CN105324125A - 具有长效的前体药物 - Google Patents

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CN105324125A CN201480025780.3A CN201480025780A CN105324125A CN 105324125 A CN105324125 A CN 105324125A CN 201480025780 A CN201480025780 A CN 201480025780A CN 105324125 A CN105324125 A CN 105324125A
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Abstract

提供相比于亲本肽或多肽展示延长的血清中的半衰期和体内长效的生物活性肽（或多肽）的前体药物衍生物。在一些实施方案中，肽选自胰高血糖素、毒蜥外泌肽-4、GLP-1、GLP-2、GIP、血管活性肠肽（VIP）、垂体腺苷酸环化酶激活多肽27(PACAP-27)、肽组氨酸甲硫氨酸（PHM）、胃泌酸调节素、胰泌素、骨钙蛋白、生长激素释放激素以及类似物、衍生物和缀合物。

Description

具有长效的前体药物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/792,459的优先权权益，其以其整体通过引用并入。
通过引用电子提交材料并入
在此同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表以其整体通过引用并入，并且标识如下：创建于2014年3月14日命名为“229199_序列表.txt,”的一个1,690,541字节的ASCII (文本)文件。
背景
基于肽的药物是具有相对短的作用持续时间和变化治疗指数的高效药物。本公开涉及基于肽的前体药物，其中前体药物衍生物展示长效。
概述
提供相比于亲本肽或多肽展示延长的血清中的半衰期和体内长效的生物活性肽（或多肽）的前体药物衍生物。在一些实施方案中，肽选自胰高血糖素、毒蜥外泌肽-4、GLP-1、GLP-2、GIP、血管活性肠肽（VIP）、垂体腺苷酸环化酶激活多肽27 (PACAP-27)、肽组氨酸甲硫氨酸（PHM）、胃泌酸调节素、胰泌素、骨钙蛋白、生长激素释放激素以及类似物、衍生物和缀合物。前体药物衍生物包括（a）经酰胺键共价连接至生物活性多肽的自切割二肽前体药物单元，和（b）连接至二肽前体药物单元的酰基或烷基，包括脂肪酸、胆酸或胆汁酸的类固醇部分，其优选长度为至少16、18或20个碳。优选地，二肽在干扰生物活性多肽与其相应受体或辅因子相互作用的能力的位置处共价结合至所述生物活性多肽。在生理条件下和在酶促活性不存在的情况下，随后的自切割和去除二肽，恢复多肽的完全活性。
本公开提供包含以下结构的前体药物：
A-B-Q；
其中Q为胰高血糖素超家族肽或其他生物活性肽或多肽；
A是氨基酸，任选D氨基酸，共价连接至长度至少16个碳（例如至少C16、C18或C20，或长度范围为C16至C30，或C20至C28）的酰基或烷基（包括脂肪酸、胆酸或胆汁酸的类固醇部分）；和
B为通过在A-B和Q的包含 (C1-C8烷基)NH2侧链的残基之间形成酰胺键连接至Q的N-烷基化氨基酸。
在一些实施方案中，氨基酸B的N烷基化基团为C1-C18烷基，并且在一些实施方案中，为C1-C6烷基。
已经显示该结构的前体药物可以展示在磷酸缓冲盐溶液或血清中，在生理条件下，至少约3天、至少约5天、或3-10天、或5-10天、或3-7天或5-8天的延长的A-B从Q的切割半衰期。本文数据显示该延长的体外半衰期与延长的体内半衰期相关。
因此，本公开还提供施用本公开的前体药物的方法，例如，其涉及一周两次或优选每周一次或每两周一次施用。此类前体药物优选肠胃外施用，例如静脉内、皮下、皮内或肺内。
在本公开的一个方面，提供包含以下结构的前体药物：
A-B-Q；
其中Q为胰高血糖素超家族肽；
A为氨基酸，任选D氨基酸，其共价连接至C16-C30酰基或C16-C30烷基；和
B为通过在A-B和Q的包含 (C1-C8烷基)NH2侧链的残基之间的酰胺键连接至Q的N-烷基化氨基酸。
在一些或任何实施方案中，在生理条件下在血清中A-B从Q的切割半衰期为至少约3天、至少约5天、或约3天至约10天、或约5天至约10天、或约3天至约7天、或约5天至约8天。
在一些或任何实施方案中，Q的包含(C1-C8烷基)NH2侧链的残基位于对应于天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 701)的位置1、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、28、或29的位置、或在Q的C末端最后5个氨基酸之一处。
在一些或任何实施方案中，A-B包含以下结构：
其中
R1和R2独立地选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OR9、(C1-C18烷基)SR9、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONHR9、(C1-C4烷基)COOR9、(C1-C4烷基)NHR9、(C1-C4烷基)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)、和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2连同它们连接的原子形成C3-C12环烷基或芳基；
R4和R8独立地选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)、和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R4和R8连同它们连接的原子形成C3-C6环烷基；
R3是C1-C18烷基或R4和R3连同它们连接的原子形成4、5或6元杂环；
R5是NHR6或NHR9；
R6是H、C1-C8烷基或R6和R2连同它们连接的原子形成4、5或6元杂环；
R7选自H、OR9、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONHR9、(C0-C4烷基)COOR9、(C0-C4烷基)NHR9、(C0-C4烷基)OR9、和卤素；和
R9选自H、C16-C30酰基、和C16-C30烷基。
在一些或任何实施方案中，R1和R8独立地为H或C1-C8烷基。
在一些或任何实施方案中，R4选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)、和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R4和R8连同它们连接的原子形成C3-C6环烷基。
在一些或任何实施方案中，R3是C1-C8烷基或R4和R3连同它们连接的原子形成4、5或6元杂环。
在一些或任何实施方案中，R3是C1-C8烷基。
在一些或任何实施方案中，R2选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OR9、(C1-C4烷基)SR9、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONHR9、(C1-C4烷基)COOR9、(C1-C4烷基)NHR9、(C1-C4烷基)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)、和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2连同它们连接的原子形成C3-C12环烷基或芳基。
在一些或任何实施方案中，R2选自(C1-C4烷基)OR9、(C1-C4烷基)SR9、(C1-C4烷基)CONHR9、(C1-C4烷基)COOR9、(C1-C4烷基)NHR9、和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；且R7选自OR9、(C0-C4烷基)CONHR9、(C0-C4烷基)COOR9、(C0-C4烷基)NHR9、和(C0-C4烷基)OR9。
在一些或任何实施方案中，R5是NHR6。
在一些或任何实施方案中，R1、R4和R8独立地选自H和C1-C18烷基、或者R4和R8连同它们连接的原子形成C3-C6环烷基；R2选自(C1-C18烷基)OR9、(C1-C18烷基)SR9、(C1-C4烷基)CONHR9、(C1-C4烷基)COOR9、(C1-C4烷基)NHR9、和 (C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；R6为H或C1-C8烷基；且R7选自OR9、(C0-C4烷基)CONHR9、(C0-C4烷基)COOR9、(C0-C4烷基)NHR9、和(C0-C4烷基)OR9。
在一些或任何实施方案中，R1、R4和R8独立地选自H和C1-C8烷基、或者R4和R8连同它们连接的原子形成C3-C6环烷基；R2选自(C1-C8烷基)OR9、(C1-C8烷基)SR9、(C1-C4烷基)CONHR9、(C1-C4烷基)COOR9、(C1-C4烷基)NHR9、和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；且R3为C1-C8烷基或R4和R3连同它们连接的原子形成4、5或6元杂环。
在一些或任何实施方案中，R2选自(C1-C8烷基)OR9、(C1-C8烷基)SR9和(C1-C4烷基)NHR9；且R3为C1-C8烷基或R4和R3连同它们连接的原子形成4、5或6元杂环。
在一些或任何实施方案中，R2是(C1-C4烷基)NHR9；且R3是C1-C8烷基或R4和R3连同它们连接的原子形成4、5或6元杂环。
在一些或任何实施方案中，R1、R4和R8为H；且R3为C1-C8烷基。
在一些或任何实施方案中，R5是NHR6；且R9选自C16-C30酰基和C16-C30烷基。
在一些或任何实施方案中，R1、R4和R8为H；R2为(C1-C4烷基)NHR9；R3为C1-C8烷基；R5为NHR6；R6为H或C1-C8烷基；且R9选自C16-C30酰基和C16-C30烷基。
在一些或任何实施方案中，R9选自C20-C28酰基和C20-C28烷基。
在一些或任何实施方案中，R2为(CH2)4NHR9；R3为CH3；R5为NH2；且R9为C20-C28酰基。
在一些或任何实施方案中，R2选自(CH2)4NHCO(CH2)16CH3和(CH2)4NHCO(CH2)20CH3。
在一些或任何实施方案中，A-B连接至Q的包含(C2-C4烷基)NH2侧链的残基。
在一些或任何实施方案中，A-B连接至Q的作为赖氨酸残基的残基。
在一些或任何实施方案中，A为D氨基酸。
在一些或任何实施方案中，Q为胰高血糖素超家族肽。例如，Q为胰高血糖素相关肽、生长激素释放激素(GHRH；SEQ ID NO: 719)、血管活性肠肽(VIP；SEQ ID NO: 720)、垂体腺苷酸环化酶激活多肽27 (PACAP-27；SEQ ID NO: 721)、肽组氨酸甲硫氨酸(PHM；SEQ ID NO: 722)或胰泌素(SEQ ID NO: 723)和/或其类似物、衍生物和缀合物。在一些实施方案中，类似物包含与天然肽的对应序列至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，作为胰高血糖素相关肽的Q包含与天然胰高血糖素、天然胃泌酸调节素、天然毒蜥外泌肽-4、天然(7-37)GLP-1、天然GLP-2、或天然GIP的对应序列在天然肽的长度上（或在对应于胰高血糖素的位置上，参见例如图10）至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列。在其他实施方案中，胰高血糖素超家族肽（Q）包含具有高至1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰的天然胰高血糖素、天然毒蜥外泌肽-4、天然(7-37)GLP-1、天然GLP-2、天然GHRH、天然VIP、天然PACAP-27、天然PHM、天然胃泌酸调节素、天然胰泌素、或天然GIP的氨基酸序列。在仍进一步的实施方案中，Q包含作为两个或多个天然胰高血糖素相关肽序列的嵌合体的氨基酸序列。在一些实施方案中，Q包含保留对应于SEQ ID NO: 701的氨基酸12-29的氨基酸的α螺旋构象的与天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 701)至少约50％相同的氨基酸序列。
胰高血糖素超家族肽可以具有共同结构特征，包括但不限于在N末端氨基酸内的同源性和/或C末端部分内的α螺旋结构。据信C末端通常在受体结合中起作用，并且N末端通常在受体信号传递中起作用。N末端部分和C末端部分中的几个氨基酸在胰高血糖素超家族的成员中高度保守，例如His1、Gly4、Phe6、Phe22、Val23、Trp25、和Leu26，其中在这些位置的氨基酸显示在氨基酸侧链中的同一性、保守取代或相似性。
Q可以是本领域已知的任何胰高血糖素超家族肽，包括例如如本领域已知的任何胰高血糖素相关肽，其中一些在本文通过非限制性实例方式公开。多种GLP-1类似物是本领域已知的并且是根据本发明的胰高血糖素相关肽，参见例如WO 2008023050、WO 2007030519、WO 2005058954、WO 2003011892、WO 2007046834、WO 2006134340、WO 2006124529、WO 2004022004、WO 2003018516、WO 2007124461，其各自以其整体对于GLP-1类似物或衍生物的其序列或式公开的每一个通过引用并入本文。在一些或任何实施方案中，Q为如本文详述的第1、2、3、4、5或6类胰高血糖素相关肽。在任何本文描述的实施方案中，Q为以下的任一种：SEQ ID NOs: 1-684、701-742、801-919、1001-1262、1301-1371、1401-1518、1701-1776、1801-1908、2001-2565和3001-3262、3325-3328、或其相对于这些SEQ ID NO中任一者具有高至1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰的类似物。
尽管二肽前体药物例如A-B可以在任何干扰Q的活性的位置处连接至Q，但本文公开的实施方案表明适合于A-B连接的位置的实例。当位置编号在本文通过参考天然胰高血糖素序列(SEQ ID NO:701)的位置进行命名时，胰高血糖素类似物或其他胰高血糖素超家族肽中的相应位置可以通过比对来确定。参见例如图6，其显示某些胰高血糖素超家族肽的比对。例如，基于天然胰高血糖素的位置24对应于 (7-37) GLP-1的位置24。
在某些实施方案中，胰高血糖素超家族肽可以包含C末端或包括但不限于以下的C末端氨基酸序列：COOH、CONH2、GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 710)、GPSSGAPPPS-CONH2 (SEQ ID NO: 711)，胃泌酸调节素羧基末端延伸序列、KRNRNNIA (SEQ ID NO: 714)或KGKKNDWKHNITQ (SEQ ID NO: 713)。此外，胰高血糖素超家族肽的C末端氨基酸序列进一步在下文详述。
在其他方面，Q包含骨钙蛋白(SEQ ID NO:709)、或与天然骨钙蛋白在天然肽的长度上至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列。Q可以包含相对于天然骨钙蛋白具有高至1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰的骨钙蛋白的类似物。在仍其他方面，Q包含生长激素释放激素 (GHRH) (SEQ ID NO:719)、或与天然GHRH在天然肽的长度上至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%相同的氨基酸序列。Q可以包含相对于天然GHRH具有高至1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰的GHRH的类似物。在一些实施方案中，Q可以是本领域已知的骨钙蛋白或GHRH的任何类似物。
在一些实施方案中，仅一个前体药物部分连接至Q。例如，在此类实施方案中，当前体药物部分(A-B)在N末端连接至Q，则不存在在Q的序列中连接至内部氨基酸的前体药物部分(A-B)，并且反之亦然。在一些实施方案中，两个或三个前体药物部分连接至Q，例如在N末端和在一个或多个内部位点。
本公开还提供肽前体药物，其包含以下、或由以下组成：任何的SEQ ID NOs:3272-3275、3288-3291、3305-3316、3329、3333、3335、3336或3337。本公开还提供以下这些任一种的类似物：SEQ ID NOs:3272-3275、3288-3291、3305-3316、3329、3333、3335、3336或3337，其具有1、2、或3个氨基酸取代，例如保守氨基酸取代，1、2或3个氨基酸缺失，1、2或3个肽内部的氨基酸插入，和/或1-21个添加至N末端或C末端的氨基酸，优选相对于亲本序列全体总共高至3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
本公开进一步提供肽前体药物，其包含以下、或由以下组成：任何的SEQ ID NOs:3272-3292、3298-3300、3305-3316、3329-3337，或相对于亲本序列具有高至3、4、5、6、7、8、9或10个修饰的其类似物。
附图简述
图1是显示本发明的肽的合成的图示。试剂：(a) 肌氨酸(Sacrosine)、DEPBT、DIEA (5当量)、DMF、r.t.、1 h；(b) TFA、r.t.,1min；(c) Boc-dLys(Fmoc)、DEPBT、DIEA (5当量)、DMF、r.t.、过夜；(d) 20% 哌啶/DMF、r.t.、30min；(e) 硬脂酸、DEPBT、DIEA 5 (当量)、50%DMF/DCM、r.t.、过夜；(f) TFA、r.t.,1min；(g) 5% 苯甲醚/HF、0℃、1 h。通过使用PAM树脂用Boc固相肽策略合成前体药物。将肌氨酸偶联至结合树脂的肽1，以生成结合树脂的化合物2，随后用TFA处理并用Boc-dLys(Fmoc)偶联，以得到结合树脂的化合物3。随后，用DMF中的20％哌啶处理并与脂肪酸偶联以获得最终的结合树脂的前体药物4。用TFA处理4以去除N末端上t-Boc基团。最后，通过氢氟酸（HF）从支持物切割结合树脂的化合物4生成前体药物5。
图2是显示腹膜内注射有单一剂量的10或50 nmol/kg的肽F、肽D、具有C18酰化的二肽前体药物部分的肽D、具有在位置10直接连接4-氨基苯丙氨酸的C18酰化赖氨酸残基的肽D的膳食诱导的肥胖（DIO）小鼠中的体重变化的图。
图3A是显示腹膜内注射有单一剂量的10 nmol/kg的肽D、具有C18酰化的二肽前体药物部分的肽D、具有在位置10直接连接4-氨基苯丙氨酸的C18酰化赖氨酸残基的肽D、具有C20酰化的二肽前体药物部分的肽D、具有在位置10直接连接4-氨基苯丙氨酸的C20酰化的赖氨酸残基的肽D、具有C22酰化的二肽前体药物部分的肽D、和具有在位置10直接连接4-氨基苯丙氨酸的C22酰化的赖氨酸残基的肽D的膳食诱导的肥胖（DIO）小鼠中的体重变化的图。图3B是显示图3A的小鼠的体重中百分比总体变化的图。
图4A是显示每日腹膜内注射有单一剂量的3或10 nmol/kg的肽D、具有C22酰化的二肽前体药物部分的肽D、和具有在位置10直接连接4-氨基苯丙氨酸的C22酰化赖氨酸残基的肽D持续5天的膳食诱导的肥胖（DIO）小鼠中的体重变化的图。图4B是显示图4A的小鼠的体重中百分比总体变化的图。
图5是显示腹膜内注射有在第0天的单一剂量的40 nmol/kg、在第0天和第2天的单一剂量20 nmol/kg、或在第0、1、2和3天的单一剂量的10 nmol/kg的肽D或具有C22酰化二肽前体药物部分的肽D的膳食诱导的肥胖（DIO）小鼠中的体重变化的图。
图6是胰高血糖素超家族肽的比对。当通过参考天然胰高血糖素序列(SEQ ID NO:701)中的位置在本文命名位置编号时，胰高血糖素类似物或其他胰高血糖素超家族肽中的相应位置可以通过比对来确定。
详细描述
定义
在描述和要求保护本发明中，以下术语将根据下文描述的定义进行使用。
如本文所用，术语“前体药物”定义为在展示其完全药理学作用前经历化学修饰的任何化合物。
如本文所用，术语“氨基酸”涵盖含有氨基和羧基官能团（其中氨基和羧基连接至相同碳(α碳)）的任何分子。α碳任选可以具有一种或两种其他有机取代基。氨基酸可以通过其三字母代码、一字母代码、或者在一些情况中通过其侧链的名称来指代。例如，包含连接至α碳的环己烷基团的非天然氨基酸命名为“环己烷(cyclohexane)”或“环己基(cyclohexyl)”。对本公开的目的，未说明其立体化学的氨基酸的指代旨在涵盖氨基酸的L或D型，或外消旋混合物。然而，在其中氨基酸通过三字母代码指代且包括上标编号（即Lys-1）的情况下，此类指代旨在说明氨基酸的天然L型，而D型将通过包括在三字母代码前的小写d和上标编号（即dLys-1）来说明。
如本文所用，术语“羟基酸”指已修饰以用羟基代替α碳氨基的氨基酸。
如本文所用，术语“非编码氨基酸”涵盖不是以下20种氨基酸的任一种的L异构体的任何氨基酸：Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr。
“二肽”是通过肽键一个α氨基酸或α羟基酸连接至另一个氨基酸的结果。
如本文所用，不存在任何进一步指示的术语“化学切割”涵盖导致共价化学键断裂的非酶促反应。
“生物活性多肽”指能够体外和/或体内行使生物效应的多肽。
如本文所用，“酰化的”氨基酸是包含酰基的氨基酸，所述酰基对于天然存在的氨基酸是非天然的，而与其产生所借助的方法无关。生产酰化的氨基酸和酰化的肽的示例性方法是本领域已知的并且包括将氨基酸酰化随后包括在肽中或肽合成，随后为肽的化学酰化。
如本文所用，“烷基化的”氨基酸是包含烷基的氨基酸，所述酰基对于天然存在的氨基酸是非天然的，而与其产生所借助的方法无关。生产烷基化的氨基酸和烷基化的肽的示例性方法是本领域已知的并且包括将氨基酸烷基化随后包括在肽中或肽合成，随后为肽的化学烷基化。
如本文所用，对肽的一般引用旨在涵盖具有经修饰的氨基和羧基末端的肽。例如，指定标准氨基酸的氨基酸序列旨在涵盖在N末端和C末端的标准氨基酸以及在N末端的相应羟基酸和/或经修饰以包含酰胺基替代末端羧酸的相应的C末端氨基酸。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何标准的药物载体，诸如磷酸缓冲盐溶液、水、乳状液诸如油/水或水/油，和各种形式的湿润剂。该术语还涵盖由美国联邦政府的监管机构批准的或列于美国药典中用于动物（包括人）的任何试剂。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指保留亲本化合物的生物活性并且不是生物学上或其他方面上为不想要的化合物的盐。许多本文公开的化合物能够借助于氨基和/或羧基或与其相似的基团的存在而形成酸和/或碱盐。
药学上可接受的碱加成盐可以从无机和有机碱来制备。来源于无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐和镁盐。来源于有机碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺的盐。
药学上可接受的酸加成盐可以从无机和有机酸来制备。来源于无机酸的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。来源于有机酸的盐包括乙酸、丙酸、羟乙酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
如本文所用，术语“治疗”包括特定病症或病况的预防、或与特定病症或病况相关症状的减轻和/或预防或消除所述症状。例如，如本文所用，术语“治疗糖尿病”将一般指维持血糖水平接近正常水平并且可以包括根据给定情形增加或降低血糖水平。
如本文所用，前体药物的“有效”量或“治疗有效量”指前体药物提供期望效果的无毒但足够的量。例如，一种期望效果将是预防或治疗高血糖。“有效的”量将在主体与主体之间不同，取决于个体的年龄和一般情况、施用方式等等。因此，无法总是可以说明准确的“有效量”。然而，在任何单独情况中的合适的“有效”量可以由本领域普通技术人员使用常规实验来确定。
术语“肠胃外”意指不经过消化道而是通过一些其他途径诸如皮下、肌内、脊柱内或静脉内。
如本文所用的术语“同一性”涉及两个或多个序列之间的相似性。同一性通过将相同残基的数目除以残基总数并将结果乘以100以得到百分比来测量。因此，完全相同序列的两个拷贝具有100％的同一性，而具有氨基酸缺失、添加或取代的两个序列相对于彼此具有较低的同一性程度。本领域技术人员将认识到几种计算机程度诸如采用算法诸如BLAST (Basic Local Alignment Search Tool、Altschul 等人 (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410)的那些程序可用于测定序列同一性。
术语“胰高血糖素相关肽”指在胰高血糖素GLP-1、GLP-2和GIP受体任何一个或多个具有生物活性（作为激动剂或拮抗剂）并且包含与天然胰高血糖素、天然胃泌酸调节素、天然毒蜥外泌肽-4、天然GLP-1、天然GLP-2、或天然GIP中至少一个具有至少40％序列同一性（例如45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%）的氨基酸序列的那些肽。除非另有说明，任何提及胰高血糖素相关肽中的氨基酸位置（例如对于前体药物部分、缀合物部分、亲水聚合物的连接、酰基化或烷基化）均指相对于天然胰高血糖素氨基酸序列(SEQ ID NO: 701)的位置。
术语“胰高血糖素超家族肽”指一组涉及其N末端和C末端区域中结构的肽（例如参见Sherwood 等人，Endocrine Reviews 21:619-670 (2000))。该组中的成员包括所有胰高血糖素相关肽以及生长激素释放激素(GHRH；SEQ ID NO: 719)、血管活性肠肽(VIP；SEQ ID NO: 720)、垂体腺苷酸环化酶激活多肽27 (PACAP-27；SEQ ID NO: 721)、肽组氨酸异亮氨酸(PHI)、肽组氨酸甲硫氨酸(PHM；SEQ ID NO: 722)、胰泌素(SEQ ID NO: 723)和相对于天然肽具有高至1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸修饰的类似物、衍生物或缀合物。此类肽优选保留与胰高血糖素受体超家族的受体相互作用（激动剂或拮抗剂）的能力。除非另有说明，任何提及胰高血糖素超家族肽中的氨基酸位置（例如对于前体药物部分、缀合物部分、亲水聚合物的连接、酰基化或烷基化）均指相对于天然胰高血糖素氨基酸序列(SEQ ID NO: 701)的位置，参见图10的代表性胰高血糖素超家族肽的比对。
术语“GLP-1激动剂”指刺激GLP-1受体活性的化合物，如通过cAMP产生所测定的，其使用经验证的体外模型测定，诸如描述于2007年5月18日公开的经公开的国际申请号WO 2007/056362的实施例13的测定，所述公开内容在此明确地通过引用并入本文申请中。
如本文用，术语“天然GLP-1”是指GLP-1(7-36)酰胺（由SEQ ID NO: 704的序列组成）、GLP-1(7-37)酸（由SEQ ID NO: 703的序列组成）或这两种化合物的混合物的上位概念。如本文所用，在不存在任何进一步的指定情况下一般提及“GLP-1”均旨在意指天然GLP-1。
如本文所用，术语“胰高血糖素肽”是指定SEQ ID NO: 701的天然胰高血糖素肽以及相对于天然胰高血糖素序列具有一个或多个氨基酸修饰（任选包括但不限于在氨基酸位置1、2、5、7、8、10、12、13、14、16、17、18、24、28和29的取代）的经修饰的衍生物的上位概念。通常，所用通过编号（例如位置28）提及具体氨基酸位置均指在天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 701)的位置处或在其任何类似物中相应的氨基酸位置处的氨基酸。例如，提及“位置28”对于其中SEQ ID NO: 701的第一个氨基酸已被缺失的胰高血糖素类似物而言将意指相应的位置27。类似地，提及“位置28”将意指其中在SEQ ID NO: 701的N末端之前已添加一个氨基酸的胰高血糖素类似物的相应的位置29。
如本文所用，术语“GLP-1肽”是指定天然GLP-1以及相对于天然GLP-1序列具有一个或多个氨基酸修饰的经修饰的衍生物的上位概念。
如本文所用，氨基酸“修饰”指氨基酸的取代、添加或缺失，并且包括在人蛋白中通常发现的20种氨基酸以及稀有或非天然存在氨基酸的任一种的取代或添加。稀有氨基酸的商业来源包括Sigma-Aldrich (Milwaukee、WI)、ChemPep Inc. (Miami、FL)、和Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge、MA)。稀有氨基酸可以是购自商业供应商，重新合成，或化学修饰或衍生自天然存在的氨基酸。氨基酸修饰包括连接氨基酸至缀合物部分，诸如亲水聚合物、酰基化、烷基化、和/或氨基酸的其他化学衍生作用。
如本文所用，氨基酸“取代”指一个氨基酸残基被不同的氨基酸残基替换。
如本文所用，术语“保守氨基酸取代”在本文定义为一个氨基酸被具有相似特性例如大小、电荷、疏水性、亲水性和/或芳香性的另一个氨基酸取代，并且包括在以下五组之一内的交换：
I. 小的脂族、非极性或轻微极性残基：
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
II. 极性、带负电荷残基及其酰胺和酯：
Asp、Asn、Glu、Gln、半胱磺酸和高半胱磺酸；
III. 极性、带正电荷的残基：
His、Arg、Lys；鸟氨酸(Orn)
IV. 大的、脂族、非极性残基：
Met、Leu、Ile、Val、Cys、正亮氨酸(Nle)、高半胱氨酸
V.大的、芳香族残基：
Phe、Tyr、Trp、乙酰苯丙氨酸。
如本文所用，术语“嵌合体2”指胰高血糖素肽，其中天然胰高血糖素氨基酸序列(SEQ ID NO: 701)包含以下修饰：在位置17的Gln、在位置18的Ala、在位置20的Lys、在位置21的Glu、在位置23的Ile、在位置24的Ala、和C末端酰胺。
如本文所用，通用术语“聚乙二醇链”或“PEG链”指以支链或直链的环氧乙烷和水的缩聚物的混合物，由通式H(OCH2CH2)kOH表示，其中k为至少9。在不存在任何进一步表征的情况下，术语旨在包括具有选自范围500-80,000道尔顿的平均总分子量的乙二醇的聚合物。“聚乙二醇链”或“PEG链”与数值后缀组合使用来表示其大约的平均分子量。例如，PEG-5,000 (5k PEG )指具有平均约5,000道尔顿的总分子量的聚乙二醇链。
如本文所用，术语“PEG化的”等术语指通过将聚乙二醇链连接至化合物而从其天然状态已进行修饰的化合物。“PEG化的多肽”是具有共价连接至多肽的PEG链的多肽。
如本文所用，“接头”是将两个单独的实体彼此连接的分子或分子的组。接头可以提供两个实体的最优间隔，或者可以进一步提供不稳定的键，其允许两个实体彼此分开。不稳定的键包括光裂解的基团、酸不稳定部分、碱不稳定部分和酶可切割基团。
如本文使用，“二聚体”是包含彼此经接头共价连接的两个亚基的复合物。术语二聚体当在不存在任何限定语言的情况下，涵盖同二聚体和异二聚体两者。同二聚体包含两个相同的亚基，而异二聚体包含两个不同的亚基，尽管所述两个亚基彼此实质上类似。
术语“C1-Cn烷基”（其中n可以为1-6），如本文所用，代表具有一个至指定数目的碳原子的支链或直链烷基。典型的C1-C6烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。
术语“C2-Cn烯基”（其中n可以为2-6），指具有2个至指定数目的碳原子和至少一个双键的烯类的不饱和支链或直链基团。此类基团的实例包括但不限于1-丙烯基、2-丙烯基（-CH2-CH=CH2）、1,3-丁二烯基、（-CH=CHCH=CH2）、1-丁烯基（-CH=CHCH2CH3）、己烯基、戊烯基等。
术语“C2-Cn炔基”（其中n可以为2-6），如本文所用，代表具有2个至n个碳原子和至少一个三键的不饱和支链或直链基团。此类基团的实例包括但不限于1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基等。
如本文所用，术语“芳基”指具有一个或两个芳香环的单环或二环碳环系统，包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。芳基环的大小和取代基或连接基团的存在通过指定存在的碳的数目来表明。例如，术语"(C1-C3烷基)(C6-C10芳基)"指经一至三元烷基链连接至亲本部分的6-10元芳基。
术语“杂芳基”如本文使用指包含一个或两个芳香环并且在芳香环中包含至少一个氮、氧或硫原子的单环或二环系统。杂芳基环的大小和取代基或连接基团的存在通过指定存在的碳的数目来表明。例如，术语"(C1-Cn烷基)(C5-C6杂芳基)"指经一至“n”元烷基链连接至亲本部分的5或6元杂芳基。
如本文所用，术语“杂烷基”指含有所表示数目的碳原子和在结构的骨架中的至少一个杂原子的直链或支链烃。用于本文目的的合适的杂原子包括但不限于N、S和O。
如本文所用，术语“卤素”指选自氟、氯、溴、和碘的一个或多个成员。
如本文所用，术语“带电荷的氨基酸”指包含在生理pH下的水溶液中带负电荷（即去质子化的）或带正电荷（即质子化的）的侧链的氨基酸。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、半胱磺酸、高半胱磺酸、和高谷氨酸，而带正电荷的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带电荷的氨基酸包括在人蛋白中常见的20种氨基酸以及非典型或非天然存在氨基酸中的带电荷的氨基酸。
如本文使用，术语“酸性氨基酸”指包含第二酸性部分（即，除了所有氨基酸均具有的α-羧基之外的）包括例如羧酸或磺酸基团的氨基酸。
如本文所用，术语“患者”在无进一步的指定时旨在涵盖任何温血脊椎动物驯养动物（包括例如但不限于家畜、马、猫、犬和其他宠物）、哺乳动物和人。
实施方案
本公开描述可用于治疗疾病例如糖尿病、肥胖的生物活性多肽的前体药物衍生物的制剂。更具体而言，配制本文公开的前体药物以增强亲本生物活性肽或蛋白的半衰期，同时允许前体药物经非酶促降解机制的随后活化。理想的前体药物应该在生理条件（例如在7.2的pH和37 ℃下）在水中是可溶的，并且它应该以粉末形式对于长期储存是稳定的。它还应该是免疫学上沉默的并且展示出相对于亲本药物的低活性。在一些实施方案中，前体药物将展示不多于10％的亲本药物的活性。在一些实施方案中，前体药物展示相对于亲本药物少于约10％、少于约5％、约1％、或少于约1％的活性。此外，当在体内注射时，前体药物应该在限定的时期内定量地转化为活性药物。
本文公开了具有结构特征选择的已知生物活性多肽的前体药物的实例，所述结构特征一同提供在生理条件下在PBS或血清中至少5天至约一周的显著延长的“非酶促活化半衰期”（切割半衰期）。可以制备具有例如至少3天至例如10天的延长的半衰期的类似肽。
关于在PBS或血清中的半衰期，如本文公开的生理条件旨在包括约35-40℃的温度和约7.0至约7.4的pH，且更典型地包括7.2-7.4的pH和36-38℃的温度。本文公开的实例显示在PBS或血清中延长的切割半衰期与体内延长的作用相关。
不受本发明的理论的束缚，在形成二酮哌嗪或二酮吗啉、酰胺键连接的酰化/烷基化二肽的自切割、和释放活性多肽药物之后，发生前体药物的活化。因此，设计二肽前体药物单元根据分子内化学反应（其不依赖于额外的化学添加剂或酶）来切割。优选地，选择二肽结构以抵抗由哺乳动物血清中存在的肽酶（包括例如二肽基肽酶IV (DPP-IV)）的切割。
根据一些实施方案，所公开的前体药物可以与蛋白酶抑制剂共施用作为延迟前体药物活化的方法，所述蛋白酶抑制剂包括特异性的DPP-IV抑制剂(例如，Januvia®、Merck & Co、Inc)。在该实施方案中，选择前体药物单元的氨基酸，使得二肽是DPP-IV切割的可接受的底物。蛋白酶抑制剂可以以单一组合物或分开的组合物来施用。当作为分开的组合物施用时，蛋白酶抑制剂通常在前体药物施用1-5小时、1-2小时、30分钟、或10分钟内施用。在一些实施方案中，两种分开的组合物一者在另一者之后立即施用。
根据一些实施方案，二肽前体药物单元可以进一步修饰以包含亲水部分。在一些实施方案中，亲水部分是聚乙二醇链。根据一些实施方案，40k或更高的聚乙二醇链共价结合至二肽前体药物单元的A或B氨基酸的侧链上。
A-B与酰基或烷基的连接
在一些或任何方面中，酰基或烷基经二肽部分A-B连接至位于胰高血糖素超家族肽的位置1（N末端）、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、37、38、39、40、41、42、或43（或在C末端5个氨基酸内）的任何一个的氨基酸。在示例性方面中，肽氨基酸位于胰高血糖素超家族肽的位置9、10、12、16、20或40的任何或在胰高血糖素超家族肽的位置10、13、14、16、17或40的任何。
A-B的连接
在一些实施方案，A-B连接至式I的氨基酸：
。
在一些实施方案中，式I的氨基酸是这样的氨基酸，其中n为4（Lys）或n为3(Orn)。
酰基或烷基的连接
在一些实施方案中，酰基经酯、硫酯或酰胺键连接至二肽A-B的氨基酸，或者烷基经醚、硫醚或胺键连接至二肽A-B的氨基酸。
例如，连接可以在二肽A-B的氨基酸A的侧链的胺、羟基或巯基(thiol)的酰化后发生。
可选地，烷基的连接可以在二肽A-B的氨基酸A的侧链的胺、羟基或巯基的烷基化后发生。在一些或任何实施方案中，烷基通过将胺、羟基或巯基与活化的烷基反应来连接。在一些方面中，烷基用离去基团例如卤素、磺酸酯、吡啶基巯基、铵盐或苯氧基活化。
A-B和酰基或烷基之间的连接也可以通过间隔基发生。在一些实施方案中，间隔基是亲水双功能间隔基、小PEG部分、或疏水双功能间隔基。在示例性实施方案中，亲水性双功能间隔基包含两个或多个反应基团，例如胺、羟基、巯基、和羧基或其任何组合。在示例性实施方案中，亲水性双功能间隔基包含羟基和羧基(carboxylate)。在其他实施方案中，亲水性双功能间隔基包含胺基和羧基(carboxylate)。在其他实施方案中，亲水性双功能间隔基包含巯基和羧基(carboxylate)。在具体实施方案中，间隔基包含氨基聚(烷基氧基)羧酸。在这方面，间隔基可以包含例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m为1-6的任何整数，并且n为2-12的任何整数，诸如例如8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，其可商购自Peptides International、Inc. (Louisville、KY)。
在示例性实施方案中，间隔基包含含有结构[-O-CH2-CH2-]n的小的聚乙二醇部分（PEG），其中n为2-16的整数（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16）。此类小的PEG本文称为“小PEG(miniPEG)”。在示例性方面中，小PEG是包含一个或多个官能团的官能化的小PEG。合适的官能团包括但不限于胺、羟基、巯基和羧基或其任何组合。在示例性方面中，小PEG是包含结构{[-O-CH2-CH2-]n-COO-}的小PEG，其中n如上定义。在示例性方面中，小PEG是包含结构{-N-CH2-CH2-[-O-CH2-CH2-]n}的酰胺基小PEG，其中n如上定义。在示例性方面中，小PEG是包含结构{-N-CH2-CH2-[-O-CH2-CH2-]n-COO-}的酰胺基小PEG酸，其中n如上定义。用于酰化具有小PEG的氨基酸的合适试剂可商购自供应商，诸如Peptides International (Louisville、KY)。此外，用于酰化具有小PEG的氨基酸的合适技术描述于本文（参见实施例1）。
在一些实施方案中，间隔基是疏水性双功能间隔基。疏水性双功能间隔基是本领域已知的。参见例如Bioconjugate Techniques、G. T. Hermanson (Academic Press、San Diego、CA、1996)，其以其整体通过引用并入。在示例性实施方案中，疏水性双功能间隔基包含两个或多个反应基团，例如胺、羟基、巯基、和羧基或其任何组合。在示例性实施方案中，疏水性双功能间隔基包含羟基和羧基(carboxylate)。在其他实施方案中，疏水性双功能间隔基包含胺基和羧基(carboxylate)。在其他实施方案中，疏水性双功能间隔基包含巯基和羧基(carboxylate)。包含羧基和羟基或巯基的合适的疏水性双功能间隔基是本领域已知的并且包括例如8-羟基辛酸和8-巯基辛酸。
根据一些或任何上述实施方案，双功能间隔基可以是合成的或天然存在的氨基酸（包括但不限于本文描述的那些的任何一种），所述氨基酸包含长度为3-10个原子的氨基酸骨架（例如6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸、和8-氨基辛酸）。可选地，间隔基可以是二肽或三肽间隔基（其具有长度为3-10个原子（例如6-10个原子）的肽骨架）。二肽或三肽间隔基的每一氨基酸可以与二肽或三肽的其他氨基酸相同或不同，并且可以独立地选自：天然存在的或编码的和/或非编码的或非天然存在的氨基酸，包括例如天然存在氨基酸（Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr）的任何D或L异构体、或选自以下的非天然存在的或非编码氨基酸的任何D或L异构体：β丙氨酸（β-Ala）、N-α-甲基丙氨酸（Me-Ala）、氨基丁酸（Abu）、γ-氨基丁酸（γ-Abu）、氨基己酸（ε-Ahx）、氨基异丁酸（Aib）、氨基甲基吡咯羧酸、氨基哌啶羧酸、氨基丝氨酸（Ams）、氨基四氢吡喃-4-羧酸、精氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、β-天冬氨酸（β-Asp）、氮杂环丁烷羧酸、3-(2-苯并噻唑基)丙氨酸、α-叔丁基甘氨酸、2-氨基-5-脲基正戊酸（瓜氨酸，Cit）、β-环己基丙氨酸（Cha）、乙酰氨基甲基-半胱氨酸、二氨基丁酸（Dab）、二氨基丙酸（Dpr）、二羟基苯丙氨酸（DOPA）、二甲基噻唑烷（DMTA）、γ-谷氨酸(γ-Glu)、高丝氨酸（Hse）、羟脯氨酸（Hyp）、异亮氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、甲基-异亮氨酸（MeIle）、异哌啶酸（Isn）、甲基-亮氨酸（MeLeu）、甲基-赖氨酸、二甲基-赖氨酸、三甲基-赖氨酸、甲醇基脯氨酸、甲硫氨酸-亚砜（Met(O)）、甲硫氨酸-砜（Met(O)2）、正亮氨酸（Nle）、甲基-正亮氨酸（Me-Nle）、正缬氨酸（Nva）、鸟氨酸（Orn）、对氨基苯甲酸（PABA）、青霉胺（Pen）、甲基苯丙氨酸（MePhe）、4-氯苯丙氨酸（Phe(4-Cl)）、4-氟苯丙氨酸（Phe(4-F)）、4-硝基苯丙氨酸（Phe(4-NO2)）、4-氰基苯丙氨酸（(Phe(4-CN)）、苯基甘氨酸（Phg）、哌啶基丙氨酸、哌啶基甘氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、吡咯烷基丙氨酸、肌氨酸（Sar）、硒代半胱氨酸（Sec）、O-苄基-磷酸丝氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸（Sta）、4-氨基-5-环己基-3-羟基戊酸（ACHPA）、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸（AHPPA）、1,2,3,4,-四氢-异喹啉-3-羧酸（Tic）、四氢吡喃甘氨酸、噻吩丙氨酸（Thi）、O-苄基-磷酸酪氨酸、O-磷酸酪氨酸、甲氧基酪氨酸、乙氧基酪氨酸、O-(双-二甲基氨基-膦酰基)-酪氨酸、酪氨酸硫酸四丁基胺、甲基-缬氨酸（MeVal）和烷基化的3-巯基丙酸。在示例性方面中，间隔基是Cys残基或Lys残基。
在一些实施方案中，间隔基包含总体上负电荷，例如包含一个或两个带负电荷的氨基酸。
酰基
酰化的氨基酸的酰基优选为C16或更长。例如，酰基可以为以下任何一种：C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸、或C30脂肪酸。在一些实施方案中，酰基为C16至C30脂肪酸或C20至C28脂肪酸。
在可选的实施方案中，酰基是胆汁酸。胆汁酸可以是任何合适的胆汁酸，包括但不限于胆酸、鹅去氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和胆固醇酸。
在示例性实施方案中，酰基是琥珀酸或琥珀酸衍生物。如本文所用的“琥珀酸衍生物”意指这样的化合物，其包含取代的琥珀酸或取代的环状琥珀酸（即琥珀酸酐）或取代的扩展的环琥珀酸酐（即包含–C(O)-O-C(O)-部分和3-5个额外碳的6-8元环），其中取代的琥珀酸、取代的环状琥珀酸（即琥珀酸酐）或取代的扩展的环琥珀酸酐被一个或多个烷基链或一个或多个官能化的碳链所取代。
在示例性方面中，琥珀酸衍生物包含式V的结构：
其中R和R'的每一个独立地为H、直链或支链C16-C30碳链、或直链或支链C16-C30官能化碳链。在示例性实施方案中，R和/或R'为包含C16至C30烷基链例如C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基、或C30烷基的碳链。在示例性实施方案中，官能化的碳链包含官能团，包括但不限于羧基、巯基、胺、羰游基、亚砜基或酰胺基。
在示例性方面中，琥珀酸衍生物包含含有式VI的结构的琥珀酸酐：
其中R和R'的每一个独立地为H、直链或支链C16-C30碳链、或直链或支链C16-C30官能化碳链。在示例性实施方案中，R和/R'为包含C16至C30烷基链的碳链。例如，烷基可以为以下任一种：C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基、或C30烷基。在示例性实施方案中，官能化的碳链包含官能团，包括但不限于羧基、巯基、胺、羰游基、亚砜基或酰胺基。
在示例性方面中，琥珀酸衍生物是琥珀酸酐衍生物，其包括式VII的那些：
其中R和R'的每一个独立地为H、直链或支链C16-C30碳链、或直链或支链C16-C30官能化碳链。在示例性实施方案中，R和/R'为包含C16至C30烷基链的碳链。例如，烷基可以为以下任一种：C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基、或C30烷基。在示例性实施方案中，官能化的碳链包含官能团，包括但不限于羧基、巯基、胺、羰游基、亚砜基或酰胺基。
当式V-VI的R和R'的仅一个是H时，酰化的氨基酸称为“Cx琥珀酰基”。如本文所用，术语“Cx琥珀酰基”，其中x为整数，指这样的结构，其中R为y个碳的烷基链且y= x-1，且y不包括琥珀酰基部分的碳。例如，式VI的结构，其中R为C15烷基且R'为H，称为C16琥珀酰基。当式V-VI的R和R'均不是H时，则酰化的氨基酸称为“Cx,Cx'琥珀酰基”。如本文所用，术语“Cx,Cx'琥珀酰基”，其中x和x'为整数，指这样的结构，其中R为y个碳的烷基链，且R'为y'个碳的烷基链，且y’ = x’-1。例如，式VI的结构，其中R为C15烷基且R'为C13烷基，称为C16,C14琥珀酰基。当琥珀酸衍生物为取代的扩展的环琥珀酸酐且式VII的R和R'均不是H时，则酰化的氨基酸称为“Cx,Cx'-n-琥珀酰基”。如本文所用，术语Cx,Cx'-n-琥珀酰基”，其中x、x'和n为整数，指这样的结构，其中R为y个碳的烷基链，R'为y'个碳的烷基链，且琥珀酸酐环通过n个碳延展。例如，式VII的结构，其中R和R'为C15烷基且n=2，称为C16,C16-2-琥珀酰基。
在示例性实施方案中，酰基是马来酸或马来酸衍生物。如本文所用的“马来酸衍生物”意指这样的化合物，其包含取代的马来酸或取代的环状马来酸（即马来酸酐）或取代的扩展的环马来酸酐（即包含–C(O)-O-C(O)-部分和3-5个额外碳的6-8元环），其中取代的马来酸、取代的环状马来酸（即马来酸酐）或取代的扩展的环马来酸酐被一个或多个烷基链或一个或多个官能化的碳链所取代。
在示例性方面中，马来酸衍生物包含式VIII的结构：
其中R和R'的每一个独立地为H、直链或支链C16-C30碳链、或直链或支链C16-C30官能化碳链。在示例性实施方案中，R和/R'为包含C16至C30烷基链的碳链。例如，烷基可以为以下任一种：C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基、或C30烷基。在示例性实施方案中，官能化的碳链包含官能团，包括但不限于羧基、巯基、胺、羰游基、亚砜基或酰胺基。
在示例性方面中，马来酸衍生物包含含有式IX的结构的马来酸酐：
其中R和R'的每一个独立地为H、直链或支链C16-C30碳链、或直链或支链C16-C30官能化碳链。在示例性实施方案中，R和/R'为包含C16至C30烷基链的碳链。例如，烷基可以为以下任一种：C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基、或C30烷基。在示例性实施方案中，官能化的碳链包含官能团，包括但不限于羧基、巯基、胺、羰游基、亚砜基或酰胺基。
在示例性方面中，马来酸衍生物是马来酸酐衍生物，其包括式X的那些：
其中n为1-4，在两个非羰基碳之间存在至少一个C=C双键，且
其中R和R'的每一个独立地为H、直链或支链C16-C30碳链、或直链或支链C16-C30官能化碳链。在示例性实施方案中，R和/R'为包含C16至C30烷基链的碳链。例如，烷基可以为以下任一种：C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基、或C30烷基。在示例性实施方案中，官能化的碳链包含官能团，包括但不限于羧基、巯基、胺、羰游基、亚砜基或酰胺基。
当式VIII-IX的R和R'的仅一个是H时，酰化的氨基酸称为“Cx马来酰基”。如本文所用，术语“Cx马来酰基”，其中x为整数，指这样的结构，其中R为y个碳的烷基链且y= x-1，且y不包括马来酰基部分的碳。例如，式IX的结构，其中R为C15烷基且R'为H，称为C16马来酰基。当式VIII-IX的R和R'均不是H时，则酰化的氨基酸称为“Cx,Cx'马来酰基”。如本文所用，术语“Cx,Cx'马来酰基”，其中x和x'为整数，指这样的结构，其中R为y个碳的烷基链，且R'为y'个碳的烷基链，且y’ = x’-1。例如，式IX的结构，其中R为C15烷基且R'为C13烷基，称为C16,C14马来酰基。当马来酸衍生物为取代的扩展的环马来酸酐且式X的R和R'均不是H时，则酰化的氨基酸称为“Cx,Cx'-n-马来酰基”。如本文所用，术语“Cx,Cx'-n-马来酰基”，其中x、x'和n为整数，指这样的结构，其中R为y个碳的烷基链，R'为y'个碳的烷基链，且马来酸酐环通过n个碳延展。例如，式X的结构，其中R和R'为C15烷基且n=2，称为C16,C16-2-马来酰基。
烷基
烷基化的氨基酸的非天然烷基可以为任何大小，例如任何长度碳链，且可以是直链或支链的。在一些特定的实施方案中，烷基为C16或C30烷基。例如，烷基可以为以下任一种：C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基、或C30烷基。
在示例性实施方案中，烷基化的氨基酸的非天然烷基包含官能团，包括但不限于羧基、巯基、胺、羰游基、亚砜基或酰胺基。
在示例性实施方案中，非天然烷基是结构–Cx-COOH的羧基官能化的碳链，其中x为整数，任选4-30之间的整数（例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30），其中羧基碳为α碳，且Cx的碳的每一个指定为β、γ、δ、ε等，其中β碳连接至α碳。例如，其中，当x为4时，非天然烷基将指定如下：Cε-Cδ-Cγ-Cβ-CαOOH。在示例性实施方案中，羧基官能化的碳链经除羧基碳之外的碳即Cx碳之一连接。在示例性方面中，羧基官能化的碳链经羧基官能化的碳链的β、γ、δ或ε碳连接至烷基化氨基酸的侧链上。在可选的实施方案中，羧基官能化的碳链经羧基官能化的碳链的β、γ、δ或ε碳连接至间隔基的侧链上，所述间隔基连接至烷基化氨基酸。在示例性方面中，羧基官能化的碳链经羧基官能化的碳链的β碳连接至烷基化氨基酸的侧链上。在可选的实施方案中，羧基官能化的碳链经羧基官能化的碳链的β碳连接至间隔基的侧链上，所述间隔基连接至烷基化氨基酸。
连接酰基的方法
经肽的胺、羟基和巯基连接酰基至肽的合适方法是本领域已知的。参见例如实施例1（对于经胺酰化的方法），Miller，Biochem Biophys Res Commun 218:377-382 (1996)；Shimohigashi和Stammer，Int J Pept Protein Res 19:54-62 (1982)；和Previero 等人，Biochim Biophys Acta 263:7-13 (1972) (对于经羟基酰化的方法)；和San和Silvius，J Pept Res 66:169-180 (2005) (对于经巯基酰化的方法)；Bioconjugate Chem."Chemical Modifications of Proteins:History and Applications" 第1、2-12页(1990)；Hashimoto 等人，Pharmacuetical Res."Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol. 6、No:2 pp.171-176 (1989)。
在一些实施方案中，酰化经长链烷被A-B二肽的酰化而发生。在具体的方面，长链烷包含胺、羟基或巯基（例如十八胺、十四醇和十六硫醇），其与A-B肽的羧基或其活化形式反应。羧基或其活化形式可以是氨基酸A的侧链的部分。
在示例性实施方案中，胰高血糖素超家族肽通过由连接至A-B二肽的间隔基对长链烷的酰化而包含酰基。在具体的方面，长链烷包含胺、羟基或巯基，其与间隔基的羧基或其活化形式反应。包含羧基或其活化形式的合适的间隔基描述于本文，且包括例如双功能间隔基，例如氨基酸、二肽、三肽、亲水性双功能间隔基和疏水性双功能间隔基。
如本文所用，术语“羧基的活化形式”指具有通式R(C=O)X的羧基，其中X为离去基团，且R为胰高血糖素类似物或间隔基。例如，羧基的活化形式可以包括但不限于酰基氯、酸酐和酯。在一些实施方案中，活化的羧基是具有N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）离去基团的酯。
在一些实施方案中，A-B二肽的胺、羟基或巯基用胆固醇酸酰化。在具体的实施方案中，A-B二肽经烷基化的脱氨基Cys间隔基即烷基化3-巯基丙酸间隔基连接至胆固醇酸。
当酰基是琥珀酸、琥珀酸衍生物、马来酸或马来酸衍生物时，肽通过GIP激动剂肽或间隔基的胺、羟基或巯基与式V、式VI、式VII、式VIII、式IX或式X的琥珀酸、琥珀酸衍生物、马来酸、或马来酸衍生物反应而被琥珀酰化/马来酰化。琥珀酰化的方法描述于本文。
连接烷基的方法
连接烷基至氨基酸的方法是本领域已知的。例如，用离去基团活化的烷基可以与包含亲和侧链例如包含胺、羟基或巯基的侧链的氨基酸反应。离去基团在示例性方面中是卤素、磺酸酯、吡啶基巯基、铵盐或苯氧基。
在示例性实施方案中，待连接至烷基的氨基酸是Cys残基，且硫原子被烷基化，例如“S-烷基化”。在示例性实施方案中，Cys的硫与包含结构–Cx-COOH的羧基官能化的碳链的烷基的离去基团反应，其中x为整数，任选4-30之间的整数（例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30），其中羧基碳为α碳，且Cx的碳的每一个指定为β、γ、δ、ε等，其中β碳连接至α碳。例如，其中，当x为4时，非天然烷基将指定如下：Cε-Cδ-Cγ-Cβ-CαOOH。在示例性实施方案中，羧基官能化的碳链经除羧基碳之外的碳即Cx碳之一连接。在示例性方面中，羧基官能化的碳链经羧基官能化的碳链的β、γ、δ或ε碳连接至烷基化氨基酸的侧链上。在可选的实施方案中，羧基官能化的碳链经羧基官能化的碳链的β、γ、δ或ε碳连接至间隔基的侧链上，所述间隔基连接至烷基化氨基酸。在示例性方面中，羧基官能化的碳链经羧基官能化的碳链的β碳连接至烷基化氨基酸的侧链上。在可选的实施方案中，羧基官能化的碳链经羧基官能化的碳链的β碳连接至间隔基的侧链上，所述间隔基连接至烷基化氨基酸。
在示例性方面中，离去基团为卤素，诸如碘、溴、氯或氟，磺酸酯诸如甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯、或氟磺酸酯，吡啶基硫醇，铵盐，重氮盐，硝酸盐，磷酸盐或苯氧基(phenoxyl)。
在具体方面，烷基包含碘离去基团和羧基官能化的碳链，所述碳链包含总计16个碳（包括羧基(carboxylate)的碳）。用此类碘代羧酸烷基化可以称为“S-棕榈基烷基化”，其与“S-棕榈酸酯(palmitate)烷基化”同义。进一步的S-棕榈基烷基化的范例本文提供有实施例1和20中。
胰高血糖素相关肽
在某些方面中，本公开涉及胰高血糖素相关肽（作为指定基团“Q”的部分）。术语胰高血糖素相关肽指在胰高血糖素、GLP-1、GLP-2和GIP受体任何一个或多个具有生物活性（作为激动剂或拮抗剂）并且包含与天然胰高血糖素、天然胃泌酸调节素、天然毒蜥外泌肽-4、天然GLP-1、天然GLP-2、或天然GIP中至少一个具有至少40％序列同一性（例如45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%）的氨基酸序列的那些肽。应理解考虑胰高血糖素相关肽的所有可能的活性子集，例如在胰高血糖素或GLP-1或GIP受体的一种或多种处具有生物活性（作为激动剂或拮抗剂）的肽，连同与每一列出的天然肽的序列同一性的所有可能子集，例如包含与天然胰高血糖素在天然胰高血糖素的长度上具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%序列同一性的氨基酸序列。在本发明的一些实施方案中，胰高血糖素相关肽是具有胰高血糖素受体激动剂活性、GIP受体激动剂活性、胰高血糖素受体/GLP-1受体共激动剂活性、胰高血糖素受体拮抗剂活性、或胰高血糖素受体拮抗剂和GLP-1受体激动剂活性的肽。在一些实施方案中，肽保留分子的C末端一半中的α螺旋构象。在一些实施方案中，肽保留涉及受体相互作用或信号传递的位置，例如胰高血糖素的位置3，或(1-37)GLP-1的位置7、10、12、13、15或17。相应地，胰高血糖素相关肽可以是1类、2类、3类、4类、5类和/或6类的肽，其每一种本文进一步描述。
根据一些实施方案，二肽前体药物单元（包括连接至二肽前体药物单元的酰基或烷基）可以经之前公开于以下国际申请号中的任何生物活性化合物的酰胺键连接：PCT/US2008/08608 (提交于2008年1月3日)、PCT/US2008/053857 (提交于2008年2月13日)、PCT/US2009/47437 (提交于2009年6月16日)、PCT/US2009/47438 (提交于2009年6月16日)、PCT/US2009/47447 (提交于2009年6月16日)、PCT/US2008/080973 (提交于2008年10月23日)、和PCT/US2008/081333 (提交于2008年10月27日)、提交于09年6月16日的PCT/US09/47437、提交于09年6月16日的PCT/US09/47438、提交于09年6月16日的PCT/US09/47447、提交于10年6月16日的PCT/US10/38825、提交于09年12月09日的PCT/US10/59724、提交于11年1月26日的PCT/US11/22608、提交于11年5月10日的PCT/US11/35912、提交于11年5月10日的PCT/US11/35913、提交于11年6月23日的PCT/US11/41623、提交于11年12月20日的PCT/US11/66164、提交于11年12月22日的PCT/US11/66739、提交于12年6月12日的PCT/US12/42085和提交于12年11月16日的PCT/US12/65492，其公开内容包括每一序列在此明确地通过引用并入本申请。本文公开的二肽前体药物单元（包括连接至二肽前体药物单元的酰基或烷基）可以在一些示例性实施方案中连接至PCT/US2008/08608、PCT/US2008/053857、PCT/US2009/47437、PCT/US2009/47438、PCT/US2009/47447、PCT/US2008/08097和PCT/US2008/081333中或任何公开的之前PCT申请中公开的生物活性肽。
在一些实施方案中，Q可以是提交于12年6月12日的PCT/US12/42084中公开的肽，而在一些实施方案中，Q不是PCT/US12/42084中公开的任何肽。
修饰
胰高血糖素相关肽可以包含具有修饰的天然胰高血糖素氨基酸序列(SEQ ID NO；701)。在示例性实施方案中，胰高血糖素相关肽可以包含相对于天然胰高血糖素序列总计1、高至2、高至3、高至4、高至5、高至6、高至7、高至8、高至9或高至10个氨基酸修饰，例如保守的或非保守的取代。本文描述的修饰和取代在某些方面在胰高血糖素相关肽的特定位置进行，其中位置编号对应于胰高血糖素(SEQ ID NO: 701)的编号。在一些实施方案中，1、2、3、4、或5个非保守取代在位置2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29的任一个进行，并且高至5个进一步保守取代在任何这些位置进行。在一些实施方案中，1、2、或3个氨基酸修饰在位置1-16的氨基酸内进行，并且1、2或3个氨基酸修饰在位置17-26的氨基酸内进行。在一些实施方案中，此类胰高血糖素相关肽在天然胰高血糖素的对应位置保留至少22、23、24、25、26、27或28个天然存在的氨基酸（例如，相对于天然存在的胰高血糖素具有1-7、1-5或1-3个修饰）。
DPP-IV抗性
在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽包含在位置1或2的修饰以减少对二肽基肽酶IV切割的易感性。更具体而言，在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽（例如选自图10中的那些）的位置1被选自以下的氨基酸取代：D-组氨酸、α,α-二甲基咪唑(imidiazole)乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸和高组氨酸。更具体而言，在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽的位置2被选自以下的氨基酸取代：D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸和氨基异丁酸。在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽的位置2不是D-丝氨酸。
亲水部分
在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽（例如，1类胰高血糖素相关肽、2类胰高血糖素相关肽、3类胰高血糖素相关肽、4类胰高血糖素相关肽或5类胰高血糖素相关肽、或6类胰高血糖素相关肽）连接（共价键合）至亲水部分。亲水部分可以在用于使蛋白与活化的聚合物分子反应的任何合适条件下连接至胰高血糖素相关肽。可以使用本领域已知的任何方法，包括经酰化、还原烷基化、迈克尔加成反应、硫醇烷基化或其他经PEG部分上的反应基团（例如醛、氨基、酯、巯基、α卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基）与靶化合物上的反应基团例如醛、氨基、酯、巯基、α卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基）的化学选择性缀合/连接方法。可以用于连接水可溶性聚合物与一种或多种蛋白的活化基团包括但不限于砜、马来酰亚胺、巯基、硫醇、三氟甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯(tresylate)、氮丙啶(azidirine)、环氧乙烷和5-吡啶基。如果通过还原烷基化连接至肽，则所选的聚合物应具有单一反应性醛，从而控制聚合度。参见例如，Kinstler 等人，Adv.Drug.Delivery Rev. 54:477-485 (2002)；Roberts 等人，Adv.Drug Delivery Rev. 54:459-476 (2002)；和Zalipsky 等人，Adv.Drug Delivery Rev. 16:157-182 (1995)。
关于1-3类胰高血糖素相关肽，可以用于连接水可溶性聚合物与一种或多种蛋白的进一步活化基团包括α-卤代酰基（例如α-碘代乙酸、α-溴代乙酸、α-氯代乙酸）。在一些实施方案中，其中所述胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽，包含巯基的氨基酸在迈克尔加成反应中用马来酰亚胺活化的PEG进行修饰，以产生包含下文显示的硫醚键的PEG化的肽：
。
在其他实施方案中，1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的氨基酸的巯基在亲核取代反应中用卤代乙酰基活化的PEG进行修饰，以产生包含下文显示的硫醚键的PEG化的肽：
。
合适的亲水部分包括聚乙二醇（PEG）、聚丙二醇、聚氧乙烯化(polyoxyethylated)多元醇（例如，POG）、聚氧乙烯化山梨糖醇、聚氧乙烯化葡萄糖、聚氧乙烯化甘油（POG）、聚氧化烯、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇共聚物、单甲氧基-聚乙二醇、单-（C1-C10）烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇、羧甲基纤维素、聚缩醛、聚乙烯醇（PVA）、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚（β-氨基酸）（均聚物或随机共聚物）、聚（n-乙烯基吡咯烷酮）聚乙二醇、丙二醇均聚物（PPG）和其它聚亚烷基氧化物(polyakylene oxides)、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、结肠酸或其它多糖聚合物、聚蔗糖(Ficoll)或葡聚糖及其混合物。葡聚糖是葡萄糖亚单元的多肽聚合物，主要通过α1-6键连接。葡聚糖在许多分子量范围内是可获得的，例如约1 kD至约100 kD，或约5、10、15或20 kD至约20、30、40、50、60、70、80或90 kD。
在一些实施方案中，亲水部分是聚乙二醇（PEG）链或其他水溶性聚合物，所述水溶性聚合物共价连接至在所述胰高血糖素相关肽的位置16、17、21、24、29、40的一个或多个处、在C末端延伸内、或在C末端氨基酸处的氨基酸残基的侧链。在一些实施方案中，在该位置的天然氨基酸被具有适合于交联亲水部分的侧链的氨基酸所取代，以利于连接亲水部分与肽。示例性氨基酸包括Cys、Lys、Orn、高Cys、或乙酰基苯丙氨酸（Ac-Phe）。在其他实施方案中，修饰以包含亲水基团的氨基酸在C末端添加至肽。
亲水部分例如聚乙二醇链根据一些实施方案具有选自范围约500至约40,000道尔顿的分子量。在一些实施方案中，聚乙二醇链具有选自范围约500至约5,000道尔顿或约1,000至约5,000道尔顿的分子量。在另一个实施方案中，亲水部分例如聚乙二醇链具有约10,000至约20,000道尔顿的分子量。在仍其他示例性实施方案中，亲水部分例如聚乙二醇链具有约20,000至约40,000道尔顿的分子量。
考虑直链或支链亲水聚合物。所得的缀合物的制剂可以基本上是单分散或多分散的，并且可以具有约0.5、0.7、1、1.2、1.5或2个聚合物部分/肽。
酰化
在一些实施方案中，将胰高血糖素相关肽（例如，1类胰高血糖素相关肽、2类胰高血糖素相关肽、3类胰高血糖素相关肽、4类胰高血糖素相关肽、4类胰高血糖素相关肽、5类胰高血糖素相关肽、或6类胰高血糖素相关肽）修饰以包含酰基。例如，胰高血糖素相关肽可以是1类、2类、6类或3类之一，并且可以包含对于天然存在氨基酸是非天然的酰基。酰化可以在胰高血糖素相关肽内的任何位置进行，包括以下任何位置：位置1-29、在C末端延伸内的位置、或C末端氨基酸，条件是由非酰化的胰高血糖素相关肽展示的活性在酰化后仍保留。例如，如果未酰化的肽具有胰高血糖素激动剂活性，则酰化的肽保留胰高血糖素激动剂活性。还例如，如果未酰化的肽具有胰高血糖素拮抗剂活性，则酰化的肽保留胰高血糖素拮抗剂活性。例如，如果未酰化的肽具有GLP-1激动剂活性，则酰化的肽保留GLP-1激动剂活性。非限制性实例包括在位置5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28、或29（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的酰化。关于1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，酰化可以在以下任何位置发生：位置5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28、29、30、37、38、39、40、41、42、或43（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）。酰基可以直接共价连接至胰高血糖素相关肽的氨基酸，或经间隔基间接连接至胰高血糖素相关肽的氨基酸，其中所述间隔基位于胰高血糖素相关肽的氨基酸和酰基之间。胰高血糖素相关肽可以在其中亲水部分连接的相同氨基酸位置处或在不同的氨基酸位置处进行酰化。非限制性实例包括在位置10（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的酰化和在胰高血糖素肽的C 末端部分内的一个或多个位置处例如位置24、28或29（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的PEG化，在C末端延伸内或在C末端（例如，经添加C末端Cys）。
在本发明的具体方面中，胰高血糖素相关肽通过胰高血糖素相关肽的氨基酸的侧链的胺、羟基或巯基的直接酰化修饰以包含酰基。在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽经氨基酸的侧链胺、羟基或巯基直接酰化。在一些实施方案中，酰化在位置10、20、24或29（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）。在这方面，酰化的胰高血糖素相关肽可以包含SEQ ID NO: 701的氨基酸序列，或其包含本文描述的一个或多个氨基酸修饰的经修饰的氨基酸序列（具有在位置10、20、24和29（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的氨基酸的至少一个被修饰为包含侧链胺、羟基或巯基的任何氨基酸）。在本发明的一些具体实施方案中，胰高血糖素相关肽的直接酰化经在位置10（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的氨基酸的侧链胺、羟基或巯基发生。
在一些实施方案中，包含侧链胺的氨基酸是式I的氨基酸：
。
在一些示例性实施方案中，式I的氨基酸是这样的氨基酸，其中n为4（Lys）或n为3(Orn)。
在其他实施方案中，包含侧链羟基的氨基酸是式II的氨基酸：
。
在一些示例性实施方案中，式II的氨基酸是这样的氨基酸，其中n为1 (Ser)。
在仍其他实施方案中，包含侧链巯基的氨基酸是式III的氨基酸：
。
在一些示例性实施方案中，式III的氨基酸是这样的氨基酸，其中n为1 (Cys)。
在仍其他实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽，包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸是包含式I、式II、或式III的相同结构的二取代氨基酸，除了键合至式I、式II或式III的氨基酸的α碳的氢被第二侧链所取代之外。
在本发明的一些实施方案中，酰化的胰高血糖素相关肽包含肽和酰基之间的间隔基。在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽共价结合至间隔基，所述间隔基共价结合至酰基。在一些示例性实施方案中，胰高血糖素相关肽通过间隔基的胺、羟基或巯基的酰化修饰以包含酰基，所述间隔基连接至在位置10、20、24或29（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的氨基酸、或在胰高血糖素相关肽的C末端氨基酸的侧链。间隔基连接的氨基酸可以是包含允许连接至间隔基的部分的任何氨基酸。例如，包含侧链-NH2、–OH、或–COOH的氨基酸(例如Lys、Orn、Ser、Asp、或Glu)是合适的。而且，关于1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，包含侧链-NH2、–OH、或–COOH的氨基酸（例如单或双α取代的氨基酸）(例如，Lys、Orn、Ser、Asp、或Glu)是合适的。在这方面，酰化的胰高血糖素相关肽可以包含SEQ ID NO: 701的氨基酸序列，或其包含本文描述的一个或多个氨基酸修饰的经修饰的氨基酸序列（具有在位置10、20、24和29（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的氨基酸的至少一个被修饰为包含侧链胺、羟基或羧基的任何氨基酸）。
在一些实施方案中，间隔基是包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸或包含含有侧链胺、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽。在一些实施方案中，氨基酸间隔基不是γ-Glu。在一些实施方案中，二肽间隔基不是γ-Glu-γ-Glu。
当酰化经间隔基的氨基酸的胺基发生时，酰化可以经氨基酸的α胺或侧链胺发生。在其中α胺被酰化的情况中，间隔基氨基酸可以是任何氨基酸。例如，间隔基氨基酸可以是疏水氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr。在一些实施方案中，其中胰高血糖素相关肽是1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽，间隔基氨基酸可以是例如疏水氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸。可选地，间隔基氨基酸可以是酸性残基，例如Asp和Glu。在其中间隔基氨基酸的侧链胺被酰化的情况中，间隔基氨基酸是包含侧链胺的氨基酸，例如式I的氨基酸（例如Lys或Orn）。在这种情况下，间隔基氨基酸的α胺和侧链胺两者均可以被酰化，从而使胰高血糖素肽二酰化(diacylated)。本发明的实施方案包括此类二酰化分子。
当酰化经间隔基的氨基酸的羟基发生时，氨基酸或者二肽或三肽的氨基酸之一可以是式II的氨基酸。在具体示例性实施方案中，氨基酸是Ser。
当酰化经间隔基的氨基酸的巯基发生时，氨基酸或者二肽或三肽的氨基酸之一可以是式III的氨基酸。在具体示例性实施方案中，氨基酸是Cys。
在一些实施方案中，间隔基包含亲水性双功能间隔基。在具体实施方案中，间隔基包含氨基聚(烷基氧基)羧酸。在这方面，间隔基可以包含例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m为1-6的任何整数，并且n为2-12的任何整数，诸如例如8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，其可商购自Peptides International，Inc. (Louisville，KY)。
在一些实施方案中，仅关于1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，间隔基包含亲水性双功能间隔基。在某些实施方案中，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的亲水性双功能间隔基包含两个或多个反应基团，例如胺、羟基、巯基和羧基或其任何组合。在某些实施方案中，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的亲水性双功能间隔基包含羟基和羧基。在其他实施方案中，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的亲水性双功能间隔基包含胺基和羧基。在其他实施方案中，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的亲水性双功能间隔基包含巯基和羧基。
在一些实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，间隔基为疏水性双功能间隔基。疏水性双功能间隔基是本领域已知的。参见例如Bioconjugate Techniques，G. T. Hermanson (Academic Press，San Diego，CA，1996)，其以其整体通过引用并入。在某些实施方案中，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的疏水性双功能间隔基包含两个或多个反应基团，例如胺、羟基、巯基和羧基或其任何组合。在某些实施方案中，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的疏水性双功能间隔基包含羟基和羧基。在其他实施方案中，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的疏水性双功能间隔基包含胺基和羧基。在其他实施方案中，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的疏水性双功能间隔基包含巯基和羧基。包含羧基和羟基或巯基的合适的疏水性双功能间隔基是本领域已知的并且包括例如8-羟基辛酸和8-巯基辛酸。
在一些实施方案中，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的双功能间隔基不是在羧基之间包含非支化的、1-7个碳原子的亚甲基的二羧酸。在一些实施方案中，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的双功能间隔基是在羧基之间包含非支化的、1-7个碳原子的亚甲基的二羧酸。
在特定实施方案中的间隔基（例如氨基酸，二肽、三肽、亲水性双功能间隔基或疏水性双功能间隔基），其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽，长度为3-10个原子（例如6-10个原子，例如6、7、8、9或10个原子）。在更特定的实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽，间隔基长度为约3-10个原子（例如6-10个原子）且酰基为C12-C18脂酰基，例如C14脂酰基、C16脂酰基、使得间隔基和酰基的总长度为14-28个原子，例如约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28个原子。在一些实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽，间隔基和酰基的长度为17-28（例如19-26、19-21）个原子。
根据某些实施方案，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽，双功能间隔基可以是合成的或天然存在的氨基酸（包括但不限于本文描述的那些的任何一种），所述氨基酸包含长度为3-10个原子的氨基酸骨架（例如6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸、和8-氨基辛酸）。可选地，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的间隔基可以是具有长度为3-10个原子（例如6-10个原子）的肽骨架的二肽或三肽间隔基。连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的二肽或三肽间隔基的每一氨基酸可以与二肽或三肽的其他氨基酸相同或不同，并且可以独立地选自：天然存在的和/或非天然存在的氨基酸，包括例如天然存在氨基酸（Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr）的任何D或L异构体、或选自以下的非天然存在的氨基酸的任何D或L异构体：β丙氨酸（β-Ala）、N-α-甲基丙氨酸（Me-Ala）、氨基丁酸（Abu）、γ-氨基丁酸（γ-Abu）、氨基己酸（ε-Ahx）、氨基异丁酸（Aib）、氨基甲基吡咯羧酸、氨基哌啶羧酸、氨基丝氨酸（Ams）、氨基四氢吡喃-4-羧酸、精氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、β-天冬氨酸（β-Asp）、氮杂环丁烷羧酸、3-(2-苯并噻唑基)丙氨酸、α-叔丁基甘氨酸、2-氨基-5-脲基正戊酸（瓜氨酸，Cit）、β-环己基丙氨酸（Cha）、乙酰氨基甲基-半胱氨酸、二氨基丁酸（Dab）、二氨基丙酸（Dpr）、二羟基苯丙氨酸（DOPA）、二甲基噻唑烷（DMTA）、γ-谷氨酸(γ-Glu)、高丝氨酸（Hse）、羟脯氨酸（Hyp）、异亮氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、甲基-异亮氨酸（MeIle）、异哌啶酸（Isn）、甲基-亮氨酸（MeLeu）、甲基-赖氨酸、二甲基-赖氨酸、三甲基-赖氨酸、甲醇基脯氨酸、甲硫氨酸-亚砜（Met(O)）、甲硫氨酸-砜（Met(O2)）、正亮氨酸（Nle）、甲基-正亮氨酸（Me-Nle）、正缬氨酸（Nva）、鸟氨酸（Orn）、对氨基苯甲酸（PABA）、青霉胺（Pen）、甲基苯丙氨酸（MePhe）、4-氯苯丙氨酸（Phe(4-Cl)）、4-氟苯丙氨酸（Phe(4-F)）、4-硝基苯丙氨酸（Phe(4-NO2)）、4-氰基苯丙氨酸（(Phe(4-CN)）、苯基甘氨酸（Phg）、哌啶基丙氨酸、哌啶基甘氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、吡咯烷基丙氨酸、肌氨酸（Sar）、硒代半胱氨酸（Sec）、O-苄基-磷酸丝氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸（Sta）、4-氨基-5-环己基-3-羟基戊酸（ACHPA）、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸（AHPPA）、1,2,3,4,-四氢-异喹啉-3-甲酸（Tic）、四氢吡喃甘氨酸、噻吩丙氨酸（Thi）、O-苄基-磷酸酪氨酸、O-磷酸酪氨酸、甲氧基酪氨酸、乙氧基酪氨酸、O-(双-二甲基氨基-膦酰基)-酪氨酸、酪氨酸硫酸四丁基胺、甲基-缬氨酸（MeVal）和烷基化的3-巯基丙酸。
在一些实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，间隔基包含总体上负电荷，例如包含一个或两个带负电荷的氨基酸。在一些实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6或或3类胰高血糖素相关肽，二肽不是通用结构A-B的二肽的任何一种，其中A选自Gly、Gln、Ala、Arg、Asp、Asn、Ile、Leu、Val、Phe、和Pro，其中B选自Lys、His、Trp。在一些实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，二肽间隔基选自以下：Ala-Ala、β-Ala- β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-氨基丁酸- γ-氨基丁酸、和γ-Glu- γ-Glu。
在本发明的一些实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，通过由胰高血糖素相关肽的长链烷的酰化将胰高血糖素相关肽修饰以包含酰基。在特定方面中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，长链烷包含与胰高血糖素相关肽的羧基、或其活化形式反应的胺、羟基、或巯基（例如，十八胺、十四醇、和十六硫醇）。1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的羧基或其活化形式可以是胰高血糖素相关肽的氨基酸（例如谷氨酸、天冬氨酸）的侧链的部分或者可以是肽骨架的部分。
在某些实施方案中，1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽通过由连接至胰高血糖素肽的间隔基的长链烷的酰化修饰而包含酰基。在具体的方面，长链烷包含胺、羟基或巯基，其与间隔基的羧基或其活化形式反应。包含羧基或其活化形式的合适的间隔基描述于本文，且包括例如双功能间隔基，例如氨基酸、二肽、三肽、亲水性双功能间隔基和疏水性双功能间隔基。
如本文所用，术语“羧基的活化形式”指具有通式R(C=O)X的羧基，其中X为离去基团，且R为胰高血糖素相关肽或间隔基。例如，羧基的活化形式可以包括但不限于酰基氯、酸酐和酯。在一些实施方案中，活化的羧基是具有N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）离去基团的酯。
关于本发明的这些方面，其中长链烷通过1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽或间隔基而酰化，长链烷可以为任何大小且可以包含任何长度的碳链。长链烷可以是直链或支链的。在某些实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，长链烷为C4-C30烷。例如，长联烷可以为以下任一种：C4烷、C6烷、C8烷、C10烷、C12烷、C14烷、C16烷、C18烷、C20烷、C22烷、C24烷、C26烷、C28烷、或C30烷。在一些实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，长链烷包含C8-C20烷，例如C14烷、C16烷或C18烷。
此外，在一些实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽，胰高血糖素相关肽的胺、羟基或巯基用胆固醇酸进行酰化。在具体的实施方案中，1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽经烷基化的脱氨基Cys间隔基即烷基化3-巯基丙酸间隔基连接至胆固醇酸。
经胺、羟基和巯基的肽酰化的合适方法是本领域已知的。参见例如Miller，Biochem Biophys Res Commun 218:377-382 (1996)；Shimohigashi和Stammer，Int J Pept Protein Res 19:54-62 (1982)；和Previero 等人，Biochim Biophys Acta 263:7-13 (1972) (对于经羟基酰化的方法)；和San和Silvius，J Pept Res 66:169-180 (2005) (对于经巯基酰化的方法)；Bioconjugate Chem."Chemical Modifications of Proteins:History and Applications" 第1、2-12页 (1990)；Hashimoto 等人，Pharmacuetical Res."Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol. 6，No:2 pp.171-176 (1989)。
烷基化的胰高血糖素相关肽的酰基可以为任何大小，例如任何长度碳链，且可以是直链或支链的。在本发明的一些特定实施方案中，酰基为C4至C30脂肪酸。例如，酰基可以为以下任何一种：C4脂肪酸、C6脂肪酸、C8脂肪酸、C10脂肪酸、C12脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸、或C30脂肪酸。在一些实施方案中，酰基为C8至C20脂肪酸，例如C14脂肪酸或C16脂肪酸。
在可选的实施方案中，酰基是胆汁酸。胆汁酸可以是任何合适的胆汁酸，包括但不限于胆酸、鹅去氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和胆固醇酸。
