CN104583233B

CN104583233B - 表现出gip受体活性的胰高血糖素的类似物

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Publication number: CN104583233B
Application number: CN201380043984.5A
Authority: CN
Inventors: R.D.迪马奇; D.L.斯米利; K.H.布莱歇尔; E.A.基塔斯
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; Indiana University Research and Technology Corp
Current assignee: Novo Nord Investment 3 Co.,Ltd.; Novo Nordisk AS; Indiana University Research and Technology Corp; MB2 LLC
Priority date: 2012-06-21
Filing date: 2013-06-18
Publication date: 2018-10-23
Anticipated expiration: 2033-06-18
Also published as: PL2864350T3; RS57347B1; US20150368310A1; SI2864350T1; JP2015528795A; JP6300239B2; KR20150039748A; EP2864350A1; PH12014502857A1; PE20150863A1; EA029025B1; CL2014003421A1; DK2864350T3; PT2864350T; AU2013277372A1; EA201590065A1; HUE039267T2; MY185217A; BR112014031671A2; US20180105569A1

Abstract

本文提供了胰高血糖素类似物，其在GIP受体处表现出有效活性，且因此预见到用于治疗糖尿病和肥胖症。在示例性实施方案中，本公开内容的胰高血糖素类似物在GIP受体处表现出在纳摩尔或皮摩尔范围内的EC50。

Description

表现出GIP受体活性的胰高血糖素的类似物

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年6月21日提交的美国临时专利申请号61/662,874和2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/787,973的优先权；每篇申请的内容通过引用整体并入本申请中。

通过引用并入以电子格式呈递的材料

通过引用整体并入与本文一起呈递并如下识别的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表：107千字节ACII (文本)文件，名称为“224560SeqListing.txt”，创建于2013年3月14日。

背景技术

根据美国糖尿病协会国家糖尿病简报的最新数据，美国有2360万名儿童和成年人患有糖尿病。每年有160万名年龄在20岁或以上的人被诊断为糖尿病的新病例。根据美国医学会杂志(Journal of the American Medical Association)最近发表的一项研究，超过三分之二的美国成年人为超重或肥胖(Flegal等人, JAMA 303(3): 235-241 (2010))，且这部分人口的三分之一以上为肥胖。

肠降血糖素激素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和葡萄糖依赖性的促胰岛素肽(GIP)是天然存在的肽激素。GLP-1和GIP均以葡萄糖依赖性的方式刺激胰岛素合成和分泌，而不会产生低血糖症(参见，例如，Nauck等人, J. Clin. Endocrinol. Metab. 76:912-917(1993)和Irwin等人, Regul. Pept. 153:70-76 (2009))。

GLP-1已被证明可有效作为糖尿病的辅助治疗，且与重量减轻相关。但是，目前关于以GIP为靶标的疗法仍不清楚的是，能否通过拮抗该激素的作用(例如通过GIP受体拮抗作用)或通过模拟或增强GIP的该作用而实现糖尿病和肥胖的成功治疗。

发明内容

本文提供了肽，其是GIP激动剂肽，意图用于治疗有此需要的对象，例如患糖尿病和肥胖的对象。

天然的胰高血糖素不会活化GIP受体，且通常在GLP-1受体处具有天然GLP-1的活性的约1%。在某些实施方案中，所述肽为胰高血糖素类似物，其包含基于天然人胰高血糖素的氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)的结构，但其与SEQ ID NO: 1相比在一个或多个位置存在差异，其中所述差异或修饰会增强所述类似物在GIP受体的激动剂活性。这样的胰高血糖素类似物将在GIP受体处具有比天然胰高血糖素更高的激动剂活性，且在某些方面，大于天然GIP的激动剂活性。在某些或任何实施方案中，所述GIP激动剂具有至少0.1%的GIP百分比效能。在本公开内容的某些或任何方面，所述胰高血糖素类似物还在胰高血糖素受体和GLP-1受体之一或二者处表现出激动剂活性。因此，本文提供了GIP激动剂、GIP-GLP-1共激动剂、GIP-胰高血糖素共激动剂和GIP-GLP-1-胰高血糖素三激动剂。

在示例性实施方案中，本公开内容的GIP激动剂肽对人GLP-1受体的选择性比GIP受体小100倍。在某些或任何实施方案中，所述GIP激动剂肽的GIP百分比效能与胰高血糖素百分比效能和/或GLP-1百分比效能相差(高于或低于)20倍或10倍以内。

本公开内容提供了胰高血糖素的类似物(SEQ ID NO: 1)，其包含

(A)在位置1处的包含Tyr、His、硫代Ala或Phe的侧链的氨基酸，其中所述在位置1的氨基酸的α碳连接至选自以下的结构：

(i) H₂N-(CH₂)_-

(ii) H₂N-

(iii) H(乙酰基)N-(CH₂)_0-1-；和

(iv) H-或CH₃-

(B)在位置9、10、12、16、20或37-43中的任一个处包含酰化的或烷基化的氨基酸的氨基酸，任选地其中所述非天然的酰基或烷基经由间隔物连接至这样的氨基酸；

(C)在位置16-21中的一个或多个处的稳定α螺旋的氨基酸，和

(D)相对于SEQ ID NO: 1的至多10个(例如，至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)额外氨基酸修饰，

其中所述在位置1处的氨基酸是L-立体异构体或D-立体异构体，

其中，任选地，所述在位置1处的氨基酸不是L-His和L-Tyr，

其中，当所述胰高血糖素类似物缺少亲水部分时，所述胰高血糖素类似物在人GIP受体处表现出小于或约0.5 nM的EC50，且其中所述胰高血糖素类似物对人GLP-1受体的选择性比GIP受体小100倍。

贯穿本申请，所有以数字提及的特定氨基酸位置(例如，位置28)表示在天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)中的该位置或在其任何类似物中的对应氨基酸位置处的氨基酸。例如，对于其中已经删除SEQ ID NO: 1的第一个氨基酸的胰高血糖素类似物，文中提及“位置28”是指对应位置27。类似地，对于其中已经在SEQ ID NO: 1的N-端前面添加一个氨基酸的胰高血糖素类似物，文中提及“位置28”是指对应位置29。

在某些实施方案中，所述GIP激动剂肽包含SEQ ID NO: 11-18、21-23、25-31、33-36、38、39、100-139、141-155、157-173、175-194和196-200中的任一个的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述GIP激动剂肽包含这样的结构：其基于包含SEQ ID NO: 11-18、21-23、25-31、33-36、38、39、100-139、141-155、157-173、175-194和196-200中的任一个的亲本序列，但是与所述亲本序列在一个或多个位置处存在差异，如在本文中进一步描述的。在某些实施方案中，所述GIP激动剂肽包含SEQ ID NO: 156、174和195中的任一个的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述GIP激动剂肽包含这样的结构：其基于包含SEQ ID NO: 156、174和195中的任一个的亲本序列，但是与所述亲本序列在一个或多个位置处存在差异，如在本文中进一步描述的。在某些实施方案中，所述GIP激动剂肽包含SEQ ID NO: 201或202的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述GIP激动剂肽包含这样的结构：其基于包含SEQ ID NO:201和202中的任一个的亲本序列，但是与所述亲本序列在一个或多个位置处存在差异，如在本文中进一步描述的。在前述基于亲本序列的肽的示例性方面，所述氨基酸修饰发生在除了位置1以外的位置。

因此，本发明提供了一种肽，其包含SEQ ID NO: 11的序列、基本上由该序列组成或由该序列组成。还提供了一种肽，其包含SEQ ID NO: 12的序列、基本上由该序列组成或由该序列组成。本发明还提供了一种肽，其包含SEQ ID NO: 13的序列、基本上由该序列组成或由该序列组成。另外提供了一种肽，其包含SEQ ID NO: 15的序列、基本上由该序列组成或由该序列组成。还提供了一种肽，其包含SEQ ID NO: 16的序列、基本上由该序列组成或由该序列组成。本发明另外提供了一种肽，其包含SEQ ID NO: 22的序列、基本上由该序列组成或由该序列组成。此外，本发明提供了一种肽，其包含：

a. 与SEQ ID NO: 11相比具有至多3个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 11的序列；

b. 与SEQ ID NO: 12相比具有至多3个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 12的序列，

c. 与SEQ ID NO: 13相比具有至多3个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 13的序列，

d. 与SEQ ID NO: 15相比具有至多3个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 15的序列，

e. 与SEQ ID NO: 16相比具有至多3个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 16的序列，

f. 与SEQ ID NO: 22相比具有至多3个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 15的序列，

其中所述肽在人GIP受体和人GLP-1受体处表现出激动剂活性，且所述肽对人GLP-1受体的选择性比GIP受体小100倍。在包含SEQ ID NO: 11-13、15、16和22的序列中的任一个且具有至多3个(例如，1个、2个、3个)氨基酸修饰的肽的示例性方面，所述氨基酸修饰发生在除了位置1以外的位置。

本发明提供了一种肽，其包含

(a)序列

其中：

X₁选自乙酰基L-His、乙酰基L-Tyr、乙酰基L-硫代Ala、乙酰基D-His、乙酰基D-Tyr、乙酰基D-硫代Ala、乙酰基β-2-L-His、乙酰基β-2-L-Tyr、乙酰基β-2-L-硫代Ala、乙酰基β-2-D-His、乙酰基β-2-D-Tyr、乙酰基β-2-D-硫代Ala、脱氨基L-His、脱氨基L-Tyr、脱氨基L-硫代Ala、脱氨基D-His、脱氨基D-Tyr、脱氨基D-硫代Ala、脱氨基β-2-L-His、脱氨基β-2-L-Tyr、脱氨基β-2-L-硫代Ala、脱氨基β-2-D-His、脱氨基β-2-D-Tyr、脱氨基β-2-D-硫代Ala、D-His、D-Tyr、D-硫代Ala、β-2-D-His、β-2-D-Ala、β-2-D-硫代Ala、β-2-L-His、β-2-L-Tyr、β-2-L-硫代Ala和L-硫代Ala；

X₂是Ala、Gly、Pro、肌氨酸、Ser和Val，

X₃是Gln，包含结构I、II或III的侧链的氨基酸，疏水氨基酸，酸性氨基酸，或碱性氨基酸，或是选自以下的氨基酸：Glu、Ala、Leu、Ile、Nle、Val、NorVal、高丝氨酸、Met、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、乙酰基-Orn、乙酰基-二氨基丁酸和乙酰基-Lys；其中结构I、II和III是：

结构I

结构II

结构III

其中R¹是C_0-3烷基或C_0-3杂烷基；R²是NHR⁴或C_1-3烷基；R³是C_1-3烷基；R⁴是H或C_1-3烷基；X是NH、O或S；且Y是NHR⁴、SR³或OR³。

X₁₀是Tyr或共价地连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸；

X₁₅是酸性氨基酸，任选地是Glu或Asp；

X₁₆是任意氨基酸，任选地是除了Gly、Pro和Ser以外的任意氨基酸；例如，Glu、Ala、α,α-二取代的氨基酸(例如，AIB)、His、Lys

X₁₇是Arg、His、Gln；

X₁₈是Arg或Ala；

X₁₉是Ala或α,α-二取代的氨基酸；

X₂₀选自：α,α-二取代的氨基酸(例如，AIB)或Gln或His、Lys或Ala；

X₂₁是酸性氨基酸，任选地是Asp或Glu；

X₂₇是Leu、Ala、Nle或Met；

X₂₈是Ala或酸性氨基酸(任选地是Asp或Glu)；

X₂₉是脂族，例如，Ala或Gly或AIB或Val；

X₃₀是小脂族氨基酸，例如，Ala或Gly

X₃₅是Ala或碱性氨基酸(任选地是Arg或Lys)；

其中，当X₂₈是酸性氨基酸时，X35是碱性氨基酸；

其中，任选地，当X₂₈是Asp时，那么X₂₉不是Gly

其中，当X10是Tyr时，所述肽包含在位置40处共价地连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且，其中，任选地，所述肽包含在位置41处的Gly，

其中所述肽的C端氨基酸被酰胺化；

或者

(b)与SEQ ID NO: 35相比具有至多3个氨基酸修饰的序列SEQ ID NO: 35，

其中所述肽在人GIP受体和人GLP-1受体和/或人胰高血糖素受体处表现出激动剂活性，任选地，其中所述胰高血糖素类似物对人GLP-1受体的选择性比GIP受体小100倍。

本发明提供了一种肽，其包含

(a) 序列

其中：

X₁选自乙酰基L-His、乙酰基L-Tyr、乙酰基L-硫代Ala、乙酰基L-Phe、乙酰基D-His、乙酰基D-Tyr、乙酰基D-硫代Ala、乙酰基D-Phe、乙酰基β-2-L-His、乙酰基β-2-L-Tyr、乙酰基β-2-L-硫代Ala、乙酰基β-2-L-Phe、乙酰基β-2-D-His、乙酰基β-2-D-Tyr、乙酰基β-2-D-硫代Ala、乙酰基β-2-D-Phe、脱氨基L-His、脱氨基L-Tyr、脱氨基L-硫代Ala、脱氨基L-Phe、脱氨基D-His、脱氨基D-Tyr、脱氨基D-硫代Ala、脱氨基D-Phe、脱氨基β-2-L-His、脱氨基β-2-L-Tyr、脱氨基β-2-L-硫代Ala、脱氨基β-2-L-Phe、脱氨基β-2-D-His、脱氨基β-2-D-Tyr、脱氨基β-2-D-硫代Ala、脱氨基β-2-D-Phe、D-His、D-Tyr、D-硫代Ala、D-Phe、β-2-D-His、β-2-D-Ala、β-2-D-硫代Ala、β-2-D-Phe、β-2-L-His、β-2-L-Tyr、β-2-L-硫代Ala、β-2-L-Phe和L-硫代Ala；

X₂是Ala、Gly、Pro、肌氨酸、Ser和Val，

结构I

结构II

结构III

其中R¹是C_0-3烷基或C_0-3杂烷基；R²是NHR⁴或C_1-3烷基；R³是C_1-3烷基；R⁴是H或C_1-3烷基；X是NH、O或S；且Y是NHR⁴、SR³或OR³；

X₁₀是Tyr或共价地连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸；

X₁₅是酸性氨基酸，任选地是Glu或Asp；

X₁₇是Arg、His、Gln；

X₁₈是Arg或Ala；

X₁₉是Ala或α,α-二取代的氨基酸；

X₂₁是酸性氨基酸，任选地是Asp或Glu；

X₂₇是Leu、Ala、Nle或Met；

X₂₈是Ala或酸性氨基酸(任选地是Asp或Glu)；

X₂₉是脂族，例如，Ala或Gly或AIB或Val或Leu；

X₃₀是小脂族氨基酸，例如，Ala或Gly

X₃₅是Ala或碱性氨基酸(任选地是Arg或Lys)；

其中，当X₂₈是酸性氨基酸时，X35是碱性氨基酸；

其中，任选地，当X₂₈是Asp时，那么X₂₉不是Gly

其中所述肽的C端氨基酸被酰胺化；

或者

(b)与SEQ ID NO: 140相比具有至多3个氨基酸修饰的序列SEQ ID NO: 140，其中所述肽在人GIP受体和人GLP-1受体和/或人胰高血糖素受体处表现出激动剂活性，任选地，其中所述胰高血糖素类似物对人GLP-1受体的选择性比GIP受体小100倍。

在包含SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 140的序列且具有至多3个(例如，1个、2个、3个)氨基酸修饰的肽的示例性方面，所述氨基酸修饰发生在除了位置1以外的位置。

本文还提供了包含两个或更多个本公开内容的GIP激动剂肽的二聚体和多聚体。本文还提供了包含本公开内容的GIP激动剂肽以及缀合部分的缀合物。在某些方面，所述缀合物为融合多肽，其包含与异源肽融合的本公开内容的GIP激动剂肽。本公开内容还提供了试剂盒，其包含本公开内容的GIP激动剂肽、二聚体、多聚体或缀合物(或它们的组合)。

本公开内容还提供了药物组合物，其包含本公开内容的GIP激动剂肽、二聚体、多聚体或缀合物中的任一种(或它们的组合)，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。所述药物组合物优选地为无菌的，且适合于胃肠外施用。所述药物组合物意图用于治疗或预防糖尿病或肥胖或与糖尿病或肥胖相关的医学病症的方法中。因此，在示例性实施方案中，本公开内容提供了减少重量增加或诱导重量减轻的方法、治疗或预防糖尿病或肥胖的方法、以及诱导肠道暂时性麻痹的方法。在以下描述中提供了所述肽类似物和包含它们的药物组合物的其它应用。

附图说明

图1代表如在研究的第7天测量的体重总变化(%)的图。

图2代表皮下地注射如所示的媒介物对照或肽的DIO小鼠的总食物摄入(如在第7天测量)的图。

图3代表皮下地注射如所示的媒介物对照或肽的DIO小鼠的脂肪量(如在第0和7天测量)的量的图。

图4代表皮下地注射如所示的媒介物对照或肽的DIO小鼠的血糖水平变化(mg/dL；第7天的水平-第0天的水平)的图。

图5A-D代表胰高血糖素的示例性类似物的氨基酸序列。

图6代表已经皮下地注射10 nmol/kg的指定SEQ ID NO的肽、媒介物对照或利拉糖肽的dbdb小鼠的进食葡萄糖特性的图。

具体实施方式

本公开内容提供了GIP激动剂肽(例如，天然人胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的类似物(也被称作“胰高血糖素类似物”)，SEQ ID NO: 11-18、21-23、25-31、33-36、38、39、100-200中的任一个的类似物)，其在GIP受体处表现出激动剂活性。本文中使用的术语“肽”包括2个或更多个氨基酸的序列，且通常是少于100个或少于50个氨基酸的序列。氨基酸可以为天然存在的氨基酸或编码的氨基酸或非天然存在的氨基酸或非编码的氨基酸。非天然存在的氨基酸表示不会天然地存在于体内、但是可以掺入本文中所述的肽结构内的氨基酸。本文中使用的“非编码”表示不是下列20种氨基酸中任一种的L-异构体的氨基酸：Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr。术语“GIP激动剂肽”表示与GIP受体结合并激活下游信号传递的化合物。GIP激动剂肽可以在GIP受体处具有任何活性水平(例如，绝对活性水平或相对活性水平)、对GIP受体的选择性或GIP百分比效能，如本文所述。参见，例如，标题为“GIP受体活性”的部分。但是，此术语不应解释为将所述化合物限制为仅在GIP受体处具有活性。相反，本公开内容的GIP激动剂肽可以在其它受体处表现出另外的活性，这在本文中进一步讨论。例如，GIP激动剂肽可以在GLP-1受体和/或胰高血糖素受体处表现出激动剂活性。

本文公开的肽的活性

GIP受体活性

在某些或任何实施方案中，本公开内容的肽表现出对于GIP受体活化而言在纳摩尔范围内的EC50。在示例性实施方案中，所述肽在GIP受体处的EC50小于1000 nM、小于900nM、小于800 nM、小于700 nM、小于600 nM、小于500 nM、小于400 nM、小于300 nM、小于200nM。在某些实施方案中，所述肽在GIP受体处的EC50是约100 nM或更小，例如，约75 nM或更小、约50 nM或更小、约25 nM或更小、约10 nM或更小、约5 nM或更小、或约1 nM或更小。在某些或任何实施方案中，本公开内容的肽表现出对于GIP受体活化而言在皮摩尔范围内的EC50。在示例性实施方案中，所述GIP激动剂肽在GIP受体处的EC50小于1000 pM、小于900pM、小于800 pM、小于700 pM、小于600 pM、小于500 pM、小于400 pM、小于300 pM、小于200pM。在某些实施方案中，所述肽在GIP受体处的EC50是约100 pM或更小，例如，约75 pM或更小、约50 pM或更小、约25 pM或更小、约10 pM或更小、约5 pM或更小、或约1 pM或更小。本文中使用的术语“约”是指所述数值或数值范围±10%，但并不意图将任何数值或数值范围仅指定为该较宽的定义。前面具有术语“约”的每个数值或数值范围也意图涵盖所述绝对数值或数值范围的实施方案。

确定肽对于受体(例如，GIP受体)的活化的EC50的合适方法是本领域已知的。本文中在实施例3描述了一个示例性的体外测定，其中在过表达GIP受体的HEK293细胞中测量由荧光素酶活性所代表的cAMP诱导。

在某些或任何实施方案中，与天然人胰高血糖素相比，本公开内容的肽在GIP受体处表现出增强的活性。天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)不会活化GIP受体；天然胰高血糖素在GIP受体处表现出的活性基本上为天然GIP的0%(例如，小于0.001%、小于0.0001%)。将肽与天然胰高血糖素相比在GIP受体处的相对活性计算为(本公开内容的肽的EC50/天然胰高血糖素的EC50) x 100%的反比。

将肽与天然GIP相比在GIP受体处的相对活性计算为(本公开内容的肽的EC50/天然GIP的EC50) x 100%的反比(该值在本文中也被称作“GIP百分比效能”)。

在本公开内容的某些或任何实施方案中，本公开内容的肽表现出至少或约0.1%的GIP百分比效能。在示例性实施方案中，所述肽在GIP受体处表现出天然GIP活性的至少或约0.5%、至少或约1%、至少或约5%、至少或约10%、至少或约20%、至少或约30%、至少或约40%、至少或约50%、至少或约60%、至少或约70%、至少或约80%、至少或约90%、或至少或约100%。

在本公开内容的某些实施方案中，本公开内容的肽在GIP受体处表现出的活性大于天然GIP。在示例性实施方案中，所述GIP激动剂肽表现出至少或约125%、至少或约150%、至少或约175%至少或约200%、至少或约300%、至少或约400%、至少或约500%、至少或约600%、至少或约700%、至少或约800%、至少或约900%、或至少或约1000%的GIP百分比效能。在某些实施方案中，本文描述的GIP激动剂肽表现出不超过1000%或不超过10,000%的GIP百分比效能。

在某些方面，本公开内容的肽表现出在约0.001至约10,000 %、或约0.01至约10,000 %、或约0.1至约10,000 %、或约1至约10,000 %、或约0.001至约5000 %、或约0.01至约5000 %、或约0.1至约5000 %、或约0.1至约1000 %范围内的GIP百分比效能。

共激动剂

在某些或任何实施方案中，本公开内容的肽为共激动剂肽，只要其活化GIP受体以及不同于GIP受体的第二受体。

GIP/GLP-1共激动剂

作为一个实例，在某些方面，本公开内容的肽在GIP受体和GLP-1受体处均表现出活性(“GLP-1/GIP受体共激动剂”)。在某些方面，所述肽在GLP-1和GIP受体处表现出活性，但是胰高血糖素活性已被显著降低或破坏，例如通过在位置3处的氨基酸修饰。例如，酸性、碱性或疏水性氨基酸(谷氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸)在此位置的替代会降低胰高血糖素活性。在某些或任何实施方案中，GIP激动剂肽是在胰高血糖素受体出表现出天然胰高血糖素的活性的约10%或更低(例如，约5%或更低、或约1%或更低、或约0.1%或更低)的肽。

在某些或任何实施方案中，本公开内容的肽在GIP受体处的EC50与其在GLP-1受体的EC50相差(高于或低于)约50倍或更少、约40倍或更少、约30倍或更少、约20倍或更少、或约10倍或更少、或约5倍或更少。例如，在GIP受体处的EC50可以比在GLP-1受体处的EC50高10倍或低10倍。在某些或任何实施方案中，本公开内容的肽的GIP百分比效能与其GLP-1百分比效能相差(高于或低于)小于或约50、40、30、20、10或5倍。

因此，本公开内容的肽对人GLP-1受体的选择性比GIP受体小100倍。本文中使用的术语分子对第一受体相对于第二受体的“选择性”表示下述比例：所述分子在第二受体处的EC50除以所述分子在第一受体处的EC50。例如，如果分子在第一受体处具有1 nM的EC50且在第二受体处具有100 nM的EC50，则所述分子对第一受体相对于第二受体的选择性为100倍。在示例性实施方案中，本公开内容的肽对人GLP-1受体相对于GIP受体的选择性小于100倍(例如，小于或约90倍、小于或约80倍、小于或约70倍、小于或约60倍、小于或约50倍、小于或约40倍、小于或约30倍、小于或约20倍、小于或约10倍、小于或约5倍)。

在某些或任何实施方案中，与天然人胰高血糖素相比，本公开内容的肽在GLP-1受体处表现出增强的活性。天然胰高血糖素在天然GLP-1受体处的活性为天然GLP-1的约1%。将肽在GLP-1受体处相对天然胰高血糖素的相对活性计算为(本公开内容的肽的EC50/天然胰高血糖素的EC50) x 100%的反比。

将肽在GLP-1受体处相对天然GLP-1的相对活性计算为(本公开内容的肽的EC50/天然GLP-1的EC50) x 100%的反比(该值在本文中被称作“GLP-1百分比效能”)。

在本公开内容的某些或任何实施方案中，本公开内容的肽表现出至少或约0.1%的GLP-1百分比效能。在示例性实施方案中，所述肽表现出至少或约0.5%、至少或约1%、至少或约5%、至少或约10%、至少或约20%、至少或约30%、至少或约40%、至少或约50%、至少或约60%、至少或约70%、至少或约80%、至少或约90%、或至少或约100%的GLP-1百分比效能。

在本公开内容的某些实施方案中，本公开内容的肽在GLP-1受体处表现出的活性大于天然GLP-1。在示例性实施方案中，本公开内容的肽表现出至少或约125%、至少或约150%、至少或约175%至少或约200%、至少或约300%、至少或约400%、至少或约500%、至少或约600%、至少或约700%、至少或约800%、至少或约900%、或至少或约1000%的GLP-1百分比效能。在某些实施方案中，本公开内容的肽表现出不超过1000%或不超过10,000%的GIP百分比效能。

GIP/胰高血糖素共激动剂

作为另一个实施例，在某些方面，本公开内容的肽在GIP受体和胰高血糖素受体处均表现出活性(“胰高血糖素/GIP受体共激动剂”)。在某些实施方案中，GLP-1活性已经被显著降低或破坏，例如通过在位置7处的氨基酸修饰(例如，用Ile替换)，将位置27或28处的氨基酸的C端的氨基酸删除，从而得到27-或28-氨基酸肽，或它们的组合。在某些实施方案中，本公开内容的肽是在GLP-1受体处表现出天然GLP-1的活性的约10%或更少(例如，约5%或更少、或约1%或更少、或约0.1%或更少)的肽。

在某些或任何实施方案中，本公开内容的肽在GIP受体处的EC50与其在胰高血糖素受体处的EC50相差(高于或低于)约50倍或更少、约40倍或更少、约30倍或更少、约20倍或更少、或约10倍或更少、或约5倍或更少。在某些或任何实施方案中，本公开内容的肽的GIP百分比效能与其胰高血糖素百分比效能相差(高于或低于)小于或约50、40、30、20、10或5倍。

在某些实施方案中，与天然人胰高血糖素相比，本公开内容的肽在胰高血糖素受体处表现出增强的活性。将肽与天然胰高血糖素相比在胰高血糖素受体处的相对活性计算为(本公开内容的肽的EC50/天然胰高血糖素的EC50) x 100%的反比(该值在本文中被称作“胰高血糖素百分比效能”)。

在本公开内容的某些实施方案中，本公开内容的肽表现出至少或约0.1%的胰高血糖素百分比效能。在示例性实施方案中，所述肽表现出至少或约0.5%、至少或约1%、至少或约5%、至少或约10%、至少或约20%、至少或约30%、至少或约40%、至少或约50%、至少或约60%、至少或约70%、至少或约80%、至少或约90%、或至少或约100%的胰高血糖素百分比效能。

在本公开内容的某些实施方案中，本公开内容的肽在胰高血糖素受体表现出的活性大于天然胰高血糖素。在示例性实施方案中，本公开内容的肽表现出至少或约125%、至少或约150%、至少或约175%至少或约200%、至少或约300%、至少或约400%、至少或约500%、至少或约600%、至少或约700%、至少或约800%、至少或约900%、或至少或约1000%的胰高血糖素百分比效能。在某些实施方案中，本公开内容的肽表现出不超过1000%或不超过10,000%的胰高血糖素百分比效能。

三激动剂

在某些实施方案中，本公开内容的肽在除GIP受体以外的两种或更多种受体处表现出活性。因此，在某些方面，本公开内容提供了GIP三激动剂肽。在某些方面，本公开内容的肽在胰高血糖素受体、GIP受体和GLP-1受体中的每一种处表现出活性(“胰高血糖素/GIP/GLP-1三激动剂”)。

在某些实施方案中，本公开内容的肽在GIP受体处的EC50与本公开内容的肽相比在(a)GLP-1受体、(b)胰高血糖素受体或两者处的EC50相差(高于或低于) 50倍或更少、20倍或更少、或10倍或更少。在某些实施方案中，本公开内容的肽在GIP受体处的EC50与其在GLP-1受体处的EC50相差(高于或低于)约40倍、约30倍、约20倍以内，且任选地，与其在胰高血糖素受体处的EC50相差约50倍以内。在某些实施方案中，本公开内容的肽的GIP百分比效能与(a)其GLP-1百分比效能、(b)其胰高血糖素百分比效能或两者相差(高于或低于)小于或约50倍、20倍或10倍。在某些实施方案中，本公开内容的肽的GIP百分比效能与其GLP-1百分比效能相差(高于或低于)约40倍、约30倍、约20倍以内，且任选地，与其胰高血糖素百分比效能相差约50倍以内。在某些实施方案中，本公开内容的肽对人GLP-1受体不具有相对于GIP受体的至少100倍选择性。在示例性实施方案中，本公开内容的肽对人GLP-1受体相对于GIP受体的选择性小于100倍(例如，小于或约90倍、小于或约80倍、小于或约70倍、小于或约60倍、小于或约50倍、小于或约40倍、小于或约30倍、小于或约20倍、小于或约10倍、小于或约5倍)。

在没有GLP-1激动和胰高血糖素激动存在下的GIP激动

在某些实施方案中，本公开内容的肽仅在GIP受体处表现出活性，而不在任何其它受体（例如，GLP-1受体、胰高血糖素受体）处表现出活性。在示例性实施方案中，本公开内容的肽在GIP受体处表现出活性，并且胰高血糖素和GLP-1活性已经显著降低或破坏，例如通过在位置3和7处的氨基酸修饰。在某些实施方案中，本公开内容的肽是表现出约10%或更少(例如，约5%或更少、或约1%或更少、或约0.1%或更少)的GLP-1百分比效能的肽。在某些实施方案中，本公开内容的肽是表现出约10%或更少(例如，约5%或更少、或约1%或更少、或约0.1%或更少)的胰高血糖素百分比效能的肽。

缀合物的活性

在某些或任何实施方案中，如在本文中进一步描述的，当将本公开内容的肽与异源部分(例如，亲水部分(例如，聚乙二醇))缀合时，与游离或未缀合形式的本公开内容的肽相比，本公开内容的肽表现出降低的活性(例如，更低的百分比效能或更高的EC50)。因而，预见到，当将任意前述绝对活性水平(例如GIP百分比效能、GLP-1百分比效能或胰高血糖素百分比效能，但非相对比率)应用于缀合形式(例如，聚乙二醇化)的肽时，这样的绝对活性水平降低了约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或100倍，并且，这样的成倍降低的活性水平也在本公开内容的范围内预见到。相反，当为未缀合时，本公开内容的肽表现出的GIP百分比效能是当与异源部分(例如，亲水部分(例如，聚乙二醇))缀合时的本公开内容的肽的效能的约10倍、约20倍、约30倍、约40倍、约50倍、约100倍或更多倍。

本文公开的肽的结构

胰高血糖素类似物

在某些实施方案中，本公开内容的肽的与天然人胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)在结构上类似，例如，是天然人胰高血糖素的类似物(在本文中也被称作“胰高血糖素类似物”或“胰高血糖素的肽类似物”)。本文中使用的术语“胰高血糖素类似物”和“胰高血糖素的肽类似物”等、表示与天然人胰高血糖素在结构上类似的肽，且这些术语不一定暗示所述肽会活化胰高血糖素受体。

在某些或任何实施方案中，本公开内容的肽是天然人胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的类似物，其包含基于SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的氨基酸序列，但是与SEQ ID NO: 1的差异在于，所述胰高血糖素类似物的氨基酸序列包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个，且在某些情况下，16个或更多个(例如，17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个等))指定的或任选的氨基酸修饰。在某些或任何实施方案中，与天然人胰高血糖素序列(SEQ ID NO: 1)相比，本公开内容的肽包含总共1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个或至多10个额外氨基酸修饰(例如，除了指定的氨基酸修饰以外)。在某些或任何实施方案中，所述修饰为本文描述的那些中的任一种，例如，酰化、烷基化、聚乙二醇化、C端截短或在位置1、2、3、7、10、12、15、16、17、18、19、20、21、23、24、27、28和29中的一个或多个处的氨基酸置换。

本文中使用的“氨基酸修饰”表示：(i)将SEQ ID NO: 1的氨基酸置换为不同的氨基酸(天然存在的或编码的或非编码的或非天然存在的氨基酸)、(ii)向SEQ ID NO: 1添加氨基酸(天然存在的或编码的或非编码的或非天然存在的氨基酸)或(iii)删除SEQ ID NO:1的一个或多个氨基酸。

在某些或任何实施方案中，氨基酸置换为保守氨基酸置换，例如在位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29中一个或多个处氨基酸的保守置换。本文中使用的术语“保守氨基酸置换”在本文中被定义为一个氨基酸被置换为具有类似性质的另一个氨基酸，所述性质是例如大小、电荷、疏水性、亲水性和/或芳香性，并且包括下列五组之一内部的交换：

I. 小的、脂族的、非极性的或弱极性的残基：

Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；

II. 极性的、带负电荷的残基以及它们的酰胺和酯：

Asp、Asn、Glu、Gln、半胱磺酸和高半胱磺酸；

III. 极性的、带正电荷的残基：

His、Arg、Lys；鸟氨酸(Orn)

IV. 大的、脂族的、非极性的残基：

Met、Leu、Ile、Val、Cys、正亮氨酸(Nle)、高半胱氨酸

V. 大的、芳族残基：

Phe、Tyr、Trp、乙酰基苯丙氨酸

在替代实施方案中，氨基酸置换不是保守氨基酸置换，例如是非保守氨基酸置换。

本文中使用的术语“带电荷的氨基酸”表示包含侧链的氨基酸，该侧链在生理pH的水溶液中带负电(即去质子化的)或带正电(即质子化的)。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、半胱磺酸、高半胱磺酸和高谷氨酸，而带正电的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带电荷的氨基酸包括20种编码氨基酸中的带电荷的氨基酸，以及非典型的或非天然存在的或非编码的氨基酸中的带电荷的氨基酸。本文中使用的术语“酸性氨基酸”表示包含第二酸性部分(除了氨基酸的α羧酸以外)的氨基酸，所述第二酸性部分包括例如侧链羧酸或磺酸基团。

在某些实施方案中，本公开内容的肽包含与天然人胰高血糖素的氨基酸序列(SEQID NO: 1)具有至少25%序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开内容的肽包含与SEQ ID NO: 1具有至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或具有大于90%序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，具有上述序列同一性百分比的本文公开的肽的氨基酸序列是本文公开的肽的全长氨基酸序列。在某些实施方案中，具有上述序列同一性百分比的本公开内容的肽的氨基酸序列仅是本文公开的肽的氨基酸序列的一部分。在某些实施方案中，本文公开的肽包含与SEQ ID NO: 1的至少5个连续氨基酸(例如，至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸)的参照氨基酸序列具有约A%或更大序列同一性的氨基酸序列，其中所述参照氨基酸序列开始于在SEQ ID NO: 1的位置C处的氨基酸且终止于在SEQ ID NO: 1的位置D处的氨基酸，其中A是25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99；C是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，且D是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29。预见到前述参数的任意和所有可能的组合，包括、但不限于，例如，其中A是90%，且C和D是1和27、或6和27、或8和27、或10和27、或12和27、或16和27。

本文描述的天然人胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的类似物可以包含任何数目的氨基酸的肽主链，即，可以具有任意肽长度。在某些实施方案中，本文描述的肽与SEQ ID NO:1的长度相同，即，长度为29个氨基酸。在某些实施方案中，本文公开的肽的长度大于29个氨基酸，例如，本文公开的肽包含1-21个氨基酸的C端延伸，如在本文中进一步描述的。因此，在某些实施方案中，本公开内容的肽的长度为30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸。在某些实施方案中，本公开内容的肽的长度为至多50个氨基酸。在某些实施方案中，由于与另一个肽融合，本公开内容的肽的长度大于29个氨基酸(例如，大于50个氨基酸(例如，长度为至少或约60个、至少或约70个、至少或约80个、至少或约90个、至少或约100个、至少或约150个、至少或约200个、至少或约250个、至少或约300个、至少或约350个、至少或约400个、至少或约450个、至少或约500个氨基酸)。在其它实施方案中，本公开内容的肽的长度小于29个氨基酸，例如28个、27个、26个、25个、24个、23个氨基酸。

根据上文的描述，在某些方面，本公开内容的肽为包含基于SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的天然人胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的类似物，该序列包含一个或多个氨基酸修饰，所述修饰会影响GIP活性、胰高血糖素活性和/或GLP-1活性，增加稳定性(例如，通过减少所述肽的降解(例如，通过提高对DPP-IV蛋白酶的抗性))，增加溶解度，增加半衰期，延迟作用的开始，延长在GIP、胰高血糖素或GLP-1受体处的作用的持续时间，或前述任意的组合。除了其它修饰以外，在下面进一步描述了这样的氨基酸修饰，且这些修饰中的任一个可以单独使用或组合使用。

包含非天然酰基的氨基酸

根据某些或任何实施方案，为胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的类似物的GIP激动剂肽包含含有非天然酰基的氨基酸(在本文中被称作“酰化的氨基酸”，不论其是如何制备的，例如通过向肽内掺入预先酰化的氨基酸，或在合成后将肽酰化)。在某些或任意方面，酰化的氨基酸位于胰高血糖素类似物的位置9、10、12、13、14、16、17、20、37、38、39、40、41、42或43中的任意位置。在示例性方面，酰化的氨基酸位于胰高血糖素类似物的位置9、10、12、16、20或40中的任意位置，或位于胰高血糖素类似物的位置10、13、14、16、17或40中的任意位置。在示例性方面，酰化的氨基酸位于位置10、14和40中的任意一个或多个位置。在示例性方面，酰化的氨基酸位于肽类似物的位置10、12或16中的任意位置。

在某些实施方案中，酰化的氨基酸使GIP激动剂肽具有以下的一项或多项：(i)延长的循环半衰期、(ii)延迟的作用开始、(iii)延长的作用持续时间、(iv)增强的对蛋白酶(诸如DPP-IV)的抗性、以及(v)增强的在GIP受体、GLP-1受体和胰高血糖素受体中任意一个或多个处的效能。

