KR20230022949A - Glp1r 작용제 nmdar 길항제 접합체 - Google Patents

Glp1r 작용제 nmdar 길항제 접합체 Download PDF

Info

Publication number
KR20230022949A
KR20230022949A KR1020237000201A KR20237000201A KR20230022949A KR 20230022949 A KR20230022949 A KR 20230022949A KR 1020237000201 A KR1020237000201 A KR 1020237000201A KR 20237000201 A KR20237000201 A KR 20237000201A KR 20230022949 A KR20230022949 A KR 20230022949A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
glp
conjugated
nmdar
nmdar antagonist
Prior art date
Application number
KR1020237000201A
Other languages
English (en)
Inventor
크리스토퍼 클레멘슨
앤더스 부 클레인
요나스 오드가르드 피터슨
벤테 플렌스보리 프뢸룬드
크리스티안 스트룀가르드
Original Assignee
쾨벤하운스 유니버시테트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 쾨벤하운스 유니버시테트 filed Critical 쾨벤하운스 유니버시테트
Publication of KR20230022949A publication Critical patent/KR20230022949A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/286—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against neuromediator receptors, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

본 발명은 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1) 수용체에서 천연 GLP-1 대비 적어도 0.1% 활성을 보이는 펩티드 및 N-메틸-D-아스파르테이트 수용체(NMDAR) 길항제를 포함하는 접합된 분자에 관한 것이며, 펩티드는 직접 또는 화학적 링커를 통해 NMDAR 길항제에 공유 결합되고, 본 발명은 치료 요법에 사용하기 위한 용도를 가진 접합된 분자, 접합된 분자를 포함하는 약학 조성물, 포유동물에게 접합된 분자를 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 체중 감소 방법, 포유동물에게 접합된 분자를 경구 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 체중 감소를 위한 비치료적 요법에 관한 것이다.

Description

GLP1R 작용제 NMDAR 길항제 접합체
본 발명은 일반적으로 치료학적 접합체(conjugates) 분야에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1) 수용체 활성 및 N-메틸-D-아스파르테이트 수용체(NMDAR) 길항제(antagonist)를 갖는 접합체에 관한 것이다.
비만은 풍요로운 사회에서 인간 및 개, 고양이와 같은 가정동물에게 가장 널리 퍼진 영양 질환으로, 영양 결핍 질환의 수를 훨씬 능가한다. 비만 치료 수술(bariatric surgery)의 대안으로서 비만 치료를 위한 체중 감소 약물을 생성하려는 많은 시도가 있었다. 이로 인해, 장에서 리파아제 억제제로 작용하여 지방 흡수를 방지하거나, 시상하부에서 선택적 세로토닌 수용체 2C 효능 작용(agonism)을 통해 음식 섭취를 억제하는 약물이 만들어졌다.
글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1)은, 프로글루카곤(proglucagon) 펩티드의 조직 특이적 번역후(posttranslational) 과정에서 유도된(derived) 30 또는 31개 아미노산 길이의 펩티드 호르몬이다. GLP-1 유사체는 뇌의 식욕 조절 센터에 작용하므로, 최근의 적응증(indication)은 체중 감소를 위한 것이다. GLP-1은 식욕 조절에 관여하는 중추신경계(CNS)에 영향을 미칠 뿐만 아니라 위장관에도 작용하기 때문에 식욕 및 체중 유지와 관련이 있다. 또한 인간의 위 배출 및 장 운동을 지연시켜 음식 섭취 조절에 기여할 수 있다. 대사 질환의 치료를 위한 GLP-1 기반 요법은 선행 기술로부터 공지되어 있다. Parlevliet et al. (J Pharmacol Exp Ther. 2009 Jan; 328(1):240-8)" 및 관련 특허 출원 EP1968645 A2, EP2125003 A2, 및 EP1843788 A2는, 비만 및 비만 관련 질환 치료를 위한 GLP-1 펩티드를 포함하는 인간 GLP-1 Mimetibody™의 용도를 설명한다. 보다 구체적으로, Parlevliet et al. (2009)은 고지방식 급여 마우스에서 체지방 감소로 인해 음식 섭취량 및 체중을 감소시킬 수 있는 특정 GLP-1 CNTO 736을 설명한다.
NMDAR 길항제는 NMDA 수용체의 작용을 억제함으로써 작용하며, NMDAR 길항 작용이 식욕 감소 및 체중 유지와 관련이 있을 수 있다는 전임상 증거가 존재한다. Deng et al.(2019, Frontiers in Psychiatry, 10, Article 15)에서는 NMDAR 길항제인 메만틴 염산염(memantine hydrochloride)을 사용하여, 고지방식으로 유발된 비만 쥐의 체중 감소를 일으켰음을 설명한다. Smith et al.(Neuropsychopharmacology (2015) 40, 1163-1171)은, 선호도가 높은(highly palatable) 고당도의 식이를 급여한 랫드(rats)에서 선택적으로, 메만틴이 폭식과 유사한 행동(binge-like eating) 을 용량 의존적으로 감소시키고 음식을 찾는 행동과 강박적인 식사를 완전히 차단할 수 있다고 설명한다. 또한, Popik et al.(Amino Acids (2011) 40:477-485)은 랫드에게 만성적으로 투여된 메만틴 염산염이 선호도가 높은 사료의 섭취량을 선택적으로 감소시킬 수 있으며 표준 식이의 섭취량에 대한 영향은 더 적었고, 이러한 효과가 치료 후에도 지속된다고 설명한다.
인간의 폭식 장애 치료에 있어서 메만틴의 효과 또한 보고되었다. Hermanussen과 Tresguerres(Economics and Human Biology 3 (2005) 329-337)는, 5명의 비만 여성을 대상으로 한 시험적 치료에서 메만틴 치료가 첫 24시간 이내에 현저한 식욕 감소 및 폭식 장애 억제로 이어질 수 있으며, 며칠 내에 체중을 감소시킨다고 보고한다. Brennan et al.(Int J Eat Disord 2008; 41:520-526)은, 12주 동안 메만틴을 매일 투여하면 인간 피험자의 폭식증을 개선할 수 있음을 보여주는 예비 연구를 설명한다.
보다 더 큰 효능, 높은 안전성(낮은 독성학적 효과)을 가지며 편리하고 안전한 투여 옵션을 제공하는 새로운 체중 감량 치료법에 대한 필요가 늘어나고 있다.
따라서, 상술한 내용의 관점에서, 본 발명의 목적은 비만인 인간 대상에서 음식 섭취량 및 체중을 감소시키기 위한 효과적이고 안전한 치료제를 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명의 제1 양태는, GLP-1 수용체에서 천연(native) GLP-1 대비 적어도 0.1% 활성을 보이는 펩티드 및 N-메틸-D-아스파르테이트 수용체(NMDAR) 길항제를 포함하는 접합 분자에 관한 것이며, 상기 펩티드는 직접 또는 화학적 링커(linker)를 통해 NMDAR 길항제에 공유 결합된다.
본 발명자들은 놀랍게도 GLP-1 수용체 효능 작용 및 NMDAR 길항 작용을 가진 펩티드의 접합(conjugation)이 비만을 효과적으로 호전시키기 위한 신규한 의약적 전략을 나타낸다는 점을 발견하였다. 이러한 전략에 기반한 접합체는, 도 3 내지 13에 도시된 바와 같이, 음식 섭취 억제에 있어 GLP-1 펩티드, 메만틴, 또는 MK801 단독 물질과 비교할 때 더 우수하다. 또한, GLP-1 펩티드 변이체(variants)에 기반한 접합체, 예를 들어 GLP-1/위 억제 폴리펩티드(GIP) 펩티드(SEQ ID NO:9) 및 대안적인 NMDAR 길항제는 음식 섭취 및 체중 감소에 있어 유사한 유익한 효과를 갖는다. 이는 도 33 내지 34 및 도 36 내지 38에 각각 도시된 바와 같이 GLP-1/GIP 공작용제(co-agonist) 및 NMDAR 길항제 네라멕산(neramexane)을 시험하여 추가 발견한 결과에 의해 뒷받침된다. 더불어, 상기 접합체는 체중 감소에 대한 NMDAR 길항 효과는 얻는 반면, NMDAR 길항 작용의 중추 신경계 효과는 본 전략에 의해 회피된다. 특정 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 GLP-1 수용체에 대한 펩티드의 친화성(affinity)으로 인해 체내 GLP-1 수용체 사이트(site) 및/또는 그 부근에 축적되는 NMDAR 길항제에 의해 이러한 효과가 달성된다고 추측한다.
펩티드는 아미노 말단 및 카르복실 말단을 가질 것이다. 본 발명의 맥락에서, 아미노 말단 및 카르복실 말단은 또한 각각 N-말단 및 C-말단, 그리고 이에 상응하는 파생된 용어로 지칭될 수 있다.
펩티드는, 유전 코드에 의해 부호화된 아미노산으로 구성되거나, 유전 코드에 의해 부호화된 아미노산 및 히드록시프롤린(hydroxyproline), γ-카르복시글루타메이트(γ-carboxyglutamate), 오르니틴(ornithine), 포스포세린(phosphoserine), D-알라닌(dAla), 및 D-글루타민과 같이 유전 코드에 의해 부호화되지 않은 자연적(natural) 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 펩티드는 D-알라닌 및 D-류신, 또는 a-아미노이소부티르산(Aib), d-세린(dSer), N-메틸-세린과 같은 합성 아미노산을 포함할 수 있다.
바람직한 일 실시예에서, 펩티드 내 2번 위치(N-말단에서부터 셈) 상의 아미노산은 dSer, dAla, Aib, 글리신, N-메틸-Ser, 또는 발린(valine)이다.
펩티드는 또한, N-말단에서부터 세었을 때 펩티드의 15번 위치 상의 글루탐산(glutamic acid) 및 20번 위치 상의 리신(lysine) 사이의 고리화(cyclisation)와 같이, 2차 구조를 안정화하기 위한 하나 이상의 변형을 가질 수 있다.
펩티드는 임의의 공급원으로부터 얻을 수 있고, 또는 원하는 방식대로 생산될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 조직으로부터 분리되거나, 재조합적으로(recombinantly) 생성되거나, 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 합성될 수 있다.
접합된 분자는 펩티드를 포함하며, 상기 펩티드는, (유리 형태에서) GLP-1 수용체에서 천연 GLP-1 대비 적어도 0.1% 활성을 보인다. 본 발명의 맥락에서, GLP-1 활성화(GLP-1R 활성)로도 지칭될 수 있는 GLP-1 수용체 활성은, GLP-1 수용체가 과발현(over-expressing)되는 HEK293 세포에서 cAMP 유도를 측정함으로써 체외(in vitro) 분석법에 따라 측정될 수 있다. 구체적으로, GLP-1 수용체를 부호화하는 DNA와 cAMP 반응 요소에 연결된 루시페라아제(luciferase) 유전자(리포터 분석법)를 공동 형질주입(co-transfection)시킨 HEK293 세포를 사용할 수 있다. 분석은 Bech et al. (J. Med. Chem. 2017, 60, 17, 7434-7446)에 설명된 바와 같이 수행될 수 있다. 이 분석법을 사용하여, 각 접합체에서의 GLP-1R 활성을 측정하고, 동일한 분석법으로 천연 GLP-1(SEQ ID NO:1) 펩티드에 의해 얻은 활성과 비교하여 나타낼 수 있다. 일 실시예에서, 접합체의 펩티드는 천연 GLP-1 대비 적어도 1% 활성을 보이며, 예컨대 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 30% 활성을 보인다.
