996, Semin Thromb Hemost, 22:385). FXIIIA é usado ou considerado para uso no tratamento de hemofilia e coagulopatias relacionadas, deficiência congênita de FXIII, e deficiência adquirida de FXIII devido a doença hepática crônica, doença inflamatória do intestino, e sangramento pós-cirurgia.

[311] “Fator X” ou “FX” significa a proteína de coagulação (UniProt N° P00742(2-488)) tendo a sequência GRPLHLVLLSASLAGLLLLGESLFIRREQANNILARVTRANSFLEEMKKGHLERECMEE TCSYEEAREVFEDSDKTNEFWNKYKDGDQCETSPCQNQGKCKDGLGEYTCTCLEGFEGK NCELFTRKLCSLDNGDCDQFCHEEQNSVVCSCARGYTLADNGKACIPTGPYPCGKQTLE RRKRSVAQATSSSGEAPDSITWKPYDAADLDPTENPFDLLDFNQTQPERGDNNLTRIVG GQECKDGECPWQALLINEENEGFCGGTILSEFYILTAAHCLYQAKRFKVRVGDRNTEQE EGGEAVHEVEVVIKHNRFTKETYDFDIAVLRLKTPITFRMNVAPACLPERDWAESTLMT QKTGIVSGFGRTHEKGRQSTRLKMLEVPYVDRNSCKLSSSFIITQNMFCAGYDTKQEDA CQGDSGGPHVTRFKDTYFVTGIVSWGEGCARKGKYGIYTKVTAFLKWIDRSMKTRGLPK AKSHAPEVITSSPLK, e versões sintéticas e recombinantes e variantes de sequência das mesmas tendo pelo menos uma parte da atividade biológica de FX nativo. Fator X é ativado em fator Xa pelo fator IX (com seu cofator, fator VIII, para gerar um complexo conhecido como Xase intrínseca) e fator VII com seu cofator, fator de tecido (para gerar um complexo conhecido como Xase extrínsica). Fator X é o primeiro membro da via final comum (ou trombina). Fator X é usado para tartar a deficiência de fator X, hemoflia A & B usando estratégias de desvio devido a pacientes FVIII e FIX desenvolvendo anticorpos inibidores para terapias de reposição de FVIII e FIX), o tratamento de emergência de pacientes com hemorragias devido à overdose de anticoagulantes orais ou causas desconhecidas de sangramento grave, e pacientes que desenvolvem deficiência adquirida de FX causada por falta de vitamina K, amiloidose, doença hepática grave e uso de anticoagulantes (por exemplo, varfarina). Enquanto a meia-vida do fator X maduro é 40-45 h, a meia-vida do plasma do fator X ativado (Fxa) é <1-2 min ((Bunce MW, 2008, Blood, 117:290), tornando limitada a sua utilidade em forma não modificada, sendo rapidamente inativado por antitrombina III & TFP1.

4. Ácidos nucleicos como cargas úteis

[312] A invenção contempla também o uso de ácidos nucleicos como cargas úteis nos conjugados de XTEN. Em uma modalidade, a invenção fornece os conjugados de XTEN de carga útil, onde a carga é selecionada do grupo constituído por aptâmeros, oligonucleotideos ant isens e, os ácidos nucleicos de ribozima, os ácidos nucleicos de interferência RNA e os ácidos nucleicos de antígeno. Tais ácidos nucleicos usados como terapêutica são conhecidos na técnica Edwin Jarald, Nucleic acid drugs: a novel approach. AfricanJournal of Biotechnology Vol. 3 (12):662-666, 2004; Joanna B. Opalinska. Nucleic-acid therapeutics: basic principles and recent applications. Nature ReviewsDrug Discovery 1:503-514, 2002).

IV). RETICULADOR DE XTEN E CONJUGADOS DE XTEN DE CARGA ÚTIL E MÉTODOS DE FAZER TAIS COJUGADOS

[313] A presente invenção refere-se em parte às preparações altamente purificadas de composições conjugadas de reticulador de XTEN útil como parceiros de conjugação à qual as cargas uteis são conjugadas, conforme descrito neste documento. A invenção refere-se também às preparações altamente purificadas de cargas uteis ligadas a um ou mais XTEN usando os parceiros de conjugação de reticulador XTEN. A presente invenção abrange composições e métodos de fazer os conjugados XTEN de carga útil formados por meio da vinculação de qualquer XTEN descrito neste documento com uma carga, bem como composições reativas e métodos de fazer as composições formadas pela conjugação XTEN com um reticulador ou outros métodos químicos descritos neste documento. Especificamente pretende-se que os termos "XTEN de carga útil" e "XTEN reticulador" englobem os produtos de reação vinculada remanescentes após a conjugação dos parceiros reagente conjugação, incluindo os produtos da reação de reticulador, reagentes de química pressionada ou outros métodos descritos neste documento.

[314] Em algumas modalidades, o XTEN utilizado para criar os conjugados sujeitos compreende XTEN selecionado a partir de qualquer uma das sequências na Tabela 2, Tabela 3 e Tabelas 22-25, que possam estar ligadas ao componente de carga diretamente ou via reticuladores divulgados neste documento. Em outras modalidades, um ou mais XTEN utilizados para criar o tema conjuga individualmente compreende uma sequência XTEN tendo pelo menos aproximadamente 80% de identidade de sequência, ou alternativamente, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de sequência de identidade em comparação com um XTEN selecionado a partir de Tabelas 2, 3 e 22-25 ou um fragmento deste, quando perfeitamente alinhado com uma sequência de comprimento comparável. Em uma modalidade, os conjugados do sujeito são multiméricos em que eles compreendem uma primeira e uma segunda sequência XTEN, no qual o XTEN são iguais ou são diferentes e em que cada um individualmente é composto por uma sequência XTEN tendo pelo menos aproximadamente 80% de identidade de sequência , ou alternativamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% de identidade de sequência 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% em comparação com um XTEN selecionado a partir de tabelas 2, 3 e 22-25 ou um fragmento dos mesmos, quando perfeitamente alinhado com uma sequência de comprimento comparável. Em outra modalidade, os assunto conjugados são multiméricas em que eles compreendem uma primeira, uma segunda e uma terceira sequência XTEN, no qual o XTEN são iguais ou são diferentes e em que cada um individualmente é composto por uma sequência XTEN ter pelo menos cerca de 80% sequência identidade, ou, alternativamente, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%de identidade de sequência 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% em comparação com um XTEN selecionado de Tabelas 2, 3, 22-25 ou um fragmento dos mesmos, quando perfeitamente alinhado com uma sequência de comprimento comparável. Em outra modalidade, os assunto conjugados são multiméricas em que eles compreendem 3, 4, 5, 6 ou mais sequências XTEN, no qual o XTEN são iguais ou são diferentes e em que cada um individualmente é composto por uma sequência XTEN ter pelo menos cerca de 80% sequência de identidade, ou alternativamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%identidade de sequência 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% em comparação com um XTEN selecionado a partir de tabelas 2, 3 e 22-25 ou um fragmento de seu. Nos multiméricas conjugados, o comprimento cumulativo dos resíduos nas sequencias XTEN é maior do que aproximadamente 200 para aproximadamente 3000, ou aproximadamente 400 para aproximadamente 1000 de resíduos de aminoácidos e o XTEN podem ser idênticos ou podem ser diferentes em sequência ou em comprimento. Como usado aqui, comprimento cumulativo destina-se a englobar o comprimento total, em resíduos de aminoácidos, quando mais de um XTEN é incorporado ao conjugado.

[315] Em um aspecto, a invenção fornece composições de XTEN covalentemente ligadas a uma droga de carga pequena molécula, resultando em um conjugado de XTEN droga ("XTEN- D"). Em outro aspecto, a invenção fornece composições de XTEN covalentemente ligadas a uma proteína ativa biologicamente de carga útil que engloba peptídeos ou polipeptídeos), resultando em um conjugado XTEN de peptídeo/polipeptídeo ("XTEN-P"). Em outro aspecto, a invenção fornece composições de um ou mais XTEN recombinantes ligado a um peptídeo de carga ou polipeptídeo, resultando em uma proteína de fusão recombinante XTEN de peptídeo/polipeptídeo ("XTEN-PR "). Em outro aspecto, a invenção fornece composições de um ou mais XTEN ligados a cargas de uma ou mais drogas e uma ou mais proteínas que podem ser biologicamente ativos ou podem ser alvo de metades. Em particular, a invenção fornece XTEN-D isolado, XTEN-P, XTEN-PR e composições XTEN-D-P útil no tratamento de uma condição para que a administração de uma droga de carga e/ou proteína é conhecida na técnica de ser útil no tratamento, melhora ou prevenção de uma doença ou condição em um assunto. O XTEN-D conjugados incluem geralmente um ou mais dos seguintes componentes: 1) XTEN; 2) reticulador e 3) carga para que o XTEN é quimicamente conjugado diretamente ou pelo uso de um reticulador tais como reticuladores comercialmente disponíveis aqui descritos, ou pelo uso de reagentes de química pressionada, ou em alguns casos, pode ser criada por conjugação entre grupos reativos no XTEN de carga útil sem o uso de um ligante, conforme descrito neste documento. O XTEN-P inclui geralmente um ou mais dos seguintes componentes: 1) XTEN; 2)reticulador; e 3) carga de proteína biologicamente ativa e são também geralmente criados por conjugação com o uso de um reticulador ou reagentes de química pressionada . Os conjugados XTEN-PR geralmente são compreendidos por um ou mais dos seguintes componentes: 1) um ou mais XTEN; 2) uma sequência de espaçador e 3) carga. O XTEN-D-P incluem geralmente um ou mais dos seguintes componentes: 1) XTEN; 2) ligante opcional; 3) proteína biologicamente ativa; e 4) drogas, em que as cargas são geralmente criadas por conjugação com o uso de um reticulador ou reagentes clique- química, conforme descrito acima. No entanto, em alguns casos dos tipos precedentes de composições, a composição pode ser criada sem o uso de um reticulador desde os componentes caso contrário são quimicamente reativos.

[316] A conjugação do XTEN para cargas positivas confira várias vantagens sobre as composições resultantes em comparação com as cargas não ligadas a XTEN. Conforme descrito mais detalhadamente abaixo, não limitando as propriedades avançadas exemplos de aumentos na solubilidade total e estabilidade metabólica, suscetibilidade reduzida a proteólise em circulação, reduzido a imunogenicidade, reduziu a taxa de absorção quando administrada por via subcutânea ou intramuscular, redução da depuração pelo rim, aumento das interações com substrato, reduzida toxicidade, direcionados a entrega da carga e aumento das propriedades farmacocinéticas. Propriedades farmacocinéticas dos conjugados aumentada em comparação com carga útil não ligada a XTEN incluem meia-vida terminal (por exemplo, duplo, triplo, quatro vezes ou mais), aumento da área sob a curva (AUC) (por exemplo, 25%, 50%, 100% ou mais), diminuem o volume de distribuição, absorção mais lenta após a injeção subcutânea ou intramuscular (uma vantagem em relação a formas comercialmente disponíveis de carga que deve ser administrado por uma rota similar) tal que a Cmax é inferior, que, por sua vez, resulta em reduções de efeitos adversos da carga que, coletivamente, resulta em um maior período de tempo que uma composição de conjugação administrada a um assunto fornece atividade terapêutica. Em algumas encarnações, as composições de conjugação compreendem sequências de clivagem (descritas mais detalhadamente, abaixo) que permite uma liberação sustentada de carga útil ativa, tal que o administrado XTEN de carga útil age como um depósito quando administrada por via subcutânea ou intramuscular. Isso é especificamente contemplado que conjugados XTEN de carga útil podem exibir um ou mais ou qualquer combinação das propriedades melhoradas divulgadas neste documento. Como resultado dessas propriedades reforçadas, conjugados a XTEN de carga útil permitam menos dosagem frequente, mais adaptados de dosagem e/ou reduzida toxicidade comparada com carga não ligadas a XTEN e administrado de forma comparável. Tais conjugados XTEN de carga útil têm utilidade para tratar certas condições conhecidas na técnica a ser afetado, amenizada ou impedido pela administração da carga para um assunto em necessidade do mesmo, conforme descrito neste documento.

1. Reticuladores e reagentes azida/alquino de química pressionada para conjugação

[317] Em outro aspecto, a invenção relaciona conjugados XTEN a reticuladores resultando em conjugados de XTEN reticuladores que podem ser utilizados para preparar composições de conjugação XTEN de carga útil. Em particular, os parceiros de conjugado de XTEN reticuladores descritos neste documento são úteis para conjugação de agentes de carga útil ou superfícies tendo pelo menos um tiol, amino, carboxil, aldeído ou álcool ou qualquer outro grupo reativo disponível e adequado, como conhecido na técnica, para a reação entre os componentes aqui descritos.

[318] Em outro aspecto, a invenção refere-se aos métodos de fazer conjugados de reagentes de XTEN reticuladores e reagentes de azida/alquino XTEN de química prensada, resultando em conjugados que podem ser utilizados para preparar as composições de sujeito de XTEN de carga útil. Em particular, os métodos descritos neste documento para fazer XTEN reticuladores e reagentes de azida/alquino XTEN são úteis em que o agente de carga positiva ou uma superfície de reação tem pelo menos um tiol, amino, carboxila, aldeído, alceno, alquino, anel, álcool ou outro grupo reativo disponível para reação.

[319] Exemplares modalidades de XTEN têm sido descritas acima, incluindo as preparações de XTEN substancialmente homogêneo. A invenção fornece XTEN que servem mais como uma plataforma para que as cargas uteis podem ser conjugadas, tal que eles servem como um "transportador ", conferindo determinadas propriedades farmacocinéticas, químicas e farmacêuticas desejáveis para as composições, entre outras propriedades descritas abaixo. Em outras modalidades, a invenção fornece polinucleótidos que codificam XTEN que podem estar ligados a genes que codificam o peptídeo ou cargas de polipeptídeo que podem ser incorporadas em vetores de expressão e incorporados a hospedeiros adequados para a expressão e a recuperação das proteínas de fusão recombinantes do sujeito XTEN de carga útil.

[320] Em algumas modalidades, os componentes de XTEN conforme descrito neste documento, acima, são concebidos para incorporar um número definido de resíduos de aminoácidos reativos que podem ser reagidos com agentes reticuladores ou pode ainda conter grupos reativos que podem ser usados para conjugar cargas uteis. Em uma modalidade, a invenção fornece XTEN engenheirado por cisteína, cada qual contendo um grupo tiol reativo, são conjugados para um reticulador, resultando em um conjugado de XTEN reticulador. Em outra modalidade, invenção fornece XTEN engenheirado por lisina onde lisina, cada qual contendo um grupo ε-amino hidrofílico carregado positivamente, são conjugados para um reticulador, resultando em um conjugado de XTEN reticulador. Nas modalidades de XTEN engenheirado por cisteína, cada um compreende cerca de 1 a cerca de 100 aminoácidos cisteína, ou de 1 a cerca de 50 aminoácidos cisteína, ou de 1 a cerca de 40 aminoácidos cisteína, ou de 1 a cerca de 20 aminoácidos cisteína, ou de 1 a 10 aminoácidos cisteína ou de 1 a cerca de 5 aminoácidos cisteína, ou 9 cisteínas, ou 3 cisteínas ou um aminoácido cisteína único que está disponível para conjugação. Nas modalidades do XTEN engenheirado por lisina, cada um é composto por aproximadamente 1 a aproximadamente 100 aminoácidos lisina, ou de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos lisina, ou de 1 a aproximadamente 40 aminoácidos engenheirados por lisina, de 1 a aproximadamente 20 aminoácidos engenheirados por lisina ou de 1 a 10 aminoácidos engenheirados por lisina ou de 1 a cerca de 5 aminoácidos engenheirados por lisina, ou 9 cisteínas, ou 3 cisteínas ou uma única lisina disponível para conjugação. Em outra modalidade, o XTEN engenheirado compreende tanto a cisteína e a lisina resíduos dos intervalos ou números precedentes.

[321] Geralmente, os grupos de tiol XTEN de cisteína são mais reativos, ou seja, mais nucleofílico, em relação a reagentes de conjugação eletrofílico do que grupos amina ou hidroxila. Além disso, resíduos de cisteína são geralmente encontrados em menor número em uma proteína dada; assim, são menos susceptíveis de provocar várias conjugações dentro a mesma proteína. Resíduos de cisteína foram introduzidos nas proteínas por técnicas de engenharia genética para formar ligações covalentes para ligantes ou ligações de bissulfeto intramolecular novo formulário (Better et al (1994) J. Biol. Chem. 13:9644-9650; Bernhard et al (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; Greenwood et al (1994) TherapeuticImmunology 1:247-255; Tu et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862-4867; Kanno et al (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214; Chmura et al (2001) Proc.Nat. Acad. Sci. USA 98(15):8480-8484; Pat. U.S. No. 6,248,564).

[322] Em uma modalidade, a invenção fornece uma composição isolada, compreendendo um XTEN engenheirado pela cisteína conjugado com um reticulador, em que o reticulador é selecionado de sulfidrila-reativa reticulador homobifunctional ou heterobifunctional. Em outra modalidade, a invenção fornece uma composição isolada, que compreende um XTEN engenheirado pela lisina conjugado por um reticulador, em que o reticulador é selecionado de amina reativos reticulador homobifuntional ou heterobifuntional. A ligação cruzada é o processo de ligar quimicamente moléculas de duas ou mais ligações covalentes. O processo também é chamado de conjugação ou bioconjugação com referência à sua utilização com proteínas e outras biomoléculas. Por exemplo, as proteínas podem ser modificadas para alterar o terminal N e terminal C e cadeias laterais de aminoácidos em proteínas e peptídeos com objetivo de bloquear ou expor locais de ligação reativos, desativar funções ou alterar grupos funcionais para criar novos alvos para ligação cruzada.

[323] Em um aspecto, a invenção fornece métodos para a conjugação específica do sítio de polímero de XTEN, realizado usando resíduos de aminoácidos quimicamente ativos ou seus derivados (por exemplo, o grupo amina α do terminal N, o ε grupo amina de lisina, o grupo tiol da cisteína, o grupo carboxila de terminal C, grupos carboxila do ácido glutâmico e ácido aspártico. Grupos funcionais adequados para reações com grupos amino são cianuretos cloro primáriosa- e ε são clorocianuretos, diclorotreazinas, trezilatos, benzotriazol carbonatos, p- nitrofenil carbonatos, carbonatos triclorofenil, aldeídos, anidridos misturados , carbonilimidazoles, imidoesters, ésteres de (Harris, J. M., Herati, R. S. Polym. Prepr. (Am. Chem. Soc., Div. Polym. Chem), 32(1),154-155 (1991); Herman, S., et al. Macromol. Chem. Phys. 195, 203-209 (1994); Roberts, M. J. et. al. Advanced Drug Delivery Reviews, 54,459-476 (2002)). Ésteres N-hidroxisuccinimida (NHS-ésters e seus análogos solúveis em água e seus sulfo- NHS-ésteres) são comumente usados para conjugação de proteína (ver Fig. 2). NHS-ésteres produzem produtos de amido estável mediante reação com aminas primárias com acoplamento relativamente eficiente em pH fisiológico. As reações de conjugação são normalmente executadas em 50-200 mM fosfato, bicarbonato/carbonato, HEPES ou tampões de borato (pH entre 7 e 9) a 4°C à temperatura de 0,5 a 2 horas. Os NHS-ésteres são usados geralmente em duas a 50 vezes excesso molar de proteína. Normalmente, a concentração do reagente pode variar de 0.1-10 mM, enquanto a concentração de proteína ideal é 50-100 μM.

[324] Em outro método, dado que os polipeptídeos XTEN possuem apenas um único αde N-terminal-amino grupo, o XTEN pode ser modificado para conter εadicionais-grupos aminoácidos dos resíduos de lisina intencionalmente incorporado; sequências exemplares dos quais são fornecidas na tabela 3. O α- e e-aminoácidos grupos têm valores de pKa diferente: aproximadamente 7,6 para 8,0 para o grupo α- amino do aminoácido N-terminal e aproximadamente 10-10,5 para o grupo ε-amino da lisina. Diferença significativa nos valores de pKa pode ser usada para modificação seletiva dos grupos aminoácidos. Deprotonação de todas as aminas primárias ocorre em pH acima de pH 8.0. Neste ambiente, as propriedades nucleofílicos de aminas diferentes determinam sua reatividade. Quando deprotonado, os grupos ε-amino mais nucleofílicos das lisinas são geralmente mais reativos para eletrófilos que α-grupos aminoácidos. Por outro lado, em um pH mais baixo (por exemplo pH 6), os grupos α-amino mais ácidos são deprotonados geralmente mais do que ε- grupos aminoácidos e a ordem de reatividade é invertido. Por exemplo, a FDA aprovou a droga nova droga (pegfilgranstim) é colônia de Granulócito estimulando fator (G-CSF) modificado por ligação covalente de 20 kDa PEG- aldeído. Modificação específica de aminoácidos de N- terminal da proteína foi realizada explorando o menor pKa de α-grupo amino em comparação com ε-grupos aminoácidos das lisinas internas (Molineaux, g. Curr. Des de Arcanjo. 10, 1235-1244 (2004), Patente U.S. 5,824,784).

[325] Ospolipeptídeos de XTEN constituídos por resíduos de cisteína podem ser geneticamente modificados usando métodos recombinantes descritos (ver, por exemplo, exemplos) ou por métodos padrão conhecidos na técnica. A conjugação para grupos tiol pode ser feita usando reações altamente específicas, levando à formação de única espécie conjugado acompanhado por agentes de ligação cruzada. Os grupos funcionais adequados para reações com grupos tiol-cisteína são N-maleimidas, haloacetils e piridil dissulfetos. O grupo maleimida reage especificamente com grupos sulfidrila, quando o pH da mistura de reação está entre pH 6,5 e 7,5, formando uma ligação tioéter estável que não é reversível (ver FFIG. 3). Em pH neutro, maleimides reagem com sulfidrilas 1,000 vezes mais rápido do que com aminas, mas quando o pH é aumentado para mais de 8,5, a reação favorece aminas primárias. As maleimidas não reagem com tirosinas, histidinas ou metioninas. Para soluções de reação, tióis devem ser excluídos dos tampões de reação usados com maleimidas, como eles irão competir por sítios de acoplamento. Os maleimides em excesso na reação podem ser extintos no final de uma reação adicionando tióis livre, enquanto o EDTA pode ser incluído no tampão de ligação para minimizar a oxidação de sulfidrilas.

[326] Em outra modalidade, a invenção contempla a utilização de reagentes de haloacetil que são úteis para ligação cruzada de grupos sulfidrilas de XTEN ou cargas para preparar os assuntos conjugados. Os reagentes haloacetil mais comumente usados contêm um grupo iodoacetil que reage com grupos tióis em pH fisiológico. A reação do grupo iodoacetil com um sulfidril prossegue por substituição nucleofílica de iodo com um tiol, produzindo uma ligação tioéter estável (ver fig. 4). Usando um ligeiro excesso do grupo iodoacetil sobre o número de grupos tióis pH 8,3 garante sulfidrila seletividade. Se um grande excesso de grupo iodoacetil é usado, o grupo iodoacetil pode reagir com outros aminoácidos. Os midazoles podem reagir com os grupos iodoacetil a pH 6,9-7,0, mas a incubação deve prosseguir por mais de uma semana. Cadeias laterais de histidil e grupos aminoácidos reagem sob a forma desprotonada com grupos iodoacetil acima de pH 5 e pH 7, respectivamente. Em outra modalidade, útil para grupos sulfidrilas de reticuladores são piridil bissulfetos. Piridil dissulfetos reagem com grupos tióis uma faixa ampla do pH (o pH ideal é de 4-5) para formar ligações de bissulfeto ligando XTEN para cargas (ver fig. 5). Como um dissulfeto, conjugados preparados usando estes reagentes são cliváveis. Durante a reação, ocorrerá uma troca de bissulfeto entre a molécula-SH e o grupo 2-piridilditiol. Como resultado, a piridina-2-tiona é liberado. Estes reagentes podem ser usados como reticulador e introduzir grupos tióis em proteínas. A troca de dissulfeto pode ser realizada em pH fisiológico, embora a taxa de reação seja mais lenta.

[327] Os conjugados XTEN de carga útil ativa que compreendem peptídeos sintéticos ou polipeptídeos podem ser preparados utilizando resíduos de aminoácidos quimicamente ativos ou seus derivados; por exemplo, o αgrupo amino de terminal N, a ε-grupo amino de lisina, um grupo tiol da cisteína, o grupo carboxila do aminoácido terminal C, um grupo carboxila do ácido aspártico ou do ácido glutâmico. Cada peptídeo contém terminal N α amino grupo independentemente de uma sequência de aminoácidos primários. Se necessário, N-terminal α-amino grupo pode ficar protegido/bloqueado mediante síntese química do peptídeo ativo/polipeptídeo. O peptídeo sintético/polipeptídeo pode conter grupo(s) ε-amino adicionais de lisina que pode ser natural ou substituídos especificamente para conjugação. Conforme descrito acima, α- e ε-grupos aminoácidos podem ser seletivamente modificados em diferente pH. Outra abordagem para modificar seletivamente ou α- ou ε-grupo amino em um peptídeo sintético é uma proteção reversível dos grupos aminoácidos comdeDi terc-butílico uranila (BOC2). Por exemplo, proteção de BOC seletiva de peptídeo de vapreotide (um sintético somatostatina análogo) foi alcançado por uma modificação no pH 6 (α-grupo protegido) ou pH 8,5 ( ε-grupo protegido). O grupo amino livre restante então foi especificamente modificado por PEG-N-Hidroxisuccinimida ou PEG-aldeído. Finalmente, a proteção do COB foi removida por tratamento ácido para produzir peptídeos mono-modificado (Morpurgo, M. et al. Selective Alkylation and Acylation of α and ε Amino Groups withPEG in a Somatostatin Analogue: Tailored Chemistry for Optimized Bioconjugates. Bioconjugate Chem. 2002. 13:1238-1243)..

[328] Como as cisteínas são geralmente menos abundantes nas sequências peptídicas e proteína naturais das lisinas, o uso de cisteínas como um sítio de conjugação, que reduz a probabilidade de várias conjugações de moléculas XTEN em uma reação. Também reduz a probabilidade de desativação de proteína/peptídeo em cima de conjugação. Todavia, conjugação de sítios de cisteína muitas vezes pode ser realizada de forma bem definida, levando à formação de uma única espécie de XTEN de peptídeo-polímero ou conjugado de XTEN de polímero- polipeptídeo. Em alguns casos, cisteína pode estar ausente na sequência de aminoácidos do peptídeo para ser conjugado. Nesse caso, resíduo de cisteína pode ser adicionado ao terminal N ou terminal C do peptídeo ou recombinantes ou sinteticamente usando métodos padrão. Alternativamente, um aminoácido selecionado pode ser quimicamente ou geneticamente modificado a cisteína. Como um exemplo, a modificação serina cisteína é considerada uma mutação conservadora. Outra abordagem para introduzir um grupo tiol de peptídeos faltando cisteína é a modificação química de εo grupo amino de lisina- usando reagentes tiolante tais como 2-iminotiolano (reagente do Traut), SATA (N-succinimidil S-acetiltioacetato), SATP (N-succinimidil S-acetiltiopropionato), SAT-PEO4-Ac (N-S succinimidil- acetil (tiotetraetileno glicol)), SPDP (N- Succinimidil 3- (2-piridilditio)propionato), LC-SPDP (Succinimidil 6-(3'- [2-piridilditio]propionamido)hexanoato) (descrito mais plenamente abaixo). Uma vez que um grupo tiol único é introduzido do peptídeo, ele pode ser seletivamente modificado por compostos contendo sufidril-reativo como N- maleimidos, haloacetils e piridil dissulfetos, conforme descrito acima.

[329] A conjugação entre o polipeptídeo XTEN e um peptídeo, proteína ou carga útil de droga de pequena molécula pode ser alcançada por uma variedade de químicos de enlace, incluindo zero comprimento disponível comercialmente, homo - ou hetero-bifuncional e compostos reticuladores multifuncionais, de acordo com métodos conhecidos e disponíveis na técnica, tais como aqueles descritos, por exemplo, em R. F. Taylor (1991) "imobilização da proteína. Fundamentos e aplicações ", Marcel Dekker Inc., NY; G. T. Hermanson et al. (1992) R. F. Taylor (1991) “Protein immobilization. Fundamentals and Applications”, Marcel Dekker Inc., N.Y.; G. T. Hermanson et al. (1992) “Immobilized Affinity Ligand Techniques”, Academic Press, San Diego; G. T. Hermanson (2008) “Bioconjugate Techniques”, 2nd. ed. Elsevier, Inc., S. S. Wong(1991) “Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”, CRC Press, Boca Raton. Agentes de ligação cruzada adequados para uso em preparar os conjugados da divulgação são comercialmente disponíveis de empresas como a Sigma- Aldrich, Thermo Fisher Scientific (Pierce Protein Research Products), Invitrogen, ProteoChem, G-Biosciences. Modalidades preferenciais de reticuladores compreendem um grupo funcional do tiol-reativo ou um grupo funcional amino reativo. Uma lista de exemplares reticuladores é fornecida na Tabela 13. Tabela 13: Reticuladores exemplares

[330] Exemplos não limitativos de agentes de ligação cruzada são ABH (p-Azidobenzoil hidrazido), AMAS (N-(α- Maleimidoacetoxi)-succinimidaester), ANB-NOS (N-5-Azido-2- nitrobenziloxi-succinimida), APDP (N-(4-[p- Azidosalicilamido]butil)-3'-(2'-piridilditio) propionamida), ASBA (4-(p-Azidosalicilamido)-butilamina), BASED (Bis (β-[4-azidosalicilamido]etil) dissulfeto), BMB (1,4-Bis-Maleimidobutano), BMDB (1,4 Bismaleimidil-2,3- dihidroxibutano), BMH (Bis-Maleimidohexano), BMOE (Bis- Maleimidoetano), BMPH (N-(ácido β-Maleimidopropionico )hidrazido), BMPS (N-(β- Maleimidopropiloxi)succinimidaester), BM(PEG)2 (1,8-Bis- Maleimidodietileno-glicol), BM(PEG)3 (1,11-Bis- Maleimidotrietileneglicol), BS2G (Bis (sulfosuccinimidil)glutarato), BS3 (Sulfo-DSS) (Bis (sulfosuccinimidil)suberato), BS[PEG]5 (Bis (NHS)PEG5), BS(PEG)9 (Bis (NHS)PEG9), BSOCOES (Bis(2- [succinimidoxicarboniloxi]etil)sulfona), C6-SANH (C6- Succinimidil 4-hidrazinonicotinato acetona hidrazona), C6- SFB ( C6-Succinimidil 4-formilbenzoato), DCC (N,N- Diciclohexilcarbodiimida), DFDNB (1-5-Difluoro-2,4- dinitrobenzeno), DMA ( Dimetil adipimidato), DMP (Dimetil pimelimidato), DMS (Dimetil suberimidato), DPDPB (1,4-Di- (3'-[2'piridilditio]propionamido) butano), DSG (Disuccinimidil glutarato), DSP (Ditiobis(succimidilpropionato), Reagente de Lomant ), DSS (Disuccinimidil suberato), DST (Disuccinimidil tartarato), DTBP (Dimetil 3,3'-ditiobispropionimidato), DTME (Ditiobis- maleimidoetano), DTSSP (Sulfo-DSP) (3,3'-Ditiobis (sulfosuccinimidilpropionato)), EDC (1-Etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida cloridrato), EGS (Etileno glicol bis(succinimidilsuccinato)), EMCA (ácido N-ε- EMCH (N-( ε-Maleimidocaproico EMCS (N-(ε- Maleimidocaproiloxi)succinimidaester), GMBS (N-(y- Maleimidobutiriloxi)succinimidaester), KMUA (ácido N -K- Maleimidoundecanoico ), KMUH (N-ácido K- Maleimidoundecanoico )hidrazido), LC-SDA (NHS-LC- Diazirino), LC-SMCC (Succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato)), LC-SPDP (Succinimidil 6-(3'-[2- piridilditio]propionamido)hexanoato), MBS (m- Maleimidobenzoil- N-hidroxisuccinimida éster), MPBH (4-(4-N- Maleimidofenil)-butirico acid hidrazido), NHS-ASA (N- Hidroxisuccinimidil-4-azidosalicilico acid), PDPH (3-(2- Piridilditio)propionilhidrazido), PMPI (N-(p- Maleimidofenil)isocianato), SADP (Succinimidil (4- azidofenil ditio) propionato), SAED (Succimidil 2-[7-azido- 4-metilcoumarino-3-acetamido]etil-1,3'-ditiopropionato), SAND (Succinimidil-2-(m-azido- o-nitrobenzamido)etil 1,3'- ditiopropionato), SANH (Succinimidil 4-hidrazinonicotinato acetona hidrazona), SANPAH (N-Succinimidil 6-(4'-azido-2'- nitrofenilamino)hexanoato), SASD (Succinimidil-2-(p- azidosalicilamido)etil-1,3-ditiopropionato), SBAP (Succinimdil 3-(bromoacetamido)propionato), SDA (NHS- Diazirino), SDAD (NHS-SS-Diazirino), SFAD (Succinimidil(perfluoroazidobenzamido)etil 1,3'- ditiopropionato), SFB (Succinimidil 4-formilbenzoato), SHTH (Succinimidil 4-hidrazidotereftalato), SIA ( N-succinimidil iodoacetato), SIAB (N-Succinimidil(4- iodoacetil)aminobenzoato), SMPB (Succinimidil 4-(p- maleimidofenil) butirato), SMCC (Succinimidil 4-(N- maleimida-metil)ciclohexano-1-carboxilato), SM[PEG]2 (NHS- PEG2-Maleimida), SM[PEG]4 (NHS-PEG4-Maleimida), SM(PEG)6 (NHS-PEG6-Maleimida), SM[PEG]8 (NHS-PEG8-Maleimida), SM[PEG]12 (NHS-PEG12-Maleimida), SM(PEG)24 (NHS-PEG24- Maleimida), SMPB (Succinimidil 4-(p-maleimida- fenil)butirato), SMPH (Succinimidil-6-(β- maleimidopropionamido)hexanoato), SMPT (4- Succinimidiloxicarbonil-metil-α-(2-piridilditio)tolueno), SPB (Succinimidil-(4-psoralen-8-iloxi)butirato), SPDP (N- Succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato), Sulfo-DST (Sulfodisuccinimidil tartrate), Sulfo-EGS (Etileno glicol bis (sulfo-succinimidil succinato)), Sulfo-EMCS (N-(ε- Maleimidocaproiloxi)sulfosuccinimidaester), Sulfo-GMBS (N- (Y-Maleimidobutriloxi)sulfosuccinimidaester), Sulfo-HSAB (N-Hidroxisulfosuccinimidil-4-azidobenzoato), Sulfo-KMUS (N- (K-Maleimidoundecanoiloxi)sulfosuccinimidaester), Sulfo- LC-SDA (Sulfo-NHS-LC-Diazirino), Sulfo-LC-SMPT (Sulfosuccinimidil 6-(α-metil- α-[2-piridilditio]- toluamido)hexanoato), Sulfo-LC-SPDP (Sulfosuccinimidil 6- (3'-[2-piridilditio]propionamido)hexanoato), Sulfo-MBS (m- Maleimidobenzoil- N-hidroxisulfosuccinimidaester), Sulfo- NHS-LC-ASA (Sulfosuccinimidil(4-azido-salicilamido) hexanoato), Sulfo-SADP (Sulfosuccinimidil (4-azidofenil ditio) propionato), Sulfo-SAED (Sulfosuccimidil 2-[7-azido- 4-metilcoumarino-3-acetamido]etil-1,3'-ditiopropionato), Sulfo-SAND (Sulfosuccinimidil-2-(m-azido-o- nitrobenzamido)etil 1,3'-ditiopropionato), Sulfo-SANPAH (Sulfosuccinimidil 6-(4'-azido-2'- nitrofenilamino)hexanoato), Sulfo-SASD (Sulfosuccinimidil- 2-(p-azidosalicilamido)etil-1,3-ditiopropionato), Sulfo-SDA (Sulfo-NHS-Diazirino), Sulfo-SDAD (Sulfo-NHS-SS-Diazirino), Sulfo-SFAD (Sulfosuccinimidil(perfluoroazidobenzamido)etil 1,3'-ditiopropionato), Sulfo-SIAB (Sulfosuccinimidil(4- iodo-acetil)aminobenzoato), Sulfo-SMCC (Sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato), Sulfo-SMPB (Sulfosuccinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirato), THPP (β- (Tris[hidroximetil]fosfina) propiônico acid (betaina)), TMEA (Tris-(2-Maleimidoetil)amine), TSAT (Tris-(succinimidil aminotriacetato)).

[331] Em algumas modalidades, conjugados XTEN de carga útil usando reagentes de ligação cruzada introduzem braços espaçador não-naturais. No entanto, em casos onde uma ligação peptídica nativa é preferencial, a invenção que fornece uma reação pode ser realizada usando reticulador de zero-comprimento que atuam através da ativação de um grupo carboxilato. Nas respectivas modalidades, para alcançar a seletividade da reação, o primeiro polipeptídeo deve conter apenas um grupo carboxila terminal C livre enquanto todas as cadeias laterais de lisina, ácido glutâmico e ácido aspártico são protegidas e o segundo peptídeo/proteína terminal N aminaα tem de ser o único grupo amino desprotegido disponíveis (o que exige que qualquer lisina, face ou glutaminas protegidas). Em tais casos, o uso de sequências família XTEN AG da tabela 2 que estão sem ácido glutâmico como o polipeptídeo primeiro no XTEN de carga útil ou XTEN reticulador é preferencial. Nesse sentido, em uma modalidade, a invenção fornece XTEN reticulador e XTEN de carga útil composto por sequências de AG XTEN no qual as composições são conjugadas para cargas usando um reticulador de comprimento zero. Exemplares reticuladores de comprimento zero, utilizados nas modalidades incluem mas não estão limitados a DCC (N, N-Diciclohexicarbodiimida) e EDC (cloridrato de 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida) qual os reticuladores são usados diretamente para conjugar grupos carboxil funcionais de uma molécula (tais como uma carga) para a amina primária de outra molécula, como uma carga com o grupo funcional (ver fig. 6). Sulfo-SNS (N-hidroxisulfosuccinimida) e NHS (N- Hidroxisuccinimida) são utilizados como catalisadores para conjugação, aumentando a eficiência da reação (Grabarek Z, Gergely J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. (1990) Anal. Biochem. 185(1), 131-135). O EDC reage com o grupo ácido carboxílico e ativa do grupo carboxila para formar um Ó-acilisourea ativo intermediário, permitindo-lhe ser acoplados ao grupo amino na mistura reacional. O intermediário O-acilisourea é instável em solução aquosa, tornando-o ineficaz em procedimentos de conjugação de duas etapas sem aumentar a estabilidade do intermediário usando N-Hidroxisuccinimida. Este intermediário reage com uma amina primária para formar um derivado de Amida. A reação de ligação cruzada é geralmente realizada entre pH 4,5 a 5 e requer apenas alguns minutos para muitas aplicações. No entanto, o rendimento da reação é semelhante a pH de 4,5 a 7,5. A hidrólise de EDC é uma reação de concorrente durante o acoplamento e é dependente da composição de tampão, pH e temperatura. Ácido 4- Morfolinoetanesulfonico (MES) é um tampão da reação carbodiimida eficaz. Tampões de fosfato reduzem a eficiência da reação da EDC, mas aumentam a quantidade de EDC pode compensar a redução da eficiência. Tris, glicina e tampões de acetato não podem ser usados como tampões de conjugação.

[332] A invenção fornece também composições em que três XTENs estão ligados por reticuladores trivalentes, resultando em conjugados triméricos de XTEN reticuladores. Reticuladores triméricos podem ser criados conectando um núcleo trivalente simétrico como amina terciária, metano trisubstituido ou 1, 3,5 benzeno trisubstituido ou molécula assimétrica trivalente tal um dipeptídeo LisLis ou um dipeptídeo GluGlu ou um dipeptídeo AspAsp ou um tripeptídeo CysCysCys por espaçadores com vários grupos de lado reativo descritos na tabela 14, usando as técnicas padrão de conjugação. Em uma modalidades, a invenção fornece composições em que três XTENs estão covalentemente ligados por um reticulador trivalente selecionado do grupo constituído tiol-reativa-Tris (2-Maleimidoetil) amina (TMEA), Amina-reativo Tris-(succimimidil aminotricetato) (North) e os reticuladores estabelecidos na Tabela 14. Tabela 14: Reticuladores Trivalentes * Um dos núcleos trivalentes + qualquer um do Grupo 1 + qualquer um do Grupo 2 + qualquer um do Grupo 3

[333] Em outras modalidades, XTEN e cargas úteis podem ser conjugados usando um amplo grupo de reticuladores, incluindo os constituídos por um braço de espaçador (linear ou ramificado) e duas ou mais extremidades reativas capazes de anexar a grupos funcionais específicos (por exemplo, aminas primárias, sulfidrilas, etc.) em proteínas ou outras moléculas. Reticuladores lineares podem ser homobifunctional ou heterobifunctional. Homobifunctional reticuladores tem dois grupos reativos idênticos que são usados para ligação cruzada de proteínas em um processo de reação de passo. Exemplos de não-limitação de amina reativos homobifunctional são reiculadores BS2G (glutarato de Bis (sulfosuccinimidil)), BS3 (Sulfo-DSS) (Bis (sulfosuccinimidil) suberato), BS [PEG] 5 (Bis (NHS) PEG5), BS (PEG) 9 (Bis (NHS) PEG9), BSOCOES (Bis(2- [succinimidoxicarboniloxi]etil)sulfona), DFDNB (1-5- diflúor-2,4-dinitrobenzeno), DMA (dimetil adipimidato ), DMP (dimetil pimelimidato ), DMS (dimetil suberimidato), (Ditiobis(succimidilpropionato) ( reagente de Lomant ), DSS (Disuccinimidil suberato), DST (Disuccinimidil tartarato)DTBP (dimetil 3, 3'-ditiobispropionimidato), DTSSP (Sulfo-DSP) (3, 3'-Ditiobis (sulfosuccinimidilpropionato)), EGS (bis(succinimidilsuccinato)) de etileno glicol, Sulfo-EGS (glicol de etileno bis (succinimidil-sulfo succinato)).

[334] Além disso, são exemplos de reticuladores homobifunctionais empregados nas composições e nos métodos para criar as composições XTEN de carga útil e/ou composições de XTEN são agentes sulfidrila - reativos como BMB (1,4-Bis-Maleimidobutano), BMH (Bis-Maleimidohexano), BMDB (Bismaleimidil 1,4-2,3-dihidroxibutano), BMOE (Bis- Maleimidoetano), BM (PEG) 2 (1,8-Bis-Maleimidodietileno- glicol), BM (PEG) 3 (1,11-Bis-Maleimidotrietilenoglicol), DPDPB (1,4-Di-(3'-[2'piridilditio]propionamido) de butano), DTME (Ditiobis-maleimidoetano).

[335] Para a criação de conjugados XTEN reticulador para subsequente conjugação para cargas úteis, bem como a criação de conjugados XTEN de carga útil, reticuladores heterobifuncionais são preferidos como as reações sequenciais pode ser controlada. Os reticuladores heterobifunctionais possuem dois grupos reativos diferentes, a sua utilização nas composições sequencial permite a conjugação de duas etapas. Um reagente heterobifuncional é feito reagir com uma primeira proteína utilizando o grupo mais lábil. Em uma modalidade, a conjugação do reticulador heterobifuncional a um grupo reativo em uma XTEN resulta num conjugado XTEN-reticulador. Após conclusão da reação e remoção do excesso de reticulador que não reagiu, a proteína modificada (tal como o XTEN-reticulador) podem ser acrescentados à carga útil que interage com um segundo grupo reativo do reticulador, resultando num conjugado de XTENde carga útil. O mais geralmente usado heterobifuncional reticuladores contém um grupo amino-reativo numa extremidade e um grupo sulfidrilo reativo na outra extremidade. Por conseguinte, estes reticuladores são adequados para uso com XTEN de cisteína ou de engenharia de lisina, ou com o grupo alfa-amino do terminal N do XTEN. Exemplos não limitativos de reticuladores heterobifuncionais são AMAS (N-(α- Maleimidoacetoxi)-succinimidaester), BMPS (N-(β- Maleimidopropiloxi)succinimidaester), EMCS (N-(ε- Maleimidocaproiloxi)succinimidaester), GMBS (N-(y- Maleimidobutiriloxi)succinimidaester), LC-SMCC (Succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxi- (6-amidocaproato)), LC-SPDP (Succinimidil 6-(3'-[2- piridilditio]propionamido)hexanoato), MBS (m- Maleimidobenzoil- N-hidroxisuccinimida éster), SBAP (Succinimdil 3-(bromoacetamido)propionato), SIA (N- succinimidil iodoacetato), SIAB (N-Succinimidil(4- iodoacetil)aminobenzoato), SMPB (Succinimidil 4-(p- maleimidofenil) butirato), SMCC (Succinimidil 4-(N- maleimida-metil)ciclohexano-1-carboxilato), SM[PEG]2 (NHS- PEG2-Maleimida), SM[PEG]4 (NHS-PEG4-Maleimida), SM(PEG)6 (NHS-PEG6-Maleimida), SM[PEG]8 (NHS-PEG8-Maleimida), SM[PEG]12 (NHS-PEG12-Maleimida), SM(PEG)24 (NHS-PEG24- Maleimida), SMPB (Succinimidil 4-(p-maleimida- fenil)butirato), SMPH (Succinimidil-6-(β- maleimidopropionamido)hexanoato), SMPT (4- Succinimidiloxicarbonil-metil-α-(2-piridilditio)tolueno), SPDP (N-Succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato), Sulfo- EMCS (N-(ε -Maleimidocaproiloxi)sulfosuccinimidaester), Sulfo-GMBS (N-(Y—Maleimidobutriloxi)sulfosuccinimidaester), Sulfo-KMUS (N -(K- Maleimidoundecanoiloxi)sulfosuccinimidaester), Sulfo-LC- SMPT (Sulfosuccinimidil 6-(α-metil- α-[2-piridilditio]- toluamido)hexanoato), Sulfo-LC-SPDP (Sulfosuccinimidil 6- (3'-[2-piridilditio]propionamido)hexanoato), Sulfo-MBS (m- Maleimidobenzoil- N-hidroxisulfosuccinimidaester), Sulfo- SIAB (Sulfosuccinimidil(4-iodo-acetil)aminobenzoato), Sulfo-SMCC (Sulfosuccinimidil 4-(N- maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato), Sulfo-SMPB (Sulfosuccinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirato). An example of a heterobifunctional reticulador that allows covalent conjugation of amine- and sulfidril-containing molecules is Sulfo-SMCC (SulfoSulfosuccinimidil 4-(N- maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato). Sulfo-SMCC é um análogo solúvel em água do MCCS que pode ser preparado em tampões aquosos até à concentração de 10 mM. O anel de ciclohexano, no braço espaçador deste reticulador diminui a taxa de hidrólise do grupo de maleimida em comparação com os reagentes semelhantes que não contenham este anel. Esta característica permite que XTEN que foram activados com maleimida-SMCC e sulfo-SMCC para ser liofilizada e armazenada para posterior conjugação de uma molécula contendo um grupo sulfidrilo. Assim, numa forma de realização, a invenção proporciona um XTEN-reticulador tendo um XTEN possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência, ou, pelo menos, cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94 %, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% de identidade de sequência, ou é idêntico a uma sequência ou a um fragmento de uma sequência selecionada a partir do Quadro 3, quando otimamente alinhado , em que XTEN-reticulador tem uma ou mais reticuladores de sulfo-SMCC ligado ao grupo α-amino do XTEN ou o ε-amina de um XTEN engenharia de lisina. Numa outra forma de realização, a invenção proporciona um XTEN- reticulador tendo um XTEN possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência, ou, pelo menos, cerca de 90%, ou cerca de 91%, ou cerca de 92%, ou cerca de 93%, ou cerca de 94%, ou cerca de 95%, ou cerca de 96%, ou cerca de 97%, ou cerca de 98%, ou cerca de 99% de identidade de sequência, ou é idêntico a uma sequência ou a um fragmento de uma sequência selecionada a partir do Quadro 2, quando alinhadas de forma ótima., em que o XTEN reticulador tem um sulfo-SMCC SMCC ligado ao grupo amino do terminal N do XTEN. O anterior descreveu reticuladores heterobifuncionais conjugar duas moléculas através de uma única amina e uma única cisteína. Um tipo especial de reticulador foi desenvolvido para a conjugação específica do sítio de pontes dissulfeto em proteínas (Balan S. et al. Site-specific PEGylation of protein dissulfeto bonds using a three-carbon bridge. (2007) Bioconjugate Chem. 18, 61-76; Brocchini S. et al. Disulfide bridge based PEGylation of proteins. (2008) Advanced Drug Delivery Reviews 60, 3-12). Em primeiro lugar, o ligante é sintetizada como um específico para amina 4-[2,2-bis[p- tolilsulfonil)metil]acetil) ácido benzoico-NHS éster. Esta molécula pode ser covalentemente ligada ao grupo amino de XTEN originando XTEN-Bis(sulfona). A incubação desta última molécula em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,8, resultará na eliminação do tolueno sulfínico para gerar XTEN-a,e-não saturado β’-monosulfona. A molécula resultante vai reagir com uma proteína contendo dissulfeto de carga da ponte de uma forma específica de sítio. Em um primeiro passo, a ponte dissulfeto é convertido em dois tióis por redução. Num segundo passo, o XTEN monosulfona-bis- alquilados resultantes duas cisteínas numa ponte de três carbono quimicamente estáveis. O mesmo a,e—não saturado β‘- monosulfona pode ser usado não só para a conjugação de dois grupos tiol derivado de uma ponte dissulfeto, mas também para a conjugação de etiquetas de poli-histidina (Cong Y. et al. Site-specific PEGylation at histidine tags. (2012) Bioconjugate Chem. 23, 248-263).

[336] Conjugação usando composições XTEN reticuladores com o sulfo-SMCC é geralmente realizada em um processo de duas etapas. Em uma modalidade, a proteína que contêm amina é preparada em tampão de conjugação de, por exemplo, tampão de fosfato salino (PBS = 100 mM de fosfato de sódio, cloreto de sódio de 150 mM, pH 7,2) ou um tampão comparável de amina sulfidrila livre e no pH 6,5-7,5. A adição de EDTA a 1-5mM ajuda a quelar metais divalentes, reduzindo assim a formação de dissulfeto na proteína contendo sulfidrila. A concentração da proteína contendo amina determina o excesso molar de reticulador para ser usado. Em geral, em proteínas amostras de < 1 mg / ml utilizam um excesso molar de 40-80- vezes, amostras da proteína de 1-4mg/ml utilizam um excesso molar 20 vezes e amostras da proteína de 5-10 mg/ml utilizam um 5 - a 10 vezes molar excesso do reticulador. A mistura de reação (amina-contendo proteínas e reticulador) é incubada por 30 minutos em temperatura ambiente ou 2 horas a 4°C e em seguida o reticulador em excesso é removido usando uma coluna de dessalinização incubada com tampão de conjugação. No caso de preparar um XTEN reticulador, a composição seria realizada nesse ponto. Em modalidades onde o XTEN reticulador é conjugado a uma carga, a carga que contêm sulfidrila e o conjugado XTEN reticulador são misturados em uma relação molar correspondente que desejado para o conjugado final (tendo em conta o número de reticuladores esperados conjugado com um ou mais grupos aminoácidos por molécula do XTEN) e consistente com o grupo sulfidrila único que existe na carga. A mistura de reação é incubada em temperatura ambiente por 30 minutos ou 2 horas a 4°C. Eficiência de conjugação pode ser estimada por SDS-PAGE, seguido pela proteína coloração ou por técnica de cromatografia analítica apropriados tais como cromatografia em fase reversa HPLC ou permuta de cátion/anion.

[337] Em uma modalidade, a invenção fornece composições conjugadas XTEN reticulador, criadas usando os reticuladores que são polivalentes, resultando em composições que têm XTEN 2, 3, 4, 5, 6 ou mais. Em outra modalidade, a invenção fornece composições de conjugado XTENde reticuladores de carga útil criadas usando o reticuladores que são polivalentes, resultando em composições que tem 2, 3, 4, 5, 6 ou mais XTEN ligado 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais diferentes cargas. Exemplos não- limitação de reticulaores trifuncional multivalentes são TMEA sulfidrila-reativa "Em forma de Y" (-(2- Maleimidoetil)amin) dede Tris e amina reativos North (Tris- (succimimidil aminotricetato). Qualquer combinação de partes reativas pode ser projetada usando um polímero de andaime, linear ou ramificado, por composições multivalentes. Exemplos são mostrados na FIG. 7, no qual as construções podem ter qualquer combinação de grupos reativos homo - ou heterofunctional. De particular interesse são as configurações triméricas, mostradas esquematicamente em figos, 21-23 e 97-105 e configurações tetraméricas, mostradas na FIG. 21 e 105-106. Não deseja ser vinculada por uma teoria particular, uma composição conjugada tendo três XTEN ligados por um ligante trifuncional (com cargas ligadas, em vez de XTEN através de resíduos de lisina ou cisteína incorporados) pode utilizar o XTEN proporcionalmente mais curto para cada "braço" da construção, em comparação com uma composição de XTEN de carga útil monovalente, no qual o mesmo número de cargas é ligado à cisteína incorporada ou lisina ou resíduos de aminoácidos N-terminal de cada XTEN, e a composição de XTEN de carga útil trimérica resultante terá um peso de molecular aparente comparável e raio hidrodinâmico como composição monomérica XTEN de carga útil, ainda terá menor viscosidade, auxiliando a administração da composição do objeto através de agulhas de pequeno calibre e fornecerá potência igual ou melhor das cargas devido à reduzido estérico e maior flexibilidade da composição em relação à composição monomérica XTEN de carga útil tendo um número equivalente de aminoácidos de XTEN.

[338] Em uma modalidade, a invenção fornece uma composição compreendendo três XTEN ligados por um reticulador trivalente em que uma solução contendo cerca de 100 mg/ml de proteína da composição tem uma viscosidade que é pelo menos uns 5 cP, ou aproximadamente 6 cP, ou aproximadamente 7 cP, ou aproximadamente 8 cP, ou cerca de 9 cP, ou aproximadamente 10 cP mais baixo do que o correspondente XTEN linear de igual peso molecular e concentração. Em outra modalidade, a invenção fornece uma composição que inclui quatro XTEN ligados por um reticulador tetravalente em que uma solução contendo cerca de 100 mg/ml de proteína da composição tem uma viscosidade que é pelo menos uns 5 cP, ou aproximadamente 6 cP, ou aproximadamente 7 cP, ou aproximadamente 8 cP, ou aproximadamente 9 cP, ou aproximadamente 10 cP mais baixo do que o correspondente XTEN linear de igual peso molecular e concentração.

[339] Métodos para fazer tais composições usando os reticuladores multivalentes pode empregar condições de reação similar como descrito neste documento, acima, enquanto um método exemplar e dados de suporte são fornecidos nos exemplos, abaixo. Adicionalmente, reticuladores multivalentes podem ser facilmente obtidos por modificação de oligômeros de lisina. Por exemplo, o peptídeo Lis-Lis é composto por três grupos aminoácidos, um grupo alfa-amino e dois grupos de amino de épsilon em cada resíduo de Lis. Estes grupos aminoácidos podem ser convertidos em muitos outros grupos reativos, reagindo com reticuladores bifuncionais que possuem um grupo amina- reativo. Por exemplo, a reação de Lis-Lis com o reticulador DBCO-NHS produz um produto que carrega três grupos DBCO. A reação de Lis-Lis com NMal-NHS cruz produto de rendimentos de ligante que carrega três grupos NMal. De forma semelhante, um pode obter reticulador tetravalente baseados no Lis-Lis-Lis e reticuladores de maiores valências usando peptídeos de lisina mais longos.

[340] Reticuladores podem ser classificados como "homobifuntionais" ou "heterobifunctionais", no qual reticuladores homobifuntionais tem dois ou mais grupos reativos idênticos e são utilizados em procedimentos de reação de uma etapa para aleatoriamente vincular ou polimerizar moléculas contendo como grupos funcionais, e reticuladores heterobifunctionais possuem diferentes grupos reativos que permitem a qualquer conjugação de etapa única de moléculas que possuem grupos funcionais respectivos alvos ou permitir para conjugações sequenciais (Duas Etapas) que minimizam a polimerização indesejável ou auto conjugação. Em uma modalidade preferencial, onde XTEN reticuladores são preparados e isolados como composições para reação subsequente, o XTEN reticulador está ligado a um reticulador heterbifuntional e tem pelo menos um grupo reativo disponível para reação subsequente.

