CN101983066B - 基于酯的胰岛素前药 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了生物活性多肽的前药制剂，其中该生物活性多肽被通过酯键的二肽与该生物活性多肽的连接所修饰。在本文某些实施方案中公开的前药延长的半衰期为至少1.5小时(例如，至少10小时)，更通常大于20小时且小于70小时，并且在生理条件下通过由化学不稳定性驱动的非酶促反应转化为活性形式。

Description

基于酯的胰岛素前药
发明背景
基于肽的药物是作用持续时间较短并且治疗指数可变的高效药物。本公开涉及基于肽的前药，其中该前药的衍生物被设计为延缓药物起效和延长药物的半衰期。延缓起效的优势在于，其允许前药在其活化前全身地分布。因此，前药的给药消除了给药时峰活性所导致的并发症，并且增加了母体药物的治疗指数。
肽及蛋白激动剂的受体识别和随后加工是许多基于肽和蛋白的药物降解的主要途径。因此，肽药物与其受体的结合会导致生物刺激，但是也会通过肽或蛋白的酶促降解而启动肽/蛋白诱导的药效的随后失活。根据本公开，能够基于抑制相应受体识别前药而制备前药来延长肽或蛋白的生物半衰期。
本文所公开的前药最终被化学转化为能够被受体识别的结构，其中这种化学转化的速度决定了体内生物作用的起效时间和持续时间。本申请所公开的分子设计取决于不依赖于另外的化学添加剂或酶的分子内化学反应。当脂肪族羟基能够被容纳于活性位点，并且当化学修饰的衍生物产生活性不好的肽时，前药化学广泛应用于基于肽和蛋白的药物。描述这一点的具体实例是在丝氨酸蛋白酶家族中的活性位点丝氨酸处可逆的丝氨酸酯的形成。
胰岛素是神奇的肽激素。其表现出降低几乎全部形式的糖尿病中葡萄糖的空前的能力。不幸的是，胰岛素的药理学不是葡萄糖敏感性的，因此其能够过度地作用从而导致威胁生命的低血糖。不一致的药理学是胰岛素疗法的标志，从而其非常难以将血糖正常化而不引起低血糖。而且，天然胰岛素作用持续时间短并且要求修饰以使得其适合用于控制基础葡萄糖。确立的延缓胰岛素起效的方法包括溶解性降低和白蛋白结合。前药化学提供了在从给药位点清除和高定义浓度下在血浆中平衡后精确地控制胰岛素起效和和持续时间的机会。
详述了胰岛素结构功能关系的研究的丰富历史指出了能够成功应用前药化学的氨基酸位置。胰岛素是双链异源二聚体，其通过酶促加工以生物合成的方式衍生自低效单链胰岛素原前体。人胰岛素由通过二硫键结合在一起的两条肽链(“A链”(SEQIDNO：613)和“B链”(SEQIDNO：614))组成，并且总共具有51个氨基酸。B链的C-末端区和A-链的两个末端在三维结构中结合在一起，从而组装成与胰岛素受体高亲和力结合的位点。在这个活性位点区域的多个位置处能够容纳羟基的选择性插入，而不损失效力。这些活性位点羟基与特异性二肽的化学酯化会明显地降低活性，并且充当合适的前药。
前胰高血糖素原(pre-proglucagon)是158个氨基酸的前体多肽，其在不同组织中加工，形成许多不同的胰高血糖素原(proglucagon)衍生的肽，包括胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)和泌酸调节肽(OXM)，它们参与各种各样的生理功能，不但包括食物摄取的调节，而且包括葡萄糖体内稳态、胰岛素分泌、胃排空和肠生长。胰高血糖素是29个氨基酸的肽(SEQIDNO：612)，其对应于前胰高血糖素原的氨基酸33-61；而GLP-1作为37个氨基酸肽而产生，其对应于前胰高血糖素原的氨基酸72-108。GLP-1(7-36)酰胺(SEQIDNO：602；C末端为精氨酸酰胺)或GLP-1(7-37)酸(SEQIDNO：601；C末端为甘氨酸)是GLP-1生物强效形式，这在GLP-1受体上表现出基本上等同的活性。
胰高血糖素是用于严重低血糖急救治疗的拯救生命的药物。泌酸调节肽据报道具有抑制食欲和减轻体重的药理作用。GLP-1样激动剂的临床研究证明，这一家族的肽对于治疗II型糖尿病是有效的。另外，其由于其葡萄糖依赖性作用而本质上比胰岛素疗法更安全，从而消除低血糖风险。结构活性关系研究证实，这三种肽(胰高血糖素、GLP-1和泌酸调节肽)中每一种的N末端组氨酸对于完全的作用特别重要，并且N-末端延伸的形式严重地降低了生物功效。
与这三种肽的治疗用途有关的一个劣势在于，它们在血浆中极短的半衰期(约2分钟)。因此，为了获得合理的血糖控制，需要连续给予天然胰高血糖素相关的类似物肽，达延长的时间段。短半衰期源自通过二肽基肽酶IV(DPP-IV)的快速降解，该二肽基肽酶IV在第二和第三个氨基酸之间进行切割。这种切割不但使天然肽失活，而且在胰高血糖素和GLP-1的情况下，缩短的形式是它们各自受体的功能性拮抗剂。因此，亟需胰高血糖素、GLP-1和泌酸调节肽及相关肽的较长作用的变体以实现这些药物作用机制的完全治疗潜力。
发明概述
根据一实施方案，通过使二肽经由酯键共价连接至生物活性多肽来制备生物活性多肽的前药衍生物。在一实施方案中，在干扰生物活性多肽与其相应受体或辅因子相互作用的能力的位置，将二肽共价结合至生物活性多肽。随后在生理条件和不存在酶促活性的条件下，除去二肽来恢复多肽的完全活性。
根据一实施方案，提供了前药，其包含通式I的一般结构：
其中
R3选自NH2、氨基酸序列和
R4为-OH、NH2或氨基酸序列，
R10选自H、C1-C4烷基和(CH2)n(C6-C10芳基)，
W为C6-C10芳基或键，并且
N为0至3的整数。
R1和R2独立地选自H、C1-C4烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C4-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R9和CH2(C5-C9杂芳基)，
R5为OH或NH2，并且
R9＝C1-C4烷基、NH2或OH，
其中，R7为-O-氨基酸或O，并且
R12为-0H、H或
其条件是，当R12为
时，
R3不是
并且进一步的条件是，当R3为NH2或氨基酸序列时，
R12为
在某些实施方案中，R3或R4是生物活性肽的氨基酸序列。在更具体的实施方案中，R3是生物活性肽的氨基酸序列，其位于生物活性肽的包含以下结构的侧链的氨基酸的N-末端
并且R4是生物活性肽的氨基酸序列，其位于生物活性肽的上述氨基酸的C-末端。
在某些实施方案中，当R3为
并且
R7为O-氨基酸时，R7为生物活性肽的氨基酸序列，其位于生物活性肽的包含以下结构的侧链的氨基酸的N-末端
并且R4为生物活性肽的氨基酸序列，其位于生物活性肽的上述氨基酸的C-末端。
在一实施方案中，R3为
并且R7和R4代表胰高血糖素、GLP-1或胰岛素肽的氨基酸序列。
在替代性实施方案中，R3为选自胰高血糖素、GLP-1或胰岛素肽的N-末端序列，R4为选自胰高血糖素、GLP-1或胰岛素肽的羧基末端序列，并且R12为
根据一实施方案，提供了生物活性蛋白的前药衍生物，其包含通式II的一般结构：
其中R3为H或生物活性蛋白(如胰高血糖素、GLP-1或胰岛素肽)的N-末端氨基酸，R4代表OH或生物活性蛋白(如胰高血糖素、GLP-1或胰岛素肽)的C-末端氨基酸，R10选自H、C1-C4烷基和(CH2)n(C6-C10芳基)，并且n为0至3的整数。
R1和R2独立地选自H、C1-C4烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C4-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R9和CH2(C5-C9杂芳基)，其中R5为OH或NH2，并且R9＝C1-C4烷基、NH2或OH。在一实施方案中，R1选自CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)(CH2CH3)、(C4-C5)环烷基、(C0-C4烷基)(C6芳基)和(C0-C4烷基)(C5-C6杂芳基)，R2选自(C0-C4烷基)C1-C4烷基、(C4-C5)环烷基、(C0-C4烷基)(C6芳基)和(C0-C4烷基)(C5-C6杂芳基)，并且R5为OH或NH2。
在一实施方案中，通过丝氨酸或苏氨酸残基的羟基使二肽连接至生物活性多肽(即，在通式II的化合物中，n为0，并且R10为H；或者n为0，并且R10为CH3)。更具体而言，修饰的丝氨酸或苏氨酸残基位于蛋白结合结构域或活性位点中，从而二肽的连接干扰生物活性多肽与其天然受体或底物相互作用的能力。
对于通式II的一般结构的前药，至少R3或R4之一代表生物活性肽的氨基酸。在某些实施方案中，R3和R4代表生物活性肽的氨基酸。
根据某些实施方案，前药包含A-B-Q的一般结构，其中A为共价连接至B的羟基酸或氨基酸；B为经由酯键共价连接至Q的氨基酸，并且Q为生物活性肽、多肽或蛋白，例如胰高血糖素超家族肽(如胰高血糖素相关的类似物肽)，其中在PBS中于生理条件下，A-B从Q切割的化学切割半衰期(t1/2)为约1周。
根据一实施方案，提供了包含一般结构A-B-Q的非酶促自我切割复合物，其中Q为已知的生物活性肽并且A-B代表二肽。更具体而言，A可以是氨基酸或羟基酸，并且B是氨基酸。二肽(A-B)经由酯键在干扰Q与其相应受体或辅因子相互作用能力的位置共价连接至Q。在一实施方案中，0为生物活性肽、多肽或蛋白，例如胰高血糖素超家族肽，如胰高血糖素相关的类似物肽，并且A-B代表以下结构的二肽：
其中
R1和R2独立地选自H、C1-C4烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C4-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R9和CH2(C5-C9杂芳基)，
R5为OH或NH2，并且
R9＝C1-C4烷基、NH2或OH，并且
其中R7为-O-氨基酸或0。
在一实施方案中，提供了可注射的贮库组合物(depotcomposition)，其包含具有A-B-Q的一般结构的复合物，其中
A为氨基酸或羟基酸；
B为经由酯键共价连接至Q的氨基酸，并且Q为生物活性肽、多肽或蛋白，例如胰高血糖素超家族肽，如胰高血糖素相关的类似物肽，其中二肽A-B还包含连接至A或B的侧链的贮库聚合物。选择贮库聚合物以具有足够的大小，从而复合物A-B-Q在注射位置被有效地隔绝或者不能与其靶标(如受体)相互作用。A-B从Q的化学切割产生哌嗪二酮或吗啉二酮，并在给药后以受控方式在预定的持续时间内向患者释放活性的生物活性肽、多肽或蛋白。
根据一实施方案，生物活性多肽选自胰岛素、胰高血糖素和GLP-1以及所述多肽的衍生物，其中衍生多肽相对于天然序列包含1至6个氨基酸取代。取代的氨基酸可以是天然氨基酸或合成氨基酸，并且在一实施方案中，氨基酸取代代表保守性氨基酸取代。
在一实施方案中，前药包含通式III的一般结构：
其中，R3包含生物活性蛋白(如胰高血糖素、GLP-1或胰岛素肽)的N-末端氨基酸，R4包含生物活性蛋白(如胰高血糖素、GLP-1或胰岛素肽)的C-末端氨基酸，R1和R2独立地选自H、C1-C3烷基、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)(CH2CH3)、(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，并且R5为OH或NH2，其中非酶促活化t1/2为1hr(小时)至100hr，更通常为12小时至72小时，并且在一实施方案中，t1/2为24hr至48hr。
在一实施方案中，R1选自CH2(CH3)2、(C4-C5)环烷基、CH2(C6芳基)和CH2(C5-C6杂芳基)，R2选自(C4-C5)环烷基、CH2(C6芳基)和CH2(C5-C6杂芳基)，并且R5为OH或NH2。
在某些实施方案中，其中前药包含通式III的一般结构，R3包含生物活性蛋白的N-末端氨基酸，所述N-末端氨基酸位于包含以下侧链结构的氨基酸的N-末端
并且R4包含生物活性蛋白的C-末端氨基酸，所述C-末端氨基酸位于上述氨基酸的C-末端。
在某些方面，其中前药包含通式I、II或III的一般结构，生物活性肽、生物活性多肽或生物活性蛋白选自胰高血糖素超家族肽(如胰高血糖素相关的类似物肽)、骨钙蛋白、胰岛素以及上述之一的类似物、衍生物或偶联物。
在某些方面，胰高血糖素超家族肽选自生长激素释放激素(GHRH；SEQIDNO：657)、血管活性肠肽(VIP；SEQIDNO：658)、垂体腺苷酸环化酶激活多肽27(PACAP-27；SEQIDNO：659)、肽组氨酸甲硫氨酸(PHM；SEQIDNO：660)或促胰液素(SEQIDNO：661)、胰高血糖素(SEQIDNO：612)、毒蜥外泌肽-4(SEQIDNO：662)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(作为SEQIDNO：601的氨基酸7-37提供)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)(SEQIDNO：663)、GIP(SEQIDNO：664)或泌酸调节肽(SEQIDNO：665)，以及上述之一的类似物、衍生物或偶联物。
在某些方面，其中前药包含通式I、II或III的一般结构，胰高血糖素超家族肽为胰高血糖素相关的类似物肽。
根据一实施方案，提供了胰岛素的前药衍生物，其中胰岛素前药包含A链和B链，A链包含SEQIDNO：626的序列，B链包含SEQIDNO：628的序列，其中以下通式的二肽经由酯键连接至位于SEQIDNO：626的位置1、4或21或者SEQIDNO：628的位置1、5、12或21的氨基酸，其中R1和R2独立地选自H、C1-C3烷基、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)(CH2CH3)、(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，并且R5为OH或NH2：
根据一实施方案，提供了GLP-1或胰高血糖素的前药衍生物，其中前药包含R3-Y-R4的一般结构的多肽，其中Y是选自以下结构的结构：
其中，n为0至3的整数，并且m为1-4的整数，
R3为选自X1X2X3G(SEQIDNO：621)和
的氨基酸序列，
其中，X1选自组氨酸、羟基-组氨酸、高组氨酸(homo-histidine)、酪氨酸和苯丙氨酸；X2为选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、d丙氨酸、氨基异丁酸、N-甲基丙氨酸和类似大小的天然及合成的氨基酸的氨基酸；X3选自谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺；X4选自脱氨基组氨酸、脱氨基高组氨酸、脱氨基酪氨酸和脱氨基苯丙氨酸，
R4为选自以下序列的氨基酸序列：
FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQIDNO：603)、
FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-酰胺(SEQIDNO：604)、
FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGX14PSSGAPPPS-酰胺(SEQIDNO：605)，其中X14为Arg或Gly；
FTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQIDNO：618)和
FTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTPSSGAPPPS-酰胺(SEQIDNO：620)；
R5为NH2或HO；
R6为H或
R7为O或OX4X2X3G(SEQIDNO：634)；并且
R1和R2独立地选自H、C1-C3烷基、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)(CH2CH3)、(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)；并且R5为OH或NH2，，
其条件是，当R3为
时，
R6为H，并且当R6为
时，
R3为X1X2X3G-(SEQIDNO：621)，
还假设当R6为H时，R3不是X1X2X3G-(SEQIDNO：621)。
在一实施方案中，R1选自CH2(CH3)2、(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，并且R2选自(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)；且R5为OH或NH2。
在一实施方案中，提供了GLP-1前药，其包含通式III的结构：
其中，
R3为选自R5HAQG(SEQIDNO：639)、R5FAQG(SEQIDNO：640)、R5YAQG(SEQIDNO：641)的氨基酸序列；
R4包括选自以下序列的氨基酸序列：
FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQIDNO：603)、
FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-酰胺(SEQIDNO：604)和
FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGX14PSSGAPPPS-酰胺(SEQIDNO：605)，其中X14为Arg或G1y；
R5为NH2或HO；并且
R1和R2独立地选自H、C1-C3烷基、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)(CH2CH3)、(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，并且R5为OH或NH2。
在一实施方案中，R1选自CH2(CH3)2、(C4-C5)环烷基、CH2(C6芳基)、和CH2(C5-C6杂芳基)，R2选自(C4-C5)环烷基、CH2(C6芳基)，并且R5为OH或NH2。
附图简述
图1为制备GLP-1类似物HO-FAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGXPSSGAPPPS(SEQIDNO：607；HO-F7，GLP(8-36)-CEX)的合成示意图。
图2是示出相对于GLP-1(●)的GLP-1类似物HO-F7，GLP(8-36)-CEX(○)的生物测定结果的图。
图3是制备酯连接的胺亲核试剂二肽前药的合成示意图。
图4是制备酯连接的羟基亲核试剂二肽前药的合成示意图。
图5A和5B是通过带有胺亲核试剂的前药(图5A)和通过带有羟基亲核试剂的前药(图5B)切割酯键来分别产生活性化合物和哌嗪二酮或吗啉二酮的示意图。
图6A至6D显示以下四种前药的结构和它们各自的t1/2时间：(6A：HO-F5dV6-O-F7，GLP(8-36)-CEX；6B：F5V6-O-F7，GLP(8-36)-CEX；6C：HO-F5F6-O-F7，GLP(8-36)-CEX和6D：G5V6-O-F7，GLP(8-36)CEX)。
图7是表示生物测定数据的条形图，其显示G5V6-O-F7，GLP(8-36)CEX随时间相对于合适的GLP-1对照的相对效力。
图8是表示生物测定数据的条形图，其显示HO-F5F6-O-F7，GLP(8-36)-CEX随时间相对于合适的GLP-1对照的相对效力。
图9是显示相对于GLP-1(■)的内部丝氨酸/苏氨酸GLP衍生物(F7Q9S11GLPCEX，◆；F7Q9T11GLPCEX，◇)的生物测定结果的图。
图10是将前药和药物浓度的对数随时间作图的图，其示出了前药F7Q9-S11-(Gly-Gly)-GLP-CEX)的动力学谱。数据显示前药(◆)随时间的消失和药物(□)随时间的出现。这里所示的结果是典型的本文所公开的前药。
图11A至11C提供了合成(H7F)，(E9Q)，[T11S-Oβ-(Gly-Gly)]，GLP(8-36)-CEX的合成示意图。
图12表示响应以下步骤的作为时间(分钟)的函数的血糖(mg/dl)的图：在DIO小鼠中注射葡萄糖，然后注射PBS媒介物、基于GLP-1的肽(2nmol/kg的肽B或D)或者两种不同的基于GLP-1的肽(2nmol/kg的肽A、C或E)的前药。
图13表示响应以下步骤的作为时间(分钟)的函数的血糖(mg/dl)的图：在DIO小鼠中注射葡萄糖，然后注射PBS媒介物、基于GLP-1的肽(2nmol/kg的肽F)或者两种不同的基于GLP-1的肽(2nmol/kg的肽G或H)的前药。
图14表示响应以下步骤的作为时间(分钟)的函数的血糖(mg/dl)的图：在DIO小鼠中注射葡萄糖，然后注射PBS媒介物、基于GLP-1的肽(0.67nmol/kg的肽D或F)或者基于GLP-1的肽(0.67nmol/kg的肽E或G)的前药。
图15表示响应以下步骤的作为时间(分钟)的函数的血糖(mg/dl)的图：在DIO小鼠中注射葡萄糖，然后注射媒介物对照、15nmol/kg或70nmol/kg的基于GLP-1的聚乙二醇化的肽(肽Y和F-PEG)或者15nmol/kg或70nmol/kg的基于GLP-1的肽(肽Z和G-PEG)的前药。
图16表示注射了媒介物对照、15nmol/kg或70nmol/kg的基于GLP-1的聚乙二醇化的肽(肽Y和F-Peg)或者15nmol/kg或70nmol/kg的基于GLP-1的肽(肽Z和G-PEG)的前药的DIO小鼠的总体重变化的图。
图17表示注射了媒介物对照、15nmol/kg或70nmol/kg的基于GLP-1的聚乙二醇化的肽(肽Y和F-Peg)或者15nmol/kg或70nmol/kg的基于GLP-1的肽(肽Z和G-PEG)的前药的DIO小鼠的总食物摄取的图。
图18是某些胰高血糖素超家族肽的氨基酸序列的比对。
发明详述
定义
在描述本发明和要求保护本发明时，根据下文所列的定义使用下述术语。
本文所用的术语“前药”定义为任何化合物，其在表现出其药理效果前进行生物转化。
“生物活性肽”指能够在体外和/或体内发挥生物效果的多肽。
如本文所用的，对肽的一般引用旨在包括具有修饰的氨基末端和羧基末端的肽。例如，指定标准氨基酸的氨基酸序列旨在包括氨基酸链，该氨基酸链包含代替末端羧酸的酰胺基团。本文所用的术语“O-氨基酸”或“HO-氨基酸”指定这样的氨基酸，其中氨基酸或氨基酸序列的N-末端天然氨基已分别被氧或羟基代替。例如，“O-HAEG”或“HO-HAEG”旨在指定这样的氨基酸序列(HAEG)，其中N-末端的天然氨基已分别被氧或羟基代替。本文所用的术语“羟基酸”或“羟基酸”指这样的氨基酸，其中天然α氨基已被羟基代替。类似地，指定“-氨基酸-酰胺”代表这样的氨基酸序列，其中天然羧基被酰胺基团代替。
没有规定其立体化学的情况下，指定氨基酸旨在包括氨基酸的L或D形式或者外消旋混合物。
本文所用的术语“药用可接受的载体”包括任何标准药物载体，例如磷酸盐缓冲液、水、诸如油/水或水/油乳液的乳液以及各种类型的湿润剂。该术语还包括由美国联邦政府的管理机构所批准或美国药典中所列的用于包括人在内的动物的任何试剂。
本文所用的术语“药用可接受的盐”指保持母体化合物生物活性的化合物的盐，并且不是生物或其他方式所不期望的。本文公开的许多化合物能够通过氨基和/或羧基或与它们类似的基团而形成酸和/或碱盐。
药用可接受的碱加成盐能够从无机和有机碱来制备。仅作为示例的源自无机碱的盐包括钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐和镁盐。源自有机碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺的盐。
药用可接受的酸加成盐可以从无机和有机酸来制备。源自无机酸的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。源自有机酸的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、唾液酸等。
本文所用的术语“治疗”包括具体病症或疾病状况的预防，或者与具体病症或疾病状况有关的症状的缓和，和/或所述症状的预防或消除。例如，本文所用的术语“治疗糖尿病”通常指将血糖水平保持在正常水平附近，并且包括根据给定状况而升高或降低血糖水平。
本文所用的前药的“有效”量或“治疗有效量”指无毒但是足以提供期望效果的前药的量。例如，一种期望效果是预防或治疗高血糖。“有效”量根据个体的年龄和一般状况、给药模式等随个体而变化。因此，不可能总是规定准确的“有效量”。然而，任何个体情况的合适的“有效”量由本领域技术人员利用常规实验来测定。
术语“胃肠外”表示不通过消化道而是通过某些其他途径，例如皮下、肌肉内、脊柱内或静脉内。
术语“胰高血糖素超家族肽”指这样的一组肽，其在它们的N-末端区域和C-末端区域结构相关(参见，例如Sherwoodetal.，EndocrineReviews21：619-670(2000))。这一组的成员包括全部胰高血糖素相关的类似物肽，以及生长激素释放激素(GHRH；SEQIDNO：657)、血管活性肠肽(VIP；SEQIDNO：658)、垂体腺苷酸环化酶激活多肽27(PACAP-27；SEQIDNO：659)、肽组氨酸异亮氨酸(PHI)、肽组氨酸甲硫氨酸(PHM)(SEQIDNO：660)和促胰液素(SEQIDNO：661)，以及相对于天然肽具有高达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰的其类似物、衍生物或偶联物。胰高血糖素超家族肽优选保持与其相应受体相互作用的能力。例如，胰高血糖素和胰高血糖素类似物、衍生物及其偶联物优选保持与胰高血糖素受体相互作用的能力。
除非另外指明，对胰高血糖素超家族肽中氨基酸位置的任何引用(例如，对于前药部分、偶联物部分、亲水聚合物、酰化或烷基化、氨基酸修饰等的连接)，指相对于天然胰高血糖素氨基酸序列(SEQIDNO：612)的位置，对于代表性胰高血糖素超家族肽的比对，参见图18。
术语“胰高血糖素相关的类似物肽”指这样的肽：其对胰高血糖素受体、GLP-1受体、GLP-2受体和GIP受体的任何一种或多种具有生物活性(作为激动剂或拮抗剂)，并且包含与天然胰高血糖素(SEQIDNO：612)、天然泌酸调节肽(SEQIDNO：665)、天然毒蜥外泌肽-4(SEQIDNO：662)、天然GLP-1(SEQIDNOs：601和602)、天然GLP-2(SEQIDNO：663)或天然GIP(SEQIDNO：664)中的至少一种共有至少40％序列同一性(如45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％)的氨基酸序列。除非另外指明，对胰高血糖素相关的类似物肽中氨基酸位置的任何引用(例如，对于前药部分、偶联物部分、亲水聚合物、酰化或烷基化、氨基酸修饰等的连接)，指相对于天然胰高血糖素氨基酸序列(SEQIDNO：612)的位置。
本文所用的术语“同一性”涉及两个或更多个序列之间的相似性。通过用相同残基的数目除以残基的总数并将结果乘以100以获得百分比来测量同一性。因此，两个完全相同拷贝的序列具有100％的同一性，而互相具有氨基酸缺失、增加或取代的两个序列具有较低程度的同一性。本领域技术人员应当认识到，诸如使用如BLAST的算法(BasicLocalAlignmentSearchTool，Altschuletal.(1993)J.Mol.Biol.215：403-410)的几种计算机程序对于测定序列同一性是可用的。
术语“GLP-1激动剂”指这样的化合物，其刺激如利用诸如实施例2中所述的有效体外模型测定通过cAMP产生所测量的GLP-1受体活性。
本文所用的术语“天然GLP-1”是一般术语，其指定GLP-1(7-36)酰胺(由SEQIDNO：602的序列组成)、GLP-1(7-37)酸(由SEQIDNO：601的序列组成)或这两种化合物的混合物。如本文所用的，在没有任何进其他指定的情况下对“GLP-1”的一般引用旨在分别表示天然GLP-1。
本文所用的术语“胰高血糖素肽”是一般术语，其指定SEQIDNO：612的天然胰高血糖素肽，以及相对于SEQIDNO：612序列，在氨基酸位置1、2、5、7、8、10、12、13、14、16、17、18、24、28和29处具有一个或多个氨基酸取代的修饰的衍生物。
本文所用的术语“GLP-1肽”是一般术语，其指定天然GLP-1，以及相对于天然GLP-1序列，在氨基酸位置1、2、3、5、8、10、12、13、14、16、17、18、24、28和29处具有一个或多个氨基酸取代的修饰的衍生物。
本文所用的术语“胰岛素肽”是一般术语，其指定包含SEQIDNO：613的A链和SEQIDNO：614的B链以及A链和/或B链的修饰的衍生物的51个氨基酸的二聚体，包括在选自A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30的位置处的一个或多个氨基酸取代，或者B1至5和B26至30的任何或全部位置的缺失。
本文所用的氨基酸“修饰”指氨基酸的取代、添加或缺失，并且包括任何通常在人蛋白质中发现的20种氨基酸以及非典型或非天然存在的氨基酸的取代或添加。非典型氨基酸的商业来源包括Sigma-Aldrich(Milwaukee，WI)、ChemPepInc.(Miami，FL)和GenzymePharmaceuticals(Cambridge，MA)。非典型氨基酸可以购自供应商，从头合成或者从天然存在的氨基酸化学修饰或衍生。
本文所用的氨基酸“取代”指一个氨基酸残基被不同的氨基酸残基代替。
本文所用的术语“保守性氨基酸取代”在本文中定义为在以下5组之一中互换：
I.小脂肪族、非极性或微极性残基：
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
II.极性、带负电荷的残基及其酰胺：
Asp、Asn、Glu、Gln；
III.极性、带正电荷的残基：
His、Arg、Lys、鸟氨酸(Orn)
IV.大、脂肪族、非极性残基：
Met、Leu、Ile、Val、Cys、正亮氨酸(Nle)、高半胱氨酸；
V.大、芳香残基：
Phe、Tyr、Trp、乙酰基苯丙氨酸。
本文所用的一般术语“聚乙二醇链”或“PEG链”指由通式H(OCH2CH2)nOH表示的、支链或直链的环氧乙烷与水的缩聚物的混合物，其中n至少为9。在没有任何其他表征的情况下，该术语旨在包括平均总分子量为500道尔顿至80,000道尔顿的乙二醇聚合物。“聚乙二醇链”或“PEG链”与数值后缀联合使用以表明其大约的平均分子量。例如，PEG-5,000指平均总分子量为约5,000道尔顿的聚乙二醇链。
本文所用的术语“聚乙二醇化”及类似的术语指这样的化合物，其通过将聚乙二醇链连接至该化合物而由其天然状态进行了修饰。“聚乙二醇化的多肽”是具有共价结合至该多肽的PEG链的多肽。
本文所用的“连接物”是键、分子或分子的组，其使两个分离的实体互相结合。连接物可以提供两个实体的最佳间隔，或者还可以供给允许两个实体互相分离的可靠连接。可靠连接包括光致切割基团、酸不稳定部分(acid-labilemoiety)、碱不稳定部分和酶致切割基团。
本文所用的“二聚体”是包含经由连接物彼此共价结合的两个亚基的复合物。术语二聚体，当没有任何限定语而使用时，包括同型二聚体和异源二聚体。同型二聚体包含两个相同的亚基，而异源二聚体包含两个不同的亚基，尽管这两个亚基基本上互相类似。
本文所用的术语“C1-Cn烷基”，其中n为1至6，表示具有1至规定数目的碳原子的支链或直链烷基。典型的C1-C6烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。
本文所用的术语“C2-Cn烯基”，其中n可以为2至6，表示具有2至规定数目的碳原子和至少一个双键的烯烃不饱和支链或直链基团。这样的基团的实例包括但不限于1-丙烯基、2-丙烯基(-CH2-CH＝CH2)、1，3-丁二烯基(-CH＝CHCH＝CH2)、1-丁烯基(-CH＝CHCH2CH3)、己烯基、戊烯基等。
本文所用的术语“C2-Cn炔基”，其中n可以为2至6，表示具有2至n个碳原子和至少一个三键的不饱和直链或支链基团。这样的基团的实例包括但不限于1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基等。
本文所用的术语“芳基”至具有一个或两个芳香环的单环或二环碳环体系，包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。芳基环的大小和取代基或连接基团的存在通过指定碳原子存在的数目来表示。例如，术语“(C1-C3烷基)(C6-C10芳基)”指5至10元的芳基，其经由1至3元的烷基链连接至母体部分。
本文所用的术语“杂芳基”指单环或二环体系，其含有1个或2个芳香环并且在芳香环中含有至少一个氮、氧或硫原子。杂芳基环的大小和取代基或连接基团的存在通过指定碳原子存在的数目来表示。例如，术语“(C1-Cn烷基)(C5-C6杂芳基)”指5或6元的杂芳基，其经由1至“n”元的烷基链连接至母体部分。
本文所用的术语“带电荷的氨基酸”指于生理pH值下在水溶液中，包含带负电的侧链(即，去质子化)或带正电荷的侧链(即，质子化)的氨基酸。例如，带负荷电的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、半胱磺酸、高半胱磺酸和高谷氨酸，而带正电荷的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带电荷的氨基酸包括在人蛋白质中常见的20种氨基酸中以及非典型或非天然存在的氨基酸中的带电荷氨基酸。
本文所用的术语“酸性氨基酸”指包含包括例如羧酸基团或磺酸基团在内的第二酸性部分的氨基酸。
没有其他指定的情况下，本文所用的术语“患者”旨在包括任何驯养的温血脊椎动物(例如，包括但不限于家畜、马、猫、犬和其他宠物)和人。
实施方案
本公开描述了已知的生物活性多肽的前药衍生物的制剂。更具体而言，配制本文所公开的前药以增强母体生物活性肽或蛋白的半衰期，同时允许经由非酶促降解机制来激活前药。理想的前药应当在生理条件(例如，pH值为7.2和37℃)下溶于水，并且应当在长期储存的粉末形式中保持稳定。理想的前药还应当是免疫沉默的，并且相对于母体药物表现出低活性。通常，前药表现出的活性不超过母体药物的10％。在一实施方案中，相对于母体药物，前药表现出小于10％、小于5％、约1％或小于1％的活性。而且，当注射于体内时，前药应当在给定的时间段内定量地转化为活性药物。如本文所公开的，申请人提供了制备满足每一个这些目的的已知生物活性多肽的前药的一般技术。
更具体而言，提供了化学可逆(chemoreversible)的前药，其包含修饰为具有经由酯键共价结合至生物活性多肽的二肽的已知生物活性多肽的序列。在一实施方案中，提供了生理条件下非酶促激活半衰期(t1/2)为1-100hr的前药。本文所公开的生理条件旨在包括约约35℃至40℃的温度和约7.0至约7.4的pH值，并且更通常包括7.2至7.4的pH值和36℃至38℃的温度。
有利的是，切割的速率及因此前药的激活取决于二肽原部分(pro-moiety)的结构和立体化学，并且还取决于亲核试剂的强度。本文公开的前药最终被化学转化为能够被药物的天然受体识别的结构，其中这种化学转化的速度会决定体内生物作用的起效时间和持续时间。本申请所公开的分子设计取决于不依赖于其他化学添加剂或酶的分子内化学反应。转化的速度由二肽取代基的化学属性及其在生理条件下的切割控制。由于生理pH值和温度在高度限定的范围内受到严紧调节，所以从前药转化为药物的速度会表现出高患者内和患者间重复性。
如本文所公开的，提供了前药，其中生物活性多肽延长的半衰期为至少1小时，更通常大于20小时但是小于100小时，并且该前药通过由内在化学不稳定性驱动的非酶促反应在生理条件下转换为活性形式。在一实施方案中，前药的非酶促激活t1/2时间为1-100hr，更通常为12小时至72小时，在一实施方案中，通过于37℃和7.2的pH值下将前药在磷酸盐缓冲溶液(如PBS)中孵育所测量的t1/2为24-48hr。各种前药的半衰期利用公式t1/2＝0.693/k来计算，其中“k”为前药降解的一级速率常数。在一实施方案中，前药的激活发生在酯键连接的二肽的切割以及哌嗪二酮或吗啉二酮和活性生物活性多肽的形成之后(参见，图5A和％B)。已经鉴定了由天然或合成的氨基酸组成的具体二肽，其促进生理条件下的分子内分解以释放生物活性肽。
当脂肪族羟基能够容纳于活性位点，并且当化学修饰的衍生物产生活性不好(例如，相对于母体，具有10％或更低的活性)的肽或蛋白质时，前药化学广泛地应用于基于肽和蛋白质的药物。描述这一点的具体实例是丝氨酸蛋白酶家族的活性位点丝氨酸处的可逆丝氨酸酯的形成。能够使用这样的前药技术的医药上重要的肽和蛋白质包括但不限于胰岛素、胰高血糖素及胰高血糖素相关的肽(GLP，泌酸调节肽)、胃泌素抑制肽(GIP)、生长激素释放激素(GHRH)、降钙素、甲状旁腺激素(PTH)、神经肽Y(NPY)、胰多肽(PP)以及相关的物质。能够使用这样的前药技术的医药上重要的蛋白包括但不限于生长激素、红细胞生成素(EPO)、嗜中性粒细胞刺激生长因子(CGSF)、干扰素、凝血酶、抗体、瘦蛋白等。根据一实施方案，提供了胰高血糖素、胰岛素、GLP-1的前药衍生物，或者胰高血糖素、胰岛素或GLP-1的修饰的衍生物。本文所用的胰高血糖素、胰岛素或GLP-1的修饰的衍生物包括例如这样的多肽：其与胰高血糖素、胰岛素或GLP的天然序列的不同分别在于1、2、3、4、5或6个氨基酸取代。
根据一实施方案，包括例如带有羟基的丝氨酸或苏氨酸残基的侧链或者N-末端羟基化的氨基酸(HO-氨基酸)的羟基在内的生物活性肽或蛋白的脂肪族羟基被以下基团的共价键经由酯键修饰至生物活性多肽：
其中，R1和R2独立地选自H、C1-C6烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C4-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R9和CH2(C5-C9杂芳基)，并且R5为OH或NH2。
在某些实施方案中，生物活性肽是胰高血糖素超家族肽(如胰高血糖素相关的类似物肽)、骨钙蛋白或者上述之一的类似物、衍生物或偶联物。
在一实施方案中，生物活性蛋白为胰高血糖素、GLP-1或胰岛素。
在一实施方案中，R1和R2独立地选自H、C1-C3烷基、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)(CH2CH3)、(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，并且R5为OH或NH2。在一实施方案中，R1选自CH2(CH3)2、(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，R2选自(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，并且R5为OH或NH2。
根据一实施方案，提供了前药，其包含通式I的一般结构：
其中R3选自NH2、HO-、氨基酸序列和
R4为-OH、NH2或氨基酸序列，
R10选自H、C1-C4烷基和(CH2)n(C6-C10芳基)，W为C6-C10芳基或键，并且
n为0至3的整数，
R1和R2独立地选自H、C1-C4烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C4-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R9和CH2(C5-C9杂芳基)，
R5为OH或NH2，并且
R9＝C1-C4烷基、NH2或OH，
其中R7为-O-氨基酸或O，并且
R12为-OH或
其条件是，当R12是
时，
R3不是
并且进一步的条件是，当R3为NH2或氨基酸序列时，R12是
在某些实施方案中，R3或R4为生物活性肽的氨基酸序列。在更具体的实施方案中，R3为生物活性肽的氨基酸序列，其位于生物活性肽的包含以下结构的侧链的氨基酸的N-末端
并且R4为生物活性肽的氨基酸序列，其位于生物活性肽的上述氨基酸的C-末端。
在某些实施方案中，当R3为
并且
R7为O-氨基酸时，R7为生物活性肽的氨基酸序列，其位于生物活性肽的包含以下结构的侧链的氨基酸的N-末端
并且R4为生物活性肽的氨基酸序列，其位于生物活性肽的上述氨基酸的C-末端。
在一实施方案中，R3为
并且R7和R4代表胰高血糖素、GLP-1或胰岛素肽的氨基酸序列。
在替代性实施方案中，R3为选自胰高血糖素、GLP-1或胰岛素肽的N-末端序列，R4为选自胰高血糖素、GLP-1或胰岛素肽的羧基末端序列，并且R12为
根据一实施方案，提供了生物活性蛋白的前药衍生物，其包含通式II的一般结构：
其中，R3为H或生物活性蛋白(如胰高血糖素、GLP-1或胰岛素肽)的N-末端氨基酸，R4代表OH或生物活性蛋白(如胰高血糖素、GLP-1或胰岛素肽)的C-末端氨基酸，R10选自H、C1-C4烷基和(CH2)n(C6-C10芳基)，其中n为0至3的整数，
R1和R2独立地选自H、C1-C4烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C4-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R9和CH2(C5-C9杂芳基)，其中R5为OH或NH2，并且R9＝C1-C4烷基、NH2或OH。
在一实施方案中，R1选自CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)(CH2CH3)、(C4-C5)环烷基、(C0-C4烷基)(C6芳基)和(C0-C4烷基)(C5-C9杂芳基)，R2选自(C0-C4烷基)C1-C4烷基、(C4-C5)环烷基、(C0-C4烷基)(C6芳基)和(C0-C4烷基)(C5-C9杂芳基)，并且R5为OH或NH2。
在一实施方案中，通过丝氨酸或苏氨酸残基的羟基使二肽连接至生物活性多肽(即，在通式II的化合物中，n为0，并且R10为H；或者n为0，并且R10为CH3)。更具体而言，修饰的丝氨酸或苏氨酸残基位于蛋白结合结构域或活性位点中，从而二肽的连接干扰生物活性多肽与其天然受体或底物相互作用的能力。
对于通式II的一般结构的前药，至少R3或R4之一代表生物活性肽的氨基酸。在某些实施方案中，R3和R4代表生物活性肽的氨基酸。
根据一实施方案，提供了具有通式II的一般结构的多肽，其中R3选自H和氨基酸序列；
R4为-OH或氨基酸序列；
R10选自H、C1-C4烷基和(CH2)n(C6-C10芳基)，其中n为0至3的整数；
R1选自CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)(CH2CH3)、(C4-C5)环烷基、(C0-C4烷基)(C6芳基)和(C0-C4烷基)(C5-C6杂芳基)；
R2选自(C0-C4烷基)C1-C4烷基、(C4-C5)环烷基、(C0-C4烷基)(C6芳基)和(C0-C4烷基)(C5-C6杂芳基)；并且R5为OH或NH2。
在另一实施方案中，R10为H并且n为0。
根据一实施方案，提供了具有通式IV的一般结构的前药：
其中R3为H或位于存在于生物活性多肽中的丝氨酸/苏氨酸残基(天然或氨基酸取代)上游的生物活性蛋白的N-末端氨基酸，R4表示OH或位于存在于生物活性多肽(酸或酰胺)中的丝氨酸/苏氨酸残基(天然或氨基酸取代)下游的生物活性蛋白的C-末端氨基酸，R10为H或CH3，其中位于所述生物活性蛋白中的丝氨酸/苏氨酸部分已经被以下基团的共价键修饰：
其中R1和R2独立地选自H、C1-C4烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C4-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R9和CH2(C5-C9杂芳基)；
R5为OH或NH2；并且
R9＝C1-C4烷基、NH2或OH。
在一实施方案中，R1选自CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)(CH2CH3)、(C4-C5)环烷基、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)和(C0-C4烷基)(C5-C9杂芳基)，R2选自(C0-C4烷基)C1-C4烷基、(C4-C5)环烷基、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)和(C0-C4烷基)(C5-C9杂芳基)，并且R5为OH或NH2。在一实施方案中，选择用于修饰的丝氨酸/苏氨酸残基位于蛋白结合结构域或活性位点，从而二肽的连接干扰生物活性多肽与其天然受体或底物相互作用的能力。
对于包含通式II或通式IV的一般结构的前药，至少R3或R4之一代表生物活性肽的氨基酸。在某些实施方案中，R3和R4都代表生物活性肽的氨基酸。在某些实施方案中，R3为生物活性肽的氨基酸序列，其位于生物活性肽的包含以下结构的侧链的氨基酸的N-末端
并且R4为生物活性肽的氨基酸序列，其位于生物活性肽的上述氨基酸的C-末端。
根据一实施方案，生物活性多肽选自胰岛素、胰高血糖素、GLP-1和这些多肽的衍生物，其中衍生物相对于天然序列的不同在于1、2、3、4、5或6个氨基酸。在一实施方案中，胰岛素、胰高血糖素、GLP-1衍生物与天然序列的不同在于1、2、3、4、5或6个保守氨基酸取代。
在一实施方案中，前药包含通式III的一般结构：
其中，R3包含生物活性蛋白的天然N-末端氨基酸，R4包含生物活性蛋白的天然C-末端氨基酸，其中R1和R2独立地选自H、C1-C3烷基、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)(CH2CH3)、(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，并且R5为OH或NH2，其中非酶促激活t1/2为10-100hr。在一实施方案中，前药的t1/2为20-70hr。
在一实施方案中，R1选自CH2(CH3)2、(C4-C5)环烷基、CH2(C6芳基)和CH2(C5-C6杂芳基)，R2选自(C4-C5)环烷基、CH2(C6芳基)和CH2(C5-C6杂芳基)，并且R5为OH或NH2。
在某些实施方案中，其中前药包含通式III的一般结构，R3包含生物活性蛋白的N-末端氨基酸，其位于生物活性蛋白的包含以下结构的侧链的氨基酸的N-末端
并且R4包含生物活性蛋白的C-末端氨基酸，其位于生物活性蛋白的上述氨基酸的C-末端。
根据一实施方案，生物活性多肽选自胰岛素、胰高血糖素、GLP-1和胰岛素、胰高血糖素和GLP-1的衍生物，其中衍生多肽相对于天然序列包含1至6个氨基酸取代。取代氨基酸可以是天然氨基酸或合成的氨基酸，在一实施方案中，氨基酸取代代表保守性氨基酸取代。
生物活性肽、多肽和蛋
经由酯键连接至前药二肽部分的生物活性肽、生物活性多肽或生物活性蛋白可以是胰高血糖素超家族肽(例如胰高血糖素超家族的成员(上文Sherwoodetal.，2000所述的那些)、胰高血糖素相关的类似物肽、骨钙蛋白、胰岛素或者它们的类似物、衍生物或偶联物。
骨钙蛋白
在某些实施方案中，生物活性肽为骨钙蛋白或者其包含氨基酸序列的类似物或衍生物，该氨基酸序列与天然骨钙蛋白在天然肽的长度上至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相同。在一相关的实施方案中，生物活性肽可以包括骨钙蛋白的类似物，该类似物相对于天然骨钙蛋白具有高达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
胰岛素
在其他实施方案中，生物活性肽为胰岛素或者其包含A链和B链的类似物或衍生物，每条链都包含与胰岛素的天然A链或B链在天然肽的长度上至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。在相关的实施方案中，胰岛素类似物或衍生物可以包括胰岛素A链或B链的类似物，该类似物相对于天然A胰岛素链或B胰岛素链具有高达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。在具体的实施方案中，胰岛素的A链包含SEQIDNO：613或SEQIDNO：626的氨基酸序列或者它们的类似物或衍生物(如，与SEQIDNO：613或626具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或者相对于SEQIDNO：613或626具有高达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)。另外，在某些实施方案中，胰岛素的B链可以包含SEQIDNO：614、SEQIDNO：627或SEQIDNO：628的氨基酸序列或者它们的类似物或衍生物(如，与SEQIDNO：614、SEQIDNO：627或SEQIDNO：628具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或者相对于SEQIDNO：614、SEQIDNO：627或SEQIDNO：628具有高达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰)。
胰高血糖素超家族肽
仍然在其他实施方案中，生物活性肽是任何本领域已知的胰高血糖素超家族肽，其包括例如GHRH(SEQIDNO：657)、VIP(SEQIDNO：658)、PACAP-27(SEQIDNO：659)、PHM(SEQIDNO：660)、促胰液素(SEQIDNO：661)、胰高血糖素(SEQIDNO：612)、毒蜥外泌肽-4(SEQIDNO：662)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(如，作为SEQIDNO：601提供的氨基酸7-37)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)(SEQIDNO：663)、GIP(SEQIDNO：664)和泌酸调节肽(SEQIDNO：665)。
胰高血糖素超家族肽可以具有共有的特征，其包括但不限于N-末端氨基酸中的同源性和/或C-末端部分中的α-螺旋结构。据认为，C-末端通常在受体结合中起作用，N-末端通常在受体信号传送中起作用。N-末端部分和C-末端部分的一些氨基酸，如His1、Gly4、Phe6、Phe22、Val23、Trp25和Leu26(根据胰高血糖素的氨基酸编号)，在胰高血糖素超家族成员中是高度保守的，从而胰高血糖素超家族成员的氨基酸在相应的位置表现出同一性；被保守取代，或者在氨基酸侧链上表现出相似性。
胰高血糖素超家族肽可以是包含具有高达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰的天然氨基酸序列的下列蛋白的类似物或衍生物：GHRH(SEQIDNO：657)、VIP(SEQIDNO：658)、PACAP-27(SEQIDNO：659)、PHM(SEQIDNO：660)、促胰液素(SEQIDNO：661)、胰高血糖素(SEQIDNO：612)、毒蜥外泌肽-4(SEQIDNO：662)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(如，作为SEQIDNO：601提供的氨基酸7-37)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)(SEQIDNO：663)、GIP(SEQIDNO：664)和泌酸调节肽(SEQIDNO：665)。
例如，胰高血糖素超家族肽可以包含C-末端或C-末端氨基酸序列，其包括但不限于：COOH、CONH2、GPSSGAPPPS(SEQIDNO：624)、GPSSGAPPPS-CONH2(SEQIDNO：723)、泌酸调节肽羧基末端延伸、KRNRNNIA(SEQIDNO：625)或KGKKNDWKHNITQ(SEQIDNO：666)。另外，胰高血糖素超家族肽的C-末端氨基酸序列在下文中作了更详细讨论。
此外，例如，胰高血糖素超家族肽可以是GHRH(SEQIDNO：657)的类似物，该类似物包含与天然GHRH在天然肽的长度上至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。胰高血糖素超家族肽可以包含GHRH的类似物，该类似物相对于天然GHRH具有高达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
仍然在其他实施方案中，生物活性肽可以包含氨基酸序列，该氨基酸序列是两种或更多种天然胰高血糖素相关的类似物肽序列的嵌合体。在某些实施方案中，生物活性肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列与天然胰高血糖素(SEQIDNO：612)至少约50％相同，并且保持对应于SEQIDNO：612的氨基酸12-29的氨基酸的α-螺旋构象。
生物活性肽可以是胰高血糖素超家族肽的偶联物。本文还描述了胰高血糖素相关的类似物肽的偶联物。本文的上下文中偶联物的教导通常适用于不是胰高血糖素相关的类似物肽的生物活性肽。
在某些实施方案中，胰高血糖素超家族肽为胰高血糖素相关的类似物肽，例如胰高血糖素(SEQIDNO：612)、泌酸调节肽(SEQIDNO：665)、毒蜥外泌肽-4(SEQIDNO：662)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(作为SEQIDNO：601提供的氨基酸7-37)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)(SEQIDNO：663)、GIP(SEQIDNO：664)或者上述的类似物、衍生物和偶联物。在某些实施方案中，胰高血糖素相关的类似物肽包含天然胰高血糖素、天然毒蜥外泌肽-4、天然(7-37)GLP-1、天然GLP-2、天然GHRH、天然VIP、天然PACAP-27、天然PHM、天然泌酸调节肽、天然促胰液素或天然GIP的氨基酸序列，该氨基酸序列具有高达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。这样的肽在本领域是已知的。参见，例如WO2008023050、WO2007030519、WO2005058954、WO2003011892、WO2007046834、WO2006134340、WO2006124529、WO2004022004、WO2003018516和WO2007124461，在此通过引用将每一篇上述国际申请整体并入。
在相关的实施方案中，胰高血糖素相关的类似物肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列与天然胰高血糖素、天然泌酸调节肽、天然毒蜥外泌肽-4、天然(7-37)GLP-1、天然GLP-2或天然GIP在天然肽的长度上(或者在对应于胰高血糖素的位置上，参见，例如图18)至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相同。
在某些实施方案中，胰高血糖素相关的类似物肽为本文详细描述的1类、2类、3类、4类或5类胰高血糖素相关的类似物肽。
胰高血糖素相关的类似物肽
在某些方面，本公开涉及胰高血糖素相关的类似物肽。术语胰高血糖素相关的类似物肽指这样的肽：其对于胰高血糖素受体、泌酸调节肽受体、毒蜥外泌肽-4受体、GLP-1受体、GLP-2受体和GIP受体的任一种或多种具有生物活性(作为激动剂或拮抗剂)，并且包含与天然胰高血糖素、天然泌酸调节肽、天然毒蜥外泌肽-4、天然GLP-1、天然GLP-2或天然GIP中的至少一种共有至少40％的序列同一性(如，45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％)的氨基酸序列。应当理解，考虑了胰高血糖素相关的类似物肽的全部可能的活性子集，例如对胰高血糖素受体或GLP-1受体或GIP受体中的任一种或多种具有生物活性(作为激动剂或拮抗剂)的肽；以及对每一所列的天然肽具有序列同一性的全部可能的子集，例如包括与天然胰高血糖素在天然胰高血糖素的长度上共有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明的一实施方案中，胰高血糖素相关的类似物肽是这样的肽，其具有胰高血糖素受体激动剂活性、GIP受体激动剂活性、胰高血糖素受体/GLP-1受体共激动剂活性、胰高血糖素受体拮抗剂活性或胰高血糖素受体拮抗剂和GLP-1受体激动剂活性。在某些实施方案中，肽在该分子的C-末端的一半保留α-螺旋构象。在某些实施方案中，肽保留与受体相互作用或信号传送有关的位置，例如胰高血糖素的位置3或(1-37)GLP-1的位置7、10、12、13、15或17。因此，胰高血糖素相关的类似物肽可以是1类、2类、3类、4类和/或5类肽，每一类都在本文中做了进一步描述。
修饰
胰高血糖素相关的类似物肽可以包含具有修饰的天然胰高血糖素氨基酸序列(SEQIDNO：612)。在示例性实施方案中，胰高血糖素相关的类似物肽相对于天然胰高血糖素序列可以包含总共1、高达2、高达3、高达4、高达5、高达6、高达7、高达8、高达9或高达10个氨基酸修饰，例如保守性或非保守性取代。在某些方面，本文所述的修饰和取代在胰高血糖素相关的类似物肽中的某些特定位置发生，其中位置的编号对应于胰高血糖素(SEQIDNO：612)的编号。在某些实施方案中，1、2、3、4或5个非保守性取代可以在位置2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29中的任何位置进行，并且高达5个的其他保守性取代在这些位置中的任何位置发生。在某些实施方案中，1、2或3个氨基酸修饰在氨基酸中的位置1-16发生，并且1、2或3个氨基酸修饰在氨基酸中的位置17-26发生。在某些实施方案中，这样的胰高血糖素相关的类似物肽在天然胰高血糖素中的相应位置保留至少22、23、24、25、26、27或28个天然存在的氨基酸(如，相对于天然存在的胰高血糖素具有1-7、1-5或1-3个修饰)。
DPP-IV抗性
在某些实施方案中，胰高血糖素相关的类似物肽在位置1或2处包含修饰以降低对二肽基肽酶IV切割的易感性。更具体而言，在某些实施方案中，胰高血糖素相关的类似物肽(例如，选自图10中的那些)的位置1被选自以下氨基酸的氨基酸取代：D-组氨酸、α，α-二甲基咪唑(imidiazole)乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸和高组氨酸。更具体而言，在某些实施方案中，胰高血糖素相关的类似物肽的位置2被选自以下氨基酸的氨基酸取代：D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸和氨基异丁酸。
亲水部分
在一实施方案中，使胰高血糖素相关的类似物肽(如，1类胰高血糖素相关的类似物肽、2类胰高血糖素相关的类似物肽、3类胰高血糖素相关的类似物肽、4类胰高血糖素相关的类似物肽或5类胰高血糖素相关的类似物肽)连接(共价键合)至亲水部分。能够使亲水部分在用于使蛋白与激活的聚合物分子反应的任何合适条件下连接至胰高血糖素相关的类似物肽。能够使用本领域任何已知方法，其包括经由酰化、还原性烷基化、迈克尔加成(Michaeladdition)、巯基烷基化或通过PEG部分上的反应性基团(如，醛、氨基、酯、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基)与靶化合物上的反应性基团(如，醛、氨基、酯、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基)反应的其他化学选择性共轭/连接方法。能够用于将水溶性聚合物连接至一种或多种蛋白的激活基团包括但不限于砜、马来酰亚胺、硫氢基、巯基、三氟甲磺酸酯(triflate)、三氟乙磺酸酯(tresylate)、azidirine、环氧乙烷和5-吡啶基。如果通过还原性烷基化连接至肽，则所选的聚合物应当具有单个反应性醛，从而控制聚合度。参见，例如Kinstleretal.，Adv.Drug.DeliveryRev.54：477-485(2002)；Robertsetal.，Adv.DrugDeliveryRev.54：459-476(2002)；和Zalipskyetal.，Adv.DrugDeliveryRev.16：157-182(1995)。
合适的亲水部分包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇(如，POG)、聚氧乙烯化山梨醇、聚氧乙烯化葡萄糖、聚氧乙烯化甘油(POG)、聚氧化烯、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇共聚物、单甲氧-聚乙二醇、单-(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇、羧甲基纤维素、聚缩醛、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚(β-氨基酸)(均聚物或随机共聚物)、聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物(propropyleneglycol)(PPG)和其他聚环氧烷(polyakyleneoxide)、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、结肠酸(colonicacid)或其他多糖聚合物、聚糖体(Ficoll)或葡聚糖以及上述的混合物。葡聚糖是主要通过1，6-连接连接的葡萄糖亚基的多糖聚合物。可以利用具有许多分子量范围的葡聚糖，如约1kD至约100kD，或者约5kD、10kD、15kD或20kD至约20kD、30kD、40kD、50kD、60kD、70kD、80kD或90kD。