本文描述的酰化的胰高血糖素相关肽可以进一步修饰以包含亲水部分。在一些实施方案中，亲水部分可以包含聚乙二醇（PEG）链。亲水部分的掺入可以通过任何合适的方法诸如本文描述的任何方法来完成。在这方面，酰化的胰高血糖素相关肽可以包含SEQ ID NO: 701，包括本文描述的任何修饰，其中在位置10、20、24和29（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的氨基酸中至少一个包含酰基，且在位置16、17、21、24、或29（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）、在C末端延伸内的位置的氨基酸、或C末端氨基酸中的至少一个被修饰为Cys、Lys、Orn、高Cys或Ac-Phe，且氨基酸的侧链共价键合至亲水部分（例如PEG）。在一些实施方案中，酰基在位置10（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）任选经包含Cys、Lys、Orn、高Cys或Ac-Phe的间隔基连接，且亲水部分在位置24的Cys残基处掺入。
可选地，酰化的胰高血糖素相关肽可以包含间隔基，其中所述间隔基被酰化并修饰以包含亲水部分。合适的间隔基的非限制实例包括包含一个或多个选自Cys、Lys、Orn、高Cys和Ac-Phe的氨基酸。
烷基化
根据一些实施方案，胰高血糖素相关肽例如1类胰高血糖素相关肽、2类胰高血糖素相关肽、3类胰高血糖素相关肽、4类胰高血糖素相关肽、5类胰高血糖素相关肽或6类胰高血糖素相关肽被修饰以包含经醚、硫醚或氨基连接连接至胰高血糖素相关肽的烷基，用于延长循环中的半衰期和/或延迟作用的开始和/或延长作用的持续时间和/或改善对蛋白酶诸如DPP-IV的抗性。在示例性实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，胰高血糖素相关肽包含对天然存在的氨基酸为非天然的烷基。
烷基化可以在胰高血糖素相关肽内的任何位置进行，包括以下任何位置：位置1-29、在C末端延伸内的位置、或C末端氨基酸，条件是胰高血糖素相关肽关于胰高血糖素、GLP-1或其他胰高血糖素相关肽受体的激动剂或拮抗剂活性仍保留。在一些实施方案中，如果未烷基化的肽具有胰高血糖素激动剂活性，则烷基化的肽保留胰高血糖素激动剂活性。在一些实施方案中，如果未烷基化的肽具有胰高血糖素拮抗剂活性，则烷基化的肽保留胰高血糖素拮抗剂活性。在一些实施方案中，如果未烷基化的肽具有GLP-1激动剂活性，则烷基化的肽保留GLP-1激动剂活性。非限制性实例包括在位置5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28、或29（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的烷基化。关于1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，烷基化可以在以下位置发生：位置5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28、29、30、37、38、39、40、41、42、或43（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）。烷基可以直接共价连接至胰高血糖素相关肽的氨基酸，或经间隔基间接连接至胰高血糖素相关肽的氨基酸，其中所述间隔基位于胰高血糖素相关肽的氨基酸和烷基之间。胰高血糖素相关肽可以在其中亲水部分连接的相同氨基酸位置处或在不同的氨基酸位置处进行烷基化。非限制性实例包括在位置10（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的烷基化和在胰高血糖素相关肽的C末端部分内的一个或多个位置处例如位置24、28或29（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号），在C末端延伸内或在C末端（例如，经添加C末端Cys）的PEG化。
在本发明的具体方面中，胰高血糖素相关肽通过胰高血糖素相关肽的氨基酸的侧链的胺、羟基或巯基的直接烷基化修饰以包含烷基。在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽经氨基酸的侧链胺、羟基或巯基直接烷基化。在一些实施方案中，烷基化在位置10、20、24或29（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）。在这方面，烷基化的胰高血糖素相关肽可以包含SEQ ID NO: 701的氨基酸序列，或其包含本文描述的一个或多个氨基酸修饰的经修饰的氨基酸序列（具有在位置10、20、24和29（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的氨基酸的至少一个被修饰为包含侧链胺、羟基或巯基的任何氨基酸）。在本发明的一些具体实施方案中，胰高血糖素相关肽的直接烷基化经在位置10（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的氨基酸的侧链胺、羟基或巯基发生。
在一些实施方案中，包含侧链胺的氨基酸为式I的氨基酸。在一些示例性实施方案中，式I的氨基酸为其中n为4 (Lys)或n为3 (Orn)的氨基酸。
在其他实施方案中，包含侧链羟基的氨基酸是式II的氨基酸。在一些示例性实施方案中，式II的氨基酸是这样的氨基酸，其中n为1 (Ser)。
在仍其他实施方案中，包含侧链巯基的氨基酸是式III的氨基酸。在一些示例性实施方案中，式II的氨基酸是这样的氨基酸，其中n为1 (Cys)。
在仍其他实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽，包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸是包含式I、式II、或式III的相同结构的二取代氨基酸，除了是键合至式I、式II或式III的氨基酸的α碳的氢被第二侧链所取代之外。
在本发明的一些实施方案中，烷基化的胰高血糖素相关肽包含肽和烷基之间的间隔基。在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽共价结合至间隔基，所述间隔基共价结合至烷基。在一些示例性实施方案中，胰高血糖素相关肽通过间隔基的胺、羟基或巯基的烷基化修饰以包含烷基，所述间隔基连接至在胰高血糖素相关肽的位置10、20、24或29（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的氨基酸的侧链。间隔基连接的氨基酸可以是包含允许连接至间隔基的部分的任何氨基酸。关于1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，间隔基连接的氨基酸可以是包含允许连接间隔基的部分的任何氨基酸（例如单α取代的氨基酸或α,α-双取代的氨基酸）。例如，包含侧链-NH2、–OH、或–COOH的氨基酸(例如Lys、Orn、Ser、Asp、或Glu)是合适的。在这方面，烷基化的胰高血糖素相关肽可以包含SEQ ID NO: 701的氨基酸序列，或其包含本文描述的一个或多个氨基酸修饰的经修饰的氨基酸序列（具有在位置10、20、24和29（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的氨基酸的至少一个被修饰为包含侧链胺、羟基或羧基的任何氨基酸）。
在一些实施方案中，间隔基是包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸或包含含有侧链胺、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽。在一些实施方案中，氨基酸间隔基不是γ-Glu。在一些实施方案中，二肽间隔基不是γ-Glu-γ-Glu。
当烷基化经间隔基的氨基酸的氨基发生时，烷基化可以经氨基酸的α胺或侧链胺发生。在其中α胺被烷基化的情况中，间隔基氨基酸可以是任何氨基酸。例如，间隔基氨基酸可以是疏水氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr。可选地，间隔基氨基酸可以是酸性残基，例如Asp和Glu。在示例性实施方案中，其中胰高血糖素相关肽是1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽，间隔基氨基酸可以是疏水氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸。可选地，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的间隔基氨基酸可以是酸性氨基酸，例如Asp和Glu，条件是烷基化在酸性残基的α胺上发生。在其中间隔基氨基酸的侧链胺被烷基化的情况中，间隔基氨基酸是包含侧链胺的氨基酸，例如式I的氨基酸（例如Lys或Orn）。在这种情况下，间隔基氨基酸的α胺和侧链胺两者均可以被烷基化，从而使胰高血糖素肽二烷基化(dialkylated)。本发明的实施方案包括此类二烷基化分子。
当烷基化经间隔基的氨基酸的羟基发生时，氨基酸或者间隔基的氨基酸之一可以是式II的氨基酸。在具体示例性实施方案中，氨基酸是Ser。
当烷基化经间隔基的氨基酸的巯基发生时，氨基酸或者间隔基的氨基酸之一可以是式III的氨基酸。在具体示例性实施方案中，氨基酸是Cys。
在一些实施方案中，间隔基包含亲水性双功能间隔基。在具体实施方案中，间隔基包含氨基聚(烷基氧基)羧酸。在这方面，间隔基可以包含例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m为1-6的任何整数，并且n为2-12的任何整数，诸如例如8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，其可商购自Peptides International、Inc. (Louisville、KY)。
在一些实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，间隔基为亲水性双功能间隔基。在某些实施方案中，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的亲水性双功能间隔基包含两个或多个反应基团，例如胺、羟基、巯基和羧基或其任何组合。在某些实施方案中，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的亲水性双功能间隔基包含羟基和羧基。在其他实施方案中，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的亲水性双功能间隔基包含胺基和羧基。在其他实施方案中，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的亲水性双功能间隔基包含巯基和羧基。
在一些实施方案中，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的间隔基为疏水性双功能间隔基。在某些实施方案中，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的疏水性双功能间隔基包含两个或多个反应基团，例如胺、羟基、巯基和羧基或其任何组合。在某些实施方案中，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的疏水性双功能间隔基包含羟基和羧基。在其他实施方案中，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的疏水性(hydropholic)双功能间隔基包含胺基和羧基。在其他实施方案中，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的疏水性(hydropholic)双功能间隔基包含巯基和羧基。包含羧基和羟基或巯基的合适的疏水性双功能间隔基是本领域已知的并且包括例如8-羟基辛酸和8-巯基辛酸。
在特定实施方案中的间隔基（例如氨基酸，二肽、三肽、亲水性双功能间隔基或疏水性双功能间隔基），其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽，长度为3-10个原子（例如6-10个原子，例如6、7、8、9或10个原子）。在更特定的实施方案中，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的间隔基长度为约3-10个原子（例如6-10个原子）且烷基为C12-C18烷基，例如C14烷基、C16烷基、使得间隔基和烷基的总长度为14-28个原子，例如约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28个原子。在一些实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽，间隔基和烷基的长度为17-28（例如19-26、19-21）个原子。
根据某些前述实施方案，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽，双功能间隔基可以是合成的或非天然存在的氨基酸，所述氨基酸包含长度为3-10个原子的氨基酸骨架（例如6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸、和8-氨基辛酸）。可选地，连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的间隔基可以是具有长度为3-10个原子（例如6-10个原子）的肽骨架的二肽或三肽间隔基。连接至1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的二肽或三肽间隔基可以由天然存在的和/或非天然存在的氨基酸包括例如本文教导的任何氨基酸构成。在一些实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，间隔基包含总体上负电荷，例如包含一个或两个带负电荷的氨基酸。在一些实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，二肽间隔基选自以下：Ala-Ala、β-Ala- β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-氨基丁酸- γ-氨基丁酸、和γ-Glu- γ-Glu。在一些实施方案中，二肽间隔基不是γ-Glu-γ-Glu。
经胺、羟基和巯基的肽烷基化的合适方法是本领域已知的。例如，Williamson醚合成可以用于形成在胰高血糖素相关肽和烷基之间的醚键。而且，肽与烷基卤的亲核取代反应可以产生醚、硫醚或氨基键的任一种。
烷基化的胰高血糖素相关肽的烷基可以为任何大小，例如任何长度碳链，且可以是直链或支链的。在本发明的一些实施方案中，烷基为C4至C30烷基。例如，烷基可以为以下任一种：C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基、或C30烷基。在一些实施方案中，烷基为C8至C20烷基，例如C14烷基或C16烷基。
在一些特定实施方案中，烷基包含胆汁酸例如胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和胆固醇酸的类固醇部分。
在本发明的一些实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，通过使亲核的、长链烷与胰高血糖素相关肽反应将胰高血糖素相关肽修饰以包含烷基，其中胰高血糖素相关肽包含适合于亲核取代的离去基团。在特定方面中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，长链烷的亲核基团包含胺、羟基、或巯基（例如，十八胺、十四醇、和十六硫醇）。1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽的离去基团可以是氨基酸的侧链的部分或者可以是肽骨架的部分。合适的离去基团包括例如N-羟基琥珀酰亚胺、卤素和磺酸酯。
在某些实施方案中，1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽通过使亲核的、长链烷与连接至胰高血糖素相关肽的间隔基反应而包含烷基，其中所述间隔基包含离去基团。在某些方面中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，长链烷包含胺、羟基或巯基。在某些实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽，包含离去基团的间隔基可以是本文讨论的任何间隔基，例如进一步包含合适的离去基团的氨基酸、二肽、三肽、亲水性双功能间隔基和疏水性双功能间隔基。
关于本发明的这些方面，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽或其中长链烷通过胰高血糖素相关肽或间隔基被烷基化，长链烷可以为任何大小且可以包含任何长度的碳链。长链烷可以是直链或支链的。在某些方面，长链烷是C4-C30烷。例如，长联烷可以为以下任一种：C4烷、C6烷、C8烷、C10烷、C12烷、C14烷、C16烷、C18烷、C20烷、C22烷、C24烷、C26烷、C28烷、或C30烷。在一些实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，长链烷包含C8-C20烷，例如C14烷、C16烷或C18烷。
此外，在一些实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽，胰高血糖素相关肽和胆固醇部分之间发生烷基化。例如，胆固醇的羟基可以替代长链烷上的离去基团以形成胆固醇-胰高血糖素肽产物。
本文描述的烷基化的胰高血糖素相关肽可以进一步修饰以包含亲水部分。在一些实施方案中，亲水部分可以包含聚乙二醇（PEG）链。亲水部分的掺入可以通过任何合适的方法诸如本文描述的任何方法来完成。在这方面，烷基化的胰高血糖素相关肽可以包括SEQ ID NO: 701，或包含本文描述的描述的一个或多个氨基酸修饰的其经修饰的氨基酸序列，其中在位置10、20、24和29（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的氨基酸中至少一个包含烷基，且在位置16、17、21、24和29、在C末端延伸内的位置的氨基酸、或C末端氨基酸中的至少一个被修饰为Cys、Lys、Orn、高Cys或Ac-Phe，且氨基酸的侧链共价键合至亲水部分（例如PEG）。在一些实施方案中，烷基在位置10（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）任选经包含Cys、Lys、Orn、高Cys或Ac-Phe的间隔基连接，且亲水部分在位置24的Cys残基处掺入。
可选地，烷基化的胰高血糖素相关肽可以包含间隔基，其中所述间隔基被烷基化并修饰以包含亲水部分。合适的间隔基的非限制实例包括包含一个或多个选自Cys、Lys、Orn、高Cys和Ac-Phe的氨基酸的间隔基。
α螺旋结构的稳定
在一些实施方案中，分子内桥在两个氨基酸侧链之间形成以稳定胰高血糖素相关肽的羧基末端部分（例如氨基酸12-29(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)）的三维结构。两个氨基酸侧链可以经氢键键合、离子相互作用诸如形成盐桥或通过共价键彼此连接。
在一些实施方案中，分子内桥在间隔3个氨基酸的两个氨基酸之间形成，例如在位置i和i+4的氨基酸，其中根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号i为12-25的任何整数（例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、和 25）。更具体而言，根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号的氨基酸对12和16、16和20、20和24或24和28（其中i=12、16、20或24的氨基酸对）的侧链可以彼此连接并因此稳定胰高血糖素α螺旋。可选地，i可以为17。
在一些特定实施方案中，其中位置i和i+4的氨基酸通过分子内桥连接，接头的大小为约8个原子，或约7-9个原子。
在其他实施方案中，分子内桥在间隔2个氨基酸的两个氨基酸之间形成，例如在位置j和j+3的氨基酸，其中根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号j为12-26的任何整数（例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26）。在一些特定实施方案中，j为17。
在一些特定实施方案中，其中位置j和j+3的氨基酸通过分子内桥连接，接头的大小为约6个原子，或约5-7个原子。
在仍其他实施方案中，分子内桥在间隔6个氨基酸的两个氨基酸之间形成，例如在位置k和k+7的氨基酸，其中根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号k为12-22的任何整数（例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、和22）。在一些特定实施方案中，k为12、13或17。在示例性实施方案中，k为17。
能够共价键合以形成六个原子的连接桥的氨基酸配对的实例包括Orn和Asp、Glu和式I的氨基酸，其中n为2，和高谷氨酸和式I的氨基酸，其中n为1，其中式I为：
。
能够共价键合以形成七个原子的连接桥的氨基酸配对的实例包括Orn-Glu (内酰胺环)；Lys-Asp (内酰胺)；或高ser-高glu (内酯)。可以形成八个原子的接头的氨基酸配对的实例包括Lys-Glu (内酰胺)；高lys-Asp (内酰胺)；Orn-高glu (内酰胺)；4-氨基Phe-Asp (内酰胺)；或Tyr-Asp (内酯)。可以形成九个原子的接头的氨基酸配对的实例包括高lys-Glu (内酰胺)；Lys-高glu (内酰胺)；4-氨基Phe-Glu (内酰胺)；或Tyr-Glu (内酯)。这些氨基酸上的任何侧链可以额外被额外的化学基团所取代，只要不破坏α螺旋的三维结构。本领域技术人员可以想象可选的配对或可选的氨基酸类似物，包括化学修饰的衍生物，其将产生类似大小和期望效果的稳定结构。例如，高半胱氨酸-高半胱氨酸二硫键为长度6个原子且可以进一步修饰以提供期望的效果。甚至没有共价键，以上描述的氨基酸配对或本领域普通技术人员可以想象的类似配对也可以通过非共价键为α螺旋提供增加的稳定性，例如，通过盐桥或氢键键合相互作用的形成。
内酰胺环的大小可以根据氨基酸侧链的长度而不同，且在一些实施方案中，内酰胺通过连接赖氨酸氨基酸的侧链与谷氨酸侧链来形成。进一步的示例性实施方案（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）包括以下配对，任选具有内酰胺桥：在位置12的Glu与在位置16的Lys；在位置12的天然Lys与在位置16的Glu；在位置16的Glu与在位置20的Lys；在位置16的Lys与在位置20的Glu；在位置20的Glu与在位置24的Lys；在位置20的Lys与在位置24的Glu；在位置24的Glu与在位置28的Lys；在位置24的Lys与在位置28的Glu。可选地，在内酰胺环中的酰胺键的次序可以反转（例如，内酰胺环可以在Lys12和Glu16的侧链之间或可选地在Glu12和Lys16之间形成）。
分子内桥而非内酰胺桥可以用于稳定胰高血糖素相关肽的α螺旋。在一些实施方案中，分子内桥是疏水桥。在这种情况下，分子内桥任选在作为胰高血糖素相关肽的α螺旋的疏水界面的部分的两个氨基酸的侧链之间。例如，通过疏水桥连接的氨基酸之一可以是位置10、14和18（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的氨基酸。
在一个特定方面中，使用全烃交联系统将烯烃复分解反应用于交联胰高血糖素相关肽的α螺旋的一个或两个转角(turns)。在这种情况下的胰高血糖素相关肽可以包含α甲基化的氨基酸，所述氨基酸携带有可变长度的烯烃侧链并在i和i+4或i+7位置配置有R或S立体化学。例如，烯烃侧可以包含(CH2)n，其中n为1-6的任何整数。在一些实施方案中，对于8原子的交联长度，n为3。合适的形成此类分子内桥的方法描述于本领域中。参见例如Schafmeister 等人，J. Am. Chem.Soc.122:5891-5892 (2000)和Walensky 等人，Science 305:1466-1470 (2004)。可选地，胰高血糖素肽可以包含位于邻近螺旋转角上的O-烯丙基Ser残基，其经钌催化的环闭合复分解反应(ring closing metathesis)一同成桥。此类交联的程序描述于例如Blackwell 等人，Angew，Chem.，Int. Ed.37:3281-3284 (1998)。
在另一特定方面中，使用非天然的硫代二丙氨酸氨基酸、羊毛硫氨酸（其已广泛用作胱氨酸的拟肽物）来用于交联α螺旋的一个转角。基于羊毛硫氨酸的环化的合适方法是本领域已知的。参见例如Matteucci 等人，Tetrahedron Letters 45:1399-1401 (2004)；Mayer 等人，J. Peptide Res.51:432-436 (1998)；Polinsky 等人，J. Med.Chem.35:4185-4194 (1992)；Osapay 等人，J. Med.Chem.40:2241-2251 (1997)；Fukase 等人，Bull.Chem.Soc.Jpn.65:2227-2240 (1992)；Harpp 等人，J. Org.Chem.36:73-80 (1971)；Goodman和Shao、Pure Appl.Chem.68:1303-1308 (1996)；和Osapay和Goodman、J. Chem.Soc.Chem.Commun.1599-1600 (1993)。
在一些实施方案中，位置i和i+7的两个Glu残基之间的α、ω-二氨基烷系链(tether)例如1,4-二氨基丙烷和1,5-二氨基戊烷用于稳定胰高血糖素肽的α螺旋。此类系链导致形成长度为9个原子或更多的桥，其取决于二氨基烷系链的长度。产生用此类系链交联的肽的合适方法描述于本领域中。参见例如Phelan 等人，J. Am. Chem.Soc.119:455-460 (1997)。
在仍另一个本发明的实施方案中，二硫键用于交联胰高血糖素相关肽的α螺旋的一个或两个转角。可选地，其中一个或两个硫原子通过亚甲基替代产生等排大环化(isosteric macrocyclization)的修饰的二硫键用于稳定胰高血糖素相关肽的α螺旋。用二硫键或基于硫的环化修饰肽的方法描述于例如Jackson 等人，J. Am. Chem.Soc.113:9391-9392 (1991)和Rudinger和Jost，Experientia 20:570-571 (1964)。
在仍另一个实施方案中，胰高血糖素相关肽的α螺旋通过位于i和i+4的两个His残基或His和Cys对经金属原子结合而稳定。金属原子可以是例如Ru(III)、Cu(II)、Zn(II)、或Cd(II)。基于金属结合的α螺旋稳定的此类方法是本领域已知的。参见例如Andrews和Tabor，Tetrahedron 55:11711-11743 (1999)；Ghadiri 等人，J. Am. Chem.Soc.112:1630-1632 (1990)；和Ghadiri 等人，J. Am. Chem.Soc.119:9063-9064 (1997)。
胰高血糖素相关肽的α螺旋可以可选地经肽环化的其他方法进行稳定，所述方法综述于Davies，J. Peptide.Sci.9:471-501 (2003)。α螺旋可以经形成酰胺桥、硫醚桥、硫酯桥、脲桥、氨基甲酸酯桥、磺酰胺桥等来稳定。例如，硫酯桥可以在C末端和Cys残基的侧链之间形成。可选地，硫酯可以经具有巯基（Cys）和羧酸（例如Asp、Glu）的氨基酸的侧链形成。在另一方法中，交联剂诸如二羧酸，例如软木酸（辛二酸）等可以在氨基酸侧链的两个官能团之间引入联系，诸如游离氨基、羟基、巯基及其组合。
根据一些实施方案，胰高血糖素相关肽的α螺旋经在位置i和i+4掺入疏水性氨基酸而稳定。例如，i可以为Tyr且i+4可以为Val或Leu；i可以为Phe且i+4可译为Cys或Met；I可以为Cys且i+4可以为Met；或i可以为Phe且i+4可以为Ile。应理解，为了本文目的，上述氨基酸配对可以反转，从而在位置i的所示氨基酸可以可选地位于i+4，而i+4氨基酸可以位于i位置。
根据本发明的其他实施方案，其中胰高血糖素相关肽为具有胰高血糖素激动剂活性、GIP激动剂活性、胰高血糖素拮抗剂和GLP-1活性的肽，α螺旋经在胰高血糖素相关肽的C末端部分（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号大约为氨基酸12-29）掺入（通过氨基酸取代或插入）一个或多个α螺旋稳定的氨基酸而得到稳定。在特定实施方案中，α螺旋稳定的氨基酸为α,α-二取代的氨基酸，包括但不限于以下任一种：氨基异丁酸（AIB）、二取代有选自甲基、乙基、丙基和正丁基的相同或不同基团或二取代有环辛烷或环庚烷（例如1-氨基环辛烷-1-甲酸）的氨基酸。在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽的位置16、17、18、19、20、21、24 或29的一个、两个、三个、四个或更多个被α,α-二取代氨基酸取代。在特定实施方案中，位置16、20、21和24的一个、两个、三个或全部被AIB所取代。
缀合物
本公开还包括其中胰高血糖素相关肽（例如，1类胰高血糖素相关肽、2类胰高血糖素相关肽、3类胰高血糖素相关肽、4类胰高血糖素相关肽或5类胰高血糖素相关肽、或6类胰高血糖素相关肽）连接至缀合物部分（任选经共价键合且任选经接头）的缀合物。连接可以通过共价化学键、物理力诸如静电、氢、离子、范德华力或疏水或亲水相互作用来实现。可以使用多种非共价偶联系统，包括生物素-抗生物素蛋白、配体/受体、酶/底物、核酸/核酸结合蛋白、脂质/脂质结合蛋白、细胞粘合分子配偶体；或任何彼此具有亲和力的结合配偶体或其片段。
胰高血糖素相关肽可以通过使肽的靶定氨基酸残基与能够与这些靶定氨基酸的所选侧链或N或C末端残基反应的有机衍生剂反应经直接共价连接而连接至缀合物部分。在肽或缀合物部分上的反应基团包括例如醛、氨基、酯、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基。衍生剂包括例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯（经半胱氨酸残基缀合）、N-羟基琥珀酰亚胺（经赖氨酸残基）、戊二醛、琥珀酸酐或本领域已知的其他试剂。可选地，缀合物部分可以经中间载体诸如多糖或多肽载体间接连接至肽。多糖载体的实例包括氨基葡聚糖。合适的多肽载体的实例包括多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、多聚天冬氨酸、其共聚物、和混合的这些氨基酸的聚合物与其他例如丝氨酸，以赋予所得的经装载的载体期望的溶解性特性。
半胱氨酰残基最通常与α-卤代乙酸（及相应的胺）诸如氯乙酸或氯乙酰胺反应，以生成羧甲基或羧基氨基甲基衍生物。半胱氨酰残基也通过与以下反应来衍生化：溴代三氟丙酮、α-溴代-β-(5-咪唑基)丙酸、氯代乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯代汞苯甲酸(p-chloromercuribenzoate)、2-氯代汞-4-硝基苯酚、或氯代-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑。
组氨酰残基通过与焦碳酸二乙酯在pH 5.5-7.0下反应来衍生化，因为该试剂对于组氨酰侧链相对特异。对溴代苯甲酰甲基溴也是可用的；反应优选在0.1 M甲胂酸钠在pH 6.0下进行。
赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸酐或其他羧酸酐反应。用这些试剂衍生化具有反转赖氨酰残基的电荷的作用。用于衍生含α氨基的残基的其他合适试剂包括亚氨酸酯诸如甲基吡啶酰胺(methyl picolinimidate)、吡哆醛磷酸、吡哆醛、氯代氢硼化物、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2,4-戊二酮和与乙醛酸的氨基转移酶催化的反应。
精氨酰残基通过与一种或几种常规试剂反应来修饰，所述常规试剂为苯乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生化需要反应在碱性条件下进行，因为胍官能团的高pKa。此外，这些试剂可以与赖氨酸的基团反应以及与精氨酸ε氨基反应。
酪氨酰残基的特定修饰可以进行，特别关注的是通过与芳香重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标签引入酪氨酰残基。最常见的是，N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别用于形成O-乙酰基酪氨酰种类和3-硝基衍生物。
羧基侧基团（天冬氨酰基或谷氨酰基）通过与碳二亚胺(R-N=C=N-R')反应而选择性修饰，其中R和R'是不同的烷基，诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓(azonia)-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，天冬氨酰基和谷氨酰基残基通过与铵离子反应转化为天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基。
其他修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸、和组氨酸侧链的α氨基的甲基化(T. E. Creighton，Proteins: Structure and Molecular Properties，W.H. Freeman & Co.，San Francisco，pp. 79-86 (1983))、天冬酰胺或谷氨酰胺的脱酰胺、N末端胺的乙酰化、和/或C末端羧酸基团的酰胺化或酯化。
另一类型的共价修饰涉及化学或酶促偶联苷类至肽。糖可以连接至(a)精氨酸和组氨酸，（b）游离羧基，（c）游离巯基诸如半胱氨酸的巯基，（d）游离羟基诸如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基，（e）芳香族残基诸如酪氨酸或色氨酸的那些，或（f）谷氨酰胺的酰胺基。这些方面描述于1987年9月11日公开的WO87/05330和Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev. Biochem.，pp. 259-306 (1981)。
可以连接至本文描述的胰高血糖素相关肽的任一种的示例性缀合物部分包括但不限于异源肽或多肽（包括例如血浆蛋白）、靶定剂、免疫球蛋白或其部分（例如可变区、CDR或Fc区）、诊断标签诸如放射性同位素、荧光团或酶标签，聚合物包括水溶性聚合物、或其他治疗或诊断剂。在一些实施方案中，提供包含本发明的胰高血糖素相关肽和血浆蛋白的缀合物，其中血浆蛋白选自白蛋白、运铁蛋白、凝血因子和球蛋白。在一些实施方案中，缀合物的血浆蛋白部分为白蛋白或运铁蛋白。在一些实施方案中，接头包含1-约60、或1-30个原子或更长、2-5个原子、2-10个原子、5-10个原子、或10-20个原子长的原子链。在一些实施方案中，链原子均为碳原子。在一些实施方案中，接头的骨架中的链原子选自C、O、N和S。链原子和接头可以根据它们期望的溶解性（亲水性）来选择，从而提供更可溶的缀合物。在一些实施方案中，接头提供经受由酶或其他催化剂或在靶组织或器官或细胞中发现的水解条件切割的官能团。在一些实施方案中，接头的长度足够长以减少空间位阻的可能。如果接头为共价键或肽键且缀合物为多肽，则整个缀合物可以为融合蛋白。此类肽接头可以是任何长度。示例性接头为约1至50个氨基酸长度，5-50、3-5、5-10、5-15、或10-30个氨基酸长度。此类融合蛋白可以可选地通过本领域普通技术人员已知的重组遗传工程方法来产生。
如上所述，在一些实施方案中，胰高血糖素相关肽缀合至例如融合至免疫球蛋白或其部分（例如可变区、CDR或Fc区）。已知类型的免疫球蛋白（Ig）包括IgG、IgA、IgE、IgD 或IgM。Fc区是Ig重链的C末端区域，其负责结合Fc受体，所述Fc受体行使活性诸如再循环（其导致延长的半衰期）、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC)。
例如，根据一些定义，人IgG重链Fc区从Cys226延伸至重链的C末端。“铰链区”通常从人IgG1的Glu216延伸至Pro230（其他IgG同种型的铰链区可以通过将参与半胱氨酸成键的半胱氨酸比对而与IgG1序列比对）。IgG的Fc区包括两个恒定域，CH2和CH3。人IgG Fc区的CH2结构域通常从氨基酸231延伸至氨基酸341。人IgG Fc区的CH3结构域通常从氨基酸342延伸至447。对免疫球蛋白或免疫球蛋白片段、或区域的氨基酸编号的提及均基于Kabat 等人 1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S. Department of Public Health，Bethesda，Md。在相关的实施方案中，Fc区域可以包含来自免疫球蛋白重链除CH1之外的一个或多个天然或修饰的恒定区，例如IgG和IgA的CH2和CH3区、或IgE的CH3和CH4区。
合适的缀合物部分包括包含FcRn结合位点的免疫球蛋白序列的部分。FcRn是补救受体(salvage receptor)，负责将免疫球蛋白再循环并将它们返回至血液中循环。结合FcRn受体的IgG的Fc部分的区域己基于X射线晶体学描述(Burmeister 等人1994，Nature 372:379)。Fc与FcRn的主要接触区域邻近CH2和CH3结构域的连接处。FC-FcRn接触均在单一Ig重链内。这样接触位点包括CH2结构域的氨基酸残基 248、250-257、272、285、288、290-291、308-311、和 314和CH3结构域的氨基酸残基385-387、428、和 433-436。
一些缀合部分可以包括或可以不包括FcγR结合位点。FcγR负责ADCC和CDC。与FcγR直接接触的Fc区内的位置的实例为氨基酸234-239 (较低铰链区)、氨基酸265-269 (B/C环)、氨基酸297-299 (C'/E环)、和氨基酸327-332 (F/G)环(Sondermann 等人，Nature 406:267-273、2000)。IgE的较低铰链区(lower hinge region)也已涉及FcRI结合 (Henry、等人，Biochemistry 36、15568-15578，1997)。参与IgA受体结合的残基描述于Lewis 等人，(J Immunol.175:6694-701，2005)。参与IgE受体结合的氨基酸残基描述于Sayers 等人(J Biol Chem.279(34):35320-5，2004)。
氨基酸修饰可以对免疫球蛋白的Fc区进行。此类变体Fc区包含在Fc区的CH3结构域（残基342-447）内的至少一个氨基酸修饰和/或在Fc区的CH2结构域（残基231-341）中的至少一个氨基酸修饰。据信给予FcRn增加的亲和力的突变包括T256A、T307A、E380A、和 N434A (Shields 等人2001、J. Biol.Chem.276:6591)。其他突变可以降低Fc区与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的结合而不显著降低对FcRn的亲和力。例如，在Fc区的位置297的Asn用Ala或另一个氨基酸的取代去除高度保守的N糖基化位点并可以导致伴随Fc区的延长的半衰期的降低的免疫原性，以及与FcγR的降低的结合(Routledge 等人1995，Transplantation 60:847；Friend 等人1999，Transplantation 68:1632；Shields 等人1995，J. Biol.Chem.276:6591)。在IgG1的位置233-236的氨基酸修饰已进行，其降低与FcγR的结合(Ward和Ghetie 1995，Therapeutic Immunology 2:77和Armour 等人1999，Eur.J. Immunol.29:2613)。一些示例性氨基酸取代描述于美国专利7,355,008和7,381,408，其以其整体通过引用并入本文。
rPEG
在一些实施方案中，本发明的缀合物包含胰高血糖素超家族肽，包括胰高血糖素相关肽、骨钙蛋白、以及前述的类似物、衍生物和缀合物，其融合至能够形成类似于化学PEG（例如重组PEG (rPEG)分子）的扩展的构象的附属肽，诸如描述于国际专利申请公开号WO2009/023270和美国专利申请公开号US2008/0286808中的那些。rPEG分子不是聚乙二醇。rPEG分子在一些方面是包含甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸或脯氨酸中的一种或多种的多肽。在一些方面，rPEG是均聚物，例如多聚甘氨酸、多聚丝氨酸、多聚谷氨酸、多聚天冬氨酸、多聚丙氨酸或多聚脯氨酸。在其他实施方案中，rPEG包含两种类型的重复的氨基酸，例如多聚(Gly-Ser)、多聚(Gly-Glu)、多聚(Gly-Ala)、多聚(Gly-Asp)、多聚(Gly-Pro)、多聚(Ser-Glu)等。在一些方面中，rPEG包含三种不同类型的氨基酸，例如多聚(Gly-Ser-Glu)。在特定方面，rPEG增加胰高血糖素超家族肽或骨钙蛋白的半衰期。在一些方面中，rPEG包含净正电荷或净负电荷。rPEG在一些方面缺少二级结构。在一些实施方案中，rPEG长度大于或等于10个氨基酸，且在一些实施方案中，长度为约40至约50个氨基酸。附属肽(accessory peptide)在一些方面中经肽键或蛋白酶切割位点融合至本发明的肽的N末端或C末端，或插入至本发明的肽的环内。rPEG在一些方面中包含亲和力标签或连接至大于5 kDa的PEG。在一些实施方案中，rPEG赋予本发明的肽增加的流体动力学半径、血清半衰期、蛋白酶抗性、或溶解性，且在一些方面中赋予肽降低的免疫原性。
融合肽－C末端延伸
在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽可以包含C末端或包括但不限于以下的C末端氨基酸序列：COOH、CONH2、GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:710)、GPSSGAPPPS-CONH2 (SEQ ID NO:711)、胃泌酸调节素羧基端延伸、KRNRNNIA (SEQ ID NO:714)或KGKKNDWKHNITQ (SEQ ID NO:713)。例如，毒蜥外泌肽-4的末端十个氨基酸（即SEQ ID NO: 710的序列(GPSSGAPPPS)）连接至本公开的1类胰高血糖素相关肽、2类胰高血糖素相关肽、3类胰高血糖素相关肽、4类胰高血糖素相关肽、5类胰高血糖素相关肽或6类胰高血糖素相关肽的羧基末端。
诱导重量减少的另一种化合物是胃泌酸调节素，其是发现于小肠内的天然存在的消化激素（参见Diabetes 2005；54:2390-2395）。胃泌酸调节素是含有胰高血糖素的29个氨基酸序列随后为SEQ ID NO: 714的8个氨基酸的羧基末端延伸(KRNRNNIA)的37个氨基酸的肽(SEQ ID NO: 706)。因此，在一些实施方案中，提供进一步包含SEQ ID NO: 714的序列的羧基末端延伸或具有序列KRNR的四个氨基酸的延伸的胰高血糖素相关肽的前体药物衍生物。
在位置3的胰高血糖素修饰
本文描述的1类至3类胰高血糖素相关肽可以在位置3（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）进行修饰以保持或增加在胰高血糖素受体的活性。
在一些实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽，在胰高血糖素受体的保持的或增强的活性可以通过在位置3用谷氨酰胺类似物修饰Gln来实现。例如，在位置3包含谷氨酰胺类似物的1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽可以展示天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 701)对胰高血糖素受体的约5％、约10％、约20％、约50％、或约85％或更高的活性。在一些实施方案中，在位置3包含谷氨酰胺类似物的1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽可以展示具有（除了位置3的修饰的氨基酸之外）与包含谷氨酰胺类似物的肽相同的氨基酸序列的相应的胰高血糖素肽对胰高血糖素受体的约20％、约50％、约75％、约100％、约200％、或约500％或更高的活性。在一些实施方案中，在位置3包含谷氨酰胺类似物的1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽展示对胰高血糖素受体增强的活性，但所述增强的活性不超过天然胰高血糖素或具有（除了位置3的修饰的氨基酸之外）与包含谷氨酰胺类似物的肽相同的氨基酸序列的相应的胰高血糖素相关肽对胰高血糖素受体的1000%、10,000%、100,000%或1,000,000%的活性。
在一些实施方案中，谷氨酰胺类似物是包含结构I、II或III的侧链的天然存在或非天然存在的氨基酸：
结构I
结构II
结构III
其中R1为C0-3烷基或C0-3杂烷基；R2为NHR4或C1-3烷基；R3为C1-3烷基；R4为H或C1-3烷基；X为NH、O或S；且Y为NHR4、SR3、或OR3。在一些实施方案中，X为NH或Y为NHR4。在一些实施方案中，R1为C0-2烷基或C1杂烷基。在一些实施方案中，R2为NHR4或C1烷基。在一些实施方案中，R4为H或C1烷基。在示例性实施方案中，其中胰高血糖素相关肽为1类、2类、6类或3类胰高血糖素相关肽，提供包含结构I的侧链的氨基酸，其中R1为CH2-S，X为NH且R2为CH3 (乙酰氨基甲基-半胱氨酸、C(Acm))；R1为CH2，X为NH且R2为CH3 (乙酰基二氨基丁酸、Dab(Ac))；R1为C0烷基， X为NH，R2为NHR4且R4为H (氨基甲酰基二氨基丙酸、Dap(尿素))；或R1为CH2-CH2，X为NH且R2为CH3 (乙酰鸟氨酸、Orn(Ac))。在示例性实施方案中，提供包含结构II的侧链的氨基酸，其中R1为CH2，Y为NHR4，且R4为CH3（甲基谷氨酰胺，Q(Me)）；在示例性实施方案中，提供包含结构III的侧链的氨基酸，其中R1为CH2且R4为H（甲硫氨酸-亚砜，M(O)）；在特定实施方案中，位置3的氨基酸被Dab(Ac)取代。
二聚体
关于1类、2类、6类和3类胰高血糖素相关肽，胰高血糖素相关肽可以是包含经接头结合的至少两个、三个、或更多个肽的二聚体、三聚体或更高级多聚体的部分，其中至少一个或两个肽为胰高血糖素相关肽。二聚体可以是同二聚体或异二聚体。在一些实施方案中，接头选自双功能巯基交联剂和双功能胺交联剂。在某些实施方案中，接头为PEG，例如5 kDa PEG、20 kDa PEG。在一些实施方案中，接头是二硫键。例如，二聚体的每一单体可以包含Cys残基（例如末端或内部位置的Cys）且每一Cys残基的硫原子参与二硫键的形成。在本发明的一些方面中，单体经末端氨基酸（例如N末端或C末端）、经内部氨基酸、或经至少一个单体的末端氨基酸和至少一个其他单体的内部氨基酸而连接。在特定方面，单体不经N末端氨基酸连接。在一些方面，多聚体的单体以“尾与尾(tail-to-tail)”方向连接在一起，其中每一单体的C末端氨基连接在一起。缀合物部分可以共价连接至本文描述的任何胰高血糖素相关肽，包括二聚体、三聚体或更高级多聚体。
制备胰高血糖素相关肽的方法
本文公开的该胰高血糖素相关肽（及前体药物）可以通过标准合成方法、重组DNA技术、或制备肽和融合蛋白的任何其他方法来制备。尽管某些非天然氨基酸无法通过标准重组DNA技术来表达，但其制备技术是本领域已知的。当可应用时，除了标准肽化学反应，包括非肽部分的本发明的化合物也可以通过标准有机化学反应来合成。
胰高血糖素相关肽的类别下文详细描述。关于涉及1、2、3、4、5和/或6类胰高血糖素相关肽修饰的公开内容部分的每一部分，参考上文详述的前体药物化合物的胰高血糖素相关肽部分（Q）来描述。因此，关于胰高血糖素相关肽类别描述的结构元件为Q的结构元件（其随后进一步修饰以生成如上所述的前体药物化合物）。
1类胰高血糖素相关肽
在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽为1类胰高血糖素相关肽，其描述于本文和国际专利申请号PCT US2009/47437 (提交于2009年6月16日)、公开于2008年7月17日的国际专利申请公开号WO 2008/086086和美国临时申请号61/090,415，其内容以其整体通过引用并入，以及提交于11年6月23日的国际申请号PCT/US11/41623和美国临时申请号61/358,710中，其内容以其整体通过引用并入。
关于1类胰高血糖素相关肽的以下部分(SEQ ID NOs: 801-915)中提及的生物序列对应于国际专利申请号PCT US2009/47437中的SEQ ID NOs: 1-115。
活性
1类胰高血糖素肽保留相对于天然胰高血糖素肽(SEQ ID NO: 801)的胰高血糖素受体活性。例如，胰高血糖素肽可以保留天然胰高血糖素的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%活性、80%活性、85%活性、或90%的活性（使用实施例中一般描述的测定，例如通过cAMP产生测定，计算为胰高血糖素肽相对于胰高血糖素的EC50的反比）。在一些实施方案中，1类胰高血糖素相关肽具有与胰高血糖素相同的或比其更高的活性（本文用术语“效力”同义使用）。在一些实施方案中，本文描述的胰高血糖素相关肽展示不超过天然胰高血糖素肽的活性的约100%、1000%、10,000%、100,000%、或1,000,000%。
当例如使用实施例5的测定在过表达胰高血糖素受体的HEK293细胞中测试cAMP诱导时，任何本文描述的1类胰高血糖素相关肽可以展示对人胰高血糖素受体的约100 nM、75 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、5 nM、1 nM或更低的EC50。通常，PEG化的肽将展示相比于未PEG化的肽更高的EC50。例如，本文描述的1类胰高血糖素相关肽当PEG化时，可以对胰高血糖素受体展示出天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 801)对胰高血糖素受体的活性的至少20% (例如，至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、100%、150%、200%、400%、500%或更高)。在某些实施方案中，本文描述的1类胰高血糖素相关肽当缺少亲水部分时展示出天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的所示的％活性，而当包含亲水部分时展示出天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的降低的％活性。例如，本文描述的1类胰高血糖素相关肽当PEG化时，可以对胰高血糖素受体展示出天然胰高血糖素的活性的至少2% (例如，至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、或至少10％)的活性。在一些实施方案中，本文描述的1类胰高血糖素相关肽可以展示出任何上述的活性，但不超过天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的1000%、10,000%、100,000%、或1,000,000%。
在一些实施方案中，1类胰高血糖素相关肽展示出天然GLP-1对GLP-1受体的活性的少于约5%、4%、3%、2% 或1%和/或对于胰高血糖素受体相比于对GLP-1受体的大于约5倍、10倍或15倍的选择性。例如，在一些实施方案中，1类胰高血糖素相关肽展示出天然GLP-1对GLP-1受体的活性的少于5%和/或展示出对于胰高血糖素受体相比于对GLP-1受体的大于5倍的选择性。
改善的溶解性
天然胰高血糖素展示出在水溶液中尤其在生理pH下差的溶解性，趋于随时间聚集和沉淀。相反，1类胰高血糖素相关肽在一些实施方案中展示出相比于天然胰高血糖素在6-8或6-9的pH例如在pH7在25℃下24小时后至少2倍、5倍或甚至更高的溶解性。
因此，在一些实施方案中，1类胰高血糖素相关肽相对于His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe- Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID NO: 801)的野生型肽已修饰以改善肽在水溶液中尤其在约5.5至约8.0范围的pH下的溶解性，同时保留天然肽的生物活性。
例如，任何本文描述的1类胰高血糖素相关肽的溶解性可以进一步通过连接亲水部分至肽来改善。引入此类基团可以增加作用的持续时间，例如通过在循环中延长的半衰期来测量。亲水部分本文进一步描述。
用带电荷的残基修饰
在一些实施方案中，通过用选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的带电荷的氨基酸取代天然的不带电荷的氨基酸或者通过添加带电荷的氨基酸至肽的氨基末端或羧基末端来将电荷添加至1类胰高血糖素相关肽，从而改善溶解性。
根据一些实施方案，由于通过引入带电荷的氨基酸至肽的C末端部分（且在一些实施方案中在C末端至SEQ ID NO: 801的位置27的位置）的氨基酸取代和/或添加来修饰肽这一事实，1类胰高血糖素相关肽已改进溶解性。任选地，一个、两个或三个带电荷的氨基酸可以引入C末端部分，且在一些实施方案中为C末端至位置27。根据一些实施方案，在位置28和/或29的天然氨基酸被带电荷的氨基酸取代，和/或一至三个带电荷的氨基酸添加至肽的C末端，例如在位置27、28或29之后。在示例性实施方案中，一个、两个、三个或所有带电荷的氨基酸均带负电荷。在其他实施方案中，一个、两个、三个或所有带电荷的氨基酸均带正电荷。
在特定示例性实施方案中，1类胰高血糖素相关肽可以包含以下修饰中的任一个或两个：用E取代N28；用D取代N28；用D取代T29；用E取代T29；在位置27、28或29之后插入E；在位置27、28或29之后插入D。例如，D28E29、E28E29、E29E30、E28E30、D28E30。
根据一个示例性实施方案，1类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NO: 811的氨基酸序列，或其相对于天然胰高血糖素含有1-3个进一步氨基酸修饰（本文参考胰高血糖素激动剂描述）的类似物、或其胰高血糖素激动剂类似物。SEQ ID NO:811代表修饰的1类胰高血糖素相关肽，其中天然蛋白在位置28的天冬酰胺残基已被天冬氨酸取代。在另一个示例性实施方案中，1类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NO: 838的氨基酸序列，其中天然蛋白在位置28的天冬酰胺残基已被谷氨酸取代。其他示例性实施方案包括SEQ ID NOS: 824、825、826、833、835、836和837的1类胰高血糖素相关肽。
在位置28和/或29用带电荷的氨基酸取代天然存在的氨基酸、和/或在1类胰高血糖素相关肽的羧基末端添加一个或两个带电荷的氨基酸，增强胰高血糖素肽在水溶液中在生理学相关pH（即约6.5至约7.5的pH）下的溶解性和稳定性至少5倍且多至30倍。因此，一些实施方案的1类胰高血糖素肽在约5.5至8的给定的pH例如pH7下（当在25℃下24小时后测量）保留胰高血糖素活性且展示相对于天然胰高血糖素的至少2倍、5倍、10倍、15倍、25倍、30倍或更高的溶解性。
另外的修饰例如保守取代（所述修饰在本文进一步描述）可以对1类胰高血糖素相关肽进行，所述修饰仍允许其保留胰高血糖素活性。
改善的稳定性
任何1类胰高血糖素肽可以额外展示出改善的稳定性和/或降低的降解，例如在25℃下24小时后保留至少95％的原始肽。任何本文公开的1类胰高血糖素相关肽可以额外展示出在5.5至8的范围内的pH下改善的稳定性，在25℃下24小时后保留至少75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的原始肽。在一些实施方案中，本发明的1类胰高血糖素相关肽展示出改善的稳定性，从而在至少20℃(例如，21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、至少27.5℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃、至少50℃)且低于100℃、低于85℃、低于75℃、或低于70℃的温度下在溶液中约1或更多周（例如约2周、约4周、约1个约、约2个月、约4个月、约6个月、约8个月、约10个月、约12个月）后通过紫外（UV）检测器在280 nm处可检测至少75％（例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、多于95%、高至100%)的浓度的肽或少于约25% (例如，少于20%、少于15%、少于10%、少于5%、4%、3%、2%、1%、低至0%）的降解的肽。1类胰高血糖素相关肽可以包括额外的修饰，所述修饰改变其药物特性，例如增加的效力，循环中延长的半衰期，增加的储存期，降低的沉淀或聚集，和/或降低的降解，例如储存后切割或化学修饰的发生降低。
在仍进一步的示例性实施方案中，任何前述1类胰高血糖素相关肽可以通过修饰SEQ ID NO: 801的位置15的氨基酸来降低肽随时间（尤其在酸性或碱性缓冲液中）的降解，从而进一步修饰以改善稳定性。在示例性实施方案中，位置15的Asp被Glu、高Glu、半胱磺酸(cysteic acid)或高半胱磺酸取代。
可选地，任何本文描述1类胰高血糖素相关肽可以进一步修饰以改善稳定性，其通过修饰在SEQ ID NO: 801的位置16的氨基酸。在示例性的实施方案中，位置16的Ser被Thr或AIB所取代，或本文描述的关于1类胰高血糖素相关肽的增强对胰高血糖素受体的效力的任何氨基酸取代。此类修饰降低在Asp15-Ser16之间的肽键的切割。
在一些实施方案中，任何本文描述的1类胰高血糖素相关肽可以进一步修饰以降低在多个氨基酸位置的降解，其通过修饰位置20、21、24或27中的任一个、两个、三个或所有。示例性实施方案包括在位置20用Ser、Thr、Ala或AIB取代Gln，在位置21用Glu取代Asp，在位置24用Ala或AIB取代Gln，在位置27用Leu或Nle取代Met。由于甲硫氨酸的氧化，因此去除或取代甲硫氨酸降低降解。由于Gln或Asn的脱酰胺作用，去除或取代Gln或Asn降低降解。去除或取代Asp降低降解，其通过脱水Asp以形成环状的琥珀酰亚胺中间体随后异构化为异天冬氨酸来发生。
增强的效力
根据另一实施方案，提供1类胰高血糖素相关肽，其具有对胰高血糖素受体增强的效力，其中肽包含天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 801)的位置16的氨基酸修饰。借助于非现实性实例，此类增强的效力可以通过在位置16用以下取代天然存在的丝氨酸来提供：谷氨酸、或另一具有长度为4个原子的侧链的带负电荷的氨基酸、或可选地谷氨酰胺、高谷氨酸或高半胱磺酸或具有含有至少一个杂原子（例如N、O、S、P）的侧链和具有长度约4（或3-5）个原子的侧链的带电荷的氨基酸之一。在位置16用谷氨酸取代丝氨酸增强胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性升高至少2倍、4倍、5倍且高至10倍。在一些实施方案中，1类胰高血糖素相关肽保留相对于GLP-1受体的对胰高血糖素受体的选择性，例如至少5倍、10倍、或15倍的选择性。
DPP-IV抗性
在一些实施方案中，本文公开的1类胰高血糖素肽在位置1或2进一步修饰以减少对二肽基肽酶IV切割的易感性。更具体而言，在一些实施方案中，1类胰高血糖素相关肽的位置1和/或位置2取代有本文描述的DPP-IV抗性氨基酸。在一些实施方案中，类似物肽的位置2被氨基异丁酸取代。在一些实施方案中，类似物肽的位置2被选自以下的氨基酸取代：D-丝氨酸、D-丙氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸和ε-氨基异丁酸。在另一实施方案中，1类胰高血糖素相关肽的位置2被选自以下的氨基酸取代：D-丝氨酸、甘氨酸和氨基异丁酸。在一些实施方案中，位置2的氨基酸不是D-丝氨酸。
胰高血糖素肽的位置1和/或位置2的氨基酸修饰后胰高血糖素活性的降低可以通过稳定胰高血糖素肽的C末端部分（约氨基酸12-29）中的α螺旋结构来恢复。α螺旋结构可以通过例如形成共价或非共价分子内桥（例如在位置“i”和“i+4”的氨基酸侧链之间的内酰胺桥，其中i为12-25的整数）、在位置12-29附近用α螺旋稳定的氨基酸（例如α,α-二取代的氨基酸）取代和/或插入来稳定，如本文进一步描述的。
在位置3的修饰
胰高血糖素受体活性可以通过在位置3（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的氨基酸修饰来降低，例如在位置3用酸性、碱性、或疏水性氨基酸取代天然存在的谷氨酰胺。例如，在位置3用谷氨酸、鸟氨酸、或正亮氨酸取代实质上降低或破坏了胰高血糖素受体活性。
对胰高血糖素受体的维持或增强的活性可以通过在位置3用谷氨酰胺类似物（如本文描述的）修饰Gln来实现。例如，胰高血糖素激动剂可以包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:863、SEQ ID NO:869、SEQ ID NO:870、SEQ ID NO:871、SEQ ID NO:872、SEQ ID NO:873、和SEQ ID NO:874。
用C末端酰胺和酯增强GLP-1活性
对GLP-1受体增强的活性通过用电荷中性的基团诸如酰胺或酯替代C末端氨基酸的羧酸来提供。相反，保留肽的C末端的天然羧酸维持1类胰高血糖素相关肽对胰高血糖素受体相对于GLP-1受体的相对更大的选择性（例如，大于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20倍）。
进一步的修饰和组合
可以对1类胰高血糖素相关肽进行额外的修饰，其可以进一步增加溶解性和/或稳定性和/或胰高血糖素活性。1类胰高血糖素相关肽可以可选地包含其他修饰，其不实质上影响溶解性或稳定性，并且其不实质上降低胰高血糖素活性。在示例性实施方案中，1类胰高血糖素相关肽相对于天然胰高血糖素序列可以包含总计高至11、或高至12、或高至13、或高至14个氨基酸修饰。例如，保守或非保守的取代、添加或缺失可以在位置2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28 或29的任一个进行。
1类胰高血糖素相关肽的示例性修饰包括但不限于：
（a）非保守取代，保守取代、添加或缺失，同时保留至少部分的胰高血糖素激动剂活性，例如，在位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28 或29中的一个或多个的保守取代，在位置10用Val或Phe取代Tyr，在位置12用Arg取代Lys，在这些位置中的一个或多个用Ala取代；
（b）缺失位置29和/或28的氨基酸，且任选位置27，同时保留至少部分胰高血糖素激动剂活性；
（c）在位置15修饰天冬氨酸，例如，通过用谷氨酸、高谷氨酸、半胱磺酸或高半胱磺酸取代，其可以降低降解；或在位置16修饰丝氨酸，例如，通过苏氨酸、AIB、谷氨酸或用另一个具有4个原子长的侧链的带负电荷的氨基酸或可选地用谷氨酰胺、高谷氨酸或高半胱磺酸之一取代，其同样可以降低由于Asp15-Ser16键的切割的降解；
（d）添加亲水部分诸如水可溶性聚合物聚乙二醇，如本文所述，例如在位置16、17、20、21、24、29、40或在C末端氨基酸，其可以增加溶解性和/或半衰期；
（e）在位置27修饰甲硫氨酸，例如，通过用亮氨酸或正亮氨酸来取代，以降低氧化降解；
（f）在位置20或24修饰Gln，例如，通过用Ser、Thr、Ala或AIB取代，以降低经Gln的脱酰胺作用发生的降解；
（g）在位置21修饰Asp，例如通过用Glu取代，以降低经Asp脱水形成环状琥珀酰亚胺中间体随后异构化为异天冬氨酸而发生的降解；
（h）如本文所述在位置1或2的修饰，其改善对DPP-IV切割的抗性，任选组合有分子内桥，诸如在位置“i”和“i+4”之间的内酰胺桥，其中i为12-25的整数，例如12、16、20、24；
（i）如本文所述的酰化或烷基化胰高血糖素肽，其可以增加对胰高血糖素受体和/或GLP-1受体的活性，增加在循环中的半衰期和/或延长作用持续时间和/或延迟作用的开始，任选组合有添加亲水部分，额外的或可选地，任选组合有这样的修饰，所述修饰选择性降低对GLP-1肽的活性，例如在位置7的Thr的修饰，诸如在位置7用缺少羟基的氨基酸例如Abu或Ile取代Thr；缺失C末端氨基酸至位置27的氨基酸（例如，缺失位置28和29的氨基酸的一个或两个，产生长度为27或28个氨基酸的肽）；
（j）如本文所述的C末端延伸；
（k）如文所述的同二聚化或异二聚化；和
（a）至（k）的组合。
在一些实施方案中，1类胰高血糖素相关肽的示例性修饰包括选自组A的至少一个氨基酸修饰和选自组B和/或组C的一个或多个氨基酸修饰，
其中组A为：
在位置28用带电荷的氨基酸取代Asn；
在位置28用选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸的带电荷的氨基酸取代Asn；
在位置28用Asn、Asp或Glu取代；
在位置28用Asp取代；
在位置28用Glu取代；
在位置29用带电荷的氨基酸取代Thr；
在位置29用选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸的带电荷的氨基酸取代Thr；
在位置29用Asp、Glu或Lys取代；
在位置29用Glu取代；
在位置29后插入1-3个带电荷的氨基酸；
在位置29后插入Glu或Lys；
在位置29后插入Gly-Lys或Lys-Lys；
或其组合；
其中组B为：
在位置15用Glu取代Asp；
在位置16用Thr或AIB取代Ser；
且其中组C为：
在位置1用降低胰高血糖素肽对由二肽基肽酶IV (DPP-IV)的切割的易感性的非天然氨基酸取代His，
在位置2用降低胰高血糖素肽对由二肽基肽酶IV (DPP-IV)的切割的易感性的非天然氨基酸取代Ser，
在位置12用Arg取代Lys；
在位置20用Ser、Thr、Ala 或AIB取代Gln；
在位置21用Glu取代Asp；
在位置24用Ser、Thr、Ala 或AIB取代Gln；
在位置27用Leu或Nle取代Met；
在位置27-29缺失氨基酸；
在位置28-29缺失氨基酸；
在位置29缺失氨基酸；
或其组合。
在示例性实施方案中，位置12的Lys被Arg取代。在其他示例性实施方案中，位置29和/或28的氨基酸和任选在位置27的氨基酸被缺失。
在一些特定实施方案中，胰高血糖素肽包含（a）在位置1和/或2赋予DPP-IV抗性的氨基酸修饰，例如在位置1用DMIA取代，或在位置2用AIB取代，（b）在位置12-29内的分子内桥，例如在位置16和20，或位置16、20、21和24的氨基酸用α,α二取代氨基酸的一个或多个取代，任选地（c）连接至亲水部分诸如PEG，例如经在位置24、29的Cys或在C末端氨基酸，任选地（d）在位置27的氨基酸修饰，其用例如Nle取代Met，任选地（e）在位置20、21和24的氨基酸修饰，其降低降解，和任选地（f）连接至SEQ ID NO: 820。当胰高血糖素肽连接至SEQ ID NO: 820时，位置29的氨基酸在某些实施方案中为Thr或Gly。在其他特定实施方案中，胰高血糖素肽包含（a）Asp28Glu29、或Glu28Glu29、或Glu29Glu30、或Glu28Glu30、或Asp28Glu30，和任选地（b）在位置16的氨基酸修饰，其用例如Thr或AIB取代Ser，和任选地（c）在位置27的氨基酸修饰，其用例如Nle取代Met，和任选地（d）在位置20、21和24的氨基酸修饰，其降低降解。在特定的实施方案中，胰高血糖素肽为T16、A20、E21、A24、Nle27、D28、E29。
在一些实施方案中，1类胰高血糖素相关肽包含氨基酸序列：
X1-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z (SEQ ID NO:839)，其具有对其的1-3个氨基酸修饰，
其中X1和/或X2为降低胰高血糖素肽对由二肽基肽酶IV (DPP-IV)的切割的易感性（或增加其抗性）的非天然氨基酸，
其中Z选自–COOH (天然存在的C末端羧基)、-Asn-COOH、Asn-Thr-COOH、和 Y-COOH，其中Y为1-2个氨基酸，且
其中分子内桥优选共价键连接位置i的氨基酸和位置i+4的氨基酸的侧链，其中i为12、16、20或24。
在一些实施方案中，分子内桥是内酰胺桥。在一些实施方案中，SEQ ID NO: 839的位置i和i+4的氨基酸为Lys和Glu，例如Glu16和Lys20。在一些实施方案中，X1选自：D-His、N-甲基-His、α-甲基-His、咪唑乙酸、脱氨基His、羟基-His、乙酰基-His、高-His和α,α二甲基咪唑乙酸（DMIA）。在其他实施方案中，X2选自：D-Ser、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、Val、和α,氨基异丁酸(AIB)。在一些实施方案中，胰高血糖素肽共价连接至在以下的亲水部分：氨基酸位置16、17、20、21、24、29、40、C末端延伸内、或在C末端氨基酸。在示例性实施方案中，该亲水部分共价连接至在任何这些位置的Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸、或乙酰基-苯丙氨酸残基。示例性亲水部分包括聚乙二醇（PEG），例如分子量约1,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约40,000道尔顿的聚乙二醇。
在其他实施方案中，I类胰高血糖素相关肽包含氨基酸序列：
其中X1和/或X2为降低胰高血糖素肽对由二肽基肽酶IV (DPP-IV)的切割的易感性（或增加其抗性）的非天然氨基酸，
其中胰高血糖素肽的位置16、20、21、和24的一个、两个、三个、四个或更多个被α,α-二取代氨基酸取代，和
其中Z选自–COOH (天然存在的C末端羧基)、-Asn-COOH、Asn-Thr-COOH、和Y-COOH，其中Y为1-2个氨基酸。
对前述1类胰高血糖素相关肽或类似物的示例性进一步氨基酸修饰包括在位置7用缺少羟基的氨基酸例如氨基丁酸（Abu）、Ile取代Thr，任选地，组合有取代或添加包含共价连接（任选地，经间隔基）至酰基或烷基的侧链的氨基酸，所述酰基或烷基对于天然存在的氨基酸是非天然的，在位置12用Arg取代Lys；在位置15用Glu取代Asp；在位置16用Thr或AIB取代Ser；在位置20用Ser、Thr、Ala或AIB取代Gln；在位置21用Glu取代Asp；在位置24用Ser、Thr、Ala、或AIB取代Gln；在位置27用Leu或Nle取代Met；在位置28用带电荷的氨基酸取代Asn；在位置28用选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸的带电荷的氨基酸取代Asn；在位置28用Asn、Asp或Glu取代；在位置28用Asp取代；在位置28用Glu取代；在位置29用带电荷的氨基酸取代Thr；在位置29用选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸的带电荷的氨基酸取代Thr；在位置29用Asp、Glu或Lys取代；在位置29用Glu取代；在位置29后插入1-3个带电荷的氨基酸；在位置30（即位置29后）插入Glu或Lys；任选在位置31插入Lys；添加SEQ ID NO: 820至C末端，任选地，其中位置29的氨基酸为Thr或Gly；取代或添加共价连接至亲水部分的氨基酸；或其组合。
提及1类胰高血糖素激动剂的上文描述的任何增加胰高血糖素受体活性，保留部分胰高血糖素受体活性，改善溶解性，增加稳定性，或降低降解的的修饰，可以单独地或组合应用于1类胰高血糖素肽。因此，可以制备这样的1类胰高血糖素相关肽，其保留至少20％的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性，且其以至少1 mg/mL的浓度在6-8或6-9的pH下（例如pH7）是可溶的，且任选地在25℃下24小时后保留至少95％的原始肽（例如，5％或更少的原始肽降解或被切割）。可选地，可以制备这样的高效力1类胰高血糖素肽，其展示至少约100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%、900%或10倍或更高的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性，且任选地以至少1 mg/mL的浓度在6-8或6-9的pH下（例如pH7）是可溶的，且任选地在25℃下24小时后保留至少95％的原始肽（例如，5％或更少的原始肽降解或被切割）。在一些实施方案中，本文描述的1类胰高血糖素相关肽可以展示出对胰高血糖素受体至少任何上述的相对水平的活性，但不超过天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的10,000%、100,000%、或1,000,000%。
1类胰高血糖素相关肽的实施方案的实例
根据一些实施方案，SEQ ID NO: 801的天然胰高血糖素肽通过在位置28和/或29用带负电荷的氨基酸（例如天冬氨酸或谷氨酸）取代天然氨基酸和任选地添加带负电荷的氨基酸（例如天冬氨酸或谷氨酸）至肽的羧基末端来修饰。在可选的实施方案中，SEQ ID NO: 801的天然胰高血糖素肽通过在位置29用带正电荷的氨基酸（例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸）取代天然氨基酸和任选地添加一个或两个带正电荷的氨基酸（例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸）至肽的羧基末端来修饰。根据一些实施方案，提供具有改善的溶解性和稳定性的胰高血糖素类似物，其中类似物包含SEQ ID NO: 834的氨基酸序列，条件是位置28或29的至少一个氨基酸被酸性氨基酸所取代和/或一个额外的酸性氨基酸被添加至SEQ ID NO: 834的羧基末端。在一些实施方案中，酸性氨基酸独立地选自Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸。
根据一些实施方案，提供具有改善的溶解性和稳定性的胰高血糖素激动剂，其中所述激动剂包含SEQ ID NO: 833的氨基酸序列，其中位置27、28或29的至少一个氨基酸被非天然氨基酸残基取代（即，在类似物的位置27、28或29存在的至少一个氨基酸为与SEQ ID NO: 801中对应位置存在的氨基酸不同的酸性氨基酸）。根据一些实施方案，提供包含SEQ ID NO: 833的序列的胰高血糖素激动剂，条件是当位置28的氨基酸为天冬酰胺且位置29的氨基酸为苏氨酸，所述肽进一步包含添加至胰高血糖素肽的羧基末端的独立地选自Lys、Arg、His、Asp或Glu的一个或两个氨基酸。
已报道天然胰高血糖素肽的某些位置可以被修饰同时保留亲本肽的至少一些活性。因此，申请人理解位于SEQ ID NO: 811的肽的位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28 或29的位置的一个或多个氨基酸可以被不同于天然胰高血糖素肽中存在的氨基酸所取代，且仍保留增强的效力、生理pH稳定性和亲本胰高血糖素肽的生物活性。例如，根据一些实施方案，天然肽的位置27存在的甲硫氨酸残基改变为亮氨酸或正亮氨酸以防止肽的氧化降解。
在一些实施方案中，提供SEQ ID NO: 833的胰高血糖素类似物，其中选自类似物的位置1、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21 或24的1-6个氨基酸不同于SEQ ID NO: 801的对应氨基酸。根据另一实施方案，提供SEQ ID NO: 833的胰高血糖素类似物，其中选自类似物的位置1、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21 或24的1-3个氨基酸不同于SEQ ID NO: 801的对应氨基酸。在另一个实施方案中，提供SEQ ID NO: 807、SEQ ID NO: 808或SEQ ID NO: 834的胰高血糖素类似物，其中选自类似物的位置1、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21 或24的1-2个氨基酸不同于SEQ ID NO: 801的对应氨基酸，且在进一步的实施方案中，那一至两个不同的氨基酸代表相对于天然序列(SEQ ID NO: 801)中存在的氨基酸的保守氨基酸取代。在一些实施方案中，提供SEQ ID NO: 811或SEQ ID NO: 813的胰高血糖素肽，其中胰高血糖素肽进一步包含选自位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27 或29的位置处一个、两个或三个氨基酸取代。在一些实施方案中，在位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、27或29的取代是保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，提供胰高血糖素激动剂，其包含SEQ ID NO: 801的类似物肽，其中所述类似物与SEQ ID NO: 801的不同在于在位置2具有不是丝氨酸的氨基酸且在位置28或29用酸性氨基酸取代天然氨基酸或添加酸性氨基酸至SEQ ID NO: 801的肽的羧基末端。在一些实施方案中，酸性氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施方案中，提供SEQ ID NO: 809、SEQ ID NO: 812、SEQ ID NO: 813或SEQ ID NO: 832的胰高血糖素类似物，其中所述类似物与亲本分子的不同在于位置2的取代。更具体而言，类似物肽的位置2被选自以下的氨基酸取代：D-丝氨酸、丙氨酸、D-丙氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸和氨基异丁酸。
在另一实施方案中，提供胰高血糖素激动剂，其包含SEQ ID NO: 801的类似物肽，其中所述类似物与SEQ ID NO: 801的不同在于在位置1具有不是组氨酸的氨基酸且在位置28或29用酸性氨基酸取代天然氨基酸或添加酸性氨基酸至SEQ ID NO: 801的肽的羧基末端。在一些实施方案中，酸性氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施方案中，提供SEQ ID NO: 809、SEQ ID NO: 812、SEQ ID NO: 813或SEQ ID NO: 832的胰高血糖素类似物，其中所述类似物与亲本分子的不同在于位置1的取代。更具体而言，类似物肽的位置1被选自以下的氨基酸取代：DMIA、D-组氨酸、脱氨基组氨酸、羟组氨酸、乙酰基组氨酸和高组氨酸。
根据一些实施方案，经修饰的胰高血糖素肽包含选自SEQ ID NO: 809、SEQ ID NO: 812、SEQ ID NO: 813和SEQ ID NO: 832的序列。在进一步的实施方案中，提供胰高血糖素肽，其包含SEQ ID NO: 809、SEQ ID NO: 812、SEQ ID NO: 813 或SEQ ID NO: 832的序列，进一步包含添加至SEQ ID NO: 809、SEQ ID NO: 812、SEQ ID NO: 813 或SEQ ID NO: 832的C末端的一至两个氨基酸，其中额外氨基酸独立地选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸或高半胱磺酸。在一些实施方案中，添加至羧基末端的额外氨基酸选自Lys、Arg、His、Asp或Glu或在进一步的实施方案中，额外氨基酸为Asp或Glu。
在另一个实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO: 7的序列或其胰高血糖素激动剂类似物。在一些实施方案中，肽包含选自SEQ ID NO: 808、SEQ ID NO: 810、SEQ ID NO: 811、SEQ ID NO: 812和SEQ ID NO: 813的序列。在另一实施方案中，肽包含选自SEQ ID NO: 808、SEQ ID NO: 810和SEQ ID NO: 811的序列。在一些实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO: 808、SEQ ID NO: 810和SEQ ID NO: 811的序列，其进一步包含添加至胰高血糖素肽的C末端的选自Asp和Glu的额外氨基酸。在一些实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO: 811 或SEQ ID NO: 813的序列，且在进一步的实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO: 811的序列。
根据一些实施方案，提供胰高血糖素激动剂，其包含选自以下的经修饰的胰高血糖素肽：
其中位置15的Xaa为Asp、Glu、半胱磺酸、高谷氨酸或高半胱磺酸，位置28的Xaa为Asn或酸性氨基酸，且位置29的Xaa为Thr或酸性氨基酸，且R为酸性氨基酸、COOH或CONH2，条件是酸性酸残基存在于位置28、29或30之一。在一些实施方案中，R为COOH，且在另一实施方案中，R为CONH2。
本公开还包括胰高血糖素融合肽，其中第二肽已融合至胰高血糖素肽的C末端以增强胰高血糖素肽的稳定性和溶解性。更具体而言，融合胰高血糖素肽可以包含含有胰高血糖素肽
的胰高血糖素激动剂类似物，其中R为酸性氨基酸或键和连接至胰高血糖素肽的羧基末端氨基酸的SEQ ID NO: 820 (GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO: 821 (KRNRNNIA)或SEQ ID NO: 822 (KRNR)的氨基酸序列。在一些实施方案中，胰高血糖素肽选自SEQ ID NO: 833、SEQ ID NO: 807 或SEQ ID NO: 808，其进一步包含连接至胰高血糖素肽的羧基末端氨基酸的SEQ ID NO: 820 (GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO: 821 (KRNRNNIA) 或SEQ ID NO: 822 (KRNR)的氨基酸序列。在一些实施方案中，胰高血糖素融合肽包含SEQ ID NO: 802、SEQ ID NO: 803、SEQ ID NO: 804、SEQ ID NO: 805和SEQ ID NO: 806或其胰高血糖素激动剂类似物，其进一步包含连接至胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQ ID NO: 820 (GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO: 821 (KRNRNNIA) 或SEQ ID NO: 822 (KRNR)的氨基酸序列。根据一些实施方案，融合肽进一步包含连接至位置16、17、21、24、29、C末端延伸内、或在C末端氨基酸处的氨基酸的PEG链，其中PEG链选自500至40,000道尔顿的范围。在一些实施方案中，SEQ ID NO: 820 (GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO: 821 (KRNRNNIA) 或SEQ ID NO: 822 (KRNR)的氨基酸序列经肽键结合至胰高血糖素肽的氨基酸29。在一些实施方案中，胰高血糖素融合肽的胰高血糖素肽部分包含选自SEQ ID NO: 810、SEQ ID NO: 811和SEQ ID NO: 813的序列。在一些实施方案中，胰高血糖素融合肽的胰高血糖素肽部分包含SEQ ID NO: 811 或SEQ ID NO: 813的序列，其中PEG链分别连接至位置21、24、29、C末端延伸内或C末端氨基酸。
在另一实施方案中，融合肽的胰高血糖素肽序列包含SEQ ID NO: 811的序列，进一步包含连接至胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQ ID NO: 820 (GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO: 821 (KRNRNNIA) 或SEQ ID NO: 822 (KRNR)的氨基酸序列。在一些实施方案中，胰高血糖素融合肽包含选自SEQ ID NO: 824、SEQ ID NO: 825和SEQ ID NO: 826的序列。通常，本发明的融合肽将具有含有标准羧酸基团的C末端氨基酸。然而，其中C末端氨基酸的酰胺取代为羧酸的那些序列的类似物也包括作为实施方案。根据一些实施方案，融合胰高血糖素肽包含选自SEQ ID NO: 810、SEQ ID NO: 811和SEQ ID NO: 813的胰高血糖素激动剂类似物，其进一步包含连接至胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQ ID NO: 823 (GPSSGAPPPS-CONH2)的氨基酸序列。
本发明的胰高血糖素激动剂可以进一步修饰以改善肽在水溶液中的溶解性和稳定性，同时保留胰高血糖素肽的生物活性。根据一些实施方案，预期在SEQ ID NO: 811的肽或其胰高血糖素激动剂类似物的选自位置16、17、20、21、24和29的一个或多个位置引入亲水基团会改善pH稳定的胰高血糖素类似物的溶解性和稳定性。更具体而言，在一些实施方案中，修饰SEQ ID NO: 810、SEQ ID NO: 811、SEQ ID NO: 813、或SEQ ID NO: 832的胰高血糖素肽以包含共价连接至在胰高血糖素肽的位置21和24处存在的氨基酸的侧链的一个或多个亲水基团。
根据一些实施方案，修饰SEQ ID NO: 811的胰高血糖素肽以包含在位置16、17、20、21、24和/或29的一个或多个氨基酸取代，其中天然氨基酸被具有适合于与亲水部分（包括例如PEG）交联的侧链的氨基酸所取代。天然肽可以被天然存在的氨基酸或合成的（非天然存在的）氨基酸所取代。合成的或非天然存在的氨基酸指这样的氨基酸，其在体内不天然存在，但尽管如此，其可以引入到本文描述的肽结构中。
在一些实施方案中，提供SEQ ID NO: 810、SEQ ID NO: 811 或SEQ ID NO: 813的胰高血糖素激动剂，其中已修饰天然胰高血糖素肽序列以包含在天然序列的位置16、17、21、24、29、在C末端延伸或在C末端氨基酸至少一个的天然存在的或合成的氨基酸，其中氨基酸取代基进一步包含亲水部分。在一些实施方案中，取代在位置21或24，且在进一步的实施方案中，亲水部分为PEG链。在一些实施方案中，SEQ ID NO: 811的胰高血糖素肽被至少一个半胱氨酸残基取代，其中半胱氨酸残基的侧链进一步修饰有巯基反应试剂，包括例如马来酰亚胺、乙烯砜、2-吡啶基硫代(pyridylthio)、卤代烷基和卤代酰基。这些巯基反应试剂可以包含羧基、酮基、羟基和醚基以及其他亲水部分诸如聚乙二醇单元。在可选的实施方案中，天然胰高血糖素肽被赖氨酸取代，且取代的赖氨酸残基的侧链进一步使用胺反应试剂诸如羧酸的活性酯（琥珀酰亚胺基、酐等）或亲水部分诸如聚乙二醇的醛来修饰。在一些实施方案中，胰高血糖素肽选自SEQ ID NO: 814、SEQ ID NO: 815、SEQ ID NO: 816、SEQ ID NO: 817、SEQ ID NO: 818和SEQ ID NO: 819。
根据一些实施方案，PEG化的胰高血糖素肽包含共价连接至胰高血糖素肽的两个或多个聚乙二醇链，其中胰高血糖素链的总分子量为约1,000至约5,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG化的胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO: 806的肽，其中PEG链共价连接至位置21和位置24的氨基酸残基，且其中两个PEG链的组合的分子量为约1,000至约5,000道尔顿。在另一实施方案中，PEG化的胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO: 806的肽，其中PEG链共价连接至位置21和位置24的氨基酸残基，且其中两个PEG链的组合的分子量为约5,000至约20,000道尔顿。
聚乙二醇链可以以直链形式或者其可以是支链的。根据一些实施方案，聚乙二醇链具有选自范围约500至约40,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，聚乙二醇链具有选自范围约500至约5,000道尔顿的分子量。在另一个实施方案中，聚乙二醇链具有约20,000至约40,000道尔顿的分子量。