[341] Em uma modalidade a invenção fornece XTEN reticuladores e XTEN de carga útil que são conjugados utilizando reticuladores quebráveis com ligações dissulfeto. Tipicamente, a clivagem é afetada pela ligação dissulfeto agentes, tais como a redução β-mercaptoetanol, DTT, TCEP, no entanto, é especialmente contemplado que tais composições seria clivável endogenamente de uma forma de libertação lenta, por condições com agentes de redução endógenos (tais como cisteína e glutationa). A seguir, são exemplos de tais reticuladores não-limitantes: APDP (N-(4- [p-Azidosalicilamido]butil)-3'-(2'-piridilditio) propionamida), BASED (Bis (β-[4-azidosalicilamido]etil) dissulfeto), DPDPB (1,4-Di-(3'- [2'piridilditio]propionamido) butano), DSP (Ditiobis(succimidilpropionato) (Reagente de Lomant), DTBP (Dimetil 3,3'-ditiobispropionimidato), DTME (Ditiobis- maleimidoetano), DTSSP (Sulfo-DSP) (3,3'-Ditiobis (sulfosuccinimidilpropionato)), LC-SPDP (Succinimidil 6- (3'-[2-piridilditio]propionamido)hexanoato), PDPH (3-(2- Piridilditio)propionilhidrazido), SDAD (NHS-SS-Diazirino), SMPT (4-Succinimidiloxicarbonil-metil-α-(2- piridilditio)tolueno), SPDP (N-Succinimidil 3-(2- piridilditio)propionato), Sulfo-LC-SMPT (Sulfosuccinimidil 6-(α-metil-α -[2-piridilditio]-toluamido)hexanoato), Sulfo- LC-SPDP (Sulfosuccinimidil 6-(3'-[2- piridilditio]propionamido)hexanoato), Sulfo-SAED (Sulfosuccimidil 2-[7-azido-4-metilcoumarino-3- acetamido]etil-1,3'-ditiopropionato), Sulfo-SAND (Sulfosuccinimidil-2-(m-azido-o-nitrobenzamido) etil 1,3'- ditiopropionato), Sulfo-SDAD (Sulfo-NHS-SS-Diazirino), Sulfo-SFAD (Sulfosuccinimidil(perfluoroazidobenzamido)etil 1,3'-ditiopropionato podem ser cortados sob condições alcalinas. Numa outra forma de realização, os conjugados XTEN-carga compreendendo BSOCOES (Bis(2- [succinimidoxicarboniloxi]etil)sulfona) podem ser clívados sob condições alcalinas. Em outra modalidade, conjugados XTEN de carga útil compreendem DST (Disuccinimidil tartarato) and BMDB (1,4 Bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano) podem ser clivados por oxidação de periodato. EGS (Etileno glicol bis(succinimidilsuccinato)) and Sulfo-EGS (Etileno glicol bis (sulfo-succinimidil succinato)) são clivadas por hidroxilamina, mas que se espera que seja clivada endogenamente tal que a carga ativa seria libertada a partir do conjugado.

[342] Em geral, os reagentes de conjugação descritos acima assumem que um reticulador é reativo com os grupos caso contrário estáveis e inertes, como aminas, sulfidrilas e carboxilas. Em outras modalidades, a invenção fornece uma abordagem diferente de conjugação com base em modificações separadas do XTEN de carga útil com dois grupos funcionais que são estáveis e inativos em direção de biopolímeros em geral ainda é altamente reativos em direção um do outro. Diversas reações ortogonais foram agrupadas sob o conceito da química pressionada, que fornece reagentes XTEN- azida/alquino que têm propriedades de boa estabilidade e justificam particularmente adequadas como reagentes para posterior conjugação com cargas em uma reação separada (Kolb H.C., Finn M.G., Sharpless K.B. Click chemistry:diverse chemical function from a few good reactions. (2001) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40(11), 20042021) Em geral, química depressão é usada como um conceito de reação que engloba reações envolvendo (1) alquino-azida; (2) "ene"-tiol e (3) aldeído-maleica e a invenção contempla a utilização de todos os três. Um exemplo é o cicloadição de Huisgen 1,3-dipolar de alcinos de azidas de forma 1,4- dissubstituído-1, 2,3-triazóis, mostrado na FIG. 8. Azida sódica e metades de alquino podem ser introduzidas em cargas de proteína/peptídeo ou drogas ou em XTEN pela modificação química de αgrupos N-terminal-aminoácidos, ε- grupos aminoácidos da lisina e grupos cisteína. A Tabela 15 fornece exemplos de não-limitação de reagentes de química pressionada previstos para uso na fabricação das composições conjugadas, no qual um componente do conjugado pretendido (e XTEN ou uma carga útil) é reagido com um reagente 1 da tabela e o segundo componente (uma carga ou um XTEN) é reagido com um reagente de azida 2 da Tabela. Por exemplo, uma molécula é modificada com um fração alquino usando um alqueno amina reativo, tais como o ácido 3-propargiloxipropanoico,NHS éster,acetileno-PEG4-NHS éster, dibenzilcyclooctina (DBCO)- NHS éster, DBCO-PEG4-NHS éster, ciclooctina (COT)-PEG2-NHS éster, COT-PEG3-NHS éster, COT-PEG4-NHS éster, COT-PEG2- pentafluorofenil (PFP) éster, COT-PEG3-PFP éster, COT-PEG4- PFP éster, BCOT-PEG2-NHS éster, BCOT-PEG3-NHS éster, BCOT- PEG4-NHS éster, BCOT-PEG2-PFP éster, BCOT-PEG3-PFP éster, BCOT-PEG4-PFP éster. Alternativamente a molécula é modificada com um sulfidrilo reativo, tal como alcino acetileno-PEG4-Maleimida, DBCO-Maleimida, ou DBCO-PEG4- Maleimida. A segunda molécula é modificada com azida-PEG2- NHS éster, azida-PEG3-NHS éster, azida-PEG4-NHS éster, éster de azida-PEG2-PFP, éster de azida-PEG3-PFP, azida- PEG4-PFP éster ou azida-PEG4-Maleimida. As azida sódica e alquino metades podem ser usados indiscriminadamente; Eles são biologicamente únicos, estável e inerte em relação a ambientes aquosos e moléculas biológicas. Quando misturado, as azida sódica e alquino reagentes formam uma ligação covalente irreversível sem quaisquer reações colaterais (Moses J.E. and Moorhouse A.D. The growing applications of click chemistry. (2007) Chem. Soc. Rev.36, 1249-1262; Breinbauer R. and Kohn M. Azide-alquino coupling: powerful reaction for bioconjugate chemistry. (2003) ChemBioChem 4(11), 1147-1149; Rostovtsev V.V., Green L.G., FokinV.V., Sharpless K.B. A stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.(2002) Angew Chem Int Ed Engl. 41(14), 2596-2599). Em uma modalidade, a invenção fornece um conjugado composto por um primeiro XTEN conjugado com uma segunda XTEN onde o primeiro XTEN está ligado a um reagente de alquino 1 da tabela 15, o segundo XTEN está ligado a um reagente de azida 2 da tabela 15, e então o primeiro XTEN e o segundo XTEN estão ligadas em condições eficazes para reagir o reagente alquino 1 e o reagente de azida 2, resultando no conjugado XTEN-XTEN. Em outra modalidade, a invenção fornece um conjugado composto por um primeiro XTEN conjugado com uma carga útil onde o XTEN está ligado a um reagente de alquino 1 da tabela 15, a carga está ligada a um reagente de azida 2 da tabela 15, e em seguida o XTEN e a carga útil estão ligados em condições eficazes para reagir o reagente alquino 1 e o reagente de azida 2, resultando no conjugado XTEN-carga. Em outras modalidades, a invenção fornece um conjugado composto por um primeiro XTEN conjugado com uma carga onde o XTEN está ligado a um reagente de azida 2 da tabela 15, a carga está ligada a um reagente de alquino 1 da tabela 15, e em seguida o XTEN e a carga útil estão ligados em condições eficazes para reagir o reagente alquino 1 e o reagente de azida 2, resultando no conjugado XTEN-carga. Nas modalidades anteriores, as condições para o efeito as reações são aqueles aqui descritos ou condições de reação conhecidas na técnica para a conjugação de tais reagentes. A invenção também contempla as várias combinações de conjugados os precedentes; por exemplo, um conjugado XTEN- XTEN no qual o XTEN estão ligados por reagentes de química clique e em qual deles XTEN é ainda composto por uma ou mais moléculas de uma carga de conjugado com o XTEN usando clique em química, um conjugado XTEN-XTEN no qual o XTEN estão ligados por clique reagentes de química na qual um XTEN é ainda composto por um ou mais moléculas de uma primeira carga, conjugada com o XTEN usando clique química e o segundo XTEN é ainda composto por uma ou mais moléculas de uma segunda carga conjugado com o XTEN usando clique em química. Variações adicionais sobre estas combinações serão prontamente aparentes aos versados na técnica Tabela 15: Alqueno e reagentes de química pressionada azida * pode ser éster NHS ou éster de sulfo-NHS

[343] Em algumas modalidades, os conjugados XTEN-XTEN e conjugados XTEN de carga útil são conjugados usando química pressionada com base tio-eno que procede por reação de radicais livres, denominado reação tiol-eno, ou reação aniônica, denominado tiol adição de Michael (ver fig. 9) (Hoyle C. E. and Bowman C.N. Thiol-ene click chemistry. (2010) Angew. Chem. Int. Ed. 49, 1540-1573). Em particular, acredita-se que adição de tiol de Michael é mais adequada para o conjugado XTEN de carga útil, onde a carga é uma proteína (Pounder R. J. et. al. Metal free thiol-maleimida 'Click' reaction as amild functionalisation strategy for degradable polymers. (2008) Chem Commun (Camb). 41, 51585160). Como pelo menos uma molécula precisa conter um grupo tiol livre, uma engenharia de cisteína XTEN pode ser utilizada se a carga não contém cisteína. Alternativamente, o grupo tiol pode ser introduzido por modificação química de terminal N grupo amino ou o de grupos lisina de aminoácidos do XTEN ou a carga útil do peptidio/proteína usando reagentes de tiolante como 2-iminotiolano (reagente do Traut), SATA (N-succinimidil S-acetiltioacetato), SATP (N-succinimidil S-acetilthiopropionato), SAT-PEO4-Ac (N-S succinimidil-acetil (totetraetileno glicol)), SPDP (N- succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato)LC-SPDP (grufo 6- (3'-[2-piridilditio]propionamido)hexanoato). Tais métodos são conhecidos na técnica (Carlsson J. et al. (1978) Biochem. J. 173, 723-737; Wang D. et al. (1997) Bioconjug. Chem. 8, 878-884; Traut R.R. et al. (1973) Biochemistry 12(17), 3266-3273; Duncan, R.J.S. et.al. (1983) Anal. Biochem. 132. 68-73; U.S. Pat. No. 5,708,146). O segundo componente da reação de adição de tol-Michael requer um reagente com ligação dupla de carbono-carbono de elétron- deficientes, tais como em acrilatos (metanfetamina), maleimidas, -cetonas insaturadas, ésteres fumarato, acrilonitrila, Cinamatos e crotonatos. As N-maleimides são comumente usados como funcionalidades sulfidrila reativos e podem ser introduzidos a proteína de carga ou a molécula XTEN via N-terminal-amino grupo ou de Lis-modificação de grupo amino usando reticuladoresheterobifunctional comercialmente disponível como AMAS (1 c 9 N 1 d 9-(α- Maleimidoacetoxi)-succinimida éster), BMPS (N-(β- Maleimidopropiloxi) éster succinimida) e outros, 0g 9 descrito acima. h 0 9 as resultante de duas moléculas contendo tiol livre e partes maleimida , respectivamente, formam uma ligação covalente estável em condições suaves, resultando em uma XTEN carga útil por maleimida.

[344] Em outras modalidades, conjugados de XTEN-XTEN e conjugados XTEN e carga útil são criados utilizando química pressionada, com base em reações entre Hidrazidas e aldeídos, como descrito por Ganguly et al. E como mostrado na FIG. 10 (Ganguly T. et al. The hidrazido/hidrazona click reaction as a biomolecule labeling strategy for M(CO)3 (M = Re, 99mTc) radiopharmaceuticals. (2011) Chem. Commun. 47, 12846-12848).. Por exemplo, um XTEN pode ser modificado para ter uma hidrazina ou maleica que é misturada com uma carga útil ter um grupo aldeído para produzir o conjugado XTEN-carga desejado. Em uma modalidade, a invenção fornece XTEN pelo menos um hidrazina ou maleica introduzido no grupo amino α-N-terminal ou, alternativamente, um ou mais εde lisina-grupos aminoácidos são modificadas para fornecer um XTEN apropriado como um reagente para conjugação de uma carga de alvo, pois é considerada estável. O resultante bis-arilhidrazonas formado de hidrazinas aromáticas e aldeídos aromáticos são estáveis para 92óC e uma vasta gama de valores de pH de 2,0-10.0 (Solulink, Inc., ProteinProtein Conjugation Kit, Technical Manual,Catalog # S-9010- 1). O grupo lábil na reação é água e não agentes redutores (por exemplo, cianoborohidrido de sódio) são necessários para estabilizar o vínculo. Moléculas modificadas com partes de hidrazina/maleica ou aldeído tem boa estabilidade em ambientes aquosos e permanecem ativas sem requisitos de tratamento especial. O grupo amino da molécula XTEN é modificado pelo NHS-éster/maleica, tais como SANH (grufo 4- hidrazinonicotinato acetona hidrazona), C6-SANH (C6- succinimidil 4-hidrazinonicotinato acetona hidrazona), SHTH (grupo 4-hidrazidotereftalato hidrocholoreto). Em uma reação típica, uma proteína é preparada como solução de 1-5 mg/ml em buffer de modificação (100 mM de fosfato, 150 mM NaCl, pH 7,4) e o agente modificador é adicionado em um 5 - a 20 vezes molar excesso e a reação é realizada por 2 horas à temperatura ambiente. Separadamente, a molécula de carga é modificada com SFB NHS-éster/aldeído (grufo 4- formilbenzoato) ou C6-SFB (C6-succinimidil 4- formilbenzoato) em condições semelhantes. Ambas moléculas modificadas são então dessalinizada em tampão de conjugação (fosfato de 100 mM, 150 mM NaCl, pH 6.0). Os componentes resultantes são misturados juntos usando uma proteína limitante 1 mol equivalente e 1,5-2 equivalentes de toupeira de uma proteína que pode ser usado em abundância. Um tampão de catalisador de anilina de 100mm em fosfato de 100 mM, 150 mM NaCl, pH 6.0 é adicionado para ajustar a concentração final de anilina de 10 mM e a reação é realizada por 2 horas à temperatura ambiente.

[345] Em outra modalidade, o conjugado XTEN de carga útil pode ser produzido pela reação entre um aldeído e um grupo amino primário, seguido de redução da base de Schiff formada com borohidreto de sódio ou cianoborohidrido. Como uma primeira etapa no método, uma molécula XTEN, tais como o XTEN com um grupo α -amino primário ou Lis-contendo XTEN com um grupo ε-amino, é modificada pelo NHS-éster/aldeído SFB (grufo 4-formilbenzoato), C6-SFB (C6-succinimidil 4- formilbenzoato) ou AFPG (grufo 4-formilphenoxiacetato) usando química amina-NHS típico em um tampão de ligação livre de aminas tais como fosfato de sódio 0,1 M, 0.15 M NaCl, pH 7,2. O XTEN de aldeído modificada resultante também pode ser realizada neste momento como uma composição de XTEN reticulador ou pode ser usado como um reagente para criar um conjugado XTEN de carga útil. Para tornar o XTEN de carga útil, o XTEN de aldeído modificado é misturado com uma carga útil com um grupo amino-reativo e um agente redutor suave como cianoborohidrido de sódio 20-100 mM. A mistura de reação é incubada por 6 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C. Grupos aldeído que não reagiram são então bloqueados com 50-500mm Tris*HCl, pH 7,4 e cianoborohidrido de sódio 20-100 mM, permitindo a separação do XTEN de carga útil purificado conjugado.

[346] Em outras modalidades, a invenção fornece o cojugado XTEN de carga útil composto por peptídeos ou cargas de proteínas, onde a carga é conjugada através da ligadura química baseiam a reatividade da proteína/peptídeo azida de acila C-terminal da carga. , por exemplo, quando o peptídeo ou uma proteína é produzida usando a síntese do peptídeo de fase sólida (SPPS) com resina de hydroxymethylbenzoic ácido (HMBA), o peptídeo final pode ser clivada da resina por uma variedade de reagentes nucleofílicos para dar acesso aos peptídeos com diversas funcionalidades do C-terminal. Em uma modalidade, o método inclui hidrazinolisis das resinas peptidil/proteína para produzir Hidrazidas peptídeo ou proteína. Nitrosation de Hidrazidas resultante de acila com sódio nitrito ou tert-nitrito de butila em ácido clorídrico diluído, então resulta na formação de azidas de acila. A azida de carbonila resultante (ou azida de acila) é um carboxilato registrados grupo (ésteres) que pode reagir com uma amina primária de um XTEN para formar uma ligação Amida estável, resultando no conjugado XTEN-carga. Em alternativas incorporações, a amina primária pode ser a α amina de XTEN terminal N ou um ou mais ε amina de resíduos de lisina projetado na sequência XTEN. A reação de conjugação, a função de azida é o grupo lábil, mostrado na FIG. 11. A reação de conjugação com os grupos amina ocorre por ataque do nucleófilo no grupo carbonila elétron- deficiente (Meienhofer, J. (1979) The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 1, Academic Press: N.Y.; ten Kortenaar P. B. W.et. al. Semisynthesis of horse heart cytochrome c analogues from two or three fragments. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 8279-8283).

[347] Em ainda outras modalidades, a invenção fornece XTEN reticuladores e XTEN de carga útil conjugados em que a conjugação é executada pela ligadura de proteína ortogonais em que uma captura inicial quimiosseletiva é seguida por um rearranjo intramolecular acil, como mostrado na FIG. 12. A captura quimiosseletiva requer um nucleófilo ou eletrófilo colocados proximalmente a uma amina N-terminal e a outra compatível eletrófilo ou nucleófilo também proximalmente, localizado em um éster carboxílico terminal C. Na modalidade, é especificamente contemplado que o XTEN pode servir como Proteina1 ou Proteina 2 na FIG. 12. Assim, em alternativas encarnações, o XTEN pode ser reagida com reagentes apropriados para produzir o Tioéster no C- terminal ou apresentar uma cisteína na N-terminal para produzir alternativas composições XTEN-reticulador. Usando o precedente XTEN de reticulador conjuga para tornar a XTEN de carga útil, a captura de quimiosseletiva do par nucleófilo e eletrófilo formando um éster ou um Tioéster traz o grupo amino N-terminal e éster terminal C dos respectivos reagentes em uma proximidade para permitir uma transferência de acila intramolecular espontânea para formar uma ligação amida. Mais reações de ligadura ortogonal não requerem proteção dos grupos de cadeia lateral e ter lugar em condições suaves que são compatíveis com ambientes biológicos (Tam J. P., Xu J., Eom K. D. Methods and strategies of peptídeo ligation. (2001) Biopolymers (Peptide Science) 60, 194-205).

[348] Numa outra modalidade, os conjugados podem ser criados por um método conhecido como reação Native Chemical Ligation (NCL) envolvendo um tioéster C-terminal como um electrófilo e cisteína N-terminal como um nucleófilo. O resultado desta reação é uma ligação amida nativa no sítio de ligação do conjugado XTEN de carga única (Dawson P. E., Muir T. W., Clark-Lewis I., Kent S. B. Synthesis of proteins by native chemical ligation. (1994) Science 266, 776-779; Tam J. P.; Lu Y.-A.; Liu C. F.; Shao, J. Peptide synthesis using unprotected peptides through orthogonal coupling methods. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 12485-12489; Johnson, E.C.B.; Kent, S.B.H. J. Insights into the mechanism and catalysis of the native chemical ligation reaction. (2006) J. Am. Chem. Soc. 128, 6640-6646; Kent S. B. (2009) Total chemical synthesis of proteins. (2009) Chem. Soc. Rev. 38:338-351). O primeiro aminoácido de o componente terminal Cna reação NCL (como mostrado na Proteína 2 FIG. 12) is cisteina. Tal proteína pode ser XTEN com cisteína na primeira posição, ou qualquer outra proteína preparada por biossíntese proteína recombinante convencional, incluindo uma carga de peptídeo / proteína. O componente terminal N(como mostrado na carga útil na FIG. 13) é preparado como tioéster terminal C através de síntese química. Exemplos de métodos de síntese de tioéster são conhecidos e disponíveis na técnica, tais como aqueles descritos, por exemplo, em Li X., Kawakami T., Aimoto S., Direct preparation of peptídeo thioesters using an Fmoc solid-phase method. (1998) Tetrahedron Lett., 39, 8660 8672); Ingenito R., Bianchi E., Fattori D., Pessi A. Solidphase synthesis of peptídeo C-terminal thioesters by Fmoc/tBu chemistry. (1999) J. Am. Chem. Soc., 121, 11369-11374); Sewing A., Hilvert D. Fmoc-compatible solid-phase peptídeo synthesis of long C-terminal peptídeo thioesters. (2001) Angew. Chem. Int. Ed. 40, 3395-3398; Brask J., Albericio F., Jensen K. J. ,Fmoc solid-phase synthesis of peptídeo thioesters by masking as trithioorthoesters. (2003) Org. Lett., 2003, 5, 2951-2953; Ollivier N., Behr J.-B., El-Mahdi O., Blanpain A., Melnyk O. Fmoc-solid-phase synthesis of peptídeo thioesters using an intramolecular N, S-acyl shift. (2005) Org. Lett., 7, 2647-2650.Geralmente α- alquiltioésteres são preferidos por causa da facilidade de preparação e armazenamento. No entanto, porque são pouco não reativo, a reação é catalisada por ligação em transtioesterificação situ com aditivos tiol, com os catalisadores de tiol mais comuns são 2- mercaptoethanesulfonato (MESNa) ou ácido 4- mercaptofenilacetico (MPAA). A conjugação química é tipicamente completa em algumas horas e com rendimentos elevados. Enquanto todos os 20 aminoácidos naturais são adequados como o último resíduo de componente N-terminal, as taxas mais elevadas de ligação foram relatadas para a glicina e histidina, fazendo XTEN particularmente adequado para esta reação como o XTEN exemplar da Tabela 2 são quase todos glicina N-terminal polipeptídeos (Hackeng T.M. et al. Protein synthesis by native chemical ligation: expanded scope by using straightforward methodology. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 10068-10073). Em outra modalidade deste método de conjugação reações de ligação incluem ortogonais: (1) C-terminal thioacid with N-terminal BrAla or N-terminal aziridine (Tam J. P.; Lu Y.-A.; Liu C. F.; Shao, J. Peptide synthesis using unprotected peptides through orthogonal coupling methods. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 12485-1248 9); (2) C-terminal thioacid with N-terminal Cys-perthioester (Liu, C. F., Rao, C., Tam, J. P. (1996) Tetrahedron Lett., 37, 933-936); (3) C- terminal thioester with N-terminal Homocysteine (Tam J.P., Yu Q. Methionine ligation strategy in the biomimetic synthesis of parathyroid hormones. (1998) Biopolymers 46(5), 319-327); and (4) C-terminal thioacid and N-terminal His (Zhang L., Tam J. P. (1997) Tetrahedron. Lett. 38, 36). No método, a preparação de tioésteres C-terminal por síntese química restringe o tamanho do componente N- terminal na reação NCL. No entanto, o uso de ligadura proteína expressa (EPL) metodologia supera as limitações de tamanho de peptídeo α- tioester imposta pela necessidade de síntese química (Muir T. W.; Sondhi D.; Cole P. A. Expressed protein ligation: a general method for protein engineering. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 67056710; Muir T.W. Semisynthesis of proteins by expressed protein ligation. (2003) Annu. Rev. Biochem. 72, 249-289). O método baseia-se na junção EPL da proteína, o processo em que uma proteína sofre um rearranjo intramolecular resultando na extrusão de uma sequência interna (intein) e a união das sequências laterais (exteins). O último processo envolve a formação de um éster ou tioéster intermediários. Na prática da invenção, o comercialmente disponível os vetores de expressão da protein Escherichia coli permite que se possa produzir proteínas de interesse, tais como XTEN, expressa em tabela fundido com um domínio de ligação (CBD) sequência intein-quitina. No método, a proteína fundida é submetida a uma mudança NS quando a cadeia lateral do primeiro resíduo de cisteína da porção intein da proteína precursora ataca nucleofilicamente da ligação peptídica do resíduo imediatamente a montante (isto é, por exemplo, o resíduo final de XTEN) para formar um intermediário tioéster linear, como mostrado na FIG. 13. O passo de ligação química é iniciado por incubação da proteína com tiofenol (ou outros catalisadores de tiol, tais como o MESNa e MPAA) e um péptidio sintético contendo cisteína ou proteína. Isto resulta na produção in situ de um derivado Fenil a-tioéster altamente reativos de, por exemplo, a proteína XTEN que então se liga rapidamente com a carga de péptidio / proteína sintética para resultar no conjugado XTEN de carga útil desejada Numa outra forma de realização, um intermediário tioéster-XTEN podem ser cortados por ácido 50 mM de 2-mercaptoethanesulfonic (MESNa) em 20 mM de Na-HEPES, pH 8,5, NaCl 50-1000 mM, e EDTA 1 mM (facultativo), e o resultante MESNa- marcaram proteína pode ser purificada e armazenado a -80°C em Tris 5 mM Bis, pH 6,5, NaCl 250 mM, até ser utilizado como um conjugado de XTEN-reticulador por reação NCL como o componente N-terminal no acima descrito conjugação. O componente C-terminal pode ser uma carga, com um péptidio / proteína natural ou sintético, com uma cisteína N-terminal.

[349] Em ainda outras modalidades, a invenção fornece XTEN de reticuladores e conjugados XTEN de carga -útil em que a conjugação entre o XTEN de carga útil é executada pela ligação Staudinger sem traço, como ligadura química nativa (NCL), resultando em uma ligação Amida nativo no sítio da ligadura. Em uma vantagem para o método, uma cisteína não é necessária a conjuntura de ligadura (Saxon, E.; Armstrong, C.R.; Bertozzi, C.R. Uma ligação Staudinger "sem traço" para a síntese de quimioseletiva de ligações Amida. (2000) org. Lett. 2, 21412143; Nilsson, BL; Kiessling, L.L.; Raines, ligadura de R.T. Staudinger: um peptídeo de um Tio éster e azida. (2000) org. Lett. 2, 1939-1941). Em vez disso, uma proteína do N-terminal 1 é preparada como um Tio éster do C-terminal usando difenilfosfinemetanetiol (ver fig. 14), enquanto a proteína C-terminal 2 é preparada como uma azida de terminal N que pode ser gerada através de uma reação de transferência de diazo (Cavender C. J.; Peixe do gênero Notropis J. V., Jr. (1972) J. org. Chem. 22, 35673569; Lundquist J. T., IV, Pelletier J. C. melhorado peptídeo de fase sólida síntese método utilizando aminoácidos alfa-azida-protegido. (2001) org. Lett. 3, 781 - 783). Um resíduo de fosfina reage com a azida de Protein2 para formar um iminofosforano após a eliminação de nitrogênio (reação de Staudinger). A iminofosforano resultante com o átomo de nitrogênio altamente nucleofílico também pode ser considerado como um ileto-aza. O átomo de nitrogênio nucleofílica do aza-ileto então ataca o grupo carbonila de Proteína 1, fendendo a Tio éster. Especificamente pretende-se que a carga ou XTEN pode ser Proteina1 ou Proteina2 nesta reação. A hidrólise do produto XTEN de carga útil rearranjado finalmente produz um amido nativo e liberta o componente de fosfina como óxido de fosfina(V). Bis (p-dedimetilaminoetilenil) fosfinometanetiol, uma variante solúvel em água do difenilfosfinemetanetiol, Medeia a ligadura rápida dos substratos equimolar na água (Tam, A.; Soellner, M.B.; Raines, R.T. Water-soluble phosphinothiols for traceless Staudinger ligation and integration with Expressed Protein Ligation. (2007) J. Am. Chem. Soc., 129, 1142111-430).

[350] Em outra modalidade, a invenção fornece os cojugados XTEN-carga útil preparados pela ligação enzimática. Transglutaminases são enzimas que catalisam a formação de um isótopo entre o grupo g-carboxamida de glutamina de um peptídeo ou proteína de carga e o grupo e-amino de uma lisina em um XTEN engenheirado por lisina, assim, criando ligações cruzadas inter- ou intramoleculares entre o XTEN e a carga útil (vide FIG. 15), resultando na composição (Lorand L, Conrad S.M. Transglutaminases. (1984) Mol. Cell Biochem. 58(1-2), 9-35). Exemplos não-limitantes de enzimas que têm sido usados com sucesso para ligações são fator XIIIa (Schense J. C., Hubbell J.A. Cross-linking exogenous bifunctional peptides into fibrin gels with factor XIIIa. (1999) Bioconjug. Chem. 10(1):75-81) e transglutaminase do tecido (Collier J.H., Messersmith P.B. Enzymatic modification of self-assembled peptide structures with tissue transglutaminase. (2003) Bioconjug. Chem. 14(4), 748-755; Davis N. E., Karfeld-Sulzer L. S., Ding S., Barron A. E. Synthesis and characterization of a new class of cationic protein polymers for multivalent display and biomaterial applications. (2009) Biomacromolecules 10 (5), 1125-1134). A sequência de substrato de glutamina GQQQL é conhecida por ter alta especificidade em direção à transglutaminase do tecido (Hu B.H., Messersmith P.B. Rational design of transglutaminase substrate peptides for rapid enzimatic formation of hydrogels. (2003) J. Am. Chem. Soc. 125(47), 14298-14299). A especificidade de sequência de transglutaminase de tecido foi menos rigorosa para um aceitador de acil (lisina) do que para o doador de acil (glutamina) (Greenberg C. S., Birckbichler P. J., Rice R. H. Transglutaminases: multifuncional cross-linking enzymes that stabilize tissues. (1991) FASEB J. 1991, 5, 3071- 3077).

[351] Em uma modalidade alternativa de uma composição de XTEN-carga útil criada enzimaticamente, a enzima de transpeptidase sortase A de Staphylococcus aureus é usada para catalisar a clivagem de um LPXTG da sequência de reconhecimento de 5 aminoácidos curta entre os resíduos de treonina e glicina de Proteína 1, e posteriormente transfere o fragmento de acil para um nucleófilo de oligoglicina de terminal N de Proteína 1 (vide FIG. 16). Pela funcionalização da Proteína 2 para conter a oligoglicina, é possível conjugar enzimaticamente as duas proteínas em um modo de sítio específico para resultar na composição de XTEN-carga útil desejada. O (poli)peptídeo tendo o sítio de reconhecimento sortase (LPXTG) pode ser feito facilmente usando protocolos de clonagem de biologia molecular padrão. É conveniente introduzir ácido glutâmico na posição X do sítio de reconhecimento, como este resíduo é comumente encontrado em substratos naturais de sortase A (Boekhorst J., de Been M.W., Kleerebezem M., Siezen R. J. Genome-wide detection and analysis of cell wall-bound proteins with LPxTG-like sorting motifs. (2005) J. Bacteriol. 187, 4928-4934). Um elevado nível de transacilação pode ser alcançado colocando o sítio de clivagem de sortase ambos no terminal C do substrato (Popp M.W., Antos J.M., Grotenbreg G.M., Spooner E., Ploegh H.L. Sortagging: A versatile method for protein labeling. (2007) Nat. Chem. Biol. 311,707-708) e em loops flexíveis (Popp M.W., Artavanis-Tsakonas K., Ploegh H.L. Substrate filtering by the active-site crossover loop in UCHL3 revealed by sortagging and gain-of-function mutations. (2009) J. Biol. Chem. 284(6), 3593-3602). Para proteínas marcadas no terminal C, é importante que a glicina na marca de LPETG mínima não seja colocada no terminal C; deve estar em uma ligação peptídica com pelo menos um aminoácido de terminal C adicional. Além disso, a melhor ligação é atingida adicionando uma glicina extra para o terminal C do sítio de clivagem para produzir LPETGG (Pritz S., Wolf Y., Kraetke O., Klose, J., Bienert, M., Beyermann M. Synthesis of biologically active peptide nucleic acid-peptide conjugates by sortase-mediated ligation. (2007) J. Org. Chem. 72, 3909-3912; Tanaka T., Yamamoto T., Tsukiji S., Nagamune T. Site-specific protein modification on living cells catalyzed by sortase. (2008) Chembiochem 95, 802807). Nucleófilos compatíveis com a transpeptidação mediada por sortase têm a exigência estrutural única de um trecho de resíduos de glicina com um terminal amino livre. A transpeptidação com sucesso pode ser alcançada com nucleófilos contendo em qualquer lugar de uma a cinco glicinas; no entanto, em uma modalidade preferida, uma taxa de reação máxima é obtida quando duas ou três glicinas estão presentes.

[352] Embora as várias modalidades da química de conjugação tenham sido descritas em termos de conjugações de proteína- proteína, pretende-se especificamente que na prática da invenção, a fração de carga útil dos conjugados de XTEN- carga útil pode ser uma droga de molécula pequena naqueles métodos de conjugação aplicáveis a grupos funcionais como aminas, sulfidrilas, carboxil que estão presentes nas drogas de molécula pequena alvo. Será compreendido por uma pessoa versada na técnica que alguém pode aplicar técnicas químicas ainda mais amplas em comparação com proteínas e peptídeos, cujas funcionalidades são geralmente limitadas a grupos amino, sulfidril e carboxil. Cargas úteis de droga podem ser conjugadas com o XTEN através de grupos funcionais, incluindo, mas não limitado a, grupos amino primários, aminóxi, hidrazida, hidroxil, tiol, tiolato, succinato (SUC), succinato de succinimidil (SS), propionato de succinimidil (SPA), butanoato de succinimidil (SBA), carboximetilato de succinimidil (SCM), carbonato de benzotriazol (BTC), N-hidroxisuccinimida (NHS), carbonato de p-nitrofenil (NPC). Outros grupos funcionais reativos adequados de cargas úteis da molécula da droga incluem acetal, aldeídos (por exemplo, acetaldeído, propionaldeído, e butiraldeído), hidrato de aldeído, aquenil, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona ativa, haleto de ácido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epóxido, glioxal, diona, mesilato, tosilato, e tresilato.

[353] Em outra modalidade, as cargas da droga também podem ser conjugadas para conjugados de XTEN-reticulador usando um sistema de anel heterociclo em que um ou mais átomos do anel é um heteroátomo, por exemplo, um nitrogênio, um oxigênio, um fósforo ou um átomo de enxofre. O grupo heterociclo compreende pelo menos 1 até um máximo de 20 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, O, P e S. Na modalidade, o heterociclo pode ser um monociclo tendo 3 a 7 membros do anel (2 a 6 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, O, P, e S) ou um biciclo tendo 7 a 10 membros do anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, O, P, e S), por exemplo: um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6], ou [6,6]. Heterociclos são descritos em Paquette, Leo A. “Principles of Modern Heterocyclic Chemistry” (W. A. Benjamin, New York, 1968); “ The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs” (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), em particular Volumes 13, 14, 16, 19, e 28. Exemplos não- limitantes de heterociclos que podem ser encontrados em drogas adequadas para conjugação incluem piridil, dihidropiridil, tetrahidropiridil (piperidil), tiazolil, tetrahidrotiofenil, tetrahidrotiofenil oxidado por enxofre, pirimidinil, furanil, tienil, pirrolil, pirazolil, imidazolil, tetrazolil, benzofuranil, tianaftalenil, indolil, indolenil, quinolinil, isoquinolinil, benzimidazolil, piperidinil, 4-piperidonil, pirrolidinil, 2-pirrolidonil, pirrolinil, tetrahidrofuranil, bis- tetrahidrofuranil, tetrahidropiranil, bis- tetrahidropiranil, tetrahidroquinolinil, tetrahidroisoquinolinil, decahidroquinolinil, octahidroisoquinolinil, azocinil, triazinil, 6H-1,2,5- tiadiazinil, 2H,6H-1,5,2-ditiazinil, tienil, tiantrenil, piranil, isobenzofuranil, cromenil, xantenil, fenoxatinil, 2H-pirrolil, isotiazolil, isoxazolil, pirazinil, piridazinil, indolizinil, isoindolil, 3H-indolil, 1H- indazolil, purinil, 4H-quinolizinil, ftalazinil, naftiridinil, quinoxalinil, quinazolinil, cinolinil, pteridinil, 4Ah-carbazolil, carbazolil, β-carbolinil, fenantridinil, acridinil, pirimidinil, fenantrolinil, fenazinil, fenotiazinil, furazanil, fenoxazinil, isocromanil, cromanil, imidazolidinil, imidazolinil, pirazolidinil, pirazolinil, piperazinil, indolinil, isoindolinil, quinuclidinil, morfolinil, oxazolidinil, benzotriazolil, benzisoxazolil, oxindolil, benzoxazolinil, e isatinoil.

[354] Em algumas modalidades dos conjugados de XTEN-carga útil com drogas como a carga útil, as moléculas de droga são ligadas ao XTEN engenheirado por lisina ou cisteína (tais como as sequências da Tabela 3), por reticuladores tendo dois sítios reativos para a ligação com a droga e o XTEN. Grupos reticuladores preferidos são aqueles que são relativamente estáveis para hidrólise na circulação, são biodegradáveis e são não tóxicos quando clivados a partir do conjugado. Além disso, o uso de reticuladores pode fornecer o potencial para conjugados com uma flexibilidade ainda maior entre a droga e o XTEN, ou fornecer espaço suficiente entre a droga e o XTEN de modo que o XTEN não interfira na ligação entre o farmacóforo e seu sítio de ligação. Em uma modalidade, um reticulador tem um sítio reativo que tem um grupo eletrofílico que é reativo para um grupo nucleofílico presente em um XTEN. Nucleófilos preferidos incluem tiol, tiolato, e amina primária. O heteroátomo do grupo nucleofílico de um XTEN engenheirado por lisina ou cisteína é reativo para um grupo eletrofílico em um reticulador e forma uma ligação covalente para unidade reticuladora, resultando em um conjugado de XTEN- reticulador. Grupos eletrofílicos úteis para reticuladores incluem, mas não estão limitados a, grupos maleimida e haloacetamida, e fornecem um sítio conveniente para a ligação para o XTEN. Em outra modalidade, um reticulador tem um sítio reativo que tem um grupo nucleofílico que é reativo para um grupo eletrofílico presente em uma droga de modo que uma conjugação possa ocorrer entre o XTEN- reticulador e a droga de carga útil, resultando em um conjugado de XTEN-droga. Grupos eletrofílicos úteis em uma droga incluem, mas não estão limitados a, grupos hidroxil, tiol, aldeído, alqueno, alcano, azida e carbonil de cetona. O heteroátomo do grupo nucleofílico de um reticulador pode reagir com um grupo eletrofílico de uma droga e formar uma ligação covalente. Grupos nucleofílicos úteis em um reticulador incluem, mas não estão limitados a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina, e arilhidrazida. O grupo eletrofílico em uma droga fornece um sítio conveniente para ligação a um reticulador.

[355] Em uma determinada modalidade, a conjugação de drogas para o grupo amino épsilon de lisina de um XTEN engenheirado por lisina que faz uso de um reagente reativo de drogas-N-hidroxilsuccinimida, ou ésteres tais como propionato de droga-succinimidil, ou butanoato de droga- succinimidil ou outros conjugados de droga-succinimida. Alternativamente, resíduos de lisina do XTEN engenheirado por lisina do sujeito podem ser usados para introduzir grupos sulfidril livres através de reação com 2- iminotiolano. Alternativamente, lisinas de substância de direcionamento do XTEN engenheirado por lisina do sujeito podem ser ligadas a um reagente heterobifuncional tendo um grupo aldeído ou hidrazida livre disponível para conjugação com um agente de droga ativa. Ésteres reativos podem conjugar em pH fisiológico, mas derivados menos reativos normalmente exigem valores de pH mais elevados. Baixas temperaturas também podem ser empregadas se uma carga de proteína lábil estiver sendo usada. Sob condições de baixa temperatura, um tempo de reação pode ser usado para a reação de conjugação.

[356] Em outra modalidade, a invenção fornece o cojugado de XTEN-carga útil com uma conjugação de grupo amino com resíduos de lisina de um XTEN engenheirado de lisina do sujeito no qual a conjugação é facilitada pela diferença entre os valores de pKa do grupo α-amino do aminoácido de terminal N (aproximadamente 7,6 a 8,0) e pKa do grupo ε- amino da lisina (aproximadamente 10). A conjugação do grupo amino terminal muitas vezes droga-aldeídos reativos (tal como droga-propionaldeído ou droga-butilaldeído), que são mais seletivos para aminas e, portanto, são menos propensos a reagir com, por exemplo, o grupo imidazol da histidina. Além disso, resíduos amino são reagidos com anidridos de ácido succínico ou outros de ácido carboxílico, ou com carbonato de N,N'-Dissuccinimidil (DSC), N,N'-carbonil di- imidazol (CDI), ou cloroformato de p-nitrofenil para produzir o carbonato de succinimidil ativado, carbamato de imidazol ou carbonato de p-nitrofenil, respectivamente. A derivatização com esses agentes tem o efeito de reverter a carga dos resíduos de lisinil. A conjugação de uma droga- aldeído ao grupo amino terminal de um XTEN do sujeito normalmente ocorre em um tampão adequado executado em um pH que permite aproveitar as diferenças de pKa entre os grupos ε-amino dos resíduos de lisina e o grupo α-amino do resíduo de terminal N da proteína. No método da modalidade, a reação de acoplamento usa um pH na faixa de cerca de pH 7 até cerca de 8. Métodos úteis para a conjugação do grupo amino épsilon de lisina têm sido descritos na Pat. U.S. N° 4.904.584 e Pat. U.S. N° 6.048.720.

[357] A pessoa versada na técnica estará ciente de que o método de ativação e/ou a química de conjugação a ser usada na criação dos conjugados de XTEN-carga útil depende dos grupos reativos do polipeptídeo de XTEN, bem como dos grupos funcionais da fração de droga (por exemplo, sendo amino, hidroxil, carboxil, aldeído, sulfidril, alqueno, alcano, azida, etc.), do grupo funcional do reagente de droga-reticulador, ou do grupo funcional do reagente de XTEN-reticulador. A conjugação de drogas pode ser direcionada à conjugação de todos os grupos de ligação disponíveis no polipeptídeo de XTEN engenheirado tais como os grupos de ligação engenheirados nos resíduos de cisteína ou resíduos de lisina incorporados. A fim de controlar os reagentes, de modo que a conjugação seja direcionada para o sítio reativo apropriado, a invenção contempla o uso de grupos de proteção durante a reação de conjugação. Um "grupo de proteção" é uma fração que impede ou bloqueia a reação de um determinado grupo funcional quimicamente reativo em uma molécula sob determinadas condições de reação. O grupo de proteção variará dependendo do tipo de grupo quimicamente reativo sendo protegido bem como as condições de reação a serem empregadas, bem como a presença de grupos reativos adicionais na molécula. Exemplos não- limitantes de grupos funcionais que podem ser protegidos incluem grupos de ácido carboxílico, grupos hidroxil, grupos amino, grupos tiol, e grupos carbonil. Grupos de proteção representativos para ácidos carboxílicos e hidroxilas incluem ésteres (por exemplo, um éster de p- metoxibenzil), amidas e hidrazidas; para grupos amino, carbamatos (tais como terc-butoxicarbonil) e amidas; para grupos hidroxil, éteres e ésteres; para grupos tiol, tioéteres e tioésteres; para grupos carbonila, acetais e cetais; e similares. Tais grupos de proteção são bem conhecidos para aqueles versados na técnica e são descritos, por exemplo, em T. W. Greene and G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesist, Third Edition, Wiley, New York, 1999, e referências citadas aqui. A conjugação pode ser alcançada em uma única etapa ou de forma gradual (por exemplo, como descrito no WO 99/55377), tal como através da adição de um reticulador de intermediário de reação, usando os reticuladores divulgados neste documento ou aqueles conhecidos na técnica como sendo úteis para a conjugação de resíduos de cisteína ou lisina de polipeptídeos a serem ligados a grupos funcionais reativos em moléculas de droga.

[358] Em algumas modalidades da invenção, o método para a conjugação de um reticulador com um XTEN engenheirado por cisteína pode determinar que o XTEN é pré-tratado com um agente redutor, tal como ditiotreitol (DTT) para reduzir quaisquer resíduos de dissulfeto de cisteína para formar grupos tiol de cisteína altamente nucleofílicos (—CH2 SH). O agente redutor é posteriormente removido por qualquer método convencional, tal como por dessalinização. O XTEN reduzido assim reage com os compostos de droga-reticulador, ou reagentes reticuladores, com grupos funcionais eletrofílicos tal como maleimida ou α-halo carbonil, de acordo com, por exemplo, o método de conjugação de Klussman et al. (2004) Bioconjugate Chemistry 15(4), 765-773. A conjugação de um reticulador ou uma droga com um resíduo de cisteína normalmente ocorre em um tampão adequado no pH 6 a 9 a temperaturas variando entre 4°C e 25°C por períodos até cerca de 16 horas. Alternativamente, os resíduos de cisteína podem ser derivatizados. Métodos e agentes de derivatização adequados são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, resíduos de cisteinil mais comumente são reagidos com α-haloacetatos (e aminas correspondentes), tal como ácido iodoacético ou iodoacetamida, para fornecer derivados de carboximetil ou carboxiamidometil. Resíduos de cisteinil também são derivatizados pela reação com bromotrifluoroacetona, ácido α-bromo-β -(4- imidozoil)propiônico, fosfato de cloroacetil, N- alquilmaleimidas, dissulfeto de 3-nitro-2-piridil, dissulfeto de metil 2-piridil, p-cloromercuribenzoato, 2- cloromercuri-4-nitrofenol, ou cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3- diazol.

[359] Em alguns casos, a conjugação é realizada sob condições visando reagir como muitos dos grupos de fixação de XTEN disponíveis como possível com moléculas de droga ou droga-ligante. Isto é obtido por meio de um excesso molar adequado da droga em relação ao polipeptídeo. Razões molares típicas de moléculas de droga ou droga-ligantes ativadas para polipeptídeo são de até cerca de 1000-1, tal como até cerca de 200-1 ou até cerca de 100-1. Em alguns casos, a razão pode ser um pouco menor, no entanto, tais como cerca de 50-1, 10-1 ou 5-1. Razões equimolares também podem ser usadas.

[360] Nas modalidades, os conjugados de XTEN-carga útil da divulgação mantêm pelo menos uma parte da atividade farmacológica em comparação com a carga útil correspondente não ligada ao XTEN. Em uma modalidade, o XTEN-carga mantém pelo menos cerca de 1%, ou pelo menos cerca de 5%, ou pelo menos cerca de 10%, ou pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 30%, ou pelo menos cerca de 40%, ou pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% da atividade farmacológica da carga útil não ligada ao XTEN.

[361] Em uma modalidade, os conjugados de XTEN-carga útil podem ser projetados para liberar a carga útil no corpo por hidrólise enzimática ou não específica do ligante, incluindo redução de ligação de dissulfeto, liberação dependente de pH, ou por proteases exógenas ou endógenas, incluindo as proteases da Tabela 9. Macromoléculas podem ser tomadas pela célula por meio de endocitose mediada pelo receptor, endocitose de adsorção ou endocitose de fase fluida (Jain R.K. Transport of molecules across tumor vasculature. (1987) Cancer Metastasis Rev. 6(4), 559-593; Jain R.K. Transport of molecules, particles, and cells in solid tumors. (1999) Ann. Rev. Biomed. Eng. 1, 241-263; Mukherjee S., Ghosh R.N., Maxfield F.R. Endocytosis. (1997) Physiol. Rev. 77(3), 759-803). Após a absorção celular de XTEN-carga útil, a carga útil pode ser liberada por baixos valores de pH em endossomos (pH 5,0 a 6,5) e lisossomos (pH 4,5 a 5,0), bem como por enzimas lisossomais (por exemplo, esterases e proteases). Exemplo de reticulador sensível ao ácido é hidrazona de 6-maleimidodocaproil, que pode ser acoplada aos transportadores portadores de tiol. O ligador de hidrazona é rapidamente clivado em valores de pH < 5 permitindo uma liberação da carga útil no pH acídico de endossomos e lisossomos após a internalização do conjugado (Trail P.A. et al. Effect of linker variation on the stability, potency, and efficacy of carcinoma-reactive BR64-doxorubicin immunoconjugates. (1997) Cancer Res. 57(1), 100-105; Kratz F. et al. Acute and repeat-dose toxicity studies of the (6-maleimidocaproyl)hydrazone derivative of doxorubicin (DOXO-EMCH), an albumin-binding prodrug of the anticancer agent doxorubicin. (2007) Hum. Exp. Toxicol. 26(1), 19-35). O conjugado de mAb-droga clinicamente aprovado, gemtuzumabe ozogamicina (Mylotarg™) é um conjugado de droga-anticorpo contendo um mAb humanizado P67.6 contra CD33, ligado quimicamente à caliqueamicina do agente antibiótico citotóxico. O ligante entre o anticorpo e a droga incorpora duas ligações lábeis: uma hidrazona e um dissulfeto estericamente impedido. Tem sido mostrado que a ligação de hidrazona sensível ao ácido é o sítio de clivagem real (Jaracz S., Chen J., Kuznetsova L.V., Ojima I. Recent advances in tumor-targeting anticancer drug conjugates. (2005) Bioorg. Med. Chem. 13(17), 5043-5054).

[362] Para os conjugados de XTEN-carga útil em que a carga útil está ligada por uma ligação de dissulfeto, a carga útil pode ser liberada do XTEN por redução da ligação de dissulfeto dentro do ligante lábil. Por exemplo, huN901-DM1 é uma pró-droga imunoterapêutica ativada pelo tumor desenvolvida por ImmunoGen, Inc. para o tratamento de câncer de pulmão de células pequenas. A pró-droga consiste em mAb anti-CD56 humanizado (huN901) conjugado com maitansinoide de inibidor de microtúbulo DM1. Uma média de 3,5 a 3,9 moléculas de DM1 são ligadas a cada anticorpo através de ligações de dissulfeto impedido. Embora a ligação de dissulfeto seja estável no sangue, é clivada rapidamente ao entrar na célula direcionada por huM901, assim liberando DM1 ativo (Smith S.V. Technology evaluation: huN901-DM1, ImmunoGen. (2005) Curr. Opin. Mol. Ther. 7(4), 394-401). DM1 também tem sido acoplado a Millennium Pharmaceuticals MLN-591, um mAb de antígeno de membrana específico anti-próstata. DM1 é ligado ao anticorpo através de uma ligação de dissulfeto impedido que fornece a estabilidade de soro ao mesmo tempo que permite a liberação de droga intracelular na internalização (Henry M.D. et al. A prostate-specific membrane antigen-targeted monoclonal antibody-chemotherapeutic conjugate designed for the treatment of prostate cancer. (2004) Cancer Res. 64(21), 7995-8001).

[363] A liberação da carga útil a partir do XTEN do transportador pode ser alcançada através da criação de composições usando peptídeos cliváveis curtos como ligantes entre a carga e o XTEN. Exemplo do conjugado avaliado clinicamente é o conjugado de doxorrubicina-HPMA (N-(2- hidroxipropil)metacrilamida) em que a doxorrubicina é ligada por meio de seu açúcar amino para o copolímero de HPMA através de um espaçador de tetrapeptídeo GlyPheLeuGly que é clivado por proteases lisossomais, tal como catepsina B (Vasey P.A. et al. Phase I clinical and pharmacokinetic study of PK1 [N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymer doxorubicin]: first member of a new class of chemotherapeutic agents-drug-polymer conjugates. (1999) Clin. Cancer Res. 5(1), 83-94). Outros exemplos de conjugados de transportador-droga com ligantes de peptídeo que atingiram o estágio clínico de desenvolvimento são complexos de platina macromoleculares. Dois candidatos de droga baseados em HPMA consistiam em uma estrutura principal de copolímero de HPMA à qual os complexos de platina de aminomalonato complexantes foram ligados por meio de espaçador de peptídeo clivável B de catepsina GlyPheLeuGly ou espaçador de tripeptídeo GlyGlyGly (Rademaker-Lakhai J.M. et al. A Phase I and pharmacological study of the platinum polymer AP5280 given as an intravenous infusion once every 3 weeks in patients with solid tumors. (2004) Clin. Cancer Res. 10(10), 3386-3395; Sood P. et al. Synthesis and characterization of AP5346, a novel polymer-linked diaminocyclohexyl platinum chemotherapeutic agent. (2006) Bioconjugate Chem. 17(5), 1270-1279).

[364] Um método altamente seletivo foi desenvolvido para câncer de próstata alvo através de protease de antígeno prostático específico (PSA) que é quase exclusivamente expressa no tecido da próstata e carcinomas da próstata. Uma nova pró-droga de ligação à albumina de paclitaxel, EMC-ArgSerSerTyrTyrSerLeu-PABC-paclitaxel (EMC: ε- maleimidocaproil; PABC: p-aminobenziloxicarbonil) foi sintetizada. Esta pró-droga era solúvel em água e foi ligada à albumina endógena e exógena. A forma ligada à albumina da pró-droga foi clivada por PSA que libera o paclitaxel-dipeptídeo Ser-Leu-PABC-paclitaxel. Devido à incorporação de um ligante que autoelimina PABC, este dipeptídeo foi rapidamente degradado para liberar o paclitaxel como um produto de clivagem final (Elsadek B. et al. Development of a novel prodrug of paclitaxel that is cleaved by prostate-specific antigen: an in vitro and in vivo evaluation study. (2010) Eur. J. Cancer 46(18), 34343444).

[365] Espaçadores autoimolativos ganharam interesse significante devido à sua utilidade em sistemas de distribuição de pró-droga. Diversos relatórios descreveram sistemas autoeliminantes lineares ou estruturas dendriméricas que podem liberar todas as suas unidades através de uma fragmentação de cadeia semelhante ao domínio, iniciada por um evento de clivagem único (Haba K. et al. Single-triggered trimeric prodrugs. (2005) Angew. Chem., Int. Ed. 44, 716-720; Shabat D. Self-immolative dendrimers as novel drug delivery platforms. (2006) J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 44, 1569-1578.Warnecke A., Kratz F. 2,4-Bis(hydroxymethyl)aniline as a building block for oligomers with self-eliminating and multiple release properties. (2008) J. Org. Chem. 73, 1546-1552; Sagi A. et al. Self-immolative polymers. (2008) J. Am. Chem. Soc. 130, 5434-5435). Em um estudo, uma pró-droga dendrítica autoimolativa com quatro moléculas da camptotecina do agente anticâncer e duas moléculas de PEG5000 foram projetadas e sintetizadas. A pró-droga foi efetivamente ativada pela penicilina-G-amidase sob condições fisiológicas e a camptotecina livre foi liberada para os meios de reação para causar a inibição de crescimento celular (Gopin A. et al. Enzymatic activation of second-generation dendritic prodrugs: conjugation of self-immolative dendrimers with poly(ethylene glycol) via click chemistr y. (2006) Bioconjugate Chem. 17, 1432-1440). A incorporação de um substrato enzimático específico, clivado por uma protease que é superexpressa em células tumorais, poderia gerar sistemas de ativação de pró-droga dendrítica específica de células de câncer altamente eficientes. Exemplos não-limitantes de sequências de espaçador que são cliváveis por proteases são listados na Tabela 9.

[366] Em algumas modalidades, a invenção fornece configurações de XTEN-carga útil, incluindo conjugados diméricos, triméricos, tetraméricos e de ordem mais elevada em que a carga é ligada ao XTEN usando um ligante lábil conforme descrito neste documento, acima. Em uma modalidade do acima exposto, a composição adicionalmente inclui um componente alvo para liberar a composição para um ligante ou receptor em uma célula alvo. Em outra modalidade, a invenção fornece conjugados em que um, dois, três, ou quatro composições de XTEN-carga são conjugados com os ligantes lábeis para anticorpos ou fragmentos de anticorpo, fornecendo composições solúveis para uso em terapia alvo das indicações clínicas tais como, mas não limitados a, vários tratamentos de tumores e outros cânceres em que o anticorpo fornece o componente alvo e então, quando interiorizados dentro da célula alvo, o ligante lábil permite que XTEN-carga desassocie-se da composição e efetue a atividade pretendida (por exemplo, citotoxicidade em uma célula de tumor). Então, as composições inventivas são um tipo de imunoconjugado.