在一实施方案中，亲水部分为聚乙二醇(PEG)链或其他水溶性聚合物，其在所述胰高血糖素相关的类似物肽的位置16、17、21、24、29、40中一个或多个位置处，在C-末端延伸内或在C-末端氨基酸处，共价连接至氨基酸残基的侧链。在某些实施方案中，该位置的天然氨基酸被具有适合于与亲水部分交联的侧链的氨基酸取代，以促进亲水部分与肽的连接。示例性氨基酸包括Cys、Lys、Orn、高-Cys或乙酰基苯丙氨酸(Ac-Phe)。在其他实施方案中，将经修饰而包含亲水基团的氨基酸在C-末端处添加至肽。
某些实施方案的诸如聚乙二醇链的亲水部分的分子量为约500道尔顿至约40,000道尔顿。在一实施方案中，聚乙二醇链的分子量为约500道尔顿约5,000道尔顿，或者约1,000道尔顿至约5,000道尔顿。在另一实施方案中，诸如聚乙二醇链的亲水部分的分子量为约10,000道尔顿至约20,000道尔顿。仍然在其他示例性实施方案中，诸如聚乙二醇链的亲水部分的分子量为约20,000道尔顿至约40,000道尔顿。
包括了直链或支链的聚合物。偶联物的所得制备物可以基本上是单分散性或多分散性的，并且可以具有每个肽约0.5、0.7、1、1.2、1.5或2个聚合物部分。
酰化
在一实施方案中，修饰胰高血糖素相关的类似物肽(如，1类胰高血糖素相关的类似物肽、2类胰高血糖素相关的类似物肽、3类胰高血糖素相关的类似物肽、4类胰高血糖素相关的类似物肽、4类胰高血糖素相关的类似物肽或5类胰高血糖素相关的类似物肽)，以包含酰基。酰化可以在胰高血糖素相关的类似物肽中的任何位置发生，包括位置1-29的任何位置、C-末端延伸内的位置或C-末端氨基酸，其条件是未酰化的胰高血糖素相关的类似物肽所表现出的活性在酰化时得以保留。例如，如果未酰化的肽具有胰高血糖素激动剂活性，则酰化的肽保留了胰高血糖素激动剂活性。还例如，如果未酰化的肽具有胰高血糖素拮抗剂活性，则酰化的肽保留胰高血糖素拮抗剂活性。例如，如果未酰化的肽具有GLP-1激动剂活性，则酰化的肽保留GLP-1激动剂活性。非限制性实例包括位置5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29处(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的酰化。可以使酰基直接共价连接至胰高血糖素相关的类似物肽的氨基酸，或者经由间隔物(spacer)间接连接至胰高血糖素相关的类似物肽的氨基酸，其中该间隔物位于胰高血糖素相关的类似物肽的氨基酸与酰基之间。可以在连接亲水部分的相同氨基酸位置或在不同的氨基酸位置将胰高血糖素相关的类似物肽酰化。非限制性实例包括在位置10处(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的酰化和在胰高血糖素肽的C-末端部分的一个或多个位置处，如24、28或29(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)，在C-末端延伸内或在C-末端处(例如，通过添加C末端Cys)的聚乙二醇化。
在本发明的具体方面，通过胰高血糖素相关的类似物肽的氨基酸侧链的胺、羟基或巯基的直接酰化，修饰胰高血糖素相关的类似物肽以包含酰基。在某些实施方案中，通过氨基酸的侧链胺、羟基或巯基直接将胰高血糖素相关的类似物肽酰化。在某些实施方案中，酰化在位置10、20、24或29处(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)。在这一点上，酰化的胰高血糖素相关的类似物肽可以包含SEQIDNO：612的氨基酸序列，或其包含一个或多个本文所述氨基酸修饰的修饰的氨基酸序列，并且至少一个位置10、20、24和29处(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的氨基酸被修饰为包含侧链胺、羟基或巯基的任何氨基酸。在本发明某些具体实施方案中，胰高血糖素相关的类似物肽的直接酰化通过位置10处(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的氨基酸的侧链胺、羟基或巯基发生。
在某些实施方案中，包含侧链胺的氨基酸是通式VIII的氨基酸：
其中n＝1至4
[通式VIII]
在某些示例性实施方案中，通式VIII的氨基酸是n为4(Lys)或n为3(Orn)的氨基酸。
在其他实施方案中，包含侧链羟基的氨基酸是通式IX的氨基酸：
其中n＝1至4
[通式IX]
在某些示例性实施方案中，通式IX的氨基酸是n为1(Ser)的氨基酸。
仍然在其他实施方案中，包含侧链巯基的氨基酸是通式X的氨基酸：
其中n＝1至4
[通式X]
在某些示例性实施方案中，通式X的氨基酸是n为1(Cys)的氨基酸。
在本发明的一实施方案中，酰化的胰高血糖素相关的类似物肽在肽与酰基之间包含间隔物。在某些实施方案中，使胰高血糖素相关的类似物肽共价结合至间隔物，该间隔物共价结合至酰基。在某些示例性实施方案中，通过间隔物的胺、羟基或巯基的酰化，修饰胰高血糖素相关的类似物肽以包含酰基，该间隔物连接至胰高血糖素相关的类似物肽的位置10、20、24或29处(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)或C-末端氨基酸处的氨基酸的侧链。间隔物所连接的氨基酸可以是包含允许连接至间隔物的部分的任何氨基酸。例如，包含侧链NH2、-OH或-COOH(如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)的氨基酸是合适的。在这一点上，酰化的胰高血糖素相关的类似物肽可以包含SEQIDNO：612的氨基酸序列，或其包含一个或多个本文所述氨基酸修饰的修饰的氨基酸序列，并且至少一个位置10、20、24和29处(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的氨基酸被修饰为包含侧链胺、羟基或羧酸酯的任何氨基酸。
在某些实施方案中，间隔物是包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸，或者包含含有侧链胺、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽。
当酰化通过间隔物的氨基发生时，酰化可以通过氨基酸的α胺或侧链胺发生。在α胺被酰化的情况下，间隔氨基酸(spaceraminoacid)可以是任何氨基酸。例如，间隔氨基酸可以是疏水氨基酸，如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr。或者，间隔氨基酸可以是酸性残基，如Asp和Glu。在间隔氨基酸的侧链胺被酰化的情况下，间隔氨基酸为包含侧链胺的氨基酸，如通式VIII的氨基酸(如，Lys或Orn)。在这种情况下，间隔氨基酸的α胺和侧链胺都可以被酰化，从而将胰高血糖素肽二酰化。本发明的实施方案包括这类二酰化的分子。
当酰化通过间隔物的羟基发生时，氨基酸或者二肽或三肽的氨基酸之一可以是通式IX的氨基酸。在具体的示例性实施方案中，氨基酸为Ser。
当酰化通过间隔物的巯基发生时，氨基酸或者二肽或三肽的氨基酸之一可以是通式通式X的氨基酸。在具体的示例性实施方案中，氨基酸为Cys。
在一实施方案中，间隔物包括亲水双官能间隔物。在一具体实施方案中，间隔物包括氨基聚(烷氧基)羧酸酯。在这一点上，间隔物可以包括，例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m为1至6的任何整数，并且n为2至12的任何整数，例如8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(dioxaoctanoicacid)，其可从PeptidesInternational，Inc.(Louisville，KY)商购获得的。
经由胺、羟基和巯基的合适的肽酰化方法在本领域是已知的。参见，例如Miller，BiochemBiophysResCommun218：377-382(1996)；ShimohigashiandStammer，IntJPeptProteinRes19：54-62(1982)；和Previeroetal.，BiochimBiophysActa263：7-13(1972)(通过羟基的酰化方法)；和SanandSilvius，JPeptRes66：169-180(2005)(通过巯基的酰化方法)；BioconjugateChem.“ChemicalModificationsofProteins：HistoryandApplications(蛋白质的化学修饰：历史和应用)”第1页，2-12(1990)；Hashimotoetal.，PharmacueticalRes.“SynthesisofPalmitoylDerivativesofInsulinandtheirBiologicalActivity(胰岛素的棕榈酰衍生物的合成及它们的生物活性)”Vol.6，No：2pp.171-176(1989)。
酰化的胰高血糖素相关的类似物肽的酰基可以是任何大小，如任何长度的碳链，并且可以是直链或支链的。在本发明的某些具体实施方案中，酰基是C4至C30脂肪酸。例如，酰基可以是任何C4脂肪酸、C6脂肪酸、C8脂肪酸、C10脂肪酸、C12脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸或C30脂肪酸。在某些实施方案中，酰基为C8至C20脂肪酸，如C14脂肪酸或C16脂肪酸。
在替代性实施方案中，酰基为胆汁酸。胆汁酸可以是任何合适的胆汁酸，其包括但不限于胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和胆甾醇酸。
还可以修饰本文所述的酰化的胰高血糖素相关的类似物肽以包含亲水部分。在某些具体实施方案中，亲水部分可以包含聚乙二醇(PEG)链。亲水部分的并入可以通过任何合适的方法来完成，例如任何本文所述的方法。在这一点上，酰化的胰高血糖素相关的类似物肽可以包含SEQIDNO：612，包括本文所述的任何修饰在内，其中至少一个位置10、20、24和29处(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的氨基酸包含酰基，且位置16、17、21、24或29处(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的、C-末端延伸中的位置处的或者C-末端氨基酸处的至少一个氨基酸，被修饰为Cys、Lys、Orn、高-Cys或Ac-Phe，并且氨基酸的侧链共价键合至亲水部分(如，PEG)。在某些实施方案中，任选地通过包含Cys、Lys、Orn、高-Cys或Ac-Phe的间隔物使酰基连接至位置10(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)，并且使亲水部分并入位置24的Cys处。
或者，酰化的胰高血糖素相关的类似物肽可以包含间隔物，其中酰化并修饰该间隔物以包含亲水部分。合适间隔物的非限制性实例包括包含一个或多个选自Cys、Lys、Orn、高-Cys和Ac-Phe的氨基酸的间隔物。
烷基化
根据一实施方案，修饰胰高血糖素相关的类似物肽，如1类胰高血糖素相关的类似物肽、2类胰高血糖素相关的类似物肽、3类胰高血糖素相关的类似物肽、4类胰高血糖素肽或5类胰高血糖素相关的肽，以包含烷基，该烷基经由醚、硫醚或氨基连接连接至胰高血糖素相关的类似物肽，以延长循环中的半衰期和/或延缓作用的起效和/或延长作用的持续时间和/或改善对诸如DPP-IV的蛋白酶的抗性。
烷基化可以在胰高血糖素相关的类似物肽中的任何位置发生，包括位置1-29的任何位置、C-末端延伸内的位置或者C-末端氨基酸，其条件是保留相对于胰高血糖素、GLP-1或其他胰高血糖素相关的类似物肽受体的胰高血糖素相关的类似物肽的激动剂活性或拮抗剂活性。在某些实施方案中，如果未烷基化的肽具有胰高血糖素激动剂活性，则烷基化的肽保留胰高血糖素激动剂活性。在其他实施方案中，如果未烷基化的肽具有胰高血糖素拮抗剂活性，则烷基化的肽保留胰高血糖素拮抗剂活性。在某些实施方案中，如果未烷基化的肽具有GLP-1激动剂活性，则烷基化的肽保留GLP-1激动剂活性。非限制性实例包括位置5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29处(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的烷基化。烷基可以直接连接至胰高血糖素相关的类似物肽的氨基酸，或者经由间隔物间接连接至胰高血糖素相关的类似物肽的氨基酸，其中该间隔物位于胰高血糖素相关的类似物肽的氨基酸与烷基之间。可以在连接亲水部分的相同氨基酸位置或者在不同的氨基酸位置将胰高血糖素相关的类似物肽烷基化。非限制性实例包括在位置10处(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的烷基化和在胰高血糖素相关的类似物肽C-末端部分的一个或多个位置处，如位置24、28或29(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)，在C-末端延伸内或在C-末端处(例如，通过添加C末端Cys)的聚乙二醇化。
在本发明的具体方面，通过胰高血糖素相关的类似物肽的氨基酸侧链的胺、羟基或巯基的直接烷基化，修饰胰高血糖素相关的类似物肽以包含烷基。在某些实施方案中，通过氨基酸的侧链胺、羟基或巯基直接将胰高血糖素相关的类似物肽烷基化。在某些实施方案中，烷基化在位置10、20、24或29处(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)。在这一点上，烷基化的胰高血糖素相关的类似物肽可以包含SEQIDNO：612的氨基酸序列，或其包含一个或多个本文所述氨基酸修饰的修饰的氨基酸序列，并且至少一个位置10、20、24和29处(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的氨基酸被修饰为包含侧链胺、羟基或巯基的任何氨基酸。在本发明的某些具体实施方案中，胰高血糖素相关的类似物肽的直接烷基化通过位置10处(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的氨基酸的侧链胺、羟基或巯基发生。
在某些实施方案中，包含侧链胺的氨基酸为通式VIII的氨基酸。在某些示例性实施方案中，通式VIII的氨基酸是n为4(Lys)或n为3(Orn)的氨基酸。
在其他实施方案中，包含侧链羟基的氨基酸为通式IX的氨基酸。在某些示例性实施方案中，通式IX的氨基酸是n为1(Ser)的氨基酸。
仍然在其他实施方案中，包含侧链巯基的氨基酸为通式X的氨基酸。在某些示例性实施方案中，通式X的氨基酸是n为1(Cys)的氨基酸。
在本发明的一实施方案中，烷基化的胰高血糖素相关的类似物肽在肽与烷基之间包含间隔物。在某些实施方案中，胰高血糖素相关的类似物肽共价连接至间隔物，该间隔物共价连接至烷基。在某些示例性实施方案中，通过间隔物的胺、羟基或巯基的烷基化修饰胰高血糖素相关的类似物肽以包含烷基，该间隔物连接至胰高血糖素相关的类似物肽的位置10、20、24或29(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)处的氨基酸的侧链。间隔物所连接的氨基酸可以是包含允许连接至间隔物的部分的任何氨基酸。例如，包含侧链NH2、-OH或-COOH(如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)的氨基酸是合适的。在这一点上，烷基化的胰高血糖素相关的类似物肽可以包含SEQIDNO：612的氨基酸序列，或其包含一个或多个本文所述氨基酸修饰的修饰的氨基酸序列，并且至少一个位置10、20、24和29处(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的氨基酸被修饰为包含侧链胺、羟基或羧酸酯的任何氨基酸。
在某些实施方案中，间隔物是包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸，或者包含含有侧链胺、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽。
当烷基化通过间隔物的氨基发生时，烷基化可以通过氨基酸的α胺或侧链胺发生。在α胺被烷基化的情况下，间隔氨基酸可以是任何氨基酸。例如，间隔氨基酸可以是疏水氨基酸，如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr。或者，间隔氨基酸可以是酸性残基，如Asp和Glu。在间隔氨基酸的侧链胺被烷基化的情况下，间隔氨基酸为包含侧链胺的氨基酸，如通式VIII的氨基酸(如，Lys或Orn)。在这种情况下，间隔氨基酸的α胺和侧链胺都可以被烷基化，从而将胰高血糖素肽二烷基化。本发明的实施方案包括这类二烷基化的分子。
当烷基化通过间隔物的羟基发生时，氨基酸或者间隔物的氨基酸之一可以是通式IX的氨基酸。在具体的示例性实施方案中，氨基酸为Ser。
当烷基化通过间隔物的巯基发生时，氨基酸或者间隔物的氨基酸之一可以是通式通式X的氨基酸。在具体的示例性实施方案中，氨基酸为Cys。
在一实施方案中，间隔物包括亲水双官能间隔物。在具体实施方案中，间隔物包括氨基聚(烷氧基)羧酸酯。在这一点上，间隔物可以包括，例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m为1至6的任何整数，并且n为2至12的任何整数，例如8-氨基-3，6-二氧杂辛酸，其可从PeptidesInternational，Inc.(Louisville，KY)商购获得。
通过胺、羟基和巯基的合适的肽烷基化方法在本领域是已知的。例如，可以使用威廉逊(Williamson)醚合成在胰高血糖素相关的类似物肽与烷基之间形成醚键。此外，肽与卤代烷的亲核取代反应可以获得任何醚、硫醚或氨基连接。
烷基化的胰高血糖素相关的类似物肽的烷基可以是任何大小，如任何长度的碳链，并且可以是直链或支链的。在本发明的某些具体实施方案中，烷基是C4至C30烷基。例如，烷基可以是任何C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基或C30烷基。在某些实施方案中，烷基为C8至C20烷基，如C14烷基或C16烷基。
在某些具体实施方案中，烷基包含胆汁酸的类固醇部分，如胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和胆甾醇酸。
可以进一步修饰本文所述的烷基化的胰高血糖素相关的类似物肽，以包含亲水部分。在某些具体实施方案中，亲水部分可以包含聚乙二醇(PEG)链。亲水部分的并入可以通过任何合适的方法来完成，例如任何本文所述的方法。在这一点上，烷基化的胰高血糖素相关的类似物肽可以包含SEQIDNO：612，或其包含一个或多个本文所述氨基酸修饰的修饰的氨基酸序列，其中至少一个位置10、20、24和29处(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的氨基酸包含烷基，且位置16、17、21、24或29处(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的、C-末端延伸中的位置处的或者C-末端氨基酸处的至少一个氨基酸，被修饰为Cys、Lys、Orn、高-Cys或Ac-Phe，并且氨基酸的侧链被共价键合至亲水部分(如，PEG)。在某些实施方案中，任选地经由包含Cys、Lys、Orn、高-Cys或Ac-Phe的间隔物使烷基连接至位置10(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)，并且使亲水部分并入位置24的Cys处。
或者，烷基化的胰高血糖素相关的类似物肽可以包含间隔物，其中将该间隔物烷基化并修饰以包含亲水部分。合适间隔物的非限制性实例包括包含一个或多个选自Cys、Lys、Orn、高-Cys和Ac-Phe的氨基酸的间隔物。
α-螺旋结构的稳定
在某些实施方案中，在两个氨基酸侧链之间形成分子内桥，以稳定胰高血糖素相关的类似物肽的羧基末端部分(如，氨基酸12-29(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号))的三维结构。可以通过氢键、诸如形成盐桥的离子相互作用或通过共价键将两个氨基酸侧链互相连接。
在某些实施方案中，在相距3个氨基酸的两个氨基酸之间形成分子内桥，例如位置i的氨基酸与位置i+4的氨基酸之间，其中i为根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号的12至25的任何整数(如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和25)。更具体而言，将根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号的氨基酸对12与16、16与20、20与24或24与28(氨基酸对，其中i＝12、16、20或24)的侧链互相连接，从而稳定胰高血糖素α-螺旋。或者，i可以为17。
在某些具体实施方案中，其中位置i和i+4的氨基酸通过分子内桥连接，连接物的大小为约8个原子，或者约7-9个原子。
在其他实施方案中，在相距2个氨基酸的两个氨基酸之间形成分子内桥，例如位置j的氨基酸与位置j+3的氨基酸之间，其中j为根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号的12至26的任何整数(如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26)。在某些具体实施方案中，j为17。
在某些具体实施方案中，其中位置j和j+3的的氨基酸通过分子内桥连接，连接物的大小为约6个原子，或者约5至7个原子。
仍然在其他实施方案中，在相距6个氨基酸的两个氨基酸之间形成分子内桥，例如位置k的氨基酸与位置k+7的氨基酸之间，其中k为根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号的12至22的任何整数(如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21和22)。在某些具体实施方案中，k为12、13或17。在示例性实施方案中，k为17。
能够共价键合形成6原子连接桥的氨基酸对的实例包括Orn与Asp；Glu与通式VIII的氨基酸，其中n为2；高谷氨酸与通式VIII的氨基酸，其中n为1，其中通式VIII为：
其中n＝1至4
[通式VIII]
能够共价键合形成7原子连接桥的氨基酸对的实例包括Orn-Glu(内酰胺环)、Lys-Asp(内酰胺)或高Ser-高Glu(内酯)。可以形成8原子连接物的氨基酸对的实例包括Lys-Glu(内酰胺)、高Lys-Asp(内酰胺)、Orn-高Glu(内酰胺)、4-氨基Phe-Asp(内酰胺)或Tyr-Asp(内酯)。可以形成9原子连接物的氨基酸对的实例包括高Lys-Glu(内酰胺)、Lys-高Glu(内酰胺)、4-氨基Phe-Glu(内酰胺)或Tyr-Glu(内酯)。这些氨基酸上的任何侧链还可以被其他化学基团取代，只要α-螺旋的三维结构不被破坏。本领域技术人员能够预见，包括化学修饰的衍生物在内的可选择对或可选择氨基酸类似物会产生类似大小和期望效果的稳定结构。例如，高半胱氨酸-高半胱氨酸二硫键的长度为6个原子，并且可以被进一步修饰以提供期望的效果。甚至在没有共价键的情况下，本领域技术人员能够预见的上文所述的氨基酸对或类似的对也可以通过诸如通过形成盐桥或氢键相互作用的非共价键为α-螺旋提供增加的稳定性。
内酰胺环的大小可以根据氨基酸的长度而变化，在一实施方案中，通过将赖氨酸氨基酸的侧链与谷氨酸侧链连接而形成内酰胺。其他示例性实施方案(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)包括任选地具有内酰胺桥的以下对：位置12的Glu与位置16的Lys；位置12的天然Lys与位置16的Glu；位置16的Glu与位置20的Lys；位置16的Lys与位置20的Glu；位置20的Glu与位置24的Lys；位置20的Lys与位置24的Glu；位置24的Glu与位置28的Lys；位置24的Lys与位置28的Glu。或者，可以将内酰胺环中酰胺键的次序逆转(如，可以在Lys12的侧链与Glu16的侧链之间，或在Glu12与Lys16之间，形成内酰胺环)。
除了内酰胺桥之外的分子内桥可以用于稳定胰高血糖素相关的类似物肽的α螺旋。在一实施方案中，分子内桥为疏水桥。在这种情况下，分子内桥任选地在两个氨基酸的侧链之间，该两个氨基酸是胰高血糖素相关的类似物肽的α螺旋的疏水面的一部分。例如，由疏水桥所连接的氨基酸之一可以是位置10、14和18处(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的氨基酸。
在一具体方面，利用全烃交联系统，将烯烃置换用于交联胰高血糖素相关的类似物肽α螺旋的一个或两个转角。在这种情况下，胰高血糖素相关的类似物肽可以包含α-甲基化的氨基酸，该氨基酸带有长度变化的烯烃侧链并在i和i+4或i+7位置处形成R或S立体化学。例如，烯烃侧可以包含CH2)n，其中n为1至6的任何整数。在一实施方案中，n对于8个原子交联长度而言为3。本领域描述了形成这类分子内桥的合适方法。参见，例如Schafmeisteretal.，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)和Walenskyetal.，Science305：1466-1470(2004)。或者，胰高血糖素肽可以包含位于相邻螺旋转角的O-烯丙基Ser残基，该螺旋转角经由钌催化的闭环置换而桥接在一起。这样的交联方法描述于，例如Blackwelletal.，Angew，Chem.，Int.Ed.37：3281-3284(1998)。
在另一具体方面，将非天然硫代二丙氨酸，即羊毛硫氨酸，其广泛地用作胱氨酸的拟肽(peptidomimetic)，用于交联α螺旋的一个转角。基于羊毛硫氨酸环化的合适方法在本领域是已知的。参见，例如Matteuccietal.，TetrahedronLetters45：1399-1401(2004)；Mayeretal.，J.PeptideRes.51：432-436(1998)；Polinskyetal.，J.Med.Chem.35：4185-4194(1992)；Osapayetal.，J.Med.Chem.40：2241-2251(1997)；Fukaseetal.，Bull.Chem.Soc.Jpn.65：2227-2240(1992)；Harppetal.，J.Org.Chem.36：73-80(1971)；GoodmanandShao，PureAppl.Chem.68：1303-1308(1996)；和OsapayandGoodman，J.Chem.Soc.Chem.Commun.1599-1600(1993)。
在某些实施方案中，将位置i与i+7处的两个Glu残基之间的α，ω-二氨基链烷系链(tether)(如，1，4-二氨基丙烷和1，5-二氨基戊烷)用于稳定胰高血糖素肽的α螺旋。根据二氨基链烷系链的长度，这样的系链使得长度为9个原子或更长的桥形成。本领域描述了产生用这样的系链交联的肽的合适方法。参见，例如Phelanetal.，J.Am.Chem.Soc.119：455-460(1997)。
仍然在本发明的另一实施方案中，将二硫键用于交联胰高血糖素相关的类似物肽的α螺旋的一个或两个转角。或者，将修饰的二硫键，其中一个或两个硫原子被导致等排的大环化(isostericmacrocyclization)的亚甲基代替，用于稳定胰高血糖素相关的类似物肽的α螺旋。用二硫键或基于硫的环化修饰肽的合适方法描述于，例如Jacksonetal.，J.Am.Chem.Soc.113：9391-9392(1991)和RudingerandJost，Experientia20：570-571(1964)。
仍然在另一实施方案中，经由位于i和i+4的两个His残基或His和Cys对的金属原子结合，稳定胰高血糖素相关的类似物肽。金属原子可以为，例如Ru(III)、Cu(II)、Zn(II)或Cd(II)。这样的基于金属结合的α螺旋稳定方法在本领域内是已知的。参见，例如AndrewsandTabor，Tetrahedron55：11711-11743(1999)；Ghadirietal.，J.Am.Chem.Soc.112：1630-1632(1990)；和Ghadirietal.，J.Am.Chem.Soc.119：9063-9064(1997)。
或者，可以通过肽环化的其他方法来稳定胰高血糖素相关的类似物肽的α螺旋，这些方法综述于Davies，J.Peptide.Sci.9：471-501(2003)。可以经由形成酰胺桥、硫醚桥、硫酯桥、脲桥、氨基甲酸酯桥、磺酰胺桥等来稳定α螺旋。例如，可以在C末端与Cys残基的侧链之间形成硫酯桥。或者，可以通过具有巯基(Cys)和羧酸(如，Asp、Glu)的氨基酸的侧链形成硫酯。在另一方法中，诸如二羧酸的交联剂等，如辛二酸(辛二酸(octanedioicacid))，可以在诸如游离的氨基、羟基、巯基及其组合的氨基酸侧链的两个官能团之间导入连接。
根据一实施方案，通过在位置i和i+4处并入疏水氨基酸来稳定胰高血糖素相关的类似物肽的α螺旋。例如，i可以为Tyr，并且i+4可以为Val或Leu；i可以为Phe，并且i+4可以为Cys或Met；i可以为Cys，并且i+4可以为Met；或者i可以为Phe，并且i+4可以为Ile。应当理解，对于本文的目的，上文的氨基酸对可以是可逆的，从而位置i处所示的氨基酸可以可选地位于i+4处，而i+4氨基酸能够位于i位置处。
根据本发明的其他实施方案，其中胰高血糖素相关的类似物肽为具有胰高血糖素激动剂活性、GIP激动剂活性、胰高血糖素拮抗剂和GLP-1活性的肽，通过在胰高血糖素相关的类似物肽的C末端部分(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号的氨基酸12-29附近)并入一个或多个α螺旋稳定氨基酸(通过氨基酸取代或插入)来稳定α螺旋。在具体实施方案中，α螺旋稳定氨基酸为α，α-二取代的氨基酸，其包括但不限于任何氨基异丁酸(AIB)、由选自甲基、乙基、丙基和正丁基的相同或不同基团二取代的氨基酸，或者由环辛烷或环庚烷二取代的氨基酸(如，1-氨基环辛烷-1-羧酸)。在某些实施方案中，胰高血糖素相关的类似物肽的位置16、17、18、19、20、21、24或29中1、2、3、4个或更多个位置由α，α-二取代的氨基酸取代。在一具体实施方案中，位置16、20、21和24中1、2、3个或全部位置由AIB取代。
偶联物
本公开还包括这样的偶联物，在该偶联物中，胰高血糖素相关的类似物肽(例如，1类胰高血糖素相关的类似物肽、2类胰高血糖素相关的类似物肽、3类胰高血糖素相关的类似物肽、4类胰高血糖素相关的类似物肽或5类胰高血糖素相关的类似物肽)任选地通过共价键和任选地通过连接物连接至偶联物部分。连接可以通过共价化学键；物理力如静电相互作用、氢相互作用、离子相互作用、范德华相互作用或者疏水相互作用或亲水相互作用实现。可以使用各种非共价偶联系统，包括生物素-抗生物素蛋白、配体/受体、酶/底物、核酸/核酸结合蛋白、脂质/脂质结合蛋白、细胞粘附分子配偶体(partner)；或者上述系统的互相具有亲和力的任何结合配偶体或片段。
可以通过使肽的靶氨基酸残基与有机衍生剂(derivatizingagent)反应，经由直接共价键将胰高血糖素相关的类似物肽连接至偶联物部分，该有机衍生剂能够与这些靶氨基酸的所选的侧链或者N-末端残基或C-末端残基反应。肽或偶联物部分上的反应性基团包括，例如醛、氨基、酯、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基。衍生剂包括，例如马来酰亚胺基苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐或本领域已知的其他试剂。或者可以通过诸如多糖载体或多肽载体的中间体载体将偶联物部分间接地连接至肽。多糖载体的实例包括氨基葡聚糖。合适的多肽载体的实例包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、上述的共聚物以及这些氨基酸与诸如丝氨酸的其他氨基酸的混合聚合物，以赋予所得的装载载体期望的溶解性。
最常见的是使半胱氨酰残基与诸如氯乙酸或氯乙酰胺的α-卤代乙酸(和对应的胺)反应，获得羧甲基或羧基酰胺基甲基衍生物。还通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基(imidozoyl))丙酸、氯乙酰基磷酸盐、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞基苯甲酸盐、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-噁-1，3-二唑反应，将半胱氨酰残基衍生化。
通过在pH为5.5-7.0的条件下与焦碳酸二乙酯的反应，将组氨酰残基衍生化，因为这种试剂对组氨酰侧链为相对特异性的。对溴苯酰甲基溴也是有用的；这种反应优选于pH为6.0的条件下，在0.1M的卡可酸钠中进行。
将赖氨酰(lysinyl)和氨基末端的残基与琥珀酸酐或其他羧酸酐反应。使用这些试剂的衍生化具有将赖氨酰残基的电荷逆转的效果。将含有α-氨基的残基衍生化的其他合适试剂包括诸如甲基吡啶亚胺甲酯(methylpicolinimidate)的亚氨酸酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、硼氢化氯(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2，4-戊二酮以及转氨酶催化的与乙醛酸的反应。
通过与一种或几种常规试剂的反应，修饰精氨酰残基，该试剂中有苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生化由于胍基官能团的高pKa而要求反应在碱性条件下进行。而且，这些试剂可以与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基反应。
可以进行酪氨酰残基的特异性修饰，特别令人感兴趣的是通过与芳香重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标签(spectrallabel)引入酪氨酰残基中。最常见的是，分别将N-乙酰咪唑(acetylimidizole)和四硝基甲烷用于形成O-乙酰基酪氨酰化合物和3-硝基衍生物。
通过与亚胺(R-N＝C＝N-R’)反应，选择性地修饰羧基侧基团(天冬氨酰或谷氨酰)，其中R和R’是不同的烷基，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓(azonia)-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。而且，通过与铵离子的反应，将天冬氨酰残基和谷氨酰残基转化为天冬酰胺酰残基和谷氨酰胺酰残基。
其他修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：StructureandMolecularProperties，W.H.Freeman&Co.，SanFrancisco，pp.79-86(1983))；天冬酰胺或谷氨酰胺的脱酰氨基作用；N-末端胺的乙酰化，和/或C-末端羧酸基团的酰胺化作用或酯化。
其他类型的共价修饰涉及使糖苷化学或酶促地偶联至肽。可以使糖连接至(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；(c)游离硫氢基，如半胱氨酸的游离硫氢基；(d)游离羟基，如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的游离羟基；(e)芳香残基，如酪氨酸或或色氨酸的芳香残基；或者(f)谷氨酰胺的酰胺基团。这些方法描述于1987年9月11日公开的WO87/05330和AplinandWriston，CRCCrit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)中。
能够连接至任何本文所述的胰高血糖素相关的类似物肽的示例性偶联物部分，包括但不限于异源性肽或多肽(包括，例如血浆蛋白)、靶向剂、免疫球蛋白或其部分(如，可变区、CDR或Fc区)、诸如放射性同位素、荧光团或酶标签的诊断标签、包括水溶性聚合物在内的聚合物或者其他治疗或诊断试剂。在一实施方案中，提供了偶联物，其包含本发明的胰高血糖素相关的类似物肽和血浆蛋白，其中血浆蛋白选自白蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原和球蛋白。在某些实施方案中，偶联物的血浆蛋白部分为白蛋白或转铁蛋白。在某些实施方案中，连接物包含的链的长度为1至约60个原子，或者1至30个原子或更长，2至5个原子，2至10个原子，5至10个原子，或者10至20个原子。在某些实施方案中，链原子全部是碳原子。在某些实施方案中，连接物的主链中的链原子选自C、O、N和S。链原子和连接物可以根据它们预期的溶解性(亲水性)来选择以提供更加可溶的偶联物。在某些实施方案中，连接物提供官能团，该官能团易被酶或其他催化剂或者靶组织或靶器官或靶细胞中所发现的水解条件切割。在某些实施方案中，连接物的长度足以减少立体位阻的潜能。如果连接物为共价键或肽基键(peptidylbond)并且偶联物为多肽，则完整的偶联物可以是融合蛋白。这样的肽基连接物可以为任何长度。示例性连接物的长度为约1至50个氨基酸、5至50个、3至5个、5至10个、5至15个或10至30个氨基酸。或者，这样的融合蛋白可以通过对本领域技术人员已知的的重组遗传工程方法来制备。
如上文所指出的，在某些实施方案中，使胰高血糖素相关的类似物肽偶联，例如，融合至免疫球蛋白或其部分(如，可变区、CDR或Fc区)。已知类型的免疫球蛋白(Ig)包括IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc区为Ig重链的C-末端区域，其负责与行使例如以下活性的Fc受体结合：再循环(这导致延长的半衰期)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。
例如，根据某些定义，人IgG重链Fe区从Cys226延伸至重链的C-末端。“铰链区”通常从人IgG1的Glu216延伸至Pro230(其他IgG同种型的铰链区可以通过比对涉及半胱氨酸键合的半胱氨酸来与IgG1序列进行比对)。IgG的Fc区包含两个恒定域，CH2和CH3。人IgGFc区的CH2结构域通常从氨基酸231延伸至氨基酸341。人IgGFc区的CH3结构域通常从氨基酸342延伸至447。对免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或区的氨基酸编号的引用全部基于Kabatetal.1991、SEQuencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫学所关注的蛋白的序列)，U.S.DepartmentofPublicHealth，Bethesda，Md。在一相关的实施方案中，除了CH1以外，Fc区可以包含一个或多个免疫球蛋白重链的天然或修饰的恒定区，例如IgG和IgA的CH2区和CH3区，或者IgE的CH3区和CH4区。
合适的偶联物部分包括免疫球蛋白序列的部分，该部分包括FcRn结合位点。补救受体FcRn负责将免疫球蛋白再循环并将它们返回血液循环。IgG的Fc部分的结合FcRn受体的区域已经基于X射线晶体学进行了描述(Burmeisteretal.1994，Nature372：379)。Fc与FcRn的主要接触区在CH2结构域与CH3结构域的连接处附近。Fc-FcRn接触完全位于单个Ig重链中。主要的接触位点包括CH2结构域的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3结构域的氨基酸残基385-387、428和433-436。
某些偶联物部分可以或者可以不包括FcγR结合位点。FcγR负责ADCC和CDC。Fc区中与FcγR直接接触的位置的实例为氨基酸234-239(下铰链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299(C’/E环)以及氨基酸327-332(F/G)环(Sondermannetal.，Nature406：267-273，2000)。IgE的下铰链区还与FcRI结合有关(Henry，etal.，Biochemistry36，15568-15578，1997)。与IgA受体结合有关的残基描述于Lewisetal.，(JImmunol.175：6694-701，2005)中。与IgE受体结合有关的氨基酸残基描述于Sayersetal.(JBiolChem.279(34)：35320-5，2004)中。
可以对免疫球蛋白的Fc区进行氨基酸修饰。这类变异的Fc区包含Fc区的CH3结构域(残基342至447)中的至少一个氨基酸修饰和/或Fc区的CH2结构域(残基231-341)中的至少一个氨基酸修饰。被认为赋予了对FcRn增加的亲和力的突变包括T256A、T307A、E380A和N434A(Shieldsetal.2001，J.Biol.Chem.276：6591)。其他突变可以降低Fc区对FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的结合，而不会明显降低对FcRn的亲和力。例如，由Ala或另一氨基酸取代Fc区位置297处的Asn，移除了高度保守的N-糖基化位点，并且可以导致免疫原性降低和伴随的Fc区半衰期延长，以及对FcγR的结合降低(Routledgeetal.1995，Transplantation60：847；Friendetal.1999，Transplantation68：1632；Shieldsetal.1995，J.Biol.Chem.276：6591)。在IgG1的位置233-236处进行了氨基酸修饰，该修饰使对FcγR的结合降低(WardandGhetie1995，TherapeuticImmunology2：77和Armouretal.1999，Eur.J.Immunol.29：2613)。某些示例性氨基酸取代描述于美国专利7,355,008和7,381,408中，每一专利通过引用整体并入本文。
融合肽-C-末端延伸延伸
在某些实施方案中，胰高血糖素相关的类似物肽可以包含C-末端或C-末端氨基酸序列，其包括但不限于：COOH、CONH2、GPSSGAPPPS(SEQIDNO：624)、GPSSGAPPPS-CONH2(SEQIDNO：723)、泌酸调节肽羧基末端延伸、KRNRNNIA(SEQIDNO：625)或KGKKNDWKHNITQ(SEQIDNO：662)。例如，将毒蜥外泌肽-4(即，SEQIDNO：624(GPSSGAPPPS)的序列)的末端10个氨基酸连接至本公开的1类胰高血糖素相关的类似物肽、2类胰高血糖素相关的类似物肽、3类胰高血糖素相关的类似物肽、4类胰高血糖素相关的类似物肽或5类胰高血糖素相关的类似物肽的羧基末端。
诱导重量减轻的另一化合物为泌酸调节肽，其是在小肠中发现的天然存在的消化激素(参见，Diabetes2005；54：2390-2395)。泌酸调节肽为37个氨基酸的肽(SEQIDNO：661)，其含有胰高血糖素的29个氨基酸的序列及随后的SEQIDNO：625(KRNRNNIA)的8个氨基酸的羧基末端延伸。因此，在一实施方案中，提供了胰高血糖素相关的类似物肽的前药衍生物，其还包含SEQIDNO：625序列的羧基末端延伸或者具有序列KRNR的4个氨基酸的延伸。
制备胰高血糖素相关的类似物肽的方法
本文公开的胰高血糖素相关的类似物肽(和前药)可以通过标准合成方法、重组DNA技术或任何制备肽和融合蛋白的其他方法来制备。尽管某些非天然氨基酸不能通过标准重组DNA技术来表达，但是制备它们的技术在本领域内是已知的。除了应用标准化学反应以外，包括非肽部分的本发明的化合物可以通过标准有机化学反应来合成。
下文详细地描述了胰高血糖素相关的类似物肽的类型。对于涉及1、2、3、4和5类胰高血糖素相关的类似物肽的本公开的每一章节，描述了有关上文详细描述的前药化合物的胰高血糖素相关的类似物肽部分的修饰。因此，对于胰高血糖素相关的类似物肽的类型所述的结构元件是进一步修饰以产生上文所述的前药化合物的生物活性肽、多肽或蛋白的结构元件。
1类胰高血糖素相关的类似物肽
在某些实施方案中，胰高血糖素相关的类似物肽为1类胰高血糖素相关的类似物肽，其描述于本文和2008年7月17日公开的国际专利申请WO2008/086086以及美国临时申请61/090,415中，上述参考文献通过引用整体并入本文中。
活性
1类胰高血糖素肽保留了相对于天然胰高血糖素肽(SEQIDNO：701)的胰高血糖素受体活性。例如，胰高血糖素可以保留至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％或90％(计算为胰高血糖素肽比胰高血糖素的ECS0的反比，例如通常利用实施例2所述的测定通过cAMP的产生测量)的天然胰高血糖素的活性。在一实施方案中，1类胰高血糖素相关的类似物肽具有与胰高血糖素相同或比其更高的活性(与术语“效力(potency)”同义使用)。
当利用实施例2的测定，在过量表达胰高血糖素受体的HEK293细胞中测试cAMP诱导时，任何本文所述的1类胰高血糖素相关的类似物肽对人胰高血糖素受体都可以表现出约100nM、75nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、1nM或更低的EC50。与未聚乙二醇化的肽相比，聚乙二醇化的肽通常会表现出更高的EC50。
在某些实施方案中，1类胰高血糖素相关的类似物肽表现出低于约5％、4％、3％、2％或1％的天然GLP-1对GLP-1受体的活性和/或与GLP-1受体相比对胰高血糖素受体大于约5倍、10倍或15倍的选择性。例如，在某些实施方案中，1类胰高血糖素相关的类似物肽表现出小于约5％的天然GLP-1对GLP-1受体的活性，并且与GLP-1受体相比表现出大于5倍的对胰高血糖素受体的选择性。
改善的溶解性
天然胰高血糖素在水溶液中，特别是在生理pH值下的水溶液中溶解性不好，并且随时间趋向于聚集和沉淀。相比之下，在一实施方案中，在6至8或6至9的pH下，例如在25℃、pH为7的条件下24小时后，1类胰高血糖素相关的类似物肽与天然胰高血糖素相比，表现出至少2倍、5倍或者甚至更高的溶解性。
因此，在一实施方案中，相对于His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(SEQIDNO：701)的野生型肽，修饰了1类胰高血糖素相关的类似物肽，以改善肽在水溶液中，特别是在约5.5至约8.0的pH值下水溶液中的溶解性，同时保留天然肽的生物活性。
例如，任何本文所述的1类胰高血糖素相关的类似物肽的溶解性还可以通过将亲水部分连接至肽上改善。这样的基团的引入还增加了作用持续时间，例如通过循环中延长的半衰期所测量的作用持续时间。本文还描述了亲水部分。
带电荷的残基的修饰
在一实施方案中，通过以下方法向1类胰高血糖素相关的类似物肽添加电荷来改善溶解性：由选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的带电荷的氨基酸取代天然不带电荷的氨基酸，或者向肽的氨基末端或羧基末端添加带电荷的氨基酸。
根据一实施方案，1类胰高血糖素相关的类似物肽的溶解性由于这样的事实而改善：通过向肽的C-末端部分引入带电荷的氨基酸的氨基酸取代和/或添加来修饰肽，并且在一实施方案中，在位于SEQIDNO：701位置27的C-末端的位置处进行上述修饰。任选地，可以在C-末端部分引入1、2或3个带电荷的氨基酸，并且在一实施方案中，在位置27的C-末端处引入上述氨基酸。根据一实施方案，由带电荷的氨基酸取代位置28和/或29处的天然氨基酸，和/或向肽的C-末端添加1至3个带电荷的氨基酸，例如在位置27、38或29后。在示例性实施方案中，1、2、3个或全部带电荷的氨基酸都是带负电荷的。在其他实施方案中，1、2、3个或全部带电荷的氨基酸都是带正电荷的。
在具体的示例性实施方案中，1类胰高血糖素相关的类似物肽可以包含以下修饰的任一个或两个：由E取代N28；由D取代N28；由D取代T29；由E取代T29；在位置27、28或29后插入E；在位置27、28或29后插入D。例如，D28E29、E28E29、E29E30、E28E30、D28E30。
根据一示例性实施方案，1类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：711的氨基酸序列，或其相对于天然胰高血糖素含有1至3个其他氨基酸修饰的类似物(在本文中对于胰高血糖素激动剂而描述)，或其高血糖素激动剂类似物。SEQIDNO：711代表修饰的1类胰高血糖素相关的类似物肽，其中天然蛋白位置28处的天冬酰胺残基已由天冬氨酸取代。在另一示例性实施方案中，1类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：738的氨基酸序列，其中天然蛋白位置28处的天冬酰胺残基已由谷氨酸取代。其他示例性实施方案包括SEQIDNOS：724、725、726、733、735、736和737的1类胰高血糖素相关的类似物肽。
由带电荷的氨基酸取代位置28处和/或29处的通常存在的氨基酸，和/或在1类胰高血糖素相关的类似物肽的羧基末端处添加一个至两个带电荷的氨基酸，将胰高血糖素肽在生理相关pH值(即，约6.5至约7.5的pH值)下在水溶液中溶解性和稳定性增强至少5倍，并且多达30倍。因此，一实施方案的1类胰高血糖素肽保留胰高血糖素活性，并且当于25℃下24小时后进行测量时，在约5.5-8如7的给定pH值下，相对于天然胰高血糖素，表现出至少2倍、5倍、10倍、15倍、25倍、30倍或更高的溶解性。
可以对1类胰高血糖素相关的类似物肽进行诸如保守性取代的其他修饰，这些修饰仍然允许该1类胰高血糖素相关的类似物肽保留胰高血糖素活性并且在本文中做了进一步描述。
改善的稳定性
任何1类胰高血糖素肽还可以表现出改善的稳定性和/或减少的降解，例如，于25℃下24小时后保留至少95％的原始肽。任何本文公开的1类胰高血糖素相关的类似物肽还可以在5.5至8的pH下表现出改善的稳定性，例如，于25℃下24小时后保留至少75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的原始肽。1类胰高血糖素相关的类似物肽可以包含改变其药物属性的其他修饰，例如，增强效力、循环中延长半衰期、增加保质期、减少沉淀或聚集和/或减少降解，例如减少储存后切割或化学修饰的发生。
仍然在其他示例性实施方案中，可以通过修饰SEQIDNO：701位置15处的氨基酸以减少肽随时间，特别是在酸性或碱性缓冲液中的降解，进一步修饰任何前述1类胰高血糖素相关的类似物肽，以改善稳定性。在示例性实施方案中，位置15处的Asp由Glu、高-Glu、半胱磺酸或高-半胱磺酸取代。
或者，可以通过修饰SEQIDNO：701位置16处的氨基酸，进一步修饰任何本文所述的1类胰高血糖素相关的类似物肽以改善稳定性。在示例性实施方案中，位置16处的Ser由Thr或AIB取代，或者由本文关于1类胰高血糖素相关的类似物肽所述的增强对胰高血糖素受体的效力的任何氨基酸取代来取代。这样的修饰减少了Asp15-Ser16之间肽键的切割。
在某些实施方案中，可以通过修饰位置20、21、24或27的任何1、2、3或全部4个，在各种氨基酸位置进一步修饰任何本文所述的1类胰高血糖素相关的类似物肽，以减少降解。示例性实施方案包括由Ala或AIB取代位置20处的Gln；由Glu取代位置21处的Asp；由Ala或AIB取代位置24处的Gln；由Leu或Nle取代位置27处的Met。甲硫氨酸的去除或取代减少由于甲硫氨酸的氧化而导致的降解。Gln或Asn的去除或取代减少由于Gln或Asn的脱酰胺而导致的降解。Asp的去除或取代减少通过Asp脱水形成环琥珀酰亚胺中间体然后异构化为异天冬氨酸而发生的降解。
增强的效力
根据另一实施方案，提供了1类胰高血糖素相关的类似物肽，其具有对胰高血糖素受体的增强的效力，其中该肽在天然胰高血糖素(SEQIDNO：701)位置16处包含氨基酸修饰。作为非限制性实例，这类增强的效力可以通过由谷氨酸；或由具有长度为4个原子的侧链的其他带负电荷的氨基酸；或可选地由谷氨酰胺、高谷氨酸或高半胱磺酸(homocysteicacid)中任一氨基酸；或由具有长度为约4(或3-5)个原子的侧链的带电荷的氨基酸，该侧链含有至少一个杂原子(如，N、0、S、P)，取代位置16处的天然存在的丝氨酸来提供。由谷氨酸取代位置16处的丝氨酸将对胰高血糖素受体的胰高血糖素活性增强至少2倍、4倍、5倍和高达10倍以上。在某些实施方案中，1类胰高血糖素相关的类似物相对于GLP-1受体保留对胰高血糖素受体的选择性，例如至少5倍、10倍或15倍的选择性。
DPP-IV抗性
在某些实施方案中，在位置1或2处进一步修饰本文公开的1类胰高血糖素肽以减少对二肽基肽酶IV切割的易感性。特别是，在某些实施方案中，1类胰高血糖素相关的类似物肽的位置1和/或位置2由本文所述的DPP-IV抗性氨基酸取代。在一实施方案中，类似物肽的位置2由氨基异丁酸取代。在一实施方案中，类似物肽的位置2由选自D-丝氨酸、D-丙氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸和ε-氨基丁酸的氨基酸取代。在另一实施方案中，1类胰高血糖素相关的类似物肽的位置2由选自D-丝氨酸、甘氨酸和氨基异丁酸的氨基酸取代。
胰高血糖素肽的位置1和/或位置2处氨基酸修饰时的胰高血糖素活性的减少，可以通过稳定胰高血糖素肽的C-末端部分(氨基酸12至29附近)的α螺旋结构来恢复。如本文进一步所述，α螺旋结构可以通过例如形成共价或非共价分子内桥(如在位置“i”与“i+4”处的氨基酸侧链之间形成内酰胺桥)、由α螺旋稳定氨基酸(如，α，α-二取代的氨基酸)取代和/或插入位置12-29附近的氨基酸来稳定。
通过在位置3处的修饰减少胰高血糖素活性
胰高血糖素受体活性可以通过位置3处的氨基酸修饰来减少，例如由任何氨基酸取代位置3处的天然存在的谷氨酰胺。在这个位置由酸性、碱性或疏水性氨基酸(谷氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸)的取代基本上减少或破坏了胰高血糖素受体活性。
用C-末端酰胺和酯增强GLP-1活性
通过用诸如酰胺或酯的电中性基团代替C-末端氨基酸的羧酸来增强对GLP-1受体的活性。相反地，保留肽C-末端的天然羧酸保持了1类胰高血糖素相关的类似物肽对于胰高血糖素受体比GLP-1受体更高的选择性(如，大于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20倍)。
其他修饰和组合
可以对1类胰高血糖素相关的类似物肽进行可以进一步增加溶解性和/或稳定性和/或胰高血糖素活性的其他修饰。或者，1类胰高血糖素相关的类似物肽可以包含基本上不影响溶解性或稳定性且基本上不降低胰高血糖素活性的其他修饰。在示例性实施方案中，1类胰高血糖素相关的类似物肽相对于天然胰高血糖素序列可以包含总共高达11、或高达12、或高达13或高达14个氨基酸修饰。例如，可以在位置2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29中的任何位置处发生保守性糊非保守性取代、添加或缺失。
1类胰高血糖素相关的类似物肽的示例性修饰包括但不限于：
(a)非保守性取代、保守性取代、添加或缺失，但保留至少部分的胰高血糖素激动剂活性，例如，在位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29中一个或多个位置处的保守性取代，由Val或Phe取代位置10处的Tyr，由Arg取代位置12处的Lys，这些位置的一个或多个由Ala的取代；
(b)位置29和/或28处，并且任选的位置27处的氨基酸的缺失，同时保留至少部分的胰高血糖素激动剂活性；
(c)例如通过由谷氨酸、高谷氨酸、半胱磺酸或高半胱磺酸的取代来修饰位置15处的天冬氨酸，这可以减少降解；或者例如通过由苏氨酸、AIB、谷氨酸或具有长度为4个原子的侧链的其他带负电荷的氨基酸，或者由谷氨酰胺、高谷氨酸或高半胱磺酸的任一氨基酸的取代来修饰位置16处的丝氨酸，这同样可以减少由于Asp15-Ser16键的切割而导致的降解；
(d)例如在位置16、17、20、21、24、29、40处或在C-末端氨基酸处添加诸如本文所述的水溶性聚合物聚乙二醇的亲水部分，这可以增加溶解性和/或半衰期；
(e)例如通过由亮氨酸或正亮氨酸的取代来修饰位置27处的甲硫氨酸以减少氧化降解；
(f)例如通过由Ala或AIB的取代来修饰位置20或24处的Gln以减少由于Gln的脱酰胺而发生的降解；
(g)例如通过由Glu的取代来修饰位置21处的Asp以减少由于Asp脱水形成环琥珀酰亚胺中间体然后异构化为异天冬氨酸而发生的降解；
(h)如本文所述位置1或2处的修饰，其改善对DPP-IV切割的抗性，并且任选地与诸如位置“i”与“i+4”之间的内酰胺桥的分子内桥组合，其中i为12至25的整数，如12、16、20、24；
(i)如本文所述，将胰高血糖素肽酰化，这可以增加循环中的半衰期和/或延长作用的持续时间和/或延缓作用起效，并且任选地与亲水部分的添加组合；
(j)如本文所述的C-末端延伸；
(k)如本文所述的同源二聚化或异源二聚化；
以及(a)至(k)的组合。
在一实施方案中，1类胰高血糖素相关的类似物肽的示例性修饰包括选自A组的至少一个氨基酸修饰和选自B组和/或C组的一个或多个氨基酸修饰，
其中A组为：
由带电荷的氨基酸取代位置28处的Asn；
由选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸的带电荷的氨基酸取代位置28处的Asn；
由Asn、Asp或Glu在位置28处的取代；
由Asp在位置28处的取代；
由Glu在位置28处的取代；
由带电荷的氨基酸取代位置29处的Thr；
由选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸的带电荷的氨基酸取代位置29处的Thr；
由Asp、Glu或Lys在位置29处的取代；
由Glu在位置29处的取代；
位置29后1至3个带电荷的氨基酸的插入；
位置29后Glu或Lys的插入；
位置29后Gly-Lys或Lys-Lys的插入；
或上述的其组合；
其中B组为：
由Glu取代位置15处的Asp；
由Thr或AIB取代位置16处的Ser；
并且其中C组为：
由非天然氨基酸取代位置1处的His，该非天然氨基酸减少了胰高血糖素肽对二肽基肽酶IV(DPP-IV)切割的易感性；
由非天然氨基酸取代位置2处的Ser，该非天然氨基酸减少了胰高血糖素肽对二肽基肽酶IV(DPP-IV)切割的易感性；
由Arg取代位置12处的Lys；
由Ala或AIB取代位置20处的Gln；
由G1u取代位置21处的Asp；
由Ala或AIB取代位置24处的Gln；
由Leu或Nle取代位置27处的Met；
位置27至29处的氨基酸缺失；
位置28至29处的氨基酸缺失；
位置29处的氨基酸缺失；
或上述的组合。
在示例性实施方案中，由Arg取代位置12处的Lys。在其他示例性实施方案中，位置29和/或28以及任选的位置27处的氨基酸缺失。
在某些具体实施方案中，胰高血糖素肽包含(a)位置1和/或2处的氨基酸修饰，其赋予DPP-IV抗性，如由DMIA在位置1处的取代或由AIB在位置2处的取代；(b)位置12-29中的分子内桥，如在位置16和20处，或者由α，α-二取代的氨基酸取代位置16、20、21和24处的一个或多个氨基酸；任选的(c)例如通过位置24、29或C末端氨基酸处的Cys连接至诸如PEG的亲水部分；任选的(d)位置27处的、由例如Nle取代Met的氨基酸修饰；任选的(e)减少降解的位置20、21和24处的氨基酸修饰；以及任选的(f)连接至SEQIDNO：720。在其他具体实施方案中，胰高血糖素肽包含(a)Asp28Glu29，或Glu28Glu29，或Glu29Glu30，或Glu28Glu30，或Asp28Glu30；和任选的(b)位置16处的、由例如Thr或AIB取代Ser的氨基酸修饰；和任选的(c)位置27处的、由例如Nle取代Met的氨基酸修饰；以及任选的(d)减少降解的位置20、21和24处的氨基酸修饰。在一具体实施方案中，胰高血糖素肽为T16、A20、E21、A24、Nle27、D28、E29。
在一实施方案中，1类胰高血糖素相关的类似物肽包含以下氨基酸序列：
X1-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z(SEQIDNO：739)，其具有1至3个氨基酸修饰，
其中，X1和/或X2为减少胰高血糖素肽对二肽基肽酶IV(DPP-IV)切割的易感性(或增加抗性)的非天然氨基酸，
其中Z选自-COOH(天然存在的C-末端羧酸)、-Asn-COOH、Asn-Thr-COOH和Y-COOH，其中Y为1-2个氨基酸，并且