上文描述的任何胰高血糖素肽可以进一步修饰以包括共价或非共价的分子内桥或在胰高血糖素肽的C末端部分（氨基酸位置12-29）内的稳定α螺旋的氨基酸。根据一些实施方案，除了在位置16、20、21或24（或其组合）处用α,α-二取代氨基酸例如AIB的氨基酸取代外，胰高血糖素肽包含上文讨论的任一个或多个修饰。根据另一实施方案，除了在胰高血糖素肽的位置16和20的氨基酸的侧链之间的分子内桥例如内酰胺外，胰高血糖素肽包含任一个或多个上文讨论的修饰。
根据一些实施方案，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO: 877的氨基酸序列，其中位置3的Xaa为包含结构I、II或III的侧链的氨基酸：
结构I
结构II
结构III
其中R1为C0-3烷基或C0-3杂烷基；R2为NHR4或C1-3烷基；R3为C1-3烷基；R4为H或C1-3烷基；X为NH、O或S；且Y为NHR4、SR3、或OR3。在一些实施方案中，X为NH或Y为NHR4。在一些实施方案中，R1为C0-2烷基或C1杂烷基。在一些实施方案中，R2为NHR4或C1烷基。在一些实施方案中，R4为H或C1烷基。在示例性实施方案中，提供包含结构I的侧链的氨基酸，其中R1为CH2-S，X为NH且R2为CH3 (乙酰氨基甲基-半胱氨酸、C(Acm))；R1为CH2，X为NH且R2为CH3 (乙酰基二氨基丁酸、Dab(Ac))；R1为C0烷基， X为NH，R2为NHR4且R4为H (氨基甲酰基二氨基丙酸、Dap(尿素))；或R1为CH2-CH2，X为NH且R2为CH3 (乙酰鸟氨酸、Orn(Ac))。在示例性实施方案中，提供包含结构II的侧链的氨基酸，其中R1为CH2，Y为NHR4，且R4为CH3（甲基谷氨酰胺，Q(Me)）；在示例性实施方案中，提供包含结构III的侧链的氨基酸，其中R1为CH2且R4为H（甲硫氨酸-亚砜，M(O)）；在特定实施方案中，位置3的氨基酸被Dab(Ac)取代。例如，胰高血糖素激动剂可以包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:863、SEQ ID NO:869、SEQ ID NO:871、SEQ ID NO:872、SEQ ID NO:873、和SEQ ID NO:874。
在某些实施方案中，胰高血糖素肽是SEQ ID NO: 877的胰高血糖素肽的类似物。在特定方面，类似物包含上文描述的任何氨基酸修饰，包括但不限于：在位置28用带电荷的氨基酸取代Asn；在位置28用选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸的带电荷的氨基酸取代Asn；在位置28用Asn、Asp或Glu取代；在位置28用Asp取代；在位置28用Glu取代；在位置29用带电荷的氨基酸取代Thr；在位置29用选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸的带电荷的氨基酸取代Thr；在位置29用Asp、Glu、或Lys取代；在位置29用Glu取代；在位置29后插入1-3个带电荷的氨基酸；在位置29后插入Glu或Lys；在位置29后插入Gly-Lys或Lys-Lys；及其组合。
在某些实施方案中，SEQ ID NO: 877的胰高血糖素肽的类似物在位置16、20、21和24的一个、两个、三个或所有处包含α,α-二取代的氨基酸，诸如AIB。
在某些实施方案中，SEQ ID NO: 877的胰高血糖素肽的类似物包含以下中的一个或多个：在位置1用降低胰高血糖素肽对由二肽基肽酶IV (DPP-IV)的切割的易感性的非天然氨基酸取代His，在位置2用降低胰高血糖素肽对由二肽基肽酶IV (DPP-IV)的切割的易感性的非天然氨基酸取代Ser，在位置7用缺少羟基的氨基酸例如Abu或Ile取代Thr；在位置10用Phe或Val取代Tyr；在位置12用Arg取代Lys；在位置15用Glu取代Asp，在位置16用Thr或AIB取代Ser；在位置20用Ala或AIB取代Gln；在位置21用Glu取代Asp；在位置24用Ala或AIB取代Gln；在位置27用Leu或Nle取代Met；在位置27-29缺失氨基酸；在位置28-29缺失氨基酸；在位置29缺失氨基酸；添加SEQ ID NO: 820的氨基酸序列至C末端，其中在位置29的氨基酸为Thr或Gly，或其组合。
根据特定的实施方案，胰高血糖素肽包含SEQ ID NOs: 862-867和869-874的任何的氨基酸序列。
在某些实施方案中，包含SEQ ID NO: 877的胰高血糖素肽的类似物包含亲水部分例如PEG，其共价连接至在位置16、17、20、21、24和29或在C末端氨基酸的任一处的氨基酸。
在某些实施方案中，包含SEQ ID NO: 877的胰高血糖素肽的类似物包含含有共价连接（任选地，经间隔基）至酰基或烷基的侧链的氨基酸，所述酰基或烷基对于天然存在的氨基酸是非天然的。酰基在一些实施方案中是C4至C30脂肪酰基。在其他实施方案中，烷基为C4至C30烷基。在特定方面中，酰基或烷基共价连接至位置10的氨基酸的侧链。在一些实施方案中，位置7的氨基酸是Ile或Abu。
胰高血糖素激动剂可以是包含SEQ ID NOs: 801-919的任一的氨基酸序列（任选具有高至1、2、3、4或5个进一步保留胰高血糖素激动剂活性的修饰）的肽。根据特定的实施方案，胰高血糖素肽包含SEQ ID NOs: 859-919的任何的氨基酸。
2类胰高血糖素相关肽
在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽为2类胰高血糖素相关肽，其描述于本文和国际专利申请号PCT US2009/47447 (提交于2009年6月16日)、美国临时申请号61/090,448和美国申请号61/151,349，其内容以其整体通过引用并入，以及提交于10年6月16日的国际专利申请号PCT/US10/38825和美国临时申请号61/187578中，其内容以其整体通过引用并入。2类胰高血糖素相关肽包括在6类胰高血糖素相关肽内的肽，并本文因此关于2类胰高血糖素相关肽的所有提及类似物、衍生物、缀合物、修饰等也应用于6类胰高血糖素相关肽。
关于2类胰高血糖素相关肽的以下部分(SEQ ID NOs: 1001-1262)中提及的生物序列对应于国际专利申请号PCT US2009/47447中的SEQ ID NOs: 1-262。
活性
天然胰高血糖素不活化GIP受体，且通常具有约1％的天然GLP-1对GLP-1受体的活性。对本文描述的天然胰高血糖素序列的修饰产生可以展示等同于或优于天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 1001)的活性的有效胰高血糖素活性、等同于或优于天然GIP (SEQ ID NO: 1004)的活性的有效GIP活性、和/或等同于或优于天然GLP-1的活性的有效GLP-1活性的2类胰高血糖素相关肽。在这方面，2类胰高血糖素相关肽可以是如本文进一步描述的胰高血糖素/GIP共激动剂、胰高血糖素/GIP/GLP-1三激动剂、GIP/GLP-1共激动剂、或GIP激动剂胰高血糖素肽之一。
在一些实施方案中，本文描述的2类胰高血糖素相关肽展示对GIP受体活化活性的约100 nM或更低、或约75、50、25、10、8、6、5、4、3、2 或1 nM或更低的EC50。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽展示对胰高血糖素受体活化的约100 nM或更低、或约75、50、25、10、8、6、5、4、3、2 或1 nM或更低的EC50。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽展示对GLP-1受体活化的约100 nM或更低、或约75、50、25、10、8、6、5、4、3、2 或1 nM或更低的EC50。受体活化可以通过在过表达受体的HEK293细胞中测量cAMP诱导的体外测定中测量，例如，如实施例中所述，测定共转染有编码受体和连接至cAMP应答元件的萤光素酶的DNA的HEK293细胞。
在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽相对于天然GIP展示对GIP受体的至少约0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%,1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、100%、125%、150%、175% 或200%或更高的活性（GIP效力）。在一些实施方案中，本文描述的胰高血糖素肽相对于天然GIP展示对GIP受体的不超过1000%、10,000%、100,000%、或1,000,000%的活性。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽相对于天然胰高血糖素展示对胰高血糖素受体的至少约1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、或500%或更高的活性（胰高血糖素效力）。在一些实施方案中，本文描述的胰高血糖素肽相对于天然胰高血糖素肽展示对胰高血糖素肽受体的不超过1000%、10,000%、100,000%、或1,000,000%的活性。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽相对于天然GLP-1展示对GLP-1受体的至少约0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、100%、125%、150%、175% 或200%或更高的活性（GLP-1效力）。在一些实施方案中，本文描述的胰高血糖素肽相对于天然GLP-1展示对GLP-1受体的不超过1000%、10,000%、100,000%、或1,000,000%的活性。2类胰高血糖素相关肽相对于受体的天然配体的对于受体的活性计算为2类胰高血糖素相关肽相比于天然配体的EC50的反比。
在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽展示出对胰高血糖素受体和GIP受体两者的活性（“胰高血糖素/GIP共激动剂”）。这些2类胰高血糖素相关肽已丧失天然胰高血糖素对于胰高血糖素受体相比于GIP受体的选择性。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽对GIP受体的EC50比其对胰高血糖素受体的EC50低于约50倍、40倍、30倍或20倍不同（更高或更低）。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽的GIP效力比其胰高血糖素效力低于约500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、或5倍不同（更高或更低）。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽对GIP受体的EC50除以2类胰高血糖素相关肽对胰高血糖素受体的EC50的比率低于约100、75、60、50、40、30、20、15、10、或5。在一些实施方案中，对GIP受体的EC50除以对胰高血糖素受体的EC50的比率为约1或低于约1（例如约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2）。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽的GIP效力相比于2类胰高血糖素相关肽的胰高血糖素效力的比率低于约500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、60、50、40、30、20、15、10、或5。在一些实施方案中，对GIP受体的效力除以对胰高血糖素受体的效力的比率为约1或低于约1（例如约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2）。在一些实施方案中，GLP-1活性已显著降低或破坏，例如通过在位置7的氨基酸修饰、C末端至位置27或28的氨基酸的氨基酸的缺失产生27或28个氨基酸的肽、或其组合。
在另一方面，2类胰高血糖素相关肽展示出对胰高血糖素、GIP和GLP-1受体的活性（“胰高血糖素/GIP/GLP-1三激动剂”）。这些2类胰高血糖素相关肽已丧失天然胰高血糖素对于胰高血糖素受体相比于GLP-1和GIP受体的选择性。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽对GIP受体的EC50比其对胰高血糖素和GLP-1受体的各个EC50低于约50倍、40倍、30倍或20倍不同（更高或更低）。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽的GIP效力比其胰高血糖素和GLP-1效力低于约500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、或5倍不同（更高或更低）。在一些实施方案中，三激动剂对GIP受体的EC50除以三激动剂对GLP-1受体的EC50的比率低于约100、75、60、50、40、30、20、15、10、或5。在一些实施方案中，对GIP受体的EC50除以对GLP-1受体的EC50的比率为约1或低于约1（例如约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2）。在一些实施方案中，三激动剂的GIP效力相比于三激动剂的GLP-1效力的比率低于约100、75、60、50、40、30、20、15、10、或5。在一些实施方案中，对GIP受体的效力除以对GLP-1受体的效力的比率为约1或低于约1（例如约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2）。在相关实施方案中，三激动剂对GIP受体的EC50除以三激动剂对胰高血糖素受体的EC50的比率低于约100、75、60、50、40、30、20、15、10、或5。在一些实施方案中，对GIP受体的EC50除以对胰高血糖素受体的EC50的比率为约1或低于约1（例如约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2）。在一些实施方案中，三激动剂的GIP效力相比于三激动剂的胰高血糖素效力的比率低于约500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、60、50、40、30、20、15、10、或5。在一些实施方案中，对GIP受体的效力除以对胰高血糖素受体的效力的比率为约1或低于约1（例如约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2）。在一些实施方案中，三激动剂对GLP-1受体的EC50除以三激动剂对胰高血糖素受体的EC50的比率低于约100、75、60、50、40、30、20、15、10、或5。在一些实施方案中，对GLP-1受体的EC50除以对胰高血糖素受体的EC50的比率为约1或低于约1（例如约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2）。在一些实施方案中，三激动剂的GLP-1效力相比于三激动剂的胰高血糖素效力的比率低于约100、75、60、50、40、30、20、15、10、或5。在一些实施方案中，对GLP-1受体的效力除以对胰高血糖素受体的效力的比率为约1或低于约1（例如约0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2）。
在仍另一方面中，2类胰高血糖素相关肽展示对GLP-1和GIP受体的活性，但其中例如通过在位置3的氨基酸修饰，胰高血糖素活性已显著降低或破坏（“GIP/GLP-1共激动剂”）。例如，在该位置用酸性、碱性、或疏水氨基酸（谷氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸）的取代降低胰高血糖素活性。在一些实施方案中，胰高血糖素肽对GIP受体的EC50比其对GLP-1受体的EC50低于约50倍、40倍、30倍或20倍不同（更高或更低）。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽的GIP效力比其GLP-1效力低于约25、20、15、10、或5倍不同（更高或更低）。在一些实施方案中，这些2类胰高血糖素相关肽具有天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的约10％或更少，例如约1-10%，或约0.1-10%、或大于约0.1％但少于约10％。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽对GIP受体的EC50除以2类胰高血糖素相关肽对GLP-1受体的EC50的比率低于约100、75、60、50、40、30、20、15、10、或5，且不少于1。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽的GIP效力相比于2类胰高血糖素相关肽的GLP-1效力的比率低于约100、75、60、50、40、30、20、15、10、或5，且不少于1。
在仍进一步的方面中，2类胰高血糖素相关肽展示对GLP-1受体的活性，其中例如通过在位置3用Glu和在位置7用Ile的氨基酸修饰，胰高血糖素和GLP-1活性已显著降低或破坏（“GIP激动剂胰高血糖素肽”）。在一些实施方案中，这些2类胰高血糖素相关肽具有天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的约10％或更少，例如约1-10%，或约0.1-10%、或大于约0.1％、0.5％、或1％但少于约1％、5％、或10％。在一些实施方案中，这些2类胰高血糖素相关肽也具有天然GLP-1对GLP-1受体的活性的约10％或更少，例如约1-10%，或约0.1-10%、或大于约0.1％、0.5％、或1％但少于约1％、5％、或10％。
在一些实施方案中，当2类胰高血糖素相关肽未PEG化时，2类胰高血糖素相关肽对GIP受体活化的EC50为约4、2、1 nM或更低，或者类似物具有天然GIP对GIP受体的活性的至少约1%、2%、3%、4% 或5%。在相关实施方案中，未PEG化的2类胰高血糖素相关肽对GLP-1受体活化的EC50为约4、2、1 nM或更低，或者具有天然GLP-1对GLP-1受体的活性的至少约1%、2%、3%、4% 或5%。在仍其他相关实施方案中，未PEG化的2类胰高血糖素相关肽对胰高血糖素受体活化的EC50为约4、2、1 nM或更低，或者天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的至少约5%、10%、15% 或20%。在一些实施方案中，未PEG化的2类胰高血糖素相关肽具有低于约1％的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性。在其他实施方案中，未PEG化的2类胰高血糖素相关肽具有低于约10%、5% 或1%的天然GLP-1对GLP-1受体的活性。
在其中2类胰高血糖素相关肽连接至亲水部分诸如PEG的实施方案中，对一种或多种受体的相关EC50可以更高，例如约10倍更高。例如，PEG化的类似物对GIP受体活化的EC50为约10 nM或更低，或者2类胰高血糖素相关肽具有天然GIP对GIP受体的活性的至少约0.1%、0.2%、0.3%、0.4% 或0.5%。在相关实施方案中，PEG化的2类胰高血糖素相关肽对GLP-1受体活化的EC50为约10 nM或更低，或者具有天然GLP-1对GLP-1受体的活性的至少约0.1%、0.2%、0.3%、0.4% 或0.5%。在仍其他相关实施方案中，PEG化的2类胰高血糖素相关肽对胰高血糖素受体活化的EC50为约10 nM或更低，或者天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的至少约0.5%、1%、1.5% 或2%。在一些实施方案中，2类胰高血糖素相关肽具有低于约1％的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性。在其他实施方案中，2类胰高血糖素相关肽具有低于约10%、5% 或1%的天然GLP-1对GLP-1受体的活性。
修饰
本文公开的关于2类胰高血糖素相关肽的修饰允许操作胰高血糖素(SEQ ID NO: 1001)以产生展示增加的GIP活性、胰高血糖素活性和/或GLP-1活性的胰高血糖素肽。本文公开的其他关于2类胰高血糖素相关肽的修饰延长所得肽的半衰期，增加其溶解性或增加其稳定性。本文公开的关于2类胰高血糖素相关肽的仍其他修饰对活性没有影响，或者可以进行而不破坏期望的一种或多种活性。关于2类胰高血糖素相关肽的用于相同目的（例如增加GIP活性）的任何组合可以单独或组合应用。关于2类胰高血糖素相关肽的赋予增强的特性的任何单一或多组的组合可以单独或组合应用，例如增加的GIP和/或GLP-1活性可以与增加的半衰期组合。在相关的实施方案中，1、2、3、4、5、6或更多个氨基酸修饰可以是非保守取代、添加或缺失。在一些实施方案中，1、2、3、4、5、6或更多个氨基酸修饰可以是保守取代。
影响GIP活性的修饰
对GIP受体的增强的活性通过在位置1的氨基酸修饰来提供。例如，在位置1的His被大的、芳香族氨基酸，任选Tyr、Phe、Trp、氨基-Phe、硝基Phe、氯代Phe、硫代Phe、4-吡啶基-Ala、甲基-Tyr或3-氨基Tyr所取代。位置1的Tyr与在对应于氨基酸12-29的区域内稳定α螺旋的组合提供活化GIP受体以及GLP-1受体和胰高血糖素受体的2类胰高血糖素相关肽。α螺旋结构可以通过例如形成共价或非共价分子内桥、或用稳定α螺旋的氨基酸（例如，α,α-二取代氨基酸）取代和/或插入位置12-29周围的氨基酸来稳定。
对GIP受体增强的活性还通过在位置27和/或28及任选位置29的氨基酸修饰来提供。例如，在位置27的Met被大的脂族氨基酸任选Leu取代，在位置28的Asn被小的脂族氨基酸任选Ala取代，且在位置29的Thr被小的脂族氨基酸任选Gly取代。在位置27-29用LAG取代提供了相对于在那些位置的天然MNT序列的增加的GIP活性。
对GIP受体的增强的活性还通过在位置12的氨基酸修饰来提供。例如，位置12用大的、脂族、非极性氨基酸任选Ile取代。
对GIP受体的增强的活性还通过在位置17和/或18的氨基酸修饰来提供。例如，位置17被极性残基任选Gln取代，和位置18被小的脂族氨基酸任选Ala取代。在位置17和18用QA取代提供了相对于在那些位置的天然RR序列的增加的GIP活性。
对GIP受体的增加的活性通过允许在位置12-29的氨基酸侧链之间的分子内桥的形成的修饰来提供。例如，分子内桥可以通过在位置i和i+4或位置j和j+3之间或位置k和k+7之间的两个氨基酸的侧链之间的共价键来形成。在示例性实施方案中，桥在位置12和16、16和20、20和24、24和28或17和20之间。在其他实施方案中，非共价相互作用诸如盐桥可以在这些位置的带正电荷和带负电荷的氨基酸之间形成。
任何上文描述的增加GIP受体活性的修饰均可以单独或组合应用。增加GIP受体活性的修饰的组合通常提供比单独采用的任何此类修饰提供更高的GIP活性。
影响胰高血糖素活性的修饰
在一些实施方案中，通过在天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 1001)的位置16的氨基酸修饰提供增强的胰高血糖素效力。借助于非现实性实例，此类增强的效力可以通过在位置16用以下取代天然存在的丝氨酸来提供：谷氨酸、或另一具有长度为4个原子的侧链的带负电荷的氨基酸、或可选地谷氨酰胺、高谷氨酸或高半胱磺酸或具有含有至少一个杂原子（例如N、O、S、P）的侧链和具有长度约4（或3-5）个原子的侧链的带电荷的氨基酸之一。在一些实施方案中，胰高血糖素肽保留其对胰高血糖素受体相对于GLP-1受体的原始选择性。
胰高血糖素受体活性可以通过在位置3的氨基酸修饰来降低，例如在位置3用酸性、碱性、或疏水性氨基酸取代天然存在的谷氨酰胺。例如，在位置3用谷氨酸、鸟氨酸、或正亮氨酸取代实质上降低或破坏了胰高血糖素受体活性。
对胰高血糖素受体的维持或增强的活性可以通过在位置3用谷氨酰胺类似物（如本文描述的）修饰Gln来实现。例如，胰高血糖素激动剂可以包含SEQ ID NOs: 1243-1248、1250、1251、和 1253-1256的任一的氨基酸序列。
已通过在位置1和2的氨基酸修饰降低的胰高血糖素活性的恢复通过稳定胰高血糖素肽或其类似物的C末端部分（氨基酸12-29）的α螺旋结构的修饰来提供。例如，分子内桥可以通过在位置i和i+4或位置j和j+3之间或位置k和k+7之间的两个氨基酸的侧链之间的共价键来形成。在其他实施方案中，非共价相互作用诸如盐桥可以在这些位置的带正电荷和带负电荷的氨基酸之间形成。在仍其他实施方案中，一个或多个α,α-二取代氨基酸在保留期望活性的位置插入或取代入该C末端部分（氨基酸12-29）。例如，位置16、20、21或24的一个、两个、三个或全部被α,α-二取代氨基酸例如AIB所取代。
影响GLP-1活性的修饰
对GLP-1受体增强的活性通过用电荷中性的基团诸如酰胺或酯替代C末端氨基酸的羧酸来提供。
对GLP-1受体的增强的活性还通过稳定胰高血糖素的C末端部分（氨基酸12-29周围）中的α螺旋结构来提供，例如通过在两个氨基酸的侧链之间形成分子内桥、或在位置12-29周围用稳定α螺旋的氨基酸（例如α,α-二取代氨基酸）取代和/或插入，如本文进一步描述。在示例性实施方案中，氨基酸对12和16、13和17、16和20、17和21、20和24或24和28（其中i=12、16、20或24的氨基酸对）彼此连接并因此稳定胰高血糖素α螺旋。在一些实施方案中，桥或接头长度约8（例如约7-9）个原子，特别是当桥在位置i和i+4之间时。在一些实施方案中，桥或接头长度约6（例如约5-7）个原子，特别是当桥在位置j和j+3之间时。
在一些实施方案中，分子内桥通过以下形成：（a）在位置16用谷氨酸或用另一具有长度4个原子的侧链的带负电荷的氨基酸、或可选地用谷氨酰胺、高谷氨酸、或高半胱磺酸中任一种、或具有含有至少一个杂原子（例如N、O、S、P）和具有长度约4（或3-5）个原子的侧链的带电荷的氨基酸取代天然存在丝氨酸，和（b）在位置20用另一具有带电荷的或具有形成氢键能力且长度至少约5（或约4-6）个原子的侧链的亲水性氨基酸例如赖氨酸、瓜氨酸、精氨酸或鸟氨酸取代天然存在的谷氨酰胺。位置16和20的此类氨基酸的侧链可以形成盐桥或可以共价连接。在一些实施方案中，两个氨基酸彼此结合形成内酰胺环。
在一些实施方案中，胰高血糖素肽的C末端部分中的α螺旋结构的稳定通过形成分子内桥而非内酰胺桥来实现。例如，合适的共价键合方法包括以下中任一种或多种：烯烃复分解反应、基于羊毛硫氨酸的环化、二硫键或修饰的含硫键形成、使用α、ω-二氨基烷系链、形成金属原子桥，和其他肽环化的方法用于稳定α螺旋。
在仍其他实施方案中，一个或多个α,α-二取代氨基酸在保留期望活性的位置插入或取代入该C末端部分（氨基酸12-29）。例如，位置16、20、21或24的一个、两个、三个或全部被α,α-二取代氨基酸例如AIB所取代。
对GLP-1受体的增强的活性通过如本文所述的在位置20的氨基酸修饰来提供。
对GLP-1受体的增加的活性通过添加GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1095)或XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1096)至C末端来提供。在此类类似物中的GLP-1活性可以进一步通过修饰在位置18、28或29、或位置18和29的氨基酸来增加，如本文所述。
GLP-1效力中的进一步适度增加通过修饰位置10的氨基酸为大的、芳香族氨基酸残基任选为Trp来提供。
对GLP-1受体的降低的活性例如通过如本文所述的在位置7的氨基酸修饰来提供。
对GLP-1受体的效力可以进一步通过在位置18的丙氨酸取代天然精氨酸来增强。
关于2类胰高血糖素相关肽的上文描述的任何修饰（其增加GLP-1受体活性）可以单独或组合应用。增加GLP-1受体活性的修饰的组合通常提供比单独采用的任何此类修饰提供更高的GLP-1活性。例如，本发明提供在位置16、在位置20、和在C末端羧酸基团包含修饰，任选具有位置16和20的氨基酸之间的共价键的胰高血糖素肽；在位置16和在C末端羧酸基团包含修饰的胰高血糖素肽；在位置16和20包含修饰，任选具有在位置16和20的氨基酸之间的共价键的胰高血糖素肽；和包含在位置20和在C末端羧酸基团的修饰的胰高血糖素肽。
改善DPP-IV抗性的修饰
在位置1和/或2的修饰可以增加肽对二肽基肽酶IV (DPP IV)切割的抗性。例如，位置1和/或位置2可以被如本文描述的DPP-IV抗性氨基酸取代。在一些实施方案中，位置2的氨基酸被N-甲基丙氨酸取代。
观察到在位置2的修饰（例如在位置2的AIB）和在一些情况下在位置1的修饰（例如在位置1的DMIA）可以降低胰高血糖素活性，有时显著降低；令人惊讶地，该胰高血糖素活性中的降低可以通过稳定胰高血糖素的C末端部分（氨基酸12-29周围）中的α螺旋结构，例如如本文所述的通过在两个氨基酸的侧链之间形成共价键来恢复。在一些实施方案中，共价键在位置“i”和“i+4”、或位置“j”和“j+3”之间，例如位置12和16、16和20、20和24、24和28、或17和20之间的氨基酸之间。在示例性实施方案中，该共价键为位置16的谷氨酸和位置20的赖氨酸之间的内酰胺桥。在一些实施方案中，该共价键为除内酰胺桥以外的分子内桥，如本文所述。
降低降解的修饰
在仍进一步的示例性实施方案中，任何2类胰高血糖素相关肽可以通过修饰SEQ ID NO: 1001的位置15和/或16的氨基酸来降低肽随时间（尤其在酸性或碱性缓冲液中）的降解，从而进一步修饰以改善稳定性。此类修饰降低Asp15-Ser16肽键的切割。在示例性实施方案中，位置15的氨基酸修饰为缺失或用谷氨酸、高谷氨酸、半胱磺酸或高半胱磺酸取代Asp。在其他示例性实施方案中，位置16的氨基酸修饰为缺失或用Thr或AIB取代Ser。在其他示例性实施方案中，位置16的Ser被谷氨酸或被另一具有长度4个原子的侧链的带负电荷的氨基酸或任选被谷氨酰胺、高谷氨酸或高半胱磺酸中任一者所取代。
在以下实施方案中，天然肽的位置27存在的甲硫氨酸残基被修饰，例如通过缺失或取代。此类修饰可以防止肽的氧化降解。在一些实施方案中，在位置27的Met被亮氨酸、异亮氨酸或正亮氨酸取代。在一些特定实施方案中，在位置27的Met被亮氨酸或正亮氨酸取代。
在一些实施方案中，位置20和/或24的Gln被修饰，例如通过缺失或取代。此类修饰可以降低经Gln的脱酰胺作用发生的降解。在一些实施方案中，位置20和/或24的Gln被Ser、Thr、Ala 或AIB取代。在一些实施方案中，位置20和/或24的Gln被Lys、Arg、Orn、或瓜氨酸取代。
在一些实施方案中，位置21的Asp被修饰，例如通过缺失或取代。此类修饰可以降低通过脱水Asp以形成环状的琥珀酰亚胺中间体随后异构化为异天冬氨酸来发生的降解。在一些实施方案中，位置21被Glu、高谷氨酸或高半胱磺酸取代。在一些特定实施方案中，位置21被Glu取代。
α螺旋结构的稳定
在2类胰高血糖素相关肽的C末端部分（氨基酸12-29周围）中稳定α螺旋结构提供增强的GLP-1和/或GIP活性，且恢复已通过在位置1和/或2的氨基酸修饰降低的胰高血糖素活性。α螺旋结构可以通过例如形成共价或非共价分子内桥、或用稳定α螺旋的氨基酸（例如，α,α-二取代氨基酸）取代和/或插入位置12-29周围的氨基酸来稳定。GIP激动剂的α螺旋结构的稳定可以如本文所述实现。
酰化和烷基化
根据一些实施方案，修饰本文公开的胰高血糖素肽以包含酰基或烷基，例如对于如本文所述的天然存在的氨基酸非天然的酰基或烷基。酰化或烷基化可以增加胰高血糖素肽在循环中的半衰期。酰化或烷基化可以有利地延迟对胰高血糖素和/或GLP-1受体的作用的起始和/或延长该作用的持续时间，和/或改善对蛋白酶诸如DPP-IV的抗性和/或改善溶解性。胰高血糖素肽对胰高血糖素和/或GLP-1和/或GIP受体的活性可以在酰化后维持。在一些实施方案中，酰化的胰高血糖素肽的效力与胰高血糖素肽的未酰化形式的相当的。2类胰高血糖素相关肽可以在其中亲水部分连接的相同氨基酸位置处或在不同的氨基酸位置处进行酰化或烷基化，如本文所述。
在一些实施方案中，本发明提供经修饰以包含共价连接至胰高血糖素肽的位置10的氨基酸的酰基或烷基的胰高血糖素肽。胰高血糖素肽可以进一步包含胰高血糖素肽的位置10的氨基酸和酰基或烷基之间的间隔基。在一些实施方案中，酰基是脂肪酸或胆汁酸，或其盐，例如C4至C30脂肪酸，C8至C24脂肪酸、胆酸、C4至C30烷基、C8至C24烷基、或包含胆汁酸的类固醇部分的烷基。间隔基是具有连接酰基或烷基的合适的反应基团的任何部分。在示例性实施方案中，间隔基包含氨基酸、二肽、三肽、亲水性双功能、或疏水性双功能间隔基。在一些实施方案中，间隔基选自：Trp、Glu、Asp、Cys和包含NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH的间隔基，其中m为1-6的任何整数，且n为2-12的任何整数。此类酰化或烷基化的胰高血糖素肽可以进一步包含亲水部分，任选聚乙二醇。任何前述胰高血糖素肽可以包含两个酰基或两个烷基，或其组合。
缀合物和融合体
GIP激动剂可以连接，任选经共价键合和任选经接头，至本文所述的缀合物部分。
在其他实施方案中，第二肽是XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1096)，其中X选自20种普通氨基酸之一，例如谷氨酸、天冬氨酸或甘氨酸。在一些实施方案中，X代表氨基酸，例如Cys，其进一步包含共价连接至该氨基酸的侧链的亲水部分。此类C末端延伸改善溶解性，且还改善GIP或GLP-1活性。在一些实施方案中，其中胰高血糖素肽进一步包含羧基末端延伸，所述延伸的羧基末端氨基酸终止于酰胺基或酯基而非羧酸。
在一些实施方案中，例如在包含C末端延伸的胰高血糖素肽中，天然胰高血糖素肽的位置29的苏氨酸被甘氨酸替代。例如，具有位置29的甘氨酸取代苏氨酸且包含GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1095)的C末端延伸的胰高血糖素肽为经修饰以包含相同的C末端延伸的天然胰高血糖素对GLP-1受体的效力的至少4倍。该T29G取代可以与其他本文公开的修饰一同使用来增强胰高血糖素肽对GLP-1受体的亲和力。例如，T29G取代可以与S16E和N20K氨基酸取代组合，任选与氨基酸16和20之间的内酰胺桥，和任选与如本文所述的添加PEG链组合。
在一些实施方案中，添加氨基酸至C末端，且额外的氨基酸选自谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸。
增强溶解性的修饰
在另一实施方案中，任何胰高血糖素肽的溶解性可以通过引入带电荷的氨基酸至肽的C末端部分优选SEQ ID NO: 1001的C末端位置至位置27的氨基酸取代和/或添加来改善。任选地，一个、两个或三个带电荷的氨基酸可以引入C末端部分，优选为C末端至位置27。在一些实施方案中，位置28和/或29的天然氨基酸被一个或两个带电荷的氨基酸取代，和/或在进一步的实施方案中，一至三个带电荷的氨基酸也添加至肽的C末端。在示例性实施方案中，一个、两个或所有带电荷的氨基酸均带负电荷。在一些实施方案中，带负电荷的（酸性氨基酸）为天冬氨酸或谷氨酸。
额外的修饰例如保守取代可以对胰高血糖素肽进行，这仍允许它保留GIP活性（和任选地GLP-1活性和/或胰高血糖素活性）。
其他修饰
关于2类肽的上文描述的任何修饰（其增加或降低GIP活性、其增加或降低胰高血糖素受体活性和其增加GLP-1受体活性）可以单独或组合应用。关于2类胰高血糖素相关肽的上文描述的任何修饰还可以与其他修饰组合，所述其他修饰赋予其他期望的特性，诸如增加的溶解性和/或稳定性和/或作用的持续时间，如本文关于2类胰高血糖素相关肽所述的。可选地，关于2类胰高血糖素相关肽的上文描述的任何修饰可以与本文描述的关于2类胰高血糖素相关肽的其他修饰（其不实质上影响溶解性或稳定性或活性）组合。示例性的修饰包括但不限于：
（A）改善溶解性，例如通过引入一个、两个、三个或更多个带电荷的氨基酸至天然胰高血糖素的C末端部分，优选在C末端位置至位置27。此类带电荷的氨基酸可以通过用带电荷的氨基酸取代天然氨基酸，例如在位置28或29，或可选地通过添加带电荷的氨基酸例如在位置27、28或29之后来引入。在示例性实施方案中，一个、两个、三个或所有带电荷的氨基酸均带负电荷。在其他实施方案中，一个、两个、三个或所有带电荷的氨基酸均带正电荷。此类修饰增加溶解性，例如提供在约5.5至8的给定的pH例如pH7下（当在25℃下24小时后测量）相对于天然胰高血糖素的至少2倍、5倍、10倍、15倍、25倍、30倍或更高的溶解性。
（B）如本文所述通过添加亲水部分诸如聚乙二醇链例如在位置16、17、20、21、24或29、在C末端延伸内或在肽的C末端氨基酸来增加溶解性和作用的持续时间或在循环中的半衰期，
（C）通过胰高血糖素肽的酰化或烷基化（如本文所述）来增加溶解性和/或作用的持续时间或在循环中的半衰期和/或延迟作用的起始；
（D）如本文所述通过修饰位置1或2的氨基酸经引入对二肽基肽酶IV (DPP IV)切割的抗性来增加作用的持续时间或在循环中的半衰期。
（E）通过修饰位置15的Asp，例如通过缺失或用谷氨酸、高谷氨酸、半胱磺酸或高半胱磺酸取代增加稳定性。此类修饰可以降低在范围5.5-8的pH下的降解或切割，例如，在25℃下24小时后保留至少75%、80%、90%、95%、96%、97%、98% 或99%、高至100％的原始肽。此类修饰降低Asp15-Ser16之间的肽键的切割。
（F）通过在位置16修饰Ser例如通过用Thr或AIB取代来增加稳定性。此类修饰也降低在Asp15-Ser16之间的肽键的切割。
（G）通过在位置27修饰甲硫氨酸例如通过用亮氨酸或正亮氨酸取代来增加稳定性。此类修饰可以降低氧化降解。稳定性还可以通过修饰位置20或24的Gln，例如通过用Ser、Thr、Ala或AIB取代来增加。此类修饰可以降低经Gln的脱酰胺作用发生的降解。稳定性可以通过修饰位置21的Asp，例如通过用Glu取代来增加。此类修饰可以降低通过脱水Asp以形成环状的琥珀酰亚胺中间体随后异构化为异天冬氨酸来发生的降解。
（H）不实质上影响活性的非保守或保守取代、添加或缺失，例如，在位置2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28 或29中的一个或多个处的保守取代；用Ala取代这些位置中的一个或多个；缺失位置27、28或29中的一个或多个处的氨基酸；或缺失氨基酸29任选组合有C末端酰胺或酯代替C末端羧酸基团；在位置12用Arg取代Lys；在位置10用Val或Phe取代Tyr；
PEG化后活性的保留通过添加GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1095)至C末端来提供。
天然胰高血糖素肽的一些位置可以被修饰同时保留亲本肽的至少一些活性。因此，申请人理解位于位置2、5、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28 或29的位置的一个或多个氨基酸可以被不同于天然胰高血糖素肽中存在的氨基酸所取代，且仍保留对胰高血糖素受体的活性。
在一些实施方案中，位置18被选自Ala、Ser或Thr的氨基酸取代。在一些实施方案中，位置20的氨基酸被Ser、Thr、Lys、Arg、Orn、瓜氨酸或AIB取代。在一些实施方案中，位置21被Glu、高谷氨酸或高半胱磺酸取代。在一些实施方案中，胰高血糖素肽包含选自位置16、17、18、20、21、23、24、27、28和29的1-10个氨基酸修饰。在示例性实施方案中，修饰为选自Gln17、Ala18、Glu21、Ile23、Ala24、Val27和Gly29的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，选自位置17-26的1-2个氨基酸与亲本肽不同。在其他实施方案中，选自位置17-22的1-2个氨基酸与亲本肽不同。在仍其他实施方案中，修饰为Gln17、Ala18、Glu21、Ile23和Ala24。
在一些实施方案中，将一个或多个氨基酸添加至胰高血糖素肽的羧基末端。氨基酸通常选自20种常见氨基酸之一，且在一些实施方案中，氨基酸具有酰胺基代替天然氨基酸的羧酸。在示例性实施方案中，添加的氨基酸选自谷氨酸和天冬氨酸和甘氨酸。
其他不破坏活性的修饰包括W10和R20。
在一些实施方案中，本文公开的2类胰高血糖素相关肽通过截短C末端的一或两个氨基酸残基修饰，仍保留对胰高血糖素、GLP-1和/或GIP受体的相似的活性和效力。在这方面，位置29和/或28的氨基酸被缺失。
示例性实施方案
根据本发明的一些实施方案，具有GIP激动剂活性的胰高血糖素的类似物(SEQ ID NO: 1001)包含SEQ ID NO: 1001，其具有（a）赋予GIP激动剂活性的在位置1的氨基酸修饰，（b）稳定类似物的C末端部分（氨基酸12-29）的α螺旋结构的修饰，和（c）任选地，1-10（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）个进一步的氨基酸修饰。在一些实施方案中，类似物展示天然GIP对GIP受体的至少约1％的活性或对本文描述的GIP受体的任何其他活性水平。
在某些实施方案中，稳定α螺旋结构的修饰是提供或引入分子内桥包括例如共价分子内桥（诸如本文描述的那些中的任一种）的修饰。共价分子内桥在一些实施方案中是内酰胺桥。这些实施方案的类似物的内酰胺桥可以是如本文所述的内酰胺桥。参见例如在部分“α螺旋结构的稳定”下的内酰胺桥的教导。例如，内酰胺桥可以是在位置i和i+4的氨基酸侧链之间或在位置j和j+3的氨基酸侧链之间的内酰胺桥，其中i为12、13、16、17、20或24，且其中j为17。在某些实施方案中，内酰胺桥可以在位置16和20的氨基酸之间，其中在位置16和20的氨基酸之一被Glu取代且在位置16和20的另一氨基酸被Lys取代。
在可选的实施方案中，稳定α螺旋结构的修饰为在类似物的位置16、20、21和24引入一个、两个、三个或四个α,α-二取代氨基酸。在一些实施方案中，α,α-二取代氨基酸是AIB。在某些方面，α,α-二取代氨基酸（例如AIB）在位置20且在位置16的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，诸如例如式IV的氨基酸，其描述于本文。式IV的氨基酸可以是高Lys、Lys、Orn、或2,4-二氨基丁酸（Dab）。
在本发明的特定方面，位置1的氨基酸修饰为His被缺少咪唑侧链的氨基酸例如大的芳香族氨基酸（例如Tyr）取代。
在某些实施方案中，胰高血糖素的类似物包含在位置27、28和29的一个、两个或全部的氨基酸修饰。例如，在位置27的Met可以被大的脂族氨基酸任选Leu取代，在位置28的Asn可以被小的脂族氨基酸任选Ala取代，在位置29的Thr可以被小的脂族氨基酸任选Gly取代，或前述两者或三者的组合。在特定实施方案中，胰高血糖素类似物包含位置27的Leu，位置28的Ala，和位置29的Gly或Thr。
在本发明的某些实施方案中，胰高血糖素类似物包含C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸的延伸。例如，延伸可以包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 1095 或1096。另外或可选地，胰高血糖素类似物可以包含其1-6个氨基酸为带正电荷的氨基酸的延伸。带正电荷的氨基酸可以是式IV的氨基酸，包括但不限于Lys、高Lys、Orn和Dab。
胰高血糖素类似物在一些实施方案中如本文所述酰化或烷基化。例如，如本文进一步所述，酰基或烷基可以在类似物的位置10或40连接至胰高血糖素类似物，具有或不具有间隔基。类似物可以额外或可选地被修饰以包含如本文进一步所述的亲水部分。此外，在一些实施方案中，类似物包含以下修饰的任一种或组合：
在位置2的Ser被D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、AIB、Val、或α-氨基-N-丁酸取代；
在位置10的Tyr被Trp、Lys、Orn、Glu、Phe、或Val取代：
酰基与在位置10的Lys的连接；
位置12的Lys被Arg或Ile取代；
位置16的Ser被Glu、Gln、高谷氨酸、高半胱磺酸、Thr、Gly、或AIB取代；
位置17的Arg被Gln取代；
位置18的Arg被Ala、Ser、Thr、或Gly取代；
位置20的Gln被Ser、Thr、Ala、Lys、瓜氨酸、Arg、Orn、或AIB取代；
位置21的Asp被Glu、高谷氨酸、高半胱磺酸取代；
位置23的Val被Ile取代；
位置24的Gln被Asn、Ser、Thr、Ala、或AIB取代；
和位置2 5、9、10、11、12. 13、14、15、16、8 19 20、21. 24、27、28、和 29的任一者处的保守取代。
在示例性实施方案中，具有GIP激动剂活性的胰高血糖素类似物(SEQ ID NO: 1001)包含以下修饰：
（a）在位置1的赋予GIP激动剂活性的氨基酸修饰，
（b）在位置i和i+4的氨基酸侧链之间或在位置j和j+3的氨基酸侧链之间的内酰胺桥，其中i为12、13、16、17、20或24，且其中j为17，
（c）在位置27、28和29中的一个、两个或所有处的氨基酸修饰，例如在位置27和/或28的氨基酸修饰，和
（d）1-9或1-6进一步氨基酸修饰，例如1、2、3、4、5、6、7、8 或9进一步的氨基酸修饰，
且类似物对GIP受体活化的EC50为约10 nM或更低。
这些实施方案的类似物的内酰胺桥可以是如本文所述的内酰胺桥。参见例如在部分“α螺旋结构的稳定”下的内酰胺桥的教导。例如，内酰胺桥可以在位置16和20的氨基酸之间，其中在位置16和20的氨基酸之一被Glu取代且在位置16和20的另一氨基酸被Lys取代。
根据这些实施方案，类似物包含例如SEQ ID NOs: 1005-1094的任何的氨基酸序列。
在其他示例性实施方案中，具有GIP激动剂活性的胰高血糖素类似物(SEQ ID NO: 1001)包含以下修饰：
（a）在位置1的赋予GIP激动剂活性的氨基酸修饰，
（b）在类似物的位置16、20、21和24的一个、两个、三个或全部氨基酸被α,α-二取代氨基酸所取代，
（c）在位置27、28和29中的一个、两个或所有处的氨基酸修饰，例如在位置27和/或28的氨基酸修饰，和
（d）1-9或1-6进一步氨基酸修饰，例如1、2、3、4、5、6、7、8 或9进一步的氨基酸修饰，
且类似物对GIP受体活化的EC50为约10 nM或更低。
这些实施方案的类似物的α,α-二取代的氨基酸可以为任何α,α-二取代的氨基酸，包括但不限于：氨基异丁酸（AIB）、二取代有选自甲基、乙基、丙基和正丁基的相同或不同基团或二取代有环辛烷或环庚烷（例如1-氨基环辛烷-1-甲酸）的氨基酸。在某些实施方案中，α,α-二取代氨基酸是AIB。在某些实施方案中，位置20的氨基酸被α,α-二取代的氨基酸例如AIB取代。
根据这些实施方案，类似物可以包含例如SEQ ID NOs: 1099-1141、1144-1164、1166-1169、和 1173-1178的任何的氨基酸序列。
在仍其他示例性实施方案中，具有GIP激动剂活性的胰高血糖素类似物(SEQ ID NO: 1001)包含以下修饰：
（a）在位置1的赋予GIP激动剂活性的氨基酸修饰，
（b）位置16的Ser被式IV的氨基酸的氨基酸取代：
[式IV],
其中n为1-16、或1-10、或1-7、或1-6、或2-6，R1和R2的每一个独立地选自H、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、和 (C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，其中R7为H或OH，且式IV的氨基酸的侧链包含游离氨基，
（c）位置20的Gln被α,α-二取代的氨基酸的氨基酸取代，
（d）在位置27、28和29中的一个、两个或所有处的氨基酸修饰，例如在位置27和/或28的氨基酸修饰，和
（e）1-9或1-6进一步氨基酸修饰，例如1、2、3、4、5、6、7、8 或9进一步的氨基酸修饰，
且类似物对GIP受体活化的EC50为约10 nM或更低。
这些实施方案的类似物的式IV的氨基酸可以是任何氨基酸，例如式IV的氨基酸，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或16。在某些实施方案中，n为2、3、4或5，在这种情况下，氨基酸分别为Dab、Orn、Lys或高Lys。
这些实施方案的类似物的α,α-二取代的氨基酸可以为任何α,α-二取代的氨基酸，包括但不限于：氨基异丁酸（AIB）、二取代有选自甲基、乙基、丙基和正丁基的相同或不同基团或二取代有环辛烷或环庚烷（例如1-氨基环辛烷-1-甲酸）的氨基酸。在某些实施方案中，α,α-二取代氨基酸是AIB。
根据这些实施方案，类似物包含例如SEQ ID NOs: 1099-1165的任何的氨基酸序列。
在仍其他示例性实施方案中，具有GIP激动剂活性的胰高血糖素类似物(SEQ ID NO: 1001)包含：
（a）在位置1的赋予GIP激动剂活性的氨基酸修饰，和
（b）C末端至位置29的氨基酸的约1个至约21个氨基酸的延伸，其中所述延伸的氨基酸的至少一个酰化或烷基化，
其中类似物对GIP受体活化的EC50为约10 nM或更低。
在一些实施方案中，酰化或烷基化的氨基酸为式I、II或III的氨基酸。在更多特定的实施方案中，式I的氨基酸为Dab、Orn、Lys或高Lys。而且，在一些实施方案中，约1至约21个氨基酸的延伸包含氨基酸序列：GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1095) 或XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1096)，其中X为任何氨基酸；或者GPSSGAPPPK (SEQ ID NO: 1170) 或XGPSSGAPPPK (SEQ ID NO: 1171) 或XGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 1172)，其中X为Gly或小的脂族或非极性或轻微极性氨基酸。在一些实施方案中，约1至约21个氨基酸可以包含含有相对于SEQ ID NO: 1095、1096、1170、1171 或1172的一个或多个保守取代的序列。在一些实施方案中，酰化或烷基化的氨基酸位于C末端延伸的类似物的位置37、38、39、40、41、42、或43。在某些实施方案中，酰化或烷基化的氨基酸位于C末端延伸的类似物的位置40。
在一些实施方案中，具有GIP激动剂活性的类似物进一步包含在位置27、28和29中的一个、两个或所有处的氨基酸修饰，例如在位置27和/或28的氨基酸修饰。
在任何上述示例性实施方案中，赋予GIP激动剂活性的位置1的氨基酸修饰可以是His被缺少咪唑侧链的氨基酸的取代。位置1的氨基酸修饰可以是例如His被大的芳香族氨基酸取代。在一些实施方案中，大的芳香族氨基酸是本文描述的那些中的任何，包括例如Tyr。
而且，关于上述示例性实施方案，在位置27、28和29的一个、两个、或全部的氨基酸修饰可以为本文描述的这些位置的任何修饰。例如，在位置27的Met可以被大的脂族氨基酸任选Leu取代，在位置28的Asn可以被小的脂族氨基酸任选Ala取代，和/或在位置29的Thr被小的脂族氨基酸任选Gly取代。可选地，类似物可以包含位置27和/或28处的此类氨基酸修饰。
上述示例性实施方案的类似物可以进一步包含1-9或1-6个进一步的额外的氨基酸修饰，例如1、2、3、4、5、6、7、8 或9个进一步的氨基酸修饰，诸如例如本文描述任何修饰，其增加或降低对GIP、GLP-1和胰高血糖素受体的任一者的活性，改善作用持续时间或在循环中的半衰期，延迟作用起始或增加稳定性。类似物可以进一步包括例如在位置12的氨基酸修饰，任选地，被Ile取代，和/或位置17和18的氨基酸修饰，任选在位置17被Q和在位置18被A取代，和/或添加GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1095) 或XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1096)，或包含相对于SEQ ID NO: 1095 或1096的在C末端的一个或多个保守取代的序列。类似物可以包含以下修饰中的一个或多个：
在位置2的Ser被D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、AIB、Val、或α-氨基-N-丁酸取代；
在位置10的Tyr被Trp、Lys、Orn、Glu、Phe、或Val取代；
酰基与在位置10的Lys的连接；
位置12的Lys被Arg取代；
位置16的Ser被Glu、Gln、高谷氨酸、高半胱磺酸、Thr、Gly、或AIB取代；
位置17的Arg被Gln取代；
位置18的Arg被Ala、Ser、Thr、或Gly取代；
位置20的Gln被Ala、Ser、Thr、Lys、瓜氨酸、Arg、Orn、或AIB取代；
位置21的Asp被Glu、高谷氨酸、高半胱磺酸取代；
位置23的Val被Ile取代；
位置24的Gln被Asn、Ala、Ser、Thr、或AIB取代；和
位置2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28、和 29的任一者处的保守取代。
类似物在一些实施方案中包含修饰（i）至（xii）的组合。可选地或另外地，类似物可以包含在位置3的氨基酸修饰（例如Gln被Glu氨基酸取代），其中类似物具有胰高血糖素对胰高血糖素受体的低于1％的活性。可选地或另外地，类似物可以包含在位置7的氨基酸修饰（例如Thr被缺少羟基的氨基酸例如Abu或Ile取代），其中类似物具有GLP-1对GLP-1受体的低于约10%的活性。
关于示例性实施方案，类似物可以共价连接至亲水部分。在一些实施方案中，类似物共价连接至在以下任何的亲水部分：氨基酸位置16、17、20、21、24、29、40、或C末端。在某些实施方案中，类似物包含C末端延伸（例如SEQ ID NO: 1095的氨基酸序列）和包含亲水部分的氨基酸添加，从而使亲水部分在位置40共价连接至类似物。
在一些实施方案中，该亲水部分共价连接至类似物的Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸、或乙酰苯丙氨酸。Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸或乙酰苯丙氨酸可以是对胰高血糖素序列(SEQ ID NO: 1001)天然的氨基酸或它可以是代替SEQ ID NO: 1001的天然氨基酸的氨基酸。在一些实施方案中，其中亲水部分连接至Cys，与亲水部分的连接可以包含结构
。
关于包含亲水部分的类似物，亲水部分可以是本文描述的那些的任一种。参见例如在部分“亲水部分的连接”下的教导。在一些实施方案中，亲水部分是聚乙二醇（PEG）。PEG在某些实施方案中具有约1,000道尔顿至约40,000道尔顿、例如约20,000道尔顿至约40,000道尔顿的分子量。
关于示例性实施方案，类似物可以包含经修饰的氨基酸，其中侧链共价连接至酰基或烷基（例如，对天然存在的氨基酸非天然的酰基或烷基）。酰化或烷基化的类似物可以依照部分“酰化和烷基化”中描述的酰化或烷基化的肽。在一些实施方案中，酰基为C4至C30脂酰基，诸如例如C10脂酰基或烷基、C12脂酰基或烷基、C14脂酰基或烷基、C16脂酰基或烷基、C18脂酰基或烷基、C20脂酰基或烷基或C22脂酰基或烷基。酰基或烷基可以共价连接至类似物的任何氨基酸，包括但不限于位置10或40的氨基酸或C末端氨基酸。在某些实施方案中，类似物包含C末端延伸（例如SEQ ID NO: 1095的氨基酸序列）和包含酰基或烷基的氨基酸添加，从而使酰基或烷基在位置40共价连接至类似物。在一些实施方案中，酰基或烷基共价连接至式I、II、或III的氨基酸例如Lys残基的侧链。酰基或烷基可以共价连接至对于胰高血糖素序列(SEQ ID NO: 1001)是天然的氨基酸，或者可以连接至添加至序列SEQ ID NO: 1001或序列SEQ ID NO: 1001随后为SEQ ID NO: 1095（在N或C末端）的氨基酸，或者可以连接至替代天然氨基酸例如SEQ ID NO: 1001的位置10的Tyr的氨基酸。
在上述示例性实施方案中，其中类似物包含酰基或烷基，如本文所述，类似物可以经间隔基连接至酰基或烷基。该间隔基例如可以为长度3-10个原子，且可以例如为氨基酸（例如6-氨基己酸、本文描述的任何氨基酸）、二肽（例如Ala-Ala、βAla-βAla、Leu-Leu、Pro-Pro、γGlu-γGlu）、三肽、或亲水性或疏水性双功能间隔基。在某些方面中，间隔基和酰基或烷基的总长为约14至约28个原子。在一些实施方案中，氨基酸间隔基不是γ-Glu。在一些实施方案中，二肽间隔基不是γ-Glu-γ-Glu。
在仍进一步的示例性实施方案中，具有GIP激动剂活性的胰高血糖素类似物包含根据SEQ ID NOs: 1227、1228、1229 或1230的任一者的氨基酸序列，其进一步包含以下修饰：
（a）任选地，在位置1的赋予GIP激动剂活性的氨基酸修饰，
（b）C末端至位置29的氨基酸的约1个至约21个氨基酸的延伸，其中所述延伸的氨基酸的至少一个酰化或烷基化，和
（d）高至6个进一步的氨基酸修饰，
其中类似物对GIP受体活化的EC50为约10 nM或更低。
在一些方面中，酰化或烷基化的氨基酸为式I、II或III的氨基酸。在更多特定的实施方案中，式I的氨基酸为Dab、Orn、Lys或高Lys。而且，在一些实施方案中，约1至约21个氨基酸的延伸包含氨基酸序列：GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1095) 或XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1096)，其中X为任何氨基酸；或者GPSSGAPPPK (SEQ ID NO: 1170) 或XGPSSGAPPPK (SEQ ID NO: 1171) 或XGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 1172)，其中X为Gly或小的脂族或非极性或轻微极性氨基酸。在一些实施方案中，约1至约21个氨基酸可以包含含有相对于SEQ ID NO: 1095、1096、1170、1171 或1172的一个或多个保守取代的序列。在一些实施方案中，酰化或烷基化的氨基酸位于C末端延伸的类似物的位置37、38、39、40、41、42、或43。在某些实施方案中，酰化或烷基化的氨基酸位于C末端延伸的类似物的位置40。
在任何上述示例性实施方案中，赋予GIP激动剂活性的位置1的氨基酸可以是缺少咪唑侧链的氨基酸。位置1的氨基酸可以是例如大的芳香族氨基酸。在一些实施方案中，大的芳香族氨基酸是本文描述的那些中的任何，包括例如Tyr。
上述示例性实施方案的类似物可以进一步包含1-6个进一步的氨基酸修饰，诸如例如本文描述任何修饰，其增加或降低对GIP、GLP-1和胰高血糖素受体的任一者的活性，改善溶解性，改善作用持续时间或在循环中的半衰期，延迟作用起始或增加稳定性。
在某些方面中，上述示例性实施方案中描述的胰高血糖素的类似物包含在位置27、28和29的一个、两个或全部的进一步氨基酸修饰。在这些位置的修饰可以是相对于这些位置的本文描述的任何修饰。例如，相对于SEQ ID NO: 1227、1228、1229 或1230，位置27可以被大的脂族氨基酸（例如Leu、Ile或正亮氨酸）或Met取代，位置28可以被另一小的脂族氨基酸（例如Gly或Ala）或Asn取代，和/或位置29可以被另一小的脂族氨基酸（例如Ala或Gly）或Thr取代。可选地，类似物可以包含位置27和/或28处的此类氨基酸修饰。
类似物可以进一步包含以下额外修饰中的一个或多个：
在位置2的氨基酸被D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、AIB、Val、或α-氨基-N-丁酸中任一者取代；
在位置10的氨基酸被Tyr、Trp、Lys、Orn、Glu、Phe、或Val取代；
酰基与在位置10的Lys的连接；
位置12的氨基酸为Ile、Lys或Arg；
位置16的氨基酸为Ser、Glu、Gln、高谷氨酸、高半胱磺酸、Thr、Gly、或AIB中任一者；
位置17的氨基酸为Gln或Arg；
位置18的氨基酸为Ala、Arg、Ser、Thr或Gly中任一者；
位置20的氨基酸为Ala、Ser、Thr、Lys、瓜氨酸、Arg、Orn、或AIB或另一α,α-二取代氨基酸中任一者；
位置21的氨基酸为Glu、Asp、高谷氨酸、高半胱磺酸中任一者；
位置23的氨基酸为Val或Ile；
位置24的氨基酸为Gln、Asn、Ala、Ser、Thr、或AIB中任一者；
位置2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28、和 29的任一者处的一个或多个的保守取代。
类似物在一些实施方案中包含修饰（i）至（xii）的组合。可选地或另外地，类似物可以包含在位置3的氨基酸修饰（例如Gln被Glu氨基酸取代），其中类似物具有胰高血糖素对胰高血糖素受体的低于1％的活性。可选地或另外地，类似物可以包含在位置7的氨基酸修饰（例如Thr被缺少羟基的氨基酸例如Abu或Ile取代），其中类似物具有GLP-1对GLP-1受体的低于10%的活性。
关于示例性实施方案，类似物可以共价连接至亲水部分。在一些实施方案中，类似物共价连接至在以下任何的亲水部分：氨基酸位置16、17、20、21、24、29、40、或C末端。在某些实施方案中，类似物包含在位置24共价连接至类似物的亲水部分。
在一些实施方案中，该亲水部分共价连接至类似物的Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸、或乙酰苯丙氨酸。Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸或乙酰苯丙氨酸可以是对于SEQ ID NO: 1001、1227、1228、1229 或1230是天然的氨基酸或它可以是取代的氨基酸。在一些实施方案中，其中亲水部分连接至Cys，所述连接可以包含结构
。
关于包含亲水部分的类似物，亲水部分可以是本文描述的那些的任一种。参见例如在部分“亲水部分的连接”下的教导。在一些实施方案中，亲水部分是聚乙二醇（PEG）。PEG在某些实施方案中具有约1,000道尔顿至约40,000道尔顿、例如约20,000道尔顿至约40,000道尔顿的分子量。
关于示例性实施方案，类似物包含在C末端延伸内修饰的氨基酸，其中侧链共价连接至酰基或烷基。酰化或烷基化的类似物可以依照部分“酰化和烷基化”中描述的酰化或烷基化的肽。在一些实施方案中，酰基为C4至C30脂酰基，诸如例如C10脂酰基或烷基、C12脂酰基或烷基、C14脂酰基或烷基、C16脂酰基或烷基、C18脂酰基或烷基、C20脂酰基或烷基或C22脂酰基或烷基。酰基或烷基可以共价连接至类似物的任何氨基酸，包括但不限于位置10或40的氨基酸或C末端氨基酸。在一些实施方案中，酰基或烷基共价连接至式I、II、或III的氨基酸例如Lys残基的侧链。酰基或烷基共价连接至对于SEQ ID NO: 1001、1227、1228、1229或1230是天然的氨基酸或它可以连接至取代的氨基酸。酰基或烷基共价连接至对于SEQ ID NO: 1095、1096、1171 或1172是天然的氨基酸或它可以连接至取代的氨基酸。
在上述示例性实施方案中，其中类似物包含酰基或烷基，如本文所述，类似物可以经间隔基连接至酰基或烷基。该间隔基例如可以为长度3-10个原子，且可以例如为氨基酸（例如6-氨基己酸、本文描述的任何氨基酸）、二肽（例如Ala-Ala、βAla-βAla、Leu-Leu、Pro-Pro、γGlu-γGlu）、三肽、或亲水性或疏水性双功能间隔基。在某些方面中，间隔基和酰基或烷基的总长为约14至约28个原子。在一些实施方案中，氨基酸间隔基不是γ-Glu。在一些实施方案中，二肽间隔基不是γ-Glu-γ-Glu。
在一些非常特定的实施方案中，本发明的类似物包含选自SEQ ID NOs: 1099-1141、1144-1164、1166、1192-1207、1209-1221和1223或选自SEQ ID NOs: 1167-1169、1173-1178和1225的氨基酸序列。
此外，本发明的类似物的特定实例包括但不限于表1-3中提及的那些的任何。
在仍进一步的示例性实施方案中，具有GIP激动剂活性的胰高血糖素类似物包含酰基或烷基（例如，对于天然存在的氨基酸为非天然的酰基或烷基），其中酰基或烷基连接至间隔基，其中（i）间隔基连接至类似物的位置10的氨基酸的侧链；或（ii）类似物包含C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸的延伸且间隔基连接至对应于相对于SEQ ID NO: 1001的位置37-43之一的氨基酸的侧链，其中类似物对于GIP受体活化的EC50为约10 nM或更少。
在此类实施方案中，类似物可以包含SEQ ID NO: 1001的氨基酸序列，其具有（i）在位置1的赋予GIP激动剂活性的氨基酸修饰，（ii）在位置27、28和29的一个、两个、或所有处的氨基酸修饰，（iii）以下中的至少一个：
（A）类似物包含在位置i和i+4的氨基酸侧链之间或在位置j和j+3的氨基酸侧链之间的内酰胺桥，其中i为12、13、16、17、20或24，且其中j为17；
（B）在类似物的位置16、20、21和24的一个、两个、三个或全部氨基酸被α,α-二取代氨基酸所取代；或
（C）类似物包含(i)位置16的Ser被式IV的氨基酸的氨基酸取代：
[式IV],
其中n为1-7，其中R1和R2的每一个独立地选自H、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、和 (C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，其中R7为H或OH，且式IV的氨基酸的侧链包含游离氨基；和（ii）位置20的Gln被α,α-二取代氨基酸的氨基酸取代。
和（iv）高至6个进一步的氨基酸修饰。
这些实施方案的类似物的α,α-二取代的氨基酸可以为任何α,α-二取代的氨基酸，包括但不限于：氨基异丁酸（AIB）、二取代有选自甲基、乙基、丙基和正丁基的相同或不同基团或二取代有环辛烷或环庚烷（例如1-氨基环辛烷-1-甲酸）的氨基酸。在某些实施方案中，α,α-二取代氨基酸是AIB。
这些实施方案的类似物的式IV的氨基酸可以是任何氨基酸，例如式IV的氨基酸，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或16。在某些实施方案中，n为2、3、4或5，在这种情况下，氨基酸分别为Dab、Orn、Lys或高Lys。
在任何上述示例性实施方案中，赋予GIP激动剂活性的位置1的氨基酸修饰可以是His被缺少咪唑侧链的氨基酸的取代。位置1的氨基酸修饰可以是例如His被大的芳香族氨基酸取代。在一些实施方案中，大的芳香族氨基酸是本文描述的那些中的任何，包括例如Tyr。
而且，关于上述示例性实施方案，在位置27、28和29的一个、两个、或全部的氨基酸修饰可以为本文描述的这些位置的任何修饰。例如，在位置27的Met可以被大的脂族氨基酸任选Leu取代，在位置28的Asn可以被小的脂族氨基酸任选Ala取代，和/或在位置29的Thr被小的脂族氨基酸任选Gly取代。可选地，类似物可以包含位置27和/或28处的此类氨基酸修饰。
上述示例性实施方案的类似物可以进一步包含1-9或1-6个进一步的额外的氨基酸修饰，例如1、2、3、4、5、6、7、8 或9个进一步的氨基酸修饰，诸如例如本文描述任何修饰，其增加或降低对GIP、GLP-1和胰高血糖素受体的任一者的活性，改善溶解性，改善作用持续时间或在循环中的半衰期，延迟作用起始或增加稳定性。类似物可以进一步包括例如在位置12的氨基酸修饰，任选地，被Ile取代，和/或位置17和18的氨基酸修饰，任选在位置17被Q和在位置18被A取代，和/或添加GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1095) 或XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1096)，或包含相对于SEQ ID NO: 1095 或1096的在C末端的一个或多个保守取代的序列。类似物可以包含以下修饰中的一个或多个：
在位置2的Ser被D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、AIB、Val、或α-氨基-N-丁酸取代；
在位置10的Tyr被Trp、Lys、Orn、Glu、Phe、或Val取代；
酰基与在位置10的Lys的连接；
位置12的Lys被Arg取代；
位置16的Ser被Glu、Gln、高谷氨酸、高半胱磺酸、Thr、Gly、Lys、或AIB取代；
位置17的Arg被Gln取代；
位置18的Arg被Ala、Ser、Thr、或Gly取代；
位置20的Gln被Ala、Ser、Thr、Lys、瓜氨酸、Arg、Orn、或AIB取代；
位置21的Asp被Glu、高谷氨酸、高半胱磺酸取代；
位置23的Val被Ile取代；
位置24的Gln被Asn、Ala、Ser、Thr、或AIB取代；和
位置2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28、和 29的任一者处的保守取代。
类似物在一些实施方案中包含修饰（i）至（xii）的组合。可选地或另外地，类似物可以包含在位置3的氨基酸修饰（例如Gln被Glu氨基酸取代），其中类似物具有胰高血糖素对胰高血糖素受体的低于1％的活性。可选地或另外地，类似物可以包含在位置7的氨基酸修饰（例如Thr用缺少羟基的氨基酸例如Abu或Ile的氨基酸取代）、C末端至位置27或28的氨基酸的缺失，产生27或28个氨基酸的肽，或其组合，其中所述类似物具有GLP-1对GLP-1受体的活性的少于约10％。
关于示例性实施方案，类似物可以共价连接至亲水部分。在一些实施方案中，类似物共价连接至在以下任何的亲水部分：氨基酸位置16、17、20、21、24、29、40、或C末端。在某些实施方案中，类似物包含C末端延伸（例如SEQ ID NO: 1095的氨基酸序列）和包含亲水部分的氨基酸添加，从而使亲水部分在位置40共价连接至类似物。
在一些实施方案中，该亲水部分共价连接至类似物的Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸、或乙酰苯丙氨酸。Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸或乙酰苯丙氨酸可以是对胰高血糖素序列(SEQ ID NO: 1001)天然的氨基酸或它可以是代替SEQ ID NO: 1001的天然氨基酸的氨基酸。在一些实施方案中，其中亲水部分连接至Cys，与亲水部分的连接可以包含结构
。
关于包含亲水部分的类似物，亲水部分可以是本文描述的那些的任一种。参见例如在部分“亲水部分的连接”下的教导。在一些实施方案中，亲水部分是聚乙二醇（PEG）。PEG在某些实施方案中具有约1,000道尔顿至约40,000道尔顿、例如约20,000道尔顿至约40,000道尔顿的分子量。
在示例性实施方案中，其中类似物包含酰基或烷基，其经间隔基连接至类似物，间隔基可以是如本文所述的任何间隔基。该间隔基例如可以为长度3-10个原子，且可以例如为氨基酸（例如6-氨基己酸、本文描述的任何氨基酸）、二肽（例如Ala-Ala、βAla-βAla、Leu-Leu、Pro-Pro、γGlu-γGlu）、三肽、或亲水性或疏水性双功能间隔基。在某些实施方案中，间隔基和酰基或烷基的总长为约14至约28个原子。在一些实施方案中，氨基酸间隔基不是γ-Glu。在一些实施方案中，二肽间隔基不是γ-Glu-γ-Glu。
酰基或烷基是如本文所述的任何酰基或烷基，诸如对于天然存在的氨基酸是非天然的酰基或烷基。酰基或烷基在一些实施方案中为C4至C30脂酰基，诸如例如C10脂酰基或烷基、C12脂酰基或烷基、C14脂酰基或烷基、C16脂酰基或烷基、C18脂酰基或烷基、C20脂酰基或烷基、或C22脂酰基或烷基、或C4至C30烷基。在特定实施方案中，酰基为C12至C18脂酰基（例如C14或C16脂酰基）。
在一些实施方案中，类似物的C末端至位置29的氨基酸的约1至约21个氨基酸的延伸包含氨基酸序列：GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1095) 或XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 1096)，其中X为任何氨基酸；或者GPSSGAPPPK (SEQ ID NO: 1170) 或XGPSSGAPPPK (SEQ ID NO: 1171) 或XGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 1172)，其中X为Gly或小的脂族或非极性或轻微极性氨基酸。在一些实施方案中，约1至约21个氨基酸可以包含含有相对于SEQ ID NO: 1095、1096、1170、1171 或1172的一个或多个保守取代的序列。在一些实施方案中，酰化或烷基化的氨基酸位于C末端延伸的类似物的位置37、38、39、40、41、42、或43。在某些实施方案中，酰化或烷基化的氨基酸位于C末端延伸的类似物的位置40。
GIP激动剂可以是包含氨基酸序列例如SEQ ID NOs: 1005-1094的任一的氨基酸序列（任选具有高至1、2、3、4或5个进一步保留胰高血糖素激动剂活性的修饰）的肽。在某些的实施方案，GIP激动剂包含SEQ ID NOs: 1099-1262的任何的氨基酸。
进一步的示例性实施方案
在本发明的一些方面中，展示对GIP受体的激动剂活性的类似物包含具有至少一个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 1001（天然胰高血糖素）和类似物的C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸（例如5-18、7-15、9-12个氨基酸）的延伸。
在某些方面中，类似物包含至少一个氨基酸修饰和高至15个氨基酸修饰（例如，不超过15个氨基酸修饰，不超过10个氨基酸修饰）。例如，类似物可以包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15氨基酸修饰的SEQ ID NO: 1001。在某些实施方案中，类似物包含至少一个氨基酸修饰高至10个氨基酸修饰和额外的保守的氨基酸修饰。在进一步的方面中，氨基酸修饰的至少一个赋予类似物的C末端部分中的稳定的α螺旋结构。实现稳定的α螺旋结构的修饰本文描述。参见例如在标题为α螺旋结构的稳定的部分下的教导。
包含酰化或烷基化的（1-21个氨基酸的）C末端延伸的类似物出人意料地展示对GIP受体的增加的激动剂活性。因此，在某些方面中，位于位置37-43（根据SEQ ID NO: 1001的编号）的任何的延伸的至少一个氨基酸包含对于天然存在的氨基酸为非天然的酰基或烷基，即延伸是酰化或烷基化的。在一些实施方案中，酰基或烷基直接连接至氨基酸，例如经氨基酸的侧链。在其他实施方案中，酰基或烷基经接头（例如，氨基酸、二肽、三肽、亲水性双功能间隔基、疏水性双功能间隔基）连接至氨基酸。包含酰基或烷基的合适的氨基酸以及合适的酰基和烷基描述于本文。参见例如在标题为酰化和/或烷基化以及A-B与酰基或烷基的连接部分下的教导。
在其他实施方案中，C末端延伸的1-6个氨基酸（例如1-2、1-3、1-4、1-5个氨基酸）为带正电荷的氨基酸，例如式IV的氨基酸，诸如Lys。如本文所用，术语“带正电荷的氨基酸”指任何氨基酸（天然存在的或非天然存在的氨基酸），其包含在生理pH（例如pH6.8-8.0、pH7.0-7.7）下在其侧链的原子上的正电荷。在某些方面，带正电荷的氨基酸位于位置37、38、39、40、41、42、和 43的任一者。在特定的实施方案中，带正电荷的氨基酸位于位置40。
在其他情况下，延伸如本文所述酰化或烷基化，且包含如本文所述的1-6个带正电荷的氨基酸。
在仍其他实施方案中，展示对GIP受体的激动剂活性的类似物包含（i）具有至少一个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 1001，（ii）类似物的C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸（例如5-18、7-15、9-12个氨基酸）的延伸，和（iii）包含对于天然存在的氨基酸为非天然的酰基或烷基的位于C末端延伸的外面（例如位于位置1-29的任一者）的氨基酸。在一些实施方案中，类似物包含位置10的酰化或烷基化的氨基酸。在具体实施方案中，酰基或烷基为C4-C30脂酰基或C4-C30烷基。在一些实施方案中，酰基或烷基经接头（例如，氨基酸、二肽、三肽、亲水性双功能间隔基、疏水性双功能间隔基）连接。在某些实施方案中，类似物包含稳定α螺旋的氨基酸修饰，诸如位置16的Glu和位置20的Lys之间的盐桥，或在位置16、20、21和24中的任一个、两个、三个或多个处的α,α-二取代氨基酸。在特定实施方案中，类似物额外包含赋予DPP-IV蛋白酶抗性的氨基酸修饰。包含进一步氨基酸修饰的类似物在本文中进行考虑。
在某些实施方案中，具有GIP受体活性的类似物展示出天然GIP对GIP受体的活性的至少0.1% (例如至少 0.5%、1%、2%、5%、10%、15%、或20%)。在一些实施方案中，类似物展示天然GIP对GIP受体的活性的多于20％（例如多于50%、多于75%、多于100%、多于200%、多于300%、多于500%）。在一些实施方案中，类似物展示对GLP-1和胰高血糖素受体的一者或两者的可估计的激动剂活性。在一些方面中，对于这些受体（GIP受体和GLP-1受体和/或胰高血糖素受体）的选择性在100倍内。例如，具有GIP受体活性的类似物对GLP-1受体的选择性可以为对于GIP受体和/或胰高血糖素受体的选择性的少于100倍，在50倍内、在25倍内、在15倍内、在10倍内。
GLP-1活性可以通过包含以下来降低：（i）C末端α羧基，（ii）在位置7用缺少羟基的氨基酸例如Abu或Ile取代Thr，（iii）缺失C末端氨基酸至位置27或28的氨基酸（例如缺失位置28的氨基酸，缺失位置28和29的氨基酸）以产生长度为27或28个氨基酸的肽，或（iv）其组合。
在本发明的一些实施方案中，提供胰高血糖素肽的类似物，所述类似物展示对GIP受体的激动剂活性。在某些实施方案中，类似物包含具有至少一个氨基酸修饰（任选地，高至15个氨基酸修饰）和类似物的C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸的延伸的SEQ ID NO: 1001的氨基酸序列。
在某些方面中，类似物包含至少一个氨基酸修饰和高至15个氨基酸修饰（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个氨基酸修饰，高至10个氨基酸修饰）。在某些实施方案中，类似物包含至少一个氨基酸修饰高至10个氨基酸修饰和额外的保守的氨基酸修饰。保守氨基酸修饰描述于本文。
在一些方面中，氨基酸修饰的至少一个赋予类似物的C末端部分中的稳定的α螺旋结构。实现稳定的α螺旋结构的修饰本文描述。参见例如在标题为α螺旋结构的稳定的部分下的教导。在一些方面中，类似物包含在类似物的两个氨基酸的侧链之间的分子内桥（例如共价分子内桥、非共价分子内桥）。在某些方面中，分子内桥连接在位置i和i+4的氨基酸的侧链，其中i为12、13、16、17、20、或24。在其他方面，分子内桥连接在位置j和j+3的氨基酸的侧链，其中j为17，或在位置k和k+7的氨基酸的侧链，其中k为12-22之间的任何整数。在某些实施方案中，分子内桥为共价分子内桥，例如内酰胺桥。在特定方面中，内酰胺桥连接位置16和20的氨基酸的侧链。在具体的方面中，位置16和20处的氨基酸之一为带正电荷的氨基酸且另一个为带负电荷的氨基酸。例如，类似物可以包含连接位置16的Glu和位置20的Lys的侧链的内酰胺桥。在其他方面，带负电荷的氨基酸和带正电荷的氨基酸形成盐桥。在这种情况下中，分子内桥是非共价的分子内桥。
在特定方面中，赋予稳定的α螺旋的氨基酸修饰为SEQ ID NO: 1001的氨基酸被α,α-二取代氨基酸插入或取代。用于稳定α螺旋的目的的合适的α,α-二取代氨基酸描述于本文且包括例如AIB。在一些方面，SEQ ID NO: 1001的位置16、20、21和24的一个、两个、三个或全部氨基酸被α,α-二取代氨基酸例如AIB所取代。在特定实施方案中，位置16的氨基酸是AIB。
展示对GIP受体的激动剂活性的类似物可以包含额外的修饰，诸如本文描述的任何那些。例如，氨基酸修饰可以增加或降低GLP-1受体和胰高血糖素受体的一者或两者的活性。氨基酸修饰可以增加肽的稳定性，例如增加对DPP-IV蛋白酶降解的抗性，稳定氨基酸15和16之间的键。氨基酸修饰可以增加肽的溶解性和/或改变类似物对GIP、胰高血糖素和GLP-1受体的任一者的作用时间。这些类型修饰的任何的组合可以存在于展示对GIP受体的激动剂活性的类似物中。
因此，在一些方面中，类似物包含具有以下中的一个或多个的SEQ ID NO: 1001的氨基酸序列：在位置17的Gln，在位置18的Ala，在位置21的Glu，在位置23的Ile，和在位置24的Ala、Asn、或Cys，或其保守氨基酸取代。在一些方面，类似物包含C末端酰胺替代C末端α羧基。在某些实施方案中，类似物包含在位置1、位置2、或位置1和2的氨基酸取代，所述取代实现DPP-IV蛋白酶抗性。合适的氨基酸取代描述于本文。例如，在位置1的DMIA和/或在位置2的d-Ser或AIB。
在一些实施方案中，在位置27和/或28且任选在位置29修饰类似物。例如，在位置27的Met被大的脂族氨基酸任选Leu取代，在位置28的Asn被小的脂族氨基酸任选Ala取代，且在位置29的Thr被小的脂族氨基酸任选Gly取代。不受任何具体理论束缚，据信在位置27-29被LAG取代提供相对于SEQ ID NO: 1001在那些位置的天然MNT序列的增加的GIP活性。在一些方面，位置1的氨基酸为包含咪唑环的氨基酸，例如His、His的类似物，且类似物如本文所述在位置27和/或28和任选在位置29修饰。
另外或可选地，类似物可以包含以下之一或其组合：（a）位置2的Ser被Ala取代；（b）位置3的Gln被Glu或谷氨酰胺类似物取代；（c）位置7的Thr被Ile取代；（d）位置10的Tyr被Trp或包含对于天然存在的氨基酸为非天然的酰基或烷基的氨基酸取代；（e）位置12的Lys被Ile取代；（f）位置15的Asp被Glu取代；（g）位置16的Ser被Glu取代；（h）位置20的Gln被Ser、Thr、Ala、AIB取代；（i）位置24的Gln被Ser、Thr、Ala、AIB取代；（j）位置27的Met被Leu或Nle取代；（k）位置29的Asn被带电荷的氨基酸任选为Asp或Glu取代；和（l）位置29的Thr被Gly或带电荷的氨基酸任选Asp或Glu取代。
在某些方面，类似物不包含在位置1的赋予GIP激动剂活性的氨基酸修饰。在一些实施方案中，位置1的氨基酸不是大的芳香族氨基酸例如Tyr。在一些实施方案中，位置1的氨基酸为包含咪唑环的氨基酸例如His或His的类似物。在某些实施方案中，类似物不是任何美国专利申请号61/151,349中公开的化合物。在某些方面，激动剂包含SEQ ID NOs: 657-669的任何的氨基酸序列。在某些方面，类似物包含SEQ ID NOs: 657-669的任何的经修饰的氨基酸序列，其中位置12的氨基酸为Ile和/或位置27的氨基酸为Leu和/或位置28的氨基酸为Ala。在一些方面，类似物包含SEQ ID NOs: 676、677、679、680的任何的氨基酸序列。
关于展示对GIP受体的激动剂活性的类似物，所述类似物包含1-21个氨基酸（例如5-19、7-15、9-12个氨基酸）的延伸。类似物的延伸可以包含任何氨基酸序列，只要延伸为1-21个氨基酸。在一些方面中，延伸为7-15个氨基酸且在其他方面中，延伸为9-12个氨基酸。在一些实施方案中，延伸包含（i）SEQ ID NO: 26或674的氨基酸序列，（ii）与SEQ ID NO: 26或674的氨基酸序列具有高序列同一性（例如至少80%、85%、90%、95%、98%、99%）的氨基酸序列，或（iii）具有一个或多个保守氨基酸修饰的（i）或（ii）的氨基酸序列。
在一些实施方案中，延伸的至少一个氨基酸为酰化的或烷基化的。包含酰基或烷基的氨基酸可以位于类似物的延伸的任何位置。在某些实施方案中，延伸的酰化或烷基化的氨基酸位于类似物的位置37、38、39、40、41、或42 (根据SEQ ID NO: 1001的编号)之一。在某些实施方案中，酰化或烷基化的氨基酸位于类似物的位置40。
在示例性实施方案中，酰基或烷基为对于天然存在的氨基酸是非天然的酰基或烷基。例如，酰基或烷基可以为C4-C30（例如C12-C18）脂酰基或C4-C30（例如C12-C18）烷基。酰基或烷基可以为本文所讨论的那些的任一种。
在一些实施方案中，酰基或烷基直接连接至氨基酸，例如经氨基酸的侧链。在其他实施方案中，酰基或烷基经接头（例如，氨基酸、二肽、三肽、亲水性双功能间隔基、疏水性双功能间隔基）连接至氨基酸。在某些方面中，间隔基长度为3-10个原子。在一些实施方案中，间隔基为包含6-氨基己酸、Ala、Pro、Leu、β-Ala、γ-Glu（例如γ-Glu-γ-Glu）中的一种或两种的氨基酸或二肽。在具体的方面中，间隔基的总长度为14-28个原子。
而且，在示例性实施方案中，酰基或烷基与其连接的氨基酸可以是本文描述的那些的任一种，包括例如式I、II或III的氨基酸。酰化或烷基化的氨基酸可以是Lys，例如。包含酰基或烷基的合适的氨基酸以及合适的酰基、烷基和间隔基描述于本文。参见例如在标题为酰化和/或烷基化以及A-B与酰基或烷基的连接部分下的教导。
在其他实施方案中，延伸的1-6个氨基酸（例如1-2、1-3、1-4、1-5个氨基酸）为带正电荷的氨基酸，例如式IV的氨基酸，诸如Lys。如本文所用，术语“带正电荷的氨基酸”指任何氨基酸（天然存在的或非天然存在的氨基酸），其包含在生理pH下在其侧链的原子上的正电荷。在某些方面，带正电荷的氨基酸位于位置37、38、39、40、41、42、和 43的任一者。在特定的实施方案中，带正电荷的氨基酸位于位置40。
在其他情况下，延伸如本文所述酰化或烷基化，且包含如本文所述的1-6个带正电荷的氨基酸。
在仍其他实施方案中，展示对GIP受体的激动剂活性的类似物包含（i）具有至少一个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 1001，（ii）类似物的C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸（例如5-18、7-15、9-12个氨基酸）的延伸，和（iii）包含对于天然存在的氨基酸为非天然的酰基或烷基的位于C末端延伸的外面（例如位于位置1-29的任一者）的氨基酸。在一些实施方案中，类似物包含位置10的酰化或烷基化的氨基酸。在具体实施方案中，酰基或烷基为C4-C30脂酰基或C4-C30烷基。在一些实施方案中，酰基或烷基经接头（例如，氨基酸、二肽、三肽、亲水性双功能间隔基、疏水性双功能间隔基）连接。在某些实施方案中，类似物包含稳定α螺旋的氨基酸修饰，诸如位置16的Glu和位置20的Lys之间的盐桥，或在位置16、20、21和24中的任一个、两个、三个或多个处的α,α-二取代氨基酸。在特定方面中，类似物额外包含赋予DPP-IV蛋白酶抗性的例如在位置1的DMIA、在位置2的AIB的氨基酸修饰。包含进一步氨基酸修饰的类似物在本文中进行考虑。
在某些实施方案中，当类似物缺少亲水部分例如PEG时，具有GIP受体活性的类似物展示出天然GIP对GIP受体的活性的至少0.1% (例如至少 0.5%、1%、2%、5%、10%、15%、或20%)。在一些实施方案中，类似物展示天然GIP对GIP受体的活性的多于10%（例如多于20％、多于50%、多于75%、多于100%、多于200%、多于300%、多于500%）。在一些实施方案中，类似物展示对GLP-1和胰高血糖素受体的一者或两者的可估计的激动剂活性。在一些方面中，对这些受体（GIP受体和GLP-1受体和/或胰高血糖素受体）的效力和/或选择性在1000倍、750倍、500倍、250倍、或100倍之内（更高或更低）。例如，具有GIP受体活性的类似物对GLP-1受体的选择性可以为对于GIP受体和/或胰高血糖素受体的选择性的少于1000倍、500倍、100倍，在50倍内、在25倍内、在15倍内、在10倍内（更高或更低）。
本文进一步提供具有GIP激动剂活性的胰高血糖素肽的类似物，所述类似物包含：
（i）具有至少一个且高至10个氨基酸修饰的天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 1001)的序列，其中至少一个氨基酸修饰赋予类似物的C末端部分中的稳定的α螺旋结构；
（ii）C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸的延伸，和
（iii）以下中至少一个：
（a）位于位置37-43（根据SEQ ID NO: 1001的编号）的任何的延伸的至少一个氨基酸包含对于天然存在的氨基酸为非天然的酰基或烷基，
（b）类似物在类似物的位置10包含含有酰基或烷基的氨基酸，所述酰基或烷基对于天然存在的氨基酸是非天然的，或
（c）（a）和（b）的组合；
其中，当类似物缺乏亲水部分时，类似物展示出天然GIP对GIP受体的至少0.1%的活性。优选地，包含（连接至）非天然酰基或烷基的氨基酸为式I、II或III的氨基酸，例如Lys。优选地，包含非天然酰基或烷基的氨基酸位于类似物的位置37、38、39、40、41、42 或43中的任一者。