[367] As características não estruturadas e a composição uniforme e a carga de XTEN resultam em propriedades que podem ser exploradas para a purificação de conjugados de XTEN-carga útil seguindo uma reação de conjugação. De utilidade específica é a captura dos conjugados de XTEN por troca iônica, que permite a remoção de carga útil não- reagida e derivados de carga útil. De utilidade específica é a captura de conjugados por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC). Devido à sua natureza hidrofílica, a maioria dos polipeptídeos de XTEN mostram baixa ligação para resinas de HIC, que facilita a captura de conjugados de XTEN-carga útil devido a interações hidrofóbicas entre a carga útil e o material da coluna, e sua separação de XTEN não-conjugado que falhou em conjugar-se com a carga útil durante o processo de conjugação. A alta pureza do XTEN e conjugados de XTEN-carga útil oferece um benefício significativo em comparação com os polímeros mais químicos ou naturais, particularmente cargas úteis peguiladas. A maioria dos polímeros químicos e naturais é produzida por polimerização aleatória ou semialeatória, o que resulta na geração de muitos homólogos. Tais polímeros podem ser fracionados por vários métodos para aumentar a fração da entidade alvo do produto. No entanto, mesmo após o enriquecimento a maioria dos polímeros naturais e seus conjugados de carga útil contém menos de 10% de entidade alvo. Exemplos de conjugados de PEG com G-CSF têm sido descritos em [Bagal, D., et al. (2008) Anal Chem, 80: 240818]. Esta publicação mostra que mesmo um conjugado de PEG que é aprovado para uso terapêutico contém mais de 100 homólogos que ocorrem com uma concentração de pelo menos 10% de entidade alvo.

[368] A complexidade de polímeros aleatórios, tal como PEG, é um impedimento significativo para o monitoramento e controle de qualidade durante a conjugação e purificação. Em contraste, o XTEN purificado pelos métodos descritos neste documento tem altos níveis de pureza e uniformidade. Além disso, os conjugados criados, conforme descrito neste documento, contêm rotineiramente mais do que cerca de 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% do alvo pretendido e na configuração pretendida, resultando na facilidade de interpretar espectros de massa e cromatogramas.

2. XTEN-reticulador monomérico, e Configurações de XTEN- carga útil

[369] Em outro aspecto, a invenção fornece os cojugados de XTEN-reticulador e conjugados de XTEN-carga útil com um único XTEN, em que o conjugado é projetado em diferentes configurações. Seguem configurações exemplares de tais conjugados.

[370] Em uma modalidade, a invenção fornece um conjugado com a configuração de fórmula IV: em que independentemente para cada ocorrência CL1 é um reticulador; x é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2, ou é 1; e XTEN é uma sequência tendo pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3. Em uma modalidade do conjugado de fórmula IV, CL1 é um reticulador selecionado a partir da Tabela 13. Em outra modalidade do conjugado de fórmula IV, x tem as faixas mencionadas acima e um reticulador da Tabela 13 é ligado a cada enxofre de cisteína do XTEN. Em outra modalidade do conjugado de fórmula IV, x tem as faixas mencionadas acima e um reticulador é ligado a cada grupo amino épsilon de lisina do XTEN. Em outra modalidade do conjugado de fórmula IV, x é 1 e um reticulador da Tabela 13 é ligado a cada grupo amino de terminal N do XTEN. Será compreendido por uma pessoa versada na técnica que as composições das modalidades mencionadas acima compreendendo o reticulador conjugado com um XTEN usando os componentes especificados representam o produto de reação dos reagentes individuais e, portanto, diferem da composição exata dos reagentes. Em outra modalidade, a invenção fornece uma preparação do conjugado de fórmula IV em que pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95% das moléculas de XTEN da preparação do conjugado têm comprimento de sequência idêntico.

[371] Em outra modalidade, a invenção fornece um conjugado tendo a configuração de fórmula V: em que independentemente para cada ocorrência CL1 é um reticulador; x é um número inteiro a partir de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2, ou é 1; CL2 é um reticulador que é diferente de CL1; y é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2, ou é 1, com a ressalva de que x + y é > 2; e XTEN é uma sequência tendo pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos creca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência selecionada a partir do grupo estabelecido nas Tabelas 2 e 3. Em uma modalidade do conjugado de fórmula V, CL1 e CL2 são, cada um, selecionados a partir do grupo de reticuladores estabelecidos na Tabela 13. Em uma modalidade do conjugado de fórmula V, x tem as faixas mencionadas acima e cada CL1 é ligado a um grupo amino épsilon de cada lisina do XTEN e y tem as faixas mencionadas acima e cada CL2 é ligado a um grupo de enxofre de cada cisteína do XTEN. Em outra modalidade do conjugado de fórmula V, x é 1 e CL1 é ligado ao grupo amino de terminal N do XTEN e cada CL2 é ligado a um grupo de enxofre de cisteína do XTEN. Será compreendido por uma pessoa versada na técnica que as composições das modalidades mencionadas acima compreendendo o reticulador conjugado com um XTEN usando os componentes especificados representam o produto de reação dos reagentes e, portanto, diferem da composição exata dos reagentes. Em outra modalidade, a invenção fornece uma preparação do conjugado de fórmula V em que pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95% das moléculas de XTEN da preparação do conjugado têm comprimento de sequência idêntico.

[372] Em outro aspecto, a invenção fornece os cojugados de XTEN-carga útil tendo configurações definidas. A invenção aproveita as composições parceiras de conjugação de XTEN- reticulador reativa descritas neste documento para que moléculas reativas de cargas úteis possam ser unidas por reação química.

[373] Em uma modalidade, a invenção fornece um conjugado tendo a configuração de fórmula VI: em que independentemente para cada ocorrência PR1 é um único resíduo de átomo de uma carga útil, em que o resíduo é selecionado a partir do grupo consistindo em carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre; CL1 é um reticulador; x é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 3, ou é 2, ou é 1; e XTEN é uma sequência tendo pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3. Em uma modalidade do conjugado de fórmula VI, o resíduo de átomo único de uma carga útil é de uma carga útil selecionada a partir do grupo consistindo em cargas úteis estabelecidas nas Tabelas 11, 12, 18, 19, e 21. Em uma modalidade do conjugado de fórmula VI, CL1é um reticulador selecionado a partir da Tabela 13. Em uma modalidade do conjugado de fórmula VI, cada reticulador é ligado a um enxofre de cisteína do XTEN. Em outra modalidade do conjugado de fórmula VI, cada reticulador é ligado a cada grupo amino épsilon de lisina do XTEN. Em outra modalidade do conjugado de fórmula VI, x é 1 e o reticulador é ligado ao grupo amino de terminal N do XTEN. Em outra modalidade do conjugado de fórmula VI, CL1 é o produto de reação de um primeiro e um segundo reagente de química pressionada selecionado a partir da Tabela 15. Em outra modalidade, a invenção fornece uma preparação do conjugado de fórmula VI em que pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95% das moléculas de XTEN da preparação do conjugado têm comprimento de sequência idêntico.

[374] Em outra modalidade, a invenção fornece um conjugado tendo a configuração de fórmula VII: em que independentemente para cada ocorrência: P1 é uma carga útil selecionada a partir do grupo consistindo em cargas úteis estabelecidas nas Tabelas 11, 12, 18 , 19, e 21; CL1 é um reticulador; x é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerc a de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2, ou é 1; e XTEN é uma sequência tendo pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3. Em uma modalidade do conjugado de fórmula VII, CL1é um reticulador selecionado a partir da Tabela 13. Em uma modalidade do conjugado de fórmula VII, cada reticulador é ligado a um enxofre de cisteína do XTEN. Em outra modalidade do conjugado de fórmula VII, cada reticulador é ligado a cada grupo amino épsilon de lisina do XTEN. Em outra modalidade do conjugado de fórmula VII, x é 1 e o reticulador é ligado ao grupo amino de terminal N do XTEN. Em uma modalidade, o conjugado de fórmula VII é selecionado a partir do grupo consistindo nos conjugados estabelecidos na Tabela 21. Em outra modalidade do conjugado de fórmula VII, CL1 é o produto de reação de um primeiro e um segundo reagente de química pressionada selecionado a partir da Tabela 15. Será compreendido por uma pessoa versada na técnica que as composições das modalidades mencionadas acima compreendendo a carga útil conjugada com um XTEN-reticulador usando os componentes especificados representam o produto de reação dos reagentes e, portanto, diferem da composição exata dos reagentes. Em outra modalidade, a invenção fornece uma preparação do conjugado de fórmula VII em que pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95% das moléculas de XTEN da preparação do conjugado têm comprimento de sequência idêntico.

[375] Em outra modalidade, a invenção fornece um conjugado tendo a configuração de fórmula VIII: em que independentemente para cada ocorrência PR1 é um único resíduo de átomo de uma carga útil, em que o resíduo é selecionado a partir do grupo consistindo em carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre; PR2 é um único resíduo de átomo de uma carga útil, em que o resíduo é selecionado a partir do grupo consistindo em carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre; CL1 é um reticulador; x é um número inteiro a partir de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2, ou é 1; CL2 é um reticulador que é diferente de CL1; y é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2, ou é 1, com a ressalva de que x + y é > 2; e XTEN é uma sequência tendo pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos creca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequ ência para uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3. Em uma modalidade do conjugado de fórmula VIII, o resíduo de átomo único de uma carga útil é de uma carga útil selecionada a partir do grupo consistindo em cargas úteis estabelecidas nas Tabelas 11, 12, 18, 19, e 21. Em uma modalidade do conjugado de fórmula VIII, CL1 e CL2 são, cada um, selecionados a partir do grupo de reticuladores estabelecidos na Tabela 13. Em uma modalidade do conjugado de fórmula VIII, cada CL1 é ligado ao grupo amino épsilon de lisina do XTEN e cada CL2 é ligado a um grupo de enxofre de cisteína do XTEN. Em outra modalidade do conjugado de fórmula VIII, x é 1 e CL1 é ligado ao grupo amino de terminal N do XTEN e cada CL2 é ligado a um grupo de enxofre de cisteína ou um grupo amino épsilon de lisina do XTEN. Em outra modalidade do conjugado de fórmula VIII, CL1 é o produto de reação de um primeiro e um segundo reagente de química pressionada selecionado a partir da Tabela 15. Em outra modalidade do conjugado de fórmula VIII, C2 é o produto de reação de um primeiro e um segundo reagente de química pressionada selecionado a partir da Tabela 15. Em outra modalidade, a invenção fornece uma preparação do conjugado de fórmula VIII em que pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95% das moléculas de XTEN da preparação do conjugado têm comprimento de sequência idêntico.

[376] Em outra modalidade, a invenção fornece um conjugado tendo a configuração de fórmula IX: em que independentemente para cada ocorrência P1 é uma carga útil selecionada a partir do grupo consistindo em cargas úteis estabelecidas nas Tabelas 11, 12, 18, 19, e 21; P2 é uma carga útil selecionada a partir das cargas úteis estabelecidas nas Tabelas 11, 12, 18, 19, e 21 e que é diferente de P1; CL1 é um reticulador; x é um número inteiro a partir de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2, ou é 1; CL2 é um reticulador que é diferente de CL1; y é um número inteiro de 1 a cerca de 100 , ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2, ou é 1, com a ressalva de que x + y é > 2; e XTEN é uma sequência tendo pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos creca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3. Em uma modalidade do conjugado de fórmula IX, o resíduo de átomo único de uma carga útil é de uma carga útil selecionada a partir do grupo consistindo em cargas úteis estabelecidas nas Tabelas 11, 12, 18, 19, e 21. Em uma modalidade do conjugado de fórmula IX, CL1e CL2 são, cada um, selecionados a partir do grupo de reticuladores estabelecidos na Tabela 13. Em uma modalidade do conjugado de fórmula IX, cada CL1 é ligado ao grupo amino épsilon de lisina do XTEN e cada CL2 é ligado a um grupo de enxofre de cisteína do XTEN. Em outra modalidade do conjugado de fórmula IX, x é 1 e CL1 é ligado ao grupo amino de terminal N do XTEN e cada CL2 é ligado a um grupo de enxofre de cisteína ou um grupo amino épsilon de lisina do XTEN. Em outra modalidade do conjugado de fórmula IX, CL1 é o produto de reação de um primeiro e um segundo reagente de química pressionada selecionado a partir da Tabela 15. Em outra modalidade do conjugado de fórmula IX, C2 é o produto de reação de um primeiro e um segundo reagente de química pressionada selecionado a partir da Tabela 15. Em uma modalidade, o conjugado de fórmula IX é selecionado a partir do grupo consistindo nos conjugados estabelecidos na Tabela 21. Em outra modalidade, a invenção fornece uma preparação do conjugado de fórmula IX em que pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95% das moléculas de XTEN da preparação do conjugado têm comprimento de sequência idêntico.

3. Configurações Diméricas, Triméricas, Tetraméricas, e Multiméricas de conjugados de XTEN-reticuladores e XTEN- carga útil

[377] Em um aspecto, a invenção fornece conjugados em que diferentes números de parceiros de conjugação de XTEN ou XTEN-carga útil são unidos por ligantes em uma configuração definida numericamente; por exemplo, dimérica, trimérica, tetramérica, ou multimérica. Como usado neste documento, "precursor" destina-se a incluir componentes usados como reagentes em uma reação de conjugação, levando a uma composição intermediária ou final, e inclui mas não está limitado a segmentos de XTEN de qualquer comprimento (incluindo o XTEN das Tabelas 2 e 3 ou retratados nas várias fórmulas, acima), XTEN-reticuladores, segmentos de XTEN-carga útil-reticulador, cargas úteis com grupos reativos, ligantes, e outros tais componentes descritos neste documento.

[378] Em algumas modalidades, a invenção fornece conjugados nos quais dois segmentos precursores de XTEN ou XTEN-carga útil são ligados por um reticulador divalente, resultando em uma configuração divalente, tal como mostrado na FIG. 19C e FIG. 27B. Em uma modalidade do conjugado de XTEN- carga útil divalente, cada XTEN-carga útil pode ser uma proteína de fusão monomérica compreendendo um peptídeo ou polipeptídeo biologicamente ativo, em que cada segmento precursor de proteína de fusão é ligado ao ligante divalente pelo grupo alfa-amino do terminal N, resultando no conjugado divalente. Em outra modalidade do conjugado de XTEN-carga útil divalente, cada segmento precursor de XTEN- carga útil é uma proteína de fusão monomérica compreendendo um peptídeo ou polipeptídeo biologicamente ativo, em que cada proteína de fusão é ligada ao ligante divalente no terminal C, resultando no conjugado divalente. Em outra modalidade do conjugado de XTEN-carga útil divalente, cada XTEN compreende uma ou mais cargas úteis (que podem ser um peptídeo, polipeptídeo ou uma droga) conjugadas com o XTEN, em que cada precursor de XTEN é ligado ao outro precursor de XTEN compreendendo um ou mais segundas moléculas de carga útil diferentes por um ligante divalente no terminal N, resultando no conjugado divalente. Em outra modalidade do conjugado de XTEN-carga útil divalente, cada XTEN compreende uma ou mais cargas úteis (que podem ser um peptídeo, polipeptídeo ou uma droga) conjugadas com o XTEN, em que cada precursor de XTEN está ligado a outro precursor de XTEN compreendendo uma ou mais segundas moléculas de carga útil diferentes por um ligante divalente por grupo carboxil ou um grupo modificado no terminal C (incluindo, mas não se limitando ao XTEN modificado pela inserção de uma cisteína no terminal C), resultando no conjugado divalente. Nas modalidades mencionadas acima do parágrafo, como seria apreciado por uma pessoa versada na técnica à luz da presente divulgação, há diferentes abordagens para criar os precursores a serem ligados, tal como conjugar um ligante com um primeiro precursor de XTEN-carga útil e em seguida efetuando uma segunda reação para juntar o precursor ao grupo reativo do terminal do segundo precursor de XTEN-carga útil. Alternativamente, um ou ambos os terminais de XTEN podem ser modificados como precursores que então podem ser unidos por química pressionada ou por outros métodos descritos ou ilustrados neste documento, deixando poucos ou nenhum átomo residual para fazer ponte com a interseção do XTEN. Em outra modalidade, duas sequências de precursor de XTEN-carga útil são ligadas por uma ponte de dissulfeto usando cisteínas ou grupos tiol introduziram em ou perto dos terminais dos reagentes de precursor de reagentes de XTEN-carga útil, resultando em um conjugado de XTEN-carga útil divalente. Seguem configurações exemplares de tais conjugados divalentes.

[379] Em uma modalidade, a invenção fornece um conjugado tendo a configuração de fórmula X: em que independentemente para cada ocorrência PR1 é um único resíduo de átomo de uma primeira carga útil em que o resíduo é selecionado a partir do grupo consistindo em carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre; PR2 é um único resíduo de átomo de uma segunda carga útil em que o resíduo é selecionado a partir do grupo consistindo em carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre; CL1 é um reticulador; x é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2, ou é 1; CL2 é um reticulador que é diferente de CL1; y é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2, ou é 1, com a ressalva de que x + y é > 2; 2xCL é alternativamente um reticulador divalente ou o produto de reação de um primeiro ou um segundo reagente de química pressionada selecionado a partir da Tabela 15; XTEN1 é um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelos menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3; e XTEN2 é um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3. Em uma modalidade do conjugado de fórmula X, CL1e CL2 são, cada um, selecionados a partir do grupo de reticuladores estabelecidos na Tabela 13. Em outra modalidade do conjugado de fórmula X, x é 1 e CL1 é ligado ao grupo amino de terminal N do XTEN. Em outra modalidade do conjugado de fórmula X, CL1 é o produto de reação de um primeiro e um segundo reagente de química pressionada selecionado a partir da Tabela 15. Em outra modalidade do conjugado de fórmula X, C2 é o produto de reação de um primeiro e um segundo reagente de química pressionada selecionado a partir da Tabela 15. Em uma modalidade do conjugado de fórmula X, cada CL1 é ligado ao enxofre de cisteína do XTEN1 e cada CL2 é ligado a um enxofre de cisteína do XTEN2. Em outra modalidade do conjugado de fórmula X, cada CL1 é ligado ao grupo amino épsilon de lisina do XTEN1 e cada CL2 é ligado a um grupo amino épsilon de lisina do XTEN2. Em outra modalidade do conjugado de fórmula X, cada CL1 é ligado a um enxofre de cisteína do XTEN1 e cada CL2 é ligado a um grupo amino épsilon de lisina do XTEN2. Em outra modalidade do conjugado de fórmula X, XTEN1 e XTEN2 são idênticos. Em outra modalidade do conjugado de fórmula X, XTEN1 e XTEN2 são diferentes. Em outra modalidade, a invenção fornece uma preparação do conjugado de fórmula X em que pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95% das moléculas de XTEN da preparação do conjugado têm comprimento de sequência idêntico.

[380] Em outra modalidade, a invenção fornece um conjugado tendo a configuração de fórmula XI: em que independentemente para cada ocorrência P1 é uma primeira carga útil selecionada a partir do grupo de cargas úteis estabelecidas nas Tabelas 11, 12, 18, 19, e 21; P2 é uma segunda carga útil selecionada a partir do grupo de cargas úteis estabelecido nas Tabelas 11, 12, 18, 19, e 21 e que é diferente de P1; CL1 é um reticulador; x é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2, ou é 1; CL2 é um reticulador que é diferente de CL1; y é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2, ou é 1, com a ressalva de que x + y é > 2; 2xCL é alternativamente um reticulador divalente ou o produto de reação de um primeiro e um segundo reagente de química pressionada selecionado a partir da Tabela 15; XTEN1 é um primeiroXTEN substancialmente homogêneo tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3; e XTEN2 é um primeiro XTEN substancialmente homogêneo tendo pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 91%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3. Em uma modalidade do conjugado de fórmula XI, CL1e CL2 são, cada um, selecionados a partir do grupo de reticuladores estabelecidos na Tabela 13. Em outra modalidade do conjugado de fórmula XI, x é 1 e CL1 é ligado ao grupo amino de terminal N do XTEN. Em outra modalidade do conjugado de fórmula XI, CL1 é o produto de reação de um primeiro e um segundo reagente de química pressionada selecionado a partir da Tabela 15. Em outra modalidade do conjugado de fórmula XI, C2 é o produto de reação de um primeiro e um segundo reagente de química pressionada selecionado a partir da Tabela 15. Em outra modalidade do conjugado de fórmula XI, cada CL1 é ligado ao enxofre de cisteína do XTEN1 e cada CL2 é ligado a um enxofre de cisteína do XTEN2. Em outra modalidade do conjugado de fórmula XI, cada CL1 é ligado ao grupo amino épsilon de lisina do XTEN1 e cada CL2 é ligado a um grupo amino épsilon de lisina do XTEN2. Em outra modalidade do conjugado de fórmula XI, cada CL1 é ligado a um enxofre de cisteína do XTEN1 e cada CL2 é ligado a um grupo amino épsilon de lisina do XTEN2. Em outra modalidade do conjugado de fórmula XI, XTEN1 e XTEN2 são idênticos. Em outra modalidade do conjugado de fórmula XI, XTEN1 e XTEN2 são diferentes. Em uma modalidade, o conjugado de fórmula XI é selecionado a partir do grupo consistindo nos conjugados estabelecidos na Tabela 21. Em outra modalidade, a invenção fornece uma preparação do conjugado de fórmula XI em que pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95% das respectivas moléculas de XTEN1 e XTEN2 da preparação do conjugado têm comprimento de sequência idêntico.

[381] Em outras modalidades, a invenção fornece conjugados de XTEN-ligante e XTEN-carga útil do ligante com uma configuração trimérica, como mostrado nas FIGS. 21-23.

[382] A invenção fornece conjugados triméricos nos quais os conjugados de XTEN-reticulador são ligados por um ligante trivalente, resultando em uma configuração trimérica de XTEN-reticulador. Em uma modalidade, a invenção fornece um XTEN-reticulador trimérico tendo a configuração de fórmula XII: em que independentemente para cada ocorrência 3xCL é o reticulador trivalente, CL1 é o primeiro reticulador conjugado com XTEN1, CL2 é o segundo reticulador conjugado com XTEN2, CL3 é o terceiro reticulador conjugado com XTEN3, x é um número inteiro de 1 a cerca de 10, y é um número inteiro de 1 a cerca de 10, z é um número inteiro de 1 a cerca de 10 com a ressalva de que x + y + z é > 3, XTEN1 é o primeiro XTEN tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3; XTEN2 é o segundo XTEN tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3; e XTEN3 é o terceiro XTEN tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3 em que XTEN1, XTEN2, e XTEN3 são iguais ou são diferentes sequências de XTEN. Em uma modalidade do conjugado de fórmula XII, CL1, CL2, e CL3 são, cada um, selecionados a partir do grupo consistindo nos reticuladores estabelecidos na Tabela 13, e são iguais ou são diferentes. Em uma modalidade, o conjugado de fórmula que XII compreende ainda um único resíduo de átomo de uma primeira carga útil conjugado com cada reticulador do primeiro XTEN substancialmente homogêneo, em que o resíduo é selecionado a partir do grupo consistindo em carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre, um único resíduo de átomo de uma segunda carga útil conjugado com cada reticulador do segundo XTEN substancialmente homogêneo, em que o resíduo é selecionado a partir do grupo consistindo em carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre, e um único resíduo de átomo de uma terceira carga útil conjugado com cada reticulador do terceiro XTEN substancialmente homogêneo, em que o resíduo é selecionado a partir do grupo consistindo em carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre.

[383] Em outra modalidade, a invenção fornece conjugados triméricos nos quais três precursores de XTEN-carga útil são ligados por um ligante trivalente, resultando em uma configuração trimérica de XTEN-carga útil, como mostrado nas FIGS. 21 e 97-106. Em uma modalidade, a invenção fornece um XTEN-reticulador trimérico tendo a configuração de fórmula XIII em que independentemente para cada ocorrência 3xCL é o reticulador trivalente que é selecionado a partir do grupo de reticuladores trivalentes estabelecidos nas Tabelas 13 e 14; P1 é conjugada com cada reticulador do primeiro XTEN e é selecionada a partir do grupo consistindo em cargas úteis estabelecidas nas Tabelas 11, 12, 18 e 21, P2 é uma segunda carga útil conjugada com cada reticulador do segundo XTEN e é selecionada a partir do grupo consistindo em cargas úteis estabelecidas nas Tabelas 11, 12, 18 e 21, em que a carga útil é igual ou é diferente da primeira carga útil, e P3 é uma terceira carga útil conjugada com cada reticulador do terceiro XTEN e é selecionada a partir do grupo consistindo nas cargas úteis estabelecidas nas Tabelas 11, 12, 18 e 21, em que a carga útil é igual ou é diferente da primeira ou da segunda carga útil; CL1 é o primeiro reticulador; x é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2, ou é 1; CL2 é um segundo reticulador; y é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2, ou é 1; e z é um número inteiro de 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 50, ou 1 a cerca de 40, ou 1 a cerca de 20, ou 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 5, ou é 9, ou é 3, ou é 2, ou é 1, com a ressalva de que x + y + z é > 3; XTEN1 é o primeiro XTEN tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo das sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3; XTEN2 é o segundo XTEN tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo das sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3; e XTEN3 é o terceiro XTEN tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3 em que XTEN1, XTEN2, e XTEN3 são iguais ou são diferentes sequências de XTEN. Em algumas modalidades, o conjugado de fórmula XIII compreende ainda uma primeira carga útil em que a primeira carga útil é uma fração alvo com afinidade de ligação específica para um alvo, em que a fração alvo é selecionada a partir do grupo consistindo nas frações alvo estabelecidas nas Tabelas 17 a 19 e 21, e pelo menos uma outra das cargas úteis é uma droga em que a droga é selecionada a partir do grupo consistindo nas drogas estabelecidas na Tabela 11, Tabela 19, e Tabela 21. Em uma modalidade do exposto acima, a fração alvo é LHRH ou folato e a droga é selecionada a partir de doxorrubicina, paclitaxel, auristatina, monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F, maitansina, dolastatina, caliqueamicina, alcaloide de vinca, camptotecina, mitomicina C, epotilona, hTNF, Il-12, bortezomibe, ranpirnase, exotoxina de pseudomonas, SN-38, e raquelmicina. Em outra modalidade da composição de conjugado de XTEN trimérico, a composição tem a configuração de fórmula XIV: em que independentemente para cada ocorrência; 3xCL é o reticulador trivalente; CL1 é o primeiro reticulador conjugado com o XTEN1; CL2 é o segundo reticulador conjugado com XTEN2; x é um número inteiro de 1 a cerca de 10; y é um número inteiro de 1 a cerca de 10 com a ressalva de que x + y é > 2; XTEN1 é o primeiro XTEN; XTEN2 é o segundo XTEN; e XTEN3 é o terceiro XTEN em que o XTEN é selecionado a partir do grupo consistindo nas sequências estabelecidas na Tabela 2. Em uma modalidade da composição de conjugado de XTEN trimérico de fórmula XIV, a composição compreende ainda um único resíduo de átomo de uma primeira carga útil para cada primeiro reticulador do primeiro XTEN em que o resíduo é selecionado a partir do grupo consistindo em carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre; e um único resíduo de átomo de uma segunda carga útil conjugada cada segundo reticulador do segundo XTEN em que o resíduo é selecionado a partir do grupo consistindo em carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre. Em outra modalidade da composição de conjugado de XTEN trimérico de fórmula XIV, a composição compreende ainda uma primeira carga útil conjugada com cada primeiro reticulador do primeiro XTENselecionado a partir do grupo consistindo nas cargas úteis estabelecidas nas Tabelas 6, 7, 18 e 21; e uma segunda carga útil conjugada com cada segundo reticulador do segundo XTEN selecionado a partir do grupo consistindo em cargas úteis estabelecidas nas Tabelas 6, 7, 18, e 21, e em que a carga útil é igual ou diferente da primeira carga útil. Em uma modalidade do acima exposto, a primeira carga útil é uma fração alvo com afinidade de ligação específica para um alvo, em que a fração alvo é selecionada a partir do grupo consistindo nas frações alvo estabelecidas nas Tabelas 17 a 19 e 21, e as segundas cargas úteis são uma droga selecionada a partir do grupo consistindo nas drogas estabelecidas na Tabela 6, Tabela 18, e Tabela 21. Em outra modalidade do acima exposto, a primeira carga útil é uma fração alvo que é selecionada a partir do grupo consistindo em LHRH e folato, e a segunda carga útil é uma droga que é selecionada a partir do grupo consistindo em doxorrubicina, paclitaxel, auristatina, monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F, maitansina, dolastatina, caliqueamicina, alcaloide de vinca, camptotecina, mitomicina C, epotilona, hTNF, Il-12, bortezomibe, ranpirnase, exotoxina de pseudomonas, SN-38, e raquelmicina. Em uma modalidade do acima exposto, a primeira carga útil é uma droga selecionada a partir do grupo consistindo nas drogas da Tabela 11 e nas proteínas da Tabela 12 e a segunda carga útil é diferente da primeira carga útil e é selecionada a partir do grupo consistindo nas drogas da Tabela 11 e nas proteínas da Tabela 12. Em outra modalidade do acima exposto, a primeira carga útil e a segunda carga útil são idênticas e são selecionadas a partir do grupo consistindo nas drogas da Tabela 11 e nas proteínas da Tabela 12. Em outra modalidade da composição de conjugado de XTEN trimérico, a composição tem a configuração de fórmula XV: em que independentemente para cada ocorrência; 3xCL é o reticulador trivalente; CL1 é o primeiro reticulador conjugado com o XTEN1; x é um número inteiro de 1 a cerca de 10; XTEN1 é o primeiro XTEN em que o XTEN é selecionado a partir do grupo consistindo nas sequências estabelecidas na Tabela 3; XTEN2 é o segundo XTEN em que o XTEN é selecionado a partir do grupos consistindo nas sequências estabelecidas na Tabela 2; e o XTEN3 é o terceiro XTEN em que o XTEN é selecionado a partir do grupo consistindo no grupo consistindo nas sequências estabelecidas na Tabela 2. Em uma modalidade da composição de conjugado de XTEN trimérico configurada como fórmula XV, a composição compreende ainda um único resíduo de átomo de uma primeira carga útil conjugada com cada primeiro reticulador do primeiro XTEN em que o resíduo é selecionado a partir do grupo consistindo em carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre. Em uma modalidade da composição de conjugado de XTEN trimérico configurada como fórmula XV, a composição compreende ainda uma primeira carga útil conjugada com cada primeiro reticulador do primeiro XTEN selecionado a partir do grupo consistindo nas cargas úteis estabelecidas nas Tabelas 6, 7, 18, e 21.

[384] Em outra modalidade do conjugado de XTEN-carga útil trimérico, cada XTEN-carga útil pode ser uma proteína de fusão monomérica compreendendo um peptídeo ou polipeptídeo biologicamente ativo, em que a proteína de fusão é ligada ao ligante trivalente em um grupo amino ou um grupo tiol do XTEN. Em outra modalidade do conjugado de XTEN-carga útil trimérico, cada XTEN-carga útil pode ser um conjugado de uma carga útil ligada ao XTEN, que pode ser um peptídeo ou polipeptídeo biologicamente ativo ou uma molécula pequena ou toxina farmacologicamente ativa, ligado ao XTEN que, por sua vez, é ligado ao ligante trivalente no terminal N do XTEN. Nas modalidades de XTEN-ligante-carga útil precedentes descritas acima neste parágrafo, as três cargas úteis podem ser idênticas ou podem ser diferentes. Em uma modalidade do conjugado de XTEN-carga útil trimérico, o conjugado compreende pelo menos uma proteína biologicamente ativa e pelo menos uma droga ligada ao XTEN diferente que, por sua vez, é ligado ao ligante trivalente no terminal N do XTEN. Em uma modalidade específica da configuração mencionada acima, a pelo menos uma proteína biologicamente ativa é uma fração alvo e pelo menos uma droga é uma toxina, incluindo, mas não limitada a, doxorrubicina, paclitaxel, auristatina, mono-metil auristatina E, monometil auristatina F, maitansina, dolastatina, caliqueamicina, alcaloide de vinca, camptotecina, mitomicina C, epotilona, hTNF, Il-12, bortezomibe, ranpirnase, exotoxina de pseudomonas, SN-38, e raquelmicina. Dependendo da posição do grupo tiol ou do grupo amino épsilon no XTEN, alguém pode controlar se a carga é interior para (como mostrado na FIG. 23B) ou no terminal do XTEN reticulado (como mostrado na FIG. 23A). Na modalidade mencionada acima, de forma exemplar, frações alvo não-limitantes incluem LHRH, folato, octreotida, pasireotida, bombesina, anticorpos monoclonais, scFV, centri-ínas, e os fragmentos de anticorpo, estruturas e miméticos da Tabela 17. Seguem configurações exemplares de tais conjugados triméricos.

[385] A invenção fornece ainda conjugados de XTEN-ligante e XTEN-carga útil do ligante com uma configuração tetramérica. Em uma modalidade, a invenção fornece conjugados nos quais quatro sequências de XTEN são ligadas por um ligante tetravalente, resultando em uma configuração tetramérica de XTEN-reticulador, tal como mostrado na FIG. 22D. Exemplos não-limitantes de ligantes tetravalentes incluem um tetravalente-tiol, um ligante tetravalente-N- maleimida tal como descrito na Pat. U.S. N° 7.524.821, ou um anticorpo ou fragmento de anticorpo com quatro grupos reativos.

[386] A invenção fornece conjugados em que quatro sequências precursoras de XTEN-reticulador são ligadas por um ligante tetravalente, resultando em uma configuração tetravalente de XTEN-reticulador. Em uma modalidade, a invenção fornece um XTEN-reticulador tetramérico tendo a configuração de fórmula XVI: em que independentemente para cada ocorrência: 4xCL é o reticulador tetravalente; CL1 é o primeiro reticulador conjugado com XTEN1; CL2 é o segundo reticulador conjugado com XTEN2; CL3 é o terceiro reticulador conjugado com XTEN3; CL4 é o quarto reticulador conjugado com XTEN4; v é um número inteiro de 1 a cerca de 10; x é um número inteiro de 1 a cerca de 10; y é um número inteiro de 1 a cerca de 10; z é um número inteiro de 1 a cerca de 10 com a ressalva de que x + y + z é > 4; XTEN1 é o primeiro XTEN tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3; XTEN2 é o segundo XTEN tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3; XTEN3 é o terceiro XTEN tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91% , ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93% , ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95% , ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97% , ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3 em que XTEN1, XTEN2, e XTEN3 são iguais ou diferentes sequências de XTEN; XTEN4 é o quarto XTEN tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3 em que XTEN1, XTEN2, XTEN3 e XTEN4 são iguais ou são diferentes sequências de XTEN.

[387] A invenção fornece conjugados nos quais quatro sequências precursoras de XTEN-carga útil são ligadas por um ligante tetravalente, resultando em uma configuração tetravalente de XTEN-carga útil como mostrado nas FIGS. 22C e 105. Em uma modalidade, a invenção fornece um XTEN-carga útil tetramérico tendo a configuração de fórmula XVII: em que independentemente para cada ocorrência: 4xCL ,é o reticulador tetravalente; P1 é conjugada com cada reticulador do primeiro XTEN e é selecionada a partir do grupo consistindo nas cargas úteis estabelecidas nas Tabelas 11, 12, 18 e 21, P2 éuma segunda carga útil conjugada com cada reticulador do segundo XTEN e é selecionada a partir do grupo consistindo nas cargas úteis estabelecidas nas Tabelas 11, 12, 18 e 21, em que a carga útil é a mesma ou é diferente da primeira carga útil, P3 é uma terceira carga útil conjugada com cada reticulador do terceiro XTEN e é selecionada a partir do grupo consistindo nas cargas úteis estabelecidas nas Tabelas 11, 12, 18 e 21, em que a carga útil é a mesma ou é diferente da primeira ou da segunda carga útil; P4 é uma quarta carga útil conjugada com cada reticulador do quarto XTEN e é selecionada a partir do grupo consistindo nas cargas úteis estabelecidas nas Tabelas 11, 12, 18 e 21, em que a carga útil é a mesma ou é diferente da primeira, da segunda ou da terceira carga útil; CL1 é o primeiro reticulador conjugado com o XTEN1; CL2 é o segundo reticulador conjugado com o XTEN2; CL3 é o terceiro reticulador conjugado com o XTEN3; CL4 é o quarto reticulador conjugado com o XTEN4; v é um número inteiro de 1 a cerca de 10; x é um número inteiro de 1 a cerca de 10; y é um número inteiro de 1 a cerca de 10; z é um número inteiro de 1 a cerca de 10 com a ressalva de que x + y + z é > 4; XTEN1 é o primeiro XTEN tendo pelo menos 8 0%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3 ; XTEN2 é o segundo XTEN tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3; XTEN3 é o terceiro XTEN tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de seuqência para uma sequência estabelecida a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3 em que XTEN1, XTEN2, e XTEN3 são iguais ou são diferentes sequências de XTEN; XTEN4 é o quarto XTEN tendo pelo menos 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada a partir do grupo de sequências estabelecidas nas Tabelas 2 e 3 em que XTEN1, XTEN2, XTEN3 e XTEN4 são as mesmas ou são diferentes sequências de XTEN.

[388] Em outra modalidade do conjugado de XTEN-carga útil tetravalente, cada XTEN-carga útil pode ser uma proteína de fusão monomérica compreendendo um peptídeo ou polipeptídeo biologicamente ativo, em que a proteína de fusão é ligada ao ligante tetravalente em um grupo amino ou um grupo tiol do XTEN. Em outra modalidade do conjugado de XTEN-carga útil tetravalente, cada XTEN-carga útil pode ser um conjugado de uma carga útil, que pode ser um peptídeo ou polipeptídeo biologicamente ativo ou uma molécula pequena ou toxina farmacologicamente ativa, ligado ao XTEN que, por sua vez, é ligado ao ligante tetravalente pelo terminal N do XTEN. Nas modalidades de XTEN-ligante-carga útil precedentes descritas acima neste parágrafo, as quatro cargas úteis podem ser idênticas ou podem ser diferentes. Em uma modalidade específica da configuração mencionada acima, a pelo menos uma proteína biologicamente ativa é uma fração alvo e pelo menos uma droga é uma toxina, incluindo, mas não limitada a, doxorrubicina, paclitaxel, auristatina, maitansina, dolastatina, caliqueamicina, alcaloide de vinca, camptotecina, mitomicina C, epotilona, hTNF, Il-12, bortezomibe, ranpirnase, exotoxina de pseudomonas, SN-38, e raquelmicina. Dependendo da posição do grupo tiol ou do grupo amino épsilon no XTEN, alguém pode controlar se a carga é interior para ou no terminal do XTEN reticulado.

4. Configurações Multivalentes para Quatro ou Mais Cargas de XTEN

[389] Usando XTEN da tabela 3, composições são contempladas contendo quatro ou mais moléculas de carga de XTEN ligadas à estrutura principal projetada de cisteína ou lisina, resultando em uma configuração de multivalentes do tipo "pente", ou ligando múltiplos precursores ramificados para fazer uma configuração de "dendrímero", conforme ilustrado na FIG. 7. Em uma encarnação, o conjugado de configuração multivalente é criado por reagir um XTEN projetado de cisteína ou lisina com uma carga de XTEN compreendendo um ligador apropriado para a reação com XTEN projetado de cisteína ou lisina (conforme ilustrado na FIG. 24), resultando no produto final. Em outra encarnação, o conjugado de configuração multivalente é criado reagindo um XTEN projetado de cisteína ou lisina com ligadores com uma carga de XTEN compreendendo uma cisteína ou um grupo amino primário ou epsilon apropriado para reação com o ligador ligado com o XTEN projetado de cisteína ou lisina, resultando no produto final. Nas incorporações, a valência do produto final é controlada pelo número de grupos reativos incorporados no XTEN, seja um aminoácido reativo ou ligador. Além disso, está previsto que o produto final possa ser projetado para localizar a carga ou perto dos terminais XTEN, o que melhora a interação com o ligante, ou perto dos pontos de ramificação para proteger a carga e reduzir o grau de interação com o ligante.

5. Configurações de Carga Bi-específicas na Estrutura Principal de XTEN Monômero

[390] Em outro aspecto, a invenção fornece conjugados que contém duas moléculas de carga diferentes ligadas a uma única estrutura principal de XTEN projetado de cisteína ou lisina, conforme ilustrado na FIG. 27A, resultando em um conjugado bivalente. Em uma encarnação, o conjugado de configuração bivalente é criado reagindo o XTEN projetado, tal como aqueles fornecidos na tabela 3, com uma primeira carga de XTEN compreendendo um ligador apropriado para a reação com o XTEN projetado de cisteína, seguido por uma segunda reação com uma segunda carga de XTEN compreendendo um ligador apropriado para reação com o XTEN projetado de lisina, resultando no produto final. O número e a localização de cargas são controlados pelo design do XTEN projetado, com a colocação do grupo amino ou tiol reativo sendo determinante. Em uma encarnação, o conjugado bivalente é composto por uma única molécula de uma primeira carga e uma única molécula de uma segunda carga ligada ao XTEN projetado de cisteína-lisina por ligadores. Em outra encarnação, o conjugado bivalente é composto por uma, ou duas, ou três, ou quatro, ou cinco moléculas de uma primeira carga e uma única molécula de uma segunda carga ligada a XTEN projetado de cisteína-lisina por ligadores. Em outra encarnação, o conjugado bivalente é composto por uma ou duas, ou três, ou quatro, ou cinco moléculas de uma primeira carga e uma, ou duas, ou três, ou quatro ou cinco moléculas de uma segunda carga ligada para ao XTEN projetado de cisteína-lisina por ligadores.

[391] Em outra encarnação, o conjugado de configuração bivalente é criado reagindo o XTEN projetado de cisteína e lisina, tal como os da tabela 3, com um primeiro ligador apropriado para a reação com o XTEN projetado de cisteína, seguido por uma segunda reação com um ligador apropriado para reação com o XTEN projetado de lisina, em seguida reagindo a estrutura principal de reticulador XTEN com uma primeira carga com um grupo reativo tiol capaz de reagir com o primeiro ligador, seguido por uma reação de uma segunda carga com um grupo amino capaz de reagir com o segundo reticulador, resultando no produto final.

6. Conjugados de Carga de XTEN e reticulador XTEN Grupos de Liberação de Espaçador

[392] Em outro aspecto, a invenção fornece conjugados de carga de XTEN e reticulador XTEN configurados com um ou mais espaçadores incorporados em ou adjacentes a XTEN que são projetados para incorporar ou aprimorar uma funcionalidade ou propriedade na composição, ou como um auxílio na montagem ou fabricação das composições. Tais propriedades incluem, mas não estão limitadas a, inclusão de uma sequência capaz de ser clivada proteoliticamente ou um grupo funcional lábil para permitir a liberação da carga, ou um espaçador pode ser introduzido entre uma sequência de XTEN e um componente de carga para diminuir impedimento estérico, tal que o componente de carga possa interagir apropriadamente com seu ligante alvo.

[393] Em uma encarnação, os um ou mais espaçadores são incorporados nos ligadores dos conjugados do sujeito. Para espaçadores e métodos de identificação de espaçadores desejáveis, ver, por exemplo, George, et al. (2003) Protein Engineering 15:871-879, especificamente incorporados por referência neste documento. Em uma modalidade, o espaçador é composto por uma ou mais sequências peptídicas que são entre 1-50 resíduos de aminoácidos de comprimento, ou cerca de 1-25 de resíduos ou cerca de 1-10 de resíduos de comprimento. Sequências de espaçador, exclusivas de sítios de clivagem, podem incluir qualquer um dos 20 L-aminoácidos naturais e de preferência terão propriedades similares a XTEN em que a maioria dos resíduos será de hidrofílicos que são estericamente sem impedimentos. O espaçador pode ser poliglicinas ou polialaninas, ou é predominantemente uma mistura de combinações de resíduos de alanina, serina e glicina. Em uma encarnação, a sequência de espaçador é uma sequência da tabela 15. Em uma outra modalidade, a sequência de espaçador é GPEGPS.

[394] Além disso, sequências de espaçador são projetadas para evitar a introdução de epítopos de célula T que, em parte, é possível evitar ou limitar o número de aminoácidos hidrofóbicos, utilizado no espaçador; a determinação dos resumos é descrita acima e nos exemplos.

[395] Em uma encarnação, o espaçador compreende um grupo de liberação que permite a liberação da carga do conjugado. Em outra encarnação, o reticulador compreende um grupo de liberação que permite a liberação da carga do conjugado. O grupo de liberação pode ser qualquer grupo lábil, fornecendo para tal um anexo liberável. Em uma encarnação, o grupo de lançamento é uma ligação quimicamente clivável ou ligação quimicamente lábil. Tais ligações normalmente podem ser clivadas por métodos que são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, tal como por ácido, base, oxidação, redução, deslocamento ou eliminação. Em uma determinada encarnação, a ligação quimicamente clivável compreende uma base modificada, um açúcar modificado, uma ligação de dissulfureto, um grupo quimicamente clivável incorporado no reticulador ou espaçador. Alguns exemplos destas ligações são descritos na PCT WO 96/37630 e PAT. U.S. N° 7,132,519, a qual é incorporada neste documento por referência. Grupos de liberação englobados pela invenção também incluem grupos ou ligações cliváveis por uma enzima. Grupos de liberação enzimaticamente cliváveis incluem ligações de amida ou fosfodiéster, bem como sítios de reconhecimento de endonuclease de restrição. Em uma encarnação, a invenção fornece composições que compreendem uma ou mais cargas, em que um ligador clivável de valina- citrulina está entre a carga e o XTEN, permitindo clivagem composição é internalizada intracelularmente; por exemplo, dentro de uma célula de tumor. Em outra encarnação, grupos de liberação são cliváveis por nucleases. Estas nucleases podem normalmente ser uma exonuclease ou uma endonuclease de restrição. Exonucleases típicas incluem exonucleases específicas para ambos os ácidos polinucleicos de fita única e fita dupla. Além disso, as endonucleases de restrição englobadas por determinadas encarnações incluem as endonucleases de restrição de tipo IIS e tipo II. Em outras encarnações, o grupo de liberação pode ser uma sequência que é clivável por uma protease, onde a sequência é selecionada a partir das sequências estabelecidas na tabela 9. Proteases típicas atuando em sequências adequadas para inclusão nas composições inventivas incluem endoproteinases, incluindo as proteinases do quadro 9.

7. Bibliotecas de Configurações Carga de XTEN

[396] Em outro aspecto, a invenção fornece bibliotecas de precursores de carga de XTEN, métodos para fazer as bibliotecas e métodos para combinar os precursores de biblioteca em uma abordagem combinatória, conforme ilustrado nas FIGS. 34-35, para conseguir combinações ideais e a razão ideal de cargas. Em uma encarnação, a invenção fornece uma biblioteca de XTEN individual, cada qual ligados a 1 ou 2, ou 3, ou 4, ou 5, ou 6, ou 7, ou 8 ou 9, ou 10 ou mais moléculas de uma determinada carga, incluindo aquelas descritas neste documento, para criar a biblioteca de precursores de carga de XTEN. No método, uma série de precursores de carga de XTEN a ser ligados são conjugados ainda a um ligador, é posteriormente misturado e reagido com os outros precursores de carga de XTEN capazes de reagir com o ligador em condições para efetuar a conjugação, resultando em uma biblioteca das várias permutações e razões de cargas ligadas a XTEN. Uma tal biblioteca em seguida é triada em um ensaio in vitro ou in vivo apropriado para avaliar um parâmetro em uma determinada indicação clínica (por exemplo, câncer, doença metabólica, diabetes) para determinar as composições fornecendo a resposta ideal. Em uma encarnação exemplar, uma categoria de precursores de carga inclui vários módulos de direcionamento, tais como peptídeos (por exemplo, as frações de direcionamento da tabela 17), com afinidade de ligação para um antígeno associado a tumor da tabela 20, e a segunda categoria de precursor é uma ou mais drogas, como uma droga citotóxica ou uma droga escolhida da tabela 9. Cada categoria de precursor a ser ligado é ainda conjugada a um ligador e, conforme ilustrado na FIG. 36, é posteriormente misturada e reagida com outros precursores carga de XTEN capazes de reagir com o ligador em condições para efetuar a conjugação, resultando em uma biblioteca das várias frações de direcionamentos e permutações de droga em razões diferentes umas das outras. Os conjugados de carga de XTEN são projetados para permitir razões fixas de uma carga para outra; por exemplo, é 1:1, ou 1:1.5, ou 1:2, ou 1:3, ou 2:3, ou 1:4, ou 1:5 ou 1:9, no caso de duas cargas diferentes. Intervalos semelhantes de razões seriam aplicados para conjugados de biblioteca compreendendo 3, 4, 5 ou mais cargas.

[397] Em outras encarnações, as bibliotecas são construídas usando três ou mais cargas conhecidas por ter um efeito benéfico no tratamento de uma doença comum. Em uma encarnação, uma biblioteca é composta por cargasligadas a XTEN, em que cada carga é uma droga biologicamente eficaz para atenuar uma doença comum. Em outra encarnação, uma biblioteca compreende cargas ligadas a XTEN, onde cada droga ou biológico é eficaz no tratamento de diferentes sintomas de uma doença comum. Em outra encarnação, uma biblioteca compreende cargas ligadas s a XTEN, onde cada droga ou biológico intermedia seu efeito terapêutico através de um caminho biológico comum. Nas modalidades anteriores de bibliotecas, a doença comum é selecionada a partir de câncer, cuidados de suporte de câncer, sistema nervoso central, cardiovascular, doença endócrina, gastrointestinal, genito-urinária, hematológica, infecção por HIV, sistema hormonal, inflamação, doença autoimune, doença infecciosa, doença metabólica, doenças músculo- esqueléticas, distúrbios de nefrologia, doenças oftalmológicas, dor, e respiratória. Com maior particularidade, a doença para a qual as bibliotecas são construídas com cargas conhecidas por ter um efeito benéfico é selecionada da tabela 16. Cargas apropriadas para o uso no tratamento ou prevenção de tais doenças incluem aquelas descritas neste documento (por exemplo, as cargas das tabelas 11, 12, 18 e 21), ou podem ser encontradas em bancos de dados comumente acessíveis ou caso contrário seriam conhecidas por aqueles versados na técnica. Tabela 16: Doenças para as quais as cargas são indicadas

[398] Em uma encarnação, conforme ilustrado na FIG. 37, o conjugado bi-específico tem um módulo de drogas ligado a XTEN por um ligador clivável ou lábil, em que o ligador pode ser clivado ou desassocia após a administração a um sujeito, inclusive por internalização intracelular em uma célula alvo pelos módulos de direcionamento. Em outra encarnação a droga está ligada a XTEN por um ligador não clivável mas o conjugado permanece suscetível à degradação. Após internalização o XTEN é clivado por proteases e a droga conectada ao seu ligador é liberada, resultando em citotoxicidade.

[399] Em uma personificação exemplar, o módulo de direcionamento é hormônio luteinizante liberador de hormônio (também conhecido como LHRH, GnRH e hormônio liberador de gonadotrofinas), a droga é a doxorrubicina, em que a proporção de LHRH para doxorrubicina é 1:1, ou 1:1.5, ou 1:2, ou 1:3, ou 1:9, ou 2:3, ou 3:1, ou 3:2, ou 2:1 ou 1.5:1. O conjugado pode ser gerado a partir de precursores de XTEN. Um precursor de XTEN pode ter 1, 2, ou mais moléculas de drogas e um reticulador reativo ou reagente de química click ou um aminoácido reativo. Um precursor de XEN segundo tem 1, 2, ou mais domínios de LHRH para direcionamento e um reticulador reativo ou reagente de química click ou um aminoácido reativo. Ambos os segmentos de precursor então se juntam por reação entre grupos reativos do XTEN respectivo. Em uma encarnação exemplar o grupo reativo é uma azida que é conjugada com o N-terminal do primeiro segmento de XTEN através de um reticulador; e grupo reativo do segundo XTEN é um alquino que é conjugado com o N-terminal do segundo segmento de XTEN através de um reticulador. Em uma outra encarnação do conjugado LHRH- XTEN-droga, a droga é maitansina. Em uma outra encarnação do conjugado LHRH-XTEN-droga, a droga é auristatinaa.

8. Conjuga de Carga de XTEN Ligados às Frações de Direcionamento

[400] Em outro aspecto, a presente invenção fornece conjugadas composições que compreende uma ou mais composições XTEN-carga ligadas à segmentação metades. As composições direcionadas do sujeito encontram utilidade no tratamento de uma variedade de condições onde entrega seletiva de uma carga terapêutica ou tóxica para uma célula, tecido ou órgão é desejada. A invenção contempla uma diversidade de frações de direcionamento para uso em composições do sujeito, incluindo os anticorpos, fragmentos de anticorpos e miméticos de anticorpo incluindo, mas não limitado a esses conjuntos estabelecidos na tabela 17, bem como peptídeos e pequenas moléculas capazes de ligar ligantes ou receptores associados com doença ou anormalidade metabólica ou fisiológica. Em uma encarnação, a invenção fornece um conjugado compreendendo pelo menos uma fração de direcionamento das tabelas 17, 18 ou 21 ligadas a pelo menos um XTEN. Em outra encarnação, a invenção fornece um conjugado compreendendo pelo menos uma fração de direcionamento das tabelas 17, 18 ou 21 ligadas a cada um de pelo menos dois ou três ou quatro XTEN. Em outra encarnação, a invenção fornece um conjugado compreendendo pelo menos uma fração de direcionamento das tabelas 17, 18 ou 21 ligada a pelo menos um XTEN e pelo menos uma droga ou carga biológica selecionada do grupo constituído pelas cargas estabelecidas na tabela 11, tabela 12, tabela 18 ou tabela 21 ligadas a pelo menos um XTEN. Em uma encarnação, a invenção fornece composições de conjugado droga-XTEN- fração de direcionamento em que a composição é seletivamente entregada a um ligante ou receptor em uma célula alvo, que pode então ser interiorizada dentro da célula, como ilustrado na FIG. 37, resultando em um efeito farmacológico conhecido por aqueles versados na técnica para o componente de droga.