其中分子内桥，优选共价键，连接位置i处的氨基酸侧链和位置i+4处的氨基酸侧链，其中i为12、16、20或24
在某些实施方案中，分子内桥位内酰胺桥。在某些实施方案中，SEQIDNO：739的位置i和i+4处的氨基酸为Lys和Glu，如Glu16和Lys20。在某些实施方案中，X1选自：D-His、N-甲基-His、α-甲基-His、咪唑乙酸、脱氨基-His、羟基-His、乙酰基-His、高-His和α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)。在其他实施方案中，X2选自：D-Ser、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、Val和α，氨基异丁酸(AIB)。在某些实施方案中，胰高血糖素肽在氨基酸位置16、17、20、21、24、29、40中的任何氨基酸位置处，在C-末端延伸内或在C-末端氨基酸处，共价连接至亲水部分。在示例性实施方案中，该亲水部分共价连接至任何这些位置的Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸或乙酰基-苯丙氨酸残基。示例性亲水部分包括聚乙二醇(PEG)，例如分子量为约1,000道尔顿至约40,000道尔或约20,000道尔顿至约40,000道尔顿的聚乙二醇(PEG)。
在其他实施方案中，I类胰高血糖素相关的类似物肽包含以下氨基酸序列：
X1-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z(SEQIDNO：739)，
其中，X1和/或X2为减少胰高血糖素肽对二肽基肽酶IV(DPP-IV)切割的易感性(或增加抗性)的非天然氨基酸，
其中，由α，α-二取代的氨基酸取代胰高血糖素肽的位置16、20、21和24中的1、2、3、4个或更多个位置，并且
其中Z选自-COOH(天然存在的C-末端羧酸)、-Asn-COOH、Asn-Thr-COOH和Y-COOH，其中Y为1至2个氨基酸。
对前述1类胰高血糖素相关的类似物肽或类似物的其他示例性氨基酸修饰包括，由Arg取代位置12处的Lys；由Glu取代位置15处的Asp；由Thr或AIB取代位置16处的Ser；由Ala或AIB取代位置20处的Gln；由Glu取代位置21处的Asp；由Ala或AIB取代位置24处的Gln；由Leu或Nle取代位置27处的Met；由带电荷的氨基酸取代位置28处的Asn；由选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸的带电荷的氨基酸取代位置28处的Asn；由Asn、Asp或Glu在位置28处的取代；由Asp在位置28处的取代；由Glu在位置28处的取代；由带电荷的氨基酸取代位置29处的Thr；由选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸的带电荷的氨基酸取代位置29处的Thr；由Asp、Glu或Lys在位置29处的取代；由Glu在位置29处的取代；1-3个带电荷的氨基酸在位置29后的插入；Glu或Lys在位置30处的插入(即，在位置29后)；任选的Lys在位置31处的插入；SEQIDNO：720向C-末端的添加；或者上述的组合。
任何上文所述的对于1类胰高血糖素激动剂的修饰可以单独或组合地应用于1类胰高血糖素肽，该修饰增加胰高血糖素受体活性，保留部分胰高血糖素受体活性，改善溶解性，增加稳定性或减少降解。因此，可以制备1类胰高血糖素相关的类似物肽，其保留至少20％的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性，并且在pH值为6至8或6至9(如，pH值为7)的条件下可溶的浓度为至少1mg/mL，并且任选地于25℃下24小时后，保留至少95％的原始肽(如，5％或更少的原始肽被降解或切割)。或者，可以制备高效力的1类胰高血糖素肽，其表现出至少约100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％或者10倍或更高的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性，并且任选地在pH值为6至8或6至9(如，pH值为7)的条件下可溶的浓度为至少1mg/mL，并且任选地于25℃下24小时后，保留至少95％的原始肽(如，5％或更少的原始肽被降解或切割)。
1类胰高血糖素相关的类似物肽实施方案的实例
根据一实施方案，通过以下方法来修饰SEQIDNO：701的天然胰高血糖素肽：由带负电荷的氨基酸(如，天冬氨酸或谷氨酸)取代位置28和/或29处的天然氨基酸，和任选地向肽的羧基末端添加带负电荷的氨基酸(如，天冬氨酸或谷氨酸)。在替代性实施方案中，通过以下方法来修饰SEQIDNO：701的天然胰高血糖素肽：由带正电荷的氨基酸(如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)取代位置29处的天然氨基酸，和任选地在肽的羧基末端处添加1个或2个带正电荷的氨基酸(如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)。根据一实施方案，提供了具有改善的溶解性和稳定性的1类胰高血糖素相关的类似物肽，其中该肽包含SEQIDNO：734的氨基酸序列，其条件是由酸性氨基酸取代位置28或29处的至少一个氨基酸和/或在SEQIDNO：734的羧基末端处添加另外的酸性氨基酸。在一实施方案中，酸性氨基酸独立地选自Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸。
根据一实施方案，提供了具有改善的溶解性和稳定性的1类胰高血糖素相关的类似物肽，其中激动剂包含SEQIDNO：733的氨基酸序列，其中由非天然氨基酸残基取代位置27、28或29处的至少一个氨基酸(即，存在于类似物的位置27、28或29处的至少一个氨基酸是不同于存在于SEQIDNO：701的相应位置的氨基酸的酸性氨基酸)。根据一实施方案，提供了包含SEQIDNO：733的序列的1类胰高血糖素相关的类似物肽，其条件是当位置28处的氨基酸为天冬酰胺并且位置29处的氨基酸为苏氨酸时，肽还包含1个或2个添加到胰高血糖素肽羧基末端的氨基酸，该氨基酸独立地选自Lys、Arg、His、Asp或Glu。
据报道，可以修饰天然胰高血糖素肽的某些位置而保留母体肽的至少某些活性。因此，申请人预料，可以由不同于存在于天然胰高血糖素肽的氨基酸取代位于SEQIDNO：711的肽的位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29处的一个或多个氨基酸，并且仍然保留母体胰高血糖素肽的增强的效力、生理pH值下的稳定性和生物活性。例如，根据一实施方案，将存在于天然肽的位置27处的甲硫氨酸残基变为亮氨酸或正亮氨酸以防止肽的氧化降解。
在一实施方案中，提供了SEQIDNO：733的1类胰高血糖素相关的类似物肽，其中选自类似物的位置1、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21或24处的1至6个氨基酸不同于SEQIDNO：701的相应氨基酸。根据另一实施方案中，提供了SEQIDNO：733的1类胰高血糖素相关的类似物肽，其中选自肽的位置1、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21或24处的1至3个氨基酸不同于SEQIDNO：701的相应氨基酸。在另一实施方案中，提供了SEQIDNO：707、SEQIDNO：708或SEQIDNO：734的1类胰高血糖素相关的类似物肽，其中选自肽的位置1、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21或24处的1至2个氨基酸不同于SEQIDNO：701的相应氨基酸，并且在另一实施方案中，这些1至2个不同氨基酸相对于存在于天然序列(SEQIDNO：701)的氨基酸代表保守性氨基酸取代。在一实施方案中，提供了SEQIDNO：711或SEQIDNO：713的1类胰高血糖素相关的类似物肽，其中该胰高血糖素肽还在选自位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27或29的位置处包含1、2或3个氨基酸取代。在一实施方案中，位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、27或29处的取代为保守性氨基酸取代。
在一实施方案中，提供了包含SEQIDNO：701的类似物肽的1类胰高血糖素相关的类似物肽，其中该肽与SEQIDNO：701的不同在于在位置2处具有除了丝氨酸以外的氨基酸，和在位置28或29处具有取代天然氨基酸的酸性氨基酸或者添加到SEQIDNO：701的肽的羧基末端的酸性氨基酸。在一实施方案中，酸性氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。在一实施方案中，提供了SEQIDNO：709、SEQIDNO：712、SEQIDNO：713或SEQIDNO：732的1类胰高血糖素相关的类似物肽，其中该肽与母体分子的不同在于位置2处的取代。更具体而言，由选自D-丝氨酸、丙氨酸、D-丙氨酸、甘氨酸、n-甲基丝氨酸和氨基异丁酸的氨基酸取代肽的位置2。
在另一实施方案中，提供了包含SEQIDNO：701的肽的1类胰高血糖素相关的类似物肽，其中该肽与SEQIDNO：701的不同在于在位置1处具有除了丝氨酸以外的氨基酸，在位置28或29处具有取代天然氨基酸的酸性氨基酸或者添加到SEQIDNO：701的肽的羧基末端的酸性氨基酸。在一实施方案中，酸性氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。在一实施方案中，提供了SEQIDNO：709、SEQIDNO：712、SEQIDNO：713或SEQIDNO：732的1类胰高血糖素相关的类似物肽，其中该肽与母体分子的不同在于位置1处的取代。更具体而言，由选自DMIA、D-组氨酸、脱氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸和高组氨酸的氨基酸取代肽的位置1。
根据一实施方案，1类胰高血糖素相关的类似物肽包含选自SEQIDNO：709、SEQIDNO：712、SEQIDNO：713和SEQIDNO：732的序列。在另一实施方案中，提供了1类胰高血糖素相关的类似物肽，其包含SEQIDNO：709、SEQIDNO：712、SEQIDNO：713或SEQIDNO：732的序列，还包含添加到SEQIDNO：709、SEQIDNO：712、SEQIDNO：713或SEQIDNO：732的C-末端的1至2个氨基酸，其中另外的氨基酸独立地选自Lys、Arg、His、AspGlu、半胱磺酸或高半胱磺酸。在一实施方案中，添加到羧基末端的另外的氨基酸选自Lys、Arg、His、Asp或Glu，或者在另一实施方案中，另外的氨基酸为Asp或Glu。
在另一实施方案中，1类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDN0：707的序列或其胰高血糖素激动剂类似物。在一实施方案中，肽包含选自SEQIDNO：708、SEQIDNO：710、SEQIDNO：711、SEQIDNO：712和SEQIDNO：713的序列。在另一实施方案中，肽包含选自SEQIDNO：708、SEQIDNO：710和SEQIDNO：711的序列。在一实施方案中，1类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：708、SEQIDNO：710和SEQIDNO：711的序列，还包含添加到胰高血糖素肽的C-末端的另外的氨基酸，该另外的氨基酸选自Asp和Glu。在一实施方案中，1类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：711或SEQIDNO：713的序列，并且在另一实施方案中，胰高血糖素肽包含SEQIDNO：711的序列。
根据一实施方案，提供了1类胰高血糖素相关的类似物肽，其包含选自以下序列的修饰的胰高血糖素肽：
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-R(SEQIDNO：734)、
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asp-Thr-R(SEQIDNO：711)和
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Glu-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asp-Thr-R(SEQIDNO：713)，
其中位置15处的Xaa为Asp、Glu、半胱磺酸、高谷氨酸或高半胱磺酸，位置28处的Xaa为Asn或酸性氨基酸，位置29处的Xaa为Thr或酸性氨基酸，并且R为酸性氨基酸、COOH或CONH2，其条件是酸性残基存在于位置28、29或30之一处。在一实施方案中，R为COOH，在另一实施方案中，R为CONH2。
更具体而言，1类胰高血糖素相关的类似物肽可以为包含胰高血糖素激动剂类似物的融合胰高血糖素肽，其包含胰高血糖素肽NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-R(SEQIDNO：734)，其中R为酸性氨基酸或连接至胰高血糖素肽序列的羧基末端氨基酸的键和SEQIDNO：720(GPSSGAPPPS)、SEQIDNO：721(KRNRNNIA)或SEQIDNO：722(KRNR)的氨基酸序列。在一实施方案中，胰高血糖素肽选自SEQIDNO：733、SEQIDNO：707或SEQIDNO：708，其还包含连接至胰高血糖素肽序列的羧基末端氨基酸的SEQIDNO：720(GPSSGAPPPS)、SEQIDNO：721(KRNRNNIA)或SEQIDNO：722(KRNR)的氨基酸序列。在一实施方案中，胰高血糖素融合肽包含SEQIDNO：702、SEQIDNO：703、SEQIDNO：704、SEQIDNO：705和SEQIDNO：706或其胰高血糖素激动剂类似物，其还包含连接至胰高血糖素融合肽序列的氨基酸29的SEQIDNO：720(GPSSGAPPPS)、SEQIDNO：721(KRNRNNIA)或SEQIDNO：722(KRNR)的氨基酸序列。根据一实施方案，融合肽还包含连接至位置16、17、21、24、29处的、C-末端延伸内的或C-末端氨基酸处的氨基酸的PEG链，其中PEG链选自500道尔顿至40,000道尔顿的PEG链。在一实施方案中，SEQIDNO：720(GPSSGAPPPS)、SEQIDNO：721(KRNRNNIA)或SEQIDNO：722(KRNR)的氨基酸序列通过肽键结合至胰高血糖素肽的氨基酸29。在一实施方案中，胰高血糖素融合肽的胰高血糖素肽部分包含选自SEQIDNO：710、SEQIDNO：711和SEQIDNO：713的序列。在一实施方案中，胰高血糖素融合肽的胰高血糖素肽部分包含SEQIDNO：711或SEQIDNO：713的序列，其中PEG链分别连接至位置21、24、29处、C-末端延伸内或C-末端氨基酸处。
在另一实施方案中，融合肽的胰高血糖素肽序列包含SEQIDNO：711的序列，还包含连接至胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQIDNO：720(GPSSGAPPPS)、SEQIDNO：721(KRNRNNIA)或SEQIDNO：722(KRNR)的氨基酸序列。在一实施方案中，胰高血糖素融合肽包含选自SEQIDNO：724、SEQIDNO：725和SEQIDNO：726的序列。通常，本发明的融合肽具有带有标准羧酸基团的C-末端氨基酸。然而，这些序列的类似物，其中C-末端氨基酸具有取代羧酸的酰胺，也被包括，作为实施方案。根据一实施方案，融合胰高血糖素肽包含选自SEQIDNO：710、SEQIDNO：711和SEQIDNO：713的胰高血糖素激动剂类似物，还包含连接至胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQIDNO：723(GPSSGAPPPS-CONH2)的氨基酸序列。
示例性胰高血糖素肽选自SEQIDNO：702、SEQIDNO：703、SEQIDNO：704、SEQIDNO：705、SEQIDNO：706、SEQIDNO：707、SEQIDNO：708、SEQIDNO：709、SEQIDNO：710、SEQIDNO：711和SEQIDNO：733，其中胰高血糖素肽的氨基酸29通过肽键结合至第二肽，并所述第二肽包含SEQIDNO：720、SEQIDNO：721或SEQIDNO：722的序列。在一实施方案中，胰高血糖素肽是聚乙二醇化的。
可以进一步修饰本文所述的1类胰高血糖素相关的类似物肽，以改善肽在水溶液中的溶解性和稳定性，同时保留胰高血糖素肽的生物活性。根据一实施方案，预料在选自SEQIDNO：711的肽或其胰高血糖素激动剂类似物的位置16、17、20、21、24和29的一个或多个位置处引入亲水基团，会改善溶解性和稳定性。更具体而言，在一实施方案中，修饰SEQIDNO：710、SEQIDNO：711、SEQIDNO：713或SEQIDNO：732的1类胰高血糖素相关的类似物肽，以包含共价连接至存在于胰高血糖素肽的位置21和24的氨基酸的侧链的一个或多个亲水基团。
根据一实施方案，修饰SEQIDNO：711的1类胰高血糖素相关的类似物肽以含有位置16、17、20、21、24和/或29处的一个或多个氨基酸取代，其中由具有侧链的氨基酸取代天然氨基酸，该侧链适合于与包括例如PEG在内的亲水部分交联。天然肽可以由天然存在的氨基酸或合成(非天然存在)的氨基酸取代。合成或非天然存在的氨基酸指在体内不天然存在，但是可以被并入本文所述的肽结构中的氨基酸。
在一实施方案中，提供了SEQIDNO：710、SEQIDNO：711或SEQIDNO：713的1类胰高血糖素相关的类似物肽，其中天然胰高血糖素肽序列经修饰，在位置16、17、21、24、29中的至少一个位置处、C-末端延伸内或在天然序列的C-末端氨基酸处含有天然存在或合成的氨基酸，其中氨基酸取代基还包含亲水部分。在一实施方案中，取代位于位置21或24处，并且在另一实施方案中，亲水部分为PEG链。在一实施方案中，SEQIDNO：711的1类胰高血糖素相关的类似物肽由至少一个半胱氨酸残基取代，其中半胱氨酸残基的侧链还由巯基反应性试剂进行修饰，该巯基反应性试剂包括，例如马来酰亚胺基、乙烯基砜、2-吡啶基巯基、卤代烷基和卤代酰基。这些巯基反应性试剂可以含有羧基、酮、羟基和醚以及诸如聚乙二醇单元的其他亲水部分。在替代性实施方案中，天然胰高血糖素肽由赖氨酸取代，并且取代的赖氨酸残基的侧链利用胺反应性试剂进一步修饰，该胺反应性试剂例如诸如聚乙二醇的亲水部分的羧酸或醛的活性酯(琥珀酰亚胺基、酐等)。在一实施方案中，1类胰高血糖素相关的类似物肽选自SEQIDNO：714、SEQIDNO：715、SEQIDNO：716、SEQIDNO：717、SEQIDNO：718和SEQIDNO：719。
根据一实施方案，聚乙二醇化的1类胰高血糖素相关的类似物肽包含共价结合至胰高血糖素肽的2条或更多条聚乙烯链，其中胰高血糖素链的总分子量为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿。在一实施方案中，聚乙二醇化的1类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：706的肽，其中PEG链共价连接至位置21和位置24处的氨基酸残基，并且其中两条PEG链的组合分子量为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿。在另一实施方案中，聚乙二醇化的1类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：706的肽，其中PEG链共价连接至位置21和位置24处的氨基酸残基，并且其中两条PEG链的组合分子量为约5,000道尔顿至约20,000道尔顿。
聚乙二醇链可以为直链形式或其可以为分支的。根据一实施方案，聚乙二醇链的平均分子量为约500道尔顿至约40,000道尔顿。在一实施方案中，聚乙二醇链的分子量为约500道尔顿至约5,000道尔顿。在另一实施方案中，聚乙二醇链的分子量为约20,000道尔顿至约40,000道尔顿。
胰高血糖素激动剂可以为包含任何SEQIDNOs：701-758的氨基酸序列的氨基酸序列的肽，任选地具有保留胰高血糖素激动剂活性的高达1、2、3、4或5个其他修饰。
2类胰高血糖素相关的类似物肽
在某些实施方案中，胰高血糖素相关的类似物肽为2类胰高血糖素相关的类似物肽，其描述于本文和美国临时申请61/090,448号中，其内容通过引用整体并入本文。
活性
天然胰高血糖素不激活GIP受体，并且通常具有约1％的天然GLP-1对GLP-1受体的活性。对本文所述的天然胰高血糖素序列的修饰产生2类胰高血糖素相关的类似物肽，其能够表现出等同于或优于天然胰高血糖素(SEQIDNO：801)活性的强效胰高血糖素活性、等同于或优于天然GIP(SEQIDNO：804)活性的强效GIP活性和/或等同于或优于天然GLP-1活性的强效GLP-1活性。在这一点上，如本文进一步所述，2类胰高血糖素相关的类似物肽可以为高血糖素/GIP共激动剂、胰高血糖素/GIP/GLP-1三激动剂、GIP/GLP-1共激动剂或GIP激动剂胰高血糖素肽之一。
在某些实施方案中，本文所述的2类胰高血糖素相关的类似物肽表现出的GIP受体激活活性的EC50为约100nM或更低，或者约75、50、25、10、8、6、5、4、3、2或1nM或更低。在某些实施方案中，2类胰高血糖素相关的类似物肽表现出的胰高血糖素受体激活的EC50为约100nM或更低，或者约75、50、25、10、8、6、5、4、3、2或1nM或更低。在某些实施方案中，2类胰高血糖素相关的类似物肽表现出的GLP-1受体激活的EC50为约100nM或更低，或者约75、50、25、10、8、6、5、4、3、2或1nM或更低。受体激活可以通过在过量表达受体的HEK293细胞中测量cAMP诱导的体外测定来测量，例如，如实施例2中所述，测定用编码受体的DNA和连接至cAMP应答元件的萤光素酶基因共转染的HEK293细胞。
在某些实施方案中，2类胰高血糖素相关的类似物肽相对于天然GIP表现出对GIP受体至少约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％，1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、100％、125％、150％、175％或200％或者更高的活性(GIP效力)。在某些实施方案中，2类胰高血糖素相关的类似物肽相对于天然胰高血糖素表现出对胰高血糖素受体至少约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％或者更高的活性(胰高血糖素效力)。在某些实施方案中，2类胰高血糖素相关的类似物肽相对于天然GLP-1表现出对GLP-1受体至少约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、100％、125％、150％、175％或200％或者更高的活性(GLP-1效力)。2类胰高血糖素相关的类似物肽相对于受体的天然配体对受体的活性计算为2类胰高血糖素相关的类似物肽比天然配体的EC50的反比。
在一实施方案中，2类胰高血糖素相关的类似物肽表现出对胰高血糖素受体和GIP受体的活性(“胰高血糖素/GIP共激动剂”)。与GIP受体相比，这些2类胰高血糖素相关的类似物肽失去了天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的选择性。在某些实施方案中，2类胰高血糖素相关的类似物肽对GIP受体的EC50与其对胰高血糖素受体的EC50的差别(较高或较低)为小于50倍、40倍、30倍或20倍。在某些实施方案中，2类胰高血糖素相关的类似物肽的GIP效力与其胰高血糖素效力的差别(较高或较低)为小于约500倍、450倍、400倍、350倍、300倍、250倍、200倍、150倍、100倍、75倍、50倍、25倍、20倍、15倍、10倍或5倍。在某些实施方案中，2类胰高血糖素相关的类似物肽对GIP受体的EC50除以2类胰高血糖素相关的类似物肽对胰高血糖素受体的EC50的比率为小于约100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在某些实施方案中，2类胰高血糖素相关的类似物肽的GIP效力与2类胰高血糖素相关的类似物肽的胰高血糖素效力相比的比率为小于约500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在某些实施方案中，GLP-1活性被例如位置7处的氨基酸修饰明显地降低或破坏。
在另一方面，2类胰高血糖素相关的类似物肽表现出对胰高血糖素受体、GIP受体和GLP-1受体的活性(“胰高血糖素/GIP/GLP-1三激动剂”)。与GLP-1受体和GIP受体相比，这些2类胰高血糖素相关的类似物肽失去了天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的选择性。在某些实施方案中，2类胰高血糖素相关的类似物肽对GIP受体的EC50与其分别对胰高血糖素受体和GLP-1受体的EC50的差别(较高或较低)为小于约50倍、40倍、30倍、或20倍。在某些实施方案中，2类胰高血糖素相关的类似物肽的GIP效力与其胰高血糖素效力和GLP-1效力的差别(较高或较低)为小于约500倍、450倍、400倍、350倍、300倍、250倍、200倍、150倍、100倍、75倍、50倍、25倍、20倍、15倍、10倍或5倍。在某些实施方案中，三激动剂对GIP受体的EC50除以三激动剂对GLP-1受体的EC50的比率为小于约100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在某些实施方案中，三激动剂的GIP效力与三激动剂GLP-1效力相比的比率为小于约100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在相关的实施方案中，三激动剂对GIP受体的EC50除以三激动剂对胰高血糖素受体的EC50的比率为小于约100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在某些实施方案中，三激动剂的GIP效力与三激动剂的胰高血糖素效力相比的比率为小于约500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。
仍然在另一方面，2类胰高血糖素相关的类似物肽表现出对GLP-1受体和GIP受体的活性，但是其中胰高血糖素活性已经例如通过位置3处的氨基酸修饰被明显降低或破坏。例如，由酸性、碱性或疏水性氨基酸(谷氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸)在该位置的取代减少胰高血糖素活性。在某些实施方案中，胰高血糖素肽对GIP受体的EC50与其对GLP-1受体的EC50的差别(较高或较低)为小于约50倍、40倍、30倍或20倍。在某些实施方案中，2类胰高血糖素相关的类似物肽的GIP效力与其GLP-1效力的差别(较高或较低)为小于约25倍、20倍、15倍、10倍或5倍。在某些实施方案中，这些2类胰高血糖素相关的类似物肽具有约10％或更低的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性，例如约1％-10％，或者约0.1％-10％，或者大于约0.1％但是小于约10％。在某些实施方案中，2类胰高血糖素相关的类似物肽对GIP受体的EC50除以2类胰高血糖素相关的类似物肽对GLP-1受体的EC50的比率为小于约100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在某些实施方案中，2类胰高血糖素相关的类似物肽的GIP效力与2类胰高血糖素相关的类似物肽的GLP-1效力相比的比率为小于约100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。
在另一方面，2类胰高血糖素相关的类似物肽表现出对GIP受体的活性，其中胰高血糖素活性和GLP-1已经通过例如位置3和7处的氨基酸修饰被明显降低或破坏(“GIP激动剂胰高血糖素肽”)。在某些实施方案中，这些2类胰高血糖素相关的类似物肽具有约10％或更低的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性，例如约1％-10％，或者约0.1％-10％，或者大于约0.1％、0.5％或1％但是小于约1％、5％或10％。在某些实施方案中，这些2类胰高血糖素相关的类似物肽还具有约10％或更低的天然GLP-1对GLP-1受体的活性，例如约1％-10％，或者约0.1％-10％，或者大于约0.1％、0.5％或1％但是小于约1％、5％或10％。
在某些实施方案中，当2类胰高血糖素相关的类似物肽未聚乙二醇化时，2类胰高血糖素相关的类似物肽对GIP受体激活的EC50为约4、2、1nM或更低，或者该类似物具有至少约1％、2％、3％、4％或5％的天然GIP对GIP受体的活性。在相关的实施方案中，未聚乙二醇化的2类胰高血糖素相关的类似物肽对GLP-1受体激活的EC50为约4、2、1nM或更低，或者具有至少约1％、2％、3％、4％或5％的天然GLP-1对GLP-1受体的活性。仍然在其他相关的实施方案中，未聚乙二醇化的2类胰高血糖素相关的类似物肽对胰高血糖素受体激活的EC50为约4、2、1nM或更低，或者具有至少约5％、10％、15％或20％的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性。在某些实施方案中，未聚乙二醇化的2类胰高血糖素相关的类似物肽具有小于约1％的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性。在其他实施方案中，未聚乙二醇化的2类胰高血糖素相关的类似物肽具有小于约10％、5％或1％的天然GLP-1对GLP-1受体的活性。
在2类胰高血糖素相关的类似物肽连接至诸如PEG的亲水部分的实施方案中，对一种或多种受体的相对EC50可以更高。例如，聚乙二醇化的类似物对GIP受体激活的EC50为约10nM或更低，或者2类胰高血糖素相关的类似物肽具有至少约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％的天然GIP对GIP受体的活性。在相关的实施方案中，聚乙二醇化的2类胰高血糖素相关的类似物肽对GLP-1受体激活的EC50为约10nM或更低，或者具有至少约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％的天然GLP-1对GLP-1受体的活性。仍然在其他相关的实施方案中，聚乙二醇化的2类胰高血糖素相关的类似物肽对胰高血糖素受体激活的EC50为约10nM或更低，或者具有至少约0.5％、1％、1.5％或2％的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性。在某些实施方案中，2类胰高血糖素相关的类似物肽具有小于约1％的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性。在其他实施方案中，2类胰高血糖素相关的类似物肽具有小于约10％、5％或1％的天然GLP-1对GLP-1受体的活性。
修饰
本文所公开的关于2类胰高血糖素相关的类似物肽的修饰允许操作胰高血糖素(SEQIDNO：801)以产生表现出增加的GIP活性、胰高血糖素活性和/或GLP-1活性的胰高血糖素肽。本文所公开的关于2类胰高血糖素相关的类似物肽的其他修饰延长了所得肽的半衰期、增加了所得肽的溶解性或增加了所得肽的稳定性。本文所公开的关于2类胰高血糖素相关的类似物的其他修饰对活性没有影响，或者可以进行这些修饰而不破坏期望的一种活性或多种活性。用于相同目的(如，增加GIP活性)的关于2类胰高血糖素相关的类似物肽的任何组合可以单独或组合应用。赋予增强属性的关于2类胰高血糖素相关的类似物肽的任何单个或多套组合，都可以单独或组合应用，例如，增加的GIP和/或GLP-1活性可以与增加的半衰期组合。在相关的实施方案中，1、2、3、4、5、6或更多个氨基酸修饰可以为非保守性取代、添加或缺失。在某些实施方案中，1、2、3、4、5、6或更多个氨基酸修饰可以为保守性取代。
影响GIP活性的修饰
位置1处的氨基酸修饰提供了对GIP受体的增强的活性。例如，位置1处的His由大芳香氨基酸取代，该大芳香氨基酸任选为Tyr、Phe、Trp、氨基-Phe、硝基-Phe、氯-Phe、磺基-Phe、4-吡啶基-Ala、甲基-Tyr或3-氨基Tyr。位置1处的Tyr与对应于氨基酸12-29的区域中α螺旋的稳定的组合，提供了2类胰高血糖素相关的类似物肽，其激活GIP受体以及GLP-1受体和胰高血糖素受体。α螺旋结构可以通过以下方法来稳定：例如，形成共价或非共价分子内桥，或者由α螺旋稳定氨基酸(如，α，α-二取代的氨基酸)取代和/或插入位置12-29附近的氨基酸。
还可以通过位置27和/或28以及任选的位置29处的氨基酸修饰，提供对GIP受体的增强的活性。例如，由任选Leu的大脂肪族氨基酸取代位置27处的Met；由任选Ala的小脂肪族氨基酸取代位置28处的Asn；以及由任选Gly的小脂肪族氨基酸取代位置29处的Thr。由LAG在位置27至29处的取代提供了在那些位置相对于天然MNT序列增加的GIP活性。
还通过位置12处的氨基酸修饰，提供对GIP受体的增强的活性。例如，由任选Ile的大脂肪族非极性氨基酸取代位置12。
还通过位置17和/或18处的氨基酸修饰，提供对GIP受体的增强的活性。例如，由任选Gln的极性残基取代位置17，和由任选Ala的小脂肪族氨基酸取代位置18。由QA在位置17和18处的取代提供了在这些位置相对于天然RR序列增加的GIP活性。
通过允许在位置12至29处的氨基酸侧链之间形成分子内桥的修饰，提供对GIP受体的增加的活性。例如，可以通过共价键，在位置i与i+4处的两个氨基酸侧链之间，或者位置j与j+3处的两个氨基酸侧链之间，或者位置k与k+7处的两个氨基酸侧链之间，形成分子内桥。在示例性实施方案中，桥位于位置12与16、16与20、20与24、24与28或17与20之间。在其他实施方案中，能够在这些位置，在带正电荷的氨基酸与带负电荷的氨基酸之间形成诸如盐桥的非共价相互作用。
任何本文所述的增加GIP受体活性的修饰可以单独或组合应用。增加GIP受体活性的修饰的组合通常比任何这些修饰提供更高的GIP活性。
影响胰高血糖素活性的修饰
在一实施方案中，通过在天然胰高血糖素(SEQIDNO：801)的位置16处的氨基酸修饰提供增强的胰高血糖素效力。作为非限制性实例，这样的增强效力可以通过由谷氨酸；或者由具有长度为4个原子的侧链的其他带负电荷的氨基酸；或者由谷氨酰胺、高谷氨酸或高半胱磺酸的任一氨基酸；或者由具有长度为约4(或3-5)个原子的侧链的带电荷的氨基酸，该侧链含有至少一个杂原子(如，N、O、S、P)，取代位置16处的天然存在的丝氨酸来提供。在某些实施方案中，相对于GLP-1受体，胰高血糖素肽保留了其对胰高血糖素受体的原始选择性。
胰高血糖素受体活性可以通过位置3处的氨基酸修饰减少，例如，由任何氨基酸取代位置3处的天然存在的谷氨酸。由酸性、碱性或疏水性氨基酸(谷氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸)在该位置的取代已经证实基本上减少或破坏胰高血糖素受体活性。在这种情况下，包含位置3处的取代的这种肽的聚乙二醇化增加了胰高血糖素受体活性。
允许在位置12至29处的氨基酸侧链之间形成分子内桥的修饰提供了被位置1和2处的氨基酸修饰减少的胰高血糖素活性的恢复。例如，可以通过共价键在位置i与i+4处的两个氨基酸侧链之间，或在位置j与j+3处的两个氨基酸侧链之间，或在位置k与k+7处的两个氨基酸侧链之间形成分子内桥。在其他实施方案中，能够在这些位置，在带正电荷的氨基酸与带负电荷的氨基酸之间形成诸如盐桥的非共价相互作用。
影响GLP-1活性的修饰
通过由诸如酰胺或酯的电中性基团代替C-末端氨基酸的羧酸来提供对GLP-1受体的增强的活性。
如本文另外所述的，还通过稳定胰高血糖素的C-末端部分的α-螺旋结构(氨基酸12至29附近)来提供对GLP-1受体的增强的活性，例如通过在两个氨基酸的侧链之间形成分子内桥，或者由α螺旋稳定氨基酸(如，α，α-二取代的氨基酸)取代和/或插入位置12-29附近的氨基酸。在示例性实施方案中，将氨基酸对12与16、13与17、16与20、17与21、20与24或24与28(i＝12、16、20或24的氨基酸对)的侧链互相连接因而稳定胰高血糖素α螺旋。在某些实施方案中，桥或连接物的长度为约8(或约7-9)个原子，特别是当桥在位置i与i+4之间时。在某些实施方案中，桥或连接的长度为约6(或约5-7)个原子，特别是当桥在位置j与j+3之间时。
在某些实施方案中，通过以下方法形成分子内桥：(a)由谷氨酸，或者由具有长度为4个原子的侧链的其他带负电荷的氨基酸；或由谷氨酰胺、高谷氨酸或高半胱磺酸的任一氨基酸；或由具有长度为约4(或3-5)个原子的侧链的带电荷的氨基酸，该侧链含有至少一个杂原子(如，N、O、S、P)，取代位置16处的天然存在的丝氨酸；以及(b)由诸如赖氨酸、瓜氨酸、精氨酸或鸟氨酸的另一亲水氨基酸取代位置20处的天然存在的谷氨酰胺，该亲水氨基酸具有带电荷的或能够形成氢键，并且长度为至少约5(或约4至6)个原子的侧链。位置16和20的这样的氨基酸的侧链可以形成盐桥或者共价连接。在一实施方案中，两个氨基酸互相结合，形成内酰胺环。
在某些实施方案中，稳定胰高血糖素肽C-末端部分的α螺旋结构，通过形成分子内桥而不是内酰胺桥来实现。例如，合适的共价键合方法包括烯烃置换、基于羊毛硫氨酸的环化、二硫键或修饰的含硫桥的形成、使用α，ω-二氨基链烷系链、形成金属原子桥以及用于稳定α螺旋的肽环化的其他方法中的任一种或多种。
仍然在其他实施方案中，在保留期望活性的位置，将一个或多个α，α-二取代的氨基酸插入或取代入该C-末端部分(氨基酸12-29)。例如，由诸如AIB的α，α-二取代的氨基酸取代位置16、20、21或24的1个、2个、3个或全部位置。
如本文所述，由位置20处的氨基酸修饰提供对GLP-1受体的增加的活性。
通过向C-末端添加GPSSGAPPPS(SEQIDNO：895)或XGPSSGAPPPS(SEQIDNO：896)，提供对GLP-1受体的增加的活性。如本文所述，可以通过修饰位置18、28或29处或者位置28和29处的氨基酸进一步增加这样的类似物中的GLP-1活性。
通过将位置10处的氨基酸修饰为任选Trp的大芳香氨基酸残基进一步适度地增加GLP-1效力。
如本文所述，例如，通过位置7处的氨基酸修饰提供了对GLP-1受体的减少的活性。
可以通过由丙氨酸取代位置18处的天然精氨酸进一步增强对GLP-1受体的效力。
任何上文所述的关于2类胰高血糖素相关的类似物肽的修饰可以单独或组合应用，该修饰增加GLP-1受体活性。增加GLP-1受体活性的修饰的组合通常比单独采用的任何这些修饰提供更高的GLP-1活性。例如，本发明提供了胰高血糖素肽，其在位置16、在位置20和在C-末端羧酸基团处包含修饰，并且任选地在位置16与20处的氨基酸之间具有共价键；胰高血糖素肽，其在位置16和在C-末端羧酸基团处包含修饰；胰高血糖素肽，其在位置16和20处包含修饰，并且任选地在位置16与20的氨基酸之间具有共价键；以及胰高血糖素肽，其在位置20处和在C-末端羧酸基团处包含修饰。
改善DPP-IV抗性的修饰
位置1和/或2处的修饰可以增加肽对二肽基肽酶IV(DPPIV)切割的抗性。例如，如本文所述，可以由DPP-IV抗性氨基酸取代位置1和/或位置2。在一实施方案中，由N-甲基丙氨酸取代位置2处的氨基酸。
据观察，位置2处的修饰(如，位置2处的AIB)和在某些情况下的位置1处的修饰(如，位置1处的DMIA)可以减少胰高血糖素活性，有时明显减少，令人吃惊的是，这种胰高血糖素活性减少可以通过稳定胰高血糖素C-末端部分的α-螺旋结构(氨基酸12-29附近)而恢复，例如，如本文所述，通过在两个氨基酸侧链之间形成共价键。在某些实施方案中，共价键在位置“i”与“i+4”的氨基酸之间，或者位置“j”与“j+3”的氨基酸之间，例如在位置12与16、16与20、20与24、24与28或17与20之间。在示例性实施方案中，该共价键为位置16处的谷氨酸与位置20处的赖氨酸之间的内酰胺桥。在某些实施方案中，如本文所述，该共价键为除了内酰胺桥以外的分子内桥。
减少降解的修饰
仍然在其他示例性实施方案中，可以通过修饰SEQIDNO：801的位置15和/或16处的氨基酸进一步修饰任何2类胰高血糖素相关的类似物肽，以改善稳定性从而减少随时间的降解，特别是酸性或碱性缓冲液中的降解。这样的修饰减少了Asp15-Ser16肽键的切割。在示例性实施方案中，位置15处的氨基酸修饰为缺失或者由谷氨酸、高谷氨酸、半胱磺酸或高半胱磺酸取代Asp。在其他示例性实施方案中，位置16处的氨基酸修饰为缺失或者由Thr或AIB取代Ser。在其他示例性实施方案中，由谷氨酸；或者由具有长度为4个原子的侧链的其他带负电荷的氨基酸；或者由谷氨酰胺、高谷氨酸或高半胱磺酸的任一氨基酸取代位置16处的Ser。
在某些实施方案中，存在于天然肽的位置27处的甲硫氨酸残基通过例如缺失或取代而修饰。这样的修饰可以防止肽的氧化降解。在某些实施方案中，由亮氨酸、异亮氨酸或正亮氨酸取代位置27处的Met。在某些具体实施方案中，由亮氨酸或正亮氨酸取代位置27处的Met。
在某些实施方案中，位置20和/或24处的Gln例如通过缺失或取代而修饰。这样的修饰可以减少通过Gln的脱酰胺而发生的降解。在某些实施方案中，由Ala或AIB取代位置20和/或24处的Gln。在某些实施方案中，由Lys、Arg、Orn或瓜氨酸取代位置20和/或24处的Gln。
在某些实施方案中，位置21处的Asp例如通过缺失或取代而修饰。这样的修饰可以减少通过Asp脱水形成环琥珀酰亚胺中间体然后异构化为异天冬氨酸而发生的降解。在某些实施方案中，由Glu、高谷氨酸或高半胱磺酸取代位置21。在某些具体实施方案中，由Glu取代位置21。
α-螺旋结构的稳定
2类胰高血糖素相关的类似物肽C-末端部分的α-螺旋结构(氨基酸12-29附近)的稳定，提供了增强的GLP-1和/或GIP活性，并且恢复了由位置1和/或2处的氨基酸修饰减少的胰高血糖素活性。可以通过例如形成共价或非共价分子内桥，或者由α螺旋稳定氨基酸(如，α，α-二取代的氨基酸)取代和/或插入位置12-29附近的氨基酸。GIP激动剂的α-螺旋结构的稳定可以如本文所述来实现。
酰化和烷基化
根据某些实施方案，如本文所述，本文公开的胰高血糖素肽修饰为包含酰基或烷基。酰化或烷基化可以增加胰高血糖素肽在循环中的半衰期。酰化或烷基化可以有利地延缓起效和/或延长对胰高血糖素受体和/或GLP-1受体作用的持续时间和/或改善对诸如DPP-IV的蛋白酶的抗性和/或改善溶解性。可以在酰化后保持胰高血糖素肽对胰高血糖素受体和/或GLP-1受体和/或GIP受体的活性。在某些实施方案中，酰化的胰高血糖素肽的效力与未酰化形式的胰高血糖素肽相当。如本文所述，可以在连接亲水部分的相同氨基酸位置，或在不同的氨基酸位置，将2类胰高血糖素相关的类似物肽酰化或烷基化。
在某些实施方案中，本发明提供了胰高血糖素肽，其经修饰包含共价连接至胰高血糖素肽的位置10处的氨基酸的酰基或烷基。胰高血糖素肽还可以包含胰高血糖素肽的位置10处的氨基酸与酰基或烷基之间的间隔物。在某些实施方案中，酰基为脂肪酸或胆汁酸，或它们的盐，如C4至C30脂肪酸、C8至C24脂肪酸、胆酸、C4至C30烷基、C8至C24烷基或者包含胆汁酸的类固醇部分的烷基。间隔物为任何部分，其具有用于连接酰基或烷基的合适的反应性基团。在示例性实施方案中，间隔物包括氨基酸、二肽、三肽、亲水双官能间隔物。在某些实施方案中，间隔物选自：Trp、Glu、Asp、Cys和包含NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH的间隔物，其中m为1至6的任何整数，并且n为2至12的任何整数。这样的酰化或烷基化的胰高血糖素肽还可以进一步包含亲水部分，任选地聚乙二醇。任何前述胰高血糖素肽都可以包含两个酰基或两个烷基或其组合。
偶联物和融合
如本文所述，可以任选地经由共价键合以及任选地经由连接物将GIP激动剂连接至偶联物部分。
在其他实施方案中，第二肽为XGPSSGAPPPS(SEQIDNO：896)，其中X选自20种常见氨基酸之一，如谷氨酸、天冬氨酸或甘氨酸。在一实施方案中，X代表诸如Cys的氨基酸，其还包含共价连接至该氨基酸的侧链的亲水部分。这样的C-末端延伸改善溶解性，并且还可以改善GIP活性或GLP-1活性。在某些实施方案中，其中胰高血糖素肽还包含羧基末端延伸，延伸的羧基末端氨基酸以酰胺基团或酯基团而不是羧酸为结尾。
在某些实施方案中，例如在包含C-末端延伸的胰高血糖素肽中，由甘氨酸代替天然胰高血糖素肽的位置29处的苏氨酸。例如，胰高血糖素肽，其具有取代位置29处的苏氨酸的甘氨酸并且包含GPSSGAPPPS(SEQIDNO：895)的C-末端延伸，对GLP-1受体的效力是被修饰为包含相同的C-末端延伸的天然胰高血糖素的4倍。T29G取代可以用于与本文公开的其他修饰联合以增强胰高血糖素肽对GLP-1受体的亲和力。例如，如本文所述，T29G取代可以与S16E和N20K氨基酸取代组合，任选地与氨基酸16与20之间的内酰胺桥组合，并且任选地与添加EPG链组合。
在某些实施方案中，向C-末端添加氨基酸，并且另外的氨基酸选自谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸。
增强溶解性的修饰
在另一实施方案中，任何胰高血糖素肽的溶解性可以通过向肽的C-末端部分，优选地在位于SEQIDNO：801的位置27的C-末端位置处引入带电荷的氨基酸的氨基酸取代和/或增加来改善。任选地，可以向C-末端部分，优选位置27的C-末端引入1、2或3个带电荷的氨基酸。在某些实施方案中，由1个或2个带电荷的氨基酸取代位置28和/或29处的天然氨基酸，和/或在另一实施方案中，还向肽的C-末端添加1至3个带电荷的氨基酸。在示例性实施方案中，1、2个或全部带电荷的氨基酸是带负电荷的的。在某些实施方案中，带负电荷的氨基酸(酸性氨基酸)为天冬氨酸或谷氨酸。
可以对胰高血糖素肽进行诸如保守性取代的其他修饰，该修饰仍然允许胰高血糖素肽保留GIP活性(和任选的GLP-1活性和/或胰高血糖素活性)。
其他修饰
任何上文所述的关于2类肽的修饰可以单独或组合应用，该修饰增加或降低GIP活性，增加或降低胰高血糖素受体活性和增加GLP-1受体活性。如本文关于2类胰高血糖素相关的类似物肽所述，任何上文所述的关于2类胰高血糖素相关的类似物肽的修饰还可以与其他修饰组合，该其他修饰赋予其他期望的属性，例如，增加的溶解性和/或稳定性和/或作用持续时间。或者，任何上文所述的关于2类胰高血糖素相关的类似物肽的修饰可以与本文关于2类胰高血糖素相关的类似物肽所述的其他修饰组合，该其他修饰基本上不影响溶解性或稳定性或活性。示例性的修饰包括但不限于：
(A)例如，通过向天然胰高血糖素的C-末端部分，优选地在位于位置27的C-末端的位置处引入1、2、3个或更多个带电荷的氨基酸，改善溶解性。这样的带电荷的氨基酸可以通过由带电荷的氨基酸取代位置28或29处的天然氨基酸，或者通过在例如，在位置27、28或29后添加带电荷的氨基酸来引入。在示例性实施方案中，1、2、3个或全部带电荷的氨基酸是带负电荷的。在其他实施方案中，1、2、3个或全部带电荷的氨基酸是带正电荷的。这样的修饰增加了溶解性，例如，当于25℃下24小时后进行测量时，在约5.5至8的给定pH，如pH为7的条件下，提供了相对于天然胰高血糖素至少2倍、5倍、10倍、15倍、25倍、30倍或更高的溶解性。
(B)如本文所述，通过例如在位置16、17、20、21、24或29处，在C-末端延伸内或者在肽的C-末端氨基酸处，添加诸如聚乙二醇链的亲水部分，增加溶解性和作用持续时间或循环中的半衰期。
(C)，如本文所述，通过胰高血糖素肽的酰化或烷基化，增加溶解性和/或作用持续时间或循环中的半衰期和/或延缓起作用。
(D)如本文所述通过在位置1或2处的氨基酸的修饰引入对二肽基肽酶IV(DPPIV)的抗性，增加作用持续时间或循环中的半衰期。
(E)通过修饰位置15处的Asp，例如，通过缺失或由谷氨酸、高谷氨酸、半胱磺酸或高半胱磺酸取代，增加稳定性。这样的修饰在5.5至8的pH下可以减少降解或切割，例如于25℃下24小时后，保留至少75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的原始肽。这样的修饰减少了Asp15-Ser16之间的肽键的切割。
(F)通过位置16处的Ser的修饰，例如通过由Thr或AIB取代，增加稳定性。这样的修饰也可以减少Asp15-Ser16之间的肽键的切割。
(G)通过位置27处的甲硫氨酸的修饰，例如通过由亮氨酸或正亮氨酸取代，增加稳定性。这样的修饰可以减少氧化降解。还可以通过位置20或24处的Gln的修饰，例如通过由Ala或AIB取代来增加稳定性。这样的修饰可以减少通过Gln的脱酰胺发生的降解。可以通过位置21处的Asp的修饰，例如通过由Glu取代来增加稳定性。这样的修饰可以减少通过Asp脱水形成环琥珀酰亚胺中间体然后异构化为异天冬氨酸而发生的降解。
(H)基本上不影响活性的非保守性或保守性取代、添加或缺失：例如，位置2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29的一个或多个位置处的保守性取代；由Ala取代这些位置中的一个或多个；位置27、28或29的一个或多个位置处的氨基酸缺失；任选地与代替C-末端羧酸基团的C-末端酰胺或酯组合的氨基酸29的缺失；由Arg取代位置12处的Lys；由Val或Phe取代位置10处的Tyr。
通过向C-末端添加GPSSGAPPPS(SEQIDNO：895)来提供聚乙二醇化后的活性保留。
可以修饰天然胰高血糖素肽的某些位置，同时保留至少某些母体肽的活性。因此，申请人认为可以由不同于存在于天然胰高血糖素肽中的氨基酸的氨基酸取代位于位置2、5、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29处的一个或多个氨基酸，并且仍然保留对胰高血糖素受体的活性。
在某些实施方案中，由选自Ala、Ser或Thr的氨基酸取代位置18。在某些实施方案中，由Lys、Arg、Orn、瓜氨酸或AIB取代位置20处的氨基酸。在某些实施方案中，由Glu、高谷氨酸或高半胱磺酸取代位置21。在某些实施方案中，胰高血糖素肽包含选自位置16、17、18、20、21、23、24、27、28和29的1至10个氨基酸修饰。在示例性实施方案中，修饰为选自Gln17、Ala18、Glu21、Ile23、Ala24、Val27和Gly29的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，选自位置17-26的1-2个氨基酸不同于母体肽。在其他实施方案中，选自位置17-22的1-2个氨基酸不同于母体肽。仍然在其他实施方案中，修饰为Gln17、Ala18、Glu21、Ile23和Ala24。
在某些实施方案中，向胰高血糖素肽的羧基末端添加一个或多个氨基酸。氨基酸通常选自20种常见的氨基酸之一，并且在某些实施方案中，氨基酸具有代替天然氨基酸的羧酸的酰胺基团。在示例性实施方案中，添加的氨基酸选自谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸。
不破坏活性的其他修饰包括W10或R20。
在某些实施方案中，本文公开的2类胰高血糖素相关的类似物肽通过截断C-末端的1或2个氨基酸残基来修饰，但仍然保留对胰高血糖素受体、GLP-1受体和/或GIP受体的活性和效力。
在这一点上，位置29和/或28处的氨基酸可以缺失。
示例性实施方案
在某些实施方案中，2类胰高血糖素相关的类似物肽为具有GIP激动剂活性的胰高血糖素(SEQIDNO：801)的类似物，其具有以下修饰：
(a)位置1处的氨基酸修饰；
(b)(i)位置i与i+4的氨基酸侧链之间或者位置j与j+3的氨基酸侧链之间的内酰胺桥，其中i为12、13、16、17、20或24，并且其中j为17；或者(ii)由α，α-二取代的氨基酸取代位置16、20、21或24处的1、2、3个或全部氨基酸；
(c)位置27、28和29处的1、2个或全部氨基酸修饰；以及
(d)1、2、3、4、5、6或8个其他的氨基酸修饰，其中类似物对GIP受体激活的EC50为约100nM或更低。
在示例性实施方案中，
(a)位置1处的氨基酸修饰是由大芳香氨基酸取代位置1处的His，该大芳香氨基酸任选为Tyr、Phe、Trp、氨基-Phe、硝基-Phe、氯-Phe、磺基-Phe、4-吡啶基-Ala、甲基-Tyr或3-氨基Tyr；
(b)(i)内酰胺桥位于位置16与20处的氨基酸之间，其中由Glu取代位置16和20处的氨基酸之一，并且由Lys取代位置16和20处的另一氨基酸，或者(ii)α，α-二取代的氨基酸为AIB；
(c)由任选Leu的大脂肪族氨基酸取代位置27处的Met；
(d)由任选Ala的小脂肪族氨基酸取代位置28处的Asn；以及
(e)由任选Gly的小脂肪族氨基酸取代位置29处的Thr。
类似物可以包含其他修饰，包括但不限于：
(a)位置12处的氨基酸修饰，任选地由Ile取代；
(b)位置17和18处的氨基酸修饰，任选地由Q在位置17处和A在位置18处取代；
(c)向C-末端添加GPSSGAPPPS(SEQIDNO：895)；或者上述的任何组合。
可选地或另外，类似物可以包含其他修饰，包括但不限于：
(a)由D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、AIB、Val或氨基-异丁酸取代位置2处的Ser；
(b)由Trp、Lys、Orn、Glu、Phe或Val取代位置10处的Tyr；
(c)酰基与位置10处的Lys的连接；
(d)由Arg取代位置12处的Lys；
(e)由Glu、Gln、高谷氨酸、高半胱磺酸、Thr、Gly或AIB取代位置16处的Ser；
(f)由Gln、Lys或Glu取代位置17处的Arg；
(g)由Ala、Ser、Thr或Gly取代位置18处的Arg；
(h)由Ala、Lys、瓜氨酸、Arg、Orn或AIB取代位置20处的Gln；
(i)由Glu、高谷氨酸、高半胱磺酸取代位置21处的Asp；
(j)由Ile取代位置23处的Val；
(k)由Asn、Ala、Glu、Lys或AIB取代位置24处的Gln；以及
(l)位置2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28和29的任何位置处的保守性取代；或者上述的任何组合。
在某些实施方案中，2类胰高血糖素相关的类似物肽在任何氨基酸位置16、17、20、21、24或29处，在位置29后的C-末端延伸内添加的氨基酸(如，位置30)处，或者在C-末端氨基酸处共价连接至亲水部分。在示例性实施方案中，该亲水部分在任何这些位置共价连接至Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸或乙酰基-苯丙氨酸残基。示例性亲水部分包括聚乙二醇(PEG)，其分子量为，例如约1,000道尔顿至约40,000道尔顿或约20,000道尔顿至约40,000道尔顿。
GIP激动剂可以为包含诸如SEQIDNOs：805-894的任何氨基酸序列的氨基酸序列的肽，并且任选地具有保留GIP激动剂活性的高达1、2、3、4或个其他修饰。
3类胰高血糖素相关的类似物肽
在某些实施方案中，胰高血糖素相关的类似物肽为3类胰高血糖素相关的类似物肽，其描述于本文和2008年8月21日公开的国际专利申请公开WO2008/101017以及美国临时申请61/090,412号中，这些参考文献的内容通过引用整体并入本文。
活性
3类胰高血糖素相关的类似物肽可以为对胰高血糖素受体表现出增加的活性的肽，并且在另外的实施方案中表现出增强的生物物理稳定性和/或水溶性。另外，在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽丧失了天然胰高血糖素对胰高血糖素受体相对GLP-1受体的选择性，因此代表这两种受体的共激动剂。3类胰高血糖素相关的类似物肽中选择的氨基酸修饰可以控制肽对GLP-1受体相对胰高血糖素受体的相对活性。因此，3类胰高血糖素相关的类似物肽可以为胰高血糖素/GLP-1共激动剂，其对胰高血糖素受体的活性比对GLP-1受体的活性更高；胰高血糖素/GLP-1共激动剂，其对两种受体的活性大约相当；或者胰高血糖素/GLP-1共激动剂，其对GLP-1受体的活性比对胰高血糖素受体的活性更高。后一类共激动剂经改造可以对胰高血糖素受体表现出很少的活性或没有活性，但是仍然保留以与天然GLP-1相同或更好的效力激活GLP-1受体的能力。任何这些共激动剂还可以包含赋予增强的生物物理稳定性和/或水溶性的修饰。
可以对3类胰高血糖素相关的类似物的肽进行修饰，以产生胰高血糖素肽，其对GLP-1受体的活性相对于天然GLP-1为至少约10％至约200％的任意值(包括至少约20％、30％、40％、50％、60％、75％、100％、125％、150％、175％)或者更高；并且对胰高血糖素受体的活性相对于天然胰高血糖素为至少约10％至约500％的任意值(包括约20％、30％、40％、50％、60％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％)或者更高。天然胰高血糖素的氨基酸序列为SEQIDNO：1，GLP-1(7-36)酰胺的氨基酸序列为SEQIDNO：52，并且GLP-1(7-37)酸的氨基酸序列为SEQIDNO：50。在示例性实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽可以表现出至少10％的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性和至少50％的天然GLP-1对GLP-1受体的活性，或者至少40％的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性和至少40％的天然GLP-1对GLP-1受体的活性，或者至少60％的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性和至少60％的天然GLP-1对GLP-1受体的活性。
3类胰高血糖素相关的类似物肽对胰高血糖素受体相对GLP-1受体的选择性，可以描述为胰高血糖素/GLP-1活性的相对比率(肽相对于天然胰高血糖素对胰高血糖素受的活性除以肽相对于天然GLP-1对GLP-1受体的活性)。例如，表现出60％的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性和60％的天然GLP-1对GLP-1受体的活性的3类胰高血糖素相关的类似物肽具有1∶1比率的胰高血糖素/GLP-1活性。胰高血糖素/GLP-1活性的示例性比率包括约1∶1、1.5∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1or10∶1，或约1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2或1∶1.5。作为实例，10∶1的胰高血糖素/GLP-1活性比率表示对胰高血糖素受体的选择性为对GLP-1受体的选择性的10倍。类似地，10∶1的GLP-1/胰高血糖素活性比率表示对GLP-1受体的选择性为对胰高血糖素受体选择性的10倍。
在某些实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽具有约10％或更少的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性，例如约1％-10％或约0.1％-10％或者大于约0.1％但小于约10％，同时表现出至少20％的GLP-1对GLP-1受体的活性。例如，本文所述的示例性3类胰高血糖素相关的类似物肽具有约0.5％、约1％或约7％的天然胰高血糖素的活性，同时表现出至少20％的GLP-1对GLP-1受体的活性。
3类胰高血糖素相关的类似物肽可以为对胰高血糖素受体或GLP-1受体或这两者的活性增加或降低的胰高血糖素肽。3类胰高血糖素相关的类似物肽可以为，对胰高血糖素受体相对GLP-1受体的选择性发生改变的胰高血糖素肽。
因此，如本文所公开的，提供了高效3类胰高血糖素相关的类似物肽，其还表现出改善的溶解性和/或稳定性。示例性高效3类胰高血糖素相关的类似物肽表现出约200％的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性，并且任选地在pH值为6至8或6至9或7至9(如，pH值为7)的条件下可溶的浓度为至少1mg/mL，并且任选地于25℃下24小时后，保留至少95％的原始肽(如，5％或更少的原始肽被降解或切割)。作为另一实例，示例性3类胰高血糖素相关的类似物肽表现出大于约40％或大于约60％的对胰高血糖素受体和GLP-1受体两者的活性(比率为约1∶3至3∶1，或者约1∶2至2∶1)，任选地在pH值为6至8或6至9或7至9(如，pH值为7)的条件下可溶的浓度为至少1mg/mL，并且任选地于25℃下24小时后，保留至少95％的原始肽。另一示例性3类胰高血糖素相关的类似物肽表现出约175％或更高的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性和约20％或更低的天然GLP-1对GLP-1受体的活性，任选地在pH值为6至8或6至9或7至9(如，pH值为7)的条件下可溶的浓度为至少1mg/mL，并且任选地于25℃下24小时后，保留至少95％的原始肽。仍然另一示例性3类胰高血糖素相关的类似物肽表现出约10％或更低的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性和至少约20％的天然GLP-1对GLP-1受体的活性，任选地在pH值为6至8或6至9或7至9(如，pH值为7)的条件下可溶的浓度为至少1mg/mL，并且任选地于25℃下24小时后，保留至少95％的原始肽。仍然另一示例性3类胰高血糖素相关的类似物肽表现出约10％或更低但高于0.1％、0.5％或1％的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性和至少约50％、60％、70％、80％、90％或100％或者更高的天然GLP-1对LP-1受体的活性，任选地在pH值为6至8或6至9或7至9(如，pH值为7)的条件下可溶的浓度为至少1mg/mL，并且任选地于25℃下24小时后，保留至少95％的原始肽。在某些实施方案中，这样的3类胰高血糖素相关的类似物肽在天然胰高血糖素的相应位置处保留至少22、23、24、25、26、27或28个天然存在的氨基酸(如，具有相对于天然存在的胰高血糖素，具有1-7、1-5或1-3个修饰)。
影响胰高血糖素活性的修饰
由天然胰高血糖素(SEQIDNO：1)的位置16处的氨基酸修饰提供了对胰高血糖素受体的增加的活性。在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽为胰高血糖素激动剂，其已经相对于His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(SEQIDNO：1)的野生型肽已受到修饰，以增强肽对胰高血糖素受体的效力。对于其在验证的体外模型测定(参见实施例2)中刺激cAMP合成的能力，天然胰高血糖素(SEQIDNO：1)的位置16处的通常存在的丝氨酸可以由选择的酸性氨基酸取代以增强胰高血糖素的效力。更具体而言，这种取代将类似物对胰高血糖素受体的效力增强了至少2倍、4倍、5倍并且高达10倍多。这种取代还将类似物对GLP-1受体的活性相对于天然胰高血糖素增强至少5倍、10倍或15倍，但是保持对胰高血糖素受体的选择性高于对GLP-1受体的选择性。
作为非限制性实例，这样的增强的效力可以通过由谷氨酸；或由具有长度为4个原子的侧链的其他带负电荷的氨基酸；或由谷氨酰胺、高谷氨酸或高半胱磺酸的任一氨基酸；或由具有长度为约4(或3至5)个原子的侧链的带电荷的氨基酸，该侧链含有至少一个杂原子(如，N、O、S、P)，取代位置16处的天然存在的丝氨酸来提供。根据一实施方案，天然胰高血糖素的位置16处的丝氨酸残基由选自谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸、高半胱磺酸、苏氨酸或甘氨酸的氨基酸取代。根据一实施方案，天然胰高血糖素的位置16处的丝氨酸残基由选自谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸和高半胱磺酸的氨基酸取代，并且在一实施方案中，丝氨酸残基由谷氨酸取代。
在一实施方案中，增强效力的3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7的肽或者SEQIDNO：5的胰高血糖素激动剂类似物。根据一实施方案，提供了3类胰高血糖素相关的类似物肽，其相对于野生型胰高血糖素对胰高血糖素受体的效力增强，其中该肽包含SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9或SEQIDNO：10的序列，其中胰高血糖素肽相对于GLP-1受体保留其对胰高血糖素受体的选择性。在一实施方案中，对胰高血糖素受体的特异性增强的3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10的肽或其胰高血糖素激动剂类似物，其中羧基末端氨基酸保留其天然羧酸基团。根据一实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-COOH(SEQIDNO：10)的序列，其中如通过实施例2的体外cAMP测定所测量的，该肽相对于天然胰高血糖素表现出对胰高血糖素受体的效力约增强5倍。
例如，通过位置3处的氨基酸修饰，提供了对胰高血糖素受体减少的活性。由酸性、碱性或疏水性氨基酸(谷氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸)在该位置的取代已经证实基本上减少或破坏胰高血糖素受体活性。特别是，可以修饰本文所述的任何3类胰高血糖素相关的类似物肽，包括胰高血糖素类似物、胰高血糖素激动剂类似物、胰高血糖素共激动剂和胰高血糖素/GLP-1共激动剂分子在内，以含有位置3处的修饰，例如，由Glu取代Gln，以产生与对胰高血糖素受体相比，具有对GLP-1受体的高选择性诸如10倍选择性的肽。
据观察，位置2处的修饰(如，位置2处的AIB)和某些情况下位置1处的修饰可以减少胰高血糖素活性。这种胰高血糖素活性减少可以由稳定胰高血糖素C-末端的α-螺旋恢复，例如通过本文所述的方法，如通过位置“i”与“i+4”的氨基酸之间的共价键，如12与16、16与20或者20与24的氨基酸之间的共价键。在某些实施方案中，该共价键为位置16处的谷氨酸与位置20处的赖氨酸之间的内酰胺桥。在某些实施方案中，该共价键为除了内酰胺桥以外的分子内桥。例如，合适的共价键合方法包括烯烃置换、基于羊毛硫氨酸的环化、二硫键或修饰的含硫桥的形成、使用α，ω-二氨基链烷系链、形成金属原子桥以及肽环化的其他方法中的任一种或多种。
影响GLP-1活性的修饰
通过由诸如酰胺或酯的电中性基团代替C-末端氨基酸的羧酸，提供了对GLP-1受体的增强的活性。在一实施方案中，这些3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：20的序列，其中羧基末端氨基酸具有代替在天然氨基酸中发现的羧酸基团的酰胺基团。这些3类胰高血糖素相关的类似物肽对胰高血糖素受体和GLP-1受体两者都具有强烈的活性，因此充当这两种受体的共激动剂。根据一实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽为胰高血糖素受体和GLP-1受体共激动剂，其中该肽包含SEQIDNO：20的序列，其中位置28处的氨基酸为Asn或Lys，并且位置29处的氨基酸为Thr-酰胺。
通过稳定胰高血糖素C-末端部分的α螺旋(如，残基12至29附近)的修饰，提供了对GLP-1受体的增加的活性。
在某些实施方案中，这样的修饰允许在两个氨基酸的侧链之间形成分子内桥，该两个氨基酸被3个居间氨基酸隔开(即，位置“i”处的氨基酸与位置“i+4”处的氨基酸，其中i为12至25的任意整数)，被2个居间氨基酸隔开(即，位置“j”处的氨基酸与位置“j+3”处的氨基酸，其中i为12至27的任意整数)，或者被6个居间氨基酸隔开(即，位置“k”处的氨基酸与位置“k+7”处的氨基酸，其中k为12至22的任意整数)。在示例性实施方案中，桥或连接物的长度为约8(或约7-9)个原子，并且在位置12与16处的氨基酸的侧链之间形成，或者在位置16与20处的氨基酸的侧链之间形成，或者在位置20与24之间的氨基酸的侧链之间形成，或者在位置24与28处的氨基酸的侧链之间形成。两个氨基酸侧链可以通过氢键、诸如形成盐桥的离子相互作用或者共价键互相连接。
根据一实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽表现出胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂活性，并且包含选自SEQIDNO：11、47、48和49的氨基酸序列。在一实施方案中，侧链相互共价结合，并且在一实施方案中，两个氨基酸互相结合，形成内酰胺环。
根据一实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：45，其中氨基酸对的侧链之间形成至少一个内酰胺环，该氨基酸对选自氨基酸对12与16、16与20、20与24或24与28。在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：20的胰高血糖素肽类似物，其中该肽包含在氨基酸位置12与16之间或氨基酸位置16与20之间形成的分子内内酰胺桥。在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：20的序列，其中在氨基酸位置12与16之间、氨基酸位置16与20之间或者氨基酸位置20与24之间形成分子内内酰胺桥，并且位置29处的氨基酸为甘氨酸，其中SEQIDNO：29的序列连接至SEQIDNO：20的C-末端氨基酸。在另一实施方案中，位置28处的氨基酸为天冬氨酸。
在某些具体实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽C-末端部分中的α螺旋结构的稳定，通过形成除了内酰胺桥以外的分子内桥来实现。例如，合适的共价键合方法包括烯烃置换、基于羊毛硫氨酸的环化、二硫键或修饰的含硫桥的形成、使用α，ω-二氨基链烷系链、形成金属原子桥以及用于稳定α螺旋的肽环化的其他方法中的任一种或多种。
而且，可以通过在保留期望活性的位置引入一个或多个α，α-二取代的氨基酸来稳定胰高血糖素肽C-末端部分中的α-螺旋结构(氨基酸12-29附近)，实现对GLP-1受体的增强的活性。在某些方面，以这种方式在不引入诸如盐桥的分子内桥或共价键的情况下，实现α-螺旋的稳定。在某些实施方案中，由α，α-二取代的氨基酸取代胰高血糖素肽的位置16、17、18、19、20、21、24或29的1、2、3、4或更多个位置。例如，由氨基异丁酸(AIB)取代3类胰高血糖素相关的类似物肽的位置16，在不存在盐桥或内酰胺的情况下，增强了GLP-1活性。在某些实施方案中，由AIB取代位置16、20、21或24的1、2、3或更多个位置。
可以通过位置20处的氨基酸修饰实现对GLP-1受体的增强的活性。在一实施方案中，由具有侧链的另一亲水氨基酸代替位置20处的谷氨酰胺，该侧链为带电荷的或者具有形成氢键的能力，并且长度为至少约5(或约4-6)个原子，该亲水氨基酸为例如赖氨酸、瓜氨酸、精氨酸或鸟氨酸。
在包含SEQIDNO：26的C-末端延伸的3类胰高血糖素相关的类似物肽中证明了对GLP-1受体的增加的活性。如本文所述，包含SEQIDNO：26的这样的3类胰高血糖素相关的类似物肽中的GLP-1活性可以通过修饰位置18、28或29处的氨基酸或者位置18和29处的氨基酸进一步增加。
GLP-1效力的进一步适当增加可以通过将位置10处的氨基酸修饰为Trp来实现。
增加GLP-1受体活性的修饰的组合通常比单独采用的任何这样的修饰提供更高的GLP-1活性。例如，3类胰高血糖素相关的类似物肽可以包含位置16处、位置20处和C-末端羧酸基团处的修饰，并且任选地具有位置16与20处的氨基酸之间的共价键；可以包含位置16处和C-末端羧酸基团处的修饰；可以包含位置16和20处的修饰，并且任选地具有位置16与20处的氨基酸之间的共价键；或者可以包含位置20处和C-末端羧酸基团的修饰；并且任选地条件是：位置12处的氨基酸不是Arg；或者条件是：位置9处的氨基酸不是Glu。
影响溶解性的修饰
添加亲水部分
可以进一步修饰3类胰高血糖素相关的类似物肽，以改善肽在生理pH值下水溶液中的溶解性和稳定性，同时保持相对于天然胰高血糖素的高生物活性。如本文进一步所讨论的，本文所讨论的亲水部分可以连接至3类胰高血糖素相关的类似物肽。
根据一实施方案，预料在包含SEQIDNO：9或SEQIDNO：10的3类胰高血糖素相关的类似物肽的位置17、21和24处引入亲水基团，改善高效胰高血糖素类似物在具有生理pH值的溶液中的溶解性和稳定性。这些基团的引入还增加了例如通过延长的循环中半衰期所测量的作用持续时间。
在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含选自SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18和SEQIDNO：19的序列，其中所述3类胰高血糖素相关的类似物肽的位置16、17、21或24之一处的氨基酸残基的侧链还包含分子量为约500道尔顿至约40,000道尔顿的聚乙二醇链。在一实施方案中，聚乙二醇链的分子量为约500道尔顿至约5,000道尔顿。在另一实施方案中，聚乙二醇链的分子量为约10,000道尔顿至约20,000道尔顿。仍然在其他示例性实施方案中，聚乙二醇链的分子量为约20,000道尔顿至约40,000道尔顿。
合适的亲水部分包括本领域已知的任何水溶性聚合物，包括本文所述的亲水部分、PEG的均聚物或共聚物以及PEG的单甲基取代的聚合物(mPEG)。根据一实施方案，亲水部分包括聚乙烯(PEG)链。更具体而言，在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：6或SEQIDNO：7的序列，其中PEG链共价连接至存在于3类胰高血糖素相关的类似物肽的位置21和24处的氨基酸的侧链，并且3类胰高血糖素相关的类似物肽的羧基末端氨基酸具有羧酸基团。根据一实施方案，聚乙二醇链的平均分子量为约500道尔顿至约10,000道尔顿。
根据一实施方案，聚乙二醇化的3类胰高血糖素相关的类似物肽包含2条或更多条共价连接至3类胰高血糖素相关的类似物肽的聚乙烯链，其中胰高血糖素链的总分子量为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿。在一实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含由SEQIDNO：5组成的肽或者SEQIDNO：5的胰高血糖素激动剂类似物，其中PEG链共价连接至位置21处和位置24处的氨基酸残基，其中两条PEG链的组合分子量为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿。
带电荷的的C-末端
还可以进一步改善包含SEQIDNO：20的3类胰高血糖素相关的类似物肽的溶解性，例如，通过向SEQIDNO：20的胰高血糖素肽的C-末端部分，优选地在位于位置27的C-末端的位置处，引入1、2、3个或更多个带电荷的氨基酸。这样的带电荷的氨基酸可以通过由带电荷的氨基酸取代天然氨基酸引入，例如在位置28或29处，或者通过添加带电荷的氨基酸引入，例如在位置27、28或29后。在示例性实施方案中，1、2、3或全部带电荷的氨基酸是带负电荷的的。可以对3类胰高血糖素相关的类似物肽进行诸如保守性取代的另外修饰，该另外修饰仍然允许3类胰高血糖素相关的类似物肽保留胰高血糖素活性。在一实施方案中，提供了SEQIDNO：20的3类胰高血糖素相关的类似物肽的类似物，其中该类似物与SEQIDNO：20的不同在于位置17-26处的1至2个氨基酸取代，并且在一实施方案中，该类似物与SEQIDNO：20的肽的不同在于位置20处的氨基酸取代。
酰化/烷基化
根据一实施方案，修饰胰高血糖素肽，以包含酰基，从而延长循环中的半衰期和/或延缓起效和/或延长作用持续时间和/或改善对诸如DPP-IV的蛋白酶的抗性。酰化后，保持了3类胰高血糖素相关的类似物肽对胰高血糖素受体和GLP-1受体的活性。此外，酰化的类似物的效力与未酰化形式的3类胰高血糖素相关的类似物肽的效力相当。
在某些实施方案中，本发明提供了3类胰高血糖素相关的类似物肽，其经修饰包含共价连接至胰高血糖素肽的位置10处的氨基酸的酰基或烷基。胰高血糖素肽还可以包含3类胰高血糖素相关的类似物肽的位置10处的氨基酸与酰基或烷基之间的间隔物。任何前述3类胰高血糖素相关的类似物肽可以包含两个酰基或两个烷基或上述的组合。
在本发明的具体方面，酰化的3类胰高血糖素相关的类似物肽包含任何SEQIDNOs：534-544和546-549的氨基酸序列。
C-末端截断
在某些实施方案中，通过胰高血糖素肽C-末端两个氨基酸(即，位置29和/或28)的截断或缺失，进一步修饰本文所述的3类胰高血糖素相关的类似物肽，而不影响对胰高血糖素受体和GLP-1受体的活性和/或效力。在这一点上，3类胰高血糖素相关的类似物肽可以包含天然胰高血糖素肽(SEQIDNO：1)的氨基酸1-27或1-28，任选地具有一个或多个本文所述的修饰。
在一实施方案中，截断的3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：550或SEQIDNO：551。在另一实施方案中，截断的胰高血糖素激动剂肽包含SEQIDNO：552或SEQIDNO：553。
C-末端延伸
根据一实施方案，通过向胰高血糖素肽的羧基末端添加第二肽，例如SEQIDNO：26、SEQIDNO：27或SEQIDNO：28，修饰本文所公开的3类胰高血糖素相关的类似物肽。在一实施方案中，具有选自SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：19、SEQIDNO：66、SEQIDNO：67、SEQIDNO：68和SEQIDNO：69的序列的3类胰高血糖素相关的类似物肽通过肽键共价结合至第二肽，其中该第二肽包含选自SEQIDNO：26、SEQIDNO：27和SEQIDNO：28的序列。在另一实施方案中，在包含C-末端延伸的3类胰高血糖素相关的类似物肽中，天然胰高血糖素肽的位置29处的苏氨酸由甘氨酸代替。具有取代位置29处的苏氨酸的甘氨酸并且包含SEQIDNO：26的羧基末端延伸的3类胰高血糖素相关的类似物肽对GLP-1受体的效力是修饰为包含SEQIDNO：26的羧基末端延伸的天然胰高血糖素的4倍。对GLP-1受体的效力可以通过取代位置18处的天然精氨酸的丙氨酸进一步增强。
因此，3类胰高血糖素相关的类似物肽可以具有SEQIDNO：27(KRNRNNIA)或SEQIDNO：28的羧基末端延伸。根据一实施方案，包含SEQIDNO：33或SEQIDNO：20的3类胰高血糖素相关的类似物肽还包含连接至胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQIDNO：27(KRNRNNIA)或SEQIDNO：28的氨基酸序列。更具体而言，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含选自SEQIDNO：10、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13SEQIDNO：14和SEQIDNO：15的序列，还包含连接至胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQIDNO：27(KRNRNNIA)或SEQIDNO：28的氨基酸序列。更具体而言，胰高血糖素肽包含选自SEQIDNO：10、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：66、SEQIDNO：67、SEQIDNO：68、SEQIDNO：69、SEQIDNO：55和SEQIDNO：56的序列，还包含连接至3类胰高血糖素相关的类似物肽的氨基酸29的SEQIDNO：26(GPSSGAPPPS)或SEQIDNO：29的氨基酸序列。在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：64的序列。
其他修饰
任何上文所述的关于3类胰高血糖素相关的类似物肽的修饰可以单独或组合应用，该修饰增加或降低胰高血糖素受体活性和增加GLP-1受体活性。增加GLP-1受体活性的修饰的组合通常比单独采用的任何这些修饰提供更高的GLP-1活性。任何上文所述的修饰还可以与本文所述的关于3类胰高血糖素相关的类似物肽的其他修饰组合，该其他修饰赋予其他期望属性，例如增加的溶解性和/或稳定性和/或作用持续时间。或者，任何上文所述的修饰可以与本文所述的关于3类胰高血糖素相关的类似物肽的其他修饰组合，该其他修饰基本上不影响溶解性或稳定性或活性。示例性修饰包括但不限于：
(A)例如，通过向天然胰高血糖素的C-末端部分，优选地在位于位置27的C-末端部分处，引入1、2、3个或更多个带电荷的氨基酸，改善溶解性。这样的带电荷的氨基酸可以通过由带电荷的氨基酸取代天然氨基酸引入，例如在位置28或29处；或者通过添加带电荷的氨基酸引入，例如在位置27、28或29后。在示例性实施方案中，1、2、3个或全部带电荷的氨基酸是带负电荷的。在其他实施方案中，1、2、3个或全部带电荷的氨基酸是带正电荷的。这样的修饰增加溶解性，例如，当于25℃下24小时后进行测量时，在约5.5至8的给定pH，如pH为7的条件下，相对于天然胰高血糖素，提供了至少2倍、5倍、10倍、15倍、25倍、30倍或更高的溶解性。
(B)如本文所述，通过例如在位置16、17、20、21、24或29处，或者在肽的C-末端氨基酸处，添加诸如聚乙二醇链的亲水部分，增加溶解性和作用持续时间或循环中的半衰期。
(C)通过位置15处的天冬氨酸的修饰，例如通过缺失或由谷氨酸、高谷氨酸、半胱磺酸或高半胱磺酸取代，增加稳定性。这样的修饰可以减少5.5至8的pH下的降解或切割，特别是在酸性或碱性缓冲液中，例如于25℃下24小时后，保留至少75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的原始肽。
(D)通过位置27处的甲硫氨酸的修饰，例如，通过由亮氨酸或正亮氨酸取代，增加稳定性。这样的修饰可以减少氧化降解。还可以通过位置20或24处的Gln的修饰，例如通过由Ala或AIB取代，增加稳定性。这样的修饰可以减少通过Gln脱酰胺而发生的降解。可以通过位置21处的Asp的修饰，例如通过由Glu取代，增加稳定性。这样的修饰可以减少通过Asp脱水形成环琥珀酰亚胺中间体然后异构化为异天冬氨酸而发生的降解。
(E)通过由本文所述的DPP-IV抗性氨基酸修饰位置1或2处的氨基酸并且包括由N-甲基-丙氨酸修饰位置2处的氨基酸，增加对二肽基肽酶IV(DPPIV)切割的抗性。
(F)不影响活性的非保守性或保守性取代、添加或缺失，例如，位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29的一个或多个位置处的保守性取代；位置27、28或29的一个或多个位置处的缺失；任选地与代替C-末端羧酸基团的C-末端酰胺或酯组合的氨基酸29的缺失。
(G)如本文所述添加C-末端延伸。
(H)如本文所述，例如，通过胰高血糖素肽的酰化或烷基化，增加循环中的半衰期和/或延长作用持续时间和/或延缓起作用。
(I)如本文所述的同型二聚化或异源二聚化。
其他修饰包括由大芳香氨基酸(如，Tyr、Phe、Trp或氨基-Phe)取代位置1处的His；由Ala取代位置2处的Ser；由Ala或Phe取代位置10处的Tyr；由Arg取代位置12处的Lys；由Glu取代位置15处的Asp；由Thr或AIB取代位置16处的Ser。
具有GLP-1活性的3类胰高血糖素相关的类似物肽，含有由大芳香氨基酸(如Tyr)取代位置1处的His的非保守性取代，其可以保留GLP-1活性，其条件是经由诸如本文所述的那些分子内桥的分子内桥稳定了α-螺旋。
偶联物和融合
3类胰高血糖素相关的类似物肽可以任选地经由共价键合和任选地经由连接物连接至偶联物部分。
3类胰高血糖素相关的类似物肽还可以是融合肽或蛋白的一部分，其中第二肽或多肽与末端融合，例如与3类胰高血糖素相关的类似物肽的羧基末端融合。
更具体而言，3类胰高血糖素相关的类似物肽融合物可以包含SEQIDNO：55、SEQIDNO：9或SEQIDNO：10的胰高血糖素激动剂，还包含连接至胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQIDNO：26(GPSSGAPPPS)、SEQIDNO：27(KRNRNNIA)或SEQIDNO：28(KRNR)的氨基酸序列。在一实施方案中，SEQIDNO：26(GPSSGAPPPS)、SEQIDNO：27(KRNRNNIA)或SEQIDNO：28(KRNR)的氨基酸序列通过肽键结合至3类胰高血糖素相关的类似物肽的氨基酸29。申请人发现，在包含毒蜥外泌肽-4(如，SEQIDNO：26或SEQIDNO：29)的C-末端延伸肽的3类胰高血糖素相关的类似物肽融合肽中，由甘氨酸取代位置29处的天然苏氨酸残基明显地增加了GLP-1受体活性。该氨基酸取代可以与本文公开的关于3类胰高血糖素相关的类似物肽的其他修饰联合使用以增强胰高血糖素类似物对GLP-1受体的亲和力。例如，如本文所述，T29G取代可以与S16E和N20K氨基酸取代组合，任选地与氨基酸16与20之间的内酰胺桥组合，以及任选地与本文所述的PEG链的添加组合。在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：64的序列。在一实施方案中，胰高血糖素融合肽的3类胰高血糖素相关的类似物肽部分选自SEQIDNO：55、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4和SEQIDNO：5，其中当PEG链存在于位置17、21、24或C-末端氨基酸处，或存在于位置21和24处时，PEG链的分子量为500道尔顿至40,000道尔顿。更具体而言，在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽节段选自SEQIDNO：7、SEQIDNO：8和SEQIDNO：63，其中PEG链的分子量选自500至5,000。在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽为包含SEQIDNO：55和SEQIDNO：65的序列的融合肽，其中SEQIDNO：65的肽连接至SEQIDNO：55的羧基末端。
根据一实施方案，SEQIDNO：10的3类胰高血糖素相关的类似物肽另外的化学修饰赋予了这样程度的增加的GLP-1受体效力：对胰高血糖素受体和GLP-1受体的相对活性几乎相当。因此，在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含末端氨基酸，该末端氨基酸包含代替存在于天然氨基酸的羧酸基团的酰胺基团。可以通过对3类胰高血糖素相关的类似物肽进一步修饰，调节3类胰高血糖素相关的类似物肽分别对胰高血糖素受体和GLP-1受体的相对活性，以产生这样的类似物，该类似物表现出约40％至约500％或者更高的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体的活性，和约20％至约200％或者更高的天然GLP-1对GLP-1受体的活性，例如相对于胰高血糖素对GLP-1受体正常活性增加50倍、100倍或更多。
示例性实施方案
根据一实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽为SEQIDNO：55的类似物，其中所述类似物与SEQIDNO：55的不同在于选自位置1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28和29的1至3个氨基酸，其中所述3类胰高血糖素相关的类似物肽表现出至少20％的天然GLP-1对GLP-1受体的活性。
根据一实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含以下序列：NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQIDNO：33)，其中位置15处的Xaa选自Asp、Glu、半胱磺酸、高谷氨酸和高半胱磺酸，位置16处的Xaa选自Ser、Glu、Gln、高谷氨酸和高半胱磺酸，位置20处的Xaa为Gln或Lys，位置24处的Xaa为Gln或Glu，位置28处的Xaa为Asn、Lys或酸性氨基酸，位置29处的Xaa为Thr、Gly或酸性氨基酸，并且R为COOH或CONH2，其条件是当位置16为丝氨酸时，位置20为Lys，或者当位置16为丝氨酸时，位置24为Glu，并且位置20或位置28为Lys。在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：33的序列，其中位置28处的氨基酸为天冬氨酸，并且位置29处的氨基酸为谷氨酸。在另一实施方案中，位置28处的氨基酸为天然天冬酰胺，位置29处的氨基酸为甘氨酸，并且SEQIDNO：29或SEQIDNO：65的氨基酸序列共价连接至SEQIDNO：33的羧基末端。
在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：33的序列，其中向肽的羧基末端添加另外的酸性氨基酸。在另一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽的羧基末端氨基酸具有代替天然氨基酸的羧酸基团的酰胺。在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含选自SEQIDNO：40、SEQIDNO：41、SEQIDNO：42、SEQIDNO：43和SEQIDNO：44的序列。
根据一实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽为包含SEQIDNO：33的类似物，其中所述类似物与SEQIDNO：33的不同在于选自位置1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21和27的1至3个氨基酸，其条件是当位置16处的氨基酸为丝氨酸时，位置20为赖氨酸，或者在位置24处的氨基酸与位置20处的氨基酸或位置28处的氨基酸之间形成内酰胺桥。根据一实施方案，类似物与SEQIDNO：33的不同在于选自位置1、2、3、21和27的1至3个氨基酸。在一实施方案中，SEQIDNO：33的胰高血糖素肽类似物与该序列的不同在于选自位置1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21和27的1至2个氨基酸，或者在一实施方案中，不同之处在于选自位置1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21和27的单个氨基酸，其条件是当位置16处的氨基酸为丝氨酸时，位置20为赖氨酸，或者在位置24处的氨基酸与位置20处的氨基酸或者位置28处的氨基酸之间形成内酰胺桥。
根据另一实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽为相对选择性的GLP-1受体激动剂，其包含序列NH2-His-Ser-Xaa-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQIDNO：53)，其中位置3处的Xaa选自Glu、Orn或Nle，位置15处的Xaa选自Asp、Glu、半胱磺酸、高谷氨酸和高半胱磺酸，位置16处的Xaa选自Ser、Glu、Gln、高谷氨酸和高半胱磺酸，位置20处的Xaa为Gln或Lys，位置24处的Xaa为Gln或Glu，位置28处的Xaa为Asn、Lys或酸性氨基酸，位置29处的Xaa为Thr、Gly或酸性氨基酸，并且R为COOH、CONH2、SEQIDNO：26或SEQIDNO：29，其条件是当位置16为丝氨酸时，位置20为Lys，或者当位置16为丝氨酸时，位置24为Glu并且位置20或位置28为Lys。在一实施方案中，位置3处的氨基酸为谷氨酸。在一实施方案中，位置28和/或29处取代的酸性氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：33的序列，还包含添加至该肽的羧基末端的另外的酸性氨基酸。在另一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽的羧基末端氨基酸具有代替天然氨基酸的羧酸基团的酰胺。
根据一实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含选自以下序列的修饰的胰高血糖素肽：
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQIDNO：34)，其中位置15处的Xaa选自Asp、Glu、半胱磺酸、高谷氨酸和高半胱磺酸，位置16处的Xaa选自Ser、Glu、Gln、高谷氨酸和高半胱磺酸，位置20处的Xaa为Gln或Lys，位置20处的Xaa为Gln或Glu，位置28处的Xaa为Asn、Asp或Lys，R为COOH或CONH2，位置29处的Xaa为Thr或Gly，并且R为COOH、CONH2、SEQIDNO：26或SEQIDNO：29，其条件是当位置16为丝氨酸时，位置20为Lys，或者当位置16为丝氨酸时，位置24为Glu并且位置20或位置28为Lys。在一实施方案中，R为CONH2，位置15处的Xaa为Asp，位置16处的Xaa选自Glu、Gln、高谷氨酸和高半胱磺酸，位置20和24处的Xaa各自为Gln，位置28处Xaa为Asn或Asp，并且位置29处的Xaa为Thr。在一实施方案中，位置15和16处的Xaa各自为Glu，位置20和24处的Xaa各自为Gln，位置28处的Xaa为Asn或Asp，位置29处的Xaa为Thr，并且R为CONH2。
根据一实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽具有增强的GLP-1活性，并且包含(a)由大芳香氨基酸取代位置1处的His的氨基酸取代，和(b)稳定分子C-末端部分的α-螺旋(如，在位置12-29附近)的分子内桥。在具体实施方案中，位置1处的氨基酸为Tyr、Phe、Trp、氨基-Phe、硝基-Phe、氯-Phe、磺基-Phe、4-吡啶基-Ala、甲基-Tyr或3-氨基Tyr。在具体的方面，分子内桥在两个氨基酸的侧链之间，该两个氨基酸被3个居间氨基酸隔开，即，氨基酸i与i+4的侧链之间。在某些实施方案中，分子内桥为内酰胺桥。在本发明更具体的实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含位置1处的大芳香氨基酸和肽的位置16与20处的氨基酸之间的内酰胺桥。这样的3类胰高血糖素相关的类似物肽还可以包含一个或多个(如，2、3、4、5个或更多个)本文所述的其他修饰。例如，3类胰高血糖素相关的类似物肽可以包含代替C-末端羧酸的酰胺。因此，在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：555的氨基酸序列。
仍然根据本发明的另一实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽具有增强的GLP-1活性，并且包含(a)由α，α-二取代的氨基酸取代氨基酸位置12-29中的一个或多个位置的取代，和任选的(b)C-末端酰胺。在某些方面，应当理解这样的3类胰高血糖素相关的类似物肽特别地缺乏稳定胰高血糖素C-末端部分的α-螺旋(位置12至29附近)的分子内桥。在某些实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽的位置16、17、18、19、20、21、24或29的1、2、3、4个或更多个位置由α，α-二取代的氨基酸取代，例如氨基异丁酸(AIB)，由选自甲基、乙基、丙基和正丁基的相同或不同基团二取代的氨基酸或者由环辛烷或环庚烷取代的氨基酸(如，1-氨基环辛烷-1-羧酸)。例如，由AIB取代位置16，在没有盐桥或内酰胺的条件下，增强了GLP-1活性。在某些实施方案中，由AIB取代位置16、20、21或24的1、2、3个或更多个位置。这样的3类胰高血糖素相关的类似物肽还可以包含一个或多个本文所述的其他修饰，包括但不限于酰化；烷基化；聚乙二醇化；C-末端处1-2个氨基酸的缺失；C-末端处带电荷的氨基酸的添加和/或由带电荷的氨基酸的取代；由酰胺代替C-末端羧酸；C-末端延伸的添加以及保守性和/或非保守性氨基酸取代，如由Leu或Nle取代位置27处的Met，由Glu(或类似的氨基酸)取代位置15处的Asp，由实现DPP-IV蛋白酶抗性的氨基酸在位置1和/或2处的取代，由Ala取代位置2处的Ser，由Val或Phe取代位置10处的Tyr，由Arg取代位置12处的Lys，由Thr或AIB取代位置16处的Ser，由Asp、Glu或AIB取代位置20和/或24处的Gln，由Glu或Thr取代位置16处的Ser，由Ala取代位置18处的Arg，由Lys取代位置20处的Gln，由Glu取代位置21处的Asp以及由Asn或Cys取代位置24处的Gln。在某些实施方案中，前述3类胰高血糖素相关的类似物肽包含位置29处的Gln或Gly，或者C-末端延伸的添加，如位于位置28处氨基酸的C-末端的GGPSSGAPPPS(SEQIDNO：26)。在具体的方面，3类胰高血糖素相关的类似物肽，包含下述的一种或多种：代替C-末端羧酸的酰胺基团，诸如C16脂肪酸的酰基，诸如聚乙二醇(PEG)的亲水部分。此外，在另一具体方面，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含任何SEQIDNOs：1-25、30-64和66-555的氨基酸序列，该氨基酸序列相对于SEQIDNO：1包含不超过10个修饰，并且包含由AIB在位置16、20、21和/或24处的一个或多个氨基酸取代，其中该肽缺乏在肽的两个氨基酸侧链之间的分子内桥。因此，在更具体的方面，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含任何SEQIDNOs：556-561的氨基酸序列。
据报道，可以修饰天然胰高血糖素肽的某些位置，同时保留至少某些母体肽的活性。因此，申请人预料位于SEQIDNO：11的3类胰高血糖素相关的类似物肽的位置2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29处的一个或多个氨基酸可以由不同于存在于天然胰高血糖素肽中的氨基酸的氨基酸取代，并且仍然保留对胰高血糖素受体的活性。在一实施方案中，将存在与天然肽的位置27处的甲硫氨酸残基变为亮氨酸或正亮氨酸以防止肽的氧化降解。在另一实施方案中，由Lys、Arg、Orn或瓜氨酸(Citrullene)取代位置20处的氨基酸，和/或由Glu、高谷氨酸或高半胱磺酸取代位置21处的氨基酸。
在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含具有另外1至6个氨基酸改变的SEQIDNO：20，该氨基酸改变选自不同于SEQIDNO：1的相应氨基酸的位置1、2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、27、28或29，其条件是当位置16处的氨基酸为丝氨酸时，位置20为Lys，或者当位置16为丝氨酸时，位置24为Glu并且位置20或位置28为Lys。根据另一实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含具有选自位置1、2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、20、21、27、28或29中的1至3个氨基酸的SEQIDNO：20，该氨基酸选自不同于SEQIDNO：1的相应氨基酸。在另一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含具有选自位置1、2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、20或21中的1至2个氨基酸的SEQIDNO：8、SEQIDNO：9或SEQIDNO：11，该氨基酸不同于SEQIDNO：1的相应氨基酸，并且在另一实施方案中，1至2个不同的氨基酸代表相对于存在于天然胰高血糖素序列(SEQIDNO：1)的氨基酸的保守性氨基酸取代。在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14或SEQIDNO：15，其还包含在选自位置2、5、7、10、11、13、14、17、18、19、20、21、27或29的位置处的1、2或3个氨基酸取代。在一实施方案中，位置2、5、7、10、11、13、14、16、17、18、19、20、21、27或29处的取代为保守性氨基酸取代。
根据一实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：33的变异序列，其中选自位置16、17、18、20、21、23、24、27、28和29的1至10个氨基酸分别不同于SEQIDNO：1的相应氨基酸。根据一实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽与SEQIDNO：33的不同在于选自Gln17、Ala18、Glu21、Ile23、Ala24、Val27和Gly29的一个或多个氨基酸取代。根据一实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：33的变异序列，其中选自位置17-26的1至2个氨基酸不同于SEQIDNO：1的相应氨基酸。根据一实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：33的变异序列，其与SEQIDNO：33的不同在于选自Gln17、Ala18、Glu21、Ile23和Ala24的氨基酸取代。根据一实施方案，SEQIDNO33的变异序列与SEQIDNO：33的不同在于位置18处的氨基酸取代，其中取代的氨基酸选自Ala、Ser、Thr和Gly。根据一实施方案，SEQIDNO33的变异序列与SEQIDNO33的不同在于位置18处的Ala的氨基酸取代。这样的变异包括于SEQIDNO：55。在另一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：33的变异序列，其中选自位置17-22的1至2个氨基酸不同于SEQIDNO：1的相应氨基酸，并且在另一实施方案中，SEQIDNO：33变体的变异序列与SEQIDNO：33的不同在于位置20和21处的1或2个氨基酸取代。根据一实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含以下序列：
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Xaa-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQIDNO：51)，其中位置15处的Xaa为Asp、Glu、半胱磺酸、高谷氨酸或高半胱磺酸，位置16处的Xaa为Ser、Glu、Gln、高谷氨酸或高半胱磺酸，位置20处的Xaa为Gln、Lys、Arg、Orn或瓜氨酸，位置21处的Xaa为Asp、Glu、高谷氨酸或高半胱磺酸，位置24处的Xaa为Gln或Glu，位置28处的Xaa为Asn、Lys或酸性氨基酸，位置29处的Xaa为Thr或酸性氨基酸，并且R为COOH或CONH2。在一实施方案中，R为CONH2。根据一实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：47、SEQIDNO：48或SEQIDNO：49的变异序列，该变异序列与所述序列的不同在于位置20处的氨基酸取代。在一实施方案中，氨基酸取代选自位置20的Lys、Arg、Orn或瓜氨酸。
在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：34的类似物肽序列，该序列与SEQIDNO：34的不同在于在位置2处具有除了丝氨酸以外的氨基酸。在一实施方案中，由氨基异丁酸、D-丙氨酸取代丝氨酸残基，并且在一实施方案中，由氨基异丁酸取代丝氨酸残基。这样的修饰抑制二肽基肽酶IV的切割，同时保留母体化合物的内在效力(如，至少75％、80％、85％、90％、95％或更高的母体化合物的效力)。在一实施方案中，增加了类似物的溶解性，例如通过向天然胰高血糖素C-末端部分，优选地在位于位置27的C-末端的位置，引入1、2、3个或更多个带电荷的氨基酸。在示例性实施方案中，1、2、3或全部带电荷的氨基酸是带负电荷的。在另一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽还包含取代位置28或29处的天然氨基酸的酸性氨基酸，或者添加到SEQIDNO：34的肽的羧基末端的酸性氨基酸。
在一实施方案中，还在位置1或2处修饰本文公开的3类胰高血糖素相关的类似物肽，以减少对二肽基肽酶IV切割的易感性。在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：9、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14或SEQIDNO：15的序列，该序列与母体分子的不同在于位置2的取代，并且表现出对二肽基肽酶IV切割的减少的易感性(即，抗性)。更具体而言，在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽的位置2由选自D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、α-氨基异丁酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸和ε-氨基丁酸的氨基酸取代。在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽的位置2由选自D-丝氨酸、D-丙氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸和氨基异丁酸的氨基酸取代。在另一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽的位置2由选自D-丝氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸和α-氨基丁酸的氨基酸取代。在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：21或SEQIDNO：22的序列。
在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：9、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14或SEQIDNO：15的变异序列，该序列与母体分子的不同在于位置1的取代，并且表现出对二肽基肽酶IV切割的减少的易感性(即，抗性)。更具体而言，3类胰高血糖素相关的类似物肽的位置1由选自D-组氨酸、α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸和高组氨酸的氨基酸取代。在另一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：34的类似物肽，其中该类似物与SEQIDNO：34的不同在于在位置1处具有除了组氨酸以外的氨基酸。在一实施方案中，例如通过向天然胰高血糖素C-末端部分，优选在位于位置27的C-末端的位置，引入1、2、3个或更多个带电荷的氨基酸，增加类似物的溶解性。在示例性实施方案中，1、2、3或全部带电荷的氨基酸是带负电荷的。在另一实施方案中，类似物还包含取代位置28或29处的天然氨基酸的酸性氨基酸，或者添加到SEQIDNO：34的肽的羧基末端的酸性氨基酸。在一实施方案中，酸性氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。
在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：20的序列，还包含一个氨基酸或选自SEQIDNO：26、SEQIDNO：27和SEQIDNO：28的肽的另外的羧基末端延伸。在单个氨基酸被添加到SEQIDNO：20的羧基末端的实施方案中，该氨基酸通常选自20种常见氨基酸之一，并且在一实施方案中，另外的羧基末端氨基酸具有代替天然氨基酸的羧酸的酰胺基团。在一实施方案中，另外的氨基酸选自谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸。
在替代性实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含至少一个在谷氨酸残基的侧链与赖氨酸残基的侧链之间形成的内酰胺环，其中该谷氨酸残基与赖氨酸残基被3个氨基酸隔开。在一实施方案中，带有内酰胺的3类胰高血糖素相关的类似物肽的羧基末端氨基酸具有代替天然氨基酸的羧酸的酰胺基团。更具体而言，在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含修饰的胰高血糖素肽，该修饰的胰高血糖素肽选自：
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQIDNO：66)、
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQIDNO：67)、
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R(SEQIDNO：68)、
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys-Xaa-R(SEQIDNO：69)、
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-R(SEQIDNO：16)、
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys-Thr-R(SEQIDNO：17)、
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Met-Lys-Thr-R(SEQIDNO：18)，
其中，位置28处的Xaa＝Asp或Asn，位置29处的Xaa为Thr或Gly，R选自COOH、CONH2、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、SEQIDNO：26、SEQIDNO：27和SEQIDNO：28，并且内酰胺桥形成于SEQIDNO：66的位置12处的Lys与位置16处的Glu之间、SEQIDNO：67的位置16处的Glu与位置20处的Lys之间、SEQIDNO：68的位置20处的Lys与位置24处的Glu之间、SEQIDNO：69的位置24处的Glu与位置28处的Lys之间、SEQIDNO：16的位置12处的Lys与位置16处的Glu之间及位置20处的Lys与位置24处的Glu之间、SEQIDNO：17的位置12处的Lys与位置16处的Glu之间及位置24处的Glu与位置28处的Lys之间以及SEQIDNO：18的位置16处的Glu与位置20处的Lys之间及位置24处的Glu与位置28处的Lys之间。在一实施方案中，R选自COOH、CONH2、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸，位置28处的氨基酸为Asn，位置29处的氨基酸为苏氨酸。在一实施方案中，R为CONH2，位置28处的氨基酸为Asn，并且位置29处的氨基酸为苏氨酸。在另一实施方案中，R选自SEQIDNO：26、SEQIDNO：29和SEQIDNO：65，并且位置29处的氨基酸为甘氨酸。
在另一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽选自SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17和SEQIDNO：18，其中该肽还包含一个氨基酸或选自SEQIDNO：26、SEQIDNO：27和SEQIDNO：28的肽的另外的羧基末端延伸。在一实施方案中，末端延伸包含SEQIDNO：26、SEQIDNO：29或SEQIDNO：65的序列，并且3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：55的序列。在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：33的序列，其中位置16处的氨基酸为谷氨酸，位置20处的氨基酸为赖氨酸，位置28处的氨基酸为天冬酰胺，并且SEQIDNo：26或SEQIDNO：29的氨基酸序列连接至SEQIDNO：33的羧基末端。
在单个氨基酸被添加到SEQIDNO：20的羧基末端的实施方案中，该氨基酸通常选自20种常见氨基酸之一，并且在一实施方案中，该氨基酸具有代替天然氨基酸的羧酸的酰胺基团。在一实施方案中，另外的氨基酸选自谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸。在3类胰高血糖素相关的类似物肽还包含羧基末端的实施方案中，延伸的羧基末端氨基酸，在一实施方案中以酰胺基团或酯基团而不是羧酸为结束。
在另一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含以下序列：NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Xaa-CONH2(SEQIDNO：19)，其中位置30处的Xaa代表任何氨基酸。在一实施方案中，选自20种常见氨基酸之一，并且在一实施方案中，氨基酸为谷氨酸、天冬氨酸或甘氨酸。该肽的溶解性可以通过将PEG链共价连接至SEQIDNO：19的位置17、21、24或30处的氨基酸的侧链进一步改善。在另一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含选自SEQIDNO：26、SEQIDNO：27和SEQIDNO：28的肽的另外的羧基末端延伸。根据一实施方案，胰高血糖素/GLP-1受体共激动剂包含SEQIDNO：30、SEQIDNO：31和SEQIDNO：32的序列。
可以对SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：19和SEQIDNO：64的胰高血糖素序列内部进行其他位点特异性修饰，以获得一组3类胰高血糖素相关的类似物肽，其具有可变程度的GLP-1激动。因此，制备和表征了对每种受体具有几乎相同的体外效力的肽。类似地，鉴定和表征了对两种受体的每一种具有选择性地增强的10倍效力的肽。如上文所指出的，由谷氨酸取代位置16处的丝氨酸残基增强了天然胰高血糖素对胰高血糖素受体和GLP-1受体的效力，但是仍保持约10倍的对胰高血糖素受体的选择性。另外，由谷氨酸取代位置3处的天然谷氨酰胺(SEQIDNO：22)产生了胰高血糖素类似物，其表现出约10倍的对GLP-1受体的选择性。
通过在肽的位置16、17、21和24处引入亲水基团或者通过在3类胰高血糖素相关的类似物肽的羧基末端处添加单个修饰的氨基酸(即，经修饰包含亲水基团的氨基酸)，可以进一步增强3类胰高血糖素相关的类似物肽在生理pH值的水溶液中的溶解性，同时保留相对于天然胰高血糖素的高生物活性。根据一实施方案，亲水基团包含聚乙烯(PEG)链。更具体而言，在在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17或SEQIDNO：18的序列，其中PEG链共价连接至3类胰高血糖素相关的类似物肽的位置16、17、21、24、29处的氨基酸的侧链，或者C-末端氨基酸的侧链，其条件是：当肽包含SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12或SEQIDNO：13时，聚乙二醇链共价结合至位置17、21或24处的氨基酸残基；当肽包含SEQIDNO：14或SEQIDNO：15时，聚乙二醇链共价结合至位置16、17或21处的氨基酸残基；以及当肽包含SEQIDNO：16、SEQIDNO：17或SEQIDNO：18时，聚乙二醇链共价结合至位置17或21处的氨基酸残基。
在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：11、SEQIDNO：12或SEQIDNO：13的序列，其中PEG链共价连接至3类胰高血糖素相关的类似物肽的位置17、21、24处的氨基酸的侧链，或者C-末端氨基酸的侧链，并且肽的羧基末端氨基酸具有代替天然氨基酸的羧酸基团的酰胺基团。在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含选自SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18和SEQIDNO：19的序列，其中PEG链共价连接至3类胰高血糖素相关的类似物肽的SEQIDNO：12、SEQIDNO：13和SEQIDNO：19的位置17、21或24处的氨基酸的侧链，或者SEQIDNO：14和SEQIDNO：15的位置16、17或21的氨基酸的侧链，或者SEQIDNO：16、SEQIDNO：17和SEQIDNO：18的位置17或21处的氨基酸的侧链。在另一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：11或SEQIDNO：19的序列，其中PEG共价连接至3类胰高血糖素相关的类似物肽的位置17、21或24处的氨基酸的侧链，或者C-末端氨基酸的侧链。
根据一实施方案和对于前述段落所述条件限制的主题，3类胰高血糖素相关的类似物肽经修饰，含有位置16、17、21、24或29处或者C-末端氨基酸处的一个或多个氨基酸取代，其中由具有侧链的氨基酸取代天然氨基酸，该侧链适合于与包括例如PEG在内的亲水部分交联。天然肽可以由天然存在的氨基酸或合成(非天然存在)的氨基酸取代。合成或非天然存在的氨基酸指这样的氨基酸，其在体内不天然存在，但是能够并入本文所述的肽结构中。或者，可以将具有侧链的氨基酸添加到本文公开的任何3类胰高血糖素相关的类似物肽的羧基末端，该侧链适合于与包括例如PEG在内的亲水部分交联。根据一实施方案，在3类胰高血糖素相关的类似物肽中的选自16、17、21、24或29的位置处进行氨基酸取代，从而由选自赖氨酸、半胱氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸和乙酰基苯丙氨酸的氨基酸代替天然氨基酸，其中取代氨基酸还包含共价结合至该氨基酸侧链的PEG链。在一实施方案中，进一步修饰选自SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18和SEQIDNO：19的3类胰高血糖素相关的类似物肽，以包含共价连接至胰高血糖素肽的位置17或21处的氨基酸的侧链的PEG链。在一实施方案中，聚乙二醇化的3类胰高血糖素相关的类似物肽还包含SEQIDNO：26、SEQIDNO：27或SEQIDNO：29的序列。
在另一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：55或SEQIDNO：56的序列，还包含连接至SEQIDNO：55或SEQIDNO：56的C-末端氨基酸的SEQIDNO：26、SEQIDNO：29或SEQIDNO：65的C-末端延伸，并且任选地还包含共价连接至肽的位置17、18、21、24或29的氨基酸的侧链或者C-末端氨基酸的侧链的PEG链。在另一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：55或SEQIDNO：56的序列，其中PEG链共价连接至3类胰高血糖素相关的类似物肽的位置21或24处的氨基酸的侧链，并且3类胰高血糖素相关的类似物肽还包含SEQIDNO：26或SEQIDNO：29的C-末端延伸。
在另一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：55或SEQIDNO：33或SEQIDNO：34的序列，其中将另外的氨基酸添加到SEQIDNO：33或SEQIDNO：34的羧基末端，并且PEG链共价连接至添加的氨基酸的侧链。在另一实施方案中，聚乙二醇化的3类胰高血糖素相关的类似物肽还包含连接至SEQIDNO：33或SEQIDNO：34的C-末端氨基酸的SEQIDNO：26或SEQIDNO：29的C-末端延伸。在另一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：19的序列，其中PEG共价连接至3类胰高血糖素相关的类似物肽位置30处的氨基酸的侧链，并且3类胰高血糖素相关的类似物肽还包含连接至SEQIDNO：19的C-末端氨基酸的SEQIDNO：26或SEQIDNO：29的C-末端延伸。
根据一实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：20的序列，其中在位于位置12、20或28的赖氨酸残基的侧链与位于位置16或24的谷氨酸残基的侧链之间形成内酰胺环，其中胰高血糖素肽的两个氨基酸被3个居间氨基酸互相隔开，所述两个氨基酸的侧链参与形成内酰胺环。根据一实施方案，带有内酰胺的3类胰高血糖素相关的类似物肽包含选自SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17和SEQIDNO：18的氨基酸序列。在一实施方案中，带有内酰胺的肽的羧基末端氨基酸包含代替末端羧酸的酰胺基团或酯基团。在一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13，和SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17和SEQIDNO：18，还包含共价结合至SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17或SEQIDNO：18的羧基末端的另外的氨基酸。在另一实施方案中，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含选自SEQIDNO：66、SEQIDNO：67、SEQIDNO：68和SEQIDNO：69的序列，还包含共价结合至SEQIDNO：66、SEQIDNO：67、SEQIDNO：68和SEQIDNO：69的羧基末端的另外的氨基酸。在一实施方案中，位置28处的氨基酸为天冬酰胺或赖氨酸，并且位置29处的氨基酸为苏氨酸。
根据一实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含天然胰高血糖素的氨基酸序列(SEQIDNO：1)，该序列包含以下修饰：位置2处的AIB、位置3处的Glu、位置10处的Lys、位置16处的Glu、位置17处的Gln、位置18处的Ala、位置20处的Lys、位置21处的Glu、位置23处的Ile、位置24处的Ala；其中位置10处的Lys由C14或C16脂肪酸酰化，并且其中由酰胺代替C-末端羧酸。在一具体实施方案中，该3类胰高血糖素相关的类似物肽经由其N-末端氨基酸连接至二肽D-Lys-肌氨酸。
根据某些实施方案，3类胰高血糖素相关的类似物肽包含以下序列、基本上由以下序列组成或者由以下序列组成：任何SEQIDNOs：70-514、517-534或554的氨基酸序列，并且任选地具有高达1、2、3、4或5个保留GLP-1激动剂和/或胰高血糖素激动剂活性的其他修饰。4类胰高血糖素相关的类似物肽
在某些实施方案中，胰高血糖素相关的类似物肽为4类胰高血糖素相关的类似物肽(参见，例如国际(PCT)专利申请PCT/US2008/080973号，该申请通过引用整体并入本文)。
活性
根据一实施方案，提供了4类胰高血糖素相关的类似物肽(在下文中称为“4类肽”)。在某些方面，提供了具有胰高血糖素拮抗剂活性的4类肽。在期望抑制胰高血糖素激动的任何环境中使用胰高血糖素拮抗剂。最直接和明显的用途是治疗糖尿病，其中在高血糖的临床前模型中已经证明了胰高血糖素拮抗降低血糖。可以进一步修饰胰高血糖素拮抗剂修饰以改善该化合物的生物物理稳定性和/或水溶性，同时保留母体化合物的拮抗剂活性。在某些方面，4类肽被定义为纯胰高血糖素拮抗剂。
术语“胰高血糖素拮抗剂”指对抗胰高血糖素活性或防止胰高血糖素功能的化合物。例如，胰高血糖素拮抗剂表现出至少60％(如，至少70％)并且优选至少80％的胰高血糖素对胰高血糖素受体所实现的最大应答的抑制。在一实施方案中，胰高血糖素拮抗剂表现出至少90％的胰高血糖素对胰高血糖素受体所实现的最大应答的抑制。在一具体实施方案中，胰高血糖素拮抗剂表现出100％的高血糖素对胰高血糖素受体所实现的最大应答的抑制。另外，浓度为约1μM的胰高血糖素拮抗剂表现出小于约20％的胰高血糖素对胰高血糖素受体所实现的最大激动剂活性。在一实施方案中，胰高血糖素拮抗剂表现出小于约10％的胰高血糖素对胰高血糖素受体所实现的最大激动剂活性。在一具体实施方案中，胰高血糖素拮抗剂表现出小于约5％的胰高血糖素对胰高血糖素受体所实现的最大激动剂活性。仍然在另一具体实施方案中，胰高血糖素拮抗剂表现出0％的胰高血糖素对胰高血糖素受体所实现的最大激动剂活性。
“纯胰高血糖素拮抗剂”为这样的胰高血糖素拮抗剂，如通过利用验证的体外模型测定的cAMP产生所测量的(参见，例如PCT/US2008/080973)，其不产生胰高血糖素或GLP-1受体活性的任何检测到的刺激。例如，纯胰高血糖素拮抗剂表现出小于约5％(如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、约0％)的胰高血糖素对胰高血糖素受体所实现的最大激动剂活性，并且表现出小于约5％(如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％和约0％)的GLP-1对GLP-1受体所实现的最大激动剂活性。
因此，在某些方面，提供了表现出纯胰高血糖素拮抗剂活性的4类肽。根据一实施方案，当使胰高血糖素受体同时与0.8nM的胰高血糖素和胰高血糖素拮抗剂接触时，胰高血糖素拮抗剂表现出这样的活性，该活性将胰高血糖素受体胰高血糖素诱导的cAMP产生减少最大量的至少50％，如通过体外测定中的cAMP产生所测量的。在一实施方案中，胰高血糖素拮抗剂将胰高血糖素受体胰高血糖素诱导的cAMP产生减少最大量的至少80％。
4类肽被认为适合于任何以前所述的用于胰高血糖素拮抗剂的用途。因此，本文所述的4类肽可以用于治疗高血糖，或者治疗高胰高血糖素血液水平或高血糖水平导致的其他代谢疾病。根据一实施方案，要利用本文公开的4类肽治疗的患者为饲养的动物，并且在另一实施方案中，要治疗的患者为人。研究表明，糖尿病患者中胰高血糖素抑制的缺乏经由加速的糖原分解部分地促进饭后高血糖。口服葡萄糖耐受测试(OGTT)期间并且在存在或不存在生长抑素诱导的胰高血糖素抑制的情况下的血糖分析显示，具有较高胰高血糖素水平的个体中葡萄糖显著增加。因此，本发明的4类肽可以用于治疗高血糖，并且预期对治疗包括胰岛素依赖性或非胰岛素依赖性的I型糖尿病、II型糖尿病或妊娠糖尿病在内的各种类型的糖尿病和减少包括肾病、视网膜病和血管疾病在内的糖尿病并发症是有用的。
在一实施方案中，毒蜥外泌肽-4(即，SEQIDNO：919(GPSSGAPPPS)的序列)的末端10个氨基酸连接至4类肽的羧基末端。预料这些融合蛋白具有抑制食欲和诱导体重减轻/体重维持的药理活性。根据一实施方案，可以进一步修饰本文公开的4类肽，以包括连接至SEQIDNO：942的4类肽的氨基酸24的SEQIDNO：919(GPSSGAPPPS)的氨基酸序列，并给予个体以诱导体重减轻或辅助体重维持。更具体而言，4类肽包含选自SEQIDNO：902，SEQIDNO：903、SEQIDNO：904SEQIDNO：905、SEQIDNO：906、SEQIDNO：907、SEQIDNO：908、SEQIDNO：936、SEQIDNO：939、SEQIDNO：940、SEQIDNO：941、SEQIDNO：942、SEQIDNO：943和SEQIDNO：944的序列，还包含连接至4类肽的氨基酸24的SEQIDNO：919(GPSSGAPPPS)的氨基酸序列，以用于抑制食欲和诱导体重减轻/体重维持。在一实施方案中，给予的4类肽包含SEQIDNO：946或SEQIDNO：947的序列。
预期减少食欲或促进体重减轻的这类方法可用于减少体重；防止体重增加；或治疗包括药物诱导的肥胖在内的各种原因的肥胖，以及减少与肥胖有关的并发症，包括血管疾病(冠状动脉疾病、中风、外周血管疾病、缺血再灌注等)、高血压、II型糖尿病的发作、高血脂和肌肉骨骼疾病。
本发明的4类肽可以单独给予或与其他抗糖尿病剂或抗肥胖剂组合给予。本领域已知或研究中的抗糖尿病剂包括胰岛素；磺脲类，如甲苯磺丁脲(甲糖宁)、醋磺己脲(Dymelor)、妥拉磺脲(Tolinase)、氯磺丙脲(特泌胰)、格列吡嗪(利糖妥)、格列本脲(Diabeta、Micronase、Glynase)、格列美脲(亚莫利)或格列齐特(达美康)；氯茴苯酸类，如瑞格列奈(Prandin)或那格列奈(唐力)；双胍，如甲福明(格华止)或苯乙双胍；噻唑烷二酮，如罗格列酮(文迪雅)、吡格列酮(艾可拓)或曲格列酮(瑞泽林)或其他PPARγ抑制剂；抑制碳水化合物消化的α葡糖苷酶抑制剂，如米格列醇(Glyset)、阿卡波糖(阿卡波糖片剂/拜唐苹)；艾塞那肽(倍它)或普兰林肽；二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂，如维格列汀或西格列汀；SGLT(钠依赖性葡萄糖转运蛋白1)抑制剂；或FBPase(果糖1，6-二磷酸酶)抑制剂。
本领域已知或研究中的抗肥胖剂包括食欲遏抑剂，其包括苯乙胺型兴奋剂芬特明(任选地联合芬氟拉明或右芬氟拉明)、安非拉酮苯甲曲秦苄非他明西布曲明利莫纳班其他大麻素类受体拮抗剂；泌酸调节肽；盐酸氟西汀(百优解)；Qnexa(托吡酯和芬特明)、Excalia(安非他酮和唑尼沙胺)或Contrave(安非他酮和纳曲酮)；或类似于赛尼可(奥利司他)或西替司他(又称为ATL-962)的脂肪酶抑制剂或者GT389-255。
还可以将本发明的4类肽给予患有分解代谢虚损(catabolicwasting)的患者。据估计，超过一半的癌症患者经历了分解代谢虚损，其特征在于不期望的和进行性体重减轻、虚弱以及低身体脂肪和肌肉。该综合征在AIDS患者中也同样常见，并且还可以存在于细菌性和寄生性疾病、类风湿性关节炎以及肠、肝、肺和心脏的慢性疾病中。其通常与厌食相伴，并且可以表现为老化疾病状况或者物理损伤的结果。分解代谢虚损是降低生活质量、恶化潜在疾病状况的症状，并且是死亡的主因。申请人预料可以将本文所公开的4类肽给予患者以治疗分解代谢虚损。
可以利用标准药用可接受的载体和本领域技术人员已知的给药途径，配制包含本文公开的4类肽的药物组合物并将其给予患者。因此，本公开还包括药物组合物，该药物组合物包含与药用可接受的载体组合的一种或多种本文公开的4类肽。药物组合物可以包含作为唯一的药物活性组分的4类肽，或者可以将4类肽与一种或多种另外的活性剂组合。根据一实施方案，提供了组合物，其包含本发明的4类肽和激活GLP-1受体的化合物(如，GLP-1、GLP-1类似物、毒蜥外泌肽-4类似活期衍生物)。根据一实施方案，提供了组合物，其包含本发明的4类肽和胰岛素或胰岛素类似物。或者，提供了用于诱导体重减轻或防止体重增加的组合物，其包含SEQIDNO：942的序列和抗肥胖肽，还包含连接至SEQIDNO：942的氨基酸24的SEQIDNO：919(GPSSGAPPPS)的氨基酸序列。合适的抗肥胖肽包括美国专利5,691,309、6,436,435或美国专利申请20050176643中公开的那些抗肥胖肽，并且包括但不限于GLP-1、GIP(抑胃肽)、MP1、PYY、MC-4、瘦蛋白。
4类肽结构
在一实施方案中，提供了4类胰高血糖素相关的类似物肽，其中由谷氨酸或基于半胱磺酸的衍生物取代(胰高血糖素SEQIDNO：901的)位置9处的通常存在的天冬氨酸。更具体而言，在某些方面，第一氨基酸的缺失(脱-His)和由谷氨酸取代位置9处的天冬氨酸产生了4类肽。具有在胰高血糖素的位置9取代的磺酸取代基的4类胰高血糖素相关的类似物肽，行使类似于基于羧酸的氨基酸的功能，但是具有一些有关诸如溶解性的物理属性的关键差别。当高半胱磺酸(hCysSO3)取代常规脱-His中的位置9处的等构谷氨酸Glu9时，4类肽保留部分拮抗剂和弱激动剂。
在一实施方案中，提供了4类肽，其中最前的2至5个氨基酸被除去，并且位置9(根据SEQIDNO：901的编号)由hCys(SO3)、高谷氨酸、β-高谷氨酸或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸衍生物代替：
其中，X5为C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基，这提供了作为激素拮抗剂行使功能的化合物，该拮抗剂是高度特异性、高效的并且无污染激动剂属性。
根据一实施方案，提供了4类肽，其相对于SEQIDNO：901的野生型序列，包含通过以下方法而修饰的胰高血糖素肽：从N-末端缺失2至5个氨基酸残基，并且天然蛋白的位置9处的天冬氨酸残基由谷氨酸、高谷氨酸、β-高谷氨酸、半胱氨酸的磺酸衍生物或者具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸衍生物取代：
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基。
在一具体的实施方案中，通过高达3个氨基酸修饰，进一步修饰4类肽，该4类肽包含N-末端2至5个氨基酸残基的缺失，以及天然胰高血糖素位置9处Asp的取代。例如，4类肽可以包含1、2或3个保守性氨基酸修饰。可选地或另外，4类肽可以包含选自以下修饰的一个或多个氨基酸修饰：
A.由经由酯、醚、硫醚、酰胺或烷基胺连接而共价连接至酰基或烷基的氨基酸，取代4类肽的位置10、20和24(根据SEQIDNO：901的氨基酸编号)处的1或2个氨基酸或N或C末端氨基酸；
B.由选自Cys、Lys、鸟氨酸、高半胱氨酸和乙酰基-苯丙氨酸(Ac-Phe)的氨基酸取代4类肽的位置16、17、20、21和24(根据SEQIDNO：901的氨基酸编号)处的1个或2个氨基酸或者N-末端或C末端氨基酸，其中以上群组的氨基酸共价键合至亲水部分；
C.添加共价键合至4类肽的N-末端或C-末端的亲水部分的氨基酸；
D.由半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸取代位置15(根据SEQIDNO：901的编号)处的Asp；
E.由半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸取代位置16(根据SEQIDNO：901的编号)处的Ser；
F.由AIB在根据SEQIDNO：901的氨基酸编号的位置16、20、21和24的一个或多个位置处的取代；
G.根据SEQIDNO：901的编号的位置29处的氨基酸或位置28和29处的氨基酸的缺失；
H.由带电荷的氨基酸取代位置28处的Asn和位置29处的Thr(根据SEQIDNO：901的氨基酸编号)的每一个或两个，和/或在SEQIDNO：901的C-末端处添加1至2个带电荷的氨基酸；
I.由Leu或正亮氨酸取代位置27(根据SEQIDNO：901的编号)处的Met；
J.将具有任何SEQIDNOs：919-921和953的氨基酸序列的肽添加到SEQIDNO：901的C-末端，其中位置29(根据SEQIDNO：901的编号)处的Thr为Thr或Gly；以及
K.由酰胺或酯代替C-末端羧酸。
在具体实施方案中，4类肽包含上文所述的A、B或C或其组合的氨基酸修饰，或其组合。仍然在另一具体实施方案中，除了A、B和/或C的氨基酸修饰以外，4类肽还包含上文所述的任何D至K或其组合的氨基酸修饰。
在一实施方案中，4类肽包含胰高血糖素肽，其中从N-末端缺失最前的5个氨基酸，并且由羟基代替剩余的N-末端氨基(“PLA6类似物”)，从而产生SEQIDNO：939的肽。申请人发现，苯乳酸取代4类肽类似物中的苯丙氨酸进一步增强了这些4类肽类似物的效力，该4类肽类似物缺失最前的5个氨基酸和位置9处的谷氨酸的取代(相对于天然胰高血糖素)。
在一实施方案中，SEQIDNO：939的4类肽肽通过由具有以下一般结构的氨基酸取代位置4(天然胰高血糖素的位置9)处的天冬氨酸残基得到进一步修饰：
其中X6为C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基，且在一实施方案中，X6为C1-C3烷基，以及在另一实施方案中，X6为C2烷基。在一实施方案中，4类肽包含胰高血糖素肽，其中从N-末端缺失了最前的5个氨基酸，并且由半胱磺酸或高半胱磺酸取代位置4(天然胰高血糖素的位置9)处的天冬氨酸残基。在一实施方案中，4类肽包含胰高血糖素肽，其包含选自SEQIDNO：939、SEQIDNO：907和SEQIDNO：908的氨基酸序列。在一实施方案中，4类肽包含选自SEQIDNO：908的氨基酸序列，其中位置4处的氨基酸为高半胱磺酸。
在另一实施方案中，SEQIDNO：939的4类肽通过由谷氨酸、高谷氨酸、β-高谷氨酸或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸衍生物取代位置4(天然胰高血糖素的位置9)处的天冬氨酸残基，得到进一步修饰：
其中，X5为C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基。在一具体实施方案中，X5为C1或C2烷基。
然而，申请人发现，在由PLA取代脱1-5胰高血糖素类似物(des1-5glucagonanalog，即，最前的5个氨基酸缺失的胰高血糖素类似物)中的N-末端苯丙氨酸的情况下，并不要求位置4(天然胰高血糖素的位置9)处的天然天冬氨酸残基的其他取代就产生了表现出纯拮抗的类似物。该结果按照现有技术教导是令人惊讶的，该教导为，要产生胰高血糖素(2至29)类似物的高亲和力和强效拮抗剂，必须取代位置4处的天然天冬氨酸残基。PLA取代的使用将Asp9类似物的相对效力改善为与Glu9类似物和hCys(SO3H)9类似物相当的程度。
由其他苯丙氨酸类似物取代苯丙氨酸残基没有达到PLA取代的效力，该苯丙氨酸类似物包括3，4-2F-苯丙氨酸(3，4-2F-Phe)、2-萘基丙氨酸(2-Nal)、N-乙酰基-苯丙氨酸(Ac-Phe)、α-甲基氢化肉桂酸(MCA)和苄基丙二酸(BMA)。
用PLA在包括位置4和5在内的除了位置6(根据天然胰高血糖素的氨基酸编号)的位点处取代表明，PLA6类似物是比具有稍微延长的N-末端的胰高血糖素类似物略微更强效的拮抗剂。本发明还包括N-末端氨基由酰化和烷基化的“O-末端”肽取代的类似物。
而且，PLA6取代不仅增加拮抗剂的效力，还在聚乙二醇化中起到关键作用。可以选择性地将PLA6类似物聚乙二醇化而不恢复胰高血糖素激动。在没有PLA取代的情况下，类似物的聚乙二醇化令人惊讶地诱导了胰高血糖素激动。在聚乙二醇化的PLA6类似物中没有观察到这样的胰高血糖素激动。研究了聚乙二醇化的几个位点，包括位置3、6和19(天然胰高血糖素的位置8、11和19)以及N-末端氨基酸残基处的位置。在一实施方案中，聚乙二醇化在位置19(天然胰高血糖素的位置24)处，因为该位点表现出最强效和选择性的胰高血糖素拮抗。
在一实施方案中，4类肽包含A-B-C的一般结构，其中A选自：
(i)苯乳酸(PLA)；
(ii)PLA的含氧衍生物；
(iii)2至6个氨基酸的肽，其中该肽的2个连续氨基酸经由酯键或醚键连接；
B代表SEQIDNO：901的氨基酸i至26，其中i为3、4、5、6或7，并且任选地包含选自以下修饰的一个或多个氨基酸修饰：
(iv)位置9(根据SEQIDNO：901的氨基酸编号)处的Asp由Glu、Cys的磺酸衍生物、高谷氨酸、β-高谷氨酸或者具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸衍生物取代：
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基；
(v)由经由酯、醚、硫醚、酰胺或烷基胺连接而共价连接至酰基或烷基的氨基酸取代，位置10、20和24(根据SEQIDNO：901的氨基酸编号)处的1或2个氨基酸；
(vi)由选自Cys、Lys、鸟氨酸、高半胱氨酸和乙酰基-苯丙氨酸(Ac-Phe)的氨基酸取代位置16、17、20、21和24(根据SEQIDNO：901的氨基酸编号)处的1或2个氨基酸，其中该群组的氨基酸共价连接至亲水部分；
(vii)由半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸取代位置15(根据SEQIDNO：901的编号)处的Asp；
(viii)由半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸取代位置16(根据SEQIDNO：901的编号)处的Ser；
(ix)由AIB在根据SEQIDNO：901的氨基酸编号的位置16、20、21和24的一个或多个位置处取代；
并且，C选自：
(x)X；
(xi)X-Y；
(xii)X-Y-Z；和
(xiii)X-Y-Z-R10，
其中X为Met、Leu或Nle；Y为Asn或带电荷的氨基酸；Z为Thr、Gly、Cys、Lys、鸟氨酸(Orn)、高半胱氨酸、乙酰基苯丙氨酸(Ac-Phe)或带电荷的氨基酸；其中R10选自SEQIDNOs：919-921和953；以及
(xiv)任何(x)至(xiii)，其中由酰胺代替C-末端羧酸。
在具体方面，4类肽包含PLA的含氧衍生物。本文所用的“PLA的含氧衍生物”指包含PLA的修饰的结构的化合物，在所述修饰的结构中，O-R11代替羟基，其中R11为化学部分。在这一点上，PLA的含氧衍生物可以为，例如PLA的酯或PLA的醚。
制备PLA的含氧衍生物的方法在本领域是已知的。例如，当含氧衍生物为PLA的酯时，该酯可以通过PLA的羟基与带有羰基的亲核试剂的反应而形成。该亲核试剂可以为任何合适的亲核试剂，其包括但不限于胺或羟基。因此，PLA的酯可以包含通式XI的结构：
通式XI
其中，R7为PLA的羟基与带有羰基的亲核试剂反应形成的酯。
带有羰基的亲核试剂(其与PLA的羟基反应形成酯)可以为，例如羧酸、羧酸衍生物或羧酸的活化酯。羧酸衍生物可以为但不限于酰基氯、酸酐、酰胺、酯或腈。羧酸的活化酯可以为，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、甲苯磺酸酯(Tos)、碳二亚胺或六氟磷酸酯。在某些实施方案中，碳二亚胺为1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)、1，1’-羰基二咪唑(CDI)、盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)或1，3-二异丙基碳二亚胺(DICD)。在某些实施方案中，六氟磷酸酯选自六氟磷酸酯苯并三唑-1-基-氧-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸酯(BOP)、苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸酯(benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphate)(PyBOP)、2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(2-(1H-7-azabenzotriazol-1-yl)-1，1，3，3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate)(HATU)和邻苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟-磷酸酯(o-benzotriazole-N，N，N’，N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate)(HBTU)。
从与羟基(如，PLA的羟基)的反应制备醚的方法也是本领域已知的。例如，可以使PLA的羟基与卤代烷基或甲苯磺酸烷基醇反应形成醚键。
通常，R11的化学部分为不降低4类肽活性的化学部分。在某些实施方案中，化学部分增强4类肽的活性、稳定性和/或溶解性。
在具体实施方案中，经由含氧键(如，通过酯键或醚键)结合至PLA的化学部分为聚合物(如，聚聚亚烷基二醇)、碳水化合物、氨基酸、肽、诸如脂肪酸或类固醇的脂质。
在具体实施方案中，化学部分为氨基酸，该氨基酸任选地为肽的一部分，从而通式XI为缩酚酸肽(depsipeptide)。在这一点上，PLA可以在除了4类肽的N-末端氨基酸残基的位置处，从而该4类肽包含一个或多个(如，1、2、3、4、5、6个或更多个)位于PLA残基N-末端的氨基酸。例如，4类肽可以包含4类肽的位置n处的PLA，其中n为2、3、4、5或6。
位于PLA残基N-末端的氨基酸可以是合成或天然存在的。在具体实施方案中，N-末端PLA的氨基酸为天然存在的氨基酸。在一实施方案中，位于PLA的N-末端的氨基酸为天然胰高血糖素的N-末端氨基酸。例如，4类肽在N-末端可以包含任何SEQIDNOs：954-958的氨基酸序列，其中PLA经由酯键连接至苏氨酸：
SEQIDNO：954His-Ser-Gln-Gly-Thr-PLA
SEQIDNO：955Ser-Gln-Gly-Thr-PLA
SEQIDNO：956Gln-Gly-Thr-PLA
SEQIDNO：957Gly-Thr-PLA
SEQIDNO：958Thr-PLA
在替代性实施方案中，可以由除了天然胰高血糖素的氨基酸以外的氨基酸取代一个或多个N-末端氨基酸。例如，当4类肽包含作为位置5或6处的氨基酸的PLA时，位置1和/或位置2处的氨基酸可以为减少对二肽基肽酶IV切割的易感性的氨基酸。更具体而言，在某些实施方案中，4类肽的位置1为选自以下氨基酸的氨基酸：D-组氨酸、α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸和高组氨酸。更具体而言，在某些实施方案中，拮抗剂肽的位置2为选自以下氨基酸的氨基酸：D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸(AIB)。此外，例如，与天然胰高血糖素的天然谷氨酰胺残基不同，当4类肽包含作为位置4、5或6处的氨基酸的PLA时，4类肽的位置3处的氨基酸可以为谷氨酸。在本发明的示例性实施方案中，4类肽在N-末端可以包含任何SEQIDNOs：959-961的氨基酸序列。
对于包含通式XI的化合物的4类肽，聚合物可以为任何聚合物，只要其能够与PLA的羟基反应。聚合物可以为天然或通常包含带有羰基的亲核试剂的聚合物。或者，聚合物可以为衍生为包含带有羰基的聚合物。聚合物可以为任何以下化合物的衍生聚合物：聚酰胺；聚碳酸酯；聚烯烃及其衍生物，其包括聚亚烷基二醇、聚亚烷基氧化物、聚对苯二甲酸亚烷基酯；丙烯酸酯与甲基丙烯酸酯的聚合物，其包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷基酯)；聚乙烯基聚合物，其包括聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚(乙酸乙烯酯)和聚乙烯吡咯烷酮、聚乙醇酸交酯、聚硅氧烷、聚氨基甲酸酯及其共聚物；纤维素，其包括烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素，羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、羧乙基纤维素、三醋酸纤维素和纤维素硫酸钠盐；聚丙烯、聚乙烯，其包括聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)和聚(对苯二甲酸亚乙酯)及聚苯乙烯。
聚合物可以为生物可降解的聚合物，其包括合成生物可降解聚合物(如，乳酸与乙醇酸的聚合物、聚酸酐、聚原酸酯(poly(ortho)ester)、聚氨基甲酸酯、聚(丁酸)(poly(buticacid))、聚(戊酸)和聚(丙交酯-共-己内酯)(poly(lactide-cocaprolactone)))和天然生物可降解聚合物(如，藻酸盐和其他多糖，包括葡聚糖和纤维素、胶原蛋白、其化学衍生物(取代；诸如烷基、亚烷基的化学基团的增加；羟基化；氧化和由本领域技术人员做出的其他常规修饰)、白蛋白和其他亲水蛋白质(如，玉米醇溶蛋白和其他谷醇溶蛋白以及疏水蛋白至))以及上述的任何共聚物或混合物。通常，这些材料通过酶促水解或在体内暴露于水、通过表面或骨架溶蚀而降解。
聚合物可以为生物粘附聚合物，例如H.S.Sawhney，C.P.PathakandJ.A.HubbellinMacromolecules，1993，26，581-587描述的生物蚀解水凝胶(其教导并入本文)聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酸酐、聚丙烯酸、藻酸盐、壳聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)以及聚(丙烯酸十八烷基酯)。
在一实施方案中，聚合物为水溶性聚合物。合适的水溶性聚合物在本领域是已知的，并且包括例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素(HPC；Klucel)、羟丙基甲基纤维素(HPMC；Methocel)、硝基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羟丙基丁基纤维素、羟丙基戊基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素(Ethocel)、羟乙基纤维素、各种烷基纤维素和羟烷基纤维素、各种纤维素醚、醋酸纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、乙酸乙烯酯/巴豆酸共聚物、聚-甲基丙烯酸羟烷基酯、甲基丙烯酸羟甲酯、甲基丙烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、马来酸酐/甲基乙烯基醚共聚物、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠和钙、聚丙烯酸、酸性羧基聚合物、羧基聚亚甲基、羧基乙烯基聚合物、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚甲基乙烯基醚马来酸酐共聚物(polymethylvinyletherco-maleicanhydride)、羧甲基酰胺、甲基丙烯酸钾二乙烯基苯共聚物、聚氧乙烯乙二醇、聚环氧乙烷及上述的衍生物、盐和组合。
在一具体实施方案中，聚合物为聚亚烷基二醇，其包括，例如聚乙二醇(PEG)。
碳水化合物可以为任何碳水化合物，只要其包含或使得其包含具有α离去基团的羰基。例如，碳水化合物可以为经衍生包含具有α离去基团的羰基的碳水化合物。在这一点上，碳水化合物可以为以下糖的衍生形式：单糖(如，葡萄糖、半乳糖、果糖)、二糖(如，蔗糖、糖、麦芽糖)、寡糖(如，蜜三糖、水苏糖)、多糖(淀粉、淀粉酶、支链淀粉、纤维素、甲壳质、愈疮葡聚糖、昆布多糖、木聚糖、甘露聚糖、岩藻依聚糖、半乳甘露聚糖)。
对于包含通式XI的化合物的4类肽，脂质可以为包含具有α离去基团的羰基的任何脂质。例如，脂质可以为经衍生包含羰基的脂质。在这一点上，脂质可以为以下脂质的衍生物：脂肪酸(如，C4-C30脂肪酸、类二十烷酸、前列腺素、白细胞三烯、血栓烷、N-乙酰基乙醇胺)、甘油脂(如，单、二、三取代的甘油)、甘油磷酸脂(如，磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)、鞘脂(如，鞘氨醇、神经酰胺)、甾醇脂(如，类固醇、胆固醇)、异戊烯醇脂、糖脂(saccharolipid)或聚酮(polyketide)。油、蜡、胆固醇、甾醇、脂溶性维生素、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂。
在一实施方案中，R7的分子量为约100kDa或更小，如约90kDa或更小、约80kDa或更小、约70kDa或更小、约60kDa或更小、约50kDa或更小、约40kDa或更小。因此，R7的分子量可以是约35kDa或更小、约30kDa或更小、约25kDa或更小、约20kDa或更小、约15kDa或更小、约10kDa或更小、约5kDa或更小或约1kDa。
在替代性实施方案中，4类肽包含作为A的2至6个氨基酸的肽，其中该肽的2个连续氨基酸经由酯键或醚键连接。酯键或醚键可以位于，例如，氨基酸2与3、氨基酸3与4、氨基酸4与5或者氨基酸5与6之间。任选地，可以通过共价连接至另一化学部分进一步修饰肽，包括连接至聚合物(如，亲水聚合物)、烷基化或酰化。
对于包含一般结构A-B-C的4类肽，B代表天然胰高血糖素的氨基酸，如SEQIDNO：901的i至26，其中i为3、4、5、6或7，并且任选地包含一个或多个氨基酸修饰。在一具体实施方案中，B代表SEQIDNO：901的氨基酸7至26，并且任选地另外进行修饰。
在一实施方案中，通过高达3个氨基酸修饰来修饰B。例如，通过一个或多个保守性氨基酸修饰来修饰代表SEQIDNO：901的天然氨基酸序列的B。
在另一实施方案中，B包含一个或多个选自如本文所述的(iv)至(ix)的氨基酸修饰。在具体实施方案中，B包含氨基酸修饰(v)和(vi)之一或全部。在另一具体实施方案中，除了(v)和(vi)以外，B还包含选自(iv)、(vii)、(viii)和(ix)的氨基酸修饰之一或组合。
在另一具体实施方案中，4类肽在C-末端包含一个或多个带电荷的氨基酸。例如，Y和/或Z可以为带电荷的氨基酸，如Lys、Arg、His、Asp和Glu。仍然在另一实施方案中，4类肽包含位于Z的C-末端的1至2个带电荷的氨基酸(如，Lys、Arg、His、Asp和Glu)。在具体的方面，由1至2个带电荷的氨基酸跟随的Z不包含R10。
在一实施方案中，如本文所述，4类肽包含共价结合至4类肽的氨基酸残基的亲水部分。例如，4类肽可以包含共价连接至根据SEQIDNO：901的编号的位置1、16、20、21或24处的氨基酸的亲水部分。在另一实施方案中，亲水部分连接至4类肽的C-末端氨基酸，其在某些情况下为位于Z的C末端的1或11个氨基酸。仍然在另一实施方案中，当A为PLA、PLA-Phe或PLA-Thr-Phe时，亲水部分连接至PLA，其中PLA经修饰包含亲水部分。在另一实施方案中，向4类肽的N-末端或C-末端添加包含亲水部分的氨基酸。在另一实施方案中，如本文所述，4类肽包含酰基或烷基。例如，酰化或烷基化可以发生在根据SEQIDNO：901的编号的位置10、20或24处的氨基酸的侧链。在替代性实施方案中，酰化或烷基化离开4类肽的C-末端氨基酸的侧链而发生，其在某些情况下，是位于Z的C-末端的1或11个氨基酸。仍然在另一实施方案中，当A为PLA、PLA-Phe或PLA-Thr-Phe时，PLA经修饰包含酰基或烷基。
示例性实施方案
4类肽可以包含合成或天然存在的任何氨基酸，只要该肽的至少两个相邻氨基酸经由酯键或醚键连接。在具体实施方案中，肽包含天然胰高血糖素的氨基酸。例如，肽可以包含天然胰高血糖素(SEQIDNO：901)的j至6，其中j为1、2、3、4或5。或者，肽可以包含基于具有一个或多个氨基酸修饰的SEQIDNO：901的N-末端的氨基酸序列。位置1和/或位置2处的氨基酸可以为减少对二肽基肽酶IV切割的易感性的氨基酸。例如，肽可以在4类肽的位置1处包含选自以下氨基酸的氨基酸：D-组氨酸、α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸和高组氨酸。更具体而言，在某些实施方案中，拮抗剂肽的位置2为选自以下氨基酸的氨基酸：D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸(AIB)。此外，例如，与天然胰高血糖素的天然谷氨酰胺残基不同，4类肽的位置3处的氨基酸可以为谷氨酸。因此，4类肽可以包含以下氨基酸序列：
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Thr-Gly-Phe(SEQIDNO：968)、
Xaa2-Xaa3-Thr-Gly-Phe(SEQIDNO：969)或
Xaa3-Thr-Gly-Phe(SEQIDNO：970)；
其中，Xaa1选自：His、D-组氨酸、α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸和高组氨酸；Xaa2选自：Ser、D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸(AIB)；并且Xaa3为Gln或Glu。
本发明还包括这样的实施方案，其中4类肽的C-末端氨基酸具有取代存在于天然氨基酸的羧基的酰胺基团。
在4类肽被聚乙二醇化的某些实施方案中，4类肽包含缩短的胰高血糖素肽，特别是6-29，其中“N-末端”氨基酸为PLA(苯基-乳酸)。这样的胰高血糖素表现出独特的性质。它们是比具有天然N-末端苯丙氨酸的肽更强效的肽，并且它们抑制聚乙二醇化导致的任何胰高血糖素激动，这是用天然苯丙氨酸尚未观察到的。最后，尽管目前的文献认为取代位置9处的天然天冬氨酸是拮抗剂活性所必需的，但申请人发现了令人惊讶的结果，即这样的修饰在PLA6-(6-29)胰高血糖素类似物中不再是必需的。
在一实施方案中，4类肽的氨基酸由至少一个半胱氨酸残基取代，其中半胱氨酸残基的侧链由巯基反应性试剂就进一步修饰，该巯基反应性试剂包括例如，马来酰亚胺基、乙烯基砜、2-吡啶基硫代、卤代烷基和卤代酰基。这些巯基反应性试剂可以含有羧基、酮、羟基和醚基团以及其他亲水部分，如聚乙二醇单元。在替代性实施方案中，4类肽的氨基酸由赖氨酸取代，并且取代的赖氨酸残基的侧链利用胺反应性试剂进一步修饰，该胺反应性试剂例如诸如聚乙二醇的亲水部分的羧酸或醛的活性酯(琥珀酰亚胺基、酐等)。根据一实施方案，对应于天然肽的位置12的赖氨酸残基由精氨酸取代，并且插入单个赖氨酸取代对应于天然肽的位置1、16、17、20、21、24或29的一个氨基酸，或者将赖氨酸添加到4类肽的N-末端或C-末端。
在另一实施方案中，将对应于天然肽的位置27的甲硫氨酸残基改变为亮氨酸或正亮氨酸，以防止肽的氧化降解。
在某些实施方案中，在不影响对胰高血糖素受体的活性和/或效力的情况下，通过胰高血糖素肽C-末端的1或2个氨基酸的截断或缺失(即截断天然胰高血糖素的位置29处或位置28和29处的氨基酸)，进一步修饰本文所述的4类肽。在这一点上，本文所述的4类肽可以，例如，基本上由具有一个或多个导致本文所述的4类肽活性的修饰的天然胰高血糖素肽(SEQIDNO：901)的氨基酸1-27、1-28、2-27、2-28、3-27、3-28、4-27、4-28、5-27、5-28、6-27或6-28组成，或者由具有一个或多个导致本文所述的4类肽活性的修饰的天然胰高血糖素肽(SEQIDNO：901)的氨基酸1-27、1-28、2-27、2-28、3-27、3-28、4-27、4-28、5-27、5-28、6-27或6-28组成。
本发明公开的4类肽还包含在已知对胰高血糖素肽的功能不重要的位置处的氨基酸取代。在一实施方案中，取代是在选自以下位置的1、2或3个位置处的保守性氨基酸取代：SEQIDNO：939的2、5、6、7、8、9、12、13、14、15、16、19、22、23或24。在一实施方案中，4类肽包含SEQIDNO：942的衍生肽，其中胰高血糖素肽包含选自位置2、5、6、8、9、12、13和14的1至3个氨基酸位置处的相对于SEQIDNO：942的其他氨基酸取代。在一实施方案中，SEQIDNO：942的位置2、5、6、8、9、12、13和14处的取代为保守性氨基酸取代。在一实施方案中，由半胱氨酸或赖氨酸取代对应于天然肽的位置16、17、20、21、24或29处，更特别地是位置21和/或24处的氨基酸，其中PEG链共价连接至取代的半胱氨酸残基或赖氨酸残基。
根据一实施方案，修饰的4类肽包含2条或更多条共价结合至肽的聚乙烯链，其中胰高血糖素链的总分子量为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿。在一实施方案中，聚乙二醇化的4类肽包含选自SEQIDNO：912和SEQIDNO：922的肽，其中所述肽包含连接至位置11和19处的氨基酸的聚乙二醇链，并且两条PEG链的组合分子量为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿。
根据一实施方案，提供了4类肽，其包含选自以下序列的修饰的胰高血糖素肽：
R1-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R2(SEQIDNO：909)、
R1-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R2(SEQIDNO：910)、
R1-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R2(SEQIDNO：911)和
R1-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R2(SEQIDNO：912)，
其中位置4处的Xaa＝天冬氨酸、谷氨酸、半胱磺酸或高半胱磺酸；位置7处的Xaa＝Lys或Arg；位置10处的Xaa为天冬氨酸、半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸；位置11处的Xaa为Ser、Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸；位置16处的Xaa为Asp、Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸；位置19处的Xaa为Gln、Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸和乙酰基苯丙氨酸；位置22处的Xaa＝Met、Leu或Nle；R1为OH或NH2，并且R2为COOH或CONH2，其中肽在以下位置处被聚乙二醇化：SEQIDNO：909的位置11、SEQIDNO：910的位置16、SEQIDNO：911的位置19以及SEQIDNO：912的位置16和19，其条件是当位置4处的Xaa＝天冬氨酸时，则R1为OH。根据一实施方案，肽包含SEQIDNO：909、SEQIDNO：910或SEQIDNO：911的序列，其中R1为OH并且R2为CONH2。在一实施方案中，肽包含SEQIDNO：909、SEQIDNO：910或SEQIDNO：911的序列，其中R1为OH，R2为CONH2，并且位置4处的氨基酸为天冬氨酸，并且在另一实施方案中，这样的肽包含羧基末端延伸，该羧基末端延伸包含SEQIDNO：919的序列。
根据一实施方案，肽包含选自SEQIDNO：909、SEQIDNO：910、SEQIDNO：913、SEQIDNO：914和SEQIDNO：916的序列，其中肽在以下位置被聚乙二醇化：SEQIDNO：909和SEQIDNO：913的位置11、SEQIDNO：910的位置16以及SEQIDNO：910和SEQIDNO：914的位置19。在一实施方案中，胰高血糖素激动剂包含SEQIDNO：913或SEQIDNO：914的肽。在一实施方案中，本文公开的4类肽的C-末端氨基酸具有代替存在于天然氨基酸的羧酸基团的酰胺基团。根据一实施方案，4类肽包含SEQIDNO：918的序列。
根据一实施方案，提供了4类肽，其中已将血浆蛋白共价连接至该肽的氨基酸侧链，以改善胰高血糖素肽的溶解性、稳定性和/或药物动力学。例如，可以将血清白蛋白共价结合至本文羧酸的4类肽。在一实施方案中，血浆蛋白共价结合至对应于天然胰高血糖素肽的位置16、17、20、21、24或29的氨基酸。更具体而言，在一实施方案中，血浆蛋白结合至对应于天然胰高血糖素肽的位置16或24的氨基酸，其中4类肽包含SEQIDNO：903、SEQIDNO：904、SEQIDNO：905、SEQIDNO：906、SEQIDNO：907、SEQIDNO：908、SEQIDNO：909、SEQIDNO：911、SEQIDNO：912、SEQIDNO：922、SEQIDNO：923、SEQIDNO：924、SEQIDNO：925、SEQIDNO：926、SEQIDNO：927、SEQIDNO：928、SEQIDNO：936和SEQIDNO：939的序列。在一实施方案中，4类肽包含选自SEQIDNO：909、SEQIDNO：910、SEQIDNO：911和SEQIDNO：912的肽。
根据一实施方案，提供了4类肽，其中已将代表免疫球蛋白分子的Fc部分的线性氨基酸序列共价连接至本文公开的4类肽的氨基酸侧链，以改善胰高血糖素肽的溶解性、稳定性和/或药物动力学。例如，可以将代表免疫球蛋白分子的Fc部分的氨基酸序列共价结合至SEQIDNO：907、SEQIDNO：939的胰高血糖素肽或其胰高血糖素类似物的位置11、12、15、16、19、21或24。在一实施方案中，将Fc肽共价结合至SEQIDNO：906、SEQIDNO：907、SEQIDNO：908或SEQIDNO：936的4类肽的位置11或19。Fc部分通常分离自IgG，但是来自任何免疫球蛋白的Fc肽片段应当功能相当。在一实施方案中，胰高血糖素肽选自SEQIDNO：903、SEQIDNO：904、SEQIDNO：905、SEQIDNO：907SEQIDNO：908和SEQIDNO：939，其中将Fc部分连接至天然胰高血糖素肽的16、17、20、21、24或29的相应部分。在一实施方案中，4类肽包含选自SEQIDNO：909、SEQIDNO：910、SEQIDNO：911和SEQIDNO：912的胰高血糖素肽，其中Fc肽分别结合至位于SEQIDNO：909、SEQIDNO：910、SEQIDNO：911的位置11、16或19处的氨基酸的侧链以及位于SEQIDNO：912的位置11和19两处的氨基酸的侧链。
在本发明的某些实施方案中，4类肽包含任何SEQIDNOs：962、964-967和971的氨基酸序列。
改善溶解性的修饰
可以进一步修饰将4类肽以改善肽在生理pH的水溶液中的溶解性，同时在某些方面保留胰高血糖素拮抗剂活性。在对应于天然肽的位置1、16、17、20、21、24和29的位置处，或者在C-末端处引入亲水基团可以改善所得的4类肽在生理pH的溶液中的溶解性，同时保留母体化合物拮抗剂活性。因此，在一实施方案中，进一步修饰本发明公开的4类肽，以包含一个或多个亲水基团，该亲水基团共价连接至对应于天然胰高血糖素肽的氨基酸位置1、16、17、20、21、24和29的氨基酸的侧链，或者N-末端氨基酸或C-末端氨基酸的侧链。在另一实施方案中，对应于天然胰高血糖素肽的氨基酸位置16和24的氨基酸的侧链共价结合至亲水基团，并且在一实施方案中，亲水基团为聚乙二醇(PEG)。
申请人还发现，天然胰高血糖素可以通过在其羧基末端引入电荷来修饰以增强肽的溶解性，同时保留肽的激动剂属性。增强的溶解性允许在接近中性pH值的条件下制备和储存胰高血糖素溶液。在相对中性pH值(如，约6.0至约8.0的pH值)下配制胰高血糖素溶液改善了4类肽的长期稳定性。
申请人还预料，可以类似地修饰本文公开的4类肽以增强它们在相对中性pH值(如，约6.0至约8.0的pH值)的水溶液中的溶解性，同时保留母体蛋白的拮抗剂属性。因此，本发明的一实施方案涉及SEQIDNO：939的4类肽，其相对于存在于野生型胰高血糖素(SEQIDNO：901)的位置6-29处的天然氨基酸被进一步修饰，以通过由带电荷的氨基酸取代天然不带电荷的氨基酸，或者向羧基末端添加带电荷的氨基酸，向肽增加电荷。根据一实施方案，由带电荷的氨基酸代替SEQIDNO：939的4类肽的1至3个不带电荷的天然氨基酸。在一实施方案中，带电荷的氨基酸选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。更具体而言，申请人发现，由带电荷的氨基酸取代相对于天然胰高血糖素的相应位置28和/或29处的天然存在的氨基酸，和/或在4类肽的羧基末端处添加1至2个带电荷的氨基酸，增强了4类肽在生理相关pH值(即，约6.5至约7.5的pH值)的水溶液中的溶解性和稳定性。因此，预期本文所公开的4类肽的这类修饰对在水溶液，特别是在约5.5至约8.0的的pH值的水溶液中的稳定性有类似的效果，同时保留母体肽的生物活性。
根据一实施方案，通过以下方法修饰SEQIDNO：939的4类肽：由带负电荷的氨基酸(如，天冬氨酸或谷氨酸)取代相对于天然胰高血糖素的相应位置28和/或29处的天然氨基酸，和任选地向肽的羧基末端添加带负电荷的氨基酸(如，天冬氨酸或谷氨酸)。在替代性实施方案中，通过以下方法修饰SEQIDNO：939的4类肽：由带正电荷的氨基酸(如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)取代相对于天然胰高血糖素的相应位置29处的天然氨基酸，和任选地向肽的羧基末端添加1或2个带正电荷的氨基酸(如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)。根据一实施方案，提供了具有改善的溶解性和稳定性的4类肽，其中该肽包含SEQIDNO：941的氨基酸序列，其条件是由酸性氨基酸取代SEQIDNO：941的位置23或24处的至少1个氨基酸，和/或在SEQIDNO：941的羧基末端添加另外的酸性氨基酸。在一实施方案中，酸性氨基酸独立地选自Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸。
根据一实施方案，提供了具有改善的溶解性和稳定性的4类肽，其中，激动剂包含SEQIDNO：941、SEQIDNO：942、SEQIDNO：943或SEQIDNO：944的氨基酸序列，其中由非天然氨基酸残基取代位置23或24处的至少一个氨基酸(即，存在于类似物的位置23或24处的至少一个氨基酸为不同于存在于SEQIDNO：907的相应位置处的氨基酸的酸性氨基酸)。根据一实施方案，提供了包含SEQIDNO：941或942的序列的胰高血糖素激动剂，其条件是当位置23处的氨基酸为天冬酰胺并且位置24处的氨基酸为苏氨酸时，肽还包含添加到4类肽的羧基末端的1至2个氨基酸，该氨基酸独立地选自Lys、Arg、His、Asp或Glu。
在另一实施方案中，可以通过将亲水部分共价连接至位置11、12、15、16、19或24处的氨基酸残基来改善SEQIDNO：942的4类肽的溶解性，在一实施方案中，亲水部分连接至11、16或19处的氨基酸；在另一实施方案中，亲水部分连接至氨基酸19。在一实施方案中，亲水部分为血浆蛋白或免疫球蛋白的Fc部分，并且在替代性实施方案中，亲水部分为亲水碳水化合物链。在一实施方案中，亲水部分是分子量为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿的聚乙二醇。在另一实施方案中，亲水部分是分子量为至少约20,000道尔顿的聚乙二醇。在一实施方案中，聚乙烯修饰的4类肽包含SEQIDNO：909、SEQIDNO：910、SEQIDNO：911、SEQIDNO：912、SEQIDNO：943、SEQIDNO：944或SEQIDNO：945的氨基酸序列。
改善稳定性的修饰
天然胰高血糖素的位置15-16处的Asp-Ser序列已经被鉴定为独特的不稳定二肽，其导致天然激素在水性缓冲液中过早化学切割。例如，当在37℃下的0.01NHCl中保持两周时，超过50％的天然胰高血糖素可以被切割为片段。两种释放的切割肽1-15和16-29缺乏胰高血糖素样生物活性，并因而代表了对胰高血糖素及其相关类似物的水性预形成(aqueouspre-formulation)的限制。已经观察到由Glu选择性地化学取代天然胰高血糖素肽的位置15处的Asp几乎消除了15-16肽键的化学切割。
因此，预期可以类似地修饰本发明的4类肽，以减少它们在水性缓冲液中对过早化学切割的易感性。根据一实施方案，还可以进一步修饰本文所述的4类肽，以增强它们在水溶液中的稳定性，该修饰是通过由选自半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸的氨基酸代替位于天然胰高血糖素肽的位置15处的天然天冬氨酸实现。根据一实施方案，可以由选自半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸的氨基酸取代SEQIDNO：939的4类肽的位置10处的天冬氨酸残基；在一实施方案中，由谷氨酸代替SEQIDNO：939的位置10处的天然天冬氨酸。根据一实施方案，提供了具有水溶液中改善的稳定性的4类肽，其中拮抗剂包含选自SEQIDNO：936、SEQIDNO：940和SEQIDNO：942的序列。在另一实施方案中，4类肽是酰胺化的。
根据一实施方案，还可以通过由谷氨酸、半胱磺酸、高-谷氨酸或高-半胱磺酸取代位置16(根据天然胰高血糖素的编号)处的丝氨酸，实现通过减少本文所述的4类肽的降解而增加稳定性。在一具体实施方案中，由谷氨酸代替位置16(根据天然胰高血糖素序列编号)处的丝氨酸。在更具体的方面，包含这类修饰的4类肽包含C-末端羧酸，并且未被酰胺化。
根据一实施方案，提供了包含选自以下序列的胰高血糖素肽的4类肽：SEQIDNO：907、SEQIDNO：936、SEQIDNO：939、SEQIDNO：940、SEQIDNO：941、SEQIDNO：942、SEQIDNO：943和SEQIDNO：944，其还被对应于天然胰高血糖素肽的位置11、12、15、16、19和/或24的位置处的一个或多个另外的氨基酸取代修饰，其中氨基酸取代包含由具有侧链的氨基酸的取代，所述侧链适于与包括例如PEG在内的亲水部分交联。肽可以由天然存在的氨基酸或合成(非天然存在)的氨基酸取代。合成或非天然存在的氨基酸指在体内不天然存在，但是可以被并入本文所述的肽结构中的氨基酸。在一实施方案中，提供了4类肽，其中该肽包含SEQIDNO：907、SEQIDNO：936、SEQIDNO：939、SEQIDNO：940、SEQIDNO：941、SEQIDNO：942、SEQIDNO：943和SEQIDNO：944的序列，并且还包含结合至天然胰高血糖素肽的相应位置21或24的聚乙烯链。在另一实施方案中，修饰4类肽的C-末端，以由酰胺基团代替羧酸基团。
融合肽和偶联物
本公开还包括4类肽融合肽，其中第二肽已与4类肽的C-末端融合。更具体而言，融合肽可以包含SEQIDNO：944的4类肽肽，其还包含连接至4类肽的C-末端氨基酸的SEQIDNO：919(GPSSGAPPPS)、SEQIDNO：920(LysArgAsnArgAsnAsnIleAla)或SEQIDNO：921(LysArgAsnArg)的氨基酸序列。在一实施方案中，SEQIDNO：919(GPSSGAPPPS)的氨基酸序列通过肽键结合至SEQIDNO：942的4类肽的氨基酸24。在另一实施方案中，融合肽包含SEQIDNO：907、SEQIDNO：936、SEQIDNO：939、SEQIDNO：940、SEQIDNO：941或SEQIDNO：943的4类肽肽，其还包含连接至4类肽的氨基酸24的SEQIDNO：919(GPSSGAPPPS)的氨基酸序列。在另一实施方案中，融合肽包含SEQIDNO：907、SEQIDNO：936、SEQIDNO：937、SEQIDNO：938、SEQIDNO：939、SEQIDNO：941或SEQIDNO：943的4类肽肽，其还包含连接至4类肽的氨基酸24的SEQIDNO：920、SEQIDNO：921或SEQIDNO：953的氨基酸序列。在一实施方案中，4类肽融合肽包含选自SEQIDNO：946和SEQIDNO：947的序列。在另一实施方案中，修饰融合肽的C-末端以由酰胺基团代替羧酸基团。
在一实施方案中，提供了4类肽融合肽，其中融合肽的4类肽部分选自SEQIDNO：903、SEQIDNO：904、SEQIDNO：905、SEQIDNO：906、SEQIDNO：907、SEQIDNO：908、SEQIDNO：909、SEQIDNO：911、SEQIDNO：912、SEQIDNO：913、SEQIDNO：914、SEQIDNO：915、SEQIDNO：910、SEQIDNO：916、SEQIDNO：917、SEQIDNO：918和SEQIDNO：939，并且SEQIDNO：919的序列与4类肽部分的羧基末端融合，其中当存在PEG链时，PEG链的分子量为500道尔顿至40,000道尔顿。更具体而言，在一实施方案中，4类肽节段选自SEQIDNO：913、SEQIDNO：914、SEQIDNO：915、SEQIDNO：916、SEQIDNO：946和SEQIDNO：947，其中PEG链为约500道尔顿至约5,000道尔顿；更具体而言，在一实施方案中，PEG链为约1,000道尔顿。在另一实施方案中，修饰C-末端，以由酰胺基团代替羧酸基团。
4类肽还可以包含添加到羧基末端的1至2个带电荷的氨基酸。在另一实施方案中，其中向SEQIDNO：944的羧基末端添加1至2个带电荷的氨基酸，氨基酸为带负电荷的的氨基酸，其包括例如谷氨酸和天冬氨酸。在一实施方案中，4类肽包含SEQIDNO：942的的序列，其中至少一个相对于天然胰高血糖素肽的相应位置27和28包含选自天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸，并且其中任选地修饰SEQIDNO：942，以包括添加到羧基末端的1到2个带负荷的氨基酸。在一实施方案中，带负电荷的氨基酸为谷氨酸或天冬氨酸。
可以将本文公开的4类肽与包括例如胰岛素在内的其他活性剂组合，以治疗特征为过量的胰高血糖素活性的疾病或疾病状况。在一实施方案中，可以与胰岛素联合给予4类肽以帮助保持糖尿病患者的稳定血糖水平，所述4类肽被修饰为共价结合至分子量大于10,000道尔顿的PEG链。可以将本公开的4类肽与胰岛素作为单一组合物共给药，作为单独的溶液同时给药，或者可选择地，可以互相不同时地给予胰岛素和4类肽。在一实施方案中，在互相给药的12小时内给予包含胰岛素的组合物和包含4类肽的组合物。4类肽相对于给予的胰岛素的确切比率部分地取决于患者的胰高血糖素水平的测定，并且可以通过常规实验来测定。
二聚体肽
本公开还包括本文公开的修饰的4类肽的多聚体。2个或更多个修饰的4类肽可以利用领域技术人员已知的标准连接剂和方法连接在一起。例如，可以通过使用双官能巯基交联物和双官能胺交联物在两个修饰的4类肽之间形成二聚体，特别是对于已经由半胱氨酸残基、赖氨酸残基、鸟氨酸残基、高半胱氨酸残基或乙酰基苯丙氨酸残基取代的4类肽(例如，在位置11、16或19处)(如，SEQIDNO：909、SEQIDNO：910、SEQIDNO：911和SEQIDNO：912)。二聚体可以为同型二聚体或者可以为异源二聚体。在一实施方案中，在独立地选自以下序列的两个4类肽之间形成二聚体：SEQIDNO：908、SEQIDNO：909、SEQIDNO：910、SEQIDNO：911、SEQIDNO：912、SEQIDNO：945、SEQIDNO：946或SEQIDNO：947，其中两个肽经由连接至每个肽的位置11、每个肽的位置16或每个肽的位置19或其组合的连接物互相连接在一起。在一实施方案中，连接是各自的4类肽肽的Cys11与Cys11、Cys19与Cys19或Cys11与Cys19残基之间的二硫键。
类似地，二聚体可以在独立地选自以下序列的两个4类肽肽之间形成：SEQIDNO：903、SEQIDNO：904、SEQIDNO：905、SEQIDNO：906、SEQIDNO：907、SEQIDNO：908、SEQIDNO：909、SEQIDNO：910、SEQIDNO：911、SEQIDNO：912、SEQIDNO：936，SEQIDNO：937、SEQIDNO：938、SEQIDNO：939和SEQIDNO：942，其中在独立地选自相对于天然胰高血糖素肽的位置16、21和24的氨基酸位置之间形成连接。
根据一实施方案，提供了包含两个4类肽的4类肽二聚体，每个4类肽都包含SEQIDNO：946的序列，其中两个拮抗剂通过氨基酸位置25的二硫键互相连接。在另一实施方案中，提供了包含两个4类肽的4类肽二聚体，每个4类肽都包含SEQIDNO：947的序列，其中两个拮抗剂通过氨基酸位置35的二硫键互相连接。在一实施方案中，从SEQIDNO：946和SEQIDNO：947的4类肽形成二聚体，其中位置10处的氨基酸为谷氨酸。
在一实施方案中，二聚体包括4类肽融合肽的同型二聚体，该融合肽选自SEQIDNO：907、SEQIDNO：908、SEQIDNO：936、SEQIDNO：937、SEQIDNO：940、SEQIDNO：939、SEQIDNO：940、SEQIDNO：941、SEQIDNO：942以及所述4类肽的药用可接受的盐。根据一实施方案，提供了包含经由连接物结合至第二4类肽的第一4类肽的二聚体，其中二聚体的第一肽和第二肽独立地选自SEQIDNO：907、SEQIDNO：908、SEQIDNO：936、SEQIDNO：937、SEQIDNO：939、SEQIDNO：940、SEQIDNO：941和SEQIDNO：942以及所述胰高血糖素多肽的药用可接受的盐。在另一实施方案中，二聚体的第一4类肽和第二4类肽独立地选自SEQIDNO：907、SEQIDNO：908、SEQIDNO：936和SEQIDNO：939。
在另一实施方案中，二聚体包括4类肽的同型二聚体，该4类肽选自SEQIDNO：923、SEQIDNO：924、SEQIDNO：925、SEQIDNO：926、SEQIDNO：927、SEQIDNO：928、SEQIDNO：929、SEQIDNO：930、SEQIDNO：931。在另一实施方案中，提供了4类肽二聚体，其中该二聚体的第一肽和第二肽包含独立地选自以下序列的氨基酸序列：SEQIDNO：923、SEQIDNO：924、SEQIDNO：925、SEQIDNO：926、SEQIDNO：927和SEQIDNO：928。在另一实施方案中，二聚体包括4类肽的同型二聚体，该4类肽选自SEQIDNO：909、SEQIDNO：911和SEQIDNO：912，其中该肽还包含共价结合至胰高血糖素肽的位置11或19的聚乙二醇链。
4类胰高血糖素相关的类似物肽可以包含任何SEQIDNOs：901-971的氨基酸序列，并且任选地具有保留胰高血糖素拮抗剂活性的高达1、2、3、4或5个其他修饰。
5类胰高血糖素相关的类似物肽
在某些实施方案中，胰高血糖素相关的类似物肽为5类胰高血糖素相关的类似物肽(参见，例如国际(PCT)专利申请PCT/US2008/081333，其通过引用整体并入本文)。
活性