NMDAR 길항제는 NMDAR에 결합할 것이고, NMDAR 길항제는, 예를 들어 NMDAR 길항제의 유리 형태(free form)에서 특정 NMDA 수용체와 해리 상수 Kd를 가질 것으로 설명될 수 있다. NMDAR 길항제는 일반적으로 나노몰 범위의 해리 상수를 가지며, 예를 들어 서로 다른 종(species)의 NMDA 수용체와 MK801의 해리 상수는, 랫드의 뇌막에서 Kd = 6.3nM이고, 마우스의 뇌 균질액(brain homogenates)에서 Kd = 10nM이고, 돼지 뇌에서 Kd 1.3nM이다. 해리 상수의 측정은 당업자에게 잘 알려져 있다. 일 실시예에서, 유리 형태의 NMDAR 길항제는 NMDA 수용체와 0.5nM에서 1000nM까지의 범위 내, 예를 들어 0.5nM에서 100nM까지의 범위 내의 해리 상수 Kd를 가진다. NMDA 수용체는, 예를 들어 인간 NMDA 수용체일 수 있으며, 예컨대, NMDAR 길항제는 인간 NMDA 수용체와 0.5nM에서 100nM까지의 범위 내의 Kd를 갖는다. 본 발명의 맥락에서, 유리 형태의 NMDA 수용체 길항제는, 어떤 화학적 그룹(chemical group)에도 결합되지 않은(특히 화학적으로 연결되지 않은) 길항제를 말하며, 따라서 천연의 변형되지 않은 형태이다. 당업자는 NMDA 수용체 간에 종에 따른 경미한 변화만이 예상된다는 것을 인식할 것이다. 이에 따라 마우스나 랫드와 같은 설치류에 대하여 측정된 Kd 값 또는 돼지와 같은 고등 포유동물에 대하여 측정된 Kd 값은, 인간 NDMA 수용체 또는 기타 관련된 동물 또는 포유류 NMDA 수용체에 대하여 측정된 Kd 값과 유사할 것으로 예상된다.
접합된 분자의 펩티드는, GLP-1 수용체에서 천연 GLP-1 대비 적어도 0.1% 활성을 갖는 임의의 펩티드일 수 있다. 일 실시예에서, 접합체의 펩티드는 글루카곤-수퍼패밀리(glucagon-superfamily)의 것이다. 글루카곤-수퍼패밀리는 N-말단 및 C-말단 영역의 구조에 있어서 서로 관련된 펩티드 군이다(예: Sherwood et al., Endocrine Reviews 21: 619-670 (2000). 본원에 참조에 의해 포함됨). 해당 군의 구성원은 모든 글루카곤 관련 펩티드뿐만 아니라 성장 호르몬 방출 호르몬(SEQ ID NO:2), 혈관활성 장 펩티드(SEQ ID NO:3), 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라아제-활성화 폴리펩티드 27(SEQ ID NO: 4), 세크레틴(SEQ ID NO:5), 위 억제 폴리펩티드(GIP)(SEQ ID NO:6), 엑센딘-4(Exendin-4, SEQ ID NO:7), 변형되지 않은(unmodified) GLP-1(SEQ ID NO:8), GLP-1/GIP 공작용제(GLP-1/GIP co-agonist, SEQ ID NO:9), 및 천연 펩티드에 대하여 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산 변형을 갖는 유사체, 유도체 또는 접합체를 포함한다. 이러한 펩티드는, 바람직하게는, 글루카곤 수용체 수퍼패밀리의 수용체, 바람직하게는 GLP-1 수용체와 (작용제로서)상호작용하는 능력을 보유한다. 접합된 분자의 펩티드는, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, 또는 SEQ ID NO:5에 대해 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 또한, 접합된 분자의 펩티드는, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, 또는 SEQ ID NO:9에 대해 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 특정 실시예에서, 접합된 분자의 펩티드는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, 또는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는다. 다른 특정 실시예에서, 접합된 분자의 펩티드는 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, 또는 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시예에서, 본 발명의 펩티드는 엑세나티드(exenatide), 리라글루티드(liraglutide), 릭시세나티드(lixisenatide), 알비글루티드(albiglutide), 둘라글루티드(dulaglutide), 또는 세마글루티드(semaglutide)이다.
또한, 글루카곤 수용체 수퍼패밀리의 서로 다른 수용체에 결합하는 능력을 보이는 공작용제 활성을 갖는 펩티드가 고려된다. 일 실시예에서, 이러한 공작용제는 GLP-1/GIP 수용체 공작용제이다. SEQ ID NO:9의 공작용제 및 NMDAR 길항제에 기반한 접합된 분자의 음식 섭취량 및 체중에 대한 효과는 도 33 내지 34에 도시되어 있다.
일 실시예에서, 접합체의 펩티드는 SEQ ID NO:1에 대해 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 펩티드는 SEQ ID NO:1에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%의 동일성을 갖거나, 또는 약 97%를 초과하는 동일성을 가질 수 있다. 특정 일 실시예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 펩티드는, GLP-1 수용체에서의 천연 GLP-1과 비교하여 GLP-1 수용체에서 훨씬 더 큰 GLP-1 활성을 가질 수 있다. 이와 같이, 펩티드는 NMDAR 길항제에 접합되는 경우 GLP-1 수용체 사이트에 더 큰 속도로 축적될 수 있으며, 이는 NMDAR 길항제의 보다 큰 효능으로 이어질 수 있다. SEQ ID NO:1에 대하여 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 접합체의 펩티드의 예가 도 35에 도시되어 있으며, 이 펩티드의 효과는 도 33 내지 도 34에 의해 뒷받침된다. GLP-1/GIP Pen40/MK801(SEQ ID NO:9에 따른 펩티드) 및 GLP-1 Pen40/MK801(SEQ ID NO:1에 따른 펩티드) 사이의 일치도는 아래에 더 예시된다.
Figure pct00001
접합된 분자의 펩티드는, 펩티드(자유 형태)가 GLP-1 수용체에서 천연 GLP-1 대비 적어도 0.1% 활성을 보이기에 충분한 길이를 가질 것이다. 이는 일반적으로 적어도 10개의 아미노산을 포함하는 펩티드에서 관찰될 수 있지만, 펩티드가 60개 이상의 아미노산을 포함하는 경우 활성을 나타내지 않을 수 있다. 따라서, 일 실시예에서, 펩티드는 10개에서 60개까지의 범위 내, 예를 들어 20에서 50개까지의 아미노산 길이를 갖는다. 다른 펩티드 서열과 일정 백분율만큼 동일한 본 발명의 아미노산 서열은, 당업자에 의한 서열의 수동 평가 또는 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)와 같은 알고리즘을 사용한 컴퓨터 자동 서열 비교 및 식별에 의하여 해당 펩티드의 추정적 식별(putative identification)이 가능하도록, 충분한 길이의 펩티드 아미노산 서열(예: 적어도 10개 아미노산)을 포함해야 한다(Altschul, et al., Meth Enzymol. 266: 460, 1996 및 Altschul, et al., Nature Genet. 6: 119, 1994 참조).
본 발명의 맥락에서, 펩티드는 자연 또는 합성 아미노산의 삽입 또는 치환, 및/또는 아미노산 결실(deletion)을 가짐으로써 %-동일성이 상이할 수 있다. 일 실시예에서, 접합체의 펩티드는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시예에서, 펩티드는 아세틸화(acetylation), 지방산 접합, 이산(diacid) 접합, 알부민 접합, 소분자-알부민 바인더(binder), 및/또는 PEG 접합에 의해 변형된다. 또한, 항체와 같은 운반 단백질(carrier protein)에 연결됨으로써 변형된 펩티드가 고려된다. 변형은 바람직하게는 펩티드의 16, 17, 20, 21, 24, 29, 40번 위치(N-말단에서부터 셈), C-말단 영역 내, 또는 C-말단 아미노산에 있다. 접합은, 디설파이드, 말레이미드(maleimide), 알파-케톤과 같은 임의의 적합한 링커에 의해, 또는 클릭 화학(click-chemistry) 기반 접합에 의해 이루어질 수 있다. 당업자는 이러한 접합체를 제조하는 방법을 알고 있다. 바람직하게는, PEG 분자는 1kDa보다 클 수 있고, 지방산 및 이산은 12개 이상의 탄소 원자를 함유할 수 있다. 변형(PEG/지방산/이산)과 펩티드 사이에는 스페이서(spacer)를 첨가하는 것이 일반적으로 바람직하며, 링커는 바람직하게는 짧은 PEG 사슬인 감마-Glu 링커이다.
접합된 분자는 NMDAR 길항제를 포함한다. 임의의 NMDAR 길항제가 접합체와 함께 사용될 수 있다. 그러나 NMDAR 길항제는, 예를 들어 최대 900kDa인 소분자인 것이 바람직하다. 예를 들어, 일 실시예에서, NMDAR 길항제는 MK801, 메만틴, 케타민(ketamine), 펜시클리딘(phencyclidine, PCP), 네라멕산(neramexane), 및 아만타딘(amantadine)으로부터 선택된다. MK801, 네라멕산, 및 메만틴이 바람직하다. MK801 및 메만틴 또한 바람직하다. 네라멕산은 메만틴 관련 화합물의 비제한적인 예이며, 네라멕산의 효과는 도 36 내지 38에 도시된다.
본 발명의 펩티드 및 NMDAR 길항제는 공유 결합된다. 본 발명의 맥락에서, 접합된 분자는 또한 펩티드-약물-접합체(peptide-drug-conjugate, PDC)로 지칭될 수 있다. 펩티드 및 NMDAR 길항제는 서로 직접 결합될 수 있다. 예를 들어, NMDAR 길항제는 아미드 결합을 통해 공유적으로 결합될 수 있으며, 아미드 결합은 NMDAR 길항제 상의 아미노기에서 펩티드 상의 카르복실산기로 결합된다. 이러한 아미드 결합은, 글루탐산 잔기(residue), 아스파르트산 잔기, 카르복실산기를 갖는 합성 잔기, 또는 C-단말의 카르복실산기와 같이, 펩티드 상의 카르복실산기를 가진 임의의 잔기에 이루어질 수 있다. 예를 들어, NMDAR 길항제가 MK801인 경우, MK801의 아민은 펩티드의 아미노산 잔기의 카르복실산에 결합될 수 있다. 이에 대응되게, NMDAR 길항제가 메만틴인 경우, 메만틴의 아민은 펩티드의 아미노산 잔기의 카르복실산에 결합될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 직접적으로 공유 결합된다는 것은 펩티드가 NMDAR 길항제와 공유 결합된다는 것을 의미하며, 예컨대 두 분자 사이에 링커 그룹(linker group)과 같은 추가적인 화학적 그룹이 없다. 펩티드와 NMDAR 길항제는 화학적 링커를 통해 결합될 수도 있다. 임의의 화학적 링커가 사용될 수 있다. 그러나, 일반적으로 화학적 링커는 최대 원자 30개의 길이를 갖는 것이 바람직하다. 긴 사슬은 NMDAR 길항제가 펩티드로부터 거리를 두게 하여, 이로 인해 펩티드가 GLP-1 수용체와 상호작용할 때 NMDAR 길항제가 펩티드에 대하여 입체 장애(steric hindrance)를 거의 또는 전혀 일으키지 않도록 하는 이점을 가질 수 있다. 펩티드의 입체 장애가 없거나 적으면 GLP-1 수용체에 대한 친화력이 더 커질 수 있다. GLP-1 수용체에 더 큰 친화성을 갖는 접합체는 GLP-1 수용체 사이트에 더 많이 축적될 가능성이 있다. 화학적 링커는 바람직하게는 산-절단 가능(acid-cleavable) 링커, 효소-절단 가능(enzyme-cleavable) 링커, 펩티드-절단 가능 링커, 또는 디설파이드 링커와 같은 절단 가능한 링커이며, 이들은 일반적으로 펩티드-약물 접합체에서의 사용에 있어 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 절단 가능한 링커의 예로는, 글루쿠로니드(glucuronide), 베타-갈락토시드(beta-galactoside), 디설파이드, 히드라존(hydrazone)을 포함하는 화합물 및/또는 갈락토시다아제(galactosidases), 글루쿠로니다아제(glucuronidases), 피로포스파타아제(pyrophosphatases), 포스파타아제(phosphatases), 아릴설파타아제(arylsulfatases), 프로테아제(proteases), 또는 에스테라아제(esterases)에 의해 절단 가능한 화합물이 있다. 예를 들어, 링커는 GFLG와 같이 카텝신(cathepsin)에 의해 절단 가능한 펩티드를 포함할 수 있다. 링커는, 아미드 또는 카바메이트(carbamate) 결합을 통해 NMDAR 길항제의 아미노기에 공유 결합될 수 있는 4-아미노벤조산(PAB)을 더 포함할 수 있다. 링커는 바람직하게는 유리 형태(즉, 천연 형태)로 NMDAR 길항제를 방출하며, 이는 본원에 개시된 디설파이드 링커와 같은 다양한 링커 화학(linker chemistries)에 의해 달성될 수 있다. 이러한 링커 화학 및 추가적인 링커 화학은 당업자에게 잘 알려져 있다.