[401] Conforme ilustrado nas Figs. 21-24 e 28-32, tais composições de conjugado podem ter diferentes valências, com um, dois, três, ou quatro ou mais moléculas de carga de XTEN ligadas a um ou mais anticorpo de direcionamento ou fração de direcionamento. No caso de frações de direcionamento de anticorpo, em uma encarnação as cargas de XTEN estão ligadas por um reticulador a uma cisteína em uma região de dobradiça do anticorpo. Em outra encarnação, a carga de XTEN está ligada por uma ponte de dissulfeto a uma cisteína em uma região de dobradiça do anticorpo. Por conseguinte, um conjugado anticorpo-XTEN-carga pode incluir 1, 2, 3 ou 4 ou mais segmentos de carga de XTEN ligados ao anticorpo, fragmento de anticorpo ou mimético. Em outra encarnação Xten é conjugado fora da região de dobradiça, o que inclui a inserção de cisteína no anticorpo para controlar sítios de conjugação ou pela conjugação de cadeias laterais de lisina existentes. A ligação da carga de XTEN para criar os conjugados de anticorpo tem muitos benefícios: a) a carga de XTEN serve como um ligador clivável, b) fornece solubilidade, c) permite definir a relação de carga de droga por IgG e d) pode ser pre- conjugada com drogas para simplificar a fabricação. Tabela 17: Frações de Direcionamento: Fragmentos de anticorpo, andaimes e miméticos

[402] Em algumas encarnações, a invenção fornece conjugados compreendendo um componente de direcionamento como uma carga e uma toxina como uma segunda carga, com uma ou mais cópias de cada tipo de carga ligadas ao XTEN da composição. Em uma variação do acima exposto, o conjugado, opcionalmente, pode ter a toxina ligada para ao XTEN com um ligador lábil ou clivável tal que a toxina seja liberada quando entregue ao ou seja internalizada dentro do alvo. Em uma outra variação do que foi acima exposto, o componente de direcionamento é um anticorpo ou fragmento de anticorpo, com um, dois, três ou quatro composições de carga de XTEN conjugadas com ligadores ao anticorpo (por exemplo, conjugadas com cisteínas na região de dobradiça como ilustrado nas FIGS. 28-29), fornecendo conjugados para utilização em terapia de direcionamento de indicações clínicas tais como, mas não limitadas a, vários tratamentos de tumores e outros tipos de câncer em que o anticorpo fornece o componente de direcionamento e a carga de XTEN efetua a atividade pretendida (por exemplo, citotoxicidade em uma célula de tumor). Daí, os inventivos conjugados são um tipo de imunoconjugado. Os conjugados alvo podem ser projetados com componentes direcionamento que são derivados de anticorpos, ou miméticos de anticorpo, ou são peptídeos ou pequenas moléculas que ligam ligantes associados com células ou órgãos doentes. Exemplos não limitantes das categorias de fragmentos de anticorpos, andaimes e miméticos são fornecidos na tabela 17. Exemplos não limitados de componentes específicos de direcionamentos, os alvos aos quais são dirigidos e as toxinas que podem ser utilizadas como cargas nos conjugados inventivos são fornecidas na tabela 18. É especificamente contemplado que as composições de conjugado alvo da divulgação presente incluem composições de qualquer componente de direcionamento dado que possa ser usado em combinação com uma ou mais de qualquer das toxinas do quadro 18 ou das cargas fornecidas na tabela 11 ou tabela 12. É ainda contemplado que um conjugado de carga de XTEN pode incluir dois ou mais componentes de direcionamento, que podem ser idênticos ou podem ser diferentes. Está contemplado que tais conjugados podem ser usados no tratamento de condições tais como mas não se limitando às estabelecidos na tabela 15. Tabela 18: Frações de direcionamento exemplares, cargas de toxina e alvos aos quais composições de conjugados podem ser dirigidas

[403] Em encarnações particulares, a invenção fornece conjugados de carga de XTEN compreendendo um ou mais componentes de direcionamento para LHRH selecionados da tabela 19 e um ou mais componentes de drogas selecionados da tabela 11. Na personificação precedente, o LHRH pode ser ligado a um segmento de XTEN que, por sua vez, está ligado a um ou mais segmentos de XTEN aos quais os componentes de droga são conjugados. Alternativamente, os componentes de LHRH e de drogas podem ser conjugados com um XTEN monomérico. Além disso, os componentes da droga, opcionalmente, podem ser ligados a XTEN usando ligadores lábeis ou cliváveis que permitem que a droga seja liberada do conjugado após a administração a um sujeito. Tabela 19: LHRH exemplar

[404] Alvos adicionais contemplados para os quais podem ser direcionados os conjugados de carga de XTEN incluem antígenos associados a tumor listados na tabela 20. Em uma encarnação, a invenção fornece conjugados de carga de XTEN compreendendo um ou mais componentes de direcionamento capazes de ligar um ou mais alvos da tabela 20. Tabela 20: Alvos de antígeno associado a tumor

[405] Em incorporações particulares, a invenção fornece conjugados de carga de XTEN compreendendo um, dois ou mais componentes de direcionamento e um, dois ou mais componentes de droga conjugados com XTEN. Incorporações não limitantes de composições específicas de conjugado são fornecidas na tabela 21, em que a composição nomeadas da coluna 2 tem componentes específicos de: i) sequências de XTEN da tabela 3 designadas na coluna XTEN da tabela; ii) cargas de fração de direcionamento especificadas na coluna de Fração de Direcionamento a da tabela que fornece capacidade de direcionamento da composição (com o número de frações especificadas; por exemplo, 1x ou 3x); e iii) farmacóforo de droga especificado na coluna de Fração de Droga da tabela (com o número de moléculas de drogas conjugadas com o XTEN; por exemplo, 3x ou 9 x). Como seria estimado por aqueles versados na técnica, a invenção contempla outras combinações de componentes divulgadas, bem como diferentes números ou razões dos respectivos componentes especificados, bem como diferentes sequências de XTEN às quais cargas são conjugadas. Por exemplo, a invenção contempla que o número de frações de drogas ligado a um determinado XTEN pode ser 1, ou 2, ou 3, ou 4, ou 5, ou 6, ou 7, ou 8, ou 9 ou 10 ou mais e que o XTEN teria, por exemplo, o número correspondente de resíduos de cisteína ou lisina aos quais as frações de drogas seriam conjugadas. Além disso, a invenção contempla que o número de frações de direcionamento ligadas ao conjugado pode ser 1 ou 2, ou 3 ou mais, que da mesma forma estariam ligadas a XTEN com um grupo amino do N-terminal ou um número correspondente de resíduos de lisina ou cisteína. Tabela 21: Conjugados de exemplo

V). COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[406] A presente invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo conjugados de carga de XTEN da divulgação. Em uma encarnação, a composição farmacêutica compreende um conjugado selecionado do grupo constituído pelos conjugados estabelecidos na tabela 21 e pelo menos um transportador farmaceuticamente aceitável. Em uma encarnação, a composição farmacêutica compreende um conjugado compreendendo pelo menos uma primeira sequência XTEN tendo pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 93%, ou pelo menos cerca de 94%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96% ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% ou tendo 100% de identidade de sequência para uma sequência selecionada do grupo de sequências estabelecidas na tabela 2 e tabela 3 onde as sequências XTEN da composição são substancialmente homogêneas em comprimento, e em que o XTEN é conjugado com pelo menos uma primeira carga selecionada do grupo de cargas de estabelecidos nas Tabelas 11, 12, 18, 19 e 21, e em que a composição compreende ainda pelo menos um transportador farmaceuticamente aceitável. Em uma encarnação, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um conjugado de carga de XTEN qualquer uma das encarnações aqui descritas e pelo menos um transportador farmaceuticamente aceitável.

[407] A invenção fornece um método de preparação de uma composição farmacêutica, compreendendo a etapa de combinar uma composição de conjugado com sujeito das modalidades com pelo menos um transportador farmaceuticamente aceitável em uma formulação farmaceuticamente aceitável. Conjugados de carga de XTEN da presente invenção podem ser formulados de acordo com os métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, em que a carga de XTEN [e combinada em mistura com um veículo transportador farmaceuticamente aceitável, tais como soluções aquosas, tampões, emulsões ou suspensões farmaceuticamente aceitáveis. Propil etileno glicol, polietileno glicol e óleos vegetais são exemplos de solventes não aquosos. Formulações terapêuticas são preparadas para armazenamento, misturando o ingrediente ativo com o desejado grau de pureza com transportadores fisiologicamente aceitáveis opcionais, excipientes ou estabilizadores, conforme descrito em Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. As composições farmacêuticas podem ser administradas por qualquer meio apropriado ou rota, incluindo por via subcutânea, por via subcutânea por bomba de infusão, por via intramuscular e via intravenosa. Será apreciado que a rota preferencial irá variar com a doença e a idade do beneficiário e a gravidade da condição a ser tratada. Bomas osmóticas podem ser usadas como agentes de liberação lenta na forma de comprimidos, cápsulas ou dispositivos implantáveis. Bombas de seringa também podem ser usadas como agentes de liberação lenta. Tais dispositivos são descritos em Pat. U.S. N ° s 4.976.696; 4.933.185; 5.017.378; 6.309.370; 6.254.573; 4.435.173; 4.398.908; 6.572.585; 5.298.022; 5.176.502; 5.492.534; 5.318.540; e 4.988.337, cujo conteúdo é incorporado a adendo por referência. Aqueles versados na técnica, considerando tanto a divulgação da presente invenção e as divulgações dessas outras patentes, poderiam produzir uma bomba de seringa para a liberação prolongada das composições da presente invenção.

[408] Em outra encarnação, a invenção fornece um conjugado de carga de XTEN de qualquer uma das encarnações aqui descritas para o uso em fazer um medicamento útil para o tratamento de uma condição, incluindo, mas não se limitando às condições estabelecidas na tabela 16.

VI). MÉTODOS DE TRATAMENTO

[409] A invenção fornece um método de tratamento de uma doença em um sujeito, compreendendo a administração ao sujeito uma quantidade eficaz do conjugado de carga de XTEN de qualquer uma das encarnações precedentes para um sujeito em necessidade disso. Em uma encarnação, a carga de XTEN compreende um único tipo de carga selecionado das tabelas 11, 12, 18, 19 e 21. Em outra encarnação, a carga de XTEN compreende dois tipos de cargas, selecionados a partir das tabelas 11, 12, 18, 19 e 21. Em outra encarnação, a carga de XTEN compreende dois tipos de cargas, em que uma carga é selecionada das tabelas 11, 12 e 18 e a segunda carga é uma fração de direcionamento com afinidade de ligação a um destino da tabela 20 ou é uma fração de direcionamento de qualquer uma das tabelas 18, 19 ou 21. Em outra encarnação, a carga de XTEN compreende mais de três ou mais tipos de cargas, selecionados a partir das tabelas 11, 12, 18, 19 e 21. No método, a carga do conjugado é uma conhecida por aqueles versados na técnica por ter um efeito benéfico ou afinidade com uma doença alvo quando administrada a um sujeito com uma determinada doença ou condição. Em uma encarnação, a(s) carga(s) da composição medeia seu efeito terapêutico através de um caminho biológico comum. Nas modalidades anteriores do parágrafo, o método é útil em tratar ou melhorar ou prevenir uma doença selecionada a partir de câncer, cuidados de suporte de câncer, sistema nervoso central, cardiovascular, doença endócrina, gastrointestinal, genito-urinária, hematológica, infecção por HIV, sistema hormonal, inflamação, doença autoimune, doença infecciosa, doença metabólica, doenças musculoesqueléticas, distúrbios de nefrologia, doenças oftalmológicas, dor, e respiratória. Com maior particularidade, a doença é selecionada da tabela 16.

[410] Em algumas encarnações do método de tratamento, a composição de conjugado pode ser administrada por via subcutânea, intramuscular ou intravenosa. Em uma encarnação, a composição é administrada usando uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em uma encarnação, a administração de duas ou mais doses consecutivas da quantidade terapeuticamente eficaz resulta em um ganho em tempo gasto dentro de uma janela terapêutica para a composição em comparação com a carga não ligada a XTEN e administrada utilizando doses comparáveis a um sujeito. O ganho em tempo gasto dentro da janela terapêutica pode demorar pelo menos três vezes mais do que carga não modificada, ou alternativamente, pelo menos quatro ou cinco vezes, ou seis vezes, ou sete vezes, ou oito vezes, ou nove vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vinte vezes, ou pelo menos cerca de 30 vezes ou pelo menos cerca de 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes mais de carga não ligada a XTEN.

[411] Em uma personificação do método de tratamento, uma menor quantidade de moles/kg de cerca de duas vezes menos, ou cerca de três vezes menos, ou cerca de quatro vezes menos, ou cerca de cinco vezes menos, ou cerca de seis vezes menos ou cerca de oito vezes menos, ou cerca de 10 vezes menos ou mais do conjugado ou composição farmacêutica, compreendendo o conjugado é administrado a um sujeito em necessidade respectiva em comparação com a correspondente carga(s) não ligada a XTEN sob um regime de dose necessário manter um efeito terapêutico e o conjugado atinge uma área comparável sob a curva como a quantidade de mol/kg correspondente da carga(s) não ligada a XTEN necessário manter um efeito terapêutico. Em outra encarnação, o conjugado ou composição farmacêutica compreendendo o conjugado requer administração menos frequente para tratamento de rotina de um sujeito, onde a dose de conjugado ou composição farmacêutica é administrada a cerca de cada quatro dias, cerca de cada sete dias, cerca de cada 10 dias, cerca de cada 14 dias, cerca de cada 21 dias ou cerca de mensalmente para o assunto, e o conjugado atinge uma área comparável sob a curva como da carga(s) correspondente não ligada a XTEN e administrado ao sujeito. Em ainda outras encarnações, uma menor quantidade acumulativa de cerca de 5%, ou cerca de 10%, ou cerca de 20%, ou cerca de 40%, ou cerca de 50%, ou cerca de 60%, ou cerca de 70%, ou cerca de 80% ou cerca de 90% menos do conjugado é administrada a um sujeito em comparação com a quantidade correspondente de carga(s) não ligada a XTEN sob um regime de dose necessário para manter uma concentração de sangue eficaz, no entanto, o conjugado atinge pelo menos uma área comparável sob a curva como a carga(s) correspondente não ligada a XTEN. A menor quantidade de acumulativa é medida por um período de pelo menos cerca de uma semana, ou cerca de 14 dias, ou cerca de 21 dias ou cerca de um mês. Em algumas encarnações do método, o efeito terapêutico é um parâmetro medido, sintoma clínico ou ponto de extremidade conhecido na técnica a ser associado com a condição subjacente do sujeito a ser tratada ou prevenida.

[412] Em uma encarnação, a invenção fornece um método de tratamento de uma célula de câncer in vitro, compreendendo a administração para uma cultura de uma célula de câncer uma composição que inclui uma quantidade eficaz de uma composição de carga de XTEN, em que a primeira carga é uma fração de direcionamento e a segunda carga é uma toxina da tabela 21. Em outra encarnação, a invenção fornece um método de tratamento de um câncer em um sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de uma composição de carga de XTEN em que a primeira carga é uma fração de direcionamento e a segunda carga é uma toxina da tabela 21. Em uma encarnação do método, a composição farmacêutica compreende a composição tendo a estrutura estabelecida na FIG. 117. Em uma outra encarnação do método, o câncer é selecionado do grupo constituído por câncer de pulmão de células não pequenas ou mesotelioma. Câncer de ovário resistente à platina, câncer de endométrio, adenocarcinoma do pulmão e tumores avançados refratários. Em uma outra encarnação do método, a administração resulta em pelo menos 10%, ou 20%, ou 30%, ou 40%, ou 50%, ou 60%, ou 70%, ou 80% ou 90% maior melhoria de pelo menos um, dois ou três parâmetros associados com um câncer em comparação com um sujeito não tratado em que os parâmetros são selecionados a partir do grupo consistindo de taxa de resposta conforme definido pelos Critérios de Avaliação da Resposta em Tumores Sólidos (RECIST), tempo para progressão do câncer (recaída), detecção de recorrência local, descoberta de metástase regional, descoberta de metástase à distância, aparecimento de sintomas, hospitalização, aumento da exigência de medicação para dor, exigência de quimioterapia de resgate, exigência da cirurgia de resgate, exigência da radioterapia de resgate, insuficiência de tempo para tratamento e aumento do tempo de sobrevivência.

[413] Em um outro aspecto, a invenção apresenta um regime de tratamento de um sujeito com uma doença, sendo que esse regime compreende uma composição que compreende um conjugado de qualquer uma das modalidades descritas neste instrumento. Em uma modalidade do regime, o regime compreende ainda a etapa de determinação da quantidade da composição farmacêutica, compreendendo o CFXTEN necessário para atingir o efeito terapêutico no paciente.

[414] A invenção apresenta conjugados compreendendo um regime de tratamento para um sujeito doente compreendendo a administração de uma composição farmacêutica compreendendo um conjugado de qualquer uma das modalidades descritas neste documento em duas ou mais doses sucessivas administradas em uma quantidade eficaz, em que a administração resulta na melhora de pelo menos um parâmetro associado à doença.

VII). KITS DE CONJUGAÇÃO

[415] Em outro aspecto, a invenção apresenta um kit para facilitar o uso das composições do conjugado do reticulador XTEN. Em uma modalidade, o kit compreende um reticulador XTEN em uma formulação, um recipiente e um rótulo no ou associado ao recipiente. Na modalidade anterior, o reticulador XTEN pode ser qualquer uma das modalidades descritas neste instrumento. O recipiente possui reticulador XTEN em uma concentração definida em um tampão apropriado para o uso em uma reação de conjugação para se ligar a uma carga útil.

VIII) . KITS FARMACÊUTICOS

[416] Em outro aspecto, a invenção apresenta um kit para facilitar o uso das composições do conjugado. O kit é composto pela composição farmacêutica apresentada neste documento, um recipiente e um rótulo ou bula sobre ou associado ao recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc., formados a partir de uma variedade de materiais como o vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição farmacêutica como uma formulação que é eficaz para tratar o sujeito e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). A bula pode listar as indicações aprovadas pela droga, instruções para a reconstituição e/ou a administração da droga para o uso de indicações aprovadas, dosagem apropriada e informações de segurança e indicações que permitam identificar o lote e validade da droga. Em uma outra modalidade do acima exposto, o kit pode incluir um segundo recipiente que pode transportar um diluente adequado para a composição farmacêutica, cuja utilização irá fornecer ao usuário a concentração adequada para ser distribuída ao sujeito. Em outra modalidade, o kit é composto por, pelo menos, num primeiro recipiente: um primeiro recipiente: uma quantidade de uma droga da composição do conjugado suficiente para administrar no tratamento de um sujeito com uma doença; uma quantidade de um transportador farmaceuticamente aceitável; um segundo recipiente que pode transportar um diluente adequado para a composição do objeto, que oferecerá ao usuário uma concentração apropriada da composição farmacêutica a ser distribuída ao sujeito; juntamente com um rótulo que identifica a droga e as condições de armazenamento e manipulação e/ou uma folha de das indicações aprovadas para a droga e instruções para a reconstituição e/ou administração da droga para o uso no tratamento de uma indicação aprovada, dosagem apropriada e informações de segurança e informações que identifiquem o lote e validade da droga.

IX) . SEQUÊNCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS DA INVENÇÃO

[417] A presente invenção apresenta ácidos polinucleicos isolados que codificam os componentes do polipeptídeo dos conjugados e sequências complementares às moléculas de ácido polinucleico que codificam os componentes do polipeptídeo dos conjugados. Em algumas modalidades, a invenção apresenta ácidos polinucleicos que codificam o XTEN de quaisquer modalidades do conjugado descritas neste instrumento, ou o complemento do ácido polinucleico. Em uma modalidade, os ácidos polinucleicos codificam um XTEN selecionado do grupo que consiste no XTEN mencionados nas tabelas 2 e 3 ou o complemento do ácido polinucleico.

[418] Em outras modalidades, a invenção apresenta ácidos polinucleicos que codificam o XTEN ligado às sequências de clivagem, marcadores de afinidade proteína de sequências auxiliares de quaisquer modalidades descritas neste documento, ou o complemento dos ácidos polinucleicos. Em uma modalidade, os ácidos polinucleicos codificam uma carga útil de proteína selecionada do grupo que consiste em cargas úteis de proteína mencionadas nas tabelas 7, 18, 19 e 21 ou complemento do ácido polinucleico.

[419] Em uma modalidade, a invenção abrange métodos para produzir ácidos polinucleicos que codificam o XTEN e o XTEN ligado à sequência de clivagem, marcadores de afinidade e modalidades de proteína de sequências auxiliares, ou sequências complementares aos ácidos polinucleicos, incluindo variantes homólogas dos mesmos. Em geral e conforme ilustrado nas FIGS. 38 e 39, os métodos de produzir uma codificação de sequência polinucleotídica para um XTEN e expressar o produto do gene resultante incluem juntar nucleotídeos codificando o XTEN, ligar os componentes no quadro, incorporar o gene codificante em um vetor de expressão apropriado para uma célula hospedeira, transformar a célula hospedeira adequada com o vetor de expressão, e cultivar a célula hospedeira em condições causando ou permitindo que o XTEN seja expresso na célula hospedeira transformada, produzindo assim o polipeptídeo de XTEN biologicamente ativo, que é recuperado pelos métodos aqui descritos ou pelos métodos de purificação da proteína padrão conhecidos na técnica. Técnicas recombinantes padrão em biologia molecular são usadas para fazer polinucleotídeos e vetores de expressão da presente invenção.

[420] Em conformidade com a invenção, sequências de ácidos nucleicos que codificam XTEN ou XTEN ligado às sequências de clivagem, marcadores de afinidade e proteína de sequências auxiliares (ou seu complemento) são usadas para gerar as moléculas de DNA recombinantes que direcionam a expressão em células hospedeiras adequadas. Várias estratégias de clonagem são adequadas para a realização da presente invenção, sendo que muitas delas são usadas para gerar um construto que compreende uma codificação de gene para um XTEN ou uma composição de carga útil da presente invenção, ou o seu complemento. Em uma modalidade, a estratégia de clonagem é usada para criar um gene que codifica um XTEN que compreende nucleotídeos que codificam o XTEN que é usado para transformar uma célula hospedeira para a expressão da composição do XTEN. Nas modalidades anteriores descritas acima neste parágrafo, os genes podem ainda compreender nucleotídeos que codificam sequências de clivagem, marcadores de afinidade e sequências auxiliares. Em outra modalidade, a estratégia de clonagem é usada para criar um gene que codifica uma carga de proteína que compreende nucleotídeos que codificam a carga que é usada para transformar uma célula hospedeira para a expressão da composição da carga.

[421] Ao se projetar uma sequência de XTEN desejada, foi descoberto que a natureza não repetitiva do XTEN das composições inventivas é alcançada apesar do uso de uma abordagem molecular "bloco de construção" na criação de sequências de codificação de XTEN. Isto foi conseguido através da utilização de uma biblioteca de polinucleotídeos que codificam motivos de sequência de peptídeo, descritos acima, que são então ligados e/ou multimerizados para criar os genes que codificam as sequências de XTEN (ver FIGS. 38 e 39 e Exemplos). Assim, enquanto o XTEN(s) do polipeptídeo expresso pode consistir em várias unidades de poucos a quatro motivos de sequência diferentes, já que os motivos próprios consistem em sequências de aminoácidos não repetitivas, a sequência de XTEN global é considerada não repetitiva. Nesse sentido, em uma modalidade, os polinucleotídeos de codificação do XTEN compreendem vários polinucleotídeos que codificam sequências não repetitivas, ou motivos, ligados operavelmente em estrutura e em que as sequências de aminoácido do XTEN expressas são não repetitivas.

[422] Em uma abordagem, um construto é primeiro preparado contendo a sequência de DNA correspondente ao XTEN. Métodos exemplificativos para a preparação desses construtos são descritos nos Exemplos. O construto é, então, usado para criar um vetor de expressão adequado para transformar uma célula hospedeira, como uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, E. coli) para a expressão e recuperação do XTEN. Métodos exemplificativos para a criação de vetores de expressão, a transformação de células hospedeiras e a expressão e a recuperação de XTEN estão descritos nos Exemplos.

[423] A codificação de gene para o XTEN pode ser feita em uma ou mais etapas, seja de maneira totalmente sintética ou por síntese combinada com os processos enzimáticos, como clonagem mediada por enzimas de restrição, PCR e extensão de sobreposição, incluindo métodos descritos com mais detalhes nos Exemplos. Os métodos divulgados neste documento podem ser usados, por exemplo, para ligar sequências curtas de polinucleotídeos que codificam XTEN em genes do XTEN mais longos com um comprimento e sequência desejados. Em uma modalidade, o método liga dois, três, quatro ou mais oligonucleotídeos otimizados para o códon que codificam motivo de XTEN ou sequências de segmento de cerca de 9 a 14 aminoácidos, ou cerca de 12 a 20 aminoácidos, ou cerca de 18 a 36 aminoácidos ou cerca de 48 a cerca de 144 aminoácidos, ou cerca de 144 a cerca de 288 aminoácidos ou maior, ou qualquer combinação das variações supracitadas do motivo ou dos comprimentos de segmento. Como alternativa, o método divulgado é usado para multimerizar sequências de codificação de XTEN em sequências maiores de comprimento desejado; por exemplo, um gene que codifica 36 aminoácidos de XTEN pode ser dimerizado em um gene que codifica 72 aminoácidos e, em seguida, 144 e, em seguida, 288, etc. Mesmo com multimerização, polipeptídeos de XTEN podem ser construídos de modo que o gene de codificação do XTEN tenha baixa ou praticamente nenhuma repetitividade através do projeto dos códons selecionado para os motivos da menor unidade sendo usada, o que pode reduzir a recombinação e aumentar a estabilidade do gene de codificação no hospedeiro transformado. Os genes que codificam o XTEN com sequências não repetitivas são montados a partir de oligonucleotídeos que usam técnicas padrão de síntese do gene. O projeto do gene pode ser executado usando algoritmos que otimizam o uso do códon e a composição do aminoácido. Em um método da invenção, uma biblioteca de construtos relativamente curtos de polinucleotídeos que codificam XTEN é criada e então montada, como descrito acima. Os genes resultantes são então montados com genes que codificam o peptídeo ou o polipeptídeo de carga e com os genes resultantes usados para transformar uma célula hospedeira e produzir e recuperar a carga do XTEN para avaliação de suas propriedades, conforme descrito neste documento.

[424] Os polinucleotídeos resultantes que codificam o XTEN e as sequências de peptídeo às quais estão vinculados podem ser clonados individualmente em um vetor de expressão. A sequência do ácido nucleico é inserida no vetor por uma variedade de procedimentos. Em geral, o DNA é inserido em locais de endonuclease de restrição apropriados usando técnicas conhecidas na técnica. Componentes do vetor incluem, geralmente, entre outros, uma ou mais de uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição. Construção de vetores apropriados contendo um ou mais desses componentes utiliza técnicas de ligação padrão que são conhecidas por aqueles versados na técnica. Essas técnicas são bem conhecidas na técnica e bem descritas na literatura científica e de patente. Vários vetores estão publicamente disponíveis. O vetor pode, por exemplo, ser na forma de um plasmídeo, cosmídeo, partícula viral ou fago que pode ser convenientemente submetido a procedimentos do DNA recombinante, e a escolha do vetor dependerá frequentemente da célula hospedeira na qual será introduzido. Assim, o vetor pode ser um vetor replicante autonomamente, ou seja, um vetor, que existe como uma entidade extracromossômica, sendo que a sua replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado no genoma da célula hospedeira e replicado em conjunto com os cromossomos em que foi integrado. Plasmídeos representativos são ilustrados na FIG. 17, com regiões de codificação para diferentes configurações de componentes FVIII e XTEN retratados.

[425] A invenção prevê a utilização de vetores de expressão de plasmídeo contendo replicação e sequências controle que são compatíveis e reconhecidas pela célula hospedeira e estão operavelmente ligadas ao gene que codifica o polipeptídeo para expressão controlada do polipeptídeo. O vetor normalmente carrega um sítio de replicação, bem como sequências que codificam proteínas que são capazes de apresentar seleção fenotípica em células transformadas. Tais sequências de vetor são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. Vetores de expressão úteis que podem ser usados incluem, por exemplo, segmentos de sequências de DNA cromossômico, não- cromossômico e sintético. "Vetor de expressão" se refere a um construto de DNA contendo uma sequência de DNA que esteja operavelmente vinculada a uma sequência de controle apropriada capaz de efetuar a expressão do DNA que codifica o polipeptídeo em um hospedeiro adequado. Os requisitos são que os vetores sejam replicáveis e viáveis na célula hospedeira de escolha. Vetores de números de alta ou baixa cópia podem ser utilizadas como desejado.

[426] Vetores apropriados incluem, entre outros, derivados de SV40 e pcDNA e plasmídeos bacterianos conhecidos como col EI, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX, conforme descrito por Smith, et al., Gene 57:31-40 (1988), pMB9 e seus derivados, plasmídeos como RP4, DNAs de fago como os inúmeros derivados do fago I como NM98 9, bem como outro DNA de fago como M13 e DNA de fago de fita única; plasmídeos de fermento como o plasmídeo de 2 mícrons ou derivados do plasmídeo de 2 m, bem como vetores de transporte de fermento Integrativo e centoméricos; vetores úteis em células eucarióticas como vetores úteis em células de insetos ou de mamíferos; vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNAs de fago, como plasmídeos que foram modificados para empregar DNA de fago ou sequências de controle de expressão; e afins. Sistemas de expressão de fermento que também podem ser usados na presente invenção incluem, entre outros, o vetor de pYES2 de não-fusão (Invitrogen), os vetores de fusão pYESHisA, B, C (Invitrogen), pRS e afins. As sequências de controle do vetor incluem um promotor para efetuar transcrição, uma sequência de operador opcional para controlar essa transcrição, uma sequência que codifica locais adequados de vinculação de ribossomo de mRNA e sequências que controlam a terminação da transcrição e tradução. O promotor pode ser qualquer sequência de DNA, que mostre a atividade transcricional na célula hospedeira de escolha e possa ser derivada de genes que codificam proteínas homólogas ou heterólogas à célula hospedeira. Promotores apropriados para o uso em vetores de expressão com hospedeiros procarióticos incluem os sistemas promotores de -lactamase e de lactose [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544(1979)], fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], e promotores híbridos como promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 80:21-25 (1983)], tudo operavelmente ligado ao DNA que codifica polipeptídeos de CFXTEN. Promotores para uso em sistemas bacterianos também podem conter uma sequência Shine-Dalgarno (S.D.) operavelmente ligada ao DNA que codifica polipeptídeos de CFXTEN.

EXEMPLOS Exemplo 1: Construção de segmentos de motivo de XTEN_AD36

[427] O exemplo a seguir descreve a construção de uma coleção de genes otimizados para códon que codificam sequências de motivo de 36 aminoácidos. Como primeiro passo, um vetor contido pCW0359 foi construído com base em um vetor pET e inclui um promotor T7 pCW0359 codifica um domínio de ligação de celulose (CBD) e um sítio de reconhecimento de protease TEV seguido por uma seqüência contida que é ladeada por sítios BsaI, BbsI e KpnI. Os sítios BsaI e BbsI foram inseridos de modo que gerem saliências compatíveis após a digestão. A sequência contida é seguida por uma versão truncada do gene GFP e um marcardor His. A sequência contida contém códons de parada e, portanto, as células de E. coli que possuem plasmídeo contido pCW0359 formam colônias não-fluorescentes. O vetor contido pCW0359 foi digerido com BsaI e KpnI para remover o segmento contido e o fragmento de vetor resultante foi isolado por purificação por gel de agarose. As sequências foram designadas XTEN_AD36, refletindo a família de motivos AD. Seus segmentos têm a sequência de aminoácidos [X]3 onde X é um peptídeo 12mer com as sequências: GESPGGSSGSES, GSEGSSGPGESS, GSSESGSSEGGP, ou GSGGEPSESGSS. A inserção foi obtida pelo recozimento dos seguintes pares de pares de oligonucleotídeos fosforilados sintéticos: AD1for: AGGTGAATCTCCDGGTGGYTCYAGCGGTTCYGARTC AD1rev: ACCTGAYTCRGAACCGCTRGARCCACCHGGAGATTC ADfor: AGGTAGCGAAGGTTCTTCYGGTCCDGGYGARTCYTC AD2rev: ACCTGARGAYTCRCCHGGACCRGAAGAACCTTCGCT ADfor: AGGTTCYTCYGAAAGCGGTTCTTCYGARGGYGGTCC AD3rev: ACCTGGACCRCCYTCRGAAGAACCGCTTTCRGARGA ADfor: AGGTTCYGGTGGYGAACCDTCYGARTCTGGTAGCTC

[428] Nós também anelamos o oligonucleotídeo fosforilado 3KpnIstopperFor: AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC e oligonucleotídeo não-fosforilado pr_3KpnIstopperRev: CCTCGAGTGAAGACGA. Os pares de oligonucleotídeos recozidos foram ligados, o que resultou em uma mistura de produtos com comprimento variável que representa o número variável de repetições de 12mer ligado a um segmento de BbsI/KpnI. Os produtos correspondentes ao comprimento de 36 aminoácidos foram isolados a partir da mistura por eletroforese em gel de agarose preparativa e ligados ao vetor contido digerido pCW0359 BsaI/KpnI. A maioria dos clones na biblioteca resultante designada LCW0401 mostrou uma fluorescência verde após a indução, o que mostra que a sequência de XTEN_AD36 foi ligada em quadro com o gene GFP e que a maioria das sequências de XTEN_AD36 tinham bons níveis de expressão.

[429] Nós triamos 96 isolados da biblioteca LCW0401 para nível elevado de fluorescência marcando-os na placa de ágar contendo IPTG. Os mesmos isolados foram avaliados por PCR e 48 isolados foram identificados que continham segmentos com 36 aminoácidos, bem como forte fluorescência. Estes isolados foram sequenciados e 39 clones foram identificados que continham segmentos correto de XTEN_AD36. Os nomes de arquivo dos construtos de nucleotídeos e de aminoácidos para esses segmentos estão listados na tabela 22.Tabela 22: Sequências de DNA e de Aminoácidos para motivos 36 mer

Exemplo 2: Construção de segmentos XTEN_AE36

[430] Uma biblioteca de códon que codifica sequências de XTEN de 36 aminoácidos de comprimento foi construída. A sequência de XTEN foi designada para XTEN_AE36. Seus segmentos têm a sequência de aminoácidos [X]3 onde X é um peptídeo 12mer com a sequência: GSPAGSPTSTEE, GSEPATSGSE TP, GTSESA TPESGP, ou GTSTEPSEGSAP. A inserção foi obtida pelo recozimento dos seguintes pares de pares de oligonucleotídeos fosforilados sintéticos: AE1for: AGGTAGCCCDGCWGGYTCTCCDACYTCYACYGARGA AE1rev: ACCTTCYTCRGTRGARGTHGGAGARCCWGCHGGGCT AE2for: AGGTAGCGAACCKGCWACYTCYGGYTCTGARACYCC AE2rev: ACCTGGRGTYTCAGARCCRGARGTWGCMGGTTCGCT AE3for: AGGTACYTCTGAAAGCGCWACYCCKGARTCYGGYCC AE3rev: ACCTGGRCCRGAYTCMGGRGTWGCGCTTTCAGARGT AE4for: AGGTACYTCTACYGAACCKTCYGARGGYAGCGCWCC AE4rev: ACCTGGWGCGCTRCCYTCRGAMGGTTCRGTAGARGT

[431] Também realizamos o recozimento do oligonucleotídeo fosforilado 3KpnIstopper Para: AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC e o oligonucleotídeo não fosforilado pr_3KpnIstopper Rev: CCTCGAGTGAAGACGA. Os pares de oligonucleotídeos recozidos foram ligados, o que resultou em uma mistura de produtos com comprimento variável que representa o número variável de repetições de 12mer ligado a um segmento de BbsI/KpnI. Os produtos correspondentes ao comprimento de 36 aminoácidos foram isolados a partir da mistura por eletroforese em gel de agarose preparativa e ligados ao vetor contido digerido pCW0359 BsaI/KpnI. A maioria dos clones na biblioteca resultante designada LCW0402 mostrou uma fluorescência verde após a indução, o que mostra que a sequência de XTEN_AE36 foi ligada em quadro com o gene GFP e que a maioria das sequências de XTEN_AE36 tinham bons níveis de expressão.

[432] Nós triamos 96 isolados da biblioteca LCW0402 para nível elevado de fluorescência marcando-os na placa de ágar contendo IPTG. Os mesmos isolados foram avaliados por PCR e 48 isolados foram identificados que continham segmentos com 36 aminoácidos, bem como forte fluorescência. Estes isolados foram sequenciados e 37 clones foram identificados que continham segmentos corretos de XTEN_AE36. Os nomes de arquivo dos construtos de nucleotídeos e de aminoácidos para esses segmentos estão listados na tabela 23.Tabela 23: Sequências de DNA e de Aminoácidos para motivos de 36-mer

Exemplo 3: Construção de segmentos XTEN_AF36

[433] Uma biblioteca de códon que codifica sequências de 36 aminoácidos de comprimento foi construída. As sequências foram designadas para XTEN_AF36. Seus segmentos têm a sequência de aminoácidos [X]3 onde X é um peptídeo 12mer com a sequência: GSTSESPSGTAP, GTSTPESGSASP, GTSPSGESSTAP, ou GSTSSTAESPGP. A inserção foi obtida pelo recozimento dos seguintes pares de pares de oligonucleotídeos fosforilados sintéticos: AF1for: AGGTTCTACYAGCGAATCYCCKTCTGGYACYGCWCC AF1rev: ACCTGGWGCRGTRCCAGAMGGRGATTCGCTRGTAGA AF2for: AGGTACYTCTACYCCKGAAAGCGGYTCYGCWTCTCC AF2rev: ACCTGGAGAWGCRGARCCGCTTTCMGGRGTAGARGT AF3for: AGGTACYTCYCCKAGCGGYGAATCTTCTACYGCWCC AF3rev: ACCTGGWGCRGTAGAAGATTCRCCGCTMGGRGARGT AF4for: AGGTTCYACYAGCTCTACYGCWGAATCTCCKGGYCC AF4rev: ACCTGGRCCMGGAGATTCWGCRGTAGAGCTRGTRGA

[434] Nós também anelamos o oligonucleotídeo fosforilado 3KpnIstopperFor: AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC and the non-phosphorylated oligonucleotide pr_3KpnIstopperRev: CCTCGAGTGAAGACGA. Os pares de oligonucleotídeos foram ligados, o que resultou em uma mistura de produtos com comprimento variável que representa o número variável de repetições de 12mer ligadas a um segmento de BbsI/KpnI. Os produtos correspondentes ao comprimento de 36 aminoácidos foram isolados da mistura por eletroforese em gel de agarose preparativa e ligados ao vetor contido digerido pCW0359 de BsaI/KpnI. A maioria dos clones na biblioteca resultante designada LCW0403 mostrou uma fluorescência verde após a indução, o que mostra que a sequência de XTEN_AF36 foi ligada em quadro com o gene da GFP e que a maioria das sequências de XTEN_AF36 tinham bons níveis de expressão.

[435] Nós triamos 96 isolados da biblioteca LCW0403 para nível elevado de fluorescência marcando-os na placa de ágar contendo IPTG. Os mesmos isolados foram avaliados por PCR e 48 isolados foram identificados que continham segmentos com 36 aminoácidos, bem como forte fluorescência. Estes isolados foram sequenciados e 44 clones foram identificados que continham segmentos corretos de XTEN_AF36. Os nomes de arquivo dos construtos de nucleotídeos e de aminoácidos para esses segmentos estão listados na tabela 24.Tabela 24: Sequências de DNA e de Aminoácidos para motivos de 36-mer

Exemplo 4: Construção de segmentos XTEN_AG36

[436] Uma biblioteca de códon que codifica sequências de 36 aminoácidos de comprimento foi construída. As sequências foram designadas como XTEN_AG36. Seus segmentos têm a sequência de aminoácidos [X]3 onde X é um peptídeo 12mer com a sequência: GTPGSGTASSSP, GSSTPSGATGSP, GSSPSASTGTGP, ou GASPGTSSTGSP. A inserção foi obtida pelo recozimento dos seguintes pares de pares de oligonucleotídeos fosforilados sintéticos: AG1for: AGGTACYCCKGGYAGCGGTACYGCWTCTTCYTCTCC AG1rev: ACCTGGAGARGAAGAWGCRGTACCGCTRCCMGGRGT AG2for: AGGTAGCTCTACYCCKTCTGGTGCWACYGGYTCYCC AG2rev: ACCTGGRGARCCRGTWGCACCAGAMGGRGTAGAGCT AG3for: AGGTTCTAGCCCKTCTGCWTCYACYGGTACYGGYCC AG3rev: ACCTGGRCCRGTACCRGTRGAWGCAGAMGGGCTAGA AG4for: AGGTGCWTCYCCKGGYACYAGCTCTACYGGTTCTCC AG4rev: ACCTGGAGAACCRGTAGAGCTRGTRCCMGGRGAWGC

[437] Nós também anelamos o oligonucleotídeo fosforilado 3KpnIstopperFor: AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC e oligonucleotídeo não-fosforilado pr_3KpnIstopperRev: CCTCGAGTGAAGACGA. Os pares de oligonucleotídeos recozidos foram ligados, o que resultou em uma mistura de produtos com comprimento variável que representa o número variável de repetições de 12mer ligado a um segmento de BbsI/KpnI. Os produtos correspondentes ao comprimento de 36 aminoácidos foram isolados a partir da mistura por eletroforese em gel de agarose preparativa e ligados ao vetor contido digerido pCW0359 de BsaI/KpnI. A maioria dos clones na biblioteca resultante designada LCW0404 mostrou uma fluorescência verde após a indução, o que mostra que a sequência de XTEN_AG36 tinha sido ligada em quadro com o gene da GFP e que a maioria das sequências de XTEN_AG36 tinham bons níveis de expressão.

[438] Nós triamos 96 isolados da biblioteca LCW0404 quanto ao nível elevado de fluorescência marcando-os na placa de ágar contendo IPTG. Os mesmos isolados foram avaliados por PCR e 48 isolados foram identificados que continham segmentos com 36 aminoácidos, bem como forte fluorescência. Estes isolados foram sequenciados e 44 clones foram identificados que continham segmentos correto de XTEN_AG36. Os nomes de arquivo dos construtos de nucleotídeos e de aminoácidos das sequências para esses segmentos estão listados na tabela 25.Tabela 25: Sequências de DNA e Aminoácidos para motivos de 36 mer

Exemplo 5: Construção de XTEN_AE864

[439] XTEN_AE864 foi construído a partir de dimerização serial de XTEN_AE36 para AE72, 144, 288, 576 e 864. Uma coleção de segmentos de XTEN_AE72 foi construída a partir de 37 segmentos diferentes de XTEN_AE36. Culturas de E. coli, abrigando todos os 37 segmentos diferentes de 36 aminoácidos foram misturadas e o plasmídeo foi isolado. Este agrupamento de plasmídeo foi digerido com BsaI/NcoI para gerar o fragmento pequeno como a inserção. O mesmo agrupamento de plasmídeo foi digerido com BbsI/NcoI para gerar o fragmento grande como o vetor. A inserção e os fragmentos do vetor foram ligados, resultando em uma duplicação do comprimento e a mistura de ligação foi transformada em células BL21Gold(DE3) para obter colônias de XTEN_AE72.

[440] Esta biblioteca de segmentos XTEN_AE72 foi designada LCW0406. Todos os clones de LCW0406 foram combinados e dimerizados novamente usando o mesmo processo descrito acima, resultando em uma biblioteca LCW0410 de XTEN_AE144. Todos os clones de LCW0410 foram combinados e dimerizados novamente usando o mesmo processo, conforme descrito acima rendendo biblioteca LCW0414 de XTEN_AE288. Dois isolados, LCW0414.001 e LCW0414.002 foram aleatoriamente escolhidos da biblioteca e sequenciados para verificar as identidades. Todos os clones de LCW0414 foram combinados e dimerizados novamente usando o mesmo processo, conforme descrito acima, resultando em uma biblioteca LCW0410 de XTEN_AE144. Nós triamos 96 isolados da biblioteca LCW0418 para nível elevado de fluorescência de GFP. 8 isolados com os tamanhos certos de inserções por PCR e forte fluorescência foram sequenciados e 2 isolados (LCW0418.018 e LCW0418.052) foram escolhidos para uso futuro com base em dados de sequenciamento e expressão.

[441] O clone específico pCW0432 de XTEN_AE864 foi construído pela combinação de LCW0418.018 de XTEN_AE576 e LCW0414.002 de XTEN_AE288, usando o mesmo processo de dimerização conforme descrito acima.

Exemplo 6: Construção de XTEN_AG864

[442] Usando as várias rodadas consecutivas de dimerização, montamos uma coleção de sequências de XTEN_AG864 iniciando a partir dos segmentos de XTEN_AD36 listados no Exemplo 1. Estas sequências foram montadas conforme descrito no Exemplo 3. Vários isolados de XTEN_AG864 foram avaliados e considerados para mostrar boa expressão e excelente solubilidade sob condições fisiológicas. Um clone de comprimento total de XTEN_AG864 tinha excelente solubilidade e mostrou meia-vida superior a 60 h em macacos cynomolgus.

Exemplo 7: Construção da CBD-XTEN-Cys, um XTEN engenheirado pela cisteína

[443] Uma ilha de cisteína (CysIsland) que codifica uma sequência de aminoácidos GGSPAGSCTSP contendo uma cisteína foi introduzida por oligosa recozido no vetor de GFP contido por CBD para obter GFP-CysIsland,-CBD onde CysIsland é ladeado pelos sítios de restrição BsaI e BbsI. O vetor da GFP contido por CBD é um derivado pET30 da Novagen com sítio de reconhecimento de protease TEV entre CBD e o contido. Construtos foram geradas anteriormente, substituindo o contido no vetor da GFP contido por CBD por genes que codificam XTEN_AE288 e XTEN_AE576. O plasmídeo de CBD-XTEN_AE288-GFP foi digerido com BsaI/NcoI para gerar o fragmento pequeno como inserção. O plasmídeo de CBD- Cysland-GFP foi digerido com BbsI/NcoI para gerar o fragmento grande como o vetor. A inserção e os fragmentos do vetor foram ligados e a mistura de ligação foi eletroporada em células de BL21-Gold (DE3) para obter transformantes de CBD-CysIsland-XTEN_AE288-GFP. Similarmente, o plasmídeo de CBD-CysIsland-XTEN_AE288-GFP foi digerido com BsaI/NcoI para gerar o fragmento pequeno como inserção. O plasmídeo de CBD-XTEN_AE576-GFP foi digerido com BbsI/NcoI para gerar o fragmento grande como o vetor. A inserção e os fragmentos do vetor foram ligados e a mistura de ligação foi eletroporada em células de BL21- Gold (DE3) para obter transformantes de XTEN_AE576- CysIsland-XTEN_AE288-GFP. Finalmente, o plasmídeo de CBD- XTEN_AE576-CysIsland-XTEN_AE288-GFP foi digerido com BbsI/HindIII para remover a GFP e se ligar aos oligos recozidos para o códon de parada e a mistura de ligação foi eletroporada em células BL21-Gold (DE3) para obter transformantes de CBD-XTEN_AE576-CysIsland-XTEN_AE288, que tem o DNA e sequências de aminoácidos codificados contidos Tabela 26. Construtos adicionais podem ser criados com cisteínas inseridas em diferentes locais dentro da sequência XTEN pela seleção de sítios de restrição apropriados para o determinado local incluindo várias inserções. O método também poderia ser utilizado para criar XTEN engenheirado por lisina pela substituição de códons que codificam a lisina por aqueles que codificam a cisteína nos oligonucleotides.Tabela 26: Sequência de DNA e de aminoácidos de XTEN engenheirado por cisteína

Exemplo 8: Construção dede Cys3-XTEN

[444] Um par de iniciadores foi projetado para introduzir BamHI do sítio de restrição e a ilha de cisteína 1 da sequência GRATAEAAGCGTAEAA no terminal N da XTEN_AE432-1 e uma ilha de cisteína parcial 2 da sequência TAEAAG e BbsI do sítio de restrição no terminal C da XTEN_AE432-1. Um segundo par de iniciadores foi projetado para introduzir o BsaI do sítio de restrição e uma ilha de cisteína parcial 2 da seqüência GCGTAEAA no terminal N do XTEN_AE432-2 e ilha de cisteína 4 de sequência TAEAAGCGTAEAAR com 8 marcadores xHis (H8) e HindIII do sítio de restrição no terminal C de XTEN_AE432-2. O XTEN_AE432-1 contém a sequência de aminoácidos 1-432 e XTEN_AE432-2 contém a sequência de aminoácidos de 433-864 codificada pelo gene XTEN_AE864. Esses dois pares de iniciadores foram usados para amplificar os genes XTEN_AE432-1 e XTEN_AE432-2, respectivamente, pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Os produtos da PCR de tamanhos corretos foram purificados com gel e digeridos com as enzimas de restrição BamHI/BbsI e BsaI/HindIII, respectivamente, como inserções da ligação. Um vetor de destino, um derivado da pET30 (Novagen) inclui um CDB (domínio de ligação de celulose)-contido com BamHI e HindIII dos sítios de restrição flanqueadores. O vetor de destino foi digerido com as enzimas de restrição BamHI/HindIII para remover o contido e ser preparado como o vetor. O vetor foi ligado com produto do XTEN_AE432-1 da PCR digerido por BamHI/BbsI e BsaI/HindIII digerido e PCR digerido por BsaI/HindIII do XTEN_AE432-2b. A mistura de ligação foi transformada nas 10 melhores células competentes de E. coli. Transformantes foram triados por miniprep de DNA e os construtos desejados foram confirmados pelo sequenciamento de DNA. Assim, o plasmídeo final produz o gene CBD-ilha de cisteína ilha 1-XTEN_AE432-ilha de cisteína 2-XTEN_AE432-ilha de cisteína 3-H8 sob controle de um promotor T7. As sequências de DNA e sequências de proteínas são apresentadas na Tabela 27.Tabela 27: DNA Cys3-XTEN e sequências d e aminoácidos

Exemplo 9: Construção de Lys2-XTEN

[445] Um par de iniciadores foi projetado para introduzir BamHI do sítio de restrição e a sequência de aminoácido GRGSP no terminal N do XTEN_AE432-1 e uma sequência de aminoácidos TAEAAG e BbsI do sítio de restrição no terminal C do XTEN_AE432-1. Um segundo par de iniciadores foi projetado para introduzir o BsaI do sítio de restrição e uma sequência de aminoácidos com uma lisina incorporada de GKPGTAEAA no terminal N do XTEN_AE432-2 e uma sequência de aminoácidos com uma lisina incorporada de GKAT com um marcador 8xHis (H8) e HindIII do sítio de restrição no terminal C da XTEN_AE432-2. O XTEN_AE432-1 contém sequência de 1-432 aminoácidos e o XTEN_AE432-2 contém sequência de 433-864 aminoácidos codificados pelo gene XTEN_AE864. Esses dois pares de iniciadores foram usados para amplificar os genes XTEN_AE432-1 e XTEN_AE432-2, respectivamente, pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Os produtos da PCR de tamanhos corretos foram purificados com gel e digeridos com as enzimas de restrição BamHI/BbsI e BsaI/HindIII, respectivamente, como inserções para a ligação. Um vetor de destino, derivado de pET30 (Novagen), da CBD (domínio de ligação de celulose)-contida com BamHI e HindIII dos sítios de restrição flanqueados foi digerido com as enzimas de restrição BamHI/HindIII para remover o contido e ser preparada como o vetor. Ligar o vetor ao produto de XTEN_AE432-1 de PCR digerido por BamHI/BbsI e PCR digerido por BsaI/HindIII do XTEN_AE432-2 acima. A mistura de ligação foi transformada nas 10 melhores células competentes de E. coli. Transformantes foram triados por miniprep de DNA e os construtos desejados foram confirmados pelo sequenciamento de DNA. Assim, o plasmídeo final produz o gene CBD-GRGSP-XTEN_AE432-TAEAAGKPGTAEAA-XTEN_AE432-GKAT-H8 sob o controle de um promotor T7. As sequências de DNA e as sequências de proteínas são apresentadas na Tabela 28.Tabela 28: DNA Lys2-XTEN e sequências de aminoácidos

Exemplo 10: Cepa Hospedeira e Promovedor para Expressão do XTEN para Conjugação

[446] PlasmídeospCW1054 que expressam CBD-TEV sítio- XTEN_AE864 sob o controle do promovedor T7/lac, pLCW0968.003 que expressa CBD-TEV sítio-XTEN_AE864-GFP sob o controle do promovedor T7/lac e pLCW0970.030 que expressa CBD-TEV sítio-XTEN_AE864-GFP sob o controle do promovedor PhoA, foram transformados em ambos os de BL21 DE3 de E. coli e DE3 BL21 rne-131 de E. coli (Lopez, P. J., et al. Mol (1999). Microbiol. 33, 188-199). A mutação de rne-131 interrompe a atividade endorribonucleico 3' de RNase E (Kido, M., et al. (1996) Journal of Bacteriology, 178: 3917-3925). As culturas iniciais de todos os seis transformantes foram preparadas pela escolha de colônias únicas para inocular 2 mL do meio de caldo LB contendo o antibiótico seletivo apropriado. As culturas iniciais cresceram durante a noite e 0,5 mL foi utilizado para inocular, em quatro exemplares, 25 mL de caldo de 2xYT, para células que contêm pCW1054 e pLCW0968.003 ou 25mL de caldo de indução PhoA (receita de Amunix 136 - 1) para as células contendo pLCW0970.030. As culturas foram agitadas por 3 horas a 37°C. A temperatura foi então reduzida a 26°C para todas as culturas; e para as células que contêm a expressão da proteína pCW1054 e pLCW0968.003 foram induzidas com IPTG na concentração final de 1.0 mM. A indução do promovedor PhoA em pLCW070.030 é auto induzida mediante depleção de fosfato dos meios de cultura. As culturas foram em seguida agitadas durante a noite a 26°C. As amostras de cada cultura foram lisadas e 20 μl de cada lisado estavam sujeitos a SDS-PAGE não reduzido usando gel NuPAGE 4-12% Bis-Tris da Invitrogen, de acordo com as especificações do fabricante, com coloração Coomassie. Os resultados (FIG. 43) mostraram que quando CBD-PEV sítio- XTEN_AE864-GFP ou CBD-TEV sítio-XTEN_AE864 é expresso sob o controle do promovedor T7/lac o rendimento da proteína recombinante é significativamente maior na rne-131 BL21 DE3 da E. coli em comparação com a células BL21 DE3 do E. coli. As células também foram medidas quanto à fluorescência da GFP, usando um leitor de placa fluorescente. Os resultados (FIG. 44) mostrara, que a expressão em células BL21 DE3 de CBD-TEV sítio-XTEN_AE864-GFP da E.coli sob o controle do promovedor PhoA é quase três vezes maior do que a expressão da CBD-TEV sítio-XTEN_AE864-GFP sob o controle do promovedor T7/lac. Em rne-131 BL21 DE3 da E. coli os promovedores T7/lac e PhoA renderam níveis semelhantes de expressão. Portanto, somente após a inibição da atividade riboendocleolítica da Rnase E 3' faz títulos de rendimento de indução de T7/ALC similar àquele obtido usando indução de PhoA. Provavelmente taxa mais da transcrição de T7 RNAP (Studier, w., et al. (1986) Journal of Molecular Biology 189: 113-130), relativa aos resultados de tradução no mRNA suscetível ao ataque endonucleolítico, enquanto no caso da indução de PhoA onde a transcrição é mediada pela polimerase II do RNA de E. coli nativo, a taxa de transcrição está intimamente acoplada à taxa de tradução que protege o mRNA do ataque endonucleolítico.

Exemplo 11: Construção de 1xAmino-XTEN288

[447] A par de iniciadores AE278BsaIfor-AACG e AE278- RH8HindIIIrev foram usados para PCR o plasmídeo contendo XTEN_AE864_003, a fim de obter o produto do PCR XTEN_AE278. Foi realizada purificação com gel da banda de tamanho certo, seguida da digestão com BsaI/HindIII como a inserção de XTEN_AE278-R-H8. Uma digestão do plasmídeo pCW1161, que codifica o gene N-term-RP11-R-AE432_3Cys-R-H8 (construto AC763) com BsaI/HindIII foi realizada para remover o fragmento de AE432_3Cys-R-H8 e foi realizada purificação por gel no fragmento grande como o vetor. Ligação do vetor com a inserção foi realizada e foi usada para transformar células competentes BL21 para obter de o construto de N- term-RP11-R-AE288-R-H8. O comprimento do XTEN entre os dois sítios de digestão de tripsina (R, arginina) foi calculado pelo XTEN_AE278 mais alguns aminoácidos flanqueados e foram igualados a exatamente 288 aminoácidos. Assim, o construto é projetado para produzir o precursor N-term-RP11-R-AE288- R-H8 (sequencial na Tabela 29, abaixo) e gerar 1xAmino- XTEN288 (Seg 178 da Tabela 3, com um grupo amino do terminal N para conjugação) após a remoção do marcador N- term-RP11 e marcador C-term-8xHis pela digestão da tripsina. Tabela 29: Sequência de DNA e aminoácidos para lxAmino-XTEN288

Exemplo 12: Otimização para expressão de construtos de XTEN com marcador de afinidade RP11 1.1. Concepção e construção de construtos que codificam N- term-RP11-AE864-GFP e MalEss-AE48-RP11-AE864

[448] Um grupo de proteínas de E. coli nativo altamente expresso descrito por Ishihama Y. et al, BMC Genomics 2008, 9:102 foram usados para gerar uma lista dos primeiros 20 aminoácidos do terminal N (coluna 3 da Tabela 30), do qual os aminoácidos hidrofóbicos F, I, W, L, V, M, C foram convertidos para alanina ou serina, ou foram excluídos a fim de gerar candidatos para criar sequências de auxiliar contendo pelo menos 11 aminoácidos (coluna 4 da Tabela 30). Para fins comparativos, os 20 primeiros aminoácidos de uma sequência CBD conhecida a partir de um construto expresso construído em Amunix (AC616) também foram incluídos como um controle.Tabela 30: Lista de auxiliares do terminal N concebidos no estudo

[449] Oligonucleotídeos de DNA para série 107N-F&R a 119N- F&R e sequências de RP11F&R da Tabela 31 foram sintetizados em Elim Biopharm (Hayward, CA). As soluções de cada par de DNA (107N-F e 107N-R, 108N-F e 108N-R, etc.) foram misturadas em uma relação molar de 1:1, foram desnaturadas a 95°C por 3 min, seguido do resfriamento a 25°C em 0,1°C/min para permitir o recozimento do DNA de fita dupla. O vetor de base LCW0970.030 (codificação CBD-AE864-GFP) foi digerido com NdeI/BsaI e o maior fragmento foi purificado com gel como o vetor. O vetor foi ligado com os oligos recozido 107-118N-F&R e PNK oligos RP11F& recozidos tratados por PNK, e os produtos da ligação foram transformados em células competentesBL21 de E. coli (New England Biolabs) para obter colônias designadas pSD0107 a pSD118. Os clones pSD0107-109, pSD0111-112 e pSD0114-118 foram obtidos e verificadas por sequenciamento de DNA; clone pSD0110.001 tinha uma mutação do quadro shift e foi usada como vetor contido.

[450] O construto pCW1110 do plasmídeo (codificação RP11- AE864) foi digerido com BsaI/NotI e a banda menor dos nucleotídeos correspondentes que codificam AE864 foi purificado com gel como a inserção pCW1139 (codificação MalEss-AE48-carga-AE864) foi digerido pelo XhoI/BstXI/NotI e o maior fragmento foi purificado com gel como o vetor. O produto recozido de oligos de 119-AEN-F&R foi ligado à inserção e ao vetor e depois transformado em BL21 de E. coli para obter colônias com o plasmídeo, pSD0119 designado. Os clones foram verificados quanto à sequência.