在某些方面，5类胰高血糖素相关的类似物肽(在下文中称为“5类肽”)可以为用于期望抑制胰高血糖素激动然而期望同时刺激GLP-1活性的任何环境中的胰高血糖素拮抗剂/GLP-1激动剂。例如，与GLP-1刺激联合的胰高血糖素拮抗剂活性可以用于治疗糖尿病，其中在高血糖的临床前模型中已经证明，胰高血糖素拮抗降低血糖，并且GLP-1活性与胰岛素产生有关。已知表现出GLP-1活性的化合物可用于治疗肥胖和防止体重增加。
在某些方面，认为5类肽适合于以前对其他胰高血糖素拮抗剂/GLP-1激动剂所述的任何用途。这两种活性分别被证明对于代谢综合征的治疗是高度期望的属性，特别是糖尿病和肥胖。胰高血糖素拮抗剂活性可用于期望抑制胰高血糖素激动的任何环境中。GLP-1激动的存在还抑制胰高血糖素从胰脏的内源性分泌，同时刺激胰岛素合成和分泌。这两种药理作用以协同的方式起作用从而将代谢异常正常化。因此，5类肽可以用于治疗高血糖，或者治疗高胰高血糖素血液水平或高血糖水平导致的其他代谢疾病。根据一实施方案，要利用诸如本文公开的5类肽的胰高血糖素拮抗剂/GLP-1激动剂治疗的患者为饲养的动物；在另一实施方案中，要治疗的患者为人。研究表明，糖尿病患者中胰高血糖素抑制的缺乏通过加速的糖原分解部分地促进了饭后高血糖。口服葡萄糖耐受测试(OGTT)期间并且在存在或不存在生长抑素诱导的胰高血糖素抑制的情况下的血糖分析显示，具有较高胰高血糖素水平的个体中葡萄糖增加显著。因此，本文所述的胰高血糖素拮抗剂/GLP-1激动剂或5类肽可以用于治疗高血糖，并且预期对治疗包括胰岛素依赖性或非胰岛素依赖性的I型糖尿病、II型糖尿病或妊娠糖尿病在内的各种类型的糖尿病和减少包括肾病、视网膜病和血管疾病在内的糖尿病并发症是有用的。
预期减少食欲或促进体重减轻的此类方法可用于减少体重；防止体重增加；或治疗包括药物诱导的肥胖在内的各种原因的肥胖以及减少与肥胖有关的并发症，包括血管疾病(冠状动脉疾病、中风、外周血管疾病、缺血再灌注等)、高血压、II型糖尿病的发作、高血脂和肌肉骨骼疾病。
可以利用标准药用可接受的载体和本领域技术人员已知的给药途径，配制包含5类肽的药物组合物并将其给予患者。因此，本公开还包括药物组合物，该药物组合物包含与药用可接受的载体组合的一种或多种本文公开的5类肽。药物组合物可以包含作为唯一的药物活性组分的5类肽，或者可以将5类肽与一种或多种另外的活性剂组合。根据一实施方案，提供了包含5类肽和胰岛素或胰岛素类似物的组合物。或者，提供了用于诱导体重减轻或防止体重增加的组合物，其包含SEQIDNO：1015或SEQIDNO：1051的序列和抗肥胖肽，还包含连接至SEQIDNO：1015或SEQIDNO：1051的氨基酸24的SEQIDNO：1021(GPSSGAPPPS)或SEQIDNO：1050的氨基酸序列。合适的抗肥胖肽包括美国专利5,691,309、6,436,435或美国专利申请20050176643中公开的那些抗肥胖肽。
5类肽结构
根据一实施方案，提供了包含胰高血糖素肽的5类肽，该胰高血糖素肽通过以下方式受到修饰：从N-末端缺失了最前的1至5个氨基酸(如，最前的1个氨基酸、最前的2个氨基酸、最前的3个氨基酸、最前的4个氨基酸、最前的5个氨基酸)；并且稳定化合物C-末端部分的α-螺旋结构(根据野生型胰高血糖素SEQIDNO：1001的氨基酸编号，在氨基酸位置12至29附近)，这是通过例如选自位置12与16、16与20、20与24以及24与28(相对于天然胰高血糖素肽序列)的氨基酸对的侧链由氢键或诸如形成盐桥的粒子相互作用的彼此连接，或者通过共价键实现的。或者，通过在保留期望的活性的位置处引入-个或多个α，α-二取代的氨基酸，实现在残基12至29附近的α-螺旋的稳定。在某些实施方案中，由α，α-二取代的氨基酸取代5类肽或其类似物的位置16、17、18、19、20、21、24或29(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)处的1、2、3、4或更多个位置。例如，由氨基异丁酸(AIB)取代5类肽或其类似物的位置16(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)，在缺乏盐桥或内酰胺的情况下，提供了稳定的α螺旋。在某些实施方案中，由AIB取代位置16、20、21或24(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的1、2、3或更多个位置。
根据一实施方案，提供了5类肽，其中该肽表现出至少80％的天然GLP-1对GLP-1受体所实现的最大激动，并且表现出这样的胰高血糖素拮抗剂活性，其将对胰高血糖素受体的最大胰高血糖素诱导的cAMP产生减少至少约50％，如通过在体外测定中通过cAMP产生所测量的。在一实施方案中，5类肽表现出至少90％的天然GLP-1对GLP-1受体的活性，并且表现出这样的胰高血糖素拮抗剂活性，其将对胰高血糖素受体的最大胰高血糖素诱导的cAMP产生减少至少约80％。
根据一实施方案，5类肽包含SEQIDNO：1002的衍生肽，其中该肽相对于SEQIDNO：1002在选自位置1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、19、22和24的1至3个氨基酸位置处还包含其他氨基酸取代，并且表现出至少90％的天然GLP-1对GLP-1受体的活性，而且表现出这样的胰高血糖素拮抗剂活性，其将对胰高血糖素受体的最大胰高血糖素诱导的cAMP产生减少至少约80％。
在某些实施方案中，通过例如形成共价或非共价分子内桥，或者通过位置12-29附近的氨基酸由α螺旋稳定氨基酸(如，α，α-二取代的氨基酸)的取代和/或插入来稳定5类肽C-末端部分的α-螺旋结构(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号的氨基酸12-29附近)。在某些实施方案中，由诸如氨基异丁酸(AIB)的α，α-二取代的氨基酸取代5类肽或其类似物的位置16、17、18、19、20、21、24或29(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的1、2、3、4个或更多个位置。例如，由氨基异丁酸(AIB)取代5类肽或其类似物的位置16(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)，在缺乏盐桥或内酰胺的情况下，提供了稳定的α螺旋。
在一实施方案中，5类肽包含SEQIDNO：1015或SEQIDNO：1051，更具体而言，选自以下序列的序列：SEQIDNO：1005、SEQIDNO：1006、SEQIDNO：1007、SEQIDNO：1008、SEQIDNO：1009、SEQIDNO：1016、SEQIDNO：1017、SEQIDNO：1018、SEQIDNO：1019、SEQIDNO：1022、SEQIDNO：1023、SEQIDNO：1024和SEQIDNO：1025。在其他实施方案中，5类肽包含SEQIDNO：1015或SEQIDNO：1051的衍生肽，其中该肽相对于SEQIDNO：1015或SEQIDNO：1051在选自位置1、2、5、6、8、9、12、13和14的1至3个氨基酸位置处还包含另一氨基酸取代。在一实施方案中，位置1、2、5、6、8、9、12、13和14处的取代为保守性氨基酸取代。在一实施方案中，由甘氨酸取代SEQIDNO：1005或SEQIDNO：1006的位置24处的苏氨酸。
根据一实施方案，5类肽代表该肽的另一修饰，其中除了N-末端缺失以外，例如，还修饰天然胰高血糖素肽的位置6处的苯丙氨酸，以包含代替N-末端氨基的羟基。在另一实施方案中，由诸如酰胺或酯的电中性基团代替C-末端氨基酸的天然羧酸。
根据一实施方案，制备了5类肽，其中天然胰高血糖素最前的3至5个氨基酸缺失，由选自谷氨酸、高谷氨酸、β-高谷氨酸、半胱氨酸的磺酸衍生物或具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸取代相对于天然胰高血糖素肽的位置9处的氨基酸：
其中，X5为C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基，并且经由例如，在相对于天然胰高血糖素肽的氨基酸12与16的侧链或者氨基酸16与20的侧链之间形成内酰胺桥，稳定胰高血糖素C-末端部分的α-螺旋结构(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号的氨基酸12-29附近)。能够共价键合以形成7原子连接桥的氨基酸对的实例在本公开中做了详细描述。在一实施方案中，半胱氨酸的磺酸衍生物为半胱磺酸或高半胱磺酸。
在一实施方案中，提供了5类肽，其包含选自SEQIDNO：1005、SEQIDNO：SEQIDNO：1006、SEQIDNO：1007或SEQIDNO：1008的氨基酸序列，其中所述肽包含在以下位置形成的内酰胺环：SEQIDNO：1005的氨基酸7与11的侧链之间、SEQIDNO：1006的氨基酸11与15的侧链之间、SEQIDNO：1007的位置15与19的侧链之间以及SEQIDNO：1008的位置19与24的侧链之间，每个所述序列经进一步修饰包含共价结合至所述肽的亲水部分。更具体而言，在一实施方案中，通过聚乙二醇链的共价连接修饰每个带有内酰胺的5类肽。例如，对于包含SEQIDNO：1005的5类肽，在选自12、15、16、19和24的位置将该肽聚乙二醇化；对于包含SEQIDNO：1006的5类肽，在选自12、16、19和24的位置将该肽聚乙二醇化；对于包含SEQIDNO：1007的5类肽，在选自11、12、16和24的位置将该肽聚乙二醇化；对于包含SEQIDNO：1008的5类肽，在选自11、12、15和16的位置将该肽聚乙二醇化。根据一实施方案，提供了包含SEQIDNO：1047或SEQIDNO：1048的5类肽，其中在相对于SEQIDNO：1047或SEQIDNO：1048序列的选自12、16、19和24的位置将该肽聚乙二醇化。在另一实施方案中，通过向肽的羧基末端添加SEQIDNO：1021的序列，进一步修饰SEQIDNO：1047或SEQIDNO：1048的肽。
如上文所详细描述的，在某些方面，提供了5类肽，其中天然胰高血糖素的最前的5个氨基酸已经缺失，N-末端氨基酸(苯丙氨酸)的氨基已经由羟基代替(即，第一个氨基酸为苯乳酸)，并且选自位置12与16、16与20、20与24以及24与28的氨基酸对的一个或多个侧链互相连接，因而稳定5类肽α螺旋。
根据一实施方案，提供了包含SEQIDNO：1002的序列的5类肽，该序列通过由选自谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸、高半胱磺酸、苏氨酸或甘氨酸的氨基酸取代SEQIDNO：1002的位置11(根据天然胰高血糖素的氨基酸编号的位置16)处的丝氨酸残基来修饰。根据一实施方案，由选自谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸和高半胱磺酸的氨基酸取代SEQIDNO：1002的位置11处的丝氨酸残基；在一实施方案中，由谷氨酸取代丝氨酸残基。根据一实施方案，5类肽包含SEQIDNO：1038的序列。
在一实施方案中，提供了5类肽，其中在两个氨基酸侧链之间形成分子内桥，以稳定SEQIDNO：1002的肽羧基末端的三维结构。更具体而言，选自SEQIDNO：1002的氨基酸对7与11、11与15、15与19或者19与23的一个或多个氨基酸的侧链互相连接，因而稳定C-末端部分的α螺旋。可以通过氢键、离子相互作用(例如形成盐桥)，或者通过共价键，将两个侧链互相连接。根据一实施方案，连接物的大小为7-9个原子，并且在一实施方案中，连接物的大小为8个原子。在一实施方案中，5类肽选自SEQIDNO：1005、SEQIDNO：1006、SEQIDNO：1007和SEQIDNO：1008。在一实施方案中，5类肽的C-末端氨基酸具有取代存在于天然氨基酸的羧酸基团的酰胺基团。
根据一实施方案，提供了5类肽，其中类似物包含SEQIDNO：1009的氨基酸序列。在一实施方案中，通过在肽的侧链之间形成共价键来稳定SEQIDNO：1009的肽羧基末端的三维结构。在一实施方案中，两个氨基酸侧链互相结合以形成内酰胺环。内酰胺环的大小可以根据氨基酸侧链的长度而变化，并且在一实施方案中，通过将赖氨酸的侧链连接于谷氨酸侧链，形成内酰胺。在一实施方案中，5类肽的C-末端氨基酸具有取代存在于天然氨基酸的羧酸基团的酰胺基团。
可以逆转内酰胺环中酰胺键的次序(如，可以在Lys12的侧链与Glu16的侧链之间形成内酰胺环，或者在Glu12与Lys16之间形成内酰胺环)。根据一实施方案，提供了SEQIDNO：1009的胰高血糖素类似物，其中在选自SEQIDNO：1009的氨基酸对7与11、11与15、15与19或者19与23的氨基酸对的侧链之间至少形成一个内酰胺环。在一实施方案中，提供了5类肽，其中该肽包含SEQIDNO：1010的序列，所述序列还包含在SEQIDNO：1010的氨基酸位置7与11之间、氨基酸位置11与15之间或氨基酸位置15与19之间形成的内酰胺桥。在一实施方案中，提供了5类肽，其中该肽包含SEQIDNO：1011的序列，所述序列还包含在SEQIDNO：1011的氨基酸位置7与11之间或氨基酸位置11与15之间形成的内酰胺桥。在一实施方案中，5类肽包含SEQIDNO：17的序列。
提供了另外的5类肽，其包含SEQIDNO：1005的衍生物，其中SEQIDNO：1005的位置10(天然胰高血糖素的位置15)处的天冬氨酸已经由谷氨酸、以下一般结构的氨基酸取代：
其中X6为C1-C3烷基、C2-C3烯基或C2-C3炔基，且在一实施方案中，X6为C1-C3烷基，并且在另一实施方案中，X6为C2烷基。在一实施方案中，提供了SEQIDNO：1009的5类肽衍生物，其中由选自谷氨酸、半胱磺酸、高半胱磺酸和高谷氨酸的氨基酸取代SEQIDNO：1009的位置10(天然胰高血糖素的位置15)。在另一实施方案中，由选自半胱磺酸或高半胱磺酸的氨基酸取代SEQIDNO：1009的位置10。在一实施方案中，提供了SEQIDNO：1006、SEQIDNO：1007或SEQIDNO：1008的5类肽衍生物，其中由选自谷氨酸、半胱磺酸、高半胱磺酸和高谷氨酸的氨基酸取代SEQIDNO：1006、SEQIDNO：1007或SEQIDNO：1008的位置10。在一实施方案中，5类肽的C-末端氨基酸具有取代天然氨基酸的羧酸基团的酰胺基团。
在一实施方案中，由至少一个半胱氨酸残基取代5类肽的氨基酸，其中该半胱氨酸残基的侧链由巯基反应性试剂进一步修饰，该巯基反应性试剂包括例如，马来酰亚胺基、乙烯基砜、2-吡啶基硫代、卤代烷基和卤代酰基。这些巯基反应性试剂可以含有羧基、酮、羟基和醚基团以及其他亲水部分，如聚乙二醇单元。在替代性实施方案中，5类肽的氨基酸由赖氨酸取代，并且取代的赖氨酸残基的侧链利用胺反应性试剂进一步修饰，该胺反应性试剂为例如诸如聚乙二醇的亲水部分的羧酸或醛的活性酯(琥珀酰亚胺基、酐等)。根据一实施方案，对应于SEQIDNO：1005的肽的位置7的赖氨酸残基由精氨酸取代，并且插入单个赖氨酸，取代一个对应于SEQIDNO：1005的位置12、15、16、19和24的氨基酸。
在另一实施方案中，将对应于本文公开的5类肽的位置22的甲硫氨酸残基改变为亮氨酸或正亮氨酸，以防止肽的氧化降解。
而且，在某些方面，5类肽还包含在已知为对胰高血糖素肽类似物的功能不重要的位置处的氨基酸取代。在一实施方案中，取代为选自2、5、6、7、8、9、12、13、14、15、16、19、22、23或24的1、2或3个位置处的保守性氨基酸取代。在一实施方案中，由半胱氨酸或赖氨酸取代对应于天然胰高血糖素肽的位置16、17、20、21、24或29的氨基酸，更特别是，取代相对于天然胰高血糖素的位置21和/或24处的氨基酸，其中PEG链共价连接至取代的半胱氨酸残基或赖氨酸残基。
根据一实施方案，提供了5类肽，其包含由SEQIDNO：1009组成的序列，还通过对应于该肽的位置11、12、15、16、19和/或24的位置处的一个或多个另外的氨基酸取代(包括，例如由半胱氨酸的取代)受到修饰，其中氨基酸取代包含具有侧链的氨基酸，所述侧链适于与包括例如PEG在内的亲水部分交联。可以由天然存在的氨基酸或合成(非天然存在)的氨基酸取代天然胰高血糖素。合成或非天然存在的氨基酸指在体内不天然存在，但是可以被并入本文所述的肽结构中的氨基酸。在一实施方案中，提供了5类肽，其中该肽包含SEQIDNO：1009的序列，且还包含结合至该肽的位置16或19的聚乙烯链。在另一实施方案中，修饰胰高血糖素类似物的C-末端，以由酰胺基团代替羧酸基团。
根据一实施方案，提供了5类肽，其包含选自以下序列的胰高血糖素类似物：
R1-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R2(SEQIDNO：1039)、
R1-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R2(SEQIDNO：1013)、
R1-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R2(SEQIDNO：1014)以及
R1-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R2(SEQIDNO：1012)，
其中，位置4处的Xaa＝天冬氨酸、谷氨酸、半胱磺酸或高半胱磺酸；位置10处的Xaa＝Asp、Glu、半胱磺酸、高谷氨酸和高半胱磺酸；位置16处的Xaa为Asp、Cys、Orn、高半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸；位置19处的Xaa为Gln、Cys、Orn、高半胱氨酸和乙酰基苯丙氨酸；位置22处的Xaa＝Met、Leu或Nle；R1为OH或NH2；并且R2为GlyProSerSerGlyAlaProProProSer(SEQIDNO：1021)、GlyProSerSerGlyAlaProProProSerXaa(SEQIDNO：1050，其中Xaa为Cys、Orn、高半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸)、COOH或CONH2，其中任选地将肽在SEQIDNO：1013的位置16、SEQIDNO：1014的位置19以及SEQIDNO：1012的位置16和19处聚乙二醇化。在一实施方案中，由Gly取代SEQIDNOs：1012-1014和1039的位置24处的Thr。根据一实施方案，肽包含SEQIDNO：1013或SEQIDNO：1014的序列，其中R1为OH。根据一实施方案，肽包含SEQIDNO：1013或SEQIDNO：1014的序列，其中R1为OH并且R2为CONH2。根据一实施方案，肽包含SEQIDNO：1013或SEQIDNO：1014的序列，其中R1为OH，R2为CONH2，并且由甘氨酸取代位置24处的苏氨酸。
在一实施方案中，通过在相应氨基酸位置处取代天然胰高血糖素残基，进一步修饰5类肽，以包含天然GLP-1的一个或多个氨基酸。例如，5类肽可以包含任何位置2、3、17、18、21、23和24(根据天然胰高血糖素的氨基酸编号)处的一个或多个氨基酸取代。在具体实施方案中，通过一个或多个以下氨基酸取代修饰5类肽：由Ala代替Ser2、由Glu代替Gln3、由Gln代替Arg17、由Ala代替位置18处的Arg、由Glu代替位置21处的Asp、由Ile代替位置23处的Val以及由Ala代替位置24处的Gln(氨基酸位置根据天然胰高血糖素序列)。在具体实施方案中，通过由Ala代替Ser2和由Glu代替Gln3(根据天然胰高血糖素的氨基酸编号)，修饰5类肽。在另一具体实施方案中，由所有以下氨基酸取代修饰5类肽：由Gln代替Arg17、由Ala代替位置18处的Arg、由Glu代替位置21处的Asp、由Ile代替位置23处的Val以及由Ala代替位置24处的Gln(根据天然胰高血糖素的氨基酸编号)。仍然在另一具体实施方案中，修饰5类肽以仅包含位置21处的Glu(根据SEQIDNO：1001的编号)。因此，5类肽可以包含任何SEQIDNOs：1060-1070、1073-1078、1080-1088、1090-1096、1103、1104、1106和1114-1118的氨基酸序列。
本文还提供了5类肽或其偶联物，其包含(1)通过本文所述的方法稳定的α螺旋(如，通过分子内桥，或并入一个或多个α，α-二取代的氨基酸，或位置16(根据SEQIDNO：1001的编号)处的酸性氨基酸，或者上述的组合)；(2)代替C-末端羧酸的C-末端酰胺或酯；以及(3)A-B-C的一般结构，
其中A选自
(i)苯乳酸(PLA)；
(ii)PLA的含氧衍生物；以及
(iii)2至6个氨基酸的肽，其中该肽的2个连续氨基酸经由酯键或醚键连接；
其中B代表SEQIDNO：1001的氨基酸p至26，其中p为3、4、5、6或7，并且任选地包含本文所述的一个或多个氨基酸修饰，其包括例如对5类肽所述的任何修饰。例如，该一个或多个修饰可以选自：
(iv)位置9(根据SEQIDNO：1001的氨基酸编号)处的Asp由Glu、Cys的磺酸衍生物、高谷氨酸、β-高谷氨酸或者具有以下结构的半胱氨酸的烷基羧酸衍生物取代：
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基；
(v)由经由酯、醚、硫醚、酰胺或烷基胺连接而共价连接至酰基或烷基的氨基酸，取代位置10、20和24(根据SEQIDNO：1001的氨基酸编号)处的1或2个氨基酸；
(vi)由选自Cys、Lys、鸟氨酸、高半胱氨酸和乙酰基-苯丙氨酸(Ac-Phe)的氨基酸取代位置16、17、20、21和24(根据SEQIDNO：1001的氨基酸编号)处的1或2个氨基酸；
(vii)由半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸取代位置15(根据SEQIDNO：1001的编号)处的Asp；
(viii)由半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸取代位置16(根据SEQIDNO：1001的编号)处的Ser；
(ix)由Gln代替位置17处的Arg、由Ala代替位置18处的Arg、由Glu代替位置21处的Asp、由Ile代替位置23处的Val以及由Ala代替位置24处的Gln(根据SEQIDNO：1001的氨基酸编号)；
(x)由Glu代替位置16处的Ser、由Glu代替位置20处的Gln或者由Glu代替位置24处的Gln(根据SEQIDNO：1001的氨基酸编号)；
其中(A-B-C的一般结构的)C选自：
(vii)X；
(viii)X-Y；
(ix)X-Y-Z；
(x)X-Y-Z-R10；
其中X为Met、Leu或Nle；Y为Asn或带电荷的氨基酸；Z为Thr、Gly、Cys、Lys、鸟氨酸(Orn)、高半胱氨酸、乙酰基苯丙氨酸(Ac-Phe)或带电荷的氨基酸；其中R10选自SEQIDNOs：1021、1026、1027和1050。
在具体的方面，肽包含PLA的含氧衍生物。本文所用的“PLA的含氧衍生物”指这样的化合物，其包含PLA的修饰的结构，其中由O-R11代替羟基，其中R11为化学部分。在这一点上，PLA的含氧衍生物可以为，例如PLA的酯或PLA的醚。
制备PLA的含氧衍生物的方法在本领域内是已知的。例如，当含氧衍生物为PLA的酯时，该酯可以通过PLA的羟基与带有羰基的亲核试剂的反应而形成。该亲核试剂可以为任何合适的亲核试剂，其包括但不限于胺或羟基。因此，PLA的酯可以包含通式XI的结构：
通式XI
其中，R7为PLA的羟基与带有羰基的亲核试剂反应形成的酯。
带有羰基的亲核试剂(其与PLA的羟基反应形成酯)可以为，例如羧酸、羧酸衍生物或羧酸的活化酯。羧酸衍生物可以为但不限于酰基氯、酸酐、酰胺、酯或腈。羧酸的活化酯可以为，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、甲苯磺酸酯(Tos)、碳二亚胺或六氟磷酸酯。在某些实施方案中，碳二亚胺为1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)、1，1’-羰基二咪唑(CDI)、盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)或1，3-二异丙基碳二亚胺(DICD)。在某些实施方案中，六氟磷酸酯选自六氟磷酸酯苯并三唑-1-基-氧-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸酯(BOP)、苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸酯(PyBOP)、2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和邻苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟-磷酸酯(HBTU)。
从与羟基(如，PLA的羟基)的反应制备醚的方法也是本领域已知的。例如，可以使PLA的羟基与卤化烷基或甲苯磺酰化的(tosylated)烷基醇反应以形成醚键。
在具体实施方案中，通过含氧键(即，通过醚键或酯键)结合至PLA的化学部分为聚合物(如，聚亚烷基二醇)、碳水化合物、氨基酸、肽、诸如脂肪酸或类固醇的脂质。
在具体实施方案中，化学部分为氨基酸，该氨基酸任选地为肽的一部分，从而通式XI为缩酚酸肽。在这一点上，PLA可以在除了肽的N-末端氨基酸残基以外的位置处，从而该肽包含一个或多个(如，1、2、3、4、5、6个或更多个)位于PLA残基N-末端的氨基酸。例如，肽可以包含肽的位置n处的PLA，其中n为2、3、4、5或6。
位于PLA残基N-末端的氨基酸可以是合成或天然存在的。在一具体实施方案中，为N-末端PLA的氨基酸是天然存在的氨基酸。在一实施方案中，位于PLA的N-末端的氨基酸为天然胰高血糖素的N-末端氨基酸。例如，肽可以在N-末端处包含任何SEQIDNOs：1052-1056的氨基酸序列，其中PLA经由酯键连接至苏氨酸：
SEQIDNO：1052His-Ser-Gln-Gly-Thr-PLA
SEQIDNO：1053Ser-Gln-Gly-Thr-PLA
SEQIDNO：1054Gln-Gly-Thr-PLA
SEQIDNO：1055Gly-Thr-PLA
SEQIDNO：1056Thr-PLA。
在替代性实施方案中，可以由除了天然胰高血糖素的氨基酸以外的氨基酸取代一个或多个N-末端氨基酸。例如，当肽包含作为位置5或6处的氨基酸的PLA时，位置1和/或位置2处的氨基酸可以为减少对二肽基肽酶IV切割的易感性的氨基酸。更具体而言，在某些实施方案中，肽的位置1为选自以下氨基酸的氨基酸：D-组氨酸、α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸和高组氨酸。更具体而言，在某些实施方案中，拮抗剂/激动剂肽的位置2为选自以下氨基酸的氨基酸：D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸(AIB)。此外，例如，与天然胰高血糖素的天然谷氨酰胺残基不同，当肽包含作为位置4、5或6处的氨基酸的PLA时，肽的位置3处的氨基酸可以为谷氨酸。在本发明的示例性实施方案中，肽可以在N-末端处包含任何SEQIDNOs：1057-1059的氨基酸序列。
对于包含通式XI的化合物的肽，聚合物可以为任何聚合物，只要其能够与PLA的羟基反应。聚合物可以为天然或通常包含带有羰基的亲核试剂的聚合物。或者，聚合物可以为衍生为包含带有羰基的羰基的聚合物。聚合物可以为任何以下化合物的衍生聚合物：聚酰胺；聚碳酸酯；聚烯烃及其衍生物，其包括聚亚烷基二醇、聚亚烷基氧化物、聚对苯二甲酸亚烷基酯；丙烯酸酯与甲基丙烯酸酯的聚合物，其包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷基酯)；聚乙烯基聚合物，其包括聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚(乙酸乙烯酯)和聚乙烯吡咯烷酮、聚乙醇酸交酯、聚硅氧烷、聚氨基甲酸酯及其共聚物；纤维素，其包括烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、羧乙基纤维素、三醋酸纤维素和纤维素硫酸钠盐；聚丙烯、聚乙烯，其包括聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)和聚(对苯二甲酸亚乙酯)及聚苯乙烯。
聚合物可以为生物可降解的聚合物，其包括合成生物可降解聚合物(如，乳酸与乙醇酸的聚合物、聚酸酐、聚原酸酯、聚氨基甲酸酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)和聚(丙交酯-共-己内酯))和天然生物可降解聚合物(如，藻酸盐和其他多糖，包括葡聚糖和纤维素、胶原蛋白、其化学衍生物(取代；诸如烷基、亚烷基的化学基团的增加；羟基化；氧化和由本领域技术人员做出的其他常规修饰)、白蛋白和其他亲水蛋白质(如，玉米醇溶蛋白和其他谷醇溶蛋白以及疏水蛋白至))以及上述的任何共聚物或混合物。通常，这些材料通过酶促水解或或在体内暴露于水、通过表面或骨架溶蚀而降解。
聚合物可以为生物粘附聚合物，例如H.S.Sawhney，C.P.PathakandJ.A.HubbellinMacromolecules，1993，26，581-587描述的生物蚀解水凝胶(其教导并入本文)聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酸酐、聚丙烯酸、藻酸盐、壳聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)以及聚(丙烯酸十八烷基酯)。
在一实施方案中，聚合物为水溶性聚合物。合适的水溶性聚合物在本领域是已知的，并且包括例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素(HPC；Klucel)、羟丙基甲基纤维素(HPMC；Methocel)、硝基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羟丙基丁基纤维素、羟丙基戊基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素(Ethocel)、羟乙基纤维素、各种烷基纤维素和羟烷基纤维素、各种纤维素醚、醋酸纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、乙酸乙烯酯/巴豆酸共聚物、聚-甲基丙烯酸羟烷基酯、甲基丙烯酸羟甲酯甲基丙烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、马来酸酐/甲基乙烯基醚共聚物、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠和钙、聚丙烯酸、酸性羧基聚合物、羧基聚亚甲基、羧基乙烯基聚合物、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚甲基乙烯基醚马来酸酐共聚物、羧甲基酰胺、甲基丙烯酸钾二乙烯基苯共聚物、聚氧乙烯乙二醇、聚环氧乙烷及上述的衍生物、盐和组合。
在一具体实施方案中，聚合物为聚亚烷基二醇，其包括，例如聚乙二醇(PEG)。
碳水化合物可以为任何碳水化合物，只要其包含或使得其包含具有α离去基团的羰基。例如，碳水化合物可以为这样的碳水化合物，其被衍生为包含具有α离去基团的羰基。在这一点上，碳水化合物可以为以下的糖的衍生形式：单糖(如，葡萄糖、半乳糖、果糖)、二糖(如，蔗糖，乳糖、麦芽糖)、寡糖(如，蜜三糖、水苏糖)、多糖(淀粉、淀粉酶、支链淀粉、纤维素、甲壳质、愈疮葡聚糖、昆布多糖、木聚糖、甘露聚糖、岩藻依聚糖、半乳甘露聚糖)。
脂质可以为包含具有α离去基团的羰基的任何脂质。例如，脂质可以为经衍生包含羰基的脂质。在这一点上，脂质可以为以下脂质的衍生物：脂肪酸(如，C4-C30脂肪酸、类二十烷酸、前列腺素、白细胞三烯、血栓烷、N-乙酰基乙醇胺)、甘油脂(如，单、二、三取代的甘油)、甘油磷酸脂(如，磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)、鞘脂(如，鞘氨醇、神经酰胺)、甾醇脂(如，类固醇、胆固醇)、异戊烯醇脂、糖脂或聚酮。
油、蜡、胆固醇、甾醇、脂溶性维生素、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂。
在一实施方案中，R7的分子量为约100kDa或更小，如约90kDa或更小、约80kDa或更小、约70kDa或更小、约60kDa或更小、约50kDa或更小、约40kDa或更小。因此，R7的分子量可以是约35kDa或更小、约30kDa或更小、约25kDa或更小、约20kDa或更小、约15kDa或更小、约10kDa或更小、约5kDa或更小或约1kDa。
在替代性实施方案中，包含A-B-C的一般结构的肽包含作为A的2至6个氨基酸的肽，其中A的肽的2个连续氨基酸经由酯键或醚键连接。酯键或醚键可以在，例如，氨基酸2与3、氨基酸3与4、氨基酸4与5或者氨基酸5与6之间。任选地，可以通过共价连接至另一化学部分进一步修饰A的肽，包括连接至聚合物(如，亲水聚合物)、烷基化或酰化。
在具体实施方案中，修饰上文所述的包含PLA的5类肽，以包含PLA的含氧衍生物，例如PLA的酯或PLA的醚。例如，5类肽可以包含任何SEQIDNOs：1002、1005-1020、1022-1025、1032-1036、1038、1039、1045、1046和1051的氨基酸序列，其中PLA经由酯键或醚键连接至氨基酸、肽、聚合物、酰基或烷基。该氨基酸、肽、聚合物、酰基或烷基可以为任何本文所述的那些氨基酸、肽、聚合物、酰基或烷基。在PLA经由醚键连接至氨基酸或肽的情况下，可以将5类肽视为缩酚酸肽。
此外，在另一具体实施方案中，修饰上文所述的缺乏PLA的5类肽，以在位置7(根据天然胰高血糖素的编号)处的氨基酸的N-末端的两个相邻氨基酸之间包含至少一个酯键或醚键。在具体实施方案中，5类肽在两个相邻氨基酸之间包含至少一个酯键或醚键。在更具体的实施方案中，5类肽包含SEQIDNO：1001的N-末端6个氨基酸，并且N-末端6个氨基酸的两个连续氨基酸经由酯键或醚键连接。
A的肽可以包含任何合成或天然存在的氨基酸，只要至少两个相邻氨基酸经由酯键或醚键连接。在具体实施方案中，A的肽包含天然胰高血糖素的氨基酸。位置1和/或位置2处的氨基酸可以为减少对二肽基肽酶IV切割的易感性的氨基酸。例如，A的肽可以在位置1处包含选自以下氨基酸的氨基酸：D-组氨酸、α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸和高组氨酸。更具体而言，在某些实施方案中，A的肽的位置2为选自以下氨基酸的氨基酸：D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸(AIB)。此外，例如，与天然胰高血糖素的天然谷氨酰胺残基不同，A的肽的位置3处的氨基酸可以为谷氨酸。因此，A-B-C的一般结构的肽可以包含以下氨基酸序列：
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Thr-Gly-Phe(SEQIDNO：1107)、
Xaa2-Xaa3-Thr-Gly-Phe(SEQIDNO：1108)或
Xaa3-Thr-Gly-Phe(SEQIDNO：1109)；
其中Xaa1选自His、D-组氨酸、α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、脱氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸和高组氨酸；Xaa2选自Ser、D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸和氨基异丁酸(AIB)；并且Xaa3为Gln或Glu.
在一实施方案中，通过高达3个氨基酸修饰，修饰B。例如，通过一个或多个保守性氨基酸修饰，修饰代表SEQIDNO：1001的天然氨基酸序列的B。
在另一实施方案中，B包含选自如本文所述(iv)至(x)的一个或多个氨基酸修饰。在具体实施方案中，B包含氨基酸修饰(v)和(vi)之一或全部。在另一具体实施方案中，除了(v)和(vi)以外，B还包含选自(iv)、(vii)、(viii)、(ix)和(x)的氨基酸修饰的一个或组合。
如本文所述，包含一般结构A-B-C的肽可以包含C-末端处的一个或多个带电荷的氨基酸，例如，如本文所述的Y和/或Z。可选择地或者另外，当C包含X-Y-Z时，包含一般结构A-B-C的肽还可以包含位于Z的C-末端的1至2个带电荷的氨基酸。例如，带电荷的氨基酸可以为Lys、Arg、His、Asp和Glu之一。在具体实施方案中，Y为Asp。
在一实施方案中，包含一般结构A-B-C的肽包含亲水部分，该亲水部分共价连接至位置1、16、20、21或24(根据SEQIDNO：1001的氨基酸编号)处的氨基酸残基，或者包含一般结构A-B-C的肽的N-末端残基或C-末端残基处的氨基酸残基。在具体实施方案中，亲水部分连接至包含一般结构A-B-C的肽的Cys残基。在这一点上，可以由Cys残基取代天然胰高血糖素(SEQIDNO：1001)的位置16、21、24或29处的氨基酸。或者，可以将包含Cys残基的亲水部分添加到包含一般结构A-B-C的肽的C末端，作为位置30或位置40，例如，当包含一般结构A-B-C的肽包含C-末端延伸时(根据SEQIDNO：1001的氨基酸编号的位置)。或者，亲水部分可以经由PLA的羟基部分连接至包含一般结构A-B-C的肽的PLA。亲水部分可以是任何本文所述的亲水部分，包括例如聚乙二醇。
在具体的方面，包含一般结构A-B-C的肽包含通过并入分子内桥而稳定的α螺旋。在一实施方案中，分子内桥为内酰胺桥。内酰胺桥可以在以下位置：位置9与12处的氨基酸之间、位置12与16处的氨基酸之间、位置16与20处的氨基酸之间、位置20与24处的氨基酸之间或者位置24与28处的氨基酸之间(根据SEQIDNO：1001的氨基酸编号)。在具体实施方案中，位置12与16处的氨基酸或者位置16与20处的氨基酸(根据SEQIDNO：1001的氨基酸编号)经由内酰胺桥连接。考虑了其他位置的内酰胺桥。
另外或者可选择地，包含一般结构A-B-C的肽可以在例如位置16、20、21或24(根据SEQIDNO：1001的氨基酸编号)的任何位置包含α，α二取代的氨基酸。在一实施方案中，α，α二取代的氨基酸为AIB。在具体的方面，AIB位于位置16(根据SEQIDNO：1001的编号)处。
可选择地或另外，可以修饰包含一般结构A-B-C的肽，以包含位置16(根据SEQIDNO：1001的编号)处的酸性氨基酸，该修饰增强了α螺旋的稳定性。在一实施方案中，酸性氨基酸为包含侧链磺酸或侧链羧酸的氨基酸。在更具体的实施方案中，酸性氨基酸选自Glu、Asp、高谷氨酸、Cys的磺酸衍生物、半胱磺酸、高半胱磺酸、Asp以及具有以下结构的Cys的烷基化衍生物：
其中X5为C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基。
在具体实施方案中，5类肽可以包含任何以下序列的氨基酸序列：SEQIDNOs：1060-1070、1073-1078、1080-1088、1090-1096、1103、1104、1106及1114-1118；或者包含以下任何氨基酸序列：表9的肽2-6；表10的肽1-8以及表11的肽2-6、8和9。
表10
在一实施方案中，包含一般结构A-B-C的肽为5类肽。在具体实施方案中，该肽表现出至少约50％的天然GLP-1对GLP-1受体所实现的最大激动，和至少约50％的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体所实现的最大应答的抑制。在另一具体实施方案中，肽表现出至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的天然GLP-1对GLP-1受体所实现的最大激动。可选择地或者另外，肽可以表现出至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％的天然胰高血糖素对胰高血糖素受体所实现的最大应答的抑制。
在某些实施方案中，提供了具有5类肽或其偶联物的肽，其包含
(1)赋予胰高血糖素拮抗剂活性的修饰，其包括但不限于：
(a)由PLA取代位置6(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)处的Phe，任选地从野生型胰高血糖素的N-末端缺失1至5个氨基酸；或
(b)从野生型胰高血糖素的N-末端缺失2至5个氨基酸，任选地由谷氨酸、高谷氨酸或半胱氨酸的磺酸衍生物取代野生型胰高血糖素的位置9处的Asp(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)；和
(2)赋予GLP-1激动剂活性的修饰，其包括但不限于：
(a)在野生型胰高血糖素的氨基酸12-29中α，α-二取代的氨基酸的插入或取代，例如在位置16、17、18、19、20、21、24或29(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的1、2、3、4个或更多个位置处；或
(b)在野生型胰高血糖素的氨基酸12-29中引入分子内桥，如盐桥或内酰胺桥或其他类型的共价键；或
(c)由GLP-1的相应氨基酸取代位置2、3、17、18、21、23或24(根据天然胰高血糖素的氨基酸编号)的一个或多个位置处的氨基酸，例如由Ala代替Ser2、由Glu代替Gln3、由Gln代替Arg17、由Ala代替位置18处的Arg、由Glu代替位置21处的Asp、由Ile代替位置23处的Val和/或由Ala代替位置24处的Gln；或
(d)稳定根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号的氨基酸位置12-29附近的α-螺旋结构的其他修饰；和
(3)增强GLP-1激动剂活性的其他修饰，例如
(a)代替C-末端羧酸的C-末端酰胺或酯；
和任选的
(4)一个或多个以下修饰：
(a)共价连接至诸如聚乙二醇的亲水部分，例如在N-末端处，或在位置6、16、17、20、21、24、29、40处，或在C末端氨基酸处；和/或
(b)酰化或烷基化；和任选的
(5)一个或多个下列另外的修饰：
(a)氨基酸共价连接至N-末端，例如连接至N-末端的1-5个氨基酸，任选地经由与位置6(根据野生型胰高血糖素的编号)处的PLA的酯键，任选地与例如本文所述的位置1或2处的改善对DPP-IV切割的抗性的修饰一起；
(b)位置29和/或28和任选的位置27处的氨基酸的缺失(根据野生型胰高血糖素的编号)；
(c)氨基酸共价连接至C-末端；
(d)非保守性取代、保守性取代、添加或缺失，同时保留期望的活性，例如位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29中一个或多个位置处的保守性取代；由Val或Phe取代位置10处的Tyr；由Arg取代位置12处的Lys；由Ala取代这些位置的一个或多个；
(e)位置15处的天冬氨酸的修饰，例如，由谷氨酸、高谷氨酸、半胱磺酸或高半胱磺酸的取代，这可以减少降解；或者位置16处的丝氨酸的修饰，例如，由苏氨酸、AIB、谷氨酸，或由其他具有长度为4个原子的侧链的带负电荷的氨基酸，或由谷氨酰胺、高谷氨酸或高半胱磺酸的任一氨基酸取代，这同样可以减少由于Asp15-Ser16键的切割的降解；
(f)位置27处的甲硫氨酸的修饰，例如，通过由亮氨酸或正亮氨酸取代，以减少氧化降解；
(g)位置20或24处的Gln的修饰，例如，通过由Ala或AIB取代，以减少通过Gln的脱酰胺而发生的降解；
(h)位置21处的Asp的修饰，例如通过由Glu取代，以减少通过Asp脱水形成环琥珀酰亚胺中间体然后异构化为异天冬氨酸而发生的降解
(j)本文所述的同型二聚化或异源二聚化；以及
(k)上述的组合。
应当理解，可以将任何相同类型的修饰组合在一起和/或将不同类型的修饰组合。例如，可以将(1)(a)的修饰与(2)(a)及(3)组合；可以将(1)(a)与诸如内酰胺桥或盐桥的(2)(b)及(3)组合；可以将(1)(a)与(2)(c)及(3)组合；可以将(1)(b)与(2)(a)及(3)组合；可以将(1)(b)与诸如内酰胺桥或盐桥的(2)(b)及(3)组合；可以将(1)(b)与(2)(c)及(3)组合；可以将任何前述修饰与(4)(a)和/或(4)(b)组合；以及可以将任何前述修饰与(5)(a)至(5)(k)的任何组合。
在示例性实施方案中，在位置16、20、21或24(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)的1、2、3个或全部处取代α，α-二取代的氨基酸AIB。
在示例性实施方案中，分子内桥为盐桥。
在其他示例性实施方案中，分子内桥位共价键，如内酰胺桥。在某些实施方案中，内酰胺桥在以下位置处：位置9与12处的氨基酸之间、位置12与16处的氨基酸之间、位置16与20处的氨基酸之间、位置20与24处的氨基酸之间或者位置24与28处的氨基酸之间(根据SEQIDNO：1001的氨基酸编号)。在示例性实施方案中，酰化或烷基化在SEQIDNO：1001的位置6、10、20或24(根据野生型胰高血糖素的氨基酸编号)处，或者在N-末端或C-末端处。
在示例性实施方案中，修饰包括：
(i)由半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸取代位置15(根据SEQIDNO：1001的编号)处的Asp；
(ii)由半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸取代位置16(根据SEQIDNO：1001的编号)处的Ser；
(iii)由带电荷的氨基酸取代位置28处的Asn；
(iv)由选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸的带电荷的氨基酸取代位置28处的Asn；
(v)由Asn、Asp或Glu在位置28处的取代；
(vi)由Asp在位置28处的取代；
(vii)由Glu在位置28处的取代；
(viii)由带电荷的氨基酸取代位置29处的Thr；
(ix)由选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸的带电荷的氨基酸取代位置29处的Thr；
(x)由Asp、Glu或Lys在位置29处的取代；
(xi)由Glu在位置29处的取代；
(xii)位置29后1-3个带电荷的氨基酸的插入；
(xiii)位置29后Glu或Lys的插入；
(xiv)位置29后Gly-Lys或Lys-Lys的插入；
或者上述的组合。
任何上述修饰可以单独或组合应用，该修饰增加GLP-1受体激动剂活性、胰高血糖素受体拮抗剂活性、肽溶解性、和/或肽稳定性。
增强稳定性的修饰
根据一实施方案，可以进一步修饰本文公开的5类肽，以包括连接至5类肽的羧基末端氨基酸(位置24)的SEQIDNO：1021(GPSSGAPPPS)或SEQIDNO：1050的氨基酸序列，并且可以给予个体本文公开的5类肽以诱导体重减轻或辅助体重维持。更具体而言，5类肽包含选自以下序列的序列：SEQIDN0：1005、SEQIDNO：1006、SEQIDNO：1007、SEQIDNO：1008、SEQIDNO：1009、SEQIDNO：1012、SEQIDNO：1013、SEQIDNO：1014、SEQIDNO：1016、SEQIDNO：1017、SEQIDNO：1018、SEQIDNO：1019、SEQIDNO：1022、SEQIDNO：1023、SEQIDNO：1024和SEQIDNO：1025，并且还包含连接至肽或5类肽的羧基末端氨基酸(位置24)的SEQIDNO：1021(GPSSGAPPPS)或SEQIDNO：1050的氨基酸序列，其用于抑制食欲和诱导体重减轻/体重维持。在一实施方案中，给予的肽或5类肽包含选自SEQIDNO：1016、SEQIDNO：1017、SEQIDNO：1018和SEQIDNO：1019的序列，还包含连接至5类肽的羧基末端氨基酸(位置24)的SEQIDNO：1021(GPSSGAPPPS)的氨基酸序列。在一实施方案中，方法包括给予包含SEQIDNO：1045或SEQIDNO：1046的序列的肽或5类肽。
因此，预期可以类似地修饰本文公开的5类肽，以减少它们在水性缓冲液中对过早化学切割的易感性。根据一实施方案，可以进一步修饰本文所述的5类肽，以增强它们在水溶液中的稳定性，该修饰通过由选自半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸代替位于天然胰高血糖素的相应位置15处的天然天冬氨酸实现。根据一实施方案，可以由选自半胱磺酸、谷氨酸、高谷氨酸和高半胱磺酸的氨基酸取代SEQIDNO：1005、SEQIDNO：1006、SEQIDNO：1007或SEQIDNO：1008的5类肽的位置10处的天冬氨酸残基；在一实施方案中，由谷氨酸取代SEQIDNO：1005、SEQIDNO：1006、SEQIDNO：1007或SEQIDNO：1008的位置10处的天然天冬氨酸。根据一实施方案，提供了具有改善的水溶液中稳定性的5类肽，其中拮抗剂包含SEQIDNO：1009的修饰的序列，其中修饰包含由Glu取代SEQIDNO：1009的位置10处的Asp。在一实施方案中，提供了5类肽，其包含选自SEQIDNO：1022、SEQIDNO：1023、SEQIDNO：1024和SEQIDNO：1025的序列。在一实施方案中，5类肽是酰胺化的。
天然胰高血糖素的位置15-16处的Asp-Ser序列已经被鉴定为独特的不稳定二肽，其导致天然激素在水性缓冲液中过早的化学切割。例如，当在37℃下的0.01NHCl中保持两周时，超过50％的天然胰高血糖素可以被切割为片段。两种释放的切割肽1-15和16-29缺乏胰高血糖素样生物活性，并因而代表了对胰高血糖素及其相关类似物的水性预形成的限制。已经观察到由Glu选择性地化学取代天然胰高血糖素肽的位置15处的Asp几乎消除了15-16肽键的化学切割。
仍然在其他示例性实施方案中，可以通过修饰对应于天然胰高血糖素的位置15或16的氨基酸，进一步修饰任何前述化合物，以改善稳定性，以减少肽随时间的降解，特别是在酸性或碱性缓冲液中的降解。
增强溶解性的修饰
可以进一步修饰5类肽，以改善肽在生理pH的水溶液中的溶解性，同时在某些方面保留胰高血糖素拮抗剂活性和GLP-1激动剂活性。在对应于SEQIDNO：1005的肽的位置12、15、16、19和24的位置处，或者在SEQIDNO：1006的肽的位置12、16、19或24处引入亲水基团可以改善所得的肽在生理pH的溶液中的溶解性，同时保留母体化合物胰高血糖素拮抗剂和GLP激动剂活性。因此，在一实施方案中，进一步修饰本发明公开的5类肽以包含一个或多个亲水基团，该亲水基团共价连接至对应于SEQIDNO：1005或SEQIDNO：1006的肽的氨基酸位置12、15、16、19和24的氨基酸的侧链。在另一实施方案中，对应于SEQIDNO：1005或SEQIDNO：1006的氨基酸位置16和19的氨基酸的侧链共价结合至亲水基团；并且在一实施方案中，亲水基团为聚乙二醇(PEG)。
还可以通过在羧酸末端引入电荷来修饰5类胰高血糖素相关的类似物肽，以增强肽的溶解性，同时保留肽的激动剂属性。增强的溶解性允许在接近中性pH值的条件下制备和储存胰高血糖素溶液。在相对中性pH值(如，约6.0至约8.0的pH值)下配制胰高血糖素溶液改善了5类肽的长期稳定性。
申请人预料，可以类似地修饰本文公开的5类肽，以增强它们在相对中性pH值(如，约6.0至约8.0的pH值)的水溶液中的溶解性，同时在某些情况下保留胰高血糖素拮抗剂活性和GLP-1活性。因此，一实施方案涉及SEQIDNO：1005、SEQIDNO：1006、SEQIDNO：1007或SEQIDNO：1008的胰高血糖素拮抗剂/GLP-1，其相对于存在于野生型胰高血糖素(SEQIDNO：1001)的位置6-29处的天然氨基酸被修饰，以通过由带电荷的氨基酸取代天然不带电荷的氨基酸或者向羧基末端添加带电荷的氨基酸，向肽增加电荷。根据一实施方案，由带电荷的氨基酸代替本文公开的5类肽的1至3个不带电荷的天然氨基酸。在一实施方案中，带电荷的氨基酸选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。更具体而言，申请人发现，由带电荷的氨基酸取代对应于位置28和/或29(相对于天然胰高血糖素)处的通常存在的氨基酸，和/或在肽的羧基末端处添加1至2个带电荷的氨基酸，增强了5类肽在生理相关pH值(即，约6.5至约7.5的pH值)的水溶液中的溶解性和稳定性。因此，预期5类肽的这类修饰对水溶液，特别是约5.5至约8.0的pH值的水溶液中的稳定性有类似的效果，同时保留母体肽的生物活性。
根据一实施方案，通过以下方法修饰SEQIDNO：1005、SEQIDNO：1006、SEQIDNO：1007或SEQIDNO：1008的5类肽：由带负电荷的氨基酸(如，天冬氨酸或谷氨酸)取代这些序列的位置23和/或24处的天然氨基酸，以及任选地向肽的羧基末端添加带负电荷的氨基酸(如，天冬氨酸或谷氨酸)。在替代性实施方案中，通过以下方法修饰包含SEQIDNO：1005、SEQIDNO：1006、SEQIDNO：1007或SEQIDNO：1008的5类肽：由带正电荷的氨基酸(如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)取代SEQIDNO：1005、SEQIDNO：1006、SEQIDNO：1007或SEQIDNO：1008的位置24处的天然氨基酸，以及任选地向肽的羧基末端添加1或2个带正电荷的氨基酸(如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)。根据一实施方案，提供了具有改善的溶解性和稳定性的5类肽，其中类似物包含SEQIDNO：1015或SEQIDNO：1051的氨基酸序列，其条件是由酸性氨基酸取代SEQIDNO：1015或SEQIDNO：1051的位置23或24处的至少一个氨基酸，和/或在SEQIDNO：1015或SEQIDNO：1051的羧基末端处添加另外的酸性氨基酸。在一实施方案中，酸性氨基酸独立地选自Asp、Glu、半胱磺酸和高半胱磺酸。
根据一实施方案，提供了具有改善的溶解性和稳定性的5类肽，其中拮抗剂包含SEQIDNO：1016、SEQIDNO：1017、SEQIDNO：1018或SEQIDNO：1019的氨基酸序列。根据一实施方案，提供了胰高血糖素激动剂，其包含SEQIDNO：1016或SEQIDNO：1017的序列。在一实施方案中，5类肽包含SEQIDNO：1020的序列。
根据一实施方案，提供了5类肽，其包含SEQIDNO：1015或SEQIDNO：1051的序列。在一实施方案中，SEQIDNO：1015或SEQIDNO：1051的位置4为天冬氨酸、谷氨酸、高谷氨酸、半胱磺酸或高半胱磺酸；在一实施方案中，位置4为天冬氨酸、谷氨酸、半胱磺酸或高半胱磺酸；在另一实施方案中，SEQIDNO：1015或SEQIDNO：1051的位置4为天冬氨酸或谷氨酸；以及在一实施方案中，SEQIDNO：1015或SEQIDNO：1051的位置4为天冬氨酸。在一实施方案中，提供了5类肽，其包含SEQIDNO：1015或SEQIDNO：1051的序列，其中SEQIDNO：1015的位置4为天冬氨酸，并且SEQIDNO：1015的位置10为谷氨酸。在另一实施方案中，修饰SEQIDNO：1015或SEQIDNO：1051的C-末端氨基酸，以由诸如酰胺或酯的电中性基团代替天然羧酸基团。
5类肽融合
在另一实施方案中，本文所述的5类肽的羧基末端氨基酸共价结合至包含选自SEQIDNOs：1021、1026、1027和1050的序列的第二肽。例如，在一实施方案中，以下序列的5类肽共价结合至包含选自SEQIDNO：1021(GPSSGAPPPS)、SEQIDNO：1026(KRNRNNIA)、SEQIDNO：1027(KRNR)和SEQIDNO：1050(GPSSGAPPPSX)的序列的第二肽：SEQIDNO：1015、SEQIDNO：1051、SEQIDNO：1005、SEQIDNO：1006、SEQIDNO：1007、SEQIDNO：1008、SEQIDNO：1012、SEQIDNO：1013、SEQIDNO：1014、SEQIDNO：1016、SEQIDNO：1017、SEQIDNO：1018、SEQIDNO：1019、SEQIDNO：1022、SEQIDNO：1023、SEQIDNO：1024和SEQIDNO：1025。
在一实施方案中，提供了5类肽二聚体，其包含独立地选自以下序列的两条序列：SEQIDNO：1005、SEQIDNO：1006、SEQIDNO：1007、SEQIDNO：1008、SEQIDNO：1009、SEQIDNO：1022、SEQIDNO：1023、SEQIDNO：1024和SEQIDNO：1025，该二聚体还包含连接至5类肽的羧基末端氨基酸的SEQIDNO：1021(GPSSGAPPPS)的氨基酸序列。
在某些实施方案中，通过肽C-末端的1或2个氨基酸的截断或缺失(即，天然胰高血糖素的位置29处或者位置28和29处的氨基酸的截断)，进一步修饰5类肽。优选地，截断不影响5类肽的活性(如，胰高血糖素拮抗/GLP-1激动)。
5类肽偶联物
还提供了5类肽的偶联物，其中胰高血糖素肽任选地经由共价键合和任选地经由连接物连接至偶联物部分。
在5类肽包含聚乙二醇链的实施方案中，聚乙烯链可以为直链形式，或其为支链的。根据一实施方案，聚乙二醇链的平均分子量为约500道尔顿至约10,000道尔顿。在一实施方案中，聚乙二醇链的平均分子量为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿。在一实施方案中，聚乙二醇链的平均分子量为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿。在一实施方案中，聚乙二醇链的平均分子量为约1,000道尔顿至约2,000道尔顿。在一实施方案中，聚乙二醇链的平均分子量为约1,000道尔顿。
在一实施方案中，聚乙二醇化的5类肽包含由SEQIDNO：1015或SEQIDNO：1051的序列组成的肽，其中聚乙二醇链连接至选自SEQIDNO：1015或SEQIDNO：1051的位置11、12、15、16、19和24的氨基酸，并且PEG链的分子量为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿。在一实施方案中，聚乙二醇化的5类肽包含由SEQIDNO：1015或SEQIDNO：1051的序列组成的肽，其中聚乙二醇链连接至SEQIDNO：1015或SEQIDNO：1051的位置16或19处的氨基酸，并且PEG链的分子量为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿。在另一实施方案中，修饰的5类肽包含共价结合至肽的2条或更多条聚乙烯链，其中胰高血糖素链的总分子量为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿。在一实施方案中，5类肽包含SEQIDNO：1015或SEQIDNO：1051的序列，其中聚乙二醇链连接至SEQIDNO：1015或SEQIDNO：1051的位置16和19处的氨基酸，并且两条PEG链的组合分子量为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿。
5类胰高血糖素相关的类似物肽可以包含任何SEQIDNOs：1001-1118的氨基酸序列，并且任选地具有保留胰高血糖素拮抗剂活性和GLP-1激动剂活性的高达1、2、3、4或5个其他修饰。
相对于生物活性肽、多肽或蛋白的二肽位置
前药二肽经由酯键共价连接至生物活性肽、多肽或蛋白的任何氨基酸。在某些实施方案中，二肽连接至为生物活性肽、多肽或蛋白的活性位点的一部分的氨基酸或羟基酸。
在某些实施方案中，二肽通过二肽与生物活性肽、多肽或蛋白的第一氨基酸之间的酯键连接至生物活性肽、多肽或蛋白。在某些方面，二肽连接至生物活性肽、多肽或蛋白的第一个氨基酸的侧链，而在其他方面，二肽经由酯键连接至生物活性肽、多肽或蛋白的第一氨基酸的α碳。在后者的情况中，生物活性肽、多肽或蛋白的第一氨基酸为HO-氨基酸。在更具体的方面，生物活性肽、多肽或蛋白的第一氨基酸为HO-His、HO-Tyr、HO-Phe或HO-Phe的衍生物。
在其他实施方案中，二肽经由二肽与生物活性肽、多肽或蛋白的最后氨基酸之间的酯键连接至生物活性肽、多肽或蛋白。在某些方面，二肽连接至生物活性肽、多肽或蛋白的最后氨基酸的侧链，而在其他方面，二肽经由酯键连接至生物活性肽、多肽或蛋白的最后氨基酸的α碳。在后者的情况中，生物活性肽、多肽或蛋白的最后氨基酸为氨基醇，其中天然α羧酸基团被改变为醇基团。
在可选实施方案中，二肽连接至生物活性肽、多肽或蛋白的内部氨基酸残基。在某些实施方案中，内部氨基酸为诸如Ser、Thr的包含侧链羟基的氨基酸。
在生物活性肽、多肽或蛋白为胰高血糖素的某些实施方案中，二肽连接至胰高血糖素(SEQIDNO：612)的位置2、5、7、8或11。在生物活性肽、多肽或蛋白为胰高血糖素超家族肽(如，胰高血糖素相关的类似物肽)的其他实施方案中，二肽连接至对应于胰高血糖素(SEQIDNO：612)的位置2、5、7、8或11的胰高血糖素超家族肽的位置。对应于胰高血糖素的位置2、5、7、8或11的胰高血糖素超家族肽的位置，可以通过将胰高血糖素超家族肽的氨基酸序列与天然胰高血糖素的氨基酸序列比对来测定。例如，在图18中，将许多胰高血糖素超家族肽序列与胰高血糖素序列(SEQIDNO：612)比对。