일 실시예에서, NMDAR 길항제는 펩티드의 C-말단 영역에 공유 결합된다. 본 발명의 맥락에서, C-말단 영역은 C-말단에서부터 세어진 최대 50%의 아미노산에 해당할 수 있으며, 예를 들어, C-말단에서부터 세어진 최대 40%, 30%, 25%, 20%, 또는 10%의 아미노산일 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO:1의 C-말단 영역은 아미노산 21번 내지 40번, 26번 내지 40번, 또는 31번 내지 40번(N-말단에서부터 세는 번호)일 수 있다. 따라서, NMDAR 길항제, 예를 들어 메만틴 또는 MK801은, 직접적으로 또는 링커를 통해 C-말단에서부터 세어진 10개의 아미노산 중 임의의 하나에 결합될 수 있다. 예를 들어, 메만틴 또는 MK801과 같은 NMDAR 길항제는 C-말단으로부터 5개 아미노산 이내에 해당하는 아미노산에 직접 결합될 수 있다. 따라서 NMDAR 길항제는 펩티드의 N-말단에서 입체 장애를 거의 또는 전혀 일으키지 않는다. N-말단이 GLP-1 수용체에 대한 결합에 관여하기 때문에, N-말단에서의 입체 장애가 없거나 적으면 GLP-1 수용체에 대하여 보다 큰 친화성을 제공할 수 있다. GLP-1 수용체에 대하여 보다 큰 친화성을 갖는 접합체는 GLP-1 수용체 사이트에 더 많이 축적될 가능성이 있다. 또한 둘 이상의 NMDAR 길항제가 동일한 펩티드 분자에 결합될 수 있다는 점도 고려된다.
다른 매우 바람직한 일 실시예에서, NMDAR 길항제는 디설파이드기를 포함하는 화학적 링커를 통해 펩티드에 공유 결합된다. 디설파이드기는 NMDAR 길항제가 화학적으로 환원될 때 펩티드로부터 방출되도록 한다. 디설파이드 링커라고도 알려진, 디설파이드기를 포함하는 화학적 링커는, 접합체의 전신 순환 중 장시간동안 펩티드 및 NMDAR 길항제가 접합된 상태로 유지되도록 한다. 디설파이드 링커의 디설파이드기는 세포내의 환경과 같은 환원 환경에서 환원되어, 이에 따라 접합체가 절단되고 접합체의 펩티드 부분이 접합체의 NMDAR 길항제 부분으로부터 분리되도록 할 수 있다. 환원은, 예를 들어, 글루타티온(glutathione)과 같은 티올(thiol), 또는 세포내 단백질 디설파이드-이성화 효소(intracellular protein disulfide-isomerase enzymes)와 같은 환원 효소와의 디설파이드 교환을 통해 이루어질 수 있다. 화학적 링커는, 일반식 R'-S-S-R''을 갖는 당업계에 공지된 화학적 링커로부터 선택될 수 있으며, 이때 R' 및 R'' 기는 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 실험에 따르면, 디설파이드기를 포함하는 화학적 링커를 통해 접합된 펩티드와 NMDAR 길항제의 접합체가 도 3에서 나타난 바와 같이 약 0.5 내지 13시간의 인간 혈장 절단 반감기(human plasma cleavage half-time)를 가진다. 유리하게는, 체내에서 접합체는 GLP-1 수용체에 대한 펩티드의 친화성으로 인해 GLP-1 수용체 사이트 및/또는 그 부근에 축적될 수 있고, NMDAR 길항제는 GLP-1 수용체 사이트 및/또는 그 부근에서 방출될 수 있다. 접합체의 펩티드 부분으로부터 분리되었을 때, NMDAR 길항제는 사이트-특이적(site-specific) NMDAR 결합(binding)으로서 적절한 효과를 가질 수 있다. 본 발명자들은, GLP-1 수용체를 보유하는 세포에 바로 인접한 세포외(extracellular) 환경에서 접합체가 절단될 수 있거나, GLP-1 수용체를 보유하는 세포에 의해 접합체가 내재화(internalized)된 후 세포의 환원 환경에서 절단될 수 있다고 추측한다.
일 실시예에서, 접합된 분자는 화학적 링커를 통해 접합되며, 화학적 링커는 화학식 R1-R3-S-S-R4-R5-O-CO-R2를 가지고, 여기서 R1은 펩티드이고, R2는 NMDAR 길항제이고, R3은 선택적이며, 존재하는 경우 C(CH3)2, CH2-CH2, 또는 CH2 중에서 선택되며 펩티드의 측쇄(side chain)에, 또는 펩티드 주쇄(backbone chain)의 탄소 원자에 결합되고, R4는 (CH2)n 또는 C6H4이고, R5는 선택적이며, 존재하는 경우 C(CH3)2, CH2-CH2, 또는 CH2 중에서 선택되며 n은 1, 2 또는 3이다. 화학적 링커가 환원되면 접합체의 유리된 NMDAR 길항제 부분에는 분자 내 고리화(intramolecular cyclisation)가 일어나 NMDAR 길항제를 유리 형태로 방출한다(도 1b 참조).
일 실시예에서, 화학적 링커는 화학식 R1-R3-S-S-(CH2)n-O-CO-R2를 가지며, 여기서 R1은 펩티드이고, R2는 NMDAR 길항제이고, R3은 선택적이며 존재하는 경우 C(CH3)2, CH2-CH2, 또는 CH2중에서 선택되고 펩티드의 측쇄에, 또는 펩티드 주쇄의 탄소 원자에 결합되며, n은 1, 2, 또는 3이다.
일 실시예에서, 화학적 링커는 화학식 R1-R4-R3-S-S-(CH2)n-O-CO-R2를 가지며, 여기서 R1은 펩티드이고, R2는 NMDAR 길항제이고, R3은 선택적이며 존재하는 경우 C(CH3)2, CH2-CH2, 또는 CH2중에서 선택되고 펩티드의 측쇄에, 또는 펩티드 주쇄의 탄소 원자에 결합되며, R4는 선택적이며 존재하는 경우 CH(CH3)2, CH2-CH2, 또는 CH2중에서 선택되고 펩티드의 측쇄에, 또는 펩티드 주쇄의 탄소 원자에 결합되고, n은 1, 2, 또는 3이다.
일 실시예에서, 제2 라디칼 결합(radical bond)은 본 발명의 펩티드의 주쇄에 대한 결합이다.
다른 일 실시예에서, 제2 라디칼 결합은 본 발명의 펩티드의 측쇄에 대한 결합이다.
본 발명의 맥락에서, R1이 펩티드의 주쇄에 결합될 때, C(CH3)2(L-페니실라민)은 Pen으로 지칭될 수 있고, CH2-CH2(L-호모시스테인)은 hCys로 지칭될 수 있으며, CH2(L-Cysteine)는 Cys로 지칭될 수 있다(도 1a 참조).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 제1 및 제2 라디칼 결합은 본 명세서에 개시된 화학적 링커에서 적어도 2개의 자유 결합의 존재를 나타내기 위해 사용된다.
본 발명은 화학적 링커를 통해 부착된 펩티드와 NMDAR 길항제를 포함하는 접합된 분자 라이브러리(library)의 설계 및 합성을 용이하게 한다. 도 1에서는, 이러한 접합된 분자가 어떻게 설계될 수 있는지 도시된다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 접합체는 NMDAR 길항제(도 1에서 MK801)를 펩티드에 화학적으로 결합시켜 제조할 수 있다. 당업자는 여러 다양한 화학적 링커가 본 명세서에 개시된 방법 및 문헌에 보고된 다른 방법에 의해 제조될 수 있고, 이러한 화학적 링커가 본 명세서에 개시된 방법 또는 다른 공지된 기술에서 보고된 바에 따라 펩티드와 NMDAR 길항제를 부착하는 데 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명자들은 놀랍게도, 본 발명의 펩티드가 체중 감소 약물 및 표적화제(targeting agent)로서의 이중기능적 역할을 할 수 있으며, NMDAR 길항제와 같은 비특이적(non-specific) 소분자를, 시상하부 핵, 맨아래구역(area postrema), 고립로핵(nucleus of the solitary tract), 및 복측 피개부(ventral tegmental area)등이 있지만 이에 국한되지는 않는 섭식을 관장하는 뇌의 영역으로 사이트-선택적(site-selective) 전달을 가능하게 함을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 접합된 분자는 음식 섭취를 관장하는 뇌 영역에서 글루탐산성 신호(glutamatergic signaling)를 선택적으로 조절하는 한편, 뇌 전체에 걸쳐 자유롭게 신호 전달을 하는 것은 우회하는 수단을 제공한다. 본 발명의 펩티드의 표적 특성은 또한, 내분비 췌장과 같은 다른 사이트로의 NMDAR 길항제 전달을 용이하게 할 수 있음이 이해된다.
본 명세서에 개시된 접합 분자는 선택성을 제공하고, 또한 표적 영역에서 약물 작용을 집중시킨다. 접합된 분자에 의해 가능해진 이러한 표적화는 개선된 치료 지수, 즉 더 낮은 최소 유효 농도를 가능하게 한다. 또한, 결합은 GLP-1 수용체 표적 약물의 효능에 대사 약물 작용의 또 다른 층을 추가할 수 있게 한다. NMDAR의 조직 선택적 표적화는 섭식 행동 관리에 이용될 수 있으며, 더 낮은 체중 설정값에서 재경화(reconsolidated)된 시냅스 가소성(synaptic plasticity)으로 인한 치료 중단 이후의 재발을 약화시킬 수 있다.
본 발명자들은 식욕, 음식 섭취량, 및 체중에 대한 본 발명의 접합체의 놀라운 상승 효과를 입증하였으며, 이는 펩티드 또는 약물의 단독 투여로 얻은 효과와 비교하여 유의하게(significantly) 더 크다(도 4 내지 14 참조). 본 발명의 접합체의 놀라운 상승 효과는, 도 21 내지 28, 도 33 내지 34, 및 도 36 내지 38에서 확인되는 바에 의해 더 뒷받침된다.
본 발명자들은 음식 보상(food reward) 및 포만감에 대한 본 발명의 접합체의 놀라운 상승 효과를 추가로 입증하였고, 이는 펩티드 또는 약물의 단독 투여로 얻은 효과와 비교하여 유의하게 더 크다(도 31 참조).
더불어, 본 발명의 접합체의 상승 효과는 당뇨병 환자의 치료와 관련이 있는 것으로 입증되었다(도 32 참조).
따라서, 본 발명의 접합체의 투여는 비만 동물의 음식 섭취량 및 체중의 예상치 못한 감소를 초래한다.
본 발명의 실시예에서, 접합된 분자는 치료 요법에 사용하기 위한 것이다.
일 실시예에서, 본 발명의 접합된 분자는, 비만, 폭식 장애, 인슐린 저항성, 2형 당뇨병, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염, 또는 비알코올성 지방간 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 일 양태는, 본 발명에 따른 접합된 분자 및 약학적으로 허용 가능한 운반체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 접합된 분자의 임의의 실시예가 약학 조성물에 사용될 수 있다.
추가적인 일 양태에서, 본 발명은 약학 조성물의 제조에 있어 본 발명에 따른 접합된 분자의 용도에 관한 것이다. 특히, 약학 조성물은 비만, 폭식 장애, 인슐린 저항성, 2형 당뇨병, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염, 또는 비알코올성 지방간 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다. 접합된 분자의 임의의 실시예가 약학 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명에 개시된 데이터는 마우스에 대한 연구에서 얻은 것이나, 마우스와 인간이 유사한 수용체 발현 프로파일을 보임에 따라 에너지 대사를 관장하는 주요 호르몬 경로는 마우스와 인간 사이에서 유사하므로, 상기 연구의 결론은 인간에게도 동일한 관련성이 있다.
본 발명의 접합체는 약학 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 본 발명의 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 약학적으로 허용 가능한 운반체를 포함하는 약학 조성물을 더 제공한다. 약학적 제형은 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 간단히 설명하면, 약학적으로 허용 가능한 운반체는 고체 또는 액체일 수 있다. 고체 제제에는 분말, 정제, 알약, 캡슐, 카세제(cachets), 좌약 및 분산성 과립(dispersible granules)이 포함된다. 고체 운반체는, 희석제, 가용화제, 윤활제, 현탁화제, 결합제, 방부제, 습윤제, 정제 붕해제(disintegrating agent), 또는 캡슐화 재료로도 작용할 수 있는 하나 이상의 부형제일 수 있다.