2. Construção de bibliotecas auxiliares de terminal N, com base em pSD0116.

[451] Pares de oligonucleotídeo de DNA do Stuffer-RP5for & Stuffer-RP5revP, RP6-SASRSAforP & RP6-SASRSArev, L2for & L2rev, L3for & L3rev, L4for & L4rev, L5for & L5rev, L6for & L6rev, L7for & L7rev, L8for & L8rev, L9for & L9rev, L10for & L10rev, L11for & L11rev, L12for & L12rev e L13for & L13rev (Tabela 31) foram sintetizados em Elim Biopharm (Hayward, CA) e cada par foi anelado conforme descrito acima (Seção 1) para gerar o DNA de fita dupla.

[452] O plasmídeo pSD0110 foi digerido com NdeI/BsaI e o maior fragmento foi purificado em gel como o vetor. O vetor foi ligado com os oligos anelados de Stuffer-RP5for&revP e RP6-SASRSAforP&rev e depois transformado em E. coli BL21 para obter as colônias com o plasmídeo vetor contido pCW1146 (Stuffer-RP11-XTEN_AE864_003-GFP). O clone teve a sua sequência verificada.

[453] O vetor pSD0110 com NdeI/BsaI digerido foi ligado com oligos L5for & rev anelados para obter colônias de LCW1160 (L5).

[454] O vetor contido pCW1146 foi digerido com NdeI/BsaI e o maior fragmento foi purificado em gel como o vetor. O vetor foi ligado com os oligos anelados de L2-4, e L6-13 for&rev conforme Tabela 31, e então transformado em E . coli BL21 para obter as colônias de construtos LCW1157 (L2),LCW1158 (L3), LCW1159 (L4), LCW1163 (L6), LCW1171 (L7),LCW1172 (L8), LCW1203 (L9), LCW1204 (L10), LCW1208 LCW1209 (L12), e LCW1210 (L13).Tabela 31: Lista de oligonucleotídeos de DNA (L11),

3. Triagem e análise de bibliotecas auxiliares de terminal N LCW1157-1159

[455] Células hospedeiras de E. coli transformadas com o plasmídeo pSD0107 para pSD0118 foram expressas em frascos de agitação e os níveis de expressão em cada um foram avaliados pela medição da fluorescência da GFP repórter do terminal C. Brevemente, uma cultura durante a noite foi cultivada para cada construto em meio SB (com 12,5 μg/ml de tetraciclina), que foi usada para inocular uma cultura de 200 ml de meio de autoindução de depleção de fosfato de PhoA com 12,5 de μg/ml de tetraciclina (3 frascos de agitação foram cultivados para cada construto). Após ter crescido a 26°C com 225 RPM por 48 h, uma alíquota de 100 μl foi tirada de cada cultura e o nível de expressão da GFP foi medido com um leitor de placa de fluorescência com comprimento de onda de excitação de 395 nm e comprimento de onda de emissão de 510 nm. Duas leituras foram realizadas para cada frasco de agitação. Entre os construtos testados, pSD0116 tinha o maior sinal de fluorescência, seguido pelo pSD0114 (FIG. 81), mas os níveis de expressão desses dois construtos foram significativamente mais baixos do que os do controle positivo LCW0970.030 (pLCW970).

[456] Para melhorar adicionalmente a expressão, três bibliotecas (LCW1157, 1158 e 1159) foram construídas com base no pSD0106 e foram triadas em um formato de alta taxa de transferência. Um grande número de colônias dessas bibliotecas (Tabela 32) foi escolhido para crescer individualmente em 500 μl de meio SB (com 12,5 μg/ml de tetraciclina) em placas de 96 poços profundos durante a noite em 37°C agitado a 300 RPM. Foram utilizados 20 μl de cultura saturada para inocular 500 μl de meio de autoindução de depleção de fosfato de PhoA (com 12,5 μg/ml de tetraciclina) em placas de 96 poços profundos que foram incubadas a 26°C agitando a 300 RPM durante 22-24 horas. Determinou-se a expressão, então, colocando-se 100 μl da cultura em uma placa de 96 poços para medir a fluorescência da GFP repórter do C-terminal. Tabela 32: Bibliotecas LCW1157-1159

[457] Após a avaliação do sinal de fluorescência, os seis clones de expressão mais alta e dois clones de baixa expressão foram escolhidos a partir de cada placa testada de 96 poços profundos e a expressão destes clones foi testada novamente com 4 repetições. Para todas as três bibliotecas, os clones com a expressão mais alta do que o construto pSD0116 foram identificadas (FIG. 82 A-C), e a correlação entre os testes originais e retestes foi boa (FIG. 82 D-F). Entre as 3 bibliotecas testadas, abiblioteca LCW1159 apresentou o maior nível de expressão em geral, e o construto com expressão mais alta desta rodada de triagem (LCW1159.004) veio desta biblioteca.

[458] Os 8 construtos com os níveis de expressão mais altos destas três bibliotecas e controles foram tratados com Pop Culture (EMD Millipore), foram tratados termicamente, o lisado resultante foi analisado com corante SDS- PAGE/Coomassie (FIG. 83). Os níveis de expressão dos 8 construtos foram confirmados como mais altos do que os dos controles (controle negativo, LSD0114 e LSD0116), e proteínas completas foram produzidas a partir desses construtos. Lisados dos 4 construtos com a maior expressão (depois do tratamento com Pop Culture e tratamento térmico) e um controle negativo (AP32, uma proteína XTEN-GFP purificada sem o marcador RP11) foram carregados em uma coluna SP da MacroCap em um pH de 8 e condutividade de 6,5 mS/cm. A coluna foi lavada com 20mM de fosfato de sódio, pH 8, 100mM de NaCl, e a proteína foi eluída com 20mM de fosfato de sódio, pH 8, 500mM de NaCl. As amostras da carga, de vazão, lavagem e eluato foram analisadas por SDS- PAGE em gel (FIG. 84). Os resultados demonstraram que a proteína de expressão dos quatro, que vieram de todas as três bibliotecas, pode ser capturada por MacroCap SP; assim, a ligação foi contribuída pela presença do marcador de proteína RP11 uma vez que o controle negativo (não contendo o marcador RP11) não liga à coluna MacroCap SP.

[459] Os plasmídeos dos clones escolhidos para retestes foram minipreparados e as sequências de DNA dos auxiliares de terminal N foram analisados. O desvio de códon foi observado em vários locais (Tabela 33). Por exemplo, o 3° aminoácido de LCW1157, N, é codificado pelo AAC ou AAT. A maioria dos clones de alta expressão (77%) em LCW1157 é codificada por AAT no 3° aminoácido, enquanto a maioria dos clones de baixa expressão (88%) é codificada por AAC, indicando que AAT é preferível a AAC nessa posição para alta expressão. Da mesma forma, CCG é preferível no 4° aminoácido, enquanto GCG no 7° aminoácido é acumulado em clones de baixa expressão. Estas tendências também foram observadas da mesma forma nas bibliotecas de LCW1158 e LCW1159.Tabela 33: Análise dos resultados da sequência dos clones com alta e baixa expressão em bibliotecas LCW1157-1159 *Os números totais de clones com alta e baixa expressão analisados são especificados para cada biblioteca e os percentuais de A, G, C ou T em cada um do local onde o códon foi variado foram analisados.

4. Triagem e análise da biblioteca auxiliar de terminal N LCW1163

[460] Uma vez que a biblioteca LCW1159 teve expressão geralmente maior do que LCW1157 e LCW1158, o próximo projeto de biblioteca foi baseado na LCW1159, com a introdução de mais variantes na região de codificação no domínio auxiliar do terminal N. Um total de 672 clones desta biblioteca (diversidade teórica de 55296) foi projetado e retestado em da mesma forma que as bibliotecas LCW1157-1159. Clones com expressão mais elevada do que LCW1159.004 (a maior da rodada anterior de triagem) foram observados (FIG. 85). O clone com maior expressão, LCW1163.029, alcançou uma melhoria de 40% do que LCW1159.004, enquanto o seu nível de expressão foi 27% menor do que o do controle CBD. A sequência dos clones com alta e baixa expressão foi analisada, e os nucleotídeos preferenciais para expressão foram identificados e resumidos (ver Tabela 34). A maioria dos locais tem demonstrado uma preferência de códon A para expressão alta, enquanto outros têm uma preferência para C. Tabela 34. Análise dos resultados da sequência dos clones com alta e baixa expressão na biblioteca LCW1163** Os percentuais de A, G, C ou T em cada local onde o códon foi variado foram analisados, e os nucleotídeos preferenciais identificados foram resumidos na linha inferior.

5. Triagem e análise da biblioteca RP11 de LCW1160

[461] Ao mesmo tempo, 168 colônias da biblioteca LCW1160 (biblioteca variando a região codificante do marcador RP11 sem qualquer domínio auxiliar de terminal N (total diversidade teórica de 8.8X1012) foram selecionadas e analisadas). No entanto, esta biblioteca tinha um nível muito baixo de expressão em geral (FIG. 86), e o um caso isolado com alta expressão foi encontrado para codificar um marcador RP11 truncado após a realização de uma minipreparação de plasmídeo e análise de sequenciamento de DNA. Os resultados da triagem da biblioteca, sob estas condições experimentais, sugerem fortemente que um auxiliar do terminal N é necessário para alcançar os níveis de alta expressão.

6. Triagem de bibliotecas auxiliares de terminal N LCW1171, LCW1172, LCW1203, e LCW1204.

[462] Mais bibliotecas do terminal N (LCW1171, LCW1172, LCW1203 e LCW1204) foram selecionadas e analisadas da mesma forma que as descritas acima. LCW1171 e 1172 foram projetadas similarmente, enquanto LCW1171 permitiu mais alterações de aminoácidos na sequência auxiliar do que a LCW1172. Os resultados da triagem revelaram que LCW1171 tiveram, em geral, um nível de expressão muito mais baixo do que LCW1172 (FIGS. 94A e B). LCW1203 e 1204 foram projetados similarmente, focando na randomização de uma região diferente da sequência auxiliar em comparação com LCW1171 e 1172. LCW1204 permitiu mais alterações de aminoácidos do que LCW1203, que resultou em menor expressão do que LCW1203 em geral (FIGS 94 C e D). Estes resultados sugerem que o nível de expressão é sensível às alterações de aminoácidos nas sequências de domínio auxiliar.

7. Triagem de bibliotecas auxiliares de terminal N LCW1208, LCW1209, e LCW1210.

[463] As três novas bibliotecas de terminal N (LCW1208, LCW1209 e LCW1210) foram projetadas para investigar o efeito do alongamento adicional da sequência auxiliar do terminal N (tabela 35). LCW1208 e LCW1210 introduziram 4 resíduos a mais ao domínio auxiliar, enquanto LCW1209 introduziu 8 resíduos a mais. Os resultados da triagem mostraram uma tendência geral que LCW1209 tivesse a expressão mais alta, com LCW1208 em seguida, e então LCW1210 (FIG.95), que confirmou o efeito benéfico da adição de mais aminoácido na sequência auxiliar.Tabela 35: Bibliotecas LCW1208-1210Resíduos adicionais nas sequências auxiliares foram sublinhados.

[464] As três novas bibliotecas de terminal N (LCW1208, LCW1209 e LCW1210) foram projetadas para investigar o efeito do alongamento adicional da sequência auxiliar do terminal N (tabela 36). LCW1208 e LCW1210 introduziram 4 resíduos a mais ao domínio auxiliar, enquanto LCW1209 introduziu 8 resíduos a mais. Os resultados da triagem mostraram uma tendência geral de que LCW1209 tem uma expressão mais alta, seguido por LCW1208 e LCW1210 (FIG. 95), que confirmou o efeito benéfico da adição de mais aminoácidos na sequência auxiliar para melhorar a expressão.

[465] Os 4 primeiros construtos com os níveis mais altos de expressão das três bibliotecas foram escolhidos a partir do reteste e a sequência de suas sequências auxiliares de terminal N foram analisadas (tabela 36). O construto atual com maior expressão (LCW 1209.029) alcançou 90% do nível de expressão do controle CBD, comparando a fluorescência média depois de remover o controle negativo.Tabela 36: Construtos com os mais altos níveis de expressão a partir das bibliotecas LCW1208-1210 e controles. * Resíduos adicionais nas sequências auxiliares foram sublinhados.

[466] Em resumo, os resultados da triagem, sob estas condições experimentais, sugerem fortemente que um auxiliar do terminal N contribui para alcançar os níveis de alta expressão.

Exemplo 13: Fermentação de XTEN usando indução PhoA - Avaliação de Produção de Expressão

[467] E. coli BL21 carregando os plasmídeos codificando os auxiliares Helper_LCW1159.004-RP11-AE288-His8 (AC767), Helper_LCW1172.033-RP11-AE576-His8 (AC780), e Helper_LCW1172.033-RP11-AE864-His8 (AC786) foram transformados em cepa E. coli BL21. Três fermentações de 10L foram executadas para cada uma das 3 cepas. Estoques de glicerol foram usados para inocular 125ml de meio de caldo LB contendo 10 μg/mL de tetraciclina. As culturas iniciadoras foram em seguida agitadas durante a noite a 37°C. A cultura iniciadora foi utilizada para inocular 4L dos meios do lote de fermentação contendo -20 g de sulfato de amônio, 10,4 g de fosfato de potássio dibásico anidro, 5 g de citrato de sódio dihidratado; 4,6 g de fosfato de sódio monobásico mono-hidratado; 106g de peptona de soja NZ BL4 (Kerry Bioscience #5X00043); 54g de extrato de levedura (Teknova #Y9020); 3,6 L de água; 0,05 mL de polipropileno glicol; 5,2 mL de solução de oligoelementos (receita de Amunix 144 - 1); 35mL 1M de sulfato de magnésio; e 4 mL de canamicina (50mg/mL) - em um recipiente de vidro revestido de 10L com um controlador da B. Braun Biostat B. As configurações de controle de fermentação foram: pH = 6,9 + /-0.1; dO2 = 10%; cascata de oxigênio dissolvido no modo somente agitação com uma gama de 125 - 1180 rpm; fluxo de ar de 5 litros por minuto com o oxigênio a 90%; temperatura inicial 37oC; controle base 13% de hidróxido de amônio; e sem controle de ácido. Após 6 horas de cultura, um suprimento de 70% de glicerol foi iniciado a uma taxa de 40 g/hr. Quando as culturas atingiram uma OD600 de 50 +/- 10 OD, a temperatura de cultura baixou para 26oC, 54 mL de 1M de sulfato de magnésio foi adicionado, e um suprimento de sal que consiste de: 10 g/l sulfato de amônio, 26 g/l de fosfato de potássio dibásico anidro, 2 g/l de citrato de sódio dihidratado; 13 g/l de fosfato de sódio monobásico mono-hidratado; 15 g/l de fosfato de potássio monobásico anidro; 0,08% de solução de oligoelementos foram iniciados em uma taxa de 33 g/L e continuou por 6 horas. Depois de um tempo de execução total de fermentação de 64-70 horas a cultura foi colhida por centrifugação rendendo sedimentos de células entre 1,6-2,3 quilogramas em peso molhado. Os sedimentos foram armazenados congelados a - 80 °C até utilização posterior. Para análise de titulação, no fim da execução da fermentação, foram congeladas amostras de caldo integrais em um volume de 0,2 mL, depois descongeladas, em seguida, foram adicionados 0,2 mL de água, em seguida, para fazer lise e flocular as proteínas hospedeiras, as amostras foram incubadas em 85°C durante 15 minutos, depois transferidas para 4oC por 15 minutos, seguido de centrifugação durante 10 minutos em 20,000g. Os lisados solúveis floculados resultantes foram analisados por HPLC em C18 de fase reversa, e a área de absorvância de A214 correspondente dos picos representando o Helper-RP11-XTEN- His8 foi comparada com a área de referência de purificado padrão. Em seguida, para determinar o peso da célula seca (DCW), alíquotas de células foram sedimentadas e o sobrenadante descartado. O sedimento de células foi lavado uma vez com água e em seguida foi seco em estufa a 80°C durante 3 dias. Os tubos contendo sedimento de células foram pesados, o peso do tubo foi subtraído os pesos medidos, e o restante do peso foram divididos pelo volume inicial de cada amostra (0,0002 L) para obter o DCW. Os resultados do crescimento de fermentação, análise de título e peso de célula seca estão resumidos na Tabela 37 abaixo. Em ensaios de triagem em placa de 96 poços, quando uma biblioteca de construtos RP11-XTEN-His8 sem um auxiliar do terminal-N, LCW1160 foram triados (Exemplo 12, FIG. 86) o nível de expressão da LCW1160.006, o construto com a expressão mais alta, era apenas 50% da expressão do LCW1159.004 ou LCW1172.033; construtos com sequências auxiliares. Portanto, espera-se que os construtos XTEN com sequências auxiliares de terminal N resultarão em títulos com expressão significativamente maior em comparação com construtos XTEN sem sequências auxiliares. Tabela 37: Parâmetros de Expressão Medida

Exemplo 14: Purificação do XTEN com marcadores RP11 e His8 1. Expressão, Lise e Clarificações.

[468] A proteína de fusão MKNPEQAEEQAEEQREET-RP11-SASRSA- XTEN_AE432(C12,C217,C422)-SASRSA-His(8)], com a sequência auxiliar de terminal N a partir do membro da biblioteca LCW1159.004 descrito no Exemplo 10, com dois marcadores de afinidade vinculados a XTEN nos terminais N e C, respectivamente, foi expressa em E. coli usando um fermentador de 4L usando as condições descritas neste documento. Após crescimento, as células foram colhidas por centrifugação e congeladas a - 80° c até o uso. O sedimento de células foi ressuspenso em tampão de lise (20 mM de fosfato de sódio, 50mm de NaCl, 2 mM de EDTA de pH 8.0, 3 ml de tampão por grama de pasta de células). As células foram lisadas passando através de um homogeneizador APV três vezes a uma pressão de 830-900 bar. Tampão de lise (1 ml de tampão por grama de pasta de células) foi usado como uma injeção para recuperar o volume realizado do homogeneizador. O lisado homogeneizado foi incubado em um banho de água a 85°C por 20 minutos, seguido de resfriamento rápido em banho de gelo por 20 minutos. Após o tratamento de aquecimento e arrefecimento, o lisado foi centrifugado a 11000 RPM por 90 minutos em uma centrífuga SORVALL. Após a centrifugação, o sobrenadante foi filtrado através de dois filtros CUNO Bio cap 25 (BC0025L90SP08A). O sobrenadante clarificado foi armazenado a 4°C durante a noite.

2. Etapa de Captura: Cromatografia Toyopearl IMAC

[469] A Cromatografia de afinidade IMAC foi usada como uma etapa de captura para ligar XTEN com um His-marcador de terminal C. Brevemente, a coluna de cromatografia BPG140/12 (GE Life Sciences) foi embalada com 2000 ml de resina Toyopearl IMAC 650 M (TOSOH Biosciences). A coluna foi equilibrada com 2 volumes de coluna (CVs) de tampões de equilíbrio (20 mM de fosfato de sódio, 500 mM de NaCl, pH 8.0). Lisado clarificado celular foi ajustado para uma concentração de NaCl final de 500 mM, utilizando 5 M de solução-estoque de NaCl e então foi carregado para a resina do IMAC. A coluna foi lavada com 2 volumes de coluna do tampão de equilíbrio e em seguida 2 volumes de coluna com 20 mM de fosfato de sódio, 500 mM de NaCl, 5 mM de Imidazol com pH 8.0, seguido de 2 volumes de coluna com 20 mM de fosfato de sódio, 5 mM de imidazol com pH 8.0 para remover o sal. Realizou-se a eluição com 2 volumes de coluna com 20 mM de fosfato de sódio, 100 mM de imidazol, pH 8.0. Fluindo através, as frações de lavagem e eluição foram analisadas pela não-redução de 4 -12% de corante Bis-Tris SDS-Page/Coomassie e as frações com o produto desejado foram agrupadas.

3. Etapa de Polimento/Captura: Cromatografia MacroCap SP

[470] A cromatografia de permuta catiônica foi usada como uma etapa de polimento para garantir a integridade do terminal N do produto. Resina MacroCap SP (GE Life Sciences) foi selecionada entre os vários meios de permuta catiônica devido à sua capacidade superior e seletividade do produto. 1000 ml de resina MacroCap SP foi embalado em uma coluna de cromatografia de BPG100/13 (GE Life Sciences) e equilibrado com 20mm de fosfato de sódio pH 8.0, 20 mM de NaCl. O agrupamento do IMAC foi carregado para a coluna e a resina foi lavada com 2 volumes de coluna de 20 mM de fosfato de sódio, 50 mM de NaCl, pH 8.0 e 2 volumes de coluna de 20mm de fosfato de sódio pH 8.0, 150 mM de NaCl. A proteína foi eluída com 5 volumes de coluna de gradiente linear de 150 a 500 mM de NaCl em 20mm de fosfato de sódio pH 8.0. Frações foram coletadas e analisadas por 4-12% de Bis-Tris SDS/PAGE. Frações com o produto desejado foram combinadas para a próxima etapa.

4. Digestão de tripsina do agrupamento de eluição de Macrocap SP

[471] Digestão de tripsina (Sigma, tripsina de Pâncreas Bovino) do agrupamento de eluição SP foi realizada na proporção de 1:200 m/m enzima/proteína durante a noite a 37°C.

5. Etapa de Polimento: Cromatografia Macrocap Q

[472] Após a digestão de tripsina, os marcadores clivados foram separados do produto final usando cromatografia Macrocap Q. A coluna BPG100/19 (GE Life Sciences) foi embalada com 1500 ml de volume de coluna de resina Macrocap Q (GE Life Sciences). O agrupamento de eluição de tripsina digerida Macrocap SP foi incubado por 15 min a 80°C com 20 mM de DTT e 2mm de EDTA para reduzir as ligações de dissulfeto e inativar a tripsina. A solução de refrigeração da proteína foi diluída para uma condutividade abaixo de 5 mS/cm com água Milli-Q e carregada para a coluna Macrocap Q incubada com 20 mM HEPES, 50mM de NaCl, pH 7.0. A coluna foi lavada com 2 volumes de coluna de 20 mM HEPES, 50mM de NaCl, pH 7.0, então 2 volumes de coluna com 20 mM de HEPES, 2mM de TCEP, e 150mM de NaCl pH 7,0. A proteína foi eluída com gradiente linear a partir de 150 mM de NaCl a 500 mM de NaCl em 20mM de HEPES, pH 7.0 em 20 volumes de coluna. Frações foram analisadas pela coloração SDS-PAGE/prata.

6. Concentração e Diafiltração (Fórmula Final)

[473] Frações MacroCap Q selecionadas foram combinadas e concentradas e usando 10 KD Pellicon mini (Millipore) em uma pressão de suprimento < 20 psi e retentado < 8 psi, seguido por 10 X de diafiltração com 20 mM de HEPES, 50mm de NaCl, pH 7,0 para obter uma concentração final de proteína > 5mg / ml.

9. Análise de pureza das proteínas purificadas com diferentes métodos

[474] Um lote (Lote 1) foi purificado através de três etapas de purificação, como descrito acima. Outro lote (Lote 2) foi purificado a partir do mesmo material fermentado, mas a etapa de polimento MacroCap SP foi omitida. Espécies truncadas de XTEN foram detectadas por coloração SDS-PAGE/prata em frações de eluição MacroCap Q para o Lote 2 (FIG. 87A), enquanto as frações de eluição MacroCap Q para Lote 1 ficaram essencialmente livres de truncamentos (FIG. 87B). Estes resultados suportam que, nas condições empregadas, a etapa de MacroCap SP com base no marcador RP11 é essencial para garantir a integridade do terminal N e a qualidade geral do produto.

Exemplo 15: Construção de 1xAmino, 9xThiol-XTEN432.

[475] Os seguintes conjuntos de primers 5Afor& CI1BbsIrev- TGGC, CI1BsaIfor-TGGC&CI2-AE38BbsIrev, e CI2- AE38BsaIfor&AatIICI3-2P foram usados para o plasmídeo PCR do pCW1164 contendo XTEN_AE432 (C422) para obter os produtos PCR de AE-CI1, CI1-2 e CI2-3, respectivamente. CI1, 2&3 foram designados Ilha de Cisteína 1, 2 & 3, tendo a mesma sequência de aminoácido TAEAAGCGTAEAA, mas com usos de códons diferentes. Purificação em gel dos produtos PCR foi realizada para obter bandas dos tamanhos certos, que foram digeridas com enzimas de restrição SbfI/BbsI, BsaI/BbsI e BsaI/AatII, respectivamente, como as inserções. Digestão do plasmídeo pCW1164, que codifica o gene da N- term-RP11-R-XTEN_AE432 (C422)-R-H8, foi realizada com SbfI/AatII para remover o fragmento de cerca de 290 aminoácidos dentro do XTEN_AE432 e a purificação em gel foi realizada no fragmento restante como o vetor. Ligação do vetor com as três inserções de produtos PCR, acima, foi realizada e usada para transformar as células BL21 competentes para obter o construto N-term-RP11-R-XTEN_AE432 (C319, C370, C422)-R-H8. PCR foi realizado sobre esse construto com primers CI1BsaIfor-TGGC&AatIICI3-2P para obter um produto PCR de cerca de 360 bp em comprimento. Realizou-se a purificação em gel da banda do tamanho certo, seguido pela digestão com BsaI/AatII como a inserção XTEN_AE120-3Cys, que contém três Ilhas de Cisteína.

[476] Simultaneamente, o fragmento de DNA com códon otimizado de XTEN_AE313-6Cys, contendo seis Ilhas de Cisteína, foi projetado e sintetizado (Genscript). O fragmento foi digerido pelas enzimas de restrição que flanqueiam BsaI/BbsI e purificado em gel como a inserção contendo as seis primeiras Ilhas de Cisteína de XTEN_AE432. Digestão do plasmídeo pCW1161, que codifica o gene N-term- RP11-R-XTEN_AE432_3Cys-R-H8, com BsaI/AatII foi realizada para remover o fragmento de XTEN_AE432_3Cys e foi realizada purificação em gel para obter o fragmento grande como o vetor. Ligação do vetor com a inserção digerida por BsaI/BbsI de XTEN_AE313-6Cys e a inserção digerida por BsaI/AatII de XTEN_AE120-3Cys, acima, foi executada. O produto ligado foi usado para transformar as células BL21 competentes, para obter o construto N-term-RP11-R- XTEN_AE432 (C12, C63, C114, C165, C217, C268, C319, C370, C422)-R-H8. O construto foi projetado para produzir o precursor N-term-RP11-R-AE432_9Cys-R-H8 (sequencial na Tabela 38, abaixo), o produto do qual foi usado para gerar 1xAmino, 9-Thio-XTEN432 após a remoção do marcador N-term- RP11 e do marcador C-term8xHis por digestão da tripsina. O produto final contém nove cisteínas na sequência XTEN432 (Seg 177).Tabela 38: Sequência de DNA e aminoácidos para lxAmino, 9-Thio-XTEN432.

Exemplo 16: Construção de 1xAmino, 9xThiol-XTEN864.

[477] Os primers PhoAfor&RP11-SASRSABsaIrevAGGT foram usados para PCR o plasmídeo contendo o marcador N-term-RP11 para obter o produto PCR do N-term-RP11-R. Purificação em gel da banda do tamanho certo foi realizada e foi digerido com NdeI/BsaI como a primeira inserção. Outro PCR foi realizado com primers AE432BsaIforAGGT&AE432_001BbsIrev- AACG no plasmídeo contendo XTEN_AE864_003 para obter o produto PCR de XTEN_AE432. Purificação em gel foi realizada na faixa do tamanho certo, que foi digerida com BsaI/BbsI como a segunda inserção. Digestão do construto do N-term- RP11-R-AE432_9Cys-R-H8 do Exemplo 10 foi realizada com NdeI/BsaI para remover o fragmento N-term-RP11-R e a purificação em gel foi realizada para obter o fragmento grande como o vetor. Ligação do vetor com a primeira e segunda inserção acima foi realizada e o produto foi usado para transformar as células BL21 competentes para obter o construto N-term-RP11-R-XTEN_AE864 (C444, C495, C546, C597, C649, C700, C751, C802, C854)-R-H8. O construto resultante foi projetado para produzir o precursor N-term-RP11-R- AE864_9Cys-R-H8 (sequência na Tabela 39, abaixo), o produto do qual geraria 1xAmino, 9-Thio-XTEN864 após a remoção do marcador N-term-RP11 e do marcador C-term8xHis por digestão da tripsina. O produto resultante contém um grupo amino de terminal N e nove cisteínas na sequência XTEN864 por conjugação (Seg 175).Tabela 39: Sequência de DNA e aminoácidos para lxAmino, 9-Thio-XTEN864.

Exemplo 17: Fermentação de XTEN para Conjugação

[478] Culturas iniciais foram preparadas pela inoculação de estoques de glicerol de E. coli carregando o plasmídeo contendo o XTEN apropriado para conjugação de sequências de proteínas em 125 mL de caldo de cultura LB contendo 50 μg/mL de canamicina. As culturas foram em seguida agitadas durante a noite a 37°C. A cultura iniciadora foi utilizada para inocular 2L dos meios do lote de fermentação contendo -12,5g de sulfato de amônio, 15 g de fosfato de potássio dibásico anidro, 2,5 g de citrato de sódio dihidratado; 8.5g de fosfato de sódio monobásico mono-hidratado; 50 g de peptona de soja NZ BL4 (Kerry Bioscience #5X00043); 25g de extrato de levedura (Teknova #Y9020); 1,8 L de água; 0,5mL de polipropileno glicol; 2,5 mL de solução de oligoelementos (receita de Amunix 144-1); 17.5mL com 1M de sulfato de magnésio; e 2mL de canamicina (50mg/mL) - em um recipiente de vidro revestido de 5L com um controlador da B. Braun Biostat B. As configurações de controle de fermentação foram: pH = 6,9 + /-0.1; dO2 = 10%; cascata de oxigênio dissolvido no modo somente agitação com uma gama de 125 - 1180 rpm; fluxo de ar de 5 litros por minuto com o oxigênio a 90%; temperatura inicial 37oC; controle base 13% de hidróxido de amônio; e sem controle de ácido. Após 6 horas de cultura, um suprimento de 50% de glucose foi iniciado a uma taxa de 30 g/hr. Após 20 horas de cultura, foram adicionados 25mL com 1M de sulfato de magnésio e 3mL de 1M de IPTG. Depois de um tempo de execução total de fermentação de 45 horas a cultura foi colhida por centrifugação rendendo sedimentos de células entre 0.45-1.1 quilogramas em peso molhado para todos os construtos. Os sedimentos foram armazenados congelados a - 80 °C até utilização posterior. Foram colhidas amostras de cultura em vários pontos de tempo na fermentação, as células foram lisadas, então o resíduo de células foi floculado com calor e resfriamento rápido, lisados solúveis clarificados foram preparados por centrifugação e analisados por um SDS-PAGE regular sem redução usando NuPAGE 4-12% de Bis-Tris gel da Invitrogen, de acordo com as especificações do fabricante com coloração Coomassie. Um exemplo da acumulação da proteína de fusão XTEN em função do tempo de execução da fermentação é mostrado na FIG. 45. Os resultados mostraram que os construtos de proteína de fusão XTEN foram expressos na escala de fermentação com títulos > 1g/L, com um PM aparente de cerca de 160 kDa (observação: o peso molecular real é 100 kDa. A migração observada em SDS-PAGE foi comparável às observadas em outras proteínas da fusão contendo XTEN).

Exemplo 18: Purificação do reagente 1xThiol-XTEN (XTEN com construção de cisteína) com marcadores CBD e His8

[479] O exemplo descreve a purificação de uma construção de cisteína XTEN compreendendo um único resíduo de cisteína. Materiais e Métodos:

1. Clarificação

[480] 20 gm de pasta de célula da fermentação foi ressuspensa em 100 ml de 20 mM com fosfato de sódio, pH 8.0 (Tampão de Lise). Lisado celular foi homogeneizado entre 800-900 bars três vezes em um homogeneizador. 50 ml de tampão de lise foram usados como uma injeção para recuperar o volume realizado a partir do homogeneizador. O lisado homogeneizado foi incubado em um banho de água a 85°C por 20 minutos, seguido por um resfriamento rápido em um banho de gelo por 20 minutos. Após o tratamento de aquecimento e arrefecimento, o lisado foi centrifugado a 11000 RPM por 90 minutos em uma centrífuga SORVALL. Após a centrifugação, o sobrenadante foi filtrado através de dois filtros CUNO Bio cap 25 (BC0025L90SP08A). Filtros foram injetados com 40 ml de tampão de lise. O volume final de material clarificado foi 230 ml. O sobrenadante clarificado foi armazenado a 40C durante a noite.

2. Etapa de Captura: Cromatografia de Interação Hidrofóbica

[481] A cromatografia de interação hidrofóbica foi usada como uma primeira etapa usando marcador hidrofóbico CBD de XTEN para garantir a captura de proteína intacta do terminal N. Fenil Toyopearl 650M (Parte # 0014783, TOSOH Bioscience) foi usada para embalar XK16 a um leito com 15 cm de altura (30 ml de volume de coluna). A cromatografia foi realizada usando AKTA FPLC (GE Biosciences). Resina Fenil Toyopearl foi incubada com 2 volumes de coluna com 20 mM de Fosfato de sódio, 1M de Sulfato de sódio, pH 8.0, antes do seu carregamento. Carga HIC foi preparada pela adição de sulfato de sódio com concentração de 1 M ao lisado clarificado acima (volume final ~250 ml). A amostra foi carregada na resina HIC (~ 4 mg/ml de carga de resina) em 2 ml/min. A carga foi completada pela injeção de ~9 volumes de coluna de tampão de equilíbrio (20 mM de fosfato de sódio, 1M de sulfato de sódio, pH 8.0) até UV215 estar estável. Proteína foi eluído na etapa com 100% B (20 mM de fosfato de sódio, pH 8.0). Aplicou-se um total de 7 volumes de coluna de tampão de eluição para confirmar a eluição completa (FIG. 46).

[482] As amostras foram analisadas por 4 -12% de Bis-Tris SDS-PAGE (sem redução) para determinar o agrupamento de eluição (FIG. 47). Com base na seguinte eluição em gel, as frações E1, E2, E3 e E4 foram agrupadas para processamento posterior. A proteína total foi estimada em 85 mg no agrupamento de eluição de HIC, com um rendimento de 65% na etapa determinado pela execução de outra quantificação em gel.

3. Etapa de Polimento/Captura: Cromatografia Toyopearl IMAC

[483] A Cromatografia de afinidade IMAC foi usada como uma etapa de captura para ligar ao marcador His do Terminal C intacto do XTEN. Uma coluna de cromatografia XK26 estava repleta de Toyopearl IMAC 650 M (Parte # 0014907, TOSOH Biosciences) com leito de 15 cm de altura (85 ml de volume da coluna). A coluna foi equilibrada com 2 volumes de coluna de 20 mM de fosfato de sódio, 10 mM de imidazol, 0,25 M de NaCl, pH 8.0 (tampão de equilíbrio). Carga IMAC foi preparada pela adição de 5 M de NaCl para o agrupamento de eluição de HIC para produzir 0,25 M de NaCl no volume final. A amostra foi carregada em resina IMAC em taxa de fluxo de 4 ml/min. A carga foi concluída por 2 volumes de coluna do tampão de equilíbrio. Resina foi lavada com 2 volumes de coluna de 20 mM de Fosfato de sódio, 10 mM de imidazol, pH 8.0 para remover o sal. Uma eluição linear foi realizada de 0 a 100 %B em 7 volumes de coluna com um tampão (20 mM de Fosfato de sódio, 10 mM de Imidazol, pH 8.0) e tampão B (20 mM de Fosfato de sódio, 200 mM de Imidazol, pH 8.0) seguido por 2 CV de 100% B. Presença de Imidazol manteve a absorvância de UV 215 acima de 3500 mAu com AKTA FPLC, então um pico de eluição não foi observado. As frações de fluxo, lavagem e eluição foram analisadas por 4 -12% de Bis-Tris sem redução de SDS-PAGE em gel (FIG. 48). O gel mostra a remoção bem sucedida da proteína da célula hospedeira e espécies XTEN truncadas (FIG. 48A). Com base no segundo gel (FIG. 48b), as frações, C5, C6 e C7 foram agrupadas. Estimou-se um total de 70 mg de proteína no agrupamento de eluição de IMAC.

4. Digestão de tripsina do agrupamento de eluição de IMAC

[484] A digestão da tripsina do agrupamento de eluição do IMAC foi realizada na proporção 1: 200 m/m. 0,35 mg de tripsina bovina do pâncreas (Sigma, Cat. # T1426) foi incubado com 70 mg de proteína (agrupamento de eluição do IMAC) durante a noite a°37°C. Análise de 4-12% sem redução de Bis-Tris SDS-PAGE foi realizada para confirmar que a clivagem do marcador CBD foi concluída conforme indicado na FIG. 49.

5. Etapa de Polimento: Cromatografia MacroCap Q

[485] Após a digestão de tripsina, os marcadores clivados foram separados usando cromatografia Macrocap Q. Uma coluna de XK 16 foi embalada com leito de 18 cm de altura com MacroCap Q (GE Life Sciences, Cat. # 17-5469-02). O agrupamento de eluição IMAC com tripsina digerida foi incubado por 1 hora a 37°C com 2 mM de TCEP para reduzir os dímeros de XTEN previamente ao seu carregamento na coluna MacroCap Q. A coluna foi incubada com 20 mM de HEPES, pH 7.0. A amostra foi carregada em 4 ml/min (~ 2 mg/ml de carga de resina). Carga da coluna foi concluída com 2 volumes de coluna adicionais de 20 mM de HEPES, 2mM de TCEP, pH 7.0. A coluna foi lavada com 2 volumes de coluna de (20 mM HEPES, 2 mM de TCEP, 150 mM de NaCl, pH 7.0). Uma eluição gradiente linear de 150 mM de NaCl a 500 mM de NaCl em 20 mM de HEPES, 2mM de TCEP, tampão de pH 7.0 foi realizada em mais de 20 volumes de coluna. Observou-se UV 215 em um nível elevado durante a cromatografia inteira (FIG. 50) devido à presença do TCEP, mas o pico da eluição foi observado entre 22 a 30 mS/cm. Todas as amostras foram analisadas por SDS-PAGE, coloração prata e C18 RP-HPLC. A remoção de CBD clivado foi observada no fluxo (FIG. 51a), enquanto bandas muito fracas de XTEN foram observadas em frações de eluição (FIG. 51B) em frações de eluição E11, E12, F12, F11, F10... F6). A separação de espécies em truncamento de XTEN foi observada através da coloração prateada em frações de eluição anteriores E11, E12, F12 e F11 como espécies migrando mais rápido do que o polipeptídio XTEN principal (FIG. 51C). Com base nos resultados acima, as frações de eluição foram posteriormente analisadas por C18 RP-HPLC. A FIG. 52 mostra perfis de cromatografia empilhados da análise de RP-HPLC. As frações de eluição anteriores tinham ombro principal amplo, indicando a presença significativa de espécies truncadas. Também, estas frações anteriores (E12, F12 & F11) foram enriquecidas com marcadores de proteólise. Com base na análise acima, as frações de eluição F10, F9, F8, F7 e F6 foram agrupadas. O agrupamento de eluição foi analisado novamente pela C18 RP-HPLC (FIG. 53). Descobriu- se que a proteína purificada era 97,5% pura.

6. Concentração e Diafiltração (Fórmula Final).

[486] O agrupamento acima MacroCap Q estava concentrado usando um dispositivo centrífugo Amicon Ultracel-15 (MWCO 10K) para 5 ml seguido por diafiltração de 7X com 20 mM de HEPES, pH 7.0 para uma concentração de proteína final de 8,13 mg/ml. Total de 43 mg de proteína foi purificado a partir de 20 gm de centrifugado. A recuperação total para as três etapas de cromatografia foi estimada em ~ 33%.

Exemplo 19: Purificação do reagente 1xAmino-XTEN com marcadores CBD e His8

[487] Purificação de amino-XTEN foi realizada essencialmente como descrito para a purificação da 1xThiol- XTEN contendo uma cisteína (ver exemplo 15 para obter detalhes). 20 gm de pasta de células da fermentação foi homogeneizado em 100 ml com 20 mM de fosfato de sódio, pH 8.0 (tampão de lise), tratado com calor e clarificado por centrifugação e filtração. A cromatografia de interação hidrofóbica foi usada como uma primeira etapa para capturar a proteína intacta do terminal N (FIG. 54). As frações, E2, E3, e E4 foram agrupadas para processamento posterior. A Cromatografia de afinidade IMAC foi usada como uma etapa de captura para ligar ao marcador His do Terminal C intacto do XTEN (FIG. 55). Frações E2 e E3 foram agrupados. A digestão da tripsina do agrupamento de eluição do IMAC foi realizada em uma razão de 1:200 m/m durante a noite a 37°C. Após a digestão da tripsina, marcadores clivados foram separados usando cromatografia MacroCap Q. Frações foram analisadas por SDS-PAGE seguido por coloração prateada (FIG. 56) e C18 RP-HPLC (FIG. 57). Com base na análise acima, as frações de eluição C10, C11, e C12 foram agrupadas. O agrupamento de eluição foi analisado novamente pela C18 RP-HPLC (FIG. 58). Descobriu-se que a proteína era >98% pura. O agrupamento MacroCap Q foi concentrado usando um dispositivo centrífugo Amicon Ultracel-15 (MWCO 10K) a 3000 RPM para 5 ml seguido por diafiltração de 7X com 20 mM de HEPES, pH 7.0 para uma concentração de proteína final de 5.35 mg/ml.

Exemplo 20: Purificação e Avaliação do sistema com Dois- marcadores RP11/His8-XTEN

[488] Usando a expressão vetores conforme descrito acima, Duas proteínas XTEN marcadas foram construídas para codificar as proteínas de fusão com os seguintes componentes ou sequências de aminoácidos: MKIKTGARILALSALTTMMFSASALAAPTTAGAG-Tag-XTEN_AE869(Am1)- RHHHHHHHH, em que: MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA é uma sequência de reconhecimento MalE que é clivada do polipeptídio expresso e transportada para o periplasma da célula hospedeira, APTTAGAG é um espaçador e Marcador é a partir do seguinte (nome do marcador, seguido pela sequência entre parênteses): RP5 (RPRPRPRPRPGR); RP7 (RPRPRPRPRPRPRPGR); KP5 (KPKPKPKPKPGR); RP9 (RPRPRPRPRPRPRPRPRPGR); RP11 (RPRPRPRPRPRPRPRPRPRPRPGR); P5K4P9 (RPRPKPRPKPRPKPRPKPGR); e R6K5P11 (RPRPKPRPKPRPKPRPKPRPKPGR). Todas as variações dos construtos com marcadores foram feitas e as proteínas foram expressas em E. coli usando os métodos descritos no Exemplo 15. Extratos solúveis foram preparados a partir da célula hospedeira para a análise de coloração SDS-PAGE/Coomassie. Pela análise, a composição de comprimento e aminoácido do marcador do terminal N não afetou a expressão da proteína visivelmente (ver FIG. 59) para expressão dos construtos com marcadores RP7, RP9, RP11 e R6K5P11. Proteínas expressas com os marcadores de proteínas RP5, RP7, RP9 e RP11 foram posteriormente testados para a ligação com resina MacroCap SP. Proteínas com marcadores mais longos ligaram de forma mais eficientemente a resina de permuta catiônica e mantiveram-se ligados nas mais rigorosas condições de lavagem. Assim, o marcador RP11 foi selecionado como marcador de terminal N para a purificação do XTEN usando cromatografia de permuta catiônica. Um experimento adicional mostrou que o polipeptídio RP11-XTEN- His8 foi expresso eficientemente no fermentador e a maioria das proteínas expressas foi encontrada na fração do sedimento de células (FIG. 60).

Exemplo 21: Purificação do reagente 1xAmino-XTEN com sistema com dois-marcadores RP11/H8 1. Expressão

[489] Precursor de RP11-XTEN-His8 de 1xAmino-XTEN foi produzido pela expressão no E. coli transformado usando uma reação de fermentação de 4 L conforme descrito. As células foram colhidas por centrifugação e congeladas a - 80° C até o uso.

2. Lise e Clarificação

[490] 25 g de pasta de célula foi ressuspensa em 75 mL de 20 mM de fosfato de sódio pH 8.0, 50mm de NaCl, 2 mM de EDTA. A lise foi realizada passando a pasta ressuspensa através de um homogeneizador a 800-900 bar, três vezes. O homogeneizado foi mantido a 85°C em um banho de água durante 15 minutos antes de ser rapidamente esfriado usando um banho de gelo/água até a temperatura estar abaixo de - 10°C. O homogeneizado tratado foi então centrifugado a 10.000 rpm no rotor SLA-3000 durante 60 minutos. Sobrenadante foi coletado e filtrado usando um filtro para frasco de 0,22 μm.

3. Etapa de captura de permuta catiônica

[491] A cromatografia de permuta catiônica foi usada como uma etapa de captura para garantir a integridade do terminal N do produto. Resina MacroCap SP (GE Healthcare) foi selecionada entre os vários meios de permuta catiônica devido à sua capacidade superior e seletividade do produto. Uma coluna de 20 mL da MacroCap SP foi embalada em uma carcaça de Redi-Sep e equilibrada com tampão com 20 mM de fosfato de sódio (pH 8.0), 20 mM de NaCl. O lisado foi carregado na coluna pela gravidade. Três volumes de coluna (CV) de 20 mM de sódio fosfato pH 8.0, 100 mM de NaCl foi aplicado como a etapa de lavagem antes da proteína ser eluída na etapa com 3 CVs de 20mm de sódio fosfato pH 8.0, 500 mM de NaCl. Metade das frações de CV (10 mL) foi coletadas para eluições e analisadas por 4-12% de Bis-Tris SDS/PAGE (FIG. 61) . As fracções de eluição 2-4 foram combinadas para a posterior análise cromatográfica.

4. Etapa de polimento IMAC

[492] Uma coluna com 20-mL de ToyoPearl AF-quelato foi embalada em uma carcaça de coluna de Redi-Sep e carregada com 100 mM de sulfato de níquel. A coluna foi incubada com 20mm de fosfato de sódio pH 8.0, 500 mM de NaCl antes do agrupamento MacroCap SP ser carregado na coluna pela gravidade. As duas etapas de lavagem foram aplicadas usando tampão com 20 mM de fosfato de sódio (pH 8.0), 500 mM de NaCl, 5 mM de imidazol seguido por 20 mM de fosfato de sódio (pH 8.0), 5 mM de imidazol. O produto foi então eluído a partir da coluna utilizando 20mM de fosfato de sódio, 100 mM de imidazol e metade das frações de CV (10 mL) foram coletadas para 4 CVs de eluição. Amostras de cada etapa foram examinadas por 4-12% de Bis-Tris SDS/PAGE (FIG. 62). Com base em gel, as eluições 2 e 3 foram agrupadas para processamento posterior. O rendimento total foi de 30%.

5. Digestão de tripsina do agrupamento de eluição de IMAC

[493] A digestão da tripsina do agrupamento IMAC foi realizado na proporção de 1:200 e 1:500 m/m, adicionando 1 mg/mL de tripsina bovina (Sigma, Cat. # T1426, tripsina de pâncreas bovino) para o agrupamento IMAC. As misturas da reação foram mantidas a 37°C durante a noite e a conclusão da digestão foi confirmada por espectrometria de massa MALDI-TOF. Amostras pé e pós-digestão foram analisadas por 4-12% de Bis-Tris SDS/PAGE colorida por Coomassie e corante prata (FIG. 63). A coloração mais fraca em gel manchado da Coomassie, assim como o deslocamento do peso molécula para as amostras pós-digestão, quando comparado à amostra de pré-digestão, indica a remoção bem sucedida de ambas os marcadores de terminal N e C. Um gel manchado de prata mostrou as bandas homogêneas após a digestão, sugerindo a ausência de espécies truncadas na amostra, apoiando a conclusão de que os métodos de purificação e de sistema e dois-marcadores RP11/H8 fornece um produto final de XTEN homogêneo.

Exemplo 22: Purificação do XTEN com marcadores de afinidade RP11 e His8 1. Expressão

[494] A proteína de fusão RP11-XTEN-His8, com duas marcas de afinidade ligadas à XTEN no terminal N e C, respectivamente, foi expressa em E. coli usando uma reação de fermentação de 4 L usando as condições descritas.

2. Lise e Clarificação

[495] Após o crescimento, as células foram colhidas por centrifugação e congeladas a - 80°C até o uso. O sedimento de células foi ressuspenso em tampão de lise (20 mM de fosfato de sódio, 50mm de NaCl, 2 mM de EDTA de pH 8.0, 3 ml de tampão por grama de pasta de células). As células foram lisadas passando através de um homogeneizador APV três vezes a uma pressão de 830-900 bar. Tampão de lise (1 ml de tampão por grama de pasta de células) foi usado como uma injeção para recuperar o volume realizado do homogeneizador. O lisado homogeneizado foi incubado em um banho de água a 85°C por 20 minutos, seguido de resfriamento rápido em banho de gelo por 20 minutos. Após o tratamento de aquecimento e arrefecimento, o lisado foi centrifugado a 11000 RPM por 90 minutos em uma centrífuga SORVALL. Após a centrifugação, o sobrenadante foi filtrado através de dois filtros CUNO Bio cap 25 (BC0025L90SP08A). O sobrenadante clarificado foi armazenado a 4°C durante a noite.

3. Etapa de Captura: Cromatografia Toyopearl IMAC

[496] A Cromatografia de afinidade IMAC foi usada como uma etapa de captura para ligar XTEN com um His-marcador de terminal C. Brevemente, a coluna de cromatografia BPG140/12 (GE Life Sciences) foi embalada com 2000 ml de resina Toyopearl IMAC 650 M (TOSOH Biosciences). A coluna foi equilibrada com 2 volumes de coluna (CVs) de tampões de equilíbrio (20 mM de fosfato de sódio, 500 mM de NaCl, pH 8.0). Lisado clarificado celular foi ajustado para uma concentração de NaCl final de 500 mM, utilizando 5 M de solução-estoque de NaCl e então foi carregado para a resina do IMAC. A coluna foi lavada com 2 volumes de coluna do tampão de equilíbrio e em seguida 2 volumes de coluna com 20 mM de fosfato de sódio, 500 mM de NaCl, 5 mM de Imidazol com pH 8.0, seguido de 2 volumes de coluna com 20 mM de fosfato de sódio, 5 mM de imidazol com pH 8.0 para remover o sal. Realizou-se a eluição com 2 volumes de coluna com 20 mM de fosfato de sódio, 100 mM de Imidazol, pH 8.0. Fluindo através, as frações de lavagem e eluição foram analisadas pela não-redução de 4 -12% de corante Bis-Tris SDS-Page/Coomassie e as frações com o produto desejado foram agrupadas.

4. Etapa de Polimento/Captura: Cromatografia MacroCap SP

[497] A cromatografia de permuta catiônica foi usada como uma etapa de polimento para garantir a integridade do terminal N do produto. Resina MacroCap SP (GE Life Sciences) foi selecionada entre os vários meios de permuta catiônica devido à sua capacidade superior e seletividade do produto. 1000 ml de resina MacroCap SP foi embalado em uma coluna de cromatografia de BPG100/13 (GE Life Sciences) e equilibrado com 20mm de fosfato de sódio pH 8.0, 20 mM de NaCl. O agrupamento do IMAC foi carregado para a coluna e a resina foi lavada com 2 volumes de coluna de 20 mM de fosfato de sódio, 50 mM de NaCl, pH 8.0 e 2 volumes de coluna de 20mm de fosfato de sódio pH 8.0, 150 mM de NaCl. A proteína foi eluída com 5 volumes de coluna de gradiente linear de 150 a 500 mM de NaCl em 20mm de fosfato de sódio pH 8.0. Frações foram coletadas e analisadas por 4-12% de Bis-Tris SDS/PAGE. Frações com o produto desejado foram combinadas para a próxima etapa.

5. Digestão de tripsina do agrupamento de eluição de Macrocap SP

[498] Digestão de tripsina (Sigma, tripsina de Pâncreas Bovino) do agrupamento de eluição SP foi realizada na proporção de 1:200 m/m enzima/proteína durante a noite a 37°C.

6. Etapa de Polimento: Cromatografia Macrocap Q

[499] Após a digestão de tripsina, os marcadores clivados foram separados do produto final usando cromatografia Macrocap Q. A coluna BPG100/19 (GE Life Sciences) foi embalada com 1500 ml de volume de coluna de resina Macrocap Q (GE Life Sciences). O agrupamento de eluição de tripsina digerida Macrocap SP foi incubado por 15 min a 80°C com 20 mM de DTT e 2mm de EDTA para reduzir as ligações de dissulfeto e inativar a tripsina. A solução de refrigeração da proteína foi diluída para uma condutividade abaixo de 5 mS/cm com água Milli-Q e carregada para a coluna Macrocap Q incubada com 20 mM HEPES, 50mM de NaCl, pH 7.0. A coluna foi lavada com 2 volumes de coluna de 20 mM HEPES, 50mM de NaCl, pH 7.0, então 2 volumes de coluna com 20 mM de HEPES, 2mM de TCEP, e 150mM de NaCl pH 7,0. A proteína foi eluída com gradiente linear a partir de 150 mM de NaCl a 500 mM de NaCl em 20mM de HEPES, pH 7.0 em 20 volumes de coluna. Frações foram analisadas pela coloração SDS-PAGE/prata.

7. Concentração e Diafiltração (Fórmula Final)

[500] Frações MacroCap Q selecionadas foram combinadas e concentradas e usando 10 KD Pellicon mini (Millipore) em uma pressão de suprimento < 20 psi e retentado < 8 psi, seguido por 10 X de diafiltração com 20 mM de HEPES, 50mm de NaCl, pH 7,0 para obter uma concentração final de proteína > 5mg / ml.

8. Análise de pureza das proteínas purificadas com diferentes métodos

[501] Um lote (Lote 1) foi purificado através de três etapas de purificação, como descrito acima. Outro lote (Lote 2) foi purificado a partir do mesmo material fermentado, mas a etapa de polimento MacroCap SP foi omitida. Espécies truncadas de XTEN foram detectadas por coloração SDS-PAGE/prata em frações de eluição MacroCap Q para o Lote 2 (FIG. 87A), enquanto as frações de eluição MacroCap Q para Lote 1 ficaram essencialmente livres de truncamentos (FIG. 87B). Estes resultados suportam que, nas condições empregadas, a etapa de MacroCap SP com base no marcador RP11 é essencial para garantir a integridade do terminal N e a qualidade geral do produto e que os métodos de purificação e de sistema com dois-marcadores RP11/H8 fornece um produto XTEN homogêneo final.

Exemplo 23: Conjugação do Ligante DBCO-Mal para 3xThiol- XTEN para Produzir um Precursor XTEN

[502] Um segmento XTEN com construção de cisteína 3x-Thiol- XTEN (XTEN_AE905 (Am1, C8, C453, C898, Seg174)) foi preparado para a reação conforme uma solução com 193 uM (16 mg/ml) em 20 mM de HEPES, pH 7.0, 50mM de NaCl. DBCO- Maleimida (Click Chemistry Tools, Inc., Cat. # A108) foi dissolvida em DMF para uma concentração final de 50 mM. Uma alíquota de 3xThiol-XTEN (5,1 mg, 320 μl) foi reduzida com 10 mM de DTT recém-reconstituído em 70oC por 20 minutos. A amostra de proteína foi diluída para 600 μl de volume total com água. 1200 μl de acetonitrilo 100% foi adicionado e a mistura foi centrifugada a 13.000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi removido, 1000 μl de acetonitrilo 80% foi adicionado e a mistura foi centrifugada a 13.000 rpm por 1 minuto. A etapa de lavagem foi repetida mais uma vez. O sedimento foi dissolvido em 300 μl com 100 mM de HEPES de pH 7.0. Uma solução de 7,7 μl com 50 mM de DBCO-Mal em DMF foi adicionado (razão molar de 1:6 de 3xThiol-XTEN para DBCO-Maleimida) e foi incubada por 2 horas a 25°C. A conclusão da modificação foi monitorada por análise RP-HPLC em C18 (FIG. 64A). A mistura de proteína foi purificada por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usando uma coluna de butil Toyopearl com 1,6 ml. A eluição foi realizada com gradiente descendente de sulfato de amônio em 30 volumes de coluna a partir de 1,05 M até 0,3M em tampão com 20 mM de fosfato, pH 7,0, em uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min (FIG. 64B). Frações cromatográficas foram analisadas por RP-HPLC em C18 (FIG. 64C).

[503] Exemplo 24: Clivagem de tripsina e purificação do precursor com marcador duplo.

Digestão de tripsina

[504] Um precursor com marcação dupla (CBD/His8) da XTEN_AE870_Am1, C1 mancha bem com Coomassie devido à presença da seqüência CBD, enquanto uma versão não-marcada da XTEN_AE870_Am1, C1 mancha mal com Coomassie, mas pode ser detectada por coloração de prata. Portanto, a integralidade de digestão de tripsina foi monitorada usando as técnicas de coloração Coomassie (FIG. 65A) e a coloração de prata (FIG. 65B). O precursor com duplo marcador de XTEN_AE870_Am1, C1 foi digerido com diferentes proporções de tripsina bovina e tripsina suína de classe proteômica (controle positivo) em tampão de 20 mM de fosfato, pH 8:. Incubação durante a noite a 37°C, permitiu a digestão mais completa do que a incubação durante a noite a 25°C com base na detecção da coloração da Coomassie restante 160 kDa da banda do precursor com duplo marcador (FIG. 65A: todas as razões se referem a relação massa/massa de tripsina para o substrato). A FIG. 65B mostra que as razões de 1:100, 1: 200 e 1:500 digerem com tripsina bovina e 1:100 digere com tripsina porcina, resultando em uma digestão eficiente do precursor XTEN.

Purificação MacroCap Q de precursor com duplo marcador digerido por tripsina.

[505] A proporção de 1: 200cde tripsina bovina para precursor com duplo marcador (massa/massa) foi usada para a digestão, a 37°C durante a noite. A FIG. 66a mostra > 90% da conversão do precursor com marcador duplo ao produto digerido. Isto foi demonstrado pelo desaparecimento da banda manchada da Coomassie em ~ 160kDa após a digestão e o aparecimento do fragmento CBD em 20 kDa.

[506] O material de tripsina digerida foi submetido a etapa de purificação usando resina de permuta ânionica MacroCap Q e os tampões a seguir: A: 20mM de HEPES, 50mm de NaCl, pH 7,5 e B: 20mM de HEPES, 500mM de NaCl, pH 7,5. O material digerido foi carregado por gravidade e eluído de forma gradual, usando lavagens com 3 volumes de coluna de 0%, 20%, 40%, 60%, 80% e 100% de Tampão B consecutivamente. XTEN_AE870 foi eluída em 60% de B. FIG. 66B mostra que aquele fragmento CBD clivado não se liga à MacroCap Q mediante as condições usadas e estava completamente separado da XTEN. A eluição gradual de XTEN a partir da MacroCap Q somente separou parcialmente os polipeptídeos truncados. A melhor separação foi alcançada por eluição gradiente de XTEN (FIG. 66 C).

Teste de atividade residual da tripsina.

[507] Para testar a presença de atividade residual da tripsina nas preparações formuladas finais de XTEN, uma amostra de proteína foi misturada com peptídeo sintético [G2] GLP2 na razão de 10:1 massa/massa. Um controle positivo para digestão continha o peptídeo [G2] GLP2 e tripsina bovina; Um controle negativo continha somente o peptídeo [G2] GLP2. Todas as amostras foram incubadas durante a noite a 37°C. Após a incubação, as amostras foram extintas com 1% de TFA e submetidas a análise por RP-HPLC de C18, utilizando uma coluna analítica Phenomenex Jupiter C18 5 μm 300A. O Tampão A contém 0.1% de TFA, 99,9% de HPLC classe H2O; O Tampão B contém 0.1% de TFA, 99,9% de HPLC classe Acetonitrilo. A análise foi realizada usando um gradiente de 5% de B até 50% de B durante 45 min do tempo de eluição. A FIG. 67 mostra os resultados das análises de RP-HPLC de atividade residual da tripsina na preparação final de XTEN_AE869(Am1,C2). A FIG. 67A mostra o peptídeo GLP2 intacto (41 min de tempo de retenção). A FIG. 67b mostra a digestão tríptica do peptídeo GLP2 com dois fragmentos trípticos característicos (33,5 min e 34 min do tempo de retenção). A FIG. 67C mostra que o peptídeo GLP2 permaneceu intacto após a incubação durante a noite com XTEN e nenhum fragmento tríptico foi observado. Este resultado indica que as preparações purificadas finais de MacroCap Q não contêm qualquer atividade residual da tripsina.

Exemplo 25: Fermentação e Purificação de XTEN com construção de cisteína para Conjugação

[508] E. coli contendo AC292 em um plasmídeo foi cultivado até a saturação durante a noite em 2xYT e então 200 ml desta cultura foram utilizados para inocular uma cultura de 25L de meio 2xYT em um wavebag. Ambas as culturas estavam na presença de 50 μg/ml de canamicina. A segunda cultura foi cultivada a um OD600 de ~1.0 a 37°C, refrigerada a 26°C e induzida com 12 ml de 1m de IPTG durante a noite. O sedimento de células foi colhido a 4000 rpm em um rotor de SLA-3000 girando por 20 minutos. O sediemnto de células (184g) foi ressuspenso em 736 ml de 20 mM de Tris 20mm, pH 6,8, 50 mM de NaCl. As células ressuspensas foram lisadas com um microfluidificador de 20.000 psi e em seguida aquecidas a 75°C por 15 minutos, seguido por resfriamento rápido no gelo por 30 minutos. O lisado foi então clarificado por centrifugação. O clarificado lisado foi então carregado em uma coluna DE52, previamente higienizada com NaOH e equilibrada com 20 mM de Tris, pH 6,8, 50 mM de NaCl. A coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de 20 mM de Tris, pH 6,8, 50mm de NaCl, 5 volumes de coluna de 20 mM de Tris, pH 6,8, 150 mM de NaCl e eluída com 5 volumes de coluna de 20 mM de Tris, pH 6,8, 250 mM de NaCl. As frações de eluição agrupadas, em seguida, foram carregadas em uma coluna de MacrocapQ, previamente higienizada com NaOH e equilibrada com 20 mM de Tris, pH 6,8, 50 mM de NaCl. A coluna foi lavada com 9 volumes de coluna de 20 mM de Tris, pH 6,8, 50mm de NaCl, 9 volumes de coluna de 20 mM de Tris, pH 6,8, 100 mM de NaCl e eluída com 9 volumes de coluna de 20 mM de Tris, pH 6,8, 250 mM de NaCl. As frações de eluição agrupadas foram ajustadas a um 15% w/v de sulfato de sódio e então carregadas em uma coluna de octil sefarose FF, previamente higienizada com NaOH e equilibrada com Tris pH 7,5. A coluna foi lavada com 4 volumes de coluna de 20mM de Tris, pH 7,5, 15% w/v de sulfato de sódio e eluída com 4 volumes de coluna de 20mM de Tris, pH 7,5, 15% w/v de sulfato de sódio. A amostra foi armazenada a 4° C e fornecida ao Lot # AP197. O XTEN purificado com construção de cisteína pode, então, servir como um reagente adequado para conjugação com uma carga útil, tal como uma droga da tabela 11, resultando em um conjugado XTEN-droga.

Exemplo 26: Conjugação de GLP2-Cys para 1xAmino-XTEN para resultar em XTEN-carga útil de GLP2-XTEN

[509] Um 1xAmino-XTEN (XTEN_AE869(Am1)) foi preparado como 67 uM de solução (5,35 mg/ml) em 20 mM de HEPES, pH 7.0, 50 mM de NaCl. Sulfo-SMCC (Thermo Scientific, Cat. # 22322) foi preparada fresca como solução de 100mM em DMSO. 10 mg de amino-XTEN (1,87 ml) foi misturado com 15-molar de excesso de sulfo-SMCC (18.7ul) e incubado durante 1 hora a 25°C. Reticulador em excesso foi removido por filtração centrífuga usando dispositivo centrífugo Amicon Ultra-15, MWCO 5K. Um volume de 1,8 ml de mistura da reação foi misturado com 8 ml de 20mm de HEPES pH 7.0, 50mm de NaCl e centrifugado por 20 min em centrífuga Sorvall RT6000 a 3000 rpm, a 4°C. O procedimento foi repetido mais duas vezes. O volume final do retentado recuperado foi de 1,8 ml. O peptídeo GLP2-Cys (CSBio, síntese personalizada) foi dissolvido em 20 mM de HEPES pH 7.0, 50mm de NaCl na concentração final de 3 mg/ml. N-Maleimida-XTEN foi misturado com 2.3-vezes de excesso molar de peptídeo GLP2- Cys e foi incubada por 1 hora a 25°C. A conclusão da modificação foi monitorada por RP-HPLC de C18. 20 μg de amostras de proteína foram carregadas na coluna de Phenomenex Jupiter C18 5uM 300A de 4.6mm x 150mm. Proteínas foram eluídas com gradiente de 5-50% de acetonitrilo em 0,1% de ácido trifluoroacético e detectadas pela absorvância a 214 nm. Essencialmente todos os N-maleimida- XTEN foram convertidos em conjugado GLP2-Cys-XTEN, como demonstrado por HPLC e espectrometria de massa eletrospray (a análise ESI-MS das amostras foi realizada em 100 μg de amostras da proteína desalgadas usando dispositivos de centrífuga Omega NanoSep 3K (Pall Corp.). Soluções de proteínas em 50% de acetonitrilo, 0,5% de ácido fórmico foram infundidas em espectômetro de massa de alta resolução na taxa do fluxo de 10ul/min. Os espectros foram adquiridos na faixa de 800-1600 amu e reconstruídos em espectros de carga zero usando Software de Reconstrução de Proteína Bayesian) (FIG. 68). Peptídeo XTEN e GLP2 não reagido foi separado do conjugado por permuta de ânion consecutiva (MacroCap Q) e cromatografias de interação hidrofóbica (Toyopearl Fenil). Os resultados das análises de RP-HPLC e MS demonstraram o alto rendimento e pureza dos reagentes e produto final (FIG. 68).

Exemplo 27: Conjugação de GLP2-N-Mal para1xThiol-XTEN (XTEN com construção de cisteína)

[510] 1xThiol-XTEN (XTEN_AE880(Am1,C8) (Seg 181) foi preparado como 122 uM (9,84 mg/ml) de solução de 20 mM de HEPES, pH 7.0, 50 mM de NaCl. Peptídeo GLP2-N-Maleimida (CSBio, síntese personalizada) foi dissolvido em DMSO para a concentração final de 3 mg/ml. 1xThiol-XTEN (8,8 mg em 900 μl) foi misturado com 3 vezes excesso molar de peptídeo GLP2-N-Mal e incubado durante 1 hora a 25°C. Conclusão da modificação e o conjugado resultante foi monitorada por RP- HPLC de C18 (20 μg de amostras de proteínas foram carregadas na coluna Phenomenex Jupiter C18 5uM 300A de 4,6mm x 150 mm. Proteínas foram eluídas com gradiente de 550% de acetonitrilo em 0,1% de ácido trifluoroacético e detectadas pela absorvância a 214 nm e espectrometria de massa por ionização em eletrospray (análise ESI-MS das amostras foi realizada em 100 μg de amostras de proteína desalgadas usando dispositivos de centrífuga Omega NanoSep 3 K (Pall Corp.). Soluções de proteínas em 50% de acetonitrilo, 0,5% de ácido fórmico foram infundidas em espectrômetro de massa de alta resolução na taxa do fluxo de 10ul/min. Os espectros foram adquiridos na faixa de 8001600 amu e reconstruídos em espectros de carga zero usando Software de Reconstrução de Proteína Bayesian). Os resultados da análise são mostrados na FIG. 69. O conjugado GLP2-XTEN foi purificado por preparativo C4 RP-HPLC (VydacProtein C4 5μ 300A coluna de 10 mm x 250 mm) usando gradiente de 5-50% de acetonitrilo em 0,1% de TFA como fase móvel (Ver FIG. 70A). Conjugado GLP2-XTEN final de HPLC- purificado foi analisado usando coluna Phenomenex Jupiter C18 5uM 300A de 4.6mm x 150 mm (Ver FIG. 70B). O rendimento do conjugado GLP2-XTEN purificado foi de 6,2 mg (70%).

Exemplo 28: Conjugação de DBCO-Mal para 1xThiol-XTEN

[511] 1xThiol-XTEN (XTEN_AE880(Am1,C8) (Seg 181) foi preparado como 150uM (12 mg/ml) de solução de 20 mM de HEPES, pH 7.0, 50 mM de NaCl. DBCO-Maleimida (Click Chemistry Tools, Inc., Cat # A108) foi dissolvida em DMF para uma concentração final de 50 mM. Um volume de 200ul (2,4 mg) de 1xThiol-XTEN foi ajustado para 100mM de HEPES pH 7.0 usando uma solução estoque de 1M. Um volume de 1.2 μl de 50 mM de DBCO-Mal em DMF foi adicionado à solução da proteína (razão de 1:2 molar de 1xThiol-XTEN para reagente DBCO-Maleimida) e foi incubada por 1 hora a 25°C. Conclusão da reação de modificação foi monitorada por RP-HPLC de C18 (FIG. 71A). A mistura de proteína foi purificada por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usando uma coluna de Butil Toyopearl com 1,6 ml. A eluição foi realizada com gradiente descendente de sulfato de amônio em 30 volumes de coluna a partir de 1,05 M até 0,3M em tampão com 20 mM de fosfato, pH 7,0, em uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min (FIG. 71B). Frações cromatográficas foram analisadas por RP-HPLC em C18 (FIG. 71C).

Exemplo 29: Preparação de um Conjugado Biespecífico a partir de Precursores XTEN Monoespecíficos ligados pelos Terminais N.

[512] O exemplo descreve a criação de uma composição de XTEN-carga útil, ligando dois diferentes precursores de XTEN-carga útil em uma configuração de terminais N - a N -; um com uma carga A e outro com uma carga de B, resultando em um conjugado de biespecífico.

[513] Como uma primeira etapa, as moléculas XTEN contendo várias cisteínas (contrução de cisteína XTEN) são preparadas através de um sistema de purificação de duplo marcador RP11-His8, descrito acima e são formuladas em 20 mM de HEPES, pH 7.0, 50 mM de NaCl. Uma carga A-maleimida é dissolvida em solução aquosa 20 mM de HEPES, pH 7.0, DMF ou DMCO ou qualquer outro solvente apropriado, dependendo da solubilidade do reagente. A carga útil A-maleimida é adicionada para o XTEN com construção de cisteína em um excesso molar de 2-6 sobre XTEN e incubada durante 1 hora a 25°C. Conclusão da modificação é monitorado por RP-HPLC de C18. O conjugado carga útil A-XTEN resultante é purificado de contaminantes e componentes que não reagiram usando preparativo C4-C18 RP-HPLC. O conjugado de carga útil A- XTEN é formulado em 20 mM de HEPES, pH 7.0, 50 mM de NaCl. Em seguida, o conjugado de carga útil A-XTEN é modificado adicionalmente pela adição de éster dibenzilciclooctino (DBCO)-NHS ou éster DBCO-sulfo-NHS em um excesso molar de 10-50 para o XTEN e incubação de 1-2 horas a 2 5°C. A conclusão da modificação foi monitorada por análise RP-HPLC em C18. Se a eficiência de conjugação é baixa (por exemplo, < 90%) ou múltiplos produtos inespecíficos são formados, o conjugado de carga útil DBCO A-XTEN é purificado usando preparativo C4-C18 RP-HPLC. Se a eficiência da conjugação de éster DBCO-NHS é elevada (> 90%) com produtos colaterais não significativos, o conjugado de carga útil-DBCO A-XTEN é purificado do reagente em excesso por permutação de tampão usando um dispositivo centrífugo de MWCO 10-30 kDa, precipitação de acetonitrilo ou cromatografia de permutação de ânion.

[514] Para criar o segundo precursor XTEN-carga útil, uma carga de B-maleimida é dissolvido em solução aquosa 20 mM de HEPES, pH 7.0, DMF ou DMCO ou qualquer outro solvente apropriado, dependendo da solubilidade do reagente. A carga útil B-maleimida é adicionada para o segundo XTEN com construção de cisteína em um excesso molar de 2-6 sobre a concentração de XTEN e incubada durante 1 hora a 25°C. Conclusão da modificação é monitorado por RP-HPLC de C18 analítica. O conjugado carga útil B-XTEN resultante é purificado de contaminantes e reagentes usando preparativo C4-C18 RP-HPLC. O conjugado de carga útil B-XTEN é formulado em 20 mM de HEPES, pH 7.0, 50 mM de NaCl. O éster azida-PEG4-NHS é adicionado em excesso molar de 10-50 para a carga útil B-XTEN e incubado por 1-2 horas a 25°C. A conclusão da modificação foi monitorada por RP-HPLC em C18. Se a eficiência de conjugação é baixa (por exemplo, < 90%) ou múltiplos produtos inespecíficos são formados, o conjugado de azida-carga útil B-XTEN é purificado usando preparativo C4-C18 RP-HPLC. Se a eficiência da conjugação de éster DBCO-NHS é elevada (> 90%) com produtos colaterais não significativos, o conjugado de azida -carga útil-B-XTEN é purificado do reagente em excesso por permutação de tampão usando um dispositivo centrífugo de MWCO 10-30 kDa, precipitação de acetonitrilo ou cromatografia de permutação de ânion. O produto final é criado pela mistura de proteínas DBCO-carga útil A-XTEN e azida-carga útil B- XTEN purificadas e concentradas em uma razão equilmolar de tampão de 20 mM de HEPES pH 7.0, 50mm de NaCl e incubadas a 25°C por 1 hora ou mais, até que a reação estar completa. A conclusão da modificação foi monitorada por RP-HPLC em C4 ou C18. Se necessário, o conjugado de biespecífico carga útil-A-XTEN-carga útil B é purificado por preparativo RP- HPLC, cromatografia de interação hidrofóbica ou cromatografia de permutação de ânion.

Exemplo 30: Preparação de um Conjugado Trimérico a partir de Precursores XTEN Monoespecíficos ligados pelos Terminais N.

[515] Precursores monoespecíficos de XTEN-carga útil serão preparados como fusões de terminal N de Carga útil A ligado a uma molécula XTEN; por exemplo, de comprimentos variando de AE144 a AE890, que contém uma única cisteína no terminal C (preparado e purificado, como descrito no exemplo 25). Precursores purificado são formulados em 20 mM de HEPES, pH 7.0, 50 mM de NaCl. Tris-(2-maleimidoetil) amina (TMEA, Thermo Scientific, Cat. # 33043) e dissolvidos em DMSO ou DMF. Precursor (4-6 de excesso molar sobre reticuladores) e reagente TMEA são misturados e incubados durante 1 hora a 25°C. Conclusão da modificação é monitorada por RP-HPLC de C4 ou C18 ou cromatografia de exclusão de tamanho. O conjugado resultante de carga A-XTEN trivalente é purificado de reagentes de proteína ou mistura de produto parcial por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), cromatografia de permutação de ânion ou preparativa C4-C18 RP-HPLC.

Exemplo 31: Conjugação e Purificação do FITC-X-XTEN

[516] A proteína purificada derivada de AC272, lot # AP197, foi marcada com FITC maleimida. A amostra foi reduzida pela incubação à temperatura ambiente com 5mm TCEP por 1 hora. A amostra foi então posta em PBS usando colunas DG-10. A amostra foi rotulada, adicionando um 25-vezes de excesso molar de FITC-maleimida em DMSO e incubando à temperatura ambiente por 2 horas. Observe que o volume ajustado de tal forma que a concentração de DMSO foi < 5% de solvente total. A reação foi extinta, adicionando 2 mM de DTT e em seguida a amostra foi digerida durante a noite com protease TEV. A amostra foi diluída duas vezes com 20mm de Tris pH 7.5 e carregada em uma coluna de MacrocapQ, previamente higienizada com NaOH e equilibrada com 20 nM de Tris pH 7.5. A coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de 20 mM de Tris, pH 7.5, 135 mM de NaCl, 5 volumes de coluna de 20 mM de Tris, pH 7.5, 175 mM de NaCl e eluída com 5 volumes de coluna de 20 mM de Tris, pH 7.5, 250 mM de NaCl. As frações de eluição agrupadas foram então digeridas com TEV por mais de 60 horas a 4C para completar a digestão. As amostras digeridas foram, em seguida, passadas duas vezes por uma coluna de perloza de 1 ml previamente higienizada com NaOH e equilibrada com 20 mM de Tris pH 7.5, 135 mM de NaCl. Para remover qualquer amostra de FITC livre, fez-se, então, a diálise contra 20mm de Tris pH 7.5, 135 mM de NaCl usando uma membrana MWCO de 10.000. A co-migração de proteína sinal OD214 e FITC OD495 sinal em uma coluna de SEC indica a conjugação bem sucedida do XTEN com marca, com contaminação mínima de corante livre (FIG. 72B). A conjugação bem sucedida também é indicada pelo PM aparente grande da proteína com fluorescência FITC em SDS-PAGE (FIG. 72A).

Exemplo 32: Purificação da GFP-X-XTEN

[517] A GFP (AC219) foi quimicamente reticulada de XTEN por um reticulador bifuncional com um grupo de amina reativas para acoplar as lisinas GFP e um grupo reativo de cisteína para acoplar a cisteína livre projetada para o XTEN em AC292. GFP foi marcado com reticulador bi-funcional sulfo- SMCC incubando à temperatura ambiente por 2 horas. A proteína foi posta em PBS com DG-10 colunas para remover sulfo-SMCC livre. A proteína derivada purificada de AC272, lot # AP197 foi reduzido e desalgada em PBS em DG-10 colunas e misturado com o GFP marcado para permitir a reticulação. A reação do reticulador foi extinta com 2 mM de DTT e TEV adicionados para remover o domínio CBD em uma incubação durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte TEV adicional foi adicionado para completar a digestão com uma incubação adicional por 60 horas a 4°C. Após a digestão por TEV, a amostra foi diluída em 100 ml com 20mm de Tris pH 7.5 e carregada dentro de uma coluna de MacrocapQ, previamente higienizada com NaOH e equilibrada com 20 nM de Tris pH 7.5. A coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de 20 mM de Tris pH 7.5, 5 volumes de coluna de 20 mM de Tris pH 7.5, 50 mM de NaCl, 5 volumes de coluna de 20 mM de Tris pH 7.5, 100 mM de NaCl, 5 volumes de coluna de 20 mM de Tris pH 7.5, 150 mM de NaCl, 5 volumes de coluna de 20 mM de Tris pH 7.5, 200 mM de NaCl, 5 volumes de coluna de 20 mM de Tris pH 7.5, 250 mM de NaCl, 5 volumes de coluna de 20 mM de Tris pH 7.5, 300 mM de NaCl e 5 volumes de coluna de 20 mM de Tris pH 7.5, 500 mM de NaCl. As frações de eluição de pico foram agrupadas e armazenadas a 4° C. O reticulador foi confirmado pela co-migração da proteína OD214 de sinal e da GFP OD395 sinal em uma coluna da SEC, com a saída do SEC mostrada como sobreposições na FIG. 73. Exemplo 33: Farmacocinética dos Conjugados da GFP-XTEN e FITC-XTEN

[518] A farmacocinética dos conjugados reticulados GFP-XTEN e FITC-XTEN preparados como descrito nos Exemplos acima foram testadas em macacos cynomolgus. GFP-XTEN e FITC-XTEN foram administradas ao cynos macho IV para volumes de 2 mg/kg e a dose de 0,77 e 0,68 mL respectivamente. As amostras de sangue (1.0 mL) foram coletadas em tubos heparinizados pré-refrigerados na pré-dose, em pontos de tempo de 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 216, 264, 336, 388, 432, 504 horas, e processadas no plasma. A quantificação foi realizada pelo ensaio de ELISA utilizando o anticorpo anti-XTEN tanto na captura quanto na detecção no caso da captura de GFP-XTEN e deteção anti-FITC no caso FITC-XTEN. Uma análise não-compartimental foi realizada em WinNonLin com todos os pontos de tempo incluídos no ajuste para determinar os parâmetros PK. Os resultados farmacocinéticos estão resumidos na tabela 40 e FIG. 74. Os dados mostram que XTEN pode prolongar a meia-vida de moléculas às quais ele é quimicamente conjugado de uma forma comparável às fusões genéticas para cargas úteis de tamanho similar.Tabela 40: Parâmetros de PK de composições de XTEN-carga útil conjugadas.

[519] As farmacocinéticas de GFP-L288, GFP-L576, GFP- XTEN_AF576, GFP-XTEN_Y576 e XTEN_AD836-GFP foram testadas em macacos cynomolgus para determinar o efeito da composição e o comprimento dos polipeptídeos não estruturados em parâmetros PK. Amostras de sangue foram analisadas em vários momentos após a injeção e a concentração de GFP no plasma foi medida por ELISA usando um anticorpo policlonal contra GFP para captura e uma preparação biotinilada do mesmo anticorpo policlonal para a detecção. Os resultados são resumidos na figura 75. Eles mostram um aumento surpreendente de meia-vida com o aumento do comprimento da sequência de XTEN. Por exemplo, uma meia- vida de 10 h foi determinada por GFP-XTEN_L288 (com 288 resíduos de aminoácidos no XTEN). Dobrar o comprimento do parceiro de fusão de polipeptídeo não estruturado para 576 aminoácidos aumentou a meia-vida de 20 a 22 h para vários construtos de proteína de fusão; ou seja, GFP-XTEN_L576, GFP-XTEN_AF576, GFP-XTEN_Y576. Um novo aumento do comprimento do parceiro de fusão de polipeptídeo não estruturado para 836 resíduos resultou em uma meia-vida de 72 a 75 h para XTEN_AD836-GFP. Assim, aumentar o comprimento do polímero por 288 resíduos de 288 para 576 resíduos aumentou a meia-vida in vivo por cerca de 10 h. No entanto, aumentar o comprimento do polipeptídeo por 260 resíduos de 576 resíduos para 836 resíduos aumentou a meia- vida por mais de 50 h. Esses resultados mostram que há um limite surpreendente do comprimento do polipeptídeo não estruturado que resulta em um ganho maior do que o proporcional na meia-vida in vivo. Assim, proteínas de fusão compreendendo polipeptídeos não estruturados, estendidos deverão ter a propriedade de farmacocinética intensificada em comparação com os polipeptídeos de comprimentos mais curtos.

Exemplo 34: Preparação de 1xDBCO, 3xLHRH-XTEN por conjugação

[520] Uma alíquota de 1xAmino,3xThiol-XTEN432 (XTEN_AE432(Am1,C12,C217,C422)) foi preparada como uma solução de 196 μM (7.7 mg/ml) em 20 mM de HEPES, pH 7.0, 50 mM de NaCl. A FIG. 88A mostra uma análise C18 RP-HPLC e ESI-MS da proteína. 2, 2'-dipiridil dissulfeto (DPD, Sigma, Cat. # D5767) foi dissolvido em dimetilformamida (DMF) para a concentração final de 100 mM. 4 ml de solução de 1xAmino, 3xThiol-XTEN432 foi misturada com 0,2 ml 1m de HEPES, pH 8.0 para ajustar o pH a ~7.5 e com solução de 78 μl de DPD (10 x excesso molar sobre proteínas). A mistura de reação foi incubada por 2 horas a 25° C e produtos da reação foram analisados por C18 RP-HPLC (FIG. 88B). DBCO-sulfo-NHS (Click Chemistry Tools, Inc., Cat # A124) foi dissolvida em DMF anidro para uma concentração final de 10 mM. 0,865 ml da solução de DBCO-sulfo-NHS foi adicionada à solução da proteína (11 x excesso molar sobre proteínas). A mistura de reação foi incubada por 2 horas a 25° C e produtos da reação foram analisados por C18 RP-HPLC (FIG. 88 C). Uma solução de 1M de etanolamina pH 8.0 foi adicionada a uma concentração final de 50 mM para extiguir o DBCO-sulfo-NHS não-reagido. A mistura de reação foi incubada por 2 horas a 25° C e em seguida durante a noite a 4° C. 500 mM de solução de Bond-Breaker™ TCEP (Thermo Scientific, Cat # 77720) foi adicionada a uma concentração final de 20 mM. A mistura de reação foi incubada por 1 horas a 25° C e produtos da reação foram analisados por C18 RP-HPLC (FIG. 88D). A mistura de reação foi diluída em 15mL com 0,01% de TFA e pH ajustado para ~ 3 usando solução de 10% de TFA. A solução da proteína foi carregada em uma coluna C4 RP-HPLC preparativa Vydac C4 250 x 22mm (Grace Davison Discovery Sciences, Cat. # 214TP1022). A proteína foi eluída com gradiente linear 5-50% de 1200 ml de acetonitrilo em 0,01% de TFA em taxa de fluxo de 15 ml/min. Frações que contêm 1xDBCO, 3xThiol-XTEN432 foram ajustados para pH ~ 7 com 1M de HEPES pH 8 e concentradas por evaporação a vácuo. Um peptídeo Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 modificado com ácido 3-maleimidopropiônico no grupo ε-amino de D-Lys (LHRH-Mal) foi sintetizado por CSBio co (Menlo Park, CA). O peptídeo dissolveu-se a uma concentração final de 25 mg/ml em DMF anidro e foi adicionado à solução 1xDBCO, 3xThiol-XTEN432 em 5x excesso molar sobre proteína. A mistura de reação foi incubada por 1 hora a 25° C e produtos da reação foram analisados por C18 RP-HPLC (FIG. 88E). A mistura de reação foi diluída em 15mL com 0,01% de TFA e pH ajustado para ~ 3 usando solução de 10% de TFA. A solução da proteína foi carregada em uma coluna C4 RP-HPLC preparativa Vydac C4 250 x 22mm. A proteína foi eluída com gradiente linear 5-50% de 1200 ml de acetonitrilo em 0,01% de TFA em taxa de fluxo de 15 ml/min. Frações que contêm 1xDBCO, 3xLHRH-XTEN432 foram ajustados para ~ pH 7 com 1M de HEPES pH 8 e concentrada em 2 ml por evaporação a vácuo para produzir o produto final.

Exemplo 35: Preparação de 1xAzide, 3xMMAE-XTEN por conjugação

[521] Uma alíquota da proteína de fusão 1xAmino,3xThiol- XTEN432 (XTEN_AE432(Am1,C12,C217,C422)) foi preparada como uma solução de 196 μM (7.7 mg/ml) em 20 mM de HEPES, pH 7.0, 50 mM de NaCl. A FIG. 89A mostra uma análise C18 RP- HPLC e ESI-MS da proteína. MA6-Val-Cit-PAB-MMAE (MMAE-Mal, síntese personalizada por Concortis Biosystems, Inc.) foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração final de 1 mg/ml. Um volume de 2,2 ml da solução de 1xAmino, 3xThiol-XTEN432 foi misturada com 2,5 ml de MMAE- Mal (3.5x excesso molar sobre proteínas). A mistura de reação foi incubada por 1 hora a 25° C e produtos da reação foram analisados por C18 RP-HPLC (FIG. 89B). O éster Azida- PEG4-NHS (Click Chemistry Tools, Inc., Cat. # A103) foi dissolvida em DMF anidro para uma concentração final de 500 mM. A mistura da reação (4,7 ml) foi misturada com 0,235 ml 1m de HEPES, pH 8.0 e com 9.75ul 500 mM de azida-PEG4-NHS (10 x excesso molar sobre proteínas). A mistura de reação foi incubada por 2 horas a 25° C e produtos da reação foram analisados por C18 RP-HPLC (FIG. 89 C). A mistura da conjugação foi diluída em 15mL com 0,01% de TFA e pH ajustado para ~ 3 usando 10% de TFA. A solução da proteína foi carregada em uma coluna C4 RP-HPLC preparativa Vydac C4 250 x 22mm (Grace Davison Discovery Sciences, Cat. # 214TP1022). A proteína foi eluída com gradiente linear 550% de 1200 ml de acetonitrilo em 0,01% de TFA em taxa de fluxo de 15 ml/min. Frações que contêm 1xAzide, 3xMMAE- XTEN432 foram ajustados para ~pH 7 com 1M de HEPES pH 8 e concentrada em 2 ml por evaporação a vácuo para produzir o produto final.

Exemplo 36: Preparação de 3xLHRH, 3xMMAE-XTEN por conjugação

[522] Uma alíquota da proteína de fusão 1xDBCO,3xLHRH- XTEN432 foi preparada como uma solução de 143 μM (6.26 mg/ml) em 20 mM de HEPES, pH 7.0. 1xAzida, 3xMMAE-XTEN432 foi preparado como uma solução de 135 μM (5,90 mg/ml) em 20 mM de HEPES, pH 7.0. Os reagentes de duas proteínas foram misturados em solução para produzir um excesso molar de 1.1 de 1xDBCO, 3xLHRH-XTEN432. A mistura de reação foi incubada durante a noite a 25° C. Conclusão da reação química de clique foi analisada por SDS-PAGE (FIG. 90A) e RP-HPLC (FIG. 90B). A mistura da conjugação foi diluída em 15mL com 0,01% de TFA e pH ajustado para ~ 3 usando 10% de TFA. A solução da proteína foi carregada em uma coluna C4 RP-HPLC preparativa Vydac C4 250 x 10 mm (Grace Davison Discovery Sciences, Cat. # 214TP510). A proteína foi eluída com 180 ml de gradiente linear 5-50% de acetonitrilo em 0,01% de TFA em taxa de fluxo de 2 ml/min. Frações que contêm 3xLHRH, 3xMMAE-XTEN foram ajustadas para ~pH 7 com 1M de HEPES pH 8 e concentradas por evaporação a vácuo para produzir o produto final.

Exemplo 37: Preparação de 1xLHRH, 3xMMAE-XTEN por conjugação

[523] Uma alíquota da proteína de fusão 1xAmino,3xThiol- XTEN_AE905 (XTEN_AE905(Am1,C8,C453,C898, Seg 1174) foi preparada como uma solução de 131 μM (10.9 mg/ml) em 20 mM de HEPES, pH 7.0, 50 mM de NaCl. A FIG. 91A mostra uma análise C18 RP-HPLC e ESI-MS da proteína. 2, 2'-dipiridil dissulfeto (DPD, Sigma, Cat. # D5767) foi dissolvido em dimetilformamida (DMF) para a concentração final de 100 mM. A solução de 1xAmino, 3xThiol-XTEN905 foi ajustada para pH ~7.5 com 1M de HEPES, pH 8.0 misturado com solução DPD (10 x excesso molar sobre proteínas). A mistura de reação foi incubada por 2 horas a 25° C e produtos da reação foram analisados por C18 RP-HPLC (FIG. 91B). DBCO-sulfo-NHS (Click Chemistry Tools, Inc., Cat # A124) foi dissolvida em DMF anidro para uma concentração final de 10 mM. A solução de DBCO-sulfo-NHS foi adicionada à solução da proteína (10 x excesso molar sobre proteínas). A mistura de reação foi incubada por 2 horas a 25° C e produtos da reação foram analisados por C18 RP-HPLC (FIG. 91). 1M de etanolamina pH 8.0 foi adicionada a uma concentração final de 50 mM para extiguir o DBCO-sulfo-NHS não-reagido. A mistura de reação foi incubada por 2 horas a 25° C e em seguida durante a noite a 4° C. 500 mM de solução de Bond-Breaker™ TCEP (Thermo Scientific, Cat # 77720) foi adicionada a uma concentração final de 20 mM. A mistura de reação foi incubada por 1 horas a 25° C e produtos da reação foram analisados por C18 RP-HPLC (FIG. 91D). A mistura de reação foi diluída em 15mL com 0,01% de TFA e pH ajustado para ~ 3 usando solução de 10% de TFA. A solução da proteína foi carregada em uma coluna C4 RP-HPLC preparativa Vydac C4 250 x 22mm (Grace Davison Discovery Sciences, Cat. # 214TP1022). A proteína foi eluída com gradiente linear 550% de 1200 ml de acetonitrilo em 0,01% de TFA em taxa de fluxo de 15 ml/min. Frações que contêm 1xDBCO, 3xThiol- XTEN905 foram ajustados para ~ pH7 com 1M de HEPES pH 8 e concentradas por evaporação a vácuo. MA6-Val-Cit-PAB-MMAE (MMAE-Mal, síntese personalizada por Concortis Biosystems, Inc.) foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração final de 1 mg/ml. a solução de 1xDBCO, 3xThiol-XTEN905 foi misturada com um 3.5 x excesso molar de MMAE-Mal. A mistura de reação foi incubada por 1 hora a 25° C e produtos da reação foram analisados por C18 RP-HPLC. Um peptídeo Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 foi modificado com ácido azido-hexanóico no grupo ε-amino de D- Lys (LHRH-Mal, síntese personalizada) por CSBio Co., Menlo Park, CA). O peptídeo dissolveu-se a uma concentração final de 25 mg/ml em DMF anidro e foi adicionado à solução 1xDBCO, 3xMMAE-XTEN905 em um 1.5-5x em excesso molar sobre proteína. A mistura de reação foi incubada a 25° C e produtos da reação foram analisados por C18 RP-HPLC. A mistura de reação final foi diluída em 15mL com 0,01% de TFA e pH ajustado para ~ 3 usando solução de 10% de TFA. A solução da proteína foi carregada em uma coluna C4 RP-HPLC preparativa Vydac C4 250 x 22mm. A proteína foi eluída com gradiente linear 5-50% de 1200 ml de acetonitrilo em 0,01% de TFA em taxa de fluxo de 15 ml/min. Frações que contêm 1xDBCO, 3xLHRH-XTEN432 foram ajustadas para ~pH 7 com 1M de HEPES pH 8 e concentradas por evaporação a vácuo para produzir o produto final.

Exemplo 38: Preparação de lxDBCO, 3xFolato(Y)-XTEN por conjugação

[524] Uma alíquota da proteína de fusão 1xAmino,3xThiol- XTEN432 (XTEN_AE432(Am1,C12,C217,C422) foi preparada como uma solução de 203 μM (8.0 mg/ml) em 20 mM de HEPES, pH 7.0, 50 mM de NaCl. A FIG. 107A mostra uma análise C18 RP- HPLC e ESI-MS da proteína. Folato-Y- aminopentil-maleimida (FA (Y)-Mal, síntese personalizada pelo CPC Scientific) foi dissolvido em dimetilformamida (DMF) a uma concentração final de 21 mg/ml (9,8 mM) . Um volume de 1.1 ml da solução de 1xAmino, 3xThiol-XTEN432 foi misturada com 0.08 ml de FA(y)-Mal (3.5 excesso molar sobre proteínas). A mistura de reação foi incubada por 2 horas a 25° C e produtos da reação foram analisados por C18 RP-HPLC (FIG. 107B). pH da mistura de reação foi ajustada com 0,06 ml de tampão de 1 M de HEPES pH 8.0. DBCO-sulfo-NHS (Click Chemistry Tools, Inc., Cat # A124) foi dissolvida em DMF anidro para uma concentração final de 50 mM. 0. 53 ml da solução de DBCO- sulfo-NHS foi adicionada à solução da proteína (11 x excesso molar sobre proteínas). A mistura de reação foi incubada por 2 horas a 25° C e produtos da reação foram analisados por C18 RP-HPLC (FIG. 107 C). Uma solução de 1M de etanolamina pH 8.0 foi adicionada a uma concentração final de 50 mM para extiguir o DBCO-sulfo-NHS não-reagido. A mistura de reação foi incubada por 2 horas a 25° C e em seguida durante a noite a 4° C. A mistura de reação foi diluída em 15mL com 0,01% de TFA e pH ajustado para ~ 3 usando solução de 10% de TFA. A solução da proteína foi carregada em uma coluna C4 RP-HPLC preparativa Vydac C4 250 x 10 mm (Grace Davison Discovery Sciences, Cat. # 214TP510). A proteína foi eluída com 180 ml de gradiente linear 5-50% de acetonitrilo em 0,01% de TFA em taxa de fluxo de 2 ml/min. Frações que contêm lxDBCO, 3XFA(Y)- XTEN432 foram ajustadas para ~pH 7 com 1M de HEPES pH 8 e foram concentradas por evaporação a vácuo para produzir o produto final.

[525] O conjugado 1xDBCO, 3xFolato ( α)-XTEN foi preparado essencialmente conforme descrito acima, utilizando folato- alfa-Maleimida (FA(α)-Mal, síntese personalizada pela CPC Scientific).

Exemplo 39: Preparação de 3XFA(Y), 3xMMAE-XTEN por conjugação

[526] Uma alíquota da proteína de fusão 1XDBC0,3XFA(Y)- XTEN432 foi preparada como uma solução de 191 μM (8.8 mg/ml) em 20 mM de HEPES, pH 7.0. 1xAzida, 3xMMAE-XTEN432 (preparada conforme descrito no Exemplo 32) foi preparada como uma solução de 242 μM (11.1 mg/ml) em 20 mM de HEPES, pH 7.0. Os reagentes de duas proteínas foram misturados em solução para produzir um excesso molar de 1.1 de 1xDBCO, 3XFA(Y)-XTEN432. A mistura de reação foi incubada durante a noite a 25° C. Conclusão da reação química de clique foi analisada por RP-HPLC (FIG. 108). A mistura da conjugação foi diluída em 15mL com 0,01% de TFA e pH ajustado para ~ 3 usando 10% de TFA. A solução da proteína foi carregada em uma coluna C4 RP-HPLC preparativa Vydac C4 250 x 10 mm (Grace Davison Discovery Sciences, Cat. # 214TP510). A proteína foi eluída com 180 ml de gradiente linear 5-50% de acetonitrilo em 0,01% de TFA em taxa de fluxo de 2 ml/min. Frações que contêm 3xFA(y), 3xMMAE-XTEN foram ajustadas para ~pH 7 com 1M de HEPES pH 8 e concentradas por evaporação a vácuo para produzir o produto final. O produto final foi analisado por cromatografia de exclusão (SEC- HPLC) (FIG. 109A), RP-HPLC (FIG. 109B) e ESI-MS (FIG. 109C).

[527] O conjugado 3xFA( α),3xMMAE-XTEN foi preparado essencialmente conforme descrito acima usando a reação de clique entre 1xDBCO, 3xFA(α)-XTEN432 e 1xAzida, 3xMMAE- XTEN432.

Exemplo 40: Comparação da viscosidade em soluções de XTEN ramificada versus linear

[528] A viscosidade de XTENs lineares e ramificadas (este último como configurações triméricas ou tetraméricas) pode ser medido usando vários tipos de Viscosímetros e reômetros. Por exemplo, um pode medir o tempo necessário para retirar 1 mL de líquido em uma seringa através de uma agulha 30G, conforme descrito por Miller, M. A., et al. (2010) Langmuir, 26:1067. Para comparar configurações de XTENs monomérico linear versus triméricas ou tetraméricas para a viscosidade, construtos tendo equivalente peso moleculares para o componente de ácido aminado XTEN são preparadas e então soluções são feitas em concentrações fixas, equivalentes, de proteína em 20, 50, 100 mg/ml cada. As soluções são então avaliadas usando o método de Miller. Usando o método, dados são obtidos com padrões conhecidos para preparar uma curva-padrão, e então as soluções XTEN são medidas. Espera-se que os resultados mostrem que a viscosidade de soluções equimolar de XTENs com semelhante peso molecular vão diminuindo significativamente com o aumento da ramificação; um conjugado de 3 braços de XTEN288 terá viscosidade significativamente menor em comparação com uma concentração igual de XTEN864 linear, mesmo que tenham um número equivalente de aminoácidos. Da mesma forma, espera-se que uma configuração com 4 braços de XTEN216 tenha ainda menos viscosidade do que um conjugado com 3 braços de XTEN288.

Exemplo 41: Preparação de Her2-XTEN-PTX por conjugação

[529] Uma alíquota da proteína de fusão 1xAmino,3xThiol- XTEN432 (XTEN_AE432(Am1,C12,C217,C422)) foi preparada como uma solução de 196 μM (7.7 mg/ml) em 20 mM de HEPES, pH 7.0, 50 mM de NaCl. Paclitaxel-Mal (PTX-Mal) é sintetizado personalizado por modificação de paclitaxel com anidrido succínico seguido pela conjugação de aminoetilmaleimida. PTX-Mal é dissolvido em dimetilformamida (DMF) e adicionado à proteína em um excesso molar de 3,5-5x. A mistura de reação foi incubada por 1-2 horas a 25° C e produtos da reação foram analisados por C18 RP-HPLC. Sulfo-SMCC (Thermo Scientific, Cat. #22122) é dissolvido em DMF anidro para uma concentração final de 50mm e adicionada à solução da proteína em um excesso molar sobre proteína de 10x. A mistura de reação foi incubada por 2 horas a 25° C e produtos da reação foram analisados por C18 RP-HPLC (FIG. 92). A mistura de reação final é diluída em 15mL com 0,01% de TFA e pH ajustado para ~ 3 usando solução de 10% de TFA. A solução da proteína foi carregada em uma coluna C4 RP- HPLC preparativa Vydac C4 250 x 22mm (Grace Davison Discovery Sciences, Cat. # 214TP1022). A proteína é eluída com gradiente linear 5-50% de 1200 ml de acetonitrilo em 0,01% de TFA em taxa de fluxo de 15 ml/min. Frações que contêm 1xMal, 3xPTX-XTEN432 foram ajustados para pH ~ 7 com 1M de HEPES pH 8 e concentradas por evaporação a vácuo. Anticorpo Herceptin (Trastuzumab, Roche) é reconstituído em água de acordo com as instruções e é permutado em tampão em PBS pH 7.2 contendo 5 mM de EDTA. DTT é adicionado à solução da proteína para uma concentração final de 1-10 mM e incubado durante 5 a 30 min a 37°C. DTT em excesso é removido por filtração em gel ou filtração em membrana de corte. 1xMal, 3xPTX-XTEN432 é adicionado ao anticorpo parcialmente reduzido em um excesso molar de x 3-4. A mistura de reação é incubada por 1 hora a 25° c e os produtos finais da reação são analisados por SDS-PAGE e a cromatografia de exclusão por tamanho sob condições sem- redução e com redução.

Exemplo 42: Preparação de iodoacetil-XTEN por conjugação

[530] Uma alíquota da proteína de fusão 1xAmino-XTEN869 (XTEN_AE869(Am1) foi preparada como uma solução de 164 μM (13.1 mg/ml) em 20 mM de HEPES, pH 7.0, 50 mM de NaCl. Um volume de 1/20 do 1M de HEPES pH 8 foi adicionado à solução da proteína para ajustar o pH da solução da proteína para ~ 7.5. Iodoacetato de N-succinimidil (SIA, Thermo Scientific. Cat. #22349) foi dissolvido em dimetilformamida (DMF) anidro para uma concentração final de 100 mm e foi adicionada em um excesso molar de 10x sobre proteína. A mistura de reação foi incubada por 1 hora a 25° C e produtos da reação foram analisados por C18 RP-HPLC (Fig. 93A). O SIA em excesso foi removido pela permutação de tampão usando o dispositivo ultra-centrífuga Vivaspin 500 (5,000 MWCO, VivaScience, Cat. # VS0112). Modificação do grupo amino de terminal N, pelo grupo de iodoacetil não alterou o tempo de retenção do XTEN modificado (FIG. 93A), portanto, a modificação covalente foi confirmada por ESI-MS (FIG. 93B). Além disso, o conjugado de IA-XTEN reagiu eficientemente com o peptídeo contendo cisteína HCKFWW (Bachem, Cat. # H-3524) (FIG93C).

Exemplo 43: Na triagem baseada em células in vitro da droga de XTEN-LHRH conjugado para a atividade e a especificidade

[531] Conjugados LHRH-XTEN-droga são avaliados para atividade e seletividade in vitro. Cada conjugado da droga de LHRH-XTEN, sua correspondente da molécula da droga de XTEN sem alvo e seu controle respectivo de droga livre são testados em um ensaio da anti-proliferação de CellTiter-Glo contra um painel de linhas da célula positivas e negativas do receptor de LHRH listados na Tabela 41. As condições apropriadas do ensaio, incluindo a densidade da célula e o tempo ideal da incubação é determinado usando a droga livre respectiva como o controle. Os conjugados da droga de LHRH- XTEN são testados da seguinte forma: as células na fase de registro são coletadas, contadas e colocadas em placas na densidade pré-determinada da célula em cada poço de uma placa do ensaio de microtitulação de 96 poços. As células aderentes são permitidas unir à placa por uma incubação durante a noite em 37oC, com uma atmosfera de 5% CO2. A droga de LHRH-XTEN conjugada e os controles correspondentes são introduzidos usando diluições de escala de dose apropriadas, em duplicata, e as placas são incubadas por uns 2 a 5 dias adicionais. Após o período apropriado da incubação, o reagente de CellTiter-Glo é adicionado a cada poço, misturado por 2 minutos em um agitador orbital. A placa então é centrifugada em 90 x g e incubada na temperatura ambiente por 10 minutos adicionais para estabilizar o sinal luminescente. Os sinais de luminescente são lidos então em um luminômetro e os valores de IC50 (meia concentração de inibitória máxima) são calculados com GraphPad Prism ou software equivalente. As comparações quantitativas dos valores de IC50 permitirão o ranking da atividade dos construtos para a inibição do crescimento e da seletividade celular contra o receptor de LHRH positivo versus as linhas da célula negativa. Espera-se que os resultados suportem as descobertas que os conjugados da droga de LHRH-XTEN apresentarão a morte altamente seletiva e potente das células positivas do receptor de LHRH, mas não em células do receptor de LHRH negativas. Isto estará no contraste à fração da droga livre por meio de que nenhuma discriminação na citotoxicidade forte é esperado entre linhas da célula positivas e negativas do receptor de LHRH. O controle da droga de XTEN é esperado para render a atividade citotóxica pobre. O conjugado da droga de LHRH- XTEN com a atividade favorável e a linhas celulares de seletividade relativa para controle será verificado posteriormente para a associação do receptor de LHRH pela adição do peptídeo do competidor livre de LHRH no ensaio, resultando em citotoxicidade danificada da droga de LHRH- XTEN, e verificando ainda a atividade seletiva dos construtos.Tabela 41: receptor LHRH de linhas de célula positivas e negativas ER: receptor do estrogênio; PR: receptores de progesterona.

Exemplo 44 Na triagem baseada em células in vitro da droga de Folato-XTEN conjugado para a atividade e a especificidade

[532] Os conjugados de drogas de folato-XTEN são primeiramente submetidas a uma triagem de atividade e seletividade in vitro. Cada conjugado da droga de Folato- XTEN, sua correspondente molécula da droga de XTEN sem direcionamento e controle respectivo da droga livre será testado em um ensaio da anti-proliferação da CellTiter-Glo de encontro a um painel de linhas da célula positivas e negativas do folato receptor listado na Tabela 42. Como meios de cultura contêm teor elevado de ácido fólico, as células serão crescidas e o ensaio realizado em meio livre de ácido fólico contendo soro de vitela fetal inativado pelo calor em 5-10% (FCS) a 37oC, em atmosfera de 5% de CO 2 (FCS innativado por calor contendo nível endógeno de ácido fólico suficiente para receptor de folato, expressando as células para sobreviver e proliferar). As condições apropriadas do ensaio são estabelecidas, incluindo a densidade da célula e o tempo ideal da incubação, usando meio livre de folato que contêm 5-10% de FCS usando a droga livre respectiva como o controle. Os conjugados da droga de Folato-XTEN são testados então como segue: as células na fase de registro são coletadas, contadas e colocadas em placas em uma densidade pré-determinada da célula em cada poço de uma placa de ensaio de microtitulação com 96 poços. As células aderentes são permitidas unir à placa por uma incubação de noite em 37oC, 5% CO2. A droga de Folato-XTEN conjugada e os controles correspondentes são introduzidos usando diluições de escala de dose apropriadas, em duplicata, e as placas são incubadas por uns 2 a 5 dias adicionais. Após o período apropriado da incubação, o reagente de CellTiter-Glo é adicionado a cada poço e é misturado por 2 minutos em um agitador orbital. A placa então é centrifugada em 90 x g e incubada na temperatura ambiente por 10 minutos adicionais para estabilizar o sinal luminescente. Os sinais de luminescente são lidos então em um luminômetro e os valores de IC50 (meia concentração de inibitória máxima) são calculados com GraphPad Prism ou software equivalente. As comparações quantitativas dos valores de IC50 permitirão o ranking da atividade dos construtos para a inibição do crescimento e da seletividade celular contra o receptor de folato positivo versus as linhas da célula negativa. Espera-se que os resultados suportem as descobertas de que os conjugados de droga de folato-XTEN apresentarão a morte potente altamente seletiva nas células positivas do receptor de folato, mas não em células do receptor de folato negativas. Isto estará em contraste à fração da droga livre em que nenhuma discriminação na citotoxicidade forte é esperada entre linhas da célula positivas e negativas do receptor de folato. O controle da droga de XTEN é esperado para render a atividade citotóxica pobre. O conjugado da droga de Folato-XTEN com a atividade favorável e a linhas celulares de seletividade relativa para controle será verificado posteriormente para a associação do receptor de folato pela adição do ácido fólico competidor livre no ensaio, demonstrando a citotoxicidade danificada da droga de folato-XTEN, e verificando ainda a atividade seletiva dos construtos.Tabela 42: receptor de folato de linhas de célula positivas e negativas

Exemplo 45: A estabilidade do soro in vitro do conjugado da droga de LHRH-XTEN

[533] Como uma medida da estabilidade, os conjugados da droga de LHRH-XTEN são incubados independentemente em no plasma humano normal, de macacos cynomolgus e de camundongo a 37oC por até 2 semanas com uma alíquota removida no intervalo periódico e armazenados a -80oC até a análise. A estabilidade do conjugado da droga de LHRH-XTEN pode ser avaliada pela quantidade de droga livre liberada ou da integridade do tempo excedente do conjugado da droga de LHRH-XTEN. A droga livre é quantificada com RP-HPLC e/ou LC-MS/MS visto que a quantidade de conjugado intacto da droga de LHRH-XTEN é determinada usando um teste ELISA para XTEN/droga e/ou de LHRH/droga.

[534] Para a análise RP-HPLC, as amostras de plasma são tratadas com solventes orgânicos tal como acetonitrilo ou acetona para precipitar proteínas. Frações solúveis são evaporadas sob vácuo, redissolvidas em soluções de carregamento e analisadas por RP-HPLC. Analitos são detectados pela absorção de UV em comprimentos de onda específicos para a droga em particular, em comparação com padrões conhecidos de droga. Por exemplo, a doxorrubicina é detectada em 480 nm. Para a análise LC-MS/MS, as amostras de plasma são tratadas com solventes orgânicos tal como acetonitrilo ou acetona para precipitar as proteínas. Frações solúveis são evaporadas sob vácuo, redissolvidas em soluções de carregamento e analisadas por RP-HPLC. Analitos são detectados e quantificados por espectrometria de massa tripla quadrupolo em tandem, em comparação com padrões conhecidos da droga. Pares de íons de íon-produto parentais serão determinados experimentalmente para cada droga. Para ELISA quantitativa, as concentrações ideais dos anticorpos para o conjugado da droga de LHRH-XTEN no ELISAs são determinadas usando a análise de série cruzada da diluição. Um anticorpo apropriado da captação que reconhece um componente do conjugado é revestido em uma placa de microtitulação de 96 poços por uma incubação durante a noite em 4oC. Os poços são bloqueados, lavados e as amostras de estabilidade do soro adicionadas aos poços, cada um em diferentes diluições para permitir a captura ideal do conjugado da droga de LHRH-XTEN ao anticorpo revestido. Após a lavagem, o anticorpo da detecção que reconhece um outro componente do conjugado é adicionado e permitido ligar ao conjugado capturado na placa. Os poços são lavados então outra vez e o peroxidase de rábano de estreptavidina (complementar para a versão da detecção do anticorpo biotinilado) ou um peroxidase secundária apropriada do anticorpo de rábano (complementar para a versão da detecção do anticorpo não biotinilado) são adicionados então. Depois que a incubação apropriada e uma etapa de lavagem final, o substrato do tetrametilbenzidina (TMB) é adicionado e a placa é lida em 450 nM. As concentrações do conjugado intato são calculadas então para cada vez que o ponto comparando a resposta colorimétrica a uma curva de calibração se preparou com a droga de LHRH- XTEN no tipo relevante do plasma. O t1/2 da decadência do conjugado no soro do ser humano, do cynomolgus e do camundongo é definido então usando a análise da regressão linear dos registros de concentrações versus tempo.

Exemplo 46: A estabilidade de soro in vitro do conjugado da droga de folato-XTEN

[535] Como uma medida da estabilidade, os conjugados da droga de folato-XTEN são incubados independentemente no plasma humano normal, de macacos cynomolgus e de camundongo a 37oC por até 2 semanas com uma alíquota removida em intervalo periódico e armazenadas a -80oC até a análise. A estabilidade do conjugado da droga de folato-XTEN pode ser avaliada pela quantidade de droga livre ou da integridade do conjugado da droga de folato-XTEN com o tempo. A droga livre é quantificada com HPLC e/ou LC-MS/MS visto que a quantidade de conjugado intacto da droga de folato-XTEN é determinada usando um ELISA para XTEN/droga e/ou de LHRH/droga.