任何前述的类似物可以进一步包含（i）位置i的氨基酸和位置i+4的氨基酸的侧链之间或位置j和j+3的氨基酸的侧链之间的分子内桥，其中i为12、13、16、17、20 或24且j为17，或（ii）类似物的位置16、20、21或24中的一个、两个、三个或更多个被α,α-二取代氨基酸取代，或（iii）（i）和（ii）两者。此类类似物可以在位置1具有不是大的芳香族氨基酸（例如Tyr）的氨基酸。例如，位置1的氨基酸可以是包含咪唑环的氨基酸任选为His。
在一些或任何实施方案中，类似物包含位置16的Glu和位置20的Lys，其中任选地内酰胺桥连接Glu和Lys，且任选地进一步包含以下的一个或多个：位置17的Gln、位置18的Ala、位置21的Glu、位置23的Ile、和位置24的Ala或Cys、或其一个或多个保守氨基酸取代。
在一些或任何实施方案中，此类类似物可以包含（a）C末端酰胺，和/或（b）位置1、位置2或位置1和2的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代实现DPP-IV蛋白酶抗性。在一些实施方案中，位置1的His被选自以下的氨基酸取代：D-组氨酸、α,α-二甲基咪唑乙酸（DMIA）、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟组氨酸、乙酰组氨酸和高组氨酸。在一些实施方案中，位置2的Ser被选自以下的氨基酸取代：D-丝氨酸、丙氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸、和氨基异丁酸（AIB）。
任何前述类似物可以包含在位置27、28和29的一个、两个或全部的进一步氨基酸修饰。例如，（a）在位置27的Met被大的脂族氨基酸任选Leu取代，（b）在位置28的Asn被小的脂族氨基酸任选Ala取代，（c）在位置29的Thr被小的脂族氨基酸任选Gly取代，或（d）（a）、（b）和（c）中的两者或全部的组合。在特定的示例性实施方案中，此类修饰为：位置27的Leu，位置28的Ala，和位置29的Gly或Thr。
任何前述类似物可以包含以下修饰中的一个或多个：
a.位置2的Ser被Ala取代；
b.位置3的Gln被Glu或谷氨酰胺类似物取代；
c.位置7的Thr被Ile取代；
d.位置10的Tyr被Trp或包含对于天然存在的氨基酸为非天然的酰基或烷基的氨基酸取代；
e.位置12的Lys被Ile取代；
f.位置15的Asp被Glu取代；
g.位置16的Ser被Glu取代；
h.位置20的Gln被Ser、Thr、Ala、AIB取代；
i.位置24的Gln被Ser、Thr、Ala、AIB取代；
j.位置27的Met被Leu或Nle取代；
k.位置29的Asn被带电荷的氨基酸任选Asp或Glu取代；和
l.位置29的Thr被Gly或带电荷的氨基酸任选Asp或Glu取代。
任何前述类似物可以在一些或任何实施方案中包含（i）GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 26) 或XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 674)的氨基酸序列，其中X为任何氨基酸，（ii）对SEQ ID NO: 26或SEQ ID NO: 674具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，或（iii）具有一个或两个保守氨基酸取代的（i）或（ii）的氨基酸序列，其中氨基酸序列为类似物的C末端至位置29的氨基酸。
在任何这些实施方案中，酰基为C4至C30脂酰基，或C12至C18脂酰基，或C14至C16脂酰基，或胆汁酸或盐，或类固醇或胆固醇基团。酰基或烷基可以共价连接至氨基酸的侧链，其经过间隔基例如氨基酸或二肽、6-氨基己酸、选自以下的二肽：Ala-Ala、β-Ala- β-Ala、Leu-Leu、或Pro-Pro。在一些实施方案中，间隔基长度为3-10个原子，或间隔基与酰基的总长度为长度约14至约28个原子。
在一些实施方案中，任何前述类似物可以在位置37、38、39、40、41、42、和43（根据SEQ ID NO: 1001的编号）或在C末端中任一者包含1-6个带正电荷的氨基酸。此类带正电荷的氨基酸包括式IV的结构：
[式IV],
其中n为1-16、或1-10、或1-7、或1-6、或2-6、或2或3或4或5，R1和R2的每一个独立地选自H、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、和 (C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，其中R7为H或OH，且式IV的氨基酸的侧链包含游离氨基。例如，式IV的氨基酸为Orn、Dab、Lys或高Lys。
任何前述类似物可以共价连接至在以下任何的亲水部分：氨基酸位置19、20、23、24、27、32、40、43或C末端。亲水部分可以在该位置共价连接至任何合适的氨基酸，包括Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸或乙酰苯丙氨酸。亲水部分的实例包括聚乙二醇（PEG），例如分子量约1,000道尔顿至约40,000道尔顿、或约20,000道尔顿至约40,000道尔顿的聚乙二醇。
在一些实施方案中，当未连接至亲水部分时，类似物对GIP受体活化的EC50为约10 nM或更低。类似物对GLP-1受体的EC50与类似物对GIP受体的EC50的比率可以少于0.01。
3类胰高血糖素相关肽
在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽为3类胰高血糖素相关肽，其描述于本文和国际专利申请号PCT US2009/47438 (提交于2009年6月16日)、公开于2008年8月21日的国际专利申请公开号WO 2008/101017和美国临时申请号61/090,412和美国申请号61/177,476，其内容以其整体通过引用并入，和提交于10年12月09日的国际申请号PCT/US10/59724和美国临时申请号61/288,248中，其内容以其整体通过引用并入，以及提交于12年6月12日的国际专利申请号PCT/US12/42085和美国临时申请号61/500,025中，其内容以其整体通过引用并入。
关于3类胰高血糖素相关肽的以下部分(SEQ ID NOs: 1-656)中提及的一些生物序列对应于国际专利申请号PCT/US2009/47438中的SEQ ID NOs: 1-656。
活性
3类胰高血糖素相关肽可以是展示对胰高血糖素受体增加的活性且在进一步的实施方案中展示增强的生物物理稳定性和/或水溶解性的肽。此外，在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽已丧失天然胰高血糖素对于胰高血糖素受体相比于GLP-1受体的选择性，且因此代表这两种受体的共激动剂。在3类胰高血糖素相关肽内所选的氨基酸修饰可以控制肽对于GLP-1受体相比于胰高血糖素受体的相对活性。因此，3类胰高血糖素相关肽可以是胰高血糖素/GLP-1共激动剂，其具有对胰高血糖素受体相比于GLP-1受体的更高的活性；胰高血糖素/GLP-1共激动剂，其具有对两种受体大致相同的活性；或胰高血糖素/GLP-1共激动剂，其具有对GLP-1受体相比于胰高血糖素受体更高的活性。共激动剂的后一类可以工程化以展示对胰高血糖素受体几乎没有或完全没有的活性，且仍保留以与天然GLP-1相同的或比其更好的效力活化GLP-1受体的能力。任何这些共激动剂还可以包括赋予增强的生物物理稳定性和/或水溶解性的修饰。
3类胰高血糖素相关肽的修饰可以进行以产生这样的胰高血糖素肽，其具有相对于天然GLP-1对GLP-1受体的从至少约1％（包括至少约1.5%、2%、5%、7%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、100%、125%、150%、175%）至约200％或更高之间的任何数值的活性和相对于天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的从约1％（包括约1.5%、2%、5%、7%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%）至约500％或更高之间的任何数值的活性。天然胰高血糖素的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，GLP-1(7-36)酰胺的氨基酸序列为SEQ ID NO: 52，且GLP-1(7-37)酸的氨基酸序列为SEQ ID NO: 50。在示例性实施方案中，3类胰高血糖素相关肽可以展示出天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的至少10％和天然GLP-1对GLP-1受体的活性的至少50％，或者天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的至少40％和天然GLP-1对GLP-1受体的活性的至少40％，或者天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的至少60％和天然GLP-1对GLP-1受体的活性的至少60％。
3类胰高血糖素相关肽对胰高血糖素受体相比于GLP-1受体的选择性可以描述为胰高血糖素/GLP-1活性的相对比率（肽的相对于天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性除以肽的相对于GLP-1对GLP-1受体的活性）。例如，展示出天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的60％和天然GLP-1对GLP-1受体的活性的60％的3类胰高血糖素相关肽具有胰高血糖素/GLP-1活性的1:1的比率。胰高血糖素/GLP-1活性的示例性比率包括约1:1、1.5:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1 或10:1、或约1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、或1:1.5。作为实例，10:1的胰高血糖素/GLP-1活性比率表示对于胰高血糖素受体相比于GLP-1受体的10倍的选择性。类似地，10:1的GLP-1/胰高血糖素活性比率表示对于GLP-1受体相比于胰高血糖素受体的10倍的选择性。
在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽具有天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的约10％或更少，例如约1-10%，或约0.1-10%、或大于约0.1％但少于约10％，同时展示出GLP-1对GLP-1受体的活性的至少20％。例如，本文描述的示例性3类胰高血糖素相关肽具有天然胰高血糖素的活性的约0.5％、约1％或约7％，同时展示出GLP-1对GLP-1受体的活性的至少20％。
3类胰高血糖素相关肽可以为对胰高血糖素受体、或GLP-1受体或两者具有增加或降低的活性的胰高血糖素肽。3类胰高血糖素相关肽可以为对胰高血糖素受体相比于GLP-1受体具有改变的选择性的胰高血糖素肽。
因此，如本文公开，提供还展示改善的溶解性和/或稳定性的高效力3类胰高血糖素相关肽。示例性的高效力3类胰高血糖素相关肽展示至少约200%的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性，且任选地以至少1 mg/mL的浓度在6-8、或6-9、或7-9的pH下（例如pH7）是可溶的，且任选地在25℃下24小时后保留至少95％的原始肽（例如，5％或更少的原始肽降解或被切割）。作为另一实例，示例性3类胰高血糖素相关肽展示出对胰高血糖素和GLP-1受体两者大于约40％或大于约60％的活性（例如约1:3至3:1、或约1:2至2:1的比率），任选地以至少1 mg/mL的浓度在6-8、或6-9、或7-9的pH下（例如pH7）是可溶的，且任选地在25℃下24小时后保留至少95％的原始肽。另一示例性3类胰高血糖素相关肽展示出对天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的约175％或更多的活性和天然GLP-1对GLP-1受体的约20%或更少的活性，任选地以至少1 mg/mL的浓度在6-8、或6-9、或7-9的pH下（例如pH7）是可溶的，且任选地在25℃下24小时后保留至少95％的原始肽。仍另一示例性3类胰高血糖素相关肽展示出对天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的约10%或更少的活性和天然GLP-1对GLP-1受体的至少约20%的活性，任选地以至少1 mg/mL的浓度在6-8、或6-9、或7-9的pH下（例如pH7）是可溶的，且任选地在25℃下24小时后保留至少95％的原始肽。仍另一示例性3类胰高血糖素相关肽展示出对天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的约10%或更少但高于0.1%、0.5%或1%的活性和天然GLP-1对GLP-1受体的至少约50%、60%、70%、80%、90%或100%或更多的活性，任选地以至少1 mg/mL的浓度在6-8、或6-9、或7-9的pH下（例如pH7）是可溶的，且任选地在25℃下24小时后保留至少95％的原始肽。在一些实施方案中，此类3类胰高血糖素相关肽在天然胰高血糖素的对应位置保留至少22、23、24、25、26、27或28个天然存在的氨基酸（例如，相对于天然存在的胰高血糖素具有1-7、1-5或1-3个修饰）。
影响胰高血糖素活性的修饰
通过在天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的位置16的氨基酸修饰提供对胰高血糖素受体提高的活性。在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽是已经相对于野生型肽
修饰已增强肽对胰高血糖素受体的效力的胰高血糖素激动剂。天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)在位置16的正常存在的丝氨酸可以被所选的酸性氨基酸取代以增强胰高血糖素的效力，所述效力为其在经验证的体外模型测定中刺激cAMP合成的能力（参见实施例5）。更具体而言，该取代增强类似物对胰高血糖素受体的效力升高至少2倍、4倍、5倍且高至10倍。该取代还增强类似物相对于天然胰高血糖素而言对GLP-1受体的活性至少5倍、10倍、或15倍，但维持对胰高血糖素受体相比于GLP-1受体的选择性。
借助于非限制性实例，此类增强的效力可以通过在位置16用以下取代天然存在的丝氨酸来提供：谷氨酸、或另一具有长度为4个原子的侧链的带负电荷的氨基酸、或可选地谷氨酰胺、高谷氨酸或高半胱磺酸或具有含有至少一个杂原子（例如N、O、S、P）的侧链和具有长度约4（或3-5）个原子的侧链的带电荷的氨基酸之一。根据一些实施方案，天然胰高血糖素的位置16的丝氨酸残基被选自谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸、高半胱磺酸、苏氨酸或甘氨酸的氨基酸取代。根据一些实施方案，天然胰高血糖素的位置16的丝氨酸残基被选自谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸和高半胱磺酸的氨基酸取代，和在一些实施方案中，丝氨酸残基被谷氨酸取代。
在一些实施方案中，增强效力的3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7的肽或SEQ ID NO: 5的胰高血糖素激动剂类似物。根据一些实施方案，提供具有相对于野生型胰高血糖素而言对胰高血糖素受体的增强的效力的3类胰高血糖素相关肽，其中所述肽包含的SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9 或SEQ ID NO: 10序列，其中所述胰高血糖素肽保留相对于GLP-1受体的对胰高血糖素受体的选择性。在一些实施方案中，具有对胰高血糖素受体增强的特异性的3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10的肽或其胰高血糖素激动剂类似物，其中羧基末端氨基酸保留其天然的羧酸基团。根据一些实施方案，3类胰高血糖素相关肽包含
的序列，其中如通过实施例5的体外cAMP测定所测量，相对于天然胰高血糖素，所述肽展示出对胰高血糖素受体的大约五倍增强的效力。
胰高血糖素受体活性可以通过在位置3的氨基酸修饰，例如在位置3的天然存在的谷氨酰胺的取代来降低、维持、或增强。在一些实施方案中，位置3的氨基酸被酸性、碱性或疏水性氨基酸（谷氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸）取代已显示实质上降低或破坏胰高血糖素受体活性。被例如谷氨酸、鸟氨酸或正亮氨酸取代的类似物具有天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的约10％或更少，例如约1-10%，或约0.1-10%、或大于约0.1％但少于约10％，同时展示出GLP-1对GLP-1受体的活性的至少20％。例如，本文描述的示例性类似物具有天然胰高血糖素的活性的约0.5％、约1％或约7％，同时展示出GLP-1对GLP-1受体的活性的至少20％。具体而言，任何3类胰高血糖素相关肽，包括本文描述的胰高血糖素类似物、胰高血糖素激动剂类似物、胰高血糖素共激动剂、和胰高血糖素/GLP-1共激动剂分子，可以被修饰以包含位置3的修饰，例如Gln被Glu取代，以产生具有当相比于对胰高血糖素受体的选择性时对GLP-1受体的高选择性，例如10倍选择性的肽。
在另一实施方案中，任何3类胰高血糖素肽的位置3的天然存在的谷氨酰胺可以被谷氨酰胺类似物取代且对胰高血糖素受体的活性无实质上丧失，和在一些情况下，如本文所述具有增强的胰高血糖素受体活性。在特定实施方案中，位置3的氨基酸被Dab(Ac)取代。例如，胰高血糖素激动剂可以包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:595、SEQ ID NO:601 SEQ ID NO:603、SEQ ID NO:604、SEQ ID NO:605、和SEQ ID NO:606。
观察到在位置2的修饰（例如在位置2的AIB）和在一些情况下位置1的修饰可以降低胰高血糖素活性。胰高血糖素活性中的这种降低可以通过稳定胰高血糖素C末端部分中的α螺旋来恢复，例如通过本文所述的方法，例如通过位置“i”和“i+4”例如12和16、16和20、或20和24的氨基酸的侧链之间的共价键。在一些实施方案中，该共价键为位置16的谷氨酸和位置20的赖氨酸之间的内酰胺桥。在一些实施方案中，该共价键为除内酰胺桥以外的分子内桥。例如，合适的共价键合方法包括以下中任一种或多种：烯烃复分解反应、基于羊毛硫氨酸的环化、二硫键或修饰的含硫键形成、使用α、ω-二氨基烷系链、形成金属原子桥、和其他肽环化的方法。
影响GLP-1活性的修饰
对GLP-1受体增强的活性通过用电荷中性的基团诸如酰胺或酯替代C末端氨基酸的羧基来提供。在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NO: 20的序列，其中羧基末端氨基酸具有酰胺基替代天然氨基酸中发现的羧酸基团。这些3类胰高血糖素相关肽具有对胰高血糖素和GLP-1受体的强活性，并因此作为对两种受体的共激动剂。根据一些实施方案，3类胰高血糖素相关肽是胰高血糖素和GLP-1受体共激动剂，其中所述肽包含SEQ ID NO: 20的序列，其中位置28的氨基酸为Asn或Lys且位置29的氨基酸为Thr-酰胺。
对GLP-1受体的增加的活性通过稳定胰高血糖素的C末端部分（例如残基12－29周围）的α螺旋的修饰来提供。
在一些实施方案中，此类修饰允许在两个氨基酸的侧链之间形成分子内桥，所述两个氨基酸通过三个间插氨基酸(intervening amino acid)（即在位置“i”的氨基酸和在位置“i+4”的氨基酸，其中i为12-25之间的任何整数），通过两个间插氨基酸（即位置“j”的氨基酸和位置“j+3”的氨基酸，其中j为12-27的任何整数）、或通过六个间插氨基酸（即位置“k”的氨基酸和位置“k+7”的氨基酸，其中k为12-22的任何整数）分隔开。在示例性实施方案中，桥或接头长度为约8（或约7-9）个原子，且在位置12和16、或位置16和20、或位置20和24、或位置24和28的氨基酸的侧链之间形成。两个氨基酸侧链可以经非共价键，例如氢键键合、离子相互作用诸如形成盐桥，或通过共价键彼此连接。
根据一些实施方案，3类胰高血糖素相关肽展示出胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂活性，且包含选自SEQ ID NO: 11、47、48和49的氨基酸序列。在一些实施方案中，侧链彼此共价连接，和在一些实施方案中，两个氨基酸彼此连接形成内酰胺环。
根据一些实施方案，3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NO: 45，其中至少一个内酰胺环在选自氨基酸对12和16、16和20、20和24或24和28的氨基酸对的侧链之间形成。在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NO: 20的胰高血糖素肽，其中所述肽包含在氨基酸位置12和16或氨基酸位置16和20之间形成的分子内内酰胺桥。在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NO: 20的序列，其中分子内内酰胺桥在氨基酸位置12和16之间、氨基酸位置16和20之间、或氨基酸位置20和24之间形成，且位置29的氨基酸为赖氨酸，其中SEQ ID NO: 29的序列连接至SEQ ID NO: 20的C末端氨基酸。在进一步的实施方案中，位置28的氨基酸是天冬氨酸。
在一些特定实施方案中，3类胰高血糖素相关肽的C末端部分中的α螺旋结构的稳定通过形成分子内桥而非内酰胺桥来实现。例如，合适的共价键合方法包括以下中任一种或多种：烯烃复分解反应、基于羊毛硫氨酸的环化、二硫键或修饰的含硫键形成、使用α、ω-二氨基烷系链、形成金属原子桥，和其他肽环化的方法用于稳定α螺旋。
此外，对GLP-1受体的增强的活性可以通过稳定胰高血糖素肽的C末端部分（氨基酸12-29周围）中的α螺旋结构经在保持期望活性的位置处目的性引入一个或多个α,α-二取代氨基酸来实现。此类肽可以在本文考虑为缺失分子内桥的肽。在一些方面，稳定α螺旋以不引入分子内桥诸如盐桥或共价键的这种方式来完成。在一些实施方案中，胰高血糖素肽的位置16、17、18、19、20、21、24 或29的一个、两个、三个、四个或更多个被α,α-二取代氨基酸取代。例如，3类胰高血糖素相关肽的位置16被氨基异丁酸（AIB）的取代在不存在盐桥或内酰胺的情况下增强GLP-1活性。在一些实施方案中，位置16、20、21或24的一个、两个、三个或更多被AIB所取代。
对GLP-1受体的增强的活性可以通过在位置20的氨基酸修饰来实现。在一些实施方案中，位置20的谷氨酰胺被具有带电荷或具有氢键能力、且长度为至少约5（或约4-6）个原子的侧链的另一亲水氨基酸例如赖氨酸、瓜氨酸、精氨酸或鸟氨酸替代。
对GLP-1受体的增加的活性在包含SEQ ID NO: 26的C末端延伸的3类胰高血糖素相关肽中证实。在此类包含SEQ ID NO: 26的3类胰高血糖素相关肽中的GLP-1活性可以进一步通过修饰在位置18、28或29、或位置18和29的氨基酸来增加，如本文所述。
GLP-1效力中的进一步适度增加可以通过修饰位置10的氨基酸为Trp来实现。
增加GLP-1受体活性的修饰的组合可以提供比单独采用的任何此类修饰提供更高的GLP-1活性。例如，3类胰高血糖素相关肽可以包含位置16、位置20和C末端羧酸基团处的修饰，任选地具有位置16和20的氨基酸之间的共价键；可以包含位置16和C末端羧酸基团处的修饰；可以包含位置16和20的修饰，任选具有位置16和20的氨基酸之间的共价键；或可以包含位置20和C末端羧酸基团的修饰；任选地，条件为位置12的氨基酸不是Arg；或任选地，条件是位置9的氨基酸不是Glu。
影响溶解性的修饰
亲水部分的添加
3类胰高血糖素相关肽可以进一步修饰以改善肽在生理pH下在水溶液中的溶解性和稳定性，同时保留相对于天然胰高血糖素的高生物活性。如本文所述的亲水部分可以如本文进一步讨论地连接至3类胰高血糖素相关肽。
根据一些实施方案，预期在包含SEQ ID NO: 9 或SEQ ID NO: 10的3类胰高血糖素相关肽位置17、21和24引入亲水部分会改善高效力胰高血糖素类似物在具有生理pH的溶液中的溶解性和稳定性。引入此类基团可以增加作用的持续时间，例如通过在循环中延长的半衰期来测量。
在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽包含选自SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19的序列，其中所述3类胰高血糖素相关肽的位置16、17、21或24之一的氨基酸残基的侧链进一步包含聚乙二醇链，其具有选自范围约500至约40,000道尔顿的分子量。在一些实施方案中，聚乙二醇链具有选自范围约500至约5,000道尔顿的分子量。在另一个实施方案中，聚乙二醇链具有约10,000至约20,000道尔顿的分子量。在仍其他示例性实施方案中，聚乙二醇链具有约20,000至约40,000道尔顿的分子量。
合适的亲水部分包括本领域已知的任何水溶性聚合物，包括本文所述的亲水部分，PEG的均聚物或共聚物，和PEG的单甲基取代的聚合物（mPEG）。根据一些实施方案，亲水部分包含聚乙二醇（PEG）链。更具体而言，在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7的序列，其中PEG链共价连接至3类胰高血糖素相关肽的位置21和24存在的氨基酸的侧链，且3类胰高血糖素相关肽的羧基末端氨基酸具有羧酸基团。根据一些实施方案，聚乙二醇链具有选自范围约500至约10,000道尔顿的平均分子量。
根据一些实施方案，PEG化的3类胰高血糖素肽包含共价连接至3类胰高血糖素相关肽的两个或多个聚乙二醇链，其中胰高血糖素链的总分子量为约1,000至约5,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG化的胰高血糖素激动剂包含由SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 5的胰高血糖素激动剂类似物组成的肽，其中PEG链共价连接至位置21和位置24的氨基酸残基，且其中两个PEG链的组合的分子量为约1,000至约5,000道尔顿。
带电荷的C末端
包含SEQ ID NO: 20的3类胰高血糖素相关肽的溶解性可以进一步改善，例如通过向SEQ ID NO: 20的胰高血糖素肽的C末端部分（优选在C末端位置至位置27）引入一个、两个、三个或更多个带电荷的氨基酸。此类带电荷的氨基酸可以通过用带电荷的氨基酸取代天然氨基酸，例如在位置28或29，或可选地通过添加带电荷的氨基酸例如在位置27、28或29之后来引入。在示例性实施方案中，一个、两个、三个或所有带电荷的氨基酸均带负电荷。另外的修饰例如保守取代可以对3类胰高血糖素相关肽进行，所述修饰仍允许其保留胰高血糖素活性。在一些实施方案中，提供SEQ ID NO: 20的3类胰高血糖素相关肽的类似物，其中所述类似物与SEQ ID NO: 20的不同在于位置17-26处的1-2个氨基酸取代，且在一些实施方案中，类似物与SEQ ID NO: 20的肽不同在于位置20的氨基酸取代。
酰化/烷基化
根据一些实施方案，修饰胰高血糖素肽以包含酰基或烷基，例如C4至C30酰基或烷基。在一些方面中，酰基或烷基不是氨基酸上天然存在的。在特定方面中，酰基或烷基对于任何天然存在氨基酸是非天然的。酰化或烷基化可以增加循环中的半衰期和/或延迟作用的起始和/或延长作用的持续时间和/或改善对蛋白酶诸如DPP-IV的抗性。如果酰化后不实质上增强，则维持3类胰高血糖素相关肽对于胰高血糖素受体和GLP-1受体的活性。进一步，如果不实质上增强，则酰化的类似物的效力与未酰化的3类胰高血糖素相关肽的形式的效力是相当的。
在一些实施方案中，本发明提供经修饰以包含共价连接至胰高血糖素肽的位置10的氨基酸的酰基或烷基的3类胰高血糖素相关肽。胰高血糖素肽可以进一步包含3类胰高血糖素相关肽的位置10的氨基酸和酰基或烷基之间的间隔基。任何前述3类胰高血糖素相关肽可以包含两个酰基或两个烷基，或其组合。
在本发明的特定方面，酰化的3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NOs: 534-544和546-549的任何的氨基酸序列。
C末端截短
在一些实施方案中，本文描述的3类胰高血糖素相关肽通过截短或缺失胰高血糖素肽的C末端的一个或两个氨基酸（即位置29和/或28）而不影响对胰高血糖素和GLP-1受体的活性和/或效力来进一步修饰。在这方面，3类胰高血糖素相关肽可以包含天然胰高血糖素肽(SEQ ID NO: 1)的氨基酸1-27或1-28，任选具有本文描述的一个或多个修饰。
在一些实施方案中，截短的3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NO: 550 或SEQ ID NO: 551。在另一实施方案中，截短的胰高血糖素激动剂肽包含SEQ ID NO: 552 或SEQ ID NO: 553。
C末端延伸
根据一些实施方案，本文公开的3类胰高血糖素相关肽通过向胰高血糖素肽例如SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27 或SEQ ID NO: 28的羧基末端添加第二肽来修饰。在一些实施方案中，具有选自SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、和 SEQ ID NO: 69的序列的3类胰高血糖素相关肽经肽键共价连接至第二肽，其中所述第二肽包含选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27和SEQ ID NO: 28的序列。在进一步的实施方案中，在包含C末端延伸的3类胰高血糖素相关肽中，天然胰高血糖素肽的位置29的苏氨酸被甘氨酸替代。具有位置29的甘氨酸取代苏氨酸且包含SEQ ID NO: 26的羧基末端延伸的3类胰高血糖素相关肽为经修饰以包含SEQ ID NO: 26的羧基末端延伸的天然胰高血糖素对GLP-1受体的效力的4倍。对GLP-1受体的效力可以进一步通过在位置18的丙氨酸取代天然精氨酸来增强。
因此，3类胰高血糖素相关肽可以具有SEQ ID NO: 27 (KRNRNNIA) 或SEQ ID NO: 28的羧基末端延伸。根据一些实施方案，包含SEQ ID NO: 33 或SEQ ID NO: 20的3类胰高血糖素相关肽进一步包含连接至胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQ ID NO: 27 (KRNRNNIA) 或SEQ ID NO: 28的氨基酸序列。更具体而言，3类胰高血糖素相关肽包含选自SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15的序列，进一步包含连接至胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQ ID NO: 27 (KRNRNNIA) 或SEQ ID NO: 28的氨基酸序列。更具体而言，胰高血糖素肽包含选自SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 55和SEQ ID NO: 56的序列，进一步包含连接至3类胰高血糖素相关肽的氨基酸29的SEQ ID NO: 26 (GPSSGAPPPS) 或SEQ ID NO: 29的氨基酸序列。在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NO: 64的序列。
其他修饰
关于3类胰高血糖素相关肽的上文描述的任何修饰（其增加或降低胰高血糖素受体活性和其增加GLP-1受体活性）可以单独或组合应用。增加GLP-1受体活性的修饰的组合通常提供比单独采用的任何此类修饰提供更高的GLP-1活性。上文描述的任何修饰也可以与本文提及3类胰高血糖素相关肽描述的其他修饰（其赋予其他期望的特性，诸如增加的溶解性和/或稳定性和/或作用的持续时间）组合。可选地，上文描述的任何修饰可以与本文描述的关于3类胰高血糖素相关肽的其他修饰（其不实质上影响溶解性或稳定性或活性）组合。示例性的修饰包括但不限于：
（A）改善溶解性，例如通过引入一个、两个、三个或更多个带电荷的氨基酸至天然胰高血糖素的C末端部分，优选在C末端位置至位置27。此类带电荷的氨基酸可以通过用带电荷的氨基酸取代天然氨基酸，例如在位置28或29，或可选地通过添加带电荷的氨基酸例如在位置27、28或29之后来引入。在示例性实施方案中，一个、两个、三个或所有带电荷的氨基酸均带负电荷。在其他实施方案中，一个、两个、三个或所有带电荷的氨基酸均带正电荷。此类修饰增加溶解性，例如提供在约5.5至8的给定的pH例如pH7下（当在25℃下24小时后测量）相对于天然胰高血糖素的至少2倍、5倍、10倍、15倍、25倍、30倍或更高的溶解性。
（B）如本文所述通过添加亲水部分诸如聚乙二醇链例如在位置16、17、20、21、24或29、或在肽的C末端氨基酸来增加溶解性和作用的持续时间或在循环中的半衰期，
（C）通过修饰位置15的天冬氨酸，例如通过缺失或用谷氨酸、高谷氨酸、半胱磺酸或高半胱磺酸取代增加稳定性。此类修饰可以降低在范围5.5-8的pH下尤其在酸性或碱性缓冲液中的降解或切割，例如，在25℃下24小时后保留至少75%、80%、90%、95%、96%、97%、98% 或99%的原始肽。
（D）通过在位置27修饰甲硫氨酸例如通过用亮氨酸或正亮氨酸取代来增加稳定性。此类修饰可以降低氧化降解。稳定性还可以通过修饰位置20或24的Gln，例如通过用Ser、Thr、Ala或AIB取代来增加。此类修饰可以降低经Gln的脱酰胺作用发生的降解。稳定性可以通过修饰位置21的Asp，例如通过用Glu取代来增加。此类修饰可以降低通过脱水Asp以形成环状的琥珀酰亚胺中间体随后异构化为异天冬氨酸来发生的降解。
（E）通过用本文描述的DPP-IV抗性氨基酸修饰在位置1或2的氨基酸和包括用N-甲基-丙氨酸修饰位置2的氨基酸来增加对二肽基肽酶IV (DPP IV)切割的抗性。
（F）不实质上影响活性的保守或非保守取代、添加或缺失，例如，在位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28 或29中的一个或多个处的保守取代；缺失位置27、28或29中的一个或多个；或缺失氨基酸29任选组合有C末端酰胺或酯代替C末端羧酸基团；
（G）如本文所述的添加C末端延伸；
（H）增加循环中的半衰期和/或延长作用的持续时间和/或延迟作用的起始，例如，通过如本文所述的胰高血糖素肽的酰化或烷基化；
（I）如文所述的同二聚化或异二聚化。
其他修饰包括在位置1用大的芳香族氨基酸（例如Tyr、Phe、Trp或氨基-Phe）取代His；在位置2用Ala取代Ser；在位置10用Val或Phe取代Tyr；在位置12用Arg取代Lys；在位置15用Glu取代Asp；在位置16用Thr或AIB取代Ser。
含有在位置1用大的芳香族氨基酸（例如Tyr）非保守取代His的具有GLP-1活性的3类胰高血糖素相关肽可以保留GLP-1活性，条件是经分子内桥例如本文所述的那些中的任一种稳定α螺旋。
缀合物和融合体
3类胰高血糖素相关肽可以连接，任选经共价键合和任选经接头，至缀合物部分。
3类胰高血糖素相关肽还可以是融合肽或蛋白的部分，其中第二肽或多肽已融合至3类胰高血糖素相关肽的末端例如羧基末端。
更具体而言，融合3类胰高血糖素肽可以包含SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 9 或SEQ ID NO: 10的胰高血糖素激动剂，其进一步包含连接至胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQ ID NO: 26 (GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO: 27 (KRNRNNIA) 或SEQ ID NO: 28 (KRNR)的氨基酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO: 26 (GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO: 27 (KRNRNNIA) 或SEQ ID NO: 28 (KRNR)的氨基酸序列经肽键结合至3类胰高血糖素相关肽的氨基酸29。申请人已发现在包含毒蜥外泌肽-4 (例如SEQ ID NO: 26 或SEQ ID NO: 29)的C末端延伸肽的3类胰高血糖素相关肽融合肽中，位置29的天然苏氨酸残基被甘氨酸取代显著增加GLP-1受体活性。该氨基酸取代可以与其他本文公开的关于3类胰高血糖素相关肽的修饰一同使用来增强胰高血糖素类似物对GLP-1受体的亲和力。例如，T29G取代可以与S16E和N20K氨基酸取代组合，任选与氨基酸16和20之间的内酰胺桥，和任选与如本文所述的添加PEG链组合。在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NO: 64的序列。在一些实施方案中，胰高血糖素融合肽的3类胰高血糖素相关肽部分选自SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、和 SEQ ID NO: 5，其中PEG链当存在于位置17、21、24或C末端氨基酸、或21和24两者时，选自500至40,000道尔顿的范围。更具体而言， 在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽区段选自SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、和 SEQ ID NO: 63，其中PEG链选自500至5,000的范围。在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽是包含SEQ ID NO: 55和SEQ ID NO: 65的序列的融合肽，其中SEQ ID NO: 65的肽连接至SEQ ID NO: 55的羧基末端。
根据一些实施方案，SEQ ID NO: 10的3类胰高血糖素相关肽的额外的化学修饰给予增加的GLP-1受体效力至这样的点，在所述点对胰高血糖素和GLP-1受体的相对活性是实际上相同的。因此，在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽包含含有酰胺基替代存在于天然氨基酸中的羧酸基团的末端氨基酸。3类胰高血糖素相关肽对各个胰高血糖素和GLP-1受体的相对活性可以通过对3类胰高血糖素相关肽的进一步修饰以产生类似物来调节，所述类似物证明天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的约40％至约500％或更多的活性和天然GLP-1对GLP-1受体的约20％至约200％或更多的活性，例如相对于胰高血糖素对GLP-1受体的正常活性增加50倍、100倍或更多。在一些实施方案中，本文描述的胰高血糖素相关肽展示高至天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性的约100%、1000%、10,000%、100,000%、或1,000,000%。在一些实施方案中，本文描述的胰高血糖素相关肽展示高至天然GLP-1对GLP-1受体的活性的约100%、1000%、10,000%、100,000%、或1,000,000%。
示例性实施方案
根据一些实施方案，提供包含SEQ ID NO: 55的序列的胰高血糖素类似物，其中所述类似物与SEQ ID NO: 55不同在于选自位置1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28、和 29的1-3个氨基酸，其中所述胰高血糖素肽展示天然GLP-1对GLP-1受体的活性的至少20％。
根据一些实施方案，提供包含以下序列的胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂：
其中位置15的Xaa选自Asp、Glu、半胱磺酸、高谷氨酸和高半胱磺酸，位置16的Xaa选自Ser、Glu、Gln、高谷氨酸和高半胱磺酸，位置20的Xaa为Gln或Lys，位置24的Xaa为Gln或Glu，位置28的Xaa为Asn、Lys或酸性氨基酸，位置29的Xaa为Thr、Gly或酸性氨基酸，且R为COOH或CONH2，条件是当位置16为丝氨酸时，位置20为Lys，或者可选地当位置16为丝氨酸时，位置24为Glu且位置20或位置28为Lys。在一些实施方案中，胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂包含序列SEQ ID NO: 33，其中位置28的氨基酸为天冬氨酸且位置29的氨基酸为谷氨酸。在另一实施方案中，位置28的氨基酸为天然天冬酰胺，位置29的氨基酸为甘氨酸且SEQ ID NO: 29 或SEQ ID NO: 65的氨基酸序列共价连接至SEQ ID NO: 33的羧基末端。
在一些实施方案中，共激动剂包含序列SEQ ID NO: 33，其中添加额外的酸性氨基酸至肽的羧基末端。在进一步的实施方案中，胰高血糖素类似物的羧基末端氨基酸具有酰胺替代天然氨基酸的羧酸基团。在一些实施方案，胰高血糖素肽类似物包含选自SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43和SEQ ID NO: 44的序列。
根据一些实施方案，提供SEQ ID NO: 33的胰高血糖素肽类似物，其中所述类似物与SEQ ID NO: 33的不同在于选自位置1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21和27的1-3个氨基酸，条件是当位置16的氨基酸为丝氨酸时，位置20为赖氨酸，或在位置24的氨基酸和位置20或位置28的氨基酸之间形成内酰胺桥。根据一些实施方案，类似物不同于SEQ ID NO: 33在于选自位置1、2、3、21和27的1-3个氨基酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO: 33的胰高血糖素肽类似物与该序列的不同在于1-2个氨基酸，或者在一些实施方案中为单一氨基酸，其选自位置1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21和27，条件是当位置16的氨基酸为丝氨酸时，位置20为赖氨酸，或在位置24的氨基酸和位置20或位置28的氨基酸之间形成内酰胺桥。
根据另一实施方案，提供相对选择性的GLP-1受体激动剂，其包含序列
，其中位置3的Xaa选自GLu、Orn、或Nle，位置15的Xaa选自Asp、Glu、半胱磺酸、高谷氨酸和高半胱磺酸，位置16的Xaa选自Ser、Glu、Gln、高谷氨酸和高半胱磺酸，位置20的Xaa为Gln或Lys，位置24的Xaa为Gln或Glu，位置28的Xaa为Asn、Lys或酸性氨基酸，位置29的Xaa为Thr、Gly或酸性氨基酸，且R为COOH、CONH2、SEQ ID NO: 26 或SEQ ID NO: 29，条件是当位置16为丝氨酸时，位置20为Lys，或者可选地当位置16为丝氨酸时，位置24为Glu且位置20或位置28为Lys。在一些实施方案中，位置3的氨基酸是谷氨酸。在一些实施方案中，位置28和/或29取代的酸性氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施方案中，胰高血糖素肽（包括共激动剂肽）包含序列SEQ ID NO: 33，其进一步包含添加至肽的羧基末端的额外酸性氨基酸。在进一步的实施方案中，胰高血糖素类似物的羧基末端氨基酸具有酰胺替代天然氨基酸的羧酸基团。
根据一些实施方案，提供胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂，其包含选自以下的经修饰的胰高血糖素肽：
其中位置15的Xaa选自Asp、Glu、半胱磺酸、高谷氨酸和高半胱磺酸，位置16的Xaa选自Ser、Glu、Gln、高谷氨酸和高半胱磺酸，位置20的Xaa为Gln或Lys，位置24的Xaa为Gln或Glu，且位置28的Xaa为Asn、Asp 或Lys，R为COOH或CONH2，位置29的Xaa为Thr或Gly，且R为COOH、CONH2、SEQ ID NO: 26 或SEQ ID NO: 29，条件是当位置16为丝氨酸时，位置20为Lys，或者可选地当位置16为丝氨酸时，位置24为Glu且位置20或位置28为Lys。在一些实施方案中，R为CONH2，位置15的Xaa为Asp，位置16的Xaa选自氨基酸Glu、Gln、高谷氨酸和高半胱磺酸，位置20和24的Xaa各自为Gln，位置28的Xaa为Asn或Asp，且位置29的Xaa为Thr。在一些实施方案中，位置15和16的Xaa各自为Glu，位置20和24的Xaa各自为Gln，位置28的Xaa为Asn或Asp，位置29的Xaa为Thr且R为CONH2。
已报道天然胰高血糖素肽的某些位置可以被修饰同时保留亲本肽的至少一些活性。因此，申请人理解位于SEQ ID NO: 11的肽的位置2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28 或29的位置的一个或多个氨基酸可以被不同于天然胰高血糖素肽中存在的氨基酸所取代，且仍保留对胰高血糖素受体的活性。在一些实施方案中，天然肽的位置27存在的甲硫氨酸残基改变为亮氨酸或正亮氨酸以防止肽的氧化降解。在另一个实施方案中，位置20的氨基酸被Lys、Arg、Orn或瓜氨酸所取代和/或位置21被Glu、高谷氨酸或高半胱磺酸取代。
在一些实施方案中，提供SEQ ID NO: 20的胰高血糖素类似物，其中选自类似物的位置1、2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、27、28 或29的1-6个氨基酸与SEQ ID NO: 1的对应氨基酸不同，条件是当位置16的氨基酸为丝氨酸时，位置20为Lys，或可选地当位置16为丝氨酸时，位置24为Glu且位置20或位置28为Lys。根据另一实施方案，提供SEQ ID NO: 20的胰高血糖素类似物，其中选自类似物的位置1、2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、20、21、27、28 或29的1-3个氨基酸不同于SEQ ID NO: 1的对应氨基酸。在另一个实施方案中，提供SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 11的胰高血糖素类似物，其中选自类似物的位置1、2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、20 或21的1-2个氨基酸不同于SEQ ID NO: 1的对应氨基酸，且在进一步的实施方案中，一至两个不同的氨基酸代表相对于天然胰高血糖素序列(SEQ ID NO: 1)中存在的氨基酸的保守氨基酸取代。在一些实施方案中，提供SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14 或SEQ ID NO: 15的胰高血糖素肽，其中胰高血糖素肽进一步包含选自位置2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、20、21、27 或29的位置处一个、两个或三个氨基酸取代。在一些实施方案中，在位置2、5、7、10、11、13、14、16、17、18、19、20、21、27 或29的取代是保守氨基酸取代。
根据一些实施方案，提供包含SEQ ID NO 33的序列的变体的胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂，其中分别选自变体的位置16、17、18、20、21、23、24、27、28和29的1-10个氨基酸与的SEQ ID NO: 1对应氨基酸不同。根据一些实施方案，提供SEQ ID NO: 33的序列的变体，其中所述变体与SEQ ID NO: 33不同在于选自Gln17、Ala18、Glu21、Ile23、Ala24、Val27和Gly29的一个或多个氨基酸取代。根据一些实施方案，提供包含SEQ ID NO 33的序列的变体的胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂，其中选自变体的位置17-26的1-2个氨基酸与的SEQ ID NO: 1对应氨基酸不同。根据一些实施方案，提供SEQ ID NO: 33的序列的变体，其中所述变体与SEQ ID NO: 33不同在于选自Gln17、Ala18、Glu21、Ile23和Ala24的氨基酸取代。根据一些实施方案，提供SEQ ID NO: 33的序列的变体，其中所述变体与SEQ ID NO: 33不同在于位置18的氨基酸取代，其中所述取代的氨基酸选自Ala、Ser、Thr、和 Gly。根据一些实施方案，提供SEQ ID NO: 33的序列的变体，其中所述变体与SEQ ID NO: 33不同在于位置18的Ala的氨基酸取代。此类变化由SEQ ID NO: 55所包括。在另一实施方案中，提供包含SEQ ID NO 33的序列的变体的胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂，其中选自变体的位置17-22的1-2个氨基酸与的SEQ ID NO: 1对应氨基酸不同，在进一步的实施方案中，提供SEQ ID NO: 33的变体，其中所述变体与SEQ ID NO: 33的不同在于位置20或21的1或2个氨基酸取代。根据一些实施方案，提供包含以下序列的胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂：
51)，其中
位置15的Xaa为Asp、Glu、半胱磺酸、高谷氨酸或高半胱磺酸，
位置16的Xaa为Ser、Glu、Gln、高谷氨酸或高半胱磺酸，
位置20的Xaa为Gln、Lys、Arg、Orn或瓜氨酸，位置21的Xaa为Asp、Glu、高谷氨酸或高半胱磺酸，位置24的Xaa为Gln或Glu，位置28的Xaa为Asn、Lys或酸性氨基酸，位置29的Xaa为Thr或酸性氨基酸，且R为COOH或CONH2。在一些实施方案中，R为CONH2。根据一些实施方案，提供包含SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48 或SEQ ID NO: 49的变体的胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂，其中所述变体与所述序列的不同在于位置20的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代选自位置20的Lys、Arg、Orn或瓜氨酸。
在一些实施方案中，提供包含SEQ ID NO: 34的类似物肽的胰高血糖素激动剂，其中所述类似物与SEQ ID NO: 34不同在于在位置2具有不是丝氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，丝氨酸残基被氨基异丁酸、D-丙氨酸取代，且在一些实施方案中，丝氨酸残基被氨基异丁酸取代。此类修饰抑制由二肽基肽酶IV的切割，同时保留亲本化合物的内在效力（例如，至少75、80、85、90、95%或更高的亲本化合物的效力）。在一些实施方案中，增加类似物的溶解性，例如通过引入一个、两个、三个或更多个带电荷的氨基酸至天然胰高血糖素的C末端部分，优选在C末端位置至位置27。在示例性实施方案中，一个、两个、三个或所有带电荷的氨基酸均带负电荷。在另一实施方案中，类似物进一步包含位置28或29处酸性氨基酸取代天然氨基酸，或者添加至SEQ ID NO: 34的肽的羧基末端的酸性氨基酸。
在一些实施方案中，本文公开的胰高血糖素类似物在位置1或2进一步修饰以减少对二肽基肽酶IV切割的易感性。在一些实施方案中，提供SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14 或SEQ ID NO: 15的胰高血糖素类似物，其中所述类似物与亲本分子的不同在于位置2的取代，且展示出对由二肽基肽酶IV的切割降低的易感性（即抗性）。更具体而言，在一些实施方案中，类似物肽的位置2被选自以下的氨基酸取代：D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、氨基正丁酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸和氨基异丁酸。在一些实施方案中，类似物肽的位置2被选自以下的氨基酸取代：D-丝氨酸、D-丙氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸和氨基异丁酸。在另一实施方案中，类似物肽的位置2被选自以下的氨基酸取代：D-丝氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸和氨基异丁酸。在一些实施方案中，位置2的氨基酸不是D-丝氨酸。在一些实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO: 21 或SEQ ID NO: 22的序列。
在一些实施方案中，提供SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14 或SEQ ID NO: 15的胰高血糖素类似物，其中所述类似物与亲本分子的不同在于位置1的取代，且展示出对由二肽基肽酶IV的切割降低的易感性（即抗性）。更具体而言，类似物肽的位置1被选自以下的氨基酸取代：D-组氨酸、α,α-二甲基咪唑(imidiazole)乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸和高组氨酸。在另一实施方案中，提供包含SEQ ID NO: 34的类似物肽的胰高血糖素激动剂，其中所述类似物与SEQ ID NO: 34不同在于在位置1具有不是组氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，增加类似物的溶解性，例如通过引入一个、两个、三个或更多个带电荷的氨基酸至天然胰高血糖素的C末端部分，优选在C末端位置至位置27。在示例性实施方案中，一个、两个、三个或所有带电荷的氨基酸均带负电荷。在另一实施方案中，类似物进一步包含位置28或29处酸性氨基酸取代天然氨基酸，或者添加至SEQ ID NO: 34的肽的羧基末端的酸性氨基酸。在一些实施方案中，酸性氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。
在一些实施方案中，胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂包含序列SEQ ID NO: 20，其进一步包含一个氨基酸或选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27和SEQ ID NO: 28的肽的额外羧基末端延伸。在其中将单一氨基酸添加至SEQ ID NO: 20的羧基末端的实施方案中，氨基酸通常选自20种普通氨基酸之一，且在一些实施方案中，额外羧基末端氨基酸具有酰胺基团替代天然氨基酸的羧酸。在一些实施方案中，额外氨基酸选自谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸。
在可选的实施方案中，提供胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂，其中所述肽包含在谷氨酸残基和赖氨酸残基的侧链之间形成的至少一个内酰胺环，其中谷氨酸残基和赖氨酸残基被三个氨基酸分隔。在一些实施方案中，携带内酰胺的胰高血糖素肽的羧基末端氨基酸具有酰胺基替代天然氨基酸的羧酸。更具体而言，在一些实施方案中，提供胰高血糖素和GLP-1共激动剂，其包含选自以下的经修饰的胰高血糖素肽：
其中位置28的Xaa＝Asp或Asn，位置29的Xaa为Thr或Gly，R选自COOH、CONH2、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27和SEQ ID NO: 28，且在以下位置形成内酰胺环：SEQ ID NO: 66的位置12的Lys和位置16的Glu之间，SEQ ID NO: 67的位置16的Glu和位置20的Lys之间，SEQ ID NO: 68的位置20的Lys和位置24的Glu之间，SEQ ID NO: 69的位置24的Glu和位置28的Lys之间，SEQ ID NO: 16的位置12的Lys和位置16的Glu之间以及位置20的Lys和位置24的Glu之间，SEQ ID NO: 17的位置12的Lys和位置16的Glu之间以及位置24的Glu和位置28的Lys之间，和SEQ ID NO: 18的位置16的Glu和位置20的Lys之间以及位置24的Glu和位置28的Lys之间。在一些实施方案中，R选自COOH、CONH2、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸，位置28的氨基酸为Asn，且位置29的氨基酸为苏氨酸。在一些实施方案中，R为CONH2，位置28的氨基酸为Asn，且位置29的氨基酸为苏氨酸。在另一实施方案中，R1选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 65且位置29的氨基酸为甘氨酸。
在进一步的实施方案中，胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂选自SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18，其中所述肽进一步包含一个氨基酸或选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27和SEQ ID NO: 28的肽的额外的羧基末端延伸。在一些实施方案中，末端延伸包含SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 29 或SEQ ID NO: 65的序列，且胰高血糖素肽包含SEQ ID NO: 55的序列。在一些实施方案中，胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂包含序列SEQ ID NO:33，其中位置16的氨基酸为谷氨酸，位置20的氨基酸为赖氨酸，位置28的氨基酸为天冬酰胺，且SEQ ID No: 26 或SEQ ID NO: 29的氨基酸序列连接至SEQ ID NO: 33的羧基末端。
在其中将单一氨基酸添加至SEQ ID NO: 20的羧基末端的实施方案中，氨基酸通常选自20种普通氨基酸之一，且在一些实施方案中，氨基酸具有酰胺基团替代天然氨基酸的羧酸。在一些实施方案中，额外氨基酸选自谷氨酸和天冬氨酸和甘氨酸。在实施方案中，其中胰高血糖素激动剂肽进一步包含羧基末端延伸，所述延伸的羧基末端氨基酸在一些实施方案中终止于酰胺基或酯基而非羧酸。
在另一实施方案中，胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂包含序列：
其中位置30的Xaa代表任何氨基酸。在一些实施方案中，Xaa选自20种普通氨基酸之一，且在一些实施方案中，氨基酸为谷氨酸、天冬氨酸或甘氨酸。该肽的溶解性可以通过共价连接PEG链至SEQ ID NO: 19的位置17、21、24 或30的氨基酸的侧链来进一步改善。在进一步的实施方案中，肽包含选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27和SEQ ID NO: 28的肽的额外羧基末端延伸。根据一些实施方案，胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂包含SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31和SEQ ID NO: 32的序列。
对SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 64的胰高血糖素序列内部的额外位点特异性修饰可以进行，以产生具有不同程度的GLP-1激动的一组胰高血糖素激动剂。因此，具有对每一受体实际上相同的体外效力的肽已经制备和表征。类似地，对两种受体每一种具有10倍选择性增强效力的肽已经鉴定和表征。如上文所述，位置16的丝氨酸残基被谷氨酸取代增强了天然胰高血糖素对胰高血糖素和GLP-1受体两者的效力，但维持对胰高血糖素受体大约10倍的选择性。此外，位置3的天然谷氨酰胺被谷氨酸取代(SEQ ID NO: 22)产生了展示出对GLP-1受体大约10倍选择性的胰高血糖素类似物。
通过在肽的位置16、17、21和24引入亲水基团、或通过在胰高血糖素/GLP-1共激动剂肽的羧基末端添加单一修饰的氨基酸（即，经修饰以包含亲水基团的氨基酸），胰高血糖素/GLP-1共激动剂肽在生理pH下在水溶液中的溶解性可以进一步增强，同时保留相对于天然胰高血糖素的高生物活性。根据一些实施方案，亲水部分包含聚乙二醇（PEG）链。更具体而言，在一些实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17 或SEQ ID NO: 18的序列，其中PEG链共价连接至胰高血糖素肽的位置16、17、21、24、29的氨基酸或C末端氨基酸的侧链，条件是当肽包含SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12 或SEQ ID NO: 13时，聚乙二醇链共价连接至位置17、21或24的氨基酸残基，当肽包含SEQ ID NO: 14 或SEQ ID NO: 15时，聚乙二醇链共价连接至位置16、17或21的氨基酸残基，和当肽包含SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17 或SEQ ID NO: 18时，聚乙二醇链共价连接至位置17或21的氨基酸残基。
在一些实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12 或SEQ ID NO: 13的序列，其中PEG链共价连接至胰高血糖素肽的位置17、21、24的氨基酸或C末端氨基酸的侧链，且肽的羧基末端氨基酸具有酰胺基团替代天然氨基酸的羧酸基团。在一些实施方案中，胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂肽包含选自SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19的序列，其中PEG链共价连接至胰高血糖素肽的SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 19的位置17、21或24，或SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15的位置16、17或21、或SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18的位置17或21的氨基酸的侧链。在另一实施方案中，胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂肽包含SEQ ID NO: 11 或SEQ ID NO: 19的序列，其中PEG链共价连接至胰高血糖素肽的位置17、21或24的氨基酸或C末端氨基酸的侧链。
根据一些实施方案和按照前面段落中所述的条件限制，修饰胰高血糖素共激动剂肽以包含在位置16、17、21、24或29或C末端氨基酸的一个或多个氨基酸取代，其中天然氨基酸被具有适合于与亲水部分（包括例如PEG）交联的侧链的氨基酸所取代。天然肽可以被天然存在的氨基酸或合成的（非天然存在的）氨基酸所取代。合成的或非天然存在的氨基酸指这样的氨基酸，其在体内不天然存在，但尽管如此，其可以引入到本文描述的肽结构中。可选地，具有适合于与亲水部分（包括例如PEG）交联的侧链的氨基酸可以添加至本文所公开的胰高血糖素类似物的任一种的羧基末端。根据一些实施方案，氨基酸取代在胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂内在选自16、17、21、24、或29的位置进行，用选自赖氨酸、半胱氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸和乙酰苯丙氨酸的氨基酸替代天然氨基酸，其中取代氨基酸进一步包含共价连接至氨基酸的侧链的PEG链。在一些实施方案中，选自SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、和 SEQ ID NO: 19的胰高血糖素肽进一步修饰以包含共价连接至胰高血糖素肽的位置17或21的氨基酸的侧链的PEG链。在一些实施方案中，PEG化的胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂进一步包含SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27 或SEQ ID NO: 29的序列。
在另一实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO: 55 或SEQ ID NO: 56的序列，进一步包含连接至SEQ ID NO: 55 或SEQ ID NO: 56的C末端氨基酸的SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 29 或SEQ ID NO: 65的C末端延伸，和任选地，进一步包含共价连接至肽的位置17、18、21、24或29的氨基酸或C末端氨基酸的侧链的PEG链。在另一实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO: 55 或SEQ ID NO: 56的序列，其中PEG链共价连接至胰高血糖素肽的位置21或24的氨基酸的侧链，且所述肽进一步包含SEQ ID NO: 26、或SEQ ID NO: 29的C末端延伸。
在另一实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO: 55、或SEQ ID NO: 33 或SEQ ID NO: 34的序列，其中额外氨基酸添加至SEQ ID NO: 33 或SEQ ID NO: 34的羧基末端，且PEG链共价连接至添加的氨基酸的侧链。在进一步的实施方案中，PEG化的胰高血糖素类似物进一步包含连接至SEQ ID NO: 33 或SEQ ID NO: 34的C末端氨基酸的SEQ ID NO: 26 或SEQ ID NO: 29的C末端延伸。在另一实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO: 19的序列，其中PEG链共价连接至胰高血糖素肽的位置30的氨基酸的侧链，且所述肽进一步包含连接至SEQ ID NO: 19的C末端氨基酸的SEQ ID NO: 26 或SEQ ID NO: 29的C末端延伸。
聚乙二醇链可以以直链形式或者其可以是支链的。根据一些实施方案，聚乙二醇链具有选自范围约500至约10,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，聚乙二醇链具有选自范围约1,000至约5,000道尔顿的平均分子量。在可选的实施方案中，聚乙二醇链具有选自范围约10,000至约20,000道尔顿的平均分子量。根据一些实施方案，PEG化的胰高血糖素肽包含共价连接至胰高血糖素肽的两个或多个聚乙二醇链，其中胰高血糖素链的总分子量为约1,000至约5,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG化的胰高血糖素激动剂包含由SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 5的胰高血糖素激动剂类似物组成的肽，其中PEG链共价连接至位置21和位置24的氨基酸残基，且其中两个PEG链的组合的分子量为约1,000至约5,000道尔顿。
在某些实施方案中，胰高血糖素肽包含具有高至10个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，且包含位置10的酰化或烷基化的氨基酸。在一些实施方案中，位置10的氨基酸用C4至C30脂肪酸酰化或烷基化。在某些方面中，位置10的氨基酸包含对于天然存在的氨基酸是非天然的酰基或烷基。
在某些实施方案中，在位置10包含酰化或烷基化的氨基酸的胰高血糖素肽包含稳定的α螺旋。因此，在某些方面，胰高血糖素肽包含如本文所述的酰基或烷基和分子内桥，例如位置i的氨基酸和位置i+4的氨基酸的侧链之间的分子内桥（例如内酰胺桥），其中i为12、16、20或24。可选地或另外地，胰高血糖素肽包含如本文所述的酰基或烷基，且胰高血糖素肽的位置16、20、21和/或24的一个、两个、三个或更多个被α,α-二取代氨基酸例如AIB取代。在一些情况中，非天然胰高血糖素肽包含位置16的Glu和位置20的Lys，其中任选地内酰胺桥连接Glu和Lys，且任选地所述胰高血糖素肽进一步包含选自以下的一个或多个修饰：位置17的Gln、位置18的Ala、位置21的Glu、位置23的Ile、和位置24的Ala。
而且，在任何实施方案中，其中胰高血糖素肽包含位置10的酰化或烷基化的氨基酸，所述胰高血糖素肽进一步包含C末端酰胺替代C末端α羧基。
在一些实施方案中，包含如本文所述的酰基或烷基的胰高血糖素肽进一步包含位置1、位置2或位置1和2的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代实现DPP-IV蛋白酶抗性。例如，位置1的His可以被选自以下的氨基酸取代：D-组氨酸、α,α-二甲基咪唑乙酸（DMIA）、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟组氨酸、乙酰组氨酸和高组氨酸。可选地或另外地，位置2的Ser可以被选自以下的氨基酸取代：D-丝氨酸、丙氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸、和氨基异丁酸。在一些实施方案中，位置2的氨基酸不是D-丝氨酸。
包含如本文所述的位置10的酰化或烷基化的氨基酸的胰高血糖素肽可以包含与SEQ ID NO: 1实质上相关的任何氨基酸序列。例如，胰高血糖素肽包含具有高至10个（例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个修饰）氨基酸修饰的SEQ ID NO: 1。在某些实施方案中，酰化或烷基化胰高血糖素肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1大于25％相同(例如，与SEQ ID NO: 1大于30%、35%、40%、50%、60%、70% 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或接近100%相同)。在某些特定实施方案中，胰高血糖素肽是包含具有如本文所述的位置10的酰化或烷基化的氨基酸的SEQ ID NOs: 55的肽。胰高血糖素肽可以是在2-4、9-18、20、23-25、33、40-44、53、56、61、62、64、66-514、和 534具有1或2个氨基酸修饰的SEQ ID NOs: 55、55的任一种。
这些实施方案的酰基或烷基可以是本文所述的任何酰基或烷基。例如，酰基可以为C4-C30（例如C8-C24）脂酰基且烷基可以为C4-C30（例如C8-C24）烷基。
酰基或烷基连接的氨基酸可以为本文所述的任何氨基酸，例如式I（例如Lys）、式II和式III的任何的氨基酸。
在一些实施方案中，酰基或烷基直接连接至位置10的氨基酸。在一些实施方案中，酰基或烷基经间隔基连接至位置10的氨基酸，所述间隔基例如长度为3-10个原子的间隔基，例如氨基酸或二肽。用于连接酰基或烷基目的的合适间隔基描述于本文。
根据一些实施方案，3类胰高血糖素相关肽可以为如本文所述的任何前述3类胰高血糖素相关肽的类似物，所述类似物展示对GIP受体的激动剂活性。类似物对胰高血糖素受体、GLP-1受体和GIP受体的活性水平、对这些受体的效力、和对这些受体每一种的选择性可以依照本文所述的2类胰高血糖素相关肽的教导。参见，2类胰高血糖素相关肽部分标题为“活性”的子部分下的教导。
在本发明的一些实施方案中，提供胰高血糖素肽的类似物，所述类似物展示对GIP受体的激动剂活性。在某些实施方案中，类似物包含具有至少一个氨基酸修饰（任选地，高至15个氨基酸修饰）和类似物的C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸的延伸的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。
在某些方面中，类似物包含至少一个氨基酸修饰和高至15个氨基酸修饰（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个氨基酸修饰，高至10个氨基酸修饰）。在某些实施方案中，类似物包含至少一个氨基酸修饰高至10个氨基酸修饰和额外的保守的氨基酸修饰。保守氨基酸修饰描述于本文。
在一些方面中，氨基酸修饰的至少一个赋予类似物的C末端部分中的稳定的α螺旋结构。实现稳定的α螺旋结构的修饰本文描述。参见例如在标题为α螺旋/分子内桥的稳定的部分下的教导。在一些方面中，类似物包含在类似物的两个氨基酸的侧链之间的分子内桥（例如共价分子内桥、非共价分子内桥）。在某些方面中，分子内桥连接在位置i和i+4的氨基酸的侧链，其中i为12、13、16、17、20、或24。在其他方面，分子内桥连接在位置j和j+3的氨基酸的侧链，其中j为17，或在位置k和k+7的氨基酸的侧链，其中k为12-22之间的任何整数。在某些实施方案中，分子内桥为共价分子内桥，例如内酰胺桥。在特定方面中，内酰胺桥连接位置16和20的氨基酸的侧链。在具体的方面中，位置16和20处的氨基酸之一为带正电荷的氨基酸且另一个为带负电荷的氨基酸。例如，类似物可以包含连接位置16的Glu和位置20的Lys的侧链的内酰胺桥。在其他方面，带负电荷的氨基酸和带正电荷的氨基酸形成盐桥。在这种情况下中，分子内桥是非共价的分子内桥。
在特定方面中，赋予稳定的α螺旋的氨基酸修饰为SEQ ID NO: 1的氨基酸被α,α-二取代氨基酸插入或取代。用于稳定α螺旋的目的的合适的α,α-二取代氨基酸描述于本文且包括例如AIB。在一些方面，SEQ ID NO: 1的位置16、20、21和24的一个、两个、三个或全部氨基酸被α,α-二取代氨基酸例如AIB所取代。在特定实施方案中，位置16的氨基酸是AIB。
展示对GIP受体的激动剂活性的类似物可以包含额外的修饰，诸如本文描述的任何那些。例如，氨基酸修饰可以增加或降低对GLP-1受体和胰高血糖素受体的一者或两者的活性。氨基酸修饰可以增加肽的稳定性，例如增加对DPP-IV蛋白酶降解的抗性，稳定氨基酸15和16之间的键。氨基酸修饰可以增加肽的溶解性和/或改变类似物对GIP、胰高血糖素和GLP-1受体的任一者的作用时间。这些类型修饰的任何的组合可以存在于展示对GIP受体的激动剂活性的类似物中。
因此，在一些方面，类似物包含具有以下中的一个或多个的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列：位置17的Gln、位置18的Ala、位置21的Glu、位置23的Ile、和位置24的Ala或Cys、或其保守氨基酸取代。在一些方面，类似物包含C末端酰胺替代C末端α羧基。在某些实施方案中，类似物包含在位置1、位置2、或位置1和2的氨基酸取代，所述取代实现DPP-IV蛋白酶抗性。合适的氨基酸取代描述于本文。例如，在位置1的DMIA和/或在位置2的d-Ser或AIB。在一些实施方案中，位置2的氨基酸不是D-丝氨酸。
另外或可选地，类似物可以包含以下之一或其组合：（a）位置2的Ser被Ala取代；（b）位置3的Gln被Glu或谷氨酰胺类似物取代；（c）位置7的Thr被Ile取代；（d）位置10的Tyr被Trp或包含对于天然存在的氨基酸为非天然的酰基或烷基的氨基酸取代；（e）位置12的Lys被Ile取代；（f）位置15的Asp被Glu取代；（g）位置16的Ser被Glu取代；（h）位置20的Gln被Ser、Thr、Ala、AIB取代；（i）位置24的Gln被Ser、Thr、Ala、AIB取代；（j）位置27的Met被Leu或Nle取代；（k）位置29的Asn被带电荷的氨基酸任选为Asp或Glu取代；和（l）位置29的Thr被Gly或带电荷的氨基酸任选Asp或Glu取代。
在某些方面，类似物不包含在位置1的赋予GIP激动剂活性的氨基酸修饰。在一些实施方案中，位置1的氨基酸不是大的芳香族氨基酸例如Tyr。在一些实施方案中，位置1的氨基酸为包含咪唑环的氨基酸例如His或His的类似物。在某些实施方案中，类似物不是任何美国专利申请号61/151,349中公开的化合物。在某些方面，类似物包含SEQ ID NOs: 657-669的任何的氨基酸序列。
关于展示对GIP受体的激动剂活性的类似物，所述类似物包含1-21个氨基酸（例如5-19、7-15、9-12个氨基酸）的延伸。类似物的延伸可以包含任何氨基酸序列，只要延伸为1-21个氨基酸序列。在一些方面中，延伸为7-15个氨基酸且在其他方面中，延伸为9-12个氨基酸。在一些实施方案中，延伸包含（i）SEQ ID NO: 26或674的氨基酸序列，（ii）与SEQ ID NO: 26或674的氨基酸序列具有高序列同一性（例如至少80%、85%、90%、95%、98%、99%）的氨基酸序列，或（iii）具有一个或多个保守氨基酸修饰的（i）或（ii）的氨基酸序列。
在一些实施方案中，延伸的至少一个氨基酸为酰化的或烷基化的。包含酰基或烷基的氨基酸可以位于类似物的延伸的任何位置。在某些实施方案中，延伸的酰化或烷基化的氨基酸位于类似物的位置37、38、39、40、41、或42 (根据SEQ ID NO: 1的编号)之一。在某些实施方案中，酰化或烷基化的氨基酸位于类似物的位置40。
在示例性实施方案中，酰基或烷基为对于天然存在的氨基酸是非天然的酰基或烷基。例如，酰基或烷基可以为C4-C30（例如C12-C18）脂酰基或C4-C30（例如C12-C18）烷基。酰基或烷基可以为本文所讨论的那些的任一种。
在一些实施方案中，酰基或烷基直接连接至氨基酸，例如经氨基酸的侧链。在其他实施方案中，酰基或烷基经接头（例如，氨基酸、二肽、三肽、亲水性双功能间隔基、疏水性双功能间隔基）连接至氨基酸。在某些方面中，间隔基长度为3-10个原子。在一些实施方案中，氨基酸间隔基不是γ-Glu。在一些实施方案中，二肽间隔基不是γ-Glu-γ-Glu。
而且，在示例性实施方案中，酰基或烷基与其连接的氨基酸可以是本文描述的那些的任一种，包括例如式I、II或III的氨基酸。酰化或烷基化的氨基酸可以是Lys，例如。包含酰基或烷基的合适的氨基酸以及合适的酰基和烷基描述于本文。参见例如在标题为酰化和烷基化的部分下的教导。
在其他实施方案中，延伸的1-6个氨基酸（例如1-2、1-3、1-4、1-5个氨基酸）为带正电荷的氨基酸，例如式IV的氨基酸，诸如Lys。如本文所用，术语“带正电荷的氨基酸”指任何氨基酸（天然存在的或非天然存在的氨基酸），其包含在生理pH下在其侧链的原子上的正电荷。在某些方面，带正电荷的氨基酸位于位置37、38、39、40、41、42、和 43的任一者。在特定的实施方案中，带正电荷的氨基酸位于位置40。
在其他情况下，延伸如本文所述酰化或烷基化，且包含如本文所述的1-6个带正电荷的氨基酸。
在仍其他实施方案中，展示对GIP受体的激动剂活性的类似物包含（i）具有至少一个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 1，（ii）类似物的C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸（例如5-18、7-15、9-12个氨基酸）的延伸，和（iii）包含对于天然存在的氨基酸为非天然的酰基或烷基的位于C末端延伸的外面（例如位于位置1-29的任一者）的氨基酸。在一些实施方案中，类似物包含位置10的酰化或烷基化的氨基酸。在具体实施方案中，酰基或烷基为C4-C30脂酰基或C4-C30烷基。在一些实施方案中，酰基或烷基经接头（例如，氨基酸、二肽、三肽、亲水性双功能间隔基、疏水性双功能间隔基）连接。在某些实施方案中，类似物包含稳定α螺旋的氨基酸修饰，诸如位置16的Glu和位置20的Lys之间的盐桥，或在位置16、20、21和24中的任一个、两个、三个或多个处的α,α-二取代氨基酸。在特定方面中，类似物额外包含赋予DPP-IV蛋白酶抗性的例如在位置1的DMIA、在位置2的AIB的氨基酸修饰。包含进一步氨基酸修饰的类似物在本文中进行考虑。
在某些实施方案中，具有GIP受体活性的类似物展示出天然GIP对GIP受体的活性的至少0.1% (例如至少 0.5%、1%、2%、5%、10%、15%、或20%)。在一些实施方案中，类似物展示天然GIP对GIP受体的活性的多于20％（例如多于50%、多于75%、多于100%、多于200%、多于300%、多于500%）。在一些实施方案中，类似物展示对GLP-1和胰高血糖素受体的一者或两者的可估计的激动剂活性。在一些方面中，对于这些受体（GIP受体和GLP-1受体和/或胰高血糖素受体）的选择性在1000倍内。例如，具有GIP受体活性的类似物对GLP-1受体的选择性可以为对于GIP受体和/或胰高血糖素受体的选择性的少于500倍、100倍，在50倍内、在25倍内、在15倍内、在10倍内。
在特定的实施方案，类似物包含SEQ ID NOs: 657-669的任何的结构。
根据一些实施方案，3类胰高血糖素相关肽包含含有以下修饰的天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的氨基酸序列：位置2的AIB、位置3的Glu、位置10的Lys、位置16的Glu、位置17的Gln、位置18的Ala、位置20的Lys、位置21的Glu、位置23的Ile、位置24的Ala；其中位置10的Lys用C14或C16脂肪酸酰化，且其中C末端羧基被酰胺替换。在特定实施方案中，该3类胰高血糖素相关肽经其N末端氨基酸连接至二肽D-Lys-肌氨酸。
根据一些实施方案，3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NOs: 70-514、517-534、或554的任一者的氨基酸（任选具有高至1、2、3、4或5个保留GLP-1激动剂和/或胰高血糖素激动剂活性的进一步修饰），基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NOs: 562-684、和 1701-1776的任何的氨基酸。在一些实施方案中，3类胰高血糖素相关肽包含SEQ ID NOs: 1801-1908的任何的氨基酸序列。
4类胰高血糖素相关肽
在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽为4类胰高血糖素相关肽（参见例如国际（PCT）专利申请号PCT/US2008/080973，其通过引用整体并入）。
以下部分(SEQ ID NOs: 1301-1371)中提及的所有生物序列对应于国际专利申请号PCT/US2008/080973中的SEQ ID NOs: 1-71。
活性
根据一些实施方案，提供4类胰高血糖素相关肽（以下称为“4类肽”）。在某些方面中，提供具有胰高血糖素拮抗剂活性的4类肽。胰高血糖素拮抗剂将在其中期望抑制胰高血糖素激动的任何情形中使用。最直接和明显的用途将在治疗糖尿病中，其中胰高血糖素拮抗剂已证实在高血糖症的临床前模型中产生血糖降低。胰高血糖素拮抗剂可以进一步修饰以改善化合物的生物物理稳定性和/或水溶解性，同时维持亲本化合物的拮抗剂活性。在某些方面中，4类肽定义为纯的胰高血糖素拮抗剂。
术语“胰高血糖素拮抗剂”指抵抗胰高血糖素活性或阻止胰高血糖素功能的化合物。例如，胰高血糖素拮抗剂展示出由胰高血糖素对胰高血糖素受体实现的最大应答的至少60％抑制（例如至少70％抑制），且优选地，至少80％抑制。在一些实施方案中，胰高血糖素拮抗剂展示由胰高血糖素对胰高血糖素受体实现的最大应答的至少90％抑制。在特定实施方案中，胰高血糖素拮抗剂展示由胰高血糖素对胰高血糖素受体实现的最大应答的100%抑制。另外地，胰高血糖素拮抗剂以约1 μM的浓度展示出由胰高血糖素对胰高血糖素受体实现的最大激动剂活性的少于约20％。在一些实施方案中，胰高血糖素拮抗剂展示由胰高血糖素对胰高血糖素受体实现的最大激动剂活性的少于约10％。在特定实施方案中，胰高血糖素拮抗剂展示由胰高血糖素对胰高血糖素受体实现的最大激动剂活性的少于约5%。在仍另一特定实施方案中，胰高血糖素拮抗剂展示由胰高血糖素对胰高血糖素受体实现的最大激动剂活性的0%。
“纯胰高血糖素拮抗剂”是不产生任何可检测的胰高血糖素或GLP-1受体活性的刺激的胰高血糖素拮抗剂，如使用经验证的体外模型测定通过cAMP产生所测量（参见例如PCT/US2008/080973）。例如，纯胰高血糖素拮抗剂展示出由胰高血糖素对胰高血糖素受体实现的最大激动剂活性的少于约5％（例如，少于约4％，少于约3％，少于约2％，少于约1％，约0％），且展示出由GLP-1对GLP-1受体实现的最大激动剂活性的少于约5％（例如，少于约4％，少于约3％，少于约2％，少于约1％，和约0％）。
因此，在一些实施方案中，提供4类肽，其展示出纯胰高血糖素拮抗剂活性。根据一些实施方案，胰高血糖素拮抗剂展示出这样的活性，当胰高血糖素受体同时与0.8nM的胰高血糖素和胰高血糖素拮抗剂接触时，如在体外测定中通过cAMP产生所测量的，所述活性降低胰高血糖素受体胰高血糖素诱导的cAMP产生最大值的至少50％。在一些实施方案中，胰高血糖素拮抗剂降低胰高血糖素受体胰高血糖素诱导的cAMP产生最大量的至少80％。
4类肽据信对于之前已对胰高血糖素拮抗剂描述的任何用途均是合适的。因此，本文描述的4类肽可用于治疗高血糖症，或治疗其他代谢性疾病，所述代谢性疾病由胰高血糖素的高血液水平或高血糖水平导致。根据一些实施方案，待使用本文公开的4类肽治疗的患者为家养动物，和在另一实施方案中，待治疗患者为人。研究表明在糖尿病患者中缺少胰高血糖素抑制部分经加速的糖原分解促进餐后高血糖。在存在或不存在生长抑素诱导的胰高血糖素抑制的情况下，在口服葡萄糖耐量试验（OGTT）过程中的血糖分析已显示具有更高胰高血糖素水平的主体中显著的葡萄糖增加。因此，本发明的4类肽可以用于治疗高血糖症，且预期可用于治疗多种类型的糖尿病，包括I型糖尿病、II型糖尿病或妊娠糖尿病，无论是胰岛素依赖型或非胰岛素依赖型，和降低包括肾病、视网膜病和血管疾病的糖尿病并发症。
在一些实施方案中，毒蜥外泌肽-4的末端10个氨基酸（即SEQ ID NO: 1319 (GPSSGAPPPS)的序列）连接至4类肽的羧基末端。预期这些融合蛋白具有抑制食欲和诱导体重减轻/体重保持的药物活性。根据一些实施方案，本文公开的4类肽可以进一步修饰以包括连接至SEQ ID NO: 1342的4类肽的氨基酸24的SEQ ID NO: 1319 (GPSSGAPPPS)的氨基酸序列，且施用于个体以诱导体重减轻或帮助体重保持。更具体而言，4类肽包含选自SEQ ID NO: 1302、SEQ ID NO: 1303、SEQ ID NO: 1304 SEQ ID NO: 1305、SEQ ID NO: 1306、SEQ ID NO: 1307、SEQ ID NO: 1308、SEQ ID NO: 1336、SEQ ID NO: 1339、SEQ ID NO: 1340 SEQ ID NO: 1341、SEQ ID NO: 1342、SEQ ID NO: 1343和SEQ ID NO: 1344的序列，且进一步包含连接至4类肽的氨基酸24的SEQ ID NO: 1319 (GPSSGAPPPS)的氨基酸序列（用于抑制食欲和诱导体重减轻/体重保持）。在一些实施方案中，施用的4类肽包含SEQ ID NO: 1346 或SEQ ID NO: 1347的序列。
此类用于降低食欲或促进体重减轻的方法预期可用于降低体重，预防体重增加或治疗多种原因的肥胖症，包括药物诱导的肥胖症，和降低与肥胖相关的并发症，包括血管疾病（冠心病、中风、外周血管疾病、局部缺血再灌注等）、高血压、II型糖尿病发生、高脂血症和肌肉骨骼疾病。
本发明的4类肽可单独或与其他抗糖尿病或抗肥胖症药剂组合施用。本领域已知的或在研究中的抗糖尿病剂包括胰岛素、磺酰脲类如甲苯磺丁脲（Orinase）、醋酸己脲（Dymelor）、妥拉磺脲（Tolinase）、氯磺丙脲（Diabinese）、格列吡嗪（Glucotrol）、格列本脲（Diabeta、Micronase、Glynase）、格列美脲（亚莫利）或格列齐特（达美康）；氯茴苯酸类如瑞格列奈（Prandin）或那格列奈（Starlix）；双胍类如二甲双胍（格华止）或苯乙双胍；噻唑烷二酮类例如罗格列酮（文迪雅）、吡格列酮（Actos）或曲格列酮（Rezulin）或其他PPARγ抑制剂；抑制碳水化合物消化的α葡萄糖苷酶抑制剂如米格列醇（Glyset）、阿卡波糖（Precose/拜唐苹）；艾塞那肽（Byetta）或普兰林肽；二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂如维格列汀或西格列汀； SGLT（钠依赖性葡萄糖转运蛋白1）抑制剂；或FBP酶（果糖-1,6-二磷酸酶）抑制剂。
本领域已知的或在研究中的抗肥胖症剂包括食欲抑制剂，包括苯乙胺类刺激剂，芬特明（任选与芬氟拉明或右芬氟拉明）、安非拉酮（Tenuate®）、苯甲曲秦（Prelu-2®、Bontril®）、苄非他明（Didrex®）、西布曲明（Meridia®、Reductil®）；利莫那班（Acomplia®），其他大麻素受体拮抗剂；胃泌酸调节素；盐酸氟西汀（百忧解）； Qnexa（托吡酯和芬特明）、Excalia（安非他酮和唑尼沙胺）或Contrave（安非他酮和纳曲酮）；或脂肪酶抑制剂，类似于赛尼可（奥利司他）或Cetilistat（也称为ATL-962）、或GT389-255。
本发明的4类肽还可以施用于患有分解代谢消耗(catabolic wasting)的患者。估计超半数的癌症患者经历分解代谢消耗，其特征在于不期望的和进行性的体重减轻、虚弱和低体脂肪和肌肉。综合征同样于AIDS患者中常见，且可以存在于细菌性和寄生物性疾病、类风湿性关节炎、和肠、肝、肺和心的慢性疾病中。其通常与食欲减退相关且可以表现为衰老中的病况或身体创伤的结果。分解代谢消耗是降低生活质量、恶化潜在病况的症状，且是死亡的主要原因。申请人预期本文公开的4类肽可以施用于患者来治疗分解代谢消耗。
包含本文公开的4类肽的药物组合物可以配制并施用于患者，其使用本领域技术人员已知的标准的药学上可接受的载体和施用途径。因此，本公开还包括包含本文公开的一种或多种4类肽及药学上可接受的载体的药物组合物。药物组合物可以包含4类肽作为唯一的药学活性组分，或4类肽可以与一种或多种额外活性剂组合。根据一些实施方案，提供包含本发明的4类肽和活化GLP-1受体的化合物（诸如GLP-1、GLP-1类似物、毒蜥外泌肽-4类似物、或其衍生物）的组合物。根据一些实施方案，提供包含本发明的4类肽和胰岛素或胰岛素类似物的组合物。可选地，可以提供提供用于诱导体重减轻或预防体重增加的组合物，其包含SEQ ID NO: 1342的序列，进一步包含连接至SEQ ID NO: 1342的氨基酸24的SEQ ID NO: 1319 (GPSSGAPPPS)的氨基酸序列和抗肥胖症肽。合适的抗肥胖症肽包括公开于美国专利5,691,309、6,436,435或美国专利申请20050176643中的那些，且包括但不限于GLP-1、GIP(胃抑制性多肽)、MP1、PYY、MC-4、瘦蛋白。
4类肽结构
在一些实施方案中，提供4类胰高血糖素相关肽，其中(胰高血糖素、SEQ ID NO: 1301的)位置9的天然存在的天冬氨酸已被谷氨酸或基于半胱磺酸的衍生物取代。更具体而言，缺失第一氨基酸（des-His）和位置9的天冬氨酸被谷氨酸取代在一些方面产生4类肽。具有在胰高血糖素的氨基酸位置9取代的磺酸取代基的4类胰高血糖素相关肽类似于基于羧酸的氨基酸起效，但具有关于生理特性诸如溶解性的少许关键差别。高半胱磺酸hCys(SO3)当取代常规des-His, G1u9 4类肽中位置9的等排谷氨酸时，保留部分拮抗剂和弱激动剂。
在一些实施方案中，提供4类肽，其中去除前两个至五个氨基酸，且位置9（根据SEQ ID NO: 1301的编号）被hCys(SO3)、高谷氨酸、β-高谷氨酸、或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸衍生物所替代：
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基，提供作为高度特异性的、有效的且无污染激动剂特性的激素拮抗剂起效的化合物。
根据一些实施方案，提供4类肽，其包含相对于SEQ ID NO: 1301的野生型序列修饰的胰高血糖素肽，所述修饰通过缺失从N末端的两个至五个氨基酸残基和在天然蛋白的位置9用谷氨酸、高谷氨酸、β-高谷氨酸、半胱氨酸的磺酸衍生物、或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸衍生物取代：
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基。
在一个特定实施方案中，包含缺失从N末端的两个至五个氨基酸残基和在天然胰高血糖素的位置9取代Asp的4类肽进一步通过高至三个氨基酸修饰来修饰。例如，4类肽可以包含一个、两个、或三个保守氨基酸修饰。可选地或另外地，4类肽可以包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
A. 4类肽的位置10、20和24（根据SEQ ID NO: 1301的氨基酸编号）的一个或两个氨基酸或N或C末端氨基酸被经酯、醚、硫醚、酰胺或烷基胺连接共价连接至酰基或烷基的氨基酸取代；
B. 4类肽的位置16、17、20、21、和 24（根据SEQ ID NO: 1301的氨基酸编号）中的一个或两个氨基酸或N或C末端氨基酸被选自：Cys、Lys、鸟氨酸、高半胱氨酸和乙酰苯丙氨酸（Ac-Phe）的氨基酸（其中所述组的氨基酸共价连接至亲水部分）取代；
C. 添加共价连接至亲水部分的氨基酸至4类肽的N或C末端；
D. 位置15（根据SEQ ID NO: 1301的氨基酸编号）的Asp被半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸取代；
E. 位置16（根据SEQ ID NO: 1301的氨基酸编号）的Ser被半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸取代；
F. 根据SEQ ID NO: 1301的氨基酸编号的位置16、20、21和24的一个或多个用AIB取代；
G. 根据SEQ ID NO: 1301的编号的位置29的氨基酸或位置28和29的氨基酸的缺失；
H. 位置28的Asn和位置29的Thr（根据SEQ ID NO: 1301的氨基酸编号）的每一个或两个被带电荷的氨基酸取代；和/或SEQ ID NO: 1301的C末端的一个或两个带电荷的氨基酸的添加；
I. 位置27（根据SEQ ID NO: 1301的编号）的Met被Leu或正亮氨酸取代；
J. 向SEQ ID NO: 1301的C末端添加具有SEQ ID NOs: 19-21和53的任一者的氨基酸序列的肽；其中位置29（根据SEQ ID NO: 1301的编号）的Thr为Thr或Gly；和
K. 用酰胺或酯替代C末端羧基。
在一个特定的实施方案中，4类肽包含A、B或C的氨基酸修饰（如上所述）或其组合。在仍另一个特定实施方案中，除了A、B和/或C的氨基酸修饰外，4类肽进一步包含上文所述的D至K的任何的氨基酸修饰，或其组合。
在一些实施方案，4类肽包含胰高血糖素肽，其中前5个氨基酸已从N末端去除，且剩余的N末端氨基已被羟基替换("PLA6类似物")，产生SEQ ID NO: 1339的肽。申请人已发现前五个氨基酸缺失且具有位置9（相对于天然胰高血糖素）的谷氨酸取代的4类肽中苯基乳酸替换苯丙氨酸进一步增强那些4类肽类似物的效力。
在一些实施方案中，SEQ ID NO: 1339的4类肽通过在位置4（天然胰高血糖素的位置9）的天冬氨酸残基被具有以下通用结构的氨基酸取代来进一步修饰：
其中X6为C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基，和在一些实施方案中，X6为C1-C3烷基，和在另一实施方案中，X6为C2烷基。在一些实施方案中，4类肽包含胰高血糖素肽，其中前5个氨基酸已从N末端1去除，且位置4（天然胰高血糖素的位置9）的天冬氨酸已被半胱磺酸或高半胱磺酸替代。在一些实施方案中，4类肽包含含有选自SEQ ID NO: 1339、SEQ ID NO: 1307和SEQ ID NO: 1308的氨基酸序列的胰高血糖素肽。在一些实施方案中，4类肽包含选自SEQ ID NO: 1308的氨基酸序列，其中位置4的氨基酸为高半胱磺酸。
在另一实施方案中，SEQ ID NO: 1339的4类肽进一步通过在位置4（天然胰高血糖素的位置9）的天冬氨酸残基被谷氨酸、高谷氨酸、β-高谷氨酸、或具有以下结构的烷基羧酸衍生物取代：
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基。在特定的实施方案中，X5为C1或C2烷基。
然而，申请人已发现在des1-5胰高血糖素类似物（即具有前五个氨基酸缺失的胰高血糖素类似物）中用PLA取代N末端苯丙氨酸，在位置4（天然胰高血糖素的位置9）的天然天冬氨酸残基的进一步取代对于产生展示纯拮抗作用的类似物不是必需的。该结果在现有技术教导下是令人惊讶的，现有技术教导位置4的天然天冬氨酸残基必须被取代以产生高亲和力和有效的胰高血糖素(2-29)类似物的拮抗剂。PLA取代的使用改善了Asp9类似物的相对效力至Glu9和hCys(SO3H)9类似物的效力相当的点。
苯丙氨酸残基被其他苯丙氨酸类似物包括3,4-2F-苯丙氨酸(3,4-2F-Phe)、2-萘基丙氨酸 (2-Nal)、N-酰基-苯丙氨酸(Ac-Phe)、α-甲基氢化肉桂酸 (MCA)和苄基丙二酸(BMA)取代不如PLA取代一样有效。
在位点6（根据天然胰高血糖素的氨基酸编号）之外的位点（包括位置4和5）取代PLA显示PLA6类似物是比具有稍微延伸的N末端的胰高血糖素类似物略微更有效的拮抗剂。本发明还包括这样的类似物，其中N末端氨基被酰化和烷基化的“O末端”肽取代。
此外，PLA6取代不仅增加拮抗剂的效力还在PEG化中起关键作用。PLA6类似物可以选择性PEG化，而不恢复胰高血糖素激动作用。在PLA取代不存在的情况下，胰高血糖素的PEG化令人惊讶地诱导胰高血糖素激动作用。该胰高血糖素激动作用在PEG化的PLA6类似物中未见到。研究了PEG化的几个位点，包括位置3、6和19（天然胰高血糖素的位置8、11和19）和N末端的氨基酸残基。在一些实施方案中，PEG化在位置19（天然胰高血糖素的位置24），由于该位点展示出最有效和选择性的胰高血糖素激动作用。
在一些实施方案中，4类肽包含A-B-C的通用结构，其中A选自：
（i）苯基乳酸（PLA）；
（ii）PLA的氧基衍生物；
（iii）2-6个氨基酸的肽，其中肽的两个连续氨基酸经酯或醚键连接；
B代表SEQ ID NO: 1301的氨基酸i-26，其中i为3、4、5、6或7，任选地包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
（iv）位置9（根据SEQ ID NO: 1301的氨基酸编号）的Asp被Glu、Cys的磺酸衍生物、高谷氨酸、β-高谷氨酸、或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸衍生物取代：
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基。
（v）位置10、20和24（根据SEQ ID NO: 1301的氨基酸编号）的一个或两个氨基酸被经酯、醚、硫醚、酰胺或烷基胺连接共价连接至酰基或烷基的氨基酸取代；
（vi）位置16、17、20、21、和 24（根据SEQ ID NO: 1301的氨基酸编号）的一个或两个氨基酸被选自以下的氨基酸取代：Cys、Lys、鸟氨酸、高半胱氨酸和乙酰苯丙氨酸（Ac-Phe），其中该组的氨基酸共价连接至亲水部分；
（vii）位置15（根据SEQ ID NO: 1301的编号）的Asp被半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸取代；
（viii）位置16（根据SEQ ID NO: 1301的编号）的Ser被半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸取代；
（ix）根据SEQ ID NO: 1301的氨基酸编号的位置16、20、21和24的一个或多个被AIB取代；
且C选自：
（x）X；
（xi）X-Y；
（xii）X-Y-Z；和
（xiii）X-Y-Z-R10，
其中X为Met、Leu、或Nle；Y为Asn或带电荷的氨基酸；Z为Thr、Gly、Cys、Lys、鸟氨酸（Orn）、高半胱氨酸、乙酰苯丙氨酸(Ac-Phe)、或带电荷的氨基酸；其中R10选自SEQ ID NOs: 1319-1321和1353；和
（xiv）其中C末端羧基被酰胺替换的（x）至（xiii）的任一种。
在特定方面中，4类肽包含PLA的氧基衍生物。如本文所用，“PLA的氧基衍生物”指包含PLA的修饰结构的化合物，其中羟基已被O-R11取代，其中R11为化学基团。在这方面，PLA的氧基衍生物可以例如是PLA的酯或PLA的醚。
制备PLA的氧基衍生物的方法是本领域已知的。例如，当氧基衍生物为PLA的酯时，酯可以通过PLA的羟基与具有亲核基团的羰基反应后形成。亲核基团可以是任何合适的亲核基团，包括但不限于胺或羟基。因此，PLA的酯可以包含式IV的结构：
式IV
其中R7为PLA的羟基与具有亲核基团的羰基反应后形成的酯。
具有亲核基团（其与PLA的羟基反应以形成酯）的羰基可以是例如羧酸、羧酸衍生物、或羧酸的活化的酯。羧酸衍生物可以是但不限于酰基氯、酸酐、酰胺、酯、或腈。羧酸的活化的酯可以是例如N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、甲苯磺酸酯（Tos）、碳二亚胺、或六氟磷酸酯。在一些实施方案中，碳二亚胺是1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)、1,1'-羰基二咪唑(CDI)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸化物(EDC)、或1,3-二异丙基碳二亚胺(DICD)。在一些实施方案中，六氟磷酸酯选自六氟磷酸酯苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)磷六氟磷酸酯(BOP)、苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷六氟磷酸酯(PyBOP)、2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(HATU)、和o-苯并三唑-N,N,N’,N’-四甲基-脲鎓-六氟-磷酸酯(HBTU)。
从与羟基（例如PLA的羟基）反应制备醚的方法也是本领域已知的。例如，PLA的羟基可以与卤代烷基或甲苯磺酰化烷基醇反应以形成醚键。
通常，R11的化学基团是降低4类肽的活性的化学基团。在一些实施方案中，化学基团增强4类肽的活性、稳定性、和/或溶解性。
在特定的实施方案中，经含氧键（例如经醚或酯键）结合至PLA的化学基团是聚合物（例如聚乙二醇）、碳水化合物、氨基酸、肽、或脂质，例如脂肪酸或类固醇。
在特定的实施方案中，化学基团是氨基酸，其任选地为肽的一部分，从而使式IV为缩肽。在这方面，PLA可以在除4类肽的N末端氨基酸残基外的位置，从而使得4类肽包含至N末端至PLA残基的一个或多个（例如1、2、3、4、5、6或更多）氨基酸。例如，4类肽可以包含位置n的PLA，其中n为4类肽的2、3、4、5或6。
N末端至PLA残基的氨基酸可以是合成的或天然存在的。在特定实施方案中，作为N末端PLA的氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，作为PLA的N末端的氨基酸是天然胰高血糖素的N末端氨基酸。例如，4类肽可以在N末端包含SEQ ID NOs: 1354-1358的任何的氨基酸序列，其中PLA经酯键连接至苏氨酸：
。
在可选的实施方案中，一个或多个N末端氨基酸可以被除天然胰高血糖素的氨基酸之外的氨基酸取代。例如，当4类肽包含PLA作为位置5或6的氨基酸时，位置1和/或位置2的氨基酸可以是降低对由二肽基肽酶IV的切割的易感性的氨基酸。更具体而言，在一些实施方案中，4类肽的位置1为选自以下的氨基酸：D-组氨酸、α,α-二甲基咪唑(imidiazole)乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸和高组氨酸。更具体而言，在一些实施方案中，拮抗剂肽的位置2为选自以下的氨基酸：D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸（AIB）。此外例如，当4类肽包含PLA作为位置4、5或6的氨基酸时，4类肽的位置3的氨基酸可以是谷氨酸，与天然胰高血糖素的天然谷氨酰胺残基相反。在本发明的示例性实施方案中，4类肽在N末端包含SEQ ID NOs: 1359-1361的任何的氨基酸序列。
关于包含式IV的化合物的4类肽，聚合物可以是任何聚合物，条件是其可以与PLA的羟基反应。聚合物可以是天然或通常包含具有亲核基团的羰基的聚合物。可选地，聚合物可以是衍生化以包含具有羰基的羰基。聚合物可以是以下任何的衍生化的聚合物：聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烃和它们的衍生物，包括聚烷撑乙二醇、聚亚烷基氧化物、聚亚烷基对苯二酸酯(terepthalates)、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物，包括聚（甲基丙烯酸甲酯）、聚（甲基丙烯酸乙酯）、聚（甲基丙烯酸丁酯）、聚（甲基丙烯酸异丁酯）、聚（甲基丙烯酸己酯）、聚（甲基丙烯酸异癸酯）、聚（甲基丙烯酸月桂酯）、聚（甲基丙烯酸苯酯）、聚（丙烯酸甲酯）、聚（丙烯酸异丙酯）、聚（丙烯酸异丁酯）、和聚（十八烷基丙烯酸酯）、聚乙烯基聚合物包括聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚（乙酸乙烯酯）、和聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯和其共聚物，纤维素包括烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟基-丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羧乙基纤维素、三乙酸纤维素和纤维素硫酸钠盐、聚丙烯、聚乙烯包括聚（乙二醇）、聚（环氧乙烷）和聚（对苯二甲酸乙二醇酯）、以及聚苯乙烯。
聚合物可以是生物可降解聚合物，包括合成的生物可降解聚合物（例如乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酐、聚（正）酯、聚氨酯、聚（丁酸(butic acid)）、聚（戊酸）、和丙交酯-己内酯共聚物），和天然可降解聚合物（例如，藻酸盐和其他多糖包括葡聚糖和纤维素、胶原、其化学衍生物（取代、添加化学基团，例如，烷基、亚烷基，羟基化，氧化，和本领域技术人员常规进行的其他修饰）、白蛋白和其他亲水蛋白（例如，玉米蛋白和其他谷醇溶蛋白和疏水蛋白）），以及其任何共聚物或混合物。通常，这些材料通过酶促水解或体外暴露于水通过表面侵蚀或本体溶蚀而降解。
聚合物可以是生物粘附聚合物，诸如由H. S. Sawhney，C. P. Pathak和J. A. Hubbell在Macromolecules，1993，26，581-587中描述的生物蚀解的水溶胶，其教导并入本文，聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酐、聚丙烯酸、藻酸盐、壳聚糖、聚（甲基丙烯酸甲酯）、聚（甲基丙烯酸乙酯）、聚（甲基丙烯酸丁酯）、聚（甲基丙烯酸异丁酯）、聚（甲基丙烯酸己酯）、聚（甲基丙烯酸异癸酯）、聚（甲基丙烯酸月桂酯）、聚（甲基丙烯酸苯基酯）、聚（丙烯酸甲酯）、聚（丙烯酸异丙酯）、聚（丙烯酸异丁酯）和聚（丙烯酸十八酯）。
在一些实施方案中，聚合物是水溶性聚合物。合适的水溶性聚合物是本领域已知的其包括例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素（HPC；Klucel）、羟丙基甲基纤维素（HPMC；Methocel）、硝基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羟丙基丁基纤维素、羟丙基戊基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素（Ethocel）、羟乙基纤维素、各种烷基纤维素和羟烷基纤维素、各种纤维素醚、醋酸纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、乙酸乙烯酯/巴豆酸共聚物、聚甲基丙烯酸羟烷基酯、羟甲基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、马来酸酐/甲基乙烯基醚共聚物、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠和钙、聚丙烯酸、酸性羧基聚合物、羧基聚亚甲基、羧基乙烯基聚合物、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物、羧甲基酰胺、甲基丙烯酸钾二乙烯基苯共聚物、聚乙二醇、聚环氧乙烷及其衍生物、盐和组合。
在特定实施方案中，聚合物为聚烷撑乙二醇包括例如聚乙二醇（PEG）。
碳水化合物可以是任何碳水化合物，条件是其包含或者制备以包含具有α离去基团的羰基。碳水化物例如可以是已衍生化以包含具有α离去基团的羰基的碳水化合物。在这方面，碳水化合物可以是以下的衍生形式：单糖（例如葡萄糖、半乳糖、果糖）、二糖（例如蔗糖、乳糖、麦芽糖）、寡糖（例如棉子糖、水苏糖）、多糖（淀粉、淀粉酶、支链淀粉、纤维素、壳多糖、胼胝质、昆布多糖、木聚糖、甘露聚糖、岩藻多糖、半乳甘露聚糖。
关于包含式IV的化合物的4类肽，脂质可以是任何包含具有α离去基团的羰基的脂质。例如，脂质可以是衍生化以包含羰基的脂质。在这方面，脂质可以是以下的衍生物：脂肪酸（例如，C4-C30脂肪酸、类花生酸、前列腺素、白细胞三烯、血栓烷、N-酰基乙醇胺）、甘油脂（如，单、二、三取代的甘油）、甘油磷脂（例如，磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸）、鞘脂（如，鞘氨醇、神经酰胺）、甾醇脂（如，类固醇、胆固醇）、异戊烯醇脂质、糖脂质、或聚酮化合物。
油、蜡、胆固醇、甾醇、脂溶性维生素、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂。
在一些实施方案中，R7具有约100 kDa或更低，例如约90 kDa或更低、约80 kDa或更低、约70 kDa或更低、约60 kDa或更低、约50 kDa或更低、约40 kDa或更低的分子量。因此，R7可以具有约35 kDa或更低，约30 kDa或更低、约25 kDa或更低、约20 kDa或更低、约15 kDa或更低、约10 kDa或更低、约5 kDa或更低、或约1 kDa的分子量。
在可选的实施方案中，4类肽包含2-6个氨基酸的肽作为A，其中肽的两个连续氨基酸经酯或醚键连接。酯键或醚键可以在例如氨基酸2-3、3-4、4-5或5-6之间。任选地，肽可以进一步通过与另一化学基团共价连接，包括连接至聚合物（例如亲水聚合物）、烷基化或酰化来修饰。
关于包含通用结构A-B-C的4类肽，B代表天然胰高血糖素的氨基酸，例如SEQ ID NO: 1301的i至26，其中i为3、4、5、6或7，任选包含一个或多个氨基酸取代。在特定的实施方案中，B代表SEQ ID NO: 1301的氨基酸7-26，任选进一步修饰。
在一些实施方案中，B通过高至三个氨基酸修饰来修饰。例如，代表SEQ ID NO: 1301的天然氨基酸序列的B通过一个或多个保守氨基酸修饰来修饰。
在另一实施方案中，B包含选自如本文所述的（iv）至（ix）的一个或多个氨基酸修饰。在特定实施方案中，B包含氨基酸修饰（v）和（vi）的一个或两个。在进一步特定的实施方案中，B包含除了(v)和(vi)外还选自(iv)、(vii)、(viii)、和 (ix)的一个氨基酸修饰或其组合。
在另一特定实施方案中，4类肽包含C末端的一个或多个带电荷的氨基酸。例如，Y和/或Z可以是带电荷的氨基酸，例如Lys、Arg、His、Asp、和 Glu。在仍另一实施方案中，4类肽包含C末端至Z的一个至两个带电荷的氨基酸（例如Lys、Arg、His、Asp、和 Glu）。在特定的实施方案中，随后为一个至两个带电荷的氨基酸的Z不包含R10。
4类肽在一些实施方案中包含共价连接至如本文所述的4类肽的氨基酸残基的亲水部分。例如，4类肽可以包含共价连接至根据SEQ ID NO: 1301的编号的位置1、16、20、21、或24的氨基酸的亲水部分。在另一实施方案中，亲水部分连接至4类肽的C末端氨基酸，其在一些情况中为C末端至Z的1或11个氨基酸。在仍另一实施方案，亲水部分连接至PLA，当A为PLA、PLA-Phe、或PLA-Thr-Phe时，其中PLA修饰以包含亲水部分。在另一实施方案中，添加包含亲水部分的氨基酸至4类肽的N或C末端。在另一实施方案中，4类肽包含如本文所述的酰基或烷基。例如，酰化或烷基化可以在根据SEQ ID NO: 1301的编号的位置10、20或24的氨基酸的侧链之外发生。在可选的实施方案中，酰化或烷基化在4类肽的C末端氨基酸的侧链外发生，其在一些情况下是C末端至Z的1或11个氨基酸。在仍另一实施方案中，当A为PLA、PLA-Phe、或PLA-Thr-Phe时，PLA经修饰以包含酰基或烷基。
示例性实施方案
4类肽可以包含任何氨基酸（合成或天然存在的），条件是肽的至少两个连续氨基酸经酯或醚键连接。在特定实施方案中，肽包含天然胰高血糖素的氨基酸。例如，肽可以包含天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 1301)的j至6，其中j为1、2、3、4、或5。可选地，肽可以包含具有一个或多个氨基酸修饰的基于SEQ ID NO: 1301的N末端的氨基酸序列。位置1和/或位置2的氨基酸可以是降低对由二肽基肽酶IV的切割的易感性的氨基酸。例如，肽可以在4类肽的位置1包含选自以下的氨基酸：D-组氨酸、α,α-二甲基咪唑(imidiazole)乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸和高组氨酸。更具体而言，在一些实施方案中，拮抗剂肽的位置2为选自以下的氨基酸：D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸（AIB）。而且，例如，4类肽的位置3的氨基酸可以是谷氨酸，与天然胰高血糖素的天然谷氨酰胺残基相反。因此，4类肽可以包含以下的氨基酸序列：
其中Xaa1选自：His、D-组氨酸、α,α-二甲基咪唑乙酸（DMIA）、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟组氨酸、乙酰组氨酸和高组氨酸；Xaa2选自：Ser、D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸（AIB）；且Xaa3为Gln或Glu。
本发明还包括这样的实施方案，其中4类肽的C末端氨基酸具有酰胺基取代存在于天然氨基酸的羧酸基团。
在一些实施方案中，其中4类肽是PEG化的，4类肽包含缩短的胰高血糖素肽，特别是6-29，其中“N末端”氨基酸为PLA（苯基-乳酸）。此类胰高血糖素衍生物展示出独特优点。它们是比具有天然N末端苯丙氨酸的肽更有效的肽，且它们抑制任何由于PEG化的胰高血糖素激动作用（有时在天然苯丙氨酸中见不到）。最后，尽管目前的文献确定在位置9的天然天冬酰胺的取代对于拮抗剂活性是必需的，但申请人已发现令人惊讶的结果，即此类取代在PLA6-(6-29)胰高血糖素类似物中不再是需要的。
在一些实施方案中，4类肽的氨基酸被至少一个半胱氨酸残基取代，其中半胱氨酸残基的侧链进一步修饰有巯基反应试剂，包括例如马来酰亚胺、乙烯砜、2-吡啶基硫代(pyridylthio)、卤代烷基和卤代酰基。这些巯基反应试剂可以包含羧基、酮基、羟基和醚基以及其他亲水部分诸如聚乙二醇单元。在可选的实施方案中，4类肽的氨基酸被赖氨酸取代，且取代的赖氨酸残基的侧链进一步使用胺反应试剂诸如羧酸的活性酯（琥珀酰亚胺基、酐等）或亲水部分诸如聚乙二醇的醛来修饰。根据一些实施方案，对应于天然肽的位置12的赖氨酸残基被精氨酸取代，且单一赖氨酸取代插入对应于天然肽的位置1、16、17、20、21、24或29的氨基酸之一，或者赖氨酸添加至4类肽的N或C末端。
在另一实施方案中，对应于天然肽的位置27的甲硫氨酸残基改变为亮氨酸或正亮氨酸以防止肽的氧化降解。
在一些实施方案中，本文描述的4类肽通过截短或缺失胰高血糖素肽的C末端的一个或两个氨基酸（即天然胰高血糖素的位置29或位置28和29的氨基酸的截短）而不影响对胰高血糖素受体的活性和/或效力来进一步修饰。在这方面，本文描述的4类肽可以例如基本上由具有一个或多个修饰（产生如文所述的4类肽活性）的天然胰高血糖素肽(SEQ ID NO: 1301)的氨基酸1-27、1-28、2-27、2-28、3-27、3-28、4-27、4-28、5-27、5-28、6-27、或6-28组成，或由其组成。
本文公开的4类肽还包括已知对于胰高血糖素肽的功能不是关键的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代为在选自SEQ ID NO: 1339的2、5、6、7、8、9、12、13、14、15、16、19、22、23 或24的一个、两个或三个位置处的保守氨基酸取代。在一些实施方案中，4类肽包含SEQ ID NO: 1342的衍生肽，其中胰高血糖素肽包含相对于SEQ ID NO: 1342在选自位置2、5、6、8、9、12、13和14的一至三个氨基酸位置处的进一步的氨基酸取代。在一些实施方案中，在SEQ ID NO: 1342的位置2、5、6、8、9、12、13和14的取代是保守氨基酸取代。在一些实施方案中，对应于天然肽的位置16、17、20、21、24 或29的氨基酸且更具体而言在位置21和/或24的氨基酸被半胱氨酸或赖氨酸取代，其中PEG链共价连接至取代的半胱氨酸或赖氨酸残基。
根据一些实施方案，修饰的4类肽包含共价连接至肽的两个或多个聚乙二醇链，其中胰高血糖素链的总分子量为约1,000至约5,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG化的4类肽包含选自SEQ ID NO: 1312、和 SEQ ID NO: 1322的肽，其中所述肽包含连接至位置11和19的氨基酸的聚乙二醇链，且两个PEG链的组合的分子量为约1,000至约5,000道尔顿。
根据一些实施方案，提供4类肽，其包含选自以下的经修饰的胰高血糖素肽：
其中位置4的Xaa＝天冬氨酸、谷氨酸、半胱磺酸或高半胱磺酸，位置7的Xaa＝Lys或Arg，位置10的Xaa为天冬氨酸、半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸；位置11的Xaa为Ser、Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸或乙酰苯丙氨酸，位置16的Xaa为Asp、Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸或乙酰苯丙氨酸且位置19的Xaa为Gln、Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸和乙酰苯丙氨酸，位置22的Xaa＝Met、Leu、或Nle，R1为OH或NH2，且R2为COOH或CONH2，其中肽在以下位置PEG化：SEQ ID NO: 1309的位置11、SEQ ID NO: 1310的位置16、SEQ ID NO: 1311的位置19和SEQ ID NO: 1312的位置16和19，条件是当位置4的Xaa＝天冬氨酸时，R1为OH。根据一些实施方案，肽包含SEQ ID NO: 1309、SEQ ID NO: 1310 或SEQ ID NO: 1311的序列，其中R1为OH且R2为CONH2。在一些实施方案中，肽包含SEQ ID NO: 1309、SEQ ID NO: 1310 或SEQ ID NO: 1311的序列，其中R1为OH，R2为CONH2，且位置4的氨基酸为天冬氨酸，且在进一步的实施方案中，此类肽包含含有SEQ ID NO: 1319的序列的羧基末端延伸。
根据一些实施方案，肽包含选自SEQ ID NO: 1309、SEQ ID NO: 1310、SEQ ID NO: 1313、SEQ ID NO: 1314、和SEQ ID NO: 1316的序列，其中所述肽在SEQ ID NO: 1309和SEQ ID NO: 1313的位置11 PEG化，在SEQ ID NO: 1310的位置16 PEG化，且在SEQ ID NO: 1310和SEQ ID NO: 1314的位置19 PEG化。在一些实施方案中，胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO: 1313 或SEQ ID NO: 1314的肽。在一些实施方案中，本文公开的4类肽的C末端氨基酸具有酰胺基替代存在于天然氨基酸的羧酸基团。根据一些实施方案，4类肽包含SEQ ID NO: 1318的序列。
根据一些实施方案，提供4类肽，其中血浆蛋白已共价连接至肽的氨基酸侧链以改进胰高血糖素肽的溶解性、稳定性和/或药代动力学。例如，血清白蛋白可以共价连接至本文呈现的4类肽。在一些实施方案中，血浆蛋白共价连接至对应于天然胰高血糖素肽的位置16、17、20、21、24 或29的氨基酸。更具体而言，在一些实施方案中，血浆蛋白连接至对应于天然胰高血糖素肽的位置16或24的氨基酸，其中4类肽包含SEQ ID NO: 1303、SEQ ID NO: 1304、SEQ ID NO: 1305、SEQ ID NO: 1306、SEQ ID NO: 1307、SEQ ID NO: 1308、SEQ ID NO: 1309、SEQ ID NO: 1311、SEQ ID NO: 1312、SEQ ID NO: 1322、SEQ ID NO: 1323、SEQ ID NO: 1324、SEQ ID NO: 1325、SEQ ID NO: 1326、SEQ ID NO: 1327、SEQ ID NO: 1328、SEQ ID NO: 1336和SEQ ID NO: 1339的序列。在一些实施方案中，4类肽包含选自以下的肽：SEQ ID NO:1309、SEQ ID NO:1310、SEQ ID NO:1311、和SEQ ID NO:1312。
根据一些实施方案，提供4类肽，其中代表免疫球蛋白分子的Fc部分的直链氨基酸序列已共价连接至4本文公开的4类肽的氨基酸侧链以改进胰高血糖素肽的溶解性、稳定性和/或药代动力学。例如，代表免疫球蛋白分子的Fc部分的氨基酸序列可以共价连接至SEQ ID NO: 1307、SEQ ID NO: 1339的胰高血糖素肽或其胰高血糖素类似物的位置11、12、15、16、19、21 或24。在一些实施方案中，Fc肽共价连接至SEQ ID NO: 1306、SEQ ID NO: 1307、SEQ ID NO: 1308 或SEQ ID NO: 1336的4类肽的位置11或19。Fc部分通常分离自IgG，但来自任何免疫球蛋白的Fc肽片段应该是功能等同的。在一些实施方案中，胰高血糖素肽选自以下：SEQ ID NO:1303、SEQ ID NO:1304、SEQ ID NO:1305、SEQ ID NO:1307 SEQ ID NO:1308、和SEQ ID NO:1339，其中Fc部分连接至天然胰高血糖素肽的16、17、20、21、24 或29的对应位置。在一些实施方案中，4类肽包含选自以下的胰高血糖素肽：SEQ ID NO:1309、SEQ ID NO:1310、SEQ ID NO:1311、和SEQ ID NO:1312，其中Fc肽结合至分别位于SEQ ID NO: 1309、SEQ ID NO: 1310、SEQ ID NO: 1311的位置11、16或19的氨基酸或SEQ ID NO: 1312的位置11和19两者的氨基酸的侧链。
在本发明的某些实施方案中，4类肽包含SEQ ID NOs: 1362、1364-1367、和 1371的任何的氨基酸序列。
改善溶解性的修饰
4类肽可以进一步修饰以改善肽在生理pH下在水溶液中的溶解性，同时在一些方面保留胰高血糖素拮抗剂活性。在对应于天然肽的位置1、16、17、20、21、24和29或C末端的位置处引入亲水基团可以改善所得的4类肽在具有生理pH的溶液中的溶解性，同时保留亲本化合物拮抗剂活性。因此，在一些实施方案中，本文公开的4类肽进一步修饰以包含共价连接至对应于天然胰高血糖素肽的氨基酸位置1、16、17、20、21、24和29或N或C末端氨基酸的氨基酸的侧链的一个或多个亲水基团。在进一步的实施方案中，对应于天然胰高血糖素肽的氨基酸位置16和24的氨基酸的侧链共价结合至亲水基团，且在一些实施方案中，亲水基团是聚乙二醇（PEG）。
申请人已发现天然胰高血糖素可以通过在其羧基末端引入电荷来修饰以增强肽的溶解性同时保留肽的激动剂特性。增强的溶解性允许在接近中性pH处制备和储存胰高血糖素溶液。在相对中性pH（例如约6.0至约8.0的pH）配制胰高血糖素溶液改善4类肽的长期稳定性。
而且，申请人预期本文公开的4类肽可以类似地修饰以增强它们在相对中性的pH（例如约6.0至约8.0的pH）的水溶液中的溶解性，同时保留亲本蛋白的拮抗剂特性。因此，本发明的一些实施方案涉及SEQ ID NO: 1339的4类肽，其已通过用带电荷的氨基酸取代天然的不带电荷的氨基酸或者添加带电荷的氨基酸至羧基末端来相对于野生型胰高血糖素(SEQ ID NO: 1301)的位置6-29存在天然氨基酸进一步修饰，以添加电荷至肽。根据一些实施方案，SEQ ID NO: 1339的4类肽的不带电荷的天然氨基酸的一个至三个被带电荷的氨基酸替代。在一些实施方案中，带电荷的氨基酸选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。更具体而言，申请人已发现相对于天然胰高血糖素的对应位置28和/或29用带电荷的氨基酸取代通常存在的氨基酸、和/或在4类肽的羧基末端添加一个至两个带电荷的氨基酸，增强4类肽在水溶液中在生理学相关pH（即约6.5至约7.5的pH）下的溶解性和稳定性。因此，本文公开的4类肽的此类修饰预期具有对在水溶液中（尤其在范围约5.5至约8.0的pH下）的溶解性的相似作用，同时保留亲本肽的生物活性。
根据一些实施方案，SEQ ID NO: 1339的4类肽通过在相对于天然胰高血糖素的对应位置28和/或29用带负电荷的氨基酸（例如天冬氨酸或谷氨酸）取代天然氨基酸和任选地添加带负电荷的氨基酸（例如天冬氨酸或谷氨酸）至肽的羧基末端来修饰。在可选的实施方案中，SEQ ID NO: 1339的4类肽通过在相对于天然胰高血糖素的对应位置29用带正电荷的氨基酸（例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸）取代天然氨基酸和任选地添加一个或两个带正电荷的氨基酸（例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸）至肽的羧基末端来修饰。根据一些实施方案，提供具有改善的溶解性和稳定性的4类肽，其中肽包含SEQ ID NO: 1341的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO: 1341的位置23或24的至少一个氨基酸被酸性氨基酸所取代和/或一个额外的酸性氨基酸被添加至SEQ ID NO: 1341的羧基末端。在一些实施方案中，酸性氨基酸独立地选自Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸。
根据一些实施方案，提供具有改善的溶解性和稳定性的4类肽，其中所述拮抗剂包含SEQ ID NO: 1341、SEQ ID NO: 1342、SEQ ID NO: 1343 或SEQ ID NO: 1344的氨基酸序列，其中位置23或24的至少一个氨基酸被非天然氨基酸残基取代（即，在类似物的位置23或24存在的至少一个氨基酸为与SEQ ID NO: 1307中对应位置存在的氨基酸不同的酸性氨基酸）。根据一些实施方案，提供包含SEQ ID NO: 1341或1342的序列的胰高血糖素激动剂，条件是当位置23的氨基酸为天冬酰胺且位置24的氨基酸为苏氨酸，所述肽进一步包含添加至4类肽的羧基末端的独立地选自Lys、Arg、His、Asp或Glu的一个至两个氨基酸。
在另一个实施方案中，SEQ ID NO: 1342的4类肽的溶解性可以通过共价连接亲水部分至位置11、12、15、16、19 或24的氨基酸残基来改善，且在一些实施方案中，亲水部分连接至位置11、16或19的氨基酸，且在进一步的实施方案中，亲水部分连接至氨基酸19。在一些实施方案中，亲水部分是血浆蛋白或免疫球蛋白的Fc部分，且在可选的实施方案中，亲水部分是亲水性烃链。在一些实施方案中，亲水部分是聚乙二醇，其具有选自范围约1,000至约5,000道尔顿的分子量。在另一个实施方案中，亲水部分是聚乙二醇，其具有约20,000道尔顿的分子量。在一些实施方案中，聚乙烯修饰的4类肽包含SEQ ID NO: 1309、SEQ ID NO: 1310、SEQ ID NO: 1311、SEQ ID NO: 1312、SEQ ID NO: 1343、SEQ ID NO: 1344 或SEQ ID NO: 1345的氨基酸序列。
改善稳定性的修饰
天然胰高血糖素的位置15-16的Asp-Ser序列已鉴定为导致天然激素在含水缓冲液中的过早化学切割的独特的不稳定的二肽。例如，当在37℃下在0.01N HCl中保持2周时，超过50％的天然胰高血糖素可能被切成片段。两种释放的切割肽1-15和16-29缺乏胰高血糖素样生物活性，且因此代表对胰高血糖素及其相关类似物的含水预制剂的限制。已观察到天然胰高血糖素肽的位置15的Asp被Glu的选择性化学取代实质上消除了15-16肽键的化学切割。
因此，预期本发明的4类肽可以类似地修饰以降低它们对水溶液中的过早(premature)化学切割的易感性。根据一些实施方案，本文描述的4类肽可以进一步修饰以增强它们在水溶液中的稳定性，其通过用选自半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸的氨基酸代替位于天然胰高血糖素肽的位置15的天然天冬氨酸氨基酸。根据一些实施方案，SEQ ID NO: 1339的4类肽的位置10的天冬氨酸残基可以被选自半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸的氨基酸取代，且在一些实施方案中，SEQ ID NO: 1339的位置10的天然天冬氨酸被谷氨酸取代。根据一些实施方案，提供具有在水溶液中改善的稳定性的4类肽，其中拮抗剂包含选自SEQ ID NO: 1336、SEQ ID NO: 1340和SEQ ID NO: 1342的序列。在进一步的实施方案中，4类肽是酰胺化的。
根据一些实施方案，借助于本文描述的4类肽的降解降低的增加的稳定性也可以通过位置16的丝氨酸（根据天然胰高血糖素的编号）被谷氨酸、半胱磺酸、高谷氨酸或高半胱磺酸取代来实现。在特定实施方案中，位置16的丝氨酸（根据天然胰高血糖素序列编号）被谷氨酸取代。在更特定的实施方案中，包含此类修饰的4类肽包含C末端羧基且未被酰胺化。
根据一些实施方案，提供4类肽，其包含选自以下的胰高血糖素肽：SEQ ID NO: 1307、SEQ ID NO: 1336、SEQ ID NO: 1339、SEQ ID NO: 1340、SEQ ID NO: 1341、SEQ ID NO: 1342、SEQ ID NO: 1343和SEQ ID NO: 1344，进一步通过在对应于天然胰高血糖素肽的位置11、12、15、16、19和/或24的位置处的一个或多个额外氨基酸取代修饰，其中氨基酸取代包含用具有适合与亲水部分（包括例如PEG）交联的侧链的氨基酸的取代。肽可以被天然存在的氨基酸或合成的（非天然存在的）氨基酸所取代。合成的或非天然存在的氨基酸指这样的氨基酸，其在体内不天然存在，但尽管如此，其可以引入到本文描述的肽结构中。在一些实施方案中，提供4类肽，其中所述肽包含SEQ ID NO: 1307、SEQ ID NO: 1336、SEQ ID NO: 1339、SEQ ID NO: 1340、SEQ ID NO: 1341、SEQ ID NO: 1342、SEQ ID NO: 1343和SEQ ID NO: 1344的序列，且进一步包含连接至天然胰高血糖素肽的对应位置21或24的聚乙二醇链。在进一步的实施方案中，修饰4类肽的C末端以用酰胺基替代羧酸基团。
融合肽和缀合物
本公开还包括4类肽融合肽，其中第二肽已融合至4类肽的C末端。更具体而言，融合体可以包含SEQ ID NO: 1344的4类肽肽，其进一步包含连接至4类肽的C末端氨基酸的SEQ ID NO: 1319 (GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO: 1320 (Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala ) 或SEQ ID NO: 1321 (Lys Arg Asn Arg)的氨基酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO: 1319 (GPSSGAPPPS)的氨基酸序列经肽键连接至SEQ ID NO: 1342的4类肽的氨基酸24。在另一实施方案中，融合肽包含SEQ ID NO: 1307、SEQ ID NO: 1336、SEQ ID NO: 1339、SEQ ID NO: 1340、SEQ ID NO: 1341 或SEQ ID NO: 1343的4类肽，其进一步包含连接至4类肽的氨基酸24的SEQ ID NO: 1319 (GPSSGAPPPS)的氨基酸序列。在另一实施方案中，融合肽包含SEQ ID NO: 1307、SEQ ID NO: 1336、SEQ ID NO: 1337、SEQ ID NO: 1338、SEQ ID NO: 1339、SEQ ID NO: 1341 或SEQ ID NO: 1343的4类肽，其进一步包含连接至4类肽的氨基酸24的SEQ ID NO: 1320、SEQ ID NO: 1321 或SEQ ID NO: 1353的氨基酸序列。在一些实施方案中，4类肽融合肽包含选自SEQ ID NO: 1346和SEQ ID NO: 1347的序列。在进一步的实施方案中，修饰融合肽的C末端以用酰胺基替代羧酸基团。
在一些实施方案中，提供4类肽融合肽，其中所述融合肽的4类肽部分选自SEQ ID NO: 1303、SEQ ID NO: 1304、SEQ ID NO: 1305、SEQ ID NO: 1306、SEQ ID NO: 1307、SEQ ID NO: 1308、SEQ ID NO: 1309、SEQ ID NO: 1311、SEQ ID NO: 1312、SEQ ID NO: 1313、SEQ ID NO: 1314、SEQ ID NO: 1315、SEQ ID NO: 1310、SEQ ID NO: 1316、SEQ ID NO: 1317、SEQ ID NO: 1318和SEQ ID NO: 1339，且SEQ ID NO: 1319的序列融合至4类肽部分的羧基末端，且其中PEG链当存在时选自范围500至40,000道尔顿。更具体而言，在一些实施方案中，4类肽区段选自SEQ ID NO: 1313、SEQ ID NO: 1314、SEQ ID NO: 1315、SEQ ID NO: 1316、SEQ ID NO: 1346和SEQ ID NO: 1347，其中PEG链选自范围约500至约5,000道尔顿，且更具体而言，在一些实施方案中，PEG链为约1,000道尔顿。在进一步的实施方案中，修饰C末端以用酰胺基替代羧酸基团。
4类肽可以进一步包含添加至羧基末端的一至两个带电荷的氨基酸。在一些实施方案中，其中将一个至两个带电荷的氨基酸添加至SEQ ID NO: 1344的羧基末端，氨基酸为带负电荷的氨基酸，包括例如谷氨酸和天冬氨酸。在一些实施方案中，4类肽包含SEQ ID NO: 1342的序列，其中相对于天然胰高血糖素肽的对应位置27和28中的至少一个包含选自天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸，且其中SEQ ID NO: 1342任选修饰以包括添加至羧基末端的一至两个带负电荷的氨基酸的添加。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸为谷氨酸或天冬氨酸。
本文公开的4类肽可以与其他活性试剂组合，包括例如胰岛素，以治疗特征在于过度胰高血糖素活性的疾病或病况。在一些实施方案中，已修饰以共价连接至具有大于10,000道尔顿的分子量的PEG链的4类肽可以与胰岛素组合施用来帮助维持糖尿病患者中稳定的血糖水平。本公开的4类肽可以与胰岛素作为单一组合物共施用，作为分开的溶液同时施用，或可选地，胰岛素和4类肽可以彼此在不同时间施用。在一些实施方案中，包含胰岛素的组合物和包含4类肽的组合物在彼此12小时内施用。4类肽相对于施用的胰岛素的准确比率将部分取决于测定患者的胰高血糖素水平，且可以经常规实验确定。
二聚体肽
本公开还包括本文公开的修饰的4类肽的多聚体。两个或多个修饰的4类肽使用标准连接剂和本领域技术人员已知的程序连接在一起。例如，二聚体可以经使用双功能巯基交联剂和双功能胺交联剂在两个修饰的4类肽之间形成，尤其是对于已被半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸或乙酰苯丙氨酸残基取代（在例如位置11、16或19）的4类肽(例如SEQ ID NO: 1309、SEQ ID NO: 1310、SEQ ID NO: 1311和SEQ ID NO: 1312)。二聚体可以为同二聚体或可选地为异二聚体。在一些实施方案中，二聚体在独立地选自SEQ ID NO: 1308、SEQ ID NO: 1309、SEQ ID NO: 1310、SEQ ID NO: 1311、SEQ ID NO: 1312、SEQ ID NO: 1345、SEQ ID NO: 1346、或SEQ ID NO: 1347的两个4类肽之间形成，其中两个肽经连接至各个肽的位置11、各个肽的位置16、或各个肽的位置19或其任何组合的接头彼此连接。在一些实施方案中，连接是各4类肽的Cys11与Cys11或Cys19与Cys19或Cys11与Cys19残基之间的二硫键。
类似地，二聚体可以在独立地选自SEQ ID NO: 1303、SEQ ID NO: 1304、SEQ ID NO: 1305、SEQ ID NO: 1306、SEQ ID NO: 1307、SEQ ID NO: 1308、SEQ ID NO: 1309、SEQ ID NO: 1310、SEQ ID NO: 1311、SEQ ID NO: 1312、SEQ ID NO: 1336、SEQ ID NO: 1337、SEQ ID NO: 1338、SEQ ID NO: 1339和SEQ ID NO: 1342的两个4类肽肽之间形成，其中所述连接在独立地选自关于天然胰高血糖素肽的位置16、21和24的氨基酸位置之间形成。
根据一些实施方案，提供包含两个4类肽的4类肽二聚体，各自包含SEQ ID NO: 1346的序列，其中两个拮抗剂通过经氨基酸位置25的二硫键彼此连接。在另一实施方案中，提供包含两个4类肽的4类肽二聚体，各自包含SEQ ID NO: 1347的序列，其中两个拮抗剂通过经氨基酸位置35的二硫键彼此连接。在一些实施方案中，从SEQ ID NO: 1346和SEQ ID NO: 1347的4类肽形成二聚体，其中位置10的氨基酸为谷氨酸。
在一些实施方案中，二聚体包含选自SEQ ID NO: 1307、SEQ ID NO: 1308、SEQ ID NO: 1336、SEQ ID NO: 1337、SEQ ID NO: 1340、SEQ ID NO: 1339、NO: 1340、SEQ ID NO: 1341、SEQ ID NO: 1342的4类肽融合肽和所述4类肽的药学上可接受的盐的同二聚体。根据一些实施方案，提供包含经接头连接至第二4类肽的第一4类肽的二聚体，其中二聚体的所述第一和第二肽独立地选自SEQ ID NO: 1307、SEQ ID NO: 1308、SEQ ID NO: 1336、SEQ ID NO: 1337、SEQ ID NO: 1339、SEQ ID NO: 1340、SEQ ID NO: 1341 、和 SEQ ID NO: 1342和所述胰高血糖素多肽的药学上可接受的盐。在另一实施方案中，二聚体的第一和第二4类肽独立地选自SEQ ID NO: 1307、SEQ ID NO: 1308、SEQ ID NO: 1336和SEQ ID NO: 1339。
在另一实施方案中，二聚体包含选自SEQ ID NO: 1323、SEQ ID NO: 1324、SEQ ID NO: 1325、SEQ ID NO: 1326、SEQ ID NO: 1327、SEQ ID NO: 1328、SEQ ID NO: 1329、SEQ ID NO: 1330、SEQ ID NO: 1331的4类肽的同二聚体。在另一实施方案中，提供4类肽，其中二聚体的第一和第二肽包含独立地选自SEQ ID NO: 1323、SEQ ID NO: 1324、SEQ ID NO: 1325、SEQ ID NO: 1326、SEQ ID NO: 1327和SEQ ID NO: 1328的氨基酸序列。在另一实施方案中，二聚体包含选自SEQ ID NO: 1309、SEQ ID NO: 1311和SEQ ID NO: 1312的4类肽的同二聚体，其中肽进一步包含共价连接至胰高血糖素肽的位置11或19的聚乙二醇链。
4类胰高血糖素相关肽可以包含SEQ ID NOs: 1301-1371的任一的氨基酸序列，任选具有高至1、2、3、4或5个保留胰高血糖素拮抗剂活性的进一步修饰。
5类胰高血糖素相关肽
在某些实施方案中，胰高血糖素相关肽为5类胰高血糖素相关肽（参见例如国际（PCT）专利申请号PCT/US2008/081333，其通过引用整体并入）。
以下部分(SEQ ID NOs: 1401-1518)中提及的所有生物序列对应于国际专利申请号PCT/US2008/081333中的SEQ ID NOs: 1-118。
活性
在某些方面，5类胰高血糖素相关肽（下文称为“5类肽”）可以是胰高血糖素拮抗剂/GLP-1激动剂。在许多情形下利用胰高血糖素拮抗剂/GLP-1拮抗剂，在所述情形中期望胰高血糖素激动作用的抑制同时还期望GLP-1活性的同时刺激。例如，胰高血糖素拮抗剂活性连同GLP-1刺激可以用于治疗糖尿病，其中胰高血糖素拮抗作用已在高血糖症的临床前模型中证实产生降低血糖，和GLP-1活性与胰岛素产生相关。证实GLP-1活性的化合物也已知可用于治疗肥胖症和预防体重增加。
在某些方面中，5类肽据信对于之前已对其他胰高血糖素拮抗剂/GLP-1激动剂描述的任何用途均是合适的。这两种活性已单独显示是治疗代谢性综合征特别是糖尿病和肥胖症高度期望的特性。胰高血糖素拮抗剂活性可用于其中期望抑制胰高血糖素激动作用的任何情形中。GLP-1激动作用的存在进一步抑制胰高血糖素从胰脏的内源性分泌同时刺激胰岛素合成和分泌。两种药物作用以协同方式起作用来使代谢异常正常化。因此，5类肽可用于治疗高血糖症，或治疗其他代谢性疾病，所述代谢性疾病由胰高血糖素的高血液水平或高血糖水平导致。根据一些实施方案，待使用胰高血糖素拮抗剂/GLP-1激动剂诸如本文公开的5类肽治疗的患者为家养动物，和在另一实施方案中，待治疗患者为人。研究表明在糖尿病患者中缺少胰高血糖素抑制部分经加速的糖原分解促进餐后高血糖。在存在或不存在生长抑素诱导的胰高血糖素抑制的情况下，在口服葡萄糖耐量试验（OGTT）过程中的血糖分析已显示具有更高胰高血糖素水平的主体中显著的葡萄糖增加。因此，本文描述的胰高血糖素拮抗剂/GLP-1激动剂或5类肽可以用于治疗高血糖症，且预期可用于治疗多种类型的糖尿病，包括I型糖尿病、II型糖尿病或妊娠糖尿病，无论是胰岛素依赖型或非胰岛素依赖型，和降低包括肾病、视网膜病和血管疾病的糖尿病并发症。
此类用于降低食欲或促进体重减轻的方法预期可用于降低体重，预防体重增加或治疗多种原因的肥胖症，包括药物诱导的肥胖症，和降低与肥胖相关的并发症，包括血管疾病（冠心病、中风、外周血管疾病、局部缺血再灌注等）、高血压、II型糖尿病发生、高脂血症和肌肉骨骼疾病。
包含5类肽的药物组合物可以配制并施用于患者，其使用本领域技术人员已知的标准的药学上可接受的载体和施用途径。因此，本公开还包括包含本文公开的一种或多种5类肽组合有药学上可接受的载体的药物组合物。药物组合物可以包含5类肽作为唯一的药学活性组分，或5类肽可以与一种或多种额外活性剂组合。根据一些实施方案，提供包含5类肽和胰岛素或胰岛素类似物的组合物。可选地，可以提供提供用于诱导体重减轻或预防体重增加的组合物，其包含SEQ ID NO: 1415 或SEQ ID NO: 1451的序列，进一步包含连接至SEQ ID NO: 1415 或SEQ ID NO: 1451的氨基酸24的SEQ ID NO: 1421 (GPSSGAPPPS) 或SEQ ID NO: 1450的氨基酸序列和抗肥胖症肽。合适的抗肥胖症肽包括美国专利5,691,309、6,436,435或美国专利申请20050176643中公开的那些。
5类肽结构
根据一些实施方案，提供包含胰高血糖素肽的5类肽，所述胰高血糖素肽已通过以下来修饰：缺失N末端的前1-5个氨基酸残基（例如，第一氨基酸、前两个氨基酸、前三个氨基酸、前四个氨基酸、前五个氨基酸），稳定化合物的C末端部分（根据野生型胰高血糖素SEQ ID NO: 1401的氨基酸编号，氨基酸位置12-29周围）中α螺旋结构，例如通过氢键键合或离子相互作用，诸如盐桥的形成或通过共价键将选自位置12和16、16和20、20和24、和24和28（相对于天然胰高血糖素肽序列）的氨基酸对的侧链彼此连接。可选地，残基12-29周围的α螺旋的稳定通过在保留期望活性的位置处引入一个或多个α,α-二取代氨基酸来实现。在一些实施方案中，5类肽或其类似物的位置16、17、18、19、20、21、24 或29（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的一个、两个、三个、四个或更多个被α,α-二取代氨基酸取代。例如，5类肽或其类似物的位置16（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）被氨基异丁酸（AIB）取代提供在不存在盐桥或内酰胺的情况下的稳定的α螺旋。在一些实施方案中，位置16、20、21或24（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的一个、两个、三个或更多被AIB所取代。
根据一些实施方案，提供5类肽，其中所述肽展示出由天然GLP-1对GLP-1受体实现的最大激动作用的至少80％，且展示出降低对胰高血糖素受体的最大胰高血糖素诱导的cAMP产生至少约50％的胰高血糖素拮抗剂活性，如在体外测定中通过cAMP产生所测量的。在一些实施方案中，5类肽展示出天然GLP-1对GLP-1受体的活性的至少90％，且展示出胰高血糖素拮抗剂活性，其降低对胰高血糖素受体的最大胰高血糖素诱导的cAMP产生至少约80％。
根据一些实施方案，5类肽包含SEQ ID NO: 1402的衍生肽，其中所述肽包含相对于SEQ ID NO: 1402在选自1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、19、22和24的一个至三个氨基酸位置的进一步氨基酸取代，且展示出天然GLP-1对GLP-1受体的活性的至少90％，且展示出胰高血糖素拮抗剂活性，其降低对胰高血糖素受体的最大胰高血糖素诱导的cAMP产生至少约80％。
在一些实施方案中，5类肽的C末端部分（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号的氨基酸12-29周围）中的α螺旋结构通过例如形成共价或非共价分子内桥、或用稳定α螺旋的氨基酸（例如α,α-二取代氨基酸）取代位置12-29周围的氨基酸和/或插入稳定α螺旋的氨基酸（例如α,α-二取代氨基酸）来稳定。在一些实施方案中，5类肽或其类似物的位置16、17、18、19、20、21、24 或29（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的一个、两个、三个、四个或更多个被α,α-二取代氨基酸例如氨基异丁酸（AIB）取代。例如，5类肽或其类似物的位置16（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）被氨基异丁酸（AIB）取代提供在不存在盐桥或内酰胺的情况下的稳定的α螺旋。
在一些实施方案中，5类肽包含SEQ ID NO:1415或SEQ ID NO:1451，和更具体而言，选自以下的序列：SEQ ID NO:1405、SEQ ID NO:1406、SEQ ID NO:1407、SEQ ID NO:1408、SEQ ID NO:1409、SEQ ID NO:1416、SEQ ID NO:1417、SEQ ID NO:1418、SEQ ID NO:1419、SEQ ID NO:1422、SEQ ID NO:1423、SEQ ID NO:1424、和SEQ ID NO:1425。在进一步的实施方案中，5类肽包含SEQ ID NO: 1415 或SEQ ID NO: 1451的衍生肽，其中所述肽包含相对于SEQ ID NO: 1415或SEQ ID NO: 1451在选自位置1、2、5、6、8、9、12、13和14的一至三个氨基酸位置处的进一步的氨基酸取代。在一些实施方案中，在位置1、2、5、6、8、9、12、13和14的取代是保守氨基酸取代。在一些实施方案中，SEQ ID NO: 1405 或SEQ ID NO: 1406的位置24的苏氨酸被甘氨酸取代。
根据一些实施方案，5类肽代表肽的进一步修饰，其中除了N末端缺失外，天然胰高血糖素肽的位置6的苯丙氨酸被修饰以例如包含羟基替代N末端氨基。在进一步的实施方案中，C末端氨基酸的天然羧酸被电荷中性的基团诸如酰胺或酯替代。
根据一些实施方案，已制备5类肽，其中天然胰高血糖素的前三至五个氨基酸已被缺失，相对于天然胰高血糖素肽的位置9的氨基酸已被选自谷氨酸、高谷氨酸、β-高谷氨酸、半胱氨酸的磺酸衍生物、或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸衍生物取代：
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4烯基、或C2-C4炔基，且胰高血糖素的C末端部分（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号的氨基酸12-29周围）中的α螺旋结构例如经相对于天然胰高血糖素肽在氨基酸12和16的侧链之间或在氨基酸16和20之间形成内酰胺桥来稳定。能够共价键合以形成七个原子的连接桥的氨基酸配对的实例在整个该公开内容中详述。在一些实施方案中，半胱氨酸的磺酸衍生物为半胱磺酸或高半胱磺酸。
在一些实施方案中，提供5类肽，其包含选自SEQ ID NO: 1405、SEQ ID NO: 1406、SEQ ID NO: 1407、或SEQ ID NO: 1408的氨基酸序列，其中所述肽包含在SEQ ID NO: 1405的氨基酸1和11的侧链之间、在SEQ ID NO: 1406的11和15之间、在SEQ ID NO: 1407的位置5和19之间和在SEQ ID NO: 1408的位置19和24之间形成的内酰胺环，所述序列的每一个进一步修饰以包含共价连接至肽的亲水部分。更具体而言，在一些实施方案中，携带内酰胺的5类肽的每一个通过共价连接聚乙二醇链来修饰。例如，对于包含SEQ ID NO: 1405的5类肽，所述肽在选自12、15、16、19和24的位置PEG化；对于包含SEQ ID NO: 1406的5类肽，所述肽在选自12、16、19和24的位置PEG化；对于包含SEQ ID NO: 1407的5类肽，所述肽在选自11、12、16和24的位置PEG化；对于包含SEQ ID NO: 1408的5类肽，所述肽在选自11、12、15和16的位置PEG化。根据一些实施方案，提供包含SEQ ID NO: 1447 或SEQ ID NO: 1448的5类肽，其中所述肽在相对于SEQ ID NO: 1447 或SEQ ID NO: 1448序列的选自12、16、19和24的位置PEG化。在进一步的实施方案中，SEQ ID NO: 1447 或SEQ ID NO: 1448的肽进一步通过添加SEQ ID NO: 1421的序列至所述肽的羧基末端来修饰。
如上详述，在某些方面中，提供5类肽，其中天然胰高血糖素的前五个氨基酸已被缺失，N末端氨基酸（苯丙氨酸）的氨基已被羟基替代（即，第一氨基酸为苯基-乳酸）且选自位置12和16、16和20、20和24、和24和28的一个或多个氨基酸对的侧链彼此连接，从而稳定5类肽的α螺旋。
根据一些实施方案，提供包含SEQ ID NO: 1402的序列的5类肽，所述序列已通过在SEQ ID NO: 1402的位置11（根据天然胰高血糖素的氨基酸编号的位置16）的丝氨酸残基被选自谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸、高半胱磺酸、苏氨酸或甘氨酸的氨基酸取代来修饰。根据一些实施方案，SEQ ID NO: 1402的位置11的丝氨酸残基被选自谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸和高半胱磺酸的氨基酸取代，和在一些实施方案中，丝氨酸残基被谷氨酸取代。根据一些实施方案，5类肽包含SEQ ID NO: 1438的序列。
根据一些实施方案，提供5类肽，其中在两个氨基酸侧链之间形成分子内桥以稳定SEQ ID NO: 1402的肽的羧基末端的三维结构。更具体而言，选自SEQ ID NO: 1402的氨基酸对7和11、11和15、15和19或19和23的一个或多个氨基酸的侧链彼此连接，从而稳定C末端部分中的α螺旋。两个侧链可以经氢键键合、离子相互作用诸如形成盐桥或通过共价键彼此连接。根据一些实施方案，接头的大小为7-9个原子，和在一些实施方案中，接头的大小为8个原子。在一些实施方案中，5类肽选自以下：SEQ ID NO:1405、SEQ ID NO:1406、SEQ ID NO:1407、和SEQ ID NO:1408。在一些实施方案中，5类肽的C末端氨基酸具有酰胺基替代存在于天然氨基酸的羧酸基团。
根据一些实施方案，提供5类肽，其中类似物包含SEQ ID NO: 1409的氨基酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO: 1409的肽的羧基末端的三维结构通过形成肽的侧链之间的共价键来稳定。在一些实施方案中，两个氨基酸侧链彼此结合形成内酰胺环。内酰胺环的大小可以根据氨基酸侧链的长度而不同，且在一些实施方案中，内酰胺通过连接赖氨酸氨基酸的侧链与谷氨酸侧链来形成。在一些实施方案中，5类肽的C末端氨基酸具有酰胺基替代存在于天然氨基酸的羧酸基团。
在内酰胺环中的酰胺键的次序可以反转（例如，内酰胺环可以在Lys12和Glu16的侧链之间或可选地在Glu12和Lys16之间形成）。根据一些实施方案，提供SEQ ID NO: 1409的胰高血糖素类似物，其中至少一个内酰胺环在选自SEQ ID NO: 1409的氨基酸对7和11、11和15、15和19或19和23的氨基酸对的侧链之间形成。在一些实施方案中，提供5类肽，其中所述肽包含SEQ ID NO: 1410的序列，所述序列进一步包含在SEQ ID NO: 1410的氨基酸位置7和11之间、或氨基酸位置11和15之间、或在氨基酸位置15和19之间形成的分子内内酰胺桥。在一些实施方案中，提供5类肽，其中所述肽包含SEQ ID NO: 1411的序列，所述序列进一步包含在SEQ ID NO: 1411的氨基酸位置7和11之间、或氨基酸位置11和15之间形成的分子内内酰胺桥。在一些实施方案中，5类肽包含SEQ ID NO: 1417的序列。
提供包含SEQ ID NO: 1405的衍生物的额外5类肽，其中SEQ ID NO: 1405的位置10（天然胰高血糖素的位置15）的天冬氨酸已被谷氨酸、具有以下通用结构的氨基酸所取代：
其中X6为C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基，和在一些实施方案中，X6为C1-C3烷基，和在另一实施方案中，C6为C2烷基。在一些实施方案中，提供SEQ ID NO: 1409的5类肽衍生物，其中SEQ ID NO: 1409的位置10（天然胰高血糖素的位置15）被选自谷氨酸、半胱磺酸、高半胱磺酸和高谷氨酸的氨基酸取代。在进一步的实施方案中，SEQ ID NO: 1409的位置10被选自以下的氨基酸取代：半胱磺酸或高半胱磺酸。在一些实施方案中，提供SEQ ID NO: 1406、SEQ ID NO: 1407 或SEQ ID NO: 1408的5类肽衍生物，其中SEQ ID NO: 1406、SEQ ID NO: 1407 或SEQ ID NO: 1408的位置10被选自谷氨酸、半胱磺酸、高半胱磺酸和高谷氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，5类肽的C末端氨基酸具有酰胺基替代存在于天然氨基酸的羧酸基团。
在一些实施方案中，5类肽的氨基酸被至少一个半胱氨酸残基取代，其中半胱氨酸残基的侧链进一步修饰有巯基反应试剂，包括例如马来酰亚胺、乙烯砜、2-吡啶基硫代(pyridylthio)、卤代烷基和卤代酰基。这些巯基反应试剂可以包含羧基、酮基、羟基和醚基以及其他亲水部分诸如聚乙二醇单元。在可选的实施方案中，5类肽的氨基酸被赖氨酸取代，且取代的赖氨酸残基的侧链进一步使用胺反应试剂诸如羧酸的活性酯（琥珀酰亚胺基、酐等）或亲水部分诸如聚乙二醇的醛来修饰。根据一些实施方案，对应于SEQ ID NO: 1405的肽的位置7的赖氨酸残基被精氨酸取代，和单一赖氨酸取代插入对应于SEQ ID NO: 1405的位置12、15、16、19和24的氨基酸之一。
在另一实施方案中，对应于本文公开的5类肽的位置22的甲硫氨酸残基改变为亮氨酸或正亮氨酸以防止肽的氧化降解。
此外，5类肽在一些方面还包括已知对于胰高血糖素类似物的功能不是关键的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，取代为在选自2、5、6、7、8、9、12、13、14、15、16、19、22、23 或24的一个、两个或三个位置处的保守氨基酸取代。在一些实施方案中，对应于天然胰高血糖素肽的位置16、17、20、21、24 或29的氨基酸且更具体而言在相对于天然胰高血糖素的位置21和/或24的氨基酸被半胱氨酸或赖氨酸取代，其中PEG链共价连接至取代的半胱氨酸或赖氨酸残基。
根据一些实施方案，提供包含由SEQ ID NO: 1409组成的序列的5类肽，其进一步通过在对应于肽的位置11、12、15、16、19和/或24的一个或多个额外氨基酸取代（包括例如被半胱氨酸取代）来修饰，其中氨基酸取代包含具有适合于与亲水部分包括例如PEG交联的侧链的氨基酸。天然胰高血糖素可以被天然存在的氨基酸或合成的（非天然存在的）氨基酸所取代。合成的或非天然存在的氨基酸指这样的氨基酸，其在体内不天然存在，但尽管如此，其可以引入到本文描述的肽结构中。在一些实施方案中，提供5类肽，其中所述肽包含SEQ ID NO: 1409的序列且进一步包含结合至肽的位置16或19的聚乙二醇链。在进一步的实施方案中，修饰胰高血糖素类似物的C末端以用酰胺基替代羧酸基团。
根据一些实施方案，提供5类肽，其包含选自以下的胰高血糖素类似物：
其中位置4的Xaa＝天冬氨酸、谷氨酸、半胱磺酸或高半胱磺酸，位置10的Xaa＝Asp、Glu、半胱磺酸、高半谷氨酸和高半胱磺酸，位置16的Xaa为Asp、Cys、Orn、高半胱氨酸或乙酰苯丙氨酸，且位置19的Xaa为Gln、Cys、Orn、高组氨酸和乙酰苯丙氨酸，位置22的Xaa＝Met、Leu或Nle，R1为OH或NH2，且R2为Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser (SEQ ID NO: 1421)、Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa (SEQ ID NO: 1450；其中Xaa为Cys、Orn、高半胱氨酸或乙酰苯丙氨酸）、COOH或CONH2，其中所述肽任选在SEQ ID NO: 1413的位置16、SEQ ID NO: 1414的位置19和SEQ ID NO: 1412的位置16和19处PEG化。在一些实施方案中，SEQ ID NOs: 1412-1414和1439的位置24的Thr被Gly取代。根据一些实施方案，肽包含SEQ ID NO: 13 或SEQ ID NO: 1414的序列，其中R1为OH。根据一些实施方案，肽包含SEQ ID NO: 1413 或SEQ ID NO: 1414的序列，其中R1为OH且R2为CONH2。根据一些实施方案，肽包含SEQ ID NO: 1413 或SEQ ID NO: 1414的序列，其中R1为OH，R2为CONH2且位置24的苏氨酸被甘氨酸取代。
在一些实施方案中，进一步修饰5类肽以包含天然GLP-1的一个或多个氨基酸，其通过在对应的氨基酸位置取代天然胰高血糖素残基。例如，5类肽可以包含在位置2、3、17、18、21、23、和 24（根据天然胰高血糖素的氨基酸编号）的任一的一个或多个氨基酸取代。在特定的实施方案中，通过以下氨基酸修饰中的一个或多个修饰5类肽：Ser2被Ala替代，Gln3被Glu替代，Arg17被Gln替代，位置18的Arg被Ala替代，位置21的Asp被Glu替代，位置23的Val被Ile替代，和位置24的Gln被Ala替代（氨基酸位置根据天然胰高血糖素序列）。在特定的实施方案中，通过用Ala替代Ser2和用Glu替代Gln3来修饰5类肽（根据天然胰高血糖素的氨基酸编号）。在另一特定实施方案中，用以下氨基酸取代的全部修饰5类肽：Arg17被Gln替代，位置18的Arg被Ala替代，位置21的Asp被Glu替代，位置23的Val被Ile替代，和位置24的Gln被Ala替代（根据天然胰高血糖素的氨基酸编号）。在仍另一特定实施方案中，修饰5类肽以包含仅位置21的Glu（根据SEQ ID NO: 1401的编号）。因此，5类肽可以包含以下任一种的氨基酸序列：SEQ ID NOs: 1460-1470、1473-1478、1480-1488、1490-1496、1503、1504、1506、和 1514-1518。
本文还提供5类肽或其缀合物，其包含（1）经本文描述的方法的稳定的α螺旋（例如，经分子内桥、或掺入一个或多个α,α-二取代氨基酸、或位置16的酸性氨基酸（根据SEQ ID NO :1401的编号）、或其组合；（2）C末端酰胺或酯替代C末端羧基，和（3）A-B-C的通用结构，
其中A选自
（i）苯基乳酸（PLA）；
（ii）PLA的氧基衍生物；和
（iii）2-6个氨基酸的肽，其中肽的两个连续氨基酸经酯或醚键连接；
其中B代表SEQ ID NO: 1401的氨基酸p-26，其中p为3、4、5、6或7，任选地包含如本文所述的一个或多个氨基酸修饰，包括例如对于5类肽描述的任何修饰。例如，一个或多个修饰可以选自：
（iv）位置9（根据SEQ ID NO: 1401的氨基酸编号）的Asp被Glu、Cys的磺酸衍生物、高谷氨酸、β-高谷氨酸、或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸衍生物取代：
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基；
（v）位置10、20和24（根据SEQ ID NO: 1401的氨基酸编号）的一个或两个氨基酸被经酯、醚、硫醚、酰胺或烷基胺连接共价连接至酰基或烷基的氨基酸取代；
（vi）位置16、17、20、21、和 24（根据SEQ ID NO: 1401的氨基酸编号）的一个或两个氨基酸被选自以下的氨基酸取代：Cys、Lys、鸟氨酸、高半胱氨酸和乙酰苯丙氨酸（Ac-Phe），其中该组的氨基酸共价连接至亲水部分；
（vii）位置15（根据SEQ ID NO: 1401的编号）的Asp被半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸取代；
（viii）位置16（根据SEQ ID NO: 1401的编号）的Ser被半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸取代；
（ix）位置17的Arg被Gln替代，位置18的Arg被Ala替代，位置21的Asp被Glu替代，位置23的Val被Ile替代，和位置24的Gln被Ala替代（根据SEQ ID NO: 1401的氨基酸编号）；
（x）位置16的Ser被Glu替代，位置20的Gln被Glu替代，或位置24的Gln被Glu替代（根据SEQ ID NO: 1401的氨基酸编号）；
其中（通用结构A-B-C的）C选自：
（vii）X；
（viii）X-Y；
（ix）X-Y-Z；
（x）X-Y-Z-R10；
其中X为Met、Leu、或Nle；Y为Asn或带电荷的氨基酸；Z为Thr、Gly、Cys、Lys、鸟氨酸（Orn）、高半胱氨酸、乙酰苯丙氨酸(Ac-Phe)、或带电荷的氨基酸；其中R10选自SEQ ID NOs: 1421、1426、1427、和 1450。
在特定方面中，肽包含PLA的氧基衍生物。如本文所用，“PLA的氧基衍生物”指包含PLA的修饰结构的化合物，其中羟基已被O-R11取代，其中R11为化学基团。在这方面，PLA的氧基衍生物可以例如是PLA的酯或PLA的醚。
制备PLA的氧基衍生物的方法是本领域已知的。例如，当氧基衍生物为PLA的酯时，酯可以通过PLA的羟基与具有亲核基团的羰基反应后形成。亲核基团可以是任何合适的亲核基团，包括但不限于胺或羟基。因此，PLA的酯可以包含式IV的结构：
式IV
其中R7为PLA的羟基与具有亲核基团的羰基反应后形成的酯。
具有亲核基团（其与PLA的羟基反应以形成酯）的羰基可以是例如羧酸、羧酸衍生物、或羧酸的活化的酯。羧酸衍生物可以是但不限于酰基氯、酸酐、酰胺、酯、或腈。羧酸的活化的酯可以是例如N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、甲苯磺酸酯（Tos）、碳二亚胺、或六氟磷酸酯。在一些实施方案中，碳二亚胺是1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)、1,1'-羰基二咪唑(CDI)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸化物(EDC)、或1,3-二异丙基碳二亚胺(DICD)。在一些实施方案中，六氟磷酸酯选自六氟磷酸酯苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)磷六氟磷酸酯(BOP)、苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷六氟磷酸酯(PyBOP)、2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(HATU)、和o-苯并三唑-N,N,N’,N’-四甲基-脲鎓-六氟-磷酸酯(HBTU)。
从与羟基（例如PLA的羟基）反应制备醚的方法也是本领域已知的。例如，PLA的羟基可以与卤代烷基或甲苯磺酰化烷基醇反应以形成醚键。
在特定的实施方案中，经含氧键（例如经醚或酯键）结合至PLA的化学基团是聚合物（例如聚乙二醇）、碳水化合物、氨基酸、肽、或脂质，例如脂肪酸或类固醇。
在特定的实施方案中，化学基团是氨基酸，其任选地为肽的一部分，从而使式IV为缩肽。在这方面，PLA可以在除肽的N末端氨基酸残基外的位置，从而使得肽包含至N末端至PLA残基的一个或多个（例如1、2、3、4、5、6或更多）氨基酸。例如，肽可以包含位置n的PLA，其中n为肽的2、3、4、5或6。
N末端至PLA残基的氨基酸可以是合成的或天然存在的。在特定实施方案中，作为N末端PLA的氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，作为PLA的N末端的氨基酸是天然胰高血糖素的N末端氨基酸。例如，肽可以在N末端包含SEQ ID NOs: 1452-1456的任何的氨基酸序列，其中PLA经酯键连接至苏氨酸：
。
在可选的实施方案中，一个或多个N末端氨基酸可以被除天然胰高血糖素的氨基酸之外的氨基酸取代。例如，当肽包含PLA作为位置5或6的氨基酸时，位置1和/或位置2的氨基酸可以是降低对由二肽基肽酶IV的切割的易感性的氨基酸。更具体而言，在一些实施方案中，肽的位置1为选自以下的氨基酸：D-组氨酸、α,α-二甲基咪唑(imidiazole)乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸和高组氨酸。更具体而言，在一些实施方案中，拮抗剂/激动剂肽的位置2为选自以下的氨基酸：D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸（AIB）。此外例如，当肽包含PLA作为位置4、5或6的氨基酸时，肽的位置3的氨基酸可以是谷氨酸，与天然胰高血糖素的天然谷氨酰胺残基相反。在本发明的示例性实施方案中，肽在N末端包含SEQ ID NOs: 1457-1459的任何的氨基酸序列。
关于包含式IV的化合物的肽，聚合物可以是任何聚合物，条件是其可以与PLA的羟基反应。聚合物可以是天然或通常包含具有亲核基团的羰基的聚合物。可选地，聚合物可以是衍生化以包含具有羰基的羰基。聚合物可以是以下任何的衍生化的聚合物：聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烃和它们的衍生物，包括聚烷撑乙二醇、聚亚烷基氧化物、聚亚烷基对苯二酸酯(terepthalates)、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物，包括聚（甲基丙烯酸甲酯）、聚（甲基丙烯酸乙酯）、聚（甲基丙烯酸丁酯）、聚（甲基丙烯酸异丁酯）、聚（甲基丙烯酸己酯）、聚（甲基丙烯酸异癸酯）、聚（甲基丙烯酸月桂酯）、聚（甲基丙烯酸苯酯）、聚（丙烯酸甲酯）、聚（丙烯酸异丙酯）、聚（丙烯酸异丁酯）、和聚（十八烷基丙烯酸酯）、聚乙烯基聚合物包括聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚（乙酸乙烯酯）、和聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯和其共聚物，纤维素包括烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟基-丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羧乙基纤维素、三乙酸纤维素和纤维素硫酸钠盐、聚丙烯、聚乙烯包括聚（乙二醇）、聚（环氧乙烷）和聚（对苯二甲酸乙二醇酯）、以及聚苯乙烯。
聚合物可以是生物可降解聚合物，包括合成的生物可降解聚合物（例如乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酐、聚（正）酯、聚氨酯、聚（丁酸(butic acid)）、聚（戊酸）、和丙交酯-己内酯共聚物），和天然可降解聚合物（例如，藻酸盐和其他多糖包括葡聚糖和纤维素、胶原、其化学衍生物（取代、添加化学基团，例如，烷基、亚烷基，羟基化，氧化，和本领域技术人员常规进行的其他修饰）、白蛋白和其他亲水蛋白（例如，玉米蛋白和其他谷醇溶蛋白和疏水蛋白）），以及其任何共聚物或混合物。通常，这些材料通过酶促水解或体外暴露于水通过表面侵蚀或本体溶蚀而降解。
聚合物可以是生物粘附聚合物，诸如由H. S. Sawhney，C. P. Pathak和J. A. Hubbell在Macromolecules，1993，26，581-587中描述的生物蚀解的水溶胶，其教导并入本文，聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酐、聚丙烯酸、藻酸盐、壳聚糖、聚（甲基丙烯酸甲酯）、聚（甲基丙烯酸乙酯）、聚（甲基丙烯酸丁酯）、聚（甲基丙烯酸异丁酯）、聚（甲基丙烯酸己酯）、聚（甲基丙烯酸异癸酯）、聚（甲基丙烯酸月桂酯）、聚（甲基丙烯酸苯基酯）、聚（丙烯酸甲酯）、聚（丙烯酸异丙酯）、聚（丙烯酸异丁酯）和聚（丙烯酸十八酯）。
在一些实施方案中，聚合物是水溶性聚合物。合适的水溶性聚合物是本领域已知的其包括例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素（HPC；Klucel）、羟丙基甲基纤维素（HPMC；Methocel）、硝基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羟丙基丁基纤维素、羟丙基戊基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素（Ethocel）、羟乙基纤维素、各种烷基纤维素和羟烷基纤维素、各种纤维素醚、醋酸纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、乙酸乙烯酯/巴豆酸共聚物、聚甲基丙烯酸羟烷基酯、羟甲基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、马来酸酐/甲基乙烯基醚共聚物、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠和钙、聚丙烯酸、酸性羧基聚合物、羧基聚亚甲基、羧基乙烯基聚合物、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物、羧甲基酰胺、甲基丙烯酸钾二乙烯基苯共聚物、聚乙二醇、聚环氧乙烷及其衍生物、盐和组合。
在特定实施方案中，聚合物为聚烷撑乙二醇包括例如聚乙二醇（PEG）。
碳水化合物可以是任何碳水化合物，条件是其包含或者制备以包含具有α离去基团的羰基。碳水化物例如可以是已衍生化以包含具有α离去基团的羰基的碳水化合物。在这方面，碳水化合物可以是以下的衍生形式：单糖（例如葡萄糖、半乳糖、果糖）、二糖（例如蔗糖、乳糖、麦芽糖）、寡糖（例如棉子糖、水苏糖）、多糖（淀粉、淀粉酶、支链淀粉、纤维素、壳多糖、胼胝质、昆布多糖、木聚糖、甘露聚糖、岩藻多糖、半乳甘露聚糖。
脂质可以是任何包含羰基和α离去基团的脂质。例如，脂质可以是衍生化以包含羰基的脂质。在这方面，脂质可以是以下的衍生物：脂肪酸（例如，C4-C30脂肪酸、类花生酸、前列腺素、白细胞三烯、血栓烷、N-酰基乙醇胺）、甘油脂（如，单、二、三取代的甘油）、甘油磷脂（例如，磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸）、鞘脂（如，鞘氨醇、神经酰胺）、甾醇脂（如，类固醇、胆固醇）、异戊烯醇脂质、糖脂质、或聚酮化合物。
油、蜡、胆固醇、甾醇、脂溶性维生素、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂。
在一些实施方案中，R7具有约100 kDa或更低，例如约90 kDa或更低、约80 kDa或更低、约70 kDa或更低、约60 kDa或更低、约50 kDa或更低、约40 kDa或更低的分子量。因此，R7可以具有约35 kDa或更低，约30 kDa或更低、约25 kDa或更低、约20 kDa或更低、约15 kDa或更低、约10 kDa或更低、约5 kDa或更低、或约1 kDa的分子量。
在可选的实施方案中，包含通用结构A-B-C的肽包含2-6个氨基酸的肽作为A，其中A的肽的两个连续氨基酸经酯或醚键连接。酯键或醚键可以在例如氨基酸2-3、3-4、4-5或5-6之间。任选地，A的肽可以进一步通过与另一化学基团共价连接，包括连接至聚合物（例如亲水聚合物）、烷基化或酰化。
在一些实施方案中，上述包含PLA的5类肽经修饰以包含PLA的氧基衍生物，诸如例如PLA的酯或PLA的醚。例如，5类肽可以包含SEQ ID NOs: 1402、1405-1420、1422-1425、1432-1436、1438、1439、1445、1446、和 1451的任一者的氨基酸序列，其中PLA经酯键或醚键连接至氨基酸、肽、聚合物、酰基或烷基。氨基酸、肽、聚合物、酰基或烷基可以为本文所讨论的那些的任一种。在PLA经酯键连接至氨基酸或肽的情况下，5类肽可以认为是缩肽。
而且，在另一特定实施方案中，缺少PLA的上述5类肽修饰以包含N末端至位置7的氨基酸（根据天然胰高血糖素的编号）的两个连续氨基酸之间的至少一个酯键或醚键。在特定的实施方案中，5类肽包含两个连续氨基酸之间的至少一个酯键或醚键。在更特定的实施方案中，5类肽包含SEQ ID NO: 1401的N末端的6个氨基酸和N末端的6个氨基酸的两个连续氨基酸经酯键或醚键连接。
A的肽可以包含任何氨基酸（合成或天然存在的），条件是至少两个连续氨基酸经酯或醚键连接。在特定实施方案中，A的肽包含天然胰高血糖素的氨基酸。位置1和/或位置2的氨基酸可以是降低对由二肽基肽酶IV的切割的易感性的氨基酸。例如，A的肽可以在位置1包含选自以下的氨基酸：D-组氨酸、α,α-二甲基咪唑(imidiazole)乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸和高组氨酸。更具体而言，在一些实施方案中，A的肽的位置2为选自以下的氨基酸：D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸（AIB）。而且，例如，A的肽的位置3的氨基酸可以是谷氨酸，与天然胰高血糖素的天然谷氨酰胺残基相反。因此，通用结构A-B-C的肽可以包含以下氨基酸序列：
其中Xaa1选自：His、D-组氨酸、α,α-二甲基咪唑乙酸（DMIA）、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟组氨酸、乙酰组氨酸和高组氨酸；Xaa2选自：Ser、D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸（AIB）；且Xaa3为Gln或Glu。
在一些实施方案中，B通过高至三个氨基酸修饰来修饰。例如，代表SEQ ID NO: 1401的天然氨基酸序列的B通过一个或多个保守氨基酸修饰来修饰。
在另一实施方案中，B包含选自如本文所述的（iv）至（x）的一个或多个氨基酸修饰。在特定实施方案中，B包含氨基酸修饰（v）和（vi）的一个或两个。在进一步特定的实施方案中，B包含除了(v)和(vi)外还选自(iv)、(vii)、(viii)、(ix)和(x)的一个氨基酸修饰或其组合。
如本文所述，包含通用结构A-B-C的肽可以包含在C末端的一个或多个带电荷的氨基酸，例如作为Y和/或Z，如本文所述。可选地或另外地，包含通用结构A-B-C的肽可以进一步包含C末端至Z的一个至两个带电荷的氨基酸，当C包含X-Y-Z时。带电荷的氨基酸可以是例如Lys、Arg、His、Asp、和 Glu之一。在一个特定的实施方案中，Y是Asp。
在一些实施方案中，包含通用结构A-B-C的肽包含共价连接至位置1、16、20、21、或24（根据SEQ ID NO: 1401的氨基酸编号）或在包含通用结构A-B-C的肽的N或C末端残基处的氨基酸残基的亲水部分。在特定的实施方案中，亲水部分连接至包含通用结构A-B-C的肽的Cys残基。在这方面，天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 1401)的位置16、21、24或29的氨基酸可以被Cys残基取代。可选地，包含亲水部分的Cys残基可以添加至包含通用结构A-B-C作为位置30或作为位置40的肽的C末端，例如，当包含通用结构A-B-C的肽包含C末端延伸时（根据SEQ ID NO: 1401的氨基酸编号的位置）。可选地，亲水部分可以经PLA的羟基连接至包含通用结构A-B-C的肽的PLA。亲水部分可以是本文描述的任何亲水部分，例如包括聚乙二醇。
在特定方面中，包含通用结构A-B-C的肽包含借助于掺入分子内桥的稳定的α螺旋。在一些实施方案中，分子内桥是内酰胺桥。内酰胺桥可以在位置9和12的氨基酸、位置12和16的氨基酸、位置16和20的氨基酸、位置20和24的氨基酸、或位置24和28的氨基酸（根据SEQ ID NO: 1401的氨基酸编号）之间。在特定的实施方案中，位置12和16或位置16和20的氨基酸（根据SEQ ID NO: 1401的氨基酸编号）经内酰胺桥连接。考虑内酰胺桥的其他位置。
另外或可选地，包含通用结构A-B-C的肽例如在位置16、20、21或24（根据SEQ ID NO: 1401的氨基酸编号）任一者处可以包含α,α-二取代的氨基酸。在一些实施方案中，α,α-二取代氨基酸是AIB。在特定方面，AIB位于位置16（根据SEQ ID NO: 1401的编号）。
可选地或另外地，包含通用结构A-B-C的肽可以修饰以包含位置16的酸性氨基酸（根据SEQ ID NO: 1401的编号），所述修饰增强α螺旋的稳定性。酸性氨基酸在一些实施方案中为包含侧链磺酸或侧链羧酸的氨基酸。在更特定的实施方案中，酸性氨基酸选自Glu、Asp、高谷氨酸、Cys的磺酸衍生物、半胱磺酸、高半胱磺酸、Asp、和具有以下结构的Cys的烷基化衍生物
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基。
在特定的实施方案中，5类肽可以包含SEQ ID NOs: 1460-1470、1473-1478、1480-1488、1490-1496、1503、1504、1506、和 1514-1518的任何的氨基酸序列，或者包含表1的肽2-6、表2的肽1-8、和表3的肽2-6、8和9的任何的氨基酸序列。
在一些实施方案中，包含通用结构A-B-C的肽是5类肽。在特定实施方案中，肽展示出由天然GLP-1对GLP-1受体实现的最大激动作用的至少约50％和由天然胰高血糖素对胰高血糖素受体实现的最大应答的至少约50％抑制。在另一特定实施方案中，肽展示出由天然GLP-1对GLP-1受体实现的最大激动作用的至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％。可选地或另外地，肽可以展示出由天然胰高血糖素对胰高血糖素受体实现的最大应答的至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％抑制。
在一些实施方案中，提供具有5类肽或其缀合物的肽，其包含：
（1）赋予胰高血糖素拮抗剂活性的修饰，包括但不限于：
（a）位置6的Phe被PLA取代（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号），任选具有来自野生型胰高血糖素的N末端的1-5个氨基酸缺失；或
（b）缺失来自野生型胰高血糖素的N末端的2-5个氨基酸；任选具有野生型胰高血糖素的位置9的Asp被谷氨酸、高谷氨酸或半胱氨酸的磺酸衍生物取代（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）；
和
（2）赋予GLP-1激动剂活性的修饰，包括但不限于：
（a）在野生型胰高血糖素的氨基酸12-29内，例如位置16、17、18、19、20、21、24 或29（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）的一个、两个、三个、四个或更多处，α,α-二取代氨基酸的插入或取代；或
（b）在野生型胰高血糖素的氨基酸12-29内引入分子内桥，例如盐桥或内酰胺桥或另一类型的共价键；或
（c）位置2、3、17、18、21、23、或24（根据天然胰高血糖素的氨基酸编号）的一个或多个处的氨基酸被GLP-1的相应氨基酸的取代，例如Ser2被Ala取代，Gln3被Glu取代，Arg17被Gln取代，位置18的Arg被Ala取代，位置21的Asp被Glu取代，位置23的Val被Ile取代，和/或位置24的Gln被Ala取代；或
（d）稳定根据野生型胰高血糖素肽的氨基酸编号的氨基酸位置12-29周围的α螺旋结构的其他修饰；
和
（3）增强GLP-1激动剂活性的其他修饰，例如
（a）C末端酰胺或酯替代C末端羧基；
和任选地
（4）以下修饰中的一个或多个：
（a）共价连接至亲水部分，诸如聚乙二醇，例如在N末端、或在位置6、16、17、20、21、24、29、40或在C末端氨基酸；和/或
（b）酰化或烷基化；和任选地
（5）以下额外修饰中的一个或多个：
（a）氨基酸共价连接至N末端，例如1-5个氨基酸连接至N末端，任选经酯键连接至位置6的PLA（根据野生型胰高血糖素的编号），任选连同位置1或2的修饰，例如如本文所述，所述修饰改善对DPP-IV切割的抗性；
（b）缺失位置29和/或28和任选位置27（根据野生型胰高血糖素的编号）的氨基酸；
（c）氨基酸共价连接至C末端；
（d）非保守取代，保守取代、添加或缺失，同时保留期望的活性，例如，在位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28 或29中的一个或多个的保守取代，在位置10用Val或Phe取代Tyr，在位置12用Arg取代Lys，在这些位置中的一个或多个用Ala取代；
（e）在位置15修饰天冬氨酸，例如，通过用谷氨酸、高谷氨酸、半胱磺酸或高半胱磺酸取代，其可以降低降解；或在位置16修饰丝氨酸，例如，通过苏氨酸、AIB、谷氨酸或用另一个具有4个原子长的侧链的带负电荷的氨基酸或可选地用谷氨酰胺、高谷氨酸或高半胱磺酸之一取代，其同样可以降低由于Asp15-Ser16键的切割的降解；
（f）在位置27修饰甲硫氨酸，例如，通过用亮氨酸或正亮氨酸来取代，以降低氧化降解；
（g）在位置20或24修饰Gln，例如，通过用Ala或AIB取代，以降低经Gln的脱酰胺作用发生的降解；
（h）在位置21修饰Asp，例如通过用Glu取代，以降低经Asp脱水形成环状琥珀酰亚胺中间体随后异构化为异天冬氨酸而发生的降解；
（j）如本文所述的同二聚化或异二聚化；和
（k）上述的组合。
应理解相同类别内的任何修饰可以组合在一起和/或不同类别的修饰可以组合。例如，(1)(a)的修饰可以组合(2)(a)和(3)；(1)(a)可以组合(2)(b)、例如内酰胺桥或盐桥，和(3)；(1)(a)可以组合(2)(c)和(3)；(1)(b)可以组合(2)(a)和(3)；(1)(b)可以组合(2)(b)、例如内酰胺桥或盐桥，和(3)；(1)(b)可以组合(2)(c)和(3)；任何前述可以组合(4)(a)和/或(4)(b)；任何前述可以组合(5)(a)至(5)(k)的任一者。
在示例性实施方案中，α,α-二取代氨基酸AIB在位置16、20、21、或24（根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号）中的一个、两个、三个或全部处取代。
在示例性实施方案中，分子内桥是盐桥。
在其他示例性实施方案中，分子内桥为共价键，例如内酰胺桥。在一些实施方案中，内酰胺桥在位置9和12的氨基酸、位置12和16的氨基酸、位置16和20的氨基酸、位置20和24的氨基酸、或位置24和28的氨基酸（根据SEQ ID NO: 1401的氨基酸编号）之间。
在示例性实施方案中，酰化或烷基化在位置6、10、20或24或N末端或C末端（根据野生型胰高血糖素SEQ ID NO: 1401的氨基酸编号）。
在示例性实施方案中，修饰包括：
（i）位置15（根据SEQ ID NO: 1401的编号）的Asp被半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸取代；
（ii）位置16（根据SEQ ID NO: 1401的编号）的Ser被半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸取代；
（iii）在位置28用带电荷的氨基酸取代Asn；
（iv）在位置28用选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸的带电荷的氨基酸取代Asn；
（v）在位置28用Asn、Asp或Glu取代；
（vi）在位置28用Asp取代；
（vii）在位置28用Glu取代；
（viii）在位置29用带电荷的氨基酸取代Thr；
（ix）在位置29用选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸的带电荷的氨基酸取代Thr；
（x）在位置29用Asp、Glu或Lys取代；
（xi）在位置29用Glu取代；
（xii）在位置29后插入1-3个带电荷的氨基酸；
（xiii）在位置29后插入Glu或Lys；
（xiv）在位置29后插入Gly-Lys或Lys-Lys；
或其组合。
任何上述增加GLP-1受体激动剂活性、胰高血糖素受体拮抗剂活性、肽溶解性、和/或肽稳定性的修饰可以单独或组合应用。
增强稳定性的修饰
根据一些实施方案，本文公开的5类肽可以进一步修饰以包括连接至5类肽的羧基末端氨基酸（位置24）的SEQ ID NO: 1421 (GPSSGAPPPS)或SEQ ID NO: 1450的氨基酸序列，且施用于个体以诱导体重减轻或帮助体重保持。更具体而言，5类肽包含选自SEQ ID NO: 1405、SEQ ID NO: 1406、SEQ ID NO: 1407、SEQ ID NO: 1408、SEQ ID NO: 1409、SEQ ID NO: 1412、SEQ ID NO: 1413、SEQ ID NO: 1414、SEQ ID NO: 1416、SEQ ID NO: 1417、SEQ ID NO: 1418、SEQ ID NO: 1419、SEQ ID NO: 1422、SEQ ID NO: 1423、SEQ ID NO: 1424和SEQ ID NO: 1425的序列，且进一步包含连接至肽或5类肽的羧基末端氨基酸（位置24）的SEQ ID NO: 1421 (GPSSGAPPPS)或SEQ ID NO: 1450的氨基酸序列，用于抑制食欲和诱导体重减轻/体重保持。在一些实施方案中，施用的肽或5类肽包含选自SEQ ID NO: 1416、SEQ ID NO: 1417、SEQ ID NO: 1418和SEQ ID NO: 1419的序列，其进一步包含连接至5类肽的羧基末端氨基酸（位置24）的SEQ ID NO: 1421 (GPSSGAPPPS)的氨基酸序列。在一些实施方案中，方法包括施用包含SEQ ID NO: 1445 或SEQ ID NO: 1446的序列的肽或5类肽。
因此，预期本文公开的5类肽可以类似地修饰以降低它们对含水缓冲液中的过早(premature)化学切割的易感性。根据一些实施方案，本文描述的5类肽可以进一步修饰以增强它们在水溶液中的稳定性，其通过用选自半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸的氨基酸代替位于天然胰高血糖素的相应位置15的天然天冬氨酸氨基酸。根据一些实施方案，SEQ ID NO: 1405、SEQ ID NO: 1406、SEQ ID NO: 1407 或SEQ ID NO: 1408的5类肽的位置10的天冬氨酸残基可以被选自半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸的氨基酸取代，且在一些实施方案中，SEQ ID NO: 1405、SEQ ID NO: 1406、SEQ ID NO: 1407 或SEQ ID NO: 1408的位置10的天然天冬氨酸被谷氨酸取代。根据一些实施方案，提供具有在水溶液中改善的稳定性的5类肽，其中拮抗剂包含SEQ ID NO: 1409的修饰的序列，其中所述修饰包含SEQ ID NO: 1409的位置10的Asp被Glu取代。在一些实施方案中，提供5类肽，其包含选自SEQ ID NO: 1422、SEQ ID NO: 1423、SEQ ID NO: 1424和SEQ ID NO: 1425的序列。在一些实施方案中，5类肽是酰胺化的。
天然胰高血糖素的位置15-16的Asp-Ser序列已鉴定为导致天然激素在含水缓冲液中的过早化学切割的独特的不稳定的二肽。例如，当在37 oC下在0.01N HCl中保持2周时，超过50％的天然胰高血糖素可能被切成片段。两种释放的切割肽1-15和16-29缺乏胰高血糖素样生物活性，且因此代表对胰高血糖素及其相关类似物的含水预制剂的限制。已观察到天然胰高血糖素的位置15的Asp被Glu的选择性化学取代实质上消除了15-16肽键的化学切割。
在仍进一步的示例性实施方案中，任何前述化合物可以通过修饰对应于天然胰高血糖素的位置15或16的氨基酸来降低肽随时间（尤其在酸性或碱性缓冲液中）的降解，从而进一步修饰以改善稳定性。
增强溶解性的修饰
5类肽可以进一步修饰以改善肽在生理pH下在水溶液中的溶解性，同时在某些方面保留胰高血糖素拮抗剂和GLP-1激动剂活性。在对应于SEQ ID NO: 1405的肽的位置12、15、16、19和24的位置或在SEQ ID NO: 1406的肽的位置12、16、19 或24引入亲水基团可以改善所得肽在具有生理pH的溶液中的溶解性，同时保留亲本化合物胰高血糖素拮抗剂和GLP-1激动剂活性。因此，在一些实施方案中，本文公开的5类肽进一步修饰以包含共价连接至对应于SEQ ID NO: 1405 或SEQ ID NO: 1406的肽的氨基酸位置12、15、16、19和24的氨基酸的侧链的一个或多个亲水基团。在进一步的实施方案中，对应于SEQ ID NO: 1405 或SEQ ID NO: 1406的氨基酸位置16和19的氨基酸的侧链共价结合至亲水基团，且在一些实施方案中，亲水基团是聚乙二醇（PEG）。
5类胰高血糖素相关肽可以通过在其羧基末端引入电荷来修饰以增强肽的溶解性保留肽的激动剂特性。增强的溶解性允许在接近中性pH处制备和储存胰高血糖素溶液。在相对中性pH（例如约6.0至约8.0的pH）配制胰高血糖素溶液改善5类肽的长期稳定性。
申请人预期本文公开的5类肽可以类似地修饰以增强它们在相对中性的pH（例如约6.0至约8.0的pH）的水溶液中的溶解性，在一些情况下，同时保留胰高血糖素拮抗剂和GLP-1活性。因此，一些实施方案涉及SEQ ID NO: 1405、SEQ ID NO: 1406、SEQ ID NO: 1407 或SEQ ID NO: 1408的胰高血糖素拮抗剂/GLP-1，其已通过用带电荷的氨基酸取代天然的不带电荷的氨基酸或者添加带电荷的氨基酸至羧基末端来相对于野生型胰高血糖素(SEQ ID NO: 1401)的位置6-29存在天然氨基酸进一步修饰，以添加电荷至肽。根据一些实施方案，本文公开的5类肽的不带电荷的天然氨基酸的一个至三个被带电荷的氨基酸替代。在一些实施方案中，带电荷的氨基酸选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。更具体而言，申请人已发现（相对于天然胰高血糖素）对应位置28和/或29用带电荷的氨基酸取代通常存在的氨基酸、和/或在肽的羧基末端添加一个至两个带电荷的氨基酸，增强5类肽在水溶液中在生理学相关pH（即约6.5至约7.5的pH）下的溶解性和稳定性。因此，预期5类肽的此类修饰预期具有对在水溶液中（尤其在范围约5.5至约8.0的pH下）的溶解性的相似作用，同时保留亲本肽的生物活性。
根据一些实施方案，SEQ ID NO: 1405、SEQ ID NO: 1406、SEQ ID NO: 1407 或SEQ ID NO: 1408的5类肽通过在那些序列的位置23和/或24用带负电荷的氨基酸（例如天冬氨酸或谷氨酸）取代天然氨基酸和任选地添加带负电荷的氨基酸（例如天冬氨酸或谷氨酸）至肽的羧基末端来修饰。在可选的实施方案中，包含SEQ ID NO: 1405、SEQ ID NO: 1406、SEQ ID NO: 1407 或SEQ ID NO: 1408的5类肽通过在SEQ ID NO: 1405、SEQ ID NO: 1406、SEQ ID NO: 1407 或SEQ ID NO: 1408的位置24用带正电荷的氨基酸（例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸）取代天然氨基酸和任选地添加一个或两个带正电荷的氨基酸（例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸）至肽的羧基末端来修饰。根据一些实施方案，提供具有改善的溶解性和稳定性的5类肽，其中类似物包含SEQ ID NO: 1415或SEQ ID NO: 1451的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO: 1415或SEQ ID NO: 1451的位置23或24的至少一个氨基酸被酸性氨基酸所取代和/或一个额外的酸性氨基酸被添加至SEQ ID NO: 1415或SEQ ID NO: 1451的羧基末端。在一些实施方案中，酸性氨基酸独立地选自Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸。
根据一些实施方案，提供具有改善的溶解性和稳定性的5类肽，其中拮抗剂包含SEQ ID NO: 1416、SEQ ID NO: 1417、SEQ ID NO: 1418 或SEQ ID NO: 1419的氨基酸序列。根据一些实施方案，提供胰高血糖素激动剂，其包含SEQ ID NO: 1416 或SEQ ID NO: 1417的序列。在一些实施方案中，5类肽包含SEQ ID NO: 1420的序列。
根据一些实施方案，提供5类肽，其包含SEQ ID NO: 1415 或SEQ ID NO: 1451的序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO: 1415 或SEQ ID NO: 1451的位置4是天冬氨酸、谷氨酸、高谷氨酸、半胱磺酸或高半胱磺酸，和在一些实施方案中，位置4为天冬氨酸、谷氨酸、半胱磺酸或高半胱磺酸，和在进一步的实施方案中，SEQ ID NO: 1415 或SEQ ID NO: 1451的位置4为天冬氨酸或谷氨酸，和在一些实施方案中，SEQ ID NO: 1415 或SEQ ID NO: 1451的位置4为天冬氨酸。在一些实施方案中，提供包含SEQ ID NO: 1415或SEQ ID NO: 1451的5类肽，其中SEQ ID NO: 1415的位置4是天冬氨酸且SEQ ID NO: 1415的位置10是谷氨酸。在进一步的实施方案中，SEQ ID NO: 1415或SEQ ID NO: 1451的C末端氨基酸被修饰以用电荷中性的基团诸如酰胺或酯替代天然羧酸基团。
5 类肽融合体
在进一步的实施方案中，本文描述的5类肽的羧基末端氨基酸共价结合至包含选自SEQ ID NOs: 1421、1426、1427、和 1450的序列的第二肽。例如，在一些实施方案中，SEQ ID NO: 1415、SEQ ID NO: 1451、SEQ ID NO: 1405、SEQ ID NO: 1406、SEQ ID NO: 1407、SEQ ID NO: 1408、SEQ ID NO: 1412、SEQ ID NO: 1413、SEQ ID NO: 1414、SEQ ID NO: 1416、SEQ ID NO: 1417、SEQ ID NO: 1418、SEQ ID NO: 1419、SEQ ID NO: 1422、SEQ ID NO: 1423、SEQ ID NO: 1424和SEQ ID NO: 1425的5类肽共价连接至包含选自SEQ ID NO: 1421 (GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO: 1426 (KRNRNNIA)、SEQ ID NO: 1427 (KRNR)和SEQ ID NO: 1450 (GPSSGAPPPSX)的序列的第二肽。
在一些实施方案中，提供5类肽二聚体，其包含独立地选自SEQ ID NO: 1405、SEQ ID NO: 1406、SEQ ID NO: 1407、SEQ ID NO: 1408、SEQ ID NO: 1409、SEQ ID NO: 1422、SEQ ID NO: 1423、SEQ ID NO: 1424和SEQ ID NO: 1425的两个序列，其进一步包含连接至5类肽的羧基末端氨基酸的SEQ ID NO: 1421 (GPSSGAPPPS)氨基酸序列。
在一些实施方案中，5类肽通过截短或缺失肽的C末端的一个或两个氨基酸（即天然胰高血糖素的位置29或位置28和29的氨基酸的截短）来进一步修饰。优选地，截短不影响5类肽的活性（例如胰高血糖素拮抗作用/GLP-1激动作用）。
5 类肽缀合物
还提供5类肽的缀合物，其中任选经共价键合和任选经接头连接胰高血糖素肽至缀合物部分。
在那些实施方案中，其中5类肽包含聚乙二醇链，聚乙二醇链可以为直链形式或它可以是支链的。根据一些实施方案，聚乙二醇链具有选自范围约500至约10,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，聚乙二醇链具有选自范围约1,000至约5,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，聚乙二醇链具有选自范围约1,000至约5,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，聚乙二醇链具有选自约1,000至约2,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，聚乙二醇链具有选自约1,000道尔顿的平均分子量。
在一些实施方案中，PEG化的5类肽包含由SEQ ID NO: 1415 或SEQ ID NO: 1451序列组成的肽，其中聚乙二醇链连接至选自SEQ ID NO: 1415 或SEQ ID NO: 1451的序列的位置11、12、15、16、19和24的氨基酸，且PEG链的分子量为约1,000至约5,000道尔顿。在一些实施方案中，PEG化的5类肽包含由SEQ ID NO: 1415 或SEQ ID NO: 1451组成的肽，其中聚乙二醇链连接至SEQ ID NO: 1415 或SEQ ID NO: 1451的位置16或19的氨基酸，且PEG链的分子量为约1,000至约5,000道尔顿。在进一步的实施方案中，修饰的5类肽包含共价连接至肽的两个或多个聚乙二醇链，其中胰高血糖素链的总分子量为约1,000至约5,000道尔顿。在一些实施方案中，5类肽包含SEQ ID NO: 1415 或SEQ ID NO: 1451的序列，其中聚乙二醇链连接至SEQ ID NO: 1415 或SEQ ID NO: 1451的位置16和19的氨基酸，且两个PEG链的组合的分子量为约1,000至约5,000道尔顿。
5类胰高血糖素相关肽可以包含SEQ ID NOs: 1401-1518的任一的氨基酸序列，任选具有高至1、2、3、4或5个保留胰高血糖素拮抗剂和GLP-1激动剂活性的进一步修饰。
6 类胰高血糖素相关肽
本文提供作为GIP激动剂肽的肽，其被考虑用于治疗有需要的（例如患有糖尿病或肥胖症）的主体。下文描述且命名为“6类胰高血糖素相关肽”的此类肽类似于2类胰高血糖素相关肽，且2类胰高血糖素相关肽内描述的所有修饰、类似物、变体、衍生物、多聚体、融合体和缀合物均同样应用与6类胰高血糖素相关肽。Q可以是任何这些6类胰高血糖素肽。
SEQ ID NOS:2001-2565对应于提交于2012年10月22日的美国临时申请61/716878的SEQ ID NOs: 1-565，其整体通过引用并入。SEQ ID NOS:3001-3262对应于国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NOs: 1-262，其整体通过引用并入本文。因此，在一些实施方案中，Q为任何SEQ ID NOs: 2001-2565和3001-3262。
天然胰高血糖素不活化GIP受体，且通常具有约1％的天然GLP-1对GLP-1受体的活性。在一些实施方案中，肽为包含基于天然人胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的氨基酸序列但与SEQ ID NO: 1相比在一个或多个位置不同的胰高血糖素类似物，其中差异或修饰增强类似物对GIP受体的激动剂活性。此类胰高血糖素类似物将具有对GIP受体大于天然胰高血糖素的激动剂活性的激动剂活性，且在一些方面中，大于天然GIP的激动剂活性。在一些或任何实施方案中，GIP激动剂具有至少0.1％的GIP百分比效力。在本公开的一些或任何方面中，胰高血糖素类似物额外展示对胰高血糖素受体和GLP-1受体的一者或两者的激动剂活性。因此，本文提供GIP激动剂、GIP-GLP-1共激动剂、GIP胰高血糖素共激动剂和GIP-GLP-1胰高血糖素三激动剂。
在示例性实施方案中，本公开的GIP激动剂肽对人GLP-1受体相比于对GIP受体的选择性小于100倍。在一些或任何实施方案中，GIP激动剂肽具有在不同于胰高血糖素百分比效力和/或GLP-1百分比效力的20倍或10倍（更高或更低）之内的GIP百分比效力。
在本公开的一些实施方案中，胰高血糖素类似物包含（i）包含位置1的咪唑侧链的氨基酸，（ii）位置2的DPP-IV保护性氨基酸，（iii）包含非天然酰基或烷基的氨基酸，任选在位置9、10、12、16、20、或37-43中任一者，且任选地其中非天然酰基或烷基经间隔基连接至此类氨基酸；（iv）在位置16、17、18、19、20 或21的一个或多个处稳定α螺旋的氨基酸，和（v）相对于SEQ ID NO: 1的高至10个（例如高至1、2、3、4、5、6、7、8 或9个）额外的氨基酸修饰。
在示例性的实施方案中，胰高血糖素类似物包含（i）包含位置1的咪唑侧链的氨基酸（例如His），（ii）位置2的DPP-IV保护性氨基酸，任选氨基异丁酸，（iii）包含非天然酰基或烷基的氨基酸，任选在位置9、10、12、16、20、或37-43中任一者，任选地其中非天然酰基或烷基经间隔基连接至此类氨基酸；（iv）在位置20的α,α-二取代氨基酸或包含咪唑侧链的氨基酸，和（v）相对于SEQ ID NO: 1的高至10个（例如高至1、2、3、4、5、6、7、8 或9个）额外的氨基酸修饰。
在示例性的实施方案中，胰高血糖素类似物包含（i）位置1的包含咪唑侧链的氨基酸，（ii）位置2的DPP-IV保护性氨基酸，任选氨基异丁酸，（iii）包含非天然酰基或烷基的氨基酸，任选在位置9、10、12、16、20、或37-43中任一者，任选地其中非天然酰基或烷基经间隔基连接至此类氨基酸；（iv）在位置16-21的一个或多个（任选位置16）的稳定α螺旋的氨基酸，其中类似物在位置20不包含稳定α螺旋的氨基酸，和（v）相对于SEQ ID NO: 1的高至10个（例如高至1、2、3、4、5、6、7、8 或9个）额外的氨基酸修饰。在可选的示例性实施方案中，胰高血糖素类似物包含（i）类似物的位置3的选自Ala、Leu、Ile、Val、正亮氨酸、高丝氨酸、Met、和甲硫氨酸砜的氨基酸，（ii）包含非天然酰基或烷基的氨基酸，任选在位置9、10、12、16、20、或37-43中任一者，且任选地其中非天然酰基或烷基经间隔基连接至此类氨基酸；（iii）在位置16-21的一个或多个处稳定α螺旋的氨基酸，和（iv）相对于SEQ ID NO: 1的高至10个（例如高至1、2、3、4、5、6、7、8 或9个）额外的氨基酸修饰。
在示例性实施方案中，当胰高血糖素类似物缺少亲水部分时，胰高血糖素类似物展示出至少0.1%（例如至少1%、至少10%、至少20%）的GIP百分比效力。在示例性实施方案中，胰高血糖素类似物具有对于人GLP-1受体相比于GIP受体小于100倍（例如小于50倍、小于25倍、小于10倍）的选择性。在示例性实施方案中，胰高血糖素类似物展示出对GLP-1受体这样的EC50，其在它对GIP受体的EC50的100倍内（例如50倍内、25倍内、10倍内）。
所有通过编号（例如位置28）提及具体氨基酸位置均指在天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的位置处或在其任何类似物或相关肽中相应的氨基酸位置处的氨基酸。例如，本文提及“位置28”对于其中SEQ ID NO: 1的第一个氨基酸已被缺失的胰高血糖素类似物而言将意指相应的位置27。类似地，本文提及“位置28”将意指其中在SEQ ID NO: 1的N末端之前已添加一个氨基酸的胰高血糖素类似物的相应的位置29。
在一些实施方案中，GIP激动剂肽包含SEQ ID NOs: 27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89、和 90，或SEQ ID NOs: 48、52、53、和 74的任何，或SEQ ID NOs: 50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88、和 92的任何的氨基酸序列，所有SEQ ID NO参考国际申请号PCT/US11/66164，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，GIP激动剂肽包含基于含有SEQ ID NOs: 27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89、和 90、或SEQ ID NOs: 48、52、53、和 74的任何、或SEQ ID NOs: 50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88、和 92的任何的亲本序列的结构，所有SEQ ID NO参考国际申请号PCT/US11/66164，其通过引用整体并入本文，但与亲本序列在一个或多个位置不同，如本文进一步描述。
本发明因此提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 28的序列、基本上由所述序列组成、或由所述序列组成的肽，所述国际申请以其整体通过引用并入本文。还提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 37的序列、基本上由所述序列组成、或由所述序列组成的肽，所述国际申请以其整体通过引用并入本文。本发明进一步提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 180的序列、基本上由所述序列组成、或由所述序列组成的肽，所述国际申请以其整体通过引用并入本文。本发明此外提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 89的序列、基本上由所述序列组成、或由所述序列组成的肽，所述国际申请以其整体通过引用并入本文。本发明此外提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 31的序列、基本上由所述序列组成、或由所述序列组成的肽，所述国际申请以其整体通过引用并入本文。
本发明提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 184的序列的肽，所述国际申请以其整体通过引用并入本文，
其中：
X2为AIB；
X3为Gln或Gln类似物；
X10为Tyr或共价连接至C12或C18酰基或烷基的氨基酸；
X16 为任何氨基酸，任选地，除Gly、Pro和Ser以外的任何氨基酸；
X18是Arg或Ala；
X20 为带负电荷的氨基酸或电荷中性的氨基酸，任选为AIB或Gln；
X21 为酸性氨基酸，任选为Asp或Glu；
X27 为Leu、Ala、Nle、或Met；
X28 为Ala或酸性氨基酸（任选为Asp或Glu）；
X29是Arg或Gly；
X35 为Ala或碱性氨基酸（任选为Arg或Lys）；
其中，当X28为酸性氨基酸时，X35为碱性氨基酸；
其中，当X10为Tyr时，肽包含位置40的共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且其中，任选地，肽包含位置41的Gly，和
其中肽的C末端氨基酸被酰胺化。
本发明还提供包含相对于SEQ ID NO: 184具有高至3个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 184的序列的肽，其中所述类似物展示出对人GIP受体、人GLP-1受体和人胰高血糖素受体每种的激动剂活性。
本发明额外提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 185的序列的肽，所述国际申请以其整体通过引用并入本文，
其中：
X2为AIB；
X10为Tyr或共价连接至C12或C18酰基或烷基的氨基酸；
X16 为Glu、α,α-二取代氨基酸、Lys或
X18是Arg或Ala；
X20是AIB或Gln；
X21是Asp或Glu；
X27 为Leu、Nle、或Met；
X28是Ala、Asp或Glu；
X29 是Gly或Thr；
和
其中，当X10为Tyr时，肽包含位置40的共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且其中，任选地，肽包含位置41的Gly，和
其中肽的C末端氨基酸被酰胺化。
本发明还提供包含相对于SEQ ID NO: 185具有高至3个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 185的序列的肽，其中所述类似物展示出对人GIP受体、人GLP-1受体和人胰高血糖素受体每种的激动剂活性。
此外提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 186的序列的肽，所述国际申请以其整体通过引用并入本文，
其中：
X2为AIB；
X3为Gln或Gln类似物；
X10为Tyr或共价连接至C10至C26酰基或烷基的氨基酸；
X16 为任何氨基酸，任选地，除Gly、Pro和Ser以外的任何氨基酸；
X18是Arg或Ala；
X20 为带负电荷的氨基酸或电荷中性的氨基酸，任选为AIB或Gln；
X21 为酸性氨基酸（任选为Asp或Glu）；
X27 为Leu、Ala、Nle、或Met；
X28 为Ala或酸性氨基酸（任选为Asp或Glu）；
X29是Ala、Gly或Thr；和
其中肽包含共价连接至C10至C26酰基或烷基的氨基酸，任选地，在位置10，且肽的C末端氨基酸为酰胺化的。
此外，提供包含相对于SEQ ID NO: 186具有高至3个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 186的序列的肽，其中所述类似物展示出对人GIP受体、人GLP-1受体和人胰高血糖素受体每种的激动剂活性。
本发明提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 187的序列的肽，所述国际申请以其整体通过引用并入本文：
其中：
X2为AIB；
X10为Tyr或共价连接至C10至C26酰基或烷基的氨基酸；
X16 为Glu、α,α-二取代氨基酸或Lys；
X18是Arg或Ala；
X20 为带负电荷的氨基酸或电荷中性的氨基酸，任选为AIB或Gln；
X21是Asp或Glu；
X27 为Leu、Ala、Nle、或Met；
X28是Ala、Asp或Glu；
X29是Gly或Thr；和
其中肽包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，任选地，在位置10，且肽的C末端氨基酸为酰胺化的。
本发明还提供相对于SEQ ID NO: 187具有高至3个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 187，其中所述类似物展示出对人GIP受体、人GLP-1受体和人胰高血糖素受体每种的激动剂活性。
本发明还提供如国际申请号PCT/US11/66164（其通过参考整体并入本文）中描述的SEQ ID NOs: 184、185、186、和 187的任一种的类似物，但X3或位置3的氨基酸为Gln或Gln类似物或降低胰高血糖素活性的氨基酸，包括本文描述的那些。在示例性实施方案中，降低胰高血糖素活性的氨基酸是酸性、碱性、或疏水性氨基酸（例如Glu、Orn或Nle）。任选地，位置3的氨基酸是Glu。
此外，本文提供具有GIP激动剂活性的胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)类似物，其包含：
（a）位置1的包含咪唑侧链的氨基酸，
（b）位置16的式IV的氨基酸：
[式IV],
其中n为1-7，其中R1和R2的每一个独立地选自H、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、和 (C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，其中R7为H或OH，其中任选地式IV的氨基酸的侧链包含游离氨基，
（c）位置20的α,α-二取代氨基酸，
（d）相对于SEQ ID NO: 1高至10个额外的氨基酸修饰，
其中，当类似物缺少亲水部分时，胰高血糖素类似物展示出天然GIP对GIP受体至少0.1％的活性，其中胰高血糖素类似物具有对人GLP-1受体相比于GIP受体少于100倍的选择性。
本发明还提供包含以下的肽
（a）以下的序列：
（提交于2012年10月22日的美国临时申请61/716878的SEQ ID NO: 66，其整体通过引用并入）
其中：
X2为AIB；
X3为Gln或包含如本文所述的结构I、II或III的侧链结构的氨基酸；
X10为Tyr或共价连接至C12或C18酰基或烷基的氨基酸；
X15为酸性氨基酸，任选为Glu或Asp；
X16为任何氨基酸，任选地，除Gly、Pro、和 Ser以外的任何氨基酸，例如Glu、Ala、α,α-二取代氨基酸（例如AIB）、His、Lys，
X17是Arg、His或Gln；
X18是Arg或Ala；
X19为Ala或α,α-二取代氨基酸；
X20选自：α,α-二取代氨基酸（例如AIB）、Gln或His、Lys、或Ala；
X21 为酸性氨基酸，任选为Asp或Glu；
X27 为Leu、Ala、Nle、或Met；
X28 为Ala或酸性氨基酸（任选为Asp或Glu）；
X29 为酸性氨基酸，例如Ala或Gly或AIB或Val；
X30 为小的脂族氨基酸，例如Ala或Gly
X35 为Ala或碱性氨基酸（任选为Arg或Lys）；
其中，当X28为酸性氨基酸时，X35为碱性氨基酸；
任选地，其中，当X28为Asp时，则X29不是Gly
其中，当X10为Tyr时，肽包含位置40的共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且其中，任选地，肽包含位置41的Gly，
其中肽的C末端氨基酸被酰胺化；
或
(b) 相对于SEQ ID NO: 66具有高至3个氨基酸修饰的序列SEQ ID NO: 66，其中所述肽展示出对人GIP受体、人GLP-1受体和/或人胰高血糖素受体的激动剂活性。
本公开还提供包含以下的肽
（a）以下的序列：
（提交于2012年10月22日的美国临时申请61/716878的SEQ ID NO: 67，其整体通过引用并入）
其中：
X1为包含侧链咪唑的氨基酸，任选地，His或His衍生物；
X2为DPP-IV保护性氨基酸，任选地，α,α-二取代氨基酸（例如AIB）；
X3选自Glu、Ala、Leu、Ile、Nle、Val、NorVal、高丝氨酸、Met、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、乙酰-Orn、乙酰基-二氨基丁酸、乙酰-Lys；
X10为共价连接至C12或C18酰基或烷基的氨基酸；
X15为酸性氨基酸，任选为Glu或Asp；
X16为任何氨基酸，任选地，除Gly、Pro、和 Ser以外的任何氨基酸，（例如Glu、Ala、α,α-二取代氨基酸（例如AIB）、His、Lys）
X17是Arg、His或Gln；
X18是Arg或Ala；
X19为Ala或α,α-二取代氨基酸；
X20选自：α,α-二取代氨基酸（例如AIB）、Gln或His、Lys、或Ala；
X21 为酸性氨基酸，任选为Asp或Glu；
X27 为Leu、Ala、Nle、或Met；
X28 为Ala或酸性氨基酸（任选为Asp或Glu）；
X29 为脂族的，例如Ala或Gly或AIB或Val；
X30 为小的脂族氨基酸，例如Ala或Gly
X35 为Ala或碱性氨基酸（任选为Arg或Lys）；
其中，当X28为酸性氨基酸时，X35为碱性氨基酸；
任选地，其中，当X28为Asp时，则X29不是Gly
其中，当X10为Tyr时，肽包含位置40的共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且其中，任选地，肽包含位置41的Gly，
其中肽的C末端氨基酸被酰胺化；
或
（b）相对于SEQ ID NO: 67具有高至3个氨基酸修饰的序列SEQ ID NO: 67，其中所述肽展示出对人GIP受体、人GLP-1受体和/或人胰高血糖素受体的激动剂活性。
在示例性实施方案中，GIP激动剂肽包含SEQ ID NOs: 19、21-26、28、287、289-294、296、520、522-527、和 529的任何，或SEQ ID NOs: 30、31、32、33、35、37、38、和 41的任何氨基酸序列，所有SEQ ID NO参考2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878，其以其整体通过引用并入。在一些实施方案中，GIP激动剂肽包含基于含有SEQ ID NOs: 30、31、32、33、35、37、38、41、298、299、300、301、303、305、306、309、531、532、533、534、536、538、539、和 542的任何的亲本序列的结构，所有SEQ ID NO参考2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878，其通过引用整体并入本文，但与亲本序列在一个或多个位置不同，如本文进一步描述。
本发明因此提供包含2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878中的SEQ ID NO: 18的序列、基本上由所述序列组成、或由所述序列组成的肽，所述申请以其整体通过引用并入本文。还提供包含2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878中的SEQ ID NO: 43的序列、基本上由所述序列组成、或由所述序列组成的肽，所述申请以其整体通过引用并入本文。
本发明还提供包含2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878中的SEQ ID NOs: 100-282；SEQ ID NOs: 333-515中任一者、基本上由其组成、或由其组成的肽，所述申请以其整体通过引用并入本文。
本发明还提供包含2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878中的SEQ ID NOs: 15-28、34、36、39、42、43、44、52、53、63-65、283-296、302、304、307、310、311、312、320、321、330-332、516-529、535、537、540、543、544、545、553、554、和 563-565中任一者、基本上由其组成、或由其组成的肽，所述申请以其整体通过引用并入本文。
本发明还提供包含2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878中的SEQ ID NOs: 29-42、297-310、和 530-543中任一者、基本上由其组成、或由其组成的肽，所述申请以其整体通过引用并入本文。
示例性实施方案
在示例性实施方案中，本公开的6类肽为胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的类似物，其包含（i）位置1的包含咪唑侧链的氨基酸，（ii）位置2的DPP-IV保护性氨基酸，（iii）酰化氨基酸或烷基化氨基酸，任选在位置9、10、12、16、20、或37-43的任一者，其中任选地，酰基或烷基经间隔基连接至氨基酸；（iv）位置16-21的一个或多个处的稳定α螺旋的氨基酸，和（v）相对于SEQ ID NO: 1高至10个额外的氨基酸修饰，其中当胰高血糖素类似物未缀合至异源部分例如亲水部分（例如PEG）时，胰高血糖素类似物展示出天然GIP对GIP受体的活性的至少或约0.1％（例如，至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约80%、至少或约100%、至少或约500%）。
本文描述的6类胰高血糖素类似物可以包含本文描述的任何活性概况。在示例性方面中，6类胰高血糖素类似物展示出至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约90%、至少或约100%、至少或约300%、或至少或约500%的GIP百分比效力。在一些方面中，6类胰高血糖素类似物还展示出至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约90%、至少或约100%、至少或约300%、或至少或约500%的GLP-1百分比效力。在可选或额外方面中，6类胰高血糖素类似物展示出至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约90%、或至少或约100%的胰高血糖素百分比效力。因此，尽管6类胰高血糖素类似物可以考虑作为GIP激动剂肽，但在一些方面中，6类胰高血糖素类似物额外可以考虑作为GIP-GLP-1共激动剂、GIP-胰高血糖素共激动剂、或GIP-GLP-1-胰高血糖素三激动剂。例如，肽可以展示出对人GIP受体、人GLP-1受体和人胰高血糖素受体每种的激动剂活性，其中肽展示出对GIP受体的EC50在其对GLP-1受体的EC50的100倍内（例如，50倍、40倍、30倍、20倍、15倍、10倍、或更少）和其对胰高血糖素受体的EC50的100倍内（例如，50倍、40倍、30倍、20倍、15倍、10倍、或更少）。
在示例性实施方案中，6类胰高血糖素类似物包含位置1的含有咪唑侧链的氨基酸。在示例性方面中，位置1的氨基酸包含式A的结构
[式A],
其中R1和R2的每一个独立地选自H、(C1-6)烷基、O(C1-6)烷基、(C1-6)烷基-OH、F、和 (C1-C6)烷基（其中至少一个H被F取代）。
在示例性方面，位置1的氨基酸为胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的天然残基L-组氨酸（His）、或为His的衍生物（His衍生物），例如其中修饰α原子的His衍生物。如本文所用，术语“His衍生物”指包含连接至至少一个碳原子的咪唑（例如包含式A的结构）或取代的咪唑的化学基团。在示例性实施方案中，His衍生物包含类似于组氨酸结构的结构，不同之处在于α胺、α碳、或α羧基被另一化学基团取代。在示例性实施方案中，His衍生物是α取代的组氨酸，其中连接至α碳的氢原子被另一化学基团取代，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、羟基、甲氧基、乙氧基等。His衍生物在一些方面为D-组氨酸、脱氨基组氨酸、羟组氨酸、乙酰组氨酸、高组氨酸、N-甲基组氨酸、α甲基组氨酸、咪唑乙酸、或α,α-二甲基咪唑乙酸（DMIA）。
在一些方面，位置2的DPP-IV保护性氨基酸是D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸、或α氨基异丁酸（AIB）之一。在一些方面，DPP-IV保护性氨基酸为D-Ser、或其保守氨基酸取代，或α,α-二取代氨基酸。在一些方面，α,α-二取代氨基酸包含R1和R2，其每一个键合至α碳，其中R1和R2每一个独立地选自C1-C4烷基，任选被羟基、酰胺、巯基、卤素取代，或者R1和R2连同它们连接的α碳形成环。在一些方面，α,α-二取代氨基酸是AIB。在示例性实施方案，当DPP-IV保护性氨基酸是D-Ser时，GIP激动剂肽未缀合至异源部分，例如亲水部分（例如PEG）。在本公开的其他方面中，DPP-IV保护性氨基酸不是D-丝氨酸。
在一些方面中，6类胰高血糖素类似物包含在位置16、17、18、19、20、或21的任一者的稳定α螺旋的氨基酸。在一些方面中，胰高血糖素类似物包含在位置16、17、18、19、20、或21的一个、两个、三个、四个、五个或全部的稳定α螺旋的氨基酸。在示例性方面中，6类胰高血糖素类似物包含在位置16、17、20和21的稳定α螺旋的氨基酸。在一些方面中，6类胰高血糖素类似物包含在位置16和20的稳定α螺旋的氨基酸。在可选或另外的方面中，6类胰高血糖素类似物包含在位置17和21的稳定α螺旋的氨基酸。
在一些方面中，当6类胰高血糖素类似物包含位置20的稳定α螺旋的氨基酸时，位置20的氨基酸是α,α-二取代氨基酸。在示例性方面中，α,α-二取代氨基酸包含R1和R2，其每一个键合至α碳，其中R1和R2每一个独立地选自C1-C4烷基，任选被羟基、酰胺、巯基、卤素取代，或者R1和R2连同它们连接的α碳形成环。在一些实施方案中，α,α-二取代氨基酸是1-氨基环丙烷-1-甲酸（ACPC）。在一些方面，位置20的α,α-二取代氨基酸是AIB。任选地，在一些实施方案中，当位置20的氨基酸为α,α-二取代氨基酸时，位置16的氨基酸是除了AIB以外的稳定α螺旋的氨基酸。在示例性实施方案中，位置16的氨基酸是带电荷的氨基酸，例如带正电荷的氨基酸、带负电荷的氨基酸。在一些方面，当位置20的氨基酸是α,α-二取代氨基酸时，位置16的氨基酸是式IV的带正电荷的氨基酸，例如Lys，或者是带负电荷的氨基酸，例如Glu。在一些方面中，当位置20的氨基酸为α,α-二取代氨基酸时，位置16的氨基酸是电荷中性的氨基酸，例如Ser、Ala、Gly。
因此，在示例性的实施方案中，6类胰高血糖素类似物包含（i）包含位置1的咪唑侧链的氨基酸，（ii）位置2的DPP-IV保护性氨基酸，任选氨基异丁酸，（iii）包含非天然酰基或烷基的氨基酸，任选在位置9、10、12、16、20、或37-43中任一者，任选地其中非天然酰基或烷基经间隔基连接至此类氨基酸；（iv）在位置20的α,α-二取代氨基酸，和（v）相对于SEQ ID NO: 1的高至10个（例如高至1、2、3、4、5、6、7、8 或9个）额外的氨基酸修饰。
在示例性实施方案中，当6类胰高血糖素包含位置20的α,α-二取代氨基酸时，且当6类胰高血糖素类似物缺少亲水部分时，胰高血糖素类似物展示出至少0.1％的GIP百分比效力（例如至少1％、至少10％、至少20％）。在示例性实施方案中，6类胰高血糖素类似物具有对于人GLP-1受体相比于GIP受体小于100倍（例如，小于或约90倍、小于或约80倍、小于或约70倍、小于或约60倍、小于或约50倍、小于或约40倍、小于或约30倍、小于或约20倍、小于或约15倍、小于或约10倍、小于或约5倍）的选择性。在示例性实施方案中，肽对GIP受体的EC50与所述肽对GLP-1受体的EC50小于100倍（例如，小于或约90倍、小于或约80倍、小于或约70倍、小于或约60倍、小于或约50倍、小于或约40倍、小于或约30倍、小于或约20倍、小于或约15倍、小于或约10倍、小于或约5倍）不同，其任选地，与所述肽对胰高血糖素受体的EC50小于100倍（例如，小于或约90倍、小于或约80倍、小于或约70倍、小于或约60倍、小于或约50倍、小于或约40倍、小于或约30倍、小于或约20倍、小于或约15倍、小于或约10倍、小于或约5倍）不同。
在示例性实施方案中，当6类胰高血糖素类似物在位置20包含α,α-二取代氨基酸时，所述α,α-二取代氨基酸包含R1和R2，其每一个键合至α碳，其中R1和R2每一个独立地选自C1-C4烷基，任选被羟基、酰胺、巯基、卤素取代，或者R1和R2连同它们连接的α碳形成环。在示例性实施方案中，位置20的α,α-二取代氨基酸是AIB。而且，在示例性实施方案中，当胰高血糖素类似物在位置20包含α,α-二取代氨基酸时，位置16的氨基酸是除了AIB以外的稳定α螺旋的氨基酸。在示例性实施方案中，位置16的氨基酸是带电荷的氨基酸，任选地，带负电荷的氨基酸（例如Glu或Asp）或带正电荷的氨基酸（例如Lys或Orn）。
在可选的实施方案中，6类胰高血糖素类似物在位置20不包含稳定α螺旋的氨基酸，且位置16、17、18、19、或21的一个或多个为稳定α螺旋的氨基酸。在一些方面中，稳定α螺旋的氨基酸位于位置16。在一些实施方案中，稳定α螺旋的氨基酸是带负电荷的氨基酸（例如Glu）、带正电荷的氨基酸（例如包含式IV的结构（例如Lys））、或α,α-二取代氨基酸。在一些方面，α,α-二取代氨基酸包含R1和R2，其每一个键合至α碳，其中R1和R2每一个独立地选自C1-C4烷基，任选被羟基、酰胺、巯基、卤素取代，或者R1和R2连同它们连接的α碳形成环。在特定方面中，位置16的α,α-二取代氨基酸是AIB。
在另外的实施方案中，当6类胰高血糖素类似物在位置20不包含稳定α螺旋的氨基酸时，且位置16、17、18、19或21中的一个或多个为稳定α螺旋的氨基酸时，胰高血糖素类似物包含（i）肽类似物的C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸的延伸或（ii）酰化氨基酸或烷基化氨基酸位于位置10、12或16。在一些方面中，胰高血糖素类似物包含肽类似物的C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸的延伸，且任选地位置29的氨基酸为Gly。1-21个氨基酸的延伸在一些方面中为本文描述的那些的任一种。在一些方面中，延伸包含形成Trp笼结构的氨基酸序列，例如延伸包含GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 5)的氨基酸序列、或其保守取代的序列。在可选的方面中，1-21个氨基酸的延伸包含至少一个带电荷的氨基酸。在示例性方面中，延伸包含以下的氨基酸序列：X1-X2，其中X1为带电荷的氨基酸且X2为小的脂族氨基酸。在一些方面中，X1为带正电荷的氨基酸，例如Arg。在一些方面中，延伸包含Arg-Gly。
因此，在可选的示例性实施方案中，6类胰高血糖素类似物包含（i）位置1的包含咪唑侧链的氨基酸，（ii）位置2的DPP-IV保护性氨基酸，任选氨基异丁酸，（iii）包含非天然酰基或烷基的氨基酸，任选在位置9、10、12、16、20、或37-43中任一者，任选地其中非天然酰基或烷基经间隔基连接至此类氨基酸；（iv）在位置16-21的一个或多个（任选位置16）的稳定α螺旋的氨基酸，其中类似物在位置20不包含稳定α螺旋的氨基酸，和（v）相对于SEQ ID NO: 1的高至10个（例如高至1、2、3、4、5、6、7、8 或9个）额外的氨基酸修饰。在示例性方面中，类似物在位置20不包含α,α-二取代氨基酸，任选地为AIB，或者选自以下的稳定α螺旋的氨基酸：Leu、Phe、Ala、Met、Gly、Ile、Ser、Asn、Glu、Asp、Lys、和 Arg。在示例性实施方案中，胰高血糖素类似物在位置20相比于SEQ ID NO: 1未修饰，且因此具有作为胰高血糖素在该位置的天然氨基酸的Gln残基。
在示例性实施方案中，当6类胰高血糖素包含位置16-21中的一个或多个（任选位置16）的α螺旋稳定性氨基酸时，且类似物不包含位置20的稳定α螺旋的氨基酸，且当胰高血糖素类似物缺少亲水部分时，胰高血糖素类似物展示出至少0.1％的GIP百分比效力（例如至少1％、至少10％、至少20％）。在示例性实施方案中，胰高血糖素类似物具有对于人GLP-1受体相比于GIP受体小于100倍（例如，小于或约90倍、小于或约80倍、小于或约70倍、小于或约60倍、小于或约50倍、小于或约40倍、小于或约30倍、小于或约20倍、小于或约15倍、小于或约10倍、小于或约5倍）的选择性。在示例性实施方案中，肽对GIP受体的EC50与所述肽对GLP-1受体的EC50小于100倍（例如，小于或约90倍、小于或约80倍、小于或约70倍、小于或约60倍、小于或约50倍、小于或约40倍、小于或约30倍、小于或约20倍、小于或约15倍、小于或约10倍、小于或约5倍）不同，其任选地，与所述肽对胰高血糖素受体的EC50小于100倍（例如，小于或约90倍、小于或约80倍、小于或约70倍、小于或约60倍、小于或约50倍、小于或约40倍、小于或约30倍、小于或约20倍、小于或约15倍、小于或约10倍、小于或约5倍）不同。
在示例性方面中，当6类胰高血糖素类似物包含在位置16-21中的一个或多个的α螺旋稳定性氨基酸且类似物不包含位置20的稳定α螺旋的氨基酸时，胰高血糖素类似物包含位置16的稳定α螺旋的氨基酸，任选地，其中稳定α螺旋的氨基酸为带负电荷的氨基酸（例如Glu或Asp）或α,α-二取代氨基酸。位置16的α,α-二取代氨基酸可以包含R1和R2，其每一个键合至α碳，其中R1和R2每一个独立地选自C1-C4烷基，任选被羟基、酰胺、巯基、卤素取代，或者R1和R2连同它们连接的α碳形成环。在示例性方面中，位置16的氨基酸是AIB。在示例性方面中，6类胰高血糖素类似物包含位置18的小的脂族氨基酸，任选地为Ala，和位置17的Arg。在示例性实施方案中，胰高血糖素类似物包含作为位置16-20的序列ERAAQ (国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NO: 200，所述申请以其整体通过引用并入本文)或位置16-21的ERAAQD (国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NO: 201，所述申请以其整体通过引用并入本文)。
在示例性方面中，6类胰高血糖素类似物包含在位置9、10、12、16、20的任一个处的含有非天然酰基或烷基的氨基酸。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含在位置9、10、12、13、14、16、17、和 20的任一个或多个处共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸。在示例性方面，6类胰高血糖素类似物包含在位置10、14的任一个或多个共价连接至12至C18酰基或烷基的氨基酸。在一些方面中，胰高血糖素类似物包含位置10、12或16处的酰化氨基酸或烷基化氨基酸。在示例性方面中，酰化氨基酸或烷基化氨基酸在位置14。在一些方面，胰高血糖素类似物包含C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸的延伸，且包含位置37-43 (例如， 37、38、39、40、41、42、43)的任一个处的含有非天然酰基或烷基的氨基酸。在一些方面中，包含非天然酰基或烷基的氨基酸在位置40。
在示例性方面中，6类胰高血糖素类似物包含C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸的延伸，在一些方面中，延伸形成如Trp笼的本领域已知的结构。在一些方面中，延伸包含氨基酸序列GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 5) 或GGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 6) 或GPSSGRPPPS (SEQ ID NO: 183)，所有通过引用以其整体并入本文的国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NO，或者具有1、2、或3个保守氨基酸取代的前述的任一者的序列。在可选的方面中，延伸包含至少一个带电荷的氨基酸，例如延伸包含以下的氨基酸序列：X1-X2，其中X1为带电荷的氨基酸（例如带正电荷的氨基酸（例如Arg））且X2为小的脂族氨基酸。在一些方面中，延伸包含Arg-Gly。
在示例性方面中，酰化氨基酸或烷基化氨基酸包含式I（任选Lys）、式II（任选Cys）、或式III（任选Ser）的结构。任选地，在一些方面，酰化氨基酸或烷基化氨基酸包含式I的结构，例如Lys。
在一些实施方案中，酰化或烷基化的氨基酸为包含侧链胺的芳香族氨基酸。在示例性方面中，包含侧链胺的芳香族氨基酸为4-氨基-苯丙氨酸（4-氨基Phe）、对氨基苯基甘氨酸、对氨基高苯丙氨酸、或3-氨基酪氨酸。在示例性方面中，包含侧链胺的芳香族氨基酸为4-氨基-Phe。在示例性方面中，酰化或烷基化的氨基酸为式II的氨基酸，n为2（高丝氨酸）。在示例性方面中，酰化或烷基化氨基酸为Thr或高苏氨酸。在示例性实施方案中，酰化或烷基化氨基酸为包含侧链羟基的芳香族氨基酸，包括但不限于酪氨酸、高酪氨酸、甲基酪氨酸、或3-氨基酪氨酸。
在示例性方面中，6类胰高血糖素类似物包含共价连接至Cx琥珀酰基的氨基酸，其中x为10-26的整数，任选12-18。在示例性方面中，Cx琥珀酰基经间隔基连接至肽或6类胰高血糖素类似物。间隔基可以是本文描述的那些的任一个。
在一些方面中，酰化氨基酸或烷基化氨基酸经间隔基连接至酰基或烷基。在一些方面中，间隔基长度为3-10个原子。在一些方面中，间隔基为氨基酸或二肽，且在一些方面中，间隔基包含一个或两个氨基酸残基例如Glu。在一些方面中，酰基或烷基经连接至氨基酸，其中间隔基与酰基的总长度为长度约14至约28个原子。在一些方面中，间隔基包含Cys。在一些方面中，间隔基包含一个或两个γ-Glu。在一些方面中，间隔基包含Lys。在一些方面中，间隔基包含两个Cys、γ-Glu、和Lys、或两个γ-Glu残基的组合。
在特定方面，间隔基为Cys残基，其共价连接至烷基，例如非官能化的或官能化的碳链。在示例性方面中，Cys残基是S棕榈基烷基化的（例如，S棕榈酸酯烷基化），任选地，其中Cys残基连接至作为肽骨架的一部分的Lys残基。在可选的实施方案中，间隔基是包含Cys残基的二肽，其共价连接至烷基。在示例性方面中，Cys是S棕榈基烷基化的，且Cys连接至间隔基的另一氨基酸，其依次连接至例如作为肽骨架的部分的Lys残基。
在示例性方面中，间隔基包含含有结构 [-O-CH2-CH2-]n的小的聚乙二醇部分（PEG），其中n为2-16的整数（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16）。
关于酰化氨基酸，酰基在一些方面为C12至C18（例如C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18）脂酰基。在一些方面中，酰基为C14或C16脂酰基。在可选方面中，酰基为琥珀酸或琥珀酸衍生物（例如，式V、VI或VII的琥珀酸衍生物）。在可选方面中，酰基为马来酸或马来酸衍生物（例如，式VIII、IX或X的马来酸衍生物）。
关于烷基化氨基酸，非天然烷基在一些方面为结构–Cx-COOH的羧基官能化的碳链，其中x为整数，任选4-30的整数（例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30）。
在示例性方面中，6类肽或6类胰高血糖素类似物包含两个或更多个酰基或烷基。在这方面，肽或胰高血糖素类似物可以是二酰化的或双酰化的肽。两个或更多个酰基或烷基可以以直链形式排列，任选具有间插的间隔基。两个或更多个酰基或烷基可以以支链形式排列，如本文所述。在示例性方面中，两个酰基或烷基连接至Lys间隔基残基。
在本公开的一些方面，6类胰高血糖素类似物包含C末端至位置27的氨基酸的至少一个带电荷的氨基酸。例如，在一些方面，6类胰高血糖素类似物包含在位置28的带电荷的氨基酸（例如带负电荷的氨基酸）。带负电荷的氨基酸在一些方面中是Asp。在可选的方面中，位置28的氨基酸是带正电荷的氨基酸，例如带正电荷的氨基酸是式I的氨基酸，例如Lys。
在可选的或额外的方面中，6类胰高血糖素类似物包含位置27、位置29、或位置27和29两者的氨基酸修饰。例如，位置27的氨基酸在一些方面中是Leu、Nle、Val、或Lys和/或位置29的氨基酸在一些方面中是Gly或Thr。
本文描述的6类胰高血糖素类似物相对于SEQ ID NO: 1可以包含额外氨基酸修饰，例如高至10（例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）个额外氨基酸修饰，如本文进一步讨论。在示例性方面中，6类胰高血糖素类似物包含以下的一个或多个：
a) 肽类似物的位置1的DPP-IV保护性氨基酸；
b) 位置3的酸性氨基酸，任选Glu；
c) 位置7的Ile；
d) 位置12的Ile或Arg；
e) 位置15的酸性氨基酸，任选Glu；
f) 位置18的脂族氨基酸，任选Ala；
g) 位置21的酸性氨基酸，任选Glu；
h) 位置24的Asn、Ala、或AIB；
i) 位置27的脂族氨基酸，任选Ala或Leu、或Nle；
j) 位置28的酸性氨基酸，任选Glu，或脂族氨基酸，任选Ala；
k) 位置29的脂族氨基酸，任选Ala；
l) C末端的酰胺化。
根据前述内容，示例性方面中的6类胰高血糖素类似物包含国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NOs: 27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89、和 90中任一者或SEQ ID NOs: 94-100、102-112、120-124、127-131中任一者的氨基酸序列，所述申请通过引用整体并入本文。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含或由以下组成：国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NOs: 94-100、102-112、120-124、127-131中任一者，所述申请通过引用整体并入本文。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含或由以下组成：国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NOs: 28、29、31、37-41、43-46、76-80、83-87、89、和 90中任一者，所述申请通过引用整体并入本文。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含或由以下组成：国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NOs: 28、29、31、37-41、79、80、89、90、95、130、145-152、155-167、171、176、177、180、203-207、212、和 230中任一者，所述申请通过引用整体并入本文。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含或由以下组成：国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NO: 27，所述申请通过引用整体并入本文。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含或由以下组成：国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NO: 30，所述申请通过引用整体并入本文。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含或由以下组成：国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NO: 32，所述申请通过引用整体并入本文。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含或由以下组成：国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NO: 33，所述申请通过引用整体并入本文。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含或由以下组成：国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NO: 35，所述申请通过引用整体并入本文。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含或由以下组成：国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NO: 36，所述申请通过引用整体并入本文。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含或由以下组成：国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NO: 28，所述申请通过引用整体并入本文。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含或由以下组成：国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NO: 37，所述申请通过引用整体并入本文。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含或由以下组成：国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NO: 89，所述申请通过引用整体并入本文。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含或由以下组成：国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NO: 31，所述申请通过引用整体并入本文。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含或由以下组成：国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NO: 180，所述申请通过引用整体并入本文。
本发明进一步提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 28的序列的肽，所述申请通过引用整体并入本文。在示例性方面中，肽由SEQ ID NO: 28组成。
本发明还提供包含国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NO: 31的序列的肽，所述国际申请以其整体通过引用并入本文。在示例性方面中，肽由SEQ ID NO: 31组成。
本发明进一步提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 37的序列的肽，所述申请通过引用整体并入本文。在示例性方面中，肽由SEQ ID NO: 37组成。
本发明进一步提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 89的序列的肽，所述申请通过引用整体并入本文。在示例性方面中，肽由SEQ ID NO: 89组成。
本发明进一步提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 95的序列的肽，所述申请通过引用整体并入本文。在示例性方面中，肽由SEQ ID NO: 95组成。
本发明进一步提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 130的序列的肽，所述申请通过引用整体并入本文。在示例性方面中，肽由SEQ ID NO: 130组成。
此外，本文提供包含国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NO: 31的序列的肽，所述国际申请以其整体通过引用并入本文。在示例性方面中，肽由SEQ ID NO: 171组成。
本发明还提供包含国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NO: 180的序列的肽，所述国际申请以其整体通过引用并入本文。在示例性方面中，肽由SEQ ID NO: 180组成。
本发明提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 184的序列的肽，所述申请通过引用整体并入本文，
其中：
X2为AIB；
X3为Gln或Gln类似物；
X10为Tyr或共价连接至C12或C18酰基或烷基的氨基酸；
X16 为任何氨基酸，任选地，除Gly、Pro和Ser以外的任何氨基酸；
X18是Arg或Ala；
X20 为带负电荷的氨基酸或电荷中性的氨基酸，任选为AIB或Gln；
X21 为酸性氨基酸，任选为Asp或Glu；
X27 为Leu、Ala、Nle、或Met；
X28 为Ala或酸性氨基酸（任选为Asp或Glu）；
X29是Arg或Gly；
X35 为Ala或碱性氨基酸（任选为Arg或Lys）；
其中，当X28为酸性氨基酸时，X35为碱性氨基酸；
其中，当X10为Tyr时，肽包含位置40的共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且其中，任选地，肽包含位置41的Gly，和
其中肽的C末端氨基酸被酰胺化。
在示例性方面中，SEQ ID NO: 184的X10为Tyr时，肽包含位置40的共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且肽任选包含位置41的Gly。在示例性方面中，SEQ ID NO: 184的X10为共价连接至C12-C18酰基或烷基的氨基酸。
在示例性方面中，SEQ ID NO: 184的X20为Gln，且任选地，位置16的氨基酸为带负电荷的氨基酸（例如Glu）。在示例性方面中，SEQ ID NO: 184的X18为Ala，且肽包含E16、R17、A18、A19、和 Q20。
在可选的示例性方面中，SEQ ID NO: 184的X20为AIB。任选地，SEQ ID NO: 184的X16为除了AIB之外的任何氨基酸。
而且，在一些方面中，（i）SEQ ID NO: 184的X28为酸性氨基酸，任选Asp或Glu，且SEQ ID NO: 184的X35为碱性氨基酸，任选Arg或Lys，（ii）SEQ ID NO: 184的X27、X28和X29中仅一者为Ala，（iii）肽在C末端包含酰胺化的Gly。
本发明还提供包含相对于SEQ ID NO: 184具有高至3个氨基酸修饰(例如保守取代)的SEQ ID NO: 184的序列的肽，其中所述类似物展示出对人GIP受体、人GLP-1受体和人胰高血糖素受体每种的激动剂活性。在示例性实施方案中，胰高血糖素类似物对人GIP受体、人GLP-1受体和人胰高血糖素受体的每个的活性（例如EC50）在彼此的100倍内（例如在50倍内、25倍内、10倍内）。
本发明另外提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 185的序列的肽，所述申请通过引用整体并入本文，
其中：
X2为AIB；
X10为Tyr或共价连接至C12或C18酰基或烷基的氨基酸；
X16 为Glu、α,α-二取代氨基酸、Lys或
X18是Arg或Ala；
X20是AIB或Gln；
X21是Asp或Glu；
X27 为Leu、Nle、或Met；
X28是Ala、Asp或Glu；
X29 是Gly或Thr；
和
其中，当X10为Tyr时，肽包含位置40的共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且其中，任选地，肽包含位置41的Gly，和
其中肽的C末端氨基酸被酰胺化。
本发明还提供包含相对于SEQ ID NO: 185具有高至3个氨基酸修饰(例如保守取代)的SEQ ID NO: 185的序列的肽，其中所述类似物展示出对人GIP受体、人GLP-1受体和人胰高血糖素受体每种的激动剂活性。在示例性实施方案中，胰高血糖素类似物对人GIP受体、人GLP-1受体和人胰高血糖素受体的每个的活性（例如EC50）在彼此的100倍内（例如在50倍内、25倍内、10倍内）。
本发明还提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 196的序列的肽，所述申请通过引用整体并入本文，
其中：
X2为AIB；
X3为Gln或Gln类似物或降低胰高血糖素活性的氨基酸（任选为Glu）；
X10为Tyr或共价连接至C12或C18酰基或烷基的氨基酸；
X16 为任何氨基酸，任选地，除Gly、Pro和Ser以外的任何氨基酸；
X18是Arg或Ala；
X20 为带负电荷的氨基酸或电荷中性的氨基酸，任选为AIB或Gln；
X21 为酸性氨基酸，任选为Asp或Glu；
X27 为Leu、Ala、Nle、或Met；
X28 为Ala或酸性氨基酸（任选为Asp或Glu）；
X29是Arg或Gly；
X35 为Ala或碱性氨基酸（任选为Arg或Lys）；
其中，当X28为酸性氨基酸时，X35为碱性氨基酸；
其中，当X10为Tyr时，肽包含位置40的共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且其中，任选地，肽包含位置41的Gly，和
其中肽的C末端氨基酸被酰胺化。
降低胰高血糖素活性的额外氨基酸描述于本文。在示例性方面中，X3为酸性、碱性、或疏水性氨基酸（例如谷氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸）。在示例性方面中，X3为Glu。
此外提供包含国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NO: 186的序列的肽，所述国际申请以其整体通过引用并入本文，
其中：
X2为AIB；
X3为Gln或Gln类似物；
X10为Tyr或共价连接至C10至C26酰基或烷基的氨基酸；
X16 为任何氨基酸，任选地，除Gly、Pro和Ser以外的任何氨基酸；
X18是Arg或Ala；
X20 为带负电荷的氨基酸或电荷中性的氨基酸，任选为AIB或Gln；
X21 为酸性氨基酸（任选为Asp或Glu）；
X27 为Leu、Ala、Nle、或Met；
X28 为Ala或酸性氨基酸（任选为Asp或Glu）；
X29是Ala、Gly或Thr；和
其中肽包含共价连接至C10至C26酰基或烷基的氨基酸，任选地，在位置10，且肽的C末端氨基酸为酰胺化的。
在示例性方面中，SEQ ID NO: 186的X20为AIB。在示例性方面中，X29为Thr且肽不包含GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 5)。在一些方面中，SEQ ID NO: 186的X20为AIB且X16为除AIB之外的氨基酸。
在示例性方面中，X20为Gln。在一些方面中，X16为带负电荷的氨基酸，任选Glu。在示例性方面中，X18为Ala，且任选地肽包含E16、R17、A18、A19、和 Q20。
在一些方面中，SEQ ID NO: 186的肽包含C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸的延伸，且任选地位置29的氨基酸为Gly。在示例性方面中，延伸包含GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 5)的氨基酸序列或其保守取代的序列，或其中延伸包含序列X1-X2，其中X1为带电荷的氨基酸且X2为小的脂族氨基酸，任选地，其中X1为带正电荷的氨基酸。在一些方面中，带正电荷的氨基酸为Arg且任选地肽包含Arg-Gly或由其组成。在某些方面，延伸包含氨基酸序列GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 5)随后为Lys或Lys-Gly，其中Lys共价连接至C10至C26酰基。
在示例性方面中，肽包含SEQ ID NO: 186，其中X2为AIB，X3为Gln，X10为共价连接至C10至C26酰基或烷基的氨基酸，X18为Arg或Ala，X20为AIB或Gln，X21为Asp或Glu，X29为Gly，且C末端氨基酸为酰胺化的，其中位置29的Gly融合至GPSSGAPPPS随后为Lys或Lys-Gly，其中Lys共价连接至C10-C26酰基。
本发明还提供包含相对于SEQ ID NO: 186具有高至3个氨基酸修饰(例如保守取代)的SEQ ID NO: 186的序列的肽，其中所述类似物展示出对人GIP受体、人GLP-1受体和人胰高血糖素受体每种的激动剂活性。在示例性实施方案中，胰高血糖素类似物对人GIP受体、人GLP-1受体和人胰高血糖素受体的每个的活性（例如EC50）在彼此的100倍内（例如在50倍内、25倍内、10倍内）。
本发明提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 187的序列的肽，所述申请通过引用整体并入本文：
其中：
X2为AIB；
X10为Tyr或共价连接至C10至C26酰基或烷基的氨基酸；
X16 为Glu、α,α-二取代氨基酸或Lys；
X18是Arg或Ala；
X20 为带负电荷的氨基酸或电荷中性的氨基酸，任选为AIB或Gln；
X21是Asp或Glu；
X27 为Leu、Ala、Nle、或Met；
X28是Ala、Asp或Glu；
X29是Gly或Thr；和
其中肽包含共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，任选地，在位置10，且肽的C末端氨基酸为酰胺化的。
本发明还提供包含相对于SEQ ID NO: 187具有高至3个氨基酸修饰(例如保守取代)的SEQ ID NO: 187的序列的肽，其中所述类似物展示出对人GIP受体、人GLP-1受体和人胰高血糖素受体每种的激动剂活性。在示例性实施方案中，胰高血糖素类似物对人GIP受体、人GLP-1受体和人胰高血糖素受体的每个的活性（例如EC50）在彼此的100倍内（例如在50倍内、25倍内、10倍内）。
本发明提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 198的序列的肽，所述申请通过引用整体并入本文：
其中：
X2为AIB；
X3为Gln或Gln类似物或降低胰高血糖素活性的氨基酸（例如Glu）；
X10为Tyr或共价连接至C10至C26酰基或烷基的氨基酸；
X16 为任何氨基酸，任选地，除Gly、Pro和Ser以外的任何氨基酸；
X18是Arg或Ala；
X20 为带负电荷的氨基酸或电荷中性的氨基酸，任选为AIB或Gln；
X21 为酸性氨基酸（任选为Asp或Glu）；
X27 为Leu、Ala、Nle、或Met；
X28 为Ala或酸性氨基酸（任选为Asp或Glu）；
X29是Ala、Gly或Thr；和
其中肽包含共价连接至C10至C26酰基或烷基的氨基酸，任选地，在位置10，且肽的C末端氨基酸为酰胺化的。
降低胰高血糖素活性的额外氨基酸描述于本文。在示例性方面中，X3为酸性、碱性、或疏水性氨基酸（例如谷氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸）。在示例性方面中，X3为Glu。
本发明提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 184的肽，所述申请通过引用整体并入本文。本发明提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 185的肽，所述申请通过引用整体并入本文。本发明提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 196的肽，所述申请通过引用整体并入本文。本发明提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 186的肽，所述申请通过引用整体并入本文。本发明提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 187的肽，所述申请通过引用整体并入本文。本发明提供包含国际申请号PCT/US11/66164中的SEQ ID NO: 198的肽，所述申请通过引用整体并入本文。
此外，本文提供具有GIP激动剂活性的胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)类似物，其包含：
（a）位置1的包含咪唑侧链的氨基酸，
（b）位置16的式IV的氨基酸：
[式IV],
其中n为1-7，其中R1和R2的每一个独立地选自H、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、和 (C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，其中R7为H或OH，其中任选地式IV的氨基酸的侧链包含游离氨基，
（c）位置20的α,α-二取代氨基酸，
（d）相对于SEQ ID NO: 1高至10个额外的氨基酸修饰，
其中，当类似物缺少亲水部分时，胰高血糖素类似物展示出天然GIP对GIP受体至少0.1％的活性，其中胰高血糖素类似物具有对人GLP-1受体相比于GIP受体少于100倍的选择性。
在示例性实施方案中，具有GIP激动剂活性的胰高血糖素类似物(SEQ ID NO: 1)包含以下的一个或多个：
（a）位置1的包含咪唑侧链的氨基酸，
（b）位置16的式IV的氨基酸：
[式IV],
其中n为1-7，其中R1和R2各自独立地选自H、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2 、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、和 (C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，其中R7为H或OH，任选地，其中式IV的氨基酸侧链包含游离氨基，
（c）位置20的α,α-二取代氨基酸，
（d）相对于SEQ ID NO: 1高至10个额外的氨基酸修饰，
其中，其中类似物缺乏异源部分，例如亲水部分（例如PEG），胰高血糖素类似物展示天然GIP对GIP受体的活性的至少或约0.1％（例如，至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约80%、至少或约100%、至少或约500%）。在示例性实施方案中，肽对GIP受体的EC50与所述肽对GLP-1受体的EC50小于100倍（例如，小于或约90倍、小于或约80倍、小于或约70倍、小于或约60倍、小于或约50倍、小于或约40倍、小于或约30倍、小于或约20倍、小于或约15倍、小于或约10倍、小于或约5倍）不同，其任选地，与所述肽对胰高血糖素受体的EC50小于100倍（例如，小于或约90倍、小于或约80倍、小于或约70倍、小于或约60倍、小于或约50倍、小于或约40倍、小于或约30倍、小于或约20倍、小于或约15倍、小于或约10倍、小于或约5倍）不同。
在示例性实施方案中，胰高血糖素类似物在位置1包含含有式A的结构的氨基酸
[式A],
其中R1和R2的每一个独立地选自H、(C1-6)烷基、O(C1-6)烷基、(C1-6)烷基-OH、F、和 (C1-C6)烷基（其中至少一个H被F取代）。
在示例性方面，位置1的氨基酸为胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的天然残基L-组氨酸（His）、或为His的衍生物（His衍生物），例如D-组氨酸、脱氨基组氨酸、羟组氨酸、乙酰组氨酸、高组氨酸、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、或α,α-二甲基咪唑乙酸（DMIA）。
在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含在（b）中位置16的式IV的氨基酸，为高Lys、Lys、Orn、或2,4-二氨基丁酸(Dab)。
在示例性方面中，位置20的氨基酸例如α,α-二取代氨基酸包含R1和R2，其每一个键合至α碳，其中R1和R2每一个独立地选自C1-C4烷基，任选被羟基、酰胺、巯基、卤素取代，或者R1和R2连同它们连接的α碳形成环。在示例性方面中，位置20的α,α-二取代的是AIB。在其他示例性方面中，位置20的α,α-二取代的是ACPC。
在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含相对于SEQ ID NO: 1的高至10个额外的修饰。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含相对于SEQ ID NO: 1在位置2、12、17、18、21、24、27、28、和 29的一个或多个处的氨基酸取代。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含以下的一个或多个：
i. 位置2的DPP-IV保护性氨基酸，任选AIB或D-Ser；
ii. 位置12的大的、脂族、非极性氨基酸，任选Ile；
iii. 位置17的除Arg以外的氨基酸，任选Gln；
iv. 位置18的小的、脂族氨基酸，任选Ala；
v. 位置21的除Asp以外的氨基酸，任选Glu；
vi. 位置24的除Gln以外的氨基酸，任选Asn或Ala；
vii. 位置27的除Met以外的氨基酸，任选Leu；
viii. 位置28的除Asn以外的氨基酸，任选Ala；
ix. 位置29的除Thr以外的氨基酸，任选Gly；和
x. C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸的延伸。
在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含GPSSGAPPPS或GPSSGAPPPSC的延伸。
在示例性方面中，包含位置1的His、位置16的Lys和位置20的AIB的胰高血糖素类似物不包含位置17-18的Gln-Ala。
在其他示例性实施方案中，胰高血糖素类似物包含国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NOs: 48、52、53、和 74中任一者的氨基酸序列，所述申请通过引用整体并入本文。此类胰高血糖素类似物在结构上与国际申请号PCT/US11/66164（所述申请通过引用整体并入本文）的SEQ ID NOs: 27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89、和 90的那些是类似的，例外是前者胰高血糖素类似物(SEQ ID NOs: 48、52、53、和 74)不包含酰化氨基酸或烷基化氨基酸。
在仍其他示例性实施方案中，胰高血糖素类似物包含SEQ ID NOs: 50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88、和 92 或SEQ ID NOs: 114-119、125、126、和 133的任何、或SEQ ID NOs: 139-144、150-153、208、210、和 211的任何的氨基酸序列，所有SEQ ID NO参考国际申请号PCT/US11/66164，其通过引用整体并入本文。此类胰高血糖素类似物在位置1包含大的、芳香族氨基酸，例如Tyr。
在一些实施方案中，胰高血糖素超家族肽包含SEQ ID NOs: 27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89、90、94-100、102-112、120-124、和 127-131的任何，或SEQ ID NOs: 48、52、53、和 74的任何，或SEQ ID NOs: 50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88、92、114-119、125、126、和 133的任何的氨基酸序列，所有SEQ ID NO参考国际申请号PCT/US11/66164，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，GIP激动剂肽包含国际申请号PCT/US11/66164的SEQ ID NOs: 28、29、31、37-41、79、80、89、90、95、130、145-152、155-167、171、176、177、180、203-207、212、和 230中任何的氨基酸序列，所述申请通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，胰高血糖素超家族肽包含基于含有以下的亲本序列的结构：SEQ ID NOs: 27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89、90、94-100、102-112、120-124、和 127-131的任一者，或SEQ ID NOs: 48、52、53、和 74的任一者，或SEQ ID NOs: 50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88、92、114-119、125、126、和 133的任一者，或SEQ ID NOs: 28、29、31、37-41、79、80、89、90、95、130、145-152、155-167、171、176、177、180、203-207、212、和 230的任一者，所有SEQ ID NO参考国际申请号PCT/US11/66164（其通过引用整体并入本文），但与亲本序列在一个或多个位置不同。
在一些或任何实施方案中，本公开的肽为含有以下的亲本序列的类似物：SEQ ID NOs: 27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89、90、94-100、102-112、120-124、和 127-131的任一者，或SEQ ID NOs: 48、52、53、和 74的任一者，或SEQ ID NOs: 50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88、92、114-119、125、126、和 133的任一者，或SEQ ID NOs: 28、29、31、37-41、79、80、89、90、95、130、145-152、155-167、171、176、177、180、203-207、212、和 230的任一者，所有SEQ ID NO参考国际申请号PCT/US11/66164（其通过引用整体并入本文），其包含基于亲本序列的氨基酸序列的氨基酸序列，但与亲本序列不同，这是由于类似物的氨基酸序列包含一个或多个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个）且在一些情况下16或更多个（例如17、18、19、20、21、22、23、24、25等）说明的或任选的氨基酸修饰。在一些或任何实施方案中，本公开的肽包含相对于亲本文序列总计1、高至2、高至3、高至4、高至5、高至6、高至7、高至8、高至9或高至10个额外的氨基酸修饰，亲本序列包含国际申请号PCT/US11/66164（其通过引用以其整体并入本文）的SEQ ID NOs: 27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89、90、94-100、102-112、120-124、和 127-131的任一者，或SEQ ID NOs: 48、52、53、和 74的任一者，或SEQ ID NOs: 50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88、92、114-119、125、126、和 133的任一者，或SEQ ID NOs: 28、29、31、37-41、79、80、89、90、95、130、145-152、155-167、171、176、177、180、203-207、212、和 230的任一者。在一些或任何实施方案中，修饰为本文公开的关于胰高血糖素类似物的那些中的任一种，例如酰化、烷基化、PEG化、在C末端截短、位置1、2、3、7、10、12、15、16、17、18、19、20、21、23、24、27、28、和 29的一个或多个的氨基酸的取代。
在一些或任何实施方案中，修饰为氨基酸取代或替代，例如保守氨基酸取代。在一些方面中，保守取代为位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28 或29的一个或多个的氨基酸替代。在可选的实施方案中，氨基酸取代不是保守氨基酸取代，例如是非保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，本公开的肽包含与亲本序列的氨基酸序列具有至少25％序列同一性的氨基酸序列，其包含SEQ ID NOs: 27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89、90、94-100、102-112、120-124、和 127-131的任一者，或SEQ ID NOs: 48、52、53、和 74的任一者，或SEQ ID NOs: 50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88、92、114-119、125、126、和 133的任一者，或SEQ ID NOs: 28、29、31、37-41、79、80、89、90、95、130、145-152、155-167、171、176、177、180、203-207、212、和 230的任一者，所有SEQ ID NO参考国际申请号PCT/US11/66164（其通过引用整体并入本文）。在一些实施方案中，本公开的肽包含与亲本序列具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或具有大于90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有上述％序列同一性的本公开的肽的氨基酸序列是本公开的肽的全长氨基酸序列。在一些实施方案中，具有上述％序列同一性的本公开的肽的氨基酸序列是本公开的肽的氨基酸序列的仅一部分。在一些实施方案中，本公开的肽包含与亲本序列的至少5个邻接氨基酸（例如至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸）的参考氨基酸序列具有约A％或更大的序列同一性的氨基酸序列，其中参考氨基酸序列开始于SEQ ID NO: 1的位置C的氨基酸且终止与SEQ ID NO: 1的位置D的氨基酸，其中A为25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99；C为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28且D为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28 或29。设想前述参数的任何和全部可能的组合，包括但不限于，例如，其中A为90％且C和D为1和27，或6和27、或8和27、或10和27、或12和27、或16和27。
描述于本文的亲本序列的类似物可以包含任何数目氨基酸的肽骨架，即可以是任何肽长度，所述亲本序列包含SEQ ID NOs: 27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89、和 90的任一者，或SEQ ID NOs: 48、52、53、和 74的任一者，或SEQ ID NOs: 50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88、和 92的任一者，或含有任何SEQ ID NOs: 28、29、31、37-41、79、80、89、90、95、130、145-152、155-167、171、176、177、180、203-207、212、和 230的任一者，所有SEQ ID NO参考国际申请号PCT/US11/66164（其通过引用整体并入本文）。在一些实施方案中，本文描述的肽与SEQ ID NO: 1长度相同，即为长度29个氨基酸。在一些实施方案中，本公开的肽长度长于29个氨基酸，例如，本公开的肽包含1-21个氨基酸的C末端延伸，如本文进一步所述。因此，本公开的肽在一些实施方案中，长度为30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个氨基酸。在一些实施方案中，本公开的肽长度高至50个氨基酸。在一些实施方案中，由于与另一肽融合，本公开的肽长度长于29个氨基酸（例如大于50个氨基酸，（例如，长度为至少或约60个、至少或约70个、至少或约80个、至少或约90个、至少或约100个、至少或约150个、至少或约200个、至少或约250个、至少或约300个、至少或约350个、至少或约400个、至少或约450个、至少或约500个氨基酸）。在其他实施方案中，本公开的肽长度小于29个氨基酸，例如28、27、26、25、24、23个氨基酸。
根据前述内容，在一些方面中，本公开内容的肽为含有以下的亲本序列的类似物：SEQ ID NOs: 27-33、35-41、43-46、76-80、83-87、89、90、94-100、102-112、120-124、和 127-131的任一者，或SEQ ID NOs: 48、52、53、和 74的任一者，或SEQ ID NOs: 50、51、54、56、58-60、62-66、68-70、72、73、75、81、82、88、92、114-119、125、126、和 133的任一者，或SEQ ID NOs: 28、29、31、37-41、79、80、89、90、95、130、145-152、155-167、171、176、177、180、203-207、212、和 230的任一者，所有SEQ ID NO参考国际申请号PCT/US11/66164（其通过引用整体并入本文），所述类似物的序列包含一个或多个氨基酸修饰，所述氨基酸修饰影响GIP活性、胰高血糖素活性、和/或GLP-1活性，增强稳定性，例如通过降低肽的降解（例如通过改善对DPP-IV蛋白酶的抗性），增强溶解性，增加半衰期，延迟作用的起始，延长对GIP、胰高血糖素、或GLP-1受体的作用的持续时间，或任何前述内容的组合。除了其他修饰外，此类氨基酸修饰关于胰高血糖素类似物进一步描述于本文，且这些修饰的任何可以单独或组合应用。
进一步的示例性实施方案
在示例性实施方案中，本公开的肽为胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的类似物，其包含：（i）位置1的包含咪唑侧链的氨基酸，（ii）位置2的DPP-IV保护性氨基酸，（iii）位置9、10、12、16、20、或37-43的任一者的酰化氨基酸或烷基化氨基酸，任选地，其中酰基或烷基经间隔基连接至氨基酸；（iv）位置20的选自以下的氨基酸：（i）α,α-二取代氨基酸；和（ii）包含咪唑侧链的氨基酸；和（v）相对于SEQ ID NO: 1高至10个额外的氨基酸修饰，其中当胰高血糖素类似物未缀合至异源部分例如亲水部分（例如PEG）时，胰高血糖素类似物展示出天然GIP对GIP受体的活性的至少或约0.1％（例如，至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约80%、至少或约100%、至少或约500%）。
本文描述的胰高血糖素类似物可以包含本文描述的任何活性概况。在示例性方面中，胰高血糖素类似物展示出至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约90%、至少或约100%、至少或约300%、或至少或约500%的GIP百分比效力。在一些方面中，胰高血糖素类似物还展示出至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约90%、至少或约100%、至少或约300%、或至少或约500%的GLP-1百分比效力。在可选或额外方面中，胰高血糖素类似物展示出至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约90%、或至少或约100%的胰高血糖素百分比效力。因此，尽管胰高血糖素类似物可以考虑作为GIP激动剂肽，但在一些方面中，胰高血糖素类似物额外可以考虑作为GIP-GLP-1共激动剂、GIP-胰高血糖素共激动剂、或GIP-GLP-1-胰高血糖素三激动剂。例如，肽可以展示出对人GIP受体、人GLP-1受体和任选人胰高血糖素受体每种的激动剂活性，其中肽展示出对GIP受体的EC50在其对GLP-1受体的EC50的100倍内（例如，50倍、40倍、30倍、20倍、15倍、10倍、或更少）和任选地在其对胰高血糖素受体的EC50的100倍内（例如，50倍、40倍、30倍、20倍、15倍、10倍、或更少）。
在示例性实施方案中，胰高血糖素类似物包含位置1的含有咪唑侧链的氨基酸。在示例性方面中，位置1的氨基酸包含式A的结构
[式A],
其中R1和R2的每一个独立地选自H、(C1-6)烷基、O(C1-6)烷基、(C1-6)烷基-OH、F、和 (C1-C6)烷基（其中至少一个H被F取代）。在示例性方面中，位置1的氨基酸包含式A的类似物结构，其中环氮(ring nitrogen)的一个或两个连接至C1-C3烷基。
在示例性方面，位置1的氨基酸为胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的天然残基L-组氨酸（His）、或为His的衍生物（His衍生物），例如其中修饰α原子的His衍生物。如本文所用，术语“His衍生物”指包含连接至至少一个碳原子的咪唑（例如包含式A的结构）或取代的咪唑的化学基团。在示例性实施方案中，His衍生物包含类似于组氨酸结构的结构，不同之处在于α胺、α碳、或α羧基被另一化学基团取代。在示例性实施方案中，His衍生物是α取代的组氨酸，其中连接至α碳的氢原子被另一化学基团取代，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、羟基、甲氧基、乙氧基等。His衍生物在一些方面为D-组氨酸、脱氨基组氨酸、羟组氨酸、乙酰组氨酸、高组氨酸、N-甲基组氨酸、α甲基组氨酸、咪唑乙酸、或α,α-二甲基咪唑乙酸（DMIA）。
在一些方面，位置2的DPP-IV保护性氨基酸是D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸、或α氨基异丁酸（AIB）之一。在一些方面，DPP-IV保护性氨基酸为D-Ser、或其保守氨基酸取代，或α,α-二取代氨基酸。在一些方面，α,α-二取代氨基酸包含R1和R2，其每一个键合至α碳，其中R1和R2每一个独立地选自C1-C4烷基，任选被羟基、酰胺、巯基、卤素取代，或者R1和R2连同它们连接的α碳形成环。在一些方面，α,α-二取代氨基酸是AIB。在示例性实施方案，当DPP-IV保护性氨基酸是D-Ser时，GIP激动剂肽未缀合至异源部分，例如亲水部分（例如PEG）。在本公开的其他方面中，DPP-IV保护性氨基酸不是D-丝氨酸。
在示例性方面中，本公开内容的胰高血糖素类似物(SEQ ID NO: 1)在位置20包含α,α-二取代氨基酸。在示例性方面中，α,α-二取代氨基酸包含R1和R2，其每一个键合至α碳，其中R1和R2每一个独立地选自C1-C4烷基，任选被羟基、酰胺、巯基、卤素取代，或者R1和R2连同它们连接的α碳形成环。在一些实施方案中，α,α-二取代氨基酸是1-氨基环丙烷-1-甲酸（ACPC）。在一些方面，位置20的α,α-二取代氨基酸是AIB。在示例性实施方案中，位置16的氨基酸是带电荷的氨基酸，例如带正电荷的氨基酸、带负电荷的氨基酸。在一些方面，当位置20的氨基酸是α,α-二取代氨基酸时，位置16的氨基酸是式IV的带正电荷的氨基酸，例如Lys，或者是带负电荷的氨基酸，例如Glu。在一些方面中，当位置20的氨基酸为α,α-二取代氨基酸时，位置16的氨基酸是电荷中性的氨基酸，例如Ser、Ala、Gly。在示例性方面中，位置16的氨基酸为小的脂族氨基酸（例如Ala）、α,α-二取代氨基酸（例如AIB）、或包含咪唑侧链的氨基酸（例如His）。在示例性方面中，胰高血糖素类似物在胰高血糖素类似物的位置17包含Arg、Gln或包含咪唑侧链的氨基酸，任选为His。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含位置18的Ala和位置19的Ala。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含位置21的Glu。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含位置27的Leu或Nle，位置28的Asp或Glu，和位置29的Gly。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸的C末端延伸。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含C末端酰胺替代C末端残基的α羧基。
在示例性方面中，本公开内容的胰高血糖素类似物(SEQ ID NO: 1)在位置20包含含有咪唑侧链的氨基酸。在示例性方面中，包含咪唑侧链的氨基酸包含式A的结构：
[式A],
其中R1和R2的每一个独立地选自H、(C1-6)烷基、O(C1-6)烷基、(C1-6)烷基-OH、F、和 (C1-C6)烷基（其中至少一个H被F取代）。合适的包含咪唑侧链的氨基酸描述于本文。在示例性方面中，位置20的氨基酸包含式A的类似物结构，其中环氮(ring nitrogen)的一个或两个连接至C1-C3烷基。在一些方面中，位置20的氨基酸为His或His衍生物。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含位置16的带负电荷的氨基酸，例如Glu。在示例性方面中，胰高血糖素类似物在胰高血糖素类似物的位置17包含Arg、Gln或包含咪唑侧链的氨基酸，任选为His。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含位置18的Ala和位置19的Ala。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含位置27的Leu或Nle，位置28的Asp或Glu，和位置29的Gly。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸的C末端延伸。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含C末端酰胺替代C末端残基的α羧基。
在示例性实施方案中，本公开的肽为胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的类似物，其包含：（i）位置3的选自以下氨基酸：Ala、Leu、Ile、Val、正缬氨酸、高丝氨酸、Met、和甲硫氨酸砜；（ii）位置9、10、12、16、20、或37-43的任一者的酰化氨基酸或烷基化氨基酸，任选地，其中酰基或烷基经间隔基连接至氨基酸；（iii）位置16-21的一个或多个的稳定α螺旋的氨基酸；和（v）相对于SEQ ID NO: 1高至10个额外的氨基酸修饰，其中当胰高血糖素类似物未缀合至异源部分例如亲水部分（例如PEG）时，胰高血糖素类似物展示出天然GIP对GIP受体的活性的至少或约0.1％（例如，至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约80%、至少或约100%、至少或约500%）。
包含赋予对胰高血糖素受体降低的活性的氨基酸修饰的胰高血糖素类似物可以包含本文所述的任何活性概况。在示例性方面中，胰高血糖素类似物展示出至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约90%、至少或约100%、至少或约300%、或至少或约500%的GIP百分比效力。在一些方面中，胰高血糖素类似物还展示出至少或约1%、至少或约10%、至少或约50%、至少或约90%、至少或约100%、至少或约300%、或至少或约500%的GLP-1百分比效力。因此，尽管胰高血糖素类似物可以考虑作为GIP激动剂肽，但在一些方面中，胰高血糖素类似物额外可以考虑作为GIP-GLP-1共激动剂。例如，肽可以展示出对人GIP受体和人GLP-1受体的激动剂活性，其中所述肽展示出对GIP受体的EC50在其对GLP-1受体的EC50的100倍（例如50倍、40倍、30倍、20倍、15倍、10倍或更低）内。
在示例性实施方案中，胰高血糖素类似物包含位置1的含有咪唑侧链的氨基酸。在示例性方面中，位置1的氨基酸包含式A的结构
[式A],
其中R1和R2的每一个独立地选自H、(C1-6)烷基、O(C1-6)烷基、(C1-6)烷基-OH、F、和 (C1-C6)烷基（其中至少一个H被F取代）。在示例性方面中，位置1的氨基酸包含式A的类似物结构，其中环氮(ring nitrogen)的一个或两个连接至C1-C3烷基。
在示例性方面，位置1的氨基酸为胰高血糖素(SEQ ID NO: 1)的天然残基L-组氨酸（His）、或为His的衍生物（His衍生物），例如其中修饰α原子的His衍生物。如本文所用，术语“His衍生物”指包含连接至至少一个碳原子的咪唑（例如包含式A的结构）或取代的咪唑的化学基团。在示例性实施方案中，His衍生物包含类似于组氨酸结构的结构，不同之处在于α胺、α碳、或α羧基被另一化学基团取代。在示例性实施方案中，His衍生物是α取代的组氨酸，其中连接至α碳的氢原子被另一化学基团取代，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、羟基、甲氧基、乙氧基等。His衍生物在一些方面为D-组氨酸、脱氨基组氨酸、羟组氨酸、乙酰组氨酸、高组氨酸、N-甲基组氨酸、α甲基组氨酸、咪唑乙酸、或α,α-二甲基咪唑乙酸（DMIA）。
在一些方面，胰高血糖素类似物包含位置2的DPP-IV保护性氨基酸。在示例性方面中，DPP-IV保护性氨基酸是D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸、或α氨基异丁酸（AIB）之一。在一些方面，DPP-IV保护性氨基酸为D-Ser、或其保守氨基酸取代，或α,α-二取代氨基酸。在一些方面，α,α-二取代氨基酸包含R1和R2，其每一个键合至α碳，其中R1和R2每一个独立地选自C1-C4烷基，任选被羟基、酰胺、巯基、卤素取代，或者R1和R2连同它们连接的α碳形成环。在一些方面，α,α-二取代氨基酸是AIB。在示例性实施方案，当DPP-IV保护性氨基酸是D-Ser时，GIP激动剂肽未缀合至异源部分，例如亲水部分（例如PEG）。在本公开的其他方面中，DPP-IV保护性氨基酸不是D-丝氨酸。
在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含位置16-21的一个或多个的稳定α螺旋的氨基酸。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含位置16的稳定α螺旋的氨基酸，任选地，带负电荷的氨基酸（例如Glu）或α,α-二取代氨基酸。在示例性方面中，α,α-二取代氨基酸包含R1和R2，其每一个键合至α碳，其中R1和R2每一个独立地选自C1-C4烷基，任选被羟基、酰胺、巯基、卤素取代，或者R1和R2连同它们连接的α碳形成环。在示例性方面中，α,α-二取代氨基酸是AIB。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含位置17的Arg和位置18的小脂族氨基酸，任选为Ala。在示例性方面中，胰高血糖素类似物在位置20相比于SEQ ID NO: 1未修饰，且位置20的氨基酸为Gln。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含位置16的Glu、位置17的Arg、位置18的Ala、位置19的Ala、和位置20的Gln。
在前述内容的示例性方面中，胰高血糖素类似物包含位置9、10、12、16、20的任一者的酰化或烷基化氨基酸。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含在位置9、10、12、13、14、16、17、和 20的任一个或多个处共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸。在示例性实施方案中，胰高血糖素类似物包含位置10的酰化或烷基化的氨基酸。在一些方面，胰高血糖素类似物包含C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸的延伸，且包含位置37-43 (例如，37、38、39、40、41、42、43)的任一个处的酰化或烷基化的氨基酸。在一些方面中，包含非天然酰基或烷基的氨基酸在位置40。
在前述内容的示例性方面中，胰高血糖素类似物包含C末端至位置29的氨基酸的1-21个氨基酸的延伸，在一些方面中，延伸形成如Trp笼的本领域已知的结构。在一些方面中，延伸包含提交于2012年10月22日的美国临时申请61/716878（其以其整体通过并入本文）的氨基酸序列GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 5) 或GGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 6) 或GPSSGRPPPS (SEQ ID NO:68)，或者具有1、2、或3个保守氨基酸取代的前述之一的序列。在示例性方面中，当胰高血糖素类似物包含1-21个氨基酸的延伸时，胰高血糖素类似物包含位置29的Gly。
在示例性方面中，酰化氨基酸或烷基化氨基酸包含式I（任选Lys）、式II（任选Cys）、或式III（任选Ser）的结构。任选地，在一些方面，酰化氨基酸或烷基化氨基酸包含式I的结构，例如Lys。
在一些方面中，酰化氨基酸或烷基化氨基酸经间隔基连接至酰基或烷基。在一些方面中，间隔基长度为3-10个原子。在一些方面中，间隔基为氨基酸或二肽，且在一些方面中，间隔基包含一个或两个氨基酸残基例如Glu。在一些方面中，酰基或烷基经连接至氨基酸，其中间隔基与酰基的总长度为长度约14至约28个原子。在一些方面中，间隔基包含一个或两个γ-Glu。
关于酰化氨基酸，酰基在一些方面为C12至C18（例如C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18）脂酰基。在一些方面中，酰基为C14或C16脂酰基。
在前述实施方案的示例性方面中，胰高血糖素类似物在位置15、位置21、或位置28，或位置15和21、在位置15和28，或在位置21和28，或在位置15、21和28包含Glu。
在本公开的一些方面，胰高血糖素类似物包含C末端至位置27的氨基酸的至少一个带电荷的氨基酸。例如，在一些方面，胰高血糖素类似物包含在位置28的带电荷的氨基酸（例如带负电荷的氨基酸）。带负电荷的氨基酸在一些方面中是Asp或Glu。带负电荷的氨基酸在一些方面中是Glu。在可选的方面中，位置28的氨基酸是带正电荷的氨基酸，例如带正电荷的氨基酸是式I的氨基酸，例如Lys。
在可选的或额外的方面中，胰高血糖素类似物包含位置27、位置29、或位置27和29两者的氨基酸修饰。例如，位置27的氨基酸在一些方面中是Leu、Nle、Val、或Lys和/或位置29的氨基酸在一些方面中是Gly或Thr。
在一些方面中，位置28的氨基酸为Asp，且任选地，位置29的氨基酸为除了Gly之外的氨基酸，例如Val、Ala或AIB。
本文描述的胰高血糖素类似物相对于SEQ ID NO: 1可以包含额外氨基酸修饰，例如高至10（例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）个额外氨基酸修饰，如本文进一步讨论。在示例性方面中，胰高血糖素类似物包含以下的一个或多个：
i. 位置7的Ile；
ii. 位置12的Ile或Arg；
iii. 位置18的脂族氨基酸，任选Ala；
iv. 位置21的酸性氨基酸，任选Glu；
v. 位置24的Asn、Ala、或AIB；
vi. 位置27的脂族氨基酸，任选Ala或Leu、或Nle；
vii. 位置28的酸性氨基酸，任选Glu，或脂族氨基酸，任选Ala；
viii. 位置29的脂族氨基酸，任选Ala；
ix. C末端的酰胺化。
根据上述内容，在示例性方面中的胰高血糖素类似物包含SEQ ID NOs: 19、21-26、28、287、289-294、296、520、522-527、和 529的任何的 或SEQ ID NOs: 30、31、32、33、35、37、38、41、298、299、300、301、303、305、306、309、531、532、533、534、536、538、539、和 542的任何氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成，所有SEQ ID NO参考2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878，其以其整体通过引用并入。
本发明提供包含2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878中的SEQ ID NO: 66的序列，所述申请以其整体通过引用并入本文，
其中：
X2为AIB；
X3为Gln或包含结构I、II或III的侧链结构的氨基酸；
X10为Tyr或共价连接至C12或C18酰基或烷基的氨基酸；
X15为酸性氨基酸，任选为Glu或Asp；
X16为任何氨基酸，任选地，除Gly、Pro、和 Ser以外的任何氨基酸，例如Glu、Ala、α,α-二取代氨基酸（例如AIB）、His、Lys，
X17是Arg、His、Gln；
X18是Arg或Ala；
X19为Ala或α,α-二取代氨基酸（例如AIB）；
X20选自：α,α-二取代氨基酸（例如AIB）或Gln或His、Lys、或Ala；
X21 为酸性氨基酸，任选为Asp或Glu；
X27 为Leu、Ala、Nle、或Met；
X28 为Ala或酸性氨基酸（任选为Asp或Glu）；
X29 为脂族的，例如Ala或Gly或AIB或Val；
X30 为小的脂族氨基酸，例如Ala或Gly
X35 为Ala或碱性氨基酸（任选为Arg或Lys）；
其中，当X28为酸性氨基酸时，X35为碱性氨基酸；
任选地，其中，当X28为Asp时，则X29不是Gly
其中，当X10为Tyr时，肽包含位置40的共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，其中，任选地，肽包含位置41的Gly，和
其中肽的C末端氨基酸被酰胺化。
在SEQ ID NO: 66的肽的示例性方面中，X10为共价连接至C12-C18酰基或烷基的氨基酸。在示例性方面中，X28为Glu和任选地，X15为Glu和/或X21为Glu。在示例性方面中，位置15、21和28的每一个。在示例性方面中，X18为Ala且X19为Ala和任选地，X20为α,α-二取代氨基酸，例如AIB。在示例性方面中，X16为Glu、Ala、AIB、His、或Lys；X17为Arg、His 或Gln，且X21为Glu。在可选的示例性方面中，X20为Lys 或His且任选地X16为Glu，X17为Arg，和X21为Asp。在可选的方面中，X18为Ala和X19为α,α-二取代氨基酸(例如AIB)且任选地，X16为Glu、X17为Arg、和X21为Glu。而且，在示例性方面中，X20为Ala或Lys。在SEQ ID NO: 66的肽的示例性方面中，X29为Ala、Gly、Val、或α,α-二取代氨基酸，任选地AIB。
在SEQ ID NO: 66的肽的示例性方面中，X10为Tyr和共价连接至C12-C18酰基或烷基的氨基酸位于位置40。在示例性方面中，肽包含位置41的Gly。在示例性方面中，X9或X15为Glu。
在SEQ ID NO: 66的肽的示例性方面中，酰基或烷基连接至包含式I、式II或式III的结构的氨基酸。在示例性方面中，式I的氨基酸是Lys。而且，在示例性方面中，酰基或烷基经间隔基连接至肽的氨基酸，任选作为二肽的氨基酸的间隔基。在示例性方面中，间隔基是一个或两个氨基酸残基。
在SEQ ID NO: 66的肽的示例性方面中，X3为Gln或乙酰二氨基丁酸或乙酰Lys或乙酰鸟氨酸或甲基亚砜(methyl sulfoxide)。在示例性方面中，肽包含位置27的Leu，位置29的Gly和C末端至位置29的Gly的GPSSGAPPPS。
在示例性方面中，肽包含2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878中的SEQ ID NOs: 15-28、34、36、39、42、43、44、52、53、63-65、283-296、302、304、307、310、311、312、320、321、330-332、516-529、535、537、540、543、544、545、553、554、和 563-565中任一者的序列，所述申请以其整体通过引用并入本文。
本发明还提供包含相对于SEQ ID NO: 66具有高至3个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 66的序列的肽，其中所述肽展示出对人GIP受体、人GLP-1受体和/或人胰高血糖素受体的激动剂活性。氨基酸修饰可以为本文所述那些的任一种。
本发明还提供包含以下序列的肽
（a）以下的序列：
（提交于2012年10月22日的美国临时申请61/716878的SEQ ID NO: 67，其整体通过引用并入）
其中：
X1为包含侧链咪唑的氨基酸，任选地，His或His衍生物；
X2为DPP-IV保护性氨基酸，任选地，α,α-二取代氨基酸（例如AIB）；
X3选自Glu、Ala、Leu、Ile、Nle、Val、NorVal、高丝氨酸、Met、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、乙酰-Orn、乙酰基-二氨基丁酸、乙酰-Lys；
X10为共价连接至C12或C18酰基或烷基的氨基酸；
X15为酸性氨基酸，任选为Glu或Asp；
X16为任何氨基酸，任选地，除Gly、Pro、和 Ser以外的任何氨基酸，（例如Glu、Ala、α,α-二取代氨基酸（例如AIB）、His、Lys）
X17是Arg、His、Gln；
X18是Arg或Ala；
X19为Ala或α,α-二取代氨基酸；
X20选自：α,α-二取代氨基酸（例如AIB）或Gln或His、Lys、或Ala；
X21 为酸性氨基酸，任选为Asp或Glu；
X27 为Leu、Ala、Nle、或Met；
X28 为Ala或酸性氨基酸（任选为Asp或Glu）；
X29 为脂族的，例如Ala或Gly或AIB或Val；
X30 为小的脂族氨基酸，例如Ala或Gly
X35 为Ala或碱性氨基酸（任选为Arg或Lys）；
其中，当X28为酸性氨基酸时，X35为碱性氨基酸；
任选地，其中，当X28为Asp时，则X29不是Gly
其中，当X10为Tyr时，肽包含位置40的共价连接至C12至C18酰基或烷基的氨基酸，且其中，任选地，肽包含位置41的Gly，
其中肽的C末端氨基酸被酰胺化。
在包含SEQ ID NO: 67的肽的示例性方面中，所述肽包含：X1为His；X2为AIB；X16为Glu；X17为Arg；X18为Ala；X19为Ala；X20为Gln；X27为Leu；X29为Gly；X30为Gly；X35为Ala；或其组合。在示例性方面中，肽包含2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878中的SEQ ID NO: 29-42、297-310、和 530-543的序列，所述申请以其整体通过引用并入本文。
本发明还提供包含相对于SEQ ID NO: 67具有高至3个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 67的序列的肽，其中所述肽展示出对人GIP受体、人GLP-1受体和/或人胰高血糖素受体的激动剂活性。氨基酸修饰可以为本文所述那些的任一种。
本发明进一步提供包含2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878中的SEQ ID NO: 18的序列，所述申请以其整体通过引用并入本文。在示例性方面中，肽基本上由SEQ ID NO: 18组成或由其组成。
本发明还提供包含2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878中的SEQ ID NO: 43的序列，所述申请以其整体通过引用并入本文。在示例性方面中，肽基本上由SEQ ID NO: 43组成或由其组成。
本文还提供包含相对于SEQ ID NO: 18具有高至3个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 18的序列或相对于SEQ ID NO: 43具有高至3个氨基酸修饰的SEQ ID NO: 43的序列的肽，其中所述肽展示出对人GIP受体和人GLP-1受体的激动剂活性。
本发明还提供包含2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878中的SEQ ID NOs: 100-282；或SEQ ID NOs: 333-515中任一者的序列的肽，所述申请以其整体通过引用并入本文。还提供包含相对于2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878（所述申请以其整体通过引用并入本文）的SEQ ID NO: 43具有高至3个氨基酸修饰的2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878（所述申请以其整体通过引用并入本文）的SEQ ID NOs: 100-282；SEQ ID NOs: 333-515中任一者的序列的肽，其中所述肽展示出对人GIP受体和人GLP-1受体的激动剂活性。
在一些实施方案中，胰高血糖素类似物包含基于含有SEQ ID NOs: 15-42、43、44、52、53、63-65、100-312、320、321、330-543、544、545、553、554、和 563-565的任一者的亲本序列的结构，每一SEQ ID NO参考2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878，其通过引用整体并入本文，但与亲本序列在一个或多个位置不同。
在一些或任何实施方案中，本公开的肽为包含SEQ ID NOs: 15-42、43、44、52、53、63-65、100-312、320、321、330-543、544、545、553、554、和 563-565（每一SEQ ID NO参考2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878，其通过引用整体并入本文）中任一者的亲本序列的类似物，其包含基于亲本序列的氨基酸序列的氨基酸序列，但与亲本序列不同，这是由于类似物的氨基酸序列包含一个或多个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个）且在一些情况下16或更多个（例如17、18、19、20、21、22、23、24、25等）说明的或任选的氨基酸修饰。在一些或任何实施方案中，本公开的肽包含相对于含有SEQ ID NOs: 15-42、43、44、52、53、63-65、100-312、320、321、330-543、544、545、553、554、和 563-565的任一者的亲本序列的总计1、高至2、高至3、高至4、高至5、高至6、高至7、高至8、高至9或高至10个额外氨基酸修饰。在一些或任何实施方案中，修饰为本文公开的关于胰高血糖素类似物的那些中的任一种，例如酰化、烷基化、PEG化、在C末端截短、位置1、2、3、7、10、12、15、16、17、18、19、20、21、23、24、27、28、和 29的一个或多个的氨基酸的取代。
在一些或任何实施方案中，修饰为氨基酸取代或替代，例如保守氨基酸取代。在一些方面中，保守取代为位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28 或29的一个或多个的氨基酸替代。在可选的实施方案中，氨基酸取代不是保守氨基酸取代，例如是非保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，本公开的肽包含与亲本序列的氨基酸序列具有至少25％序列同一性的氨基酸序列，其包含2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878的SEQ ID NOs: 15-42、43、44、52、53、63-65、100-312、320、321、330-543、544、545、553、554、和 563-565的任一者，所述申请以其整体通过引用并入本文。在一些实施方案中，本公开的肽包含与亲本序列具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或具有大于90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有上述％序列同一性的本公开的肽的氨基酸序列是本公开的肽的全长氨基酸序列。在一些实施方案中，具有上述％序列同一性的本公开的肽的氨基酸序列是本公开的肽的氨基酸序列的仅一部分。在一些实施方案中，本公开的肽包含与亲本序列的至少5个邻接氨基酸（例如至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个氨基酸）的参考氨基酸序列具有约A％或更大的序列同一性的氨基酸序列，其中参考氨基酸序列开始于SEQ ID NO: 1的位置C的氨基酸且终止与SEQ ID NO: 1的位置D的氨基酸，其中A为25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99；C为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28且D为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28 或29。设想前述参数的任何和全部可能的组合，包括但不限于，例如，其中A为90％且C和D为1和27，或6和27、或8和27、或10和27、或12和27、或16和27。
本文描述的包含2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878（其通过引用整体并入本文）的SEQ ID NOs: 15-42、43、44、52、53、63-65、100-312、320、321、330-543、544、545、553、554、和 563-565任一者的亲本序列的类似物可以包含任何数目的氨基酸的肽骨架，即，可以是任何肽长度。在一些实施方案中，本文描述的肽与SEQ ID NO: 1长度相同，即为长度29个氨基酸。在一些实施方案中，本公开的肽长度长于29个氨基酸，例如，本公开的肽包含1-21个氨基酸的C末端延伸，如本文进一步所述。因此，本公开的肽在一些实施方案中，长度为30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个氨基酸。在一些实施方案中，本公开的肽长度高至50个氨基酸。在一些实施方案中，由于与另一肽融合，本公开的肽长度长于29个氨基酸（例如大于50个氨基酸，（例如，长度为至少或约60个、至少或约70个、至少或约80个、至少或约90个、至少或约100个、至少或约150个、至少或约200个、至少或约250个、至少或约300个、至少或约350个、至少或约400个、至少或约450个、至少或约500个氨基酸）。在其他实施方案中，本公开的肽长度小于29个氨基酸，例如28、27、26、25、24、23个氨基酸。
根据前述内容，在一些方面中，本公开的肽为包含2012年10月22日提交的美国临时申请61/716878（其以其整体通过引用并入本文）的SEQ ID NOs: 15-42、43、44、52、53、63-65、100-312、320、321、330-543、544、545、553、554、和 563-565的任一者的亲本序列的类似物，所述类似物的序列包含一个或多个氨基酸修饰，所述氨基酸修饰影响GIP活性、胰高血糖素活性、和/或GLP-1活性，增强稳定性，例如通过降低肽的降解（例如，通过改善对DPP-IV蛋白酶的抗性），增强溶解性，增加半衰期，延迟作用的起始，延长对GIP、胰高血糖素、或GLP-1受体的作用的持续时间，或任何上述内容的组合。除了其他修饰外，此类氨基酸修饰关于胰高血糖素类似物进一步描述于本文，且这些修饰的任何可以单独或组合应用。
本文还提供包含两个或多个本公开的GIP激动剂肽的二聚体和多聚体（例如，2类和/或6类胰高血糖素相关肽）。包含本公开的GIP激动剂肽和缀合物部分的缀合物本文另外提供。在一些方面中，缀合物是包含融合至异源肽的本公开的GIP激动剂肽的融合多肽。本公开还提供包含本公开的GIP激动剂肽、二聚体、多聚体或缀合物（或其组合）的试剂盒。
包含本公开的任何GIP激动剂肽、二聚体、多聚体或缀合物（例如2类和/或6类胰高血糖素相关肽）或其组合、和药学上可接受的载体、稀释剂、或赋形剂的药物组合物可以进一步通过本公开提供。药物组合物优选为无菌的且适合于肠胃外施用。考虑药物组合物，其用于治疗或预防糖尿病或肥胖症或与糖尿病或肥胖症相关的病况的方法。因此，在示例性实施方案中，本公开提供降低体重增加或诱导体重减轻的方法、和/或治疗或预防糖尿病或肥胖症的方法，其通过施用GIP激动剂肽（例如，2类和/或6类胰高血糖素相关肽），任选组合有任何其他抗糖尿病或抗肥胖症剂，包括本文描述的此类药剂。
本领域已知的或在研究中的抗糖尿病剂包括胰岛素、瘦蛋白、肽YY (PYY)、胰肽（PP）、成纤维细胞生长因子21（FGF21）、Y2Y4受体激动剂、磺酰脲类如甲苯磺丁脲（Orinase）、醋酸己脲（Dymelor）、妥拉磺脲（Tolinase）、氯磺丙脲（Diabinese）、格列吡嗪（Glucotrol）、格列本脲（Diabeta、Micronase、Glynase）、格列美脲（亚莫利）或格列齐特（达美康）；氯茴苯酸类如瑞格列奈（Prandin）或那格列奈（Starlix）；双胍类如二甲双胍（格华止）或苯乙双胍；噻唑烷二酮类例如罗格列酮（文迪雅）、吡格列酮（Actos）或曲格列酮（Rezulin）或其他PPARγ抑制剂；抑制碳水化合物消化的α葡萄糖苷酶抑制剂如米格列醇（Glyset）、阿卡波糖（Precose/拜唐苹）；艾塞那肽（Byetta）或普兰林肽；二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂如维格列汀或西格列汀； SGLT（钠依赖性葡萄糖转运蛋白1）抑制剂；葡萄糖激酶激活剂（GKA）；胰高血糖素受体拮抗剂（GRA）；或FBP酶（果糖-1,6-二磷酸酶）抑制剂。
本领域已知的或在研究中的抗肥胖症剂包括食欲抑制剂，包括苯乙胺类刺激剂，芬特明（任选与芬氟拉明或右芬氟拉明）、安非拉酮（Tenuate®）、苯甲曲秦（Prelu-2®、Bontril®）、苄非他明（Didrex®）、西布曲明（Meridia®、Reductil®）；利莫那班（Acomplia®），其他大麻素受体拮抗剂；胃泌酸调节素；盐酸氟西汀（百忧解）； Qnexa（托吡酯和芬特明）、Excalia（安非他酮和唑尼沙胺）或Contrave（安非他酮和纳曲酮）；或脂肪酶抑制剂，类似于赛尼可（奥利司他）或Cetilistat（也称为ATL-962）、或GT389-255。
本文描述的肽在一些实施方案中与治疗非酒精性脂肪肝疾病或NASH的药剂共施用。用于治疗非酒精性脂肪肝疾病的药剂包括熊脱氧胆酸（又名Actigall、URSO、和Ursodiol）、二甲双胍(格华止)、罗格列酮（文迪雅）、氯贝丁酯、吉非贝齐、多粘菌素和甜菜碱。
二肽前体药物单元结构对切割速率的影响
如本文前述，从胰高血糖素超家族肽切割二肽前体药物单元A-B的速率和因此活化前体药物取决于结构（包括N烷基化、取代基的数目、长度和松散性(bulkiness)）和二肽前体药物单元的氨基酸的立体化学。从胰高血糖素超家族肽切割二肽前体药物单元A-B的速率也取决于空间位阻、亲核性、二酮哌嗪形成过程中Q的离去基团的稳定性。这些结构特征的一些描述于下文I类(Category I)、II类和III类，其构成本发明的部分。
I 类：二肽前体药物单元的氨基酸 B 的组成
在一些实施方案中，前体药物的半衰期，例如在生理条件下在PBS中至少约1小时至约1周的A-B从Q的化学切割半衰期(t1/2)取决于B氨基酸上N烷基取代基的存在和长度。例如，在B氨基酸上具有较短的N烷基取代基（例如Gly(N-甲基)）的前体药物将比在B氨基酸上具有更长的N-烷基取代基（例如Gly(N-己基)）的前体药物经历更慢的A-B的切割速率，且具有更长的半衰期。
在一些实施方案中，前体药物的半衰期取决于二肽前体药物单元的B氨基酸的β位的取代度。例如，具有在β位二取代的B氨基酸（例如N-烷基化异亮氨酸）的前体药物将比具有在β位单取代的B氨基酸（例如N-烷基化亮氨酸）的前体药物经历更慢的A-B切割和具有更长的半衰期。此外，具有在β位单取代的B氨基酸（例如N-烷基化亮氨酸）的前体药物将比具有在β位未取代的B氨基酸（例如N-烷基化丙氨酸）的前体药物经历更慢的A-B切割和具有更长的半衰期。仍进一步，具有在β位具有碳的B氨基酸（例如N-烷基化丙氨酸）的前体药物将比具有甘氨酸作为B氨基酸的前体药物经历更慢的A-B切割和具有更长的半衰期。
在一些实施方案中，前体药物的半衰期取决于B氨基酸的侧链的松散度。例如，在B氨基酸上具有更庞大(buklier)的侧链（例如N-烷基化苯丙氨酸）的前体药物将比在B氨基酸上具有更小的侧链（例如N-烷基化丙氨酸）的前体药物经历更慢的A-B的切割且具有更长的半衰期。
二肽前体药物单元的B氨基酸的组成可以分类为以下子类：IA、IB和IC。通常，子类IA的二肽前体药物单元经历最快的切割且子类IC的二肽前体药物单元经历最慢的切割。
子类 IA ：二肽前体药物单元的氨基酸 B 是 N 烷基化甘氨酸
在一些实施方案中，前体药物包含结构：
A-B-Q；
其中Q为胰高血糖素超家族肽；
其中A-B包含结构：
其中
R1 和R2 独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18 烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)、和 C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或R1和R2连同它们连接的原子一起形成C3-C12环烷基；
R3 为C1-C18烷基；
R4 和R8 各自为H；
R5为NHR6；
R6为H或C1-C4烷基，或者R5和R2 连同它们连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和，
R7 选自H、OH、卤素、(C1-C7烷基)、(C2-C7 烯基)、OCF3 、NO2、CN、NC、O(C1-C7烷基)、CO2H、CO2(C1-C7烷基)、NHR6、芳基和杂芳基。
在一些实施方案中，B氨基酸选自甘氨酸(N-甲基)、甘氨酸(N-乙基)、甘氨酸(N-丙基)、甘氨酸(N-丁基)、甘氨酸(N-戊基)、甘氨酸(N-己基)、甘氨酸(N-庚基)、和甘氨酸(N-辛基)。例如，B氨基酸可以是甘氨酸(N-甲基)或甘氨酸(N-己基)。
在一些实施方案中，当R1和R2均为氢时，R3为C1-C4烷基，例如，当A-B缀合至脂族胺时。在一些实施方案中，当R1和R2均为氢时，R3为C5-C8烷基，例如，当A-B缀合至脂族胺时。在一些实施方案中，当R1或R2中至少一个不是氢时，R3为C1-C4烷基，例如，当A-B缀合至脂族胺时。在一些实施方案中，当R1或R2中至少一个不是氢时，R3为C5-C8烷基，例如，当A-B缀合至脂族胺时。
在一些实施方案中，当R1和R2均为氢且R3为甲基时，A-B未缀合至F7GLP-1(8-37)的α氨基。
子类 IB ：二肽前体药物单元的氨基酸 B 在β位置未取代或单取代
在一些实施方案中，前体药物包含结构：
A-B-Q；
其中Q为胰高血糖素超家族肽；
其中A-B包含结构：
其中
R1 和R2 独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18 烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)、和 C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或R1和R2连同它们连接的原子一起形成C3-C12环烷基；
R3 为C1-C18烷基；
R4 选自CH3、CH2(C1-C10烷基)、CH2(C2-C10烯基)、CH2(C0-C10烷基)OH、CH2(C0-C10烷基)SH、CH2(C0-C3烷基)SCH3、CH2(C0-C3烷基)CONH2、CH2(C0-C3烷基)COOH、CH2(C0-C3烷基)NH2、CH2(C0-C3烷基)NHC(NH2 +)NH2、CH2(C0-C3烷基)(C3-C6环烷基)、CH2(C0-C3烷基)(C2-C5杂环)、CH2(C0-C3烷基)(C6-C10芳基)R7、CH2(C1-C3烷基)(C3-C9杂芳基)、和 CH2(C0-C12烷基)(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子；或R4和R3连同它们连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R8 为H,
R5 为NHR6，或R5和R2 连同它们连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R6 为H或C1-C4烷基；和，
R7 选自H、OH、卤素、(C1-C7烷基)、(C2-C7 烯基)、OCF3 、NO2、CN、NC、O(C1-C7烷基)、CO2H、CO2(C1-C7烷基)、NHR6、芳基和杂芳基。
在一些实施方案中，R4 选自CH3、CH2(C1-C4烷基)、CH2(C1-C4)烯基、CH2(C0-C4烷基)OH、CH2(C0-C4烷基)SH、CH2(C0-C3烷基)SCH3、CH2(C0-C3烷基)CONH2、CH2(C0-C3烷基)COOH、CH2(C0-C4烷基)NH2、和CH2(C0-C3烷基)NHC(NH2 +)NH2。
这些实施方案中B氨基酸的非限制性实例包括丙氨酸(N-C1-C10烷基)、亮氨酸(N-C1-C10烷基)、甲硫氨酸(N-C1-C10烷基)、天冬酰胺(N-C1-C10烷基)、谷氨酸(N-C1-C10烷基)、天冬氨酸(N-C1-C10烷基)、谷氨酰胺(N-C1-C10烷基)、组氨酸(N-C1-C10烷基)、赖氨酸(N-C1-C10烷基)、精氨酸(N-C1-C10烷基)、丝氨酸(N-C1-C10烷基)、和半胱氨酸(N-C1-C10烷基)。
在一些实施方案中，B氨基酸选自丙氨酸(N-C1-C6烷基)、亮氨酸(N-C1-C6烷基)、甲硫氨酸(N-C1-C6烷基)、天冬酰胺(N-C1-C6烷基)、谷氨酸(N-C1-C6烷基)、天冬氨酸(N-C1-C6烷基)、谷氨酰胺(N-C1-C6烷基)、组氨酸(N-C1-C6烷基)、赖氨酸(N-C1-C6烷基)、精氨酸(N-C1-C6烷基)、丝氨酸(N-C1-C6烷基)、和半胱氨酸(N-C1-C6烷基)。
例如，B氨基酸可以包括丙氨酸(N-甲基)、亮氨酸(N-甲基)、甲硫氨酸(N-甲基)、天冬酰胺(N-甲基)、谷氨酸(N-甲基)、天冬氨酸(N-甲基)、谷氨酰胺(N-甲基)、组氨酸(N-甲基)、赖氨酸(N-甲基)、精氨酸(N-甲基)、丝氨酸(N-甲基)、和半胱氨酸(N-甲基)。
在一些实施方案中，R4 选自CH2(C0-C3烷基)(C3-C6环烷基)、CH2(C0-C3烷基)(C2-C5杂环)、CH2(C0-C3烷基)(C6-C10芳基)R7、CH2(C1-C3烷基)(C3-C9杂芳基)、和 CH2(C0-C12烷基)(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，和其中R7 选自H和OH。
这些实施方案中的B氨基酸的非限制性实例包括苯丙氨酸(N-C1-C10烷基)、酪氨酸(N-C1-C10烷基)和色氨酸(N-C1-C10烷基)。在一些实施方案中，B氨基酸选自苯丙氨酸(N-C1-C6烷基)、酪氨酸(N-C1-C6烷基)和色氨酸(N-C1-C6烷基)。例如，B氨基酸可以包括苯丙氨酸(N-甲基)、酪氨酸(N-甲基)、和色氨酸(N-甲基)。
在一些实施方案中，B氨基酸是脯氨酸。在一些实施方案中，脯氨酸从子类IB中排除。
子类 IC ：二肽前体药物单元的氨基酸 B 在β位置二取代
在一些实施方案中，前体药物包含结构：
A-B-Q；
其中Q为胰高血糖素超家族肽；
其中A-B包含结构：
其中
R1 和R2 独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)、和 C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或R1和R2连同它们连接的原子一起形成C3-C12环烷基；或R1和R2连同它们连接的原子一起形成C3-C12环烷基；
R3 为C1-C18烷基；
R4 独立选自CH(C1-C8烷基)2、CH (C2-C8 烯基)2、CH(C1-C8烷基)(OH)、CH(C1-C8烷基)((C1-C8烷基)SH)、CH(C1-C3烷基)((C1-C8烷基)(NH2))；
R8 为H；
R5 为NHR6，或R5和R2 连同它们连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R6 为H或C1-C4烷基；和，
R7 选自H、OH、卤素、(C1-C7烷基)、(C2-C7 烯基)、OCF3 、NO2、CN、NC、O(C1-C7烷基)、CO2H、CO2(C1-C7烷基)、NHR6、芳基和杂芳基。
在一些实施方案中，R4为CH(C1-C8烷基)2或CH(C1-C8烷基)OH。B氨基酸的非限制性实例包括异亮氨酸(N-C1-C10烷基)、缬氨酸(N-C1-C10烷基)和苏氨酸(N-C1-C10烷基)。在一些实施方案中，B氨基酸选自异亮氨酸(N-C1-C6烷基)、缬氨酸(N-C1-C6烷基)和苏氨酸(N-C1-C6烷基)。例如，B氨基酸可以包括异亮氨酸(N-甲基)、缬氨酸(N-甲基)、和苏氨酸(N-甲基)。
II 类：二肽前体药物单元的氨基酸 A 的组成
在一些实施方案中，前体药物的半衰期取决于A氨基酸的α位置的取代基数目。例如，包含作为α-单取代氨基酸（例如Ala）的A氨基酸的前体药物比包含作为α,α-二取代氨基酸（例如Aib）的A氨基酸的前体药物将经历更缓慢的切割和具有更长的半衰期。
在一些实施方案中，前体药物的半衰期取决于A氨基酸的α氨基的烷基化程度。通常，烷基化程度越高，前体药物的切割速率越慢且半衰期更长。例如，具有N-烷基化Ala的二肽前体药物单元将比Ala以更慢速率切割，且具有更长半衰期。
二肽前体药物单元的A氨基酸的组成可以分类为以下子类：IIA和IIB。通常，子类IIA中的二肽前体药物单元比子类IIB中的二肽前体药物单元更快切割。
子类 IIA ：二肽前体药物单元的氨基酸 A 在α位置二取代
在一些实施方案中，二肽前体药物单元的A氨基酸在α位置二取代。在这些实施方案中，子类IA、IB和IC中所述的结构的R1和R2 独立选自C1-C10烷基、C2-C10 烯基、(C1-C10烷基)OH、(C1-C10烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)、和 C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或R1和R2连同它们连接的原子一起形成C3-C12环烷基；且其中R7选自H和OH。
例如，A氨基酸可以包括氨基异丁酸（Aib）。
子类 IIB ：二肽前体药物单元的氨基酸 A 在α位置未取代或单取代
在一些实施方案中，二肽前体药物单元的A氨基酸在α位置未取代或单取代。在这些实施方案中，子类IA、IB和IC中所述的结构的R1为H，且子类IA、IB和IC中所述的结构的R2选自H、C1-C10烷基、C2-C10烯基、(C1-C10烷基)OH、(C1-C10烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)、和 C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中R7 选自H和OH，其中W1 为选自N、S和O的杂原子，或R1和R2 连同它们连接的原子一起形成C3-C12环烷基，或者R2和R5 连同它们连接的原子一起形成4、5或6元杂环。
在一些实施方案中，二肽前体药物单元的A氨基酸具有‘d’立体化学。在这些实施方案中A氨基酸的非限制性实例包括赖氨酸、半胱氨酸和丙氨酸。例如，d-赖氨酸、d-半胱氨酸和d-丙氨酸。在一些实施方案中，d-立体化学可以经降低前体药物肽的蛋白水解的降解来增强半衰期。
在一些实施方案中，A氨基酸被具有1-4个碳原子的基团N烷基化，诸如Ala(N-C1-C4烷基)、Lys(N-C1-C4烷基)、和 Cys(N-C1-C4烷基)。例如，A氨基酸可以为Ala(N-甲基)、Lys(N-甲基)、和 Cys(N-甲基)。A氨基酸的N烷基化降低二肽前体药物单元从Q的切割速率并提供更长的半衰期。
III 类：二肽前体药物单元（ A-B ）与胰高血糖素超家族肽（ Q ）的缀合位点
在一些实施方案中，前体药物的半衰期取决于空间位阻、亲核性、和在二酮哌嗪形成过程中在Q上的离去基团的稳定性。离去基团越少空间阻碍，离去基团越低亲核性，或者切割后离去基团越稳定，前体药物的半衰期越短。Q上的离去基团的类型可以通过A-B和Q的氨基之间的连接的类型来确定，如下文子类IIIA和IIIB中所述。通常，子类IIIA中的二肽前体药物单元比子类IIIB中的二肽前体药物单元从Q切割更慢且具有更长的半衰期。
子类 IIIA ：连接至 Q 的亲核氨基的 A-B
在一些实施方案中，A-B经A-B和Q的脂族氨基之间的酰胺键连接至Q，以产生在生理条件下在PBS中具有至少约1小时至约1周的A-B从Q的化学切割半衰期(t1/2)的前体药物，如本文之前所述。
在一些实施方案中，A-B经A-B与Q的N末端氨基酸的α氨基之间的酰胺键连接至Q。例如，具有子类IA、IB和IC的任一者的B氨基酸和子类IIA和IIB的任一者的A氨基酸的二肽前体药物单元可以连接至Q的N末端氨基酸，以产生在生理条件下在PBS中具有至少约1小时至约1周的A-B从Q的化学切割半衰期(t1/2)的前体药物。
在一些实施方案中，A-B经A-B与Q的氨基酸的侧链上的脂族氨基之间的酰胺键连接至Q。例如，具有子类IA、IB和IC的任一者的B氨基酸和子类IIA和IIB的任一者的A氨基酸的二肽前体药物单元可以连接至Q的的氨基酸的侧链的脂族氨基，以产生在生理条件下在PBS中具有至少约1小时至约1周的A-B从Q的化学切割半衰期(t1/2)的前体药物。
在一些实施方案中，当A-B经A-B与Q的脂族氨基之间的酰胺键连接至Q时，A应为α,α-二取代氨基酸（子类IIA）或者B应为N烷基化的（子类IA、IB或IC中任一者），或两者。例如，当A为α-单取代氨基酸（例如Ala），B为未N烷基化的，且A-B经Q的脂族氨基连接至Q时，则应不存在A-B的显著切割。
在其他实施方案中，当A-B连接至F7GLP-1(8-37)的α氨基时，A-B不是Gly-Gly(N-Me)。
在其他任选的实施方案中，当A-B经A-B和Q的脂族氨基之间的酰胺键连接至Q，和A为在α位置未取代的氨基酸（例如甘氨酸）且B为来自子类IA的氨基酸（N烷基化甘氨酸）时，则B氨基酸的N烷基取代基具有至少五个碳原子的长度（例如N-C5-C8烷基）。
在仍其他实施方案中，当A-B经A-B和Q的脂族氨基之间的酰胺键连接至Q，和A氨基酸为在α位置未取代的或单取代的（子类IIB）时，B氨基酸不是脯氨酸。在一些实施方案中，当A-B经A-B与Q的脂族氨基之间的酰胺键连接至Q时，A-B不是Gly-Pro。在一些实施方案中，当B氨基酸是脯氨酸时，A氨基酸来自子类IIA。
子类 IIIB ：连接至 Q 的芳香族氨基的 A-B
在一些实施方案中，A-B经A-B和Q的氨基酸的侧链的芳香族氨基之间的酰胺键连接至Q，以产生在生理条件下在PBS中具有至少约1小时至约1周的A-B从Q的化学切割半衰期(t1/2)的前体药物，如本文之前所述。例如，具有子类IA、IB和IC的任一者的B氨基酸和子类IIA和IIB的任一者的A氨基酸的二肽前体药物单元可以连接至Q的的氨基酸的侧链的芳香族氨基，以产生在生理条件下在PBS中具有至少约1小时至约1周的A-B从Q的化学切割半衰期(t1/2)的前体药物。
由I类限定的任何B氨基酸可以与由II类限定的任何A氨基酸组合以形成二肽前体药物单元。二肽前体药物单元可以连接至III类中描述的任何位置。前体药物的半衰期可以经以下选择来调节：
（i）A氨基酸的α位置的取代基数目；
（ii）A和B氨基酸的N烷基化程度；
（iii）B氨基酸的β位置的取代基数目；
（iv）B氨基酸的侧链的松散度；和
（iii）空间位阻、亲核性、和二酮哌嗪形成过程中Q上的离去基团的稳定性。
二肽前体药物单元 A-B 的修饰
上述的二肽前体药物单元可以进一步修饰以包含亲水部分、酰基、或烷基，如之前本文所述。在一些实施方案中，二肽前体药物单元包括经其侧链氨基缀合至酰基或烷基的赖氨酸。在一些实施方案中，二肽前体药物单元包括经侧链巯基缀合至亲水部分(例如，40 kD PEG)的半胱氨酸。亲水部分、酰基、或烷基可以直接或经间隔基缀合至二肽前体药物单元。在一些示例性实施方案中，亲水基团、烷基和/或酰基缀合至二肽前体药物单元的A氨基酸。
在一些实施方案中，以下二肽前体药物单元被PEG化：dCys-Gly(N-己基) 、dCys-Gly(N-甲基)、和 dCys-Phe(N-甲基)。在一些实施方案中，以下二肽前体药物单元包括酰基：dLys-Gly(N-己基)、dLys-Gly(N-甲基)、和 dLys-Phe(N-甲基)。在一些实施方案中，以下二肽前体药物单元包括烷基：dLys-Gly(N-己基)、dLys-Gly(N-甲基)、和 dLys-Phe(N-甲基)。
示例性实施方案
本发明的二肽前体药物单元可以包括来自I类的任何B氨基酸与来自II类的任何A氨基酸的组合。适合于二肽前体药物单元的A氨基酸和B氨基酸的氨基酸非限制性实例列于下表中。
表4:
氨基酸# 氨基酸‘A’ 氨基酸‘B’
1 Aib Gly(N-C1-C8烷基)
2 Gly Ala(N-C1-C8烷基)
3 Ala Leu(N-C1-C8烷基)
4 Leu Met(N-C1-C8烷基)
5 Met Asn(N-C1-C8烷基)
6 Asn Glu(N-C1-C8烷基)
7 Glu Asp(N-C1-C8烷基)
8 Asp Gln(N-C1-C8烷基)
9 Gln His(N-C1-C8烷基)
10 His Lys(N-C1-C8烷基)
11 Lys Arg(N-C1-C8烷基)
12 Arg Ser(N-C1-C8烷基)
13 Ser Cys(N-C1-C8烷基)
14 Cys Pro
15 Pro Phe(N-C1-C8烷基)
16 Phe Tyr(N-C1-C8烷基)
17 Tyr Trp(N-C1-C8烷基)
18 Trp Ile(N-C1-C8烷基)
19 Ile Val(N-C1-C8烷基)
20 Val Thr(N-C1-C8烷基)
21 Thr d-Ala(N-C1-C8烷基)
22 d-Ala d-Leu(N-C1-C8烷基)
23 d-Leu d-Met(N-C1-C8烷基)
24 d-Met d-Asn(N-C1-C8烷基)
25 d-Asn d-Glu(N-C1-C8烷基)
26 d-Glu d-Asp(N-C1-C8烷基)
27 d-Asp d-Gln(N-C1-C8烷基)
28 d-Gln d-His(N-C1-C8烷基)
29 d-His d-Lys(N-C1-C8烷基)
30 d-Lys d-Arg(N-C1-C8烷基)
31 d-Arg d-Ser(N-C1-C8烷基)
32 d-Ser d-Cys(N-C1-C8烷基)
33 d-Cys d-Pro
34 d-Pro d-Phe(N-C1-C8烷基)
35 d-Phe d-Tyr(N-C1-C8烷基)
36 d-Tyr d-Trp(N-C1-C8烷基)
37 d-Trp d-Ile(N-C1-C8烷基)
38 d-Ile d-Val(N-C1-C8烷基)
39 d-Val d-Thr(N-C1-C8烷基)
40 d-Thr Gly(N-甲基)
41 Gly(N-甲基) Ala(N-甲基)
42 Ala(N-甲基) Leu(N-甲基)
43 Leu(N-甲基) Met(N-甲基)
44 Met(N-甲基) Asn(N-甲基)
45 Asn(N-甲基) Glu(N-甲基)
46 Glu(N-甲基) Asp(N-甲基)
47 Asp(N-甲基) Gln(N-甲基)
48 Gln(N-甲基) His(N-甲基)
49 His(N-甲基) Lys(N-甲基)
50 Lys(N-甲基) Arg(N-甲基)
51 Arg(N-甲基) Ser(N-甲基)
52 Ser(N-甲基) Cys(N-甲基)
53 Cys(N-甲基) Phe(N-甲基)
54 Phe(N-甲基) Tyr(N-甲基)
55 Tyr(N-甲基) Trp(N-甲基)
56 Trp(N-甲基) Ile(N-甲基)
57 Ile(N-甲基) Val(N-甲基)
58 Val(N-甲基) Thr(N-甲基)
59 Thr(N-甲基) d-Ala(N-甲基)
60 d-Ala(N-甲基) d-Leu(N-甲基)
61 d-Leu(N-甲基) d-Met(N-甲基)
62 d-Met(N-甲基) d-Asn(N-甲基)
63 d-Asn(N-甲基) d-Glu(N-甲基)
64 d-Glu(N-甲基) d-Asp(N-甲基)
65 d-Asp(N-甲基) d-Gln(N-甲基)
66 d-Gln(N-甲基) d-His(N-甲基)
67 d-His(N-甲基) d-Lys(N-甲基)
68 d-Lys(N-甲基) d-Arg(N-甲基)
69 d-Arg(N-甲基) d-Ser(N-甲基)
70 d-Ser(N-甲基) d-Cys(N-甲基)
71 d-Cys(N-甲基) d-Phe(N-甲基)
72 d-Phe(N-甲基) d-Tyr(N-甲基)
73 d-Tyr(N-甲基) d-Trp(N-甲基)
74 d-Trp(N-甲基) d-Ile(N-甲基)
75 d-Ile(N-甲基) d-Val(N-甲基)
76 d-Val(N-甲基) d-Thr(N-甲基)
77 d-Thr(N-甲基) Gly(N-己基)
78 Ala(N-己基)
79 Leu(N-己基)
80 Met(N-己基)
81 Asn(N-己基)
82 Glu(N-己基)
83 Asp(N-己基)
84 Gln(N-己基)
85 His(N-己基)
86 Lys(N-己基)
87 Arg(N-己基)
88 Ser(N-己基)
89 Cys(N-己基)
90 Phe(N-己基)
91 Tyr(N-己基)
92 Trp(N-己基)
93 Ile(N-己基)
94 Val(N-己基)
95 Thr(N-己基)
96 d-Ala(N-己基)
97 d-Leu(N-己基)
98 d-Met(N-己基)
99 d-Asn(N-己基)
100 d-Glu(N-己基)
101 d-Asp(N-己基)
102 d-Gln(N-己基)
103 d-His(N-己基)
104 d-Lys(N-己基)
105 d-Arg(N-己基)
106 d-Ser(N-己基)
107 d-Cys(N-己基)
108 d-Phe(N-己基)
109 d-Tyr(N-己基)
110 d-Trp(N-己基)
111 d-Ile(N-己基)
112 d-Val(N-己基)
113 d-Thr(N-己基)
在一些实施方案中，二肽前体药物单元包括A1-A77任何一个与B1-B113任何一个的组合。例如，二肽前体药物单元的A氨基酸和B氨基酸的组合可以包括：
子类 IA ：二肽前体药物单元的氨基酸 B 是 N- 烷基化的甘氨酸
在一些实施方案中，二肽前体药物单元的B氨基酸是N-烷基化的甘氨酸。在下表中显示了以N-烷基化的甘氨酸作为B氨基酸的二肽前体药物单元的非限制性实例。
表5
二肽前体药物单元# 氨基酸‘A’ 氨基酸‘B’
1 Aib Gly(N-C1-C8烷基)
2 d-Ala Gly(N-C1-C8烷基)
3 d-Lys Gly(N-C1-C8烷基)
4 d-Cys Gly(N-C1-C8烷基)
5 Aib Gly(N-甲基)
6 d-Ala Gly(N-甲基)
7 d-Lys Gly(N-甲基)
8 d-Cys Gly(N-甲基)
9 Aib Gly(N-己基)
10 d-Ala Gly(N-己基)
11 d-Lys Gly(N-己基)
12 d-Cys Gly(N-己基)
子类 IB ：二肽前体药物单元的氨基酸 B 在β位置上是未取代的或单取代的
在一些实施方案中，二肽前体药物单元的B 氨基酸在β位置上是未取代的或单取代的并且具有相对不庞大的侧链。在下表中显示了具有在β位置上未取代的或单取代的B 氨基酸和相对不庞大侧链的二肽前体药物单元的非限制性实例。
表6
二肽前体药物单元# 氨基酸‘A’ 氨基酸‘B’
13 Aib Ala(N-C1-C8烷基)
14 d-Ala Ala(N-C1-C8烷基)
15 d-Lys Ala(N-C1-C8烷基)
16 d-Cys Ala(N-C1-C8烷基)
17 Aib Leu(N-C1-C8烷基)
18 d-Ala Leu(N-C1-C8烷基)
19 d-Lys Leu(N-C1-C8烷基)
20 d-Cys Leu(N-C1-C8烷基)
21 Aib Met(N-C1-C8烷基)
22 d-Ala Met(N-C1-C8烷基)
23 d-Lys Met(N-C1-C8烷基)
24 d-Cys Met(N-C1-C8烷基)
25 Aib Asn(N-C1-C8烷基)
26 d-Ala Asn(N-C1-C8烷基)
27 d-Lys Asn(N-C1-C8烷基)
28 d-Cys Asn(N-C1-C8烷基)
29 Aib Glu(N-C1-C8烷基)
30 d-Ala Glu(N-C1-C8烷基)
31 d-Lys Glu(N-C1-C8烷基)
32 d-Cys Glu(N-C1-C8烷基)
33 Aib Asp(N-C1-C8烷基)
34 d-Ala Asp(N-C1-C8烷基)
35 d-Lys Asp(N-C1-C8烷基)
36 d-Cys Asp(N-C1-C8烷基)
37 Aib Gln(N-C1-C8烷基)
38 d-Ala Gln(N-C1-C8烷基)
39 d-Lys Gln(N-C1-C8烷基)
40 d-Cys Gln(N-C1-C8烷基)
41 Aib His(N-C1-C8烷基)
42 d-Ala His(N-C1-C8烷基)
43 d-Lys His(N-C1-C8烷基)
44 d-Cys His(N-C1-C8烷基)
45 Aib Lys(N-C1-C8烷基)
46 d-Ala Lys(N-C1-C8烷基)
47 d-Lys Lys(N-C1-C8烷基)
48 d-Cys Lys(N-C1-C8烷基)
49 Aib Arg(N-C1-C8烷基)
50 d-Ala Arg(N-C1-C8烷基)
51 d-Lys Arg(N-C1-C8烷基)
52 d-Cys Arg(N-C1-C8烷基)
53 Aib Ser(N-C1-C8烷基)
54 d-Ala Ser(N-C1-C8烷基)
55 d-Lys Ser(N-C1-C8烷基)
56 d-Cys Ser(N-C1-C8烷基)
57 Aib Cys(N-C1-C8烷基)
58 d-Ala Cys(N-C1-C8烷基)
59 d-Lys Cys(N-C1-C8烷基)
60 d-Cys Cys(N-C1-C8烷基)
61 Aib Pro
62 d-Ala Pro
63 d-Lys Pro
64 d-Cys Pro
65 Aib Ala(N-甲基)
66 d-Ala Ala(N-甲基)
67 d-Lys Ala(N-甲基)
68 d-Cys Ala(N-甲基)
69 Aib Leu(N-甲基)
70 d-Ala Leu(N-甲基)
71 d-Lys Leu(N-甲基)
72 d-Cys Leu(N-甲基)
73 Aib Met(N-甲基)
74 d-Ala Met(N-甲基)
75 d-Lys Met(N-甲基)
76 d-Cys Met(N-甲基)
77 Aib Asn(N-甲基)
78 d-Ala Asn(N-甲基)
79 d-Lys Asn(N-甲基)
80 d-Cys Asn(N-甲基)
81 Aib Glu(N-甲基)
82 d-Ala Glu(N-甲基)
83 d-Lys Glu(N-甲基)
84 d-Cys Glu(N-甲基)
85 Aib Asp(N-甲基)
86 d-Ala Asp(N-甲基)
87 d-Lys Asp(N-甲基)
88 d-Cys Asp(N-甲基)
89 Aib Gln(N-甲基)
90 d-Ala Gln(N-甲基)
91 d-Lys Gln(N-甲基)
92 d-Cys Gln(N-甲基)
93 Aib His(N-甲基)
94 d-Ala His(N-甲基)
95 d-Lys His(N-甲基)
96 d-Cys His(N-甲基)
97 Aib Lys(N-甲基)
98 d-Ala Lys(N-甲基)
99 d-Lys Lys(N-甲基)
100 d-Cys Lys(N-甲基)
101 Aib Arg(N-甲基)
102 d-Ala Arg(N-甲基)
103 d-Lys Arg(N-甲基)
104 d-Cys Arg(N-甲基)
105 Aib Ser(N-甲基)
106 d-Ala Ser(N-甲基)
107 d-Lys Ser(N-甲基)
108 d-Cys Ser(N-甲基)
109 Aib Cys(N-甲基)
110 d-Ala Cys(N-甲基)
111 d-Lys Cys(N-甲基)
112 d-Cys Cys(N-甲基)
113 Aib Ala(N-己基)
114 d-Ala Ala(N-己基)
115 d-Lys Ala(N-己基)
116 d-Cys Ala(N-己基)
117 Aib Leu(N-己基)
118 d-Ala Leu(N-己基)
119 d-Lys Leu(N-己基)
120 d-Cys Leu(N-己基)
121 Aib Met(N-己基)
122 d-Ala Met(N-己基)
123 d-Lys Met(N-己基)
124 d-Cys Met(N-己基)
125 Aib Asn(N-己基)
126 d-Ala Asn(N-己基)
127 d-Lys Asn(N-己基)
128 d-Cys Asn(N-己基)
129 Aib Glu(N-己基)
130 d-Ala Glu(N-己基)
131 d-Lys Glu(N-己基)
132 d-Cys Glu(N-己基)
133 Aib Asp(N-己基)
134 d-Ala Asp(N-己基)
135 d-Lys Asp(N-己基)
136 d-Cys Asp(N-己基)
137 Aib Gln(N-己基)
138 d-Ala Gln(N-己基)
139 d-Lys Gln(N-己基)
140 d-Cys Gln(N-己基)
141 Aib His(N-己基)
142 d-Ala His(N-己基)
143 d-Lys His(N-己基)
144 d-Cys His(N-己基)
145 Aib Lys(N-己基)
146 d-Ala Lys(N-己基)
147 d-Lys Lys(N-己基)
148 d-Cys Lys(N-己基)
149 Aib Arg(N-己基)
150 d-Ala Arg(N-己基)
151 d-Lys Arg(N-己基)
152 d-Cys Arg(N-己基)
153 Aib Ser(N-己基)
154 d-Ala Ser(N-己基)
155 d-Lys Ser(N-己基)
156 d-Cys Ser(N-己基)
157 Aib Cys(N-己基)
158 d-Ala Cys(N-己基)
159 d-Lys Cys(N-己基)
160 d-Cys Cys(N-己基)
在一些实施方案中，二肽前体药物单元的B 氨基酸在β位置上是单取代的并且具有相对庞大的侧链，如下表显示。
表7
二肽前体药物单元# 氨基酸‘A’ 氨基酸‘B’
161 Aib Phe(N-C1-C8烷基)
162 d-Ala Phe(N-C1-C8烷基)
163 d-Lys Phe(N-C1-C8烷基)
164 d-Cys Phe(N-C1-C8烷基)
165 Aib Tyr(N-C1-C8烷基)
166 d-Ala Tyr(N-C1-C8烷基)
167 d-Lys Tyr(N-C1-C8烷基)
168 d-Cys Tyr(N-C1-C8烷基)
169 Aib Trp(N-C1-C8烷基)
170 d-Ala Trp(N-C1-C8烷基)
171 d-Lys Trp(N-C1-C8烷基)
172 d-Cys Trp(N-C1-C8烷基)
173 Aib Phe(N-甲基)
174 d-Ala Phe(N-甲基)
175 d-Lys Phe(N-甲基)
176 d-Cys Phe(N-甲基)
177 Aib Tyr(N-甲基)
178 d-Ala Tyr(N-甲基)
179 d-Lys Tyr(N-甲基)
180 d-Cys Tyr(N-甲基)
181 Aib Trp(N-甲基)
182 d-Ala Trp(N-甲基)
183 d-Lys Trp(N-甲基)
184 d-Cys Trp(N-甲基)
185 Aib Phe(N-己基)
186 d-Ala Phe(N-己基)
187 d-Lys Phe(N-己基)
188 d-Cys Phe(N-己基)
189 Aib Tyr(N-己基)
190 d-Ala Tyr(N-己基)
191 d-Lys Tyr(N-己基)
192 d-Cys Tyr(N-己基)
193 Aib Trp(N-己基)
194 d-Ala Trp(N-己基)
195 d-Lys Trp(N-己基)
196 d-Cys Trp(N-己基)
子类 IC ：在β位置上二取代的二肽前体药物单元的氨基酸 B
在一些实施方案中，二肽前体药物单元的B 氨基酸在β位置上是二取代的。在下表中显示了具有在β位置上二取代的B 氨基酸的二肽前体药物单元的非限制性实例。
表8
二肽前体药物单元# 氨基酸‘A’ 氨基酸‘B’
197 Aib Ile(N-C1-C8烷基)
198 d-Ala Ile(N-C1-C8烷基)
199 d-Lys Ile(N-C1-C8烷基)
200 d-Cys Ile(N-C1-C8烷基))
201 Aib Val(N-C1-C8烷基)
202 d-Ala Val(N-C1-C8烷基)
203 d-Lys Val(N-C1-C8烷基)
204 d-Cys Val(N-C1-C8烷基)
205 Aib Thr(N-C1-C8烷基)
206 d-Ala Thr(N-C1-C8烷基)
207 d-Lys Thr(N-C1-C8烷基)
208 d-Cys Thr(N-C1-C8烷基)
209 Aib Ile(N-甲基)
210 d-Ala Ile(N-甲基)
211 d-Lys Ile(N-甲基)
212 d-Cys Ile(N-甲基))
213 Aib Val(N-甲基)
214 d-Ala Val(N-甲基)
215 d-Lys Val(N-甲基)
216 d-Cys Val(N-甲基)
217 Aib Thr(N-甲基)
218 d-Ala Thr(N-甲基)
219 d-Lys Thr(N-甲基)
220 d-Cys Thr(N-甲基)
221 Aib Ile(N-己基)
222 d-Ala Ile(N-己基)
223 d-Lys Ile(N-己基)
224 d-Cys Ile(N-己基)
225 Aib Val(N-己基)
226 d-Ala Val(N-己基)
227 d-Lys Val(N-己基)
228 d-Cys Val(N-己基)
229 Aib Thr(N-己基)
230 d-Ala Thr(N-己基)
231 d-Lys Thr(N-己基)
232 d-Cys Thr(N-己基))
前体药物
二肽前体药物单元通过干扰胰高血糖素相关肽的活性的任何位置缀合任何下列胰高血糖素相关肽（例如，至N-末端氨基酸的α胺、Q的氨基酸侧链（例如，赖氨酸侧链）上的脂族氨基、Q的氨基酸侧链上的芳香族氨基（例如，氨基苯丙氨酸、氨基萘基丙氨酸、氨基色氨酸、氨基苯基甘氨酸、氨基高苯丙氨酸））。当A-B连接Q的氨基酸侧链上的脂族氨基时，示例性位置包括天然胰高血糖素的位置12、16、17、18、20、28或29(SEQ ID NO: 701)。当A-B连接Q的氨基酸侧链上的芳香族氨基时，示例性位置包括天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 701)的位置10、13、22或25。在一些实施方案中，本发明的二肽前体药物单元缀合SEQ ID NOs: 1-564、566-570、573-575、577、579-580、585-612、616、618-632、634-642、647、657-684、701-732、742-768、801-878、883-919、1001-1262、1301-1371、1401-1518、1701-1708、1710、1711、1731-1734、1738、1740、1741、1745和1747-1776的任何一个。例如，二肽前体药物单元可以缀合SEQ ID NOs: 742-768的任何一个。
在一些示例性实施方案中，Aib-Gly(N-己基)、dLys-Gly(N-己基)、dCys-Gly(N-己基)、dAla-Gly(N-己基)、Aib-Gly(N-甲基)、dLys-Gly(N-甲基)、dCys-Gly(N-甲基)、dAla-Gly(N-己基)、Aib-Phe(N-甲基)、dLys-Phe(N-甲基)、dCys-Phe(N-甲基)或dAla-Phe(N-甲基)缀合SEQ ID NOs: 742-745、748-770的任何一个的N-末端α氨基，如SEQ ID NOs.: 769-794所代表并列于下表中。
表9
前体药物编号(P#) 二肽前体药物单元 胰高血糖素相关肽(SEQ ID NO.)
1 Aib-Gly(N-己基) 742
2 Aib-Gly(N-己基) 743
3 Aib-Gly(N-己基) 744
4 Aib-Gly(N-己基) 745
5 Aib-Gly(N-己基) 748
6 Aib-Gly(N-己基) 749
7 Aib-Gly(N-己基) 750
8 Aib-Gly(N-己基) 751
9 Aib-Gly(N-己基) 752
10 Aib-Gly(N-己基) 753
11 Aib-Gly(N-己基) 754
12 Aib-Gly(N-己基) 755
13 Aib-Gly(N-己基) 756
14 Aib-Gly(N-己基) 757
15 Aib-Gly(N-己基) 758
16 Aib-Gly(N-己基) 759
17 Aib-Gly(N-己基) 760
18 Aib-Gly(N-己基) 761
19 Aib-Gly(N-己基) 762
20 Aib-Gly(N-己基) 763
21 Aib-Gly(N-己基) 764
22 Aib-Gly(N-己基) 765
23 Aib-Gly(N-己基) 766
24 Aib-Gly(N-己基) 767
25 Aib-Gly(N-己基) 768
26 dLys-Gly(N-己基) 742
27 dLys-Gly(N-己基) 743
28 dLys-Gly(N-己基) 744
29 dLys-Gly(N-己基) 745
30 dLys-Gly(N-己基) 748
31 dLys-Gly(N-己基) 749
32 dLys-Gly(N-己基) 750
33 dLys-Gly(N-己基) 751
34 dLys-Gly(N-己基) 752
35 dLys-Gly(N-己基) 753
36 dLys-Gly(N-己基) 754
37 dLys-Gly(N-己基) 755
38 dLys-Gly(N-己基) 756
39 dLys-Gly(N-己基) 757
40 dLys-Gly(N-己基) 758
41 dLys-Gly(N-己基) 759
42 dLys-Gly(N-己基) 760
43 dLys-Gly(N-己基) 761
44 dLys-Gly(N-己基) 762
45 dLys-Gly(N-己基) 763
46 dLys-Gly(N-己基) 764
47 dLys-Gly(N-己基) 765
48 dLys-Gly(N-己基) 766
49 dLys-Gly(N-己基) 767
50 dLys-Gly(N-己基) 768
51 dCys-Gly(N-己基) 742
52 dCys-Gly(N-己基) 743
53 dCys-Gly(N-己基) 744
54 dCys-Gly(N-己基) 745
55 dCys-Gly(N-己基) 748
56 dCys-Gly(N-己基) 749
57 dCys-Gly(N-己基) 750
58 dCys-Gly(N-己基) 751
59 dCys-Gly(N-己基) 752
60 dCys-Gly(N-己基) 753
61 dCys-Gly(N-己基) 754
62 dCys-Gly(N-己基) 755
63 dCys-Gly(N-己基) 756
64 dCys-Gly(N-己基) 757
65 dCys-Gly(N-己基) 758
66 dCys-Gly(N-己基) 759
67 dCys-Gly(N-己基) 760
68 dCys-Gly(N-己基) 761
69 dCys-Gly(N-己基) 762
70 dCys-Gly(N-己基) 763
71 dCys-Gly(N-己基) 764
72 dCys-Gly(N-己基) 765
73 dCys-Gly(N-己基) 766
74 dCys-Gly(N-己基) 767
75 dCys-Gly(N-己基) 768
76 dAla-Gly(N-己基) 742
77 dAla-Gly(N-己基) 743
78 dAla-Gly(N-己基) 744
79 dAla-Gly(N-己基) 745
80 dAla-Gly(N-己基) 748
81 dAla-Gly(N-己基) 749
82 dAla-Gly(N-己基) 750
83 dAla-Gly(N-己基) 751
84 dAla-Gly(N-己基) 752
85 dAla-Gly(N-己基) 753
86 dAla-Gly(N-己基) 754
87 dAla-Gly(N-己基) 755
88 dAla-Gly(N-己基) 756
89 dAla-Gly(N-己基) 757
90 dAla-Gly(N-己基) 758
91 dAla-Gly(N-己基) 759
92 dAla-Gly(N-己基) 760
93 dAla-Gly(N-己基) 761
94 dAla-Gly(N-己基) 762
95 dAla-Gly(N-己基) 763
96 dAla-Gly(N-己基) 764
97 dAla-Gly(N-己基) 765
98 dAla-Gly(N-己基) 766
99 dAla-Gly(N-己基) 767
100 dAla-Gly(N-己基) 768
101 Aib-Gly(N-甲基) 742
102 Aib-Gly(N-甲基) 743
103 Aib-Gly(N-甲基) 744
104 Aib-Gly(N-甲基) 745
105 Aib-Gly(N-甲基) 748
106 Aib-Gly(N-甲基) 749
107 Aib-Gly(N-甲基) 750
108 Aib-Gly(N-甲基) 751
109 Aib-Gly(N-甲基) 752
110 Aib-Gly(N-甲基) 753
111 Aib-Gly(N-甲基) 754
112 Aib-Gly(N-甲基) 755
113 Aib-Gly(N-甲基) 756
114 Aib-Gly(N-甲基) 757
115 Aib-Gly(N-甲基) 758
116 Aib-Gly(N-甲基) 759
117 Aib-Gly(N-甲基) 760
118 Aib-Gly(N-甲基) 761
119 Aib-Gly(N-甲基) 762
120 Aib-Gly(N-甲基) 763
121 Aib-Gly(N-甲基) 764
122 Aib-Gly(N-甲基) 765
123 Aib-Gly(N-甲基) 766
124 Aib-Gly(N-甲基) 767
125 Aib-Gly(N-甲基) 768
126 dLys-Gly(N-甲基) 742
127 dLys-Gly(N-甲基) 743
128 dLys-Gly(N-甲基) 744
129 dLys-Gly(N-甲基) 745
130 dLys-Gly(N-甲基) 748
131 dLys-Gly(N-甲基) 749
132 dLys-Gly(N-甲基) 750
133 dLys-Gly(N-甲基) 751
134 dLys-Gly(N-甲基) 752
135 dLys-Gly(N-甲基) 753
136 dLys-Gly(N-甲基) 754
137 dLys-Gly(N-甲基) 755
138 dLys-Gly(N-甲基) 756
139 dLys-Gly(N-甲基) 757
140 dLys-Gly(N-甲基) 758
141 dLys-Gly(N-甲基) 759
142 dLys-Gly(N-甲基) 760
143 dLys-Gly(N-甲基) 761
144 dLys-Gly(N-甲基) 762
145 dLys-Gly(N-甲基) 763
146 dLys-Gly(N-甲基) 764
147 dLys-Gly(N-甲基) 765
148 dLys-Gly(N-甲基) 766
149 dLys-Gly(N-甲基) 767
150 dLys-Gly(N-甲基) 768
151 dCys-Gly(N-甲基) 742
152 dCys-Gly(N-甲基) 743
153 dCys-Gly(N-甲基) 744
154 dCys-Gly(N-甲基) 745
155 dCys-Gly(N-甲基) 748
156 dCys-Gly(N-甲基) 749
157 dCys-Gly(N-甲基) 750
158 dCys-Gly(N-甲基) 751
159 dCys-Gly(N-甲基) 752
160 dCys-Gly(N-甲基) 753
161 dCys-Gly(N-甲基) 754
162 dCys-Gly(N-甲基) 755
163 dCys-Gly(N-甲基) 756
164 dCys-Gly(N-甲基) 757
165 dCys-Gly(N-甲基) 758
166 dCys-Gly(N-甲基) 759
167 dCys-Gly(N-甲基) 760
168 dCys-Gly(N-甲基) 761
169 dCys-Gly(N-甲基) 762
170 dCys-Gly(N-甲基) 763
171 dCys-Gly(N-甲基) 764
172 dCys-Gly(N-甲基) 765
173 dCys-Gly(N-甲基) 766
174 dCys-Gly(N-甲基) 767
175 dCys-Gly(N-甲基) 768
176 dAla-Gly(N-甲基) 742
177 dAla-Gly(N-甲基) 743
178 dAla-Gly(N-甲基) 744
179 dAla-Gly(N-甲基) 745
180 dAla-Gly(N-甲基) 748
181 dAla-Gly(N-甲基) 749
182 dAla-Gly(N-甲基) 750
183 dAla-Gly(N-甲基) 751
184 dAla-Gly(N-甲基) 752
185 dAla-Gly(N-甲基) 753
186 dAla-Gly(N-甲基) 754
187 dAla-Gly(N-甲基) 755
188 dAla-Gly(N-甲基) 756
189 dAla-Gly(N-甲基) 757
190 dAla-Gly(N-甲基) 758
191 dAla-Gly(N-甲基) 759
192 dAla-Gly(N-甲基) 760
193 dAla-Gly(N-甲基) 761
194 dAla-Gly(N-甲基) 762
195 dAla-Gly(N-甲基) 763
196 dAla-Gly(N-甲基) 764
197 dAla-Gly(N-甲基) 765
198 dAla-Gly(N-甲基) 766
199 dAla-Gly(N-甲基) 767
200 dAla-Gly(N-甲基) 768
201 Aib-Phe(N-甲基) 742
202 Aib-Phe(N-甲基) 743
203 Aib-Phe(N-甲基) 744
204 Aib-Phe(N-甲基) 745
205 Aib-Phe(N-甲基) 748
206 Aib-Phe(N-甲基) 749
207 Aib-Phe(N-甲基) 750
208 Aib-Phe(N-甲基) 751
209 Aib-Phe(N-甲基) 752
210 Aib-Phe(N-甲基) 753
211 Aib-Phe(N-甲基) 754
212 Aib-Phe(N-甲基) 755
213 Aib-Phe(N-甲基) 756
214 Aib-Phe(N-甲基) 757
215 Aib-Phe(N-甲基) 758
216 Aib-Phe(N-甲基) 759
217 Aib-Phe(N-甲基) 760
218 Aib-Phe(N-甲基) 761
219 Aib-Phe(N-甲基) 762
220 Aib-Phe(N-甲基) 763
221 Aib-Phe(N-甲基) 764
222 Aib-Phe(N-甲基) 765
223 Aib-Phe(N-甲基) 766
224 Aib-Phe(N-甲基) 767
225 Aib-Phe(N-甲基) 768
226 dLys-Phe(N-甲基) 742
227 dLys-Phe(N-甲基) 743
228 dLys-Phe(N-甲基) 744
229 dLys-Phe(N-甲基) 745
230 dLys-Phe(N-甲基) 748
231 dLys-Phe(N-甲基) 749
232 dLys-Phe(N-甲基) 750
233 dLys-Phe(N-甲基) 751
234 dLys-Phe(N-甲基) 752
235 dLys-Phe(N-甲基) 753
236 dLys-Phe(N-甲基) 754
237 dLys-Phe(N-甲基) 755
238 dLys-Phe(N-甲基) 756
239 dLys-Phe(N-甲基) 757
240 dLys-Phe(N-甲基) 758
241 dLys-Phe(N-甲基) 759
242 dLys-Phe(N-甲基) 760
243 dLys-Phe(N-甲基) 761
244 dLys-Phe(N-甲基) 762
245 dLys-Phe(N-甲基) 763
246 dLys-Phe(N-甲基) 764
247 dLys-Phe(N-甲基) 765
248 dLys-Phe(N-甲基) 766
249 dLys-Phe(N-甲基) 767
250 dLys-Phe(N-甲基) 768
251 dCys-Phe(N-甲基) 742
252 dCys-Phe(N-甲基) 743
253 dCys-Phe(N-甲基) 744
254 dCys-Phe(N-甲基) 745
255 dCys-Phe(N-甲基) 748
256 dCys-Phe(N-甲基) 749
257 dCys-Phe(N-甲基) 750
258 dCys-Phe(N-甲基) 751
259 dCys-Phe(N-甲基) 752
260 dCys-Phe(N-甲基) 753
261 dCys-Phe(N-甲基) 754
262 dCys-Phe(N-甲基) 755
263 dCys-Phe(N-甲基) 756
264 dCys-Phe(N-甲基) 757
265 dCys-Phe(N-甲基) 758
266 dCys-Phe(N-甲基) 759
267 dCys-Phe(N-甲基) 760
268 dCys-Phe(N-甲基) 761
269 dCys-Phe(N-甲基) 762
267 dCys-Phe(N-甲基) 763
271 dCys-Phe(N-甲基) 764
272 dCys-Phe(N-甲基) 765
273 dCys-Phe(N-甲基) 766
274 dCys-Phe(N-甲基) 767
275 dCys-Phe(N-甲基) 768
276 dAla-Phe(N-甲基) 742
277 dAla-Phe(N-甲基) 743
278 dAla-Phe(N-甲基) 744
279 dAla-Phe(N-甲基) 745
280 dAla-Phe(N-甲基) 748
281 dAla-Phe(N-甲基) 749
282 dAla-Phe(N-甲基) 750
283 dAla-Phe(N-甲基) 751
284 dAla-Phe(N-甲基) 752
285 dAla-Phe(N-甲基) 753
286 dAla-Phe(N-甲基) 754
287 dAla-Phe(N-甲基) 755
288 dAla-Phe(N-甲基) 756
289 dAla-Phe(N-甲基) 757
290 dAla-Phe(N-甲基) 758
291 dAla-Phe(N-甲基) 759
292 dAla-Phe(N-甲基) 760
293 dAla-Phe(N-甲基) 761
294 dAla-Phe(N-甲基) 762
295 dAla-Phe(N-甲基) 763
296 dAla-Phe(N-甲基) 764
297 dAla-Phe(N-甲基) 765
298 dAla-Phe(N-甲基) 766
299 dAla-Phe(N-甲基) 767
300 dAla-Phe(N-甲基) 768
使用方法
胰高血糖素超家族肽
一般而言，包含胰高血糖素超家族肽或胰高血糖素相关肽，例如1、2、3、4、5和/或6类肽的前体药物可以用于任何目的，为此目的已经使用胰高血糖素超家族肽和胰高血糖素相关肽（例如参见如上所详述）。例如，相信所公开的生物活性肽前体药物适合于先前已经为其相应的亲本生物活性肽所述的任何用途。因此，本文所述的胰高血糖素相关肽前体药物类似物可以用于治疗低血糖、高血糖、糖尿病、或高/低胰高血糖素血糖血液水平或高/低血糖水平引起的其他代谢疾病。根据一些实施方案，待使用本文公开的前体药物治疗的患者是家养动物，而在另一实施方案中，待治疗的患者是人。
在一些实施方案中，前体药物用于减少或抑制食欲、减少食物摄取、诱发体重减轻，或帮助体重维持。期望用于减少食欲或促进体重减轻的该方法用于减少体重、防止体重增加、或治疗多种起因的肥胖症，包括药物诱导的肥胖症，并减少肥胖症相关的并发症，包括血管疾病（冠状动脉疾病、中风、外周血管疾病、局部缺血再灌注等）、高血压、II型糖尿病发病、高脂血症和肌骨骼疾病。
在其他实施方案中，在医院环境中将前体药物组合向非糖尿病患者经肠胃外施用营养物（例如向接受肠胃外营养或全部肠胃外营养的患者施用）来使用。非限制性实例包括手术患者、昏迷患者、具有消化道疾病、或无功能胃肠道（例如，由于外科去除、阻断或受损的吸收能力、克罗恩病、溃疡性结肠炎、胃肠道阻塞、胃肠道瘘管、急性胰腺炎（panreatitis）、局部缺血的肠、主要胃肠手术、某些先天性胃肠道异常、延长的腹泻、或由于手术的短肠综合征）的患者、晕厥患者，和经历治愈过程的患者经常接受碳水化合物与脂质、电解质、矿物质、维生素和氨基酸的多种组合的肠胃外施用。胰高血糖素超家族肽前体药物和肠胃外营养组合物可以在相同时间、不同时间、彼此之前或之后施用，只要所述胰高血糖素超家族肽前体药物在肠胃外营养组合物被消化时发挥想要的生物效应。例如，肠胃外营养可以每天1、2或3次施用，而胰高血糖素超家族肽前体药物每隔一天、每周三次、每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、或每月一次施用。
代谢综合征，也称为代谢综合征X、胰岛素耐受综合征或Reaven's综合征，是影响超过5千万美国人的病症。代谢综合征特征通常在于下列风险因子的至少三个或更多个的聚集：（1）腹部肥胖症（腹部内和周围过多的脂肪组织），（2）致动脉粥样化的血脂障碍（血脂病症，包括高甘油三酯、低HDL胆固醇和高LDL胆固醇，其增强动脉壁中斑点的积累），（3）升高的血压，（4）胰岛素耐受或葡萄糖不耐受，（5）促血栓状态（例如血中高纤维氮素原或纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂-1），和（6）促炎症状态（例如血中升高的C-反应蛋白）。其他风险因子可以包括老化、激素失衡和遗传倾向。
代谢综合征与冠心病和与脉管斑点积累相关的其他病症，如中风和外周血管疾病（称为动脉粥样硬化心血管疾病(ASCVD)）的增加的风险相关。患有代谢综合征的患者可以从其早期阶段的胰岛素耐受状态进行至ASCVD风险进一步增加的全面II型糖尿病(full blown type II diabete)。不旨在受任何特定理论束缚，胰岛素耐受、代谢综合征和血管疾病之间的关系可以涉及一种或多种并发的致病机制，包括受损的胰岛素刺激的血管舒张、由于增强的氧化应激NO可用性的胰岛素耐受相关降低，和脂细胞来源激素，如脂联素的异常(Lteif和Mather, Can. J. Cardiol. 20 (suppl. B):66B-76B (2004))。
根据2001全美胆固醇教育计划成人治疗组 (ATP III)，相同个体中下列性状的任何三个满足代谢综合征的标准：（a）腹部肥胖症（男人腰围超过102cm，女人超过88cm）；（b）血清甘油三酯（150 mg/dl或高于150 mg/dl）；（c）HDL胆固醇（男人40 mg/dl或低于40 mg/dl，女人50 mg/dl或低于50 mg/dl）；（d）血压（130/85或更高）；和（e）空腹血糖（110 mg/dl或高于110 mg/dl）。根据世界卫生组织(WHO)，具有高胰岛素水平（升高的空腹血糖或升高的单独餐后血糖）的个体具有下列标准的至少两个满足代谢综合征的标准：（a）腹部肥胖症（腰与臀比例高于0.9，体重指数为至少30 kg/m2，或腰量度超过37英寸）；（b）胆固醇组，显示至少150 mg/dl的甘油三酯水平或低于35 mg/dl的HDL胆固醇；（c）140/90或更高的血压，或正在治疗高血压）。(Mathur, Ruchi, “Metabolic Syndrome,” 编辑Shiel, Jr., William C., MedicineNet.com, May 11, 2009)。
为了本文的目的，如果个体满足2001全美胆固醇教育计划成人治疗组或WHO的任一标准或两项标准，那么认为该个体遭受代谢综合征折磨。
不受任何特定理论的束缚，本文描述的胰高血糖素肽用于治疗代谢综合征。因此，本发明提供在主体中预防或治疗代谢综合征、或降低其一个、两个、三个或多个风险因子的方法，其包括以有效预防或治疗代谢综合征或其风险因子的量向所述主体施用本文所述的胰高血糖素。
非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)指从单一脂肪肝（脂肪变性）到非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化（不可逆的肝晚期瘢痕形成）范围内的广谱肝病。NAFLD的所有阶段在肝细胞（肝细胞）中共同具有脂肪积累（脂肪浸润）。单一脂肪肝是肝细胞中某些类型脂肪、甘油三酯的异常积累，并没有炎症或瘢痕形成。在NASH中，脂肪积累与肝多种程度的炎症（肝炎）和瘢痕形成（纤维变性）相关。炎症细胞可以破坏肝细胞（肝细胞坏死）。在术语“脂肪性肝炎”和“脂肪坏死”中，脂肪指脂肪浸润，肝炎指肝中的炎症，并且坏死指被破坏的肝细胞。NASH最终可以导致肝的瘢痕形成（纤维变性），然后是不可逆的晚期瘢痕形成（肝硬化）。由NASH引起的肝硬化是NAFLD谱中最后的且最严重的阶段。(Mendler, Michel, “Fatty Liver: Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) and Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH),” 编辑 Schoenfield, Leslie J., MedicineNet.com, August 29, 2005)。
酒精性肝病或酒精诱导的肝病包括三种与过度消耗酒精相关或由其引起的病理学不同的肝病：脂肪肝（脂肪变性）、慢性或急性肝炎和肝硬化。酒精性肝炎可以从轻度肝炎（异常的实验室测试是唯一的疾病指征）变化至严重的肝功能异常（其具有并发症，如黄疸（由胆红素滞留引起的黄色皮肤）、肝脑病（由肝衰竭引起的神经功能异常）、腹水（腹部中流体积累）、出血性食管曲张（食管中静脉曲张）、异常凝血和昏迷）。组织学上，酒精性肝炎具有肝细胞气球样变性、中性粒细胞的炎症，有时候是马洛里小体（细胞间微丝蛋白的异常聚集）的特征性外观。解剖学上，肝硬化的特征在于肝中广泛分布的小瘤和纤维变性。(Worman, Howard J., “Alcoholic Liver Disease”, Columbia University Medical Center website)。
不受任何特定理论的束缚，本文所述的2类和3类胰高血糖素相关肽用于治疗酒精性肝病、NAFLD、或其任何阶段，包括例如脂肪变性、脂肪性肝炎、肝炎、肝炎症、NASH、肝硬化，或其并发症。因此，本发明提供在主体中预防或治疗酒精性肝病、NAFLD、或其任何阶段的方法，其包括以有效预防或治疗酒精性肝病、NAFLD、或其阶段的量向所述主体施用本文所述的2类和3类胰高血糖素肽。此类治疗方法包括减少下列中的一项、两项、三项或多项：脂肪肝含量、肝硬化的发生率或进展、肝细胞癌的发生率、炎症征兆，例如异常的肝酶水平（例如，天冬氨酸氨基转移酶AST和/或丙氨酸氨基转移酶ALT或LDH）、升高的血清铁蛋白、升高的血清胆红素，和/或纤维变性征兆，例如升高的TGF-β水平。在优选的实施方案中，2类或3类胰高血糖素肽用于治疗已经进行单一脂肪肝之外的肝病（脂肪变性）并展示炎症或肝炎体征的患者。该方法可以导致例如AST和/或ALT水平的减少。
已经显示GLP-1和毒蜥外泌肽-4具有一些神经保护效果。本发明也提供胰高血糖素超家族肽在治疗神经变性疾病中的用途，所述疾病包括但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化、其他脱髓鞘相关病症、老年性痴呆、皮层下痴呆、脑动脉硬化性痴呆、AIDS相关的痴呆、或其他痴呆、中枢神经系统癌、外伤性脑损伤、脊髓损伤、中风或脑缺血、大脑血管炎、癫痫、亨延顿氏舞蹈病、图雷特氏综合征、Guillain Barre综合征、威尔逊病、皮克氏病、神经炎性病症、脑炎、脑脊髓炎或病毒、真菌或细菌起源的脑膜炎、或其他中枢神经系统感染、阮病毒病、小脑性共济失调、小脑变性、脊髓小脑变性综合征、弗里德赖希共济失调、运动失调性毛细血管扩张症、脊柱dysmyotrophy、进行性核上性麻痹、张力障碍、肌痉挛状态、震颤、色素性视网膜炎、纹状体黑质变性、线粒体脑肌病、神经元腊样脂褐质症、肝性脑病、肾脑病、代谢性脑病、毒素诱导的脑病，和放射诱导的脑损伤。
因此，本发明提供在主体中预防或治疗神经变性疾病、或降低其一个、两个、三个或多个风险因子的方法，其包括以有效预防或治疗神经变性疾病或其风险因子的量向所述主体施用本文所述的胰高血糖素。
根据本发明治疗的方法包括使用任何标准的施用途径，包括肠胃外，如静脉内、腹膜内、皮下或肌内、鞘内、经皮肤、直肠、口腔、鼻内或通过吸入向患者施用本发明公开的前体药物的步骤。在一些实施方案中，任选地向贮藏处皮下或肌内施用所述组合物或作为缓释组合物的一部分。
组合物和组合
本发明的前体药物可以单独施用或与第二种试剂，如抗糖尿病或抗肥胖症剂组合施用。在一些方面，前体药物与第二种前体药物或胰高血糖素超家族成员，包括例如胰高血糖素相关肽组合施用。在某些实施方案中，前体药物与抗糖尿病剂组合施用，包括但不限于胰岛素、磺酰脲，如甲苯磺丁脲（Orinase）、醋酸己脲（Dymelor）、妥拉磺脲（Tolinase）、氯磺丙脲（Diabinese）、格列吡嗪（Glucotrol）、格列本脲（Diabeta、Micronase、Glynase）、格列美脲（亚莫利）或格列齐特（达美康）；氯茴苯酸，如瑞格列奈（Prandin）或那格列奈（Starlix）；双胍，如二甲双胍（格华止）或苯乙双胍；噻唑烷二酮，如罗格列酮（文迪雅）、吡格列酮（Actos）或曲格列酮（Rezulin），或其他PPARγ抑制剂；抑制碳水化合物消化的α葡萄糖苷酶抑制剂，如米格列醇（Glyset）、阿卡波糖（Precose/拜唐苹）、艾塞那肽（Byetta）或普兰林肽；二肽基肽酶-4（DPP-IV）抑制剂，如维格列汀或西格列汀；SGLT（钠依赖性葡萄糖转运蛋白1）抑制剂；或FBP酶（果糖-1,6-二磷酸酶）抑制剂。
本领域已知或正在研究的抗肥胖症剂包括但不限于食欲抑制剂，包括苯乙胺类刺激剂、苯丁胺（任选地与芬氟拉明或右芬氟拉明）、安非拉酮（Tenuate®）、苯甲曲秦（Prelu-2®、Bontril®）、苄非他明（Didrex®）、西布曲明（Meridia®、Reductil®）；利莫那班（Acomplia®），其他大麻素受体拮抗剂；胃泌酸调节素；盐酸氟西汀（百忧解）；Qnexa（托吡酯和苯丁胺）、Excalia（丁氨苯丙酮和唑尼沙胺）或Contrave（丁氨苯丙酮和纳曲酮）；或脂肪酶抑制剂，类似于赛尼可（奥利司他）或西替利司他（也称为ATL-962）、或GT 389-255。
本发明的前体药物还可以施用于患有分解代谢消耗的患者。估计超半数的癌症患者经历分解代谢消耗，其特征在于不期望的和进行性的体重减轻、虚弱和低体脂肪和肌肉。综合征同样于AIDS患者中常见，且也可以存在于细菌性和寄生物性疾病、类风湿性关节炎、和肠、肝、肺和心的慢性疾病中。其通常与食欲减退相关且可以表现为衰老中的病况或身体创伤的结果。分解代谢消耗是降低生活质量、恶化潜在病况的症状，且是死亡的主要原因。包含本文公开的前体药物的药物组合物可以配制并施用于患者，其使用本领域技术人员已知的标准的药学上可接受的载体和施用途径。因此，本公开还包括包含本文公开的一种或多种前体药物或其药学上可接受的盐，与药学上可接受的载体组合的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含磷酸盐缓冲系统中pH约4.0-约7.0时1mg/ml浓度的前体药物。药物组合物可以包含所述前体药物作为唯一的药学活性组分，或该前体药物可以与一种或多种额外的活性剂组合。根据一些实施方案，提供包含本发明的前体药物的组合物。或者，提供组合物用于诱导体重减轻或预防体重增加，其包含前体药物和抗肥胖症肽。合适的抗肥胖症肽包括在美国专利5,691,309、6,436,435或美国专利申请20050176643中公开的那些。
根据一些实施方案，提供药物组合物，其包含本文公开的任何新前体药物，优选无菌的且优选纯度水平为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的，和药物上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。该组合物可以含有本文公开的生物活性肽前体药物衍生物，其中所得的活性肽以至少0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml、5 mg/ml、6 mg/ml、7 mg/ml、8 mg/ml、9 mg/ml、10 mg/ml、11 mg/ml、12 mg/ml、13 mg/ml、14 mg/ml、15 mg/ml、16 mg/ml、17 mg/ml、18 mg/ml、19 mg/ml、20 mg/ml、21 mg/ml、22 mg/ml、23 mg/ml、24 mg/ml、25 mg/ml或更高的浓度存在。该组合物可以含有本文公开的1、2、6或3类生物活性肽前体药物衍生物，其中所得的活性肽以至少A的浓度存在，其中A是0.001 mg/ml、0.01 mg/ml、0.1 mg/ml、0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml、5 mg/ml、6 mg/ml、7 mg/ml、8 mg/ml、9 mg/ml、10 mg/ml、11 mg/ml、12 mg/ml、13 mg/ml、14 mg/ml、15 mg/ml、16 mg/ml、17 mg/ml、18 mg/ml、19 mg/ml、20 mg/ml、21 mg/ml、22 mg/ml、23 mg/ml、24 mg/ml、25 mg/ml或更高。在其他实施方案中，该组合物可以含有至多B浓度的1、2、6或3类活性肽，其中B是30 mg/ml、25 mg/ml、24 mg/ml、23、mg/ml、22 mg/ml、21 mg/ml、20 mg/ml、19 mg/ml、18 mg/ml、17 mg/ml、16 mg/ml、15 mg/ml、14 mg/ml、13 mg/ml、12 mg/ml、11 mg/ml 10 mg/ml、9 mg/ml、8 mg/ml、7 mg/ml、6 mg/ml、5 mg/ml、4 mg/ml、3 mg/ml、2 mg/ml、1 mg/ml或0.1 mg/ml。在一些实施方案中，组合物可以含有A-B mg/ml浓度范围，例如0.001-30.0 mg/ml的1、2、6或3类胰高血糖素相关肽。在一些实施方案中，药物组合物包含灭菌的且任选地在多种容器内储存的水溶液。可以根据一些实施方案使用本发明的化合物来制备即用注射型的预先配制溶液。在其他实施方案中，药物组合物包含冻干粉。药物组合物可以进一步被包装为试剂盒的一部分，所述试剂盒包括用于向患者施用组合物的可处理设备。可以标记容器或试剂盒用于在室温环境下或在冷却温度下储存。
本文所述的所有治疗方法、药物组合物、试剂盒和其他类似的实施方案考虑前体药物化合物包括所有其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，提供试剂盒，其具有用于向患者施用前体药物组合物的设备。所述试剂盒可以进一步包括多种容器，例如小瓶、管、瓶等。优选地，该试剂盒也将包括使用说明。根据一些实施方案，试剂盒的设备是气溶胶调配设备，其中所述组合物预先包装在气溶胶设备内。在另一实施方案中，该试剂盒包含注射器和针头，并且在一些实施方案中，前体药物组合物预先包装在注射器内。
1 、 2 、 6 和 3 类胰高血糖素相关肽的药物制剂
根据一些实施方案，提供药物组合物，其中所述组合物包含本公开的胰高血糖素(glucadon)肽，或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。药物组合物可以包含任何药学上可接受的成分，包括例如酸化剂、添加剂、吸附剂、气溶胶喷射剂、空气置换剂、碱化剂、抗结块剂、抗凝血剂、抗菌性防腐剂、抗氧化剂、防腐剂、碱、粘合剂、缓冲剂、螯合剂、涂层剂、着色剂、干燥剂、去污剂、稀释剂、消毒剂、崩解剂、分散剂、溶解增强剂、染料、软化剂、乳化剂、乳化稳定剂、充填剂、薄膜成型剂、香味增强剂、调味剂、流动增强剂、胶凝剂、颗粒剂、湿润剂、润滑剂、粘膜粘着剂、软膏基质、软膏、油性媒介物、有机碱、锭剂基质、颜料、增塑剂、抛光剂、防腐剂、掩蔽剂、皮肤穿透剂、增溶剂、溶剂、稳定剂、栓剂基质、表面活性剂、表面活化剂、悬浮剂、甜味剂、治疗剂、增稠剂、张度剂、毒性剂、增粘剂、吸水剂、水可混合的潜溶剂、软化剂或湿润剂。
在一些实施方案中，药物组合物包含下来组分的任何一种或组合：阿拉伯胶、乙酰氨基磺酸钾、柠檬酸乙酰三丁基酯、柠檬酸乙酰三乙基酯、琼脂、白蛋白、醇、无水醇、变性醇、稀释醇、油桐酸、褐藻酸、脂肪族聚脂、铝、氢氧化铝、硬脂酸铝、支链淀粉、α-直链淀粉、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸盐、阿司帕坦、抑菌性注射用水、膨润土、澎润土乳浆、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、苯甲酸、苯甲醇、苯甲酸苄酯、溴硝丙二醇、丁羟基茴香醚、二叔丁对甲酚、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸丁酯钠、藻酸钙、抗坏血酸钙、碳酸钙、环己氨基磺酸钙、二碱基无水磷酸钙、二碱基脱水磷酸钙、磷酸三钙、丙酸钙、硅酸钙、山梨酸钙、硬脂酸钙、硫酸钙、半水硫酸钙、芸苔油、卡波姆、二氧化碳、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、β-胡萝卜素、角叉藻聚糖、蓖麻油、氢化蓖麻油、阳离子乳化蜡、醋酸纤维素、醋酸邻苯二甲酸纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、粉状纤维素、硅化微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、十八醇十六醇混合物、溴化十六烷基三甲铵、十六醇、氯己定、三氯叔丁醇、氯甲酚、胆固醇、醋酸氯己啶、葡萄糖酸洗必太、盐酸洗必太、一氯二氟乙烷(HCFC)、一氯二氟甲烷、氯氟碳(CFC)氯代苯氧乙醇(chlorophenoxyethanol)、对氯间二甲酚、玉米糖浆固体、无水枸橼酸、一水枸橼酸、可可豆脂、着色剂、玉米油、棉子油、甲酚、间甲酚、邻甲酚、对甲酚、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、环拉酸、环糊精、葡聚糖结合剂、糊精、葡萄糖、无水右旋糖、双咪唑烷基脲、酞酸丁酯、癸二酸二丁酯、二乙醇胺、酞酸二乙酯、二氟乙烷(HFC)、二甲基-β-环糊精、环糊精类型化合物，如Captisol®、二甲醚、邻苯二甲酸二甲酯、依地酸(edentate)二钾、依地酸二钠、磷酸氢二钠、多库酯钙、多库酯钾、多库酯钠、酸十二酯、十二烷基三甲基溴化铵、依地酸钙钠、依地酸(edtic acid)、乙葡胺、乙醇、乙基纤维素、棓酸乙酯、月桂酸乙酯、乙基麦芽酚、油酸乙酯、羟苯乙酯、羟苯乙酯钾、羟苯乙酯钠、乙基香草醛、果糖、液体果糖、碾磨的果糖、无热原果糖、粉末果糖、富马酸、明胶、葡萄糖、液体葡萄糖、饱和植物脂肪酸的甘油酯混合物、甘油、二十二烷酸甘油酯、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、自乳化单硬脂酸甘油酯、棕榈酰硬脂酰甘油酯、甘氨酸、乙二醇、四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、瓜尔胶、七氟丙烷(HFC)、十六烷基三甲基溴化铵、高果糖浆、人血清白蛋白、烃(HC)、稀盐酸、氢化植物油、类型II、羟乙基纤维素、2-羟乙基-β-环糊精、羟丙纤维素、低取代羟丙基纤维素、2-羟丙基-β-环糊精、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、咪脲、靛蓝胭脂红、铁离子交换剂、氧化铁、异丙醇、异丙基肉豆蔻酸酯、棕榈酸异丙酯、等渗盐水、高岭土、乳酸、拉克替醇、乳糖、羊毛脂、羊毛脂醇、无水羊毛脂、卵磷脂、硅酸镁铝、碳酸镁、碳酸镁、无水碳酸镁、重质碳酸镁、氢氧化镁、硫酸月桂基镁、氧化镁、硅酸镁、硬脂酸镁、三硅酸镁、无水三硅酸镁、苹果酸、麦芽、麦芽糖醇、麦芽糖醇溶液、糊精-麦芽糖复合剂、落叶松皮素、麦芽糖、甘露醇、中链甘油三酯、葡甲胺、薄荷醇、甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯、油酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯钾、对羟基苯甲酸甲酯钠、微晶纤维素和羧甲基纤维素钠、矿物油、轻质矿物油、矿物油和羊毛脂醇、油、橄榄油、乙醇胺、蒙脱石、没食子酸辛酯、油酸、棕榈酸、石蜡、花生油、矿油、矿油和羊毛脂醇、药用釉料、酚、液体酚、苯氧乙醇、苯氧丙醇、苯乙醇、醋酸苯汞、硼酸苯汞、硝酸苯汞、波拉克林、波拉克林钾、泊洛沙姆、聚葡萄糖、聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯-聚丙烯-嵌段聚合物、聚甲基丙烯酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钾、苯甲酸钾、碳酸氢钾、亚硫酸氢钾、氯化钾、柠檬酸钾（postassium）、无水柠檬酸钾、磷酸氢钾、偏重亚硫酸钾、磷酸二氢钾、丙酸钾、山梨酸钾、聚乙烯吡咯酮、丙醇、丙酸、碳酸丙烯、丙二醇、藻酸丙二醇酯、没食子酸丙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丙酯钾、尼泊金丙酯钠、鱼精蛋白硫酸盐、菜籽油、林格氏溶液、糖精、糖精铵、糖精钙、糖精钠、红花油、皂石、血清蛋白、芝麻油、胶体硅、二氧化硅胶体、海藻酸钠、抗坏血酸钠、苯甲酸钠、碳酸氢钠、亚硫酸氢钠、氯化钠、无水柠檬酸钠、脱水柠檬酸钠、氯化钠、环己氨基磺酸钠、依地酸钠(sodium edentate)、十二烷基硫酸钠、月桂酸硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠、无水丙酸钠、丙酸钠、山梨酸钠、淀粉羟乙酸钠、硬脂酰醇富马酸钠、亚硫酸钠、山梨酸、山梨坦酯（去水山梨糖醇脂肪酯）、山梨醇、山梨醇溶液70%、大豆油、鲸蜡、淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、预胶凝淀粉、灭菌的玉米淀粉、硬脂酸、纯化的硬脂酸、硬脂醇、蔗糖、糖、可压缩糖、糖果店的糖、糖球、转化糖、Sugartab、日落黄FCF、合成的石蜡、滑石、酒石酸、柠檬黄、四氟乙烷(HFC)、可可豆油、硫柳汞、二氧化钛、α-生育酚、醋酸维生素E、维生素E琥珀酸酯、β-生育酚、δ-生育酚、γ-生育酚、西黄蓍胶、甘油醋酸酯、柠檬酸三丁酯、三乙醇胺、柠檬酸三乙酯、三甲基-β-环糊精、三甲基四癸基溴化铵、氨基丁三醇缓冲液、依地酸三钠(trisodium edentate)、香荚兰醛、类型I氢化植物油、水、软水、硬水、无二氧化碳水、无热原水、注射用水、灭菌吸入用水、灭菌注射用水、灭菌冲洗用水、蜡、阴离子乳化蜡、巴西棕榈蜡、阳离子乳化蜡、鲸蜡基酯蜡、微晶蜡、非离子乳化蜡、栓剂蜡、白蜡、蜂蜡、白矿脂、羊毛脂、黄胞胶、木糖醇、玉蜀黍蛋白、丙酸锌、锌盐、硬脂酸锌、或Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第3版, A. H. Kibbe (Pharmaceutical Press, London, UK, 2000)（以其整体通过引用并入）中的任何赋形剂。Remington ’ s Pharmaceutical Sciences, 第6版, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980)（以其整体通过引用并入）公开了用于配制药学上可接受的组合物的多种组分和用于其制备的已知技术。除了如果任何常规试剂与药物组合物不相容，考虑其在药物组合物中的用途。补充的活性成分也可以掺入到组合物中。
可以将本文公开的药物制剂设计成短效的、快速释放的、长效的，或持续释放的，如下文所述。还可以配制药物制剂用于立即释放、控制释放或缓慢释放。本组合物可以进一步包含例如胶束或脂质体，或一些其他微囊剂，或可以以延长释放形式施用以提供延长的储存和/或递送效果。可以根据任何方案，包括例如每天（每天1次、每天2次、每天3次、每天4次、每天5次、每天6次）、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每两周、每三周、每月，或每两月施用本公开的药物制剂。
在一些实施方案中，上述组分可以以任何浓度，诸如例如至少A存在于药物组合物中，其中A是0.0001% w/v、0.001% w/v、0.01% w/v、0.1% w/v、1% w/v、2% w/v、5% w/v、10% w/v、20% w/v、30% w/v、40% w/v、50% w/v、60% w/v、70% w/v、80% w/v或90% w/v。在一些实施方案中，上述组分可以以任何浓度，诸如例如至多B存在于药物组合物中，其中B是90% w/v、80% w/v、70% w/v、60% w/v、50% w/v、40% w/v、30% w/v、20% w/v、10% w/v、5% w/v、2% w/v、1% w/v、0.1% w/v、0.001% w/v或0.0001%。在其他实施方案中，上述组分可以以任何浓度范围，诸如例如约A-约B存在于药物组合物中。在一些实施方案中，A是0.0001%并且B是90%。
可以配制药物组合物以达到生理学上相容的pH。在一些实施方案中，药物组合物的pH可以是至少5、至少5.5、至少6、至少6.5、至少7、至少7.5、至少8、至少8.5、至少9、至少9.5、至少10、或至少10.5高达并包括pH 11，这取决于配制和施用途径。在某些实施方案中，药物组合物可以包含缓冲剂以达到生理学上相容的pH。缓冲剂可以包括能够在想要的pH下进行缓冲的任何化合物，诸如例如磷酸盐缓冲液（例如PBS）、三乙醇胺、Tris、N，N-二羟乙基甘氨酸、TAPS、三甲基甘氨酸(tricine)、HEPES、TES、MOPS、PIPES、甲次砷酸盐、MES及其他。在某些实施方案中，缓冲液的强度是至少0.5 mM、至少1 mM、至少5 mM、至少10 mM、至少20 mM、至少30 mM、至少40 mM、至少50 mM、至少60 mM、至少70 mM、至少80 mM、至少90 mM、至少100 mM、至少120 mM、至少150 mM或至少200 mM。在一些实施方案中，缓冲液的强度不高于300 mM (例如至多200 mM、至多100 mM、至多90 mM、至多80 mM、至多70 mM、至多60 mM、至多50 mM、至多40 mM、至多30 mM、至多20 mM、至多10 mM、至多5 mM、至多1 mM)。
可以通过标准的合成方法、重组DNA技术，或制备肽和融合蛋白的任何其他方法制备本文公开的前体药物化合物。尽管某些非天然氨基酸不能通过标准的重组DNA技术表达，但是用于其制备的技术为本领域所知。当可应用时，除标准的肽化学反应外，还可以通过标准的有机化学反应合成包括非肽部分的本发明的化合物。
实施例
实施例1
胰高血糖素和 GLP-1 类似物的合成
为了研究制备胰高血糖素和GLP-1的生物活性衍生物的可能性，合成了大量肽类似物。标准程序在此简述，且细节下文讨论。
材料：
PAM树脂(PAM树脂为OCH2-苯基乙酰氨基甲基-共聚苯乙烯-1% 二乙烯基苯)、(100-180目、1% DVB交联的聚苯乙烯；0.7-1.0 mmol/g的装载)，Boc保护的和Fmoc保护的氨基酸购自Midwest Biotech。其他试剂诸如α-羟基酸（苯乳酸和乙醇酸）购自Aldrich。使用Boc保护的氨基酸的固相肽合成在Applied Biosystem 430A Peptide Synthesizer上进行。Fmoc保护的氨基酸合成使用Applied Biosystems Model 433 Peptide Synthesizer进行。缩肽的手动合成在烧结的反应容器（sintered reaction vessel）中使用类似程序 (Schnolzer、M.、等人，(1992) Int J Pept Protein Res 40(3-4):180-193)进行。
肽合成（Boc氨基酸/HF切割）：
这些类似物的合成在Applied Biosystem Model 430A Peptide Synthesizer上进行。合成肽通过连续添加氨基酸来构建，且每一氨基酸的活化的酯通过添加DMF中的1.9 mmol (3.8 mL的0.5 M溶液)的3-(二乙氧基-磷酰基氧基)-3H-苯并[d][1,2,3]三嗪-4-酮(DEPBT)至含有2 mmol Boc保护氨基酸的筒(cartridge)中来产生。氨基酸通过经筒起泡氮气来溶解。将1 mL的N,N-二异丙基乙胺添加至筒中来完成酯形成。将该溶液转移至含有0.2 mmol连接至PAM树脂的C末端残基的反应容器中，涡旋数次，且允许偶联至树脂10分钟。洗涤以除去未反应的试剂后，通过用三氟乙酸（TFA）处理5分钟去除N末端Boc保护基团。将树脂用DMF洗涤且重复循环步骤的期望次数直至链被装配。合成（通常30种氨基酸）结束时反应容器含有大约1.2-1.5 g的保护的肽基-PAM树脂。将树脂用二甲基甲酰胺（DMF）洗涤许多次，用三氟乙酸处理以去除最后的t-Boc保护基团，并最后用DMF、二氯甲烷（DCM）洗涤额外数次，并干燥。
将肽基树脂用无水HF处理（该部分后面详述的程序）并且这通常产生大约350 mg（约50％产率）的粗脱保护的肽。
肽合成（Fmoc氨基酸/HF切割）：
该合成方案用几个氨基酸在选择性位点手动进行。在该工作中，使用Fmoc氨基酸仅合成内部丝氨酸前体药物，作为更广的合成策略的一部分。在此，应注意尽管Fmoc化学已用于合成，但肽已始终在PAM树脂上建造，所述树脂需要用HF处理以从固体支持物上切割肽。这些肽的产率大约如之前对Boc/PAM合成所述。
合成如之前部分中所述进行。在偶联步骤结束时，肽基树脂用20％哌啶处理以去除N末端Fmoc保护基团。用DMF重复洗涤并且该重复循环重复偶联步骤的期望数。整个合成结束时肽基树脂通过使用DCM干燥，且肽用无水HF从树脂切割。
肽基树脂的HF处理
将肽基-树脂（30 mg至200 mg）置于氟化氢（HF）反应容器中切割。加入500 μL的对甲酚至容器中作为碳鎓离子清除剂。将容器连接至HF系统并浸入甲醇/干冰混合物中。将容器用真空泵抽真空，并将10 mL HF蒸馏至反应容器。该肽基-树脂和HF的反应混合物在0℃下搅拌1小时，随后建立真空并将HF快速排出（10-15分钟）。小心移除容器并用大约35 mL醚填充以沉淀肽并萃取对甲酚和来自HF处理的小分子有机保护基团。该混合物利用聚四氟乙烯滤器过滤并重复两次以去除所有过量甲酚。丢弃该滤液。将沉淀的肽溶解于大约20 mL的10％乙酸（水溶液(aq)）中。含有期望的肽的该滤液收集并冻干。
使用质谱法分析
使用具有标准ESI离子源的Sciex API-III电喷雾四极杆质谱仪获得质谱图。使用的电离条件如下：阳离子模式中的ESI；离子喷射电压，3.9 kV；喷口电势(orifice potential)，60 V。所用的喷雾和气帘气为流速0.9 L/min的氮气。以0.5 Th/步骤和2 msec停留时间从600-1800 Thompsons记录质谱图。样品（约1 mg/mL）溶解于50％含1％乙酸的乙腈水溶液中，并通过外部注射泵以5 μL/min的流速引入。
当肽通过ESI-MS在PBS溶液中分析时，它们首先使用含0.6 µL C4树脂的ZipTip固相提取头(tip)根据制造商提供的说明书（Millipore Corporation，Billerica，MA，参见Millipore网站：millipore.com/catalogue.nsf/docs/C5737的万维网）来脱盐。
高效液相色谱（HPLC）分析：
初步分析使用高效液相色谱（HPLC）和MALDI分析用这些粗肽对它们在磷酸缓冲液盐溶液（PBS）缓冲液（pH，7.2）中的相对转化率的近似值来进行。将粗肽样品以1 mg/mL的浓度溶解于PBS缓冲液中。将1 mL所得溶液储存在1.5 mL HPLC小瓶中，其随后密封并在37 ℃下孵育。将100 μL的等分试样以不同的时间间隔抽出，冷却至室温并通过HPLC分析。
HPLC分析使用Beckman System Gold Chromatography系统用UV检测器在214 nm下进行。HPLC分析在150 mm x 4.6 mm C18 Vydac柱上进行。流速为1 mL/min。溶剂A含有蒸馏水中的0.1％ TFA，且溶剂B含有90% CH3CN中的0.1% TFA。采用线性梯度（在15分钟内40％至70％B）。收集数据并使用Peak Simple Chromatography软件分析。
水解的起始速率用于测量各个前体药物的解离的速率常数。前体药物和药物的浓度分别从其峰面积来估计。前体药物的一级解离速率常数通过前体药物的浓度对数对不同时间间隔作图来确定。该曲线的斜率产生速率常数‘k’。各种前体药物的降解的半衰期随后通过使用公式t1/2 = 0.693/k来计算。
使用HPLC的制备纯化：
一旦鉴定展示合适t1/2的前体药物，则纯化所述前体药物。纯化使用HPLC分析在基于二氧化硅的1 x 25 cm Vydac C18 (5 μ颗粒大小、300 A°孔径)柱上进行。所用的仪器如下：Waters Associates 600型泵，717型注射器，和486型UV检测器。使用214 nm波长用于所有样品。溶剂A含有蒸馏水中的10% CH3CN /0.1% TFA，且溶剂B含有CH3CN中的0.1% TFA。采用线性梯度（在2小时内0至100％B）。流速为1.2 mL/min且级分大小为6 mL。从约350 mg的粗肽通常获得80 mg的纯肽（约23％产率）。
实施例2
生物测定实验设计：用于cAMP检测的基于萤光素酶的报道基因测定
在基于萤火虫萤光素酶报道分子的测定中测量每一胰高血糖素和GLP-1类似物或前体药物诱导cAMP的能力。诱导的cAMP产生与结合至其受体的胰高血糖素或GLP-1成正比。采用分别共转染有胰高血糖素或GLP-1报道分子和连接至cAMP应答元件的萤光素酶基因的HEK293细胞用于生物测定。
通过在添加有0.25％牛生长血清(HyClone，Logan，UT)的Dulbecco最低基础培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养16小时将细胞血清剥夺(serum-deprived)，并随后与连续稀释的GLP-1类似物或前体药物在96孔多聚D-赖氨酸包被的“生物包被(Biocoat)”板(BD Biosciences，San Jose，CA)中在37 oC、5% CO2 下孵育5小时。孵育结束时，向每孔加入100 μL的LucLite发光底物试剂(Perkin Elmer，Wellesley，MA)。将板短暂摇动，在暗中孵育10分钟并在MicroBeta-1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)上测量光输出。通过使用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)计算有效50％浓度 (EC50)。
实施例3
基于胰高血糖素相关肽酰胺的前体药物的生物活性
I ） GLP-1 类似物
使用固相肽合成装配上述肽序列。偶联并脱保护最后的残基His后，将结合肽的树脂与DMF中5倍过量的Boc-肌氨酸、DEPBT和DIEA在室温下反应6小时。通过茚三酮(nihydrin)测试监测反应。完成偶联后，将树脂相应用DMF和DCM洗涤3次。通过TFA去除Boc保护。将树脂通过DCM、DMF洗涤，和通过DIEA中和。将树脂结合的肽与5倍的diBoc-dLys、DEPBT和DIEA在室温下进一步反应过夜。树脂随后被TFA处理以去除Boc保护并通过DCM、DMF洗涤。最后，将树脂用DMF中20％哌啶处理以去除25Trp上的甲酰基并在真空下干燥。将肽最后通过与HF在4℃下反应1小时切割并通过无水乙醚沉淀。过滤后，将肽通过水中的20％乙腈（MeCN）吸收并冻干成粉末。将肽通过制备型HPLC (C5柱；流速10 ml/min；缓冲液A 10% MeCN和0.1%TFA于水中；缓冲液B: 0.1%TFA于ACN；线性梯度B%从0-40% (0-80min))纯化。通过ESI-MS验证化合物。
II ）添加酰化二肽至 GLP 的残基 10 的侧链
(d)赖氨酸-肌氨酸二肽 [(d)赖氨酸为结构A-B的‘A’氨基酸且肌氨酸为‘B’氨基酸]共价连接至位置10的苯丙氨酸的4-氨基或位置10的赖氨酸的ε氨基。将C18酰基共价连接至(d)赖氨酸的ε氨基。合成这些的方案显示于图1中。
III ）肽前体药物在 PBS 和血浆中的半衰期
上文描述的肽在PBS缓冲液或血浆中在37℃下孵育高至8天。在不同时间点对PBS和血浆收集样品，并测定半衰期。肽D在PBS和血浆中的半衰期均被测定为约1天（使用公开于WO/2011/163012中的方法测定，所述申请通过引用并入）。肽E的半衰期测定为在PBS和血浆中均为约1周。因此，取决于二肽前体药物是否连接至4-氨基苯丙氨酸（即肽D）或赖氨酸（即肽E）的侧链，肽的半衰期显著不同。
实施例4
胰高血糖素超家族肽酰化的前体药物在小鼠中的体内作用
测试实施例3中描述的肽D前体药物其在膳食诱导的肥胖症（DIO）小鼠（品系：C57B16）中的体内作用。将9组8只小鼠（具有50 g的初始平均体重）用以下皮下注射：仅媒介物或10 nmol/kg或50 nmol/kg的实施例3的肽D酰化的前体药物、亲本肽（即，缺少酰化二肽前体药物部分的肽D）、具有在位置10直接连接4-氨基苯丙氨酸的酰化赖氨酸残基的肽D，或以下肽： (SEQ ID NO:3082) (肽F)。小鼠为6月龄且已进行高脂肪膳食约2个月。注射后监测体重一周并在第0、1、2和5天测量，其中第0天为注射当天（图2）。
以更低剂量，接受肽D亲本肽的小鼠的体重在整个第1天下降，但到第5天恢复接近起始体重。也以较低剂量，酰化的含dK-Sar的前体药物在体重开始略微增加前在整个第2天引起体重降低，反映出肽D的前体药物形式的延长的作用。所有肽以较高剂量均引起整个时间过程中显著体重减轻。
实施例5
增加的酰基链长度的作用
如实施例3中所述合成肽D。(d)赖氨酸-肌氨酸二肽共价连接至位置10的苯丙氨酸的4-氨基，且C20或C22酰基共价连接至(d)赖氨酸的ε氨基。这些肽的类似的非前体药物形式也通过共价连接C20-或C22-酰化赖氨酸直接至位置10的苯丙氨酸的4-氨基来合成。
具有C20酰化(d)赖氨酸-肌氨酸二肽的肽D的半衰期测定为在PBS中约1天。
为了探究DKP的可能形成和亲本药物的同时再生，上述肽在20％人血浆中在37℃下孵育大约5天。在不同时间点（0、1、2和5天）收集样品。为了研究经DKP形成切割二肽前体药物后GLP-1的恢复的活性，所有收集的样品使用生物测定分析。更具体而言，GLP前体药物的受体结合活性在实施例2中描述的GLP受体萤光素酶测定中测定。
表10.血浆中不同时间点的生物测定数据（对GLP-1标准品的相对活性）
。
还测试上述的肽D变体在膳食诱导的肥胖症（DIO）小鼠（品系：C57B16）中的体内作用。9组的8只小鼠（具有50 g的起始平均体重）用以下皮下注射：仅媒介物、或10 nmol/kg的具有经二肽前体药物部分的C18酰化的肽D（如实施例3中所述）、亲本肽（即缺乏酰化和缺乏二肽前体药物部分的肽D）、具有直接连接至位置10的4-氨基苯丙氨酸的C18酰基的肽D、具有经二肽前体药物部分的C20酰化的肽D、具有直接连接至位置10的4-氨基苯丙氨酸的C20酰基的肽D、具有经二肽前体药物部分的C22酰化的肽D、和具有直接连接至位置10的4-氨基苯丙氨酸的C22酰基的肽D。小鼠为6月龄且已进行高脂肪膳食约2个月。注射后监测体重一周并在第0、1、2和7天测量，其中第0天为注射当天（图3A、3B）。
如实施例4中，接受亲本肽的小鼠的体重在整个第1天下降，但到第7天恢复至起始体重。肽D的C18酰化前体药物形式引起最大的体重减轻。这些小鼠也大部分持续在测试的时间过程的体重减轻。
实施例6
小鼠中每日前体药物注射的体内作用
还测试肽D的C22酰化形式在膳食诱导的肥胖症（DIO）小鼠（品系：C57B16）中在每日施用后的体内作用。9组的8只小鼠（具有65 g的初始平均体重）用以下每日皮下注射5天：仅媒介物、或3 nmol/kg或10 nmol/kg的肽D（亲本肽）、具有经前体药物二肽部分的C22酰化的肽D、和具有直接连接至位置10的4-氨基苯丙氨酸的C22酰基的肽D。小鼠为11月龄且已进行高脂肪膳食约2个月。注射后监测体重一周并在第0、1、2、3、4和7天测量，其中第0天为注射当天（图4A、4B）。
以较低剂量，所有肽在每日注射时间过程中（即在整个第4天）引起稳定体重减轻。在第4天后，接受3 nmol/kg的所有肽的小鼠到第7天恢复至初始体重。在整个第4天，较高剂量的肽D的C22酰化前体药物引起最多的体重减轻且表现类似于较高剂量的亲本肽。在第4天的最后注射后，然而，接受亲本肽的小鼠开始增加体重而接受肽D的C22酰化前体药物的小鼠持续在整个第7天减轻体重，反映出前体药物延长的活性。
实施例7
小鼠中交替前体药物注射方案的体内作用
还测试肽D的C22酰化形式在膳食诱导的肥胖（DIO）小鼠（品系：C57B16）中交替施用日程后的体内作用。两组的8只小鼠（具有65 g的初始平均体重）用40 nmol/kg的肽D（未酰化且不具有二肽前体药物部分的亲本肽）或40 nmol/kg具有经二肽前体药物部分的C22酰化的肽D皮下注射一次。三组的8只小鼠用仅媒介物、20 nmol/kg的肽D（亲本肽）、或20 nmol/kg的肽D C22酰化前体药物皮下注射两次（注射之间1天，例如周一-周三）。最后，三组的8只小鼠用仅媒介物、10 nmol/kg的肽D（亲本肽）、或10 nmol/kg的肽D C22酰化前体药物每日皮下持续4天。
结果显示于图5中。所有三个施用方案导致与亲本肽相比，肽D的C22酰化前体药物形式的更全面且持续的体重减轻，证实施用具有延长的半衰期的肽的效用。
实施例8
基于胰高血糖素相关肽酰胺的前体药物的生物活性
合成以下肽：
(d)赖氨酸-肌氨酸二肽共价连接至位置12（肽F）、位置16（肽G）或位置40（肽H）的赖氨酸的ε氨基的4-氨基。将C22酰基共价连接至(d)赖氨酸残基的ε氨基。
上文描述的肽在PBS缓冲液或血清中在37℃下孵育高至8天。在不同时间点对PBS和血浆收集样品，并测定半衰期。测定肽F在血浆中的半衰期小于24小时。肽G的半衰期测定为在PBS和血浆中均为大于1周。肽H的半衰期测定为在PBS和血浆中均为约5天。当酰化二肽连接至位置12的赖氨酸时可见的更短的半衰期可能是由于当结合血浆时促进切割的构象变化或可选地是由于当结合血浆时酰化形式的检测降低。
所有肽F、G和H保留它们的GIP和GLP活性（相对于天然GLP或GIP的活性显示的百分比），如下表中所示。
表11.生物测定数据（对GLP-1或GIP标准品的相对活性）
肽F 肽G 肽H
EC50-GLP 17.4% 24.7% 37.1%
EC50-GIP 30.2% 58.5% 81.6%
实施例9
灵长类动物中酰化前体药物的体内作用
本文公开的肽例如实施例8中的肽（F、G和H）的体内作用在肥胖的灵长类动物（例如恒河猴）模型中证实，其通过每周两次或每周一次施用媒介物对照、亲本肽对照、和实施例3-6或8的酰化前体药物肽，持续21天。肽以1 µg/kg至50 µg/kg的剂量s.c.施用。根据本领域已知的方法测试所有肽的体内半衰期。还测量体重和食物摄入。预期在血浆中具有较长半衰期的肽展示出延长的体内半衰期和产生延长的体内体重减轻。

Claims (50)

1.前体药物，其包含结构：
A-B-Q；
其中Q为胰高血糖素超家族肽；
A为共价连接至C16-C30酰基或C16-C30烷基的氨基酸；和
B为通过在A-B和Q的包含(C1-C8烷基)NH2侧链的残基之间的酰胺键连接至Q的N-烷基化氨基酸。
2.权利要求1的前体药物，其中在生理条件下在血清中A-B从Q的切割半衰期为约3天至约10天。
3.权利要求1或2的前体药物，其中Q的包含(C1-C8烷基)NH2侧链的残基位于对应于天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 701)的位置1、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、28、或29的位置或Q的C末端的最后5个氨基酸之一处。
4.权利要求1-3中任一项的前体药物，其中A-B包含结构：
其中
R1 和R2独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OR9、(C1-C18烷基)SR9、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONHR9、(C1-C4烷基)COOR9、(C1-C4烷基)NHR9、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)、和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或R1和R2连同它们连接的原子一起形成C3-C12环烷基或芳基；
R4 和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18 烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)、和 C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或R4和R8连同它们连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3为C1-C18烷基，或者R4和R3连同它们连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或NHR9；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R2连同它们连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R7选自H、OR9、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONHR9、(C0-C4烷基)COOR9、(C0-C4烷基)NHR9、(C0-C4烷基)OR9、和卤素；和
R9选自H、C16-C30酰基、和 C16-C30烷基。
5.权利要求4的前体药物，其中
R1和R8独立地为H或C1-C8烷基。
6.权利要求4或5的前体药物，其中
R4 选自H、C1-C8烷基、C2-C8 烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)、和 C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或R4和R8连同它们连接的原子一起形成C3-C6环烷基。
7.权利要求4-6中任一项的前体药物，其中
R3为C1-C8烷基，或者R4和R3连同它们连接的原子一起形成4、5或6元杂环。
8.权利要求4-7中任一项的前体药物，其中
R3为C1-C8烷基。
9.权利要求4-8中任一项的前体药物，其中
R2选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OR9、(C1-C4烷基)SR9、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONHR9、(C1-C4烷基)COOR9、(C1-C4烷基)NHR9、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)、和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或R1和R2连同它们连接的原子一起形成C3-C12环烷基或芳基。
10.权利要求4-9中任一项的前体药物，其中
R2选自(C1-C4烷基)OR9、(C1-C4烷基)SR9、(C1-C4烷基)CONHR9、(C1-C4烷基)COOR9、(C1-C4烷基)NHR9、和 (C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；和
R7选自OR9、(C0-C4烷基)CONHR9、(C0-C4烷基)COOR9、(C0-C4烷基)NHR9、和 (C0-C4烷基)OR9。
11.权利要求4-10中任一项的前体药物，其中
R5为NHR6。
12.权利要求4的前体药物，其中
R1、R4和R8独立选自H和C1-C18烷基，或者R4和R8连同它们连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R2选自(C1-C18烷基)OR9、(C1-C18烷基)SR9、(C1-C4烷基)CONHR9、(C1-C4烷基)COOR9、(C1-C4烷基)NHR9、和 (C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R6为H或C1-C8烷基；和
R7选自OR9、(C0-C4烷基)CONHR9、(C0-C4烷基)COOR9、(C0-C4烷基)NHR9、和 (C0-C4烷基)OR9。
13.权利要求12的前体药物，其中
R1、R4和R8独立选自H和C1-C8烷基，或者R4和R8连同它们连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R2选自(C1-C8烷基)OR9、(C1-C8烷基)SR9、(C1-C4烷基)CONHR9、(C1-C4烷基)COOR9、(C1-C4烷基)NHR9、和 (C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；和
R3为C1-C8烷基，或者R4和R3连同它们连接的原子一起形成4、5或6元杂环。
14.权利要求12或13的前体药物，其中
R2选自(C1-C8烷基)OR9、(C1-C8烷基)SR9、和 (C1-C4烷基)NHR9；和
R3为C1-C8烷基，或者R4和R3连同它们连接的原子一起形成4、5或6元杂环。
15.权利要求12-14中任一项的前体药物，其中
R2为(C1-C4烷基)NHR9；和
R3为C1-C8烷基，或者R4和R3连同它们连接的原子一起形成4、5或6元杂环。
16.权利要求12-15中任一项的前体药物，其中
R1、R4和R8为H；和
R3为C1-C8烷基。
17.权利要求12-16中任一项的前体药物，其中
R5为NHR6；和
R9选自C16-C30酰基和C16-C30烷基。
18.权利要求4的前体药物，其中
R1、R4和R8为H；
R2为(C1-C4烷基)NHR9；
R3为C1-C8烷基
R5为NHR6；
R6为H或C1-C8烷基；和
R9选自C16-C30酰基和C16-C30烷基。
19.权利要求1-18中任一项的前体药物，其中R9选自C20-C28酰基和C20-C28烷基。
20.权利要求18的前体药物，其中
R2为(CH2)4NHR9；
R3为CH3；
R5为NH2；和
R9为C20-C28酰基。
21.权利要求18或20的前体药物，其中
R2选自(CH2)4NHCO(CH2)16CH3和(CH2)4NHCO(CH2)20CH3。
22.权利要求1-21中任一项的前体药物，其中A-B连接至Q的包含(C2-C4烷基)NH2侧链的残基。
23.权利要求1-22中任一项的前体药物，其中A-B连接至Q的作为赖氨酸残基的残基。
24.权利要求1-22中任一项的前体药物，其中A为D氨基酸。
25.权利要求1-24中任一项的前体药物，其中胰高血糖素超家族肽为胰高血糖素相关肽。
26.权利要求1-24中任一项的前体药物，其中Q包含保留对应于SEQ ID NO: 701的氨基酸12-29的氨基酸的α螺旋构象的与天然胰高血糖素(SEQ ID NO: 701)至少50％相同的氨基酸序列。
27.权利要求1-25中任一项的前体药物，其中Q包含氨基酸序列：
，所述氨基酸序列具有对其的1-3个氨基酸修饰，
其中X1和/或X2为降低胰高血糖素肽对由二肽基肽酶IV (DPP-IV)的切割的易感性的非天然（相对于SEQ ID NO: 701）氨基酸，
其中Z选自–COOH、-Asn-COOH、Asn-Thr-COOH、和 Y-COOH，其中Y为1-2个氨基酸，且
其中（1）内酰胺桥连接位置i的氨基酸和位置i+4的氨基酸的侧链，其中i为12、16、20或24，或者（2）胰高血糖素肽的位置16、20、21、和24处的一个、两个、三个或所有氨基酸被α,α-二取代氨基酸取代；
且其中Q展示胰高血糖素激动剂活性。
28.权利要求1-25中任一项的前体药物，其中Q包含SEQ ID NO: 701的氨基酸序列且包含：
选自以下的至少一个氨基酸修饰：
在位置28的Asn被带电荷的氨基酸取代；
在位置28的Asn被选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸的带电荷的氨基酸取代；
在位置28被Asn、Asp或Glu取代；
在位置28被Asp取代；
在位置28被Glu取代；
在位置29的Thr被带电荷的氨基酸取代；
在位置29的Thr被选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸的带电荷的氨基酸取代；
在位置29被Asp、Glu或Lys取代；
在位置29被Glu取代；
在位置29后插入1-3个带电荷的氨基酸；
在位置29后插入Glu或Lys；
在位置29后插入Gly-Lys或Lys-Lys；或其组合；
和选自组A或组B、或其组合的至少一个氨基酸修饰；
其中组A为选自以下的氨基酸修饰：位置15的Asp被Glu取代，和位置16的Ser被Thr或AIB取代；和
其中组B为选自以下的氨基酸修饰：
在位置1的His被降低胰高血糖素肽对由二肽基肽酶IV (DPP-IV)的切割的易感性的非天然氨基酸取代，
在位置2的Ser被降低胰高血糖素肽对由二肽基肽酶IV (DPP-IV)的切割的易感性的非天然氨基酸取代，
在位置10的Tyr被Phe或Val取代；
在位置12的Lys被Arg取代；
在位置20的Gln被Ala或AIB取代；
在位置21的Asp被Glu取代；
在位置24的Gln被Ala或AIB取代；
在位置27的Met被Leu或Nle取代；
在位置27-29缺失氨基酸；
在位置28-29缺失氨基酸；
在位置29缺失氨基酸；
或其组合；
且其中Q展示胰高血糖素激动剂活性。
29.权利要求1-25中任一项的前体药物，其中Q包含SEQ ID NO: 701的胰高血糖素相关肽，其具有以下修饰：
（a）在位置1的赋予GIP激动剂活性的氨基酸修饰，
（b）（1）位置i和i+4的氨基酸的侧链之间或位置j和j+3的氨基酸的侧链之间的内酰胺桥，其中i为12、13、16、17、20 或24，且其中j为17，或者（2）类似物的位置16、20、21、和24处的一个、两个、三个或所有氨基酸被α,α-二取代氨基酸取代，
（c）位置27、28和29的一个、两个或所有处的氨基酸修饰，和
（d）1-6个进一步的氨基酸修饰，
其中类似物对GIP受体活化的EC50为约10 nM或更低。
30.权利要求1-25中任一项的前体药物，其中Q包含SEQ ID NO: 55的序列或SEQ ID NO: 55的类似物，其中所述类似物与SEQ ID NO: 55不同在于选自位置1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28、和 29的1-3个氨基酸修饰，其中所述胰高血糖素肽展示出天然GLP-1对GLP-1受体的活性的至少20％。
31.权利要求1-25中任一项的前体药物，其中Q包含与SEQ ID NO: 701的不同在于不超过10个氨基酸修饰的氨基酸，所述氨基酸修饰包括在位置16、20、21和/或24处的一个或多个被AIB氨基酸取代，和在位置1和/或2处的提供对由二肽基肽酶IV切割的降低的易感性的氨基酸修饰，其中所述胰高血糖素肽展示出天然GLP-1对GLP-1受体的活性的至少20％。
32.权利要求1-25中任一项的前体药物，其中Q包含SEQ ID NO: 1342的序列或其氧基衍生物，且其中Q展示出胰高血糖素拮抗剂活性。
33.权利要求1-25中任一项的前体药物，其中Q包含通过以下修饰的天然胰高血糖素的氨基酸序列：缺失来自SEQ ID NO: 701的N末端的2-5个氨基酸残基，和在SEQ ID NO: 701的位置9的天冬氨酸残基被以下所取代：谷氨酸、高谷氨酸、β-高谷氨酸、半胱氨酸的磺酸衍生物、或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸衍生物：
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4烯基、或C2-C4炔基，且其中Q展示出胰高血糖素拮抗剂活性。
34.权利要求1-25中任一项的前体药物，其中Q包含A-B-C的通用结构，其中A选自：
（i）苯基乳酸（PLA）；
（ii）PLA的氧基衍生物；
（iii）2-6个氨基酸的肽，其中肽的两个连续氨基酸经酯或醚键连接；
B代表SEQ ID NO: 701的氨基酸i-26，其中i为3、4、5、6或7，任选地包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
（iv）位置9（根据SEQ ID NO: 701的氨基酸编号）的Asp被Glu、Cys的磺酸衍生物、高谷氨酸、β-高谷氨酸、或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸衍生物取代：
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4烯基、或C2-C4炔基；
（v）位置10、20和24（根据SEQ ID NO: 701的氨基酸编号）的一个或两个氨基酸被经酯、醚、硫醚、酰胺或烷基胺连接共价连接至酰基或烷基的氨基酸取代；
（vi）位置16、17、20、21、和 24（根据SEQ ID NO: 701的氨基酸编号）的一个或两个氨基酸被选自以下的氨基酸取代：Cys、Lys、鸟氨酸、高半胱氨酸和乙酰苯丙氨酸（Ac-Phe），其中该组的氨基酸共价连接至亲水部分；
（vii）位置15（根据SEQ ID NO: 701的编号）的Asp被半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸取代；
（viii）位置16（根据SEQ ID NO: 701的编号）的Ser被半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸取代；
（ix）根据SEQ ID NO: 701的氨基酸编号的位置16、20、21和24的一个或多个处被AIB取代；
且C选自：
（x）X；
（xi）X-Y；
（xii）X-Y-Z；和
（xiii）X-Y-Z-R10，
其中X为Met、Leu、或Nle；Y为Asn或带电荷的氨基酸；Z为Thr、Gly、Cys、Lys、鸟氨酸（Orn）、高半胱氨酸、乙酰苯丙氨酸(Ac-Phe)、或带电荷的氨基酸；其中R10选自SEQ ID NOs:1319-1321和1353；和
（xiv）其中C末端羧基被酰胺替换的（x）至（xiii）的任一种；
且其中Q展示胰高血糖素拮抗剂活性。
35.权利要求1-25中任一项的前体药物，其中Q包含SEQ ID NO: 1451的序列，其中SEQ ID NO: 1451的位置4和7、位置7和11、位置11和15、位置15和19、或位置19和23处的氨基酸经内酰胺桥或氧基衍生物连接，且其中Q展示出胰高血糖素拮抗剂活性和GLP-1激动剂活性。
36.权利要求1-25中任一项的前体药物，其中Q包含含有以下的肽：（1）位置16（根据SEQ ID NO: 701的编号）的分子内桥、或α,α-二取代氨基酸、或酸性氨基酸、或其组合，（2）C末端酰胺或酯替代C末端羧基，和（3）A-B-C的通用结构，
其中A选自
（i）PLA；
（ii）PLA的氧基衍生物；和
（iii）2-6个氨基酸的肽，其中肽的两个连续氨基酸经酯或醚键连接；
其中B代表SEQ ID NO: 701的氨基酸p-26，其中p为3、4、5、6或7，任选地包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：
（iv）位置9（根据SEQ ID NO: 701的氨基酸编号）的Asp被Glu、Cys的磺酸衍生物、高谷氨酸、β-高谷氨酸、或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸衍生物取代：
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4烯基、或C2-C4炔基；
（v）位置10、20和24（根据SEQ ID NO: 701的氨基酸编号）的一个或两个氨基酸被经酯、醚、硫醚、酰胺或烷基胺连接共价连接至酰基或烷基的氨基酸取代；
（vi）位置16、17、20、21、和 24（根据SEQ ID NO: 701的氨基酸编号）的一个或两个氨基酸被选自以下的氨基酸取代：Cys、Lys、鸟氨酸、高半胱氨酸和乙酰苯丙氨酸（Ac-Phe），其中该组的氨基酸共价连接至亲水部分；
（vii）位置15（根据SEQ ID NO: 701的编号）的Asp被半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸取代；
（viii）位置16（根据SEQ ID NO: 701的编号）的Ser被半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸取代；
（ix）位置17的Arg被Gln替代，位置18的Arg被Ala替代，位置21的Asp被Glu替代，位置23的Val被Ile替代，和位置24的Gln被Ala替代（根据SEQ ID NO: 701的氨基酸编号）；
（x）位置16的Ser被Glu替代，位置20的Gln被Glu替代，或位置24的Gln被Glu替代（根据SEQ ID NO: 701的氨基酸编号）；
其中C选自：
（vii）X；
（viii）X-Y；
（ix）X-Y-Z；
（x）X-Y-Z-R10；
其中X为Met、Leu、或Nle；Y为Asn或带电荷的氨基酸；Z为Thr、Gly、Cys、Lys、鸟氨酸（Orn）、高半胱氨酸、乙酰苯丙氨酸(Ac-Phe)、或带电荷的氨基酸；其中R10选自SEQ ID NOs:1421、1426、1427、和 1450；
且其中Q展示出胰高血糖素拮抗剂活性和GLP-1激动剂活性。
37.权利要求1-25中任一项的前体药物，其中Q选自：SEQ ID NO:1-564、566-570、573-575、577、579-580、585-612、616、618-632、634-642、647、657-684、701-732、801-878、883-919、1001-1262、1301-1371、1401-1518、1701-1708、1710、1711、1731-1734、1738、1740、1741、1745、1747-1776、和 3325-3328。
38.无菌药物组合物，其包含权利要求1-36中任一项的前体药物和药学上可接受的载体。
39.治疗高血糖症或糖尿病的方法，所述方法包括施用有效量的权利要求38的药物组合物。
40.抑制食欲、降低体重增加或诱导体重减轻的方法，所述方法包括施用有效量的权利要求38的药物组合物。
41.权利要求39-40中任一项的方法，其进一步包括施用第二治疗剂。
42.权利要求41的方法，其中所述第二治疗剂为胰高血糖素相关肽或第二前体药物。
43.权利要求41的方法，其中所述第二治疗剂为胰岛素、瘦蛋白、肽YY（PYY）、胰肽（PP）、成纤维细胞生长因子21（FGF21）、Y2Y4受体激动剂；磺酰脲，甲苯磺丁脲（Orinase）、醋酸己脲（Dymelor）、妥拉磺脲（Tolinase）、氯磺丙脲（Diabinese）、格列吡嗪（Glucotrol）、格列本脲（Diabeta、Micronase、Glynase）、格列美脲（亚莫利）、格列齐特（达美康）；氯茴苯酸，瑞格列奈（Prandin）、那格列奈（Starlix）；双胍，二甲双胍（格华止）、苯乙双胍；噻唑烷二酮，罗格列酮（文迪雅）、吡格列酮（Actos）、曲格列酮（Rezulin）；PPARγ抑制剂；抑制碳水化合物消化的α葡萄糖苷酶抑制剂，米格列醇（Glyset）、阿卡波糖（Precose/拜唐苹）、艾塞那肽（Byetta）、普兰林肽；二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂，维格列汀、西格列汀；SGLT（钠依赖性葡萄糖转运蛋白1）抑制剂；葡萄糖激酶激活剂（GKA）；胰高血糖素受体拮抗剂（GRA）；或FBP酶（果糖1,6-二磷酸酶）抑制剂。
44.权利要求41的方法，其中所述第二治疗剂为苯丁胺、安非拉酮（Tenuate®）、苯甲曲秦（Prelu-2®、Bontril®）、苄非他明（Didrex®）、西布曲明（Meridia®、Reductil®）、利莫那班（Acomplia®）、胃泌酸调节素、盐酸氟西汀（百忧解）、Qnexa（托吡酯和苯丁胺）、Excalia（丁氨苯丙酮和唑尼沙胺）、Contrave（丁氨苯丙酮和纳曲酮）、赛尼可（奥利司他）、西替利司他、或GT 389-255。
45.肽前体药物，其包含SEQ ID NO: 3272-3292、3298-3300、3305-3316、和 3329-3337的任一者。
46.权利要求45的肽前体药物，其由SEQ ID NO: 3272-3292、3298-3300、3305-3316、和 3329-3337的任一者组成。
47.权利要求1-37中任一项的前体药物，其用于治疗高血糖症或糖尿病。
48.权利要求1-37中任一项的前体药物用于制备治疗高血糖症或糖尿病的药物的用途。
49.权利要求1-37中任一项的前体药物，其用于抑制食欲、降低体重增加或诱导体重减轻。
50.权利要求1-37中任一项的前体药物用于制备抑制食欲、降低体重增加或诱导体重减轻的药物的用途。
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