약학적 제형에 포함된 접합체는 분말 형태일 수 있으며, 이는 멸균 고체의 무균 분리 또는 용액으로부터의 동결건조에 의해 얻어지고, 사용 전에 적합한 매개체(vehicle), 예를 들어 멸균된 발열원 제거수(pyrogen-free water)와 함께 구성되기 위한 것이다.
일 실시예에서, 약학 조성물은 피하 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 또는 경구 투여에 적합하다. 따라서 본 발명의 조성물은, 앰플(ampoules), 사전충전형 주사기, 저용량 주입과 같은 단위 용량 형태, 또는 선택적으로 첨가된 방부제와 함께 다회용(multi-dose) 용기에 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 매개체 중의 현탁액, 용액, 또는 에멀젼과 같은 형태를 가질 수 있다.
본 개시에 따라, GLP-1R 활성을 가진 펩티드의 음식 섭취량 감소 효과가 단일 모달리티(single modality)로 NMDAR 길항작용과 조합되는 약학 조성물이 제공된다. GLP-1R 활성을 가진 펩티드를 통한 시상하부 핵, 맨아래구역, 고립로핵, 및 복측 피개부, 및/또는 내분비 최장으로의 능동적 전달은, 해리성, 정신병적, 행동 효과와 같은 전형적인 NMDAR-매개의 원치 않는 신경생물학적 효과를 긍정적인 대사 효과로부터 분리한다. NMDAR 길항작용으로 인한 원치 않는 신경생물학적 효과에는 환각, 편집증적 망상, 혼란, 집중 곤란, 불안, 기분 변화, 악몽, 긴장증, 운동 실조, 감각 상실, 학습 및 기억력 결핍이 포함될 수 있다. NMDAR 길항제의 긍정적인 대사 효과에는 포도당 대사 개선, 음식 섭취량 감소 및 폭식 장애 억제가 포함될 수 있으며, 이는 인간 또는 포유류의 비만 및 비만 관련 대사 장애를 경감하는 데 도움이 될 수 있다.
따라서, 본 발명의 펩티드 및 NMDAR 길항제 페어링의 치료적 효용은, 비만 및 이와 관련된 대사 장애의 치료를 위한 새로운 접근법을 제공한다. 비만의 치료는, 접합된 분자를 인간 또는 포유동물에게 투여함으로써 음식 섭취량 및 음식 동기(food motivation)를 감소시키고 폭식 에피소드를 감소시킴으로써 달성할 수 있으며, 따라서 본 발명의 추가적인 양태는, 본 발명의 접합된 분자 또는 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 포유 동물의 체중 감소 방법에 관한 것이다.
일 실시예에서, 체중 감소 방법은 포유동물에게 본 발명의 접합된 분자 또는 본 발명의 약학 조성물을 투여함으로써 포유동물의 음식 섭취량을 감소시키는 단계를 수반한다.
접합된 분자 또는 약학 조성물은 피하, 경구, 근육내, 복강내, 또는 정맥내 투여될 수 있다.
상기 접합된 분자, 또한 약학 조성물은, 종래 기술에 비교하여 음식 섭취량 억제 효과가 우수하다. 따라서, 접합된 분자 및 약학 조성물은 임의의 수준의 비만 치료에서 사용될 수 있다. 비만은 체질량 지수(BMI)로 나타낼 수 있으며, 이는 체질량을 신장의 제곱으로 나눈 값으로 정의되고, 예를 들어 kg/m2 단위로 표시된다. 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 BMI가 병원성(pathogenic) 비만과 비병원성 비만 사이의 한계 값을 규정하는 데 사용될 수 있다고 여긴다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서, 30kg/m2의 BMI는 병원성 비만과 비병원성 비만 사이의 한계 값으로 해석될 수 있다. 그러나 병원성 비만과 비병원성 비만 사이의 한계를 규정하기 위해 다른 BMI 값도 고려할 수 있다. 따라서, 예를 들어 24kg/m2, 26kg/m2, 27kg/m2, 28kg/m2, 29kg/m2, 30kg/m2, 31kg/m2, 32kg/m2, 33kg/m2, 34kg/m2, 및 35kg/m2의 BMI 값은 병원성 비만과 비병원성 비만 사이의 한계를 규정하기 위해 고려된다. 추가적인 일 양태에서, 본 발명은 포유동물의 체중 감소를 위한 비치료적(non-therapeutic) 요법에 관한 것이며, 포유동물에게 본 발명에 따른 접합된 분자를 경구 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 포유동물은 비병원성 BMI를 가질 수 있다. 특히, 본 방법은 비병원성 비만을 규정하는 한계 값 미만의 BMI를 갖는 대상체에게 접합된 분자를 경구 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
상기에서, 본 발명은 몇 가지 실시예를 참조하여 주로 설명되었다. 그러나, 당업자에 의해 쉽게 이해되는 바와 같이, 앞서 개시된 것 외의 다른 실시예가 본 발명의 범위 내에서 동등하게 가능하다.
본 발명의 다른 양태 및 유리한 특징은 아래의 비제한적 예에 의해 상세히 예시되고 설명된다.
일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어는 해당 기술 분야에서의 일반적인 의미에 따라 해석되어야 하며, 달리 명시적으로 정의되거나 언급되지 않는 한, 본 발명의 모든 양태 및 실시예에 적용될 수 있다. 관사 "하나/하나의/상기 [접합체, 분자, 링커, 펩티드 등]"에 대한 모든 언급은, 달리 명시적으로 기재되지 않는 한, 상기 접합체, 작용제, 분자, 링커, 펩티드 등의 적어도 하나의 사례를 언급하는 것으로 넓게 해석되어야 한다.
본 발명의 맥락에서, "GLP1", "GLP-1" 또는 "GLP1 펩티드"라는 용어는 글루카곤-수퍼패밀리의 펩티드, 특히 인크레틴(incretin) 호르몬 글루카곤-유사 펩티드 1을 의미한다. 본 발명의 펩티드는 또한 음식 섭취 조절 호르몬 펩티드로 간주될 수 있으며, 본 발명의 접합된 분자의 시상하부 및/또는 췌장으로의 능동적 전달제로서 기능하는 것으로 간주될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "펩티드"라는 용어는 펩티드 결합에 의해 연결된 10 내지 60개의 아미노산 사슬로 구성된 화합물을 의미한다.
본 발명의 맥락에서, GLP-1로부터 유도된 펩티드는, 해당 펩티드가 유래한 천연 GLP-1 펩티드, 즉 SEQ ID NO:1에 대하여 아미노산 서열 동일성을 갖는 펩티드를 의미한다.
펩티드 또는 아미노산과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "유도체"는, 화학적으로 변형된 펩티드 또는 아미노산을 의미하며, 여기서 적어도 하나의 치환기가 변형되지 않은 펩티드 또는 아미노산 또는 그 유사체에서는 존재하지 않는다. 즉, 공유 결합적으로(covalently) 변형된 펩티드 또는 아미노산이다. 전형적인 변형은 아미드, 탄수화물, 알킬기, 아실기, 및 에스테르 등이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "백분율 동일성" 또는 "% 동일성"은, 특히 BLAST 알고리즘을 사용하여 비교된 2개의 펩티드 사이에 동일한 아미노산의 %를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "NMDAR 길항제"는, NMDA 수용체(NMDAR)의 길항제인 화합물을 의미한다. NMDAR 길항제의 예는 메만틴, 메만틴 염산염, 아만타딘(amantadine), 케타민, 또는 MK801을 포함하나 이에 국한되지 않는다. NMDAR 길항제의 추가적인 예는 노르케타민(norketamin) 및 네라멕산을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
본 발명은 비만인 인간 대상에서 음식 섭취량 및 체중을 감소시키기 위한 효과적이고 안전한 치료제를 제공하는 효과가 있다.
본 발명의 상술된, 그리고 추가적인 목적, 특징, 및 이점은 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대한 다음의 예시적이고 비제한적인 상세한 설명을 통해 더 잘 이해된다.
도 1은, 펩티드 및 NMDAR 길항제 접합체의 예를 도시한다.
도 2는, MK801이 도 1의 접합체로부터 방출되는 메커니즘을 도시한다.
도 3은, 도 1 및 2의 접합체의 3가지 버전에 대하여 체외(in vitro) 인간 혈장 안정성을 도시한다.
도 4는, SEQ ID NO:1의 펩티드와 메만틴(GLP-1 Cys40/메만틴)의 접합체의 체중 감소 효과를 도시한다.
도 5는, 마우스의 누적 음식 섭취량에 대한 GLP-1 Cys40/메만틴의 효과를 도시한다.
도 6은, 마우스의 일일 음식 섭취량에 대한 GLP-1 Cys40/메만틴의 효과를 도시한다.
도 7은, 마우스의 체성분(body composition)에 대한 GLP-1 Cys40/메만틴의 효과를 도시한다.
도 8은, SEQ ID NO:1의 펩티드와 MK801(GLP-1 Cys40/MK801)의 접합체의 체중 감소 효과를 도시한다.
도 9는, 마우스의 누적 음식 섭취량에 대한 GLP-1 Cys40/MK801 접합체의 효과를 도시한다.
도 10은, 마우스의 일일 음식 섭취량에 대한 GLP-1 Cys40/MK801 접합체의 효과를 도시한다.
도 11은, 마우스의 체성분에 대한 GLP-1 Cys40/MK801 접합체의 효과를 도시한다.
도 12는, SEQ ID NO:1의 펩티드와 MK801(GLP-1 Pen40/MK801)의 접합체(여기서 SEQ ID NO:1의 시스테인 잔기는 L-페니실라민으로 치환됨)의 체중 감소 효과를 도시한다.
도 13은, 마우스의 일일 음식 섭취량에 대한 GLP-1 Pen40/MK801 접합체의 효과를 도시한다.
도 14는, 마우스의 체중에 대한 GLP-1 Pen40/MK801 접합체의 효과를 도시한다.
도 15는, 화학적 링커로 유도체화(derivatized)된 메만틴의 합성 경로를 도시한다.
도 16은, 아미노기를 가진 소분자 및 펩티드의 접합을 위한 합성 경로의 예를 도시한다.
도 17은, 화학적 링커로 유도체화된 MK801을 합성하기 위한 합성 경로를 도시한다.
도 18은, 링커로 유도체화된 MK801과 펩티드(SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드)의 접합 반응을 도시한다.
도 19는, 링커로 유도체화된 MK801의 화학적 합성을 위한 합성 경로를 도시한다.
도 20은, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 가지며 Pen40 변형을 갖는 펩티드와 링커로 유도체화된 MK801의 접합 반응을 도시한다.
도 21은, 마우스의 체중에 대한 서로 다른 투여량의 GLP-1 Pen40/MK801 접합체의 효과를 도시한다.
도 22는, 마우스의 일일 음식 섭취량에 대한 서로 다른 투여량의 GLP-1 Pen40/MK801 접합체의 효과를 도시한다.
도 23은, 화합물 내성 시험(tolerance test) 후 마우스의 혈당에 대한 서로 다른 용량의 GLP-1 Pen40/MK801 접합체의 효과를 도시한다.
도 24는, GLP-1 Pen40/MK801 접합체에서 활성 및 비활성 MK801가 마우스의 체중에 대하여 갖는 효과를 도시한다.
도 25는, GLP-1 Pen40/MK801 접합체에서 활성 및 비활성 MK801가 마우스의 누적 음식 섭취량에 대하여 갖는 효과를 도시한다.
도 26은, 접합체 GLP-1 Pen40/MK801에 사용된 활성 및 비활성 MK801의 체외 인간 혈장 안정성을 도시한다.
도 27은, 서로 다른 링커를 갖는 GLP-1/MK801 접합체가 마우스의 체중에 대하여 갖는 효과를 도시한다.
도 28은, 서로 다른 링커를 갖는 GLP-1/MK801 접합체가 마우스의 누적 음식 섭취량에 대하여 갖는 효과를 도시한다.
도 29는, 일 유형의 링커를 갖는 GLP-1/MK801 접합체이다.
도 30은, 일 유형의 링커를 갖는 GLP-1/MK801 접합체이다.
도 31은, GLP-1 Pen40/MK801 접합체가 마우스의 수크로스(sucrose) 섭취량에 대하여 갖는 효과를 도시한다.
도 32는, 화합물 내성 시험 후 db/db 마우스의 혈당에 대하여 GLP-1 Pen40/MK801 접합체가 갖는 효과를 도시한다.
도 33은, 공작용제 GIP/GLP-1/MK801 접합체가 마우스의 체중에 대하여 갖는 효과를 도시한다.