[536] Para a análise RP-HPLC, as amostras de plasma são tratadas com solventes orgânicos tal como acetonitrilo ou acetona para precipitar proteínas. Frações solúveis são evaporadas sob vácuo, redissolvidas em soluções de carregamento e analisadas por RP-HPLC. Analitos são detectados pela absorção de UV em comprimentos de onda específicos para a droga em particular, em comparação com padrões conhecidos de droga. Por exemplo, a doxorrubicina é detectada em 480 nm. Para a análise LC-MS/MS, as amostras de plasma são tratadas com solventes orgânicos tal como acetonitrilo ou acetona para precipitar as proteínas. Frações solúveis serão evaporadas a vácuo, redissolvidas em soluções de carregamento e analisadas por RP-HPLC. Analitos serão detectados em linha e quantificados por espectrometria de massa em tandem quadrupolo triplo. Pares de íons de íon-produto parentais serão determinados experimentalmente para cada droga. Os padrões da calibração serão preparados adicionando quantidades conhecidas de droga livre ao tipo correspondente do plasma e serão tratados paralelamente com as amostras experimentais. Para o ELISA quantitativo, as concentrações ideais dos anticorpos para o conjugado da droga de folato-XTEN nos ELISAs são determinados usando a análise de série cruzada da diluição. Um anticorpo apropriado da captação que reconhece um componente do conjugado é revestido em uma placa de microtitulação de 96 poços por uma incubação durante a noite em 4oC. Os poços são bloqueados, lavados e as amostras de estabilidade do soro adicionadas aos poços, cada um em diferentes diluições para permitir a captura ideal do conjugado da droga de Folato-XTEN ao anticorpo revestido. Após a lavagem, o anticorpo da detecção que reconhece um outro componente do conjugado é adicionado e permitido ligar ao conjugado capturado na placa. Os poços são lavados então outra vez e o peroxidase de rábano de estreptavidina (complementar para a versão da detecção do anticorpo biotinilado) ou um peroxidase secundária apropriada do anticorpo de rábano (complementar para a versão da detecção do anticorpo não biotinilado) são adicionados então. Depois que a incubação apropriada e uma etapa de lavagem final, o substrato do tetrametilbenzidina (TMB) é adicionado e a placa é lida em 450 nM. As concentrações do conjugado intato são calculadas então para cada vez que o ponto comparando a resposta colorimétrica a uma curva de calibração se preparou com a droga de Folato- XTEN no tipo relevante do plasma. O t1/2 da decadência do conjugado no soro do ser humano, do cynomolgus e do camundongo é definido então usando a análise da regressão linear dos registros de concentrações versus tempo.

Exemplo 47: Imagem in vivo e ex vivo do conjugado de LHRH- XTEN-Cy5.5

[537] Um marcador fluorescente Cy5.5 de molécula LHRH-XTEN é utilizado como um substituto para investigar a eficácia do direcionamento e da bio-distribuição de conjugados das drogas de LHRH-XTEN. As experiências serão realizadas nos camundongos portadores dos xenoenxertos subcutâneos crescidos das células positivas do tumor do receptor de LHRH usando imagem fluorescência in vivo, seguido por ex vivo, com sistema ótico da imagem de IVIS 50 (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Em resumo, camundongos fêmeas nu/nu portadoras de células do tumor positivo do receptor de LHRH são administradas com uma única injeção intravenosa da dose elevada ou baixa de LHRH-XTEN-Cy5.5 e doses correspondentes do controle de XTEN marcado com Cy5.5 sem direcionamento. As varreduras do corpo inteiro são adquiridas pre-injeção e então em aproximadamente 8, 24, 48 e 72 horas de pós-injeção em animais anestesiados vivos usando o sistema ótico da imagem de IVIS 50. Após ter medido a distribuição de fluorescência no animal inteiro no ponto da última vez de 72h, o tumor e os órgãos saudáveis incluindo o fígado, o pulmão, o coração, o baço e os rins são extirpados e suas fluorescências registrados e processado pelo sistema da imagem. A excitação de Cy5.5 (615-665 nm) e os filtros da emissão (695-770 nm) são selecionados para combinar comprimentos de onda dos agentes de fluorescências. Armazenamento pequeno e médio do chip CCD é usado e o momento da exposição otimizado para obter, pelo menos, diversas mil contagens dos sinais observados em cada camundongo na imagem e de evitar a saturação do chip CCD. Para normalizar imagens para a quantificação, uma imagem de fluorescência do fundo é adquirida usando filtros da excitação e da emissão do fundo para a região espectral Cy5.5. A intensidade da fluorescência é expressa em cores diferentes com a cor azul refletindo a intensidade mais baixa e vermelho indicando a intensidade mais elevada, e as imagens resultantes são usadas para avaliar a absorção dos conjugados e controles.

Exemplo 48: Imagem in Vivo e ex vivo dos conjugados de folato-XTEN-Cy5.5

[538] A molécula de Folato-XTEN etiquetada fluorescente de A Cy5.5 é usada enquanto um substituto para investigar a eficiência da escolha dos objetivos e do bio-distribuição dos conjugados da droga de Folato-XTEN. As experiências serão realizadas nos camundongos portadores dos xenoenxertos subcutâneos crescidos das células positivas do tumor do receptor de folato usando in vivo, seguidos por ex vivo, imagem fluorescência com sistema ótico da imagem de IVIS 50 (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Uma vez que os meios de cultura contêm o índice de folato elevado, as células positivas do tumor do receptor de folato a ser transplantado nestes camundongos serão crescidas nos meios de cultura de folato livres das células que contêm o FCS de calor inativado 5-10% com nenhum antibiótico. Da mesma forma, dieta normal dos roedores contém uma elevada concentração de ácido fólico; camundongos usados neste estudo serão mantidos em dieta isenta de folato 2 semanas antes da implantação do tumor e para a duração da análise de imagem para reduzir a concentração do soro de folato.

[539] Em resumo, camundongos fêmeas de nu/nu que carregam o tumor positivo do receptor de folato as células são dadas uma única injeção intravenosa da dose elevada ou baixa de XTEN-Cy5.5 de folato e doses correspondentes do controle de XTEN etiquetado de Cy5.5 sem direcionamento. As varreduras do corpo inteiro são adquiridas pre-injeção e então em aproximadamente 8, 24, 48 e 72 horas de pós-injeção em animais anestesiados vivos usando o sistema ótico da imagem de IVIS 50. Após ter medido a distribuição de fluorescência no animal inteiro no ponto da última vez de 72h, o tumor e os órgãos saudáveis incluindo o fígado, o pulmão, o coração, o baço e os rins são extirpados e suas fluorescências registrados e processado pelo sistema da imagem. A excitação de Cy5.5 (615-665 nm) e os filtros da emissão (695-770 nm) são selecionados para combinar comprimentos de onda dos agentes de fluorescências. Armazenamento pequeno e médio do chip CCD é usado e o momento da exposição otimizado para obter, pelo menos, diversas mil contagens dos sinais que eram observados em cada camundongo na imagem e de evitar a saturação do chip CCD. Para normalizar imagens para a quantificação, uma imagem de fluorescência do fundo é adquirida usando filtros da excitação e da emissão do fundo para a região espectral Cy5.5. A intensidade da fluorescência é expressa em cores diferentes com a cor azul refletindo a intensidade mais baixa e vermelho indicando a intensidade mais elevada, e as imagens resultantes são usadas para avaliar a absorção dos conjugados e controles.

Exemplo 49: Análise Farmacocinética dos conjugados da droga de LHRH-XTEN

[540] A farmacocinética in vivo dos construtos da droga LHRH-XTEN é avaliada usando métodos padrão para composições de proteínas usando camundongos, ratos, macacos cynomolgus e cães. As composições de construtos da droga de LHRH-XTEN são fornecidas em um tampão aquoso compatível com administração in vivo (por exemplo: salina tamponada com fosfato, solução salina tamponada com Tris ou salina tamponada com Hepes). As composições são administradas em doses apropriadas e através das rotas múltiplas: o mais preferivelmente através das rotas intravenosa ou subcutâneas. As amostras do sangue são coletadas nos pontos apropriados do tempo que variam de 0,08 a 504 horas, e processadas no plasma. Amostras de plasma são analisadas para concentração de conjugados de drogas de LHRH-XTEN por um de uma variedade de métodos, incluindo ELISA, HPLC e/ou LC-MS/MS. As análises ELISA são executadas usando um formato ELISA sanduíche que pode reconhecer 2 componentes do conjugado de drogas LHRH-XTEN, por exemplo, XTEN/LHRH, fração de XTEN/droga, fração de LHRH/drogas ou combinações de XTEN/XTEN. Tipicamente o anticorpo que reconhece um componente do conjugado da droga de LHRH-XTEN é revestido em poços de uma placa de microtitulação de 96 poços. Os poços são obstruídos, lavado e as amostras do plasma são adicionadas aos poços em diluições variadas para permitir a captação do conjugado pelo anticorpo revestido. Os poços são lavados então extensivamente, e a proteína da ligação detectada usar um anticorpo biotinilado ou um anticorpo secundário adequado contra o segundo componente do conjugado da droga de LHRH-XTEN. Os poços são lavados então outra vez e a peroxidase de rábano de estreptavidina (complementar para a detecção do anticorpo biotinilado) ou uma peroxidase secundária do anticorpo de rábano (complementar para a detecção do anticorpo não biotinilado) são adicionados então. Depois da incubação apropriada e uma etapa de lavagem final, o substrato do tetrametilbenzidina (TMB) é adicionado e a placa é lida em 450 nM. As concentrações do conjugado são calculadas então para cada vez apontam comparando a resposta colorimétrica a uma curva de calibração da droga de LHRH-XTEN. Os parâmetros farmacocinéticos são calculados usando o pacote de software de WinNonLin.

[541] Para a análise RP-HPLC, as amostras de plasma são tratadas com solventes orgânicos tal como acetonitrilo ou acetona para precipitar proteínas. Frações solúveis são evaporadas a vácuo, redissolvidas em soluções de carregamento e analisadas por RP-HPLC. Analitos são detectados pela absorção UV no comprimento de onda específico para uma determinada droga. Por exemplo, a doxorrubicina é detectada em 480 nm. Padrões de calibração são preparados pela adição de quantidades conhecidas de droga livre para o tipo de plasma e são analisados em paralelo com amostras experimentais.

[542] Para a análise LC-MS/MS, as amostras de plasma são tratadas com solventes orgânicos tal como acetonitrilo ou acetona para precipitar as proteínas. Frações solúveis são evaporadas sob vácuo, redissolvidas em soluções de carregamento e analisadas por RP-HPLC. Analitos são detectados em linha e quantificados por espectrometria de massa em tandem quadrupolo triplo. Pares de íons de íon- produto parentais são determinados experimentalmente para cada droga. Padrões de calibração são preparados pela adição de quantidades conhecidas de droga livre para o tipo de plasma e são analisados em paralelo com amostras experimentais.

[543] Esperava-se que os resultados suportariam a constatação de que a adição de um XTEN ao LHRH e fração de droga aumentaria extremamente a meia-vida terminal e melhoraria as propriedades farmacocinéticas da fração alvo e da droga não ligada ao XTEN.

Exemplo 50: A análise farmacocinética do conjugado da droga de folato-XTEN

[544] A farmacocinética in vivo dos construtos da droga folato-XTEN são avaliados usando métodos padrão para composições de proteínas usando camundongos, ratos, macacos cynomolgus e cães. Enquanto a alimentação normal contém uma concentração elevada do ácido fólico (exemplo 6mg/kg camundongo purina), os animais a serem usados em estudos farmacocinéticos dos conjugados de folato serão mantidos na dieta de folato livre por 2 semanas antes da iniciação do estudo e para a duração do estudo. As composições são administradas em doses apropriadas e através das rotas múltiplas: o mais preferivelmente através das rotas intravenosas ou subcutâneas. As amostras do sangue são coletadas nos pontos apropriados do tempo que variam de 0.08 a 504 horas, e processadas no plasma. As amostras do plasma são analisadas então para a concentração de conjugados da droga de Folato-XTEN por uma de uma variedade dos métodos incluindo ELISA, HPLC e/ou LC-MS/MS.

[545] A análise de ELISA é executada usando um formato de ELISA do sanduíche que possa reconhecer 2 componentes do conjugado da droga de Folato-XTEN, por exemplo, XTEN/folato, XTEN/fração da droga, folato/fração da droga e/ou combinações de XTEN/XTEN. Tipicamente o anticorpo que reconhece um componente do conjugado da droga de Folato- XTEN é revestido em poços de uma placa de microtitulação de 96 poços. Os poços são obstruídos, lavado e as amostras do plasma são adicionadas aos poços em diluições variadas para permitir a captação do conjugado pelo anticorpo revestido. Os poços são lavados então extensivamente, e a proteína da ligação detectada usar um anticorpo biotinilado ou um anticorpo secundário adequado contra o segundo componente do conjugado da droga de folato-XTEN. Os poços são lavados então outra vez e a peroxidase de rábano de estreptavidina (complementar para a detecção do anticorpo biotinilado) ou uma peroxidase secundária do anticorpo de rábano (complementar para a detecção do anticorpo não biotinilado) são adicionados então. Depois da incubação apropriada e uma etapa de lavagem final, o substrato do tetrametilbenzidina (TMB) é adicionado e a placa é lida em 450 nM. As concentrações do conjugado são calculadas então para cada vez apontam comparando a resposta colorimétrica a uma curva de calibração da droga de Folato-XTEN. Os parâmetros farmacocinéticos são calculados usando o pacote de software de WinNonLin.

[546] Para a análise RP-HPLC, as amostras de plasma são tratadas com solventes orgânicos tal como acetonitrila ou acetona para precipitar proteínas. Frações solúveis são evaporadas a vácuo, redissolvidas em soluções de carregamento e analisadas por RP-HPLC. Analitos são detectados pela absorção UV no comprimento de onda específico para uma determinada droga. Por exemplo, a doxorrubicina é detectada em 480 nm. Padrões de calibração são preparados pela adição de quantidades conhecidas de droga livre para o tipo de plasma e são analisados em paralelo com amostras experimentais.

[547] Para a análise LC-MS/MS, as amostras de plasma são tratadas com solventes orgânicos tal como acetonitrila ou acetona para precipitar as proteínas. Frações solúveis são evaporadas sob vácuo, redissolvidas em soluções de carregamento e analisadas por RP-HPLC. Analitos são detectados em linha e quantificados por espectrometria de massa em tandem quadrupolo triplo. Pares de íons de íon- produto parentais são determinados experimentalmente para cada droga. Padrões de calibração são preparados pela adição de quantidades conhecidas de droga livre para o tipo de plasma e são analisados em paralelo com amostras experimentais.

[548] Esperava-se que os resultados suportariam a constatação de que a adição de um XTEN à fração de droga e folato aumentará extremamente a meia-vida terminal e melhorará as propriedades farmacocinéticas da fração alvo e da droga não ligada ao XTEN.

Exemplo 51: Análise de eficácia e toxicidade in vivo de conjugados de LHRH-XTEN-droga

[549] O conjugado de LHRH-XTEN-droga destina-se à distribuição direcionada da toxina altamente potente para as células tumorais positivas de receptor de LHRH. Como tal, a atividade farmacológica in vivo dos construtos de LHRH-XTEN-drogas pode ser avaliada usando células tumorais humanas expressando receptor de LHRH transplantadas em camundongos nus.

[550] Antes de iniciar o estudo de eficácia, a avaliação inicial em camundongos nus é realizada para estabelecer a dose máxima tolerada (MTD) dos candidatos de LHRH-XTEN- droga. A MTD, a dose mais elevada que é tolerada pelo animal durante o estudo, será usada para calcular a faixa de dose para o estudo de eficácia e toxicidade no modelo de xenoenxerto padrão. Brevemente, o experimento de MTD é realizado com 5 camundongos por grupo avaliando que a administração intravenosa de conjugados de LHRH-XTEN-droga em vários níveis, intervalos e duração da dose. A dose MTD inicial e o número de grupos de dose necessários são baseados na literatura científica, no conhecimento da fração de LHRH alvo, na natureza da fração da droga conjugada, nas propriedades toxicológicas dos compostos intimamente relacionados, e nos dados dos estudos de farmacocinética inicial (vide, acima). Os parâmetros de MTD padrão tais como redução do peso corporal, consumo de comida e água e sinais de piloereção, padrões de comportamento curvados, padrão respiratório, tremores, convulsões, prostração e automutilação são monitorados em uma base diária. A dose mais elevada de LHRH-XTEN-droga que não causa toxicidade inaceitável será atribuída como a MTD. O estudo de xenoenxerto de tumor incluirá 3 a 4 níveis de dosagens do conjugado de LHRH-XTEN-droga e dependerá dos resultados do estudo de MTD; com outros parâmetros dependendo da linhagem celular tumoral escolhida. A Tabela 42 fornece exemplos de linhagens de tumor que podem ser usadas no estudo de xenoenxerto. Assim, um número apropriado de células positivas de receptor de LHRH da linhagem de tumor humano relevante é injetado por via subcutânea e permitido formar tumores, o tamanho que será medido com pinças e o volume calculado como 0,5 x L x W2, onde L = medida do eixo mais longo em milímetros e W = medida do eixo perpendicular à L em milímetros. Após a randomização de camundongos contendo volume de tumor na faixa de tamanho desejada em grupos de 8 a 10 animais, controle do veículo, controle de droga livre e conjugado de LHRH-XTEN-droga é administrado por via intravenosa nas doses e intervalo escolhidos. A cessação ou regressão do crescimento do tumor é determinada medindo-se o tamanho do tumor e o volume em pontos de tempo selecionados com pinças. Os pesos corporais e consumo de alimentos são medidos a cada 1 a 2 dias para avaliar a toxicidade bruta. A sobrevivência dos animais é monitorada diariamente. No final do estudo, todos os animais são sacrificados e a patologia clínica e histopatologia nos principais órgãos são executadas.

[551] Previa-se que os resultados se apoiariam na constatação de que o conjugado de LHRH-XTEN-droga produzirá um índice terapêutico positivo como exibido pela eficácia potente e baixa toxicidade sistêmica. Em contraste, espera- se que a droga livre direcionada de não-LHRH doseada em doses equimolares seja menos potente mas mais altamente tóxica. Esperava-se que o controle do veículo exibiria crescimento tumoral descontrolado e toxicidade grave.

[552] Exemplo 52: Análise de eficácia e toxicidade in vivo de conjugados de folato-XTEN-droga

[553] Conjugados de folato-XTEN-droga destinam-se à entrega alvo do componente de toxina para células tumorais positivas de receptor de folato. A atividade farmacológica in vivo de folato-XTEN-droga é avaliada usando células tumorais humanas expressando xenoenxerto de receptor de folato em camundongos. Antes de iniciar o estudo de eficácia, a avaliação inicial em camundongos nus é realizada para estabelecer a dose máxima tolerada (MTD) dos candidatos de folato-XTEN-droga. A MTD, a dose mais elevada que é tolerada pelo animal durante o estudo, será usada para calcular a faixa de dose para o estudo de eficácia e toxicidade no modelo de xenoenxerto padrão. Como ração de roedor normal contém uma alta concentração de ácido fólico (ração de 6mg/kg), camundongos a serem usados nestes estudos são mantidos em uma dieta livre de folato por 2 semanas antes do início do estudo e para a duração do estudo. O experimento de MTD é realizado com 5 camundongos por grupo avaliando que a administração intravenosa de conjugados de folato-XTEN-droga em vários níveis, intervalos e duração da dose. A dose MTD inicial e o número de grupos de dose necessários são baseados na literatura científica, no conhecimento da fração de folato alvo, na natureza da fração da droga conjugada, nas propriedades toxicológicas dos compostos intimamente relacionados, e nos dados dos estudos de farmacocinética inicial (vide, Exemplo de PK acima). Os parâmetros de MTD padrão tais como redução do peso corporal, consumo de comida e água e sinais de piloereção, padrões de comportamento, curvados, padrão respiratório, tremores, convulsões, prostração e automutilação são cuidadosamente monitorados em uma base diária. A dose mais elevada de folato-XTEN-droga que não causa toxicidade inaceitável é atribuída como a MTD.

[554] O estudo de xenoenxerto de tumor inclui 3 a 4 níveis de dosagem do conjugado de folato-XTEN-droga, dependendo dos resultados do estudo de MTD, com outros parâmetros dependendo da linhagem celular tumoral escolhida. A Tabela 42 descreve exemplos de linhagens de tumor que podem ser usadas no estudo de xenoenxerto. Para reduzir o teor de folato, as células tumorais positivas de receptor de folato podem ser transplantadas em camundongos nus são crescidas em meios de cultura celular livre de folato contendo 5 a 10% de soro fetal de bezerro inativado por calor sem nenhum antibiótico. De forma similar, para reduzir a concentração de folato de soro, os camundongos usados nos estudos de enxerto são mantidos na dieta livre de folato 2 semanas antes da implantação do tumor e para a duração do estudo. Um número apropriado de células positivas de receptor de folato de linhagem relevante é injetado por via subcutânea e permitido formar tumores, o tamanho destes é medido com pinças e o volume calculado como 0,5 x L x W2, onde L = medida do eixo mais longo em milímetros e W = medida do eixo perpendicular à L em milímetros. Após a randomização de camundongos contendo volume de tumor na faixa de tamanho desejada em grupos de 8 a 10 animais, controle do veículo, controle de droga livre e folato-XTEN-droga é administrado por via intravenosa nas doses e intervalos escolhidos. A cessação ou regressão do crescimento de tumor é determinada através da medição do tamanho de tumor e o volume em pontos de tempo selecionados com pinças. O peso corporal e o consumo de alimentos são medidos a cada 1 a 2 dias para avaliar a toxicidade bruta. A sobrevivência dos animais é monitorada diariamente. No final do estudo, todos os animais são sacrificados e os principais órgãos serão removidos para exame de histopatologia e patologia clínica.

[555] Está previsto que o conjugado de folato-XTEN-droga quimioterápico alvo será mais eficaz e menos tóxico do que a droga citotóxica livre sozinha em tumores positivos de receptor de folato no modelo de camundongo.

Exemplo 53: Projetos de Ensaio Clínico Humano para Avaliar conjugados de LHRH-XTEN-droga

[556] A quimioterapia direcionada é uma abordagem moderna com o objetivo de aumentar a eficácia da quimioterapia sistêmica e reduzir os efeitos colaterais. LHRH é um peptídeo que funciona em órgãos reprodutivos. Como seus receptores são particularmente concentrados em determinados tumores, mas não são expressos em tecido normal, o receptor de LHRH é um alvo ideal para a destruição seletiva de tumores malignos. De fato, ~52% da mama, ~80% do ovário e endométrio, e ~85% dos espécimes de câncer de próstata são direcionáveis através do receptor de LHRH. Cumpre salientar que terapias dependentes de LHRH seriam especialmente úteis para tumores de mama negativos triplos, que não superexpressam receptores de estrogênio ou progesterona ou HER2 e são portanto não adequadas para o tratamento com muitas drogas direcionadas disponíveis. Pacientes com câncer endometrial, ovariano, ou da próstata avançado, muitas vezes, têm resultados particularmente pobres, assim como estas malignidades podem ser propensas à recorrência e/ou resistentes aos tratamentos atuais. A fusão de um XTEN transportando >1 de cópia de LHRH para um portador de XTEN > 3 moléculas da droga para criar um conjugado de peptídeo- droga alvo deverá ter índice terapêutico muito melhor e meia-vida que habilitará a dosagem em níveis abaixo de MTD, reduzirá a frequência de dosagem e custo (droga reduzida necessária por dose).

[557] A avaliação clínica de uma composição de LHRH-XTEN- droga é realizada em pacientes que sofrem de cânceres de mama, endometrial, ovariano, e próstata ou da bexiga avançados, com ensaios projetados para confirmar a eficácia e segurança do conjugado de LHRH-XTEN-droga em seres humanos. Tais estudos em pacientes compreenderiam três fases. Primeiramente, um estudo de farmacocinética e segurança de Fase I seria realizado para determinar a dose tolerada máxima (MTD) e para caracterizar a toxicidade limitante da dose, farmacocinética e farmacodinâmica preliminar em seres humanos. Estes estudos iniciais podem ser realizados em pacientes com cânceres metastáticos ou irressecáveis e para os quais medidas paliativas e curativas padrão não podiam ser usadas ou não eram mais eficazes ou toleradas, e o status positivo para o receptor de LHRH nos pacientes seria um critério de inscrição. O esquema do estudo de fase I usaria as únicas doses escaladas de conjugado de LHRH-XTEN-droga e mediria a bioquímica, PK e parâmetros clínicos, permitindo a determinação da MTD e as concentrações máximas e limites e na dosagem e na droga circulante que constituem a janela terapêutica a ser usada em ensaios de Fase II e Fase III subsequentes, bem como definindo as toxicidades potenciais e efeitos adversos a serem controlados nos estudos futuros.

[558] Estudos clínicos de Fase II de pacientes humanos seriam conduzidos independentemente em receptor de LHRH positivo avançado (estágio 3 ou 4) ou pacientes com câncer de mama, endometrial, ovariano, e de próstata ou bexiga recorrente. O ensaio gostaria de avaliar a eficácia e segurança do conjugado de LHRH-XTEN-droga sozinho e em combinação com a quimioterapia atual empregada na indicação específica. Pacientes receberão candidato clínico de LHRH- XTEN-droga administrado por via intravenosa em um nível de dose e regime predeterminado na fase I com ou sem o agente quimioterápico padrão. Um braço de controle que compreende o agente quimioterapêutico mais placebo seria incluído. O ponto de ajuste primário seria a taxa de resposta conforme definido pelos Critérios de Avaliação da Resposta em Tumores Sólidos (RECIST). Pontos de ajuste secundários incluem segurança e tolerabilidade, tempo-para-progressão e sobrevivência global.

[559] Um estudo de segurança e eficácia de fase III é conduzido em pacientes com câncer de mama, endometrial, ovariano, e próstata ou bexiga (resistente, recorrente) avançado positivos para receptor LHRH para testar a capacidade de atingir pontos de ajuste clínicos estatisticamente significativos tal como sobrevivência livre da progressão, conforme medido por RECIST. O ensaio será também estatisticamente alimentado pela sobrevivência global como um ponto de ajuste secundário com inscrição projetada superior a 400 pacientes. Resultados de eficácia são determinados usando métodos estatísticos padrão. Marcadores de toxicidade e evento adverso também devem ser seguidos no estudo para verificar se o composto é seguro quando usado da forma descrita.

Exemplo 54: Projetos de Ensaio Clínico Humano para Avaliar conjugados de folato-XTEN-droga

[560] A quimioterapia direcionada é uma abordagem moderna com o objetivo de aumentar a eficácia da quimioterapia sistêmica e reduzir seus efeitos colaterais. Folato, também conhecido como ácido fólico, vitamina B9, é um nutriente vital exigido por todas as células vivas para a biossíntese de nucleotídeo e função como cofator em determinados caminhos biológicos. O receptor de folato é um foco para o desenvolvimento de terapias para tratar rápidas malignidades divisórias; em especial o câncer de ovário e carcinoma de pulmão de células não-pequenas. Embora a expressão do receptor de folato seja insignificante no ovário normal, ~90% dos cânceres ovarianos epiteliais superexpressam o receptor de folato, como fazem muitos adenocarinomas do pulmão, assim, abrindo a possibilidade de terapias dirigidas. Espera-se que a fusão de um XTEN transportando >1 de cópia de folato para um portador de XTEN > 3 moléculas da droga para criar um conjugado de peptídeo-droga aumente o índice terapêutico e a meia-vida estendida que habilitará a dosagem em níveis abaixo da dose tolerada máxima (MTD), reduzirá a frequência de dosagem e o custo (droga reduzida necessária por dose).

[561] A avaliação clínica da composição de folato-XTEN- droga é realizada em pacientes com tumores avançados reincidentes ou refratários ou em pacientes que sofrem de câncer de ovário resistente à platina e carcinoma de pulmão de células não-pequenas que falharam usando outros agentes quimioterápicos. Ensaios clínicos são projetados para determinar a eficácia e as vantagens do conjugado de folato-XTEN-droga em terapias padrão em seres humanos. Tais estudos em pacientes compreenderiam três fases. Primeiramente, um estudo de farmacocinética e segurança de Fase I seria realizado para determinar a MTD e para caracterizar a toxicidade limitante da dose, farmacocinética e farmacodinâmica preliminar em seres humanos. Estes estudos iniciais poderiam ser realizados em pacientes com o status positivo para o receptor de folato que têm tumores avançados reincidentes ou têm tumores avançados refratários e para os quais medidas curativas ou paliativas padrão não podiam ser usadas ou eram não mais eficazes ou toleradas. O esquema do estudo de fase I usaria as únicas doses escaladas de conjugado de folato-XTEN-droga e mediria a bioquímica, PK e parâmetros clínicos para permitir a determinação da MTD e estabelecer as concentrações máximas e limites e na dosagem e na droga circulante que constituem a janela terapêutica para ser usada em ensaios de Fase II e Fase III subsequentes, bem como definindo as toxicidades potenciais e efeitos adversos a serem controlados nos estudos futuros.

[562] Estudos clínicos de fase II de pacientes humanos seriam conduzidos independentemente em pacientes com carcinoma de pulmão de células não-pequenas, de população de paciente de câncer ovariano resistente à platina positiva de receptor de folato tendo inúmeras quimioterapias falhas, e pacientes que sofrem de tumores avançados refratários ou reincidentes. Os ensaios gostariam de avaliar a eficácia e segurança do conjugado de folato- XTEN-droga sozinho e em combinação com a quimioterapia atual empregada na indicação específica. Pacientes receberão conjugado de folato-XTEN-droga administrado por via intravenosa em um nível de dose e regime determinado no estudo de fase I com ou sem o agente quimioterápico padrão. Um braço de controle que compreende o agente quimioterápico mais placebo seria incluído. O ponto de ajuste primário seria a taxa de resposta conforme definido pelos Critérios de Avaliação da Resposta em Tumores Sólidos (RECIST). Pontos de ajuste secundários incluem segurança e tolerabilidade, tempo-para-progressão e sobrevivência global.

[563] Um estudo de segurança e eficácia de fase III é realizado em pacientes com câncer de ovário resistentes à platina positivo para o receptor de folato, pacientes com carcinoma de pulmão de células não-pequenas, ou pacientes com câncer, pacientes com tumor avançado reincidente ou refratário para testar a capacidade de atingir estatisticamente pontos de ajuste clínicos significativos tal como sobrevivência livre de progressão, conforme medido por RECIST. O ensaio será também estatisticamente alimentado pela sobrevivência global como um ponto de ajuste secundário com inscrição projetada superior a 400 pacientes. Resultados de eficácia são determinados usando métodos estatísticos padrão. Marcadores de toxicidade e evento adverso também devem ser seguidos no estudo para verificar se o composto é seguro quando usado da forma descrita.

Exemplo 55: Estabilidade de soro de XTEN

[564] Uma proteína de fusão contendo XTEN_AE864 fundida no terminal N de GFP foi incubada no plasma de macaco e lisado renal de rato por até 7 dias a 37°C. Amostras foram retiradas em tempo 0, Dia 1 e Dia 7 e analisadas por SDS PAGE seguido pela detecção usando análise Western e detecção com anticorpos contra GFP conforme mostrado na FIG. 76. A sequência de XTEN_AE864 mostrou sinais insignificantes de degradação ao longo de 7 dias no plasma. No entanto, XTEN_AE864 foi rapidamente degradado no lisado renal do rato durante 3 dias. A estabilidade in vivo da proteína de fusão foi testada em amostras de plasma, em que o GFP_AE864 foi imunoprecipitado e analisado por SDS PAGE, conforme descrito acima. Amostras que foram retiradas até 7 dias após a injeção ter mostrado poucos sinais de degradação. Os resultados demonstram a resistência de aaT- XTEN à degradação devido a proteases do soro; um fator na intensificação de propriedades farmacocinéticas das proteínas de fusão de aaT-XTEN.

Exemplo 56: Caracterização da estrutura secundária de XTEN ligada à exendina-4

[565] O XTEN_AE864-Ex4 foi avaliado pelo grau de estrutura secundária por espectroscopia de dicroísmo circular. A espectroscopia de CD foi realizada em um espectropolarímetro de Jasco J-715 (Jasco Corporation, Tokyo, Japão) equipado com controlador de temperatura Jasco Peltier (TPC-348WI). A concentração da proteína foi ajustada para 0,2 mg/mL em 20 mM de fosfato de sódio pH 7,0, 50 mM de NaCl. Os experimentos foram realizados usando células de quartzo HELLMA com um comprimento de caminho óptico de 0,1 cm. Os espectros de CD foram adquiridos em 5°, 25°, 45°, e 65°C e processados usando o software Jasco versão J-700 1.08.01 (Build 1) para Windows. As amostras foram equilibradas a cada temperatura por 5 min antes de realizar medições de CD. Todos os espectros foram gravados em duplicata de 300 nm a 185 nm, usando uma largura de banda de 1 nm e uma constante de tempo de 2 segundos, a uma velocidade de varredura de 100 nm/min. O espectro de CD mostrado na FIG. 77 não mostra nenhuma evidência da estrutura secundária estável e é consistente com um polipeptídeo não estruturado.

Exemplo 57: Aumentar a solubilidade e estabilidade de uma carga útil de peptídeo ligando-se ao XTEN

[566] Para avaliar a capacidade do XTEN de melhorar as propriedades físico-químicas de solubilidade e estabilidade, as proteínas de fusão do glucagon mais XTEN de comprimento mais curto foram preparadas e avaliadas. Os artigos do teste foram preparados em solução salina tamponada com Tris em pH neutro e a caracterização da solução de Gcg-XTEN foi por HPLC de fase reversa e cromatografia de exclusão de tamanho para afirmar se a proteína ficou homogênea e não agregada na solução. Os dados são apresentados na Tabela 43. Para fins de comparação, o limite de solubilidade de glucagon não modificado no mesmo tampão foi medido a 60 μM (0,2 mg/mL), e o resultado demonstra que para todos os comprimentos de XTEN adicionados, um aumento substancial de solubilidade foi alcançado. De forma importante, na maioria dos casos as proteínas de fusão de glucagon-XTEN foram preparadas para atingir concentrações alvo e não foram avaliadas para determinar os limites de solubilidade máxima para determinado construto. No entanto, no caso de glucagon ligado ao XTEN AF-144, o limite de solubilidade foi determinado, com o resultado de que um aumento de 60 vezes de solubilidade foi alcançado, em comparação com o glucagon não ligado ao XTEN. Além disso, o glucagon-AF144 foi avaliado pela estabilidade, e foi considerado ser estável em formulação líquida por pelo menos 6 meses sob condições refrigeradas e por aproximadamente um mês a 37°C (dados não mostrados).

[567] Os dados sustentam a conclusão de que a ligação de polipeptídeos de XTEN de comprimento curto a uma proteína biologicamente ativa, tal como glucagon, pode aumentar significativamente as propriedades de solubilidade da proteína pela proteína de fusão resultante, bem como conferir estabilidade nas concentrações de proteína mais altas.Tabela 43: Solubilidade de construtos de Glucagon-XTEN

Exemplo 58: Cromatografia de exclusão de tamanho analítica do XTEN ligado com diversas cargas úteis

[568] Análises de cromatografia de exclusão de tamanho foram realizadas em proteínas de fusão contendo várias proteínas terapêuticas e proteínas recombinantes não- estruturadas de comprimento crescente. Um ensaio exemplar usou uma coluna TSKGel-G4000 SWXL (7,8 mm x 30 cm) em que 40μg de proteína de fusão de glucagon purificada em uma concentração de 1 mg/ml foram separados em uma taxa de fluxo de 0,6 ml/min em 20 mM de fosfato pH 6,8, 114 mM de NaCl. Perfis de cromatograma foram monitorados usando OD214nm e OD280nm. A calibração da coluna para todos os ensaios é realizada usando um padrão de calibração de exclusão do tamanho a partir de BioRad; os marcadores incluem tiroglobulina (670 kDa), gama-globulina bovina (158 kDa), ovalbumina de frango (44 kDa), mioglobuina equina (17 kDa) e vitamina B12 (1,35 kDa). Perfis cromatográficos representativos de Glucagon-Y288, Glucagon-Y144, Glucagon- Y72, Glucagon-36 são mostrados como uma sobreposição na FIG. 78. Os dados mostram que o peso molecular de cada composto é proporcional ao comprimento da sequência de XTEN anexada. No entanto, os dados também mostram que o peso molecular aparente de cada construto é significativamente maior do que o esperado para uma proteína globular (conforme mostrado em comparação às proteínas padrão executadas no mesmo ensaio). Com base em análises de SEC para todos os construtos avaliados, os pesos moleculares aparentes, o fator de peso molecular aparente (expresso como a razão de peso molecular aparente para o peso molecular calculado) e o raio hidrodinâmico (RH em nm) são mostrados na Tabela 44. Os resultados indicam que a incorporação de diferentes XTENs de 576 aminoácidos ou mais confere um peso molecular aparente da proteína de fusão de aproximadamente 339 kDa a 760, e que o XTEN de 864 aminoácidos ou mais confere um peso molecular aparente maior do que aproximadamente 800 kDA. Os resultados dos aumentos proporcionais do peso molecular aparente para o peso molecular real foram consistentes para proteínas de fusão criadas com XTEN de várias famílias de motivo diferentes; ou seja, AD, AE, AF, AG, e AM, com aumentos de pelo menos quatro vezes e razões tão altas quanto cerca de 17 vezes. Além disso, a incorporação de parceiros de fusão de XTEN com 576 aminoácidos ou mais em proteínas de fusão com as várias cargas (e 288 resíduos no caso de glucagon fundido com Y288) resultou em um raio hidrodinâmico de 7 nm ou maior, bem além do tamanho de poro glomerular de aproximadamente 3 a 5 nm. Nesse sentido, espera-se que as proteínas de fusão compreendendo crescimento e XTEN tenham reduzido depuração renal, contribuindo para meia-vida terminal aumentada e melhorar o efeito terapêutico ou biológico em relação a uma proteína de carga biológica não- fundida correspondente.Tabela 44: Análise de SEC de vários polipeptídios * excluindo glicosilação

Exemplo 59: Análise de sequências para estrutura secundária por algoritmos de previsão

[569] Sequências de aminoácidos podem ser avaliadas para estrutura secundária através de determinados programas de computador ou algoritmos, como o conhecido algoritmo de (Chou, P. Y., et al. (1974) Biochemistry, 13: 222-45) e o método Garnier-Osguthorpe-Robson, e "GOR" (Garnier J, GibratJF, Robson B. (1996). O método GOR para prever a estrutura secundária das proteínas de sequência de aminoácidos. Métodos Enzymol 266:540-553). Para uma determinada sequência, os algoritmos podem prever se existem algumas ou nenhuma estrutura secundária, expresso como total e/ou a percentagem de resíduos da sequência que forma, por exemplo, alfa-hélices ou beta-folhas ou a percentagem de resíduos da sequência previu a resultar na formação de bobina aleatória.

[570] Várias sequências representativas de "famílias" de XTEN foram avaliadas usando duas ferramentas de algoritmo para o Chou-Fasman e GOR métodos para avaliar o grau de estrutura secundária nestas sequências. A ferramenta Chou- Fasman foi fornecida pela William R. Pearson e a Universidade da Virgínia, no site da internet "Biosupport", URL localizado na internet em.fasta. bioch.virginia. edu/fasta_www2/fasta_www. cgi?rm=misc1 , tal como existia em 19 de junho de 2009. A ferramenta GOR foi fornecida pelo site da Internet Pole Informatique Lyonnais at the Network Protein Sequence Analysis, URL localizado na internet em .npsa-pbil.ibcp.fr/cgi- bin/secpred_gor4. pl, tal como existia em 19 de junho de 2008.

[571] Como uma primeira etapa na análise, uma única sequência XTEN foi analisada pelos dois algoritmos. A composição de AE864 é um XTEN com 864 resíduos de aminoácidos, criados a partir de várias cópias de quatro 12 motivos de sequência de aminoácido consistindo dos aminoácidos G, S, T, E, P e A. Os motivos de sequência são caracterizados pelo fato de que há repetitividade limitada dentro os motivos e a sequência geral em que a sequência de quaisquer dois aminoácidos consecutivos não se repita mais que duas vezes em qualquer motivo um 12 aminoácido, e que não há três aminoácidos contíguos de longa-metragem o XTEN são idênticos. Sucessivamente mais partes da sequência do terminal N de 864 AF foram analisados pelo Chou-Fasman e algoritmos GOR (este último requer um comprimento mínimo de 17 aminoácidos). As sequências foram analisadas ao entrar as sequências de formato FASTA nas ferramentas de previsão e execução da análise. Os resultados das análises são apresentados na Tabela 45.

[572] Os resultados indicam que, pelos cálculos do Chou- Fasman, XTEN curto das famílias AE e AG, até pelo menos 288 resíduos de aminoácidos, não têm nenhuma alfa-hélices ou folhas beta, mas quantidades de percentagem prevista da bobina aleatória pelo algoritmo GOR variam de 78 a 99%. Com o aumento de comprimentos XTEN de 504 resíduos para mais de 1300, o XTEN analisado pelo algoritmo Chou-Fasman previra percentagens de alfa-hélices ou beta folhas de 0 a 2%, enquanto as percentagens calculadas de enrolamento aleatória aumentaram para de 94-99%. Esses XTEN com hélices-alfa ou beta, folhas foram essas sequências com uma ou mais instâncias de três resíduos de serina contíguo, que resultou na formação de folha-beta prevista. No entanto, mesmo estas sequências ainda tinham aproximadamente 99% de formação de enrolamento aleatório.

[573] A análise apoia a conclusão de que: 1) XTEN criado a partir de vários motivos de sequência de G, S, T, E, P e A que têm limitado a repetitividade de aminoácidos contíguos estão previstos para ter quantidades muito baixas de alfa- hélices e folhas beta; 2) que cada vez mais o comprimento da XTEN não sensivelmente aumenta a probabilidade de formação de alfa-hélice ou folha-beta; e 3) que progressivamente aumentar o comprimento da sequência XTEN pela adição de 12-mers não repetitivas, consistindo de aminoácidos G, S, T, E, P e um resulta em aumento percentual de formação da bobina aleatória. Com base em numerosas sequências avaliadas por esses métodos, conclui- se que XTEN criado a partir de motivos de sequência de G, S, T, E, P e A que têm limitado a repetitividade (definida como não mais que dois idênticos contíguos aminoácidos em qualquer um motivo) espera-se que tem a estrutura secundária muito limitada. Com exceção de motivos contendo três serinas contíguas, geralmente qualquer ordem ou combinação de motivos de sequência da tabela 1 pode ser usada para criar um polipeptídio XTEN que resultará em uma sequência XTEN substancialmente é desprovido de estrutura secundária, e que os efeitos de três serinas contíguas é amenizada por aumentar o comprimento da XTEN. Tais sequências deverão ter as características descritas as modalidades de composição XTEN-contendo da invenção divulgadas neste documento.Tabela 45:Cálculos de predição de CHOU-FASMAN e GOR de sequências de polipeptídio * H: alfa-hélice E: beta-folha

Exemplo 60: Análise de sequências de polipeptídio de repetitividade

[574] Sequências de aminoácidos do polipeptídio podem ser avaliadas por repetitividade ao quantificar o número de vezes que uma subsequência menor aparece dentro do polipeptídio geral. Por exemplo, um polipeptídio de 200 resíduos de aminoácidos tem 192 sobrepostas subsequências de aminoácido-9 (ou 9-mer "quadros"), mas o número de subsequências exclusivo 9-mer dependerá da quantidade de repetitividade dentro da sequência. Na presente análise, sequências diferentes foram avaliadas para repetitividade, somando-se a ocorrência de todas as subsequências de 3-mer exclusivo para cada quadro de ácido 3-amino do outro lado os primeiros 200 aminoácidos da porção de polímero, dividido pelo número absoluto de subsequências 3-mer exclusivo dentro da sequência de 200 aminoácidos. A pontuação de subsequência resultante é um reflexo do grau de repetitividade dentro o polipeptídio.

[575] Os resultados, mostrados na tabela 46, indicam que os polipeptídios não estruturados consiste de 2 ou 3 tipos de aminoácidos têm pontuações de subsequência alta, enquanto aqueles consistindo em 12 motivos de aminoácidos dos seis aminoácidos G, S, T, E, P e A, com um baixo grau de repetitividade interna, têm pontuações de subsequência de menos de 10 e em alguns casos, menos de 5. Por exemplo, a sequência de L288 tem dois tipos de aminoácidos e tem sequências curtas e altamente repetitivas, resultando em uma pontuação de subsequência de 50,0. O polipeptídio J288 tem três tipos de aminoácidos, mas também tem sequências curtas e repetitivas, resultando em uma pontuação de subsequência de 33,3. Y576 também tem três tipos de aminoácidos, mas não é feita de repetições internas, refletidas na partitura de 15,7 subsequência durante os primeiros 200 aminoácidos. W576 consiste de quatro tipos de aminoácidos, mas tem um maior grau de repetitividade interna, por exemplo, "GGSG", resultando em uma pontuação de subsequência de 23.4. O AD576 é composto por quatro tipos de 12 motivos de aminoácidos, cada um composto por quatro tipos de aminoácidos. Por causa do baixo grau de repetitividade interna dos temas individuais, a pontuação de subsequência geral sobre os primeiros 200 aminoácidos é 13,6. Em contraste, o XTEN é constituído por quatro motivos contém seis tipos de aminoácidos, cada um com um baixo grau de repetitividade interna tem menor pontuação de subsequência; ou seja, AE864 (6.1), AF864 (7,5) e AM875 (4,5).

[576] Conclusões: Os resultados indicam que a combinação de 12 motivos de aminoácidos de subsequência, cada um composto por quatro a seis tipos de aminoácidos que são essencialmente não-repetitivos, em um XTEN mais longo resultados polipeptídicos em uma sequência global que não é repetitiva. Isto é apesar do fato de que cada motivo de subsequência pode ser utilizado várias vezes em toda a sequência. Em contraste, polímeros criados de um menor número de tipos de aminoácido resultaram em escores de subsequência, embora a sequência real pode ser adaptada para reduzir o grau de repetitividade para resultar em menor pontuação de subsequência.Tabela 46: Cálculos de Pontuação de Subsequência de Sequências de Polipeptídio

Exemplo 61: Cálculo de pontuações de TEPITOPE

[577] Pontuações de TEPITOPE de 9mer sequência peptídica pode ser calculada adicionando potenciais de pacote, como descrito por Sturniolo [Sturniolo, T., et al. (1999) Nat Biotechnol, 555:17]. No presente exemplo, pontuações Tepitope separadas foram calculadas para cada alelo individual HLA. A Tabela 47 mostra como exemplo os potenciais de bolso para HLA * 0101B, que ocorre em alta frequência na população caucasiana. Para calcular a pontuação de TEPITOPE de um peptídeo com sequência P1-P2- P3-P4-P5-P6-P7-P8-P9, acrescentaram-se os potenciais individuais de bolso correspondente na tabela 47. O HLA * 0101B Pontuação de um peptídeo 9mer com a sequência de FDKLPRTSG é a soma de 0, 1,3, 0, 0,9, 0, 1,8, 0,09, 0, 0.

[578] Para avaliar as pontuações de TEPITOPE para peptídeos longos um pode repetir o processo para todas as subsequências 9mer das sequências. Este processo pode ser repetido para as proteínas codificadas por outros alelos HLA. As Tabelas 48-51 dão potenciais de pacote para os produtos de proteína de alelos HLA que ocorrem com alta frequência na população caucasiana.

[579] As pontuações de TEPITOPE calculadas por este método no intervalo de aproximadamente -10 a +10. No entanto, peptídeos 9mer que faltam um aminoácido hidrofóbico (FKLMVWY) em posição P1 calcularam pontuações TEPITOPE no intervalo de-1009 para-989. Esse valor é biologicamente insignificante e reflete o fato de que um aminoácido hidrofóbico serve como um resíduo de âncora para vinculação de HLA e peptídeos faltando um resíduo hidrofóbico em P1 são considerados não ligantes de HLA. Porque a maioria das sequências XTEN faltam resíduos hidrofóbicos, todas as combinações de subsequências 9mer terá TEPITOPEs no intervalo no intervalo de-1009 para-989. Esse método confirma que os polipeptídios XTEN podem ter poucos ou nenhum previstos epítopo de célula T.Tabela 47: Potencial de pacote para HLA * 0101B alelo. Tabela 48: Potencial de pacote para HLA*0301B alelo. Tabela 49: Potencial de pacote para HLA*0401B alelo. Tabela 50: Potencial de pacote para HLA*0701B alelo. Tabela 51: Potencial de pacote para HLA*1501B alelo.

Exemplo 62: GPCR Ca2 + Ensaio da atividade de mobilização

[580] Recombinante GLP2-2G-XTEN foi preparado como descrito em, Alters, S. et al. (2012) GLP2-2G-XTEN:uma proteína farmacêutica, com meia-vida no soro e uma melhor eficácia no modelo da doença de Crohn do rato. PLoS One; 7(11): e50630. O conjugado GLP2-2G-XTEN foi preparado como descrito no Exemplo 26 (Fig. 68) e purificado por preparativo RP-HPLC (Fig. 70). Um GPCR Ca2 + ensaio da atividade de mobilização de fluxo foi realizado usando uma EMD Millipore ChemiSCREEN humana recombinante GLP-2 glucagon receptor de cálcio da família optimizados linha celular estável, usada de acordo com as instruções do fabricante, com resultados apresentados na Fig. 110. O recombinante e conjugado GLP2-2G-XTEN cujo perfil foram criados como uma curva de resposta de dose de oito pontos, triplo serial diluição. Curvas de resposta à dose foram instaladas usando um enredo 4PL trama de regressão com a respectiva RFU eixo Y, com dados expressados como uma porcentagem da RFU em função da concentração no eixo dos X. Tanto recombinante GLP2-2G-XTEN e conjugado GLP2-2G-XTEN exibiram atividade agonista dependente da dose, com valores de potência preditos EC50 de 423 nM e 529 nM, respectivamente.

Exemplo 63: Ensaio de estabilidade no plasma in vitro de conjugado GLP2-2G-XTEN

[581] Concentrações iguais de recombinante GLP2-2G-XTEN e conjugado GLP2-2G-XTEN foram independentemente cravadas em respectivo rato, macacos cynomolgus e plasma humano. As amostras foram incubadas a 37oC por até 10 dias com uma alíquota removidas no intervalo de tempo adequado e armazenados a-80óC até análise. A estabilidade do plasma do conjugado GLP2-2G-XTEN em várias espécies foi comparada com o que de GLP2-2G-XTEN recombinante em um anti-XTEN/GLP2 ELISA realizado nas matrizes respectivas de plasma. O teste ELISA anti-XTEN/GLP2 composta do anticorpo anti-XTEN rato como um anticorpo de captura e um GLP2 biotinilado anti- humano como um anticorpo da detecção. Como mostrado na Fig. 111, a estabilidade in vitro no plasma humano de conjugado GLP2-2G-XTEN é comparável de recombinante GLP2-2G-XTEN tendo uma meia-vida de estabilidade calculado de > 240 h. Estabilidade in vitro semelhante observou-se também com as duas proteínas GLP2-2G-XTEN no rato e plasma de macacos cynomolgus (dados não mostrados).

Exemplo 64: Farmacocinética de conjugado GLP2-2G-XTEN em ratos

[582] Ratos de estirpe femininos SD (200-220 g) foram aleatoriamente em grupos de 3 animais cada. GLP-2G-XTEN recombinante e conjugado GLP2-2G-XTEN foram administrados por via subcutânea em 2 mg/kg em cada animal. Foram colhidas amostras de sangue (0,2 ml) em tubos microtainer heparinizado pré-refrigerado na pré-dose, 0,08, 4, 8, 24,48, 72, 96, 120 e 168 horas após a administração de composto de teste. O sangue foi então processado para o plasma e armazenado imediatamente a-80°C até análise. As amostras de plasma foram analisadas utilizando um anti-XTEN / GLP2 de ELISA que utiliza o anticorpo de rato anti-XTEN como um anticorpo de captura e um anticorpo anti-GLP2 humano biotinilado como anticorpo de detecção. O ELISA foi realizado utilizando recombinante relevante GLP2-2G-XTEN ou conjugado GLP2-2G-XTEN como os respectivos padrões de calibração de ELISA (Fig. 112). A meia-vida calculada de recombinante GLP2-2G-XTEN (36 (± 7) h) e de conjugado GLP2- 2G-XTEN (37 (± 7) h) foi descoberto como sendo semelhante.

Exemplo 65: Conjugado trimérico XTEN ligado através de cisteínas terminal C

[583] Um conjugado trimérico XTEN foi preparado pelo procedimento a seguir. Uma alíquota de proteína XTEN ,1xAmino, 1xThiol-XTEN432 (XTEN_AE432(Am1,C422)), com um resíduo de cisteína interno, foi preparado como uma solução de 587 μM (23,23 mg/ml) em 20 mM HEPES, pH 7.0, 50 mM de NaCl. -Tris [2-maleimidoeti l] amina (TMEA, Thermo Scientific, gato # 33043) foi dissolvida em DMF anidro para uma concentração final 10 mM. TMEA foi adicionada à solução da proteína de ligação ao grupo tiol do XTEN (5 x molar excesso de proteína sobre o vinculador). A mistura de reação foi incubada por 2 horas a 25° c e os produtos da reação foram analisados por HPLC-SEC (Phenomenex BioSep- SEC-s4000 600 x 7,80 mm, tampão: 50mm de sódio fosfato pH 6,5, 300 mM de NaCl, fluxo taxa 0,5 ml/min, eluição isocrática por 70 min). XTEN_432 linear, XTEN_864 e XTEN_1296 (tendo 432, 864 e 1296 aminoácidos, respectivamente) foram analisados sob as mesmas condições para identificar os produtos de reação (Fig. 113). O pico 1 eluiu a 28 min, ao mesmo tempo que XTEN_1296 e foi identificado como um trímerico de XTEN_432. O pico 2 eluiu a 30.5 min ao mesmo tempo que XTEN_864 e foi identificado como um dímero de XTEN_432. Pico 3 eluída em 35 min, ao mesmo tempo que XTEN_432 e foi identificado como precursor do XTEN_432. Os rendimentos de conjugado trimérico XTEN e conjugado XTEN Dimérico foram 19% e 36%, respectivamente. Essencialmente os tempos de retenção idêntico para o 3xXTEN_432 conjugado trimérico e a molécula linear XTEN_1296 sugerem que o aparente peso molecular e raio hidrodinâmico de uma proteína XTEN não é dependente de sua configuração geométrica.

Exemplo 66: Conjugados XTEN triméricos ligados através de grupos α-amino terminais

[584] Um conjugado XTEN trimérico foi preparado pelo procedimento seguinte.

1. Síntese de 1xDBCO-XTEN288

[585] Uma alíquota da proteína 1xAmino-XTEN288 (XTEN_AE288(Am1)) foi preparada como uma solução de 758 μM (20 mg/ml) em 20 mM HEPES, pH 7.0, 50 mM de NaCl. 2 ml de proteína foi misturado com o de 0,1 ml 1m HEPES pH 8.0 e 0,152 ml de 50mm DBCO-Sulfo-NHS (Click Chemistry Tools, cat. # A124) dissolvido em DMF anidro para vincular o grupo DBCO ao grupo amino terminal N do XTEN. A mistura de reação foi incubada por 2 horas a 25° c e analisada por RP-HPLC analítica (Fig. 114A). A mistura de reação foi diluída para 15 mL com 0,01% TFA e pH ajustada para ~ 3 usando solução de 10% TFA. A solução da proteína foi dividida em duas partes iguais e cada fração foi carregada em uma coluna de C4 RP-HPLC preparativa Vydac C4 250 x 10mm (Grace Davison Discovery Sciences, cat. #214TP510). A proteína foi eluída com um gradiente linear 5-50% de 180 ml de acetonitrila em 0,01% TFA em taxa de fluxo de 2 ml/min. Frações que contêm 1xDBCO-XTEN288 foram ajustadas para pH ~ 7 com pH HEPES 1 M 8 e concentraram-se por evaporação a vácuo.

2. Síntese de 3xAzide-PEG4-TAEA

[586] Tris(2-aminoetil) amina (TAEA, Sigma Aldrich, cat. # 225630) foi diluída em DMF anidro para a concentração final de 200 mM. Éster de azido-PEG4-NHS (ClickChemistry Tools, cat. # AZ103) foi dissolvido em DMF anidro para a concentração final de 1 M. O Azido-PEG4-NHS envolveu-se em excesso molar de 5 vezes com Tris(2-aminoetil) amina e incubados a 25°C, durante 1 hora. 3xAzide-PEG4-TAEA foi purificado usando C18 RP-HPLC usando Phenomenex C18 de Júpiter 5u 300Â 150 x 4,60 mm coluna, tampão A 0,1% de TFA na água, tampão B 0,1% TFA em acetonitrila, fluxo taxa 1ml/min, gradiente de 5 a 50 %B em 45 min. Picos cromatográficos foram coletados e analisadas por MALDI-TOF MS e ESI-MS para detectar o produto com PM de 966 Da.3xAzide-PEG4-TAEA foi identificado como um pico com tempo de retenção (Fig. 114B) de 33 min. A fração foi neutralizada usando 1m pH HEPES 8.0 e concentrado por evaporação a vácuo.