在生物活性肽为胰岛素的某些实施方案中，二肽连接至胰岛素A链的位置4或21，或者胰岛素B链的位置5或9。在生物活性肽为胰岛素另一实施方案中，二肽连接至胰岛素A链或B链的N-末端氨基酸或C-末端氨基酸。在更具体的实施方案中，其中胰岛素包含SEQIDNO：626和/或SEQIDNO：628，二肽连接至SEQIDNO：626的位置1、4或21处的氨基酸，或者连接至SEQIDNO：628的位置1、5、12、或21处的氨基酸。
对于其他生物活性肽、多肽和蛋白，二肽应当连接的位置可以通过测试生物活性肽、多肽或蛋白的前药形式的活性水平来确定，该前药形式包含通过酯键连接至存在于生物活性肽、多肽或蛋白的天然氨基酸序列中的Ser残基或Thr残基的二肽。如果修饰的生物活性肽、多肽或蛋白的活性水平小于不包含二肽的对应生物活性肽、多肽或蛋白的活性水平的约10％(如，小于约5％、小于约1％)，则将二肽连接的Ser或Thr鉴定为二肽连接的良好位置。
或者，修饰生物活性肽、多肽或蛋白，以由Ser或Thr代替天然氨基酸，并且可以测试修饰的生物活性肽、多肽或蛋白的活性。如果修饰的生物活性肽、多肽或蛋白表现出与未修饰的生物活性肽、多肽或蛋白的活性类似、相同或比其更高的活性，则可以将修饰的生物活性肽、多肽或蛋白作为包含连接至代替天然氨基酸的Ser或Thr的二肽部分的前药测试活性。如果修饰的生物活性肽、多肽或蛋白的前药的活性水平小于不包含二肽的修饰的生物活性肽、多肽或蛋白的活性水平的约10％(如，小于约5％、小于约1％)，则将二肽连接的Ser或Thr鉴定为二肽连接的良好位置。
前药二肽部分
本文所述的前药的二肽为两个共价连接的氨基酸或共价连接的羟基酸与氨基酸的任何组合物，其能够在生理条件(如，在没有任何酶或另外的化学物质的情况下)下于PBS中形成哌啶二酮(DKP)或吗啉二酮(DMP)。DKP或DMP的形成导致二肽与生物活性肽、多肽或蛋白之间酯键的切割。二肽的结构控制DKP或DMP形成的趋势，因而控制从生物活性肽、多肽或蛋白切割二肽的速率。在某些实施方案中，二肽包含结构A-B，其中A为共价连接至B的羟基酸或氨基酸，B为经由酯键连接至生物活性肽、多肽或蛋白的氨基酸。
在某些实施方案中，A和B的每一个都为氨基酸或羟基酸的L-立体异构体，在这种情况下，DKP或DMP形成的发生比二肽包含L-立体异构体和D-立体异构体的情况要慢。
在某些实施方案中，A和B的每一个都包含空间上妨碍或庞大的侧链，例如(i)包含通式VII的结构的支链侧链
通式VII
其中X和Y的每一个都独立地选自C、O、S或N，并且R15和R16都独立地选自H、C1-C18烷基、(C2-C18烷基)OH、(C2-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C2-C4烷基)COOH、(C2-C4烷基)NH2、(C2-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C4-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R17和CH2(C5-C9杂芳基)，其中R17＝H、C1-C4烷基、NH2或OH；和(ii)芳香氨基酸(如，Tyr、Phe、Trp)的侧链。这类侧链的存在减少了从生物活性肽切割的速率和DKP或DMP的形成速率。
在其他实施方案中，A和B都不包含空间上妨碍或庞大的侧链。这类侧链的缺乏减少了从生物活性肽切割的速率和DKP或DMP的形成速率。
仍然在其他实施方案中，A或B之一包含空间上妨碍或庞大的侧链，这提供了中等的切割速率和DKP或DMP的形成速率。本文所述的前药的具体二肽部分包括但不限于表4和5中所示的以及下文的示例性前药实施方案所示的任何二肽。
示例性前药实施方案
根据某些实施方案，前药包含A-B-Q的一般结构，其中A为共价连接至B的羟基酸或氨基酸；B为经由酯键共价连接至Q的氨基酸；以及Q为生物活性肽、多肽或蛋白，如胰高血糖素超家族肽(如，胰高血糖素相关的类似物肽)，其中在生理条件的PBS中，A-B从Q化学切割的半衰期(t1/2)不大于约1周。
以不依赖任何酶的方式从Q切割A-B。因此，在生理条件的PBS中，A-B从Q切割的t1/2与在生理条件的包含DPP-IV蛋白酶的溶液中A-B从Q切割的t1/2没有明显不同。包含DPP-IV蛋白酶的溶液可以是，例如血清。在某些实施方案中，在生理条件的PBS中，A-B从Q切割的t1/2不大于在生理条件的包含DPP-IV蛋白酶的溶液中A-B从Q切割的t1/2的两倍。
在某些实施方案中，在生理条件的PBS中，A-B从Q切割的t1/2为约24小时或更短，如约1小时至约2小时、约5小时或更短、约8小时或更短、约12小时或更短、约16小时或更短、约20小时或更短。在某些实施方案中，在生理条件的PBS中，A-B从Q切割的t1/2小于约1.5小时。在这些情况下，A的侧链和B的侧链都不包含通式VII的结构：
通式VII
其中X和Y的每一个都独立地选自C、O、S或N，并且R15和R16独立地选自H、C1-C18烷基、(C2-C18烷基)OH、(C2-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C2-C4烷基)COOH、(C2-C4烷基)NH2、(C2-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C4-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R17和CH2(C5-C9杂芳基)，其中R17＝H、C1-C4烷基、NH2或OH；
B任选地为芳香氨基酸；以及
A或B任选地为二取代的氨基酸，如AIB。
在某些实施方案中，其中在生理条件的PBS中，A-B从Q切割的t1/2小于约1.5小时，A选自Gly、Ala、Ser、Thr、Glu、Asp、Gln、Asn、Met、His、Cys、Lys、Pro、Arg、二取代的氨基酸(如，AIB)，或者任何前述的羟基酸或D-立体异构体；
并且B选自Gly、Ala、Ser、Thr、Glu、Asp、Gln、Asn、Met、His、Cys、Lys、Pro、Arg、二取代的氨基酸(如，AIB)、Trp、Tyr、Phe，或任何前述的D-立体异构体。
在某些实施方案中，A和B的每一个都包含以下结构的侧链：
-CH2-X-R1，
其中X为C、O、S或N，其中R1为H、C1-C18烷基、(C2-C18烷基)OH、(C2-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C2-C4烷基)COOH、(C2-C4烷基)NH2、(C2-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C4-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R9和CH2(C5-C9杂芳基)，其中R9＝C1-C4烷基、NH2或OH。
仍然在其他实施方案中，A和B之一或全部为二取代的氨基酸，其包含侧链(如，如上文所述)和由C1-C18烷基的第二取代。
在其他实施方案中，A-B从Q切割的t1/2为约1.5小时至约24小时。在这些情况下，(i)仅A和B之一包含通式VII的分枝的侧链
通式VII
其中X和Y的每一个都独立地选自C、O、S或N，并且R15和R16独立地选自H、C1-C18烷基、(C2-C18烷基)OH、(C2-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C2-C4烷基)COOH、(C2-C4烷基)NH2、(C2-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C4-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R17和CH2(C5-C9杂芳基)，其中R17＝H、C1-C4烷基、NH2或OH；A和B的另一个不是芳香氨基酸；(ii)仅A为芳香氨基酸；或者(iii)A和B的每一个都为芳香氨基酸，并且一个为D-氨基酸，且另一个为L-氨基酸。在具体实施方案中，B包含分枝的侧链。
仍然在其他实施方案中，在生理条件的PBS中，A-B从Q切割的t1/2小于1周但大于约24小时，如大于约36小时、大于约48小时、大于约72小时、大于约96小时、大于约120小时、大于约150小时。在这样的情况下，A和B的每一个都独立地为芳香氨基酸，或包含通式VII的分枝的侧链
通式VII
其中X为C、O、S或N，并且R15和R16独立地选自H、C1-C18烷基、(C2-C18烷基)OH、(C2-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C2-C4烷基)COOH、(C2-C4烷基)NH2、(C2-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C4-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R17和CH2(C5-C9杂芳基)，其中R17＝H、C1-C4烷基、NH2或OH；
其中，当A和B都是芳香氨基酸时，它们都是L-氨基酸。
在某些实施方案中，A-B经由B与Q的第一氨基酸之间的酯键连接至Q。在某些方面，A-B连接至Q的第一氨基酸的侧链，而在其他方面，A-B经由酯键连接至Q的第一氨基酸的α碳。在后者的情况中，Q的第一氨基酸为HO-氨基酸。在更具体的方面，Q的第一氨基酸为HO-His、HO-Tyr、HO-Phe或HO-Phe的衍生物。
在其他实施方案中，A-B经由B与Q的最后氨基酸之间的酯键连接至Q。在某些方面，A-B连接至Q的最后氨基酸的侧链，而在其他方面，A-B经由酯键连接至Q的最后氨基酸的α碳。在后者的情况中，Q的最后氨基酸为氨基醇，其中天然α羧酸基团已被改变为醇基团。
仍然在其他实施方案中，其中A-B经由B与Q的内部氨基酸之间的酯键连接至Q。在更具体的方面，Q的内部氨基酸位于位置2、5、7、8或11(根据天然胰高血糖素的氨基酸编号(SEQIDNO：612)处。在某些方面，Q的内部氨基酸为包含侧链的氨基酸，该侧链包含羟基(如Ser、Thr)。
在一实施方案中，提供了可注射的贮库组合物，其包含具有A-B-Q的一般结构的复合物，其中
A为氨基酸或羟基酸；
B为经由酯键共价连接至Q的氨基酸；并且Q为生物活性肽、多肽或蛋白，如胰高血糖素超家族肽，例如胰高血糖素相关的类似物肽，其中二肽A-B还包含连接至A或B的贮库聚合物。二肽A-B可以包含任何本申请之前描述的结构，其提供了期望的从Q的非酶促自我切割半衰期，其中通过连接至贮库聚合物进一步修饰二肽结构。选择的贮库聚合物具有足够的大小，从而复合物A-B-Q在注射位点被有效地隔离，或者不能与其靶标(如，其受体)相互作用。在一实施方案中，贮库聚合物连接至A和/或B的侧链。用于本实施方案的合适贮库聚合物包括，例如有关本说明书第164-166页(对应中文译文的第126-128页)所提供的通式XI的化合物所公开的任何聚合物，以及本领域技术人员已知的的其他生物相容聚合物。
从Q化学切割A-B产生哌嗪二酮或吗啉二酮，并在给药后，以受控的方式，在预定的持续时间内向患者释放活性生物活性肽、多肽或蛋白。根据一实施方案，通过以下方法修饰生物活性肽或蛋白(Q)的脂肪族羟基，该脂肪族羟基包括，例如丝氨酸残基或苏氨酸残基的带有羟基的侧链，或者N-末端羟基化的氨基酸(HO-氨基酸)的羟基：通过酯连接将以下结构的二肽(A-B)共价连接至生物活性多肽：
其中R1和R2独立地选自H、C1-C6烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C4-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R17和CH2(C5-C9杂芳基)，其中R17为H、C1-C4烷基、NH2或OH，并且R5为OH或NH2，其中进一步修饰二肽(A-B)，以包含共价连接至二肽的贮库聚合物。可以将包含二肽的贮库聚合物通过生物活性肽或蛋白的任何脂肪族羟基连接至生物活性肽或蛋白，该脂肪族羟基包括，例如丝氨酸残基或苏氨酸残基的带有羟基的侧链，或者位于肽的N-末端的羟基酸的羟基。在一实施方案中，R1和R2独立地选自H、C1-C18烷基、(C2-C18烷基)OH、(C2-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C2-C4烷基)COOH、(C2-C4烷基)NH2、(C2-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C4-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R17和CH2(C5-C9杂芳基)，其中R17＝H、C1-C4烷基、NH2或OH，并且通过R1和/或R2取代基之一共价连接贮库聚合物。在一实施方案中，生物活性肽、多肽或蛋白为胰高血糖素超家族肽或胰高血糖素相关的类似物肽。在一实施方案中，将两种或更多种贮库聚合物连接至单个二肽元件。
选择的贮库聚合物是生物相容的，并且具有足够的大小，从而通过二肽/贮库聚合物复合物的共价连接而修饰的生物活性肽、多肽或蛋白在给予患者时，在注射位点保持隔离和/或不能与其相应的受体相互作用。二肽的随后切割释放生物活性肽以与其既定靶标相互作用。选择二肽元件上取代基的不同组合会允许制备可注射的组合物，该可注射的组合物包含在期望的时限内单独释放生物活性肽的二肽/生物活性肽复合物的混合物。在一实施方案中，直接或间接通过连接物，将一个或多个贮库聚合物共价连接至A和/或B。在一实施方案中，通过与A或B的高亲和力结合(通过与A或B的直接相互作用，或者通过共价结合至A或B的连接部分)，将一个或多个贮库聚合物非共价连接。例如，在一实施方案中，经由连接至共价结合的C16或C18酰基或烷基，将贮库聚合物间接连接至A或B的侧链。从Q化学切割A-B产生哌嗪二酮或吗啉二酮，并且在给药后，以受控的方式，在预定的持续时间内释放活性生物活性肽，以全身地分布于患者中(在初始复合物被初始隔离的那些实施方案中)，并允许活性生物活性肽与其靶配体相互作用。
在一实施方案中，提供了可注射的组合物，其中该组合物包含许多不同的二肽/生物活性肽复合物，其中该二肽/生物活性肽复合物基于二肽部分的结构而互相不同。根据一实施方案，二肽/生物活性肽复合物包含A-B-Q的一般结构(如上文所定义)的化合物与连接至A或B的贮库聚合物，其中该二肽/生物活性肽复合物基于A和/或B的取代基而互相不同。以这种方式，可以提供可注射的组合物，其中基于单独的不同复合物的切割速率，以受控的方式，在延长的时间段内释放生物活性肽、多肽或蛋白(Q)。根据一实施方案，提供了这样的组合物，其中该组合物包含游离形式的生物活性肽、多肽或蛋白(Q)与共价结合至二肽元件的生物活性肽、多肽或蛋白(Q)的混合物。以这种方式，给予的组合物由于游离形式的活性生物活性肽、多肽或蛋白的存在而具有直接的治疗效果。另外，会有延长或延缓的生物效果，因为在组合物的初始给药后，二肽以预定的时间间隔从A-B-Q复合物被切割，并释放另外的活性生物活性肽、多肽或蛋白(Q)。
根据一实施方案，贮库聚合物选自本领域技术人员已知的的生物相容聚合物。贮库聚合物的大小通常为约20,000道尔顿至120,000道尔顿。在一实施方案中，贮库聚合物的大小为约40,000道尔顿至100,000道尔顿，或约40,000道尔顿至80,000道尔顿。在一实施方案中，贮库聚合物的大小为约40,000、50,000、60,000、70,000或80,000道尔顿。合适的贮库聚合物包括但不限于葡聚糖、聚交酯、聚乙醇酸交酯、基于己内酯的聚合物、聚(己内酯)、聚酸酐、聚胺、聚酰胺酯、聚原酸酯、聚二噁烷酮(polydioxanone)、聚缩醛、聚缩酮、聚碳酸酯、聚磷酸酯、聚酯、聚对苯二甲酸丁二酯(polybutyleneterephthalate)、聚原碳酸酯、聚磷腈、琥珀酸酯、聚(苹果酸)、聚(氨基酸)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚羟基纤维素、多糖、甲壳质、壳聚糖、透明质酸及上述的共聚物、三元共聚物和混合物，以及生物可降解的聚合物和它们的包括基于己内酯的聚合物、聚己内酯在内的共聚物和包括聚对苯二甲酸丁二酯在内的共聚物。在一实施方案中，贮库聚合物选自聚乙二醇、葡聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸及乳酸与乙醇酸的共聚物；在具体的实施方案中，贮库聚合物为聚乙二醇。在一实施方案中，连接至二肽元件的贮库聚合物的组合分子量为约40,000道尔顿至80,000道尔顿；并且在一实施方案中，贮库聚合物为聚乙二醇。
根据一实施方案，贮库聚合物连接至二肽“A-B”的两个氨基酸之一的侧链(或连接至存在于二肽的位置“A”的羟基酸的侧链)。在一实施方案中，二肽A-B包含半胱氨酸残基或赖氨酸残基以提供易于贮库聚合物连接的反应性基团。在一实施方案中，二肽A-B包含赖氨酸或半胱氨酸，其中分子量为40,000道尔顿至80,000道尔顿的聚乙二醇共价连接至赖氨酸或半胱氨酸侧链。
在某些实施方案中，Q为胰高血糖素超家族肽。在更具体的方面，Q为胰高血糖素相关的类似物肽，如任何本文所述的那些。
根据一实施方案，提供了胰岛素的前药衍生物，其中以下基团被共价连接至选自A链的A1、A4或A21或者B链的B5、B9、B16或B25的位置处：
在一实施方案中，胰岛素前药包含SEQIDNO：613的A链和SEQIDNO：614的B链，其中由具有以下结构的修饰的氨基酸取代选自A链的A4或A21或者B链的B5、B9的位置处的氨基酸：
或者，由具有以下结构的修饰的氨基酸取代位置B16或B25处的氨基酸：
其中R10选自H、C1-C4烷基和(CH2)n(C6-C10芳基)，W为C6-C10芳基或键，并且n为0至3的整数，
R12为
R1和R2独立地选自H、C1-C4烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C4-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R9和CH2(C5-C9杂芳基)，
R5为OH或NH2，并且R9＝C1-C4烷基、NH2或OH。在一实施方案中，R1选自CH2(CH3)2、(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，并且R2选自(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)。在一实施方案中，胰岛素前药在选自以下位置的位置处还包含一个或多个另外的氨基酸取代：A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30；在一实施方案中，这些氨基酸取代为保守性氨基酸取代。不给胰岛素的期望活性带来不利影响的这些位置处的合适氨基酸取代，对本领域技术人员而言是已知的，例如，如在Mayer，etal.，InsulinStructureandFunction(胰岛素结构与功能)，Biopolymers.2007；88(5)：687-713中所示范的，该文献通过引用并入本文。在一实施方案中，胰岛素前药在选自以下位置的位置处包含1至3个氨基酸取代：A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、B1、B2、B3、B4、B5、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30。在一实施方案中，通过天然胰岛素B肽位置B1-B5和B26-B30的一个或多个氨基酸缺失，相对于天然胰岛素序列，进一步修饰胰岛素前药；在另一实施方案中，通过氨基酸B1-B5和/或B26-B30的缺失进一步修饰。在一实施方案中，A8处的氨基酸为选自组氨酸、精氨酸和赖氨酸的氨基酸。在另一实施方案中，B10处的氨基酸为选自天冬氨酸、谷氨酸、高谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸的氨基酸。
根据一实施方案，提供了包含A链和B链的胰岛素前药，其中A链包含SEQIDNO：626的序列，B链包含SEQIDNO：628的序列，另外，其中以下一般结构的二肽经由酯键连接至位置A1、A4、A21、B5、B9、B16或B25(分别相对于SEQIDNO：613和SEQIDNO：614的天然A链和B链序列)处的氨基酸
其中R1和R2独立地选自H、C1-C4烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C4-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R9和CH2(C5-C9杂芳基)，R5为OH或NH2，并且R9＝C1-C4烷基、NH2或OH。在一实施方案中，R1选自CH2(CH3)2、(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，并且R2选自(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)。在一实施方案中，R1选自CH2(CH3)2、(C4-C5)环烷基、CH2(C6芳基)和CH2(C5-C6杂芳基)，并且R2选自(C4-C5)环烷基、CH2(C6芳基)和CH2(C5-C6杂芳基)。在另一实施方案中，胰岛素前药相对于SEQIDNO：626或SEQIDNO：628的序列还包含1-6或1-3个氨基酸取代。在一实施方案中，胰岛素前药的B链包含SEQIDNO：627的序列。
在一实施方案中，胰岛素前药包含X5IVX6QCCX7SICSLYQLENYCX8(SEQIDNO：626)和X13LCGX9X10LVEALX11LVCGERGFX12(SEQIDNO：628)的序列，其中X6为谷氨酸，X7选自苏氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸，X8为天冬酰胺或甘氨酸，X9为丝氨酸，X10选自天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸，X11和X12均为酪氨酸，X13为组氨酸，并且X5具有以下结构
其中R1选自CH2(CH3)2、(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，R2选自(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，并且R5为OH或NH2。在替代性实施方案中，胰岛素前药包含序列X5IVX6QCCX7SICSLYQLENYCX8(SEQIDNO：626)和X13LCGX9X10LVEALX11LVCGERGFX12(SEQIDNO：628)，其中X5为甘氨酸，X7选自苏氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸，X10选自天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸，X11和X12均为酪氨酸，并且X6、X8、X9或X13之一具有以下结构
其中R10选自H或CH3，n为0或3，R1选自CH2(CH3)2、(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，R2选自(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，并且R5为OH或NH2。在一实施方案中，n为0，并且R10为H。
在替代性实施方案中，胰岛素前药包含序列X5IVX6QCCX7SICSLYQLENYCX8(SEQIDNO：626)和X13LCGX9X10LVEALX11LVCGERGFX12(SEQIDNO：628)，其中X5为甘氨酸，X6为谷氨酸，X7选自苏氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸，X8为天冬酰胺或甘氨酸，X9为丝氨酸，X10选自天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸，X13为组氨酸，X11和X12之一为酪氨酸或苯丙氨酸，并且另一个具有以下结构
其中R1选自CH2(CH3)2、(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，R2选自(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，并且R5为OH或NH2。
根据一实施方案，提供了胰高血糖素或GLP-1的前药衍生物，其中以下基团共价连接至选自胰高血糖素或GLP-1肽的位置1、2、5、7、8或11处：
在一实施方案中，胰高血糖素或GLP-1前药的位置2、5、7、8或11处的氨基酸包含具有以下结构的氨基酸：
其中R10选自H、C1-C4烷基和(CH2)n(C6-C10芳基)，其中n为0至3的整数，
R12为
R1和R2独立地选自H、C1-C4烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C4-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R9和CH2(C5-C9杂芳基)，
R5为OH或NH2，并且R9＝C1-C4烷基、NH2或OH。在一实施方案中，R1选自CH2(CH3)2、(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，并且R2选自(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)。在一实施方案中，胰高血糖素和GLP-1前药还包含选自有关天然序列的位置1、2、5、8、10、12、13、14、16、17、18、24、28和29的一个或多个氨基酸取代。
在一实施方案中，提供了包含SEQIDNO：612的衍生物的胰高血糖素前药，其中该衍生物与SEQIDNO：612的不同在于选自位置1、2、5、7、8、10、12、13、14、16、17、18、24、28和29的位置处的1-6或1-3个氨基酸取代，其中以下基团共价连接至选自胰高血糖素肽的1、2、5、7、8或11的位置处：
其中R1选自CH2(CH3)2、(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，R2选自(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，并且R5为OH或NH2。
在一实施方案中，提供了包含SEQIDNO：629的衍生物的GLP-1前药，其中该衍生物与SEQIDNO：629的不同在于选自相对于天然GLP-1的位置1、2、3、5、8、10、12、13、14、16、17、18、24、28和29的位置处的1-6或1-3个氨基酸取代，其中以下基团共价连接至选自胰高血糖素肽的1、2、5、7、8或11的位置处：
其中R1选自CH2(CH3)2、(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，R2选自(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，并且R5为OH或NH2。
在一实施方案中，胰高血糖素和GLP-1衍生物包含这样的氨基酸序列，其与天然肽的不同在于位置1、2和16的一个或多个处的取代。在一实施方案中，胰高血糖素和GLP-1衍生物包含这样的氨基酸序列，其与天然肽的不同在于位置16处的取代，其中取代的氨基酸选自Glu、Gln、高谷氨酸或高半胱磺酸。在另一实施方案中，胰高血糖素和GLP-1衍生物包含这样的氨基酸序列，其与天然肽的不同在于位置1、2和/或16处的取代，其中位置1处的取代选自d-组氨酸、脱氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸和高组氨酸，并且位置2处的取代选自d-丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、n-甲基丝氨酸和氨基异丁酸。
根据一实施方案，提供了GLP-1或胰高血糖素的前药衍生物，其中该前药包含以下一般结构的多肽：
R3-Y-R4
其中Y为选自以下结构的结构
其中n为0至3的整数，m为1至4的整数，R3为选自X1X2X3G-(SEQIDNO：621)或
的氨基酸序列，其中X1选自组氨酸、羟基-组氨酸、高组氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸；X2为选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、d丙氨酸、氨基异丁酸、N-甲基丙氨酸及类似大小的天然与合成氨基酸的氨基酸；X3选自谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺；X4选自脱氨基组氨酸、脱氨基高组氨酸、脱氨基酪氨酸和脱氨基苯丙氨酸；
R4为选自(SEQIDNO：615)、(SEQIDNO：616)、(SEQIDNO：617)、(SEQIDNO：618)和(SEQIDNO：619)的氨基酸序列；
其中SEQIDNOs：615-619的位置11处的X为丝氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、高谷氨酸或高半胱磺酸；
R5为NH2或HO；
R6为H或
并且
R1和R2独立地选自H、C1-C3烷基、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)(CH2CH3)、(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，并且R5为OH或NH2，其条件是当R3为
时
R6为H，并且当R6为
时，
R3为X1X2X3G-(SEQIDNO：621)，进一步的条件是当R6为H时，R3不是X1X2X3G-(SEQIDNO：621)。在一实施方案中，R1选自CH2(CH3)2、(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)和CH2(C5-C9杂芳基)，R2选自(C4-C5)环烷基、CH2(C6-C10芳基)，并且R5为OH或NH2。
根据一实施方案，提供了胰高血糖素或GLP-1的前药衍生物，其中该前药包含序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQIDNO：602)或HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQIDNO：612)的衍生肽，其中该衍生肽包含相对于SEQIDNO：602或SEQIDNO：612在选自位置1、2、5、8、10至14、16、17、18、24、28和29的位置处的1-6个氨基酸取代，并且具有经由选自位置1、2、5、7、8和11的位置处的酯键连接至肽的以下通式的二肽
在一实施方案中，位置2、5、7、8或11处的氨基酸为丝氨酸残基，并且二肽经由与丝氨酸侧链形成的酯键而连接。通常，这些前药在前药形式时表现出小于10％的活性，而在激活时表现出完整的活性。
根据一实施方案，提供了GLP-1的前药衍生物。如在实施例4的表6和7中提供的数据所公开的，制备了各种GLP-1前药衍生物，其在物理和化学上是稳定的，表现出增强的半衰期，并且在生理条件下转化为活性多肽而不需要酶的辅助。这些GLP-1类似物中的4种在生理条件下转化为活性多肽，并且半衰期大于20小时。这些类似物对天然氨基酸序列的改变很少，这应当降低了潜在的不良免疫原性效果。在GLP-1的N-末端建立的前药化学被认为可与其他肽转换使用，其中该特异性位点对于生物活性是重要的。
根据一实施方案，前药GLP-1类似包含以下通式的多肽：
R3-Y-R4
其中Y为选自以下结构的结构
R3为选自HX2QG-(SEQIDNO：635)、FX2QG-(SEQIDNO：636)、X1X2QG-(SEQIDNO：637)或
的氨基酸序列；X1选自组氨酸、羟基-组氨酸、高组氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸；X2为选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、d丙氨酸、氨基异丁酸、N-甲基丙氨酸及类似大小的天然与合成氨基酸的氨基酸；
R4为包含选自以下序列的氨基酸序列：FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQIDNO：603)；FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-酰胺(SEQIDNO：604)；FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGX14PSSGAPPPS-酰胺(SEQIDNO：605)的序列，其中X14为Arg或Gly；FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGKRNRNNIA(SEQIDNO：606)以及SEQIDNOs3、4、5或6的衍生物；其中该衍生物与SEQIDNOs：603、604、605或606的不同在于1至3个氨基酸；并且在一实施方案中，不同在于1至3个保守氨基酸；
R5为NH2或HO；
R6为H或
R7为选自O-HX2QG-(SEQIDNO：635)、O-FX2QG-(SEQIDNO：636)和O-YX2QG-(SEQIDNO：638)的氨基酸序列；并且
R1和R2独立地选自H、C1-C3烷基、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)(CH2CH3)、(C4-C5)环烷基、CH2(C6芳基)和CH2(C5-C6杂芳基)，其条件是当R3为
时，
R6为H，并且当R6为
时，
R3为R5HX2QG-(SEQIDNO：635)、R5FX2QG-(SEQIDNO：636)或R5YX2QG-(SEQIDNO：38)，进一步的条件是当R6为H时，R3不是R5HX2QG-(SEQIDNO：635)、R5FX2QG-(SEQIDNO：636)或R5YX2QG-(SEQIDNO：638)。在一实施方案中，R1选自CH2(CH3)2、(C4-C5)环烷基、CH2(C6芳基)和CH2(C5-C6杂芳基)，R2选自(C4-C5)环烷基、CH2(C6芳基)，并且R5为OH或NH2。
在一实施方案中，提供了GLP-1前药，其具有通式V的一般结构：
其中R4为选自以下序列的氨基酸序列：
FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQIDNO：603)；FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-酰胺(SEQIDNO：604)；FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGX14PSSGAPPPS-酰胺(SEQIDNO：605)，其中X14为Arg或Gly；以及SEQIDNOs：603、604或605的衍生物，其中该衍生物与SEQIDNOs：603、604或605的不同在于1至3个氨基酸；并且在一实施方案中，不同在于1至3个保守性氨基酸；
R5为NH2或HO；
R7为选自O-HX2QG-(SEQIDNO：635)和O-FX2QG-(SEQIDNO：636)的氨基酸序列；
X2为选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、d丙氨酸、氨基异丁酸、N-甲基丙氨酸及类似大小的天然与合成氨基酸的氨基酸；并且
R1和R2独立地选自H、C1-C3烷基、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)(CH2CH3)、(C4-C5)环烷基、CH2(C6芳基)和CH2(C5-C6杂芳基)。
根据一实施方案，提供了具有通式III或V的一般结构的前药，其中R1选自CH2(CH3)2和CH2(C6芳基)；R2为CH2(C6芳基)；并且R5为OH。在另一实施方案中，R4为FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGX14PSSGAPPPS-酰胺(SEQIDNO：605)，其中X14为Arg或Gly。在另一实施方案中，提供了具有通式III或V的一般结构的前药，其中R1为CH2(CH3)2，R2为H或CH2(C6芳基)，并且R5为NH2。在另一实施方案中，R4为FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGX5PSSGAPPPS-酰胺(SEQIDNO：605)，其中X14为Arg或Gly。
在一实施方案中，提供了具有通式III的一般结构的GLP-1前药：
其中，
R3为选自R5HAQG(SEQIDNO：639)、R5FAQG(SEQIDNO：640)、R5YAQG(SEQIDNO：641)的氨基酸序列；
R4包含选自以下序列的氨基酸序列：FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQIDNO：603)；FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-酰胺(SEQIDNO：604)和FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGX14PSSGAPPPS-酰胺(SEQIDNO：605)，其中X14为Arg或Gly；
R5为NH2或HO；并且
R1和R2独立地选自H、C1-C3烷基、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)(CH2CH3)、(C4-C5)环烷基、CH2(C6芳基)和CH2(C5-C6杂芳基)；并且R5为OH或NH2。在一实施方案中，R1选自CH2(CH3)2、(C4-C5)环烷基、CH2(C6芳基)和CH2(C5-C6杂芳基)，R2选自(C4-C5)环烷基、CH2(C5-C6芳基)，并且R5为OH或NH2。
根据一实施方案，提供了具有通式III的一般结构的前药，其中R1选自CH2(CH3)2和CH2(C6芳基)，R2为CH2(C6芳基)，并且R5为OH。在另一实施方案中，R4为FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGX14PSSGAPPPS-酰胺(SEQIDNO：605)，其中X14为Arg或Gly。在另一实施方案中，提供了具有通式III的一般结构的前药，其中R1为CH2(CH3)2，R2为H或CH2(C6芳基)，R5为NH2，并且R4为FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGX14PSSGAPPPS-酰胺(SEQIDNO：605)，其中X14为Arg或Gly。在一实施方案中，提供了具有通式VI的一般结构的前药：
其中R13为AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS-酰胺(SEQIDNO：608)或AQGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS-酰胺(SEQIDNO：609)，其半衰期为约64小时。
合成肽的生物活性已经利用实施例2中详细描述的体外细胞测定进行了测定。简言之，该测定是基于细胞的测定，其中将宿主细胞用GLP-1受体与连接至cAMP应答元件(CRE)的萤光素酶基因共转染。萤光素酶基因的转录通过结合至cAMP应答元件的cAMP应答元件结合蛋白(CREB)来调节。诱导的cAMP产生与结合至其受体的GLP-1成正比，这通过表达的萤光素酶基因的检测的活性来表示。本文公开的前药在37℃的温度下，于pH值为7.2的PBS缓冲液中的孵育后重新获得它们的效力。而且，本发明的GLP-1类似物对天然氨基酸序列的改变很少，这应当减少了潜在的不良免疫原性效果。
可以进一步修饰本文公开的前药，以改善肽在生理pH值的水溶液中的溶解性，同时通过防止肽的肾清除来增强肽的有效持续时间。与血浆蛋白相比，肽由于其相对小的分子量而容易清除。将肽的分子量增加至大于40kDa超过了肾的阈值，并且明显地延长了血浆中的持续时间。因此，在一实施方案中，进一步修饰肽前药，以包含共价连接的亲水部分。在一实施方案中，亲水部分为血浆蛋白聚乙烯链或免疫球蛋白的Fc部分。因此，在一实施方案中，进一步修饰本公开的前药，以包含共价连接至氨基酸侧链的一个或多个亲水基团。
根据一实施方案，通过将亲水部分连接至B链的N-末端氨基酸，或连接至SEQIDNO：627的位置29处的氨基酸，进一步修饰本文公开的胰岛素前药。在另一实施方案中，通过将亲水部分分别连接至对应于SEQIDNO：612和SEQIDNO：602的位置20、21、24的氨基酸，或者通过向胰高血糖素或GLP-1前药的羧基末端添加修饰的氨基酸，进一步修饰本文公开的胰高血糖素和GLP-1前药。修饰C-末端添加的氨基酸，以包含氨基酸的亲水部分。在一实施方案中，通过将亲水部分分别连接至对应于SEQIDNO：612和SEQIDNO：602的位置24的氨基酸，进一步修饰本文公开的胰高血糖素和GLP-1前药。在一实施方案中，亲水部分选自血浆蛋白聚乙烯链和免疫球蛋白的Fc部分。
在一实施方案中，亲水基团为聚乙烯链；在一实施方案中，2条或更多条聚乙烯链共价连接至前药的2个或更多个氨基酸侧链。对于胰高血糖素或GLP-1前药而言，多条聚乙烯链可以连接于选自20、21、24的位置处，或者通过向肽的C-末端添加单个氨基酸而连接，其中添加的氨基酸具有连接至其侧链的聚乙烯链。在一实施方案中，添加到C-末端的氨基酸为修饰的半胱氨酸。
根据一实施方案，通过氨基酸取代进一步修饰本文公开的前药，其中取代氨基酸包含适于与诸如聚乙二醇的亲水部分交联的侧链。在一实施方案中，由天然或合成的氨基酸取代前药的要连接亲水部分的位置处的氨基酸(或者添加到前药的C-末端)，以导入或允许易于连接亲水部分。例如，在一实施方案中，由赖氨酸残基或半胱氨酸残基取代(胰高血糖素或GLP-1前药的)位置20、21、24处的天然氨基酸(或者，向C-末端添加赖氨酸残基或半胱氨酸残基)以允许聚乙烯链的共价连接。
在一实施方案中，前药具有添加到羧基末端的单个半胱氨酸残基，或者由至少一个半胱氨酸残基取代前药肽，其中该半胱氨酸残基的侧链由巯基反应性试剂进一步修饰，该巯基反应性试剂包括，例如马来酰亚胺基、乙烯基砜、2-吡啶基硫代、卤代烷基和卤代酰基。这些巯基反应性试剂可以含有羧基、酮、羟基和醚基团以及其他亲水部分，如聚乙二醇单元。在替代性实施方案中，前药具有添加到羧基末端的单个赖氨酸残基，或者由赖氨酸取代前药肽，并且取代的赖氨酸残基的侧链还利用胺反应性试剂进行修饰，该胺反应性试剂例如诸如聚乙二醇的亲水部分的羧酸或醛的活性酯(琥珀酰亚胺基、酐等)。
本发明公开的胰高血糖素和GLP-1前药包含在已知对GLP-1类似物功能重要的位置处的天然胰高血糖素和GLP-1序列的氨基酸取代。在一实施方案中，取代为选自1、2、5、8、10、12-14、16-18、24、28和29的1、2、3、4、5或6个位置处的保守性氨基酸取代。在一实施方案中，由半胱氨酸残基或赖氨酸取代对应于天然GLP-1/胰高血糖素肽的位置20、21和24处的氨基酸，更具体而言，取代相对于天然GLP-1/胰高血糖素的位置21和24处的氨基酸，其中PEG共价连接至取代的半胱氨酸残基或赖氨酸残基。在另一实施方案中，修饰GLP-1类似物的C-末端，以由酰胺基团代替羧酸基团。
在前药包含聚乙二醇链的那些实施方案中，聚乙烯链可以为直链形式或分枝的。根据一实施方案，聚乙二醇链的平均分子量为约20,000道尔顿至约60,000道尔顿。可以将多个聚乙烯链连接至前药，以提供具有最佳溶解性和血液清除属性的前药。在一实施方案中，将前药连接至单个聚乙二醇链，该聚乙二醇链的平均分子量为约20,000道尔顿至约60,000道尔顿。在另一实施方案中，将前药连接至两条聚乙二醇链，其中该两条聚乙二醇链的组合平均分子量为约40,000道尔顿至约80,000道尔顿。在一实施方案中，将平均分子量为20,000道尔顿或60,000道尔顿的单个聚乙二醇链连接至前药。在另一实施方案中，将单个聚乙烯链连接至前药，并且该聚乙烯链的的平均分子量为约40,000道尔顿至约50,000道尔顿。在一实施方案中，将两条聚乙二醇链连接至前药，其中第一和第二聚乙二醇链各自的平均分子量为20,000道尔顿。在另一实施方案中，将两条聚乙二醇链连接至前药，其中第一和第二聚乙二醇链各自的平均分子量为40,000道尔顿。
在另一实施方案中，提供了胰高血糖素或GLP-1前药，其包含2条或更多条共价结合至肽的聚乙烯链，其中胰高血糖素链的总分子量为约40,000道尔顿至约60,000道尔顿。在一实施方案中，聚乙二醇化的胰高血糖素或GLP-1前药包含连接至胰高血糖素或GLP-1肽的位置20、21和24处的一个或多个氨基酸的聚乙二醇链，其中GPE链的组合分子量为约40,000道尔顿至约80,000道尔顿。在一实施方案中，提供了胰岛素前药，其包含2条或更多条共价结合至肽的聚乙烯链，其中胰高血糖素链的总分子量为约40,000道尔顿至约60,000道尔顿。在一实施方案中，聚乙二醇化的胰岛素前药包含连接至B链的N-末端和/或B链(如，SEQIDNO：627)的位置29处的一个或多个氨基酸的聚乙二醇链，其中PEG链的组合分子量为约40,000道尔顿至约80,000道尔顿。
根据一实施方案，提供了胰高血糖素或GLP-1前药，其包含选自以下结构的化合物结构：
1：L，L-二肽延伸2：L，D-二肽延伸
3：L，L-二肽延伸4：L，L-二肽延伸
5：L，L-二肽延伸6：L，L-二肽延伸
7：L，L-二肽延伸8：L，D-二肽延伸
其中X为CH2(CH3)2；Y为苯基；
R3为X1X2X3G(SEQIDNO：621)，其中X1选自组氨酸、羟基-组氨酸、高组氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，X2为选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、d丙氨酸、氨基异丁酸、N-甲基丙氨酸及类似大小的天然与合成氨基酸的氨基酸，并且X3选自谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺；
R4为选自以下序列的氨基酸序列
FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQIDNO：603)；FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-酰胺(SEQIDNO：604)；FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGX14PSSGAPPPS-酰胺(SEQIDNO：605)，其中X14为Arg或Gly；
FTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQIDNO：618)以及
FTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTPSSGAPPPS-酰胺(SEQIDNO：620)；
R8选自
AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGXPSSGAPPPS-酰胺(SEQIDNO：608)、
AQGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGXPSSGAPPPS-酰胺(SEQIDNO：609)、
AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKG(SEQIDNO：630)、
AQGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKG(SEQIDNO：631)、
SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQIDNO：632)和
SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTPSSGAPPPS-酰胺(SEQIDNO：633)。
根据一实施方案，R8包含选自EGTR4或AQGTR4的多肽；R3为选自OH-HAEG-(SEQIDNO：642)、HAQG-(SEQIDNO：639)、HAEG-(SEQIDNO：643)、FAEG-(SEQIDNO：644)和FAQG-(SEQIDNO：640)的氨基酸序列；并且R4包含选自SEQIDNO：616和SEQIDNO：618的氨基酸序列。在一实施方案中，R4选自FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQIDNO：603)；FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-酰胺(SEQIDNO：604)；FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGX14PSSGAPPPS-酰胺(SEQIDNO：605)，其中X14为Arg或Gly；以及
FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGKRNRNNIA(SEQIDNO：606)。
根据一实施方案，提供了胰高血糖素或GLP-1前药，其中血浆蛋白已共价连接至肽的氨基酸侧链以改善胰高血糖素或GLP-1前药类似物的溶解性、稳定性和/或药物动力学。例如，血清白蛋白可以共价结合至本文所示的胰高血糖素或GLP-1前药类似物。在一实施方案中，血浆蛋白(plasmidprotein)共价结合至对应于SEQIDNO：604或SEQIDNO：612的肽的位置20、21或24的氨基酸。更具体而言，在一实施方案中，血浆蛋白结合至对应于胰高血糖素或GLP-1前药类似物的位置21或24的氨基酸。
根据一实施方案，提供了胰高血糖素或GLP-1前药类似物，其中代表免疫球蛋白分子的Fc部分的线性氨基酸序列共价连接至本文公开的胰高血糖素或GLP-1前药类似物的氨基酸侧链，以改善胰高血糖素或GLP-1前药类似物的溶解性、稳定性和/或药物动力学。例如，代表免疫球蛋白分子的Fc部分的氨基酸序列可以共价结合至SEQIDNO：604的肽或者胰高血糖素或GLP-1前药的位置20、21或24。更具体而言，在一实施方案中，Fc部分结合至对应于胰高血糖素或GLP-1前药类似物的位置21或24的氨基酸，其中该类似物包含SEQIDNO：604或SEQIDNO：612的序列。Fc部分通常是从IgG分离的部分，但是来自任何免疫球蛋白的Fc肽片段应当功能相当。
本公开还包括其他偶联物，其中本发明的前药任选地经由共价键合和任选地经由连接物连接至偶联物。连接可以通过共价化学键；物理力，如静电相互作用、氢相互作用、离子相互作用、范德华相互作用或者疏水相互作用或亲水相互作用实现。可以使用各种非共价偶联系统，包括生物素-抗生物素蛋白、配体/受体、酶/底物、核酸/核酸结合蛋白、脂质/脂质结合蛋白、细胞粘附分子配偶体；或者上述的具有互相的亲和力的任何结合配偶体或片段。
示例性偶联物部分包括但不限于异源性肽或多肽(包括，例如血浆蛋白)、靶向剂(targetingagent)、免疫球蛋白或其部分(如，可变区、CDR或Fc区)、诸如放射性同位素、荧光团或酶标签的诊断标签、包括水溶性聚合物在内的聚合物或者其他治疗或诊断试剂。在一实施方案中，提供了偶联物，其包含本发明的前药多肽和血浆蛋白，其中该血浆蛋白选自白蛋白、转铁蛋白和纤维蛋白原。在一实施方案中，偶联物的血浆蛋白部分为白蛋白或转铁蛋白。在某些实施方案中，连接物包含长度为1至约60个原子，或者1至30个原子或更长，2至5个原子，2至10个原子，5至10个原子，或者10至20个原子的链。在某些实施方案中，链原子全部是碳原子。在某些实施方案中，连接物主链中的链原子选自C、O、N和S。链原子和连接物可以根据它们预期的溶解性(亲水性)来选择，以提供更可溶的偶联物。在某些实施方案中，连接物提供官能团，该官能团易于被酶或其他催化剂或者靶组织或靶器官或靶细胞中所发现的水解条件切割。在某些实施方案中，连接物的长度足以减少立体位阻的可能性。如果连接物为共价键或肽基键并且偶联物为多肽，则完整的偶联物可以是融合蛋白。这样的肽基连接物可以为任何长度。示例性连接物的长度为约1至50个氨基酸、5至50个、3至5个、5至10个、5至15个或10至30个氨基酸。或者，这样的融合蛋白可以通过对本领域技术人员已知的的重组遗传工程方法来制备。
申请人还发现，天然胰高血糖素和GLP-1可以通过在其羧基末端引入电荷来修饰以增强肽的溶解性，同时保留肽的激动剂属性。增强的溶解性允许在接近中性pH值的条件下制备和储存胰高血糖素溶液。在相对中性pH值(如，约5.0至约7.0的pH值)下配制胰高血糖素和GLP-1溶液改善了类似物的长期稳定性。
申请人预料，可以类似地修饰本文公开的胰高血糖素和GLP-1前药，以增强它们在相对中性pH值(如，约5.0至约7.0的pH值)的水溶液中的溶解性，同时保留母体蛋白的活性。因此，本发明的一实施方案涉及胰高血糖素或GLP-1类似物，其相对于天然氨基酸被进一步修饰，以通过由带电荷的氨基酸取代天然不带电荷的氨基酸或者向羧基末端添加带电荷的氨基酸，向肽增加电荷。根据一实施方案，由带电荷的氨基酸代替本文公开的胰高血糖素或GLP-1前药的1至3个不带电荷的天然氨基酸。在一实施方案中，带电荷的氨基酸选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。更具体而言，申请人发现，对于胰高血糖素，由带电荷的氨基酸取代对应于位置28或29(相对于SEQIDNO：612)处的通常存在的氨基酸，或对于GLP-1，由带电荷的氨基酸取代位置28或29和30(相对于SEQIDNO：602)处的通常存在的氨基酸；和/或在胰高血糖素或GLP-1前药的羧基末端处添加1至2个带电荷的氨基酸，增强了该前药在生理相关pH值(即，约6.0至约7.0的pH值)的水溶液中的溶解性和稳定性。预期本文公开的胰高血糖素和GLP-1前药的这类修饰对水溶液，特别是约5.0至约7.0的pH值的水溶液中的稳定性有类似的效果，同时保留母体肽的生物活性。
用途
公开的GLP-1前药、胰高血糖素前药和胰岛素前药被认为适合于以前对那些生物活性肽所描述的任何用途。因此，本文所述的前药可以用于治疗低血糖、高血糖或治疗高/低胰高血糖素血液水平或高/低血糖水平的其他代谢疾病。根据一实施方案，要利用本文公开的前药治疗的患者为饲养的动物，并且在另一实施方案中，要治疗的患者为人。
本发明的治疗高血糖或低血糖的方法包括，利用任何常规给药途径给予患者本发明公开的前药的步骤，该常规给药途径包括胃肠外，如静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内、鞘内、透皮、直肠、口服、经鼻或通过吸入。在一实施方案中，皮下或肌肉内给予组合物。在一实施方案中，胃肠外给予组合物，并且将前药预包装于注射器中。
毒蜥外泌肽-4是由39个氨基酸组成的肽。GLP-1受体的刺激物据报道抑制食欲并诱导体重减轻。在一实施方案中，毒蜥外泌肽-4(即，SEQIDNO：624(GPSSGAPPPS)的序列)的末端10个氨基酸连接至本公开的胰高血糖素和GLP-1前药的羧基末端。预料这些融合蛋白具有抑制食欲和诱导体重减轻/体重维持的药理活性。根据一实施方案，本公开的前药衍生物包含SEQIDNO：602、SEQIDNO：612、SEQIDNO：622、SEQIDNO：623或SEQIDNO：629的肽序列，还包含连接至SEQIDNO：602、SEQIDNO：612、SEQIDNO：622、SEQIDNO：623或SEQIDNO：629的羧基末端序列的SEQIDNO：624(GPSSGAPPPS)的氨基酸序列，将其给予个体以减少食欲或促进体重减轻。根据一实施方案，患者为饲养的动物，并且在另一实施方案中，要治疗的患者为人。预期减少食欲或促进体重减轻的这类方法可用于减轻体重，防止体重增加，或治疗包括药物诱导的肥胖在内的各种原因的肥胖以及减少与肥胖有关的并发症，包括血管疾病(冠状动脉疾病、中风、外周血管疾病、缺血再灌注等)、高血压、II型糖尿病的发作、高血脂和肌肉骨骼疾病。在一实施方案中，给予的肽包含SEQIDNO：605的序列。尽管本发明考虑到，可以任选地使本文所述的胰高血糖素和GLP-1前药连接至这种10个氨基酸羧基末端延伸(SEQIDNO：624)，但是本发明特别地考虑了缺乏SEQIDNO：624的10个连续氨基酸的类似物。
诱导体重减轻的另一化合物是泌酸调节肽，其是在小肠中发现的天然存在的消化激素(参见，Diabetes2005；54：2390-2395)。泌酸调节肽为37个氨基酸的肽，其含有胰高血糖素的29个氨基酸的序列及随后的SEQIDNO：625(KRNRNNIA)的8个氨基酸的羧基末端延伸。因此，在一实施方案中，提供了胰高血糖素和GLP-1的前药衍生物，其还包含SEQIDNO：625序列的羧基末端延伸。更具体而言，根据一实施方案，本公开的前药衍生物包含SEQIDNO：602、SEQIDNO：612、SEQIDNO：622或SEQIDNO：623的肽序列，还包含连接至SEQIDNO：602、SEQIDNO：612、SEQIDNO：622或SEQIDNO：623的羧基末端序列的SEQIDNO：625(KRNRNNIA)的氨基酸序列。这些肽可以用于诱导体重减轻或防止体重增加。尽管本发明考虑到，可以任选地使本文所述的胰高血糖素和GLP-1前药连接至这种8个氨基酸的羧基末端延伸(SEQIDNO：625)，但是本发明特别地考虑了缺乏SEQIDNO：625的8个连续氨基酸的类似物。
还可以将胰高血糖素和GLP-1前药给予患有分解代谢虚损的患者。据估计，超过一半的癌症患者经历了分解代谢虚损，其特征在于不期望的和进行性体重减轻、虚弱以及低身体脂肪和肌肉。该综合征在AIDS患者中也同样常见，并且还可以存在于细菌性和寄生性疾病、类风湿性关节炎以及肠、肝、肺和心脏的慢性疾病中。其通常与厌食相伴，并且可以表现为老化疾病状况或者物理损伤的结果。分解代谢虚损是降低生活质量、恶化潜在疾病状况的症状，并且是死亡的主因。
组合
本发明的胰岛素前药、胰高血糖素前药和GLP-1前药可以单独给予或与其他抗糖尿病剂或抗肥胖剂组合给予。本领域已知或研究中的抗糖尿病剂包括胰岛素；磺脲类，如甲苯磺丁脲(甲糖宁)、醋磺己脲(Dymelor)、妥拉磺脲(Tolinase)、氯磺丙脲(特泌胰)、格列吡嗪(利糖妥)、格列本脲(Diabeta、Micronase、Glynase)、格列美脲(亚莫利)或格列齐特(达美康)；氯茴苯酸类，如瑞格列奈(Prandin)或那格列奈(唐力)；双胍，如甲福明(格华止)或苯乙双胍；噻唑烷二酮，如罗格列酮(文迪雅)、吡格列酮(艾可拓)或曲格列酮(瑞泽林)或其他PPARγ抑制剂；抑制碳水化合物消化的α葡糖苷酶抑制剂，如米格列醇(Glyset)、阿卡波糖(阿卡波糖片剂/拜唐苹)；艾塞那肽(倍它)或普兰林肽；二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂，如维格列汀或西格列汀；SGLT(钠依赖性葡萄糖转运蛋白1)抑制剂；或FBPase(果糖1，6-二磷酸酶)抑制剂。
本领域已知或研究中的抗肥胖剂包括食欲遏抑剂，其包括苯乙胺型兴奋剂芬特明(任选地联合芬氟拉明或右芬氟拉明)、安非拉酮苯甲曲秦苄非他明西布曲明利莫纳班其他大麻素类受体拮抗剂；泌酸调节肽；盐酸氟西汀(百优解)；Qnexa(托吡酯和芬特明)、Excalia(安非他酮和唑尼沙胺)或Contrave(安非他酮和纳曲酮)；或类似于赛尼可(奥利司他)或西替司他(又称为ATL-962)的脂肪酶抑制剂或者GT389-255。
药物组合物
可以利用标准药用可接受的载体和本领域技术人员已知的给药途径，配制包含本文公开的前药的药物组合物并将其给予患者。因此，本公开还包括药物组合物，该药物组合物包含与药用可接受的载体组合的一种或多种本文公开的前药或其药用可接受的盐。在一实施方案中，药物组合物包含于pH值为约4.0至约7.0下、在磷酸盐缓冲体系中浓度为1mg/ml的前药。药物组合物可以包含作为唯一的药物活性组分的前药，或者可以将前药与一种或多种另外的活性剂组合。根据一实施方案，提供了组合物，其包含本发明的胰高血糖素或GLP-1前药和胰岛素或本发明的胰岛素类似物或胰岛素前药之一。或者，可以提供用于诱导体重减轻或防止体重增加的组合物，其包含胰高血糖素或GLP-1前药以及抗肥胖肽。合适的抗肥胖肽包括美国专利5,691,309、6,436,435或美国专利申请20050176643中公开的那些抗肥胖肽。
根据一实施方案，提供了药物组合物，其包含任何本文公开的优选无菌并且优选纯度水平为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的新前药，以及药用可接受的稀释剂、载体或赋形剂。这样的组合物可以含有胰高血糖素、GLP-1或胰岛素前药，其中所得的活性肽存在的浓度为至少0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml或更高。在一实施方案中，药物组合物包含无菌并任选地地保存于各种容器中的水溶液。据一实施方案，本发明的化合物可以用于制备即用于注射的预配制溶液。在其他实施方案中，药物组合物包含冻干的粉末。还可以将药物组合物包装为试剂盒的部分，该试剂盒包括用于向患者给予该组合物的一次性装置。可以将容器或试剂盒标记为保存于室温或冷藏温度。
本文所述的所有治疗方法、药物组合物、试剂盒及其他类似实施方案考虑到，前药化合物包括其所有药用可接受的盐。
试剂盒
在一实施方案中，试剂盒提供有用于向患者给予前药组合物的装置。试剂盒还可以包括各种容器，如小瓶、管、瓶等。优选地，试剂盒还包括使用说明书。根据一实施方案，试剂盒的装置为气雾剂分配装置。在另一实施方案中，试剂盒包括注射器和针，并且在一实施方案中，将前药组合物预包装于注射器内。
制备方法
本文所述的前药可以通过标准合成方法、重组DNA技术或任何其他制备肽与融合蛋白的方法来制备，并且某些方法描述于实施例部分。尽管某些非天然氨基酸不能通过标准重组DNA技术来表达，但是它们的制备技术在本领域内是已知的。除了可用的标准肽化学反应以外，包含非肽部分的本发明的化合物还可以通过标准有机化学反应来合成。
实施例
一般的聚乙二醇化方法：(Cys-马来酰亚胺基)
通常，将GLPCys类似物溶于磷酸盐缓冲液(5-10mg/ml)中，并添加0.01M乙二胺四乙酸(总体积的10％-15％)。添加过量(2倍)的马来酰亚胺基甲氧基PEG试剂(Dow)，并将反应在室温下搅拌，通式通过HPLC监测反应过程。8hr至24hr后，将反应混合物酸化并转入制备反相柱，以用于利用0.1％TFA/乙腈梯度进行纯化。将合适的组分合并，并冻干以获得期望的聚乙二醇化的衍生物。
实施例1
胰高血糖素类似物和GLP-1类似物的合成
为了研究制备胰高血糖素和GLP-1的前药衍生物的可能性，合成了许多肽类似物。标准方法简短地描述于此图3和4中，并且稍后讨论细节。
材料：
PAM树脂(PAM树脂为OCH2-苯基乙酰氨基甲基-聚苯乙烯-1％二乙烯基苯共聚物(OCH2-phenylacetamidomethyl-copolystyrene-1％divinylbenzene))，(100-180目，1％DVB交联的聚苯乙烯；0.7-1.0mmol/g的进样)、Boc-保护的氨基酸和Fmoc保护的氨基酸购自MidwestBiotech。诸如α-羟基酸(苯乳酸和乙醇酸)的其他试剂购自Aldrich。利用Boc-保护的氨基酸的固相肽合成在AppliedBiosystem430A肽合成仪上进行。Fmoc保护的氨基酸的合成利用AppliedBiosystems433型肽合成仪进行。缩酚酸肽的人工合成利用类似的方法在烧结的反应容器中进行(Schnolzer，M.，etal.，(1992)IntJPeptProteinRes40(3-4)：180-193)。
肽合成(Boc氨基酸/HF切割)：
这些类似物的合成在AppliedBiosystem430A型肽合成仪上进行。合成的肽通过顺序添加氨基酸来构建，每个氨基酸的活化酯通过向含有2mmolBoc保护的氨基酸的筒(cartridge)添加1.9mmol(3.8ml的0.5M溶液)3-(二乙氧基-磷酰氧基)-3H-苯并[d][1，2，3]三嗪-4-酮(DEPBT)的DMF溶液来生成。通过向筒通入氮气来使氨基酸溶解。向筒中添加1mlN，N-二异丙基乙胺来实现酯形成。将该溶液转移至含有0.2mmol连接至PAM树脂的C-末端残基的反应容器，漩涡几次，并允许与树脂偶联10分钟。洗涤以除去未反应的试剂后，通过用三氟乙酸(TFA)处理5分钟，除去N末端Boc保护基团。将树脂用DMF洗涤，并将循环重复期望的步骤数，直至链被组装。合成结束时的反应容器(通常为30个氨基酸)含有约1.2g-1.5g受保护的肽基-PAM树脂。将树脂用二甲基甲酰胺(DMF)洗涤数次，用三氟乙酸处理以除去最后的tBoc保护基团，最终用DMA、二氯甲烷再洗涤几次并干燥。
将肽基树脂用无水HF(方法稍后详述于本章节)，这通常获得约350mg(产率约50％)的粗去保护的肽。
肽合成(Fmoc氨基酸/HF切割)：
该合成方案通过选择位点的一些氨基酸手动进行。在本实验中，作为更大的合成策略的一部分，仅将Fmoc氨基酸用于合成内部丝氨酸前药。在此，应当指出，尽管FMOC化学已用于合成，但是肽通常构建于PAM树脂上，其要求用HF处理以从固体支持物切割肽。这些肽的产率大约如较早时对Boc/PAM合成所指出的。
如之前章节所述，进行合成。在偶联步骤的末尾，将肽基树脂用20％的哌啶处理以除去N-末端Fmoc保护基团。将其用DMF重复洗涤，并将该重复循环重复期望的偶联步骤数。在整个合成的末尾，将肽基树脂用DCM干燥，并用无水HF从树脂切割肽。
缩酚酸肽合成(氨基酯形成)
在这种情况下，肽基树脂具有α-羟基-N末端延伸，而不是N-末端胺，并且酰化在α羟基处进行。该反应比酰胺键形成耗费更长的时间，因为与胺相比，羟基是较弱的亲核试剂。反应时间通常为12小时。
开始，通过向含有2mmolBoc保护的氨基酸残基的2mlDCM的溶液的筒添加1mmol(0.155ml)二异丙基碳二亚胺(DIC)，产生每个氨基酸的激活酯。将其冷却至10℃，保持10分钟，向筒添加0.9mmol(244mg)二甲基氨基吡啶以加速酯形成。将该混合物转移至含有肽基树脂的反应容器中，在该容器中合成肽。将反应容器搅拌12小时。
将肽基树脂用DCM干燥，并继续期望的肽的合成。在整个合成的末尾，将肽基树脂用DCM干燥，并最终用无水HF处理以产生期望的肽。
N-末端羟基肽合成(α羟基-N末端延伸)
在该反应中，肽基树脂的游离胺与α羟基酸反应形成α羟基-N末端延伸。在这一点上，仅使用两种这样的α羟基酸，即乙醇酸(OH-甘氨酸)和苯乳酸(OH-苯丙氨酸)。这些合成也手动进行。肽通过添加α羟基酸来构建，α羟基酸的活化酯通过向含有1mmol的Boc保护的残基的2mlFMF溶液的筒添加0.9mmolDEPBT(270mg)来生成。向筒添加0.5mlDIEA(N，N-二异丙基乙胺)以加速酯形成。将该混合物转移至含有肽基树脂的反应容器，在该容器中合成肽。反应时间为6小时。
将肽基树脂用DCM干燥，并继续期望的肽的合成。在整个合成的末尾，将肽基树脂用DCM干燥，并用无水HF切割以产生游离肽。
肽基树脂的HF处理
将肽基树脂(30mg至200mg)置于氟化氢(HF)反应容器中，用于切割。向容器添加500μLp-甲酚作为碳正离子清除剂。将容器连接至HF系统，并浸入甲醇/干冰混合物。将容器用真空泵抽空，并将10mlHF蒸馏至反应容器中。将肽基树脂与HF的这种反应混合物在0℃下搅拌1小时，然后建立真空并迅速排除HF(10-15min(分钟))。将容器小心地移走，并填充约35ml醚以沉淀肽和提取p-甲酚和源自HF处理的小分子有机保护基团。将该混合物用特氟隆(teflon)滤器过滤，并重复两次以除去所有过量的甲酚。弃去该滤液。将沉淀的肽溶于约20ml的10％乙酸(aq)中。收集并冻干含有期望的肽的这种滤液。
利用质谱进行分析
质谱利用具有标准ESI离子源的SciexAPI-III电喷雾四极质谱仪(SciexAPI-IIIelectrosprayquadrapolemassspectrometer)获得。所用的电离条件如下：ESI为正离子模式；离子喷雾电压：3.9kV；孔电势：60V。所用的喷雾和帘幕气体(curtaingas)为0.9L/min的氮气流。以每步0.5Th和2msec的驻留时间从600-1800Thompson记录质谱。将样品(约1mg/mL)溶于含有1％乙酸的50％乙腈水溶液中，并通过外部注射器泵以5μL/min的速率引入。
当通过ESIMS在PBS溶液中分析肽时，首先利用含有0.6μLC4树脂的ZipTip固相提取吸头(extractiontip)，根据生产商提供的说明书将它们脱盐(MilliporeCorporation，Billerica，MA，参见http://www.millipore.com/catalogue.nsf/docs/ C5737)。
高效液相色谱(HPLC)分析：
利用高效液相色谱(HPLC)和MALDI分析，用这些粗肽进行初步分析以获得它们在磷酸盐缓冲(PBS)缓冲液(pH值为7.2)中的相对转化速率的近似值。将粗肽样品溶于PBS缓冲液，并且浓度为1mg/ml。将1ml所得溶液贮存于1.5mlHPLC瓶中，然后将该瓶密封并在37℃下孵育。以各种时间间隔抽取100μl等分试样，将其冷却至室温并用HPLC分析。
HPLC分析利用BeckmanSystemGoldChromatography系统，使用214nm处的UC检测器进行。HPLC分析在150mm×4.6mmC18Vydac柱上进行。流速为1ml/min。溶剂A含有0.1％的TFA的蒸馏水溶液，溶剂B含有0.1％的TFA在90％CH3CN中的溶液。使用了线性梯度(15分钟内，从40％至70％B)。利用PeakSimpleChromatography软件收集并分析数据。
用水解的初始速率测量各前药解离的速率常数。分别从前药和药物的峰面积来估计它们的浓度。通过将前药浓度的对数对各种时间间隔作图来测定前药的一级解离速率常数。该图的斜率给出速率常数“k”。然后利用公式t1/2＝0.693/k计算各种前药降解的半衰期。
利用HPLC的制备纯化：
一旦鉴定了表现出合适的t1/2的前药，则将该前药纯化。利用HPLC分析，在基于二氧化硅的1×25cmVydacC18(粒径：5μ；孔径：300A°)柱上，进行分析。使用的设备是：WatersAssociates600型泵；717型进样器；和486型UV检测器。对于所有的样品使用214nm的波长。溶剂A含有10％CH3CN/0.1％TFA的蒸馏水溶液；溶剂B含有0.1％的TFA的CH3CN溶液。使用线性梯度(2小时内，从0至100％B)。流速为1.2ml/min，并且分级大小(fractionsize)为6ml。通常从约350mg的粗肽获得80mg的纯肽(收率为约23％)。
实施例2
生物测定实验设计：用于cAMP检测的基于萤光素酶的报道基因测定
在基于萤火虫萤光素酶的报道基因测定中，测量每种胰高血糖素和GLP-1类似物或前药诱导cAMP的能力。所诱导的cAMP产生与结合于其受体的胰高血糖素或GLP-1成正比。对于该生物测定，使用分别共转染了胰高血糖素或GLP-1受体的HEK293细胞和连接至cAMP应答元件的萤光素酶基因。
将细胞通过在补充了0.25％的牛生长血清(HyClone，Logan，UT)的达尔伯克最小必需培养基(DulbeccoMinimumEssentialMedium)(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养16小时来使血清耗尽，然后与连续稀释的GLP-1类似物或前药在96孔聚D-赖氨酸涂覆的“Biocoat”板(BDBiosciences，SanJose，CA)中，于37℃、5％CO2的条件下孵育5小时。在孵育的末尾时，向每个孔添加100μL的LucLite萤光底物试剂(PerkinElmer，Wellesley，MA)。将板短暂地摇动，避光孵育10min，并在MicroBeta-1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)上计算光输出。有效50％浓度(EC50)通过利用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)来计算。
实施例3
基于GLP-1酰胺的前药的生物活性
I)GLP-泌酸调节肽
合成了GLP-泌酸调节肽嵌合肽(SEQIDNO：610)，其中最后8个氨基酸源自泌酸调节肽。
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGKRNRNNIA(SEQIDNO：610)
合成该嵌合肽背后的基本理论是两方面的：(1)证明能够合成质量为约4300Da的肽，以及(2)如果该肽被证实为具有生物效力，则可以将具有延伸的C-末端的GLP-1类似物用作具有其他修饰的GLP-1肽的基础序列。
据发现，GLP-泌酸调节肽肽的质量为4322.5道尔顿。GLP-泌酸调节肽肽的受体结合活性通过实施例2所述的GLP-受体萤光素酶测定来测定，其效力与萤光素酶测定中的天然GLP-1肽的效力至少一样。
II)向N末端添加二肽
为了研究前药分子内环化、切割和形成哌嗪二酮(DKP)或吗啉二酮(DMP)的能力，将不同的二肽共价连接至GLP-1的N-末端(aa7-37)。将生物失活的、二肽延伸的GLP-1肽设计为在随着DKP或DMP的形成而切割酰胺键时转化成活性肽药物(GLP-1(aa7-37)。这示于示意图5A和5B中。通过化学修饰二肽的氨基酸的侧链(R1和R2)来设想变动半衰期的前药。
合成的第一种肽(称为G5P6H7，GLP(8-37))包含连接至GLP-1的N-末端(aa7-37)的Gly-Pro二肽。该肽通过如上文所述的固相合成来合成制备。合成通过MALDI-MS分析来证实(3509.5Da)。
类似地合成基于GLP-1(aa7-37)的肽前药，其包含Pro-Pro二肽或Pro-His二肽。合成二肽延伸Gly-Phe或Phe-Phe以通过空间辅助酰胺键的切割来促进DPK的形成。假设脯氨酸的顺式朝向会促进二肽采用最佳空间构象促进DKP形成。
对于包含Pro-His二肽的肽，使所关注的羰基键夹在两个组氨酸之间(氨基酸Y与组氨酸离去基团)。这种设计针对经由哌嗪二酮形成的酰胺键的质子辅助切割。
通过合成包含添加的单个氨基酸(γ-Glu、Glu、Phe或His)的肽来尝试酰胺键的酸碱催化的一般水解。因此，离去基团会是活性肽的N-末端(GLP-1(aa7-37)处的组氨酸，据说咪唑环可以促进通过一般酸碱催化的切割。
于37℃下，将每种末端延伸的肽在PBS缓冲液中孵育约1周。或者，将每种肽在100℃下加热120min以加速酰胺键切割。前药的切割通过反向HPLC和MS来分析。如表1所示，没有任何肽的酰胺键受到切割，这证明了酰胺键的稳健性(表1)。
表1：尝试切割H7，GLP(7-37)前药以形成天然GLP-1(aa7-37)
化合物编号 肽(Xaa1Yaa2-GLP1) 100℃下的切割速率 37℃下的切割速率
1 GP 无切割 无切割
2 PP 无切割 无切割
3 γGlu 无切割 无切割
4 E 无切割 无切割
5 P 无切割 无切割
6 H 无切割 无切割
7 PH 无切割 无切割
在化合物4、5和6中，向GLP-1的N-末端添加单个氨基酸。
在所有的情况下，在GLP-1的第1位置存在组氨酸(组氨酰离去基团)。
基于这些数据，假设咪唑核在切割酰胺键中起到衰减作用。为了测试这种可能性，研究了具有不同离去基团的肽。具体而言，合成了这样的肽，其包含GLP-1的aa7-37，并且由Phe代替位置7处的His(称为F7，GLP(8-37))；并且利用上文所述的方法将该肽纯化。该肽被确定为具有10％的天然GLP效力的完全激动剂。向F7，GLP(8-37)的N-末端添加二肽，以研究二肽与活性肽(F7，GLP(8-37))的N-末端之间的酰胺键的切割以及DKP的形成。在F7，GLP(8-37)的第一肽前药中，向N-末端添加Gly-Pro；而在第二肽前药中，则使用了肌氨酸，因为以前报道其增强了切割速率(Hamel，A.R.etal.，(2004)Journalof肽Research63：147-154))。尽管将两种二肽延伸都设计为在空间上辅助酰胺键的切割，但是酰胺键保持了对切割的抗性。
表2：尝试切割二肽延伸的F7，GLP(7-37)
“a”：在所有的情况下，在GLP的第1位置存在苯丙氨酸(苯丙氨酰离去基团)。
“b”：Sar代表肌氨酸
III)向F7，GLP(8-36)-CEX的N末端添加二肽
据发现F7，GLP(8-37)类似物在37℃下的PBS中表现出不好的溶解性。因此，制备了SEQIDNO：611的修饰的GLP-1类似物(称为GLP(7-36)-CEX酰胺)，其包含毒蜥外泌肽-4的最后10个氨基酸，并且具有代替酸基团的C-末端酰胺。
H7AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGXPSSGAPPPS-酰胺(SEQIDNO：611)
已观察到，GLP(7-36)-CEX酰胺在体外比天然GLP-1序列强效10倍，并且发现该肽的类似物略微更溶于PBS。
合成了GLP(7-36)-CEX酰胺的类似物的前药，其中Phe代替位置7处的His，并且该前药包含Gly-Gly二肽(G5G6F7，GLP(8-36)-CEX)或OH-Gly-Gly二肽，其中由羟基代替α氨基(OH-G5G6F7，GLP(8-36)-CEX)。测试这些肽以检查体积较小的甘氨酰离去基团的效果，并且确定亲核试剂(胺或羟基)之一是否可以分别通过2，5-哌嗪二酮或2，5-吗啉二酮形成来切割酰胺键，因而产生活性F7，GLP(8-36)-CEX肽。如上文所述测试前药的切割，并且结果示于表3中。
表3：尝试切割添加到G7，GLP(7-36)CEX的N-末端的二肽
“a”：在所有这些情况中，在GLP的第1位置存在甘氨酸(甘氨酰离去基团)。
基于表3所示的结果，可知在生理条件下，通过2，5-哌嗪二酮(DKP)或2，5-吗啉二酮(DMP)形成非常难以切割酰胺键。甚至在升高的温度下，这与测试的亲核试剂和离去基团无关。
实施例4
基于GLP-1酯的前药的生物活性
IV)缩酚酸肽和酯
通过酯连接向另一肽的N-末端处的羟基添加二肽来合成缩酚酸肽。偶联方法描述于实验章节，并且它们被证实是非常有效的。如以前一样，研究了不同分子内环化(哌嗪二酮形成)和母体药物(N-末端羟基肽)释放趋势的二肽。在添加二肽的同时，制备和研究了切割酯键的胺亲核试剂和切割酯键的羟基亲核试剂。
V)向HO-F7，GLP(8-36)-CEX的OH末端添加二肽
HO-F7，GLP(8-36)-CEX肽从GLP(8-36)-CEXPAM树脂(合成方案示于图1中)合成，并且充当这些实验的母体药物。该肽的EC50值为0.008nM(图2)，而天然GLP-1的EC50值为0.011nM。因此，发现HO-F7，GLP(8-36)-CEX的效力与天然GLP-1的效力至少一样。这是一个非常重要的并且有些意想不到的的发现，即可以由苯乳酸取代组氨酸。这保证了另外的验证。随后的实验获得了相同的结果。存在这样的可能性，即该结果是HO-F7，GLP(8-36)-CEX中CEX延伸的功能。在这一点上，已报道，毒蜥外泌肽-4的C-末端区域增加了其对GLP-1受体的亲和力。
将HO-F7，GLP(8-36)-CEX的α羟基酰化，并制备和研究了切割酯键的胺亲核试剂化合物，图5A；和切割酯键的羟基亲核试剂化合物，图5B。如图5A和5B所示，与2，5-哌嗪二酮(胺亲核试剂)或2，5-吗啉二酮(羟基亲核试剂)一起，释放了生物活性的HO-F7，GLP(8-36)-CEX。
为了研究2，5-哌嗪二酮(DKP)或2，5-吗啉二酮(DMP)可能的形成以及HO-F7，GLP(8-36)-CEX的同步产生，于37℃下将前药在PBS缓冲液中孵育约1周。还将肽在100℃下加热以测定对切割的易感性(表4)。
表4：二肽延伸的HO-F7，GLP(7-36)-CEX的切割
肽编号 肽(Yaa1Xaa2-O-Phe7-GLP-8-36-CEX) 37℃下切割的t1/2 ＊
1 Gly-Gly 0.87hr
2 HO-Gly-Gly 1.13hr
3 HO-Phe-Val 无切割
4 HO-Phe-dVal 50.58hr
5 HO-Phe-Ala 2.83hr
6 HO-Phe-dAla 2.41hr
7 HO-Phe-Gly 2.46hr
8 HO-Phe-Phe 33.31hr
9 HO-Phe-dPhe 7.65hr
10 Phe-Val 64.0hr
*t1/2为于37℃下，在PBS(pH7.2)中释放50％的HO-Phe-GLP8-36-CEX所需的时间。其通过标准的一级反应作图来计算。包括3号在内的所有这些酯在100℃下均切割了。在所有这些情况下，在GLP的第1位置存在HO-Phe(羟基苯丙氨酰离去基团)。
分析表4所示的前两个肽(肽1和2)来确定亲核试剂之一(胺或羟基)是否分别通过DKP或DMP形成来切割酯键。结果证实了我们的预期，即酯比酰胺对切割更易感。肽3、4、8、9和10相对较慢的切割速率表明，二肽延伸(Phe或Val)的体积极大地影响前药切割的速率。尽管甲基与氢侧链(肽5、6和7)之间几乎没有差异，但是如在肽3、4和10中所证实的，异丙基(β分支)的存在极大地减弱了酯切割的速率。肽10比肽3更快地解离，因为胺与羟基相比是更强的亲核试剂，这一点也被肽1和2所证实。最后，肽8与9的t1/2之间的大差异表明，二肽中侧链的相互作用(图5A和5B中的R1和R2)也起到重要作用。这种相同的效果表现于肽3和4中。在两种情况下，L，D-二肽非对映异构体比对应的L，L-非对映异构体切割得更快。
肽4、8和10的结构示于图6A-6C中。所观察到的前药半衰期随着取代基X变大而增加(表4中的肽3、4、8、9和10)。这可能是由于随着X的大小增加，过渡态(TS)在空间上更受到妨碍。因此，活化能增加，因而增加了前药的稳定性。
对于二对立体异构体(肽3与4；8与9)，特别对此进行了示例。在此处，通过改变二肽延伸的C-末端中单个氨基酸的立体化学，观察到了速率中的巨大差异。与L，D-非对映异构体相比，L，L-二肽非对映异构体中对应过渡态的空间妨碍大得多。因此，肽3的t1/2大于肽4，并且肽8的t1/2大于肽9
肽10为F5V6-O-F7，GLP(8-36)-CEX。其t1/2为64hr，并且代表了生理条件下最长的肽前药切割持续时间。这种情况下的过渡态由于苯丙氨酰侧链与缬氨酰侧链的相互作用而受到相当大的妨碍。
肽10(图6B)(4264Da)形成母体药物HO-F7，GLP(8-36)-CEX(4019Da)的切割是分子内环化。因此设想，其他杂质的存在不影响内部解离的速率。另外，甚至在污染肽的中途，前药和药物都进行了MALDI分析。
还研究了第二组类似的缩酚酸肽，以进一步检查二肽延伸结构对切割速率的影响(表5)。它们的合成按照图3和4所示的相同方式。在这种情况下，主要的差异在于R2或Y位点是较少受到妨碍的氢(甘氨酰残基)，而不是较大的苯丙氨酰。在这种情况下，在前药的末端，使用乙醇酸(OH-甘氨酸)或甘氨酸。
表5：HO-G5X6-O-F7，GLP(7-36)CEX中酯键的切割
化合物编号 肽(Yaa1Xaa2-O-Phe7-GLP-8-36-CEX) 37℃下切割的t1/2
1 Gly-Gly 0.87hr
2 HO-Gly-Gly 1.13hr
3 HO-Gly-Val 4.70hr
4 HO-Gly-dVal 5.13hr
5 HO-Gly-1AIB 0.75hr
6 HO-Gly-2PhG 0.49hr
7 HO-Gly-3tBut 未切割
8 HO-Gly-Phe 0.70hr
9 HO-Gly-dPhe 0.93hr
10 Gly-Val 20.38hr
t1/2为于37℃下，在PBS(pH7.2)中释放50％的HO-Phe-GLP8-36-CEX所需的时间。其通过标准的一级反应作图来计算。在所有这些情况下，在GLP的第1位置存在OH-Phe(羟基苯丙氨酰离去基团)。
1AIB：α-氨基异丁酸；2PhG：苯基甘氨酸；3tBut：叔丁基。
以与以前所解释的相同方式完成分析。分析表4所示的前两个肽(肽1和2)来确定亲核试剂之一(胺或羟基)是否分别通过2，5-哌嗪二酮或2，5-吗啉二酮形成来切割酯键。在表5中分析过这两个肽，并再次对其测试以充当阳性对照。如所预期的，所研究的两种亲核试剂都可以切割酯键。预期这组化合物(表5中的化合物2至9)比之前的情况切割的更快，因为除去了空间阻碍。由于X的大小在结构上变得上更大，所以过渡态逐渐变得拥挤。因此，活化能增加，因而增加了前药的稳定性。这就是在化合物10中所观察到的，其中X为异丙基(缬氨酸)(对于该化合物结构，参见图6D)。当X为叔丁基(化合物7)时，该化合物于37℃下在PBS缓冲液(pH，7.2)中根本不切割。在表5中，立体异构体对(化合物3与4；8与9)以几乎相同的速率解离。这可能是由于立体异构体在能量上没有表现出大的差异(据称是由于甘氨酸的非手性性质)。因此，在这种情况下，甘氨酰，L-二肽延伸和甘氨酰，D-二肽延伸都具有相当能量的过渡态。
化合物3比化合物10解离更快的观察看起来表明，在pH值为7.2和37℃的条件下，羟基是比胺更强的亲核试剂。这种异常的一种可能的解释可能是，在化合物10中，N-末端胺的pKa稍微地增加了。因此，在pH值为7.2的条件下，这种胺亲核试剂会不均匀地质子化，因而导致较缓慢的前药切割速率。
因此，我们的结果表明，侧链的结构性质(特别是如含有缬氨酸和叔丁基甘氨酸的二肽所证实的β分支)、亲核试剂的立体化学和pKa在确定切割的相对速率中起到了作用。已鉴定了几种快速和缓慢切割酯前药候选物，并测试了它们的生物效力。
VI)所选的较长作用前药候选物的生物测定
选择了4种较长持续时间的前药，用于在生物效力测试中进一步分析。在通过HPLC纯化全部肽并通过MALDI-MS分析证实了它们的质量后，进行了基于萤光素酶的生物测定。计算了效力百分比，以用于将母体的平均EC50与各自的前药的平均EC50进行比较。结果如表6所示。
表6：所选的较长作用酯前药候选物的生物测定
这些观察清楚地显示，向母体药物的末端羟基添加酯连接的二肽序列明显地降低了药物的效力。进一步分析了两种肽以证明，前药于PBS(pH，7.2)中孵育24小时后，恢复了母体药物的效力。基于它们的t1/2值(表6)，所选的肽为类似物4和5。
利用HPLC纯化的样品和基于萤光素酶的测定来进行这些实验。效力百分比计算通过比较母体的平均EC50与前药的平均EC50来进行。结果表7所示，并且图示于图7和8中。
表7：显示前药转化为药物的生物测定结果
*-在PBS中孵育一周后的类似物5(效力几乎完全恢复)
()-括号中的时间指各自的肽的孵育时间
孵育一周后，表7的类似物5的效力转变为接近母体药物的效力。在PBS中孵育24小时后，两种前药由于逐渐地转化为母体药物而表现出较高的效力(参见图7和8)
VII)来自肽的内部位点的酯前药
本文公开的前药在生理条件(pH＝7.2并且温度＝37℃)下自发地转化，产生母体药物。pH值和温度对该转化是可依赖的，因为它们在生理上是几乎不变的，并且这还消除了对前药加工成其活性形式的任何特异性酶介导的需要。在N-末端建立的前药化学应当还可以用于内部生物活性位点，从该活性位点可以制备酯前药。
为了制备酯前药，研究了丝氨酸/苏氨酸残基的谨慎选择，向该残基可以添加二肽。肽在以和我们的结果类似的方式向GLP-1的末端添加二肽前必须具有生物活性，而在添加后则是失活的。因此，在寻求前药修饰形式前，测试了肽变体的生物活性。
前药在内部位点的合成和分析
合成两种肽作为开发内部前药候选物的可能起点。第一种肽为(H7F)，(E9Q)，GLP(8-36)-CEX，第二种为(H7F)，(E9Q)，(T11S)，GLP(8-36)-CEX。在第5氨基酸(分别是(H7F)，(E9Q)，GLP(8-36)-CEX和(H7F)，(E9Q)，(T11S)，GLP(8-36)-CEX的苏氨酸或丝氨酸侧链)处尝试合成酯前药。对于这些分子，在PAM树脂上进行Boc苄基类型合成，直至第12位置处的Phe点。剩下的合成利用基于Fmoc的化学完成。这提供了选择性除去丝氨酸侧链的保护基团的机会，从而留下完整的所有其他保护基团。这允许在第11位置处的丝氨酸的游离羟基上选择性酰化。
更具体而言，在整个合成中不能使用Boc-苄基策略，因为丝氨酸的羟基保护苄基会要求HF处理才除去。因此，不能在肽基树脂上合成酯前药，因为HF处理会同时从树脂除去肽。这是为什么在第11位置处(Fmoc-O-叔丁基-L-丝氨酸)处添加Ser，并且将随后的Gly、Gln、Ala和Phe作为Fmoc保护的氨基酸。通过用TFA处理2小时选择性除去丝氨酸的叔丁基保护基团。向该羟基添加Boc保护的二肽基原部分，以完成酯前药的合成。通过用TFA处理来除去最后的Boc保护基团，并且通过用20％哌啶的DMF溶液处理，除去N-末端Fmoc基团。据发现，这对于由丝氨酸和苏氨酸残基的羟基侧链构建二肽酯是有用的策略。还由谷氨酰胺代替第3位置处的谷氨酸残基，以防止侧链羧基上的任何不期望的偶联。假定这不会导致活性的损失，因为以前的报道表明，第3位置对于GLP-1效力不是关键的。
如以前所述，这些肽通过HPLC纯化，并且它们的质量通过MALDI证实后，进行生物测定。计算效力百分比，并且将肽(药物候选物)的平均EC50与天然GLP-1的平均EC50比较。结果示于表8和图9中。
表8：内部丝氨酸/苏氨酸药物候选物生物测定结果
用GLP-1作标准。
肽(H7F)，(E9Q)，GLP(8-36)-CEX和(H7F)，(E9Q)，(T11S)，GLP(8-36)-CEX是完全激动剂，分别具有20％和33.3％的天然GLP-1的效力。这两种肽都被认为具有作为潜在药物候选物开发的足够效力。
认为将Gly-Gly二肽添加到这些GLP-1类似物作为其合成便利的初始研究。与较大的苏氨酸侧链相比，丝氨酸侧链的羟基更容易酰化。通过向丝氨酸侧链的羟基添加Gly-Gly二肽，合成了一种潜在的前药(H7F)，(E9Q)，[T11S-Oβ-(Gly-Gly)]，GLP(8-36)-CEX。在这一点上，Gly-Gly末端酯前药的t1/2为约1hr(表5)，而据发现内部酯前药的t1/2比其长约三倍。
据观察，(H7F)，(E9Q)，[T11S-Oβ-(Gly-Gly)]，GLP(8-36)-CEX前药以t1/2＝2.7hr解离而产生母体药物(H7F)，(E9Q)，(T11S)，GLP(8-36)-CEX，以及2，5-哌嗪二酮(DKP)。没有测定该前药的绝对效力，因为在基于细胞培养的萤光素酶测定中，该前药的半衰期比前药的孵育时间段更短(5hr)。前药的半衰期(2.7hr)表明，约70％的前药在5小时内转化为活性实体，因此该测定不能精确地在该前药上进行。然而，已经确立了将内部丝氨酸前药转化为活性实体的能力。
由于前药转化为药物的条件(pH值＝7.2并且温度＝37℃)在生理上是几乎不变的，因此发现在GLP-1的O-末端建立的前药化学也可以用于从内部位点进行切割。
实施例5
在以下的实施例中，氨基酸位置与野生型未成熟的GLP-1(SEQIDNO：667)一致，并且所有的肽包含代替C-末端羧酸基团的C-末端酰胺基团。
将初始平均体重为49.5g的6组糖尿病诱导的肥胖(DIO)小鼠(每组8只)腹膜内注射2nmol/kg的PBS媒介物对照或下文所述肽A-E之一：
肽A(在本文中又称为“肽B(dF，dF)”)为基于GLP-1的肽的前药，其中前药二肽部分(d-Phe-dPhe)经由O-末端连接至称为肽B的生物活性GLP-1肽。肽A具有SEQIDNO：645的氨基酸序列。
肽B(在本文中又称为“HO-Phe7，Glu22GLP-Cex”)为肽A和C的基于GLP-1的肽的非前药形式。肽B具有SEQIDNO：646的氨基酸序列，并且与天然GLP-1(SEQIDNO：667)的不同在于由苯乳酸(PLA)代替位置7处的His、由AIB代替位置8处的Ala、由Glu代替位置22处的Gly以及用毒蜥外泌肽4的C-末端氨基酸将C-末端延伸9个氨基酸。
肽C(在本文中又称为“肽B(dF，dV)”)为肽B的基于GLP-1的肽的第二前药形式，其中前药二肽部分(d-Phe-d-Val)通过O-末端连接至生物活性GLP-1肽。肽C具有SEQIDNO：647的氨基酸序列。
肽D(在本文中又称为“Ser11，Glu22GLP-Cex“)为基于GLP-1的肽，其与天然GLP-1(SEQIDNO：667)的不同在于由Ser代替位置11处的Thr、由AIB代替位置8处的Ala、由Glu代替位置22处的Gly以及用毒蜥外泌肽4的C-末端氨基酸将C-末端延伸9个氨基酸。肽D具有SEQIDNO：648的氨基酸序列。
肽E(在本文中又称为“肽DSer11(dF，dV)”)为肽D的前药，其中前药二肽部分(d-Phe-d-Val)经由位置11处的Ser的羟基与d-Val的羧酸基团之间所形成的酯键连接至生物活性GLP-1肽。肽E具有SEQIDNO：649的氨基酸序列。
注射了化合物之一或媒介物对照(时间点0)15分钟后，以1.5g每kg体重的剂量注射25％(w/v)葡萄糖盐水溶液。在注射化合物或媒介物对照时、在注射葡萄糖时以及在注射葡萄糖后15、30、60和120分钟时，测量小鼠的血糖浓度。
如图12所示，与注射了媒介物对照的小鼠中注射了葡萄糖后的血糖水平相比，在任何给定肽A-E之一的组中，注射葡萄糖后的血糖浓度没有升高。注射了肽B和D的前药形式(即肽A、C和E)的小鼠的血糖浓度比注射了相应肽的非前药形式的小鼠的血糖水平更高，这证明了二肽前药部分防止化合物与GLP-1受体最大结合的能力。当将前药二肽部分连接至位置11处的氨基酸的侧链时，与当将前药连接至基于GLP-1的肽的N-末端时所观察到的效果相比，前药差异效果更大。
实施例6
在以下的实施例中，氨基酸位置与野生型未成熟的GLP-1(SEQIDNO：667)一致，并且所有的肽包含代替C-末端羧酸基团的C-末端酰胺基团。
除了用2nmol/kg的PBS媒介物对照或以下所述的肽F-H之一注射小鼠以外，重复实施例5所述的实验：
肽F(在本文中又称为“desNH2-His7，Ser8，Glu22GLP-Cex”)为基于GLP-1的肽，其与天然GLP-1(SEQIDNO：667)的不同在于由脱氨基-His代替位置7处的His、由Ser代替位置8处的Ala、由Glu代替位置22处的Gly，以及用毒蜥外泌肽4的C-末端氨基酸将C-末端延伸9个氨基酸。肽F具有SEQIDNO：650的氨基酸序列。
肽G(在本文中又称为“肽F-Ser2(dF，dV)”)为肽F的前药，其中前药二肽部分(d-Phe-dVal)经由肽F的位置2处的Ser的羟基与d-Val的羧酸基团之间所形成的酯键连接至肽F。肽G具有SEQIDNO：651的氨基酸序列。
肽H(在本文中又称为“肽X-Ser2(dF，dV)”)为在本文中称为肽X(His7，Ser8，Glu22GLP-Cex)的基于GLP-1的肽的前药。肽X与天然GLP-1(SEQIDNO：667)的不同在于由Ser代替位置8处的Ala、由Glu代替位置22处的Gly，以及用毒蜥外泌肽4的C-末端氨基酸将C-末端延伸9个氨基酸。肽H(dPhe-dVal)的前药二肽部分经由肽X的位置2处的Ser的羟基与d-Val的羧酸基团之间所形成的酯键连接至肽X。肽H具有SEQIDNO：652的氨基酸序列。
如实施例5所述测量小鼠的血糖水平。如图13所示，在注射葡萄糖时，肽F-H抑制小鼠血糖的升高。注射了肽F的前药形式(即，肽G)的小鼠的血糖水平比注射了其相应的非前药形式的小鼠的血糖水平更高，这证明了二肽前药部分防止肽与GLP-1受体最大结合的能力。
实施例7
在以下的实施例中，氨基酸位置与野生型未成熟的GLP-1(SEQIDNO：667)一致，并且所有的肽包含代替C-末端羧酸基团的C-末端酰胺基团。
重复实施例5所述的实验，除了如实施例5和6所述，用0.67nmol/kg的水媒介物对照或肽D、E、F和G之一注射小鼠。如实施例5所述测量小鼠的血糖水平。如图14所述，与用相应的非前药形式注射的小鼠的血糖水平相比，用前药形式的基于GLP-1的肽注射的小鼠在注射葡萄糖时表现出更高的血糖水平。这些数据证明了前药部分防止基于GLP-1的肽与GLP-1受体最大结合的能力。
实施例8
在以下的实施例中，氨基酸位置与野生型未成熟的GLP-1(SEQIDNO：667)一致，并且所有的肽包含代替C-末端羧酸基团的C-末端酰胺基团。
将9组初始平均体重为56g的糖尿病诱导的肥胖(DIO)小鼠(每组8只小鼠)腹膜内用15nmol/kg或70nmol/kg下文所述的的肽Y、Z、F-Peg以及G-PEG或PBS媒介物注射一次，然后持续一周。
肽Y(在本文中又称为“Aib8，Glu22GLP-Cex40kPeg”)为基于GLP-1的肽，其与天然GLP-1(SEQIDNO：667)的不同在于由AIB代替位置8处的Ala、由Glu代替位置22处的Gly、由共价连接至40kDaPEG的Cys代替位置30处的Ala，以及用毒蜥外泌肽4的C-末端氨基酸将C-末端延伸9个氨基酸。肽Y具有SEQIDNO：653的氨基酸序列。
肽Z(在本文中又称为“GLPAib8，Ser11(dF，dV)Glu22GLP-Cex40kPeg”)是基于GLP-1的肽的前药，其与天然GLP-1(SEQIDNO：667)的不同在于由AIB代替位置8处的Ala、由Ser代替位置11处的Thr、由Glu代替位置22处的Gly、由共价连接至40kDaPEG的Cys代替位置30处的Ala，以及用毒蜥外泌肽4的C-末端氨基酸将C-末端延伸9个氨基酸。将肽Z的前药二肽部分(d-Phe-d-Val)经由在位置11(根据SEQIDNO：667的编号)处的Ser的羟基与d-Val的羧酸之间所形成的酯键连接至基于GLP-1的肽。肽Z具有SEQIDNO：654的氨基酸序列。
肽F-Peg(在本文中又称为“GLPdes-NH2His7，Ser8，Glu22-Cex40kPeg”)是基于GLP-1的肽，其与天然GLP-1(SEQIDNO：667)的不同在于由脱氨基-His代替位置7处的His、由Ser代替位置8处的Ala、由Glu代替位置22处的Gly、由共价连接至40kDaPEG的Cys代替位置30处的Ala，以及用毒蜥外泌肽4的C-末端氨基酸将C-末端延伸9个氨基酸。肽F-Peg具有SEQIDNO：655的氨基酸序列。
肽G-Peg(称为“GLPdes-NH2His7，Ser8(dFdV)，Glu22-Cex40kPeg”)是肽F的前药，其中前药二肽部分(d-Phe-d-Val)经由在位置8处的Ser的羟基与d-Val的羧酸之间所形成的酯键连接。肽G-Peg具有SEQIDNO：656的氨基酸序列。
注射了肽之一或者注射媒介物对照(时间点0)60分钟后，以1.5g每kg体重的剂量注射25％(w/v)的葡萄糖盐水溶液。在注射肽或媒介物对照时(时间点60)、在注射葡萄糖时(时间点0)以及在注射葡萄糖后15、30、60和120分钟时测量小鼠的血糖浓度。
如图15所示，注射了任何肽Y、Z、F-Peg、G-Peg的小鼠组的血糖浓度低于注射了媒介物对照的小鼠的血糖水平。
在注射了媒介物对照或肽后的1、3、5和7天，测量每组的每只小鼠的体重。通过注射7天后该组的平均体重减注射媒介物或肽时组的平均体重来计算总体重变化。还在该周过程中测量每组小鼠的食物摄取。测量注射了媒介物对照或肽7天后的总食物摄取。如图17所示，在注射了肽Y、Z、F-Peg、G-Peg之一的全部组的小鼠中，总食物摄取降低。肽Y看起来在减少食欲和减少体重方法在4种肽中最强效。该结果是天然氨基酸序列的作用。Ser11取代或脱氨基酸His7减少了总效力。重要的是，肽F-Peg和肽G-Peg发挥的作用类似，并且证明当仅引入酯前药时，在一周研究内测量的总效力是相当的。
实施例9
用以下的测定测试生物活性肽的溶解性、受体结合活性和稳定性。
胰高血糖素溶解性测定：
在0.01NHCl中制备胰高血糖素(或类似物)的溶液(1mg/ml或3mg/ml)。将100ul贮存溶液用0.01NHCl稀释至1ml，并测定UV吸光度(276nm)。利用200μl至250μl0.1MNa2HPO4(pH9.2)将剩余的贮存溶液的pH值调整至7。将溶液于4℃下放置过夜，然后离心。然后将100μl上清液用0.01NHCl稀释至1ml，然后测定UV吸光度(双份)。
对体积增加，补偿初始吸光度读数，并将以下的计算法用于建立溶解性百分比：
胰高血糖素受体结合测定
利用闪烁邻近测定(scintillationproximityassay)技术，在竞争结合测定中测量肽对胰高血糖素受体的亲和力。将在闪烁邻近缓冲液(0.05MTris-HCl，pH7.5，0.15MNaCl，0.1％w/v牛血清白蛋白)中制备的肽的连续3倍稀释液在96孔白/透明平底板(CorningInc.，Acton，MA)中与0.05nM(3-[125I]-碘代酪氨酰(iodotyrosyl))Tyr10胰高血糖素(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)、1微克至6微克每孔的从过量表达人胰高血糖素受体的细胞制备的原生质膜碎片以及A型闪烁邻近测定小球中的1mg/孔的聚乙烯亚胺处理的小麦胚芽凝集素(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)混合。在旋转振荡器上以800rpm振荡5min后，将板在室温下孵育12h，然后在MicroBeta1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)上读数。在具有比测试样品中最高浓度高4倍的浓度的“冷”天然配体的孔中，测量非特异性结合(NSB)的放射性，并在不含竞争物的的孔中检测总结合放射性。按如下计算特异性结合百分比：特异性结合％＝((结合-NSB)/(总结合-NSB))X100。IC50值利用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)来计算。
胰高血糖类似物的稳定性测定
将每种胰高血糖素类似物溶于水或PBS中，并进行初始HPLC分析。调整pH值(4、5、6、7)后，将样品于37℃下孵育特定的时间段，并通过HPLC再分析以测定肽的完整性。测定所关注的具体肽的浓度，并相对于初始分析计算保留完整的百分比。
实施例10
胰高血糖素相关的类似物肽的名称按如下规则使用：词“胰高血糖素”之后的括号内所示的范围表示存在于肽的胰高血糖素的氨基酸，其中通过词“胰高血糖素”之前的氨基酸的存在及随后的数字表示取代胰高血糖素的天然氨基酸的氨基酸(如，PLA6，E9，Glu9等)。氨基酸后的数字(如，“PLA6”的“6”)指定与天然胰高血糖素(SEQIDNO：612)的编号的氨基酸一致的位置。
用以下方法制备各种胰高血糖素相关的类似物肽。
[PLA6，E9]胰高血糖素(6-29)酰胺的合成
首先，利用0.1mmoleFmoc/HOBT/DCC化学程序与0.1mmoleRinkMBHA酰胺树脂，利用DIC/HOBT作为偶联剂，在ABI433A自动肽合成仪上，固相合成肽序列TSEYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQIDNO：951；[E3]胰高血糖素(7-29))。使用了如下Fmoc氨基酸：Ala、Arg(Pmc)、Asp(OtBu)、Asn(Trt)、Glu(OtBu)、Gln(Trt)、Leu、Lys(Boc)、Met、PLA、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Trp(Boc)、Tyr(tBu)和Val。
自动合成后，将肽基树脂人与3-苯乳酸(83mg，0.5mmole)和DEPBT(150mg，0.5mmole)在4ml5％的DIEA/DMF中手动偶联约2h，以获得具有如下序列的肽基树脂：HO-PLA-Thr-Ser-Glu-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQIDNO：950)。
将肽基树脂用8.5mlTFA在室温下处理约2h，该TFA添加了0.5g酚、0.5ml水和0.5ml苯硫基甲烷。将溶于TFA的肽过滤，并添加40ml醚以将肽沉淀。将粗肽离心，溶于乙酸水溶液并冻干。粗肽的产量为200mg至250mg，纯化后获得的25mg-40mg肽(总收率为10％-15％)，纯度为95％。将肽在一般分析HPLC中进行分析，表明保留时间为7.66min；并且ESI-MS分析证明了2986.0的期望质量，这符合肽分子量2986.3。
用类似的方法合成：肽[PLA6，D9]胰高血糖素(6-29)酰胺，其分析HPLC为7.25min，并且ESI-MS为2973.5，这符合计算的MW2973.3；[PLA6，D9，D28]胰高血糖素(6-29)酰胺，其分析HPLC为7.46min，并且ESI-MS为2973.0，这符合计算的MW2973.3；[PLA6，C8，E9]胰高血糖素(6-29)酰胺，其分析HPLC为7.20min，并且ESI-MS为3002.0，这符合计算的MW3002.3；[PLA6，E9，C16]胰高血糖素(6-29)酰胺，其分析HPLC为7.38min，并且ESI-MS为3002.0，这符合计算的MW3002.3；[PLA6，E9，C24]胰高血糖素(6-29)酰胺，其分析HPLC为7.33min，并且ESI-MS为2961.0，这符合计算的MW2961.3；[PLA6，D9，C24]胰高血糖素(6-29)酰胺，其分析HPLC为7.43min，并且ESI-MS为2947.0，这符合计算的MW2947.3；[PLA6，E9，C40]胰高血糖素(6-40)酰胺，其分析HPLC为7.28min，并且MALDI-MS为3925.5，这符合计算的MW3924.3。
[hCys(S03H)9]胰高血糖素(6-29)酰胺的合成
首先，利用0.1mmoleFmoc/HOBT/DCC化学程序与0.1mmoleRinkMBHA酰胺树脂，利用DIC/HOBT作为偶联剂，在ABI433A自动肽合成仪上固相合成肽序列YSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQIDNO：951；胰高血糖素(10-29))。
自动合成后，将肽基树脂在4mlDMF中与Fmoc-高Cys(SO3Na)-OH(130mg，0.3mmole)、HOBT(45.2mg，0.33mole)和DIC(52.0ul，0.33mole)偶联约2h。在茚三酮测试后，将半数部分(potion)的肽基树脂(0.05mmole)与剩余的3氨基酸Ser、Thr和Phe进一步自动组装以获得具有以下序列的肽基树脂：H2N-Phe-Thr-Ser-homoCys(SO3H)-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQIDNO：952)。
使用了以下Fmoc氨基酸：Ala、Arg(Pmc)、Asp(OtBu)、Asn(Trt)、Gln(Trt)、高Cys(SO3Na)、Leu、Lys(Boc)、Met、Phe、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Trp(Boc)、Tyr(tBu)和Val。
将肽基树脂用8.5mlTFA在室温下处理约2h，该TFA添加了0.5g酚、0.5ml水和0.5ml苯硫基甲烷。将溶于TFA的肽过滤，并添加40ml醚以将肽沉淀。将溶于TFA的肽过滤，并添加40ml醚以将肽沉淀。将粗肽离心，溶于乙酸水溶液并冻干。粗肽的产量为100mg至130mg，纯化后获得15mg-20mg肽(总收率为10％-15％)，纯度为95％。将肽在一般分析HPLC中进行分析，表明保留时间为6.73min；并且ESI-MS分析证明了3021.0的期望质量，这符合肽分子量3021.3。
用类似的方法合成：[hCys(SO3H)9]胰高血糖素(5-29)酰胺，其分析HPLC保留时间为6.82min，并且ESI-MS为3122.5，这符合计算的MW3122.4；[hCys(SO3H)9]胰高血糖素(4-29)酰胺，其分析HPLC保留时间为6.83min，并且ESI-MS为3178.5，这符合计算的MW3179.3；[hCys(SO3H)9]胰高血糖素(2-29)酰胺，其分析HPLC保留时间为6.79min，并且ESI-MS为3394.5，这符合计算的MW3394.7；[PLA6，hCys(SO3H)9]胰高血糖素(6-29)酰胺，其分析HPLC保留时间为7.17min，并且ESI-MS为3022.0，这符合计算的MW3022.3。
[PLA6，E9，C24(1.2K)]胰高血糖素(6-29)酰胺的合成
将20mg(0.00675mmole)[PLA6，E9，C24]胰高血糖素(6-29)酰胺和12.5mg(0.01mmole)m-dPEGTM24-MAL(MW1239，QuantabiodesignLtd.Powell，OH)溶于9ml25％乙腈水和1ml1MTris碱缓冲液(将pH值调整为8.0-8.5)中。在室温下搅拌反应，并通过分析HPLC监测反应过程。当在HPLC上没有检测到初始产物后(约2hr后)，将反应混合物通过制备HPLC直接纯化。
冻干后，获得了约10mg-12mg[PLA6，E9，C24(1.2K)]胰高血糖素(6-29)酰胺，其分析HPLC分析表明保留时间为7.48min，并且ESI-MS为4218.5，这符合计算的[M+H2O]4218.0。
用类似的方法合成：[C5(1.2K)，E9]胰高血糖素(5-29)酰胺，其分析HPLC分析表明保留时间为7.25min，并且ESI-MS为4327.5，这符合计算的MW4327.8；[C8(1.2K)，E9]胰高血糖素(6-29)酰胺，其分析HPLC分析表明保留时间为7.25min，并且ESI-MS为4260.0，这符合计算的[M+H2O]4259.0。
[PLA6，E9，C24(20K)]胰高血糖素(6-29)酰胺的合成
将15mg(0.005mmole)[PLA6，E9，C24]胰高血糖素(6-29)酰胺和140mg(0.006mmole)20KmPEG-MAL(MW22k，Nektar，Huntsville，AL)溶于9ml25％乙腈水和1ml1MTris碱缓冲液(将pH值调整为8.0-8.5)中。在室温下搅拌反应，并通过分析HPLC监测反应过程。当在HPLC上没有检测到初始产物后(约6hr后)，将反应混合物通过制备HPLC直接纯化。通过分析HPLC在214nm下检查组分，还通过280nm处的UV进行测量。将HPLC纯度为90％，并且还具有UV测量的高吸收(A280nm＝1.0-2.0)的组分合并并冻干。可以获得约60mg-80mg[PLA6，E9，C24(20K)]胰高血糖素(6-29)酰胺，其分析HPLC分析表明保留时间为8.5min-8.6min，并且MALDI-MS在24K-26K时表现出宽质谱。
用类似的方法合成：[PLA6，C8(20K)，E9]胰高血糖素(6-29)酰胺、[PLA6，E9，C16(20kDa)]胰高血糖素(6-29)酰胺、[PLA6，E9，C40(20K)]胰高血糖素(6-40)酰胺、[PLA6，D9，C16(20kDa)]胰高血糖素(6-29)酰胺和[PLA6，D9，C24(20K)]胰高血糖素(6-29)酰胺。
[PLA6，E9，C24(40kDa)]胰高血糖素(6-29)酰胺的合成
将15mg(0.005mmole)[PLA6，E9，C24]胰高血糖素(6-29)酰胺和240mg(0.006mmole)40KmPEG-MAL(MW40k，ChirotechTechnologyLtd.，CambsCB40WG，German)溶于18ml25％乙腈水和2ml1MTris碱缓冲液(将pH值调整为8.0-8.5)中。在室温下搅拌反应，并通过分析HPLC监测反应的过程。当在HPLC上没有检测到初始产物后(约6hr后)，将反应混合物通过制备HPLC直接纯化。通过分析HPLC在214nm下检查组分，还通过280nm处的UV进行测量。将HPLC纯度为90％，并且还具有UV测量的高吸收(A280nm＝1.0-2.0)的组分合并并冻干。可以获得约100mg-120mg[PLA6，E9，C24(40K)]胰高血糖素(6-29)酰胺，其分析HPLC分析表明保留时间为8.60min-8.8min。
用类似的方法合成：[PLA6，C8(40K)，E9]胰高血糖素(6-29)酰胺、[PLA6，E9，C16(40K)]胰高血糖素(6-29)酰胺和[PLA6，E9，C40(40K)]胰高血糖素(6-40)酰胺、[PLA6，D9，C16(40K)]胰高血糖素(6-29)酰胺和[PLA6，D9，C24(40K)]胰高血糖素(6-29)酰胺。
二聚体[PLA6，E9，C24]胰高血糖素(6-29)酰胺的合成
将20mg(0.00675mmole)[PLA6，E9，C24]胰高血糖素(6-29)酰胺溶于6mlPBS缓冲液、1ml1MTris碱(将pH值调整为8.0-8.5)和3mlDMSO中。在敞口容器中搅拌反应混合物，并通过分析HPLC每2hr进行监测。初始产物(HPLCRT7.4min)消失，且产物中主要是二聚体产物(HPLCRT7.9min)(12hr后)后，将混合物用0.1％TFA10％乙腈水稀释，并通过制备HPLC直接纯化。冻干后获得约6mg-8mg二聚体[PLA6，E9，C24]胰高血糖素(6-29)酰胺，其ESI-MS为5920.0，这符合计算的MW5920.6。
用类似的方法合成二聚体[C9]胰高血糖素(6-29)酰胺，其ESI-MS为5916.0，这符合计算的MW5916.6；和二聚体[C5，E9]胰高血糖素(5-29)酰胺，其ESI-MS为6174.0，这符合计算的MW6174.8。
酰化和/或聚乙二醇化的肽按如下制备：
利用CSBio4886肽合成仪或AppliedBiosystems430A肽合成仪在固体支持物上合成肽。如Schnolzeretal.，Int.J.PeptideProteinRes.40：180-193(1992)所述使用原位中和化学。对于酰化的肽，由Nε-FMOC赖氨酸残基取代要酰化的靶氨基酸残基(如，位置10)。用20％的哌啶的DMF溶液将完成的N-末端BOC保护的肽处理30分钟以除去FMOC/甲酰基。在DMF/DIEA中，通过将10倍摩尔过量的FMOC-保护的间隔氨基酸(ex.FMOC-(N-BOC)-色氨酸-OH)或酰基链(ex.C17-COOH)与PyBOP或DEPBT偶联剂偶联来实现与游离ε-氨基Lys残基的偶联。随后除去间隔氨基酸的FMOC基团，然后重复与酰基链的偶联。最后用100％TFA处理以除去任何侧链保护基团和N-末端BOC基团。将肽树脂用5％DIEA/DMF中和，干燥，然后利用95∶5的HF/p-甲酚于0℃从支持物切割1小时。醚萃取后，用5％HOAc溶液将粗肽溶剂化。然后，通过ESI-MS验证溶液的样品含有合适分子量的肽。在100％CH3CN中，利用10％CH3CN/0.1％TFA至0.1％TFA的线性梯度，通过RP-HPLC将合适的肽纯化。纯化使用VydacC1822mm×250mm蛋白柱。酰化的肽类似物通常通过20∶80的缓冲比率来完成洗脱。将部分集中在一起，并在分析RP-HPLC上检查纯度。将纯组分冻干，从而产生白色的固体肽。
如果肽包含内酰胺桥和要酰化的靶残基，则在向肽主链添加该氨基酸时，如上文所述，进行酰化。
对于肽聚乙二醇化，使40kDa甲氧基聚(乙二醇)马来酰亚胺基-丙酰胺(ChirotechTechnologyLtd.)与等摩尔的肽在7M尿素、50mMTris-HCl缓冲液中，利用将肽和PEG都溶解为透明溶液所需的最少量的溶剂(对于利用2mg-3mg肽的反应，通常小于2mL)进行反应。在室温下剧烈搅拌4-6小时，并且通过分析RP-HPLC分析反应。看起来聚乙二醇化的产物与起始材料的不同在于降低的保留时间。在VydacC4柱上，以类似于初始肽纯化所用的条件的条件进行纯化。洗脱以约50∶50的缓冲比率进行。发现了纯聚乙二醇化的肽的组分，并将其冻干。
胆固醇化肽的合成
通过在溶液中，将内酰胺化的肽与溴乙酰基化的胆固醇衍生物偶联，制备胆固醇修饰的肽。肽利用常规固相肽合成(SPPS)组装。PLA衍生化的肽链经由内酰胺桥环化。应用标准的切割方法和纯化方法获得期望的缩酚酸肽。
实施例
胆固醇偶联的内酰胺桥肽[PLA6，K10(COCH2CH2S-Chol)，E16K20(内酰胺)，D28]G(6-29)酰胺的合成
利用ABI430A自动肽合成仪，使用0.2mmoleMBHA酰胺树脂和DEPBT作为偶联剂，通过固相Boc化学，合成具有序列HO-PLA-TSDKSKYLDERRAKDFVQWLMDT[PLA6，K10，E16，K20，D28]胰高血糖素(6-29)的肽基树脂。使用以下Boc氨基酸：Ala、Arg(Tos)、Asp(OcHx)、Asn(Xan)、Glu(OcHx)、Gln(Xan)、Leu、Lys(2-Cl-Z)、Met、PLA、Ser(OBzl)、Thr(OBzl)、Trp(CHO)、Tyr(2.6-二-Cl-Bzl)和Val，除了使位置16处的谷氨酸与Boc-Glu(OFm)-OH结合，使位置20处的赖氨酸与Boc-Lys(Fmoc)-OH结合，以及使位置10处的赖氨酸与Boc-Lys(Alloc)-OH结合。通过20％哌啶的DMF溶液除去位置16和20处的Fm和Fmoc保护基团以后，将肽基树脂用在10％DIEA/DMF中的300mg(1mmol)DEPBT处理约4h，以形成内酰胺桥。将该内酰胺桥化的肽基树脂用由在10mLCHCl3中的由100mg(0.4当量)Pd(PPh3)4、120uLPhSiH3、0.25mLN-甲基吗啉和0.5mL乙酸组成的溶液，在N2气下处理约3h，以除去Alloc基团。然后通过DEPBT使3-三苯甲基硫代丙酸(3-tritylthiopropionicacid)偶联来获得具有以下序列的肽基树脂：HO-PLA-Thr-Ser-Asp-Lys(COCH2CH2SH)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu*-Arg-Arg-Ala-Lys*-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asp-Thr-NH2。(*内酰胺桥化的)
将肽基树脂用液态氟化氢处理以从固体支持物切割粗肽，并除去所有的保护基团。将肽通过制备HPLC纯化，并通过MS和分析RP-HPLC进行分析。纯化的肽在分析RP-HPLC中表现出单一的峰，并且ESI-MS分析产生了期望的质量3050.7，这符合肽[PLA6，K10(CH2CH2SH)，E16K20(内酰胺)，D28]G(6-29)酰胺的3051.0道尔顿的计算的分子量。
为了合成胆固醇偶联的肽[PLA6，K10(COCH2CH2S-Chol(COCH2CH2S-胆固醇))，E16K20(内酰胺)，D28]G(6-29)酰胺，将10mg(3.28μM)[PLA6，K10(COCH2CH2SH)，E16K20(内酰胺)，D28]G(6-29)酰胺溶于2mL含有50mMTris-HCl(pH8.0)的7M尿素缓冲液中。在室温下，向该溶液中添加10mg(9μM)胆固醇试剂Br-Oxa12-Chol(参见下文的结构)。通过HPLC监测反应。约4h后，通过HPLC直接纯化反应溶液。纯化的胆固醇偶联的肽在分析色谱中表现出单一的峰，并且ESI-MS分析获产生了期望的质量4074.13，这符合胆固醇偶联的内酰胺桥肽[PLA6，K10(COCH2CH2S-Chol)，E16K20(内酰胺)，D28]G(6-29)酰胺的4073.0的计算的分子量。
Br-Oxa12-胆固醇(chole)
用类似的方法合成其他胆固醇偶联的内酰胺桥化的肽，如本专利中报道的[PLA6，E16K20(内酰胺)，D28，K30(COCH2CH2S-Chol)]G(6-30)酰胺和[PLA6，E16K20(内酰胺)，D28，K40(COCH2CH2S-Chol)]G(6-40)酰胺。
基于胰高血糖素的缩酚酸肽[Thr5-O-PLA6，E9]胰高血糖素(2-29)酰胺和[Thr5-O-PLA6，E9]胰高血糖素(1-29)酰胺的合成
利用ABI430A自动肽合成仪，使用0.2mmoleMBHA酰胺树脂和DEPBT作为偶联剂，通过固相Boc化学合成肽序列HO-PLA-TSEYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT[PLA6，E9]胰高血糖素(6-29)(SEQIDNO：971)。使用了如下Boc氨基酸：Ala、Arg(Tos)、Asp(OcHx)、Asn(Xan)、Glu(OcHx)、Gln(Xan)、Leu、Lys(2-Cl-Z)、Met、PLA、Ser(OBzl)、Thr(OBzl)、Trp(HOC)、Tyr(2.6-二-Cl-Bzl)和Val。通过与预激活的对称酐溶液在DCM中手动偶联约16h，与该肽在树脂上形成了缩酚酸肽(酯键)，该溶液由Boc-Thr(OBzl)-OH(2mmole)/DIC(1mmole)/DMAP(0.2mmole)组成。将剩余的氨基酸通过标准的Boc化学偶联，以获得以下序列的缩酚酸肽基树脂：Ser-Gln-Gly-Thr-O-PLA-Thr-Ser-Glu-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQIDNO：964)。
将肽基树脂用液态氟化氢处理以从固体支持物切割粗肽，并除去所有的保护基团。将缩酚酸肽通过制备HPLC纯化，并通过MS和分析HPLC进行分析。纯化的肽在分析色谱中表现出单一的峰，并且ESI-MS分析产生了期望质量3359.0，这符合3359.6道尔顿的计算的分子量。
用类似的方法合成缩酚酸肽[Thr5-O-PLA6，E9]胰高血糖素(1-29)酰胺(SEQIDNO：965)，其具有单个N-末端组氨酸残基的添加偶联。纯化的肽在分析色谱中表现出单一的峰，并且ESI-MS分析产生了期望的质量3495.9，这符合3496.8道尔顿的计算的分子量。

Claims (4)

1.胰岛素类似物，包含
A链序列GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQIDNO:613)；
B链序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQIDNO:614)；以及
选自HO-Gly-Gly、HO-Phe-dVal、HO-Phe-Ala、HO-Phe-dAla、HO-Phe-Gly、HO-Phe-Phe、HO-Phe-dPhe、HO-Gly-Val和HO-Gly-dVal的二肽
其中所述二肽经由酯键连接至A链或B链N末端羟基化氨基酸或A链或B链中具备羟基侧链的丝氨酸或苏氨酸残基。
2.如权利要求1所述的胰岛素类似物，其中所述二肽经由酯键连接至SEQIDNO:614的第9或16位氨基酸的侧链上。
3.如权利要求1所述的胰岛素类似物，其中所述B链包含氨基酸结构：
其中R10为H，n为0，X为选自HO-Gly-Gly、HO-Phe-dVal、HO-Phe-Ala、HO-Phe-dAla、HO-Phe-Gly、HO-Phe-Phe、HO-Phe-dPhe、HO-Gly-Val和HO-Gly-dVal的二肽。
4.药物组合物，包含权利要求1-3任一项所述的胰岛素类似物和药用可接受的载体。
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