도 34는, 공작용제 GIP/GLP-1/MK801 접합체가 마우스의 누적 음식 섭취량에 대항 갖는 효과를 도시한다.
도 35는, 약물 접합체에서 공작용제 SEQ ID NO: 9의 GLP-1/GIP와 SEQ ID NO: 1의 GLP-1 펩티드 사이의 아미노산 서열 일치를 도시하며, 여기서 X1은 D-알라닌, D-세린, 알파-아미노이소부티르산(alpha-aminoisobutyric acid), N-메틸-세린, 글리신, 또는 발린(valine)이고, X2는 시스테인(hCys40/Cys40) 또는 L-페니실라민(Pen40)이다.
도 36은, GLP-1 Pen40과 접합된 서로 다른 NDMAR 길항제가 마우스의 체중에 대하여 갖는 효과를 도시한다.
도 37은, GLP-1 Pen40과 접합된 서로 다른 NDMAR 길항제가 마우스의 일일 음식 섭취량에 대하여 갖는 효과를 도시한다.
도 38은, GLP-1 Pen40과 접합된 서로 다른 NDMAR 길항제가 마우스의 누적 음식 섭취량에 대하여 갖는 효과를 도시한다.
도 1은, 디설파이드기(105)를 포함하는 화학적 링커(104)를 통해 SEQ ID NO:1의 펩티드(103)의 C-말단 시스테인(102)에 화학적으로 부착된 MK801(101)로 구성된, 펩티드와 NMDAR 길항제 접합체(100)의 예를 도시한다. C-말단 시스테인(102)의 측쇄(106)는, 측쇄(106)의 길이 n이 1 또는 2개의 탄소 원자이고/이거나 R이 수소 또는 메틸이도록 유도체화될(derivatised) 수 있다. 측쇄(106)의 hCys40으로 지칭되는 변형은, n = 2 탄소 원자 길이 및 R = 수소를 갖는다. 측쇄(106)의 hCys40으로 지칭되는 변형은, n = 1 탄소 원자 길이 및 R = 메틸을 갖는다. 일반 시스테인은 Cys40으로 지칭된다.
도 2는, MK801이 도 1의 접합체(100)로부터 방출되는 메커니즘을 나타낸다. 디설파이드기(105)를 포함하는 화학적 링커(104)는 자가-희생적(self-immolative)이며, 세포내 환경과 같은 환원 환경(미도시)에서 환원되어 티올(thiol)기를 생성하고 접합체의 MK801 부분(108)으로부터 접합체의 펩티드 부분(107)을 분리한다. 분자의 MK801 부분(108)에서, 유리된 친핵성(nucleophilic) 티올(109)은 자발적인 분자내 고리화를 거쳐 MK801을 천연 비변형 MK801 약물(MK801의 자유 형태)로서 방출한다.
도 3은, 도 1 및 2의 접합체(100)의 3가지 버전의 체외 인간 혈장 안정성을 도시하며, 각 버전은 서로 다른 시스테인 유도체 또는 잔기를 갖는다. 제1 버전 GLP-1 Pen40/MK801은 시스테인 유도체 Pen40을 가지고, 제2 버전 GLP-1 hCys40/MK801은 시스테인 유도체 hCys40을 가지며, 제3 버전 GLP-1 Cys40/MK801은 변형되지 않은 시스테인 Cys40을 가진다. 각 버전의 혈장 안정성은 시간 경과에 따른 회수율 백분율로 표시된다. LCMS 분석(미도시)에 따라, 링커의 디설파이드 교환에 의한 것으로 보이는 MK801의 탈접합(deconjugation)이 접합체의 분해(degradation)에 주로 기여하는 요소임이 밝혀졌다. 결과적으로, C-말단 시스테인(hCys40/Cys40, 102)을 L-페니실라민(Pen40)으로 단일 치환하는 것은, 증가된 입체 장애로 인해 디설파이드 결합의 접근성을 감소시켜 혈장 안정성을 크게 증가시켰다.
도 4 내지 14는, 예 8에 개시된 마우스 체내(in vivo) 연구의 결과를 나타낸다.
도 4는, 도 1 및 2에 나타낸 링커를 통해 화학적으로 부착된 SEQ ID NO:1의 펩티드와 메만틴의 접합체의 체중 감소 효과를 도시하며, 이때 시스테인 잔기는 변형되지 않은 시스테인이고(GLP-1-Cys40/메만틴, 40nmol/kg), 등몰 용량의 SEQ ID NO:1의 펩티드(GLP-1 Cys40) 또는 메만틴이 8일 동안 치료받은 식이 유도(DIO) 마우스의 체중 백분율(BW%)로 측정되었다. 데이터는 평균±SEM으로 표현되며, N은 군 당 8이다. GLP-1 Cys40 및 GLP-1 Cys40/메만틴 둘 모두는 DIO 마우스에서 감소된 BW%를 초래하였고, 후자 접합체는 치료 8일 후에 대략 7%의 BW% 감소를 초래하였다.
도 5는, 8일 동안 치료받은 DIO 마우스의 누적 음식 섭취량(누적 FI, 그램/일)에 대한 GLP-1 Cys40/메만틴 및 등몰 용량의 GLP-1 Cys40 또는 메만틴의 효과를 도시한다. 데이터는 평균±SEM 및 군 당 N = 8로 표현된다. 치료 과정에 걸쳐, 대조군(매개체) 및 메만틴에 비하여 GLP-1 Cys40 및 GLP-1 Cys40/메만틴으로 치료된 마우스에서 감소된 누적 음식 섭취량이 관찰되었다.
도 6은, 8일 동안 치료받은 DIO 마우스의 일일 음식 섭취량(일일 FI, 그램/일)에 대한 GLP-1 Cys40/메만틴(40nmol/kg) 또는 등몰 용량의 GLP-1 Cys40 또는 메만틴의 효과를 도시한다. 데이터는 평균±SEM 및 군 당 N = 8로 표현된다. 8일간의 치료 동안, GLP-1 Cys40 및 GLP Cys40/메만틴은 일반적으로 메만틴으로 치료된 마우스 및 대조군(매개체, 즉 식염수)에 비하여 일일 음식 섭취량이 감소한 것으로 나타났다. 연구 종료 시에, GLP-1로 치료받은 마우스는 대조군(매개체)에 비해 음식 섭취량이 약간만 감소한 것으로 나타났다.
도 7은, 8일 동안 치료받은 DIO 마우스의 체성분(델타 변화, g)에 대한 GLP-1 Cys40/메만틴(40nmol/kg) 또는 등몰 용량의 GLP-1 Cys40 또는 메만틴의 효과를 지방 및 제지방량(lean body mass)의 변화 측면에서 도시한 것이다. 데이터는 평균±SEM 및 군 당 N = 8로 표현된다. 8일 후, 메만틴, GLP-1 Cys40, 및 GLP-1 Cys40/메만틴으로 치료된 마우스는 모두 체지방량(fat body mass)이 감소한 반면, 제지방량에서는 거의 변화가 보이지 않았다. GLP-1 Cys40/메만틴의 경우, 본 접합체로 치료된 마우스에서 약 4g의 지방량 감소와 함께 체지방량의 가장 큰 변화를 초래하였다.
도 8은, 10일 동안 치료받은 DIO 마우스에서 GLP-1 Cys40/MK801(100nmol/kg) 또는 등몰 용량의 GLP-1 Cys40 또는 MK801의 체중 감소 효과(BW%)를 도시한다. 데이터는 평균±SEM 및 군 당 N = 8로 표현된다. MK801은 체중(BW)의 백분율 변화를 거의 보이지 않은 반면, GLP-1 Cys40 및 GLP-1 Cys40/MK801 모두는 치료 10일 후에 각각 대략 8% 및 12%의 체중 감소를 초래하였다.
도 9는, 10일 동안 치료받은 DIO 마우스의 누적 음식 섭취량(누적 FI)에 대한 GLP-1 Cys40/MK801(100nmol/kg) 또는 등몰 용량의 GLP-1 Cys40 또는 MK801의 효과를 도시한다. 데이터는 평균±SEM, 군 당 N = 8로 표시된다. 10일의 치료 과정 동안, 대조군(매개체) 및 MK801에 비해 GLP-1 Cys40 및 GLP-1 Cys40/MK801로 치료된 마우스에서 누적 음식 섭취량 감소가 관찰되었다. GLP-1 Cys40/MK801로 치료된 마우스의 경우 최상의 결과가 관찰되었으며, 누적 음식 섭취량은 약 13g/일로, 매개체로 치료된 마우스(약 23g/일)보다 약 10g/일만큼 적었다.
도 10은, 10일 동안 치료받은 DIO 마우스의 일일 음식 섭취량(일일 FI)에 대한 GLP-1 Cys40/MK801(100nmol/kg) 또는 등몰 용량의 GLP-1 Cys40 또는 MK801의 효과를 도시한다. 데이터는 평균±SEM, 군 당 N = 8로 표시된다. 일반적으로 일일 음식 섭취량은 10일의 치료기간 동안 다양한 정도로 변동했지만 GLP-1 Cys40/MK801으로 치료한 마우스에서는 대조군(매개체)에 비해 음식 섭취량의 감소가 10일 내내 관찰되었다.
도 11은, 10일동안 치료받은 DIO 마우스의 체성분(델타 변화, g)에 대한 GLP-1 Cys40/MK801(100nmol/kg) 또는 등몰 용량의 GLP-1 Cys40 또는 MK801의 효과를 지방 및 제지방량의 변화 측면에서 도시한 것이다. 데이터는 평균±SEM 및 군 당 N = 8로 표현된다. 10일간의 치료 후, GLP-1 Cys40/MK801로 치료한 마우스 군은 지방량과 제지방량 모두 감소를 나타냈으며, 지방량 변화(거의 5g 감소)가 가장 두드러졌다.
도 12는, 5일 동안 치료받은 DIO 마우스의 체중%에 대한 GLP-1 Pen40/MK801(100nmol/kg) 또는 등몰 용량의 GLP-1 Cys40 또는 MK801의 효과를 도시한다. 데이터는 평균±SEM 및 군 당 N = 8로 표현된다. 치료 5일 후, GLP-1 Pen40/MK801로 치료된 마우스는 체중이 약 15% 감소한 것으로 나타났다. 이에 비교하여 GLP-1 Cys40로 치료된 마우스는 대략 4%의 체중 감소를 보였다.
도 13은, 5일 동안 치료받은 DIO 마우스의 음식 섭취량(g/일)에 대한 GLP-1 Pen40/MK801(100nmol/kg) 또는 등몰 용량의 GLP-1 Cys40 또는 MK801의 효과를 도시한다. 데이터는 평균±SEM 및 군 당 N = 8로 표현된다. GLP-1 Pen40/MK801로 치료된 마우스는, 대조군(매개체로 치료된 마우스)에 비하여 음식 섭취량이 즉시 감소한 것으로 나타났다. 또한, 감소된 음식 섭취량은 5일의 치료 기간 동안 약 0.2 내지 0.7g/일로 유지되었다.
도 14는, 5일 동안 치료받은 DIO 마우스의 체중%에 대한 GLP-1 Pen40/MK801(100nmol/kg) 또는 등몰 용량의 GLP-1 Pen40 또는 GLP-1 Cys40의 효과를 도시한다. 데이터는 평균±SEM 및 군 당 N = 7로 표현된다. GLP-1 Pen40 또는 GLP-1 Cys40으로 치료된 마우스는 유사한 체중%의 감소(약 6%)를 나타낸 반면, GLP-1 Pen40/MK801은 약 12%의 체중 감소를 보였다. 또한, 곡선의 기울기에 따르면, 치료가 연장될 경우 GLP-1 Pen40/MK801의 추가적인 체중 감소 효과를 기대할 수 있는 것으로 보인다.
도 21 및 22는, 5일 동안 치료받은 DIO 마우스의 체중(BW%, 도 21) 및 일일 음식 섭취량(그램 단위의 일일 FI, 도 22)에 대한 GLP-1 Pen40/MK801 접합체의 서로 다른 투여량(50nmol/kg 및 100nmol/kg)의 효과를 대조군(매개체, 즉 식염수)과 비교하여 도시한다. 데이터는 평균±SEM 및 군 당 N = 5 내지 6으로 표현된다. 치료 기간동안, 두 투여량(50nmol/kg 및 100nmol/kg)으로 치료된 마우스 모두 체중 및 일일 음식 섭취량이 대조군에 비해 감소했으며, 가장 유의한 감소는 매일 100nmol/kg의 접합제가 피하 주사된 마우스에서 관찰되었다.