直接酰化

在某些实施方案中，将酰基直接连接至GIP激动剂肽的氨基酸。根据一个实施方案，GIP激动剂肽包含通过酯、硫代酸酯或酰胺键连接至肽的酰基。

在具体方面，GIP激动剂肽包含通过将GIP激动剂肽的氨基酸的侧链的胺、羟基或巯基直接酰化而得到的酰基。在某些实施方案中，酰化是在GIP激动剂肽的位置9、10、12、13、14、16、17、20或40处(例如，在位置10、14和40中的任一个处)。在这点上，GIP激动剂肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其经修饰的氨基酸序列，所述经修饰的氨基酸序列包含一个或多个本文描述的氨基酸修饰，其中GIP激动剂肽在位置9、10、12、13、14、16、17、20和40处(例如，在位置10、14和40中的任一个处)的氨基酸中的至少一个是包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸。

在某些实施方案中，所述包含侧链胺的氨基酸是式I的氨基酸：

其中n = 1-4

[式I]。

在某些实施方案中，式I的氨基酸是其中n是4 (Lys)或n是3 (Orn)的氨基酸。在某些实施方案中，所述包含侧链胺的氨基酸是包含侧链胺的芳族氨基酸。在示例性方面，包含侧链胺的芳族氨基酸是4-氨基-苯丙氨酸(4-氨基Phe)、对氨基苯基甘氨酸、对氨基高苯丙氨酸或3-氨基酪氨酸。在示例性方面，包含侧链胺的芳族氨基酸是4-氨基-Phe。

在其它实施方案中，所述包含侧链羟基的氨基酸是式II的氨基酸:

其中n = 1-4

[式II]。

在某些示例性实施方案中，所述式II的氨基酸是其中n是1的氨基酸(Ser)。在示例性方面，式II的氨基酸是其中n是2的氨基酸(高丝氨酸)。在相似的示例性实施方案中，所述包含侧链羟基的氨基酸是Thr或高苏氨酸。在相似的示例性实施方案中，所述包含侧链羟基的氨基酸是包含侧链羟基的芳族氨基酸。在示例性方面，包含侧链羟基的芳族氨基酸是酪氨酸、高酪氨酸、甲基-酪氨酸或3-氨基酪氨酸。

在其它实施方案中，所述包含侧链巯基的氨基酸是式III的氨基酸：

其中n = 1-4

[式III]。

在某些示例性实施方案中，所述式III的氨基酸是其中n是1的氨基酸(Cys)。

在其它实施方案中，包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸是二取代的氨基酸，其包含与式I、式II或式III相同的结构，但是与式I、式II或式III的氨基酸的α碳键合的氢被第二侧链替换。

酰化间隔物

在替代实施方案中，所述酰基通过间隔物连接至GIP激动剂肽的氨基酸，其中所述间隔物位于GIP激动剂肽的氨基酸和酰基之间。在某些实施方案中，所述GIP激动剂肽包含位于所述肽和酰基之间的间隔物。在某些实施方案中，所述GIP激动剂肽与间隔物共价结合，所述间隔物与酰基共价结合。

在某些实施方案中，所述间隔物为包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸，或包含含有侧链胺、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽。间隔物所连接的氨基酸可以是包含允许与间隔物连接的部分的任何氨基酸(例如，单或双α-取代的氨基酸)。例如，包含侧链NH₂、-OH或-COOH的氨基酸(例如，Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)是合适的。关于此点，在某些方面，GIP激动剂肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其经修饰的氨基酸序列，所述经修饰的氨基酸序列包含一个或多个如本文描述的氨基酸修饰，其中在位置9、10、12、13、14、16、17、20和37-43(例如，位置10、14或40)处的氨基酸中的至少一个为包含侧链胺、羟基或羧酸酯的氨基酸。

在某些实施方案中，所述间隔物为包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸，或包含含有侧链胺、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽。

当所述酰基通过间隔物的胺基连接时，在某些方面，所述酰基通过α胺或通过间隔物氨基酸的侧链胺连接。在酰基通过α胺连接的情况下，所述间隔物的氨基酸可以为任何氨基酸。例如，所述间隔物的氨基酸可以为疏水氨基酸，例如，Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸和8-氨基辛酸。可替换地，在某些方面，所述间隔物的氨基酸为酸性残基，例如，Asp、Glu、高谷氨酸、高半胱磺酸、半胱磺酸、γ-谷氨酸。

在所述酰基通过氨基酸间隔物的侧链胺连接的情况下，所述间隔物是包含侧链胺的氨基酸，例如，式I的氨基酸(例如，Lys或Orn)。在该情况下，α胺和间隔物的氨基酸的侧链胺都可能连接至酰基，使得所述GIP激动剂肽被双酰化。本发明的实施方案包括这样的双酰化的分子。在某些实施方案中，所述酰基连接至4-氨基-Phe、对氨基苯基甘氨酸、对氨基高苯丙氨酸或3-氨基酪氨酸。

当所述酰基通过间隔物的羟基连接时，所述氨基酸或二肽或三肽的氨基酸之一可以为式II的氨基酸。在一个具体的示例性实施方案中，所述氨基酸是Ser。在相似的示例性实施方案中，所述酰基连接至Thr或高苏氨酸。在相似的示例性实施方案中，所述酰基通过包含侧链羟基的芳族氨基酸的羟基连接，所述芳族氨基酸是例如，酪氨酸、高酪氨酸、甲基-酪氨酸或3-氨基酪氨酸。

当所述酰基通过间隔物的巯基连接时，所述氨基酸或二肽或三肽的氨基酸之一可以为式III的氨基酸。在一个具体的示例性实施方案中，所述氨基酸是Cys。

在某些实施方案中，所述间隔物是亲水的双功能间隔物。在示例性实施方案中，所述亲水的双功能间隔物包含两个或更多个反应基团，例如，胺、羟基、巯基和羧基或它们的任意组合。在示例性实施方案中，所述亲水的双功能间隔物包含羟基和羧酸酯。在其它实施方案中，所述亲水的双功能间隔物包含胺基和羧酸酯。在其它实施方案中，所述亲水的双功能间隔物包含巯基和羧酸酯。在一个具体实施方案中，所述间隔物包含聚(烷氧基)羧酸氨基酯。在这点上，所述间隔物可以包含，例如，NH₂(CH₂CH₂O)_n(CH₂)_mCOOH，其中m是1-6的任意整数，且n是2-12的任意整数，例如，8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，其可商购得自PeptidesInternational, Inc. (Louisville, KY)。

在示例性实施方案中，所述间隔物包含小聚乙二醇部分(PEG)，其包含结构[-O-CH₂-CH₂-]_n，其中n是2-16的整数(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16)。这样的小PEG在本文中被称作“miniPEG”。在示例性方面，miniPEG为官能化的miniPEG，其包含一个或多个官能团。合适的官能团包括、但不限于胺、羟基、巯基和羧基或它们的任意组合。在示例性方面，miniPEG为miniPEG酸，其包含结构{[-O-CH₂-CH₂-]_n-COO-}，其中n如上面所定义。在示例性方面，miniPEG为酰氨基miniPEG，其包含结构{-N- CH₂- CH₂-[-O-CH₂-CH₂-]_n}，其中n如上面所定义。在示例性方面，miniPEG为酰氨基miniPEG酸，其包含结构{-N- CH₂- CH₂-[-O-CH₂-CH₂-]_n-COO-}，其中n如上面所定义。在用miniPEG将氨基酸酰化中使用的合适试剂可商购得自供货商，例如Peptides International(Louisvelle, KY)。并且，用miniPEG将氨基酸酰化的合适技术在本申请中也有描述(参见实施例1)。

在某些实施方案中，所述间隔物是疏水的双功能间隔物。疏水的双功能间隔物是本领域已知的。参见，例如，Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (AcademicPress, San Diego, CA, 1996)，其通过引用整体并入。在示例性实施方案中，疏水的双功能间隔物包含两个或更多个反应基团，例如，胺、羟基、巯基和羧基或它们的任意组合。在示例性实施方案中，疏水的双功能间隔物包含羟基和羧酸酯。在其它实施方案中，疏水的双功能间隔物包含胺基和羧酸酯。在其它实施方案中，疏水的双功能间隔物包含巯基和羧酸酯。包含羧酸酯和羟基或巯基的合适的疏水的双功能间隔物是本领域已知的，包括例如8-羟基辛酸和8-巯基辛酸。

在某些实施方案中，所述双功能间隔物不是包含介于羧酸酯基之间的1-7个碳原子的未分支亚甲基的二羧酸。在某些实施方案中，所述双功能间隔物为包含介于羧酸酯基之间的1-7个碳原子的未分支亚甲基的二羧酸。

在具体实施方案中，所述间隔物(例如，氨基酸、二肽、三肽、亲水的双功能间隔物或疏水的双功能间隔物)的长度为3-10个原子(例如，6-10个原子(例如，6个、7个、8个、9个、或10个原子))。在更具体实施方案中，所述间隔物的长度为约3-10个原子(例如，6-10个原子)，酰基为C12至C18脂肪酰基，例如C14脂肪酰基、C16脂肪酰基，使得间隔物和酰基的总长度是14-28个原子，例如，约14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27或28个原子。在某些实施方案中，间隔物和酰基的长度是17-28 (例如，19-26、19-21)个原子。

根据某些或任意前述实施方案，所述双功能间隔物可以为合成的或天然存在的含有3至10个原子长度的氨基酸主链的氨基酸(包括、但不限于，本文描述的那些中的任一种)(例如，6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸和8-氨基辛酸)。可替换地，所述间隔物可以为具有3至10个(如6至10个原子)原子长度的肽主链的二肽或三肽间隔物。二肽或三肽间隔物的每个氨基酸可以与二肽或三肽的其它氨基酸相同或不同，且可以独立地选自天然存在的或编码的和/或非编码的或非天然存在的氨基酸，包括，例如，天然存在的氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr)的任意D或L异构体，或选自以下的非天然存在的或非编码的氨基酸的任意D或L异构体：β-丙氨酸(β-Ala)、N-α-甲基-丙氨酸(Me-Ala)、氨基丁酸(Abu)、γ-氨基丁酸(γ-Abu)、氨基己酸(ε-Ahx)、氨基异丁酸(Aib)、氨基甲基吡咯甲酸、氨基哌啶甲酸、氨基丝氨酸(Ams)、氨基四氢吡喃-4-甲酸、精氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、β-天冬氨酸(β-Asp)、氮杂环丁烷甲酸、3-(2-苯并噻唑基)丙氨酸、α-叔丁基甘氨酸、2-氨基-5-脲基-正戊酸(瓜氨酸、Cit)、β-环己基丙氨酸(Cha)、乙酰氨基甲基-半胱氨酸、二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dpr)、二羟基苯丙氨酸(DOPA)、二甲基噻唑烷(DMTA)、γ-谷氨酸(γ-Glu)、高丝氨酸(Hse)、羟脯氨酸(Hyp)、异亮氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、甲基-异亮氨酸(MeIle)、4-哌啶甲酸(Isn)、甲基-亮氨酸(MeLeu)、甲基-赖氨酸、二甲基-赖氨酸、三甲基-赖氨酸、甲醇基脯氨酸、甲硫氨酸-亚砜(Met(O))、甲硫氨酸-砜(Met(O₂))、正亮氨酸(Nle)、甲基-正亮氨酸(Me-Nle)、正缬氨酸(Nva)、鸟氨酸(Orn)、对-氨基苯甲酸(PABA)、青霉胺(Pen)、甲基苯丙氨酸(MePhe)、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、4-硝基苯丙氨酸(Phe(4-NO₂))、4-氰基苯丙氨酸((Phe(4-CN))、苯基甘氨酸(Phg)、哌啶基丙氨酸、哌啶基甘氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、吡咯烷基丙氨酸、肌氨酸(Sar)、硒代半胱氨酸(Sec)、O-苄基-磷酸丝氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸(Sta)、4-氨基-5-环己基-3-羟基戊酸(ACHPA)、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸(AHPPA)、1,2,3,4,-四氢-异喹啉-3-甲酸(Tic)、四氢吡喃甘氨酸、噻吩基丙氨酸(Thi或硫代Ala)、O-苄基-磷酸酪氨酸、O-磷酸酪氨酸、甲氧基酪氨酸、乙氧基酪氨酸、O-(双-二甲基氨基-膦酰基)-酪氨酸、酪氨酸硫酸四丁基胺、甲基-缬氨酸(MeVal)和烷基化的3-巯基丙酸。在示例性方面，所述间隔物是Cys残基或Lys残基。

在某些实施方案中，所述间隔物包含总体负电荷，例如，包含一个或两个带负电的氨基酸。在某些实施方案中，所述二肽不是通式结构A-B的二肽中的任一种，其中A选自Gly、Gln、Ala、Arg、Asp、Asn、Ile、Leu、Val、Phe和Pro，其中B选自Lys、His、Trp。在某些实施方案中，二肽间隔物的氨基酸选自Ala、β-Ala、Leu、Pro、γ-氨基丁酸、Glu和γ-Glu。

在某些示例性实施方案中，GIP激动剂肽包含通过间隔物的胺、羟基或巯基的酰化而产生的酰基，所述间隔物连接至在位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43处(例如，在位置10、14和40中的任意一个或多个处)的氨基酸的侧链，或者在GIP激动剂肽C端氨基酸处。

在更具体的实施方案中，酰基连接至肽类似物的位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43中的任一个处(例如，在位置10、14和40中的任一个或多个处)的氨基酸，间隔物和酰基的长度为14-28个原子。在某些方面，位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43中的任一个处(例如，在位置10、14和40中的任一个或多个处)的氨基酸是式I的氨基酸，例如Lys，或与式I有关的二取代的氨基酸。在更具体的实施方案中，所述肽类似物缺乏分子内桥，例如，共价分子内桥。例如，胰高血糖素类似物可以是包含一个或多个用来稳定所述类似物α螺旋的α,α-二取代的氨基酸(例如，AIB)的胰高血糖素类似物。

酰基

所述酰化的氨基酸的酰基可以为任何大小，例如任何长度碳链，且可以为直链或支链。在某些具体实施方案中，酰基为C₄至C₃₀脂肪酸。例如，酰基可以为C₄脂肪酸、C₆脂肪酸、C₈脂肪酸、C₁₀脂肪酸、C₁₂脂肪酸、C₁₄脂肪酸、C₁₆脂肪酸、C₁₈脂肪酸、C₂₀脂肪酸、C₂₂脂肪酸、C₂₄脂肪酸、C₂₆脂肪酸、C₂₈脂肪酸或C₃₀脂肪酸中的任一种。在某些实施方案中，所述酰基是C₈至C₂₀脂肪酸，例如，C₁₂至C₁₈脂肪酸、C₁₄脂肪酸或C₁₆脂肪酸。在示例性实施方案中，所述酰基是C₁₆至C₃₀脂肪酸，例如，C₂₀至C₂₈脂肪酸、C₁₆至C₂₂脂肪酸。

在一个替代实施方案中，所述酰基是胆汁酸。所述胆汁酸可以为任何合适的胆汁酸，包括、但不限于，胆酸、鹅去氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘胆酸和胆固醇酸。

在示例性实施方案中，所述酰基是琥珀酸或琥珀酸衍生物。本文中使用的“琥珀酸衍生物”是指包含取代的琥珀酸或取代的环琥珀酸(即琥珀酸酐)或取代的扩大环琥珀酸酐(即包含-C(O)-O-C(O)- 部分以及3-5个额外碳的6-8元环)的化合物，其中所述取代的琥珀酸、取代的环琥珀酸(即琥珀酸酐)或取代的扩大环琥珀酸酐被一个或多个烷基链或一个或多个官能化的碳链取代。

在示例性方面，所述琥珀酸衍生物包含式V的结构：

[式V]

其中R和R’中的每一个独立地为H、直链或支链C₄-C₃₀碳链、或直链或支链C₄-C₃₀官能化的碳链。在示例性实施方案中，R和/或R’为包含C₄至C₃₀烷基链的碳链。例如，所述烷基可以为C₄烷基、C₆烷基、C₈烷基、C₁₀烷基、C₁₂烷基、C₁₄烷基、C₁₆烷基、C₁₈烷基、C₂₀烷基、C₂₂烷基、C₂₄烷基、C₂₆烷基、C₂₈烷基或C₃₀烷基中的任一种。在某些实施方案中，所述烷基是C₈至C₂₀烷基，例如，C₁₂至C₁₈烷基、C₁₄烷基或C₁₆烷基。在示例性实施方案中，所述烷基是C₁₆至C₃₀烷基，例如，C₂₀至C₂₈烷基、C₁₆至C₂₂烷基。在示例性方面，所述官能化的碳链包含官能团，所述官能团包括、但不限于羧基、巯基、胺、酮基（ketyl）、亚砜基或酰氨基。

在示例性方面，所述琥珀酸衍生物包含含有式VI的结构的琥珀酸酐：

[式VI]

其中R和R’中的每一个独立地为H、直链或支链C4-C30碳链、或直链或支链C4-C30官能化的碳链。在示例性实施方案中，R和/或R’为包含C₄至C₃₀烷基链的碳链。例如，所述烷基可以为C₄烷基、C₆烷基、C₈烷基、C₁₀烷基、C₁₂烷基、C₁₄烷基、C₁₆烷基、C₁₈烷基、C₂₀烷基、C₂₂烷基、C₂₄烷基、C₂₆烷基、C₂₈烷基或C₃₀烷基中的任一种。在某些实施方案中，所述烷基是C₈至C₂₀烷基，例如，C₁₂至C₁₈烷基、C₁₄烷基或C₁₆烷基。在示例性实施方案中，所述烷基是C₁₆至C₃₀烷基，例如，C₂₀至C₂₈烷基、C₁₆至C₂₂烷基。在示例性方面，所述官能化的碳链包含官能团，所述官能团包括、但不限于羧基、巯基、胺、酮基（ketyl）、亚砜基或酰氨基。

在示例性方面，所述琥珀酸衍生物为琥珀酸酐衍生物，包括式VII的那些：

[式VII]

其中n是1-4，且

当式V-VI的R和R’中仅一个为H时，所述酰化的氨基酸被称作“Cx琥珀酰基”。本文中使用的术语“Cx琥珀酰基”(其中x为整数)表示这样的结构：其中R为y个碳的烷基链，且y= x-1，且y不包括琥珀酰基部分的碳。例如，其中R是C₁₅烷基且R’是H的式VI的结构被称作C₁₆琥珀酰基。例如，预期C₁₆琥珀酰基Lys，其中Lys已经在ε胺处被琥珀酰化。当式V-VI的R和R’均不为H时，则所述酰化的氨基酸被称作“Cx,Cx’琥珀酰基”。本文中使用的术语“Cx,Cx’琥珀酰基”(其中x和x’为整数)表示这样的结构：其中R为y个碳的烷基链，且R’为y’个碳的烷基链，且y’= x’-1。例如，其中R是C₁₅烷基且R’是C₁₃烷基的式VI的结构被称作C₁₆,C₁₄琥珀酰基。当所述琥珀酸衍生物为取代的扩大环琥珀酸酐且式VII的R和R’均不为H时，则所述酰化的氨基酸被称作“Cx,Cx’-n-琥珀酰基”。本文中使用的术语“Cx,Cx’-n-琥珀酰基”(其中x、x’和n为整数)表示这样的结构：其中R为y个碳的烷基链，R’为y’个碳的烷基链，且所述琥珀酸酐环延长n个碳。例如，其中R和R’为C₁₅烷基且n = 2的式VII的结构被称作C₁₆,C₁₆-2-琥珀酰基。

在示例性实施方案中，所述酰基为马来酸或马来酸衍生物。本文中使用的“马来酸衍生物”是指包含取代的马来酸或取代的环马来酸(即马来酸酐)或取代的扩大环马来酸酐(即包含-C(O)-O-C(O)- 部分和3-5额外碳的6-8元环)的化合物，其中所述取代的马来酸、取代的环马来酸(即马来酸酐)或取代的扩大环马来酸酐被一个或多个烷基链或一个或多个官能化的碳链取代。

在示例性方面，所述马来酸衍生物包含式VIII的结构：

[式VIII]

在示例性方面，所述马来酸衍生物包括马来酸酐，其包含式IX的结构：

[式IX]

在示例性方面，所述马来酸衍生物为马来酸酐衍生物，包括式X的那些：

[式X]

其中n是1-4，在两个非羰基碳之间存在至少一个C=C双键，且

当式VIII-IX的R和R’中仅一个为H时，所述酰化的氨基酸被称作“Cx马来酰基”。本文中使用的术语“Cx马来酰基”(其中x为整数)表示这样的结构：其中R为y个碳的烷基链，且y = x-1，且y不包含马来酰基部分的碳。例如，其中R是C₁₅烷基且R’是H的式IX的结构被称作C₁₆马来酰基。当式VIII-IX的R和R’均不为H时，则所述酰化的氨基酸被称作“Cx,Cx’马来酰基”。本文中使用的术语“Cx,Cx’马来酰基”(其中x和x’为整数)表示这样的结构：其中R为y个碳的烷基链，且R’为y’个碳的烷基链，且y’=x’-1。例如，其中R是C₁₅烷基且R’是C₁₃烷基的式IX的结构被称作C₁₆,C₁₄马来酰基。当所述马来酸衍生物为取代的扩大环马来酸酐且式X的R和R’均不为H时，则所述酰化的氨基酸被称作“Cx,Cx’-n-马来酰基”。本文中使用的术语“Cx,Cx’-n-马来酰基”（其中x、x’和n是整数）表示这样的结构：其中R为y个碳的烷基链，R’为y’个碳的烷基链，且马来酸酐环延长n个碳。例如，其中R和R’为C₁₅烷基且n = 2的式X的结构被称作C₁₆,C₁₆-2-马来酰基。

连接酰基的方法

通过肽的胺、羟基和巯基将酰基连接至肽的合适方法是本领域已知的。参见，例如，实施例1和实施例2 (关于通过胺进行酰化的方法)，Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi and Stammer, Int J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982)；和Previero等人, Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972) (关于通过羟基进行酰化的方法)；和San和Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005) (关于通过巯基进行酰化的方法); Bioconjugate Chem. “Chemical Modifications ofProteins: History and Applications”第1、2-12页(1990); Hashimoto等人,Pharmacuetical Res. “Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and theirBiological Activity”第6卷, 第2期第171-176页(1989)。

在某些实施方案中，GIP激动剂肽通过GIP激动剂肽对长链烷烃的酰化而包含酰化的氨基酸。在具体方面，所述长链烷烃包含胺、羟基或巯基(例如，十八烷胺、十四烷醇或十六烷硫醇)，其与GIP激动剂肽的羧基或其活化形式反应。所述GIP激动剂肽的羧基或其活化形式可以为GIP激动剂肽的氨基酸(例如，谷氨酸、天冬氨酸)的侧链的一部分，或可以是肽主链的一部分。

在示例性实施方案中，GIP激动剂肽通过连接至GIP激动剂肽的间隔物对长链烷烃的酰化而包含酰基。在具体方面，所述长链烷烃包含胺、羟基或巯基，其与间隔物的羧基或其活化形式反应。包含羧基或其活化形式的合适的间隔物描述在本文中，并包括例如双功能间隔物，例如，氨基酸、二肽、三肽、亲水的双功能间隔物和疏水的双功能间隔物。

本文中使用的术语“羧基的活化形式”表示具有通式R(C=O)X的羧基，其中X为离去基团，且R为胰高血糖素类似物或间隔物。例如，羧基的活化形式可以包括、但不限于酰氯、酸酐以及酯类。在某些实施方案中，所述活化的羧基为具有N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)离去基团的酯。

关于其中长链烷烃被胰高血糖素肽或间隔物酰化的这些方面，长链烷烃可以为任何大小，且可以包含任何长度的碳链。长链烷烃可以为直链或支链。在示例性方面，长链烷烃是C₄至C₃₀烷烃。例如，长链烷烃可以是C₄烷烃、C₆烷烃、C₈烷烃、C₁₀烷烃、C₁₂烷烃、C₁₄烷烃、C₁₆烷烃、C₁₈烷烃、C₂₀烷烃、C₂₂烷烃、C₂₄烷烃、C₂₆烷烃、C₂₈烷烃或C₃₀烷烃中的任一种。在某些实施方案中，所述长链烷烃包含C₈至C₂₀烷烃，例如，C₁₂至C₁₈烷烃、C₁₄烷烃、C₁₆烷烃或C₁₈烷烃。在示例性实施方案中，所述长链烷烃是C₁₆至C₃₀烷烃，例如，C₂₀至C₂₈烷烃、C₁₆至C₂₂烷烃。

并且，在某些实施方案中，GIP激动剂肽的胺、羟基或巯基被用胆固醇酸酰化。在一个具体实施方案中，GIP激动剂肽通过烷基化的脱氨基Cys间隔物(即，烷基化的3-巯基丙酸间隔物)连接至胆固醇酸。

当所述酰基为琥珀酸、琥珀酸衍生物、马来酸或马来酸衍生物时，所述肽通过GIP激动剂肽的胺、羟基或巯基或间隔物与式V、式VI、式VII、式VIII、式IX或式X的琥珀酸、琥珀酸衍生物、马来酸或马来酸衍生物进行反应而被琥珀酰化/马来酰化。琥珀酰化的方法描述在本文中。

其它酰基

在某些或任何实施方案中，所述肽包含在位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43以外的位置处(例如，在位置10、14和40中的任一个或多个处)的酰化的氨基酸。酰化的氨基酸的位置可以是GIP激动剂肽内的任意位置，包括以下位置中的任一个：位置1-29，在第29个氨基酸的C端的位置(例如，在位置30、31、32、33、34、35、36、44、45、46、47等处的氨基酸等，在C端延伸段内或在C端处的位置)，任选地，与在位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43中的任一个处(例如，在位置10、14和40中的任一个或多个处)的第二个酰化的氨基酸一起，前提条件是，所述肽类似物的GIP激动剂活性得到保留（如果没有增强的话）。非限制性例子包括位置5、7、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28或29。

与上述相符，在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含两个(或更多个)酰化的氨基酸，并且当存在两个酰基时，可被认为是双酰化的肽或二酰化的肽。在示例性方面，所有酰化的氨基酸位于位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43中的两个位置处(例如，在位置10、14和40中的任一个或多个处)。在示例性方面，酰化发生在位置10、14和40中的两个处。在示例性方面，所述肽包含在位置10处的第一个酰化的氨基酸和在位置40处的第二个酰化的氨基酸。

在其它示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含两个(或更多个)与肽主链的单个氨基酸连接的酰基。当存在两个酰基时，所述肽可被视为双酰化的肽或二酰化的肽。两个(或更多个)酰基可以为相同的酰基或不同的酰基，以支链或直链形式排列。例如，为获得支链形式，所述胰高血糖素类似物可以包含一个酰化的氨基酸(其为肽主链的一部分)，所述酰化的氨基酸连接至包含至少三个官能团的间隔物，所述官能团中的至少两个各自共价连接至酰基，且其中的一个官能团连接至所述肽主链的酰化的氨基酸。在示例性方面，支链形式可以通过例如下述方式实现：包含两个胺基(侧链胺和α胺)的Lys残基用于直接连接至脂肪酰基或通过间隔物间接连接至脂肪酰基。在示例性方面，另外的间隔物可以位于肽主链的氨基酸和包含至少三个官能团的间隔物之间。例如，所述肽主链的氨基酸可以(例如，通过它的侧链)连接至第一间隔物，所述第一间隔物又连接至第二间隔物，其中所述第二间隔物包含至少三个官能团，所述官能团中的至少两个各自共价连接至烷基且其中的一个官能团连接至第一间隔物。

在其中所述烷基以线性形式排列的示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含一个酰化的氨基酸(其为肽主链的一部分)，所述酰化的氨基酸直接连接至第一酰基，所述第一酰基又连接至间隔物，所述间隔物又连接至第二酰基。

双酰化的化合物的示例性结构是预期的。

亲水部分和酰基

包含酰化的氨基酸的GIP激动剂肽任选地进一步包含亲水部分。在某些或任何实施方案中，所述亲水部分包含聚乙二醇(PEG)链。通过任何合适的方法，诸如本文描述的任何方法，可以掺入亲水部分。在这点上，所述GIP激动剂肽可以包含SEQ ID NO: 1，包括本文描述的任何修饰，其中在位置9、10、12、13、14、16、17 20和37-43中任一个处(例如，在位置10、14和40中的一个或多个处)的氨基酸中的至少一个是酰化的氨基酸，且在位置16、17、21、24或29、C端延伸段内的位置处的氨基酸中的至少一个或C端氨基酸是Cys、Lys、Orn、高-Cys或Ac-Phe，其侧链共价键合至亲水部分(例如，PEG)。在某些实施方案中，在GIP激动剂肽的位置9、10、12、13、14、16、17、20和37-43中的任一个处(例如，在位置10、14和40中的一个或多个处)的氨基酸连接(任选地通过间隔物)至酰基，且该氨基酸还连接至亲水部分或还连接至与亲水部分连接的Cys、Lys、Orn、高-Cys或Ac-Phe。

可替换地，所述酰化的胰高血糖素类似物可以包含间隔物，其中所述间隔物被酰化且被修饰为包含亲水部分。合适间隔物的非限制性例子包括包含选自Cys、Lys、Orn、高-Cys和Ac-Phe的一个或多个氨基酸的间隔物。

在某些方面，在某些实施方案中，GIP激动剂肽在连接亲水部分的相同氨基酸位置被酰化，或在不同的氨基酸位置被酰化。非限制性例子包括在位置9、10、12、13、14、16、17、20或40处(例如，在位置10、14和40中的一个或多个处)的酰化，和在胰高血糖素类似物的C端部分中的一个或多个位置处(例如，位置24、28或29)、在C端延伸段内(例如，37-43)或在C端处(例如，通过添加C端Cys)的聚乙二醇化。

在某些具体实施方案中，包含酰化的氨基酸的GIP激动剂肽缺乏分子内桥，例如共价分子内桥(例如，内酰胺桥)。

包含非天然烷基的氨基酸

根据某些或任何实施方案，作为胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的类似物的GIP激动剂肽包含含有非天然烷基的氨基酸(在本文中被称作“烷基化的氨基酸”，不论其是如何被制备的，例如，通过向肽内掺入预先烷基化的氨基酸，或在合成后再将肽烷基化)。在某些或任意方面，所述烷基化的氨基酸位于位置9、10、12、13、14、16、17、20、37、38、39、40、41、42或43中的任一个处(例如，在位置10、14和40中的一个或多个处)。在示例性方面，所述烷基化的氨基酸位于位置9、10、12、16、20或40中的任一个处，或位于位置10、13、14、16、17或40中的任一个处。在示例性方面，所述烷基化的氨基酸位于位置10、12、16或40中的任一个处，或位于位置10、12或16中的任一个处。在示例性方面，所述烷基化的氨基酸位于位置10、14和40中的任一个或多个处。

在某些实施方案中，所述烷基化的氨基酸使GIP激动剂肽具有以下一项或多项：(i)延长的循环半衰期、(ii)延迟的作用开始、(iii)延长的作用持续时间、(iv)增强的对蛋白酶(例如，DPP-IV)的抗性以及(v)增强的在GIP受体、GLP-1受体和胰高血糖素受体中的任意一个或多个处的效能。

直接烷基化

在某些实施方案中，所述烷基直接连接至GIP激动剂肽的氨基酸。根据一个实施方案，GIP激动剂肽包含通过醚、硫醚或胺键连接至肽的烷基。

在具体方面，GIP激动剂肽包含通过GIP激动剂肽的氨基酸的侧链的胺、羟基或巯基的直接烷基化而产生的烷基。在某些或任何实施方案中，通过使胺、羟基或巯基与活化的烷基反应，将烷基连接至GIP激动剂肽的氨基酸。在某些方面，用离去基团（例如，卤素、磺酸酯、吡啶基巯基、铵盐或苯氧基）使烷基活化。

在某些或任何实施方案中，所述烷基化的氨基酸位于位置9、10、12、13、14、16、17、20或40之一处(例如，在位置10、14和40中的任意一个处)或位置10、12或16之一处。在这点上，所述GIP激动剂肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其经修饰的氨基酸序列，所述经修饰的氨基酸序列包含一个或多个如本文描述的氨基酸修饰，其中在位置9、10、12、13、14、16、17、20和40处(例如，在位置10、14和40中的任意一个处)的氨基酸中的至少一个是包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸。

在某些实施方案中，所述包含侧链胺的氨基酸是式I的氨基酸。在某些实施方案中，所述式I的氨基酸是其中n是4 (Lys)或n是3 (Orn)的氨基酸。在某些实施方案中，所述包含侧链胺的氨基酸是包含侧链胺的芳族氨基酸。在示例性方面，包含侧链胺的芳族氨基酸是4-氨基-苯丙氨酸(4-氨基Phe)、对氨基苯基甘氨酸、对氨基高苯丙氨酸或3-氨基酪氨酸。在示例性方面，包含侧链胺的芳族氨基酸是4-氨基-Phe。

在其它实施方案中，所述包含侧链羟基的氨基酸是式II的氨基酸。在某些示例性实施方案中，所述式II的氨基酸是其中n是1的氨基酸(Ser)。在示例性方面，式II的氨基酸是其中n是2的氨基酸(高丝氨酸)。在相似的示例性实施方案中，所述包含侧链羟基的氨基酸是Thr或高苏氨酸。在相似的示例性实施方案中，所述包含侧链羟基的氨基酸是包含侧链羟基的芳族氨基酸。在示例性方面，包含侧链羟基的芳族氨基酸是酪氨酸、高酪氨酸、甲基-酪氨酸或3-氨基酪氨酸。

在其它实施方案中，所述包含侧链巯基的氨基酸是式III的氨基酸。在某些示例性实施方案中，所述式III的氨基酸是其中n是1的氨基酸(Cys)。在某些或任意示例性实施方案中，所述式III的氨基酸共价连接至烷基，例如，非官能化的或官能化的碳链。在示例性方面，所述氨基酸是S-棕榈基-烷基化的(即S-棕榈酸-烷基化的)，其中Cys残基的硫原子共价结合至棕榈酸的β碳。在其它实施方案中，所述式III的氨基酸通过Cys残基的硫原子共价结合至Cn乙酸的β碳，其中n是4-30的整数。预期了得到S-棕榈基烷基化物的不同方法的例子。

烷基化间隔物

在替代实施方案中，所述非天然烷基通过间隔物连接至GIP激动剂肽的氨基酸，其中所述间隔物位于GIP激动剂肽的氨基酸和非天然烷基之间。在某些实施方案中，所述GIP激动剂肽与间隔物共价结合，所述间隔物与非天然烷基共价结合。

在示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物通过间隔物的胺、羟基或巯基的烷基化而被修饰成包含非天然烷基，所述间隔物连接至在位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43之一处(例如，在位置10、14和40中的任意一个处)的氨基酸的侧链。在示例性实施方案中，通过使间隔物的胺、羟基或巯基与带有离去基团(例如，卤素、磺酸酯、吡啶基巯基、铵盐、苯氧基)的烷基反应，使烷基连接至所述间隔物。

间隔物所连接的氨基酸可以为包含允许连接至间隔物的部分的任何氨基酸。例如，包含侧链NH₂、-OH或-COOH的氨基酸(例如，Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)是合适的。在这方面，所述烷基化的胰高血糖素类似物可以包含经修饰的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，其包含一个或多个本文描述的氨基酸修饰，且在位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43处(例如，在位置10、14和40中的任一个或多个处)的至少一个氨基酸被修饰为包含侧链胺、羟基或羧酸酯的任何氨基酸。

在某些实施方案中，所述间隔物为包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸，或包含含有侧链胺、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽。间隔物所连接的氨基酸可以为任何氨基酸(例如，单或双α-取代的氨基酸)，其包含允许与间隔物连接的部分。例如，包含侧链NH₂、-OH或-COOH的氨基酸(例如，Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)是合适的。关于此点，在某些方面，所述GIP激动剂肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其经修饰的氨基酸序列，所述经修饰的氨基酸序列包含一个或多个本文描述的氨基酸修饰，其中在位置9、10、12、13、14、16、17、20和37-43处(例如，在位置10、14和40中的任意一个处)的至少一个氨基酸是包含侧链胺、羟基或羧酸酯的氨基酸。

当所述烷基通过间隔物的胺基连接时，在某些方面，所述烷基通过α胺或通过间隔物氨基酸的侧链胺而连接。在其中烷基通过α胺连接的情况下，所述间隔物的氨基酸可以为任何氨基酸。例如，所述间隔物的氨基酸可以为疏水性氨基酸，例如，Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸和8-氨基辛酸。可替换地，在某些方面，间隔物的氨基酸为酸性残基，例如，Asp、Glu、高谷氨酸、高半胱磺酸、半胱磺酸、γ-谷氨酸。

在其中烷基通过氨基酸间隔物的侧链胺连接的情况下，间隔物为包含侧链胺的氨基酸，例如式I的氨基酸(例如，Lys或Orn)。在此情况下，α胺和间隔物的氨基酸的侧链胺可能连接至烷基，使得所述GIP激动剂肽被二烷基化。本发明的实施方案包括这样的二烷基化的分子。在某些实施方案中，所述烷基连接至4-氨基-Phe、对氨基苯基甘氨酸、对氨基高苯丙氨酸或3-氨基酪氨酸。

当所述烷基通过间隔物的羟基连接时，所述氨基酸或二肽或三肽的氨基酸之一可以为式II的氨基酸。在一个具体的示例性实施方案中，所述氨基酸是Ser。在相似的示例性实施方案中，所述烷基连接至Thr或高苏氨酸。在相似的示例性实施方案中，所述烷基通过包含侧链羟基的芳族氨基酸的羟基连接，所述芳族氨基酸是例如酪氨酸、高酪氨酸、甲基-酪氨酸或3-氨基酪氨酸。

当所述烷基通过间隔物的巯基连接时，所述氨基酸或二肽或三肽的氨基酸之一可以为式III的氨基酸。在一个具体的示例性实施方案中，所述氨基酸是Cys。当所述烷基通过间隔物的巯基连接时，所述氨基酸或二肽或三肽的氨基酸之一可以为式III的氨基酸。在一个具体的示例性实施方案中，所述氨基酸是Cys。在示例性实施方案中，所述间隔物为Cys残基，所述Cys残基共价连接至烷基，例如，非官能化的或官能化的碳链。在示例性方面，所述Cys残基是S-棕榈基烷基化的(即，S-棕榈酸烷基化的)，任选地，其中所述Cys残基连接至作为肽主链的一部分的Lys残基。在替代实施方案中，所述间隔物为包含Cys残基的二肽，所述Cys残基共价连接至烷基。在示例性方面，所述Cys是S-棕榈基烷基化的，且所述Cys连接至间隔物的另一个氨基酸，所述另一个氨基酸又连接至例如作为肽主链的一部分的Lys残基。

在其它示例性实施方案中，所述间隔物为双功能间隔物，其包含(i)包含离去基团的第一末端，所述离去基团与包含胺、羟基或巯基的烷基反应，以及(ii)包含官能团的第二末端，所述官能团与胰高血糖素类似物的氨基酸的侧链反应。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物的氨基酸是式I (例如，Lys)或式II (例如，Ser)的氨基酸，且所述氨基酸被羧酸或羧酸衍生物官能化。在替代性的示例性方面，所述胰高血糖素类似物的氨基酸是式III的氨基酸，且所述氨基酸被卤乙酰胺（haloacetabmide）、马来酰亚胺基（maleimido）或二硫化物官能化。在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物的氨基酸是被胺、羟基或巯基官能化的、包含侧链羧酸酯的氨基酸，例如，Glu、Asp。

在某些或任何实施方案中，所述间隔物是亲水的双功能间隔物。在示例性实施方案中，所述亲水的双功能间隔物包含2个或更多个反应基团，例如，胺、羟基、巯基和羧基或它们的任意组合。在示例性实施方案中，所述亲水的双功能间隔物包含羟基和羧酸酯。在其它实施方案中，所述亲水的双功能间隔物包含胺基和羧酸酯。在其它实施方案中，所述亲水的双功能间隔物包含巯基和羧酸酯。在一个具体实施方案中，所述间隔物包含聚(烷氧基)羧酸氨基酯。在这点上，所述间隔物可以包含，例如，NH₂(CH₂CH₂O)_n(CH₂)_mCOOH，其中m是1-6的任意整数，且n是2-12的任意整数，例如，8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，其可商购得自Peptides International, Inc. (Louisville, KY)。

在示例性实施方案中，所述间隔物包含小聚乙二醇部分(PEG)，所述小聚乙二醇部分包含结构[-O-CH₂-CH₂-]_n，其中n是2-16之间的整数(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16)。这样的小PEG在本文中被称作“miniPEG”。在示例性方面，所述miniPEG是官能化的miniPEG，其包含一个或多个官能团。合适的官能团包括、但不限于胺、羟基、巯基和羧基或它们的任意组合。在示例性方面，所述miniPEG为miniPEG酸，其包含结构{[-O-CH₂-CH₂-]_n-COO-}，其中n如上面所定义。在示例性方面，所述miniPEG为酰氨基miniPEG，其包含结构{-N- CH₂- CH₂-[-O-CH₂-CH₂-]_n}，其中n如上面所定义。在示例性方面，所述miniPEG为酰氨基miniPEG酸，其包含结构{-N- CH₂- CH₂-[-O-CH₂-CH₂-]_n-COO-}，其中n如上面所定义。在用miniPEG将氨基酸烷基化中使用的合适试剂可商购得自供货商，诸如PeptidesInternational(Louisville, KY)。

在某些实施方案中，所述间隔物是疏水的双功能间隔物。疏水的双功能间隔物是本领域已知的。参见，例如，Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (AcademicPress, San Diego, CA, 1996)，其通过引用整体并入。在示例性实施方案中，所述疏水的双功能间隔物包含2个或更多个反应基团，例如，胺、羟基、巯基和羧基或它们的任意组合。在示例性实施方案中，所述疏水的双功能间隔物包含羟基和羧酸酯。在其它实施方案中，所述疏水的双功能间隔物包含胺基和羧酸酯。在其它实施方案中，所述疏水的双功能间隔物包含巯基和羧酸酯。包含羧酸酯和羟基或巯基的合适的疏水双功能间隔物是本领域已知的，且包括，例如，8-羟基辛酸和8-巯基辛酸。

在某些实施方案中，所述双功能间隔物不是包含在羧酸酯基之间的1-7个碳原子的未分支的亚甲基的二羧酸。在某些实施方案中，所述双功能间隔物是包含在羧酸酯基之间的1-7个碳原子的未分支的亚甲基的二羧酸。

在具体实施方案中，所述间隔物(例如，氨基酸、二肽、三肽、亲水的双功能间隔物或疏水的双功能间隔物)的长度为3-10个原子(例如，6-10个原子(例如，6个、7个、8个、9个或10个原子)。在更具体的实施方案中，所述间隔物的长度为约3-10个原子(例如，6-10个原子)，且所述非天然烷基为C₁₂至C₁₈烷基，例如，C₁₄烷基、C₁₆烷基，使得间隔物和烷基的总长度是14-28个原子，例如，约14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个或28个原子。在某些实施方案中，所述间隔物和烷基的长度是17-28 (例如，19-26、19-21)个原子。

根据某些或任意前述实施方案，所述双功能间隔物可以为合成的或天然存在的氨基酸(包括、但不限于本文描述的那些中的任一种)，其包含长度为3-10个原子的氨基酸主链(例如，6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸和8-氨基辛酸)。可替换地，所述间隔物可以为具有3-10个原子(例如，6-10个原子)的长度的肽主链的二肽或三肽间隔物。二肽或三肽间隔物的每个氨基酸可以与二肽或三肽的其它氨基酸相同或不同，并且可以独立地选自天然存在的或编码的和/或非编码的或非天然存在的氨基酸，包括、例如，天然存在的氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr)的任意D或L异构体，或选自以下的非天然存在的或非编码的氨基酸的任意D或L异构体：β-丙氨酸(β-Ala)、N-α-甲基-丙氨酸(Me-Ala)、氨基丁酸(Abu)、γ-氨基丁酸(γ-Abu)、氨基己酸(ε-Ahx)、氨基异丁酸(Aib)、氨基甲基吡咯甲酸、氨基哌啶甲酸、氨基丝氨酸(Ams)、氨基四氢吡喃-4-甲酸、精氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、β-天冬氨酸(β-Asp)、氮杂环丁烷甲酸、3-(2-苯并噻唑基)丙氨酸、α-叔丁基甘氨酸、2-氨基-5-脲基-正戊酸(瓜氨酸、Cit)、β-环己基丙氨酸(Cha)、乙酰氨基甲基-半胱氨酸、二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dpr)、二羟基苯丙氨酸(DOPA)、二甲基噻唑烷(DMTA)、γ-谷氨酸(γ-Glu)、高丝氨酸(Hse)、羟脯氨酸(Hyp)、异亮氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、甲基-异亮氨酸(MeIle)、4-哌啶甲酸(Isn)、甲基-亮氨酸(MeLeu)、甲基-赖氨酸、二甲基-赖氨酸、三甲基-赖氨酸、甲醇基脯氨酸、甲硫氨酸-亚砜(Met(O))、甲硫氨酸-砜(Met(O₂))、正亮氨酸(Nle)、甲基-正亮氨酸(Me-Nle)、正缬氨酸(Nva)、鸟氨酸(Orn)、对-氨基苯甲酸(PABA)、青霉胺(Pen)、甲基苯丙氨酸(MePhe)、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、4-硝基苯丙氨酸(Phe(4-NO₂))、4-氰基苯丙氨酸((Phe(4-CN))、苯基甘氨酸(Phg)、哌啶基丙氨酸、哌啶基甘氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、吡咯烷基丙氨酸、肌氨酸(Sar)、硒代半胱氨酸(Sec)、O-苄基-磷酸丝氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸(Sta)、4-氨基-5-环己基-3-羟基戊酸(ACHPA)、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸(AHPPA)、1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-甲酸(Tic)、四氢吡喃甘氨酸、噻吩基丙氨酸(Thi或硫代Ala)、O-苄基-磷酸酪氨酸、O-磷酸酪氨酸、甲氧基酪氨酸、乙氧基酪氨酸、O-(二-二甲基氨基-膦酰基)-酪氨酸、酪氨酸硫酸盐四丁基胺、甲基-缬氨酸(MeVal)和烷基化的3-巯基丙酸。在示例性方面，所述间隔物是Cys残基。

在某些实施方案中，间隔物包含总负电荷，例如，包含一个或两个带负电的氨基酸。在某些实施方案中，所述二肽不是通式结构A-B的二肽中的任一种，其中A选自Gly、Gln、Ala、Arg、Asp、Asn、Ile、Leu、Val、Phe和Pro，其中B选自Lys、His、Trp。在某些实施方案中，二肽间隔物的氨基酸选自Ala、β-Ala、Leu、Pro、γ-氨基丁酸、Glu和γ-Glu。

在某些示例性实施方案中，GIP激动剂肽包含通过间隔物的胺、羟基或巯基的烷基化而形成的烷基，所述间隔物连接至在位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43处(例如，在位置10、14和40中的任一个或多个处)的氨基酸的侧链，或者位于GIP激动剂肽的C端氨基酸。

在更具体的实施方案中，烷基连接至肽类似物的位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43中的任一个处(例如，在位置10、14和40中的任一个或多个处)的氨基酸，间隔物和烷基的长度为14-28个原子。在某些方面，在位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43中的任一个处(例如，在位置10、14和40中的任一个或多个处)的氨基酸是式I的氨基酸，例如Lys，或与式I有关的二取代的氨基酸。在更具体的实施方案中，所述肽类似物缺乏分子内桥，例如共价分子内桥。例如，所述胰高血糖素类似物可以是包含一个或多个用来稳定类似物的α螺旋结构的α,α-二取代的氨基酸(例如，AIB)的胰高血糖素类似物。

烷基

所述烷基化的氨基酸的非天然烷基可以具有任意大小，例如，任意长度碳链，且可以是直链或支链。在某些具体实施方案中，所述烷基是C₄至C₃₀烷基。例如，所述烷基可以为C₄烷基、C₆烷基、C₈烷基、C₁₀烷基、C₁₂烷基、C₁₄烷基、C₁₆烷基、C₁₈烷基、C₂₀烷基、C₂₂烷基、C₂₄烷基、C₂₆烷基、C₂₈烷基或C₃₀烷基中的任一种。在某些实施方案中，所述烷基是C₈至C₂₀烷基，例如，C₁₂至C₁₈烷基、C₁₄烷基或C₁₆烷基。在示例性实施方案中，所述烷基是C₁₆至C₃₀烷基，例如，C₂₀至C₂₈烷基、C₁₆至C₂₂烷基。

在示例性实施方案中，所述烷基化的氨基酸的非天然烷基是任意长度的官能化的直链或支链碳链。在某些具体实施方案中，所述碳链是C₄至C₃₀烷基。例如，所述烷基可以为C₄烷基、C₆烷基、C₈烷基、C₁₀烷基、C₁₂烷基、C₁₄烷基、C₁₆烷基、C₁₈烷基、C₂₀烷基、C₂₂烷基、C₂₄烷基、C₂₆烷基、C₂₈烷基或C₃₀烷基中的任一种。在某些实施方案中，所述烷基是C₈至C₂₀烷基，例如，C₁₂至C₁₈烷基、C₁₄烷基或C₁₆烷基。在示例性实施方案中，所述烷基是C₁₆至C₃₀烷基，例如，C₂₀至C₂₈烷基、C₁₆至C₂₂烷基。在示例性方面，所述官能化的碳链包含官能团，所述官能团包括、但不限于羧基、巯基、胺、酮基（ketyl）、亚砜基或酰氨基。

在示例性实施方案中，所述非天然烷基是结构-Cx-COOH的羧基官能化的碳链，其中x是整数，任选地为4 - 30之间的整数(例如，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30)，其中所述羧基碳是α碳，且Cx的每个碳被命名为β、γ、δ、ε等，其中所述β碳连接至α碳。例如，其中，当x是4时，所述非天然烷基将如下命名：C_ε-C_δ-C_ɣ-C_β-C_αOOH。在示例性实施方案中，所述羧基官能化的碳链通过羧基碳以外的碳(即Cx的碳之一)进行连接。在示例性方面，所述羧基官能化的碳链通过羧基官能化的碳链的β、γ、δ或ε碳与烷基化的氨基酸的侧链连接。在替代实施方案中，所述羧基官能化的碳链通过羧基官能化的碳链的β、γ、δ或ε碳与间隔物的侧链连接，所述间隔物连接至烷基化的氨基酸。在示例性方面，所述羧基官能化的碳链通过羧基官能化的碳链的β碳与烷基化的氨基酸的侧链连接。在替代实施方案中，所述羧基官能化的碳链通过羧基官能化的碳链的β碳与间隔物的侧链连接，所述间隔物连接至烷基化的氨基酸。

连接烷基的方法

将烷基连接至氨基酸上的方法是本领域已知的。例如，用离去基团活化的烷基可以与包含亲核侧链（例如，包含胺、羟基或巯基的侧链）的氨基酸反应。在示例性方面，所述离去基团是卤素、磺酸酯、吡啶基巯基、铵盐或苯氧基。

在示例性实施方案中，要连接至烷基的氨基酸是Cys残基，且硫原子被烷基化，例如“S-烷基化”。在示例性实施方案中，所述Cys的硫与烷基的离去基团反应，所述烷基包含结构-Cx-COOH的羧基官能化的碳链，其中x是整数，任选地为4 - 30之间的整数(例如，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30)，其中羧基碳为α碳，且Cx的每个碳被命名为β、γ、δ、ε等，其中β碳连接至α碳。例如，其中，当x是4时，所述非天然烷基将如下命名：C_ε-C_δ-C_ɣ-C_β-C_αOOH。在示例性实施方案中，所述羧基官能化的碳链通过羧基碳以外的碳(即Cx的碳之一)进行连接。在示例性方面，所述羧基官能化的碳链通过羧基官能化的碳链的β、γ、δ或ε碳与烷基化的氨基酸的侧链连接。在替代实施方案中，所述羧基官能化的碳链通过羧基官能化的碳链的β、γ、δ或ε碳与间隔物的侧链连接，所述间隔物连接至烷基化的氨基酸。在示例性方面，所述羧基官能化的碳链通过羧基官能化的碳链的β碳与烷基化的氨基酸的侧链连接。在替代实施方案中，所述羧基官能化的碳链通过羧基官能化的碳链的β碳与间隔物的侧链连接，所述间隔物连接至烷基化的氨基酸。

在示例性方面，所述离去基团为卤素(诸如碘、溴、氯或氟)，磺酸酯(诸如甲苯磺酸酯、三氟甲基磺酸酯或氟磺酸酯)，吡啶基巯基、铵盐、重氮鎓盐、硝酸盐、磷酸盐或苯氧基。

在具体方面，所述烷基包含碘离去基团和包含总计16个碳(包括羧酸酯的碳)的羧基官能化的碳链。利用这样的碘-羧酸的烷基化可以被称作“S-棕榈基烷基化”，其与“S-棕榈酸烷基化”同义。在本文实施例1和20中提供了S-棕榈基烷基化的进一步例证。

其它烷基

在某些方面，所述肽在位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43 (例如，位置10、14和40中的任一个或多个)以外的位置包含烷基化的氨基酸。所述烷基化的氨基酸的位置可以是在GIP激动剂肽内的任意位置，包括以下位置中的任一个：位置1-29，在第29个氨基酸的C端的位置(例如，在位置30、31、32、33、34、35、36、44、45、46、47等处的氨基酸等，或在C端延伸段内或在C端处的位置)，任选地与在位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43中的任一个处(例如，在位置10、14和40中的任一个或多个处)的第二烷基化的氨基酸一起，前提条件是，所述肽类似物的GIP激动剂活性得到保留（如果没有增强的话）。非限制性例子包括位置5、7、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28或29。

与上述相符，在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含两个(或更多个)烷基化的氨基酸。在示例性方面，所有烷基化的氨基酸都位于位置9、10、12、13、14、16、17、20或37-43中的2个位置处(例如，在位置10、14和40中的任一个或多个处)。在示例性方面，所述肽包含位于位置10的第一烷基化的氨基酸和位于位置40的第二烷基化的氨基酸。

在其它示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含与肽主链的一个氨基酸连接的另外烷基。两个(或更多个)烷基可以为相同的烷基或不同的烷基，以支链或直链形式排列。例如，为获得支链形式，所述胰高血糖素类似物可以包含一个烷基化的氨基酸(其为肽主链的一部分)，该烷基化的氨基酸连接至包含至少三个官能团的间隔物，所述官能团中的至少两个各自共价连接至烷基，且其中的一个官能团连接至所述肽主链的烷基化的氨基酸。在示例性方面，支链形成可以如下实现：例如，包含两个胺基(一个侧链胺和一个α胺)的Lys残基，用于直接连接至脂肪烷基或通过间隔物间接连接至脂肪烷基。在示例性方面，另外的间隔物可以位于肽主链的氨基酸与包含至少三个官能团的间隔物之间。例如，所述肽主链的氨基酸可以(例如，通过其侧链)连接至第一间隔物，所述第一间隔物又连接至第二间隔物，其中所述第二间隔物包含至少三个官能团，所述官能团中的至少两个各自共价连接至烷基，且其中的一个官能团连接至第一间隔物。

在其中所述烷基以线性形式排列的示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含一个烷基化的氨基酸(其为肽主链的一部分)，该烷基化的氨基酸直接连接至第一烷基，所述第一烷基又连接至间隔物，所述间隔物又连接至第二烷基。

双烷基化化合物的示例性结构可从其它双酰化化合物导出。

亲水部分和烷基

所述包含烷基化的氨基酸的GIP激动剂肽任选地还包含亲水部分。在某些具体实施方案中，所述亲水部分包含聚乙二醇(PEG)链。在某些方面，通过任何合适的方法(诸如本文描述的任何方法)，掺入亲水部分。在这点上，所述GIP激动剂肽可以包含SEQ ID NO: 1，包括本文描述的任何修饰，其中GIP激动剂肽的在位置9、10、12、13、14、16、17、20和37-43中的任一个处(例如，在位置10、14和40中的任一个或多个处)的至少一个氨基酸包含烷基，且在位置16、17、21、24或29处、C端延伸段内的位置处的至少一个氨基酸或C端氨基酸是Cys、Lys、Orn、高-Cys或Ac-Phe，其侧链共价键合至亲水部分(例如，PEG)。在某些实施方案中，GIP激动剂肽的在位置9、10、12、13、14、16、17、20和37-43中的任一个处(例如，在位置10、14和40中的任一个或多个处)的氨基酸连接(任选地通过间隔物)至烷基，且所述氨基酸还连接至亲水部分或还连接至与亲水部分连接的Cys、Lys、Orn、高-Cys或Ac-Phe。

可替换地，所述烷基化的胰高血糖素类似物可以包含间隔物，其中所述间隔物被烷基化且被修饰为包含亲水部分。合适间隔物的非限制性例子包括包含一个或多个选自以下的氨基酸的间隔物：Cys、Lys、Orn、高-Cys和Ac-Phe。

在某些方面，在某些实施方案中，所述GIP激动剂肽在连接亲水部分的相同氨基酸位置或在不同氨基酸位置被烷基化。非限制性例子包括在位置9、10、12、13、14、16、17、20或40处(例如，在位置10、14和40中的任一个或多个处)的烷基化和在胰高血糖素类似物的C端部分中的一个或多个位置（例如，位置24、28或29）在C端延伸段内(例如，37-43)、或在C端处(例如，通过添加C端Cys)的聚乙二醇化。

其它烷基实施方案

在具体实施方案中，所述包含烷基化的氨基酸的GIP激动剂肽缺乏分子内桥，例如共价分子内桥(例如，内酰胺桥)。

α螺旋的稳定化和稳定α螺旋的氨基酸

不受限于任何特定理论，所述GIP激动剂肽(其为胰高血糖素类似物)包含螺旋结构，例如α螺旋。在某些或任何实施方案中，所述GIP激动剂肽包含稳定α螺旋结构的氨基酸。因此，在某些方面，所述GIP激动剂肽包含一个或多个稳定α螺旋的氨基酸。本文中使用的术语“促进α螺旋的氨基酸”与术语“稳定α螺旋的氨基酸”互换使用，表示为GIP激动剂肽（所述氨基酸是其一部分）的α螺旋提供增加的稳定性的氨基酸。促进α螺旋的氨基酸是本领域已知的。参见，例如，Lyu等人, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 88: 5317-5320 (1991);Branden和Tooze, Introduction to Protein Structure, Garland Publishing, NewYork, NY, 1991; Fasman, Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, ed. Fasman, Plenum, NY, 1989)。用于本文目的的合适的促进α螺旋的氨基酸包括、但不限于：丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、α氨基丁酸、α-氨基异丁酸(AIB)、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等。在某些实施方案中，所述促进α螺旋的氨基酸是作为在天然存在的蛋白中发现的α螺旋的一部分的任何氨基酸，例如，Leu、Phe、Ala、Met、Gly、Ile、Ser、Asn、Glu、Asp、Lys、Arg。

在示例性实施方案中，与甘氨酸或丙氨酸相比，所述促进α螺旋的氨基酸为α螺旋提供更多的稳定性。在示例性实施方案中，所述促进α螺旋的氨基酸是α,α-二取代的氨基酸，例如AIB。

α螺旋：促进α螺旋的氨基酸的位置

在本公开内容的某些或任何实施方案中，所述GIP激动剂肽包含与天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)相似的氨基酸序列，且所述GIP激动剂肽包含在肽类似物的位置16-21中的一个或多个(例如，位置16、17、18、19、20、21中的一个或多个)处的至少一个促进α螺旋的氨基酸。在某些或任何实施方案中，所述肽类似物包含在位置16、17、20和21中的1个、2个、3个、或全部处的促进α螺旋的氨基酸。

α螺旋： α,α -二取代的氨基酸

在某些或任何实施方案中，所述促进α螺旋的氨基酸是α,α-二取代的氨基酸。在具体实施方案中，所述α,α-二取代的氨基酸包含R¹和R²，其中每一个键合至α碳，其中R¹和R²中的每一个独立地选自任选地被羟基、酰胺、巯基、卤代取代的C1-C4烷基，或R¹和R²与它们所连接的α碳一起形成环(例如，C3-C8环)。在示例性实施方案中，R¹和R²中的每一个选自甲基、乙基、丙基和正丁基，或R¹和R²一起形成环辛烷或环庚烷(例如，1-氨基环辛烷-1-甲酸)。在示例性实施方案中，R¹和R²相同。在其它实施方案中，R¹和R²不同。在示例性的方面，R¹和R²中的每一个是C1-C4烷基。在某些方面，R¹和R²中的每一个是C1或C2烷基。在示例性实施方案中，R¹和R²中的每一个是甲基，使得所述α,α-二取代的氨基酸是α-氨基异丁酸(AIB)。在其它示例性实施方案中，所述α,α-二取代的氨基酸是ACPC。

在某些方面，本文描述的GIP激动剂肽包含一个或多个α,α-二取代的氨基酸，且所述GIP激动剂肽特别地缺乏共价分子内桥(例如，内酰胺)，因为所述α,α-二取代的氨基酸能够在没有共价桥存在下稳定α螺旋。在某些方面，所述GIP激动剂肽包含位于C端(位置12-29附近)的一个或多个α,α-二取代的氨基酸。在某些或任何实施方案中，所述GIP激动剂肽的位置16、17、18、19、20、21、24或29中的1个、2个、3个、4个或更多个或位置16、17、18、19、20或21中的1个、2个、3个、4个、5个或全部被α,α-二取代的氨基酸置换，例如氨基异丁酸(AIB)，被选自甲基、乙基、丙基和正丁基的相同或不同基团二取代的氨基酸，或环辛烷或环庚烷(例如，1-氨基环辛烷-1-甲酸)。例如，在没有分子内桥例如非共价分子内桥(例如，盐桥)或共价分子内桥(例如，内酰胺)存在下，用AIB取代位置20会增强GIP活性。在某些或任何实施方案中，位置16、20、21或24中的1个、2个、3个或更多个被AIB取代。在示例性实施方案中，与天然人胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的位置2、16和20对应的1个、2个或全部氨基酸被α,α-二取代的氨基酸(诸如AIB)取代。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置2和16处或在位置2和20处的AIB。在其它示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置2处的D-Ser和在位置16或位置20处的AIB。

α螺旋：分子内桥

在某些示例性实施方案中，所述促进α螺旋的氨基酸是通过分子内桥与GIP激动剂肽的另一个氨基酸连接的氨基酸。在这样的实施方案中，通过分子内桥相连接的这两个氨基酸中的每一个都被视作促进α螺旋的氨基酸。在示例性实施方案中，所述GIP激动剂肽包含一个或两个分子内桥。在示例性实施方案中，所述GIP激动剂肽包含一个分子内桥以及至少一个其它促进α螺旋的氨基酸，例如α,α-二取代的氨基酸。

在某些实施方案中，所述分子内桥是通过非共价键连接GIP激动剂肽的两个部分的桥，所述非共价键包括、例如，范德华相互作用氢键、离子键、疏水性相互作用、偶极-偶极相互作用等。在这点上，所述胰高血糖素类似物包含非共价分子内桥。在某些实施方案中，所述非共价分子内桥为盐桥。

在某些实施方案中，所述分子内桥是通过共价键连接GIP激动剂肽的两个部分的桥。在这点上，所述GIP激动剂肽包含共价分子内桥。

在某些实施方案中，所述分子内桥(例如，非共价分子内桥、共价分子内桥)形成于相隔三个氨基酸的两个氨基酸之间，例如在位置i和i+4处的氨基酸，其中，i为12-25之间的任意整数(例如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和25)。更具体地，氨基酸对12和16、16和20、20和24、或24和28 (其中i = 12、16、20或24的氨基酸对)的侧链彼此相连，并从而稳定α螺旋。可替换地，i可以为17。在某些具体实施方案中，所述GIP激动剂肽包含氨基酸17和21之间的分子内桥。在某些具体实施方案中，所述GIP激动剂肽包含在位置16和20、或12和16处的氨基酸之间的分子内桥，以及在位置17和21处的氨基酸之间的第二分子内桥。在本文中预见到包含一个或多个分子内桥的GIP激动剂肽。在其中在位置i和i+4处的氨基酸通过分子内桥连接的具体实施方案中，接头的大小为约8个原子，或约7-9个原子。

在其它实施方案中，所述分子内桥形成于相隔2个氨基酸的两个氨基酸之间，例如在位置j和j+3处的氨基酸，其中j为12-26之间的任意整数(例如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26)。在某些具体实施方案中，j为17。在其中在位置j和j+3处的氨基酸通过分子内桥连接的具体实施方案中，接头的大小为约6个原子，或约5-7个原子。

在其它实施方案中，所述分子内桥形成于相隔6个氨基酸的两个氨基酸之间，例如在位置k和k+7处的氨基酸，其中k为12-22之间的任意整数(例如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21和22)。在某些具体实施方案中，k为12、13或17。在一个示例性实施方案中，k为17。

α螺旋：参与分子内桥的氨基酸

能够(共价地或非共价地)键合以形成六原子连接桥的氨基酸对的例子包括Orn和Asp、Glu和式I的氨基酸(其中n是2)、以及高谷氨酸和式I的氨基酸(其中n是1)，其中式I是：

其中n = 1-4

[式I]。

能够键合以形成七原子连接桥的氨基酸对的例子包括Orn-Glu (内酰胺环)；Lys-Asp (内酰胺)；或高ser-高glu (内酯)。可形成八原子接头的氨基酸对的例子包括Lys-Glu(内酰胺)；高lys-Asp (内酰胺)；Orn-高glu (内酰胺)；4-氨基Phe-Asp (内酰胺)；或Tyr-Asp (内酯)。可形成九原子接头的氨基酸对的例子包括高lys-Glu (内酰胺)；Lys-高glu(内酰胺)；4-氨基Phe-Glu (内酰胺)；或Tyr-Glu (内酯)。这些氨基酸上的任意侧链可以另外被其它化学基团取代，只要不破坏α螺旋的三维结构即可。本领域普通技术人员可以预见到将产生具有相似大小和预期效果的稳定结构的替代性氨基酸对或替代性氨基酸类似物，包括化学修饰的衍生物。例如，高半胱氨酸-高半胱氨酸二硫键的长度为6个原子，其可以进一步修饰以提供期望的作用。

即使没有共价键，上述氨基酸对(或本领域普通技术人员可以预见到的相似配对)也可以通过非共价键向α螺旋提供增加的稳定性，例如，通过形成盐桥或氢键合相互作用。因此，盐桥可以形成于下列氨基酸对之间：Orn和Glu；Lys和Asp；高-丝氨酸和高-谷氨酸；Lys和Glu；Asp和Arg；高-Lys和Asp；Orn和高-谷氨酸；4-氨基Phe和Asp；Tyr和Asp；高-Lys和Glu；Lys和高-Glu；4-氨基Phe和Glu；或Tyr和Glu。在某些实施方案中，所述类似物包含在任何下列氨基酸对之间的盐桥：Orn和Glu；Lys和Asp；Lys和Glu；Asp和Arg；高-Lys和Asp；Orn和高-谷氨酸；高-Lys和Glu；和Lys和高-Glu。盐桥可以形成于具有带相反电荷的侧链的其它氨基酸对之间。参见，例如，Kallenbach等人, Role of the Peptide Bond in Protein Structure and Folding, in The Amide Linkage: Structural Significance inChemistry, Biochemistry, and Materials Science, John Wiley & Sons, Inc.(2000)。

在某些实施方案中，非共价分子内桥为疏水桥。根据一个实施方案，所述类似物的α螺旋通过疏水氨基酸在位置j和j+3或i和i+4处的掺入而稳定化。例如，i可以为Tyr，i+4可以为Val或Leu；i可以为Phe，i+4可以为Met；或i可以为Phe，i+4可以为Ile。应当理解，为了本文的目的，上述氨基酸配对可以颠倒，使得在位置i的指定氨基酸可以可替换地位于i+4，而i+4氨基酸可以位于i位置。还应当理解，可以关于j和j+3形成合适的氨基酸配对。

α螺旋：共价分子内桥

在某些实施方案中，所述共价分子内桥为内酰胺环或内酰胺桥。所述内酰胺环的大小可以随氨基酸侧链的长度而变化，且在一个实施方案中，所述内酰胺通过将鸟氨酸的侧链与天冬氨酸侧链相连而形成。内酰胺桥及其制备方法是本领域已知的。参见，例如，Houston, Jr., 等人, J Peptide Sci 1: 274-282 (2004)，以及本文的实施例1。在某些实施方案中，所述类似物包含经修饰的SEQ ID NO: 1的序列以及在i和i+4之间的内酰胺桥，其中i如上文所定义。在某些实施方案中，所述GIP激动剂肽包含两个内酰胺桥：一个是在位置16和20处的氨基酸之间，另一个是在位置17和21处的氨基酸之间。在某些实施方案中，所述GIP激动剂肽包含一个内酰胺桥和一个盐桥。其它示例性实施方案描述在本文中的标题为“实施例”的部分中。其它示例性实施方案包括下列配对，任选地具有内酰胺桥：在位置12处的Glu和在位置16处的Lys；在位置12处的天然Lys和在位置16处的Glu；在位置16处的Glu和在位置20处的Lys；在位置16处的Lys和在位置20处的Glu；在位置20处的Glu和在位置24处的Lys；在位置20处的Lys和在位置24处的Glu；在位置24处的Glu和在位置28处的Lys；在位置24处的Lys和在位置28处的Glu。

在某些实施方案中，所述共价分子内桥为内酯。合适的制备内酯桥的方法是本领域已知的。参见，例如，Sheehan等人, J Am Chem Soc 95: 875-879 (1973)。

在某些方面，利用全烃交联系统，使用烯烃易位将类似物的α螺旋的一个或两个转角交联。在该情况下，所述GIP激动剂肽包含在j和j+3或i和i+4位置处的携带不同长度的烯族侧链且配置为R或S立体化学的α-甲基化的氨基酸。在某些实施方案中，所述烯族侧链包含(CH₂)n，其中n是1-6之间的任意整数。在某些实施方案中，对于8个原子的交联长度，n为3。在某些实施方案中，对于6个原子的交联长度，n为2。在本领域中描述了形成这样的分子内桥的合适方法。参见，例如，Schafmeister等人, J. Am. Chem. Soc. 122: 5891-5892(2000)和Walensky等人, Science 305: 1466-1470 (2004)。在替代实施方案中，所述类似物包含位于相邻螺旋转角上的O-烯丙基Ser残基，其通过钌催化的环闭合易位桥接在一起。这样的交联方法描述在，例如，Blackwell等人, Angew, Chem., Int. Ed. 37: 3281-3284(1998)。

在具体方面，使用非天然的硫代-二丙氨酸氨基酸(羊毛硫氨酸，其已经被广泛地用作胱氨酸的肽拟似物)来交联α螺旋的一个转角。基于羊毛硫氨酸的环化作用的合适方法是本领域已知的。参见，例如，Matteucci等人, Tetrahedron Letters 45: 1399-1401(2004); Mayer等人, J. Peptide Res. 51: 432-436 (1998); Polinsky等人, J. Med. Chem. 35: 4185-4194 (1992); Osapay等人, J. Med. Chem. 40: 2241-2251 (1997);Fukase等人, Bull. Chem. Soc. Jpn. 65: 2227-2240 (1992); Harpp等人, J. Org. Chem. 36: 73-80 (1971); Goodman和Shao, Pure Appl. Chem. 68: 1303-1308 (1996)；和Osapay和Goodman, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1599-1600 (1993)。

在某些实施方案中，利用在位置i和i+7处的两个Glu残基之间的α, ω-二氨基烷烃系链(例如，1,4-二氨基丙烷和1,5-二氨基戊烷)来稳定类似物的α螺旋。这样的连接会导致长度为9个原子或更长的桥的形成，其取决于二氨基烷烃系链的长度。在本领域中描述了制备用这样的连接交联的肽的合适方法。参见，例如，Phelan等人, J. Am. Chem. Soc.119: 455-460 (1997)。

在其它实施方案中，使用二硫桥来交联类似物的α螺旋的一个或两个转角。可替换地，使用经修饰的二硫桥来稳定类似物的α螺旋，在所述经修饰的二硫桥中，一个或两个硫原子被亚甲基替代，从而形成立体异构的大环环化。用二硫桥或基于硫的环化来修饰肽的合适方法描述于，例如，Jackson等人, J. Am. Chem. Soc. 113: 9391-9392 (1991)和Rudinger和Jost, Experientia 20: 570-571 (1964)。

在其它实施方案中，通过位于j和j+3、或i和i+4处的两个His残基或His和Cys对对金属原子的结合来稳定所述类似物的α螺旋。所述金属原子可以为例如Ru(III)、Cu(II)、Zn(II)或Cd(II)。这样的基于金属结合的α螺旋稳定化的方法是本领域已知的。参见，例如，Andrews和Tabor, Tetrahedron 55: 11711-11743 (1999)；Ghadiri等人, J. Am. Chem. Soc. 112: 1630-1632 (1990)；和Ghadiri等人, J. Am. Chem. Soc. 119: 9063-9064(1997)。

可替换地，通过其它肽环化方法，可以稳定GIP激动剂肽的α螺旋，所述方法综述在Davies, J. Peptide. Sci. 9: 471-501 (2003)中。通过酰胺桥、硫醚桥、硫代酸酯桥、脲桥、氨基甲酸酯桥、磺酰胺桥等的形成，可以稳定α螺旋。例如，可以在C端和Cys残基的侧链之间形成硫代酸酯桥。可替换地，可以经由具有巯基(Cys)和羧酸(例如，Asp、Glu)的氨基酸的侧链形成硫代酸酯。在另一个方法中，交联剂(诸如二羧酸，例如，软木酸(辛二酸)等)可以在氨基酸侧链的两个官能团（诸如游离氨基、羟基、巯基和它们的组合）之间引入连接。

其它描述

以下提供本公开内容的胰高血糖素类似物的其它描述。如本文所讨论的，以下描述中的氨基酸的位置是参照SEQ ID NO: 1的氨基酸编号。并且，尽管以下描述参考天然人胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)进行讨论(例如，SEQ ID NO: 1的修饰)，但是这些描述并不一定暗示：(i)这样的修饰存在于本文公开的所有肽中，和(ii)制备本文公开的肽的唯一方法是以天然人胰高血糖素为起点并修饰该序列。相反，提供所述描述来描述本公开内容的胰高血糖素类似物的一些实施方案，并且本文公开的肽可以重新合成，无需利用天然人胰高血糖素作为起始材料，如在标题为“制备肽的方法”的部分中进一步描述的。

位置1和2

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含相对于SEQ ID NO: 1而言在位置1处的氨基酸修饰，例如，所述胰高血糖素类似物包含在位置1处不是His的氨基酸。在示例性方面，胰高血糖素类似物包含在位置1处的大的芳族氨基酸。在示例性实施方案中，所述大的芳族氨基酸是Tyr、Phe、Trp、氨基-Phe (例如，4-氨基-Phe)、氯-Phe、磺基-Phe、4-吡啶基-Ala、甲基-Tyr或3-氨基Tyr。

在其它示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含在位置1处的含有咪唑侧链的氨基酸。在示例性方面，在位置1处的氨基酸包含式A的结构：

[式A]，

其中R¹和R²中的每一个独立地选自H、(C1-6)烷基、O(C1-6)烷基、(C1-6)烷基-OH、F和(C1-C6)烷基（其中至少一个H被F替代）。

在示例性方面，在位置1处的氨基酸是胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的天然残基L-组氨酸(His)，或是His的衍生物(His衍生物)，例如，其中α原子被修饰的His衍生物。在示例性方面，所述His衍生物为D-组氨酸、脱氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基组氨酸、高组氨酸、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸或α, α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)。

在示例性方面，在位置1处的氨基酸包含式A的类似物结构，其中一个或两个环氮连接至C1-C3烷基。

在其它方面，在位置1处的氨基酸是DPP-IV保护性氨基酸，如本文中所述的。本文中使用的术语“DPP-IV保护性氨基酸”表示这样的氨基酸：其实现本文公开的肽对二肽基肽酶IV (DPP IV)切割的显著抗性。在某些方面，所述DPP-IV保护性氨基酸是His的衍生物。

在示例性方面，所述在位置1处的氨基酸是包含Tyr、His、硫代Ala或Phe的侧链的氨基酸，其中所述在位置1的氨基酸的α碳连接至选自以下的结构：

(i) H₂N-(CH₂)_-

(ii) H₂N-

(iii) H(乙酰基)N-(CH₂)_0-1-；和

(iv) H-或CH₃-。

本文中使用的术语“硫代Ala”是指2-噻吩基丙氨酸或2-噻吩丙氨酸。硫代Ala具有以下结构：

在示例性方面，在位置1处的氨基酸包含以下结构：

其中R是Tyr、His、硫代Ala或Phe的侧链，其中X是以下之一：

(i) H₂N-(CH₂)_-

(ii) H₂N-

(iii) H(乙酰基)N-(CH₂)_0-1-；和

(iv) H-或CH₃-。

当所述氨基酸包含与α碳(而不是αNH₂)连接的H₂N-(CH₂)-的结构时，所述氨基酸可以被视作“β-2”形式的氨基酸，例如，β-2-L-Tyr、β-2-D-His、β-2-D-Ala、β-2-D-硫代Ala、β-2-L-His、β-2-L-Tyr、β-2-L-硫代Ala。

当所述氨基酸包含与α碳(而不是αNH₂)连接的H(乙酰基)N-的结构时，所述氨基酸可以被视作“乙酰基”或“乙酰化”形式的氨基酸，例如，乙酰基L-His、乙酰基L-Tyr、乙酰基L-硫代Ala、乙酰基D-His、乙酰基D-Tyr、乙酰基D-硫代Ala。当所述氨基酸包含H(乙酰基)N-(CH₂)-时，所述氨基酸可以被视作“乙酰基-β-2-”形式的氨基酸，例如，乙酰基β-2-L-His、乙酰基β-2-L-Tyr、乙酰基β-2-L-硫代Ala、乙酰基β-2-D-His、乙酰基β-2-D-Tyr、乙酰基β-2-D-硫代Ala。

当所述氨基酸包含与α碳(而不是αNH₂)连接的结构H-时，所述氨基酸可以被视作“脱氨基”形式的氨基酸，例如，脱氨基L-His、脱氨基L-Tyr、脱氨基L-硫代Ala、脱氨基D-His、脱氨基D-Tyr、脱氨基D-硫代Ala。

当所述氨基酸包含与α碳(而不是αNH₂)连接的结构CH₃-时，所述氨基酸可以被视作“脱氨基-β-2”形式的氨基酸，例如，脱氨基β-2-L-His、脱氨基β-2-L-Tyr、脱氨基β-2-L-硫代Ala、脱氨基β-2-D-His、脱氨基β-2-D-Tyr、脱氨基β-2-D-硫代Ala。

当所述氨基酸包含与α碳连接的H₂N-时，所述氨基酸可以被视作包含未修饰的α氨基的氨基酸，且可以是氨基酸的L-立体异构体或D-立体异构体，例如，D-His、D-Tyr、D-硫代Ala。

在示例性方面，所述在位置1处的氨基酸不是L-His、L-Tyr和L-Phe。

在示例性实施方案中，所述在位置1处的氨基酸选自：乙酰基L-His、乙酰基L-Tyr、乙酰基L-硫代Ala、乙酰基L-Phe、乙酰基D-His、乙酰基D-Tyr、乙酰基D-硫代Ala、乙酰基D-Phe、乙酰基β-2-L-His、乙酰基β-2-L-Tyr、乙酰基β-2-L-硫代Ala、乙酰基β-2-L-Phe、乙酰基β-2-D-His、乙酰基β-2-D-Tyr、乙酰基β-2-D-硫代Ala、乙酰基β-2-D-Phe、脱氨基L-His、脱氨基L-Tyr、脱氨基L-硫代Ala、脱氨基L-Phe、脱氨基D-His、脱氨基D-Tyr、脱氨基D-硫代Ala、脱氨基D-Phe、脱氨基β-2-L-His、脱氨基β-2-L-Tyr、脱氨基β-2-L-硫代Ala、脱氨基β-2-L-Phe、脱氨基β-2-D-His、脱氨基β-2-D-Tyr、脱氨基β-2-D-硫代Ala、脱氨基β-2-D-Phe、D-His、D-Tyr、D-硫代Ala、D-Phe、β-2-D-His、β-2-D-Ala、β-2-D-硫代Ala、β-2-D-Phe、β-2-L-His、β-2-L-Tyr、β-2-L-硫代Ala、β-2-L-Phe和L-硫代Ala。

在示例性实施方案中，所述在位置1处的氨基酸选自乙酰基D-Tyr、乙酰基D-His、脱氨基Tyr、D-Tyr、D-His和乙酰基-D-Phe。

在某些实施方案中，本文公开的肽包含在位置2处的DPP-IV保护性氨基酸。在某些方面，所述DPP-IV保护性氨基酸是D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸或α- 氨基异丁酸(AIB)之一。在某些方面，所述DPP-IV保护性氨基酸是α,α-二取代的氨基酸。在某些方面，所述α,α-二取代的氨基酸包含R1和R2，所述R1和R2中的每一个与α碳键合，其中R1和R2中的每一个独立地选自任选地被羟基、酰胺、巯基、卤代取代的C1-C4烷基，或R1和R2与它们所连接的α碳一起形成环。在某些方面，所述α,α-二取代的氨基酸是AIB或1-氨基环丙烷-1-甲酸酯(ACPC)。

本文中使用的术语“C₁-C_n烷基(其中n可以为1至6)”表示具有1至指定数目的碳原子的支链或直链烷基。典型的C₁-C₆烷基包括、但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。

在示例性实施方案中，所述DPP-IV保护性氨基酸是Ser的D-异构体(D-Ser)或其保守氨基酸置换。例如，所述DPP-IV保护性氨基酸可以包含-(C1-C4烷基)OH的侧链结构。任选地，当所述侧链结构包含-(C3烷基)OH或-(C4烷基)OH时，所述碳链可以为直链或支链。

在示例性实施方案中，在位置2处的DPP-IV保护性氨基酸选自Ala、Gly、Pro、肌氨酸和Val。在示例性方面，在位置2处的DPP-IV保护性氨基酸是Ala或Gly。

在示例性方面，当所述DPP-IV保护性氨基酸是D-Ser且在位置1处的氨基酸是His时，所述GIP激动剂肽不与异源部分（例如，亲水部分(例如，PEG)）缀合。在本公开内容的其它方面，所述DPP-IV保护性氨基酸不是D-丝氨酸。

在示例性方面，当在位置2处的氨基酸是Ala时，在位置1处的氨基酸是氨基酸的D-立体异构体。

在示例性实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含在位置1和2处的选自以下的一对氨基酸：

位置1	位置2
		乙酰基D-His	Ala
乙酰基D-硫代Ala	Ala
		乙酰基D-Tyr	Ala
乙酰基D-Tyr	Gly
		乙酰基Thio-Ala	Ala
脱氨基His	Ala
		脱氨基His	Gly
脱氨基Tyr	Ala
		D-His	Ala
D-His	Gly
		D-His	Pro
D-硫代Ala	Ala
		D-Tyr	Ala
His	肌氨酸
		硫代Ala	Gly
硫代Ala	Pro
		β2 His	Ala
乙酰基D-Phe	Ala

位置1	位置2
		乙酰基D-His	Ala
乙酰基D-Tyr	Ala
		脱氨基Tyr	Ala
乙酰基D-硫代Ala	Ala
		乙酰基硫代Ala	Ala
D-His	Ala
		D-Tyr	Ala
脱氨基His	Ala
		乙酰基D-Phe	Ala

在示例性方面，在位置1处的氨基酸包含以下结构：

其中R是His或硫代Ala的侧链，或R包含以下结构：

其中R’任选地存在，且当存在时，是C_1-4亚烷基，

其中X是以下之一：

(i) H₂N-(CH₂)_-

(ii) H₂N-

(iii) H(乙酰基)N-(CH₂)_0-1-；和

(iv) H-或CH₃-。

在示例性方面，R’不存在，且X是H。在这样的方面，所述氨基酸可以被视作4-羟基苯乙酸。

位置3

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含在位置3处的氨基酸，与在该位置具有天然胰高血糖素残基(Gln)的匹配对照肽相比，所述氨基酸赋予胰高血糖素类似物降低的对胰高血糖素受体的活性。在某些方面，在位置3处具有这类氨基酸的胰高血糖素类似物具有天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的约10%或更少，例如，约1-10%、或约0.1-10%，或大于约0.1%但是小于约10%。在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物表现出天然胰高血糖素的活性的约0.5%、约1%或约7%。在示例性方面，在位置3处的氨基酸是酸性的、碱性的或疏水的氨基酸残基，例如，谷氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸。在某些方面，在位置3处的氨基酸是Ile或Leu。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含在位置3处的SEQ ID NO: 1的天然氨基酸，例如，谷氨酰胺，或包含谷氨酰胺类似物。不受限于特定理论，这样的包含谷氨酰胺类似物的胰高血糖素类似物在胰高血糖素受体处不表现出活性的大量损失，且在某些情况下，所述包含谷氨酰胺类似物的胰高血糖素类似物增强胰高血糖素受体活性。在某些实施方案中，所述谷氨酰胺类似物包含在位置3处的含有结构I、II或III的侧链的氨基酸：

结构I

结构II

结构III

其中R¹是C_0-3烷基或C_0-3杂烷基；R²是NHR⁴或C_1-3烷基；R³是C_1-3烷基；R⁴是H或C_1-3烷基；X是NH、O或S；且Y是NHR⁴、SR³或OR³。在某些实施方案中，X是NH或Y是NHR⁴。在某些实施方案中，R¹是C_0-2烷基或C₁杂烷基。在某些实施方案中，R²是NHR⁴或C₁烷基。在某些实施方案中，R⁴是H或C¹烷基。在示例性实施方案中，提供了包含结构I的侧链的氨基酸，其中R¹是CH₂-S，X是NH，且R²是CH₃ (乙酰氨基甲基-半胱氨酸，C(Acm))；R¹是CH₂，X是NH，且R²是CH₃ (乙酰基二氨基丁酸，Dab(Ac))；R¹是C₀烷基，X是NH，R²是NHR⁴，且R⁴是H (氨甲酰基二氨基丙酸，Dap(脲))；R¹是CH₂-CH₂，X是NH，且R²是CH₃(乙酰基鸟氨酸，Orn(Ac))；或R¹是(CH₂)₃，X是NH，且R²是CH₃(乙酰基赖氨酸(Ac Lys)。在示例性实施方案中，提供了包含结构II的侧链的氨基酸，其中，R¹是CH₂，Y是NHR⁴，且R⁴是CH₃ (甲基谷氨酰胺，Q(Me))；在示例性实施方案中，提供了包含结构III的侧链的氨基酸，其中，R¹是CH₂，且R⁴是H (甲硫氨酸-亚砜，M(O))；在具体实施方案中，在位置3的氨基酸被Dab(Ac)取代。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含在位置3处的：

(i) 脂族氨基酸，例如，Ala、Val、正亮氨酸(Nle)或正缬氨酸(NorVal)；

(ii) 具有结构S1的侧链的氨基酸：

-(CH₂)n-X

[结构S1]

其中n是1-4之间的整数；且

其中X是SCH₃、S(O)CH₃；或SOO；或者

(iii) 具有结构S2的侧链的氨基酸：

-(CH₂)n-OH

[结构S2]

其中n是1-4之间的整数。

在示例性方面，具有结构S1的侧链的氨基酸是Met、甲硫氨酸亚砜或甲硫氨酸砜。在示例性方面，具有结构S2的侧链的氨基酸是高丝氨酸。不受限于特定理论，这样的胰高血糖素类似物维持一些胰高血糖素活性。

位置7

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含相对于SEQ ID NO: 1而言在位置7处的氨基酸修饰，例如，所述胰高血糖素类似物包含在位置7处的除了Thr以外的氨基酸。在某些方面，在位置7处的氨基酸是大的、脂族氨基酸，例如，Ile、Leu、Ala等。不受限于特定理论，认为包含这样的在位置7处的氨基酸的胰高血糖素类似物会表现出急剧降低的对GLP-1受体的活性。

位置9

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含相对于SEQ ID NO: 1而言在位置9处的氨基酸修饰，例如，所述胰高血糖素类似物包含在位置9处的除了Asp以外的氨基酸。在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含除了Asp以外的带负电荷的氨基酸，例如，Glu、高谷氨酸、半胱磺酸、高半胱磺酸。在某些方面，在位置9处的氨基酸是如本文中讨论的酰化的氨基酸或烷基化的氨基酸。

位置10

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含相对于SEQ ID NO: 1而言在位置10处的氨基酸修饰，例如，所述胰高血糖素类似物包含在位置10处的除了Tyr以外的氨基酸。在某些方面，在位置10处的氨基酸是Trp。不受限于特定理论，与在位置10处具有Tyr的对应肽相比，认为在位置10处包含这样的氨基酸的胰高血糖素类似物会表现出对GIP受体、GLP-1受体和/或没有还原的胰高血糖素受体的活性。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含如本文中讨论的酰化的氨基酸或烷基化的氨基酸。

位置11

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含相对于SEQ ID NO: 1而言在位置11处的氨基酸修饰，例如，所述胰高血糖素类似物包含在位置11处除了Ser以外的氨基酸。在某些方面，在位置11处的氨基酸是小脂族氨基酸，例如，Gly或Ala。不受限于特定理论，认为包含在位置10处的这样的氨基酸的胰高血糖素类似物会表现出降低的对胰高血糖素受体的活性。

位置12

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含相对于SEQ ID NO: 1而言在位置12处的氨基酸修饰。例如，所述胰高血糖素类似物包含在位置10处除了Lys以外的氨基酸。在某些方面，所述位置12处的氨基酸是大的、脂族、非极性氨基酸，任选地是异亮氨酸。在某些方面，所述在位置12处的氨基酸是Arg。不受限于特定理论，包含大的、脂族、非极性氨基酸（例如，Ile）的胰高血糖素类似物表现出增强的对GIP受体的活性。在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含如本文中讨论的酰化的氨基酸或烷基化的氨基酸。

位置15

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含相对于SEQ ID NO: 1而言在位置15处的氨基酸修饰，例如，所述胰高血糖素类似物包含在位置15处除了Asp以外的氨基酸。在某些方面，在位置15处的氨基酸缺失，或者是谷氨酸、高谷氨酸、半胱磺酸或高半胱磺酸。不受限于特定理论，这样的胰高血糖素类似物表现出提高的稳定性，例如，通过减少类似物随时间的降解或切割，特别是在酸性或碱性缓冲液（例如，在5.5-8范围内的pH的缓冲液）中。在某些实施方案中，包含该修饰的胰高血糖素类似物在25℃保持24小时以后保留原始类似物的至少75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。

位置16

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含相对于SEQ ID NO: 1而言在位置16处的氨基酸修饰，例如，所述胰高血糖素类似物包含在位置16处的除了Ser以外的氨基酸。在某些方面，在位置16处的氨基酸是谷氨酸，或具有4个原子长度的侧链的另一种带负电荷的氨基酸，或可替换地为谷氨酰胺、高谷氨酸或高半胱磺酸中的任一种，或具有含至少一个杂原子(例如，N、O、S、P)的侧链且具有约4 (或3-5)个原子的侧链长度的带电荷的氨基酸。在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含在位置16处的选自谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸、高半胱磺酸、苏氨酸或甘氨酸的氨基酸，或是选自谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸和高半胱磺酸的氨基酸。

不受限于特定理论，这样的胰高血糖素类似物表现出增强的稳定性，例如，通过减少所述肽随时间的降解，特别是在酸性或碱性缓冲液（例如，在5.5-8范围内的pH的缓冲液）中。这样的胰高血糖素类似物对Asp15-Ser16肽键的切割不太敏感。

在某些实施方案中，在位置16处的氨基酸是带负电荷的氨基酸，任选地与在位置20处的促进α螺旋的氨基酸(例如，α,α-二取代的氨基酸，或AIB)组合。这样的胰高血糖素类似物表现出GIP活性。

在替代实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含在位置16处的Thr或如上所述的促进α螺旋的氨基酸。在某些实施方案中，所述促进α螺旋的氨基酸是AIB或Glu。

在某些方面，所述在位置16处的氨基酸是带正电荷的氨基酸，例如，式IV：

[式IV]，

其中n是1-16、或1-10、或1-7、或1-6、或2-6、或2或3或4或5，R¹和R²中的每一个独立地选自：H、C₁-C₁₈烷基、(C₁-C₁₈烷基)OH、(C₁-C₁₈烷基)NH₂、(C₁-C₁₈烷基)SH、(C₀-C₄烷基)(C₃-C₆)环烷基、(C₀-C₄烷基)(C₂-C₅杂环基)、(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇和(C₁-C₄烷基)(C₃-C₉杂芳基)，其中R₇是H或OH。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物的在位置16处的氨基酸是Lys。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含在位置16处的如本文中讨论的酰化的氨基酸或烷基化的氨基酸。

在其它实施方案中，在位置16处的氨基酸是包含与异源部分缀合的侧链的氨基酸，如本文中在标题为“缀合物”的部分下面所述。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含在位置16处的脂族氨基酸。例如，所述胰高血糖素类似物可以具有在胰高血糖素类似物的位置16处的Gly、Ala、Val、Leu或Ile。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含小脂族残基，例如，Gly、Ala。

在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含含有咪唑侧链的氨基酸。在示例性方面，在位置16处的氨基酸包含式A的结构：

[式A]，

其中R¹和R²中的每一个独立地选自：H、(C1-6)烷基、O(C1-6)烷基、(C1-6)烷基-OH、F和(C1-C6)烷基（其中至少一个H被F替代）。在示例性方面，在位置16处的氨基酸包含式A的类似物结构，其中一个或两个环氮连接至C1-C3烷基。

在示例性方面，在位置16处的氨基酸是L-组氨酸(His)。在其它方面，在位置16处的氨基酸是His的衍生物(His衍生物)，其中的一些描述在本文中。参见，例如，在“ 位置1 ”下的教导。

位置17和18

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含相对于SEQ ID NO: 1而言在位置17和18中的任一个或两个处的氨基酸修饰，从而消除在位置17和18处的双碱性Arg-Arg位点。在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含在位置17和18中的一个或两个处的除了Arg以外的氨基酸。不受限于任何特定理论，认为，消除双碱性位点会改善胰高血糖素类似物的体内效力。在某些方面，在位置17处的氨基酸不是碱性氨基酸。在某些方面，在位置17处的氨基酸是脂族氨基酸。在某些实施方案中，在位置17处的氨基酸被如本文中所述的另一种氨基酸（例如，包含亲水部分的氨基酸，促进α螺旋的氨基酸）置换。在某些实施方案中，所述促进α螺旋的氨基酸与在j+3或i+4处的氨基酸形成非共价分子内桥。在某些方面，在位置17处的氨基酸是Gln。

在其它方面，本公开内容的胰高血糖素类似物包含含有在位置17处的咪唑侧链的氨基酸。在示例性方面，在位置17处的氨基酸包含式A的结构：

[式A]，

其中R¹和R²中的每一个独立地选自：H、(C1-6)烷基、O(C1-6)烷基、(C1-6)烷基-OH、F和(C1-C6)烷基（其中至少一个H被F替代）。在示例性方面，在位置17处的氨基酸包含式A的类似物结构，其中一个或两个环氮连接至C1-C3烷基。

在示例性方面，在位置17处的氨基酸是L-组氨酸(His)。在其它方面，在位置17处的氨基酸是His的衍生物(His衍生物)，其中的一些描述在本文中。参见，例如，在“ 位置1 ”下的教导。

在某些方面，在位置18处的氨基酸不是碱性氨基酸。在某些方面，在位置18处的氨基酸是脂族氨基酸。在某些实施方案中，在位置18处的氨基酸是小脂族氨基酸，例如，Ala。

在某些具体方面，在位置18处的氨基酸是小脂族氨基酸，例如，Ala，且在位置17处的氨基酸是Arg。在其它方面，在位置18处的氨基酸是小脂族氨基酸，例如，Ala，且在位置17处的氨基酸是Gln。

在某些方面，在位置17处的氨基酸是包含与异源部分缀合的侧链的氨基酸，如本文中在标题为“缀合物”的部分下面所述。

位置19

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含相对于SEQ ID NO: 1而言在位置19处的氨基酸修饰，例如，所述胰高血糖素类似物包含在位置19处的除了Ala以外的氨基酸。在某些方面，在位置19处的氨基酸是促进α螺旋的氨基酸(例如，α,α-二取代的氨基酸，或AIB)。不受限于任何特定理论，与匹配的对照肽相比，包含α,α-二取代的氨基酸（例如，AIB）的胰高血糖素类似物表现出降低的胰高血糖素激动剂活性，其中所述在位置19处的氨基酸是天然氨基酸残基Ala。

位置20

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含相对于SEQ ID NO: 1而言在位置20处的氨基酸修饰，例如，在位置20处的氨基酸是除了Gln以外的氨基酸。在某些方面，所述在位置20处的氨基酸是促进α螺旋的氨基酸，例如如上所述。在某些方面，所述在位置20处的氨基酸是α,α-二取代的氨基酸（例如，AIB、ACPC）。在某些实施方案中，所述促进α螺旋的氨基酸与在j-3或i-4处的氨基酸形成非共价分子内桥。

在某些具体实施方案中，所述氨基酸是具有侧链的亲水氨基酸，所述侧链是带电荷的或具有氢键合的能力，且具有至少约5 (或约4-6)个原子的长度，例如，赖氨酸、瓜氨酸、精氨酸或鸟氨酸。在其它方面，在位置20处的氨基酸是Ser、Thr、Ala或AIB。

在某些方面，所述在位置20处的氨基酸是如本文中讨论的酰化的氨基酸或烷基化的氨基酸。

在某些方面，所述在位置20处的氨基酸是包含与异源部分缀合的侧链的氨基酸，如本文中在标题为“缀合物”的部分下面所述。

在某些方面，所述胰高血糖素类似物的在位置20处的氨基酸包含咪唑侧链。在示例性方面，在位置20处的氨基酸包含式A的结构：

[式A]，

其中R¹和R²中的每一个独立地选自：H、(C1-6)烷基、O(C1-6)烷基、(C1-6)烷基-OH、F和(C1-C6)烷基（其中至少一个H被F替代）。在示例性方面，在位置20处的氨基酸包含式A的类似物结构，其中一个或两个环氮连接至C1-C3烷基。

在示例性方面，在位置20处的氨基酸是L-组氨酸(His)。在其它方面，在位置20处的氨基酸是His的衍生物(His衍生物)，其中的一些描述在本文中。参见，例如，在”位置1”下的教导。

在某些方面，在位置20处的氨基酸是带正电荷的氨基酸，例如，式IV：

[式IV]，

其中n是1-16、或1-10、或1-7、或1-6、或2-6、或2或3或4或5，R¹和R²中的每一个独立地选自：H、C₁-C₁₈烷基、(C₁-C₁₈烷基)OH、(C₁-C₁₈烷基)NH_2、(C₁-C₁₈烷基)SH、(C₀-C₄烷基)(C₃-C₆)环烷基、(C₀-C₄烷基)(C₂-C₅杂环基)、(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇和(C₁-C₄烷基)(C₃-C₉杂芳基)，其中R₇是H或OH。在示例性方面，胰高血糖素类似物的在位置20处的氨基酸是Lys。

不受限于特定理论，这样的胰高血糖素类似物表现出增强的对GLP-1受体和/或GIP受体的活性，或表现出减少的通过Gln的脱酰胺化而发生的降解，和/或表现出增加的稳定性。

位置21

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含相对于SEQ ID NO: 1而言在位置21处的氨基酸修饰，例如，在位置21处的氨基酸是除了Asp以外的氨基酸。在示例性方面，在位置21处的氨基酸是Ser、Thr、Ala或AIB。在其它方面，在位置21处的氨基酸是Lys、Arg、Orn或瓜氨酸。在某些方面，在位置21处的氨基酸是Glu、高谷氨酸或高半胱磺酸。在某些方面，在位置21处的氨基酸是包含与异源部分缀合的侧链的氨基酸，如本文中在标题为“缀合物”的部分下面所述。

在某些实施方案中，在位置21处的氨基酸是促进α螺旋的氨基酸。在某些实施方案中，所述促进α螺旋的氨基酸与在j-3或i-4处的氨基酸形成非共价分子内桥。

不受限于特定理论，这样的胰高血糖素类似物表现出减少的降解和/或表现出增加的稳定性，所述降解通过Asp的脱水而发生以形成环状琥珀酰亚胺中间体，随后异构化成异天冬氨酸。

位置23

在某些方面，所述胰高血糖素类似物包含相对于SEQ ID NO: 1而言在位置23处的氨基酸修饰。在某些方面，在位置23处的氨基酸是除了Val以外的氨基酸，包括、但不限于Ile。

位置24

在某些方面，所述胰高血糖素类似物包含相对于SEQ ID NO: 1而言在位置24处的氨基酸修饰。在某些方面，在位置24处的氨基酸是除了Gln以外的氨基酸，例如，Ala、Asn、Cys。在某些方面，在位置24处的氨基酸是包含与异源部分缀合的侧链的氨基酸，如本文中在标题为“缀合物”的部分下面所述。

位置27

在某些方面，所述胰高血糖素类似物包含相对于SEQ ID NO: 1而言在位置27处的氨基酸修饰。在某些方面，在位置27处的氨基酸是除了Met以外的氨基酸。在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含在位置27处的防止所述肽的氧化降解的氨基酸。在某些方面，在位置27处的氨基酸是甲硫氨酸亚砜、亮氨酸、异亮氨酸或正亮氨酸。在某些具体实施方案中，在位置27处的氨基酸是亮氨酸或正亮氨酸。

在其它方面，在位置27处的氨基酸是脂族氨基酸(例如，Gly、Ala、Val、Leu、Ile)或如本文中所述的式IV的氨基酸，例如，Lys。在示例性实施方案中，所述在位置27处的氨基酸是Val或Lys。不受限于任何特定理论，这样的氨基酸修饰会降低胰高血糖素活性。

位置28和29

在某些方面，所述胰高血糖素类似物包含相对于SEQ ID NO: 1而言在位置28处的氨基酸修饰。在某些方面，在位置28处的氨基酸是除了Asn以外的氨基酸。在某些方面，在位置28处的氨基酸是Ala、Ser、Thr或AIB。在某些方面，在位置28处的氨基酸是带电荷的氨基酸，例如，带负电荷的氨基酸，如在本文中进一步描述的。参见标题为“带电荷的C端”的部分。在某些方面，在位置28处的氨基酸是Asp。在示例性的优选方面，在位置28处的氨基酸是Glu。

在示例性方面，在位置28处的氨基酸是如本文中所述的式IV的氨基酸。在示例性实施方案中，所述氨基酸是Lys。不受限于任何特定理论，这样的氨基酸修饰会降低胰高血糖素活性。

在某些方面，所述胰高血糖素类似物包含相对于SEQ ID NO: 1而言在位置29处的氨基酸修饰。在某些方面，在位置29处的氨基酸是除了Thr以外的氨基酸。在某些方面，在位置29处的氨基酸是脂族残基，例如，Gly、Ala、Val、Leu、Ile。在某些方面，在位置29处的氨基酸是小脂族氨基酸。在某些方面，在位置29处的氨基酸是Ala或Gly或Leu。在某些方面，在位置29处的氨基酸是α,α-二取代的氨基酸，诸如本文描述的这些中的任一种。在示例性方面，在位置29处的氨基酸是AIB。

在某些方面，在位置29处的氨基酸是包含与异源部分缀合的侧链的氨基酸，如本文中在标题为“缀合物”的部分下面所述。

不受限于任何特定理论，当位置28是Asp且位置29是Gly时，所述胰高血糖素类似物发生一定程度的化学不稳定性。因而，在示例性方面，所述胰高血糖素类似物不具有在位置28处的Asp和在位置29处的Gly，且可以表现出增强的化学稳定性。例如，在某些方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置28处的Asp和在位置29处的除了Gly以外的氨基酸。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置28处的Asp以及在位置29处的Gly、Ala、Val、Leu、Ile或AIB之一。在替代方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置29处的Gly和在位置28处的除了Asp以外的氨基酸。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置28处的Ala、Ser、Thr、Lys、AIB或Glu和在位置29处的Gly。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置28处的Glu和在位置29处的Gly。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置28处的Asp或Glu和在位置29处的Ala。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置28处的Asp和在位置29处的Leu。

带电荷的C端

在某些实施方案中，相对于SEQ ID NO: 1而言，所述胰高血糖素类似物包含一个或多个向所述类似物的C端部分引入带电荷氨基酸的氨基酸置换和/或添加。在某些实施方案中，这样的修饰会增加稳定性和溶解度。本文中使用的术语“带电荷的氨基酸”或“带电荷的残基”表示包含侧链的氨基酸，所述侧链在生理pH下、在水溶液中待正电荷或带负电荷的(即，去质子化)或带正电荷(即，质子化)。在某些方面，这些引入带电荷氨基酸修饰的氨基酸置换和/或添加位于SEQ ID NO: 1的在位置27的C端的位置。在某些实施方案中，将1、2或3个(在某些情况下，超过3个)带电荷的氨基酸引入C端部分内(例如，在位置27的C端的位置)。根据某些实施方案，在位置28和/或29处的天然氨基酸被带电荷的氨基酸置换，和/或在另一个实施方案中，还将1-3个带电荷的氨基酸添加至所述类似物的C端。在示例性实施方案中，1个、2个或所有的带电荷的氨基酸是带负电荷的。在某些实施方案中，所述带负电荷的氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸、半胱磺酸、高半胱磺酸或高谷氨酸。在某些方面，这些修饰会增加溶解度或稳定性。在某些实施方案中，位置30不是带电荷的氨基酸。不受限于特定理论，带电荷的氨基酸（例如，带负电荷的氨基酸，例如，Glu）会降低GIP活性。

C端截短

根据某些实施方案，本文中公开的胰高血糖素类似物通过C端截短1个或2个氨基酸残基而被修饰。这样的修饰的胰高血糖素肽保留对胰高血糖素受体和GLP-1受体的相似的活性和效能。在这方面，所述胰高血糖素肽可以包含天然胰高血糖素类似物(SEQ ID NO:1)的氨基酸1-27或1-28，任选地具有本文描述的任何其它修饰。

电荷中性C端

在某些实施方案中，相对于SEQ ID NO: 1而言，所述胰高血糖素类似物包含在C端的电荷中性基团(例如，酰胺或酯)以替代α羧酸酯。不受限于任何特定理论，在示例性方面，这样的修饰会增加所述胰高血糖素类似物对GLP-1受体的活性。因此，在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物为酰胺化的肽，使得所述C端残基包含酰胺来替代氨基酸的α羧酸酯。本文中使用的对肽或类似物的一般提及意图包括具有修饰的氨基端、羧基端、或氨基端和羧基端两者的肽。例如，意图用指定标准氨基酸的氨基酸序列涵盖包含酰胺基（替代末端羧酸）组成的氨基酸链。

C端延伸段

在本公开内容的某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含与在位置29处的氨基酸融合的1-21个氨基酸的C端延伸段。所述C端延伸段可以包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个氨基酸。在某些方面，所述C端延伸段是在下面在“缀合物”部分中描述的任意异源肽。例如，所述胰高血糖素类似物包含在位置30处的脂族残基，例如，Gly、Ala、Val、Leu、Ile。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置30处的小脂族残基，例如，Gly、Ala。

另外，例如，在某些方面，所述延伸段包含形成Trp笼结构的氨基酸序列，例如，所述延伸段包含GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 5)的氨基酸序列或其保守置换序列。在替代方面，1-21个氨基酸的延伸段包含至少一个带电荷的氨基酸。在示例性方面，所述延伸段包含以下氨基酸序列：X1-X2，其中X1是带电荷的氨基酸，且X2是小脂族氨基酸。在某些方面，X1是带正电荷的氨基酸，例如，Arg。在某些方面，延伸段包含Arg-Gly。

在某些实施方案中，所述延伸段包含SEQ ID NO: 5 (GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO: 6(GGPSSGAPPPS)、SEQ ID NO: 7 (KRNRNNIA)或SEQ ID NO: 8 (KRNR)的氨基酸序列。在具体方面，所述氨基酸序列通过胰高血糖素类似物的C端氨基酸(例如，在位置29处的氨基酸)进行连接。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 5-8中任一个的氨基酸序列通过肽键结合至所述胰高血糖素类似物的氨基酸29。在某些具体实施方案中，所述胰高血糖素类似物在位置29处的氨基酸是Gly，所述Gly与SEQ ID NO:5-8中任一个的氨基酸序列之一融合。

在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含形成本领域称作Trp笼的结构的延伸段(参见，例如，Paschek等人, Proc Natl Acad Sci USA 105 (46): 17754-17759(2008)。在某些方面，所述延伸段包含氨基酸序列GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 5)或GGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 6)或GPSSGRPPPS (SEQ ID NO: 183)，或带有1、2或3个保守氨基酸置换的上述之一的序列。在示例性方面，当所述延伸段包含SEQ ID NO: 183的氨基酸序列时，所述在位置28处的氨基酸是带负电荷的氨基酸，例如，Asp或Glu。

其它修饰

本公开内容的胰高血糖素类似物相对于SEQ ID NO: 1而言的其它修饰的描述参见本说明书全文。上列的列举不是穷举性的，而仅仅是示例性的。

在某些实施方案中，本文描述的胰高血糖素类似物被糖基化、酰胺化、羧酸酯化、磷酸化、酯化、N-酰化、环化（例如，通过二硫键）或转化成盐(例如，酸加成盐、碱加成盐)，和/或任选地二聚化、多聚化或聚合化或缀合化。

被排除的肽

本公开内容的胰高血糖素类似物在结构上不同于在以下文献中描述的表现出GIP受体激动剂活性的胰高血糖素类似物：国际专利申请号PCT US2009/47447 (2009年6月16日提交)、美国申请号61/073,274 (2008年6月17日提交)；美国申请号61/078,171 (2008年7月3日提交)；美国申请号61/090,448 (2008年8月20日提交)、美国申请号61/151,349(2009年2月10日提交)、美国申请号61/187,578 (2009年6月16日提交)、国际专利申请号PCT/US2010-038825 (2010年6月16日提交)；2010年12月22日提交的美国临时专利申请号61/426,285；2011年8月3日提交的美国临时专利申请号61/514,609，和2011年12月20日提交的国际专利申请号PCT/US2011/066164，它们的内容通过引用整体并入。因此，在任一个或所有实施方案中，本公开内容的胰高血糖素类似物不是下列文献中描述的任何胰高血糖素类似物或肽：国际专利申请号PCT/US2009/47447 (2009年6月16日提交，且公开为WO2010/011439)、美国申请号61/073,274 (2008年6月17日提交)；美国申请号61/078,171(2008年7月3日提交)；美国申请号61/090,448 (2008年8月20日提交)、美国申请号61/151,349 (2009年2月10日提交)、美国申请号61/187,578 (2009年6月16日提交)、国际专利申请号PCT/US2010/038825 (2010年6月16日提交，且公开为WO 2010/148089)、美国申请号61/298,812 (2010年1月27日提交)、国际专利申请号PCT/US2011/022608 (2011年1月26日提交，且公开为WO 2011/094337)、2010年12月22日提交的美国临时专利申请号61/426,285；2011年8月3日提交的美国临时专利申请号61/514,609，或2011年12月20日提交的国际专利申请号PCT/US2011/066164。在示例性实施方案中，本公开内容的肽、胰高血糖素肽或胰高血糖素类似物不是(即排除)以下的任一种或全部肽：WO 2010/011439的SEQ ID NO: 1-262、WO 2010/148089的SEQ ID NO: 1-680、或PCT/US2011/022608的SEQ ID NO: 1-1318、或2011年12月20日提交的国际专利申请号PCT/US2011/066164的SEQ ID NO: 10-262。

在示例性实施方案中，本公开内容的肽、胰高血糖素肽或胰高血糖素类似物不是(即排除)以下的任一种或全部肽：国际专利申请公开号WO 2010/011439的SEQ ID NO:

。

在示例性实施方案中，本公开内容的肽、胰高血糖素肽或胰高血糖素类似物不是(即排除)以下的任一种或全部肽：国际专利申请公开号WO 2010/148089的SEQ ID NO:

。在示例性实施方案中，本公开内容的肽、胰高血糖素肽或胰高血糖素类似物不是(即排除)以下的任一种或全部肽：国际专利申请公开号WO 2010/148089的SEQ ID NO: 657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669，它们在本文中分别呈现为SEQ ID NO: 219-229。

在示例性实施方案中，本公开内容的肽、胰高血糖素肽或胰高血糖素类似物不是(即排除)以下的任一种或全部肽：国际申请号公开号WO/2011/094337的SEQ ID NO:

。

示例性实施方案

在示例性实施方案中，本公开内容的肽是胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的类似物，其包含

A. 在位置1处的包含Tyr、His、硫代Ala或Phe的侧链的氨基酸，其中所述在位置1的氨基酸的α碳连接至选自以下的结构：

(i) H₂N-(CH₂)_-

(ii) H₂N-；

(iii) H(乙酰基)N-(CH₂)_0-1-；和

(iv) H-或CH₃-

B. 在位置9、10、12、20或37-43中的任一个处的酰化的氨基酸或烷基化的氨基酸，任选地其中所述酰基或烷基通过间隔物连接至所述氨基酸；

C. 在位置16-21中的一个或多个处的稳定α螺旋的氨基酸，

和

D. 相对于SEQ ID NO: 1的至多10个额外氨基酸修饰；

所述在位置1处的氨基酸是L-立体异构体或D-立体异构体，其中，任选地，所述在位置1处的氨基酸不是L-His、L-Phe和L-Tyr，其中，当所述胰高血糖素类似物缺少亲水部分时，所述胰高血糖素类似物在人GIP受体处表现出小于或约0.5 nM (例如，小于或约0.01nM、小于或约0.05 nM、或小于或约0.03 nM)的EC50，且其中所述胰高血糖素类似物对人GLP-1受体的选择性比GIP受体小100倍。

A. 在位置1处的包含以下结构的氨基酸：

其中R是His或硫代Ala的侧链，或R是：

其中R’任选地存在，且当存在时，是C_1-4亚烷基，

其中X是以下之一：

(i) H₂N-(CH₂)_-

(ii) H₂N-

(iii) H(乙酰基)N-(CH₂)_0-1-；和

(iv) H-或CH₃-。

C. 在位置16-21中的一个或多个处的稳定α螺旋的氨基酸，

和

D. 相对于SEQ ID NO: 1的至多10个额外氨基酸修饰；

其中所述在位置1处的氨基酸是L-立体异构体或D-立体异构体，其中，任选地，所述在位置1处的氨基酸不是L-His、L-Phe和L-Tyr，其中，当所述胰高血糖素类似物缺少亲水部分时，所述胰高血糖素类似物在人GIP受体处表现出小于或约0.5 nM (例如，小于或约0.01 nM、小于或约0.05 nM、或小于或约0.03 nM)的EC50，且其中所述胰高血糖素类似物对人GLP-1受体的选择性比GIP受体小100倍。在示例性方面，R’是C_1-2亚烷基。在示例性方面，R’不存在，且X是H。在这样的方面，所述氨基酸可以被视作4-羟基苯乙酸。

本文中描述的胰高血糖素类似物可以包含本文描述的任意活性谱。参见，例如，标题为“ 本文公开的肽的活性 ”的部分。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物表现出至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约90%、至少或约100%、至少或约300%、或至少或约500%的GIP百分比效能。在某些方面，所述胰高血糖素类似物也表现出至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约90%、至少或约100%、至少或约300%、或至少或约500%的GLP-1百分比效能。在替代性的或额外的方面，所述胰高血糖素类似物表现出至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约90%、或至少或约100%的胰高血糖素百分比效能。因此，尽管所述胰高血糖素类似物可以被视作GIP激动剂肽，但是在某些方面，所述胰高血糖素类似物另外可以被视作GIP-GLP-1共激动剂、GIP-胰高血糖素共激动剂或GIP-GLP-1-胰高血糖素三激动剂。例如，所述肽可以在人GIP受体、人GLP-1受体和任选的人胰高血糖素受体中的每一种处表现出激动剂活性，其中所述肽在GIP受体处表现出的EC50是它在GLP-1受体处的EC50的100倍(例如，50倍、40倍、30倍、20倍、15倍、10倍、或更少)以内，且任选地是在它在胰高血糖素受体处的EC50的100倍(例如，50倍、40倍、30倍、20倍、15倍、10倍或更少)以内。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物对人GLP-1受体的选择性比GIP受体小100倍。

在某些方面，在位置1处的氨基酸选自：乙酰基L-His、乙酰基L-Tyr、乙酰基L-硫代Ala、乙酰基L-Phe、乙酰基D-His、乙酰基D-Tyr、乙酰基D-硫代Ala、乙酰基D-Phe、乙酰基β-2-L-His、乙酰基β-2-L-Tyr、乙酰基β-2-L-硫代Ala、乙酰基β-2-L-Phe、乙酰基β-2-D-His、乙酰基β-2-D-Tyr、乙酰基β-2-D-硫代Ala、乙酰基β-2-D-Phe、脱氨基L-His、脱氨基L-Tyr、脱氨基L-硫代Ala、脱氨基L-Phe、脱氨基D-His、脱氨基D-Tyr、脱氨基D-硫代Ala、脱氨基D-Phe、脱氨基β-2-L-His、脱氨基β-2-L-Tyr、脱氨基β-2-L-硫代Ala、脱氨基β-2-L-Phe、脱氨基β-2-D-His、脱氨基β-2-D-Tyr、脱氨基β-2-D-硫代Ala、脱氨基β-2-D-Phe、D-His、D-Tyr、D-硫代Ala、D-Phe、β-2-D-His、β-2-D-Tyr、β-2-D-硫代Ala、β-2-D-Phe、β-2-L-His、β-2-L-Tyr、β-2-L-硫代Ala、β-2-L-Phe、和L-硫代Ala。在示例性方面，在位置1处的氨基酸选自乙酰基D-Tyr、乙酰基D-His、脱氨基Tyr、D-Tyr、D-His和乙酰基-D-Phe。

在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置2处的选自Ala、Gly、Pro、肌氨酸和Val的氨基酸。在某些方面，在位置2处的氨基酸是Ser。在其它方面，在位置2处的氨基酸是Ala或Gly。

在示例性方面，当在位置2处的氨基酸是Ala时，所述胰高血糖素类似物包含在位置1处的氨基酸的D-立体异构体。

在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置1和2处的选自以下的一对氨基酸：

在示例性方面，当所述胰高血糖素类似物包含在位置2处的Gly时，所述类似物不包含在位置1处的D-His，脱氨基His。在某些方面，所述胰高血糖素类似物不包含在位置1处的脱氨基His和在位置2处的Ala。在某些方面，所述胰高血糖素不包含在位置1处的乙酰基His和在位置2处的肌氨酸。

在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置16-21中的一个或多个处的稳定α螺旋的氨基酸。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置16处的稳定α螺旋的氨基酸，任选地是带负电荷的氨基酸(例如，Glu)或α,α-二取代的氨基酸。在示例性方面，所述α,α-二取代的氨基酸包含R1和R2，其中的每一个键合至α碳，其中R1和R2中的每一个独立地选自任选地被羟基、酰胺、巯基、卤代取代的C1-C4烷基，或R1和R2与它们所连接的α碳一起形成环。在示例性方面，所述α,α-二取代的氨基酸是AIB。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置17处的Arg和小脂族氨基酸，任选地包含在位置18处的Ala。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物与SEQ ID NO: 1相比在位置20处没有经过修饰，且在位置20处的氨基酸是Gln。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置16处的Glu、在位置17处的Arg、在位置18处的Ala、在位置19处的Ala和在位置20处的Gln。

在前述内容的示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置9、10、12、16、20中的任一个处的酰化的或烷基化的氨基酸。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含与在位置9、10、12、13、14、16、17和20中的任一个或多个处的C₁₂至C₁₈酰基或烷基共价连接的氨基酸。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置10处的酰化的或烷基化的氨基酸。在某些方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置29处的氨基酸的C端的1-21个氨基酸的延伸段，且包含在位置37-43中的任一个(例如，37、38、39、40、41、42、43)处的酰化的或烷基化的氨基酸。在某些方面，所述包含非天然的酰基或烷基的氨基酸是在位置40处。

在前述内容的示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置29处的氨基酸的C端的1-21个氨基酸的延伸段，且在某些方面，所述延伸段形成本领域称作Trp笼的结构。在某些方面，所述延伸段包含氨基酸序列GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 5)或GGPSSGAPPPS (SEQID NO: 6)或GPSSGRPPPS (SEQ ID NO:68)或具有1个、2个、或3个保守氨基酸置换的前述之一的序列。在示例性方面，当所述胰高血糖素类似物包含1-21个氨基酸的延伸段时，所述胰高血糖素类似物包含在位置29处的Gly、Ala或Leu。

在示例性方面，所述酰化的氨基酸或烷基化的氨基酸包含式I(任选地是Lys)、式II、(任选地是Cys)或式III (任选地是Ser)的结构。任选地，在某些方面，所述酰化的氨基酸或烷基化的氨基酸包含式I的结构，例如，Lys。

在某些方面，所述酰化的氨基酸或烷基化的氨基酸通过间隔物连接至酰基或烷基。在某些方面，所述间隔物的长度是3-10个原子。在某些方面，所述间隔物是氨基酸或二肽，且在某些方面，所述间隔物包含1或2个酸性氨基酸残基，例如，Glu。在某些方面，所述酰基或烷基通过间隔物连接至氨基酸，其中所述间隔物和所述酰基的总长度是约14至约28个原子的长度。在某些方面，所述间隔物包含1或2个γ-Glu。

关于酰化的氨基酸，在某些方面的酰基是C₁₂至C₁₈(例如，C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18)脂肪酰基。在某些方面，所述酰基是C14或C16脂肪酰基。

在前述实施方案的示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置15、位置21或位置28处，或在位置15和21处、在位置15和28处、或在位置21和28处、或在位置15、21和28处的Glu。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含仅在位置15、21和28中的位置28处的Glu。

在本公开内容的某些方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置27处的氨基酸的C端的至少一个带电荷的氨基酸。例如，在某些方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置28处的带电荷的氨基酸(例如，带负电荷的氨基酸)。在某些方面，所述带负电荷的氨基酸是Asp或Glu。在某些方面，所述带负电荷的氨基酸是Glu。在替代方面，在位置28处的氨基酸是带正电荷的氨基酸，例如，带正电荷的氨基酸是式I的氨基酸，例如，Lys。

在替代性的或额外的方面，所述胰高血糖素类似物包含在位置27处、在位置29处或在位置27和29二者处的氨基酸修饰。例如，在某些方面，在位置27处的氨基酸是Leu、Nle、Val或Lys，和/或在某些方面，在位置29处的氨基酸是Gly或Thr。

在某些方面，在位置28处的氨基酸是Asp，且任选地，在位置29处的氨基酸是除了Gly以外的氨基酸，例如，Val、Ala、Leu或AIB。

在示例性方面，在位置28处的氨基酸是Glu，且在位置29处的氨基酸是Gly、Ala或Leu。

相对于SEQ ID NO: 1而言，本文描述的胰高血糖素类似物可以包含额外氨基酸修饰，例如，至多10个(例如，0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个)额外氨基酸修饰，如在本文中进一步讨论的。在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含以下的一个或多个：

i. 在位置7处的Ile；

ii. 在位置12处的Ile或Arg；

iii. 在位置18处的脂族氨基酸，任选地是Ala；

iv. 在位置21处的酸性氨基酸，任选地是Glu；

v. 在位置24处的Asn、Ala或AIB；

vi. 在位置27处的脂族氨基酸，任选地是Ala或Leu或Nle；

vii. 在位置28处的酸性氨基酸，任选地是Glu，或脂族氨基酸，任选地是Ala；

viii. 在位置29处的脂族氨基酸，任选地是Ala；

ix. 在C端处的酰胺化。

根据前述内容，在示例性方面，所述胰高血糖素类似物包含SEQ ID NO: 11-34中的任一个的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。

本发明提供了一种肽，其包含SEQ ID NO: 35的序列，

其中：

X₂是Ala、Gly、Pro、肌氨酸、Ser和Val，

X₃是Gln或包含结构I、II或III的侧链的氨基酸；其中结构I、II和III是：

结构I

结构II

结构III

X₁₀是Tyr或共价地连接至C₁₂至C₁₈酰基或烷基的氨基酸；

X₁₅是酸性氨基酸，任选地是Glu或Asp；

X₁₇是Arg、His、Gln；

X₁₉是Ala或α,α-二取代的氨基酸；

X₁₈是Arg或Ala；

X₂₁是酸性氨基酸，任选地是Asp或Glu；

X₂₇是Leu、Ala、Nle或Met；

X₂₈是Ala或酸性氨基酸(任选地是Asp或Glu)；

X₂₉是脂族，例如，Ala或Gly或AIB或Val；

X₃₀是小脂族氨基酸，例如，Ala或Gly

X₃₅是Ala或碱性氨基酸(任选地是Arg或Lys)；

其中，当X₂₈是酸性氨基酸时，X35是碱性氨基酸；

其中，任选地，当X₂₈是Asp时，那么X₂₉不是Gly

其中，当X10是Tyr时，所述肽包含在位置40处的共价地连接至C₁₂至C₁₈酰基或烷基的氨基酸，且，其中，任选地，所述肽包含在位置41处的Gly，且

其中所述肽的C端氨基酸被酰胺化；

在某些方面，在位置1处的氨基酸选自乙酰基D-Tyr、乙酰基D-His、脱氨基Tyr、D-Tyr、D-His和乙酰基D-Phe。

在示例性方面，所述肽包含在位置2处的选自Ala、Gly、Pro、肌氨酸和Val的氨基酸。在示例性方面，在位置2处的氨基酸选自Ala和Gly。

在示例性方面，当在位置2处的氨基酸是Ala时，所述肽包含在位置1处的氨基酸的D-立体异构体。

在示例性方面，所述肽包含在位置1和2处的选自以下的一对氨基酸：

在示例性方面，当所述肽包含在位置2处的Gly时，所述肽不包含在位置1处的D-His, 脱氨基His。在某些方面，所述肽不包含在位置1处的脱氨基His和在位置2处的Ala。在某些方面，所述肽不包含在位置1处的乙酰基His和在位置2处的肌氨酸。

在SEQ ID NO: 35的肽的示例性方面，X₁₀是Tyr，所述肽包含在位置40处的共价地连接至C₁₂至C₁₈酰基或烷基的氨基酸，且所述肽任选地包含在位置41处的Gly。在SEQ IDNO: 35的肽的替代性的示例性方面，X₁₀是与C12-C18酰基或烷基共价连接的氨基酸。

在SEQ ID NO: 35的肽的示例性方面，X₂₀是Gln。在示例性方面，在位置16处的氨基酸是带负电荷的氨基酸，任选地是Glu。在示例性方面，X₁₈是Ala。在示例性方面，X₂₈是Glu。并且，在示例性方面，X₂₇是Leu或Nle，X₂₉是Gly，所述肽包含在C端处酰胺化的Gly或它们的组合。

本发明另外提供了一种肽，其包含与SEQ ID NO: 35相比具有至多3个氨基酸修饰(例如，0、1、2个或3个氨基酸修饰)的序列SEQ ID NO: 35，其中所述肽在人GIP受体和人GLP-1受体和/或人胰高血糖素受体处表现出激动剂活性。所述氨基酸修饰可以是本文描述的那些中的任一种。在具有至多3个(例如，1个、2个、3个)氨基酸修饰的、包含SEQ ID NO:35的序列的肽的示例性方面，所述氨基酸修饰发生在除了位置1以外的位置。

本发明提供了一种肽，其包含SEQ ID NO: 35的序列，

其中：

X₂是Ala、Gly、Pro、肌氨酸、Ser和Val，

结构I

结构II

结构III

X₁₅是酸性氨基酸，任选地是Glu或Asp；

X₁₇是Arg、His、Gln；

X₁₉是Ala或α,α-二取代的氨基酸；

X₁₈是Arg或Ala；

X₂₁是酸性氨基酸，任选地是Asp或Glu；

X₂₇是Leu、Ala、Nle或Met；

X₂₈是Ala或酸性氨基酸(任选地是Asp或Glu)；

X₂₉是脂族，例如，Ala或Gly或AIB或Val；

X₃₀是小脂族氨基酸，例如，Ala或Gly

X₃₅是Ala或碱性氨基酸(任选地是Arg或Lys)；

其中，当X₂₈是酸性氨基酸时，X35是碱性氨基酸；

其中，任选地，当X₂₈是Asp时，那么X₂₉不是Gly

其中所述肽的C端氨基酸被酰胺化；

在某些方面，在位置1处的氨基酸选自乙酰基D-Tyr、乙酰基D-His、脱氨基Tyr、D-Tyr、D-His和乙酰基-D-Phe。

在SEQ ID NO: 140的肽的示例性方面，X₁₀是Tyr，所述肽包含在位置40处的共价地连接至C₁₂至C₁₈酰基或烷基的氨基酸，且所述肽任选地包含在位置41处的Gly。在SEQ IDNO: 140的肽的替代性的示例性方面，X₁₀是与C12-C18酰基或烷基共价连接的氨基酸。

在SEQ ID NO: 140的肽的示例性方面，X₂₀是Gln。在示例性方面，在位置16处的氨基酸是带负电荷的氨基酸，任选地是Glu。在示例性方面，X₁₈是Ala。在示例性方面，X₂₈是Glu。并且，在示例性方面，X₂₇是Leu或Nle，X₂₉是Gly，所述肽包含在C端处的酰胺化的Gly，或它们的组合。

本发明另外提供了一种肽，其包含相对于SEQ ID NO: 140而言具有至多3个氨基酸修饰(例如，0个、1个、2个或3个氨基酸修饰)的序列SEQ ID NO: 140，其中所述肽在人GIP受体和人GLP-1受体和/或人胰高血糖素受体处表现出激动剂活性。所述氨基酸修饰可以是本文描述的那些中的任一种。在包含具有至多3个(例如，1个、2个、3个)氨基酸修饰的SEQID NO: 140的序列的肽的示例性方面，所述氨基酸修饰发生在除了位置1以外的位置。

本发明还提供了一种包含SEQ ID NO: 11的序列的肽。在示例性方面，所述肽基本上由SEQ ID NO: 11组成或由其组成。

本发明还提供了一种包含SEQ ID NO: 12的序列的肽。在示例性方面，所述肽基本上由SEQ ID NO: 12组成或由其组成。

本发明还提供了一种包含SEQ ID NO: 13的序列的肽。在示例性方面，所述肽基本上由SEQ ID NO: 13组成或由其组成。

本发明还提供了一种包含SEQ ID NO: 15的序列的肽。在示例性方面，所述肽基本上由SEQ ID NO: 15组成或由其组成。

本发明还提供了一种包含SEQ ID NO: 16的序列的肽。在示例性方面，所述肽基本上由SEQ ID NO: 16组成或由其组成。

本发明还提供了一种包含SEQ ID NO: 22的序列的肽。在示例性方面，所述肽基本上由SEQ ID NO: 22组成或由其组成。

本发明还提供了一种肽，其包含：

(A) 与SEQ ID NO: 11相比具有至多3个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 11的序列；

(B) 与SEQ ID NO: 12相比具有至多3个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 12的序列，

(C) 与SEQ ID NO: 13相比具有至多3个氨基酸修饰的SEQ ID NO：13的序列，或者

(D) 与SEQ ID NO: 15相比具有至多3个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 15的序列，

(E) 与SEQ ID NO: 16相比具有至多3个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 16的序列，

(F) 与SEQ ID NO: 22相比具有至多3个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 22的序列，

其中所述肽在人GIP受体和人GLP-1受体处表现出激动剂活性。在包含具有至多3个(例如，1个、2个、3个)氨基酸修饰的SEQ ID NO: 11-13、15、16和22中的任一个序列的肽的示例性方面，所述氨基酸修饰发生在除了位置1以外的位置。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物包含基于含有SEQ ID NO: 11-18、21-23、25-31、33-36、38、39、100-200中的任一个的亲本序列的结构，但是与所述亲本序列在一个或多个位置存在差异。

在某些或任何实施方案中，本公开内容的肽是亲本序列的类似物，所述亲本序列包含SEQ ID NO: 11-18、21-23、25-31、33-36、38、39、100-200中任一个，本公开内容的肽包含基于亲本序列的氨基酸序列的氨基酸序列，但是与所述亲本序列不同之处在于所述类似物的氨基酸序列包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个，且在某些情况下，16个或更多个(例如，17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个等)指定的或任选的氨基酸修饰。在某些或任何实施方案中，本公开内容的肽与亲本序列相比包含共计1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、或至多10个额外氨基酸修饰，所述亲本序列包含SEQ IDNO: 11-18、21-23、25-31、33-36、38、39、100-200中的任一个。在某些或任何实施方案中，所述修饰为在本文中关于胰高血糖素类似物描述的那些中的任一种，例如，酰化、烷基化、聚乙二醇化、C端截短、在位置1、2、3、7、10、12、15、16、17、18、19、20、21、23、24、27、28和29中的一个或多个处的氨基酸的置换。在示例性方面，所述氨基酸修饰发生在除了位置1以外的位置。

在某些或任何实施方案中，所述修饰是氨基酸置换或替换，例如保守氨基酸置换。在某些方面，所述保守置换是替换在位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29中一个或多个处的氨基酸。在替代实施方案中，所述氨基酸置换不是保守氨基酸置换，例如，是非保守氨基酸置换。在示例性方面，所述氨基酸修饰发生在除了位置1以外的位置。

在某些实施方案中，本公开内容的肽包含与亲本序列的氨基酸序列具有至少25%序列同一性的氨基酸序列，所述亲本序列包含SEQ ID NO: 11-18、21-23、25-31、33-36、38、39、100-200中的任一种。在某些实施方案中，本公开内容的肽包含与亲本序列具有至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或具有大于90%序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，具有上述序列同一性百分比的本文公开的肽的氨基酸序列是本文公开的肽的全长氨基酸序列。在某些实施方案中，具有上述序列同一性百分比的本公开内容的肽的氨基酸序列仅是本文公开的肽的氨基酸序列的一部分。在某些实施方案中，本文公开的肽包含与亲本序列的至少5个连续氨基酸(例如，至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸)的参照氨基酸序列具有约A%或更大序列同一性的氨基酸序列，其中所述参照氨基酸序列开始于SEQ ID NO: 1的在位置C处的氨基酸且终结于SEQ ID NO: 1的在位置D处的氨基酸，其中A是25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99；C是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，且D是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29。预见到前述参数的任意和所有可能的组合，包括、但不限于，例如，其中A是90%，且C和D是1和27、或6和27、或8和27、或10和27、或12和27、或16和27。

包含本文描述的SEQ ID NO: 11-18、21-23、25-31、33-36、38、39、100-200中的任一个的亲本序列的类似物可以包含任意数目的氨基酸的肽主链，即，可以具有任意肽长度。在某些实施方案中，本文描述的肽具有与SEQ ID NO: 1相同的长度，即，是29个氨基酸的长度。在某些实施方案中，本文公开的肽超过29个氨基酸的长度，例如，本文公开的肽包含1-21个氨基酸的C端延伸段，如在本文中进一步描述的。因此，在某些实施方案中，本公开内容的肽是30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸的长度。在某些实施方案中，本文公开的肽是至多50个氨基酸的长度。在某些实施方案中，由于与另一种肽的融合，本文公开的肽超过29个氨基酸的长度(例如，大于50个氨基酸(例如，至少或约60个、至少或约70个、至少或约80个、至少或约90个、至少或约100个、至少或约150个、至少或约200个、至少或约250个、至少或约300个、至少或约350个、至少或约400个、至少或约450个、至少或约500个氨基酸的长度)。在其它实施方案中，本文公开的肽小于29个氨基酸的长度，例如，28个、27个、26个、25个、24个、23个氨基酸。

根据前述内容，在某些方面，本公开内容的肽是包含SEQ ID NO: 11-18、21-23、25-31、33-36、38、39、100-200中的任一个的亲本序列的类似物，所述类似物的序列包含一个或多个氨基酸修饰，所述氨基酸修饰影响GIP活性、胰高血糖素活性和/或GLP-1活性，增强稳定性，例如，通过减少所述肽的降解(例如，通过提高对DPP-IV蛋白酶的抗性)，增强溶解度，增加半衰期，延迟作用的开始，延长在GIP、胰高血糖素或GLP-1受体处的作用的持续时间，或前述任意的组合。除了其它修饰以外，在本文中关于胰高血糖素类似物进一步描述了这样的氨基酸修饰，并且这些修饰中的任一种可以单独地或联合地应用。

制备肽的方法

通过本领域已知的方法，可以获得本公开内容的胰高血糖素类似物。重新合成肽的合适方法描述在，例如，Chan等人, Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, OxfordUniversity Press, Oxford, United Kingdom, 2005; Peptide and Protein DrugAnalysis, Reid, R.编, Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, Westwood等人编, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000；和美国专利号5,449,752。制备本公开内容的肽的其它示例性方法阐述在实施例1和2中。

在某些实施方案中，本文描述的肽由公司商业合成，诸如Synpep (Dublin, CA)、Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD)和Multiple Peptide Systems (SanDiego, CA)。在这方面，所述肽可以是合成的、重组的、分离的和/或纯化的。

并且，在其中本公开内容的类似物不包含任何非编码的或非天然的氨基酸的情况下，使用标准的重组方法，利用编码所述类似物的氨基酸序列的核酸，可以重组产生所述胰高血糖素类似物。参见，例如，Sambrook等人, Molecular Cloning: A LaboratoryManual. 第3版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001；和Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, Greene PublishingAssociates and John Wiley & Sons, NY, 1994。

在某些实施方案中，本公开内容的胰高血糖素类似物是分离的。本文中使用的术语“分离的”是指已脱离其天然环境。在示例性实施方案中，通过重组方法制备所述类似物，并从宿主细胞中分离所述类似物。

在某些实施方案中，本公开内容的胰高血糖素类似物是纯化的。本文中使用的术语“纯化的”是指分离基本上不含污染物的形式的分子或化合物，在某些方面，所述污染物在天然或自然环境中通常与所述分子或化合物相结合，并且术语“纯化的”是指由于与原始组合物中的其它组分分离而提升纯度。纯化的肽或化合物包括例如基本上不含有核酸分子、脂质和碳水化合物或在肽的化学合成中使用或形成的其它起始材料或中间体的肽。应当认识到，“纯度”是相对的术语，且不一定被解释为绝对纯度或绝对富集或绝对选择。在某些方面，所述纯度是至少或约50%，是至少或约60%、至少或约70%、至少或约80%或至少或约90%(例如，至少或约91%、至少或约92%、至少或约93%、至少或约94%、至少或约95%、至少或约96%、至少或约97%、至少或约98%、至少或约99%，或是大约100%。

缀合物

本发明还提供了缀合物，其包含与异源部分缀合的一个或多个本文描述的胰高血糖素类似物。本文中使用的术语“异源部分”与术语“缀合部分”同义，且表示与本文描述的胰高血糖素类似物不同的任何分子(化学的或生物化学的，天然存在的或非编码的)。可与本文描述的任何类似物连接的示例性缀合部分包括、但不限于异源肽或多肽(包括例如血浆蛋白)、靶向试剂、免疫球蛋白或其部分(例如，可变区、CDR或Fc区)、诊断标签(诸如放射性同位素、荧光团或酶标签)、包括水溶性聚合物在内的聚合物、或其它治疗剂或诊断剂。在某些实施方案中，提供了一种包含本发明的类似物和血浆蛋白的缀合物，其中所述血浆蛋白选自白蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原和球蛋白。在某些实施方案中，所述缀合物的血浆蛋白部分是白蛋白或转铁蛋白。在某些实施方案中，所述缀合物包含一个或多个本文描述的胰高血糖素类似物以及下述的一个或多个：肽(其与本文描述的胰高血糖素和/或GLP-1受体活性的胰高血糖素类似物不同)、多肽、核酸分子、抗体或其片段、聚合物、量子点、小分子、毒素、诊断剂、碳水化合物、氨基酸。

在某些实施方案中，所述异源部分是与本文描述的胰高血糖素类似物不同的肽，且所述缀合物是融合肽或嵌合肽。在某些实施方案中，所述异源部分是1-21个氨基酸的肽延伸段。在具体实施方案中，所述延伸段连接至所述胰高血糖素类似物的C端，例如连接至在位置29处的氨基酸。

在某些具体方面，所述延伸段为单个氨基酸或二肽。在具体实施方案中，所述延伸段包含选自以下的氨基酸：带电荷的氨基酸(例如，带负电荷的氨基酸(例如，Glu)、带正电荷的氨基酸)、包含亲水部分的氨基酸。在某些方面，所述延伸段为Gly、Glu、Cys、Gly-Gly、Gly-Glu。

在某些实施方案中，所述延伸段包含SEQ ID NO: 5 (GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO: 6(GGPSSGAPPPS)、SEQ ID NO: 7 (KRNRNNIA)或SEQ ID NO: 8 (KRNR)的氨基酸序列。在具体方面，所述氨基酸序列通过所述胰高血糖素类似物的C端氨基酸(如在位置29处的氨基酸)连接。在某些实施方案中，SEQ ID NO:5-8中的任一个的氨基酸序列通过肽键与胰高血糖素类似物的氨基酸29结合。在某些具体实施方案中，所述胰高血糖素类似物的在位置29处氨基酸是Gly，且所述Gly与SEQ ID NO:5-8中的任一个的氨基酸序列之一融合。

在某些实施方案中，所述异源部分成聚合物。在某些实施方案中，所述聚合物选自：聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯及其衍生物(包括聚亚烷基二醇、聚环氧烷烃、聚烯烃对酞酸酯)、丙烯酸和甲基丙烯酸酯的聚合物(包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷酯))、聚乙烯基聚合物（包括聚乙烯醇、聚乙烯基醚、聚乙烯基酯、聚乙烯基卤化物、聚(乙酸乙烯酯)和聚乙烯吡咯烷酮）、聚乙醇酸交酯、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、纤维素（包括烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟基丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、羧基乙基纤维素、三乙酸纤维素和硫酸纤维素钠盐）、聚丙烯、聚乙烯（包括聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)和聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚苯乙烯）。

在某些方面，所述聚合物是可生物降解的聚合物，包括合成的可生物降解的聚合物(例如，乳酸和羟乙酸的聚合物、聚酸酐、聚(原)酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)和聚(丙交酯-己内酯共聚物)，以及天然的可生物降解的聚合物(例如，海藻酸盐和其它多糖类，包括葡聚糖和纤维素、胶原、它们的化学衍生物(化学基团(例如，烷基、烯基)的置换、添加，羟基化，氧化，及本领域技术人员常规地做出的其它修饰)，白蛋白和其它亲水蛋白(例如，玉米醇溶蛋白和其它谷醇溶蛋白和疏水蛋白))，及它们的任何共聚物或混合物。一般而言，这样的材料通过酶促水解或在体内暴露于水、通过表面或整体侵蚀而降解。

在某些方面，所述聚合物是生物粘附聚合物，诸如由H. S. Sawhney, C. P.Pathak和J. A. Hubbell在Macromolecules, 1993, 26, 581-587（其教导并入本文中）中描述的可生物蚀解的水凝胶、聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酸酐、聚丙烯酸、藻酸盐、壳聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷酯)。

在某些实施方案中，所述聚合物是水溶性聚合物或亲水性聚合物。本文中在“亲水部分”下面进一步描述了亲水性聚合物。合适的水溶性聚合物是本领域已知的，且包括，例如，聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素(HPC; Klucel)、羟丙基甲基纤维素(HPMC; Methocel)、硝酸纤维素、羟丙基乙基纤维素、羟丙基丁基纤维素、羟丙基戊基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素(Ethocel)、羟乙基纤维素、各种烷基纤维素和羟基烷基纤维素、各种纤维素醚、醋酸纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、乙酸乙烯酯/巴豆酸共聚物、聚甲基丙烯酸羟基烷酯, 甲基丙烯酸羟甲酯、甲基丙烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、马来酸酐/甲基乙烯基醚共聚物、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠和聚丙烯酸钙、聚丙烯酸、酸性羧基聚合物、羧聚乙烯、羧基乙烯基聚合物、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物、羧甲基酰胺、甲基丙烯酸钾-二乙烯基苯共聚物、聚氧乙烯二醇、聚氧化乙烯以及它们的衍生物、盐和组合。

在具体实施方案中，所述聚合物是聚亚烷基二醇，包括、例如，聚乙二醇(PEG)。

在某些实施方案中，所述异源部分成碳水化合物。在某些实施方案中，所述碳水化合物是单糖(例如，葡萄糖、半乳糖、果糖)、二糖(例如，蔗糖、乳糖、麦芽糖)、寡糖(例如，棉子糖、水苏糖)、或多糖(例如，淀粉、淀粉酶、支链淀粉、纤维素、甲壳质、愈创葡聚糖、昆布多糖、木聚糖、甘露聚糖、岩藻依聚糖、或半乳甘露聚糖)。

在某些实施方案中，所述异源部分是脂质。在某些实施方案中，所述脂质是脂肪酸、类花生酸、前列腺素、白三烯、血栓烷、N-酰基乙醇胺)、甘油脂(例如，单-、二-、三-取代的甘油)、甘油磷脂(例如，磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)、鞘脂(例如，鞘氨醇、神经酰胺)、甾醇脂质(例如，类固醇、胆固醇)、戊二烯醇脂质、糖脂质或聚酮化合物、油、蜡、胆固醇、固醇、脂溶性的维生素、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂。

在某些实施方案中，所述异源部分通过非共价键合或共价键合连接至本公开内容的类似物。在示例性方面，所述异源部分通过接头连接至本公开内容的类似物。通过共价化学键、物理力(诸如静电、氢、离子、范德华力，或疏水的或亲水的相互作用)，可以实现连接。可以使用多种非共价偶联系统，包括生物素-抗生物素蛋白、配体/受体、酶/底物、核酸/核酸结合蛋白、脂质/脂质结合蛋白、细胞粘附分子配偶体；或对于彼此具有亲和力的任何结合配偶体或其片段。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物通过直接共价连接与缀合部分连接，所述直接共价连接通过所述类似物的靶氨基酸残基与有机衍生剂反应实现，所述有机衍生剂能够与这些靶氨基酸的选定侧链或N端或C端残基反应。所述类似物或缀合部分的反应基团包括，例如，醛、氨基、酯、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基。衍生剂包括，例如，马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐或本领域已知的其它试剂。可替换地，缀合部分可以通过中间载体（诸如多糖或多肽载体）间接地与所述类似物连接。多糖载体的例子包括氨基葡聚糖。合适的多肽载体的例子包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、其共聚物以及这些氨基酸和其它氨基酸(例如，丝氨酸)的混合聚合物，以给得到的加载的载体赋予合乎需要的溶解度性能。

半胱氨酰基残基最通常与α-卤代乙酸盐(及相应的胺类，诸如氯乙酸、氯乙酰胺)反应，以产生羧甲基或羧基酰氨基甲基衍生物。半胱氨酰基残基还通过与以下试剂反应而衍生：溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、磷酸氯乙酰酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞基苯甲酸盐、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑。

组氨酰基残基通过在pH 5.5-7.0与焦碳酸二乙酯反应而衍生，因为该试剂对于组氨酰基侧链是相对特异性的。对-溴苯酰基溴也是可用的；此反应优选地在0.1 M二甲基胂酸钠、pH 6.0进行。

赖氨酰基和氨基端残基与琥珀酸或其它羧酸酸酐反应。利用这些试剂的衍生化具有反转赖氨酰基残基的电荷的效果。其它适于衍生含α-氨基的残基的试剂包括亚胺酯(诸如甲基吡啶亚氨酸甲酯)、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氢化物、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2,4-戊烷二酮和与乙醛酸的转氨酶催化的反应。

精氨酰基残基可以通过与一种或多种常规试剂反应而进行修饰，所述常规试剂包括苯基乙二醛、2,3-丁烷二酮、1,2-环己烷二酮和茚三酮。因为胍官能团的高pKa，精氨酸残基的衍生反应要求该反应在碱性条件中进行。此外，这些试剂可以与赖氨酸的基团以及精氨酸的ε氨基反应。

可以做出酪氨酰基残基的具体修饰，特别感兴趣的是，通过与芳族重氮鎓化合物或四硝基甲烷的反应而将光谱标签引入酪氨酰基残基中。最常见的是，使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别形成O-乙酰基酪氨酰物种和3-硝基衍生物。

通过与碳二亚胺(R-N=C=N-R')反应而选择性地修饰羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)，其中R和R'是不同的烷基，诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，天冬氨酰基和谷氨酰基残基通过与铵离子反应而转化成天冬酰胺酰基和谷氨酰基残基。

其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T. E. Creighton, Proteins:Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 第79-86页(1983))，天冬酰胺或谷氨酰胺的脱酰胺化，N-端胺的乙酰化和/或C端羧酸基团的酰胺化或酯化。

另一类共价修饰涉及将糖苷与所述类似物化学地或酶促地偶联。糖可以连接至(a)精氨酸和组氨酸、(b)游离羧基、(c)游离巯基(诸如半胱氨酸的那些)、(d)游离羟基(诸如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些)、(e)芳族残基(诸如酪氨酸或色氨酸的那些)或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于于1987年9月11日公开的WO87/05330以及Aplin和Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 第259-306页(1981)中。

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物通过所述胰高血糖素类似物的氨基酸的侧链和异源部分之间的共价键与异源部分缀合。在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物通过在位置16、17、21、24或29、C端延伸段内的位置处的氨基酸的侧链、或C端氨基酸或这些位置的组合与异源部分缀合。在某些方面，共价连接至异源部分(例如，包含异源部分的氨基酸)的氨基酸是Cys、Lys、Orn、高-Cys或Ac-Phe，且所述氨基酸的侧链与异源部分共价键合。

在某些实施方案中，所述缀合物包含将胰高血糖素类似物连接至所述异源部分的接头。在某些方面，所述接头包含长度为1至约60个原子、1-30个原子或更长、2-5个原子、2-10个原子、5-10个原子、或10-20个原子的原子链。在某些实施方案中，所述链的原子全为碳原子。在某些实施方案中，所述接头的主链中的链原子选自C、O、N和S。可以根据它们的预期溶解度(亲水性)而选择链原子和接头，从而提供更可溶的缀合物。在某些实施方案中，所述接头提供官能团，所述官能团受靶组织或器官或细胞中存在的酶或其它催化剂或水解条件切割。在某些实施方案中，所述接头的长度足够长以减小位阻的可能性。如果所述接头是共价键或肽键且所述缀合物是多肽，则整个缀合物可以是融合蛋白。这样的肽接头可以是任何长度。示例性接头具有约1-50个氨基酸的长度，5-50个、3-5个、5-10个、5-15个或10-30个氨基酸的长度。可替换地，通过本领域普通技术人员已知的重组基因工程方法，可以制备这样的融合蛋白。

缀合物: Fc融合物

如上面所指出的，在某些实施方案中，所述类似物与免疫球蛋白或其部分(例如，可变区、CDR或Fc区)缀合(例如融合)。已知类型的免疫球蛋白(Ig)包括IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc区为Ig重链的C端区，其负责结合Fc受体，所述Fc受体表现活性诸如再循环(其导致延长的半衰期)、抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性的细胞毒性(CDC)。

例如，根据某些定义，人IgG重链Fc区从Cys226延伸至重链的C端。“铰链区”一般从人IgG1的Glu216延伸至Pro230(通过比对参与半胱氨酸结合的半胱氨酸，可以将其它IgG同种型的铰链区与IgG1序列比对)。IgG的Fc区包括两个恒定结构域CH2和CH3。人IgG Fc区的CH2结构域通常从氨基酸231延伸至氨基酸341。人IgG Fc区的CH3结构域通常从氨基酸342延伸至氨基酸447。对免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或区域的氨基酸编号的提及都是基于Kabat等人. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S.Department of Public Health, Bethesda, Md。在一个有关的实施方案中，所述Fc区可以包含一个或多个天然的或经修饰的来自免疫球蛋白重链的恒定区(除CH1外)，例如，IgG和IgA的CH2和CH3区，或IgE的CH3和CH4区。

合适的缀合部分包括包含FcRn结合位点的免疫球蛋白序列的部分。FcRn (一种补救受体)负责重复利用免疫球蛋白并将它们返回至血液循环。基于X-射线晶体学，已经描述了IgG的Fc部分中结合FcRn受体的区域(Burmeister等人. 1994, Nature 372:379)。Fc与FcRn的主要接触区域是在CH2和CH3结构域的连接部附近。Fc-FcRn接触点都是在单个Ig重链内。主要接触位点包括CH2结构域中的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314，以及CH3结构域中的氨基酸残基385-387、428和433-436。

某些缀合部分可以包括或不包括FcγR结合位点。FcγR负责ADCC和CDC。在Fc区中与FcγR直接接触的位置的例子是氨基酸234-239 (低铰链区)、氨基酸265-269 (B/C环)、氨基酸297-299 (C'/E环)和氨基酸327-332 (F/G)环(Sondermann等人, Nature 406:267-273, 2000)。IgE的低铰链区也已经参与FcRI结合(Henry, 等人, Biochemistry 36,15568-15578, 1997)。参与IgA受体结合的残基描述于Lewis等人, (J Immunol. 175:6694-701, 2005)。参与IgE受体结合的氨基酸残基描述于Sayers等人(J Biol Chem. 279(34):35320-5, 2004)。

可以对免疫球蛋白的Fc区进行氨基酸修饰。这类变体Fc区包含Fc区的CH3结构域(残基342-447)中的至少一个氨基酸修饰和/或Fc区的CH2结构域(残基231-341)中的至少一个氨基酸修饰。认为会赋予增加的对FcRn的亲和力的突变包括T256A、T307A、E380A和N434A (Shields等人. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591)。其它突变可以减少Fc区与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的结合，而不显著减少对FcRn的亲和力。例如，用Ala或另一种氨基酸置换Fc区中在位置297处的Asn，会除去高度保守的N-糖基化位点，并可能导致降低的免疫原性和伴随的延长的Fc区的半衰期，以及减少的与FcγR的结合(Routledge等人. 1995, Transplantation 60:847; Friend等人. 1999,Transplantation 68:1632; Shields等人. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591)。已经做出IgG1的位置233-236处的氨基酸修饰，其减少与FcγR的结合(Ward和Ghetie 1995,Therapeutic Immunology 2:77和Armour等人. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613)。某些示例性氨基酸置换描述于美国专利7,355,008和7,381,408中，每篇通过引用整体并入本文。

缀合物：亲水部分

可以进一步修饰本文描述的胰高血糖素类似物以提高其在生理pH的水溶液中的溶解度和稳定性，同时保留与天然胰高血糖素相比的高生物活性。在用于使蛋白与活化的聚合物分子反应的任何合适条件下，可以使亲水部分(诸如PEG基团)连接至所述类似物。可以使用本领域已知的任何方法，包括通过酰化、还原烷基化、迈克尔加成、巯基烷基化或通过PEG部分上的反应基团(例如，醛、氨基、酯、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基)与目标化合物上的反应基团(例如，醛、氨基、酯、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基)反应实现的其它化学选择性的缀合/连接方法。可用于连接水溶性聚合物和一个或多个蛋白的活化基团包括、但不限于砜、马来酰亚胺、巯基、巯基、三氟甲基磺酸酯、三氟乙基磺酸酯、氮丙啶（azidirine）、氧杂环丙烷、5-吡啶基和α-卤化的酰基(例如，α-碘乙酸、α-溴乙酸、α-氯乙酸)。如果通过还原烷基化连接至所述类似物，所选的聚合物应当具有单个反应醛基，从而控制聚合度。参见，例如，Kinstler等人, Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002); Roberts等人, Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002)；和Zalipsky等人, Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995)。

在具体方面，具有巯基的类似物的氨基酸残基被亲水部分（如PEG）修饰。在某些实施方案中，所述巯基在迈克尔加成反应中被马来酰亚胺活化的PEG修饰，得到聚乙二醇化的类似物，其包含如下所示的硫醚连接：

。

在某些实施方案中，巯基在亲核取代反应中被卤代乙酰基活化的PEG修饰，产生包含硫醚连接的聚乙二醇化的类似物。

合适的亲水部分包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧乙基化的多元醇(例如，POG)、聚氧乙基化的山梨醇、聚氧乙基化的葡萄糖、聚氧乙基化的甘油(POG)、聚亚氧烷基、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇的共聚物、单甲氧基-聚乙二醇、单-(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇、羧甲纤维素、聚缩醛、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚(β-氨基酸)(同聚物或无规共聚物)、聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物(PPG)和其它聚亚烷基氧化物、聚氧化丙烯/环氧乙烷共聚物、结肠酸或其它多糖聚合物、蔗聚糖或葡聚糖及其混合物。葡聚糖是主要通过α1-6键连接的葡萄糖亚基的多糖聚合物。葡聚糖有多种可用的分子量范围，例如，约1 kD至约100 kD，或从约5、10、15或20 kD至约20、30、40、50、60、70、80或90 kD。预见到直链或支化聚合物。得到的缀合物制品可以基本上为单分散体或多分散体，并且可以具有约0.5、0.7、1、1.2、1.5或2个聚合物部分/类似物。

在某些或任何实施方案中，所述胰高血糖素类似物通过所述胰高血糖素类似物的氨基酸的侧链和亲水部分之间的共价键与亲水部分缀合。在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物通过在位置16、17、21、24或29、C端延伸段内的位置处的氨基酸的侧链、或C端氨基酸、或这些位置的组合与亲水部分缀合。在某些方面，所述与亲水部分(例如，包含亲水部分的氨基酸)共价连接的氨基酸是Cys、Lys、Orn、高-Cys或Ac-Phe，且所述氨基酸的侧链与亲水部分(例如，PEG)共价键合。

缀合物：rPEG

在某些或任何实施方案中，本公开内容的缀合物包含与辅助类似物融合的具有GIP受体激动剂活性的胰高血糖素类似物，所述辅助类似物能够形成与化学PEG (例如，重组PEG (rPEG)分子)相似的延展构象，例如，描述于国际专利申请公开号WO2009/023270和美国专利申请公开号US20080286808中的那些。在某些方面，所述rPEG分子是包含甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸或脯氨酸中的一个或多个的多肽。在某些方面，所述rPEG是同聚物，例如，聚甘氨酸、聚丝氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚丙氨酸或聚脯氨酸。在其它实施方案中，所述rPEG包含两种重复氨基酸，例如，聚(Gly-Ser)、聚(Gly-Glu)、聚(Gly-Ala)、聚(Gly-Asp)、聚(Gly-Pro)、聚(Ser-Glu)等。在某些方面，rPEG包含三种不同类型的氨基酸，例如，聚(Gly-Ser-Glu)。在具体方面，rPEG增加胰高血糖素和/或GLP-1激动剂类似物的半衰期。在某些方面，rPEG具有净正电荷或净负电荷。在某些方面，rPEG缺少二级结构。在某些实施方案中，rPEG的长度大于或等于10个氨基酸，在某些实施方案中，长度为约40至约50个氨基酸。在某些方面，辅助肽通过肽键或蛋白水解酶切割位点与本公开内容的类似物的N端或C端融合，或被插入本公开内容的类似物的环中。在某些方面，rPEG包含亲和标签或连接至大于5 kDa的PEG。在某些实施方案中，rPEG给本公开内容的类似物赋予增加的流体动力学半径、血清半衰期、蛋白酶抗性或溶解度，且在某些方面，给所述类似物赋予降低的免疫原性。

缀合物：多聚体

本发明还提供了本公开内容的类似物的多聚体或二聚体，包括同多聚体或异多聚体、或同二聚体或异二聚体。使用本领域技术人员已知的标准的连接剂和方法，可以将两个或更多个类似物连接在一起。例如，通过使用双功能的巯基交联剂和双功能的胺交联剂，可以在两个肽之间形成二聚体，尤其是对于已经被半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸残基取代的类似物。所述二聚体可以为同二聚体，或可替换地可以为异二聚体。在示例性实施方案中，连接两个(或更多个)类似物的接头为PEG，例如，5 kDa PEG、20kDa PEG。在某些实施方案中，所述接头为二硫键。例如，二聚体的每个单体可以包含Cys残基(例如，位于末端或内部的Cys)，且每个Cys残基的硫原子参与二硫键的形成。在示例性方面，二聚体的每个单体均通过硫醚键连接。在示例性方面，一个单体的Lys残基的ε氨基与Cys残基键合，所述Cys残基又通过化学部分与其它单体的Lys残基的ε胺连接。在本文中进一步描述了制备这样的硫醚键合的二聚体的方法。在某些方面，单体通过末端氨基酸(例如，N端或C端)、内部氨基酸、或通过至少一个单体的末端氨基酸和至少一个其它单体的内部氨基酸连接。在具体方面，单体不通过N端氨基酸连接。在某些方面，多聚体的单体以“尾对尾”取向连接在一起，其中每个单体的C端氨基酸连接在一起。

前药

本发明还提供了本文描述的肽和类似物的前药。本文中使用的术语“前药”被定义为经化学修饰后表现出其完全药理学作用的任何化合物。

在示例性实施方案中，所述前药为基于酰胺的肽前药，与在2010年6月24日公开的国际专利申请公开号WO/2010/071807中描述的那些相似。这样的前药意图延迟药物的作用开始以及延长药物的半衰期。延迟的作用开始的优点在于，其允许前药在活化前全身性分布。因此，所述前药的施用会消除施用后由峰活性造成的并发症并且增加母体药物的治疗指数。

在示例性方面，前药包含以下结构：A-B-Q；其中Q是本文描述的肽或类似物；A是氨基酸或羟酸；B是N-烷基化的氨基酸，其通过A-B之间的酰胺键和Q的氨基与Q连接；其中A、B或Q的连接至A-B的氨基酸是非编码氨基酸，而且其中在生理条件下、在PBS中，A-B从Q的化学切割半衰期(t1/2)是至少约1小时至约1周。本文中使用的术语“羟酸”表示这样的氨基酸：其已经被修饰以用羟基替代α碳氨基。

在某些实施方案中，所述二肽前药元件具有式I的通式结构：

其中

R₁、R₂、R₄和R₈独立地选自H、C₁-C₁₈烷基、C₂-C₁₈烯基、(C₁-C₁₈烷基)OH、(C₁-C₁₈烷基)SH、(C₂-C₃烷基)SCH₃、(C₁-C₄烷基)CONH₂、(C₁-C₄烷基)COOH、(C₁-C₄烷基)NH₂、(C₁-C₄烷基)NHC(NH₂ ⁺)NH₂、(C₀-C₄烷基)(C₃-C₆环烷基)、(C₀-C₄烷基)(C₂-C₅杂环基)、(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇、(C₁-C₄烷基)(C₃-C₉杂芳基)和C₁-C₁₂烷基(A)(W₁)C₁-C₁₂烷基，其中W₁是选自N、S和O的杂原子，或R₁和R₂与它们所连接的原子一起形成C₃-C₁₂环烷基或芳基；或R₄和R₈与它们所连接的原子一起形成C₃-C₆环烷基；

R₃选自C₁-C₁₈烷基、(C₁-C₁₈烷基)OH、(C₁-C₁₈烷基)NH_2、(C₁-C₁₈烷基)SH、(C₀-C₄烷基)(C₃-C₆)环烷基、(C₀-C₄烷基)(C₂-C₅杂环基)、(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇和(C₁-C₄烷基)(C₃-C₉杂芳基)，或R₄和R₃与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；

R₅是NHR₆或OH；

R₆是H、C₁-C₈烷基，或R₆和R₂与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；且

R₇选自H和OH。

在其它实施方案中，所述二肽前药元件具有式I的通式结构：

其中

R₁、R₂、R₄和R₈独立地选自H、C₁-C₁₈烷基、C₂-C₁₈烯基、(C₁-C₁₈烷基)OH、(C₁-C₁₈烷基)SH、(C₂-C₃烷基)SCH₃、(C₁-C₄烷基)CONH₂、(C₁-C₄烷基)COOH、(C₁-C₄烷基)NH₂、(C₁-C₄烷基)NHC(NH₂ ⁺)NH₂、(C₀-C₄烷基)(C₃-C₆环烷基)、(C₀-C₄烷基)(C₂-C₅杂环基)、(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇、(C₁-C₄烷基)(C₃-C₉杂芳基)和C₁-C₁₂烷基(W₁)C₁-C₁₂烷基，其中W₁是选自N、S和O的杂原子，或R₁和R₂与它们所连接的原子一起形成C₃-C₁₂环烷基；或R₄和R₈与它们所连接的原子一起形成C₃-C₆环烷基；

R₅是NHR₆或OH；

R₆是H、C₁-C₈烷基，或R₆和R₁与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；且

R₇选自氢、C₁-C₁₈烷基、C₂-C₁₈烯基、(C₀-C₄烷基)CONH_2、(C₀-C₄烷基)COOH、(C₀-C₄烷基)NH₂、(C₀-C₄烷基)OH和卤代。

在某些实施方案中，R₈是H，且R₅是NHR₆。

在某些实施方案中，所述二肽前药元件具有式I的结构，其中

R₁和R₈独立地是H或C₁-C₈烷基；

R₂和R₄独立地选自H、C₁-C₈烷基、C₂-C₈烯基、(C₁-C₄烷基)OH、(C₁-C₄烷基)SH、(C₂-C₃烷基)SCH₃、(C₁-C₄烷基)CONH₂、(C₁-C₄烷基)COOH、(C₁-C₄烷基)NH₂、(C₁-C₄烷基)NHC(NH₂+)NH₂、(C₀-C₄烷基)(C₃-C₆环烷基)、(C₀-C₄烷基)(C₂-C₅杂环基)、(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇和CH₂(C₃-C₉杂芳基)，或R₁和R₂与它们所连接的原子一起形成C₃-C₁₂环烷基或芳基；

R₅是NHR₆；且

R₆是H或C₁-C₈烷基。

在其它实施方案中，所述二肽前药元件具有式I的结构，其中

R₁和R₈独立地是H或C₁-C₈烷基；

R₂和R₄独立地选自H、C₁-C₈烷基、C₂-C₈烯基、(C₁-C₄烷基)OH、(C₁-C₄烷基)SH、(C₂-C₃烷基)SCH₃、(C₁-C₄烷基)CONH₂、(C₁-C₄烷基)COOH、(C₁-C₄烷基)NH₂、(C₁-C₄烷基)NHC(NH₂+)NH₂、(C₀-C₄烷基)(C₃-C₆环烷基)、(C₀-C₄烷基)(C₂-C₅杂环基)、(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇和CH₂(C₃-C₉杂芳基)，或R₁和R₂与它们所连接的原子一起形成C₃-C₁₂环烷基；

R₃是C₁-C₁₈烷基；

R₅是NHR₆；

R₆是H或C₁-C₈烷基；且

根据本公开内容形成的前药的半衰期取决于二肽前药元件的取代基、其位置和与其连接的氨基酸。例如，前药可以包含本文描述的肽或类似物，其中所述二肽前药元件通过本文描述的肽或类似物的N-端胺酸的α氨基连接。在该实施方案中，具有例如约1小时的t_1/2的前药包含具有以下结构的二肽前药元件：

其中

R₁和R₂独立地是C₁-C₁₈烷基或芳基；或R₁和R₂通过-(CH₂)_p进行连接，其中p是2-9；

R₃是C₁-C₁₈烷基；

R₄和R₈各自是氢；且

R₅是胺。

在其它实施方案中，具有例如约1小时的t_1/2的前药包含具有以下结构的二肽前药元件：

其中

R₁和R₂独立地是C₁-C₁₈烷基或(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇；或R₁和R₂通过-(CH₂)_p进行连接，其中p是2-9；

R₃是C₁-C₁₈烷基；

R₄和R₈各自是氢；

R₅是NH₂；且

此外，具有连接至本文描述的肽或类似物的N端α氨基酸的二肽前药元件并具有例如约6至约24小时之间的t_1/2的前药包含具有以下结构的二肽前药元件：

其中R₁和R₂独立地选自氢、C₁-C₁₈烷基和芳基，或R₁和R₂通过(CH₂)_p进行连接，其中p是2-9；

R₃是C₁-C₁₈烷基，或R₃和R₄与它们所连接的原子一起形成4-12杂环；

R₄和R₈独立地选自氢、C₁-C₈烷基和芳基；且R₅是胺；

前提条件是，R₁和R₂都不是氢，且前提条件是，R₄或R₈之一是氢。

在某些实施方案中，具有连接至本文描述的肽或类似物的N端α氨基酸的二肽前药元件并具有例如约12至约72小时之间（或在某些实施方案中，约12至约48小时之间）的t_1/2的前药包含具有以下结构的二肽前药元件：

其中R₁和R₂独立地选自氢、C₁-C₁₈烷基、(C₁-C₁₈烷基)OH、(C₁-C₄烷基)NH₂和(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇，或R₁和R₂通过(CH₂)_p进行连接，其中p是2-9；

R₄和R₈独立地选自氢、C₁-C₈烷基和(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇；

R₅是NH₂；且

R₇选自H、C₁-C₁₈烷基、C₂-C₁₈烯基、(C₀-C₄烷基)CONH_2、(C₀-C₄烷基)COOH、(C₀-C₄烷基)NH₂、(C₀-C₄烷基)OH和卤代；

前提条件是，R₁和R₂都不是氢，且前提条件是，R₄或R₈中的至少一个是氢。

在某些实施方案中，具有连接至本文描述的肽或类似物的N-端氨基酸的二肽前药元件并具有例如约12至约72小时之间（或在某些实施方案中，约12至约48小时之间）的t_1/2的前药包含具有以下结构的二肽前药元件：

其中R₁和R₂独立地选自氢、C₁-C₈烷基和(C₁-C₄烷基)NH₂，或R₁和R₂通过(CH₂)_p进行连接，其中p是2-9；

R₃是C₁-C₈烷基，或R₃和R₄与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；

R₄选自氢和C₁-C₈烷基；且

R₅是NH₂；

前提条件是，R₁和R₂都不是氢。

在其它实施方案中，具有连接至本文描述的肽或类似物的N-端氨基酸的二肽前药元件并具有例如约12至约72小时之间（或在某些实施方案中，约12至约48小时之间）的t_1/2的前药包含具有以下结构的二肽前药元件：

其中

R₁和R₂独立地选自氢、C₁-C₈烷基和(C₁-C₄烷基)NH₂；

R₃是C₁-C₆烷基；

R₄是氢；且

R₅是NH₂；

前提条件是，R₁和R₂都不是氢。

其中

R₁和R₂独立地选自氢和C₁-C₈烷基、(C₁-C₄烷基)NH₂，或R₁和R₂通过(CH₂)_p进行连接，其中p是2-9；

R₃是C₁-C₈烷基；

R₄是(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇；

R₅是NH₂；且

R₇选自氢、C₁-C₈烷基和(C₀-C₄烷基)OH;

前提条件是，R₁和R₂都不是氢。

另外，提供了具有连接至本文描述的肽和类似物的N-端α氨基酸的二肽前药元件并具有例如约72至约168小时的t_1/2的前药，其中所述二肽前药元件具有以下结构：

其中R₁选自氢、C₁-C₈烷基和芳基；

R₃是C₁-C₁₈烷基；

R₄和R₈各自是氢；且

R₅是胺或N-取代的胺或羟基；

前提条件是，如果R₁是烷基或芳基，那么R₁和R₅与它们所连接的原子一起形成4-11元杂环。

在某些实施方案中，所述二肽前药元件具有以下结构：

其中R₁选自氢、C₁-C₈烷基和(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇；

R₃是C₁-C₁₈烷基；

R₄和R₈各自是氢；

R₅是NHR₆或OH；

R₇选自氢、C₁-C₁₈烷基、C₂-C₁₈烯基、(C₀-C₄烷基)CONH_2、(C₀-C₄烷基)COOH、(C₀-C₄烷基)NH₂、(C₀-C₄烷基)OH和卤代；

前提条件是，如果R₁是烷基或(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇，那么R₁和R₅与它们所连接的原子一起形成4-11元杂环。

在某些实施方案中，所述二肽前药元件连接至本文描述的肽或类似物的内部氨基酸的侧链胺。在该实施方案中，具有例如约1小时的t_1/2的前药具有以下结构：

其中

R₁和R₂独立地是C₁-C₈烷基或芳基；或R₁和R₂通过(CH₂)_p进行连接，其中p是2-9；

R₃是C₁-C₁₈烷基；

R₄和R₈各自是氢；且R₅是胺。

在某些实施方案中，具有例如约1小时的t_1/2的前药具有以下结构：

其中

R₁和R₂独立地是C₁-C₈烷基或(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇；或R₁和R₂通过-(CH₂)_p进行连接-，其中p是2-9；

R₃是C₁-C₁₈烷基；

R₄和R₈各自是氢；

R₅是NH₂；且

R₇选自氢、C₁-C₁₈烷基、C₂-C₁₈烯基、(C₀-C₄烷基)CONH₂、(C₀-C₄烷基)COOH、(C₀-C₄烷基)NH₂、(C₀-C₄烷基)OH和卤代。

此外，具有例如约6至约24小时之间的t_1/2且具有与内部氨基酸侧链连接的二肽前药元件的前药包含具有以下结构的二肽前药元件：

其中R₁和R₂独立地选自氢、C₁-C₈烷基和芳基，或R₁和R₂通过-(CH₂)_p进行连接，其中p是2-9；

R₄和R₈独立地是C₁-C₁₈烷基或芳基；且

R₅是胺或N-取代的胺；

在某些实施方案中，具有例如约12至约72小时之间（或在某些实施方案中，约12至约48小时之间）的t_1/2且具有与内部氨基酸侧链连接的二肽前药元件的前药包含具有以下结构的二肽前药元件：

其中R₁和R₂独立地选自氢、C₁-C₈烷基和(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇，或R₁和R₂通过-(CH₂)_p进行连接-，其中p是2-9；

R₄和R₈独立地是氢、C₁-C₁₈烷基或(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇；

R₅是NHR₆；

R₆是H或C₁-C₈烷基，或R₆和R₂与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；且

R₇选自氢、C₁-C₁₈烷基、C₂-C₁₈烯基、(C₀-C₄烷基)CONH₂、(C₀-C₄烷基)COOH、(C₀-C₄烷基)NH₂、(C₀-C₄烷基)OH和卤代；

另外，提供了具有例如约72至约168小时的t_1/2且具有与本文描述的肽或类似物的内部氨基酸侧链连接的二肽前药元件的前药，其中所述二肽前药元件具有以下结构：

其中R₁和R₂独立地选自氢、C₁-C₁₈烷基和芳基；

R₃是C₁-C₁₈烷基；

R₄和R₈各自是氢；且

R₅是胺或N-取代的胺或羟基；

前提条件是，如果R₁和R₂都独立地是烷基或芳基，那么R₁或R₂通过(CH2)_p连接至R₅，其中p是2-9。

在某些实施方案中，提供了具有例如约72至约168小时的t_1/2且具有与本文描述的肽或类似物的内部氨基酸侧链连接的二肽前药元件的前药，其中所述二肽前药元件具有以下结构：

其中R₁选自氢、C₁-C₁₈烷基和(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇；

R₃是C₁-C₁₈烷基；

R₄和R₈各自是氢；

R₅是NHR₆或OH；

R₆是H或C₁-C₈烷基，或R₆和R₁与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；且

前提条件是，如果R₁和R₂都独立地是烷基或(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇，那么R₁或R₂通过(CH2)_p连接至R₅，其中p是2-9。

在某些实施方案中，所述二肽前药元件连接至本文描述的肽或类似物的内部氨基酸的侧链胺，其中所述内部氨基酸包含式II的结构：

其中

n是选自1-4的整数。在某些实施方案中，n是3或4，且在某些实施方案中，所述内部氨基酸是赖氨酸。在某些实施方案中，所述二肽前药元件连接至位于本文描述的肽或类似物的位置12、16、17、18、20、28或29处的氨基酸的侧链上的伯胺。在某些实施方案中，所述在12、16、17、18、20、28或29处的氨基酸包含式II的结构：

其中n是选自1-4的整数，且所述二肽前药元件通过酰胺键连接至氨基酸侧链。在某些实施方案中，n是4，且所述氨基酸位于位置20处。

在另一个实施方案中，所述二肽前药元件通过芳族氨基酸的芳基上存在的胺连接至所述肽或其类似物。在某些实施方案中，所述芳族氨基酸是本文描述的肽或类似物的内部氨基酸，但是，所述芳族氨基酸也可以是N端氨基酸。在某些实施方案中，所述芳族氨基酸选自氨基-Phe、氨基-萘基丙氨酸、氨基色氨酸、氨基-苯基-甘氨酸、氨基-高Phe和氨基酪氨酸。在某些实施方案中，与二肽前药元件形成酰胺键的伯胺是在所述芳基的对位。在某些实施方案中，所述芳族胺包含式III的结构：

其中m是1-3的整数。

对于其中二肽前药元件通过芳族氨基酸的芳基上存在的胺连接至本文描述的肽或类似物的那些实施方案，具有例如约1小时的t_1/2的前药具有以下二肽结构：

其中R₁和R₂独立地是C₁-C₁₈烷基或芳基；

R₄和R₈独立地选自氢、C₁-C₁₈烷基和芳基；且R₅是胺或羟基。

在某些实施方案中，所述二肽前药元件通过芳族氨基酸的芳基上存在的胺连接至本文描述的肽或类似物，具有例如约1小时的t_1/2的前药具有以下二肽结构：

其中R₁和R₂独立地是C₁-C₁₈烷基或(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇；

R₄和R₈独立地选自氢、C₁-C₁₈烷基和(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇；

R₅是NH₂或OH；且

此外，提供了具有通过芳族氨基酸连接的二肽前药元件且具有例如约6至约24小时的t_1/2的前药，其中所述二肽包含以下结构：

其中

R₁选自氢、C₁-C₁₈烷基和芳基，或R₁和R₂通过-(CH₂)_p进行连接，其中p是2-9；

R₃是C₁-C₁₈烷基，或R₃和R₄与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；

R₄和R₈独立地选自氢、C₁-C₁₈烷基和芳基；且R₅是胺或N-取代的胺。

在某些实施方案中，提供了具有通过芳族氨基酸连接的二肽前药元件且具有例如约6至约24小时的t_1/2的前药，其中所述二肽包含以下结构：

其中

R₁选自氢、C₁-C₁₈烷基、(C₁-C₁₈烷基)OH、(C₁-C₄烷基)NH₂和(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇；

R₅是NHR₆；

另外，提供了具有通过芳族氨基酸连接的二肽前药元件且具有例如约72至约168小时的t_1/2的前药，其中所述二肽包含以下结构：

其中R₁和R₂独立地选自氢、C₁-C₈烷基和芳基；

R₄和R₈各自是氢；且

R₅选自胺、N-取代的胺和羟基。

在某些实施方案中，提供了具有通过芳族氨基酸连接的二肽前药元件且具有例如约72至约168小时的t_1/2的前药，其中所述二肽包含以下结构：

其中R₁和R₂独立地选自氢、C₁-C₈烷基、(C₁-C₄烷基)COOH和(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇，或R₁和R₅与它们所连接的原子一起形成4-11元杂环；

R₄是氢或与R₃一起形成4-6元杂环；

R₈是氢；

R₅是NHR₆或OH；

在某些实施方案中，所述二肽前药元件通过伯胺以芳族氨基酸连接，所述伯胺作为所述芳族氨基酸的芳基取代基存在，其中所述芳族氨基酸位于本文描述的肽或类似物的位置10、13、22或25处(基于天然胰高血糖素的编号，参见，例如，SEQ ID NO: 1)。在某些实施方案中，所述二肽前药元件连接的芳族氨基酸位于本文描述的肽或类似物的位置22处。

根据某些实施方案，二肽前药元件连接在本文描述的肽或类似物的N-端胺处，包括例如，胰高血糖素相关的肽或骨钙素，以及前述的类似物、衍生物和缀合物，其中所述二肽前药元件包含以下结构：

其中R₁选自H和C₁-C₈烷基；

R₂和R₄独立地选自H、C₁-C₈烷基、C₂-C₈烯基、(C₁-C₄烷基)OH、(C₁-C₄烷基)SH、(C₂-C₃烷基)SCH₃、(C₁-C₄烷基)CONH₂、(C₁-C₄烷基)COOH、(C₁-C₄烷基)NH₂、(C₁-C₄烷基)NHC(NH₂ ⁺)NH₂、(C₀-C₄烷基)(C₃-C₆环烷基)、(C₀-C₄烷基)(C₆-C₁₀芳基)R₇、CH₂(C₅-C₉杂芳基)，或R₁和R₂与它们所连接的原子一起形成C₃-C₆环烷基；

R₃选自C₁-C₈烷基、(C₃-C₆)环烷基，或R₄和R₃与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环;

R₅是NHR₆或OH；

R₆是H，或R₆和R₂与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；且

R₇选自H和OH。在某些实施方案中，R₁是H或C₁-C₈烷基、R₂选自H、C₁-C₆烷基、CH₂OH、(C₁-C₄烷基)NH₂、(C₃-C₆环烷基)和CH₂(C₆芳基)R₇，或R₆和R₂与它们所连接的原子一起形成5元杂环，R₃是C₁-C₆烷基，且R₄选自H、C₁-C₄烷基、(C₃-C₆)环烷基、(C₁-C₄烷基)OH、(C₁-C₄烷基)SH和(C₀-C₄烷基)(C₆芳基)R₇，或R₃和R₄与它们所连接的原子一起形成5元杂环。在另一个实施方案中，R₃是CH₃，R₅是NHR₆，且在一个替代性的其它实施方案中，R₃和R₄与它们所连接的原子一起形成5元杂环，且R₅是NHR₆。

根据另一个实施方案，二肽前药元件连接在本文描述的肽或类似物的N-端胺处，其中所述二肽前药元件包含以下结构：

其中R₁选自H和C₁-C₈烷基；

R₅是NHR₆或OH；

R₇选自氢、C₁-C₁₈烷基、C₂-C₁₈烯基、(C₀-C₄烷基)CONH_2、(C₀-C₄烷基)COOH、(C₀-C₄烷基)NH₂、(C₀-C₄烷基)OH和卤代。在某些实施方案中，R₁是H或C₁-C₈烷基，R₂选自H、C₁-C₆烷基、CH₂OH、(C₁-C₄烷基)NH₂、(C₃-C₆环烷基)和CH₂(C₆芳基)R₇，或R₆和R₂与它们所连接的原子一起形成5元杂环，R₃是C₁-C₆烷基，且R₄选自H、C₁-C₄烷基、(C₃-C₆)环烷基、(C₁-C₄烷基)OH、(C₁-C₄烷基)SH和(C₀-C₄烷基)(C₆芳基)R₇，或R₃和R₄与它们所连接的原子一起形成5元杂环。在另一个实施方案中，R₃是CH₃，R₅是NHR₆，且在一个替代性的其它实施方案中，R₃和R₄与它们所连接的原子一起形成5元杂环，且R₅是NHR₆。

药物组合物、用途和试剂盒

盐

在某些实施方案中，所述胰高血糖素类似物呈盐（例如，药学上可接受的盐）的形式。本文中使用的术语“药学上可接受的盐”表示这样的盐：其保留母体化合物的生物活性，且其不是生物学上或在其它方面不希望的。这样的盐可以在所述类似物的最终分离和纯化过程中原位制备，或通过使游离碱官能团与合适的酸反应而单独制备。本文中公开的许多化合物能够借助于氨基和/或羧基或与其类似的基团的存在而形成酸和/或碱盐。

药学上可接受的酸加成盐可以从无机酸和有机酸制得。代表性的酸加成盐包括、但不限于：乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐(异硫代硫酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。从无机酸衍生出的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。从有机酸衍生出的盐包括乙酸、丙酸、羟乙酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯-磺酸、水杨酸等。可用来形成药学上可接受的酸加成盐的酸的例子包括，例如，无机酸，例如，盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，和有机酸，例如，草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。

碱加成盐也可以在水杨酸来源的最终分离和纯化过程中原位制备，或通过使含羧酸的部分与合适的碱(例如，药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)或与氨或有机伯胺、仲胺或叔胺反应来制备。药学上可接受的盐包括、但不限于：基于碱金属或碱土金属的阳离子，诸如锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等，以及无毒的季铵和胺阳离子，尤其包括铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、三乙基铵、二乙基铵和乙基铵。可用于形成碱加成盐的其它代表性的有机胺包括：例如，乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。从有机碱衍生出的盐包括、但不限于伯胺、仲胺和叔胺的盐。

另外，碱性含氮基团可以用本公开内容的类似物季铵化，作为低级烷基卤化物诸如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物；长链卤化物诸如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂酰基的氯化物、溴化物和碘化物；芳基烷基卤如苄基溴和苯乙基溴和其它。由此得到水溶性的或油溶性的或可分散的产物。

制剂

根据某些实施方案，提供药物组合物，其中所述组合物包含本公开内容的胰高血糖素类似物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。本文中使用的术语“药学上可接受的载体”包括任意标准药用载体，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂诸如油/水或水/油乳剂和不同类型的润湿剂。该术语还包括美国联邦政府的监管机构批准的任何试剂，或列于美国药典中用于动物(包括人类)的任何试剂。

所述药物组合物可以包含任何药学上可接受的成分，包括例如酸化剂、添加剂、吸附剂、气溶胶抛射剂、空气置换剂、碱化剂、抗结块剂、抗凝剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂、杀菌剂、基料、粘合剂、缓冲剂、螯合剂、包衣剂、着色剂、干燥剂、去污剂、稀释剂、消毒剂、崩解剂、分散剂、增溶剂、染料、润肤剂、乳化剂、乳液稳定剂、填充剂、薄膜形成剂、气味增强剂、矫味剂、流动增强剂、胶凝剂、粒化剂、保湿剂、润滑剂、粘膜粘着剂、软膏基料、软膏、油性溶媒、有机碱、软锭剂基料、色素、增塑剂、抛光剂、防腐剂、多价螯合剂、皮肤渗透剂、增溶剂、溶剂、稳定剂、栓剂基料、表面活性剂、表面活性剂、助悬剂、甜味剂、治疗剂、增稠剂、张度剂、毒性剂、粘度增加剂、吸水剂、水混溶的助溶剂、水软化剂或湿润剂。

在某些实施方案中，药物组合物包含以下组分中的任一种或其组合：阿拉伯胶、乙酰氨基磺酸钾、乙酰柠檬酸三丁酯、乙酰柠檬酸三乙酯、琼脂、白蛋白、乙醇、无水乙醇、变性酒精、稀释酒精、油桐酸、海藻酸、脂肪族聚酯、氧化铝、氢氧化铝、硬脂酸铝、支链淀粉、α-直链淀粉、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、阿司帕坦、注射用抑菌水、皂土、皂土糊、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲酸、苯甲醇、苯甲酸苄酯、溴硝丙二醇、丁基羟基茴香醚、丁羟甲苯、对羟基苯甲酸丁酯、丁基对羟基苯甲酸钠、藻酸钙、抗坏血酸钙、碳酸钙、环己氨基磺酸钙、无水磷酸氢钙、脱水磷酸氢钙、磷酸三钙、丙酸钙、硅酸钙、山梨酸钙、硬脂酸钙、硫酸钙、硫酸钙半水合物、芥花油、卡波姆、二氧化碳、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、β-胡萝卜素、角叉菜胶、蓖麻油、氢化蓖麻油、阳离子乳化蜡、乙酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、粉状纤维素、硅化微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、鲸蜡硬脂醇、西曲溴铵、鲸蜡醇、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、胆固醇、乙酸氯己定、葡萄糖酸氯己定、盐酸氯己定、一氯二氟乙烷(HCFC)、一氯二氟甲烷、含氯氟烃(CFC)、氯苯氧基乙醇、氯二甲苯酚、玉米糖浆固体、无水柠檬酸、柠檬酸一水合物、可可脂、着色剂、玉米油、棉籽油、甲酚、间甲酚、邻甲酚、对甲酚、交联甲羧纤维素钠、交聚维酮、环拉酸、环糊精、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、无水右旋糖、二唑烷基脲、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、二乙醇胺、邻苯二甲酸二乙酯、二氟乙烷(HFC)、二甲基-β-环糊精、环糊精型化合物例如Captisol®、二甲基醚、邻苯二甲酸二甲酯、依地酸二钾、依地酸二钠、磷酸氢二钠、多库酯钙、多库酯钾、多库酯钠、没食子酸十二酯、十二烷基三甲基溴化铵、依地酸钙二钠、乙二胺四乙酸、乙葡胺、乙醇、乙基纤维素、没食子酸乙酯、月桂酸乙酯、乙基麦芽酚、油酸乙酯、对羟甲基苯甲酸乙酯、对羟甲基苯甲酸乙酯钾、对羟甲基苯甲酸乙酯钠、乙基香草醛、果糖、果糖液体、磨碎的果糖、无热原果糖、粉状果糖、富马酸、明胶、葡萄糖、液体葡萄糖、饱和植物脂肪酸的甘油酯混合物、甘油、山嵛酸甘油酯、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、自乳化单硬脂酸甘油酯、棕榈硬脂酸甘油酯、甘氨酸、乙二醇、四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、瓜尔胶、七氟丙烷(HFC)、十六基三甲基溴化铵、高果糖糖浆、人血清白蛋白、烃(HC)、稀盐酸、II型氢化植物油、羟乙基纤维素、2-羟乙基-β-环糊精、羟丙基纤维素、低取代羟丙基纤维素、2-羟丙基-β-环糊精、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、咪脲、靛蓝、离子交换剂、氧化铁、异丙醇、豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、等渗盐水、高岭土、乳酸、拉克替醇、乳糖、羊毛脂、羊毛脂醇、无水羊毛脂、卵磷脂、硅酸镁铝、碳酸镁、正常碳酸镁、无水碳酸镁、碱式碳酸镁、氢氧化镁、月桂基硫酸镁、氧化镁、硅酸镁、硬脂酸镁、三硅酸镁、无水三硅酸镁、苹果酸、麦芽、麦芽糖醇、麦芽糖醇溶液、麦芽糊精、麦芽酚、麦芽糖、甘露醇、中链甘油三酯、葡甲胺、薄荷醇、甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯、油酸甲酯、对羟甲基苯甲酸甲酯、对羟甲基苯甲酸甲酯钾、对羟甲基苯甲酸甲酯钠、微晶纤维素和羧甲基纤维素钠、矿物油、轻质矿物油、矿物油和羊毛脂醇、油、橄榄油、单乙醇胺、蒙脱石、没食子酸辛酯、油酸、棕榈酸、石蜡、花生油、矿脂、矿脂和羊毛脂醇、药用釉料、苯酚、液化苯酚、苯氧基乙醇、苯氧基丙醇、苯基乙醇、乙酸苯汞、硼酸苯汞、硝酸苯汞、波拉克林、波拉克林钾、泊洛沙姆、聚右旋糖、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚丙烯酸酯、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚甲基丙烯酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸钾、苯甲酸钾、碳酸氢钾、硫酸氢钾、氯化钾、柠檬酸钾、无水柠檬酸钾、磷酸氢钾、偏亚硫酸氢钾、磷酸二氢钾、丙酸钾、山梨酸钾、聚维酮、丙醇、丙酸、碳酸丙烯、丙二醇、丙二醇藻酸酯、没食子酸丙酯、对羟甲基苯甲酸丙酯、对羟甲基苯甲酸丙酯钾、对羟甲基苯甲酸丙酯钠、硫酸精蛋白、油菜籽油、林格氏溶液、糖精、糖精铵、糖精钙、糖精钠、红花油、皂石、血清蛋白、芝麻油、硅胶、胶态二氧化硅、藻酸钠、抗坏血酸钠、苯甲酸钠、碳酸氢钠、硫酸氢钠、氯化钠、无水柠檬酸钠、脱水柠檬酸钠、氯化钠、环己氨基磺酸钠、依地酸钠、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、偏亚硫酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸三钠、无水丙酸钠、丙酸钠、山梨酸钠、淀粉乙醇酸钠、硬脂酰醇富马酸钠、亚硫酸钠、山梨酸、脱水山梨醇酯(脱水山梨醇脂肪酯)、山梨醇、山梨醇溶液70%、大豆油、鲸蜡、淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、预胶化淀粉、灭菌玉米淀粉、硬脂酸、纯化的硬脂酸、硬脂醇、蔗糖、糖、可压缩糖、糖果用糖、糖球、转化糖、蔗糖-转化糖聚合物(Sugartab)、日落黄FCF、合成石蜡、滑石粉、酒石酸、酒石黄、四氟乙烷(HFC)、可可油、硫柳汞、二氧化钛、α生育酚、乙酸生育酚、α生育酚琥珀酸酯、β-生育酚、δ-生育酚、γ-生育酚、西黄蓍胶、三醋精、柠檬酸三丁酯、三乙醇胺、柠檬酸三乙酯、三甲基-β-环糊精、三甲基十四烷基溴化铵、tris缓冲液、依地酸三钠、香草醛、I型氢化植物油、水、软水、硬水、无二氧化碳水、无热原水、注射用水、吸入用无菌水、无菌注射用水、冲洗用无菌水、蜡、阴离子乳化蜡、巴西棕榈蜡、阳离子乳化蜡、鲸蜡酯蜡、微晶蜡、非离子乳化蜡、栓剂蜡、白蜡、黄蜡、白矿脂、羊毛脂、黄原胶、木糖醇、玉米蛋白、丙酸锌、锌盐、硬脂酸锌、或以下文献中的任何赋形剂：Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第三版, A. H. Kibbe (PharmaceuticalPress, London, UK, 2000)，其通过引用整体并入。Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第十六版, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980)（其通过引用整体并入）公开了在配制药学上可接受的组合物中所用的各种组分及制备药学上可接受的组合物的已知技术。除了任何常规药剂与药物组合物不相容外，预见到在药物组合物中使用所述药剂。也可将补充的活性成分引入所述组合物中。

在某些实施方案中，前述一种或多种组分在药物组合物中可以以任何浓度存在，例如，至少A，其中A是0.0001%w/v、0.001%w/v、0.01%w/v、0.1%w/v、1%w/v、2%w/v、5%w/v、10%w/v、20%w/v、30%w/v、40%w/v、50%w/v、60%w/v、70%w/v、80%w/v、或90%w/v。在某些实施方案中，前述组分在药物组合物中可以以任何浓度存在，例如，至多B，其中B是90%w/v、80%w/v、70%w/v、60%w/v、50%w/v、40%w/v、30%w/v、20%w/v、10%w/v、5%w/v、2%w/v、1%w/v、0.1%w/v、0.001%w/v、或0.0001%。在其它实施方案中，前述一种或多种组分在药物组合物中可以以任何浓度范围存在，例如约A至约B。在某些实施方案中，A为0.0001%，B为90%。

在某些实施方案中，所述药学上可接受的成分选自：糖(例如，葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麦芽糖、葡聚糖、甘油、葡聚糖、蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖、水苏糖、麦芽糖、乳果糖、麦芽酮糖或异麦芽酮糖或这些糖的组合)、糖醇(例如，乙二醇、甘油、赤藓醇、苏糖醇、阿糖醇、木糖醇、核糖醇、甘露醇、山梨醇、卫矛醇、艾杜糖醇、异麦芽酮糖醇、麦芽糖醇、拉克替醇或葡糖醇或这些糖醇的组合)、盐(例如，氯化钠)、乳化剂或表面活性剂(例如，聚山梨酯，诸如聚氧乙烯20脱水山梨糖醇单油酸酯或环氧乙烷和环氧丙烷的其它嵌段共聚物)、冷冻保护剂、及其混合物。例如，赋形剂诸如糖或糖醇以例如约20 mg/mL至约40mg/mL、或25-45 mg/mL（诸如35 mg/mL）的浓度存在。

可以配制药物组合物以达到生理相容的pH。在某些实施方案中，药物组合物的pH可以是至少5、至少5.5、至少6、至少6.5、至少7、至少7.5、至少8、至少8.5、至少9、至少9.5、至少10或至少10.5，至多并包括pH 11，取决于制剂和施用途径，例如4-7，或4.5和5.5。在示例性实施方案中，药物组合物可以包含缓冲剂，以达到生理相容的pH。缓冲剂可以包括能在所需pH缓冲的任何化合物，例如，磷酸盐缓冲液(例如，PBS)、三乙醇胺、Tris、N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸、TAPS、三(羟甲基)甲基甘氨酸、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲基胂酸盐、MES、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、组氨酸或其它药学上可接受的缓冲剂。在示例性实施方案中，缓冲剂的强度为至少0.5 mM、至少1 mM、至少5 mM、至少10 mM、至少20 mM、至少30mM、至少40 mM、至少50 mM、至少60 mM、至少70 mM、至少80 mM、至少90 mM、至少100 mM、至少120 mM、至少150 mM或至少200 mM。在某些实施方案中，缓冲剂的强度不超过300 mM (例如，至多200 mM、至多100 mM、至多90 mM、至多80 mM、至多70 mM、至多60 mM、至多50 mM、至多40 mM、至多30 mM、至多20 mM、至多10 mM、至多5 mM、至多1 mM)。例如，所述缓冲剂浓度可以是约2 mM至约100 mM、或约10 mM至约50 mM。

施用途径

提供以下关于施用途径的论述仅用于说明示例性的实施方案，不应解释为以任何方式限制范围。

适合口服施用的制剂可由以下组成：(a)液体溶液剂，例如有效量的溶于稀释剂例如水、盐水或橙汁的本发明类似物；(b)胶囊剂、小药囊、片剂、锭剂和糖锭剂，各自含有预定量的活性成分，作为固体或颗粒；(c)散剂；(d)在合适液体中的混悬剂；和(e)合适的乳剂。液体制剂可包括稀释剂，例如水和醇，例如，乙醇、苯甲醇和聚乙烯醇，有或没有添加药学上可接受的表面活性剂。胶囊剂形式可以是普通的硬壳或软壳明胶类型，含有例如，表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂，例如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉。片剂形式可包括以下的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、瓜尔胶、胶态二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、矫味剂和其它药理学相容的赋形剂。锭剂形式可在矫味剂(通常是蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)中包含本公开内容的类似物，而以及在惰性基料(例如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶)中包含本公开内容的类似物的丸剂，乳剂、凝胶剂等含有本领域已知的这类赋形剂。

可将本公开内容的类似物，单独或与其它合适的组分组合，经由肺部施用而递送并且可将其制成经由吸入施用的气溶胶制剂。可将这些气溶胶制剂放入加压的可接受的抛射剂例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等中。也可将它们配制成用于非加压制剂的制备物，例如在喷雾器或雾化器中。这样的喷雾制剂也可用于喷雾粘膜。在某些实施方案中，将类似物配制成粉末共混物或配制成微粒或纳米粒。合适的肺部制剂是本领域已知的。参见，例如，Qian等人, Int J Pharm 366: 218-220 (2009); Adjei and Garren, PharmaceuticalResearch, 7(6): 565-569 (1990); Kawashima等人, J Controlled Release 62(1-2):279-287 (1999); Liu等人, Pharm Res 10(2): 228-232 (1993)；国际专利申请公开号WO2007/133747和WO 2007/141411。

适合胃肠外施用的制剂包括水性和非水性、等渗无菌注射溶液剂(其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使所述制剂与预期受体血液等渗的溶质)以及水性和非水性无菌混悬剂，其可包括助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。术语“胃肠外”意指不通过消化道但通过某些其它途径，例如皮下、肌内、脊柱内或静脉内。可在药物载体中施用本公开内容的类似物与生理可接受的稀释剂，例如无菌液体或液体混合物，包括水、盐水、葡萄糖水和相关的糖溶液、醇例如乙醇或十六烷醇、二醇例如丙二醇或聚乙二醇、二甲亚砜、甘油、缩酮例如2,2- 二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-甲醇、醚、聚(乙二醇)400、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯、或乙酰化脂肪酸甘油酯(有或没有添加药学上可接受的表面活性剂，例如肥皂或去污剂)、助悬剂(例如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素)、或乳化剂和其它药物辅料。

可用于胃肠外制剂的油包括矿油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、矿油和矿物油。用于胃肠外制剂的合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的例子。

用于胃肠外制剂的合适的肥皂包括脂肪碱金属、铵和三乙醇胺盐，合适的去污剂包括(a)阳离子去污剂，例如二甲基二烷基卤化铵，和烷基吡啶鎓卤化物，(b)阴离子去污剂，例如，烷基、芳基和烯烃的磺酸盐，烷基、烯烃、醚和单甘酯的硫酸盐、和磺化琥珀酸盐，(c)非离子去污剂，例如脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物，(d)两性去污剂，例如，烷基-β-氨基丙酸酯和2-烷基-咪唑啉季铵盐，和(e)其混合物。

胃肠外制剂通常含有在溶液中的约0.5重量%至约25重量%的本公开内容的类似物。可以使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除在注射部位的刺激，这样的组合物可以含有一种或多种具有约12至约17的亲水亲油平衡值(HLB)的非离子型表面活性剂。在这样的制剂中的表面活性剂的量通常在约5%重量至约15重量%的范围内。合适的表面活性剂包括聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯，诸如脱水山梨糖醇单油酸酯以及环氧乙烷与疏水碱的高分子量加合物，其经由环氧丙烷与丙二醇缩合而形成。可将胃肠外制剂提供在单位剂量或多剂量密封容器中，例如安瓿和小管中，并且可在冷冻干燥(低压冻干)条件下贮存，仅需要在临用前添加无菌液体赋形剂，例如注射用水。可从以前描述的种类的无菌散剂、颗粒剂和片剂临时制备注射溶液剂和混悬剂。

注射用制剂是与本发明一致的。对注射用组合物的有效药物载体的需要是本领域普通技术人员众所周知的(参见，例如，Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B.Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker和Chalmers,编, 第238-250页(1982),和ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 第4版, 第622-630页(1986))。

另外，可将本公开内容的类似物制成供直肠施用的栓剂，即通过与各种基料例如乳化基料或水溶性基料混合。适合阴道施用用的制剂可提供为阴道栓剂、棉塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂，所述制剂除了活性成分之外还含有本领域已知的合适的载体。

本领域技术人员可以理解，除了上述药物组合物之外，还可将本公开内容的类似物配制成包合络合物，例如环糊精包合络合物，或脂质体。

剂量

认为本公开内容的类似物可用于治疗疾病或医学病症的方法，在所述疾病或病症中，GIP受体激动、GIP/GLP-1受体共激动、GIP/胰高血糖素受体共激动或GIP/GLP-1/胰高血糖素受体三激动起作用。为了本公开内容的目的，所施用的本公开内容的类似物的量或剂量应当足够，以在对象或动物中在合理时间范围内产生例如治疗或预防反应。例如，在自施用时间起的大约1-4分钟、1-4小时或1-4周或更长，例如5-20周或更多周的时期内，本公开内容的类似物的剂量应当足以刺激自本文所述细胞分泌cAMP或足以降低血糖水平、脂肪水平、食物摄取水平或哺乳动物体重。在示例性实施方案中，该时期可甚至更长。剂量可由本发明特定类似物的功效和待治疗动物(例如人)的状况、以及待治疗动物(例如人)的体重来决定。

用于测定施用剂量的许多测定法是本领域已知的。对于本文的目的，可以使用一种测定法来确定待施用给哺乳动物的起始剂量，所述测定法包括：在各自给定不同剂量的类似物的一组哺乳动物中，在将给定剂量的本发明类似物施用给哺乳动物之后比较血糖水平降低的程度。通过本领域已知方法，在施用某剂量之后可测定血糖水平降低的程度，所述方法包括例如本文实施例10中描述的方法。

本公开内容的类似物的剂量还将由可伴随本发明特定类似物的施用而来的任何不良副作用的存在、性质和程度而定。通常，主治医师将考虑各种因素来决定用于治疗各个患者的本发明类似物的剂量，所述因素例如年龄、体重、一般健康、饮食、性别、所施用的本发明类似物、施用途径和所治疗病症的严重程度。举例说明而非意在限制本发明，本公开内容的类似物的剂量可以为约0.0001至约1 g/kg所治疗对象的体重/天、约0.0001至约0.001g/kg体重/天、或约0.01 mg至约1 g/kg体重/天。在示例性实施方案中，所述剂量可以为约1mg至约40 mg、或约4 mg至约30 mg、或约4至约20 mg、或约10至约20 mg、或约12 mg至约30mg的总每周剂量。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含纯度水平适于施用给患者的本文公开的任何类似物。在某些实施方案中，所述类似物具有至少约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的纯度水平，和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。所述药物组合物在某些方面包含浓度为至少A的本公开内容的类似物，其中A为约0.001mg/ml、约0.01 mg/ml、0约1 mg/ml、约0.5 mg/ml、约1 mg/ml、约2 mg/ml、约3 mg/ml、约4mg/ml、约5 mg/ml、约6 mg/ml、约7 mg/ml、约8 mg/ml、约9 mg/ml、约10 mg/ml、约11 mg/ml、约12 mg/ml、约13 mg/ml、约14 mg/ml、约15 mg/ml、约16 mg/ml、约17 mg/ml、约18 mg/ml、约19 mg/ml、约20 mg/ml、约21 mg/ml、约22 mg/ml、约23 mg/ml、约24 mg/ml、约25 mg/ml或更高。在某些实施方案中，所述药物组合物包含浓度为至多B的所述类似物，其中B为约30 mg/ml、约25 mg/ml、约24 mg/ml、约23、mg/ml、约22 mg/ml、约21 mg/ml、约20 mg/ml、约19 mg/ml、约18 mg/ml、约17 mg/ml、约16 mg/ml、约15 mg/ml、约14 mg/ml、约13 mg/ml、约12 mg/ml、约11 mg/ml、约10 mg/ml、约9 mg/ml、约8 mg/ml、约7 mg/ml、约6 mg/ml、约5mg/ml、约4 mg/ml、约3 mg/ml、约2 mg/ml、约1 mg/ml或约0.1 mg/ml。在某些实施方案中，所述组合物可以含有浓度范围为A至B mg/ml的类似物，例如，约0.001至约30.0 mg/ml。

靶向形式

本领域普通技术人员将会容易理解，可以多种方式修饰本公开内容的类似物，使得本公开内容的类似物的治疗性或预防性功效通过修饰而增加。例如，可将本公开内容的类似物直接或通过接头而间接与靶向部分缀合。将缀合化合物(例如，本文所述的胰高血糖素类似物)与靶向部分缀合的实践是本领域已知的。参见，例如，Wadhwa等人, J Drug Targeting, 3, 111-127 (1995) and U.S. Patent No. 5,087,616。本文中使用的术语“靶向部分”是指特异性识别并结合到细胞表面受体上，使得靶向部分指导本发明类似物递送到其表面表达受体(胰高血糖素受体，GLP-1受体)的细胞群的任何分子或试剂。靶向部分包括、但不限于抗体或其片段、肽、激素、生长因子、细胞因子和任何其它天然的或非天然的配体，其结合到细胞表面受体(例如，上皮生长因子受体(EGFR)、T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、CD28、血小板衍生的生长因子受体(PDGF)、烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)等)。本文中使用的“接头”是将两个分离的实体彼此结合的键、分子或分子组。接头可以为两个实体提供最佳间隔，或者还可提供使两个实体彼此分开的不稳定连接。不稳定连接包括光可切割基团、酸不稳定部分、碱不稳定部分和酶可切割基团。术语“接头”在某些实施方案中是指将本公开内容的类似物与靶向部分连接的任何试剂或分子。本领域普通技术人员认识到，本公开内容的类似物上的对于本发明类似物的功能并非必要的部位，是连接接头和/或靶向部分的理想部位，前提是所述接头和/或靶向部分，一旦与本公开内容的类似物连接后，不干扰本公开内容的类似物的功能(即刺激细胞的cAMP分泌以治疗糖尿病或肥胖症的能力)。

控释制剂

可替换地，可将本文所述的胰高血糖素类似物修饰成贮库制剂形式，使得本发明类似物释放到所施用的机体的方式在时间和体内位置上受到控制(参见，例如，美国专利号4,450,150)。本发明类似物的贮库制剂形式可以是例如，包含本公开内容的类似物和多孔或非多孔材料例如聚合物的可植入组合物，其中通过将本公开内容的类似物包入材料中或使其扩散到整个材料中和/或通过非多孔材料的降解。再将贮库制剂植入体内所需位置，并且本发明类似物以预定速率从该植入物中释放。

所述药物组合物在示例性方面经修饰为具有任何类型的体内释放概况。在某些方面，药物组合物是立即释放、控释、持续释放、延长释放、延迟释放或双相释放制剂。配制用于控释的肽的方法是本领域已知的。参见，例如，Qian等人, J Pharm 374: 46-52 (2009)和国际专利申请公开号WO 2008/130158, WO2004/033036; WO2000/032218；和WO 1999/040942。

本发明的组合物可进一步包含例如，胶束或脂质体，或某种其它包封形式，或可以以延长释放形式施用以提供延长储存和/或递送效果。所公开的药物制剂可按照任何方案来施用，所述方案包括例如每日施用(每天1次、每天2次、每天3次、每天4次、每天5次、每天6次)、每周3次、每周2次、每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次或每两月一次施用。

组合

本文所述的胰高血糖素类似物可以单独施用或者与旨在治疗或预防本文所述的任何疾病或医学病症的其它治疗药联合施用。例如，可将本文所述的胰高血糖素类似物与抗糖尿病或抗肥胖症药物共同施用(同时或序贯)。本领域已知的或正处于研究中的抗糖尿病药物包括胰岛素、瘦蛋白、肽YY (PYY)、胰肽(PP)、成纤维细胞生长因子21 (FGF21)、Y2Y4受体激动剂、磺酰脲例如甲苯磺丁脲(Orinase)、醋磺己脲(Dymelor)、妥拉磺脲(Tolinase)、氯磺丙脲(Diabinese)、格列吡嗪(Glucotrol)、格列本脲(Diabeta,Micronase, Glynase)、格列美脲(Amaryl)或格列齐特(Diamicron)；氯茴苯酸类，例如瑞格列奈(Prandin)或那格列奈(Starlix)；双胍类例如二甲双胍(Glucophage)或苯乙双胍；噻唑烷二酮例如罗格列酮(Avandia)、吡格列酮(Actos)或曲格列酮(Rezulin)，或其它PPARγ抑制剂；抑制碳水化合物消化的α葡萄糖苷酶抑制剂，例如米格列醇(Glyset)，阿卡波糖(Precose/Glucobay)；艾塞那肽(exenatide)(Byetta)或普兰林肽；二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂，例如维格列汀(vildagliptin)或西他列汀(sitagliptin)；SGLT(钠依赖性葡萄糖转运蛋白1)抑制剂；葡糖激酶活化剂(GKA)；胰高血糖素受体拮抗剂(GRA)；或FBPase (果糖1,6-二磷酸酶)抑制剂。

本领域已知的或正处于研究中的抗肥胖症药物包括食欲抑制剂，包括苯乙胺型刺激剂、芬特明(任选用芬氟拉明或右芬氟拉明)、安非拉酮(Tenuate®)、苯甲曲秦(Prelu-2®、Bontril®)、苄非他明(Didrex®)、西布曲明(Meridia®、Reductil®)；利莫纳班(Acomplia®), 其它大麻素受体拮抗剂；胃泌酸调节素；盐酸氟西汀(Prozac)；Qnexa (托吡酯和芬特明), Excalia (安非他酮和唑尼沙胺)或Contrave (安非他酮和纳曲酮)；或脂肪酶抑制剂，类似于XENICAL (奥利司他)或Cetilistat (也被称作ATL-962)，或GT 389-255。

在某些实施方案中，将本文所述的肽与用于治疗非酒精性脂肪肝病或NASH的药剂共同施用。用于治疗非酒精性脂肪肝病的药剂包括熊去氧胆酸(又称为Actigall、URSO和Ursodiol)、二甲双胍(Glucophage)、罗格列酮(Avandia)、氯贝丁酯、吉非贝齐、多粘菌素B和甜菜碱。

在某些实施方案中，将本文所述的肽与用于治疗神经变性疾病例如帕金森病(Parkinson’s Disease)的药剂共同施用。抗帕金森病药剂也是本领域已知的，包括、但不限于左旋多巴、卡比多巴、抗胆碱能药、溴隐亭、普拉克索和罗匹尼罗、金刚烷胺和雷沙吉兰。

考虑到上述，本发明还提供额外包含这些其它治疗药之一的药物组合物和药盒。额外治疗药可以与本公开内容的类似物同时或序贯施用。在某些方面，所述类似物在额外治疗药之前施用，而在其它方面，所述类似物在额外治疗药之后施用。

用途

基于本文中首次提供的信息，预见到，本公开内容的组合物(例如，有关的药物组合物)可用于治疗疾病或医学病症，其中例如，在GIP受体、GLP-1受体处或在两种受体处活性的缺乏，是疾病或医学病症的发作和/或发展中的一种因子。因此，本公开内容提供了在患者中治疗或预防疾病或医学病症的方法，其中所述疾病或医学病症是其中GIP受体活化和/或GLP-1受体活化的缺乏与疾病或医学病症的发作和/或发展相关的疾病或医学病症。所述方法包括将有效治疗或预防所述疾病或医学病症的量的根据本文描述的那些中的任一种的组合物或缀合物提供给患者。

在某些实施方案中，所述疾病或医学病症是代谢综合征。代谢综合征，也称为代谢综合征X，胰岛素抗性综合征或雷文综合征(Reaven's syndrome)，是影响超过5千万美国人的病症。代谢综合征的特征通常为以下风险因子中的至少三个或更多个的聚类：(1)腹部肥胖症(在腹部内或周围过多的脂肪组织)；(2)致动脉粥样硬化的血脂障碍(血液脂肪病症，包括增加动脉壁斑块聚积的高甘油三酯、低HDL胆固醇和高LDL胆固醇)；(3)血压升高；(4)胰岛素抗性或葡萄糖不耐受；(5)血栓前状态(例如血液中高的纤维蛋白原或纤溶酶原激活物抑制剂-1)；和(6)前-炎性状态(例如血液中的C-活性蛋白升高)。其它风险因子可包括老化、激素失衡和遗传易感性。

代谢综合征与冠心病及与血管斑块聚积有关的其它病症风险的增加相关，所述其它病症例如中风和外周血管病(称为动脉粥样硬化心血管病(ASCVD))。代谢综合征患者可从其早期阶段的胰岛素抗性状态发展到具有进一步增加的ASCVD风险的充分发展的II型糖尿病。旨在不受限于任何特定理论，胰岛素抗性、代谢综合征和血管病之间的关系可涉及一种或多种同时发生的致病机制，包括胰岛素-刺激的血管舒张受损，由于增加氧化应激而产生的胰岛素抗性相关的NO可利用性降低，和脂肪细胞-衍生的激素例如脂连蛋白的异常(Lteif和Mather, Can. J. Cardiol. 20 (增刊B):66B-76B (2004))。

根据2001年的美国国家胆固醇教育计划成人治疗组(National CholesterolEducation Program Adult Treatment Panel) (ATP III)，同一个体的任何以下三个特征满足代谢综合征标准：(a)腹部肥胖(男性腰围超过102cm，女性超过88cm)；(b)血清甘油三酯(150mg/dl或以上)；(c) HDL胆固醇(男性中40mg/dl或更低，女性中50mg/dl或更低)；(d)血压(130/85或更高)；和(e)禁食血糖(110mg/dl或以上)。根据世界卫生组织(WHO)，具有高胰岛素水平(仅禁食血糖升高或餐后葡萄糖升高)并且具有至少以下两个标准的个体满足代谢综合征的标准：(a)腹部肥胖(腰臀比率大于0.9，身体质量指数至少30kg/m2或腰围测量超过37英寸)；(b)胆固醇组显示至少150mg/dl的甘油三酯水平或低于35mg/dl的HDL胆固醇；(c)140/90或更高的血压或在接受高血压治疗)。(Mathur，Ruchi，“MetabolicSyndrome”Shiel，Jr., William C.编，MedicineNet.com，2009年5月11曰)。

为了本文的目的，如果个体满足2001年美国国家胆固醇教育计划成人治疗组指南或WHO提出的标准中的任一个或两个标准，那么认为该个体罹患代谢综合征。

不受限于任何特定理论，本文所述的组合物和缀合物可用于治疗代谢综合征。因此，本发明提供在对象中预防或治疗代谢综合征或降低其一个、二个、三个或更多个风险因子的方法，所述方法包括给所述对象提供有效预防或治疗代谢综合征或其风险因子的量的本文所述的组合物。

在某些实施方案中，所述方法治疗高血糖医学病症。在示例性方面，所述高血糖医学病症是糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病或妊娠期糖尿病，或者胰岛素-依赖性或者非胰岛素-依赖性的。在某些方面，所述方法通过减少糖尿病的一个或多个并发症(包括肾病、视网膜病和血管病)而治疗高血糖医学病症。

在某些方面，所述疾病或医学病症是肥胖症。在某些方面，所述肥胖症是药物引起的肥胖症。在某些方面，所述方法通过在患者中防止或减少体重增加或者增加体重减轻而治疗肥胖症。在某些方面，所述方法通过在患者中降低食欲、减少食物摄取、降低脂肪水平、或降低食物通过胃肠系统的运动速率而治疗肥胖症。

因为肥胖症与其它疾病的发生或发展有关，治疗肥胖症的方法可进一步用于减少肥胖症相关的并发症的方法，所述并发症包括血管病(冠状动脉疾病、中风、外周血管病、缺血-再灌注等)、高血压、II型糖尿病发作、高脂血症和肌肉骨骼疾病。因此本公开内容提供治疗或预防这些肥胖症相关的并发症的方法。

在某些实施方案中，所述疾病或医学病症是非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。NAFLD是指从单纯脂肪肝(脂肪变性)到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)到肝硬化(不可逆的晚期肝瘢痕化)的广谱肝脏疾病。NAFLD的所有阶段都在肝脏细胞(肝细胞)中聚积脂肪(脂肪浸润)。单纯脂肪肝是某种脂肪、甘油三酯类型在肝脏细胞中异常聚积但肝脏细胞无炎症或瘢痕化。在NASH中，脂肪聚积与肝脏不同程度的炎症(肝炎)和瘢痕化(纤维化)有关。炎性细胞可破坏肝脏细胞(肝细胞坏死)。术语“脂肪性肝炎”和“脂肪坏死”中的脂肪(steato)指脂肪浸润，肝炎指肝脏炎症，坏死指肝脏细胞受破坏。NASH可最终导致肝脏瘢痕化(纤维化)，然后是不可逆的晚期瘢痕化(肝硬化)。由NASH引起的肝硬化是NAFLD疾病谱的最后和最严重的阶段(Mendler, Michel, “Fatty Liver: Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD)and Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH),”Schoenfield, Leslie J.编,MedicineNet.com, 2005年8月29日)。

酒精性肝病或酒精诱导的肝病包括与过量消耗酒精有关或由其引起的三种病理上不同的肝脏疾病：脂肪肝(脂肪变性)、慢性或急性肝炎和肝硬化。酒精性肝炎的范围可以为温和的肝炎(异常实验室检测为疾病的唯一指征)到严重的肝功能障碍并有并发症例如黄疸病(由胆红素留滞(bilirubin retention)引起的黄皮肤)、肝性脑病(由肝脏衰竭引起的神经功能障碍)、腹水(腹部的流体聚积)、出血性食管曲张(食管的静脉曲张)、异常血液凝结和昏迷。酒精性肝炎在组织学上具有肝细胞气球样变性、嗜中性粒细胞炎症及有时马洛里小体(细胞中间丝蛋白异常聚集)的特征性外观。肝硬化的解剖特征在于肝脏上广泛的节结以及纤维化(Worman, Howard J., “Alcoholic Liver Disease”, ColumbiaUniversity Medical Center网站)。

不受限于任何特定理论，本文所述的组合物和缀合物用于治疗酒精性肝病、NAFLD或其任何阶段，包括例如脂肪变性、脂肪性肝炎、肝炎、肝脏炎症、NASH、肝硬化或并其发症。因此，本公开内容提供了在对象中预防或治疗酒精性肝病、NAFLD或其任何阶段的方法，所述方法包括给对象施用有效预防或治疗酒精性肝病、NAFLD或其阶段的量的本文所述的组合物。这样的治疗方法包括降低以下中的一种、二种、三种或更多种：肝脏脂肪含量、肝硬化的发生或发展、肝细胞癌的发生率、炎症病征例如异常肝酶水平(例如天冬氨酸氨基转移酶AST和/或丙氨酸氨基转移酶ALT或LDH)、升高的血清铁蛋白、升高的血清胆红素和/或纤维化病征例如升高的TGF-β水平。在示例性实施方案中，将所述组合物用于治疗其进展超过单纯脂肪肝(脂肪变性)并表现出炎症或肝炎病征的患者。所述方法可导致例如AST和/或ALT水平降低。

已经证明GLP-1和艾塞那肽-4具有某种神经保护作用。本公开内容也提供了本文所述的组合物在治疗以下疾病中的用途，神经变性疾病，包括、但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森病、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、其它脱髓鞘相关病症、老年痴呆、皮质下痴呆、动脉硬化性痴呆、AIDS-相关的痴呆或其它痴呆、中枢神经系统癌症、创伤性脑损伤、脊髓损伤、中风或脑缺血、脑血管炎、癫痫、亨廷顿病、图雷特综合征、格林巴利综合征(GuillainBarre syndrome)、威尔逊病(Wilson disease)、皮克病、神经炎性病症、脑炎、脑脊髓炎或病毒性、真菌性或细菌性起源的脑膜炎、或其它中枢神经系统感染、朊蛋白病、小脑共济失调、小脑变性、脊髓小脑变性综合征、弗里德赖希共济失调(Friedreichs ataxia)、共济失调毛细血管扩张、脊柱肌营养不良(spinal dysmyotrophy)、进行性核上性麻痹、张力障碍、肌肉痉挛、震颤、视网膜色素变性、纹状体黑质变性、线粒体脑-肌病、神经元腊样脂褐质症、肝性脑病、肾性脑病、代谢性脑病、毒素诱导的脑病和辐射诱导的脑损伤。

在某些实施方案中，在医院环境中，将所述组合物与胃肠外施用营养物联合用于非糖尿病患者，例如，接受胃肠外营养或全部胃肠外营养的患者。非限制性实例包括手术患者；昏迷中的患者；具有以下疾病的患者：消化道疾病、或无功能胃肠道(例如因为手术切除、闭塞或吸收能力受损)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、胃肠道阻塞、胃肠道瘘管、急性胰腺炎、肠缺血、胃肠道大手术、某些先天性胃肠道异常、延长的腹泻或因手术所致的短肠综合征；休克中的患者，和正经历治愈过程，经常接受胃肠外施用碳水化合物以及脂质、电解质、矿物质、维生素和氨基酸的多种组合的患者。如本文中所述的包含GIP激动剂肽和胰高血糖素拮抗剂肽的组合物和胃肠外营养组合物可在同时、不同时、在彼此之前或之后施用，前提是所述组合物在胃肠外营养组合物被消化的时间发挥所需生物作用。例如，胃肠外营养物可以每天施用1、2或3次，而所述组合物则是两天1次、一周3次、一周2次、一周1次、两周1次、三周1次、或一月1次施用。

本文中使用的术语“治疗”包括预防具体障碍或病症，或减轻与具体障碍或病症有关的症状，和/或预防或消除所述症状。例如，本文使用的术语“治疗糖尿病”通常是指朝正常水平的方向改变血糖水平，并且根据特定情况可包括提高或降低血糖水平。

本文中使用的胰高血糖素肽的“有效”量或“治疗有效量”是指无毒的但足以提供期望效果的所述肽的量。例如，一种预期效果可以为预防或治疗低血糖症(例如，通过血糖水平的增加而测定)。本公开内容的胰高血糖素肽的一种替代性预期效果包括治疗高血糖症(例如，通过血糖水平更接近正常的改变而测定)，或引起体重减轻/预防体重增加(例如，通过体重减轻而测定)，或者预防或减少体重的增加，或使体脂肪分布正常化。“有效”量将根据对象的不同而变，取决于个体的年龄和一般状况、施用模式，等等。由此，并不总是可能规定确切的“有效量”。但是，在任何个体病例中，合适的“有效”量可以由本领域普通技术人员使用常规实验来确定。

对象

对于以上治疗方法，患者是任何宿主。在某些实施方案中，宿主是哺乳动物。本文中使用的术语“哺乳动物”是指哺乳类的任何脊椎动物，包括、但不限于任何单孔类、有袋类和胎盘类动物。在某些实施方案中，哺乳动物是啮齿目(Rodentia)哺乳动物之一(例如小鼠和仓鼠)，和兔形目(Logomorpha)哺乳动物(例如兔)。在示例性实施方案中，哺乳动物来自食肉目(Carnivora)，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。在示例性实施方案中，哺乳动物来自偶蹄目(Artiodactyla)，包括牛科动物(牛)和猪类(猪)，或来自奇蹄目(Perssodactyla)，包括马科动物(马)。在某些情况下，哺乳动物是灵长目(Primates)、Ceboids或Simoids (猴)或类人猿目(Anthropoids) (人和猿)。在特定的实施方案中，哺乳动物是人。

试剂盒

根据一个实施方案，本公开内容的胰高血糖素类似物可提供为试剂盒的部分。因此，在某些实施方案中，提供了将胰高血糖素类似物施用给有此需要的患者的试剂盒，其中所述试剂盒包含本文所述的胰高血糖素类似物。

在一个实施方案中，提供了含有将胰高血糖素组合物施用给对象的装置的试剂盒。在某些方面，所述装置是注射器针头、笔装置、喷射注射器或其它无针头注射器。可替换地或另外地，试剂盒可包括一个或多个容器，例如小瓶、管、瓶、单室或多室预充式注射器、药筒、输液泵(外置式或植入式)、喷射注射器、预充式笔装置等，任选含有呈冻干形式或在水溶液中的胰高血糖素类似物。在某些实施方案中，试剂盒包括使用说明书。根据一个实施方案，试剂盒的装置为气溶胶分配装置，其中将组合物预包装在气溶胶装置中。在另一实施方案中，试剂盒包含注射器和针头，而在一个实施方案中，将无菌胰高血糖素组合物预包装在注射器中。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含使用说明书。在某些方面，所述说明书包括根据本文描述的任何方法的使用说明书。所述说明书可另外包括关于维持健康饮食和/或体育运动计划的说明书。所述说明书可以呈书面小册子的形式，或呈电子形式，例如，包含所述说明书的计算机可读的存储装置。

给出以下实施例仅为说明本发明，而不是以任何方式限制其范围。

实施例

实施例1

以下提供了合成本公开内容的肽类似物的示例性方法。

胰高血糖素的肽片段的合成

材料：

本文在实施例中所述的所有肽都被酰胺化，除非另有说明。

在肽合成期间使用MBHA树脂(4-甲基二苯甲基胺聚苯乙烯树脂。MBHA树脂，100-180目，1%DVB交联聚苯乙烯；装载0.7-1.0 mmol/g)，Boc-保护的和Fmoc保护的氨基酸购自Midwest Biotech。在Applied Biosystem 430A肽合成仪上使用Boc-保护的氨基酸进行固相肽合成。使用Applied Biosystems模型433肽合成仪进行Fmoc保护的氨基酸合成。

肽合成(Boc氨基酸/HF切割):

在Applied Biosystem模型430A肽合成仪上进行这些类似物的合成。通过将氨基酸序贯加入到含有2 mmol Boc保护的氨基酸的药筒中，构建合成肽。具体地，使用BocDEPBT-活化的单偶联进行合成。在偶联步骤结束时，用TFA处理肽基-树脂以除去N-端Boc保护基。用二甲基甲酰胺(DMF)将其重复洗涤，对于所需数量的偶联步骤，重复该重复循环。装配之后，侧链保护，Fmoc，通过20%哌啶处理而除去，再用DIC进行酰化。在完全合成结束时通过使用二氯甲烷(DCM)将肽基-树脂干燥，然后用无水HF从树脂上将所述肽切割下来。

对于内酰胺化，对于Glu和Lys选择直角保护基(orthogonal protecting group)(例如Glu(Fm), Lys(Fmoc))。在除去保护基之后和HF切割之前，如先前所述(参见，例如，国际专利申请公开号WO2008/101017)进行环化。

肽基-树脂的HF处理

将肽基-树脂用无水氟化氢(HF)处理，这通常得到大约350 mg (~50%收率)粗制的去保护的肽。具体地，将肽基-树脂(30mg至200mg)放入HF反应容器中进行切割。将500 μL对甲酚加入到容器中作为阳碳离子清除剂(carbonium ion scavenger)。将容器连接到HF系统并浸入甲醇/干冰混合物中。容器用真空泵排空并将10 ml HF蒸馏到反应容器中。将肽基-树脂和HF的反应混合物在0℃搅拌1小时，然后建立真空并将HF快速排空(10-15 min)。将容器小心移动并充入大约35 ml乙醚以沉淀所述肽和萃取对甲酚和得自HF处理的小分子有机保护基。该混合物用特氟龙滤器过滤并重复2次以除去所有过量甲酚。将滤液弃去。将沉淀的肽溶于大约20 ml 10%乙酸(水)。收集含有所需肽的滤液并低压冻干。

在下述条件下对粗制溶解肽进行分析型HPLC分析[4.6 X 30 mm Xterra C8，1.50mL/min，220 nm，A缓冲液0.1%三氟乙酸(TFA)/10%丙烯腈(CAN)，B缓冲液0.1%TFA/100%ACN，梯度5-95%B历时15分钟]。用水将萃取物稀释2倍并上样到2.2 X 25 cm Vydac C4制备型反相柱并在Waters HPLC系统上用乙腈梯度洗脱(A缓冲液为0.1%TFA/10%ACN，B缓冲液为0.1%TFA/10%ACN，梯度为0-100%B，经过120分钟，流速15.00 ml /min。纯化肽的HPLC分析表明大于95%纯度并用电喷雾电离质谱分析证实所述肽的身份。

肽酰化

如下制备酰化的肽。使用CS Bio 4886肽合成仪或Applied Biosystems 430A肽合成仪，在固体载体树脂上合成肽。如Schnolzer等人, Int. J. Peptide Protein Res. 40:180-193 (1992)所述，使用原位中和化学。对于酰化的肽，用Nε-FMOC赖氨酸残基取代待酰化的靶氨基酸残基(例如，位置10，相对于SEQ ID NO: 3的氨基酸位置编号)。将完全N-端的BOC保护的肽用在DMF中的20%哌啶处理30分钟，除去FMOC/甲酰基。通过使10倍摩尔过量的FMOC-保护的间隔物氨基酸(例如FMOC-Glu-OtBu)或酰基链(例如CH₃(CH₂)₁₄-COOH)和PyBOP或DEPBT偶联剂在DMF/N,N-二异丙基乙胺(DIEA)中偶联，实现与游离ε-氨基Lys残基的偶联。随后除去间隔物氨基酸的FMOC基团，接着重复与酰基链的偶联。用100%TFA的最后处理导致任何侧链保护基和N-端BOC基团的除去。将肽树脂用5 %DIEA/DMF中和，干燥，然后用95:5的HF/对甲酚在0℃达1小时使其从载体上切割。在乙醚萃取以后，用5%乙酸(HOAc)溶液使粗制肽成为溶剂合物。然后通过ESI-MS确证溶液样品含有正确分子量的肽。通过RP-HPLC用10%乙腈(CH3CN)/0.1%TFA至100%CH3CN中的0.1%TFA的线性梯度，纯化正确的肽。用VydacC18 22 mm x 250 mm蛋白柱进行纯化。通常用20:80的缓冲液比率完成酰化肽类似物的洗脱。将各部分合并在一起，并在分析型RP-HPLC上检查纯度。将纯级分低压冻干，得到白色固态肽。

下面是一种示例性的酰化的Lys残基，其中酰基通过γ-Glu-γ-Glu二肽间隔物连接。

其中n是1-29。

如果肽包含内酰胺桥和要酰化的靶残基，在将该氨基酸添加至肽主链以后，如上所述进行酰化。

如下准备双酰化或二酰化。使用CS Bio 4886肽合成仪或Applied Biosystems430A肽合成仪，在固体载体树脂上合成肽。如Schnolzer等人, Int. J. Peptide ProteinRes. 40: 180-193 (1992)所述，使用原位中和化学。对于两个位点双酰化的肽，用Nε-FMOC赖氨酸残基取代待酰化的靶氨基酸残基(例如，位置10和40，相对于SEQ ID NO: 3的氨基酸位置编号)。将完全N-端的BOC保护的肽用在DMF中的20%哌啶处理30分钟，除去FMOC/甲酰基。通过使10倍摩尔过量的FMOC-保护的间隔物氨基酸(例如FMOC-Glu-OtBu)或酰基链(例如CH₃(CH₂)₁₄-COOH)和PyBOP或DEPBT偶联剂在DMF/DIEA中偶联，实现与游离ε-氨基Lys残基的偶联。随后除去间隔物氨基酸的FMOC基团，接着重复与酰基链的偶联。用100%TFA的最后处理导致任何侧链保护基和N-端BOC基团的除去。将肽树脂用5 %DIEA/DMF中和，干燥，然后用95:5的HF/对甲酚在0℃达1小时使其从载体上切割。在乙醚萃取以后，用5%乙酸(HOAc)溶液使粗制肽成为溶剂合物。然后通过ESI-MS确证溶液样品含有正确分子量的肽。通过RP-HPLC用10%乙腈(CH3CN)/0.1%TFA至100%CH3CN中的0.1%TFA的线性梯度，纯化正确的肽。用Vydac C18 22 mm x 250 mm蛋白柱进行纯化。通常用20:80的缓冲液比率完成酰化肽类似物的洗脱。将各部分合并在一起，并在分析型RP-HPLC上检查纯度。将纯级分低压冻干，得到白色固态肽。

如下准备单位点分支双酰化。使用CS Bio 4886肽合成仪或Applied Biosystems430A肽合成仪，在固体载体树脂上合成肽。如Schnolzer等人, Int. J. Peptide ProteinRes. 40: 180-193 (1992)所述，使用原位中和化学。对于酰化的肽，用Nε-FMOC赖氨酸残基取代待酰化的靶氨基酸残基(例如，位置10，相对于SEQ ID NO: 3的氨基酸位置编号)。将完全N-端的BOC保护的肽用在DMF中的20%哌啶处理30分钟，除去FMOC/甲酰基。通过使10倍摩尔过量的ε-氨基和α-氨基FMOC-保护的间隔物氨基酸(例如FMOC-Lys(FMOC)-OH)和PyBOP或DEPBT偶联剂在DMF/DIEA中偶联，实现通过C端与Lys残基的偶联。随后除去间隔物氨基酸的FMOC基团，接着将ε-氨基和α-氨基中的每一个与酰基链偶联。用100%TFA的最后处理导致任何侧链保护基和N-端BOC基团的除去。将肽树脂用5 %DIEA/DMF中和，干燥，然后用95:5的HF/对甲酚在0℃达1小时使其从载体上切割。在乙醚萃取以后，用5%乙酸(HOAc)溶液使粗制肽成为溶剂合物。然后通过ESI-MS确证溶液样品含有正确分子量的肽。通过RP-HPLC用10%乙腈(CH3CN)/0.1%TFA至100%CH3CN中的0.1%TFA的线性梯度，纯化正确的肽。用Vydac C1822 mm x 250 mm蛋白柱进行纯化。通常用20:80的缓冲液比率完成酰化肽类似物的洗脱。将各部分合并在一起，并在分析型RP-HPLC上检查纯度。将纯级分低压冻干，得到白色固态肽。

如下准备单位点直链双酰化。使用CS Bio 4886肽合成仪或Applied Biosystems430A肽合成仪，在固体载体树脂上合成肽。如Schnolzer等人, Int. J. Peptide ProteinRes. 40: 180-193 (1992)所述，使用原位中和化学。对于酰化的肽，用Nε-FMOC赖氨酸残基取代待酰化的靶氨基酸残基(例如，位置10，相对于SEQ ID NO: 3的氨基酸位置编号)。将完全N-端的BOC保护的肽用在DMF中的20%哌啶处理30分钟，除去FMOC/甲酰基。通过使10倍摩尔过量的FMOC-保护的间隔物氨基酸(例如FMOC-Glu-OtBu)或酰基链(例如CH₃(CH₂)₁₄-COOH)和PyBOP或DEPBT偶联剂在DMF/DIEA中偶联，实现与游离ε-氨基Lys残基的偶联。随后除去间隔物氨基酸的FMOC基团，接着与酰基链偶联，所述酰基链在脂肪酸尾巴的末端被受保护的氨基酸（诸如FmocNH-(CH₂)₁₁-COOH）官能化。将得到的单酰化的氨基酸用在DMF中的20%哌啶处理以除去FMOC保护基，接着与酰基链偶联。用100%TFA的最后处理导致任何侧链保护基和N-端BOC基团的除去。将肽树脂用5 %DIEA/DMF中和，干燥，然后用95:5的HF/对甲酚在0℃达1小时使其从载体上切割。在乙醚萃取以后，用5%乙酸(HOAc)溶液使粗制肽成为溶剂合物。然后通过ESI-MS确证溶液样品含有正确分子量的肽。通过RP-HPLC用10%乙腈(CH3CN)/0.1%TFA至100%CH3CN中的0.1%TFA的线性梯度，纯化正确的肽。使用Vydac C18 22mm x 250 mm蛋白柱进行纯化。通常用20:80的缓冲液比率完成酰化肽类似物的洗脱。将各部分合并在一起，并在分析型RP-HPLC上检查纯度。将纯级分低压冻干，得到白色固态肽。

在两个位点或单个位点双酰化的情况下，要与肽偶联的两个酰基链可以相同或不同。在两个不同酰基链的情况下，用两个不同的保护基取代要酰化的靶氨基酸。例如Nε-FMOC赖氨酸残基和Nε-ivDde赖氨酸残基(两个位点双酰化)或FMOC Lys (ivDde)-OH (单个位点双酰化，852082 Novabiochem)。将完全N-端的BOC保护的肽用在DMF中的20%哌啶处理30分钟，除去FMOC/甲酰基。将游离ε-氨基Lys残基与酰基或间隔物氨基酸偶联，随后与酰基偶联。将得到的单酰化的肽用2%肼/DMF处理以除去(ivDde)保护基。将游离氨基Lys残基与酰基或间隔物氨基酸偶联，随后与酰基偶联。如上所述分离双酰化的肽。

双酰化的肽(胰高血糖素Aib2 E16 A18 L27 D28 Cex K40(C16γE-K-γEC12)G41-酰胺，具有SEQ ID NO: 211的氨基酸序列)的一个实例合成在下面进一步描述：

将0.28克(0.2mmol) mbha-树脂(Midwest Biotech)置于反应容器中，并在CSBio336合成仪上用DEPBT/DIEA活化的Boc氨基酸的单偶联组装下列序列。

将Boc保护的肽树脂转移至手动反应容器中，用20%哌啶/DMF在室温处理10分钟。将所述树脂过滤，用DMF洗涤三次，并加入Fmoc Lys(ivDde)-OH (EMD-Novabiochem)的活化溶液(预先将2mmol Fmoc Lys(ivDde)溶解在4.0ml 0.5M DEPBT/DMF中并加入0.35ml(2mmol) DIEA来制备)。

将肽树脂在室温混合16小时，然后过滤，用DMF洗涤，并用20%哌啶/DMF处理10分钟。将树脂过滤，用DMF洗涤数次，加入Fmoc Glu-OBzl的活化溶液(预先通过将2mmol FmocGlu-OBzl溶解在4.0ml 0.5M DEPBT/DMF中并加入0.35ml DIEA来制备)。将反应物在室温混合1小时，然后过滤，用DMF洗涤树脂。用20%哌啶/DMF再一次处理后，将树脂用DMF洗涤数次，并加入棕榈酸的活化溶液以完成在位置40处的侧链Lys的α胺的酰化(预先将2mmol棕榈酸溶解在4.0ml 0.5M DEPBT/DMF中并加入0.35ml DIEA来制备)。将反应物混合1小时。

将肽树脂过滤，用DMF洗涤，并用2%肼/DMF在室温处理15分钟，过滤，并用DMF洗涤数次。加入Fmoc Glu-OBzl的活化溶液(同上)，将反应物在室温混合1小时。所述树脂分成三份，用于在ε-赖氨酸胺处的最后酰化。在此情况下，向一份中加入十二烷酸的活化溶液。其预先将1mmol十二烷酸(Aldrich)溶解在2.0ml 0.5M DEPBT/DMF中并加入0.175ml DIEA来制备。将此反应物混合1小时，过滤，用DMF洗涤，然后用二氯甲烷洗涤。用50%TFA/DCM处理以除去N端Boc基团，用5%DIEA/DCM中和后，在冰浴中进行1小时的HF切割，用对甲酚作为清除剂。蒸发HF后，将残余物悬浮在乙醚中，将肽/树脂混合物过滤，并用乙醚洗涤。将肽萃取到乙酸水溶液中，并在HPLC (4.6x50mm Zorbax SB-C8, 1ml/min, 45℃, 214nm (0.5A) A=0.1%TFA, B=0.1%TFA/90%ACN)上分析。将剩余的切割萃取物上样至21.2x250mmAmberchrom XT20柱上，并在Pharmacia FPLC上运行0.1%TFA/乙腈梯度进行纯化。

将级分83-86合并，冷冻并低压冻干，得到22.3mg SEQ ID NO:211的肽，其纯度是90%+。理论分子量= 5202.9, ESI观察到的质量= 5202.0。

通过琥珀酰化实现的肽酰化

如下准备琥珀酰化的肽。使用CS Bio 4886肽合成仪或Applied Biosystems 430A肽合成仪，在固体载体树脂上合成肽。如Schnolzer等人, Int. J. Peptide Protein Res.40: 180-193 (1992)所述，使用原位中和化学。对于琥珀酰化的肽，用Nε-FMOC赖氨酸残基取代待酰化的靶氨基酸残基(例如，位置10，相对于SEQ ID NO: 3的氨基酸位置编号)。将完全N-端的BOC保护的肽用在DMF中的20%哌啶处理10分钟，除去FMOC/甲酰基。将树脂过滤，用DMF/DCM洗涤，并再悬浮于DCM中。通过将10倍摩尔过量的正十六烷基琥珀酸酐(TCl)与4-二甲基氨基吡啶一起偶联，实现与游离ε-氨基Lys残基的偶联。将树脂混合过夜，过滤，用DCM洗涤，并用50%TFA/DCM处理，以除去任何侧链保护基和N-端BOC。将肽树脂用5 %DIEA/DMF中和，干燥，然后用95:5的HF/对甲酚在0℃达1小时使其从载体上切割。在乙醚萃取以后，用5%乙酸(HOAc)溶液使粗制肽成为溶剂合物。然后通过HPLC分析确证溶液的样品。将剩余的乙酸溶液上样至10x250mm Amberchrom XT20柱进行纯化。运行TFA/ACN水溶液梯度，同时收集级分并在214nm下监测UV。将纯级分低压冻干，得到固态肽。

琥珀酰化的肽(胰高血糖素Aib2 E16 A18 L27 D28 Cex K40(C16琥珀酰基)G41-酰胺，具有SEQ ID NO: 156的氨基酸序列)的一个实例合成在下面进一步描述:

将0.28克(0.2mmol) mbha-树脂(Midwest Biotech)置于反应容器中，并在CSBio336合成仪上用DEPBT/DIEA活化的单偶联物组装下列序列。

将约三分之一的Boc保护的肽树脂转移至手动反应容器中，用20%哌啶/DMF在室温处理10分钟。将树脂过滤，用DMF洗涤三次，用二氯甲烷洗涤两次，并再悬浮于10ml DCM中。与2-3mg 4-二甲基氨基吡啶(Aldrich)一起加入324mg (1mmol)正十六烷基琥珀酸酐(TCI)。

将树脂在室温混合过夜，然后过滤，用DMF洗涤二次，用50%TFA/DCM处理1至2分钟。将树脂过滤，用DCM洗涤数次，通过5%DIEA/DCM洗涤进行中和，并转移至HF反应容器。使用5ml液体氟化氢和0.5ml对甲酚清除剂进行HF切割。在冰浴中搅拌1小时后，在真空中除去HF并将残余物悬浮于乙醚中。将混悬液用烧结的玻璃漏斗过滤，用乙醚洗涤固体，并将肽萃取到15ml 50%乙酸水溶液中。在HPLC (4.6x50mm Zorbax SB-C8，1ml/min，45℃，214nm，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/90%ACN，梯度= 30%B至90%B历时10min)上分析后，将切割萃取物上样至21.2x250mm Amberchrom XT20柱进行纯化。运行TFA/乙腈水溶液梯度，同时收集级分并监测UV吸光度。级分55-56被鉴定为单一组分，并将其冷冻并低压冻干。回收32.5mg，纯度为90%+ (DLS-027-68B)。理论分子量= 4720.3，ESI观察到的质量= 4717.0

肽烷基化(例如，S-烷基化)

烷基化的(例如，S-烷基化的)肽(胰高血糖素Aib2 E16 A18 L27 D29 Cex Cys40(S-2棕榈基)酰胺，具有SEQ ID NO: 164的氨基酸序列)的一个实例合成在下面进一步描述：

将0.28克0.2mmol mbha-树脂(Midwest Biotech)置于CSBio反应容器中，并在CSBio336合成仪上使用Boc氨基酸和DEPBT/DIEA活化的单偶联物组装下述序列。

将肽树脂转移至HF反应容器，使用10 ml液体氟化氢和1ml对甲酚清除剂在冰浴中运行HF切割1小时。蒸发HF后，将残余物悬浮于乙醚中，将肽和树脂在烧结的玻璃漏斗中过滤。用乙醚洗涤并快速风干后，将肽萃取到50%乙酸水溶液中。通过HPLC (4.6x50mm ZorbaxSB-C8，1ml/min，45℃，214nm，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/90%ACN，30%至90%B历时10min)分析后，将切割萃取物用水稀释3至4倍，上样至22.2x250mm Amberchrom XT20柱，用TFA/CAN水溶液梯度进行纯化。将起始反应混合物在相同柱上再纯化，得到79mg产物，纯度95%。理论分子量= 4313.7, ESI观察到的质量= 4312.0。

将16 mg (3.7µmol)上述游离巯基肽悬浮于1ml甲醇中，并在氮气流下搅拌下，加入在1ml甲醇(MeOH)中的1.5 μl四甲基胍，然后加入在0.5mg四氢呋喃(THF)中的3mg (7.8µmol) 2-碘十六烷酸(2-碘棕榈酸)。预先通过用碘化钾在丙酮中的溶液(DLS-027-52)处理2-溴十六烷酸，制备2-碘十六烷酸。将烷基化反应物在浴中加热10分钟，在此期间大部分溶剂蒸发。将残余物溶解在乙酸水溶液中，用HPLC分析，并发现其疏水性高于起始肽。将剩余的乙酸溶液上样至10x250mm Amberchrom XT20柱进行纯化。运行TFA/ACN水溶液梯度，同时收集级分并在214nm监测UV。将级分64-68合并，冷冻并低压冻干，得到6.1mg材料(SEQ IDNO: 164的肽)，纯度是90%+。理论分子量= 4568.1, MALDI观察到的质量= 4568.79。

当所述肽在C端包含Lys残基而非Cys残基时，可以首先制备具有主链Lys的肽。用Nε-FMOC赖氨酸残基取代待N烷基化的靶氨基酸残基。将完全N-端的BOC保护的肽用在DMF中的20%哌啶处理30分钟，从Lys残基除去FMOC/甲酰基。将Cys残基与游离ε-氨基Lys残基偶联。然后通过如上文所述与2-碘棕榈酸反应将Cys残基烷基化。

通过“miniPEG”间隔物的肽酰化

通过miniPEG间隔物合成酰化肽(具有SEQ ID NO: 89的氨基酸序列的肽)的一个实例合成如下所述：

将0.28克(0.2mmol) 4-甲基二苯甲基胺(mbha)树脂(Midwest Biotech, Inc.,Fishers, IN)置于反应容器中，并在CSBio336合成仪上使用Boc氨基酸和3-(二乙氧基磷酰氧基)-3H-苯并[d][1,2,3]三嗪-4-酮/N,N-二异丙基乙胺(DEPBT/DIEA)活化的单偶联物组装下述序列。

将约三分之一Boc保护的肽树脂转移至手动反应容器中，并用20%哌啶/二甲基甲酰胺在室温处理10分钟。将树脂过滤，用二甲基甲酰胺(DMF)洗涤数次，并加入Fmoc酰氨基PEG4的活化溶液(预先通过将487.5mg 1.0mmol N-Fmoc酰氨基dPEG4酸(PeptidesInternational, Louisville, KY)溶解在2.0ml 0.5M DEPBT/DMF中并加入0.175ml 1mmol二异丙基乙胺来制备)。将反应物在室温混合约1小时。

将肽树脂过滤，用DMF洗涤，再用20%哌啶/DMF处理10分钟。将树脂过滤，用DMF洗涤数次，加入Fmoc Glu-OBzl的活化溶液(预先通过将470mg 1mmol的Fmoc Glu-γ-OBzl(Aapptec, Louisville, KY)溶解在2.0ml 0.5M DEPBT/DMF中并加入0.175ml 1mmol DIEA来制备)。将反应物在室温混合1小时。

将肽树脂再次过滤，用DMF洗涤，并用20%哌啶/DMF在室温处理10分钟。将树脂过滤，用DMF洗涤数次，加入棕榈酸的活化溶液(预先通过将256mg 1mmol棕榈酸(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)溶解在2.0 ml 0.5M DEPBT/DMF中并加入0.175ml DIEA来制备)。将反应物在室温混合1小时。

最后，将肽树脂过滤，用DMF洗涤，然后用二氯甲烷洗涤，并用50%TFA/DCM处理以除去N端Boc基团。1至2分钟后，将树脂过滤，用DMF洗涤数次，接着用5%DIEA/DCM溶液洗涤。将风干的肽树脂转移至HF反应容器，使用5ml液体氟化氢和0.5ml对甲酚清除剂进行HF切割。在冰浴中混合1小时后，在真空中除去HF，并将残余物悬浮于乙醚中。将肽/树脂混合物在烧结的玻璃漏斗中过滤，用乙醚洗涤，并快速风干。将肽萃取到10ml 50%乙酸水溶液中，通过HPLC(4.6x50mm Zorbax SB-C8，1ml/min，214nm，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/ 90%ACN，梯度=30%B至90%B历时10min)进行分析。将剩余的粗提物用水稀释三倍，上样至22.2x250mmAmberchrom XT20柱，利用TFA/ACN水溶液梯度进行纯化。将最初的纯化池在相同柱上再纯化，得到19mg产物，纯度为90%+。理论质量=5010.6, ESI观察到的质量为5008.0。

使用不同的N-Fmoc酰氨基dPEG酸重复相同的步骤。在一个实施例中，使用N-Fmoc酰氨基dPEG8酸(Peptides International, Louisville, KY)，在另一个实施例中，则使用N-Fmoc酰氨基dPEG2酸(Peptides International, Louisville, KY)。

肽二聚化-二硫化物二聚化

二硫化物二聚体肽的一个实例合成如下所述：

将0.28克(0.2mmol) mbha-树脂(Midwest Biotech)置于CSBio反应容器中，并在CSBio336肽合成仪上使用Boc氨基酸和DEPBT/DIEA活化的单偶联物组装下述序列。

将Boc保护的肽树脂转移至手动反应容器中，用20%哌啶/DMF在室温处理10分钟。将树脂过滤，用DMF彻底洗涤，然后用Fmoc Cys(Trt)的活化溶液(预先通过将1.17gm 2mmolFmoc Cys(Trt)-OH (Aapptec)溶解在4.0ml 0.5M DEPBT/DMF中并加入0.35ml 2mmol二异丙基乙胺来制备)进行酰化。将反应物在室温混合2小时，然后过滤，用DMF洗涤，并使用相同规程加入Fmoc Glu-OBzl，然后加入棕榈酸。

最后，将树脂过滤，用DMF洗涤，用二氯甲烷洗涤，用50%TFA/DCM处理1至2分钟。用5%DIEA/DCM中和后，将肽树脂转移至HF反应容器，使用10ml液体氟化氢和1ml对甲酚清除剂在冰浴中运行HF切割1小时。蒸发HF后，将残余物悬浮于乙醚中，并将肽和树脂在烧结的玻璃漏斗中过滤。用乙醚洗涤并快速风干后，将肽萃取到50%乙酸水溶液中。HPLC (4.6x50mmZorbax SB-C8，1ml/min，45℃，214nm，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/90%ACN，30%至90%B历时10min)分析后，将切割萃取物用水稀释三至四倍，上样至21.2x250mm Amberchrom XT20柱，使用TFA/乙腈水溶液梯度进行纯化。将纯化级分64-67合并，冷冻并低压冻干，得到58.7mg的材料，HPLC纯度是90%+。

DLS-027-97A理论分子量= 4866.48, ESI观察到的质量= 4864.0。

将18.6mg (3.8µmol)的上述肽溶解在2.0ml 3M胍/0.05M tris (pH8.5)中，并加入1ml二甲基亚砜。将反应物暴露于空气中在室温搅拌。6小时后，与起始肽相比的分析型HPLC显示更疏水性的峰的存在。

将反应混合物用20ml 0.1%TFA稀释，并上样至10x250mm Amberchrom XT20柱。使用0.1%TFA/乙腈梯度进行纯化，同时监测在220nm的UV吸光度。将级分68-72组合并低压冻干，得到5.5mg纯化的二聚体。

HPLC纯度是90%+。理论分子量=9743.99，MALDI观察到的质量= 9745.1. DLS-027-98B。

肽二聚化-硫醚二聚化

硫醚二聚体的一个实例合成如下所述：

将0.28克(0.2mmol) mbha-树脂(Midwest Biotech)置于反应容器中，并在CSBio336合成仪上用DEPBT/DIEA活化的单偶联物组装下述序列。

将三分之一的Boc保护的肽树脂转移至手动反应容器中，并用20%哌啶/DMF在室温处理10min。用DMF洗涤数次后，加入Boc Dap(Fmoc)的活化溶液(预先通过将426mg 1mmolBoc Dap(Fmoc)-OH (Chem-Impex)溶解在2.0ml 0.5M DEPBT/DMF中并加入0.175ml 1mmolDIEA来制备)。将反应物在室温混合2小时，过滤，用DMF洗涤，并如上文所述20%哌啶/DMF再处理。用DMF洗涤后，用溴乙酸的活化溶液(预先通过将139mg 1mmol溴乙酸(Aldrich)溶解在2.0ml 0.5M DEPBT/DMF中并加入0.175ml DIEA来制备)将树脂酰化。将反应物在室温混合1至2小时，然后过滤，将树脂用DMF洗涤，接着用DCM洗涤。将肽树脂用50%TFA/DCM在室温处理2分钟，然后过滤，用DCM洗涤，并用5%DIEA/DCM中和。将得到的肽树脂转移至HF反应容器，使用5ml液体氟化氢/0.5ml对甲酚进行HF切割。在冰浴中搅拌1小时后，蒸发HF，并将残余物悬浮于乙醚中。将树脂/肽混合物在烧结的玻璃漏斗中过滤，并用乙醚洗涤。将肽萃取到50%乙酸水溶液中，用HPLC分析粗产物：4.6x50mm Zorbax SB-C8, 1ml/min, 45℃,214nm, A=0.1%TFA, B=0.1%TFA/90%ACN, 梯度= 30%B至90%B历时10min。将切割萃取物上样至21.2x250mm Amberchrom XT20柱，使用TFA/乙腈水溶液梯度进行纯化，同时在220 nm监测UV吸光度。将级分48-53合并，冷冻并低压冻干，得到18mg具有K40(Dap-Br乙酰基)的SEQ ID NO: 89的肽，纯度=90%+。理论分子量= 4602.8，ESI观察到的质量= 4616.0。

将15mg (3.2µmol)上述K40(Dap-Br乙酰基)肽和15mg SEQ ID NO: 89 K40 (CysγE-C16)的肽溶解在3.0ml 7M脲/0.05M tris (pH8.6)中，在室温混合，同时通过HPLC监测反应进程。30分钟后，大部分起始材料的峰高减小，而新峰为主要组分。将反应混合物用25ml 0.1%TFA稀释，上样至10x250mm Amberchrom XT20柱进行纯化。运行TFA/乙腈水溶液梯度，同时在220 nm监测UV吸光度。将级分57-61合并，冷冻并低压冻干，得到7.1mg硫醚二聚体。HPLC纯度= 90%+，理论分子量=9401.4，MALDI观察到的质量= 9402.8。

肽聚乙二醇化

对于肽聚乙二醇化，在7M脲、50mM Tris-HCl缓冲液中，用将肽及PEG二者都溶解为澄清溶液所需的最小量溶剂(对于用2-3mg肽的反应，通常小于2mL)，使40 kDa甲氧基聚(乙二醇)碘乙酰胺(NOF)与1摩尔当量的肽反应。进行室温剧烈搅拌4-6小时，通过分析型RP-HPLC分析反应物。聚乙二醇化产物表现出与起始原料明显不同，其保留时间缩短。在VydacC4柱上用与初始肽纯化所用相似的条件进行纯化。在大约50:50的缓冲液比率进行洗脱。收集纯聚乙二醇化肽的级分并低压冻干。收率高于50%，其依每次反应不等。

使用质谱法的分析

用具有标准ESI离子源的Sciex API-III电喷射四极质谱仪获得质谱图。所用的电离条件如下：ESI处于正离子模式；离子喷雾电压, 3.9 kV；锥孔电压(orificepotential), 60 V。所用的雾化气和帘气是氮流速.9 L/min。记录质谱，从600-1800Thompsons在0.5 Th/步骤，2毫秒驻留时间。将样品(大约1mg/mL)溶于50%水性乙腈和1%乙酸并通过外部注射泵以5 μL/min的速率引入。

当通过ESI MS在PBS溶液中分析所述肽时，按照制造商提供的说明书(MilliporeCorporation, Billerica, MA, 参见Millipore互联网网址：millipore.com/catalogue.nsf/docs/C5737)，用含有0.6 μL C4树脂的ZipTip固相提取头先将它们脱盐。

高效液相色谱法(HPLC)分析：

使用高效液相色谱(HPLC)和MALDI分析，用这些粗制肽进行初步分析，得到其在磷酸缓冲盐水(PBS)缓冲液(pH, 7.2)中的相对转化率的近似值。将粗制肽样品以1 mg/ml浓度溶于PBS缓冲液。1 ml所得溶液贮存在1.5 ml HPLC管中，然后将其密封并在37℃保温。以不同时间间隔将100 μl的等分试样取出，冷却至室温并通过HPLC分析。

使用Beckman系统Gold色谱系统，使用紫外检测器在214 nm，进行HPLC分析。在150mm x 4.6 mm C18 Vydac柱上进行HPLC分析。流速为1 ml/min。溶剂A含有在蒸馏水中的0.1%TFA，溶剂B含有在90%CH3CN中的0.1%TFA。使用线性梯度(40%至70%B，在15分钟内)。使用Peak Simple色谱软件收集数据并分析。

起始水解速率用于分别测定相应前药的解离速率常数。分别根据前药和药物的峰面积，估计它们的浓度。通过绘制不同时间间隔下前药浓度的对数曲线图，求出前药的一阶解离速率常数。该曲线的斜率给出速率常数‘k’。然后通过用式t1/2=.693/k，计算各种前药降解的半衰期。

实施例2

以下提供了合成本公开内容的肽类似物的示例性方法。

使用Fmoc策略合成胰高血糖素材料的肽片段：

除非另有说明，将所有肽酰胺化，并在Tentagel S RAM-Rink树脂, (90um；0.26mmol/g的负载)上合成。Fmoc保护的氨基酸和树脂购自Novabiochem。在CS Bio CS136XT肽合成仪上进行固相肽合成。

肽合成(Fmoc策略)：

通过向混合容器中连续加入氨基酸溶液(在NMP中的0.33Mol/l，含有0.05Mol/lHOBt)，构建合成的肽。具体地，使用单偶联的COMU/DIPEA活化(4当量氨基酸、4当量COMU、8当量DIPEA)进行合成。在偶联步骤结束时(在室温静置时间30 min)，将肽基-树脂用哌啶-溶液(40%的在DMF中的溶液，1x10min + 2x 5min)处理以除去N-端Fmoc-保护基。将树脂用二甲基甲酰胺(DMF)重复洗涤，并将该合成循环重复期望数目的偶联步骤。通过将肽基-树脂用过量的18当量乙酸酐/DIPEA在DMF中的溶液在室温处理30 min，制备N-加帽的肽。

酰化的肽

为了连接酰化基团(eg C16)，使用如上所述的标准条件，将Dde-Lys(Fmoc)-OH引入至肽序列的期望位置。在定量偶联后，将Fmoc基团用DBU/DMF除去(2%处理3 x 3min连续流，用DMF重复洗涤，将该规程重复5次)。使用如上所述的偶联条件，完成酰化基团的偶联。在酰化基团的定量偶联以后，将N-端Dde保护基用在2%DMF中的20%肼一水合物(64%)除去(5x 3min，连续流，用DMF重复洗涤)。如上所述进行剩余的偶联步骤。

肽切割和去保护

在整个合成结束时，将肽基-树脂用二氯甲烷(DCM)洗涤，并使用试剂K (TFA/茴香硫醚/水/苯酚/TIS - 82.5/5/5/5/2.5)在室温2h从树脂切割肽，通常产生大约250 mg (~50%收率)粗制的去保护的肽。

具体地，将肽基-树脂(30-200mg)置于烧结筒中，然后加入试剂K (对于1.2g树脂，~20ml)，并将树脂在室温搅拌2h。滤出液体以后，将树脂用5ml试剂K冲洗，并用3ml DCM冲洗2次。将产物用冷乙醚沉淀。将混悬液离心，将液体滤出，并将粗制的肽再溶解在水/ACN中，并冷冻干燥，得到约250 mg (~50%收率)粗制的肽。

在下述条件下进行粗制的肽的分析型HPLC分析：

HPLC柱4.6 X 150mm Poroshell 120 SB-C18；

洗脱液系统：缓冲液：A：0.1%三氟乙酸(TFA)/10%丙烯腈/90%水；缓冲液B：0.1%TFA/10%水/90%CAN；梯度：5-100%B历时30分钟。

使用16 X 150mm Dr. Maisch Reprosil Gold 120 C18, 5um, 制备型反相柱，通过制备型HPLC纯化粗制的肽，并使用与在分析系统上相同的流动相，以历时190分钟的5-100%B梯度和1.80ml/min的流速进行洗脱。LC/MS分析得到的级分以后，将纯样品合并和冷冻干燥，得到白色粉末。

实施例3

本实施例描述了试验本公开内容的肽的生物活性的一种示例性方法，所述方法包括测定cAMP合成。

在基于荧火虫萤光素酶的报导基因测定中，测量胰高血糖素类似物的诱导cAMP的能力。通过在补充了0.25%牛生长血清(Hyclone, Logan, UT)的DMEM (Invitrogen,Carlsbad, CA)中培养16小时，将用受体(胰高血糖素受体、GLP-1受体或GIP受体)和连接至cAMP反应元件的萤光素酶基因共转染的HEK293细胞剥夺血清，然后与胰高血糖素、GLP-1、GIP或新颖的胰高血糖素类似物的系列稀释物一起在96孔聚D-赖氨酸包被的“Biocoat”平板(BD Biosciences, San Jose, CA)中、在37℃、5%CO₂温育5小时。在温育结束时，将100微升LucLite发光底物试剂(Perkin-Elmer, Wellesley, MA)添加至各孔。短暂地摇动板，在暗处温育10分钟，并在MicroBeta-1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer, Wellesley, MA)上测量光输出。使用Origin软件(OriginLab, Northampton, MA)计算有效的50%浓度(EC₅₀)。

实施例4

本实施例描述了测定本公开内容的肽的稳定性的一种示例性方法。

将各个胰高血糖素类似物溶解在水或PBS中，并进行初始HPLC分析。调整pH (4、5、6、7)后，将样品在37℃温育一段规定时间，并通过HPLC再分析以确定肽的完整性。测定目的具体肽的浓度，并且相对于初始分析计算剩余完整百分比。

实施例5

本实施例描述了测定肽的溶解度的一种示例性方法。

在0.01N HCl中制备胰高血糖素(或类似物)的溶液(1mg/ml或3mg/ml)。用0.01NHCl将100 μl的储备溶液稀释至1ml，并确定UV吸光度(276nm)。使用200-250ul 0.1MNa₂HPO₄ (pH9.2)将剩余储备溶液的pH调至7。将溶液在4℃静置过夜，然后离心。用0.01NHCl将100 μl的上清液稀释至1ml，并测定UV吸光度(一式两份)。

因体积增加而补偿初始吸光度值，并使用下列计算来建立溶解度百分比：

。

实施例6

本实施例描述了测定肽与受体的结合的一种示例性方法。

利用闪烁迫近测定技术，在竞争结合测定中测量肽对胰高血糖素受体的亲和力。将在闪烁迫近测定缓冲液(0.05 M Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M NaCl, 0.1%w/v牛血清白蛋白)中制备的肽的连续3倍稀释液在白色/透明底平板(Corning Inc., Acton, MA)中与以下物质混合：0.05 nM (3-[¹²⁵I]-碘酪氨酰) Tyr10胰高血糖素(Amersham Biosciences,Piscataway, NJ) (1-6微克/孔)，从过表达人胰高血糖素受体的细胞制备的质膜片段，以及1 mg/孔的聚乙烯亚胺处理过的麦胚A型凝集素闪烁迫近测定珠子(AmershamBiosciences, Piscataway, NJ)。在旋转振荡器上在800 rpm振荡5分钟后，将平板在室温温育12小时，然后在MicroBeta1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer, Wellesley, MA)上读取。测量孔中非特异性结合(NSB)放射性，“冷”天然配体的浓度比试验样品中的最高浓度高4倍，并且在没有竞争物的孔中检测总结合放射性。如下计算特异性结合百分比：%特异性结合=((结合-NSB)/(总结合-NSB))×100。使用Origin软件(OriginLab, Northampton, MA)确定IC₅₀值。

实施例7

基本上如在实施例1或实施例2中所述合成SEQ ID NO: 37的肽的类似物，并基本上如在实施例3中所述在体外试验对GLP-1受体、胰高血糖素受体和GIP受体中的每一种的激动剂活性。

在表1中提供了对GLP-1受体(GLP-1R)、胰高血糖素受体(GR)和GIP受体(GIPR)的EC50。

实施例8

通过给DIO小鼠注射10 nmol/kg肽或媒介物对照，评价表1的选定肽的体内作用。即，将每周3次(在星期一、星期三和星期五)SEQ ID NO: 10、12、15、16、22或37的肽或媒介物对照施用给小鼠，持续2周。给小鼠提供致糖尿病的饮食，每个小鼠组含有8只动物/组。平均体重为~50 g，小鼠为~ 6个月龄的雄性。

在将肽或媒介物对照施用给小鼠的当天，测量体重和食物摄入。在第0、7和14天，分析身体组成。在第0、7和14天每周1次地测量禁食血糖水平。得自该研究的数据显示在图1-4中。

如在图1中所示，所有肽造成7天后至少10%的体重下降。注射所述肽之一的小鼠的总食物摄入是在注射媒介物对照的小鼠的总食物摄入的50%至60%之间(参见图2)。与注射媒介物对照的小鼠相比，对于每组施用肽的小鼠，脂肪量减少(图3)。如在图4中所示，与媒介物对照小鼠相比，注射肽的小鼠表现出降低的血糖水平。

实施例9

基本上如在实施例1或实施例2中所述，合成SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12的肽的类似物。基本上如在实施例3中所述，在体外试验所述类似物对胰高血糖素受体、GLP-1受体和GIP受体中的每一种的激动剂活性。

在表2和3中提供了对胰高血糖素受体(GR)、GLP-1受体(GLP-1R)和GIP受体(GIPR)的EC50。

实施例10

通过给~11-周龄雄性糖尿病db/db小鼠施用媒介物对照、或10 nmol/kg肽、或30nmol/kg利拉糖肽的单次皮下注射，评价表1-3的选定肽的体内作用。允许小鼠随意接近食物饮食和水。在施用处理之前2小时，将小鼠根据它们的进食葡萄糖水平(平均~ 23 mM葡萄糖)和体重(平均~ 45 g)分成组(n = 6/组)。

在用媒介物或肽或利拉糖肽处理后24小时，测量小鼠的进食葡萄糖特性。如在图6中所示，许多肽的施用造成血糖水平的显著下降，而媒介物和利拉糖肽没有改变血糖水平。SEQ ID NO: 12、17、18、23、29、142和143的肽造成大于基线进食葡萄糖水平的50%的下降。

在本文中引用的所有参考文献（包括出版物、专利申请和专利）特此通过引用并入，达到与个别地且明确地指出每篇参考文献通过引用并入并且在本文中完全阐述相同的程度。

术语“一个”和”一种”和”所述”和类似指示物在描述本发明的上下文中(特别是在下述权利要求中)的使用应当解释为覆盖单数和复数，除非在本文中另外指出或与上下文明显矛盾。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应当解释为末端开放的术语(即，意指“包括、但不限于”)。

除非在本文中另外指出，否则本文中数值范围的列举仅意图充当对每个落入所述范围内的单独值及每个端点的单独提及的速记方法，并且将每个单独值及每个端点并入本说明书中，如同在本文中单独列举一样。

可以以任意合适的次序执行本文描述的所有方法，除非在本文中另外指出或以其它方式与上下文明显矛盾。本文提供的任意和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用，仅仅意图更好地阐释本发明，且不构成对本发明范围的限制，除非另有声明。在说明书中的语言不应解释为，指示任何没有声明的要素是实践本发明所必需的。

本文描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。本领域普通技术人员在阅读前述描述以后，那些优选实施方案的变化可以变得显而易见。发明人预见到技术人员会根据需要采用这样的变体，并且本发明的发明人会以不同于本文具体描述的方式实现。因此，本发明包括适用法律允许的、所附权利要求阐明的主题的所有改进方案和等同方案。此外，本发明包括上述元件以其所有可能变化的任意组合，除非本文另外指明或者以其它方式与上下文明显矛盾。

Claims

1.一种肽，其由选自SEQ ID NO: 11-16、22-23、27、155、157、159-160、142、143、146、148-153中任一个的序列组成。

2.权利要求1的肽，其由SEQ ID NO: 11的序列组成。

3.权利要求1的肽，其由SEQ ID NO: 12的序列组成。

4.权利要求1的肽，其由SEQ ID NO: 13的序列组成。

5.权利要求1的肽，其由SEQ ID NO: 15的序列组成。

6.权利要求1的肽，其由SEQ ID NO: 16的序列组成。

7.权利要求1的肽，其由SEQ ID NO: 22的序列组成。

8.一种药物组合物，其包含权利要求1-7中的任一项所述的肽、或它们的组合、以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

9.权利要求1-7中的任一项所述的肽，其用于在有需要的对象中减少重量增加或诱导重量减轻。

10.权利要求1-7中的任一项所述的肽在制备用于减少重量增加或诱导重量减轻的药物中的用途。

11.权利要求8所述的药物组合物在制备用于减少重量增加或诱导重量减轻的药物中的用途。

12.权利要求1-7中的任一项所述的肽，其用于治疗糖尿病。

13.权利要求1-7中的任一项所述的肽在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。

14.权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗有需要的对象的糖尿病的药物中的用途。