3. Síntese do conjugado XTEN trimérico

[587] O 1xDBCO-XTEN288 foi preparado como um 7.85 mg/ml (293 hum) solução em 20 mM HEPES, pH 7.0, 50 mM de NaCl. 3xAzide-PEG4-TAEA foi purificado e formulou a mesma reserva de RP-HPLC. Uma concentração do vinculador sintetizada não foi determinada, e 1xDBCO-XTEN288 3xAzide-PEG4-TAEA misturado empiricamente em várias relações e foram incubadas a 25° C Fosfato de Sódio pH 6.5, 300mM NaCl, fluxo taxa 0,5 ml/min, eluição isocrática para 70 min). XTEN_288 linear, XTEN_576 e XTEN_864 foram analisados sob as mesmas condições para identificar os produtos de reação (Fig. 115). Pico 1 eluída em 30,5 min, ao mesmo tempo que XTEN_864 e foi identificado como um trímerico de XTEN288. O pico 2 eluiu a 34 min, ao mesmo tempo que XTEN_576 e foi identificado como um dímero de XTEN_288. O pico 3 eluiu aos 39 min, ao mesmo tempo que XTEN_288 e foi identificado como precursor do XTEN_288. O pico 4 correspondeu a compostos de baixo peso molecular e não foi incluído na quantificação das espécies XTEN. O rendimento do conjugado XTEN trimérico sob a relação proteína/vinculador otimizado foi de 57%. Essencialmente, os tempos de retenção idênticos de conjugado e trimérico 3xXTEN_288 molécula linear XTEN_864 confirma a observação anterior que o peso molecular aparente e o raio hidrodinâmico de uma proteína XTEN não está dependente da sua configuração geométrica.

Exemplo 67: Citotoxicidade seletiva de 3xFA (Y), 3xMMAE- XTEN em células KB

[588] A capacidade de seletivamente alvo e matar células com receptores de folato foi avaliada. Teste artigos de enciclopédia MMAE, um conjugado de direcionamento-3xMMAE- XTEN (XTEN ligada à toxina) e o 3xFA do receptor-alvo de folato (ϒ), conjugado 3xMMAE-XTEN foram avaliados em um ensaio de anti-proliferação CellTiter-Glo usando a linha de celular folato receptor-positivo KB. Como meios de cultura contêm teor elevado de ácido fólico, KB células foram cultivadas em meios sem ácido fólico contendo 10% de soro de vitela fetal inativadas pelo calor em 37oC, 5% CO2 pelo menos 7 dias antes do início do experimento viabilidade celular, este meio também foi utilizado para a execução do experimento. Em breve, células KB foram banhadas em 10.000 células por poço em uma placa de ensaio da microplaca de 96 poços. Células KB foram autorizadas a aderir à placa por uma incubação durante uma noite. à 37oC, 5% CO2. O meio gasto foi então removido e os poços designados para conter concorrente ácido fólico recebeu meio de ensaio que contém o ácido fólico, enquanto os poços não designados para ter concorrente ácido fólico recebeu apenas meio de ensaio. A placa foi incubada durante 30 min a 37oC, 5% CO2 antes que o meio do ensaio foi aspirada e lavada com meios de ensaio de chapa. Os MMAE, XTEN-3xMMAE e 3xFA (y) , 3xMMAE-XTEN livres, na presença ou ausência de ácido fólico concorrente foi então adicionado em um conjunto adequado de doses. A placa foi incubada então ainda mais para 2 - 4 h em 37oC, 5% CO2. Media então foi removido, o meio fresco e lavado de placa introduzida e a placa foi autorizada a incubar por um adicional 48-72h. Após o período de incubação apropriada, o reagente CellTiter-Glo foi adicionado e a placa foi lida em um luminômetro. O IC50 de cada artigo de teste foi determinado utilizando uma curva logística 4 parâmetro ajuste usando GraphPad Prism.

[589] Resultados: Como mostrado na FIG: 116, fração livre da droga de MMAE mostra a matança altamente potente de células do KB, com um IC50 de 0.8nM, quando 3 cópias de MMAE conjugadas a XTEN de escolha dos objetivos resultaram pelo menos em uma redução de 3 registros na morte da célula (IC50 >1,000nM). Significativamente, a adição de 3 cópias do folato que alvejam domínios ao 3xMMAE-XTEN conjugado restaurou a morte da célula, com um IC 50 de 4.2 nanômetro; um nível da atividade perto daquele observado para MMAE livre. De igual importância, a introdução de ácido fólico como um concorrente ao conjugado alvo prejudicou a atividade de morte celular observada de 3xFA (y) , 3xMMAE- XTEN na linha de células KB. Esta redução da morte da célula potente do conjugado da droga de XTEN folato (de 4.2 nM a >1,000nM) suporta a conclusão que a toxicidade detectada da célula, sob as circunstâncias experimentais, esteve facilitado pelo uso do folato como o mecanismo de escolha de objetivos para o conjugado da droga de encontro à linha da célula do KB.

Exemplo 68: Na triagem baseada em células in vitro da droga de XTEN de folato conjugado para a atividade e a especificidade

[590] A habilidade de alvejar e matar seletivamente as células que carregam os receptores de folato que usam conjugados alvejados da droga de XTEN de folato é avaliada usando no ensaio baseado in vitro da seleção e da seletividade.

[591] Cada conjugado da droga de XTEN de folato, sua correspondente molécula da droga de XTENsem direcionamento e controle respectivo da droga livre será testado em um ensaio da anti-proliferação da CellTiter-Glo de encontro a um painel de linhas da célula positivas e negativas do folato receptor. A escolha de linhas da célula é baseada na relevância à aplicação clínica proposta e inclui KB, IGROV, SK-OV-3, HeLa, LoVo, SW620, Madison 109, A549, A375, LS- 174T, HT-29, 4T1, SK-BR-3. Porque os meios de cultura contêm o índice de ácido fólico elevado, as células serão crescidas e o ensaio será executado nos meios ácidos fólicos livres que contêm 5-10% do soro de bezerro fetal inativado pelo calor (FCS) em 37oC, 5% CO2. O FCS de calor inativado contém o nível de endógenos do ácido fólico suficiente para o receptor de folato que expressa células para sobreviver e proliferar. As condições apropriadas do ensaio incluindo a densidade da célula e o tempo ideal da incubação são pré-determinados nos meios de folato livres que contêm FCS de 5-10% usando a droga livre respectiva como o controle. Os conjugados da droga de XTEN do folato são testados então como segue: as células na fase de registro são coletadas, contadas e chapeadas na densidade pré-determinada da célula em cada poço de uma placa do ensaio de microtitulação de 96 poços. As células aderentes são permitidas unir à placa por uma incubação de noite em 37oC, 5% CO2. A droga de XTEN de folato conjugada e os controles correspondentes são introduzidos em uma escala da dose nas duplicatas e na placa incubada para uns 2 a 5 dias adicionais. Alternativamente, as células podem também ser pulsadas com droga de XTEN de folato conjugado e controles correspondentes para 2-6 h, meios lavados, frescos introduzidos e permitidos para incubar para umas 48-72 h adicionais. Após o período apropriado da incubação, o reagente de CellTiter-Glo é adicionado a cada poço, misturado por 2 minutos em um agitador orbital. A placa então é centrifugada em 90g e incubada na temperatura ambiente por 10 minutos adicionais para estabilizar o sinal luminescente. Os sinais de luminescente são lidos então em um luminômetro & IC50s (meia concentração de inibitória máxima) calculadas com Prisma de GraphPad ou software equivalente. As comparações quantitativas do IC50s permitirão o ranking da atividade dos compostos para a inibição do crescimento e da seletividade da célula de encontro ao receptor do folato positivo contra linhas da célula negativa.

[592] Espera-se que os resultados suportariam encontrar que a droga de XTEN de folato conjugados mostrarão a morte potente altamente seletiva nas células positivas do receptor de folato mas não em células de folato do receptor negativo. Isto estará no contraste à fração da droga livre por meio de que nenhuma discriminação na citotoxicidade forte é esperado entre linhas da célula positivas e negativas do receptor de folato. O controle da droga de XTEN é esperado para render a atividade citotóxica pobre. O conjugado da droga de XTEN de folato com a atividade e a linha mais favoráveis dos controles relativos das células da seletividade será verificado ainda para a associação do receptor de folato pela adição do ácido fólico do competidor livre no ensaio e em demonstrar a citotoxicidade danificada da droga de XTEN de folato.

Exemplo 69: Na triagem baseada em células in vitro da droga de XTEN-LHRH conjugado para a atividade e a especificidade

[593] A habilidade de alvejar e matar seletivamente as células que carregam os receptores de LHRH que usam conjugados alvejados da droga de XTEN-LHRH é avaliada usando no ensaio baseado in vitro da seleção e da seletividade. Cada conjugado da droga de LHRH-XTEN, sua correspondente da molécula da droga de XTEN e o controle respectivo da droga livre são testados em um ensaio da anti-proliferação de CellTiter-Glo de encontro a um painel de linhas da célula positivas e negativas do receptor de LHRH. A escolha de linha da célula é baseada na relevância à aplicação clínica proposta e inclui MCF-7, MDA-MB-231, HCC1806, HCC1937,OV-1063, EFO-21, EFO-27, NIH:OVCAR-3, BG- 1, HEC-1A, HEC-1B, Ishikawa, KLE, AN-3-CA, MiaPaCa, Panc-1, rat Dunning R-3327-H, PC-82, MDA-PCa-2b, C4-2 (derivativa de LNCaP), A549, A2780, UCI-107, SK-OV-3, SW 626, MFE-296 As condições apropriadas do ensaio, incluindo a densidade da célula e o tempo ideal da incubação, pré-determinada usando a droga livre respectiva como o controle. Os conjugados da droga de LHRH-XTEN são testados então como segue: as células na fase de registro são coletadas, contadas e chapeadas na densidade pré-determinada da célula em cada poço de uma placa do ensaio de microtitulação de 96 poços. As células aderentes são permitidas unir à placa por uma incubação de noite em 37oC, 5% CO2. A droga de LHRH- XTEN conjugada e os controles correspondentes são introduzidos em uma escala de dose nas duplicatas e na placa incubada para uns 2 a 5 dias adicionais dependendo das linhas das células usadas. Após o período apropriado da incubação, o reagente de CellTiter-Glo é adicionado a cada poço, misturado por 2 minutos em um agitador orbital. A placa então é centrifugada em 90 x g e incubada na temperatura ambiente por 10 minutos adicionais para estabilizar o sinal luminescente. Os sinais de luminescente são lidos então em um luminômetro & IC50s (meia concentração de inibitória máxima) são calculadas com Prisma de GraphPad ou software equivalente. As comparações quantitativas do IC50s permitirão o ranking da atividade dos compostos para a inibição do crescimento e da seletividade da célula de encontro ao receptor de LHRH positivo contra linhas da célula negativa.

[594] Espera-se que os resultados suportariam encontrar que os conjugados da droga de LHRH-XTEN mostrarão a morte altamente seletiva e potente de células positivas do receptor de LHRH, mas não em células do receptor de LHRH negativo. Isto estará no contraste à fração da droga livre por meio de que nenhuma discriminação na citotoxicidade forte é esperado entre linhas da célula positivas e negativas do receptor de LHRH. O controle da droga de XTEN sem o LHRH que alveja a fração espera-se render a atividade citotóxica pobre. O conjugado da droga de LHRH-XTEN com a atividade mais favorável e a linhas celulares de seletividade relativa para controle são verificados ainda para a associação do receptor de LHRH pela adição do peptídeo do competidor livre de LHRH no ensaio e em demonstrar a citotoxicidade danificada da droga de LHRH- XTEN.

Exemplo 69: A estabilidade in vitro do soro do conjugado da droga de LHRH-XTEN

[595] Como uma medida da estabilidade da ligação da droga, da droga de LHRH-XTEN conjugados incubados independentemente no ser humano, macacos cynomolgus e no plasma do roedor em 37oC por até 2 semanas com uma alíquota removida no intervalo periódico e armazenados em -80oC até a análise. A estabilidade do conjugado da droga de LHRH- XTEN pode ser avaliada pela quantidade de droga livre liberada ou da integridade do tempo excedente do conjugado da droga de LHRH-XTEN. A droga livre é quantificada com RP- HPLC e/ou LC-MS/MS visto que a quantidade de conjugado intacto da droga de LHRH-XTEN é determinada por um XTEN/droga e/ou de LHRH/droga de ELISA. Para a análise RP- HPLC, as amostras de plasma são tratadas com solventes orgânicos tal como acetonitrila ou acetona para precipitar proteínas. Frações solúveis são evaporadas a vácuo, redissolvidas em soluções de carregamento e analisadas por RP-HPLC. Analitos são detectados pela absorção UV no comprimento de onda específico para uma determinada droga. Por exemplo, a doxorrubicina é detectada em 480 nm. Os padrões da calibração são preparados adicionando quantidades sabidas de droga livre ao tipo correspondente do plasma e são tratados na paralela com as amostras experimentais. Para a análise LC-MS/MS, as amostras de plasma são tratadas com solventes orgânicos tal como acetonitrila ou acetona para precipitar as proteínas. Frações solúveis são evaporadas a vácuo, redissolvidas em soluções de carregamento e analisadas por RP-HPLC. Analitos são detectados em linha e quantificados por espectrometria de massa em tandem quadrupolo triplo. Pares de íons de íon- produto parentais são determinados experimentalmente para cada droga. Os padrões da calibração são preparados adicionando quantidades sabidas de droga livre ao tipo correspondente do plasma e tratados na paralela com as amostras experimentais. Para ELISA quantitativa, as concentrações ideais dos anticorpos para o conjugado da droga de LHRH-XTEN no ELISAs são determinados usando a análise de série cruzada da diluição. Um anticorpo apropriado da captação que reconhece um componente do conjugado é revestido em uma placa de microtitulação de 96 poços por uma incubação durante a noite em 4oC. Os poços são bloqueados, lavados e as amostras de estabilidade do soro adicionadas aos poços, cada um em diferentes diluições para permitir a captura ideal do conjugado da droga de LHRH-XTEN ao anticorpo revestido. Após a lavagem, o anticorpo da detecção que reconhece um outro componente do conjugado é adicionado e permitido ligar ao conjugado capturado na placa. Os poços são lavados então outra vez e o peroxidase de rábano de estreptavidina (complementar para a versão da detecção do anticorpo biotinilado) ou um peroxidase secundária apropriada do anticorpo de rábano (complementar para a versão da detecção do anticorpo não biotinilado) são adicionados então. Depois que a incubação apropriada e uma lavagem final pisam, o substrato do tetrametilbenzidina (TMB) está adicionada e a placa é lida em 450 nM. As concentrações do conjugado intato são calculadas então para cada vez que o ponto comparando a resposta colorimétrica a uma curva de calibração se preparou com a droga de LHRH-XTEN no tipo relevante do plasma. O t1/2 do conjugado no soro do ser humano, do cino e do camundongo é definido então usando a análise da regressão linear das concentrações do registro contra tempo.

Exemplo 70: A estabilidade in vitro do soro da droga de XTEN de folato conjugado

[596] Como uma medida da estabilidade da ligação da droga, da droga de XTEN de folato conjugados incubados independentemente no ser humano, macacos cynomolgus e no plasma do roedor em 37oC por até 2 semanas com uma alíquota removida no intervalo periódico e armazenados em -80oC até a análise. A estabilidade da droga de XTEN de folato conjugado pode ser avaliada pela quantidade de droga livre ou da integridade do tempo excedente da droga de XTEN de folato conjugado. A presença da droga livre é quantificada com HPLC, LC-MS/MS e/ou com o ensaio da anti-proliferação como descrita na seção relevante acima. A quantidade da droga de XTEN de folato intacto conjugado é determinada por uma XTEN/droga e/ou por uma droga de ELISA/folato. Para a análise RP-HPLC, as amostras de plasma são tratadas com solventes orgânicos tal como acetonitrila ou acetona para precipitar proteínas. Frações solúveis são evaporadas a vácuo, redissolvidas em soluções de carregamento e analisadas por RP-HPLC. Analitos são detectados pela absorção UV no comprimento de onda específico para uma determinada droga. Por exemplo, a doxorrubicina é detectada em 480 nm. Os padrões da calibração são preparados adicionando quantidades sabidas de droga livre ao tipo correspondente do plasma e tratados na paralela com as amostras experimentais. Para a análise LC-MS/MS, as amostras de plasma são tratadas com solventes orgânicos tal como acetonitrila ou acetona para precipitar as proteínas. Frações solúveis são evaporadas a vácuo, redissolvidas em soluções de carregamento e analisadas por RP-HPLC. Analitos são detectados em linha e quantificados por espectrometria de massa em tandem quadrupolo triplo. Pares de íons de íon- produto parentais são determinados experimentalmente para cada droga. Os padrões da calibração são preparados adicionando quantidades sabidas de droga livre ao tipo correspondente do plasma e tratados na paralela com as amostras experimentais. Ao usar o ensaio da anti- proliferação como um método de detecção para a presença da droga de conjugado livre, a linha da célula positiva ou negativa do receptor de folato podia ser empregado. O inibidor ácido fólico é adicionado quando a avaliação é executada na linha da célula positiva do receptor e não requerida quando feito na linha da célula negativa do receptor. Em qualquer tipo de célula do receptor, o aumento da concentração de droga de conjugado livre contribui para um aumento da toxicidade celular. Para ELISA quantitativa, as concentrações ideais dos anticorpos para o conjugado da droga de XTEN de folato no ELISAs são determinados usando a análise de série cruzada da diluição. Um anticorpo apropriado da captação que reconhece um componente do conjugado é revestido em uma placa de microtitulação de 96 poços por uma incubação durante a noite em 4oC. Os poços são bloqueados, lavados e as amostras de estabilidade do soro adicionadas aos poços, cada um em diferentes diluições para permitir a captura ideal do conjugado da droga de XTEN de folato ao anticorpo revestido. Após a lavagem, o anticorpo da detecção que reconhece um outro componente do conjugado é adicionado e permitido ligar ao conjugado capturado na placa. Os poços são lavados então outra vez e o peroxidase de rábano de estreptavidina (complementar para a versão da detecção do anticorpo biotinilado) ou um peroxidase secundária apropriada do anticorpo de rábano (complementar para a versão da detecção do anticorpo não biotinilado) são adicionados então. Depois que a incubação apropriada e uma lavagem final pisam, o substrato do tetrametilbenzidina (TMB) está adicionada e a placa é lida em 450 nM. As concentrações do conjugado intato são calculadas então para cada vez que o ponto comparando a resposta colorimétrica a uma curva de calibração se preparou com a droga de XTEN de folato no tipo relevante do plasma. O t1/2 do conjugado no soro do ser humano, do cino e do camundongo é definido então usando a análise da regressão linear das concentrações do registro contra tempo.

Exemplo 71: In vivo e ex vivo da imagem do conjugado de LHRH-XTEN-Cy5.5

[597] Um fluorescente de Cy5.5 etiquetado de LHRH-XTEN da molécula de conjugado é utilizado como um substituto para investigar a eficácia do direcionamento e da bio- distribuição de conjugados das drogas de LHRH-XTEN. As experiências são realizadas nos camundongos portadores dos xenoenxertos subcutâneos crescidos das células positivas do tumor do receptor de LHRH usando in vivo, seguidos por ex vivo, imagem fluorescência com sistema ótico da imagem de IVIS 50 (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Em resumo, camundongos fêmeas de nu/nu que carregam o tumor positivo do receptor de LHRH as células são dadas uma única injeção intravenosa da dose elevada ou baixa de LHRH-XTEN-Cy5.5 e doses correspondentes do controle de XTEN etiquetado de Cy5.5 sem direcionamento. As varreduras do corpo inteiro são adquiridas pre-injeção e então em aproximadamente 8, 24, 48 e 72 horas de pós-injeção em animais anestesiados vivos usando o sistema ótico da imagem de IVIS 50. Após ter medido a distribuição de fluorescência no animal inteiro no ponto da última vez de 72h, o tumor e os órgãos saudáveis incluindo o fígado, o pulmão, o coração, o baço e os rins são extirpados e suas fluorescências registrados e processado pelo sistema da imagem. A excitação de Cy5.5 (615-665 nn) e os filtros da emissão (695-770 nn) são selecionados para combinar comprimentos de onda dos agentes de fluorescências. Armazenamento pequeno e médio do chip CCD é usado e o momento da exposição otimizado para obter, pelo menos, diversas mil contagens dos sinais que eram observados em cada camundongo na imagem e de evitar a saturação do chip CCD. Para normalizar imagens para a quantificação, uma imagem de fluorescência do fundo é adquirida usando filtros da excitação e da emissão do fundo para a região espectral Cy5.5. A intensidade da fluorescência é expressada por cores diferentes com a cor azul que reflete a intensidade mais baixa e o vermelho é indicativo da intensidade mais elevada.

Exemplo 72: In Vivo e ex vivo da imagem dos conjugados de XTEN-Cy5.5 de folato

[598] A molécula de XTEN de folato etiquetada fluorescente de A Cy5.5 é usada enquanto um substituto para investigar a eficiência da escolha dos objetivos e do bio-distribuição dos conjugados da droga de XTEN de folato. As experiências são realizadas nos camundongos portadores dos xenoenxertos subcutâneos crescidos das células positivas do tumor do receptor de folato usando in vivo, seguidos por ex vivo, imagem fluorescência com sistema ótico da imagem de IVIS 50 (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Porque os meios de cultura contêm o índice de folato elevado, as células positivas do tumor do receptor de folato a ser transplantado nestes camundongos são crescidos nos meios de cultura de folato livres das células que contêm o FCS de calor inativado 5-10% com nenhum antibiótico. Da mesma forma, dieta normal dos roedores contém uma elevada concentração de ácido fólico; camundongos usados neste estudo são mantidos em dieta isenta de folato 2 semanas antes da implantação do tumor e para a duração da análise de imagem para reduzir a concentração do soro de folato. Em resumo, camundongos fêmeas de nu/nu que carregam o tumor positivo do receptor de folato as células são dadas uma única injeção intravenosa da dose elevada ou baixa de XTEN- Cy5.5 de folato e doses correspondentes do controle de XTEN etiquetado de Cy5.5 sem direcionamento. As varreduras do corpo inteiro são adquiridas pre-injeção e então em aproximadamente 8, 24, 48 e 72 horas de pós-injeção em animais anestesiados vivos usando o sistema ótico da imagem de IVIS 50. Após ter medido a distribuição de fluorescência no animal inteiro no ponto da última vez de 72h, o tumor e os órgãos saudáveis incluindo o fígado, o pulmão, o coração, o baço e os rins são extirpados e suas fluorescências registrados e processado pelo sistema da imagem. A excitação de Cy5.5 (615-665 nn) e os filtros da emissão (695-770 nn) são selecionados para combinar comprimentos de onda dos agentes de fluorescências. Armazenamento pequeno e médio do chip CCD é usado e o momento da exposição otimizado para obter, pelo menos, diversas mil contagens dos sinais que eram observados em cada camundongo na imagem e de evitar a saturação do chip CCD. Para normalizar imagens para a quantificação, uma imagem de fluorescência do fundo é adquirida usando filtros da excitação e da emissão do fundo para a região espectral Cy5.5. A intensidade da fluorescência é expressada por cores diferentes com a cor azul que reflete a intensidade mais baixa e o vermelho é indicativo da intensidade mais elevada.

Exemplo 73: Análise Farmacocinética dos conjugados da droga de LHRH-XTEN

[599] O in vivo farmacocinéticos de construtos da droga de LHRH-XTEN são avaliados usando métodos padrão para composições da proteína. Os farmacocinéticos são avaliados na espécie múltipla, porém os camundongos, os ratos, os macacos cynomolgus, e os cães são preferidos devido a seu uso comum em predizer farmacocinéticos humanos. As composições de construtos da droga de LHRH-XTEN são fornecidas em um tampão aquoso compatível com administração in vivo (por exemplo: salina tamponada com fosfato, solução salina tamponada com Tris ou salina tamponada com Hepes). As composições são administradas em doses apropriadas e através das rotas múltiplas: o mais preferivelmente através das rotas intravenosa ou subcutâneas. As amostras do sangue são coletadas nos pontos apropriados do tempo que variam de 0.08 a 504 horas, e processadas no plasma. As amostras do plasma serão analisadas então para a concentração de conjugados da droga de LHRH-XTEN por uma de uma variedade dos métodos incluindo ELISA, HPLC e/ou LC-MS/MS. A análise de ELISA será executada usando um formato de ELISA do sanduíche que possa reconhecer 2 componentes do conjugado da droga de LHRH-XTEN, por exemplo, XTEN/LHRH, XTEN/fração da droga, LHRH/fração da droga e/ou de combinações de XTEN/XTEN. Tipicamente o anticorpo que reconhece um componente do conjugado da droga de LHRH-XTEN é revestido em poços de uma placa de microtitulação de 96 poços. Os poços são obstruídos, lavado e as amostras do plasma que foram coletadas em pontos diferentes do tempo são adicionadas então aos poços, cada um em diluições variando, para permitir a captação do conjugado pelo anticorpo revestido. Os poços são lavados então extensivamente, e a proteína da ligação detectada usar um anticorpo biotinilado ou um anticorpo secundário adequado contra o segundo componente do conjugado da droga de LHRH-XTEN. Os poços são lavados então outra vez e a peroxidase de rábano de estreptavidina (complementar para a detecção do anticorpo biotinilado) ou uma peroxidase secundária do anticorpo de rábano (complementar para a detecção do anticorpo não biotinilado) são adicionados então. Depois que a incubação apropriada e uma lavagem final pisam, o substrato do tetrametilbenzidina (TMB) está adicionada e a placa é lida em 450 nM. As concentrações do conjugado são calculadas então para cada vez apontam comparando a resposta colorimétrica a uma curva de calibração da droga de LHRH- XTEN. Os parâmetros farmacocinéticos são calculados usando o pacote de software de WinNonLin. Para a análise RP-HPLC, as amostras de plasma são tratadas com solventes orgânicos tal como acetonitrila ou acetona para precipitar proteínas. Frações solúveis são evaporadas a vácuo, redissolvidas em soluções de carregamento e analisadas por RP-HPLC. Analitos são detectados pela absorção UV no comprimento de onda específico para uma determinada droga. Por exemplo, a doxorrubicina é detectada em 480 nm. Os padrões da calibração são preparados adicionando quantidades sabidas de droga livre ao tipo correspondente do plasma e são tratados na paralela com as amostras experimentais. Para a análise LC-MS/MS, as amostras de plasma são tratadas com solventes orgânicos tal como acetonitrila ou acetona para precipitar as proteínas. Frações solúveis são evaporadas a vácuo, redissolvidas em soluções de carregamento e analisadas por RP-HPLC. Analitos são detectados em linha e quantificados por espectrometria de massa em tandem quadrupolo triplo. Pares de íons de íon-produto parentais são determinados experimentalmente para cada droga. Os padrões da calibração são preparados adicionando quantidades sabidas de droga livre ao tipo correspondente do plasma e são tratados na paralela com as amostras experimentais. Espera-se que os resultados suportariam encontrar que a adição de um XTEN a LHRH e da fração da droga como uma preparação conjugada aumentará extremamente a meia vida terminal e realçará as propriedades farmacocinéticas comparadas a alvejar peptídeos e frança da droga não ligada a XTEN. Por sua vez, se traduzirá em um regime de dosagem menos frequente, mais conveniente para tais conjugados.

Exemplo 74: A análise farmacocinética do conjugado da droga de XTEN de folato

[600] O in vivo farmacocinéticos de construtos da droga de XTEN de folato são avaliados usando métodos padrão para composições da proteína. Os farmacocinéticos são avaliados na espécie múltipla, porém os camundongos, os ratos, os macacos cynomolgus, e os cães são preferidos devido a seu uso comum em predizer farmacocinéticos humanos. Enquanto a alimentação normal contém uma concentração elevada do ácido fólico (exemplo 6mg/kg camundongo purina), os animais a serem usados em estudos farmacocinéticos dos conjugados de folato estão mantidos na dieta de folato livre por 2 semanas antes da iniciação do estudo e para a duração do estudo. As composições dos construtos da droga de XTEN de folato são fornecidas tipicamente em um amortecedor aquoso compatível com a administração in vivo (por exemplo: salina tamponada com fosfato, solução salina tamponada com tris ou salina tamponada com Hepes). As composições seriam administradas em doses apropriadas e através das rotas múltiplas: o mais preferivelmente através das rotas intravenosa ou subcutâneas. As amostras do sangue seriam coletadas nos pontos apropriados do tempo que variam de 0.08 a 504 horas, e processadas no plasma. As amostras do plasma serão analisadas então para a concentração de conjugados da droga de XTEN de folato por uma de uma variedade dos métodos incluindo ELISA, HPLC e/ou LC-MS/MS. A análise de ELISA é executada usando um formato de ELISA do sanduíche que possa reconhecer 2 componentes do conjugado da droga de XTEN de folato, por exemplo, XTEN/folato, XTEN/fração da droga, folate/fração da droga e/ou combinações de XTEN/XTEN. Tipicamente o anticorpo que reconhece um componente do conjugado da droga de XTEN de folato é revestido em poços de uma placa de microtitulação de 96 poços. Os poços são obstruídos, lavado e as amostras do plasma que foram coletadas em pontos diferentes do tempo são adicionadas então aos poços, cada um em diluições variando, para permitir a captação do conjugado pelo anticorpo revestido. Os poços são lavados então extensivamente, e a proteína da ligação detectada usar um anticorpo biotinilado ou um anticorpo secundário adequado contra o segundo componente do conjugado da droga de LHRH- XTEN. Os poços são lavados então outra vez e a peroxidase de rábano de estreptavidina (complementar para a detecção do anticorpo biotinilado) ou uma peroxidase secundária do anticorpo de rábano (complementar para a detecção do anticorpo não biotinilado) são adicionados então. Depois que a incubação apropriada e uma lavagem final pisam, o substrato do tetrametilbenzidina (TMB) está adicionada e a placa é lida em 450 nM. As concentrações do conjugado são calculadas então para cada vez apontam comparando a resposta colorimétrica a uma curva de calibração da droga de XTEN de folato. Os parâmetros farmacocinéticos são calculados usando o pacote de software de WinNonLin. Para a análise RP-HPLC, as amostras de plasma são tratadas com solventes orgânicos tal como acetonitrila ou acetona para precipitar proteínas. Frações solúveis são evaporadas a vácuo, redissolvidas em soluções de carregamento e analisadas por RP-HPLC. Analitos são detectados pela absorção UV no comprimento de onda específico para uma determinada droga. Por exemplo, a doxorrubicina é detectada em 480 nm. Os padrões da calibração são preparados adicionando quantidades sabidas de droga livre ao tipo correspondente do plasma e são tratados na paralela com as amostras experimentais. Para a análise LC-MS/MS, as amostras de plasma são tratadas com solventes orgânicos tal como acetonitrila ou acetona para precipitar as proteínas. Frações solúveis são evaporadas a vácuo, redissolvidas em soluções de carregamento e analisadas por RP-HPLC. Analitos são detectados em linha e quantificados por espectrometria de massa em tandem quadrupolo triplo. Pares de íons de íon- produto parentais são determinados experimentalmente para cada droga. Os padrões da calibração são preparados adicionando quantidades sabidas de droga livre ao tipo correspondente do plasma e são tratados na paralela com as amostras experimentais. Espera-se que os resultados suportariam encontrar que a adição de um XTEN para folato e da fração da droga como uma preparação conjugada aumentará extremamente a meia vida terminal e realçará as propriedades farmacocinéticas comparadas a alvejar peptídeos e frança da droga não ligada a XTEN. Por sua vez, se traduzirá em um regime de dosagem menos frequente, mais conveniente para tais conjugados.

Exemplo 75: Análise de eficácia e toxicidade in vivo de conjugados de LHRH-XTEN-droga

[601] O conjugado de LHRH-XTEN-droga destina-se à distribuição direcionada da toxina altamente potente para as células tumorais positivas de receptor de LHRH. Como tal, a atividade farmacológica in vivo dos construtos de LHRH-XTEN-drogas pode ser avaliada usando células tumorais humanas expressando receptor de LHRH transplantadas em camundongos sem pelos. Antes de iniciar o estudo de eficácia, a avaliação inicial em camundongos sem pelos é realizada para estabelecer a dose máxima tolerada (MTD) dos candidatos de LHRH-XTEN-droga. A MTD, a dose mais elevada que é tolerada pelo animal durante o estudo, será usada para calcular a faixa de dose para o estudo de eficácia e toxicidade no modelo de enxerto padrão. Brevemente, o experimento de MTD é realizado com 5 camundongos por grupo avaliando que a administração intravenosa de conjugados de LHRH-XTEN-droga em vários níveis, intervalos e duração da dose. A dose MTD inicial e o número de grupos de dose necessário são baseados na literatura científica, no conhecimento da fração de LHRH alvo, na natureza da fração da droga conjugada, nas propriedades toxicológicas dos compostos intimamente relacionados, e nos dados dos estudos de farmacocinética inicial (vide, acima). Os parâmetros de MTD padrão tais como redução do peso corporal, consumo de comida e água e sinais de piloereção, padrões de comportamento, curvados, padrão respiratório, tremores, convulsões, prostração e automutilação são cuidadosamente monitorados em uma base diária. A dose mais elevada de LHRH-XTEN-droga que não causa toxicidade inaceitável é atribuída à MTD. O estudo de xenoenxerto de tumor incluirá 3 a 4 níveis de dosagens do conjugado de LHRH-XTEN-droga e dependerá dos resultados do estudo de MTD; com outros parâmetros dependendo da linhagem celular tumoral escolhida. O exemplo 69 descreve exemplos de linhagens de tumor que podem ser usadas no estudo do xenoenxerto. Assim, um número apropriado de células positivas de receptor de LHRH da linhagem de tumor humano relevante é injetado por via subcutânea e permitido formar tumores, o tamanho será medido com pinças e o volume calculado como 0,5 x L x W2, onde L = medida do eixo mais longo em milímetros e W = medida do eixo perpendicular à L em milímetros. Após a randomização de camundongos contendo volume de tumor na faixa de tamanho desejada em grupos de 8 a 10 animais, controle do veículo, controle de droga livre e conjugado de LHRH-XTEN-droga são administrados por via intravenosa nas doses e intervalo escolhidos. A cessação ou regressão do crescimento do tumor é determinada através da medição do tamanho do tumor e o volume em pontos de tempo selecionados com pinças. Os pesos corporais e consumo de alimentos são medidos a cada 1 a 2 dias para avaliar a toxicidade bruta. A sobrevivência dos animais é monitorada diariamente. No final do estudo, todos os animais são sacrificados e a patologia clínica e histopatologia nos principais órgãos são executadas. As citotoxinas alvo estão entre as estratégias mais promissoras para a eliminação seletiva de células malignas. Previa-se que os resultados se apoiariam na constatação de que o conjugado de LHRH-XTEN-droga produzirá um índice terapêutico positivo como exibido pela eficácia potente e baixa toxicidade sistêmica. Em contraste, espera-se que a droga livre direcionada de não- LHRH doseada em doses equimolares não seja menos potente mas mais tóxica. Esperava-se que o controle do veículo exibiria crescimento tumoral descontrolado e toxicidade grave.

Exemplo 76: Análise de eficácia e toxicidade in vivo de conjugados de folato-XTEN-droga

[602] O conjugado de LHRH-XTEN-droga destina-se à distribuição direcionada da toxina altamente potente para as células tumorais positivas de receptor de folato. Como tal, a atividade farmacológica in vivo dos construtos de folato-XTEN-droga é avaliada usando células tumorais humanas expressando xenoenxerto de receptor de folato em camundongos sem pelos. Antes de iniciar o estudo de eficácia, a avaliação inicial em camundongos sem pelos é realizada para estabelecer a dose máxima tolerada (MTD) dos candidatos de folato-XTEN-droga. A MTD, a dose mais elevada que é tolerada pelo animal durante o estudo, será usada para calcular a faixa de dose para o estudo de eficácia e toxicidade no modelo de enxerto padrão. Como ração de roedor normal contém uma alta concentração de ácido fólico (ração de 6mg/kg), camundongos a serem usados nestes estudos são mantidos em uma dieta livre de folato por 2 semanas antes do início do estudo e durante o estudo. O experimento de MTD é realizado com 5 camundongos por grupo avaliando que a administração intravenosa de conjugados de folato-XTEN-droga em vários níveis, intervalos e duração da dose. A dose de MTD inicial e o número de grupos de dose necessários são baseados na literatura científica, no conhecimento da fração de folato alvo, na natureza da fração da droga conjugada, nas propriedades toxicológicas dos compostos intimamente relacionados, e nos dados dos estudos de farmacocinética inicial (vide acima). Os parâmetros de MTD padrão tais como redução do peso corporal, consumo de comida e água e sinais de piloereção, padrões de comportamento, curvados, padrão respiratório, tremores, convulsões, prostração e automutilação são cuidadosamente monitorados em uma base diária. A dose mais elevada de folato-XTEN-droga que não causa toxicidade inaceitável é atribuída à MTD. O estudo de xenoenxerto de tumor incluirá 3 a 4 níveis de dosagens do conjugado de fosfalato-XTEN-droga e dependerá dos resultados do estudo de MTD; com outros parâmetros dependendo da linhagem celular tumoral escolhida. O exemplo 69 descreve exemplos de linhagens de tumor que podem ser usadas no estudo do xenoenxerto. Para reduzir o teor de folato, as células tumorais positivas de receptor de folato a serem transplantadas em camundongos sem pelos crescem em meios de cultura celular livres de folato contendo 5 a 10% de soro fetal de bezerro inativado por calor sem nenhum antibiótico. De forma similar, para reduzir a concentração de folato de soro, os camundongos usados nos estudos de enxerto são mantidos na dieta livre de folato 2 semanas antes da implantação do tumor e para a duração do estudo. Assim, um número apropriado de células positivas de receptor de folato da linhagem de tumor humano relevante é injetado por via subcutânea e permitido formar tumores, o tamanho será medido com pinças e o volume calculado como 0,5 x L x W2, onde L = medida do eixo mais longo em milímetros e W = medida do eixo perpendicular à L em milímetros. Após a randomização de camundongos contendo volume de tumor na faixa de tamanho desejada em grupos de 8 a 10 animais, controle do veículo, controle de droga livre e folato-XTEN-droga são administrados por via intravenosa nas doses e intervalos escolhidos. A cessação ou regressão do crescimento do tumor é determinada através da medição do tamanho do tumor e o volume em pontos de tempo selecionados com pinças. Os pesos corporais e consumo de alimentos são medidos a cada 1 a 2 dias para avaliar a toxicidade bruta. A sobrevivência dos animais é monitorada diariamente. No final do estudo, todos os animais são sacrificados e a patologia clínica e histopatologia nos principais órgãos são executadas. As citotoxinas alvo estão entre as estratégias mais promissoras para a eliminação seletiva de células malignas. Está previsto que o conjugado de folato- XTEN-droga quimioterápico alvo será mais eficaz e menos tóxico do que a droga citotóxica livre sozinha em tumores positivos de receptor de folato.

Exemplo 76: Aplicações clínicas dos conjugados de LHRH-XTEN-droga

[603] A quimioterapia direcionada é uma abordagem moderna com o objetivo de aumentar a eficácia da quimioterapia sistêmica e reduzir os efeitos colaterais. Brentuximab vedotin (Adcentris), aprovado para o linfoma de Hodgkin e linfoma anaplásico sistêmico de células grandes é um exemplo importante de terapia direcionada à toxina eficaz. LHRH é um peptídeo que funciona em órgãos reprodutivos. Como seus receptores são particularmente concentrados em determinados tumores, mas não são expressos em tecido normal, o receptor de LHRH é um alvo ideal para a destruição seletiva de tumores malignos. De fato, ~52% de espécies de câncer de mama, ~80% de câncer no ovário e endométrio, e ~85% de câncer de próstata são direcionáveis por meio do receptor de LHRH. Cumpre salientar que terapias dependentes de LHRH seriam especialmente úteis para tumores de mama negativos triplos, que não superexpressam receptores de estrogênio ou progesterona ou HER2 e não são, portanto, adequadas para o tratamento com muitas drogas direcionadas disponíveis. Pacientes com câncer endometrial, ovariano, ou da próstata avançado, muitas vezes, têm resultados particularmente pobres, assim como estas malignidades podem ser propensas à recorrência e/ou resistentes aos tratamentos atuais. Para respaldar este documento, os estudos clínicos com AEZS-108, doxorrubicina direcionada análoga à LHRH, indicam que cada tipo desses cânceres é suscetível a terapias baseadas em LHRH. A fusão de um XTEN transportando >1 de cópia de LHRH para um portador de XTEN > 3 moléculas da droga para criar um conjugado de peptídeo-droga alvo deverá ter índice terapêutico muito melhor e meia-vida que habilitará a dosagem em níveis abaixo de MTD, reduzirá a frequência de dosagem e custo (droga reduzida necessária por dose).

[604] A avaliação clínica de uma composição de LHRH-XTEN- droga é realizada em pacientes que sofrem de cânceres de mama, endometrial, ovariano, e próstata ou da bexiga. Ensaios clínicos são projetados de modo que a eficácia e as vantagens do conjugado LHRH-XTEN-drogas possam ser verificadas em humanos. Tais estudos em pacientes compreenderiam três fases. Primeiramente, um estudo de farmacocinética e segurança de Fase I seria realizado para determinar a dose tolerada máxima (MTD) e para caracterizar a toxicidade limitante da dose, farmacocinética e farmacodinâmica preliminar em seres humanos. Estes estudos iniciais podem ser realizados em pacientes com cânceres metastáticos ou irressecáveis e para os quais medidas paliativas e curativas padrão não podiam ser usadas ou não eram mais eficazes ou toleradas. Para melhorar a eficácia do tratamento, o status positivo do receptor de LHRH seria um critério de inscrição; determinado pela imunohistoquímica de tumores primários ou espécies metastáticas e/ou agente de imagiologia molecular direcionado ao LHRH. O esquema do estudo da fase I usará doses únicas crescentes do conjugado de LHRH-XTEN-drogas e medirá parâmetros bioquímicos, PK e clínicos. Isso possibilitaria a determinação de MTD e estabeleceria as concentrações limítrofes e máximas na dosagem e na droga circulante que constitui a janela terapêutica para ser utilizada em ensaios da Fase II e da Fase III subsequentes. Ele também define as toxicidades potenciais e eventos adversos a serem rastreados em estudos futuros.

[605] Estudos clínicos de Fase II de pacientes humanos são conduzidos independentemente em pacientes com câncer de endométrio, de ovário, de próstata ou de bexiga ou câncer de mama recorrente avançado (estágio 3 ou 4) positivo do receptor de LHRH O ensaio avalia a eficácia e a segurança do conjugado de LHRH-XTEN-droga sozinho e em combinação com a quimioterapia atual empregada naquela indicação específica. Pacientes recebem candidato clínico de LHRH- XTEN-droga administrado por via intravenosa em um nível de dose e regime pré-determinados na fase I com ou sem o agente quimioterápico padrão. Um estabilizador transversal que compreende o agente quimioterápico mais o placebo é incluído. O ponto de ajuste primário é a taxa de resposta definida pelos Critérios de Avaliação da Resposta em Tumores Sólidos (RECIST). Pontos de ajuste secundários incluem segurança e tolerabilidade, tempo-para-progressão e sobrevivência geral.

[606] O estudo de eficácia e segurança da fase III está estruturado para replicar ou modificar a concepção do ensaio da fase II em pacientes com câncer de mama avançado (resistente, recorrente), do endometrial, ovariano, de próstata ou de bexiga dependendo das observações clínicas da fase II. O refinamento dos critérios de inscrição do paciente, mais a estratificação do paciente (por exemplo, nível de expressão do receptor de LHRH), dosagem, regime, o status de agente quimioterápico padrão, etc. poderiam ser ainda mais ajustados. O ponto de ajuste primário é a sobrevivência sem progressão, medida pelo RECIST, em pacientes definidos como positivos para receptor de LHRH. O ensaio é estatisticamente alimentado pela sobrevivência global como um ponto de ajuste secundário com inscrição projetada superior a 400 pacientes. É avaliada a incidência de eventos adversos, eventos adversos graves e mortes.

[607] Prevê-se que o candidato LHRH-XTEN-droga irá demonstrar atividade anticancerígena sem cardiotoxicidade mesmo nestas populações de pacientes altamente pré- tratados.

Exemplo 76: Aplicações clínicas dos conjugados de folato- XTEN-droga

[608] A quimioterapia direcionada é uma abordagem moderna com o objetivo de aumentar a eficácia da quimioterapia sistêmica e reduzir os efeitos colaterais. Brentuximab vedotin (Adcentris), aprovado para o linfoma de Hodgkin e linfoma anaplásico sistêmico de células grandes é um exemplo importante de terapia direcionada à toxina eficaz. Folato, também conhecido como ácido fólico, vitamina B9, é um nutriente vital exigido por todas as células vivas para a biossíntese de nucleotídeo e função como cofator em determinados caminhos biológicos. É especialmente importante em ajudar na rápida divisão celular e no crescimento. Como tal, o receptor de folato é um foco para o desenvolvimento de terapias para tratar rápidas malignidades divisórias, em especial o câncer de ovário e carcinoma de pulmão de células não-pequenas. É provável que haja reincidência em determinado tipo de tumor após sucessos iniciais com cirurgia e quimioterapia baseada em platina, em relação ao qual o novo crescimento pode se tornar resistente às terapias disponíveis. Embora a expressão do receptor de folato seja insignificante no ovário normal, ~90% dos cânceres ovarianos epiteliais superexpressam o receptor de folato, como fazem muitos adenocarinomas do pulmão, assim, abrindo a possibilidade de terapias dirigidas. Para respaldar esse instrumento, estudos clínicos com EC-145, um alcaloide da vinca alvo análogo do folato, indicam que câncer de ovário e o carcinoma de pulmão de células não-pequenas resistentes à platina são suscetíveis a terapias baseadas em folato. Espera-se que a fusão de um XTEN transportando >1 de cópia de folato para portadoras de XTEN > que 3 moléculas da droga para criar um conjugado de peptídeo-droga aumente o índice terapêutico e a meia-vida que habilitará a dosagem em níveis abaixo da dose tolerada máxima (MTD), reduzirá a frequência de dosagem e o custo (droga reduzida necessária por dose).

[609] A avaliação clínica da composição do folato-XTEN- droga é realizada em pacientes com tumores avançados reincidentes ou refratários ou especificamente em pacientes que sofrem de câncer de ovário e carcinoma de pulmão de células não-pequenas resistentes à platina que falharam usando inúmeros agentes quimioterápicos. Os ensaios clínicos são projetados de modo que a eficácia e as vantagens do conjugado folato-XTEN-drogas possam ser verificadas em humanos. Tais estudos em pacientes compreenderiam três fases. Primeiramente, um estudo de farmacocinética e segurança de Fase I seria realizado para determinar a MTD e para caracterizar a toxicidade limitante da dose, farmacocinética e farmacodinâmica preliminar em seres humanos. Estes estudos iniciais são realizados em pacientes com tumores avançados reincidentes ou refratários e para os quais as medidas curativas ou paliativas padrão não podiam ser usadas ou não eram mais eficazes ou toleradas. Para melhorar a eficácia do tratamento, o status positivo do receptor de LHRH seria um critério de inscrição determinado pela imunohistoquímica de tumores primários ou espécies metastáticas e/ou pelo agente de imagiologia molecular direcionado ao folato. O esquema do estudo da fase I usará doses únicas crescentes do conjugado de folato-XTEN-drogas e medirá parâmetros bioquímicos, PK e clínicos. Isso possibilitaria a determinação de MTD e estabeleceria as concentrações limítrofes e máximas na dosagem e na droga circulante que constitui a janela terapêutica para ser utilizada em ensaios da Fase II e da Fase III subsequentes. Ele também define as toxicidades potenciais e eventos adversos a serem rastreados em estudos futuros.

[610] Estudos clínicos de fase II de pacientes humanos são conduzidos independentemente em população de paciente com câncer ovário resistente à platina positiva do receptor de folato; pacientes que têm carcinoma de pulmão em células não-pequenas e que apresentaram falhas em diversas quimioterapias; e pacientes que sofrem de tumores avançados reincidentes ou refratários. O ensaio avalia a eficácia e a segurança do conjugado de folato-XTEN-droga sozinho e em combinação com a quimioterapia atual empregada na indicação específica. Pacientes recebem conjugado de folato-XTEN- droga administrado por via intravenosa em um nível de dose e regime predeterminado na Fase I com ou sem o agente quimioterápico padrão. Um estabilizador transversal que compreende o agente quimioterápico mais o placebo é incluído. O ponto de ajuste primário é a taxa de resposta definida pelos Critérios de Avaliação da Resposta em Tumores Sólidos (RECIST). Pontos de ajuste secundários incluiriam segurança e tolerabilidade, tempo-para- progressão e sobrevivência geral.

[611] O estudo de eficácia e de segurança de fase III está estruturado para replicar ou modificar a concepção do ensaio de fase III em pacientes com câncer de ovário resistente à platina positiva do receptor do folato; pacientes com carcinoma de pulmão em células não-pequenas; e pacientes com tumor avançado reincidido ou refratário dependendo das observações clínicas da fase III. O refinamento dos critérios de inscrição do paciente, mais a estratificação do paciente (por exemplo, nível de expressão do receptor de folato), dosagem, regime, o status de agente quimioterápico padrão, etc. poderiam ser ainda mais ajustados. O ponto de ajuste primário é a sobrevivência sem progressão, medida pelo RECIST, em pacientes definidos como positivos para receptor de folato. O ensaio será também estatisticamente alimentado pela sobrevivência global como um ponto de ajuste secundário com inscrição projetada superior a 400 pacientes. É avaliada a incidência de eventos adversos, eventos adversos graves e mortes.

[612] Prevê-se que o candidato folato-XTEN-droga irá demonstrar atividade anticancerígena sem cardiotoxicidade mesmo nestas populações de pacientes altamente pré- tratados.Tabela 52: Sequências de Polipeptídeo do marcador de afinidade da sequência de clivagem do X-TEN

Claims (23)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma população homogênea de polipeptídeos compreendendo um polipeptídeo recombinante estendido (XTEN), em que pelo menos 90% das moléculas de peptídeo individuais na dita população possuem um comprimento de sequência idêntico, em que XTEN tem como características: a. o XTEN ser de 36 a 3000 resíduos de L-aminoácidos em comprimento; b. a soma de resíduos de glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P) constitui mais do que 90% dos resíduos de aminoácidos totais do XTEN; e c. a sequência de XTEN compreende um ou mais motivos de sequências selecionados a partir de SEQ ID NOs: 26-55 e um ou mais motivos de sequências selecionados a partir de SEQ ID NOs: 399-407; em que o polipeptídeo da população tem a configuração de fórmula II: (HS)-(CS1)-(XTEN)-(CS2)-(AT1) II em que: (i) HS é uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NOs: 517-526; (ii) AT1 é uma primeira marca de afinidade tendo uma sequência de aminoácidos exibindo afinidade de ligação com um substrato de cromatografia selecionado a partir do grupo consistindo em substrato de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), substrato de troca catiônica, substrato de troca aniônica, substrato de cromatografia de afinidade por íon com metal imobilizado (IMAC), e substrato de anticorpo imobilizado; (iii) CS1 é uma primeira sequência de aminoácidos capaz de ser clivada pela tripsina; (iv) CS2 é uma segunda sequência de aminoácidos capaz de ser clivada pela tripsina; e (v) XTEN é o polipeptídeo recombinante estendido.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o XTEN compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 193-205, 219-258, 267-279, 293-332, 341-350, 361, 362, 364-369, 373, 374, 376, 377, 379-385, e 387-391.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência XTEN compreende pelo menos de 1 a 10 aminoácidos cisteína.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o AT1 é selecionado a partir de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, e SEQ ID NO: 433-447.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o primeiro substrato de cromatografia é IMAC ou substrato de troca catiônica, e o AT1 compreende a sequência HHHHHH (SEQ ID NO: 18) ou HHHHHHHH (SEQ ID NO: 20).

6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que as sequências de aminoácidos CS1 e CS2 independentemente compreendem a sequência RX ou KX, em que X é qualquer L-aminoácido diferente de prolina.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que as sequências de aminoácidos CS1 e CS2 independentemente são selecionadas a partir de SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 471, e SEQ ID NO: 472.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que as sequências de aminoácidos CS1 e CS2 independentemente são SASRSA (SEQ ID NO: 467) ou SASKSA (SEQ ID NO: 468).

9. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que os polipeptídeos da população adicionalmente compreendem uma segunda marca de afinidade selecionada a partir de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, e SEQ ID NOs: 443-447, e em que a segunda marca de afinidade exibe afinidade de ligação com um substrato de cromatografia selecionado a partir do grupo consistindo em substrato de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), substrato de troca catiônica, substrato de troca de aniônica, substrato de cromatografia de afinidade por íon com metal imobilizado (IMAC), e substrato de anticorpo imobilizado.

10. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de ser selecionado a partir das SEQ ID NOs: 659-696, 742-778, 831-874, 927-971, 977, 983, 985, 1087 e 1089.

11. Célula hospedeira procariótica, caracterizada pelo fato de compreender um vetor que compreende o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 10.

12. Método de produzir uma composição compreendendo uma população homogênea de polipeptídeos, o método caracterizado pelo fato de que compreende: a. fornecer uma célula hospedeira procariótica conforme definida na reivindicação 11; b. cultivar a célula hospedeira procariótica sob condições que causam ou permitem que a população de polipeptídeos seja expressa na célula hospedeira procariótica, por meio disso produzindo a população de polipeptídeos; c. adsorver a população de polipeptídeos expressa em um substrato de cromatografia sob condições eficientes para capturar a AT1; d. tratar a referida composição com tripsina sob condições efetivas para clivar as sequências de aminoácidos CS1 e CS2; e e. recuperar o XTEN.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que pelo menos 90% do XTEN recuperado tem um comprimento de sequência idêntico.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de o substrato de cromatografia ser selecionado a partir do grupo consistindo em substrato de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), substrato de troca catiônica, substrato de troca de aniônica, substrato de cromatografia de afinidade por íon com metal imobilizado (IMAC), e substrato de anticorpo imobilizado.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de o substrato de cromatografia ser substrato de cromatografia de afinidade por íon com metal imobilizado (IMAC).

16. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender ligar um primeiro agente de reticulação ao XTEN recuperado, em que o primeiro agente de reticulação é selecionado a partir de N-maleimida, um reagente de iodoacetil, um reagente de dissulfeto de piridil, um reagente de vinil sulfona, ácido 3-propargiloxipropanoico, (oxietil)n-acetileno, onde n é 1-10, dibenzilciclo-octina (DBCO), ciclo-octina (COT), ácido 3-azida-propiônico, ácido 6-azida-hexanoico, e (oxietil)n- azida, onde n é 1-10.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o primeiro agente de reticulação é conjugado ao XTEN em uma localização selecionada do grupo que consiste em: a. um grupo alfa-amino de um resíduo de aminoácidos de N-terminal do XTEN; e b. um grupo tiol de cada resíduo de cisteína do XTEN.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o primeiro agente de reticulação é N-maleimida.

19. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender conjugar uma primeira carga útil ao primeiro agente de reticulação por um único resíduo de átomo da primeira carga útil, em que o resíduo é selecionado a partir do grupo consistindo em carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a primeira carga útil é selecionada de doxorrubicina, paclitaxel, monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F, maitansina, maitansinoide DM1, maitansinoide DM4, caliqueamicina, desacetilvinblastina mono-hidrazida, camptotecina, mitomicina C, epotilona, hTNF, IL-12, bortezomib, Ranpirnase, Pseudomonas exotoxina, SN-38, rachelmicina, inibidor de m-TOR, rapamicina, tubulisina B, tubulisina M, e duocarmicina.

21. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que adicionalmente compreende conjugar uma carga útil ao primeiro agente de reticulação, em que a carga útil é selecionada a partir de doxorrubicina, paclitaxel, monometil auristatina E, monometil auristatina F, maitansina, maitansinoide DM1, maitansinoide DM4, caliqueamicina, desacetilvinblastina mono-hidrazida, camptotecina, mitomicina C, epotilona, hTNF, IL-12, bortezomib, Ranpirnase, Pseudomonas exotoxina, SN-38, rachelmicina, inibidor de m-TOR, rapamicina, tubulisina B, tubulisina M, e duocarmicina.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender conjugar uma porção de direcionamento ao N-terminal do XTEN, em que a porção de direcionamento é um peptídeo, proteína, andaime tipo anticorpo, anticorpo, ou fragmento de anticorpo, e em que o primeiro agente de reticulação é conjugado ao grupo tiol de um resíduo cisteína do XTEN.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a porção de direcionamento é um anticorpo ou fragmento de anticorpo.