도 23은, 치료 기간 중 7일째에 ipGTT를 받은 DIO 마우스의 혈당 수준(mmol/L)에 대한 GLP-1 Pen40/MK801 접합체의 서로 다른 투여량(50nmol/kg 및 100nmol/kg)의 효과를 대조군(매개체, 측 식염수)과 비교하여 도시한다. 혈당 수준은 120분 동안 측정되었다. 데이터는 평균±SEM 및 군 당 N = 5 내지 6으로 표현된다. 일반적으로, 접합체의 두 투여량, 즉 50nmol/kg 및 100nmol/kg 모두 대조군과 비교하여 유의하게 더 낮은 초기 증가 및 전반적으로 더 낮은 혈당 수준을 초래하였다.
도 24 및 25는, GLP-1 Pen40과 접합된 활성 및 비활성 MK801이 7일 동안 치료받은 DIO 마우스의 체중(% 단위의 Δ체중, 도 24) 및 누적 음식 섭취량(그램 단위의 누적 FI, 도 25)에 대하여 갖는 효과를 대조군(매개체, 즉 식염수)과 비교하여 도시한다. 데이터는 평균±SEM 및 군 당 N = 8로 표현된다. 치료 과정에 걸쳐, 활성 MK801과 접합된 GLP-1 Pen40으로 치료된 마우스에서 감소된 체중 및 누적 음식 섭취량이 관찰되었다. 비활성 MK801과의 접합체는, 접합되지 않은 GLP-1 Pen40과 유사한 결과를 보였다. MK801과 GLP-1은 마우스의 체중과 누적 음식 섭취량을 감소시키는 데 상승 효과를 가지는 것으로 판단되었다.
도 26은, 접합체 GLP-1 Pen40/MK801의 활성 및 비활성 MK801 버전의 체외 인간 혈장 안정성을 PBS 대조군과 비교하여 도시한다. 비활성 및 활성 MK801의 혈장 안정성은 시간(시간)에 따른 회수율(%)로 표시된다. 두 접합체는 MK801이 활성인지 비활성인지에 관계없이 거의 동일한 혈장 안정성을 보였다.
도 27 및 28은, 서로 다른 링커를 갖는 GLP-1/MK801 접합체(100nmol/kg)가 7일 동안 DIO마우스의 체중(%단위의 BW, 도 27) 및 누적 음식 섭취량(그램 단위의 누적 FI, 도 28)에 미치는 영향을 대조군(매개체, 즉 식염수)와 비교하여 도시한다. 데이터는 평균±SEM 및 군 당 N = 5 내지 6으로 표현된다. 서로 다른 링커를 갖는 GLP-1/MK801 접합체의 구조는 도 20(GLP-1 Pen40/MK801), 도 29(GLP-1 Lys40-트리아졸-PEG4-Val-Cit-PAB-MK801), 및 도 29(GLP-1 Cys40-mc-Val-Cit-PAB-MK801)에 도시되어 있다. 치료 과정 동안, 서로 다른 링커를 갖는 GLP-1/MK801의 접합체로 치료된 마우스는 누적 음식 섭취량에서 유사한 감소를 보였다. 치료 7일에 걸쳐 체중의 가장 유의한 감소는 GLP-1 Pen40/MK801 접합체로 치료된 마우스 군에서 관찰되었다 (약 20% 감소).
도 31은, 8일 동안 치료 받은 DIO 마우스의 수크로스 섭취량(%)에 대한 GLP-1 Pen40/MK801(100nmol/kg) 및 등몰 용량의 GLP-1 Pen40, MK801, 또는 세마글루티드(semaglutide)의 효과를 대조군(매개체, 식염수 주사)과 비교하여 도시한다. 데이터는 평균±SEM 및 군 당 N = 8로 표현된다. 대조군(매개체)와 비교하여 발현된 수크로스 섭취량의 가장 유의한 감소는 세마글루티드 및 GLP-1/MK801 접합체로 치료된 마우스에서 관찰되었다. 본 발명의 접합된 분자는 치료된 마우스에서 음식 보상 및 포만감 효과를 유도하는 데 효과적인 것으로 판단되었다.
도 32는, 치료 기간 중 7일째에 ipGTT를 받은 db/db(당뇨병) 마우스의 혈당(mmol/L)에 대한 GLP-1 Pen40/MK801 접합체(100nmol/kg) 및 등몰 용량의 MK801, 또는 세마글루티드의 효과를 도시한다. 혈당 수준은 24시간에 걸쳐 측정되었다. 데이터는 평균±SEM 및 군 당 N = 8로 표현된다. 세마글루티드 또는 접합체 GLP-1 Pen40/MK801로 치료된 마우스는 대조군(매개체)에 비해 전반적으로 더 낮은 혈당 수준을 나타냈고, 본 발명의 접합된 분자가 당뇨병 마우스의 치료에 적합한 것으로 판단되었다.
도 33 및 34는, 7일 동안 치료받은 DIO 마우스의 체중(% 단위, 도 33) 및 누적 음식 섭취량(그램 단위의 누적 FI, 도 34)에 대하여 공작용제 GIP/GLP-1 Pen40/MK801 접합체(SEQ ID NO:9, 50nmol/kg) 및 등몰 용량의 GLP-1/GIP의 효과를 대조군(매개체, 즉 식염수 주사)과 비교하여 도시한다. 데이터는 평균±SEM 및 군 당 N = 8로 표현된다. GIP/GLP-1/MK801 접합체로 치료한 마우스에서 가장 유의한 효과가 관찰되었는데, 마우스는 대조군에 비해 약 25%의 전반적인 체중 감소를 보였고, 대조군에서 관찰된 누적 음식 섭취량 15g에 비하여 대략 3g의 누적 음식 섭취량을 보였다.
도 36 내지 38은, GLP-1 Pen40과 접합된 서로 다른 NDMAR 길항제, 즉, MK-801, 메만틴, 및 네라멕산이 5일 동안 치료받은 DIO 마우스의 체중(% 단위, 도 36), 일일 음식 섭취량(음식 섭취량, 그램/일, 도 37), 및 누적 음식 섭취량(그램 단위의 누적 FI, 도 38)에 대하여 가지는 효과를 대조군(비히클, 즉 식염수)과 비교하여 도시한다. 데이터는 평균±SEM 및 군 당 N = 8로 표현된다. 치료 과정 동안 MK801, 메만틴, 또는 네라멕산과 접합된 GLP-1 Pen40으로 치료된 마우스는 모두 대조군에 비해 체중이 유의하게 감소하고 일일 및 누적 음식 섭취량이 감소한 것으로 나타났다. 서로 다른 NMDAR 길항제가 본 발명의 펩티드에 접합되어, 마우스의 체중 및 음식 섭취량에 대해 동일한 유익한 효과를 얻을 수 있다고 판단되었다.
결론
제시된 데이터는, GLP-1 유사체와 NMDAR 길항제의 화학적 접합이 비만을 효과적으로 호전시키기 위한 신규한 의약적 전략을 나타낸다는 점을 입증한다. 본 전략에 기반한 접합체는 GLP-1 펩티드 대조군에 비하여 음식 섭취 억제 및 체중 감소 효과가 우수하며, NMDAR 길항작용의 중추적 부작용을 결함으로 갖지 않는다.
예
예 1: 펩티드 및 펩티드-NMDAR 길항제 접합체의 제조.
재료: 모든 용매 및 시약은 상업적 공급원에서 구입하였으며, 추가 정제 없이 사용되었다. H-Rink 아미드 ChemMatrix® 수지가 펩티드 신장(elongation)에 사용되었다. 달리 명시되지 않는 한, Fmoc-보호된(9-플루오레닐메틸 카바메이트) 아미노산은 Iris-Biotech 또는 Gyros Protein Technologies에서, H-Rink 아미드 ChemMatrix® 수지(35 내지 100 메쉬, 0.40 내지 0.60 mmol/g 로딩)는 Sigma Aldrich에서 구입하였다. 시중에서 구할 수 있는 N α-Fmoc 아미노산 빌딩 블록(building block)은 다음의 측쇄 보호된 유사체로 구입하였다: Arg, Pmc; Asp, OtBu; Cys, Trt; Gln, Trt; His, Trt; Lys, Trt; Ser, tBu; 및 Trp, Boc(Pmc = 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐, OtBu = tert-부틸 에스테르, Trt = 트리틸, Boc = tert-부틸옥시카르보닐, 및 tBu = tert-부틸 에테르).
모든 펩티드, 그리고 NMDAR 길항제와 펩티드의 접합체는, 분석 역상 초고성능 액체 크로마토그래피(RP-UPLC, Waters) 및, C18 칼럼(Zorbax Eclipse, XBD-C18, 4.6×50mm)을 가진 Agilent 6410 Triple Quadrupole 질량 필터에 연동된 전자분무 이온화 액체 크로마토그래피 질량 분석법(ESI-LCMS)으로 특징을 분석하였다. ESI-LCMS는 0.75mL/분의 유속에서 H2O:MeCN:TFA(A: 95:5:0.1, B: 5:95:0.1)로 구성된 2원(binary) 버퍼 시스템으로 용리되었다. 순도는, 0.45mL/분의 유속에서 H2O:MeCN:TFA(A: 95:5:0.1, B: 5:95:0.1)로 구성된 2원 버퍼 시스템으로 용리된 C18 칼럼(Acquity UPLC BEH C18, 1.7μm, 2.1×50mm)을 보유한 RP-UPLC로 측정하였다.
Fmoc 보호 스킴(scheme)에 대한 자동화된 펩티드 합성 프로토콜: 펩티드는 10mL 유리 용기가 있는 유도 가열 보조된 펩티드 합성기인 Prelude X(Gyros Protein Technologies, 투손, 애리조나, 미국)를 사용하여 C-말단 아미드화 유도체로서 제조되었다. 모든 시약(Fmoc-보호된 아미노산 0.2M, HCTU 0.5M, DIPEA 1.0M, 및 피페리딘 20% v/v)은 DMF 내의 스톡 용액으로 새로 준비되었다. 펩티드 신장은, 탈보호(2×2분, RT, 300rpm 진탕) 및 커플링(2×5분, 75℃, 300rpm 진탕, Arg 및 His는 2×5분, 50℃, 300rpm 진탕)으로 구성된 프로토콜을 사용하여 연속적인 합성 조작으로 이루어졌다. 펩티드는 수지에 비하여 5배 과량의 AA/HCTU/DIPEA(비율 1:1.25:2.5)로 구성된 이중 및 삼중 커플링을 사용하여 제조되었다.
펩티드 절단: 합성된 펩티드는, 펩티딜(peptidyl) 수지 100mg당 절단 칵테일(TFA 내 2.5% 티오아니솔, 2.5% EDT, 2.5% H2O, 2.5% TIPS) 1.5mL를 첨가한 후 2시간 동안 교반하여 펩티딜 수지로부터 분리하였다. 미정제(crude) 펩티드를 차가운 디에틸 에테르에 침전시키고 2500×g에서 10분 동안 4℃에서 원심분리한 후 MeCN:H2O:TFA(비율 1:1:0.01)에 재용해하고, 여과한 후 동결건조하였다.
정제: 미정제 펩티드 또는 NMDAR 길항제와 펩티드의 접합체를 정제하기 전에 RP-UPLC 및 ESI-LCMS 또는 MALDI-TOF 질량 분석법으로 분석하였다. 정제는 역상 C18 칼럼(Zorbax, 300 SB-C18, 21.2×250mm)이 구비된 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 시스템(Waters)을 사용하여 수행하였으며, H2O:MeCN:TFA(A: 95:5:0.1; B: 5:95:0.1)의 2원 버퍼 시스템을 사용하여 선형 구배(유속 20mL/분)로 용리하였다. 분획을 0.3분 간격으로 수집하고 ESI-LCMS로 분석하였다. 순도는 214nm에서 RP-UPLC에 의해 측정하였고, 95% 초과의 순도를 갖는 분획을 모아 동결건조시켰다. 최종 동결건조된 생성물은 추가 실험에 사용되었다.
펩티드와 NMDAR 길항제의 접합체 조립을 위한 접합 프로토콜: 순수 펩티드와 순수 티오피리딜-활성된 NMDAR 길항제 접합체를 2원 용매 시스템(A: DMF; pH = 8의 H2O중에서 1.5M 이미다졸, 6M 구아니딘, 비율 7:1)에 용해하고 최소 2시간 동안 교반하였다. 미정제 반응 혼합물을 분석 RP-UPLC 및 ESI-LCMS로 모니터링하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 버퍼 A 및 버퍼 B로 희석하고, 선형 구배로 용리하는 RP-HPLC를 이용하여 직접 정제되었다.
탈염: 모든 펩티드는 생물학적 실험 전에 탈염되었다. 탈염은 펩티드, 또는 NMDAR 길항제와 펩티드의 접합체를 연속적으로 묽은 0.01M HCl 수용액에 재용해 후 동결건조하여 수행되었고, 3회 반복하였다. 펩티드 또는 접합체의 순도는, 체내 또는 체외 실험에 사용하기 전에 RP-UPLC 및 ESI-LCMS로 모니터링하였다.
GLP-1 Cys40/메만틴(시스테인 링크)의 제조
SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 GLP-1 펩티드는 앞서 기술된 Fmoc 프로토콜을 사용하여 합성되었고, 화학적 링커로 유도체화된 메만틴 유사체에 접합되었다. 화학적 링커로 유도체화된 메만틴의 합성은 도 15에 나타낸 합성 경로를 통해 수행하였다. 합성 경로의 제1 단계는 실온에서 2시간 동안 MeOH 중에서 이루어졌다. 제2 단계는 0℃에서 2시간 동안 피리딘(pyridine) 존재 하에 CH2Cl2 중에서 수행되었다. 제3 단계는 55℃에서 5일 동안 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)의 존재 하에 DMF 중에서 수행되었다. 최종 단계(접합)는, 실온에서 2시간 동안 6M 구아니딘, 1.5M 이미다졸 버퍼 중에서 수행되었다.
2'-피리딜디티오 에탄올(2'-pyridyldithio ethanol). N2 분위기 하에 자석 교반 막대가 구비되고 건조된 둥근 바닥 플라스크에서, 2'-알드리티올(2'-aldrithiol, 4.71g, 21.3mmol, 3당량)을 무수(dry) MeOH(20mL)에 용해시킨 후, 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol, 0.56g, 7.1mmol, 0.5mL, 1당량)을 주사기를 통해 적가(dropwise) 첨가하였다. 반응물을 주변 온도(ambient temperature)에서 2시간동안 방치한 후 진공 속에서(in vacuo) 농축하였다. 미정제 황색 오일을 실리카겔 플래쉬(flash) 크로마토그래피(EtOAc:CH2Cl2, 2:8)로 정제하여, 2'-피리딜디티오 에탄올을 투명한 오일(1.33g, 100%)로 얻었다. Rf = 0.48; 1H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) δ 8.49 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.57 (td, J = 7.7, 1.8 Hz, 1H), 7.44 - 7.36 (m, 1H), 7.16 - 7.11 (m, 1H), 5.32 (s, 1H), 3.88 - 3.73 (m, 2H), 3.01 - 2.89 (m, 2H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 159.31, 149.86, 137.00, 122.12, 121.57, 58.37, 42.83.
4-니트로페닐(2-(피리딘-2-일디설파닐)에틸) 카르보네이트. N2 분위기 하에 자석 교반 막대가 구비되고 건조된 둥근 바닥 플라스크에서, 2'-피리딜디티오 에탄올(1.33g, 7.1mmol, 1당량) 및 무수 피리딘(0.56g, 8.5mmol, 0.575mL, 1.2당량)을 무수 CH2Cl2(15mL)에 희석하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 니트로페닐 클로로포르메이트(1.72g, 8.5mmol, 1.2당량)를 한번에 첨가하였다. 반응물을 10분 동안 교반하고, 주변 온도에 도달하도록 한 후 교반 하에 2시간 동안 방치하였다. 반응물을 50mL로 희석하고, 3×H2O(30mL) 및 염수(30mL)로 추출하고, MgSO4로 건조한 후 여과하고 진공 속에서 농축하였다. 미정제 오일을 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피(헵탄:EtOAc, 2:1)로 정제하여 4-니트로페닐(2-(피리딘-2-일디설파닐)에틸) 카르보네이트를 투명한 점성 오일(2.21g, 89%)로 얻었다. Rf = 0.34; 순도 >95%(HPLC), Rt = 15.99분; UPLC/MS(ESI): C14H12N2O5S2 [M+H]+에 대한 m/z 계산치 = 353.0, 실측치 353.3 m/z; 1H NMR(600MHz, DMSO-d6) δ 8.47(ddd, J = 4.8, 1.9, 0.9Hz, 1H), 8.35 - 8.26(m, 2H), 7.84(td, J = 7.8, 1.8Hz, 1H), 7.78(dt, J = 8.1, 1.1Hz, 1H), 7.58 - 7.48(m, 2H), 7.26(ddd, J = 7.3, 4.8, 1.1Hz, 1H), 4.48(t, J = 6.0Hz, 2H), 3.24(t, J = 6.1Hz, 2H); 13C NMR(151MHz, DMSO) δ 158.65, 155.17, 151.75, 149.66, 145.18, 137.80, 125.40, 122.53, 121.40, 119.52, 66.54, 36.42.
2-(피리딘-2-일디설판일)에틸 (3,5-디메틸아다만탄-1-일)카르바메이트 N2 분위기 하에 자석 교반 막대가 구비되고 건조된 둥근 바닥 플라스크에서, 4-니트로페닐 (2-(피리딘-2-일디설파닐)에틸) 카르보네이트(707mg, 2.00mmol, 1당량) 및 메만틴 염산염(650mg, 3.00mmol, 1.5당량)을 무수 DMF(20mL)에 용해하고 무수 DIPEA(260mg, 6.00mmol, 0.35mL, 3당량)를 주사기를 통해 첨가하였다. 메만틴은 완전히 용해되지 않았고 DIPEA를 첨가하자 반응물은 즉시 황색으로 변했다. 반응물을 5일 동안 방치한 후 80℃로 가열하였다. 이어서 반응물을 EtOAc(50mL)와 함께 분별깔때기로 옮기고 DMF를 제거하기 위해 5×반 포화 염수(50mL) 및 염수(50mL)로 완전히 세척하였다. 이어서 유기층을 5×1M NaOH 수용액(50mL)으로 (수성층의 황색이 없어질 때까지)로 추출하고, MgSO4로 건조하고, 여과한 후, 진공 속에서 농축하였다. 구배(헵탄:EtOAc, 9:1에서 3:1)로 용리하는 실리카 겔 플래시 크로마토그래피로 미정제 오일을 정제하여 2-(피리딘-2-일디설파닐)에틸 (3,5-디메틸아다만탄-1-일)카르바메이트를 유리질의(glassy) 점성 오일 형태로 얻었다(540mg, 54%). Rf = 0.26; 순도 >95%(HPLC), Rt = 19.36분; UPLC/MS(ESI): C20H28N2O2S2 [M+H]+에 대한 m/z 계산치 = 393.2, 실측치 393.4 m/z; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.46 (ddd, J = 4.8, 1.9, 0.9 Hz, 1H), 7.85 - 7.75 (m, 2H), 7.25 (ddd, J = 7.2, 4.8, 1.2 Hz, 1H), 6.89 (s, 1H), 4.10 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.05 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.69 - 1.63 (m, 2H), 1.54 - 1.43 (m, 4H), 1.31 - 1.20 (m, 5H), 1.07 (s, 2H), 0.80 (s, 6H); 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 159.04, 153.78, 149.55, 137.79, 121.21, 119.23, 60.80, 51.40, 50.18, 47.07, 42.22, 37.46, 31.84, 30.05, 29.46.
GLP-1 Cys40 및 GLP-1 Cys40/메만틴은 앞서 기술된 프로토콜을 사용하여 제조하였다. RP-UPLC 및 ESI-LCMS 분석으로 순도는 >95%로 측정되었다.
GLP-1 Pen40/메만틴(페니실라민 링크)의 제조
화학적 링커로 유도체화된 메만틴의 합성은 도 15에 개시된 합성 경로를 이용하여 수행되었다. GLP-1 Pen40과 메만틴은 도 16에 도시된 화학반응에 따라 접합되었고, 이는 실온에서 2시간 동안 6M 구아니딘, 1.5M 이미다졸 버퍼 중에서 수행되었다.
GLP-1 Cys40/MK801(시스테인 링크)의 제조
SEQ ID NO:1의 서열을 갖는 펩티드는 앞서 개시된 Fmoc 프로토콜을 사용하여 합성되었고 화학적 링커 유도체화된 MK801 유사체와 접합되었다. 화학 링커 유도체화된 MK801의 합성은 도 1에 개시된 두 번째 합성 경로를 통해 수행되었다. 17. DMF에서 DIPEA 존재 하에 55℃에서 5일 동안 화학 반응을 수행하였다.
링커 유도체화된 MK801은 도 1에 도시된 화학적 반응에 의해 GLP-1 Cys40에 접합되었다. 18. 실온에서 2시간 동안 6M 구아니딘, 1.5M 이미다졸 완충액에서 반응을 수행하였다.
2-(피리딘-3-일디술파닐)에틸 5-메틸-10,11-디히드로-5H-5,10-에피미노디벤조[a,d][7]아눌렌-12-카르복실레이트. N2 분위기 하에 자석 교반 막대가 구비되고 화염 건조(flame-dried)된 슐렝크(schlenk) 둥근 바닥 플라스크에서, MK801 염산염 191mg, 0.86mmol, 1.2당량을 무수 DMF(10mL)에 용해한 다음 4-니트로페닐(2-(피리딘-2-일디설파닐)에틸) 카르보네이트(253mg, 0.72mmol, 1.0당량)을 첨가하였다. 이어서, 무수 DIPEA(375μL, 2.14mmol, 3.0당량)를 첨가하였고 용액이 황색으로 변했다. UPLC-MS에 따라 출발 물질이 완전히 소모된 것으로 나타날 때까지 반응물을 오일 배스(oil bath)에서 55℃로 가열하고 4일 동안 교반하였다. 반응물을 EtOAc(50 mL)로 희석하고 반 포화 염수(5×60mL), 0.5M NaOH 수용액(5×60mL) 및 염수로 철저하게 세척하였다. 유기층을 수집하고 MgSO4로 건조한 다음 여과하고 진공 속에서 농축하였다. 분취 HPLC(preparative HPLC, 등용매 60% B로 용리, 17mL/분)에 의한 정제 후 동결건조하여 11을 투명한 고체 형태로 얻었다(250.2mg, 80.1%); 순도 >95%(HPLC), Rt = 18.17분; UPLC/MS(ESI): C24H22N2O2S2 [M+H]+에 대한 m/z 계산치 = 435.1, 실측치 435.4; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.41 (dt, J = 4.8, 1.4 Hz, 1H), 7.68 (dt, J = 7.9, 4.1 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.38 - 7.31 (m, 1H), 7.25 - 7.15 (m, 4H), 7.15 - 7.06 (m, 2H), 7.01 - 6.87 (m, 1H), 5.38 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 4.27 - 4.13 (m, 2H), 3.59 (dd, J = 17.3, 5.7 Hz, 1H), 3.10 (s, 2H), 2.67 - 2.58 (m, 1H), 2.20 (s, 3H); 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 158.92, 149.56, 143.37, 139.04, 137.70, 131.78, 130.25, 127.42, 127.34, 127.31, 125.88, 122.12, 121.66, 121.20, 119.19, 65.33, 62.21, 59.20, 37.55.
GLP-1 Cys40/MK801은 앞서 개시된 프로토콜을 사용하여 2-(피리딘-3-일디설파닐)에틸 5-메틸-10,11-디히드로-5H-5,10-에피미노디벤조[a,d][7]아눌렌-12-카르복실레이트 및 GLP-1 Cys40으로부터 제조되었다. RP-UPLC 및 ESI-LCMS 분석으로 생성물을 확인하고 순도는 >95%로 측정되었다.
GLP-1 hCys40/MK801(호모시스테인 링크)의 제조
SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 및 hCys40 변형을 갖는 펩티드를 앞서 개시된 Fmoc 프로토콜을 사용하여 합성하고, 화학적 링커로 유도체화된 MK801 유사체와 접합시켰다. 링커로 유도체화된 MK801의 화학적 합성은 도 19에 도시된 합성 경로를 통해 수행되었다. 화학반응은 상온에서 2시간 동안 6M 구아니딘, 1.5M 이미다졸 완충액 중에서 수행되었다.
GLP-1 hCys40: SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 및 hCys40 변형을 갖는 펩티드를 앞서 개시된 프로토콜을 사용하여 제조하였다. RP-UPLC 및 ESI-LCMS 분석 결과 순도는 >95%로 측정되었다. GLP-1 hCys40/MK801은 앞서 개시된 프로토콜을 사용하여 제조하였다. RP-UPLC 및 ESI-LCMS 분석 결과 순도는 >95%로 측정되었다.
GLP-1 Pen40/MK801(페닐실라민 링크)의 제조
GLP-1 펩티드 유도체는 앞서 개시된 Fmoc 프로토콜을 사용하여 합성되었고, 화학적 링커로 유도체화된 MK801 유사체와 접합되었다. 화학적 링커로 유도체화된 MK801의 화학적 합성은 도 16에 개시된 경로를 통해 수행되었다.
GLP-1 Pen40/MK801: 접합체는 앞서 개시된 프로토콜을 사용하고 도 20에 나타낸 화학 반응에 의해 제조되었으며, 화학 반응은 상온에서 2시간 동안 6M 구아니딘, 1.5M 이미다졸 완충액 중에서 수행되었다. RP-UPLC 및 ESI-LCMS 분석 결과 순도는 >95%로 측정되었다.
예 2: 시험관내 인간 혈장 안정성의 조사.
체외 인간 혈장 안정성 검정: 구연산 인산 덱스트로스(citrate phosphate dextrose, 3H Biomedical, lot P22)를 함유하는 정상 인간 혈장을 사용하여 펩티드 안정성을 측정하였다. 인간 혈장은 37℃에서 15분 동안 예열하였다. 이어서, 인간 혈장 360μL에 40μL의 GLP-1 Pen40/MK801, GLP-1 hCys40/MK801, 또는 GLP-1 Cys40/MK801 접합체 스톡 용액(1mM, DMSO 중의 10mM 펩티드 스톡을 PBS 완충액으로 희석하여 제조)을 첨가하고, 37℃에서 가볍게 진탕하면서 배양하였다. t = 0 및 5번의 추가적인 시점(접합체의 안정성에 따라 다름)에서 45μL의 분액(aliquot)을 수집하고 0℃에서 요소(urea) 버퍼(50μL, 30분)로 전처리한 다음, 아세톤 중의 20% 트리클로로아세트산으로 처리하고 -20℃에서 밤새 배양하였다. 원심분리(13400rpm, 30분) 후, 상청액을 여과하고 214nm에서 RP-UPLC 및 ESI-LCMS로 분석하였다. 프리즘(prism) 8.0을 사용하여 곡선 아래 면적(AUC)을 그리고 측정하였다. 반감기(T1/2)는 데이터를 1상 감쇠 방정식(one-phase decay equation)에 피팅하여 측정하였다. 데이터는 세 번의 개별 실험의 평균으로 나타낸다.
예 3: 식이 유도 비만(DIO) 마우스에서의 체내 약리학 연구
C57BL6J 수컷 마우스(이하 식이 유도 비만(DIO) 마우스라고 함)는 고지방식이(지방으로부터 58% 에너지)를 유지했으며, 각 연구에서 연구 시작 전의 평균 체중이 45g을 초과하였다. 마우스는 개별적으로 또는 두 마리씩(double-housed) 수용되었다. 마우스는 21 내지 23℃에서 12시간의 조명-암흑 주기로 유지되었다. 화합물은 1일 1회(오후 2시에서 오후 5시 사이) 피하 투여하였고, 음식 섭취량(FI) 및 체중(BW)을 해당하는 시간에 측정하였다. 체성분의 경우, MRI 스캐너(EchoMRI)를 사용하여 연구 전(연구 시작 1 내지 3일 전)과 연구 마지막 날에 지방 및 제지방량 측정을 수행했다. 매개체(식염수)을 주사한 마우스 군이 대조군으로 사용되었다.
예 4: 음식을 공급한(chow-fed) 마우스에서 수크로스 선호도 시험
C57BL6J 수컷 마우스를 우리에 단독으로 수용하고 사료 식이(chow diet)를 유지하였다. 10nmol/kg의 용량으로 투여된 세마글루티드를 제외하고, 모든 화합물은 1일 1회 100nmol/kg의 용량으로 피하 투여하였다. 매개체(식염수)을 주입한 마우스 군이 대조군으로 사용되었다. 각 치료군에는 8마리의 마우스가 포함되었다. 모든 우리에는 2개의 음료 병이 장착되었고, 마우스는 연구 시작 전 최소 5일동안 순응기간을 거쳤다. 연구 시작 시에 물병은 물이 담긴 병 1개와 10%(w/v) 수크로스 수용액이 들어 있는 병 1개로 교체되었다. 수크로스 병은 특정 측 선호에 대하여 보정하기 위해 왼쪽 및 오른쪽 병으로 균등하게 분배되었다. 수크로스 물 섭취량과 물 섭취량은 24시간 후 병의 무게를 달아 측정하였다.

Claims (15)

  1. 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1) 수용체에서 천연(native) GLP-1 대비 적어도 0.1% 활성을 보이는 펩티드 및 N-메틸-D-아스파르테이트 수용체(NMDAR) 길항제를 포함하는 접합된(conjugated) 분자에 있어서,
    상기 펩티드는 직접 또는 화학적 링커(linker)를 통해 상기 NMDAR 길항제에 공유 결합되는,
    접합된 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 NMDAR 길항제는, 유리 형태(free form)에서, NMDA 수용체와 약 0.5nM에서 1000nM까지의 범위 내의 해리 상수 Kd를 가지는,
    접합된 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 펩티드는 글루카곤-수퍼패밀리(glucagon-superfamily)에 속하는,
    접합된 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩티드는, SEQ ID NO:1과 적어도 80%의 아미노산 서열 일치도를 가지는,
    접합된 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩티드는, 적어도 10개의 아미노산으로 구성되며, 60개 이하의 아미노산으로 구성되는,
    접합된 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NMDAR 길항제는, 상기 펩티드의 C-말단 영역에서 공유 결합되는,
    접합된 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NMDAR 길항제는 절단 가능한 화학적 링커(cleavable chemical linker)를 통하여 상기 펩티드에 공유 결합되며,
    상기 절단 가능한 화학적 링커는, 산-절단 가능(acid-cleavable) 링커, 효소-절단 가능(enzyme-cleavable) 링커, 펩티드-절단 가능 링커, 및 디설파이드기(disulfide group)를 포함하는 링커로부터 선택되는,
    접합된 분자.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 화학적 링커는 화학식 R1-R3-S-S-R4-R5-O-CO-R2를 가지되,
    R1은 펩티드이고, R2는 NMDAR 길항제이고, R3은 선택적으로 존재하며, 존재하는 경우 C(CH3)2, CH2-CH2, 또는 CH2 중에서 선택되고 상기 펩티드의 측쇄(side chain)에, 또는 상기 펩티드 주쇄(backbone chain)의 탄소 원자에 결합되고, R4는 (CH2)n 또는 C6H4이고, R5는 선택적으로 존재하며, 존재하는 경우 C(CH3)2, CH2-CH2, 또는 CH2 중에서 선택되고, n은 1, 2, 3, 또는 4인,
    접합된 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NMDAR 길항제는 MK801, 네라멕산(neramexane), 또는 메만틴(memantine)인,
    접합된 분자.
  10. 제1항 내지 제9항에 있어서,
    치료 요법에 사용하기 위한 용도를 가지는,
    접합된 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    비만, 폭식 장애, 인슐린 저항성, 2형 당뇨병, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염, 또는 비알코올성 지방간 질환의 치료에 사용하기 위한 용도를 가지는,
    접합된 분자.
  12. 약학 조성물에 있어서,
    (i) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 접합된 분자 또는 상기 접합된 분자의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (ii) 약학적으로 허용 가능한 운반체를 포함하는,
    약학 조성물.
  13. 포유동물의 체중 감소 방법에 있어서,
    상기 포유동물에게 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 접합된 분자 또는 제12항에 따른 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는,
    포유동물의 체중 감소 방법.
  14. 포유동물의 체중 감소를 위한 비치료적(non-therapeutic) 요법에 있어서,
    상기 포유동물에게 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 접합된 분자를 경구 투여하는 단계를 포함하는,
    포유동물의 체중 감소를 위한 비치료적 요법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 포유동물은 비병원성(non-pathogenic) 체질량 지수(BMI)를 가지는,
    포유동물의 체중 감소를 위한 비치료적 요법.
KR1020237000201A 2020-06-03 2021-06-03 Glp1r 작용제 nmdar 길항제 접합체 KR20230022949A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20178057 2020-06-03
EP20178057.4 2020-06-03
PCT/EP2021/064930 WO2021245199A1 (en) 2020-06-03 2021-06-03 Glp1r agonist nmdar antagonist conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230022949A true KR20230022949A (ko) 2023-02-16

Family

ID=70977443

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237000201A KR20230022949A (ko) 2020-06-03 2021-06-03 Glp1r 작용제 nmdar 길항제 접합체

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20230183335A1 (ko)
EP (1) EP4161577A1 (ko)
JP (1) JP2023528921A (ko)
KR (1) KR20230022949A (ko)
CN (1) CN115697414A (ko)
AU (1) AU2021285138A1 (ko)
BR (1) BR112022024680A2 (ko)
CA (1) CA3181300A1 (ko)
WO (1) WO2021245199A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023099723A1 (en) 2021-12-02 2023-06-08 Københavns Universitet Peptide-drug conjugates for treatment of neurodegenerative diseases
WO2024030934A2 (en) * 2022-08-05 2024-02-08 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon-like peptide-1 receptor antagonists

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2592065A1 (en) 2004-12-22 2007-04-26 Centocor, Inc. Glp-1 agonists, compositions, methods and uses
CA2634784A1 (en) 2005-12-22 2007-07-05 Centocor, Inc. Human glp-1 mimetibodies and compositions for treating obesity and related disorders, methods and uses
TW200843794A (en) 2006-12-21 2008-11-16 Centocor Inc Use of long-acting GLP-1 receptor agonists to improve insulin sensitivity and lipid profiles
WO2011143208A1 (en) * 2010-05-13 2011-11-17 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon superfamily peptides exhibiting g protein-coupled receptor activity
MX2012014576A (es) * 2010-06-24 2013-02-21 Univ Indiana Res & Tech Corp Profarmacos de peptido de la superfamilia de glucagon basado en amida.
EP3707156A4 (en) * 2017-11-08 2021-08-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. OLIGONUCLEOTIDES CONJUGATED TO A LIGAND FRACTION OF THE GLP-1 RECEPTOR AND THEIR USES
US11578100B2 (en) * 2018-03-28 2023-02-14 Florida Atlantic University Research Corporation Cyclic peptides, cyclic peptide conjugates and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CA3181300A1 (en) 2021-12-09
WO2021245199A1 (en) 2021-12-09
AU2021285138A1 (en) 2023-02-02
EP4161577A1 (en) 2023-04-12
CN115697414A (zh) 2023-02-03
JP2023528921A (ja) 2023-07-06
BR112022024680A2 (pt) 2022-12-27
US20230183335A1 (en) 2023-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7386218B2 (ja) グルカゴン及びｇｌｐ－１共アゴニスト化合物
TWI617574B (zh) 用於治療肥胖之升糖素與ｇｌｐ－１共促效劑
CN105307672B (zh) 用于医学用途的稳定、延长的glp-1/胰高血糖素受体共激动剂
AU2009248041B2 (en) Long-acting Y2 and/or Y4 receptor agonists
KR20160079875A (ko) Ｇｉｐ-ｇｌｐ-1 이원 효능제 화합물 및 방법
CN101842386A (zh) 截短的glp-1衍生物和它们的治疗用途
KR102505628B1 (ko) 글루카곤 및 glp-1 수용체의 장기-작용성 공-효능제
WO2011033068A1 (en) Long-acting y2 receptor agonists
ES2805326T3 (es) Coagonistas estables del receptor de GLP-1/glucagón basados en GLP-1
KR20230022949A (ko) Glp1r 작용제 nmdar 길항제 접합체
KR20180014754A (ko) 페길화된 옥신토모둘린 변이체
CN116854804A (zh) 酰化胃泌酸调节素肽类似物
WO2017197048A1 (en) Albumin binding conjugate compositions and methods of making and using same
US20220056077A1 (en) Dual agonist glp-1 and neurotensin fusion peptide
CA3239054A1 (en) Peptide-drug conjugates for treatment of neurodegenerative diseases

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination