TWI474835B - 用於治療代謝病症及肥胖症之基於ｇｉｐ之混合激動劑 - Google Patents

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Description

用於治療代謝病症及肥胖症之基於GIP之混合激動劑
本發明係關於呈現GIP活性之天然胰高血糖素的類似物。更特定言之，經發現對天然胰高血糖素序列之修飾可產生呈現強效GIP活性、及強效胰高血糖素及/或強效GLP-1活性的肽。本發明之肽尤其有利於誘發減重或預防體重增加，以及治療高血糖，包括糖尿病。
本申請案主張下列申請案之優先權：2008年6月17日提出申請之美國臨時專利申請案第61/073,274號；2008年7月3日提出申請之美國臨時專利申請案第61/078,171號；2008年8月20日提出申請之美國臨時專利申請案第61/090,448號；及2009年2月10日提出申請之美國臨時專利申請案第61/151,349號。將各申請案之揭示內容的全體特意地以引用方式併入本文中。
胰高血糖素前原(pre-proglucagon)係一種在不同組織中經處理形成許多不同胰高血糖素原(proglucagon)衍生肽的158個胺基酸前體多肽，其包括參與多樣生理功能(包括葡萄糖體內平衡、胰島素分泌、胃排空、及腸道生長、以及食物攝取調節)的胰高血糖素、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)及調酸素(OXM；oxyntomodulin)。胰高血糖素係對應於胰高血糖素前原之胺基酸33至61的29-胺基酸肽，而GLP-1係經產生為對應於胰高血糖素前原之胺基酸72至108的37-胺基酸肽。
當血糖開始下降時，胰高血糖素(一種由胰腺所產生的激素)會對肝臟發出分解糖原及釋放葡萄糖的信號，導致血糖值朝向正常值上升。GLP-1具有與胰高血糖素不同的生物活性。其之作用包括刺激胰島素合成及分泌、抑制胰高血糖素分泌、及抑制食物攝取。GLP-1經證實可降低糖尿病患中的高血糖(升高的葡萄糖值)。促胰島素分泌素-4(exendin-4)(一種與GLP-1共有約50%胺基酸實體之來自蜥蜴毒(lizard venom)的肽)使GLP-1受體活化且同樣經證實可降低糖尿病患中的高血糖。
葡萄糖依賴型促胰島素肽(GIP)係一種在葡萄糖之存在下刺激自胰腺β細胞分泌胰島素的42-胺基酸胃腸調節肽。其係藉由蛋白分解處理衍生自133-胺基酸前體，preproGIP。
如本文所揭示，提供作為天然胰高血糖素(SEQ ID NO：1)之類似物且展現GIP活性的胰高血糖素肽。本發明亦提供使用該等肽之方法。
天然胰高血糖素不會使GIP受體活化，且通常對GLP-1受體具有天然GLP-1之約1%的活性。修飾文中所述之天然胰高血糖素序列產生可展現與天然胰高血糖素(SEQ ID NO：1)之活性相當或更佳之強效胰高血糖素活性、與天然GIP(SEQ ID NO：4)之活性相當或更佳之強效GIP活性、及/或與天然GLP-1之活性相當或更佳之強效GLP-1活性的胰高血糖素肽。GLP-1(7-36)醯胺(SEQ ID NO：3)或GLP-1(7-37)(酸)(SEQ ID NO：2)係GLP-1的生物強效形式，其對GLP-1受體展現基本上相等的活性。
文中所述數據顯示同時具有GIP活性及GLP-1活性之肽尤其有利於誘導減重或預防增重，以及治療高血糖，包括糖尿病。文中揭示的活體內數據顯示GIP激動劑活性與GLP-1激動劑活性之組合對減重產生較單獨之GLP-1大的作用。有鑑於在技藝中需要拮抗GIP來降低每日食物攝取及體重、及提高胰島素敏感性及能量消耗的教示，此活性尤其係在意料之外。(Irwin等人，Diabetologia 50：1532-1540(2007)；及Althage等人，J Biol Chem,於2008年4月17日電子出版)。
因此，在一態樣中，本發明提供誘導減重或預防增重之方法，其包括向有需要的病患投與有效量之對GIP受體及GLP-1受體兩者展現活性，且視情況亦對胰高血糖素受體展現活性的化合物(例如，胰高血糖素肽)。此等化合物包括文中所述的GIP/GLP-1共同激動劑及胰高血糖素/GIP/GLP-1三重激動劑。
對GIP受體的增加活性係由在位置1處之胺基酸修飾所提供。舉例來說，位置1處之His經大的芳族胺基酸，視情況為Tyr、Phe、Trp、胺基-Phe、硝基-Phe、氯-Phe、磺酸基-Phe、4-吡啶基-Ala、甲基-Tyr、或3-胺基Tyr所取代。
對GIP受體的增加活性係藉由使胰高血糖素肽或其類似物之C-端部分(胺基酸12-29)之α螺旋結構穩定的修飾所提供。舉例來說，可藉由在位置i與i+4處，或在位置j與j+3之間，或在位置k與k+7之間之兩胺基酸之側鏈之間的共價鍵形成分子內架橋。在範例具體例中，架橋係位在位置12及16、16及20、20及24、24及28、或17及20之間。在其他具體例中，可在位於該等位置處的帶正電與帶負電胺基酸之間形成諸如鹽橋的非共價交互作用。或者，舉例來說，透過在維持期望活性的位置處故意引入一或多個α,α-二取代胺基酸而達成胰高血糖素肽之C-端部分(大約胺基酸12-29)中之α螺旋結構的穩定化。在一些具體例中，胰高血糖素肽或其類似物之位置16、17、18、19、20、21、24或29中的一、二、三、四或更多個經α,α-二取代胺基酸取代。舉例來說，胰高血糖素肽或其類似物之位置16經胺基異丁酸(AIB)取代提供在不存在鹽橋或內醯胺下的穩定化α螺旋。此等肽在此被視為係缺少分子內架橋的肽。在特定態樣中，α螺旋的穩定化係藉由引入一或多個α,α-二取代胺基酸，但不引入共價分子內架橋(例如，內醯胺橋、二硫化物橋)而達成。此等肽在此被視為係缺少共價分子內架橋的肽。在一些具體例中，位置16、20、21或24中之一、二、三或更多個經AIB取代。
對GIP受體的增加活性係藉由在位置27及/或28，及視情況在位置29處之胺基酸修飾所提供。舉例來說，在位置27處之Met經大的脂族胺基酸(視情況為Leu)取代，在位置28處之Asn經小的脂族胺基酸(視情況為Ala)取代，及在位置29處之Thr經小的脂族胺基酸(視情況為Gly)取代。
對GIP受體的增加活性亦藉由在位置12處之胺基酸修飾所提供。舉例來說，位置12經大的脂族非極性胺基酸(視情況為Ile)取代。
對GIP受體的增加活性亦藉由在位置17及/或18處之胺基酸修飾所提供。舉例來說，位置17經極性殘基(視情況為Gln)取代，及位置18經小的脂族胺基酸(視情況為Ala)取代。
對胰高血糖素受體的增加活性係藉由在如文中所述之天然胰高血糖素(SEQ ID NO：1)之位置16處的胺基酸修飾來提供。
對胰高血糖素受體的減低、維持、或增加活性係(例如)藉由在如文中所述之位置3處的胺基酸修飾來提供。
已藉由在位置1及/或2處之胺基酸修飾降低之胰高血糖素活性的回復係藉由使胰高血糖素肽或其類似物之C-端部分(胺基酸12-29)之α螺旋結構穩定的修飾來提供。舉例來說，可藉由在位置i與i+4處或在位置j與j+3之間，或在位置k與k+7之間之兩胺基酸之側鏈之間的共價鍵形成分子內架橋。在其他具體例中，可在位於該等位置處的帶正電與帶負電胺基酸之間形成諸如鹽橋的非共價交互作用。在又其他的具體例中，將一或多個α,α-二取代胺基酸在維持期望活性的位置處插入或取代入此C-端部分(胺基酸12-29)中。舉例來說，位置16、20、21或24中之一、二、三個或全部經α,α-二取代胺基酸(例如，AIB)取代。
對GLP-1受體的增加活性係藉由以電荷中性基團(諸如醯胺或酯)取代C-端胺基酸之羧酸來提供。
對GLP-1受體的增加活性係藉由使胰高血糖素肽或其類似物之C-端部分(大約胺基酸12-29)之α螺旋結構穩定的修飾來提供。在一些具體例中，可藉由在位置i與i+4處或在位置j與j+3之間，或在位置k與k+7之間之兩胺基酸之側鏈之間的共價鍵形成分子內架橋。在其他具體例中，可在位於該等位置處的帶正電與帶負電胺基酸之間形成諸如鹽橋的非共價交互作用。在又其他的具體例中，將一或多個α,α-二取代胺基酸在維持期望活性的位置處插入或取代入此C-端部分(胺基酸12-29)中。舉例來說，位置16、20、21或24中之一、二、三個或全部經α,α-二取代胺基酸(例如，AIB)取代。
對GLP-1受體的增加活性係藉由在如文中所述之位置20處的胺基酸修飾來提供。
對GLP-1受體的增加活性係藉由將C-端延伸肽諸如GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：95)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：96)加成至C-端來提供。該等類似物中之GLP-1活性可藉由如文中所述修飾位置18、28或29，或位置18及29處之胺基酸而進一步提高。
GLP-1效力之進一步的適度增加係藉由將位置10處之胺基酸修飾為大的芳族胺基酸殘基(視情況為Trp)來提供。
對GLP-1受體之減低活性係(例如)如文中所述，藉由在位置7處之胺基酸修飾、除去在位置27或28處之胺基酸C-端的胺基酸、產生27-或28-胺基酸肽、或其組合來提供。
於聚乙二醇化後之活性的維持係藉由將GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：95)加成至C-端來提供。
如文中所展示，對各胰高血糖素受體、GLP-1受體、及GIP受體之維持或增加活性(相較於含內醯胺、GIP活性、基於胰高血糖素之類似物)係藉由以下方式來提供：(i)以式IV之胺基酸對位置16處之Ser作胺基酸取代：
其中n係1至16、或1至10、或1至7、或1至6、或2至6、或2或3或4或5，R1 及R2 各係獨立地選自由以下基團組成之群：H、C1 -C18 烷基、(C1 -C18 烷基)OH、(C1 -C18 烷基)NH2 、(C1 -C18 烷基)SH、(C0 -C4 烷基)(C3 -C6 )環烷基、(C0 -C4 烷基)(C2 -C5 雜環基)、(C0 -C4 烷基)(C6 -C10 芳基)R7 、及(C1 -C4 烷基)(C3 -C9 雜芳基)，其中R7 係H或OH，及式IV之胺基酸的側鏈包含自由胺基，及(ii)位置20處之Gln經α,α-二取代胺基酸(例如，AIB)作胺基酸取代。在一些具體例中，位置16處之胺基酸係Lys及位置20處之胺基酸係AIB。
在位置16處包含式IV之胺基酸及在位置20處包含α,α-二取代胺基酸之類似物對各胰高血糖素受體、GLP-1受體、及GIP受體之活性可藉由延長肽之長度(例如，藉由將長度(例如)約1-21、約9至21、約6-18、約9-12、或約10或11個胺基酸融合至C-端延伸肽)而進一步提高。在一些具體例中，C-端係藉由融合至GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：95)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：96)而延長，其中X係Gly或小的脂族或非極性或輕度極性胺基酸。在替代具體例中，C-端係藉由融合至GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：95)而延長，且將1-11個胺基酸(例如，1-5、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11個胺基酸)融合至GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：95)之C-端。位在GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：95)之C-端的1-11個胺基酸可包含，例如，一或多個小的脂族胺基酸，諸如Ala或Gly。在此方面，C-端延伸可為，例如，GPSSGAPPPSXm ，其中m係1至11(例如，1至5)及X係Ala或Gly。或者，融合至SEQ ID NO：95之C-端的1-11(例如，1至5)個胺基酸可為不同小脂族胺基酸之組合。舉例來說，1-11(例如，1至5)個胺基酸可為Ala及Gly殘基之組合。
GIP活性、基於胰高血糖素之類似物(包括含有位於位置16處之式IV胺基酸及位於位置20處之α,α-二取代胺基酸之類似物)對各胰高血糖素、GLP-1、及GIP受體之活性的提高可進一步在位於C-端延伸內或C-端胺基酸(例如，加成至C-端延伸之C-端的胺基酸)處之胺基酸的醯化或烷化後達成。醯化或烷化可係位在，例如，位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、及50之任一者處的胺基酸。在一些具體例中，經醯化或烷化的胺基酸係位在位置37、38、39、40、41、42、或43處。在一些具體例中，經醯化或烷化的胺基酸係連接至醯基或烷基(例如，C10-C22)的Lys。在某些具體例中，Lys係位在由SEQ ID NO：95之胺基酸序列所組成之C-端延伸的C-端，以致Lys係位在類似物的位置40處。視情況，經醯化的C-端延伸肽亦經聚乙二醇化，例如，在位置24處。
此外，GIP活性、基於胰高血糖素之類似物對各胰高血糖素、GLP-1、及GIP受體之活性的提高可藉由透過間隔物(例如，胺基酸、二肽、三肽、親水性雙官能間隔物、疏水性雙官能間隔物)將胺基酸醯化或烷化而達成。在一些具體例中，GIP活性、基於胰高血糖素之類似物包含透過一間隔物的醯基或烷基，該間隔物係連接至類似物之位置10或位置40處之胺基酸的側鏈。在其他具體例中，類似物包含在位置29處之胺基酸C-端之1至21個胺基酸的C-端延伸及間隔物，該間隔物係共價連接至醯基或烷基，在對應於相對於SEQ ID NO：1之位置37-43之一者的位置處連接至該延伸之一胺基酸。在某些具體例中，間隔物之長度為3至10個原子。在特定態樣中，間隔物及醯基或烷基之總長度為約14至約28個原子長度。用於提高對胰高血糖素、GLP-1、及GIP受體中之一或多者之活性的適當間隔物將進一步說明於文中。
上文所述之提高或減低GIP活性、提高或減低胰高血糖素受體活性、及提高或減低GLP-1受體活性的任何修飾可個別或組合地應用。上文所述之任何修飾亦可與賦予其他期望性質(諸如提高溶解度及/或穩定性及/或作用期間)的其他修飾組合。或者，上文所述之任何修飾可與不會實質影響溶解度或穩定性或活性的其他修飾組合。範例性的修飾包括，但不限於：
(A)改良溶解度，例如，經由引入一、二、三或更多個帶電胺基酸至天然胰高血糖素之C-端部分，較佳係於位置27之C-端的位置處。此一帶電胺基酸可經由(例如)於位置28或29處以帶電胺基酸取代天然胺基酸，或者經由(例如)於位置27、28或29之後加成帶電胺基酸而引入。在範例具體例中，帶電胺基酸中之一、二、三個或全部係帶負電。在其他具體例中，帶電胺基酸中之一、二、三個或全部係帶正電。此等修飾使溶解度提高，例如，當在25℃下於24小時後量測時，在約5.5與8間之給定pH(例如，pH 7)下相對於天然胰高血糖素提供至少2倍、5倍、10倍、15倍、25倍、30倍或以上的溶解度。
(B)藉由如文中所述，例如，於肽的位置16、17、20、21、24或29處、於C-端延伸內、或於C-端胺基酸處加成親水性部分諸如聚乙二醇鏈，而提高溶解度及作用期間或循環半衰期。
(C)藉由如文中所述將胰高血糖素肽醯化或烷化而提高溶解度及/或作用期間或循環半衰期及/或延遲作用之開始。
(D)透過經由如文中所述修飾位置1或2處之胺基酸引入對二肽基肽酶IV(DPP IV)分裂之抗性而提高作用期間或循環半衰期。
(E)藉由修飾位置15處之Asp，例如，經由刪除或以麩胺酸、升麩胺酸、半胱胺磺酸或升半胱胺磺酸取代，而提高穩定性。此等修飾可在5.5至8範圍內之pH下降低降解或分裂，例如，於25℃下在24小時後保有至少75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%、至多100%的原始肽。此等修飾降低在Asp15-Ser16間之肽鍵的分裂。
(F)藉由修飾位置16處之Ser，例如經由以Thr或AIB取代，而提高穩定性。此等修飾亦可降低在Asp15-Ser16間之肽鍵的分裂。
(G)藉由修飾在位置27處之甲硫胺酸，例如，經由以白胺酸或正白胺酸取代，而提高穩定性。此等修飾可降低氧化性降解。亦可經由修飾位置20或24處之Gln，例如，經由以Ala、Ser、Thr、或AIB取代，而提高穩定性。此等修飾可降低透過Gln之脫醯胺作用所發生的降解。可藉由修飾在位置21處之Asp，例如，經由以Glu取代，而提高穩定性。此等修飾可降低透過Asp之脫水形成環狀琥珀醯亞胺中間體隨後再異構化成異天冬胺酸酯所發生的降解。
(H)不會實質影響活性的非保留性或保留性取代、加成或刪除，例如，在位置2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29中之一或多處的保留性取代；以Ala取代一或多個此等位置；刪除位置27、28或29中之一或多處的胺基酸；或刪除胺基酸29視情況並結合以C-端醯胺或酯替代C-端羧酸基；以Arg取代位置12處之Lys；以Val或Phe取代位置10處之Tyr；
在一些具體例中，文中所述之胰高血糖素肽呈現約100nM或以下，或約75、50、25、10、8、6、5、4、3、2或1 nM或以下之對GIP受體活化活性的EC50。在一些具體例中，文中所述之胰高血糖素肽呈現約0.001 nM、0.01 nM、或0.1 nM之對GIP受體的EC50。在一些具體例中，文中所述之胰高血糖素肽呈現不多於約1 nM、2 nM、3 nM、4 nM、5 nM、6 nM、8 nM、10 nM、15 nM、20 nM、25 nM、30 nM、40 nM、50 nM、75 nM、或100 nM之對GIP受體的EC50。在一些具體例中，胰高血糖素肽呈現約100nM或以下，或約75、50、25、10、8、6、5、4、3、2或1 nM或以下之對胰高血糖素受體活化的EC50。在一些具體例中，文中所述之胰高血糖素肽呈現約0.001 nM、0.01 nM、或0.1 nM之對胰高血糖素受體的EC50。在一些具體例中，對胰高血糖素受體之EC50係不多於約1 nM、2 nM、3 nM、4 nM、5 nM、6 nM、8 nM、10 nM、15 nM、20 nM、25 nM、30 nM、40 nM、50 nM、75 nM、或100 nM。在一些具體例中，胰高血糖素肽呈現約100nM或以下，或約75、50、25、10、8、6、5、4、3、2或1 nM或以下之對GLP-1受體活化的EC50。在一些具體例中，文中所述之胰高血糖素肽呈現約0.001 nM、0.01 nM、或0.1 nM之對GLP-1受體的EC50。在一些具體例中，對GLP-1受體之EC50係不多於約1 nM、2 nM、3 nM、4 nM、5 nM、6 nM、8 nM、10 nM、15 nM、20 nM、25 nM、30 nM、40 nM、50 nM、75 nM、或100 nM。受體活化可藉由測量過度表現受體之HEK293細胞中之cAMP誘發的活體外檢定法測量，例如，如實施例16中所述之檢定經共轉染編碼受體之DNA及鍵聯至cAMP反應元件之螢光素酵素基因的HEK293細胞。
在一些具體例中，胰高血糖素肽對GIP受體呈現相對於天然GIP至少約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、100%、125%、150%、175%或200%或更高的活性(GIP效力)。在一些具體例中，文中所述之胰高血糖素肽對GIP受體呈現相對於天然GIP不多於1000%、10,000%、100,000%、或1,000,000%的活性。在一些具體例中，胰高血糖素肽對胰高血糖素受體呈現相對於天然胰高血糖素至少約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、或500%或更高的活性(胰高血糖素效力)。在一些具體例中，文中所述之胰高血糖素肽對胰高血糖素受體呈現相對於天然胰高血糖素不多於1000%、10,000%、100,000%、或1,000,000%的活性。在一些具體例中，胰高血糖素肽對GLP-1受體呈現相對於天然GLP-1至少約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、100%、125%、150%、175%或200%或更高的活性(GLP-1效力)。在一些具體例中，文中所述之胰高血糖素肽對GLP-1受體呈現相對於天然GLP-1不多於1000%、10,000%、100,000%、或1,000,000%的活性。胰高血糖素肽對受體相對於受體之天然配體之活性係以胰高血糖素肽相對於天然配體之EC50的反比計算。
因此，本發明之一態樣提供對胰高血糖素受體及GIP受體兩者呈現活性的胰高血糖素肽(「胰高血糖素/GIP共同激動劑」)。此等胰高血糖素肽失去天然胰高血糖素對胰高血糖素受體相較於對GIP受體的選擇性。在一些具體例中，胰高血糖素肽對GIP受體之EC50與其對胰高血糖素受體之EC50的差(較高或較低)係低於約50倍、40倍、30倍或20倍。在一些具體例中，胰高血糖素肽之GIP效力與其之胰高血糖素效力的差(較高或較低)係低於約500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、或5倍。在一些具體例中，胰高血糖素肽對GIP受體之EC50除以胰高血糖素肽對胰高血糖素受體之EC50的比係低於約100、75、60、50、40、30、20、15、10、或5。在一些具體例中，對GIP受體之EC50除以對胰高血糖素受體之EC50的比係約1或低於約1(例如，約0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在一些具體例中，胰高血糖素肽之GIP效力相較於胰高血糖素肽之胰高血糖素效力的比係低於約500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、60、50、40、30、20、15、10、或5。在一些具體例中，對GIP受體之效力除以對胰高血糖素受體之效力的比係約1或低於約1(例如，約0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在一些具體例中，GLP-1活性已，例如，藉由在位置7處之胺基酸修飾、刪除在位置27或28處之胺基酸C-端的胺基酸、產生27-或28-胺基酸肽、或其組合，而顯著地降低或經破壞。
本發明之另一態樣提供對胰高血糖素、GIP及GLP-1受體呈現活性的胰高血糖素肽(「胰高血糖素/GIP/GLP-1三重激動劑」)。此等胰高血糖素肽已失去天然胰高血糖素對胰高血糖素受體相較於對GLP-1及GIP受體兩者的選擇性。在一些具體例中，胰高血糖素肽對GIP受體之EC50與其對胰高血糖素及GLP-1受體之各別EC50的差(較高或較低)係低於約50倍、40倍、30倍或20倍。在一些具體例中，胰高血糖素肽之GIP效力與其之胰高血糖素及GLP-1效力的差(較高或較低)係低於約500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、或5倍。在一些具體例中，三重激動劑對GIP受體之EC50除以三重激動劑對GLP-1受體之EC50的比係低於約100、75、60、50、40、30、20、15、10、或5。在一些具體例中，對GIP受體之EC50除以對GLP-1受體之EC50的比係約1或低於約1(例如，約0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在一些具體例中，三重激動劑之GIP效力相較於三重激動劑之GLP-1效力的比係低於約100、75、60、50、40、30、20、15、10、或5。在一些具體例中，對GIP受體之效力除以對GLP-1受體之效力的比係約1或低於約1(例如，約0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在相關具體例中，三重激動劑對GIP受體之EC50除以三重激動劑對胰高血糖素受體之EC50的比係低於約100、75、60、50、40、30、20、15、10、或5。在一些具體例中，對GIP受體之EC50除以對胰高血糖素受體之EC50的比係約1或低於約1(例如，約0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在一些具體例中，三重激動劑之GIP效力相較於三重激動劑之胰高血糖素效力的比係低於約500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、60、50、40、30、20、15、10、或5。在一些具體例中，對GIP受體之效力除以對胰高血糖素受體之效力的比係約1或低於約1(例如，約0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在一些具體例中，三重激動劑對GLP-1受體之EC50除以三重激動劑對胰高血糖素受體之EC50的比係低於約100、75、60、50、40、30、20、15、10、或5。在一些具體例中，對GLP-1受體之EC50除以對胰高血糖素受體之EC50的比係約1或低於約1(例如，約0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。在一些具體例中，三重激動劑之GLP-1效力相較於三重激動劑之胰高血糖素效力的比係低於約100、75、60、50、40、30、20、15、10、或5。在一些具體例中，對GLP-1受體之效力除以對胰高血糖素受體之效力的比係約1或低於約1(例如，約0.01、0.013、0.0167、0.02、0.025、0.03、0.05、0.067、0.1、0.2)。
本發明之又另一態樣提供對GLP-1及GIP受體呈現活性，但其中之胰高血糖素活性經顯著降低或破壞(例如，藉由在位置3處之胺基酸修飾)的胰高血糖素肽(「GIP/GLP-1共同激動劑」)。舉例來說，於此位置經酸性、鹼性、或疏水性胺基酸(麩胺酸、鳥胺酸、正白胺酸)取代可使胰高血糖素活性降低。在一些具體例中，胰高血糖素肽對GIP受體之EC50與其對GLP-1受體之EC50的差(較高或較低)係低於約50倍、40倍、30倍或20倍。在一些具體例中，胰高血糖素肽之GIP效力與其之GLP-1效力的差(較高或較低)係低於約25、20、15、10、或5倍。在一些具體例中，此等胰高血糖素肽對胰高血糖素受體具有天然胰高血糖素之約10%或以下(例如，約1-10%，或約0.1-10%，或大於約0.1%但小於約10%)的活性。在一些具體例中，胰高血糖素肽對GIP受體之EC50除以胰高血糖素肽對GLP-1受體之EC50的比係低於約100、75、60、50、40、30、20、15、10、或5，且不低於1。在一些具體例中，胰高血糖素肽之GIP效力相較於胰高血糖素肽之GLP-1效力的比係低於約100、75、60、50、40、30、20、15、10、或5，且不低於1。
本發明之再一態樣提供對GIP受體呈現活性，其中之胰高血糖素及GLP-1活性經顯著降低或破壞(例如，藉由在位置3及7處之胺基酸修飾)的胰高血糖素肽(「GIP激動劑胰高血糖素肽」)。在一些具體例中，此等胰高血糖素肽對胰高血糖素受體具有天然胰高血糖素之約10%或以下(例如，約1-10%，或約0.1-10%，或大於約0.1%、0.5%、或1%但小於約1%、5%、或10%)的活性。在一些具體例中，此等胰高血糖素肽亦對GLP-1受體具有天然GLP-1之約10%或以下(例如，約1-10%，或約0.1-10%，或大於約0.1%、0.5%、或1%但小於約1%、5%、或10%)的活性。
根據本發明之一些具體例，具有GIP激動劑活性之胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的類似物包含具有(a)在位置1處賦予GIP激動劑活性之胺基酸修飾，(b)使類似物之C-端部分(胺基酸12-29)之α螺旋結構穩定的修飾，及(c)視情況1至10個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)進一步的胺基酸修飾的SEQ ID NO：1。在一些具體例中，類似物對GIP受體呈現天然GIP之至少約1%的活性或文中所述之對GIP受體的任何其他活性值。使α螺旋結構穩定的修飾可係技藝中已知之任何修飾，諸如，比方說，文中所述之任何修飾。參見「使α螺旋結構穩定化」之章節中的教示。在一些具體例中，使α螺旋結構穩定之修飾係選自由下列組成之群之修飾：(i)在位置i及i+4處之胺基酸之側鏈之間或在位置j及j+3處之胺基酸之側鏈之間的內醯胺橋，其中i係12、13、16、17、20或24，及其中j係17，及(ii)在類似物之位置16、20、21、及24處之胺基酸中的一、二、三個、或全部係經α,α-二取代胺基酸所取代。此等具有GIP激動劑活性之胰高血糖素的類似物將進一步說明於文中。
在一些具體例中，本發明提供具有GIP激動劑活性之胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的類似物，其具有以下的修飾：
(a)在位置1處之胺基酸修飾，
(b)(i)在位置i及i+4處之胺基酸之側鏈之間或在位置j及j+3處之胺基酸之側鏈之間的內醯胺橋，其中i係12、13、16、17、20或24，及其中j係17，或(ii)在位置16、20、21、或24中之一、二、三處、或全部經α,α-二取代胺基酸的胺基酸取代，
(c)在位置27、28及29之一、二或全部處的胺基酸修飾，
(d)1、2、3、4、5、6、或8個進一步的胺基酸修飾，其中該類似物對GIP受體活化之EC50係約100 nM或以下。
在範例具體例中，
(a)位置1處之胺基酸修飾係位置1處之His經大的芳族胺基酸(視情況為Tyr、Phe、Trp、胺基-Phe，硝基-Phe、氯-Phe、磺酸基-Phe、4-吡啶基-Ala，甲基-Tyr、或3-胺基Tyr)取代，
(b)(i)內醯胺橋係位在位置16及20處之胺基酸之間，其中位置16及20處之一個胺基酸經Glu取代，及位置16及20處之另一個胺基酸經Lys取代，或(ii)該α,α-二取代胺基酸係AIB，
(c)位置27處之Met經大的脂族胺基酸(視情況為Leu)取代，
(d)位置28處之Asn經小的脂族胺基酸(視情況為Ala)取代，及
(e)位置29處之Thr經小的脂族胺基酸(視情況為Gly)取代。
該類似物可包括進一步的修飾，包括但不限於：
(a)位置12處之胺基酸修飾，視情況經Ile取代，
(b)位置17及18處之胺基酸修飾，視情況在位置17處經Q取代及在位置18處經A取代，
(c)將GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：95)加成至C-端，或其任何組合。
該類似物可替代地或另外再包括進一步的修飾，包括但不限於：
(a)位置2處之Ser經D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、AIB、Val、或α-胺基-N-丁酸取代；
(b)位置10處之Tyr經Trp、Lys、Orn、Glu、Phe、或Val取代；
(c)一醯基鍵聯至位置10處之Lys；
(d)位置12處之Lys經Arg取代；
(e)位置16處之Ser經Glu、Gln、升麩胺酸、升半胱胺磺酸、Thr、Gly、或AIB取代；
(f)位置17處之Arg經Gln、Lys或Glu取代；
(g)位置18處之Arg經Ala、Ser、Thr、或Gly取代；
(h)位置20處之Gln經Ala、Ser、Thr、Lys、瓜胺酸、Arg、Orn、或AIB取代；
(i)位置21處之Asp經Glu、升麩胺酸、升半胱胺磺酸取代；
(j)位置23處之Val經Ile取代；
(k)位置24處之Gln經Asn、Ala、Ser、Thr、Glu、Lys、或AIB取代；及
(l)在位置2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28、及29中任一者處之保留性取代，或其任何組合。
在一些具體例中，當胰高血糖素肽未經聚乙二醇化時，類似物對GIP受體活化之EC50係約4、2、1 nM或以下，或類似物對GIP受體具有天然GIP之至少約1%、2%、3%、4%或5%的活性。在相關具體例中，未經聚乙二醇化之類似物對GLP-1受體活化之EC50係約4、2、1 nM或以下，或對GLP-1受體具有天然GLP-1之至少約1%、2%、3%、4%或5%的活性。在又其他的相關具體例中，未經聚乙二醇化之類似物對胰高血糖素受體活化之EC50係約4、2、1 nM或以下，或對胰高血糖素受體具有天然胰高血糖素之至少約5%、10%、15%或20%的活性。在一些具體例中，未經聚乙二醇化之類似物對胰高血糖素受體具有天然胰高血糖素之低於約1%的活性。在其他具體例中，未經聚乙二醇化之類似物對GLP-1受體具有天然GLP-1之低於約10%、5%或1%的活性。
在一些具體例中，胰高血糖素肽係共價鍵聯至位在胺基酸位置16、17、20、21、24、或29、在位置29之後在C-端延伸內之加成胺基酸處(例如，位置30)、或在C-端胺基酸處之任一者處之親水性部分。在範例具體例中，此親水性部分係共價鍵聯至在任何該等位置處之Lys、Cys、Orn、升半胱胺酸、或乙醯基-苯基丙胺酸殘基。親水性部分的實例包括，例如，分子量約1,000道耳吞(Dalton)至約40,000道耳吞，或約20,000道耳吞至約40,000道耳吞的聚乙二醇(PEG)。
在類似物係鍵聯至諸如PEG之親水性部分的該等具體例中，與沒有親水性部分的類似物相比，對一或多種受體的相對EC50可較高，例如，高約10倍。舉例來說，經聚乙二醇化之類似物對GIP受體活化之EC50係約10 nM或以下，或類似物對GIP受體具有天然GIP之至少約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、或0.5%的活性。在相關具體例中，經聚乙二醇化之類似物對GLP-1受體活化之EC50係約10 nM或以下，或對GLP-1受體具有天然GLP-1之至少約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%或0.5%的活性。在又其他的相關具體例中，經聚乙二醇化之類似物對胰高血糖素受體活化之EC50係約10 nM或以下，或對胰高血糖素受體具有天然胰高血糖素之至少約0.5%、1%、1.5%或2%的活性。在一些具體例中，類似物對胰高血糖素受體具有天然胰高血糖素之低於約1%的活性。在其他具體例中，類似物對GLP-1受體具有天然GLP-1之低於約10%、5%或1%的活性。
胰高血糖素肽可為包含至少兩個、三個、或更多個透過連接體(linker)鍵結之肽之二聚體、三聚體或更高級多聚體的部分，其中至少一或兩個肽為胰高血糖素肽。二聚體可為均二聚體或雜二聚體。在一些具體例中，連接體係選自由雙官能硫醇交聯體及雙官能胺交聯體所組成之群。在某些具體例中，連接體係PEG，例如，5 kDa PEG、20 kDa PEG。在一些具體例中，連接體係二硫化物鍵。舉例來說，二聚體之各單體可包含Cys殘基(例如，位在終端或內部的Cys)，且各Cys殘基之硫原子參與二硫化物鍵之形成。在本發明之一些態樣中，單體係透過終端胺基酸(例如，N-端或C-端)，透過內部胺基酸，或透過至少一單體之終端胺基酸及至少另一單體之內部胺基酸連接。在特定態樣中，單體並非透過N-端胺基酸連接。在一些態樣中，多聚體之單體係以「尾接尾」取向連接在一起，其中各單體之C-端胺基酸連接在一起。一結合物部分可共價鍵聯至文中所述之任何胰高血糖素肽，包括二聚體、三聚體或更高級多聚體。
文中所述之提高胰高血糖素受體活性、維持部分胰高血糖素受體活性、改良溶解度、提高穩定性、或降低降解的任何修飾可個別或組合地應用至胰高血糖素肽。在一些具體例中，胰高血糖素肽在6至8之間、或6至9之間、或7至9之間(例如，pH 7)的pH下可以至少1毫克/毫升之濃度溶解，且視情況於在25℃下24小時後保留原始肽的至少95%(例如，原始肽的5%或以下經降解或分裂)。
提供包含醫藥學上可接受之載體或稀釋劑的無菌醫藥組成物及包含裝置的套組。提供減輕體重增加或誘發減重的方法，其包括向有需要的病患投與可有效減輕體重增加或誘發減重之量的此等醫藥組成物。提供治療糖尿病的方法，其包括向有需要的病患投與可有效降低血糖值之量的此等醫藥組成物。
文中所述之所有治療方法、醫藥組成物、套組及其他類似具體例涵蓋術語肽、激動劑、共同激動劑、三重激動劑、或類似物之使用包括其所有醫藥學上可接受之鹽或酯。
先前之【發明內容】並非要定義本發明之每個態樣，且額外的具體例說明於其他章節，諸如【實施方式】中。整份文件係要認同為統一的揭示案，且應明瞭可涵蓋文中所述特徵之所有可能的組合，即使該等特徵之組合未一起出現於本文件之相同句子、或段落、或章節中。
此外，本發明包括範圍以任何方式較由文中特定段落所定義之變化窄之本發明的任一或所有具體例。舉例來說，當說明本發明之某些態樣作為一類時，應明瞭一類之每一者係個別地為本發明之一具體例，且該類之兩者或兩以上的組合係本發明之具體例。
定義
在描述及主張本發明時，將根據以下所述的定義使用以下術語。
如文中所使用之術語「約」係指較所述之值或值的範圍大或小10%，但並非要將任何值或值的範圍指示為僅此較廣的定義。前置術語「約」之各值或值的範圍亦欲涵蓋所述絕對值或值範圍的具體例。
如文中所用之術語「醫藥學上可接受之載劑」包括任何的標準醫藥載劑，諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液諸如油/水或水/油乳液、及各種類型的濕潤劑。此術語亦涵蓋任何經美國聯邦政府之管理機關所認可或列於美國藥典(US Pharmacopeia)中使用於動物(包括人類)的試劑。
如文中所用之術語「醫藥學上可接受之鹽」係指保有母化合物之生物活性，且無在生物或其他方面之不利作用之化合物的鹽。本文揭示之許多化合物可藉由胺基及/或羧基或其類似基團之存在而形成酸及/或鹼鹽。
醫藥學上可接受之鹼加成鹽可由無機及有機鹼來製備。衍生自無機鹼的鹽包括(僅作為實例)鈉、鉀、鋰、銨、鈣及鎂鹽。衍生自有機鹼的鹽包括(但不限於)第一、第二及第三胺之鹽。
醫藥學上可接受之酸加成鹽可由無機及有機酸來製備。衍生自無機酸的鹽包括氫氯酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等。衍生自有機酸的鹽包括乙酸、丙酸、羥乙酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、琥珀酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、桂皮酸、苯乙醇酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等等。
如文中所用之術語「治療」包括預防特定病症或病況，或減輕與特定病症或病況相關的症狀及/或預防或消除該等症狀。舉例來說，如本文所用之術語「治療糖尿病」一般將係指朝正常值的方向改變葡萄糖血值，且可視給定情況而包括提高或降低血糖值。
如本文所使用之「有效」量或「治療有效量」之胰高血糖素肽係指無毒性但可提供期望效果之足夠量的肽。舉例來說，一期望的效果將係預防或治療低血糖，如(例如)藉由血糖值的升高所量測。本揭示案之胰高血糖素肽之另一期望的效果將包括治療高血糖(例如，如由較接近正常的血糖值變化所量測)，或誘發減重/預防增重(例如，如由體重之降低所量測)，或預防或降低體重增加，或使體脂分佈達到標準。「有效」的量將隨對象而異，視個體的年齡及一般狀況、給藥方式等等而定。因此，並非始終可明確指出確切的「有效量」。然而，在任何個別情況中的適當「有效」量可由熟悉技藝人士使用例行實驗而決定。
術語「非經腸道」係指不通過供給營養的管道，而係經由一些其他途徑諸如皮下、肌肉內、脊椎內、或靜脈內。
如本文所用之術語「經純化」及類似術語係關於以實質上不含一般與分子或化合物於原生或天然環境中相關之污染物的形式分離出分子或化合物。如本文所使用之術語「經純化」不需要絕對純度；反之，其係指相對的定義。術語「經純化的多肽」在此係用於描述經自包括(但不限於)核酸分子、脂質及碳水化合物之其他化合物分離的多肽。
術語「經分離」需要將所提及的物質自其之原始環境(例如，若其係天然產生時的自然環境)移除。舉例來說，存在於活動物體內之天然產生的多核苷酸係未經分離，但自於天然系統中之一些或所有共同存在物質中分離出的相同多核苷酸係經分離。
如本文所使用之術語「肽」涵蓋3個或3個以上之胺基酸且典型上少於50個胺基酸的序列，其中該等胺基酸係天然產生或非天然產生的胺基酸。非天然產生的胺基酸係指不會於活體內自然產生，但可經併入至文中所述之肽結構內的胺基酸。
如本文所用之術語「多肽」及「蛋白質」係交替用於指示胺基酸之聚合物的術語，而與聚合物的長度無關。典型上，多肽及蛋白質具有大於「肽」的聚合物長度。
如本文所使用之「胰高血糖素肽」包括任何包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列、或任何SEQ ID NO：1之胺基酸序列之類似物的肽，包括肽的胺基酸取代、加成、刪除或後轉譯修飾(post translational modification)(例如，甲基化、醯化、烷化、泛醌化、分子內共價鍵結諸如內醯胺橋形成、聚乙二醇化等等)，其中該類似物刺激胰高血糖素或GLP-1或GIP受體活性，例如，如使用實施例16中所述之檢定法由cAMP產生所量測。
術語「胰高血糖素激動劑」係指包含刺激胰高血糖素受體活性(例如，如使用實施例16中所述之檢定法由cAMP產生所量測)之胰高血糖素肽的複合物。
如本文所用之胺基酸「修飾」係指胺基酸的取代、加成或刪除，且包括經20種常見於人類蛋白質中之胺基酸，以及非典型或非天然產生之胺基酸中的任一者取代或加成。在全篇申請案中，所有以數字(例如，位置28)提及之特定胺基酸位置係指在天然胰高血糖素(SEQ ID NO：1)中之該位置或在其任何類似物中之相應胺基酸位置處的胺基酸。舉例來說，文中提及「位置28」對於其中SEQ ID NO：1之第一個胺基酸經刪除的胰高血糖素類似物而言將係指相應的位置27。同樣地，文中提及「位置28」對於其中在SEQ ID NO：1之N-端之前加成一個胺基酸的胰高血糖素類似物而言將係指相應的位置29。
非典型胺基酸的商業來源包括
Sigma-Aldrich(Milwaukee,WI)、ChemPep Inc.(Miami,FL)、及Genzyme Pharmaceuticals(Cambridge,MA)。非典型胺基酸可購自商業供應商、重新合成得、或自其他胺基酸化學修飾或衍生而得。
如本文所使用之術語「天然胰高血糖素」係指由SEQ ID NO：1之序列所組成的肽，術語「天然GIP」係指由SEQ ID NO：4之序列所組成的肽，及術語「天然GLP-1」係指示GLP-1(7-36)醯胺(由SEQ ID NO：3之序列所組成)、GLP-1(7-37)酸(由SEQ ID NO：2之序列所組成)、或該兩化合物之混合物的一般術語。如本文所使用之一般在不存在任何進一步指示下的提及「胰高血糖素」或「GIP」或「GLP-1」分別係意指天然胰高血糖素或天然GIP或天然GLP-1。
如本文所使用之胺基酸「取代」係指以不同的胺基酸殘基取代一個胺基酸殘基。
如本文所使用之術語「保留性胺基酸取代」在本文係經定義為在以下五群之一者內的交換：
I.小的脂族、非極性或輕度極性殘基：
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
II.極性、帶負電殘基及其之醯胺及酯：
Asp、Asn、Glu、Gln、半胱胺磺酸及升半胱胺磺酸；
III.極性、帶正電殘基：
His、Arg、Lys；鳥胺酸(Orn)
IV.大的脂族非極性殘基：
Met、Leu、Ile、Val、Cys、正白胺酸(Nle)、升半胱胺酸
V.大的芳族殘基：
Phe、Tyr、Trp、乙醯基苯丙胺酸
如本文所使用之一般術語「聚乙二醇鏈」或「PEG鏈」係指由通式H(OCH2 CH2 )n OH所表示之環氧乙烷與水之呈分支鏈或直鏈之縮合聚合物的混合物，其中n為至少9。若不存在任何進一步的表徵，則此術語係意指包括平均總分子量選自500至40,000道耳吞之範圍之乙二醇的聚合物。「聚乙二醇鏈」或「PEG鏈」係與數字字尾結合使用以指示其之大約平均分子量。舉例來說，PEG-5,000係指具有約5,000之總分子量平均值的聚乙二醇鏈。
如本文所使用之術語「聚乙二醇化」及類似術語係指經由使聚乙二醇鏈鍵聯至化合物而自其之天然狀態經修飾的化合物。「經聚乙二醇化之胰高血糖素肽」係具有共價鍵結至胰高血糖素肽之PEG鏈的胰高血糖素肽。
如本文所使用之一般提及肽係意指涵蓋具有經修飾胺基及羧基終端的肽。舉例來說，包含醯胺基替代終端羧酸之胺基酸鏈係意指涵蓋在指示標準胺基酸的胺基酸序列內。
如本文所使用之「連接體」係使兩個個別實體彼此結合的鍵、分子或分子基團。連接體可提供兩實體的最佳間隔，或可進一步提供使兩實體可彼此隔開的不穩鍵聯。不穩鍵聯包括光可分裂基團、酸不穩定部分、鹼不穩定部分及酵素可分裂基團。
如本文所使用之「二聚體」係包含兩個透過連接體彼此共價鍵結之子單元的複合物。術語二聚體當在沒有任何修飾語下使用時係涵蓋均二聚體及雜二聚體兩者。均二聚體包含兩個相同的子單元，而雜二聚體包含兩個不同的子單元，儘管兩個子單元彼此實質上相似。
如本文所使用之術語「帶電胺基酸」係指包含在生理pH下之水溶液中帶負電(即去質子化)或帶正電(即質子化)之側鏈的胺基酸。舉例來說，帶負電的胺基酸包括天冬胺酸、麩胺酸、半胱胺磺酸、升半胱胺磺酸、及升麩胺酸，而帶正電的胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸。帶電胺基酸包括在20種常見於人類蛋白質中之胺基酸、以及非典型或非自然產生之胺基酸中的帶電胺基酸。
如本文所使用之術語「酸性胺基酸」係指包含第二個酸性部分，包括例如，羧酸或磺酸基團的胺基酸。
如本文所使用之一分子對第一受體相對於第二受體之術語「選擇性」係指以下的比：該分子對該第二受體之EC50除以該分子對該第一受體之EC50。舉例來說，對第一受體具有1 nM之EC50及對第二受體具有100 nM之EC50的分子對第一受體相對於第二受體具有100倍的選擇性。
如本文所使用之一分子的「胰高血糖素效力」係指該分子對胰高血糖素受體之EC50除以天然胰高血糖素對胰高血糖素受體之EC50的比。
如本文所使用之一分子的「GIP效力」係指該分子對GIP受體之EC50除以天然GIP對GIP受體之EC50的比。
如本文所使用之一分子的「GLP-1效力」係指該分子對GLP-1受體之EC50除以天然GLP-1對GLP-1受體之EC50的比。
如本文所使用之術語「烷基」係指含有指定碳原子數的直鏈或分支鏈烴。烷基之實例包括甲基、乙基、及直鏈丙基。
如本文所使用之術語「雜烷基」係指含有指定碳原子數及位於結構主鏈中之至少一個雜原子的直鏈或分支鏈烴。適用於此的雜原子包括，但不限於，N、S、及O。
如本文所使用之術語「環烷基」係指含有指定碳原子數的環狀烴基，例如，環丙基、環丁基、環己基、及環戊基。
如本文所使用之術語「雜環基」係指含有指定碳原子數及一至三個獨立地選自由氧、氮、及硫組成之群之雜原子的環狀烴基。雜環烷基的非限制性實例包括哌啶、四氫呋喃、四氫哌喃、二氫呋喃、啉、噻吩等。
如本文所使用之術語「芳基」係指含有指定碳原子數之單環或多環芳基，較佳為單環或雙環芳基，例如，苯基或萘基。除非另作指示，否則芳基可未經取代或經取代。
如本文所使用之術語「雜芳基」係指含有指定碳原子數及至少一個選自由氧、氮、及硫組成之群之雜原子的單環或多環芳基。除非另作指示，否則芳基可未經取代或經取代。
具體例
文中揭示之修飾允許處理胰高血糖素(SEQ ID NO：1)，以產生呈現提高之GIP活性、胰高血糖素活性、及/或GLP-1活性的胰高血糖素肽。文中揭示之其他修飾延長生成肽的半衰期、提高溶解度、或提高穩定性。文中揭示之又其他的修飾對活性沒有影響，或可不破壞一或多個期望活性而完成。提供相同目的(例如，提高GIP活性)的任何組合可個別或組合地應用。賦予增進性質的任何單一組合或其集合可個別或組合地應用，例如，提高的GIP及/或GLP-1活性可與提高的半衰期組合。
在範例具體例中，胰高血糖素肽可包含總計1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、或至多10個相對於天然胰高血糖素序列的胺基酸修飾。在一些具體例中，此等胰高血糖素肽保留至少22、23、24、25、26、27或28個天然胰高血糖素中相應位置處之天然產生之胺基酸(例如，相對於天然產生之胰高血糖素具有1-7、1-5或1-3個修飾)。在相關具體例中，1、2、3、4、5、6或更多個胺基酸修飾可為非保留性取代、加成或刪除。在一些具體例中，1、2、3、4、5、6或更多個胺基酸修飾可為保留性取代。在一些具體例中，在任意的位置2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29處進行1、2、3、4或5個非保留性取代，及在任何此等位置處進行至多5個進一步的保留性取代。在一些具體例中，在位置1-16之胺基酸內進行1、2、或3個胺基酸修飾，及在位置17-26之胺基酸內進行1、2、或3個胺基酸修飾。
影響GIP活性的修飾
對GIP受體的提高活性係藉由在位置1處之胺基酸修飾來提供。舉例來說，位置1處之His經大的芳族胺基酸，視情況為Tyr、Phe、Trp、胺基-Phe、硝基-Phe、氯-Phe、磺酸基-Phe、4-吡啶基-Ala、甲基-Tyr、或3-胺基Tyr所取代。意料之外地，位置1處之Tyr與對應於胺基酸12-29之區域內之α螺旋之穩定化的組合提供活化GIP受體以及GLP-1受體及胰高血糖素受體的胰高血糖素肽。α螺旋結構可經由，例如，形成共價或非共價分子內架橋、或以使α螺旋穩定的胺基酸(例如，α,α-二取代胺基酸)取代及/或插入在大約位置12-29處之胺基酸而穩定化。
對GIP受體的提高活性亦係藉由在位置27及/或28處，及視情況在位置29處之胺基酸修飾來提供。舉例來說，位置27處之Met係經大的脂族胺基酸(視情況為Leu)取代，位置28處之Asn係經小的脂族胺基酸(視情況為Ala)取代，及位置29處之Thr係經小的脂族胺基酸(視情況為Gly)取代。在位置27-29處以LAG取代相對於在該等位置處的天然MNT序列提供提高的GIP活性。
對GIP受體的提高活性亦係藉由在位置12處之胺基酸修飾來提供。舉例來說，位置12經大的脂族非極性胺基酸(視情況為Ile)取代。
對GIP受體的提高活性亦係藉由在位置17及/或18處之胺基酸修飾來提供。舉例來說，位置17經極性殘基(視情況為Gln)取代，及位置18經小的脂族胺基酸(視情況為Ala)取代。在位置17及18處以QA取代相對於在該等位置處的天然RR序列提供提高的GIP活性。
以上所述之提高GIP受體活性的任何修飾可個別或組合地應用。提高GIP受體活性之修飾的組合一般提供較任何單獨的該等修飾高的GIP活性。
影響胰高血糖素活性的修飾
在一些具體例中，提供具有提高效力及視情況改良之溶解度及穩定性的胰高血糖素之類似物。在一具體例中，提高的胰高血糖素效力係藉由在天然胰高血糖素(SEQ ID NO：1)之位置16處的胺基酸修飾來提供。舉非限制性的實例來說，此等提高的效力可藉由以麩胺酸或以另一具有4個原子長度之側鏈的帶負電胺基酸，或者以麩醯胺酸、升麩胺酸、或升半胱胺磺酸中之任一者、或具有含至少一個雜原子(例如，N、O、S、P)之側鏈且具約4(或3-5)個原子之側鏈長度的帶電胺基酸取代位置16處之天然產生的絲胺酸來提供。在一些具體例中，胰高血糖素肽保留其對胰高血糖素受體相對於對GLP-1受體的原始選擇性。
胰高血糖素受體活性可藉由在位置3處之胺基酸修飾來降低，例如，以酸性、鹼性、或疏水性胺基酸取代位置3處之天然產生的麩醯胺酸。舉例來說，以麩胺酸、鳥胺酸、或正白胺酸在位置3作取代實質上地降低或破壞胰高血糖素受體活性。
對胰高血糖素受體的維持或提高活性可藉由以麩醯胺酸類似物修飾位置3處之Gln而達成。舉例來說，包含位置3處之麩醯胺酸類似物的胰高血糖素肽可對胰高血糖素受體呈現天然胰高血糖素(SEQ ID NO：1)之約5%、約10%、約20%、約50%、或約85%或以上的活性。在一些具體例中，包含位置3處之麩醯胺酸類似物的胰高血糖素肽可對胰高血糖素受體呈現除了位置3處之經修飾胺基酸外具有與包含麩醯胺酸類似物之肽相同之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：250或SEQ ID NO：251)之相應胰高血糖素肽之約20%、約50%、約75%、約100%、約200%或約500%或以上的活性。在一些具體例中，包含位置3處之麩醯胺酸類似物的胰高血糖素肽對胰高血糖素受體呈現提高的活性，但該提高的活性不多於天然胰高血糖素或除了位置3處之經修飾胺基酸外具有與包含麩醯胺酸類似物之肽相同之胺基酸序列之相應胰高血糖素肽之活性的1000%、10,000%、100,000%、或1,000,000%。
在一些具體例中，麩醯胺酸類似物係包含結構I、II或III之側鏈之天然產生或非天然產生的胺基酸：
其中R1 係C0-3 烷基或C0-3 雜烷基；R2 係NHR4 或C1-3 烷基；R3 係C1-3 烷基；R4 係H或C1-3 烷基；X係NH、O、或S；及Y係NHR4 、SR3 、或OR3 。在一些具體例中，X係NH或Y係NHR4 。在一些具體例中，R1 係C0-2 烷基或C1 雜烷基。在一些具體例中，R2 係NHR4 或C1 烷基。在一些具體例中，R4 係H或C1 烷基。在範例具體例中，提供包含結構I之側鏈的胺基酸，其中R1 係CH2 -S，X係NH，及R2 係CH3 (乙醯胺甲基-半胱胺酸,C(Acm))；R1 係CH2 ，X係NH，及R2 係CH3 (乙醯二胺基丁酸,Dab(Ac))；R1 係C0 烷基，X係NH，R2 係NHR4 ，及R4 係H(胺甲醯基二胺基丙酸，Dap(脲))；或R1 係CH2 -CH2 ，X係NH，及R2 係CH3 (乙醯基鳥胺酸，Orn(Ac))。在範例具體例中，提供包含結構II之側鏈的胺基酸，其中R1 係CH2 ，Y係NHR4 ，及R4 係CH3 (甲基麩醯胺酸，Q(Me))；在範例具體例中，提供包含結構III之側鏈的胺基酸，其中R1 係CH2 及R4 係H(甲硫胺酸-亞碸，M(O))；在特定具體例中，位置3處之胺基酸經Dab(Ac)取代。舉例來說，胰高血糖素激動劑可包含SEQ ID NO：243-248、250、251、及253-256中任一者之胺基酸序列。
影響GLP-1活性之修飾
對GLP-1受體的提高活性係藉由以電荷中性基團(諸如醯胺或酯)取代C-端胺基酸之羧酸來提供。
對GLP-1受體的提高活性亦係藉由使胰高血糖素之C-端部分(大約胺基酸12-29)中之α螺旋結構穩定來提供，例如，透過在兩個胺基酸之側鏈之間形成分子內架橋，或在大約位置12-29處之胺基酸中以使α螺旋穩定之胺基酸(例如，α,α-二取代胺基酸)取代及/或插入。此等胺基酸之側鏈可透過氫鍵結或離子交互作用(諸如形成鹽橋)，或經由共價鍵而彼此鍵聯。在一些具體例中，架橋係形成於間隔三個插入胺基酸的胺基酸之間(即位置「i」 處之胺基酸與位置「i+4」處之胺基酸，其中i係自12至25之任何整數(例如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25))。在範例具體例中，胺基酸對12及16、13及17、16及20、17及21、20及24或24及28(其中i=12、16、20、或24之胺基酸對)之側鏈彼此鍵聯，因此使胰高血糖素之α螺旋穩定化。
在其他具體例中，架橋係形成於間隔兩個插入胺基酸的胺基酸之間，即位置「j」處之胺基酸與位置「j+3」處之胺基酸，其中j係12至26之任何整數(例如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26)。在範例具體例中，j係17。在其他具體例中，架橋係形成於間隔六個插入胺基酸的胺基酸之間，即位置「k」處之胺基酸與位置「k+7」處之胺基酸，其中k係12至22之任何整數(例如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22)。在一具體例中，k係17。
在一些具體例中，架橋或連接體之長度係約8(或約7-9)個原子，尤其係當架橋係在位置i與i+4之間時。在一些具體例中，架橋或連接體之長度係約6(或約5-7)個原子，尤其係當架橋係在位置j與j+3之間時。
在一些具體例中，分子內架橋係藉由下列方式形成：(a)以麩胺酸或以另一具有4個原子長度之側鏈的帶負電胺基酸，或者以麩醯胺酸、升麩胺酸、或升半胱胺磺酸中之任一者、或具有含至少一個雜原子(例如，N、O、S、P)之側鏈且具約4(或3-5)個原子之側鏈長度的帶電胺基酸取代位置16處之天然產生的絲胺酸，及(b)以另一具有帶電或具有氫鍵結能力，且長度至少約5(或約4-6)個原子之側鏈的親水性胺基酸(例如，離胺酸、瓜胺酸、精胺酸、或鳥胺酸)取代位置20處之天然產生的麩醯胺酸。位置16及20處之此等胺基酸的側鏈可形成鹽橋或可共價鍵聯。
在一具體例中，兩個胺基酸彼此鍵結形成內醯胺環。內醯胺環的大小可視胺基酸側鏈的長度而異，且在一具體例中，內醯胺係經由使離胺酸胺基酸之側鏈鍵聯至麩胺酸側鏈而形成。內醯胺環中之醯胺鍵的次序可顛倒(例如，內醯胺環可在Lys12與Glu16或者在Glu 12與Lys16之側鏈之間形成)。
在一些具體例中，胰高血糖素肽之C-端部分中之α螺旋結構的穩定化係透過形成除內醯胺橋外的分子內架橋而達成。舉例來說，合適的共價鍵結方法包括烯烴複分解、基於羊毛硫胺酸之環化、二硫化物橋或經修飾含硫橋形成、使用α,ω-二胺基烷繫鏈、形成金屬-原子橋中之任何一或多者，及使用其他的肽環化方式於使α螺旋穩定化。
對GLP-1受體之效力可進一步藉由對位置18處之天然精胺酸的丙胺酸取代而提高。
上文所述之提高GLP-1受體活性的任何修飾可個別或組合地應用。提高GLP-1受體活性之修飾的組合一般提供較任何單獨的該等修飾高的GLP-1活性。舉例來說，本發明提供包含在位置16、位置20、及C-端羧酸基處之修飾，視情況並具有在位置16及20處之胺基酸之間之共價鍵的胰高血糖素肽；包含在位置16及C-端羧酸基處之修飾的胰高血糖素肽；包含在位置16及20處之修飾，視情況並具有在位置16及20處之胺基酸之間之共價鍵的胰高血糖素肽；及包含在位置20及C-端羧酸基處之修飾的胰高血糖素肽。
GLP-1活性可藉由包含以下各項而降低：(i)C-端α羧酸酯基，(ii)以不含羥基的胺基酸(例如，Abu或Ile)取代位置7處之Thr，(iii)刪除位置27或28處之胺基酸C-端的胺基酸(例如，刪除位置28處之胺基酸，刪除位置28及29處之胺基酸)，而產生27或28個胺基酸長度的肽，或(iv)其之組合。
影響胰高血糖素、GLP-1、及GIP受體各者活性之修飾
對胰高血糖素受體、GLP-1受體、及GIP受體各者之提高活性係藉由以下各項而提供：(i)以式IV之胺基酸對位置16處之Ser作胺基酸取代：
其中n係1至16、或1至10、或1至7、或1至6、或2至6、或2或3或4或5，R1 及R2 各係獨立地選自由以下基團組成之群：H、C1 -C18 烷基、(C1 -C18 烷基)OH、(C1 -C18 烷基)NH2 、(C1 -C18 烷基)SH、(C0 -C4 烷基)(C3 -C6 )環烷基、(C0 -C4 烷基)(C2 -C5 雜環基)、(C0 -C4 烷基)(C6 -C10 芳基)R7 、及(C1 -C4 烷基)(C3 -C9 雜芳基)，其中R7 係H或OH，及式IV之胺基酸的側鏈包含自由胺基，及(ii)位置20處之Gln經α,α-二取代胺基酸(例如，AIB)作胺基酸取代。在一些具體例中，位置16處之胺基酸係Orn、Dab、Lys、或升Lys，及位置20處之胺基酸係AIB。在特定具體例中，位置16處之胺基酸係Lys，及位置20處之胺基酸係AIB。
在位置16處包含式IV之胺基酸及在位置20處包含α,α-二取代胺基酸之類似物對各胰高血糖素受體、GLP-1受體、及GIP受體之活性可藉由延長肽之長度(例如，藉由將長度(例如)約1-21、約9至21、約6-18、約9-12、或約10或11個胺基酸融合至C-端延伸肽)而進一步提高。在一些具體例中，C-端係藉由融合至GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：95)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：96)而延長，其中X係Gly或小的脂族或非極性或輕度極性胺基酸。在替代具體例中，C-端係藉由融合至GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：95)而延長，且將1-11個胺基酸融合至GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：95)之C-端。舉例來說，類似物之C-端延伸可包含GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：95)接著1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11個位在SEQ ID NO：95之C-端的額外胺基酸。該1-11個額外胺基酸可為，例如，小的脂族胺基酸，諸如Ala。在此方面，C-端延伸可，例如，包含GPSSGAPPPSAm 之胺基酸序列，其中m係1至11。
GIP活性、基於胰高血糖素之類似物(包括含有位於位置16處之式IV胺基酸及位於位置20處之α,α-二取代胺基酸之類似物)對各胰高血糖素、GLP-1、及GIP受體之活性的提高可進一步在位於C-端延伸內或C-端胺基酸(例如，加成至C-端延伸之C-端的胺基酸)處之胺基酸的醯化或烷化後達成。醯化或烷化可係位在，例如，C-端延伸類似物之位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、及50之任一者處的胺基酸。在一些具體例中，經醯化或烷化的胺基酸係位在C-端延伸類似物之位置37、38、39、40、41、42、或43處。在一些具體例中，經醯化或烷化的胺基酸係連接至醯基或烷基(例如，C10-C22)之式I、II、或III的胺基酸，例如，Lys。在某些具體例中，Lys係位在由SEQ ID NO：95組成之C-端延伸的C-端，以致Lys、Dab、Orn、或升Lys係位在類似物的位置40處。視情況，C-端延伸肽亦經聚乙二醇化，例如，在文中所述的任何位置處(例如，位置24)。
此外，GIP活性、基於胰高血糖素之類似物對各胰高血糖素、GLP-1、及GIP受體之活性的提高可藉由透過間隔物(例如，胺基酸、二肽、三肽、親水性雙官能間隔物、疏水性雙官能間隔物)將胺基酸醯化或烷化而達成。在一些具體例中，GIP活性、基於胰高血糖素之類似物包含透過一間隔物的醯基或烷基，該間隔物係連接至類似物之位置10處之胺基酸的側鏈。在其他具體例中，類似物包含在位置29處之胺基酸C-端之1至21個胺基酸的C-端延伸(例如，包含SEQ ID NO：95或96之胺基酸序列的延伸)及間隔物，該間隔物係共價連接至醯基或烷基，在對應於相對於SEQ ID NO：1之位置37-43之一者的位置處連接至該延伸之一胺基酸。在特定具體例中，間隔物係連接至相對於SEQ ID NO：1之位置40處的胺基酸。在某些具體例中，間隔物之長度為3至10個原子。在特定態樣中，間隔物及醯基或烷基之總長度為約14至約28個原子長度。舉例來說，間隔物可為胺基酸，包括，但不限於，文中所述之任何胺基酸。此外，例如，間隔物可為包含文中所述之胺基酸的二肽或三肽。在特定態樣中之間隔物為以下二肽中之一者：Ala-Ala、βAla-βAla、或γGlu-γGlu。用於提高對胰高血糖素、GLP-1、及GIP受體中之一或多者之活性的額外適當間隔物將進一步說明於文中。
改善DPP-IV抗性的修飾
位置1及/或2處之修飾可提高肽對二肽基肽酶IV(DPP IV)分裂的抗性。舉例來說，位置2處之胺基酸可經D-絲胺酸、D-丙胺酸、纈胺酸、甘胺酸、N-甲基絲胺酸、N-甲基丙胺酸、或胺基異丁酸取代。在一些具體例中，位置1處之胺基酸可經D-組胺酸、脫胺基組胺酸、羥基組胺酸、乙醯基組胺酸、升組胺酸、N-甲基組胺酸、α-甲基組胺酸、咪唑乙酸、或α,α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)取代。
經觀察到位置2處之修飾(例如，位置2處之AIB)及在一些情況中在位置1處之修飾(例如，位置1處之DMIA)可降低胰高血糖素活性，有時係顯著地；令人驚奇地，此胰高血糖素活性的降低可藉由使胰高血糖素之C-端部分(大約胺基酸12-29)中之α螺旋結構穩定而回復，例如，如文中所述透過在兩胺基酸之側鏈之間形成共價鍵。在一些具體例中，共價鍵係位在位置「i」及「i+4」、或位置「j」及「j+3」處之胺基酸之間，例如，在位置12及16、16及20、20及24、24及28、或17及20之間。在範例具體例中，此共價鍵係在位置16處之麩胺酸與位置20處之離胺酸之間的內醯胺橋。在一些具體例中，此共價鍵係除內醯胺橋外的分子內架橋。舉例來說，合適的共價鍵結方法(即形成共價分子內架橋之方式)包括烯烴複分解、基於羊毛硫胺酸之環化、二硫化物橋或經修飾含硫橋形成、使用α,ω-二胺基烷繫鏈、形成金屬-原子橋、及其他肽環化方式中之任何一或多者。
降低降解的修飾
在又進一步的範例具體例中，任何的胰高血糖素肽可進一步經修飾，以經由修飾SEQ ID NO：1之位置15及/或16處之胺基酸來改良穩定性，而降低肽隨時間的降解，尤其係於酸性或鹼性緩衝液中。此等修飾降低Asp15-Ser16肽鍵的分裂。在範例具體例中，位置15處之胺基酸修飾係將Asp刪除或以麩胺酸、升麩胺酸、半胱胺磺酸或升半胱胺磺酸取代。在其他範例具體例中，位置16處之胺基酸修飾係將Ser刪除或以Thr或AIB取代。在其他範例具體例中，位置16處之Ser係經麩胺酸或經另一具有4個原子長度之側鏈的帶負電胺基酸，或者經麩醯胺酸、升麩胺酸、或升半胱胺磺酸中之任一者取代。
在一些具體例中，存在於天然肽之位置27處之甲硫胺酸殘基係(例如)經由刪除或取代而作修飾。此等修飾可防止肽的氧化性降解。在一些具體例中，位置27處之Met係經白胺酸、異白胺酸或正白胺酸取代。在一些特定具體例中，位置27處之Met係經白胺酸或正白胺酸取代。
在一些具體例中，位置20及/或24處之Gln係(例如)經由刪除或取代而作修飾。此等修飾可降低透過Gln之脫醯胺而發生的降解。在一些具體例中，位置20及/或24處之Gln係經Ala或AIB取代。在一些具體例中，位置20及/或24處之Gln係經Lys、Arg、Orn、或瓜胺酸取代。
在一些具體例中，位置21處之Asp係(例如)經由刪除或取代而作修飾。此等修飾可降低透過Asp之脫水形成環狀琥珀醯亞胺中間體隨後再異構化成異天冬胺酸酯而發生的降解。在一些具體例中，位置21係經Glu、升麩胺酸或升半胱胺磺酸取代。在一些特定具體例中，位置21係經Glu取代。
其他修飾
天然胰高血糖素肽之一些位置可經修飾，同時仍維持母肽的至少一些活性。因此，申請人預期位在位置2、5、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29之位置處的一或多個胺基酸可經不同於天然胰高血糖素肽中所存在者的胺基酸取代，且仍維持對胰高血糖素受體的活性。
在一些具體例中，位置18係經選自由Ala、Ser、或Thr組成之群之胺基酸取代。在一些具體例中，位置20處之胺基酸係經Ser、Thr、Lys、Arg、Orn、瓜胺酸或AIB取代。在一些具體例中，位置21係經Glu、升麩胺酸或升半胱胺磺酸取代。在一些具體例中，胰高血糖素肽包含1至10個選自位置16、17、18、20、21、23、24、27、28及29的胺基酸修飾。在範例具體例中，該等修飾係一或多個選自由Gln17、Ala18、Glu21、Ile23、Ala24、Val27及Gly29組成之群的胺基酸取代。在一些具體例中，1至2個選自位置17-26之胺基酸不同於母肽。在其他具體例中，1至2個選自位置17-22之胺基酸不同於母肽。在又其他的具體例中，該等修飾係Gln17、Ala18、Glu21、Ile23及Ala24。
在一些具體例中，將一或多個胺基酸加成至胰高血糖素肽之羧基端。胺基酸典型上係選自20種常見胺基酸中之一者，且在一些具體例中，胺基酸具有替代天然胺基酸之羧酸的醯胺基。在範例具體例中，加成的胺基酸係選自由麩胺酸及天冬胺酸及甘胺酸組成之群。
其他不會破壞活性的修飾包括W10或R20。
在一些具體例中，文中揭示之胰高血糖素肽係經由將C-端截去一或兩個胺基酸殘基作修飾，但仍維持對胰高血糖素、GLP-1及/或GIP受體的相似活性及效力。在此方面，可將位置29及/或28處之胺基酸刪除。
使α螺旋結構穩定化
使胰高血糖素肽之C-端部分(大約胺基酸12-29)中之α螺旋結構穩定化提供提高的GLP-1及/或GIP活性，及回復經由位置1及/或2處之胺基酸修飾而降低的胰高血糖素活性。α螺旋結構可藉由，例如，形成共價或非共價分子內架橋，或將大約位置12-29處之胺基酸以使α螺旋穩定的胺基酸(例如，α,α-二取代胺基酸)取代及/或插入而穩定。
在一些具體例中，在兩個胺基酸側鏈之間形成分子內架橋，以使胰高血糖素肽之羧基端部分(例如，胺基酸12-29)的三維結構穩定。兩個胺基酸側鏈可透過非共價鍵(例如，氫鍵結)、離子交互作用(諸如形成鹽橋)、或藉由共價鍵彼此鍵聯。當兩個胺基酸側鏈透過一或多個共價鍵彼此鍵聯時，該肽在此可被視為包含共價分子內架橋。當兩個胺基酸側鏈透過非共價鍵(例如，氫鍵、離子交互作用)彼此鍵聯時，該肽在此可被視為包含非共價分子內架橋。
在一些具體例中，分子內架橋係在隔開3個胺基酸的兩胺基酸(例如，位置i及i+4處之胺基酸)之間形成，其中i係在12及25間的任何整數(例如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、及25)。更特定而言，胺基酸對12及16、16及20、20及24或24及28(其中i=12、16、20、或24之胺基酸對)之側鏈彼此鍵聯，因此使胰高血糖素之α螺旋穩定化。或者，i可為17。
在一些特定具體例中，其中位置i及i+4處之胺基酸係藉由分子內架橋結合，連接體之大小係約8個原子，或約7-9個原子。
在其他具體例中，分子內架橋係在隔開兩個胺基酸的兩胺基酸(例如，位置j及j+3處之胺基酸)之間形成，其中j係在12及26間的任何整數(例如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、及26)。在一些特定具體例中，j係17。
在一些特定具體例中，其中位置j及j+3處之胺基酸係藉由分子內架橋結合，連接體之大小係約6個原子，或約5至7個原子。
在又其他的具體例中，分子內架橋係在隔開6個胺基酸的兩胺基酸(例如，位置k及k+7處之胺基酸)之間形成，其中k係在12及22間的任何整數(例如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21及22)。在一些特定具體例中，k係12、13、或17。在一範例具體例中，k係17。
可共價鍵結形成六原子鍵聯橋之胺基酸配對的實例包括Orn與Asp、Glu與式I之胺基酸(其中n為2)、及升麩胺酸與式I之胺基酸(其中n為1)，其中式I為：
可共價鍵結形成七原子鍵聯橋之胺基酸配對的實例包括Orn-Glu(內醯胺環)；Lys-Asp(內醯胺)；或Homoser-Homoglu(內酯)。可形成八原子連接體之胺基酸配對的實例包括Lys-Glu(內醯胺)；Homolys-Asp(內醯胺)；Orn-Homoglu(內醯胺)；4-胺基Phe-Asp(內醯胺)；或Tyr-Asp(內酯)。可形成九原子連接體之胺基酸配對的實例包括Homolys-Glu(內醯胺)；Lys-Homoglu(內醯胺)；4-胺基Phe-Glu(內醯胺)；或Tyr-Glu(內酯)。此等胺基酸上之任何側鏈可額外地經額外的化學基團取代，只要α-螺旋的三維結構不會遭破壞即可。熟悉技藝人士可設想將可產生類似大小及期望效果之穩定化結構之另類的配對或另類的胺基酸類似物，包括經化學修飾的衍生物。舉例來說，升半胱胺酸-升半胱胺酸二硫化物橋係6個原子長度，且可進一步經修飾以提供期望效果。即使沒有共價鍵聯，上述的胺基酸配對或熟悉技藝人士可設想的類似配對亦可透過非共價鍵，例如，透過形成鹽橋或氫鍵結交互作用，而對α-螺旋提供增加的穩定性。
內醯胺環的大小可視胺基酸側鏈的長度而異，且在一具體例中，內醯胺係經由使離胺酸胺基酸之側鏈鍵聯至麩胺酸側鏈而形成。其他的範例具體例包括視情況具有內醯胺橋的以下配對：位置12處之Glu與位置16處之Lys；位置12處之天然Lys與位置16處之Glu；位置16處之Glu與位置20處之Lys；位置16處之Lys與位置20處之Glu；位置20處之Glu與位置24處之Lys；位置20處之Lys與位置24處之Glu；位置24處之Glu與位置28處之Lys；位置24處之Lys與位置28處之Glu。或者，內醯胺環中之醯胺鍵的次序可顛倒(例如，內醯胺環可在Lys12與Glu16或者在Glu 12與Lys16之側鏈之間形成)。
可使用除內醯胺橋外之分子內架橋於使胰高血糖素類似物肽的α螺旋穩定化。在一具體例中，分子內架橋係疏水性橋。在此情況，分子內架橋視情況係位在作為胰高血糖素類似物肽之α螺旋之疏水面之部分的兩胺基酸之側鏈之間。舉例來說，經由疏水性橋結合的其中一個胺基酸可係在位置10、14、及18處之胺基酸。
在一特定態樣中，使用烯烴複分解於利用全烴交聯系統交聯胰高血糖素肽之α螺旋的一或兩匝。此情況中的胰高血糖素肽可包含帶有不同長度之烯烴側鏈且經組態成具有位於i及i+4或i+7位置處之R或S立體化學性的α-甲基化胺基酸。舉例來說，烯烴側鏈可包含(CH2 )n，其中n係1至6間之任何整數。在一具體例中，對於8個原子之交聯長度，n係3。形成此等分子內架橋的適當方法說明於技藝中。參見，例如，Schafmeister等人，J.A m.Chem.Soc .122：5891-5892(2000)及Walensky等人，Science 305：1466-1470(2004)。或者，胰高血糖素肽可包含位在透過釕催化之閉環複分解作用橋連在一起之相鄰螺旋匝上的O -烯丙基Ser殘基。此等交聯程序說明於，例如，Blackwell等人，Angew,Chem.,Int.Ed .37：3281-3284(1998)中。
在另一特定態樣中，使用非天然的硫-二丙胺酸胺基酸、經廣泛採用作為胱胺酸之擬肽類的羊毛硫胺酸來交聯α螺旋之一匝。基於羊毛硫胺酸之環化反應的適當方法係技藝中所知曉。參見，例如，Matteucci等人，Tetrahedron Letters 45：1399-1401(2004)；Mayer等人，J.Peptide Res .51：432-436(1998)；Polinsky等人，J.Med.Chem .35：4185-4194(1992)；Osapay等人，J.Med.Chem .40：2241-2251(1997)；Fukase等人，Bull.Chem.Soc.Jpn .65：2227-2240(1992)；Harpp等人，J.Org.Chem .36：73-80(1971)；Goodman及Shao，Pure Appl.Chem. 68：1303-1308(1996)；及Osapay及Goodman，J.Chem.Soc.Chem.Commun .1599-1600(1993)。
在一些具體例中，使用位在位置i及i+7處之兩Glu殘基之間的α,ω-二胺基烷繫鏈(例如，1,4-二胺基丙烷及1,5-二胺基戊烷)來使胰高血糖素肽之α螺旋穩定化。此等繫鏈視二胺基烷繫鏈之長度而導致形成長度9個原子或以上的橋。產生經此等繫鏈交聯之肽的適當方法說明於技藝中。參見，例如，Phelan等人，J.Am.Chem.Soc .119：455-460(1997)。
在本發明之又另一具體例中，使用二硫化物橋於交聯胰高血糖素肽之α螺旋的一或兩匝。或者，使用其中一或兩個硫原子經導致同電子排列巨環化(isosteric macrocyclization)之亞甲基置換的經修飾二硫化物橋於使胰高血糖素肽之α螺旋穩定化。以二硫化物橋或硫基環化作用修飾肽的適當方法說明在，例如，Jackson等人，J.Am.Chem.Soc .113：9391-9392(1991)及Rudinger及Jost，Experientia 20：570-571(1964)中。
在又另一具體例中，胰高血糖素肽之α螺旋係透過藉由位在i及i+4之兩個His殘基或His及Cys對結合金屬原子而穩定化。金屬原子可為，例如，Ru(III)、Cu(II)、Zn(II)、或Cd(II)。此等基於金屬結合之α螺旋穩定化的方法係技藝中所知曉。參見，例如，Andrews及Tabor，Tetrahedron 55：11711-11743(1999)；Ghadiri等人，J.Am.Chem.Soc .112：1630-1632(1990)；及Ghadiri等人，J.Am.Chem.Soc .119：9063-9064(1997)。
或者，胰高血糖素肽之α螺旋可透過其他的肽環化方式穩定化，該等方式於Davies，J.Peptide.Sci .9：471-501(2003)中作回顧。α螺旋可透過形成醯胺橋、硫醚橋、硫酯橋、脲橋、胺基甲酸酯橋、磺醯胺橋等而穩定化。舉例來說，可在C-端與Cys殘基之側鏈之間形成硫酯橋。或者，可透過具有硫醇之胺基酸(Cys)及具有羧酸之胺基酸(例如，Asp、Glu)之側鏈形成硫酯。在另一方法中，交聯體，諸如二羧酸，例如栓酸(辛二酸)等，可在胺基酸側鏈之兩官能基(諸如自由胺基、羥基、硫醇基、及其組合)之間引入鍵聯。
根據一具體例，胰高血糖素肽之α螺旋係透過在位置i及i+4處加入疏水性胺基酸而穩定化。比方說，i可為Tyr及i+4可為Val或Leu；i可為Phe及i+4可為Cys或Met；I可為Cys及i+4可為Met；或i可為Phe及i+4可為Ile。應明瞭對於此處之目的，以上的胺基酸配對可顛倒，以致在位置i處之指示胺基酸可替代地位在i+4處，而i+4胺基酸可位在i位置處。
根據本發明之其他具體例，α螺旋係透過在胰高血糖素肽之C-端部分(大約胺基酸12-29)加入(藉由胺基酸取代或插入)一或多個使α螺旋穩定之胺基酸而穩定化。在一特定具體例中，使α螺旋穩定之胺基酸係α,α-二取代胺基酸，包括，但不限於，胺基異丁酸(AIB)、經選自甲基、乙基、丙基、及正丁基之相同或不同基團、或經環辛烷或環庚烷二取代的胺基酸(例如，1-胺基環辛烷-1-羧酸)中之任一者。在一些具體例中，胰高血糖素肽之位置16、17、18、19、20、21、24或29中之一、二、三、四或更多個經α,α-二取代胺基酸取代。在一特定具體例中，位置16、20、21、及24中之一、二、三個或全部經α,α-二取代胺基酸(例如，AIB)取代。舉例來說，胰高血糖素肽可包含在不存在分子內架橋，例如，非共價分子內架橋(例如，鹽橋)或共價分子內架橋(例如，內醯胺)下之位置16經AIB的取代。此等不含分子內架橋之肽有容易製備的優點。
根據一些具體例，不含分子內架橋之胰高血糖素肽包含於胺基酸位置12-29內之一或多個經α,α-二取代胺基酸的取代及共價連接至胰高血糖素肽之胺基酸(例如，胰高血糖素肽之位置10或40處之胺基酸)之側鏈的醯基或烷基。在特定具體例中，醯基或烷基對於天然產生之胺基酸係非天然的。在某些態樣中，醯基或烷基對於位置10處之胺基酸係非天然的。此等不含分子內架橋之經醯化或烷化的胰高血糖素肽相較於未經醯化的相對肽對GLP-1及胰高血糖素受體呈現提高的活性。對GLP-1及胰高血糖素受體之活性的進一步提高可藉由不含分子內架橋之經醯化的胰高血糖素肽經由在醯基或烷基與肽之位置10或40處之胺基酸之側鏈之間加入間隔物而達成。加入或不加入間隔物之醯化及烷化將進一步說明於文中。
在特定具體例中，經醯化或烷化的胰高血糖素肽或其類似物進一步包含選擇性地降低對GLP-1受體之活性的修飾。舉例來說，經醯化或烷化的胰高血糖素肽或其類似物包含下列之一者或一組合：C-端α羧酸酯、刪除位置27或28處之胺基酸C-端的胺基酸(例如，刪除位置29處之胺基酸、刪除位置28及29處之胺基酸)、以大的脂族非極性胺基酸(例如，Ile)取代位置7處之Thr。在一些具體例中，位置16或位置20係經α,α-二取代胺基酸(例如，AIB)取代。在一些具體例中，位置20係經α,α-二取代胺基酸(例如，AIB)取代。在某些具體例中，位置20係經α,α-二取代胺基酸(例如，AIB)取代，及位置16係經式IV之胺基酸取代
其中n係1至16、或1至10、或1至7、或1至6、或2至6、或2或3或4或5，R1 及R2 各係獨立地選自由以下基團組成之群：H、C1 -C18 烷基、(C1 -C18 烷基)OH、(C1 -C18 烷基)NH2 、(C1 -C18 烷基)SH、(C0 -C4 烷基)(C3 -C6 )環烷基、(C0 -C4 烷基)(C2 -C5 雜環基)、(C0 -C4 烷基)(C6 -C10 芳基)R7 、及(C1 -C4 烷基)(C3 -C9 雜芳基)，其中R7 係H或OH，及式IV之胺基酸的側鏈包含自由胺基。在特定具體例中，式IV之胺基酸係2,3-二胺基丙酸(DAP)、2,4-二胺基丁酸(DAB)、Orn、Lys或升Lys。位置16處之式IV胺基酸與α,α-二取代胺基酸之組合有利地對各胰高血糖素、GLP-1、及GIP受體提供改良的活性。
親水性部分之鍵聯
在另一具體例中，文中揭示之胰高血糖素肽的溶解度係藉由親水性部分對肽的共價鍵聯而提高。親水性部分可在用於使蛋白質與活化聚合物分子反應的任何適當條件下連接至胰高血糖素肽。可對目標化合物上之反應性基團(例如，醛、胺基、酯、硫醇、α-鹵乙醯基、順丁烯二醯亞胺基或肼基)使用技藝中知曉的任何方式，包括透過醯化、還原烷化、麥可加成(Michael addition)、硫醇烷化或其他透過在PEG部分上之反應性基團(例如，醛、胺基、酯、硫醇、α-鹵乙醯基、順丁烯二醯亞胺基或肼基)的化學選擇性共軛/連接方法。可用來將水溶性聚合物鍵聯至一或多個蛋白質的活化基團包括，但不限於，碸、順丁烯二醯亞胺、巰基、硫醇、三氟甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯、吖環丙烷、環氧乙烷、5-吡啶基、及α-鹵化醯基(例如，α-碘乙酸、α-溴乙酸、α-氯乙酸)。若藉由還原烷化連接至肽，則所選擇之聚合物應具有單一的反應性醛，以致可控制聚合度。參見，例如，Kinstler等人，Adv.Drug.Delivery Rev .54：477-485(2002)；Roberts等人，Adv.Drug Delivery Rev .54：459-476(2002)；及Zalipsky等人，Adv.Drug Delivery Rev .16：157-182(1995)。
在本發明之一特定態樣中，在具有硫醇之胰高血糖素肽上之胺基酸殘基係經諸如PEG的親水性部分修飾。在一些具體例中，硫醇係於麥可加成反應中經順丁烯二醯亞胺-活化PEG修飾，而產生以下所示之包含硫醚鍵聯的經聚乙二醇化肽：
在一些具體例中，硫醇係於親核取代反應中經鹵乙醯基-活化PEG修飾，而產生以下所示之包含硫醚鍵聯的經聚乙二醇化肽：
適當的親水性部分包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇(例如，POG)、聚氧乙基化山梨糖醇、聚氧乙基化葡萄糖、聚氧乙基化甘油(POG)、聚氧伸烷基、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇之共聚物、單甲氧-聚乙二醇、單-(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇、羧甲基纖維素、聚縮醛、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二、聚-1,3,6-三、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚(β-胺基酸)(均聚物或無規共聚物)、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物(PPG)及其他聚氧化烯、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、結腸酸(colonic acid)或其他多醣聚合物、聚蔗糖(Ficoll)或聚葡萄糖及其混合物。
根據一些具體例，親水性部分(例如，聚乙二醇鏈)具有選自約500至約40,000道耳吞之範圍的分子量。在一具體例中，親水性部分(例如，PEG)具有選自約500至約5,000道耳吞，或約1,000至約5,000道耳吞之範圍的分子量。在另一具體例中，親水性部分(例如，PEG)具有約10,000至約20,000道耳吞之分子量。在又其他的範例具體例中，親水性部分(例如，PEG)具有約20,000至約40,000道耳吞之分子量。
在一具體例中，使用聚葡萄糖作為親水性部分。聚葡萄糖係主要經由α1-6鍵聯連接之葡萄糖子單元的多醣聚合物。聚葡萄糖可以許多分子量範圍取得，例如，約1 kD至約100 kD，或約5、10、15或20 kD至約20、30、40、50、60、70、80或90 kD。
涵蓋線性或分支鏈聚合物。所得的結合物之製劑基本上可為單分散或多分散，且可具有每個肽約0.5、0.7、1、1.2、1.5或2個聚合物部分。
在一具體例中，親水性部分係聚乙二醇(PEG)鏈，其視情況鍵聯至位置16、17、21、24、29、C-端延伸內之位置(例如，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39)、或C-端胺基酸(例如，40)中之一或多處的肽。在一些具體例中，該位置處之天然胺基酸係經具有適合於與親水性部分交聯之側鏈的胺基酸取代，以利於親水性部分鍵聯至肽。在範例具體例中，該位置處之天然胺基酸係經Lys、CyS、Orn、升半胱胺酸、或乙醯基-苯丙胺酸殘基取代。在其他具體例中，將經修飾成包含親水性基團的胺基酸加成至肽的C-端。
其他提高溶解度的修飾
在另一具體例中，任何胰高血糖素肽之溶解度可藉由將帶電胺基酸引入至肽之C-端部分(較佳係在SEQ ID NO：1之位置27 C-端之位置處)的胺基酸取代及/或加成而改良。視情況，可將一、二或三個帶電胺基酸引入C-端部分內，較佳係位置27之C-端。在一些具體例中，位置28及/或29處之天然胺基酸係經一或兩個帶電胺基酸取代，及/或在再一具體例中，亦將一至三個帶電胺基酸加成至肽之C-端。在範例具體例中，帶電胺基酸中的一個、兩個或全部係帶負電。在一些具體例中，帶負電(酸性胺基酸)係天冬胺酸或麩胺酸。
可對胰高血糖素肽進行仍使其可保留GIP活性(及視情況GLP-1活性及/或胰高血糖素活性)之額外的修飾(例如，保留性取代)。
結合物及融合物
本揭示案亦涵蓋其中本發明之胰高血糖素肽視情況透過共價鍵結及視情況透過連接體鍵聯至結合物部分的其他結合物。鍵聯可藉由共價化學鍵、物理力諸如靜電、氫、離子、凡得瓦(van der Waals)、或疏水性或親水性交互作用完成。可使用各種非共價偶合系統，包括生物素-抗生物素蛋白質(avidin)、配體/受體、酵素/基質、核酸/核酸結合蛋白、脂質/脂質結合蛋白、細胞黏附分子伴體；或對於彼此具有親和力的其之任何結合伴體或片段。
肽可經由使肽之目標胺基酸殘基與可與此等目標胺基酸之N-或C-端殘基之選定側鏈反應之有機衍生化試劑而透過直接共價鍵聯連接至結合物部分。肽或結合物上之反應性基團包括，例如，醛、胺基、酯、硫醇、α-鹵乙醯基、順丁烯二醯亞胺基或肼基。衍生化試劑包括，例如，順丁烯二醯亞胺苯甲醯基磺酸琥珀醯亞胺酯(透過半胱胺酸殘基結合)、N-羥基琥珀醯亞胺(透過離胺酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐或其他技藝中知曉之試劑。或者，結合物部分可間接地透過中間載體(諸如多醣或多肽載體)鍵聯至肽。多醣載體的實例包括胺基聚葡萄糖。合適多肽載體的實例包括聚離胺酸、聚麩胺酸、聚天冬胺酸、其之共聚物、及此等胺基酸與其他胺基酸(例如，絲胺酸)之混合聚合物，以在所得負載載體上賦予期望的溶解度性質。
半胱胺酸基殘基最常與α-鹵乙酸酯(及相應的胺)，諸如氯乙酸、氯乙醯胺反應，而產生羧甲基或羧醯胺甲基衍生物。半胱胺酸基殘基亦經由與以下物質反應而衍生化：溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-亞胺醯基)丙酸、氯乙醯基磷酸酯、N-烷基順丁烯二醯亞胺、3-硝基-2-吡啶二硫、甲基2-吡啶二硫、對氯汞苯甲酸鹽、2-氯汞-4-硝基酚、或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑。
組胺酸基殘基係經由在pH 5.5-7.0下與焦碳酸二乙酯反應而衍生化，因此試劑對組胺酸基側鏈相當具特異性。亦可使用對溴苯甲醯基溴甲烷；此反應較佳係在0.1 M二甲胂酸鈉中在pH 6.0下進行。
離胺酸基及胺基封端殘基係與琥珀酸酐或其他羧酸酐反應。用此等試劑衍生化有逆轉離胺酸基殘基的效果。用於衍生化含α-胺基之殘基的其他適當試劑包括亞胺酯諸如吡啶甲醯亞胺酸甲酯、吡哆醛磷酸、吡哆醛、氯硼氫化物、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2,4-戊二酮、及利用乙醛酸酯的轉胺酶催化反應。
精胺酸基殘基係經由與一或數種習知試劑反應而修飾，其中包括苯基乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-環己烷二酮、及茚三酮。由於胍官能基之高pKa ，因而精胺酸殘基之衍生化需要反應在鹼性條件下進行。再者，此等試劑可與離胺酸以及精胺酸ε-胺基之基團反應。
酪胺酸基殘基之特定修飾可特別重要地在於經由與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應將光譜標記引入至酪胺酸基殘基中而進行。最常分別使用N-乙醯基咪唑及四硝基甲烷於形成O-乙醯基酪胺酸基物種及3-硝基衍生物。
羧基側基(天冬胺酸基或麩胺酸基)係經由與碳二醯亞胺(R-N.dbd.C.dbd.N-R')反應而選擇性地經修飾，其中R及R’係不同烷基，諸如1-環己基-3-(2-啉基-4-乙基)碳二醯亞胺或1-乙基-3-(4-氮陽離子-4,4-二甲基戊基)碳二醯亞胺。此外，天冬胺酸基及麩胺酸基殘基係經由與銨離子反應而轉變為天冬醯胺醯基及麩醯胺醯基。
其他的修飾包括脯胺酸及離胺酸之羥基化，絲胺酸基或羥丁胺醯基殘基之羥基的磷酸化，離胺酸、精胺酸、及組胺酸側鏈之α-胺基的甲基化(T.E.Creighton，蛋白質：結構及分子性質(Proteins：Structure and Molecular Properties)，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，79-86頁(1983))，天冬醯胺酸或麩醯胺酸之脫醯胺，N-端胺之乙醯化，及/或C-端羧酸基之醯胺化或酯化。
另一類型的共價修飾涉及將醣苷化學或酵素偶合至肽。糖可連接至(a)精胺酸及組胺酸，(b)自由羧基，(c)自由巰基諸如半胱胺酸之彼等，(d)自由羥基諸如絲胺酸、蘇胺酸、或羥基脯胺酸之彼等，(e)芳族殘基諸如酪胺酸、或色胺酸之彼等，或(f)麩醯胺酸之醯胺基。此等方法說明於1987年9月11日公告之WO87/05330中，及於Aplin及Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，259-306頁(1981)中。
可鍵聯至文中說明之任何胰高血糖素肽的範例結合物部分包括，但不限於，異源(heterologous)肽或多肽(包括，例如，血漿蛋白)、標靶試劑、免疫球蛋白或其之部分(例如，可變區域、CDR、或Fc區域)、診斷標記諸如放射性同位素、螢光團或酵素標記、包括水溶性聚合物的聚合物、或其他治療或診斷試劑。在一具體例中，提供一種包含本發明之胰高血糖素肽及血漿蛋白的結合物，其中該血漿蛋白係選自由白蛋白、轉鐵素(transferin)、纖維蛋白原及球蛋白所組成之群。
在一些具體例中，連接體包含自1至約60、或1至30個原子或更長、2至5個原子、2至10個原子、5至10個原子、或10至20個原子長的原子鏈。在一些具體例中，鏈原子皆為碳原子。在一些具體例中，連接體之主鏈中的鏈原子係選自由C、O、N、及S所組成之群。鏈原子及連接體可根據其之期望溶解度(親水性)作選擇，以提供更可溶的結合物。在一些具體例中，連接體提供會因存在於標的組織或器官或細胞中之酵素或其他催化劑或水解條件而分裂的官能基。在一些具體例中，連接體的長度夠長而可降低位阻(steric hindrance)的可能性。如連接體為共價鍵或肽基鍵且結合物為多肽，則整個結合物可為融合蛋白。此等肽基連接體可為任何長度。範例連接體的長度係自約1至50個胺基酸，5至50、3至5、5至10、5至15、或10至30個胺基酸長度。另一種方式為此等融合蛋白可藉由熟悉技藝人士已知的重組基因工程方法製得。
如前所指，在一些具體例中，胰高血糖素肽係結合(例如，融合)至免疫球蛋白或其之部分(例如，可變區域、CDR、或Fc區域)。已知的免疫球蛋白(Ig)類型包括IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc區域係Ig重鏈之C-端區域，其負責結合至執行諸如再循環(其導致延長的半衰期)、抗體依賴型細胞介導的細胞毒性(ADCC)、及補體依賴型細胞毒性(CDC)之活動的Fc受體。
舉例來說，根據一些定義，人類IgG重鏈Fc區域自Cys226拉伸至重鏈之C-端。「絞鏈區(hinge region)」一般自人類IgG1之Glu216延伸至Pro230(其他IgG同型(isotype)之絞鏈區可經由使參與半胱胺酸鍵結之半胱胺酸對準而與IgG1序列對準)。IgG之Fc區域包括兩個桓定域，CH2及CH3。人類IgG Fc區域之CH2域通常自胺基酸231延伸至胺基酸341。人類IgG Fc區域之CH3域通常自胺基酸342延伸至447。關於免疫球蛋白或免疫球蛋白片段、或區域之胺基酸編號的指示皆係根據Kabat等人1991，重要免疫學蛋白質之序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，美國公共衛生部(U.S.Department of Public Health)，Bethesda,Md。在一相關具體例中，Fc區域可包含來自免疫球蛋白重鏈之除CH1外之一或多個天然或經修飾恒定區域，例如，IgG及IgA之CH2及CH3區域、或IgE之CH3及CH4區域。
適當的結合物部分包括免疫球蛋白序列之包含FcRn結合位點的部分。FcRn(一種救援受體(salvage receptor))係負責再循環免疫球蛋白及將其送回至血液循環。結合至FcRn受體之IgG之Fc部分的區域已基於X-射線晶體學作描述(Burmeister等人1994，Nature 372：379)。Fc與FcRn之主要接觸區域係接近CH2與CH3域之接點。Fc-FcRn接觸皆係在單一Ig重鏈內。主要接觸位點包括CH2域之胺基酸殘基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311、及314及CH3域之胺基酸殘基385-387、428、及433-436。
一些結合物部分可包括或不包括FcγR結合位點。FcγR係負責ADCC及CDC。Fc區域內與FcγR直接接觸之位置的實例為胺基酸234-239(下方絞鏈區)、胺基酸265-269(B/C環路)、胺基酸297-299(C’/E環路)、及胺基酸327-332(F/G)環路(Sondermann等人，Nature 406：267-273，2000)。IgE之下方絞鏈區亦牽連FcRI結合(Henry等人，Biochemistry 36，15568-15578，1997)。涉及IgA受體結合的殘基說明於Lewis等人，(J Immunol.175：6694-701，2005)。涉及IgE受體結合的胺基酸殘基說明於Sayers等人(J Biol Chem.279(34)：35320-5，2004)。
可對免疫球蛋白之Fc區域進行胺基酸修飾。此等變異Fc區域包含在Fc區域之CH3域(殘基342-447)中之至少一個胺基酸修飾及/或在Fc區域之CH2域(殘基231-341)中之至少一個胺基酸修飾。咸信可賦予對FcRn之增加親和力的突變包括T256A、T307A、E380A、及N434A(Shields等人2001，J.Biol.Chem.276：6591)。其他突變可降低Fc區域對FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、及/或FcγRIIIA之結合，而不會顯著地降低對FcRn之親和力。舉例來說，Fc區域之位置297處之Asn經Ala或另一胺基酸取代移除高度保留性N-糖化作用位點，且可導致降低的免疫性與伴隨的Fc區域之延長半衰期，以及對FcγRs的降低結合(Routledge等人1995，Transplantation 60：847；Friend等人1999，Transplantation 68：1632；Shields等人1995，J.Biol.Chem.276：6591)。已對IgG1之位置233-236處進行降低對FcγRs之結合的胺基酸修飾(Ward及Ghetie 1995，Therapeutic Immunology 2：77及Armour等人1999，Eur.J.Immunol.29：2613)。一些範例的胺基酸取代說明於美國專利7,355,008及7,381,408中，將其各者之全體內容以引用的方式併入本文中。
本揭示案亦涵蓋胰高血糖素融合肽或蛋白質，其中第二個肽或多肽經融合至胰高血糖素肽之終端(例如，羧基端)。在一些具體例中，加成至胰高血糖素肽之羧基端的第二個肽係鍵聯至胰高血糖素肽之胺基酸29的SEQ ID NO：95(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：97(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：98(KRNR)。在其他具體例中，第二個肽係XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：96)，其中X係選自20種常見胺基酸中之一者，例如，麩胺酸、天冬胺酸或甘胺酸。在一具體例中，X代表例如Cys之胺基酸，其進一步包含共價鍵聯至該胺基酸之側鏈的親水性部分。此等C-端延伸改良溶解度且亦可改良GIP或GLP-1活性。在一些具體例中，其中該胰高血糖素肽進一步包含羧基端延伸，該延伸之羧基端胺基酸終止於醯胺基或酯基而非羧酸。
在一些具體例中，例如，在包含C-端延伸之胰高血糖素肽中，在天然胰高血糖素肽之位置29處的蘇胺酸經甘胺酸取代。舉例來說，具有在位置29處對蘇胺酸之甘胺酸取代且包含GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：95)之C-端延伸的胰高血糖素肽對GLP-1受體之效力為經修飾成包含相同C-端延伸之天然胰高血糖素的四倍。此T29G取代可與文中揭示之其他修飾結合使用，而增進胰高血糖素肽對GLP-1受體之親和力。舉例來說，T29G取代可與S16E及N20K胺基酸取代組合，視情況與胺基酸16及20間之內醯胺橋，及視情況與加成如文中所述之PEG鏈組合。
在一些具體例中，將一胺基酸加成至C-端，且該額外的胺基酸係選自由麩胺酸、天冬胺酸及甘胺酸組成之群。
本揭示案亦涵蓋文中揭示之經修飾胰高血糖素肽的多聚體。兩個或兩個以上的經修飾胰高血糖素肽可使用熟悉技藝人士已知之標準的鍵聯劑及程序鍵聯在一起。舉例來說，可透過使用雙官能硫醇交聯體及雙官能胺交聯體在兩個經修飾胰高血糖素肽之間形成二聚體，尤其係對於經半胱胺酸、離胺酸、鳥胺酸、升半胱胺酸或乙醯基苯丙胺酸殘基取代的胰高血糖素肽而言。
醯化及烷化
根據一些具體例，文中揭示之胰高血糖素肽係經修飾成包含醯基或烷基，例如，對天然產生之胺基酸為非天然的醯基或烷基。醯化或烷化可提高胰高血糖素肽於循環中之半衰期。醯化或烷化可有利地延遲對胰高血糖素及/或GLP-1受體之作用的開始及/或延長作用期間及/或改良對諸如DPP-IV之蛋白酶的抗性及/或改良溶解度。於醯化後可維持胰高血糖素肽對胰高血糖素及/或GLP-1及/或GIP受體的活性。在一些具體例中，經醯化之胰高血糖素肽的效力與未經醯化形式的胰高血糖素肽相當。在另類的具體例中，經醯化之胰高血糖素肽的效力較未經醯化形式的胰高血糖素肽提高。
在一些具體例中，本發明提供一種經修飾成包含共價鍵聯至胰高血糖素肽之位置10處之胺基酸之醯基或烷基的胰高血糖素肽。此胰高血糖素肽可進一步包含位於胰高血糖素肽之位置10處之胺基酸與醯基或烷基之間的間隔物。在一些具體例中，醯基係脂肪酸或膽汁酸、或其鹽，例如，C4至C30脂肪酸、C8至C24脂肪酸、膽酸、C4至C30烷基、C8至C24烷基、或包含膽汁酸之類固醇部分的烷基。間隔物係任何具有用於連接醯基或烷基之適當反應性基團的部分。在範例具體例中，間隔物包含胺基酸、二肽、三肽、親水性雙官能、或疏水性雙官能間隔物。在一些具體例中，間隔物係選自由以下組成之群：Trp、Glu、Asp、Cys及包含NH2 (CH2 CH2 O)n(CH2 )mCOOH之間隔物，其中m係1至6之任何整數及n係2至12之任何整數。此等經醯化或烷化之胰高血糖素肽亦可進一步包含親水性部分，視情況為聚乙二醇。任何前述的胰高血糖素肽可包含兩個醯基或兩個烷基、或其之組合。
醯化可在胰高血糖素肽內之任何位置，包括位置1-29、C-端延伸內之位置、或N-或C-端胺基酸之任一者處進行，其限制條件為GIP活性(及視情況GLP-1及/或胰高血糖素活性)若未經提高的話，係經維持。醯化可，例如，發生在任何加成至胰高血糖素序列(SEQ ID NO：1)的胺基酸處，例如，在N-或C-端。非限制性實例包括胰高血糖素肽的位置1、5、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50。醯基可直接共價鍵聯至胰高血糖素肽的胺基酸，或透過間隔物間接共價鍵聯至胰高血糖素肽的胺基酸，其中該間隔物係位於胰高血糖素肽之胺基酸與醯基之間。胰高血糖素肽可在鍵聯親水性部分的相同胺基酸位置處，或在不同胺基酸位置處醯化。非限制性實例包括在胰高血糖素肽之位置10或位置40處之醯化及在C-端部分中之一或多個位置(例如，位置24、28或29、在C-端延伸內或在C-端(例如，透過加成C-端Cys))處的聚乙二醇化。
在一些具體例中，胰高血糖素肽係經修飾成包含在SEQ ID NO：1之胰高血糖素肽或其類似物C-端之約1至約21個胺基酸的延伸，且該延伸之至少一個胺基酸經醯化或烷化。舉例來說，經修飾的胰高血糖素肽可包含在SEQ ID NO：1之胰高血糖素肽或其類似物之位置29處之胺基酸C-端之約1至約21個胺基酸的延伸。或者，如胰高血糖素肽或其類似物經截去一或兩個胺基酸，則約1至約21個胺基酸之延伸可係在胰高血糖素肽或其類似物之位置27或28處之胺基酸的C-端。因此，在C-端延伸內之經醯化或烷化之胺基酸可係，例如，在C-端延伸胰高血糖素肽之位置28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50處的任何胺基酸。在一些具體例中，C-端延伸包含SEQ ID NO：95或96之胺基酸序列。在一些具體例中，胰高血糖素肽包括含有SEQ ID NO：95之胺基酸序列及位在SEQ ID NO：95之C-端處之1至11個額外胺基酸的C-端延伸，該額外胺基酸係如文中所述經醯化或烷化。在特定具體例中，經醯化或烷化之胺基酸係Dab、Orn、Lys、或升Lys殘基，且係位在C-端延伸胰高血糖素肽或其類似物的位置40處。
根據一具體例，胰高血糖素肽係經修飾成包含透過酯、硫酯、或醯胺鍵聯連接至胰高血糖素肽之醯基，以延長於循環中之半衰期及/或延遲作用的開始及/或延長作用期間及/或改良對諸如DPP-IV之蛋白酶的抗性。
在本發明之一特定態樣中，胰高血糖素肽係經由直接醯化胰高血糖素肽之胺基酸之側鏈的胺、羥基、或硫醇，而經修飾成包含醯基。在一些具體例中，胰高血糖素肽係透過胺基酸之側鏈胺、羥基、或硫醇直接醯化。在一些具體例中，醯化係在位置10、20、24、29、或40處。在此方面，經醯化的胰高血糖素肽可包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，或其之包含文中所述之一或多個胺基酸修飾的經修飾胺基酸序列，其中位置10、20、24、29、及40處之至少一胺基酸經修飾成包含側鏈胺、羥基、或硫醇之任何胺基酸。在本發明之一些特定具體例中，胰高血糖素肽的直接醯化係透過位置10或40處之胺基酸的側鏈胺、羥基、或硫醇發生。
在一些具體例中，包含側鏈胺之胺基酸係式I之胺基酸：
在一些範例具體例中，式I之胺基酸係其中n為4(Lys)或n為3(Orn)之胺基酸。
在其他具體例中，包含側鏈羥基之胺基酸係式II之胺基酸：
在一些範例具體例中，式II之胺基酸係其中n為1(Ser)之胺基酸。
在又其他的具體例中，包含側鏈硫醇之胺基酸係式III之胺基酸：
在一些範例具體例中，式II之胺基酸係其中n為1(Cys)之胺基酸。
在又其他的具體例中，包含側鏈胺、羥基、或硫醇之胺基酸係包含式I、式II、或式III之相同結構的二取代胺基酸，僅除了鍵結至式I、式II、或式III之胺基酸之α碳的氫係經第二個側鏈取代。
在本發明之一具體例中，經醯化之胰高血糖素肽包含位於肽與醯基之間的間隔物。在一些具體例中，胰高血糖素肽係共價鍵結至間隔物，該間隔物再共價鍵結至醯基。
間隔物所連接之胺基酸可係任何包含允許鍵聯至間隔物之部分的胺基酸(例如，經單一或雙重α-取代之胺基酸)。舉例來說，包含側鏈NH2 、-OH、或-COOH之胺基酸(例如，Lys、Orn、Ser、Asp、或Glu)為適當。在此方面，經醯化之胰高血糖素肽可包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，或其之包含文中所述之一或多個胺基酸修飾的經修飾胺基酸序列，其中位置10、20、24、29、及40處之至少一胺基酸經修飾成包含側鏈胺、羥基、或羧酸酯之任何胺基酸。
在一些具體例中，間隔物係包含側鏈胺、羥基、或硫醇之胺基酸，或包括含有側鏈胺、羥基、或硫醇之胺基酸的二肽或三肽。
當透過間隔物之胺基發生醯化時，醯化可透過胺基酸之α胺或側鏈胺發生。在其中α胺經醯化的情況中，間隔物胺基酸可為任何胺基酸。舉例來說，間隔物胺基酸可為疏水性胺基酸，例如，Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-胺基己酸、5-胺基戊酸、7-胺基庚酸、及8-胺基辛酸。或者，間隔物胺基酸可為酸性殘基，例如，Asp及Glu。
在其中間隔物胺基酸之側鏈胺經醯化的情況中，間隔物胺基酸係包含側鏈胺之胺基酸，例如，式I之胺基酸(例如，Lys或Orn)。在此情況，α胺及間隔物胺基酸之側鏈胺兩者可皆經醯化，以致胰高血糖素肽經二醯化。本發明之具體例包括此等經二醯化之分子。
當醯化係透過間隔物之羥基發生時，胺基酸或二肽或三肽之其中一個胺基酸可為式II之胺基酸。在一特定範例具體例中，胺基酸係Ser。
當醯化係透過間隔物之硫醇基發生時，胺基酸或二肽或三肽之其中一個胺基酸可為式III之胺基酸。在一特定範例具體例中，胺基酸係Cys。
在一些具體例中，間隔物係親水性雙官能間隔物。在某些具體例中，親水性雙官能間隔物包含兩個或兩個以上的反應性基團，例如，胺、羥基、硫醇、及羧基或其之任何組合。在某些具體例中，親水性雙官能間隔物包含羥基及羧酸酯。在其他具體例中，親水性雙官能間隔物包含胺基及羧酸酯。在其他具體例中，親水性雙官能間隔物包含硫醇基及羧酸酯。在特定具體例中，間隔物包含胺基聚(烷氧基)羧酸酯。在此方面，間隔物可包含，例如，NH2 (CH2 CH2 O)n (CH2 )m COOH，其中m係1至6之任何整數及n係2至12之任何整數，諸如，比方說，8-胺基-3,6-二氧雜辛酸，其可購自Peptides International,Inc.(Louisville,KY)。
在一些具體例中，間隔物係疏水性雙官能間隔物。疏水性雙官能間隔物係技藝中所知曉。參見，例如，生物結合物技術(Bioconjugate Techniques) ，G.T.Hermanson(Academic Press,San Diego,CA,1996)，將其全體內容以引用的方式併入本文中。在某些具體例中，疏水性雙官能間隔物包含兩個或兩個以上的反應性基團，例如，胺、羥基、硫醇、及羧基或其之任何組合。在某些具體例中，疏水性雙官能間隔物包含羥基及羧酸酯。在其他具體例中，疏水性雙官能間隔物包含胺基及羧酸酯。在其他具體例中，疏水性雙官能間隔物包含硫醇基及羧酸酯。技藝中知曉包含羧酸酯、及羥基或硫醇基之適當的疏水性雙官能間隔物，且其包括，例如，8-羥基辛酸及8-巰基辛酸。
在一些具體例中，雙官能間隔物不為在羧酸酯基之間包含1-7個碳原子之未分支鏈亞甲基的二羧酸。在一些具體例中，雙官能間隔物係在羧酸酯基之間包含1-7個碳原子之未分支鏈亞甲基的二羧酸。
在特定具體例中之間隔物(例如，胺基酸、二肽、三肽、親水性雙官能、或疏水性雙官能間隔物)係3至10個原子(例如，6至10個原子)(例如，6、7、8、9、或10個原子)長度。在更特定的具體例中，間隔物係約3至10個原子(例如，6至10個原子)長度，及醯基係C12至C18脂肪醯基，例如，C14脂肪醯基、C16脂肪醯基，以致間隔物及醯基之總長度係14至28個原子，例如，約14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28個原子。在一些具體例中，間隔物及醯基之長度係17至28(例如，19至26、19至21)個原子。
根據某些前述具體例，雙官能間隔物可為包含3至10個原子長度之胺基酸主鏈的合成或天然產生之胺基酸(包括，但不限於，任何文中所述者)(例如，6-胺基己酸、5-胺基戊酸、7-胺基庚酸、及8-胺基辛酸)。或者，間隔物可為具有3至10個原子(例如，6至10個原子)長度之肽主鏈的二肽或三肽間隔物。二肽或三肽間隔物的各胺基酸可與二肽或三肽的其他胺基酸相同或不同，且可獨立地選自由下列組成之群：天然產生及/或非天然產生之胺基酸，包括，例如，天然產生胺基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr)之任何的D或L異構物，或選自由下列組成之群之非天然產生胺基酸之任何的D或L異構物：β-丙胺酸(β-Ala)、N-α-甲基-丙胺酸(Me-Ala)、胺基丁酸(Abu)、γ-胺基丁酸(γ-Abu)、胺基己酸(ε-Ahx)、胺基異丁酸(Aib)、胺甲基吡咯羧酸、胺基哌啶羧酸、胺基絲胺酸(Ams)、胺基四氫哌喃-4-羧酸、精胺酸N-甲氧-N-甲基醯胺、β-天冬胺酸(β-Asp)、三亞甲亞胺羧酸、3-(2-苯并噻唑基)丙胺酸、α-第三丁基甘胺酸、2-胺基-5-脲基-正戊酸(瓜胺酸，Cit)、β-環己基丙胺酸(Cha)、乙醯胺甲基-半胱胺酸、二胺基丁酸(Dab)、二胺基丙酸(Dpr)、二羥苯基丙胺酸(DOPA)、二甲基噻唑啶(DMTA)、γ-麩胺酸(γ-Glu)、升絲胺酸(Hse)、羥基脯胺酸(Hyp)、異白胺酸N-甲氧-N-甲基醯胺、甲基-異白胺酸(MeIle)、異六氫菸鹼酸(Isn)、甲基-白胺酸(MeLeu)、甲基-離胺酸、二甲基-離胺酸、三甲基-離胺酸、甲橋脯胺酸、甲硫胺酸-亞碸(Met(O))、甲硫胺酸-碸(Met(O2 ))、正白胺酸(Nle)、甲基-正白胺酸(Me-Nle)、正纈胺酸(Nva)、鳥胺酸(Orn)、對胺基苯甲酸(PABA)、青黴胺(Pen)、甲基苯丙胺酸(MePhe)、4-氯苯丙胺酸(Phe(4-Cl))、4-氟苯丙胺酸(Phe(4-F))、4-硝基苯丙胺酸(Phe(4-NO2 ))、4-氰基苯丙胺酸(Phe(4-CN))、苯基甘胺酸(Phg)、哌啶基丙胺酸、哌啶基甘胺酸、3,4-去氫脯胺酸、吡咯啶基丙胺酸、肌胺酸(Sar)、硒半胱胺酸(Sec)、O-苄基-磷絲胺酸、4-胺基-3-羥基-6-甲基庚酸(Sta)、4-胺基-5-環己基-3-羥基戊酸(ACHPA)、4-胺基-3-羥基-5-苯基戊酸(AHPPA)、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)、四氫哌喃甘胺酸、噻吩基丙胺酸(Thi)、O-苄基-磷酪胺酸、O-磷酪胺酸、甲氧酪胺酸、乙氧酪胺酸、O-(雙-二甲胺基-膦酸基)-酪胺酸、酪胺酸硫酸酯四丁胺、甲基-纈胺酸(MeVal)、及烷化3-巰基丙酸。
在一些具體例中，間隔物包含總體負電荷，例如，包含一或兩個帶負電胺基酸。在一些具體例中，二肽不為任何一般結構A-B之二肽，其中A係選自由Gly、Gln、Ala、Arg、Asp、Asn、Ile、Leu、Val、Phe、及Pro組成之群，其中B係選自由Lys、His、Trp組成之群。在一些具體例中，二肽間隔物係選自由以下組成之群：Ala-Ala、β-Ala-β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-胺基丁酸-γ-胺基丁酸、及γ-Glu-γ-Glu。
在一些範例具體例中，胰高血糖素肽係經由將間隔物之胺、羥基、或硫醇醯化而經修飾成包含醯基，該間隔物係連接至胰高血糖素肽之位置10、20、24、29、或40處之胺基酸、或C-端胺基酸之側鏈。
在又更特定的具體例中，醯基係連接至胰高血糖素肽之位置10或40處之胺基酸，且視情況，間隔物及醯基之長度係14至28個原子。在一些態樣中，位置10或40處之胺基酸係式I之胺基酸，例如，Lys，或與式I相關的二取代胺基酸。在更特定的具體例中，胰高血糖素肽不含分子內架橋，例如，共價分子內架橋。胰高血糖素肽，例如，可為包含一或多個α,α-二取代胺基酸(例如，AIB)之肽，以使肽之α螺旋穩定。如文中所示，此等包含共價連接至位置40處之胺基酸之側鏈之醯化間隔物的肽對GIP、GLP-1、及胰高血糖素受體呈現提高的效力。
透過胺、羥基、及硫醇之肽醯化的適當方法係技藝中所知曉。參見，例如，Miller，Biochem Biophys Res Commun 218：377-382(1996)，實施例19(關於透過胺醯化之方法)；Shimohigashi及Stammer，Int J Pept Protein Res 19：54-62(1982)；及Previero等人，Biochim Biophys Acta 263：7-13(1972)(關於透過羥基醯化之方法)；及San及Silvius，J Pept Res 66：169-180(2005)(關於透過硫醇醯化之方法)；Bioconjugate Chem .「蛋白質之化學修飾：歷史及應用(Chemical Modifications of Proteins：History and Applications)」，1、2-12頁(1990)；Hashimoto等人，Pharmacuetical Res .「胰島素之棕櫚醯基衍生物之合成及其生物活性(Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity)」第6冊，No：2，171-176頁(1989)。
經醯化胰高血糖素肽之醯基可為任何大小，例如，任何長度碳鏈，且可為直鏈或分支鏈。在本發明之一些特定具體例中，醯基為C4至C30脂肪酸。舉例來說，醯基可為C4脂肪酸、C6脂肪酸、C8脂肪酸、C10脂肪酸、C12脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸、或C30脂肪酸中之任一者。在一些具體例中，醯基係C8至C20脂肪酸，例如，C14脂肪酸或C16脂肪酸。
在另一具體例中，醯基係膽汁酸。膽汁酸可為任何適合的膽汁酸，包括，但不限於，膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸、石膽酸、牛膽酸、甘膽酸、及膽固醇酸。
在本發明之一些具體例中，胰高血糖素肽係經由利用胰高血糖素肽醯化長鏈烷而經修飾成包含醯基。在特定態樣中，長鏈烷包含與胰高血糖素肽之羧基或其活化形式反應之胺、羥基、或硫醇基(例如，十八胺、十四烷醇、及十六烷硫醇)。胰高血糖素肽之羧基或其活化形式可為胰高血糖素肽之胺基酸(例如，麩胺酸、天冬胺酸)之側鏈的部分或可為肽主鏈之部分。
在某些具體例中，胰高血糖素肽係經由利用連接至胰高血糖素肽之間隔物醯化長鏈烷而經修飾成包含醯基。在特定態樣中，長鏈烷包含與間隔物之羧基或其活化形式反應之胺、羥基、或硫醇基。包含羧基、或其活化形式之適當的間隔物說明於文中，且包括，例如，雙官能間隔物，例如，胺基酸、二肽、三肽、親水性雙官能間隔物及疏水性雙官能間隔物。
如文中所使用之術語「羧基之活化形式」係指具有通式R(C=O)X之羧基，其中X係脫離基及R係胰高血糖素肽或間隔物。舉例來說，羧基之活化形式可包括，但不限於，醯基氯、酐、及酯。在一些具體例中，活化羧基係具有N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS)脫離基的酯。
關於其中長鏈烷係經胰高血糖素肽或間隔物醯化之本發明的此等態樣，長鏈烷可為任何大小，且可包含任何長度的碳鏈。長鏈烷可為直鏈或分支鏈。在某些態樣中，長鏈烷為C4至C30烷。舉例來說，長鏈烷可為C4烷、C6烷、C8烷、C10烷、C12烷、C14烷、C16烷、C18烷、C20烷、C22烷、C24烷、C26烷、C28烷、或C30烷中之任一者。在一些具體例中，長鏈烷包含C8至C20烷，例如，C14烷、C16烷、或C18烷。
此外，在一些具體例中，胰高血糖素肽之胺、羥基、或硫醇基係利用膽固醇酸醯化。在特定具體例中，胰高血糖素肽係透過經修飾的Cys間隔物鍵聯至膽固醇酸。
文中所述之經醯化的胰高血糖素肽可進一步經修飾成包含親水性部分。在一些特定具體例中，親水性部分可包含聚乙二醇(PEG)鏈。親水性部分之併入可透過任何適當的方式，諸如文中所述之任何方法完成。在此方面，經醯化之胰高血糖素肽可包含SEQ ID NO：1，包括文中所述之任何修飾，其中位置10、20、24、29、及40處之至少一胺基酸包含醯基，且位置16、17、21、24、29、或40、C-端延伸內之位置、或C-端胺基酸之至少一胺基酸經修飾成Cys、Lys、Orn、升-Cys、或Ac-Phe，且胺基酸之側鏈係共價鍵結至親水性部分(例如，PEG)。在一些具體例中，醯基係視情況透過包含Cys、Lys、Orn、升-Cys、或Ac-Phe之間隔物連接至位置10或40，且親水性部分係併入至位置24處之Cys殘基。
或者，經醯化之胰高血糖素肽可包含一間隔物，其中該間隔物係既經醯化且亦經修飾成包含親水性部分。適當間隔物的非限制性實例包括含有選自由Cys、Ac-Cys、Lys、Orn、升-Cys、及Ac-Phe組成之群之一或多個胺基酸的間隔物。
在本發明之一特定態樣中，經醯化之胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：101-106、113-115、117-119、123-125、128-130、132-134、136-138、141-145、148、151、152、154、156、158、160、162、163、165、166、231、234-239、257、及258中任一者之胺基酸序列。
根據一些具體例，胰高血糖素肽係經修飾成包含烷基，例如，非天然存在於胺基酸上之烷基(例如，對天然產生之胺基酸為非天然的烷基)。不以任何特殊理論為基礎，咸信胰高血糖素肽之烷化將達成與胰高血糖素肽之醯化相似(若非相同的話)的效果，例如，延長的循環半衰期、延遲作用之開始、延長作用期間、改良對蛋白酶(諸如DPP-IV)之抗性、及提高對GLP-1、GIP、及胰高血糖素受體之效力。
烷化可在胰高血糖素肽內的任何位置處進行，包括任何的位置1-29、C-端延伸內之位置、或N-或C-端胺基酸，其限制條件為GIP活性(及視情況GIP及/或胰高血糖素活性)若未經提升的話，係經維持。烷化可發生在，例如，任何加成至胰高血糖素序列(SEQ ID NO：1)的胺基酸處，例如，在N-或C-端。非限制性的實例包括位置1、5、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50。烷基可直接共價鍵聯至胰高血糖素肽的胺基酸，或透過間隔物間接共價鍵聯至胰高血糖素肽的胺基酸，其中該間隔物係位於胰高血糖素肽之胺基酸與烷基之間。胰高血糖素肽可在鍵聯親水性部分的相同胺基酸位置處，或在不同胺基酸位置處烷化。非限制性實例包括在胰高血糖素肽之位置10或40處之烷化及在C-端部分中之一或多個位置(例如，位置24、28、29、或40、在C-端延伸內、或在C-端(例如，透過加成C-端Cys))處的聚乙二醇化。
在本發明之一特定態樣中，胰高血糖素肽係經由直接烷化胰高血糖素肽之胺基酸之側鏈的胺、羥基、或硫醇，而經修飾成包含烷基。在一些具體例中，胰高血糖素肽係透過胺基酸之側鏈胺、羥基、或硫醇直接烷化。在一些具體例中，烷化係在位置10、20、24、29、或40處。在此方面，經烷化的胰高血糖素肽可包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，或其之包含文中所述之一或多個胺基酸修飾的經修飾胺基酸序列，其中位置10、20、24、29、及40處之至少一胺基酸經修飾成包含側鏈胺、羥基、或硫醇之任何胺基酸。在本發明之一些特定具體例中，胰高血糖素肽的直接烷化係透過位置10處之胺基酸的側鏈胺、羥基、或硫醇發生。
在一些具體例中，包含側鏈胺之胺基酸係式I之胺基酸。在一些範例具體例中，式I之胺基酸係其中n為4(Lys)或n為3(Orn)之胺基酸。
在其他具體例中，包含側鏈羥基之胺基酸係式II之胺基酸。在一些範例具體例中，式II之胺基酸係其中n為1(Ser)之胺基酸。
在又其他的具體例中，包含側鏈硫醇之胺基酸係式III之胺基酸。在一些範例具體例中，式III之胺基酸係其中n為1(Cys)之胺基酸。
在又其他的具體例中，包含側鏈胺、羥基、或硫醇之胺基酸係包含式I、式II、或式III之相同結構的二取代胺基酸，僅除了鍵結至式I、式II、或式III之胺基酸之α碳的氫係經第二個側鏈取代。
在本發明之一具體例中，經烷化之胰高血糖素肽包含位於肽與烷基之間的間隔物。在一些具體例中，胰高血糖素肽係共價鍵結至間隔物，該間隔物係共價鍵結至烷基。在一些範例具體例中，胰高血糖素肽係經由烷化間隔物之胺、羥基、或硫醇而經修飾成包含烷基，該間隔物係連接至胰高血糖素肽之位置10、20、24、29、或40處之胺基酸的側鏈。間隔物所連接之胺基酸可係任何包含允許鍵聯至間隔物之部分的胺基酸(例如，經單一α-取代之胺基酸或α,α-二取代胺基酸)。舉例來說，包含側鏈NH2 、-OH、或-COOH之胺基酸(例如，Lys、Orn、Ser、Asp、或Glu)為適當。在此方面，經烷化之胰高血糖素肽可包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，或其之包含文中所述之一或多個胺基酸修飾的經修飾胺基酸序列，其中位置10、20、24、29、及40處之至少一胺基酸經修飾成包含側鏈胺、羥基、或羧酸酯之任何胺基酸。
在一些具體例中，間隔物係包含側鏈胺、羥基、或硫醇之胺基酸，或包括含有側鏈胺、羥基、或硫醇之胺基酸的二肽或三肽。
當透過間隔物之胺基發生烷化時，烷化可透過胺基酸之α胺或側鏈胺發生。在其中α胺經烷化的情況中，間隔物胺基酸可為任何胺基酸。舉例來說，間隔物胺基酸可為疏水性胺基酸，例如，Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-胺基己酸、5-胺基戊酸、7-胺基庚酸、及8-胺基辛酸。或者，間隔物胺基酸可為酸性殘基，例如，Asp及Glu，其限制條件為烷化係在酸性殘基的α胺上發生。在其中間隔物胺基酸之側鏈胺經烷化的情況中，間隔物胺基酸係包含側鏈胺之胺基酸，例如，式I之胺基酸(例如，Lys或Orn)。在此情況，α胺及間隔物胺基酸之側鏈胺兩者可皆經烷化，以致胰高血糖素肽經二烷化。本發明之具體例包括此等經二烷化之分子。
當烷化係透過間隔物之羥基發生時，胺基酸或二肽或三肽之其中一個胺基酸可為式II之胺基酸。在一特定範例具體例中，胺基酸係Ser。
當醯化係透過間隔物之硫醇基發生時，胺基酸或二肽或三肽之其中一個胺基酸可為式III之胺基酸。在一特定範例具體例中，胺基酸係Cys。
在一些具體例中，間隔物係親水性雙官能間隔物。在某些具體例中，親水性雙官能間隔物包含兩個或兩個以上的反應性基團，例如，胺、羥基、硫醇、及羧基或其之任何組合。在某些具體例中，親水性雙官能間隔物包含羥基及羧酸酯。在其他具體例中，親水性雙官能間隔物包含胺基及羧酸酯。在其他具體例中，親水性雙官能間隔物包含硫醇基及羧酸酯。在一特定具體例中，間隔物包含胺基聚(烷氧基)羧酸酯。在此方面，間隔物可包含，例如，NH2 (CH2 CH2 O)n (CH2 )m COOH，其中m係1至6之任何整數及n係2至12之任何整數，諸如，比方說，8-胺基-3,6-二氧雜辛酸，其可購自Peptides International,Inc.(Louisville,KY)。
在一些具體例中，間隔物係疏水性雙官能間隔物。在某些具體例中，疏水性雙官能間隔物包含兩個或兩個以上的反應性基團，例如，胺、羥基、硫醇、及羧基或其之任何組合。在某些具體例中，疏水性雙官能間隔物包含羥基及羧酸酯。在其他具體例中，疏水性雙官能間隔物包含胺基及羧酸酯。在其他具體例中，疏水性雙官能間隔物包含硫醇基及羧酸酯。技藝中知曉包含羧酸酯、及羥基或硫醇基之適當的疏水性雙官能間隔物，且其包括，例如，8-羥基辛酸及8-巰基辛酸。
在特定具體例中之間隔物(例如，胺基酸、二肽、三肽、親水性雙官能、或疏水性雙官能間隔物)係3至10個原子(例如，6至10個原子)(例如，6、7、8、9、或10個原子)長度。在更特定的具體例中，間隔物係約3至10個原子(例如，6至10個原子)長度，及烷基係C12至C18烷基，例如，C14烷基、C16烷基，以致間隔物及烷基之總長度係14至28個原子，例如，約14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28個原子。在一些具體例中，間隔物及烷基之長度係17至28(例如，19至26、19至21)個原子。
根據某些前述具體例，雙官能間隔物可為包含3至10個原子長度之胺基酸主鏈的合成或非天然產生之胺基酸(例如，6-胺基己酸、5-胺基戊酸、7-胺基庚酸、及8-胺基辛酸)。或者，間隔物可為具有3至10個原子(例如，6至10個原子)長度之肽主鏈的二肽或三肽間隔物。二肽或三肽間隔物可由天然產生及/或非天然產生之胺基酸(包括，例如，文中教示之任何胺基酸)所構成。在一些具體例中，間隔物包含總體負電荷，例如，包含一或兩個帶負電胺基酸。在一些具體例中，二肽間隔物係選自由以下所組成之群：Ala-Ala、β-Ala-β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-胺基丁酸-γ-胺基丁酸、及γ-Glu-γ-Glu。
技藝中知曉透過胺、羥基、及硫醇進行肽烷化之適當方法。舉例來說，可使用威廉生(Williamson)醚合成法於在胰高血糖素肽之羥基與烷基之間形成醚鍵聯。此外，肽與鹵烷基的親核性取代反應可產生醚、硫醚、或胺基鍵聯中之任一者。
經烷化胰高血糖素肽之烷基可為任何大小，例如，任何長度碳鏈，且可為直鏈或分支鏈。在本發明之一些具體例中，烷基為C4至C30烷基。舉例來說，烷基可為C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基、或C30烷基中之任一者。在一些具體例中，烷基係C8至C20烷基，例如，C14烷基或C16烷基。
在一些特定具體例中，烷基包含膽汁酸(例如，膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸、石膽酸、牛膽酸、甘膽酸、及膽固醇酸)之膽固醇部分。
在本發明之一些具體例中，胰高血糖素肽係經由使親核性、長鏈烷與胰高血糖素肽反應而經修飾成包含烷基，其中該胰高血糖素肽包含適合於親核性取代的脫離基。在特定態樣中，長鏈烷的親核性基團包含胺、羥基、或硫醇基(例如，十八胺、十四烷醇、及十六烷硫醇)。胰高血糖素肽之脫離基可為胺基酸之側鏈的部分或可為肽主鏈之部分。適當的脫離基包括，例如，N-羥基琥珀醯亞胺、鹵素、及磺酸酯。
在某些具體例中，胰高血糖素肽係經由使親核性、長鏈烷與連接至胰高血糖素肽之間隔物反應而經修飾成包含烷基，其中該間隔物包含脫離基。在特定態樣中，長鏈烷包含胺、羥基、或硫醇基。在某些具體例中，包含脫離基之間隔物可為進一步包含合適脫離基之文中論述的任何間隔物，例如，胺基酸、二肽、三肽、親水性雙官能間隔物及疏水性雙官能間隔物。
關於其中長鏈烷係經胰高血糖素肽或間隔物烷化之本發明的此等態樣，長鏈烷可為任何大小，且可包含任何長度的碳鏈。長鏈烷可為直鏈或分支鏈。在某些態樣中，長鏈烷為C4至C30烷。舉例來說，長鏈烷可為C4烷、C6烷、C8烷、C10烷、C12烷、C14烷、C16烷、C18烷、C20烷、C22烷、C24烷、C26烷、C28烷、或C30烷中之任一者。在一些具體例中，長鏈烷包含C8至C20烷，例如，C14烷、C16烷、或C18烷。
此外，在一些具體例中，烷化可在胰高血糖素肽與膽固醇部分之間發生。舉例來說，膽固醇的羥基可置換長鏈烷上之脫離基而形成膽固醇-胰高血糖素肽產物。
文中所述之經烷化的胰高血糖素肽可進一步經修飾成包含親水性部分。在一些特定具體例中，親水性部分可包含聚乙二醇(PEG)鏈。親水性部分之併入可透過任何適當的方式，諸如文中所述之任何方法完成。在此方面，經烷化之胰高血糖素肽可包含SEQ ID NO：1，或其之包括文中所述之一或多個胺基酸修飾的經修飾胺基酸序列，其中位置10、20、24、29、及40處之至少一胺基酸包含烷基，且位置16、17、21、24、29、及40、C-端延伸內之位置或C-端胺基酸之至少一胺基酸經修飾成Cys、Lys、Orn、升-Cys、或Ac-Phe，且胺基酸之側鏈係共價鍵結至親水性部分(例如，PEG)。在一些具體例中，烷基係視情況透過包含Cys、Lys、Orn、升-Cys、或Ac-Phe之間隔物連接至位置10或40，且親水性部分係併入至位置24處之Cys殘基。
或者，經烷化之胰高血糖素肽可包含一間隔物，其中該間隔物係既經烷化且亦經修飾成包含親水性部分。適當間隔物的非限制性實例包括含有選自由Cys、Lys、Orn、升-Cys、及Ac-Phe組成之群之一或多個胺基酸的間隔物。
範例具體例
根據本發明之一些具體例，具有GIP激動劑活性之胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的類似物包含具有以下各項的SEQ ID NO：1：(a)在位置1處賦予GIP激動劑活性之胺基酸修飾，(b)使類似物之C-端部分(胺基酸12-29)之α螺旋結構穩定的修飾，及(c)視情況，1至10(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)個進一步的胺基酸修飾。在一些具體例中，類似物對GIP受體呈現天然GIP之至少約1%的活性，或文中所述之任何其他對GIP受體的活性值。
在某些具體例中，使α螺旋結構穩定的修飾係提供或引入分子內架橋，包括，例如，共價分子內架橋，諸如文中所述之任何架橋的修飾。在一些具體例中，共價分子內架橋係內醯胺橋。此等具體例之類似物的內醯胺橋可為如文中所述的內醯胺橋。參見，例如，在「使α螺旋結構穩定」之章節中之內醯胺橋的教示。舉例來說，內醯胺橋可係位在位置i與i+4處之胺基酸之側鏈之間或位在位置j與j+3處之胺基酸之側鏈之間，其中i係12、13、16、17、20或24，及其中j係17。在某些具體例中，內醯胺橋可係位在位置16及20處之胺基酸之間，其中在位置16及20處之一個胺基酸係經Glu取代及在位置16及20處之另一個胺基酸係經Lys取代。
在另類的具體例中，使α螺旋結構穩定的修飾係在類似物的位置16、20、21、及24處引入一、二、三、或四個α,α-二取代胺基酸。在一些具體例中，α,α-二取代胺基酸係AIB。在某些態樣中，α,α-二取代胺基酸(例如，AIB)係在位置20處，及位置16處之胺基酸係經帶正電的胺基酸(諸如，比方說，說明於文中之式IV胺基酸)取代。式IV之胺基酸可為升Lys、Lys、Orn、或2,4-二胺基丁酸(Dab)。
在本發明之特定態樣中，位置1處之胺基酸修飾係His經不含咪唑側鏈之胺基酸(例如，大的芳族胺基酸(例如，Tyr))取代。
在某些態樣中，胰高血糖素之類似物包含在位置27、28及29之一處、兩處或全部的胺基酸修飾。舉例來說，位置27處之Met可經大的脂族胺基酸(視情況為Leu)取代，位置28處之Asn可經小的脂族胺基酸(視情況為Ala)取代，位置29處之Thr可經小的脂族胺基酸(視情況為Gly)取代，或前述之二或三者的組合。在特定具體例中，胰高血糖素之類似物包含在位置27處之Leu、在位置28處之Ala、及在位置29處之Gly或Thr。
在本發明之某些具體例中，胰高血糖素之類似物包含在位置29處之胺基酸C-端之1至21個胺基酸的延伸。該延伸可包含，例如，SEQ ID NO：95或96之胺基酸序列。另外或替代地，胰高血糖素之類似物可包含該延伸之1-6個胺基酸係帶正電胺基酸的延伸。帶正電胺基酸可為式IV之胺基酸，包括，但不限於，Lys、升Lys、Orn、及Dab。
在一些具體例中，胰高血糖素之類似物係如文中所述經醯化或烷化。比方說，醯基或烷基可如進一步說明於文中，在類似物之位置10或40處，藉由或不藉由間隔物連接至胰高血糖素之類似物。另外或替代地，類似物可經修飾成包含如進一步說明於文中的親水性部分。此外，在一些具體例中，類似物包含以下修飾的任一者或組合：
(a)位置2處之Ser經D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、AIB、Val、或α-胺基-N-丁酸取代；
(b)位置10處之Tyr經Trp、Lys、Orn、Glu、Phe、或Val取代；
(c)一醯基鍵聯至位置10處之Lys；
(d)位置12處之Lys經Arg或Ile取代；
(e)位置16處之Ser經Glu、Gln、升麩胺酸、升半胱胺磺酸、Thr、Gly、或AIB取代；
(f)位置17處之Arg經Gln取代；
(g)位置18處之Arg經Ala、Ser、Thr、或Gly取代；
(h)位置20處之Gln經Ser、Thr、Ala、Lys、瓜胺酸、Arg、Orn、或AIB取代；
(i)位置21處之Asp經Glu、升麩胺酸、升半胱胺磺酸取代；
(j)位置23處之Val經Ile取代；
(k)位置24處之Gln經Asn、Ser、Thr、Ala、或AIB取代；及
(l)在位置2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、18、19、20、21、24、27、28、及29中任一者處之保留性取代。
在範例具體例中，具有GIP激動劑活性之胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的類似物包含以下修飾：
(a)在位置1處賦予GIP激動劑活性之胺基酸修飾，
(b)在位置i與i+4處之胺基酸之側鏈之間或在位置j與j+3處之胺基酸之側鏈之間的內醯胺橋，其中i係12、13、16、17、20或24，及其中j係17，
(c)在位置27、28及29之一、二或全部處的胺基酸修飾，例如，在位置27及/或28處之胺基酸修飾，及
(d)1-9或1-6個進一步的胺基酸修飾，例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9個進一步的胺基酸修飾，且該類似物對GIP受體活化之EC50係約10 nM或以下。
此等具體例之類似物的內醯胺橋可係如文中所述之內醯胺橋。參見，例如，「使α螺旋結構穩定化」之章節中之內醯胺橋的教示。舉例來說，內醯胺橋可係位在位置16及20處之胺基酸之間，其中在位置16及20處之一個胺基酸係經Glu取代及在位置16及20處之另一個胺基酸係經Lys取代。
根據此等具體例，類似物可包含，例如，SEQ ID NO：5-94中任一者之胺基酸序列。
在其他範例具體例中，具有GIP激動劑活性之胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的類似物包含以下修飾：
(a)在位置1處賦予GIP激動劑活性之胺基酸修飾，
(b)該類似物之位置16、20、21、及24處之一個、兩個、三個、或全部的胺基酸係經α,α-二取代胺基酸取代，
(c)在位置27、28及29之一、二或全部處的胺基酸修飾，例如，在位置27及/或28處之胺基酸修飾，及
(d)1-9或1-6個進一步的胺基酸修飾，例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9個進一步的胺基酸修飾，且該類似物對GIP受體活化之EC50係約10 nM或以下。
此等具體例之類似物的α,α-二取代胺基酸可係任何的α,α-二取代胺基酸，包括，但不限於，胺基異丁酸(AIB)、經選自甲基、乙基、丙基、及正丁基之相同或不同基團、或經環辛烷或環庚烷二取代的胺基酸(例如，1-胺基環辛烷-1-羧酸)。在某些具體例中，α,α-二取代胺基酸係AIB。在某些具體例中，位置20處之胺基酸係經α,α-二取代胺基酸(例如，AIB)取代。
根據此等具體例，類似物可包含，例如，SEQ ID NO：99-141、144-164、166-169、及173-178中任一者之胺基酸序列。
在又其他的範例具體例中，具有GIP激動劑活性之胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的類似物包含以下修飾：
(a)在位置1處賦予GIP激動劑活性之胺基酸修飾，
(b)位置16處之Ser經式IV之胺基酸的胺基酸取代：
其中n係1至16、或1至10、或1至7、或1至6、或2至6，R1 及R2 各係獨立地選自由以下基團組成之群：H、C1 -C18 烷基、(C1 -C18 烷基)OH、(C1 -C18 烷基)NH2 、(C1 -C18 烷基)SH、(C0 -C4 烷基)(C3 -C6 )環烷基、(C0 -C4 烷基)(C2 -C5 雜環基)、(C0 -C4 烷基)(C6 -C10 芳基)R7 、及(C1 -C4 烷基)(C3 -C9 雜芳基)，其中R7 係H或OH，及式IV之胺基酸的側鏈包含自由胺基，
(c)位置20處之Gln經α,α-二取代胺基酸的胺基酸取代，
(d)在位置27、28及29之一、二或全部處的胺基酸修飾，例如，在位置27及/或28處之胺基酸修飾，及
(e)1-9或1-6個進一步的胺基酸修飾，例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9個進一步的胺基酸修飾，且該類似物對GIP受體活化之EC50係約10 nM或以下。
此等具體例之類似物的式IV胺基酸可係任何的胺基酸，諸如，比方說，式IV之胺基酸，其中n係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或16。在某些具體例中，n係2、3、4、或5，在此情況中，胺基酸分別係Dab、Orn、Lys、或升Lys。
此等具體例之類似物的α,α-二取代胺基酸可係任何的α,α-二取代胺基酸，包括，但不限於，胺基異丁酸(AIB)、經選自甲基、乙基、丙基、及正丁基之相同或不同基團、或經環辛烷或環庚烷二取代的胺基酸(例如，1-胺基環辛烷-1-羧酸)。在某些具體例中，α,α-二取代胺基酸係AIB。
根據此等具體例，類似物可包含，例如，SEQ ID NO：99-165中任一者之胺基酸序列。
在又其他的範例具體例中，具有GIP激動劑活性之胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的類似物包含：
(a)在位置1處賦予GIP激動劑活性之胺基酸修飾，及
(b)在位置29處之胺基酸C-端之約1至約21個胺基酸的延伸，其中該延伸之至少一個胺基酸經醯化或烷化，其中該類似物對GIP受體活化之EC50係約10 nM或以下。
在一些具體例中，經醯化或烷化之胺基酸係式I、II、或III之胺基酸。在更特定的具體例中，式I之胺基酸係Dab、Orn、Lys、或升Lys。此外，在一些具體例中，約1至約21個胺基酸之延伸包含GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：95)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：96)(其中X係任何胺基酸)、或GPSSGAPPPK(SEQ ID NO：170)或XGPSSGAPPPK(SEQ ID NO：171)或XGPSSGAPPPSK(SEQ ID NO：172)(其中X係Gly或小的脂族或非極性或輕度極性胺基酸)之胺基酸序列。在一些具體例中，該約1至約21個胺基酸可包括含有一或多個相對於SEQ ID NO：95、96、170、171或172之保留性取代的序列。在一些具體例中，經醯化或烷化之胺基酸係位在C-端延伸類似物的位置37、38、39、40、41、42、或43處。在某些具體例中，經醯化或烷化之胺基酸係位在C-端延伸類似物的位置40處。
在一些具體例中，具有GIP激動劑活性之類似物進一步包含在位置27、28及29之一、二或全部處的胺基酸修飾，例如，在位置27及/或28處之胺基酸修飾。
在以上範例具體例之任一者中，在位置1處賦予GIP激動劑活性之胺基酸修飾可係His經不含咪唑側鏈之胺基酸的取代。位置1處之胺基酸修飾可係，例如，His經大的芳族胺基酸之取代。在一些具體例中，大的芳族胺基酸係文中所述之任一者，包括，例如，Tyr。
此外，關於以上的範例具體例，在位置27、28及29之一、二或全部處的胺基酸修飾可係文中所述之在此等位置的任何修飾。舉例來說，位置27處之Met可經大的脂族胺基酸(視情況為Leu)取代，位置28處之Asn可經小的脂族胺基酸(視情況為Ala)取代，及/或位置29處之Thr可經小的脂族胺基酸(視情況為Gly)取代。或者，類似物可包含在位置27及/或28處之此等胺基酸修飾。
以上範例具體例之類似物可進一步包含1-9或1-6個進一步的額外胺基酸修飾，例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9個進一步的胺基酸修飾，諸如，比方說，文中所述之任何提高或減低對任何GIP、GLP-1、及胰高血糖素受體之活性、改良溶解度、改良循環中之作用期間或半衰期、延遲作用之開始、或提高穩定性的修飾。類似物可進一步包含，例如，在位置12處視情況經Ile取代的胺基酸修飾、及/或在位置17及18處視情況經位置17處之Q及位置18處之A取代的胺基酸修飾、及/或加成GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：95)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：96)、或含有一或多個相對於SEQ ID NO：95或96對C-端之保留性取代的序列。該類似物可包含一或多個以下的修飾：
(i)位置2處之Ser經D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、AIB、Val、或α-胺基-N-丁酸取代；
(ii)位置10處之Tyr經Trp、Lys、Orn、Glu、Phe、或Val取代；
(iii)一醯基鍵聯至位置10處之Lys；
(iv)位置12處之Lys經Arg取代；
(v)位置16處之Ser經Glu、Gln、升麩胺酸、升半胱胺磺酸、Thr、Gly、或AIB取代；
(vi)位置17處之Arg經Gln取代；
(vii)位置18處之Arg經Ala、Ser、Thr、或Gly取代；
(viii)位置20處之Gln經Ala、Ser、Thr、Lys、瓜胺酸、Arg、Orn、或AIB取代；
(ix)位置21處之Asp經Glu、升麩胺酸、升半胱胺磺酸取代；
(x)位置23處之Val經Ile取代；
(xi)位置24處之Gln經Asn、Ala、Ser、Thr、或AIB取代；及
(xii)在位置2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28、及29中任一者處之保留性取代。
在一些具體例中之類似物包含修飾(i)至(xii)之組合。或者或另外地，類似物可包含位置3處之胺基酸修飾(例如，Gln經Glu之胺基酸取代)，其中該類似物對胰高血糖素受體具有胰高血糖素之低於1%的活性。或者或另外地，類似物可包含位置7處之胺基酸修飾(例如，Thr經不含羥基之胺基酸(例如，Abu或Ile)之胺基酸取代)，其中該類似物對GLP-1受體具有GLP-1之低於約10%的活性。
關於範例具體例，類似物可共價鍵聯至親水性部分。在一些具體例中，類似物係共價鍵聯至胺基酸位置16、17、20、21、24、29、40、或C-端之任一者處的親水性部分。在某些具體例中，類似物包括C-端延伸(例如，SEQ ID NO：95之胺基酸序列)及包含親水性部分之胺基酸的加成，以致親水性部分於位置40處共價鍵聯至類似物。
在一些具體例中，親水性部分係共價鍵聯至類似物之Lys、Cys、Orn、升半胱胺酸、或乙醯基-苯丙胺酸。Lys、Cys、Orn、升半胱胺酸、或乙醯基-苯丙胺酸可係胰高血糖素序列(SEQ ID NO：1)之天然的胺基酸，或其可係取代SEQ ID NO：1之天然胺基酸的胺基酸。在一些具體例中，其中該親水性部分係連接至Cys，對親水性部分之鍵聯可包含以下結構
關於包含親水性部分之類似物，該親水性部分可係文中所述之任何親水性部分。參見，例如，在「親水性部分之鍵聯」章節下的教示。在一些具體例中，親水性部分係聚乙二醇(PEG)。某些具體例中之PEG具有約1,000道耳吞至約40,000道耳吞，例如，約20,000道耳吞至約40,000道耳吞之分子量。
關於範例具體例，類似物可包含其中之側鏈係共價鍵聯至醯基或烷基(例如，對於天然產生之胺基酸係非天然的醯基或烷基)的經修飾胺基酸。經醯化或烷化之類似物可係根據「醯化及烷化」之章節中所述的經醯化或烷化肽。在一些具體例中，醯基係C4至C30脂肪醯基，諸如，比方說，C10脂肪醯基或烷基、C12脂肪醯基或烷基、C14脂肪醯基或烷基、C16脂肪醯基或烷基、C18脂肪醯基或烷基、C20醯基或烷基、或C22醯基或烷基。醯基或烷基可共價連接至類似物之任何胺基酸，包括，但不限於，位置10或40處之胺基酸、或C-端胺基酸。在某些具體例中，類似物包括C-端延伸(例如，SEQ ID NO：95之胺基酸序列)及包含醯基或烷基之胺基酸的加成，以致醯基或烷基係於位置40處共價鍵聯至類似物。在一些具體例中，醯基或烷基係共價鍵聯至式I、II、或III之胺基酸(例如，Lys殘基)的側鏈。醯基或烷基可共價鍵聯至對胰高血糖素序列(SEQ ID NO：1)為天然的胺基酸，或可鍵聯至加成至SEQ ID NO：1之序列或至SEQ ID NO：1接著SEQ ID NO：95之序列的胺基酸(在N-或C-端)，或可鍵聯至取代天然胺基酸的胺基酸(例如，在SEQ ID NO：1之位置10處的Tyr)。
在以上的範例具體例中，其中該類似物包含醯基或烷基，該類似物可透過如文中所述之間隔物連接至醯基或烷基。該間隔物，例如，可係3至10個原子長度，且可係，例如，胺基酸(例如，6-胺基己酸、文中所述之任何胺基酸)、二肽(例如，Ala-Ala、βAla-βAla、Leu-Leu、Pro-Pro、γGlu-γGlu)、三肽、或親水性或疏水性雙官能間隔物。在某些態樣中，間隔物及醯基或烷基之總長度係約14至約28個原子。
在又進一步的範例具體例中，具有GIP激動劑活性之胰高血糖素的類似物包含根據SEQ ID NO：227、228、229或230中任一者之胺基酸序列，其進一步包含以下修飾：
(a)視情況在位置1處賦予GIP激動劑活性之胺基酸修飾，
(b)在位置29處之胺基酸C-端之約1至約21個胺基酸的延伸，其中該延伸之至少一個胺基酸經醯化或烷化，及
(c)至多6個進一步的胺基酸修飾，其中該類似物對GIP受體活化之EC50係約10 nM或以下。
在一些態樣中，經醯化或烷化之胺基酸係式I、II、或III之胺基酸。在更特定的具體例中，式I之胺基酸係Dab、Orn、Lys、或升Lys。此外，在一些具體例中，該約1至約21個胺基酸包含GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：95)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：96)(其中X係任何胺基酸)、或GPSSGAPPPK(SEQ ID NO：170)或XGPSSGAPPPK(SEQ ID NO：171)或XGPSSGAPPPSK(SEQ ID NO：172)(其中X係Gly或小的脂族或非極性或輕度極性胺基酸)之胺基酸序列。在一些具體例中，該約1至約21個胺基酸可包括含有一或多個相對於SEQ ID NO：95、96、170、171或172之保留性取代的序列。在一些具體例中，經醯化或烷化之胺基酸係位在C-端延伸類似物的位置37、38、39、40、41、42、或43處。在某些具體例中，經醯化或烷化之胺基酸係位在C-端延伸類似物的位置40處。
在以上範例具體例之任一者中，在位置1處賦予GIP激動劑活性之胺基酸可係不含咪唑側鏈之胺基酸。位置1處之胺基酸可係，例如，大的芳族胺基酸。在一些具體例中，大的芳族胺基酸係文中所述之任一者，包括，例如，Tyr。
以上範例具體例之類似物可進一步包含1-6個進一步的胺基酸修飾，諸如，比方說，文中所述之任何提高或減低對任何GIP、GLP-1、及胰高血糖素受體之活性、改良溶解度、改良循環中之作用期間或半衰期、延遲作用之開始、或提高穩定性的修飾。
在某些態樣中，以上範例具體例中所述之胰高血糖素類似物包含在位置27、28及29之一、二或全部處的進一步胺基酸修飾。在此等位置之修飾可係文中所述之相對於此等位置的任何修飾。舉例來說，相對於SEQ ID NO：227、228、229或230之位置27可經大的脂族胺基酸(例如，Leu、Ile或正白胺酸)或Met取代，位置28可經另一小的脂族胺基酸(例如，Gly或Ala)或Asn取代，及/或位置29可經另一小的脂族胺基酸(例如，Ala或Gly)或Thr取代。或者，類似物可包含在位置27及/或28處之此等胺基酸修飾。
類似物可進一步包含一或多個以下的額外修飾：
(i)位置2處之胺基酸係D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、AIB、Val、或α-胺基-N-丁酸中之任一者；
(ii)位置10處之胺基酸係Tyr、Trp、Lys、Orn、Glu、Phe、或Val；
(iii)一醯基鍵聯至位置10處之Lys；
(iv)位置12處之胺基酸係Ile、Lys或Arg；
(v)位置16處之胺基酸係Ser、Glu、Gln、升麩胺酸、升半胱胺磺酸、Thr、Gly、或AIB中之任一者；
(vi)位置17處之胺基酸係Gln或Arg；
(vii)位置18處之胺基酸係Ala、Arg、Ser、Thr、或Gly中之任一者；
(viii)位置20處之胺基酸係Ala、Ser、Thr、Lys、瓜胺酸、Arg、Orn、或AIB或另一α,α-二取代胺基酸中之任一者；
(ix)位置21處之胺基酸係Glu、Asp、升麩胺酸、升半胱胺磺酸中之任一者；
(x)位置23處之胺基酸係Val或Ile；
(xi)位置24處之胺基酸係Gln、Asn、Ala、Ser、Thr、或AIB中之任一者；及
(xii)一或多個在位置2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28、及29中任一者處之保留性取代。
一些具體例中之類似物包含修飾(i)至(xii)之組合。或者或另外地，類似物可包含位置3處之胺基酸修飾(例如’Gln經Glu之胺基酸取代)，其中該類似物對胰高血糖素受體具有胰高血糖素之低於1%的活性。或者或另外地，類似物可包含位置7處之胺基酸修飾(例如，Thr經不含羥基之胺基酸(例如，Abu或Ile)的胺基酸取代)，其中該類似物對GLP-1受體具有GLP-1之低於約10%的活性。
關於範例具體例，類似物可共價鍵聯至親水性部分。在一些具體例中，類似物係共價鍵聯至胺基酸位置16、17、20、21、24、29、40、或C-端之任一者處的親水性部分。在某些具體例中，類似物包括在位置24處共價鍵聯至類似物的親水性部分。
在一些具體例中，親水性部分係共價鍵聯至類似物之Lys、Cys、Orn、升半胱胺酸、或乙醯基-苯丙胺酸。Lys、Cys、Orn、升半胱胺酸、或乙醯基-苯丙胺酸可係SEQ ID NO：1、227、228、229或230之天然的胺基酸，或其可係經取代的胺基酸。在一些具體例中，其中該親水性部分係鍵聯至Cys，該鍵聯可包含以下結構
關於包含親水性部分之類似物，該親水性部分可係文中所述之任何親水性部分。參見，例如，在「親水性部分之鍵聯」章節下的教示。在一些具體例中，親水性部分係聚乙二醇(PEG)。某些具體例中之PEG具有約1,000道耳吞至約40,000道耳吞，例如，約20,000道耳吞至約40,000道耳吞之分子量。
關於範例具體例，類似物可包含其中之側鏈係共價鍵聯至醯基或烷基之位於C-端延伸內的經修飾胺基酸。經醯化或烷化之類似物可係根據「醯化及烷化」之章節中所述的經醯化或烷化肽。在一些具體例中，醯基係C4至C30脂肪醯基，諸如，比方說，C10脂肪醯基或烷基、C12脂肪醯基或烷基、C14脂肪醯基或烷基、C16脂肪醯基或烷基、C18脂肪醯基或烷基、C20醯基或烷基、或C22醯基或烷基。醯基或烷基可共價連接至類似物之任何胺基酸，包括，但不限於，位置10或40處之胺基酸、或C-端胺基酸。在一些具體例中，醯基或烷基係共價鍵聯至式I、II、或III之胺基酸(例如，Lys殘基)的側鏈。醯基或烷基係共價鍵聯至對SEQ ID NO：1、227、228、229或230為天然的胺基酸，或其可鍵聯至經取代胺基酸。醯基或烷基係共價鍵聯至對SEQ ID NO：95、96、171或172為天然的胺基酸，或其可鍵聯至經取代胺基酸。
在以上的範例具體例中，其中該類似物包含醯基或烷基，該類似物可透過如文中所述之間隔物連接至醯基或烷基。該間隔物，例如，可係3至10個原子長度，且可係，例如，胺基酸(例如，6-胺基己酸、文中所述之任何胺基酸)、二肽(例如，Ala-Ala、βAla-βAla、Leu-Leu、Pro-Pro、γGlu-γGlu)、三肽、或親水性或疏水性雙官能間隔物。在某些態樣中，間隔物及醯基或烷基之總長度係約14至約28個原子。
在一些非常特定的具體例中，本發明之類似物包含選自由SEQ ID NO：99-141、144-164、166、192-207、209-221及223或選自由SEQ ID NO：167-169、173-178及225所組成之群之胺基酸序列。
此外，本發明之類似物的特定實例包括，但不限於，表1-3中所提及之任一者。
在又進一步的範例具體例中，具有GIP激動劑活性之胰高血糖素的類似物包含醯基或烷基(例如，對天然產生之胺基酸為非天然的醯基或烷基)，其中該醯基或烷基係連接至一間隔物，其中(i)該間隔物係連接至類似物之位置10處之胺基酸的側鏈；或(ii)類似物包含在位置29處之胺基酸C-端之1至21個胺基酸的延伸，且該間隔物係連接至對應於相對於SEQ ID NO：1之位置37-43之一者之胺基酸的側鏈，其中該類似物對GIP受體活化之EC50係約10 nM或以下。
在此等具體例中，類似物可包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列與(i)在位置1處賦予GIP激動劑活性之胺基酸修飾、(ii)在位置27、28、及29之一、二或全部處的胺基酸修飾、(iii)下列至少一者：
(A)該類似物包含在位置i及i+4處之胺基酸之側鏈之間或在位置j及j+3處之胺基酸之側鏈之間的內醯胺橋，其中i係12、13、16、17、20或24，及其中j係17，
(B)在類似物之位置16、20、21、及24處之胺基酸中的一、二、三個、或全部係經α,α-二取代胺基酸取代；或
(C)該類似物包含(i)位置16處之Ser經式IV之胺基酸的胺基酸取代：
其中n係1至7，其中R1 及R2 各係獨立地選自由以下基團組成之群：H、C1 -C18 烷基、(C1 -C18 烷基)OH、(C1 -C18 烷基)NH2 、(C1 -C18 烷基)SH、(C0 -C4 烷基)(C3 -C6 )環烷基、(C0 -C4 烷基)(C2 -C5 雜環基)、(C0 -C4 烷基)(C6 -C10 芳基)R7 、及(C1 -C4 烷基)(C3 -C9 雜芳基)，其中R7 係H或OH，及式IV之胺基酸的側鏈包含自由胺基；及(ii)位置20處之Gln經α,α-二取代胺基酸的胺基酸取代，及(iv)至多6個進一步的胺基酸修飾。
此等具體例之類似物的α,α-二取代胺基酸可為任何的α,α-二取代胺基酸，包括，但不限於，胺基異丁酸(AIB)、經選自甲基、乙基、丙基、及正丁基之相同或不同基團、或經環辛烷或環庚烷二取代的胺基酸(例如，1-胺基環辛烷-1-羧酸)。在某些具體例中，α,α-二取代胺基酸係AIB。
此等具體例之類似物的式IV胺基酸可係任何的胺基酸，諸如，比方說，式IV之胺基酸，其中n係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或16。在某些具體例中，n係2、3、4、或5，在此情況中，胺基酸分別係Dab、Orn、Lys、或升Lys。
在任何以上的範例具體例中，位置1處賦予GIP激動劑活性之胺基酸修飾可係His經不含咪唑側鏈之胺基酸取代。位置1處之胺基酸修飾可係，例如，His經大的芳族胺基酸取代。在一些具體例中，大的芳族胺基酸係文中所述之任一者，包括，例如，Tyr。
此外，關於以上的範例具體例，在位置27、28、及29之一、二或全部處的胺基酸修飾可係文中所述之任何在此等位置處的修飾。舉例來說，位置27處之Met可經大的脂族胺基酸(視情況為Leu)取代，位置28處之Asn可經小的脂族胺基酸(視情況為Ala)取代，及/或位置29處之Thr可經小的脂族胺基酸(視情況為Gly)取代。或者，類似物可包含在位置27及/或28處的此等胺基酸修飾。
以上範例具體例之類似物可進一步包含1-9或1-6個進一步的額外胺基酸修飾，例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9個進一步的胺基酸修飾，諸如，比方說，文中所述之任何提高或減低對任何GIP、GLP-1、及胰高血糖素受體之活性、改良溶解度、改良循環中之作用期間或半衰期、延遲作用之開始、或提高穩定性的修飾。類似物可進一步包含，例如，在位置12處視情況經Ile取代的胺基酸修飾、及/或在位置17及18處視情況經位置17處之Q及位置18處之A取代的胺基酸修飾、及/或加成GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：95)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：96)、或含有一或多個相對於SEQ ID NO：95或96對C-端之保留性取代的序列。該類似物可包含一或多個以下的修飾：
(i)位置2處之Ser經D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、AIB、Val、或α-胺基-N-丁酸取代；
(ii)位置10處之Tyr經Trp、Lys、Orn、Glu、Phe、或Val取代；
(iii)一醯基鍵聯至位置10處之Lys；
(iv)位置12處之Lys經Arg取代；
(v)位置16處之Ser經Glu、Gln、升麩胺酸、升半胱胺磺酸、Thr、Gly、Lys、或AIB取代；
(vi)位置17處之Arg經Gln取代；
(vii)位置18處之Arg經Ala、Ser、Thr、或Gly取代；
(viii)位置20處之Gln經Ala、Ser、Thr、Lys、瓜胺酸、Arg、Orn、或AIB取代；
(ix)位置21處之Asp經Glu、升麩胺酸、升半胱胺磺酸取代；
(x)位置23處之Val經Ile取代；
(xi)位置24處之Gln經Asn、Ala、Ser、Thr、或AIB取代；及
(xii)在位置2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28、及29中任一者處之保留性取代。
在一些具體例中之類似物包含修飾(i)至(xii)之組合。或者或另外地，類似物可包含位置3處之胺基酸修飾(例如，Gln經Glu之胺基酸取代)，其中該類似物對胰高血糖素受體具有胰高血糖素之低於1%的活性。或者或另外地，類似物可包含位置7處之胺基酸修飾(例如，Thr經不含羥基之胺基酸(例如，Abu或Ile)之胺基酸取代)、刪除位置27或28處之胺基酸C-端的胺基酸、產生27-或28-胺基酸肽、或其之組合，其中該類似物對GLP-1受體具有GLP-1之低於約10%的活性。
關於範例具體例，類似物可共價鍵聯至親水性部分。在一些具體例中，類似物係共價鍵聯至胺基酸位置16、17、20、21、24、29、40、或C-端之任一者處的親水性部分。在某些具體例中，類似物包括C-端延伸(例如，SEQ ID NO：95之胺基酸序列)及包含親水性部分之胺基酸的加成，以致親水性部分於位置40處共價鍵聯至類似物。
在一些具體例中，親水性部分係共價鍵聯至類似物之Lys、Cys、Orn、升半胱胺酸、或乙醯基-苯丙胺酸。Lys、Cys、Orn、升半胱胺酸、或乙醯基-苯丙胺酸可係胰高血糖素序列(SEQ ID NO：1)之天然的胺基酸，或其可係取代SEQ ID NO：1之天然胺基酸的胺基酸。在一些具體例中，其中該親水性部分係連接至Cys，對親水性部分之鍵聯可包含以下結構
關於包含親水性部分之類似物，該親水性部分可係文中所述之任何親水性部分。參見，例如，在「親水性部分之鍵聯」章節下的教示。在一些具體例中，親水性部分係聚乙二醇(PEG)。某些具體例中之PEG具有約1,000道耳吞至約40,000道耳吞，例如，約20,000道耳吞至約40,000道耳吞之分子量。
在範例具體例中，其中該類似物包含透過間隔物連接至類似物之醯基或烷基，該間隔物可係如文中所述之任何間隔物。該間隔物，例如，可係3至10個原子長度，且可係，例如，胺基酸(例如，6-胺基己酸、文中所述之任何胺基酸)、二肽(例如，Ala-Ala、βAla-βAla、Leu-Leu、Pro-Pro、γGlu-γGlu)、三肽、或親水性或疏水性雙官能間隔物。在某些態樣中，間隔物及醯基或烷基之總長度係約14至約28個原子。
醯基或烷基係如文中所述之任何醯基或烷基，諸如對天然產生之胺基酸係非天然的醯基或烷基。一些具體例中之醯基或烷基係C4至C30脂肪醯基，諸如，比方說，C10脂肪醯基或烷基、C12脂肪醯基或烷基、C14脂肪醯基或烷基、C16脂肪醯基或烷基、C18脂肪醯基或烷基、C20醯基或烷基、或C22醯基或烷基、或C4至C30烷基。在特定具體例中，醯基係C12至C18脂肪醯基(例如，C14或C16脂肪醯基)。
在一些具體例中，在類似物之位置29處之胺基酸C-端之約1至約21個胺基酸之延伸包含GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：95)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：96)(其中X係任何胺基酸)、或GPSSGAPPPK(SEQ ID NO：170)或XGPSSGAPPPK(SEQ ID NO：171)或XGPSSGAPPPSK(SEQ ID NO：172)(其中X係Gly或小的脂族或非極性或輕度極性胺基酸)之胺基酸序列。在一些具體例中，該約1至約21個胺基酸可包括含有一或多個相對於SEQ ID NO：95、96、170、171或172之保留性取代的序列。在一些具體例中，經醯化或烷化之胺基酸係位在C-端延伸類似物的位置37、38、39、40、41、42、或43處。在某些具體例中，經醯化或烷化之胺基酸係位在C-端延伸類似物的位置40處。
醫藥組成物及治療方法
在一些態樣中，本發明提供一種包含任何本文所揭示之新穎胰高血糖素肽(其較佳為無菌且較佳具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之純度值)、及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑的醫藥組成物。此等組成物可包含濃度至少A的胰高血糖素肽，其中A係0.001毫克/毫升、0.01毫克/毫升、0.1毫克/毫升、0.5毫克/毫升、1毫克/毫升、2毫克/毫升、3毫克/毫升、4毫克/毫升、5毫克/毫升、6毫克/毫升、7毫克/毫升、8毫克/毫升、9毫克/毫升、10毫克/毫升、11毫克/毫升、12毫克/毫升、13毫克/毫升、14毫克/毫升、15毫克/毫升、16毫克/毫升、17毫克/毫升、18毫克/毫升、19毫克/毫升、20毫克/毫升、21毫克/毫升、22毫克/毫升、23毫克/毫升、24毫克/毫升、25毫克/毫升或以上。在其他具體例中，此等組成物可包含濃度至多B的胰高血糖素肽，其中B係30毫克/毫升、25毫克/毫升、24毫克/毫升、23毫克/毫升、22毫克/毫升、21毫克/毫升、20毫克/毫升、19毫克/毫升、18毫克/毫升、17毫克/毫升、16毫克/毫升、15毫克/毫升、14毫克/毫升、13毫克/毫升、12毫克/毫升、11毫克/毫升、10毫克/毫升、9毫克/毫升、8毫克/毫升、7毫克/毫升、6毫克/毫升、5毫克/毫升、4毫克/毫升、3毫克/毫升、2毫克/毫升、1毫克/毫升、或0.1毫克/毫升。在一些具體例中，組成物可包含在A至B毫克/毫升之濃度範圍的胰高血糖素肽，例如，0.001至30.0毫克/毫升。在一具體例中，醫藥組成物包含經滅菌且視情況儲存於各種容器內的水溶液。在一些具體例中，可使用本發明之化合物於製備立即可注射的預調配溶液。在其他具體例中，醫藥組成物包含凍乾粉末。醫藥組成物可經進一步包裝為包括用於將組成物投與病患之可棄式裝置之套組的部分。容器或套組可經標示為在環境室溫或在冷凍溫度下儲存。
胰高血糖素肽可使用任何標準的給藥途徑(包括非經腸道，諸如靜脈內、腹膜內、皮下或肌肉內、鞘內、經皮、經直腸、經口、經鼻或經吸入)投與病患。在一具體例中，組成物係經皮下或肌肉內投與。
在一具體例中，套組具有用於將胰高血糖素組成物投與病患的裝置，例如，注射器針、筆裝置、噴射注入器或其他不含針的注入器。另一種方式或除此之外，套組可包括一或多個容器，例如，小藥瓶、管、瓶、單室或多室預填充注射器、卡匣、輸注泵(外部或可植入式)、噴射注入器、預填充筆裝置及其類似物，其視情況含有呈凍乾形式或呈水溶液的胰高血糖素肽。套組較佳亦包括使用說明。在一些具體例中，套組之裝置係氣溶膠配送裝置，其中該組成物係預包裝於氣溶膠裝置內。在另一具體例中，套組包括注射器及針，且在一具體例中，將無菌胰高血糖素組成物預包裝於注射器內。
根據一具體例，提供一種醫藥組成物，其中該組成物包含本揭示案之GIP活性胰高血糖素類似物、或其醫藥學上可接受之鹽、及醫藥學上可接受之載劑。醫藥組成物可包含任何醫藥學上可接受之成分，包括，例如，酸化劑、添加劑、吸附劑、氣溶膠推進劑、空氣置換劑、鹼化劑、防結塊劑、抗凝聚劑、抗微生物防腐劑、抗氧化劑、抗菌劑、鹼、黏合劑、緩衝劑、鉗合劑、塗布劑、著色劑、乾燥劑、清潔劑、稀釋劑、消毒劑、崩解劑、分散劑、溶解增進劑、染料、潤滑藥、乳化劑、乳液穩定劑、填料、成膜劑、香味增進劑、芳香劑、流動增進劑、膠凝劑、製粒劑、濕潤劑、潤滑劑、黏膜黏著劑、軟膏基質、軟膏、油質媒劑、有機鹼、錠劑基質、顏料、增塑劑、磨光劑、防腐劑、螯隔劑、皮膚滲透劑、增溶劑、溶劑、穩定劑、栓劑基質、表面活性劑、界面活性劑、懸浮劑、甜味劑、治療劑、增稠劑、張力劑、毒性劑、黏度提高劑、吸水劑、可與水相混溶之共溶劑、水軟化劑、或潤濕劑。
在一些具體例中，醫藥組成物包含以下成分之任一者或組合：阿拉伯膠、醋磺內酯鉀、檸檬酸乙醯基三丁酯、檸檬酸乙醯基三乙酯、瓊脂、白蛋白、醇、脫水醇、變性醇、稀醇、蟲膠酸、海藻酸、脂族聚酯、氧化鋁、氫氧化鋁、硬脂酸鋁、支鏈澱粉、α-直鏈澱粉、抗壞血酸、抗壞血酸基棕櫚酸酯、阿斯巴甜、注射用之抑菌水、皂土、膨潤土乳、氯化苯甲烴銨、氯化苯齊松(benzethonium chloride)、苯甲酸、苯甲醇、苯甲酸苄酯、溴硝丙二醇(bronopol)、丁基化羥基甲氧苯、丁基化羥基甲苯、對羥基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸丁酯鈉、海藻酸鈣、抗壞血酸鈣、碳酸鈣、環己胺磺酸鈣、無水磷酸氫鈣、脫水磷酸氫鈣、磷酸三鈣、丙酸鈣、矽酸鈣、山梨酸鈣、硬脂酸鈣、硫酸鈣、半水合硫酸鈣、菜籽油、卡波姆(carbomer)、二氧化碳、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、β-胡蘿蔔素、角叉菜膠、蓖麻油、氫化蓖麻油、陽離子乳化蠟、醋酸纖維素、醋酸酞酸纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素、粉狀纖維素、矽化微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、鯨蠟硬脂醇(cetostearyl alcohol)、溴化十六烷基三甲銨(cetrimide)、鯨蠟醇、洗必太(chlorhexidine)、氯丁醇、氯甲酚、膽固醇、洗必太乙酸鹽、洗必太葡萄糖酸鹽、洗必太鹽酸鹽、氯二氟乙烷(HCFC)、氯二氟甲烷、氯氟碳化物(CFC)氯苯氧乙醇、氯二甲苯酚、玉米糖漿固體、無水檸檬酸、單水合檸檬酸、可可脂、著色劑、玉米油、棉籽油、甲酚、間甲酚、鄰甲酚、對甲酚、交聯羧甲基纖維素鈉、交聯聚乙烯吡咯啶酮(crospovidone)、環己胺磺酸、環糊精、葡萄糖結合劑(dextrate)、糊精、葡萄糖、無水葡萄糖、重氮烷基咪唑脲(diazolidinyl urea)、酞酸二丁酯、癸二酸二丁酯、二乙醇胺、酞酸二乙酯、二氟乙烷(HFC)、二甲基-β-環糊精、環糊精型化合物諸如Captisol、二甲醚、酞酸二甲酯、乙二胺四乙酸二鉀、乙二胺四乙酸二鈉、磷酸氫二鈉、多庫酯(docusate)鈣、多庫酯鉀、多庫酯鈉、五倍子酸十二烷酯、溴化十二烷基三甲銨、乙二胺四乙酸鈣二鈉、乙二胺四乙酸、N-乙基D-葡糖胺、乙醇、乙基纖維素、五倍子酸乙酯、月桂酸乙酯、乙基麥芽酚、油酸乙酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸乙酯鉀、對羥基苯甲酸乙酯鈉、乙基香草醛、果糖、果糖液體、研磨果糖、無熱原果糖、粉狀果糖、反丁烯二酸、明膠、葡萄糖、液態葡萄糖、飽和植物脂肪酸之甘油酯混合物、甘油、蘿酸甘油酯、單油酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、自乳化單硬脂酸甘油酯、棕櫚硬脂酸甘油酯、甘胺酸、二醇、四氫呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、古亞膠(guar gum)、七氟丙烷(HFC)、溴化十六烷基三甲銨、高果糖糖漿、人類血清白蛋白、碳氫化合物(HC)、稀鹽酸、氫化植物油、第II型、羥乙基纖維素、2-羥乙基-β-環糊精、羥丙基纖維素、低取代羥丙基纖維素、2-羥丙基-β-環糊精、羥丙基甲基纖維素、酞酸羥丙基甲基纖維素、咪唑烷基脲(imidurea)、靛卡紅(indigo carmine)、離子交換劑、氧化鐵、異丙醇、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、等張食鹽水、高嶺土、乳酸、乳糖醇、乳糖、羊毛脂、羊毛脂醇、無水羊毛脂、卵磷脂、矽酸鎂鋁、碳酸鎂、正碳酸鎂、無水碳酸鎂、氫氧化碳酸鎂、氫氧化鎂、月桂基硫酸鎂、氧化鎂、矽酸鎂、硬脂酸鎂、三矽酸鎂、無水三矽酸鎂、蘋果酸、麥芽、氫化麥芽糖、氫化麥芽糖溶液、麥芽糊精、麥芽醇、麥芽糖、甘露糖醇、中鏈三甘油酯、葡甲胺、薄荷腦、甲基纖維素、甲基丙烯酸甲酯、油酸甲酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸甲酯鉀、對羥基苯甲酸甲酯鈉、微晶纖維素及羧甲基纖維素鈉、礦物油、輕質礦物油、礦物油及羊毛脂醇、油、橄欖油、單乙醇胺、微晶高嶺石、五倍子酸辛酯、油酸、棕櫚酸、石蠟、花生油、石蠟脂、石蠟脂及羊毛脂醇、醫藥釉料、酚、液化酚、苯氧乙醇、苯氧丙醇、苯乙醇、乙酸苯基汞、硼酸苯基汞、硝酸苯基汞、波拉克林(polacrilin)、波拉克林鉀、聚羥亞烴(poloxamer)、聚葡萄糖、聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯-聚氧伸丙基嵌段聚合物、聚甲基丙烯酸酯、聚氧伸乙基烷基醚、聚氧伸乙基蓖麻油衍生物、聚氧伸乙基山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧伸乙基硬脂酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、海藻酸鉀、苯甲酸鉀、碳酸氫鉀、亞硫酸氫鉀、氯化鉀、檸檬酸鉀、無水檸檬酸鉀、磷酸氫鉀、偏二亞硫酸鉀、單鹼磷酸鉀、丙酸鉀、山梨酸鉀、普維酮(povidone)、丙醇、丙酸、碳酸丙二酯、丙二醇、丙二醇海藻酸酯、五倍子酸丙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丙酯鉀、對羥基苯甲酸丙酯鈉、硫酸魚精蛋白、菜籽油、生理食鹽水(Ringer's solution)、糖精、糖精銨、糖精鈣、糖精鈉、紅花子油、皂石、血清蛋白質、芝麻油、膠態矽石、膠態二氧化矽、海藻酸鈉、抗壞血酸鈉、苯甲酸鈉、碳酸氫鈉、亞硫酸氫鈉、氯化鈉、無水檸檬酸鈉、脫水檸檬酸鈉、氯化鈉、環己胺磺酸鈉、乙二胺四乙酸鈉、十二烷基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉、偏二亞硫酸鈉、磷酸鈉、二鹼磷酸鈉、單鹼磷酸鈉、三鹼無水丙酸鈉、丙酸鈉、山梨酸鈉、澱粉羥基乙酸鈉、硬脂基反丁烯二酸鈉、亞硫酸鈉、山梨酸、脫水山梨糖醇酯(脫水山梨糖醇脂肪酯)、山梨糖醇、山梨糖醇溶液70%、大豆油、鯨蠟、澱粉、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、預凝膠化澱粉、可滅菌玉米澱粉、硬脂酸、純化硬脂酸、硬脂醇、蔗糖、糖、可壓縮糖、粉糖、糖球、轉化糖、糖片(Sugartab )、食用黃色5號(Sunset Yellow FCF)、合成石蠟、滑石、酒石酸、酒石黃、四氟乙烷(HFC)、可可油(theobroma oil)、乙汞硫柳酸鈉、二氧化鈦、α生育酚、醋酸生育酚、α生育酚琥珀酸酯、β-生育酚、δ-生育酚、γ-生育酚、黃蓍膠、甘油三乙酸酯、檸檬酸三丁酯、三乙醇胺、檸檬酸三乙酯、三甲基-β-環糊精、溴化三甲基十四烷基銨、托立斯緩衝液(tris buffer)、乙二胺四乙酸三鈉、香草醛、I型氫化植物油、水、軟水、硬水、無二氧化碳水、無熱原水、注射用水、吸入用無菌水、注射用無菌水、沖洗用無菌水、蠟、陰離子乳化蠟、巴西棕櫚蠟、陽離子乳化蠟、鯨蠟酯蠟、微晶蠟、非離子乳化蠟、栓劑蠟、白蠟、黃蠟、白石蠟脂、羊毛脂、三仙膠、木糖醇、玉米蛋白、丙酸鋅、鋅鹽、硬脂酸鋅、或任何在以下文獻中的賦形劑：醫藥賦形劑手冊(Handbook of Pharmaceutical Excipients) ，第三版，A.H.Kibbe(Pharmaceutical Press,London,UK,2000)， 將其全體以引用的方式併入本文中。雷氏醫藥科學(Remington’s Pharmaceutical Sciences) ，第十六版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1980)(將其全體以引用的方式併入本文中)揭示各種用於調配醫藥學上可接受之組成物的成分及用於其製備的已知技術。除非任何習知試劑與醫藥組成物不相容，否則涵蓋將其使用於醫藥組成物中。亦可將補充的活性成分併入至組成物中。
本文所揭示之醫藥調配物可如下所述經設計為短效、快速釋放、長效、或緩釋。醫藥調配物亦可經調配為立即釋放、控制釋放或緩慢釋放。本組成物可進一步包含，例如，微膠粒或脂質體、或一些其他囊封形式，或可以延長釋放形式投與以提供長期儲存及/或傳遞作用。所揭示之醫藥調配物可根據任何方案投與，包括，例如，每天(每天1次、每天2次、每天3次、每天4次、每天5次、每天6次)、每兩天、每三天、每四天、每五天、每六天、每週、每雙週、每三週、每月、或每雙月。
在一些具體例中，前述成分可以任何濃度(諸如，比方說，至少A)存在於醫藥組成物中，其中A係0.0001% w/v、0.001% w/v、0.01% w/v、0.1% w/v、1% w/v、2% w/v、5% w/v、10% w/v、20% w/v、30% w/v、40% w/v、50% w/v、60% w/v、70% w/v、80% w/v、或90% w/v。在一些具體例中，前述成分可以任何濃度(諸如，比方說，至多B)存在於醫藥組成物中，其中B係90% w/v、80% w/v、70% w/v、60% w/v、50% w/v、40% w/v、30% w/v、20% w/v、10% w/v、5% w/v、2% w/v、1% w/v、0.1% w/v、0.001% w/v、或0.0001%。在其他具體例中，前述成分可以任何濃度範圍(諸如，比方說，約A至約B)存在於醫藥組成物中。在一些具體例中，A係0.0001%及B係90%。
醫藥組成物可經調配以達到與生理相容的pH。在一些具體例中，醫藥組成物之pH可視調配物及給藥途徑而為至少5、至少5.5、至少6、至少6.5、至少7、至少7.5、至少8、至少8.5、至少9、至少9.5、至少10、或至少10.5直至且包括pH 11。在某些具體例中，醫藥組成物可包含緩衝劑以達到與生理相容的pH。緩衝劑可包括任何可在期望pH下緩衝的化合物，諸如，比方說，磷酸鹽緩衝液(例如，PBS)、三乙醇胺、Tris、二羥乙甘胺酸(bicine)、TAPS、麥黃酮(tricine)、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲基胂酸鹽(cacodylate)、MES等等。在某些具體例中，緩衝劑的濃度係至少0.5 mM、至少1 mM、至少5 mM、至少10 mM、至少20 mM、至少30 mM、至少40 mM、至少50 mM、至少60 mM、至少70 mM、至少80 mM、至少90 mM、至少100 mM、至少120 mM、至少150 mM、或至少200 mM。在一些具體例中，緩衝劑的濃度係不多於300 mM(例如，至多200 mM、至多100 mM、至多90 mM、至多80 mM、至多70 mM、至多60 mM、至多50 mM、至多40 mM、至多30 mM、至多20 mM、至多10 mM、至多5 mM、至多1 mM)。
作為GIP/GLP-1共同激動劑、胰高血糖素/GIP共同激動劑及胰高血糖素/GIP/GLP-1三重激動劑之胰高血糖素肽可以其各者之活性先前經描述為有用的任何指示使用。舉例來說，胰高血糖素活性可提高葡萄糖值、供胰島素緩衝用、或減低放射線檢查期間的腸蠕動性。GLP-1活性可降低葡萄糖值，係一種有用於治療高血糖(例如，糖尿病)的活性。GLP-1活性亦可誘發減重或預防增重，例如，透過減低食慾。GIP活性亦可降低葡萄糖值，係一種有用於治療高血糖(例如，糖尿病)的活性。
GIP/GLP-1共同激動劑及胰高血糖素/GIP/GLP-1三重激動劑尤其有利於誘發減重或預防增重，以及用於治療高血糖，包括糖尿病。文中揭示的活體內數據顯示GIP激動劑活性與GLP-1激動劑活性之組合較單獨的GLP-1對減重產生更大的效果。有鑑於在技藝中需要拮抗GIP來降低每日食物攝取及體重、及提高胰島素敏感性及能量消耗的教示，此活性係尤其在意料之外。(Irwin等人，Diabetologia 50：1532-1540(2007)；及Althage等人，J Biol Chem，2008年4月17日之電子刊物)。
文中揭示的活體內數據亦顯示GIP激動劑活性與GLP-1激動劑活性之組合可降低葡萄糖值。
因此，預期文中所述之胰高血糖素肽可用來降低或維持體重，或治療高血糖，或降低血糖值，或標準化及/或穩定化血糖值。
在一些具體例中，提供一種治療高血糖之方法，或一種降低增重或誘發減重之方法，其包括投與有效量之包含本發明之胰高血糖素肽的水溶液。在其他具體例中，提供一種治療糖尿病之方法，其包括共同投與習知劑量或降低劑量之胰島素及本發明之胰高血糖素肽。亦提供利用本發明之胰高血糖素肽，不共同投與胰島素而治療糖尿病之方法。
預期此等用於治療高血糖的方法有用於各種類型的高血糖，包括糖尿病、第I型糖尿病、第II型糖尿病、或妊娠糖尿病(包括胰島素依賴型及非胰島素依賴型)，及降低糖尿病的併發症包括腎病變、視網膜病變及血管疾病。
預期用於降低食慾或促進體重減輕之方法有用於減輕體重，預防增重，或治療各種原因的肥胖症(包括藥物引發的肥胖症)，及減少與肥胖症相關的併發症包括血管疾病(冠狀動脈疾病、中風、周邊血管疾病、局部缺血再灌流等)、高血壓、第II型糖尿病的肇始、高脂血症及肌肉骨骼疾病。
代謝症候群(亦稱為代謝症候群X、胰島素抗性症候群或瑞文氏(Reaven’s)症候群)係一種影響超過五千萬個美國人的病症。代謝症候群典型上的特徵在於以下危險因子之至少三種或以上的群集：(1)腹部肥胖(在腹部及周圍之過多的脂肪組織)，(2)致動脈粥樣化的血脂異常(增進斑塊在動脈壁之累積之包括高三酸甘油酯、低HDL膽固醇及高LDL膽固醇的血脂病症)，(3)高血壓，(4)胰島素抗性或葡萄糖耐受不良，(5)易血栓狀態(例如，血液中之高纖維蛋白原或纖維蛋白溶酶原活化劑抑制劑-1)、及(6)促發炎狀態(例如，血液中升高的C-反應性蛋白質)。其他危險因子可包括老化、荷爾蒙不平衡及遺傳傾向。
代謝症候群與冠狀心臟病及其他與血管斑塊累積相關之病症(諸如中風及稱為粥樣動脈硬化性心血管疾病(ASCVD)的周邊血管疾病)的增加風險有關聯。患有代謝症候群的病患會從早期階段的胰島素抗性狀態進展至具有ASCVD之進一步提高風險的晚期第II型糖尿病。不欲受限於任何特定理論，胰島素抗性、代謝症候群與血管疾病之間的關係可牽涉包括下列之一或多個同時發生的致病機構：受損的胰島素刺激血管擴張、由於提高氧化應激所引起之NO有效性之與胰島素抗性相關的降低、及脂肪細胞衍生激素諸如脂聯素之異常(Lteif及Mather，Can.J.Cardiol.20(suppl.B)：66B-76B(2004))。
根據2001年國家膽固醇教育計劃成人治療小組(2001 National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel)(ATP III)，同一個體中任何三項下列特徵即符合代謝症候群的標準：(a)腹部肥胖(男性腰圍超過102公分及女性超過88公分)；(b)血清三酸甘油酯(150 mg/dl或以上)；(c)HDL膽固醇(男性40 mg/dl或以下及女性50 mg/dl或以下)；(d)血壓(130/85或以上)；及(e)空腹血糖(110 mg/dl或以上)。根據世界衛生組織(WHO)，具有高胰島素值(高空腹血糖或單獨的高飯後血糖)與至少兩項以下標準之個體即符合代謝症候群的標準：(a)腹部肥胖(腰臀比大於0.9、身體質量指數至少30 kg/m2 、或腰圍超過37英吋)；(b)膽固醇小組顯示三酸甘油酯濃度至少150 mg/dl或HDL膽固醇低於35 mg/dl；(c)血壓140/90或以上，或正在治療高血壓。(Mathur,Ruchi，「代謝症候群(Metabolic Syndrome)」，Shiel,Jr.、William C.編輯，MedicineNet.com，2009年5月11日)。
對於此處之目的，若個體符合2001年國家膽固醇教育計劃成人治療小組或WHO所記述標準之任一或兩項之標準，則將該個體視為受代謝症候群所苦。
不受限於任何特定理論，文中所述之胰高血糖素肽適用於治療代謝症候群。因此，本發明提供一種預防或治療受檢者之代謝症候群、或降低其之一、二、三或更多項風險因子的方法，其包括向該受檢者投與可有效預防或治療代謝症候群、或其風險因子之量之文中所述的胰高血糖素肽。
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)係指稱自單純性脂肪肝(脂肪肝)、至非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、至肝硬化(肝臟之不可逆的進行性結疤)之寬譜的肝病。NAFLD之所有階段皆共同具有脂肪之累積(脂肪浸潤)於肝臟細胞(肝細胞)中。單純性脂肪肝係某些類型之脂肪、三酸甘油酯的異常累積於肝臟細胞中，而無發炎或結疤。在NASH中，脂肪累積伴隨肝臟之不同程度的發炎(肝炎)及結疤(纖維化)。發炎的細胞會破壞肝臟細胞(肝細胞壞死)。在術語「脂肪性肝炎」及「脂肪壞死」中，脂肪 係指脂肪浸潤，肝炎係指肝臟發炎，及壞死係指遭破壞的肝臟細胞。NASH最終會導致肝臟結疤(纖維化)，然後導致不可逆的進行性結疤(肝硬化)。由NASH所引起的肝硬化係NAFLD譜中之最後且最嚴重的階段。(Mendler,Michel，「脂肪肝：非酒精性脂肪肝病(NAFLD)及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)(Fatty Liver：Nonalcoholic Fatty Liver Disease(NAFLD)and Nonalcoholic Steatohepatitis(NASH))」，Schoenfield,Leslie編輯，J.,MedicineNet.com，2005年8月29日)。
酒精性肝病、或酒精引發的肝病涵蓋三種與過量飲用酒精相關或由其所引起之病理上不同的肝病：脂肪肝、慢性或急性肝炎、及肝硬化。酒精性肝炎可包括從疾病的唯一指標係異常的實驗室測試之溫和性肝炎至具有諸如黃疸(由膽紅素滯留所引起的黃皮膚)、肝性腦病變(由肝臟衰竭所引起的神經性機能障礙)、腹水(流體累積於腹部)、食道靜脈曲張出血(食道的靜脈曲張)、異常凝血及昏迷之併發症的嚴重肝臟功能不良。在組織學上，酒精性肝炎具有包括肝細胞之氣球化退化、嗜中性細胞及有時馬洛氏小體(Mallory bodies)之發炎(細胞中間絲蛋白之異常聚集)的特性外觀。肝硬化在解剖學上的特徵在於肝臟中之廣泛的節結結合纖維化。(Worman,Howard J.，「酒精性肝病(Alcoholic Liver Disease)」，哥倫比亞大學醫學中心(Columbia University Medical Center)網站)。
不受限於任何特定理論，文中所述之胰高血糖素肽適用於治療酒精性肝病、NAFLD、或其任何階段，包括，例如，脂肪肝、脂肪性肝炎、肝炎、肝臟發炎、NASH、肝硬化、或其併發症。因此，本發明提供一種預防或治療受檢者之酒精性肝病、NAFLD、或其任何階段的方法，其包括向受檢者投與可有效預防或治療酒精性肝病、NAFLD、或其階段之量之文中所述的胰高血糖素肽。此等治療方法包括降低下列的一、二、三或更多項：肝臟脂肪含量、肝硬化的發生或進展、肝細胞癌的發生、發炎跡象(例如，異常的肝酵素值(例如，天冬胺酸轉胺酶AST及/或丙胺酸轉胺酶ALT、或LDH)、升高的血清鐵蛋白、升高的血清膽紅素)、及/或纖維化跡象(例如，升高的TGF-β值)。在較佳具體例中，使用胰高血糖素肽來治療已發展至超越單純性脂肪肝(脂肪肝)且呈現發炎或肝炎跡象的病患。此等方法可導致，例如，AST及/或ALT值的降低。
本發明之胰高血糖素肽可單獨或與其他抗糖尿病或抗肥胖藥劑組合投與。技藝中已知或在研究中的抗糖尿病劑包括胰島素，磺醯基脲，諸如甲苯磺丁脲(tolbutamide)(Orinase)、乙醯苯磺環己脲(acetohexamide)(Dymelor)、甲磺吖庚脲(tolazamide)(Tolinase)、氯磺丙脲(chlorpropamide)(Diabinese)、吡磺環己脲(glipizide)(Glucotrol)、優降糖(glyburide)(Diabeta、Micronase、Glynase)、格列美脲(glimepiride)(Amaryl)、或甲磺雙環脲(gliclazide)(Diamicron)；美格替耐(meglitinides)，諸如諾和隆(repaglinide)(Prandin)或糖立釋(nateglinide)(Starlix)；雙縮胍(biguanides)諸如二甲雙胍(metformin)(Glucophage)或苯乙雙胍(phenformin)；噻唑啶二酮諸如梵帝雅(rosiglitazone)(Avandia)、愛妥糖(pioglitazone)(Actos)、或曲格列酮(troglitazone)(Rezulin)、或其他PPARγ抑制劑；抑制碳水化合物消化的α葡萄糖苷酶抑制劑，諸如米格列醇(miglitol)(Glyset)、阿卡波糖(acarbose)(Precose/Glucobay)；艾塞那肽(exenatide)(Byetta)或普蘭林肽(pramlintide)；二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制劑諸如維格列汀(vildagliptin)或西他列汀(sitagliptin)；SGLT(鈉依賴性葡萄糖轉運體1)抑制劑；葡萄糖激酶活化劑(GKA)；胰高血糖素受體拮抗劑(GRA)；或FBPase(果糖1,6-雙磷酸酶)抑制劑。
技藝中已知或在研究中的抗肥胖劑包括瘦體素(Leptin)及纖維母細胞生長因子21(FGF-21)，食慾抑制劑，諸如苯乙胺型刺激劑、苯丁胺(phentermine)(視情況含有芬氟拉明(fenfluramine)或右芬氟拉明(dexfenfluramine))、二乙胺苯酮(diethylpropion)(Tenuate)、苯雙甲嗎啉(phendimetrazine)(Prelu-2、Bontril)、芐非他明(benzphetamine)(Didrex)、諾美婷(sibutramine)(Meridia、Reductil)；利莫那班(rimonabant)(Acomplia)、其他大麻鹼(cannabinoid)受體拮抗劑；調酸素；鹽酸氟西汀(fluoxetine hydrochloride)(Prozac)；奎內薩(Qnexa)(托吡酯(topiramate)及苯丁胺)、艾斯卡利亞(Excalia)(鹽酸安非他酮(bupropion)及唑尼沙胺(zonisamide))或孔特拉夫(Contrave)(鹽酸安非他酮及納曲酮(naltrexone))；或脂酶抑制劑，類似於羅氏纖(xenical)(Orlistat)或西替利司他(Cetilistat)(亦稱為ATL-962)、或GT 389-255。
可使用保有胰高血糖素於低血糖病患中之葡萄糖提升作用之本發明的胰高血糖素肽來治療低血糖，例如，預防或治療急性、週期性或夜間低血糖。此等胰高血糖素肽亦可與胰島素共同投與，以緩衝胰島素的作用並幫助維持糖尿病患的穩定血糖值。在此等具體例中，提供一種於胰島素依賴型病患中調節血糖值的改良方法。本揭示案之胰高血糖素肽可與胰島素作為單一組成物共同投與，作為個別溶液同時投與，或者，胰島素及胰高血糖素肽可在彼此不同的時間投與。在一些具體例中，此方法包括投與可在治療上有效控制糖尿病之量的胰島素及投與可在治療上有效預防低血糖之量的本揭示案之新穎經修飾胰高血糖素肽的步驟，其中該等投與步驟係彼此相隔不到12小時進行。經修飾胰高血糖素肽相對於經投與胰島素的確切比部分將係取決於病患之葡萄糖值及其他臨床參數的測定。使血值「標準化」意謂使血糖值回歸正常(例如，若血糖值高於正常值則使其降低，或若血糖值低於正常值則使其升高)。使血糖值「穩定化」意謂降低一段時間(例如，8小時、16小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天或1星期)內之血糖值的最大變化。舉例來說，投與胰高血糖素肽導致血糖值隨時間的維持較未投與胰高血糖素肽之情況更接近於正常葡萄糖值範圍。
可使用維持期望活性之本發明的胰高血糖素肽來引起腸道的暫時麻痺供放射線用途用，或治療其他由胰高血糖素之低血值所引起的代謝疾病。在此等具體例中，提供一種引起腸道之暫時麻痺的方法。此方法包括向病患投與一或多種本文所揭示之胰高血糖素肽的步驟。
在一不同態樣中，本發明提供一種降低增重或誘發減重、或治療高血糖之方法，其包括向有需要的病患共同投與可有效降低增重或誘發減重或減低食慾之量的GIP受體激動劑分子及GLP-1受體激動劑分子。兩種分子可係一起在相同的組成物中。或者，在此等方法中可投與同時活化GIP及GLP-1受體的分子。各種受體激動劑(即活化)性質之組合提供意料之外的加成或增效作用、或其他意料之外的臨床效益。根據此等方法涵蓋投與習知劑量之胰島素、降低劑量之胰島素、或不投與胰島素。範例的GIP受體激動劑分子包括於對準至使配對最大化後在視覺檢查時(例如)保有至少50%、60%、70%、或80%序列實體的GIP或GIP類似物。範例的GLP-1受體激動劑分子包括於對準至使配對最大化後在視覺檢查時(例如)保有至少50%、60%、70%、或80%序列實體的GLP-1、GLP-1類似物，於對準至使配對最大化後在視覺檢查時(例如)保有至少50%、60%、70%、或80%序列實體的促胰島素分泌素-4類似物，或其衍生物。呈現兩種活性的範例分子包括本發明之胰高血糖素肽、同時活化GLP-1及GIP受體的GLP-1類似物、GIP及GLP-1之融合物、或GIP類似物及GLP-1類似物之融合物、或其之經化學修飾的衍生物。
包括(但不限於)治療低血糖之根據本發明的治療方法可包括使用任何標準的給藥途徑(包括非經腸道，諸如靜脈內、腹膜內、皮下或肌肉內、鞘內、經皮、經直腸、經口、經鼻或經吸入)向病患投與目前揭示之胰高血糖素肽的步驟。
根據一些具體例，此等方法不包括在先前技藝中依據疾病經揭示有用於治療該特定疾病的任何胰高血糖素類似物或GLP-1類似物。在另一具體例中，亦可排除美國專利第6,864,069號中所述之用於治療糖尿病之同時作為GLP-1激動劑及胰高血糖素拮抗劑的肽。在另一具體例中，本發明可排除使用胰高血糖素拮抗劑來治療糖尿病，諸如Unson等人，J.Biol.Chem. ，264：789-794(1989)；Ahn等人，J.Med.Chem. ，44：3109-3116(2001)；及Sapse等人，Mol.Med. ，8(5)：251-262(2002)中所述之拮抗劑。在一些具體例中，可排除調酸素或包含調酸素(SEQ ID NO：97)之8個C-端胺基酸的胰高血糖素肽。
調酸素係一種存在於小腸中之天然產生的消化激素，其可誘發減重(參見Diabetes 2005；54：2390-2395)。調酸素係包含胰高血糖素(即SEQ ID NO：1)之29個胺基酸序列接著SEQ ID NO：97(KRNRNNIA)之8個胺基酸羧基端延伸的37胺基酸肽。雖然本發明涵蓋文中所述之胰高血糖素肽可視情況結合至此8個胺基酸羧基端延伸(SEQ ID NO：97)，但本發明之一些具體例亦明確地涵蓋不含SEQ ID NO：97之8個相連羧基胺基酸的胰高血糖素肽。
本發明之化合物不包括以下肽中之任一者，雖然本發明中可包括呈現期望之共同激動劑或三重激動劑活性之對其的進一步修飾、使用此等化合物的醫藥組成物、套組、及治療方法：SEQ ID NO：1之肽，具有[Arg12]取代且具有C-端醯胺；SEQ ID NO：1之肽，具有[Arg12,Lys20]取代且具有C-端醯胺；SEQ ID NO：1之肽，具有[Arg12,Lys24]取代且具有C-端醯胺；SEQ ID NO：1之肽，具有[Arg12,Lys29]取代且具有C-端醯胺；SEQ ID NO：1之肽，具有[Glu9]取代；SEQ ID NO：1之肽，缺少His1，具有[Glu9,Glu16,Lys29]取代及C-端醯胺；SEQ ID NO：1之肽，具有[Glu9,Glu16,Lys29]取代且具有C-端醯胺；SEQ ID NO：1之肽，具有透過內醯胺橋鍵聯的[Lys13,Glu17]取代且具有C-端醯胺；SEQ ID NO：1之肽，具有透過內醯胺橋鍵聯的[Lys17,Glu21]取代且具有C-端醯胺；SEQ ID NO：1之肽，缺少His1，具有透過內醯胺橋鍵聯的[Glu20,Lys24]取代；於以下申請案中揭示的肽：2008年2月13日提出申請之PCT/US2008/053857、2006年5月5日提出申請之PCT/US2006/017494、2007年8月17日提出申請之PCT/US2007/018415、2005年2月25日提出申請之PCT/GB2005/000710、2000年3月29日提出申請之PCT/GB00/01089、2006年2月10日提出申請之PCT/US2006/005020，將其各者之全體以引用的方式併入本文中。
實施例
本發明之化合物可藉由標準合成方法、重組DNA技術、或任何其他製備肽及融合蛋白的方法製備得。雖然無法藉由標準的重組DNA技術表現某些非天然胺基酸，但技藝中知曉其之製備技術。除了適用的標準肽化學反應之外，包含非肽部分的本發明化合物亦可藉由標準的有機化學反應合成得。關於胰高血糖素肽之胰高血糖素及GLP-1活性的額外資料亦揭示於2008年2月13日提出申請之PCT/US2008/053857中，將其全體以引用的方式併入本文中。
實施例1 一般合成方案：
於經修改的Applied Biosystem 430 A肽合成器上使用HBTU-活化之「Fast Boc」單一偶合劑自0.2毫莫耳之Boc Thr(OBzl)Pam樹脂開始合成得胰高血糖素類似物。自Midwest Biotech(Fishers,IN)取得Boc胺基酸及HBTU。所使用之側鏈保護基為：Arg(Tos)、Asn(Xan)、Asp(OcHex)、Cys(pMeBzl)、His(Bom)、Lys(2Cl-Z)、Ser(OBzl)、Thr(OBzl)、Tyr(2Br-Z)、及Trp(CHO)。N-端His上之側鏈保護基為Boc。
用哌啶於二甲基甲醯胺中之20%溶液處理各完成的肽基樹脂，以自色胺酸移除甲醯基。在對甲酚及二甲硫之存在下進行液態氟化氫分裂。分裂係使用HF裝置(Penninsula Labs)於冰浴中進行1小時。於蒸發掉HF後，將殘留物懸浮於乙醚中並過濾出固體物質。將各肽萃取至30-70毫升之乙酸水溶液中，並利用HPLC[Beckman System Gold，0.46x5cm Zorbax C8，1ml/min，45C，214nm，A緩衝液=0.1%TFA，B=0.1%TFA/90%乙腈，於10分鐘內10%至80%B之梯度]分析經稀釋的等分試樣。
於FPLC上在2.2 x 25公分Kromasil C18管柱上進行純化，同時並監測214奈米處之UV且收集5分鐘的溶離份。將均勻的溶離份組合並凍乾得>95%之產物純度。使用MALDI質譜分析確認準確的分子質量及純度。
實施例2
一般的聚乙二醇化方案：(Cys-順丁烯二醯亞胺基)典型上，將胰高血糖素Cys類似物溶解於磷酸鹽緩衝鹽水(5-10毫克/毫升)中，及加入0.01M乙二胺四乙酸(總體積之10-15%)。加入過量(2倍)的順丁烯二醯亞胺基甲氧基PEG試劑(Nektar)，且將反應於室溫下攪拌同時並利用HPLC監測反應之進行。於8-24小時後，將反應混合物酸化，且裝填於製備型逆相管柱上，以使用0.1%TFA/乙腈梯度進行純化。將適當的溶離份組合並凍乾得期望的聚乙二醇化類似物。
實施例3
胰高血糖素Cys17 (1-29)及類似單Cys類似物之合成使用FastBoc HBTU-活化之單一偶合劑將存於60毫升反應容器中之0.2毫莫耳Boc Thr(OBzl)Pam樹脂(SynChem Inc)及以下序列輸入及於經修改的Applied Biosystem 430 A肽合成器上執行。
HSQGTFTSDYSKYLDSCRAQDFVQWLMNT使用以下之側鏈保護基：Arg(Tos)、Asp(OcHex)、Asn(Xan)、Cys(pMeBzl)、Glu(OcHex)、His(Boc)、Lys(2Cl-Z)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CHO)、及Tyr(Br-Z)。利用20%哌啶/二甲基甲醯胺處理完成的肽基樹脂，以移除Trp甲醯基保護，然後轉移至HF反應容器中並於真空中乾燥。加入1.0毫升對甲酚及0.5毫升二甲硫連同一磁石攪拌棒。將容器連接至HF裝置(Pennisula Labs)，於乾冰/甲醇浴中冷卻，抽真空，及凝結入大約10毫升之液態氟化氫。將反應於冰浴中攪拌1小時，然後於真空中移除HF。將殘留物懸浮於乙醚中；將固體過濾，以乙醚洗滌，且將肽萃取至50毫升乙酸水溶液中。利用分裂萃取物之小樣品進行分析HPLC[0.46 x 5 cm Zorbax C8，1 ml/min，45C，214nm，A緩衝液為0.1%TFA，B緩衝液為0.1%TFA/90%ACN，梯度=於10分鐘內10%B至80%B]。將剩餘的萃取物裝填於2.2 x 25公分Kromasil C18製備型逆相管柱上，且使用Pharmacia FPLC系統執行乙腈梯度。收集5分鐘的溶離份，同時並監測214奈米處之UV(2.0A)。A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%乙腈。梯度=於450分鐘內30%B至100%B。
將含有最純產物的溶離份(48-52)組合冰凍，且凍乾得30.1毫克。產物的HPLC分析顯示純度>90%，且MALDI質譜分析顯示3429.7之期望質量。類似地製備得胰高血糖素Cys21 、胰高血糖素Cys24 、及胰高血糖素Cys29 。
實施例4 胰高血糖素-Cex及其他C-端延伸類似物之合成
將285毫克(0.2毫莫耳)甲氧二苯甲基胺樹脂(Midwest Biotech)置於60毫升反應容器中，且使用FastBoc HBTU-活化之單一偶合劑於經修改的Applied Biosystems 430A肽合成器上輸入並執行以下序列。
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTGPSSGAPPPS使用以下之側鏈保護基：Arg(Tos)、Asp(OcHex)、Asn(Xan)、Cys(pMeBzl)、Glu(OcHex)、His(Boc)、Lys(2Cl-Z)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CHO)、及Tyr(Br-Z)。利用20%哌啶/二甲基甲醯胺處理完成的肽基樹脂，以移除Trp甲醯基保護，然後轉移至HF反應容器中並於真空中乾燥。加入1.0毫升對甲酚及0.5毫升二甲硫連同一磁石攪拌棒。將容器連接至HF裝置(Pennisula Labs)，於乾冰/甲醇浴中冷卻，抽真空，及凝結入大約10毫升之液態氟化氫。將反應於冰浴中攪拌1小時，然後於真空中移除HF。將殘留物懸浮於乙醚中；將固體過濾，以乙醚洗滌，且將肽萃取至50毫升乙酸水溶液中。對分裂萃取物之等分試樣進行分析HPLC[0.46 x 5 cm Zorbax C8，1 ml/min，45C，214nm，A緩衝液為0.1%TFA，B緩衝液為0.1%TFA/90%ACN，梯度=於10分鐘內10%B至80%B]。將萃取物裝填於2.2 x 25公分Kromasil C18製備型逆相管柱上，且使用Pharmacia FPLC系統執行乙腈梯度以進行溶離。收集5分鐘的溶離份，同時並監測214奈米處之UV(2.0A)。A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%乙腈。梯度=於450分鐘內30%B至100%B。將溶離份58-65組合，冰凍且凍乾得198.1毫克。
產物的HPLC分析顯示純度大於95%。MALDI質譜分析顯示存在作為C-端醯胺產物之4316.7之期望理論質量。以經適當裝填之PAM樹脂開始，類似地製備得作為C-端羧酸的調酸素及調酸素-KRNR。
實施例5 胰高血糖素Cys17 Mal-PEG-5K
將15.1毫克之胰高血糖素Cys17 (1-29)及27.3毫克之甲氧基聚(乙二醇)順丁烯二醯亞胺平均M.W.5000(mPEG-Mal-5000，Nektar Therapeutics)溶解於3.5毫升之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中，並加入0.5毫升之0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)。將反應於室溫下攪拌，並利用HPLC分析[0.46 x 5 cm Zorbax C8，1ml/min，45C，214nm(0.5A)，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/90%ACN，梯度=於10分鐘內10%B至80%B]監測反應之進行。於5小時後，將反應混合物裝填於2.2 x 25公分Kromasil C18製備型逆相管柱上。於Pharmacia FPLC上執行乙腈梯度，同時並監測214奈米處之UV波長且收集5分鐘之溶離份。A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%乙腈，梯度=於450分鐘內自30%B至100%B。將對應於產物的溶離份組合，冰凍且凍乾得25.9毫克。
於HPLC[0.46 x 5 cm Zorbax C8，1 ml/min，45C，214nm(0.5A)，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/90%ACN，梯度=於10分鐘內自10%B至80%B]上分析此產物，其顯示純度大約為90%。MALDI(基質輔助雷射脫附游離)質譜分析顯示8700至9500之寬廣質量範圍(PEG衍生物之典型值)。此顯示將大約5,000 a.m.u加成至起始胰高血糖素肽(3429)之質量。
實施例6 胰高血糖素 Mal-PEG-5K
將21.6毫克之胰高血糖素Cys21 (1-29)及24毫克之mPEG-MAL-5000(Nektar Therapeutics)溶解於3.5毫升之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中，並加入0.5毫升之0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)。將反應於室溫下攪拌。於2小時後，加入另一12.7毫克之mPEG-MAL-5000。於8小時後，將反應混合物裝填於2.2 x 25公分Vydac C18製備型逆相管柱上，且於Pharmacia FPLC上於4毫升/分鐘下執行乙腈梯度，同時收集5分鐘之溶離份。
A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%ACN。梯度=於450分鐘內自20%至80%B。
將對應於出現產物的溶離份組合，冰凍且凍乾得34毫克。利用分析HPLC[0.46 x 5 cm Zorbax C8，1 ml/min，45C，214nm(0.5A)，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/90%ACN，梯度=於10分鐘內自10%B至80%B]分析產物顯示不同於起始胰高血糖素肽的均勻產物。MALDI(基質輔助雷射脫附游離)質譜分析顯示8700至9700之寬廣質量範圍(PEG類似物之典型值)。此顯示將大約5,000 a.m.u加成至起始胰高血糖素肽(3470)之質量。
實施例7 胰高血糖素 Mal-PEG-5K
在攪拌下將20.1毫克之胰高血糖素C24 (1-29)及39.5毫克之mPEG-Mal-5000(Nektar Therapeutics)溶解於3.5毫升之PBS中，並加入0.5毫升之0.01M EDTA。將反應於室溫下攪拌7小時，然後加入另一40毫克之mPEG-Mal-5000。於大約15小時後，將反應混合物裝填於2.2 x 25公分Vydac C18製備型逆相管柱上，且使用Pharmacia FPLC執行乙腈梯度。收集5分鐘之溶離份，同時並監測214奈米(2.0A)處之UV。A緩衝液=0.1%TFA，B緩衝液=0.1%TFA/50%ACN，梯度=於450分鐘內自30%B至100%B。將對應於產物的溶離份組合，冰凍且凍乾得45.8毫克。MALDI質譜分析顯示最大值位於9175.2(其大約比胰高血糖素C24 (3457.8)多5,000 a.m.u.)之典型的PEG寬信號。
實施例8 胰高血糖素 Mal-PEG-20K
在室溫於攪拌下將25.7毫克之胰高血糖素Cys24 (1-29)及40.7毫克之mPEG-Mal-20K(Nektar Therapeutics)溶解於3.5毫升之PBS中，並加入0.5毫升之0.01 M EDTA。於6小時後，如利用HPLC所測得，起始物料對產物之比大約為60：40。加入另一25.1毫克之mPEG-Mal-20K且使反應再多攪拌16小時。產物比率並未顯著地改良，因此將反應混合物裝填於2.2 x 25公分Kromasil C18製備型逆相管柱上，且於Pharmacia FPLC上使用於450分鐘內自30%B至100%B之梯度進行純化。A緩衝液=0.1%TFA，B緩衝液=0.1%TFA/50%ACN，流率=4毫升/分鐘，且收集5分鐘之溶離份同時並監測214奈米(2.0A)處之UV。將含有均勻產物的溶離份組合，冰凍且凍乾得25.7毫克。利用分析HPLC測得之純度為~90%。MALDI質譜分析顯示自23,000至27,000之寬峰，其大約比起始胰高血糖素C24 (3457.8)多20,000 a.m.u.。
實施例9 胰高血糖素Cys29 Mal-PEG-5K
在室溫於攪拌下將20.0毫克之胰高血糖素Cys29 (1-29)及24.7毫克之mPEG-Mal-5000(Nektar Therapeutics)溶解於3.5毫升之PBS中，並加入0.5毫升之0.01M EDTA。於4小時後，加入另一15.6毫克之mPEG-Mal-5000以驅使反應完全。於8小時後，將反應混合物裝填於2.2 x 25公分Vydac C18製備型逆相管柱上，且於Pharmacia FPLC系統上執行乙腈梯度。收集5分鐘之溶離份同時並監測214奈米(2.0A)處之UV。A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%ACN。將溶離份75-97組合，冰凍且凍乾得40.0毫克之不同於在HPLC上之回收起始物料(溶離份58-63)的產物。利用分析HPLC[0.46 x 5 cm Zorbax C8，1 ml/min，45C，214nm(0.5A)，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/90%ACN，梯度=於10分鐘內自10%B至80%B]分析產物顯示純度大於95%。MALDI質譜分析顯示存在具8,000至10,000之質量範圍(最大值在9025.3)的PEG成分，其較起始物料(3484.8)大5,540 a.m.u.。
實施例10 胰高血糖素 (2-丁內酯)
於24.7毫克之胰高血糖素Cys24 (1-29)中加入4毫升之0.05M碳酸氫銨/50%乙腈及5.5微升之2-溴-4-羥基丁酸-γ-內酯之溶液(100微升於900微升乙腈中)。於在室溫下攪拌3小時後，將另一105微升之內酯溶液加至反應混合物，將其再多攪拌15小時。以10%乙酸水溶液將反應混合物稀釋至10毫升，並將其裝填於2.2 x 25公分Kromasil C18製備型逆相管柱上。於Pharmacia FPLC上執行乙腈梯度(於450分鐘內自20%B至80%B)，同時收集5分鐘之溶離份並監測214奈米(2.0A)處之UV。流率=4毫升/分鐘，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%ACN。將溶離份74-77組合，冰凍且凍乾得7.5毫克。HPLC分析顯示純度為95%，且MALDI質譜分析顯示3540.7之質量或較起始物料多84個質量單位。此結果與加成單一的丁內酯部分一致。
實施例11 胰高血糖素Cys24 (S-羧甲基)
將18.1毫克之胰高血糖素Cys24 (1-29)溶解於9.4毫升之0.1M磷酸鈉緩衝液(pH=9.2)中，並加入0.6毫升之溴乙酸溶液(1.3毫克/毫升於乙腈中)。將反應於室溫下攪拌並利用分析HPLC追蹤反應的進行。於1小時後，加入另一0.1毫升之溴乙酸溶液。將反應再多攪拌60分鐘，然後用乙酸水溶液酸化並裝填於2.2 x 25公分Kromasil C18製備型逆相管柱上進行純化。於Pharmacia FPLC(流率=4毫升/分鐘)上執行乙腈梯度，同時收集5分鐘之溶離份並監測214奈米(2.0A)處之UV。A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%ACN。將溶離份26-29組合，冰凍且凍乾得數毫克之產物。分析HPLC顯示純度為90%，且MALDI質譜分析確認3515之期望產物的質量。
實施例12 胰高血糖素 順丁烯二醯亞胺基，PEG-3.4K-二聚體
將16毫克之胰高血糖素Cys24 及1.02毫克之Mal-PEG-Mal-3400，聚(乙二醇)-雙-順丁烯二醯亞胺平均M.w.3400(Nektar Therpeutics)溶解於3.5毫升之磷酸鹽緩衝鹽水及0.5毫升之0.01M EDTA中，並將反應於室溫下攪拌。於16小時後，加入另一16毫克之胰高血糖素Cys24 並持續攪拌。於大約40小時後，將反應混合物裝填於Pharmcia PepRPC 16/10管柱上，並於Pharmacia FPLC上執行乙腈梯度，同時收集2分鐘之溶離份並監測214奈米(2.0A)處之UV。流率=2毫升/分鐘，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%ACN。將溶離份69-74組合，冰凍且凍乾得10.4毫克。分析HPLC顯示純度為90%，且MALDI質譜分析顯示在9500-11,000範圍內之成分，其與期望的二聚體一致。
實施例13
胰高血糖素內醯胺之合成
將285毫克(0.2毫莫耳)之甲氧二苯甲基胺樹脂(Midwest Biotech)加至60毫升之反應容器，且使用Boc DEPBT-活化之單一偶合劑在經修改的Applied Biosystems 430A肽合成器上組裝以下序列。
HSQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVQWLMNT-N H2(12-16內醯胺)
使用以下的側鏈保護基：Arg(Tos)、Asp(OcHx)、Asn(Xan)、Glu(OFm)、His(BOM)、Lys(Fmoc)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CHO)、Tyr(Br-Z)。若內醯胺係由16-20、20-24、或24-28所構成，則於位置12處使用Lys(Cl-Z)。在旋轉下用20%哌啶/二甲基甲醯胺將完成的肽基樹脂處理1小時，以移除Trp甲醯基以及自Lys12及Glu16移除Fmoc及OFm保護。當由陽性水合茚三酮(positive ninhydrin)試驗確認移除時，將樹脂先用二甲基甲醯胺，接著用二氯甲烷及隨後再次用二甲基甲醯胺洗滌。用存於二甲基甲醯胺及二異丙基乙基胺(DIEA)中之520毫克(1毫莫耳)苯并三唑-1-基-氧基-參-吡咯錠鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)處理樹脂。使反應進行8-10小時，且由陰性水合茚三酮反應確認環化。將樹脂先用二甲基甲醯胺，接著再用二氯甲烷洗滌，及隨後用三氟乙酸處理10分鐘。由陽性水合茚三酮反應確認Boc基團之移除。將樹脂用二甲基甲醯胺及二氯甲烷洗滌並乾燥，隨後再轉移至氫氟酸(HF)反應容器。加入500微升對甲酚連同一磁石攪拌棒。將容器連接至HF裝置(Peninsula Labs)，於乾冰/甲醇浴中冷卻，抽真空，及將大約10毫升之液態氫氟酸凝結至容器中。將反應於冰浴中攪拌1小時，隨後於真空中移除HF。將殘留物懸浮於乙醚中；將固體過濾，以乙醚洗滌，且將肽用150毫升之20%乙腈/1%乙酸溶解。
在以下條件[4.6 X 30 mm Xterra C8，1.50 mL/min，220 nm，A緩衝液為0.1% TFA/10% ACN，B緩衝液為0.1% TFA/100% ACN，梯度為於15分鐘內5-95%B]下進行粗製溶解肽的分析性HPLC分析。將萃取液用水稀釋兩倍，且裝填於2.2 X 25公分Vydac C4製備型逆相管柱上，並於Waters HPLC系統上使用乙腈梯度溶離(A緩衝液為0.1% TFA/10% ACN，B緩衝液為0.1% TFA/10% ACN，及在15.00毫升/分鐘之流率下於120分鐘內0-100% B之梯度)。經純化肽之HPLC分析顯示純度大於95%，且電噴灑游離(electrospray ionization)質譜分析確認12-16內醯胺之3506 Da的質量。類似地製備來自16-20、20-24、及24-28的內醯胺。
實施例14 胰高血糖素溶解度檢定法：
製備存於0.01N HCl中之胰高血糖素(或類似物)的溶液(1毫克/毫升或3毫克/毫升)。用0.01N HCl將100微升之儲備溶液稀釋至1毫升，並測定UV吸光度(276奈米)。使用200-250微升之0.1M Na2 HPO4 (pH9.2)將剩餘儲備溶液之pH調整至pH7。使溶液於4℃下靜置隔夜然後離心。接著用0.01N HCl將100微升之上清液稀釋至1毫升，並測定UV吸光度(重複兩次)。
補償起始吸光度讀數之體積的增加，且使用以下計算於確定溶解度百分比：
最終吸光度
實施例15 胰高血糖素受體結合檢定法
利用閃爍親近(scintillation proximity)檢定技術於競爭結合檢定法中量測肽對胰高血糖素受體的親和力。將於閃爍親近檢定緩衝液(0.05 M Tris-HCl，pH 7.5，0.15 M NaCl，0.1% w/v牛血清白蛋白)中製得之肽的連續3倍稀釋液於96孔白色/透明底盤(Corning Inc.,Acton,MA)中與0.05 nM(3-[125 I]-碘酪胺醯基)Tyr10胰高血糖素(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)(每孔1-6微克)、由過度表現人類胰高血糖素受體之細胞製備得之細胞質膜片段、及1毫克/孔之經聚乙烯亞胺處理之小麥胚芽凝集素(agglutinin)A型閃爍親近檢定珠粒(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)混合。當於旋轉搖盪器上在800 rpm下搖盪5分鐘後，將盤於室溫下培養12小時，然後於MicroBeta1450液體閃爍計數器(Perkin-Elmer,Wellesley,MA)上進行讀取。於具有較測試樣品之最高濃度大4倍濃度之「冷」天然配體的孔中量測非特異結合(NSB)放射性，且於沒有競爭物的孔中偵測總結合放射性。特異結合百分比係計算如下：特異結合%=((結合-NSB)/(總結合-NSB))X100。IC50 值係經由使用Origin軟體(OriginLab,Northampton,MA)而測得。
實施例16 功能檢定法-cAMP合成
於基於螢火蟲螢光素酵素之報告檢定法中量測胰高血糖素類似物誘發cAMP的能力。經由於經補充0.25%牛生長血清(HyClone,Logan,UT)之DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中培養16小時，然後再用胰高血糖素、GLP-1、GIP或新穎胰高血糖素類似物之連續稀釋液於37℃，於96孔經塗布聚-D-離胺酸之「Biocoat」盤(BD Biosciences,San Jose,CA)中之5%CO2 下培養5小時，而將經共轉染受體(胰高血糖素受體、GLP-1受體或GIP受體)之HEK293細胞及鍵聯至cAMP反應元件之螢光素酵素基因除去血清。於培養結束時，將100微升之LucLite發光基質試劑(Perkin-Elmer,Wellesley,MA)添加至各孔。將盤短暫地振搖，於暗處培養10分鐘，並於MicroBeta-1450液體閃爍計數器(Perkin-Elmer,Wellesley,MA)上測量光輸出。經由使用Origin軟體(OriginLab,Northampton,MA)計算有效的50%濃度。
實施例17 胰高血糖素Cys-順丁烯二醯亞胺基PEG類似物之穩定性檢定法
將各胰高血糖素類似物溶解於水或PBS中，並進行起始HPLC分析。於調整pH(4、5、6、7)後，將樣品於37℃下在指定的期間內培養，並再次利用HPLC分析以測定肽的完整性。測定特定相關肽之濃度，並相對於起始分析計算保持完整的百分比。
實施例18 經醯化及/或聚乙二醇化肽之製備
如下製備經醯化及/或聚乙二醇化肽。使用CS Bio 4886肽合成器或Applied Biosystems 430A肽合成器於固態載劑樹脂上合成肽。使用如Schnolzer等人，Int.J.Peptide Protein Res. 40：180-193(1992)所述之原位中和化學。對於經醯化肽，以Nε-FMOC離胺酸殘基取代待醯化的目標胺基酸殘基(例如，位置10)。以於DMF中之20%哌啶將完成的N-端受BOC保護之肽處理30分鐘而移除FMOC/甲醯基。經由於DMF/DIEA中偶合十倍莫耳過量的受FMOC保護之間隔物胺基酸(例如FMOC-(N-BOC)-色胺酸-OH)或醯基鏈(例如C17-COOH)及PyBOP或DEPBT偶合試劑，而達成對自由ε-胺基Lys殘基的偶合。在移除間隔物胺基酸之FMOC基之後，接著再重複用醯基鏈偶合。最後用100% TFA處理導致移除任何的側鏈保護基及N-端BOC基。將肽樹脂用5% DIEA/DMF中和，乾燥，然後使用HF/對甲酚(95：5)在0℃下自載劑分裂歷時1小時。於乙醚萃取後，使用5% HOAc溶液於將粗製肽溶劑合。然後利用ESI-MS確認溶液樣品包含正確分子量的肽。利用RP-HPLC使用10% CH3CN/0.1% TFA至0.1% TFA於100% CH3CN中之線性梯度純化正確的肽。使用Vydac C18 22毫米x 250毫米蛋白質管柱來進行純化。經醯化的肽類似物一般係藉由20：80之緩衝比完成溶離。將溶離份匯集在一起並利用分析性RP-HPLC檢查純度。將純溶離份凍乾得白色固體肽。
若肽包含內醯胺橋及待醯化的目標殘基，則醯化係如前所述在將該胺基酸添加至肽主鏈之後進行。
對於肽聚乙二醇化，使用將肽及PEG兩者溶解成透明溶液所需之最少量的溶劑(對於使用2-3毫克肽之反應一般低於2毫升)使40 kDa甲氧基聚(乙二醇)順丁烯二醯亞胺基-丙醯胺(Chirotech Technology Ltd.)與莫耳當量的肽於7M尿素、50mM Tris-HCl緩衝劑中反應。開始在室溫下劇烈攪拌4-6小時，且利用分析性RP-HPLC分析反應。經聚乙二醇化之產物由於減少的滯留時間而明顯不同於起始物料。於Vydac C4管柱上利用與起始肽純化所用者類似的條件進行純化。溶離典型上在50：50的緩衝比附近發生。收集純的經聚乙二醇化肽之溶離份並凍乾。
如以上於實施例16中所述檢定肽的生物活性。經醯化之肽可能展現對GLP-1受體的增加效力。包含色胺酸間隔物可能提供對胰高血糖素受體的較佳效力。
雖然醯化可使肽的半衰期延長至數小時或以上，但具有在數十kDa範圍內之重複之聚乙二醇化的作用可再更高。製備包含兩種類型修飾的肽。預期此等肽呈現在循環中之延長的半衰期，以及對DPP-IV及其他蛋白酶之抗性。
實施例20 於活體內對增重、食慾及血糖值的作用
基本上如前所述合成得以下的肽。
(A)經聚乙二醇化之胰高血糖素/GLP-1共同激動劑肽(嵌合體(Chimera)2 AIB2 C24 40K PEG，其係進一步經位置2處之AIB、24處連接至40K PEG基之Cys修飾的嵌合體2肽(見實施例21))；
(B)經聚乙二醇化之GIP拮抗劑(Pro3 C24 GIP NH2(1-42)40K PEG，其係GIP(天然GIP之序列係SEQ ID NO：4)之胺基酸1-42經位置3處之Pro、連接至40K PEG基之位置24處之Cys、及替代C-端羧酸酯之醯胺修飾)；
(C)GIP激動劑(AIB2 C24 GIP(1-42)40K PEG，其係GIP(天然GIP之序列係SEQ ID NO：4)之胺基酸1-42經位置2處之AIB及連接至40K PEG基之位置24處之Cys修飾)；及
經由對飲食引起肥胖(DIO)的小鼠皮下注射各種肽，或單獨的媒劑，QW(70或210奈莫耳/公斤/週)而於活體內測試肽。各組包含8隻小鼠，其各具有50克之初始平均體重。定期測定體重、體組成、食物攝取、及血糖值。
如圖1至3所示，與經聚乙二醇化之胰高血糖素/GLP-1共同激動劑相比，GIP拮抗劑及GIP激動劑肽皆對小鼠之降低體重、累積食物攝取、及血糖值無效。
實施例21 肽之GIP、GLP-1及胰高血糖素活性
基本上如前所述合成得SEQ ID NO：5-94之肽(其各包含醯胺替代C-端羧酸酯)，且依據實施例16於活體外測試對GIP受體、GLP-1受體、及胰高血糖素受體之活性。各肽的EC50示於表1。
相對活性係相對於指示受體之天然激素的活性。
基於此等數據，經判定肽mt-140、mt-147、mt-151、mt-152、mt-158、mt-164、mt-165、mt-166、mt-169、mt-170、mt-172、mt-175、及mt-179係範例的GLP-1/GIP/胰高血糖素三重激動劑肽，而肽mt-148、mt-149、mt-162、mt-174、mt-178、mt-201、及mt-204係範例的GLP-1/GIP共同激動劑肽，及肽mt-116、mt-176、mt-177、及mt-182係範例的GIP/胰高血糖素共同激動劑肽。
實施例22
經由對飲食引起肥胖(DIO)的小鼠皮下注射實施例21之GLP-1/GIP/胰高血糖素三重激動劑肽(mt-170)、GLP-1/GIP共同激動劑肽(mt-178)、及兩種GIP/胰高血糖素共同激動劑肽(mt-182及mt-179)；胰高血糖素/GLP-1共同激動劑肽(包含以下修飾的嵌合體2 AIB2(天然胰高血糖素胺基酸序列(SEQ ID NO：1)：位置17處之Gln，位置18處之Ala，位置20處之Lys，位置21處之Glu，位置23處之Ile，及位置24處之Ala，及具有在位置2處之AIB之進一步修飾的C-端醯胺(「嵌合體2」)或嵌合體2 AIB2內醯胺(與嵌合體2 AIB2相同，具有位置16處之Glu及位置20處之Lys的進一步修飾)，其中內醯胺橋連Glu16及Lys20之側鏈)；或單獨的媒劑，QW(70或210奈莫耳/公斤/週)，而於活體內測試此等肽。各組包含8隻小鼠，其各具有50克之初始平均體重。定期測定體重。
如圖4所示，三重激動劑及GLP-1/GIP共同激動劑對於降低小鼠之體重較嵌合體2 AIB2稍微更有效，但不若顯示最佳降低體重能力的嵌合體2 AIB2內醯胺有效。相對地，兩種GIP/胰高血糖素共同激動劑，尤其係mt-182，對於降低體重較無效。
實施例23
經由對飲食引起肥胖(DIO)的小鼠皮下注射GLP-1/GIP/胰高血糖素三重激動劑肽(mt-170)及GLP-1/GIP共同激動劑肽(mt-178)，GLP激動劑(包含SEQ ID NO：3，具有在位置16處之Glu)，或單獨的媒劑，QW(10奈莫耳/公斤/週歷時4星期或35奈莫耳/公斤/週歷時2星期)，而於活體內測試此等肽。各組包含8隻小鼠，各小鼠具有49克之初始平均體重。定期測定體重及血糖值。如圖5及6所示，GLP-1/GIP共同激動劑及三重激動劑對於降低體重及血糖值皆較GLP-1激動劑更有效。
實施例24
經由以位置16處之AIB取代mt-165(SEQ ID NO：64)及mt-170(SEQ ID NO：69)之內醯胺，而研究以α,α-二取代胺基酸替代內醯胺使基於胰高血糖素之類似物之α螺旋穩定的效果。包含mt-165之序列與以位置16處之AIB替代內醯胺的肽稱為「mt-241」，且具有SEQ ID NO：167之胺基酸序列；而包含mt-170之序列與以位置16處之AIB替代內醯胺的肽稱為「mt-248」，且具有SEQ ID NO：173之胺基酸序列。
亦基本上如前所述製得不含內醯胺橋且包含位置16及/或20處之AIB之額外的線型肽。將此等肽稱為「mt-242」、「mt-249」、「mt-250」、「mt-251」、「mt-252」、「mt-255」、「mt-258」、及「mt-259」，且其分別具有SEQ ID NO：168、174-176、107、108、177、及258之胺基酸序列。基本上如實施例16所述測試各此等肽對胰高血糖素、GLP-1、及GIP受體的活體外生物活性。結果示於表2。
如由表2中之結果明顯可見，不含內醯胺的線型肽對GIP受體、以及胰高血糖素及/或GLP-1受體提供活性。更明確言之，mt-242、mt-248、mt-249、mt-250、mt-252、mt-255、mt-258、及mt-259呈現胰高血糖素/GLP-1/GIP三重激動劑之活性，而mt-251呈現GLP-1/GIP共同激動劑之活性。具有在位置16處之Lys及在位置20處之AIB的肽mt-252呈現對胰高血糖素及GLP-1受體的效力且呈現對GIP受體的提高活性。
實施例25
基本上如前所述製得不含內醯胺環且包含在位置16處之Lys或類似殘基及在位置20處之AIB的線型肽。該等肽具有SEQ ID NO：99-141、144-164、及166之胺基酸序列。基本上如實施例16所述測試該等肽對胰高血糖素、GLP-1、及GIP受體的活體外生物活性。結果示於表3。
如表3所示，線型肽對GIP受體具活性，且在許多情況中，該等肽另外對胰高血糖素受體及/或GLP-1受體具活性。更明確言之，mt-252、mt-255、mt-257、mt-260、mt-261、mt-262、mt-265、mt-266、mt-267、mt-275、mt-276、mt-277、mt-278、mt-279、mt-280、mt-286、mt-287、mt-288、mt-289、mt-290、mt-291、mt-292、mt-293、mt-295、mt-296、mt-297、mt-299、mt-306、mt-307、mt-310、mt-323、mt-324、及mt-345皆對GIP、GLP-1、及胰高血糖素受體呈現活性，而表3之其他的肽對GIP及GLP-1受體呈現活性(僅除了mt-285，其僅對GIP受體呈現活性，及mt-325，其對胰高血糖素及GIP受體呈現活性，但未對GLP-1受體呈現活性)。
當比較包含C-端延伸之mt-252的數據與其之肽不含C-端延伸之mt-257、mt-258、及mt-259的數據時，明顯可見C-端延伸對所有的胰高血糖素、GLP-1、及GIP受體提高活性。
當比較包含在位置16處之Lys之mt-252的數據與其之肽分別包含在位置16處之Orn及Dab殘基之mt-275及mt-276的數據時，明顯可見Lys可經類似Lys的殘基取代。
此外，當比較包含在位置3處之Gln之mt-252的數 據與其之肽包含在位置3處之Glu之mt-256及mt-274的數據時，明顯可見以Glu殘基取代位置3處之Gln獲致對GLP-1及GIP受體超越胰高血糖素受體的選擇性。
由mt-260對mt-263及mt-265對mt-272之數據明顯可見利用C14、C16、及C18脂肪酸醯化的效果。由此等數據，明顯可見利用C16及C18脂肪酸醯化提供對GLP-1及GIP受體的增加活性。此等肽之醯化甚至透過包含Gln3Glu取代之肽而甚至可提高對胰高血糖素受體的活性。對胰高血糖素受體的提高活性亦可由三重激動劑mt-277對mt-280的數據看出。
實施例26
於DIO小鼠中測試經聚乙二醇化、含內醯胺之環狀肽mt-178(SEQ ID NO：75)、及經聚乙二醇化、不含內醯胺之線型肽mt-178(SEQ ID NO：99)的活體內活性，並與具有SEQ ID NO：179之基於GLP-1之結構之純GLP-1激動劑對照物的活體內活性作比較。在第0天將肽或媒劑對照物以1、3、或10奈莫耳/公斤/週經腹膜內注射至小鼠。
經由在注射肽或媒劑對照物中之一者後1小時將25%(w/v)葡萄糖鹽水溶液經腹膜內注射至小鼠，而對小鼠進行1小時葡萄糖耐受試驗(GTT)。葡萄糖鹽水溶液係 以每公斤小鼠體重1.5克之劑量投與小鼠。在注射肽或媒劑對照物時(-60分鐘)，在注射葡萄糖鹽水溶液時(0分鐘)，或在注射葡萄糖鹽水溶液後15、30、60、或120分鐘時，測量血糖值。1小時GTT之結果示於圖7。
亦以與1小時GTT相同的方式對小鼠進行24小時GTT，僅除了葡萄糖鹽水溶液係在注射肽或媒劑對照物後24小時投與。24小時GTT之結果示於圖8。
於注射肽或媒劑對照物0及7天後測量各小鼠的總血糖值，且示於圖9。
此外，於注射肽或媒劑對照物後第0、1、3、5、及7天測量各小鼠的體重。小鼠的體重變化%示於圖10。
如圖10所示，經以3或10奈莫耳/公斤/週劑量注射mt-178及mt-274之小鼠減去與經注射GLP-激動劑對照肽(以10奈莫耳/公斤/週劑量)相同或更大程度的重量。
如圖7及8所示，相較於經注射媒劑對照物之小鼠，經注射mt-178、mt-274、或GLP-1激動劑對照物之小鼠呈現減低的血糖值。mt-178及mt-274之效力看來較GLP-1激動劑對照肽之效力大，由於3奈莫耳/公斤/週之mt-178及mt-274達到與10奈莫耳/公斤/週劑量之GLP-1激動劑對照肽相同的效果。mt-274看來具有最高的效力，由於此肽在1奈莫耳/公斤/週劑量下達到與 10奈莫耳/公斤/週之GLP-1激動劑對照肽類似的結果。
實施例27
再次於小鼠中測試實施例26中所述之相同肽，僅除了將較高劑量(10或35奈莫耳/公斤/週)之肽皮下注射至小鼠體內。亦以此等劑量測試兩種額外的肽：一種肽具有與mt-178相同的結構，但包含於位置40處透過經由親核性取代所形成之更穩定之硫醚鍵聯(-SCH2CO-)(相對於如見於mt-178中之透過麥可加成經由順丁烯二醯亞胺PEG所形成之傳統硫醚鍵聯)連接至Cys的PEG基；及第二種肽具有與mt-274相同的結構，但包含於位置40處透過經由親核性取代所形成之硫醚鍵聯(-SCH2CO-)連接至Cys的PEG基。此等肽在文中分別被稱為mt-178(TE)及mt-274(TE)。
於注射肽或媒劑對照物0及7天後測量小鼠的總血糖值且示於圖11。於注射肽或媒劑對照物7天後測量小鼠血糖的總變化且示於圖12。
於注射肽或媒劑對照物後第0、1、3、5、及7、及10天測量各小鼠的體重。小鼠體重變化%成時間之函數示於圖13，而於注射肽或媒劑對照物7天後測得之小鼠體重的總變化示於圖14。
如圖12所示，相較於經注射媒劑對照物之小鼠，所有經注射任何測試肽之小鼠的血糖總變化皆減小。在經注射35奈莫耳/公斤/週之mt-274或mt-178(TE)的小鼠中看到最劇烈的血糖變化。
如圖14所示，相較於經注射媒劑對照物之小鼠，所有經注射任何測試肽之小鼠的體重總變化皆減小。如同血糖總變化，在經注射35奈莫耳/公斤/週之mt-274或mt-178(TE)的小鼠中觀察到最劇烈的體重變化。
實施例28
將實施例26中所述肽之活體內活性與線型mt-274肽之經醯化形式的活體內活性作比較。更明確言之，製造且測試三種其中之C-端胺基酸(Lys殘基)共價連接至C16脂肪醯基、C14脂肪醯基、或C18脂肪醯基之mt-274的經醯化形式。此等肽在文中分別被稱為mt-298、mt-309、及mt-310。如同母肽mt-274，經醯化肽亦包含40kDa PEG基。然而，經醯化肽之PEG基係共價連接至肽之位置24處之Cys殘基的側鏈。經醯化肽mt-298、mt-309、及mt-310之胺基酸序列在文中分別係經提供為SEQ ID NO：101-103。
製造且測試未醯化形式的mt-298、mt-209、及mt-310(以下稱為mt-311)。肽mt-311與mt-274之不 同處在於mt-311係透過位置24處之Cys殘基之側鏈(相對於mt-274中所見之C-端處之Cys殘基)共價連接至PEG基，且mt-311之C-端殘基係Lys殘基，而非如mt-274中所見之Cys殘基。
於第0天將肽或媒劑對照物以1星期10奈莫耳/公斤皮下注射至DIO小鼠。
於注射肽或媒劑對照物0及7天後測量小鼠的血糖值且示於圖15。於注射肽或媒劑對照物後第0、1、3、5、及7天測量各小鼠的體重。小鼠體重變化%成時間之函數示於圖16，而於注射肽或媒劑對照物7天後測得之小鼠體重的總變化示於圖17。
如圖17所示，相較於經注射媒劑對照物之小鼠，經注射任何肽之小鼠呈現體重的減小。經注射經聚乙二醇化、含內醯胺之環狀肽(mt-178)之小鼠於注射7天後顯現最大的體重減輕。
如圖15所示，經注射mt-178、mt-274、mt-311、或其之C14或C16醯化形式之小鼠的血糖值減低。利用C18脂肪醯基醯化看來並未導致血糖值減低，顯示醯基之大小對於肽的葡萄糖降低效果可能相當重要。
實施例29
基本上如前所述製得經醯化但未經聚乙二醇化之不 含內醯胺之基於胰高血糖素的線型肽。明確言之，製得包含位在C-端胺基酸上之C14脂肪醯基之mt-260(SEQ ID NO：104)、包含位在C-端胺基酸上之C16脂肪醯基之mt-261(SEQ ID NO：105)及包含位在C-端胺基酸上之C18脂肪醯基之mt-262(SEQ ID NO：106)。各此等肽之結構類似於mt-298、mt-309、及mt-310之結構，但不同處在於mt-260、mt-261、及mt-262包含Asn殘基替代位置24處之經聚乙二醇化的Cys殘基。
將肽mt-260、mt-261、或mt-262、對照肽(利拉魯肽，一種經醯化之GLP-1類似物)、或媒劑對照物以7天25或125奈莫耳/公斤之劑量QD注射至小鼠體內。
於注射肽或媒劑對照物0及7天後測量小鼠的血糖值且示於圖18。於注射肽或媒劑對照物後第0、1、3、5、及7天測量各小鼠的體重。小鼠體重變化%成時間之函數示於圖19，而於注射肽或媒劑對照物7天後測得之小鼠體重的總變化示於圖20。
如圖18所示，經醯化、未經聚乙二醇化之線型肽(mt-260、mt-261、及mt-262)對血糖值的作用相當劇烈。在25奈莫耳/公斤下，此等肽引起血糖值約50%的減低，及在較高劑量下，此等肽引起大於50%之血糖值的減低。
如圖19所示，各經醯化、未經聚乙二醇化之線型肽(在 低或高劑量下)引起較由低劑量下之利拉魯肽所達成之體重減輕更有效的體重減輕。體重在7天的檢定過程中持續減輕。
此等結果顯示對GIP及GLP-1受體具有活性之經醯化、未經聚乙二醇化之基於胰高血糖素的線型肽可大大地減低血糖值及體重，因而指示可使用此等肽於治療代謝病症，包括糖尿病，及用於治療肥胖症。
實施例30
於DIO小鼠(N=每組8隻；平均初始體重=48克)中測試不同劑量的基於胰高血糖素之線型肽mt-261(SEQ ID NO：105)。將小鼠QD皮下注射僅僅媒劑、利拉魯肽(30奈莫耳/公斤體重)或mt-261(0.3、1、3、10或30奈莫耳/公斤體重)。
於初次注射後第0、1、3、5、及7天測量小鼠的體重。如圖21所示，注射mt-261或利拉魯肽引起小鼠的體重減輕。由於3奈莫耳/公斤之mt-261達成與30奈莫耳/公斤之利拉魯肽基本上相同的效果(圖21)，因而肽mt-261呈現較利拉魯肽高的效力。
於初次注射7天後藉由核磁共振成像測量小鼠的脂肪質量。如圖22所示，mt-261之增加劑量一般與減低的脂肪質量有關聯。經注射3奈莫耳/公斤之mt-261之小鼠 的脂肪質量大約與經注射30奈莫耳/公斤之利拉魯肽之小鼠的脂肪質量相同，顯示mt-261相較於利拉魯肽的高效力。
於初次注射0及7天後測量小鼠的血糖值。如圖23所示，低至3奈莫耳/公斤劑量之mt-261即引起血糖值的顯著減低。與脂肪質量及體重檢定的結果一致，經注射3奈莫耳/公斤mt-261之小鼠之血糖值的減低與經注射30奈莫耳/公斤利拉魯肽之小鼠之血糖值的減低類似，顯示mt-261相較於利拉魯肽的較高效力。
在一個別的實驗中，於九組C57BI/6小鼠(每組8隻小鼠)中測試未經醯化形式之mt-261(即mt-263(SEQ ID NO：111))對體重、食物攝取、血糖值、及脂肪質量的活體內作用。小鼠係11個月大，且在研究時經給予致糖尿病飲食9個月。小鼠的平均體重為57克。將小鼠每日皮下注射3、10、或30奈莫耳/公斤之mt-263歷時1星期。對照組接受10或30奈莫耳/公斤/天的媒劑對照物或促胰島素分泌素-4。
為評估對體重的活體內作用，於第0、1、3、5、及7天測量小鼠的體重，其中第0天係注射的第一天。如圖24所示，以三種劑量的任一者注射mt-263皆在7天的測試期間內引起體重的穩定減低。由於當增加mt-263之劑量時，體重的總變化(示於圖25)增加，因而看來對體 重的作用亦與劑量相關。此外，如圖25所示，由三種mt-263劑量之任一者所達成的體重總變化實質上較經由注射促胰島素分泌素-4(以任一劑量)所達成的體重總變化高。
亦測定對食物攝取、脂肪質量、及血糖的活體內作用。於經注射mt-263之小鼠之第7天測得的總食物攝取及脂肪質量相較於媒劑對照物及促胰島素分泌素-4降低。此外，經注射mt-263之小鼠之血糖值的總變化(於第7天測得值相較於第0天的測得值)相較於經注射媒劑對照物或促胰島素分泌素-4之小鼠顯著地降低(圖26)。10奈莫耳/公斤劑量的肽看來係最佳劑量，其達成血糖值的最大減低(接近-80mg/dL)。
亦將肽mt-263對體重、食物攝取、及血糖值的活體內作用與肽mt-349(SEQ ID NO：262)、mt-280、mt-356、及mt-357、及媒劑對照物作比較。給予小鼠30奈莫耳/公斤/天之其中一種肽歷時1星期。相較於媒劑對照物，所有肽皆對降低小鼠的體重有效。
實施例31
測試經醯化之基於胰高血糖素之線型肽mt-277、mt-278、及mt-279的活體內作用，並與利拉魯肽作比較。對DIO小鼠(每組8隻小鼠；平均初始體重=51.4克) 每日皮下注射媒劑對照物或10奈莫耳/公斤之利拉魯肽、mt-277、mt-278、或mt-279。
於初次注射後第0、1、3、5、及7天測量小鼠的體重。如圖27所示，注射mt-277、mt-278、或mt-279引起小鼠的顯著體重減輕。所有此等肽進一步展現較利拉魯肽高的效力。
於初次注射0及7天後測量小鼠的血糖值。如圖28所示，mt-277、mt-278、及mt-279各引起血糖值的顯著減低，該減低甚大於在經注射利拉魯肽之小鼠中所見者。
實施例32
將GLP-1受體活性、基於胰高血糖素之類似物修飾成包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列的C-端延伸，且進一步修飾成包含SEQ ID NO：95之C-端處的Lys。位在類似物之位置40處之Lys殘基經C14脂肪醯基醯化。基本上如實施例16中所述測試此醯化類似物對胰高血糖素、GLP-1、及GIP受體的活體外活性。將活體外活性與不含C-端延伸及位置40處之醯化之母GLP-1受體活性、基於胰高血糖素之類似物作比較。C-端延伸之醯化類似物對GIP受體顯現大約15%的活性增加及對胰高血糖素受體顯現大約52%的增加。當經C-端延伸之醯化類 似物刺激時，對GLP-1受體的活性實際上減低。然而，活性仍較天然GLP-1對GLP-1受體所達成的活性大100%。
實施例33
基本上如前所述合成得經醯化的胰高血糖素類似物肽(其各包含醯胺替代C-端羧酸酯)。肽mt-358、mt-367、mt-368、及mt-369係醯化單體，而mt-354、mt-376、及mt-377係醯化二聚體，其中各二聚體包含兩個透過C-端Cys殘基鍵聯的單體。肽mt-367、mt-368、及mt-369包含γGlu-γGlu二肽間隔物用於連接醯基，而mt-358則係在不存在間隔物的情況下醯化。肽mt-225、mt-227、及mt-294係包含在位置16處之麩胺酸與位置20處之離胺酸之間之內醯胺橋的聚乙二醇化單體。肽mt-225及mt-227包含二肽間隔物用於連接PEG，而mt-294係透過精油與鹵乙醯基反應製得的硫醚醯化。肽356及mt-357充作未醯化的對照肽，其中mt-357包含位置7處之Ile，但mt-356包含Thr。基本上如實施例16中所述測試其全體對GIP受體、GLP-1受體、及胰高血糖素受體的活體外活性。各肽的EC50(nM)及相對於天然激素的活性示於表4。
* 指示二硫化物鍵聯二聚體結構，其中各肽單體係透過如結構A所示的二硫化物鍵連接。** 指示PEG鍵聯的二聚體結構，其中各肽單體係透過如結構B所示的PEG連接。† 二聚體之各單體包含在單體之位置40處之醯化(其中位置1係N-端胺基酸)。
如表4所示，所有三種醯化二聚體皆對GLP-1及GIP受體顯現有效的活性。此外，mt-368所展現之對GLP-1 受體的活性相較於由mt-358所展現者大大地提高，且mt-368對GIP受體之活性與mt-358相比基本上經維持，顯示透過間隔物醯化胰高血糖素肽可提高對GLP-1受體之活性，同時仍維持對GIP受體的強固活性。由於mt-367及mt-369對GLP-1及GIP受體的相對活性大約相同，因而透過胰高血糖素類似物之位置10處之間隔物醯化看來係與胰高血糖素類似物之位置40處同樣好的位置。
實施例34
基本上如文中所述製得兩種具有相同胺基酸序列，但聚乙二醇化連接體不同的醯化胰高血糖素類似物肽：mt-331(SEQ ID NO：153)包含以下結構之對PEG的鍵聯： 而mt-311(SEQ ID NO：100)包含以下結構之對PEG的鍵聯：
將兩種肽或媒劑對照物經由皮下注射QW投與多組DIO小鼠(每組6隻小鼠；平均體重=64.6克)歷時1星期。肽係以10或35奈莫耳/公斤之劑量投與。
於投與肽或媒劑對照物後第0、1、3、5、及7天測量小鼠的體重。經注射較高劑量之mt-311或mt-331之小鼠的體重在該星期的過程中穩定地減低。體重之總變化(%)示於圖29。如此圖所示，經注射mt-311之小鼠的體重總變化最大。
亦於投與肽或媒劑對照物後第0、1、3、5、及7天測量各組小鼠的總食物攝取。如圖30所示，與經注射媒劑對照物的小鼠相比，經注射任一劑量之mt-311或mt-331之小鼠群組的總食物攝取皆減少。
於投與肽或媒劑對照物0及7天後測量各組小鼠的血糖值。小鼠之血糖值在投與較高劑量之mt-311或mt-331後減低。如圖31所示，經注射35奈莫耳/公斤mt-331之小鼠的血糖值減低較大。
測量各組小鼠的脂肪質量。然而，投與肽看來並未對脂肪質量具有影響。
實施例35
於7個月大的C57BI/6小鼠中測試兩種具相同胺基酸序列，但不同處在於不存在連接至位置40處之Lys之 醯基(mt-331(SEQ ID NO：153))或存在C14脂肪醯基(mt-353(SEQ ID NO：166))之肽對體重、食物攝取、血糖值及脂肪質量的活體內作用。小鼠經食用致糖尿病飲食5個月，且平均初始體重為53克。經由皮下注射以0.1、0.3、3、或10奈莫耳/公斤之劑量將肽或媒劑對照物投與小鼠歷時1星期。
於投與肽或媒劑對照物0、1、3、5、及7天後測量體重。如圖32所示，經注射10奈莫耳/公斤之mt-331或mt-353之小鼠的體重總變化最為顯著。
於投與肽或媒劑對照物0、1、3、5、及7天後測量小鼠的食物攝取。如圖33所示，與經投與媒劑對照物的小鼠相比，經注射3或10奈莫耳/公斤之mt-331或mt-353之小鼠的總食物攝取減少。
亦監測小鼠的血糖值。如圖34所示，mt-331導致血糖值以劑量相關的方式減低。兩種劑量的mt-353另外導致血糖值減低。脂肪質量值並未顯著地受投與任一肽影響。
實施例36
於8組DIO小鼠(每組8隻小鼠)中測試三種分別具有SEQ ID NO：123、124、及125之結構之醯化三重激動劑肽mt-277、mt-278、及mt-279對體重、血糖值、及 食物攝取的活體內作用。該等肽具有相同的胺基酸序列，但其所連接之脂肪醯基的大小不同。使用10nM/kg濃度的利拉魯肽作為對照物。每日經皮下注射投與肽或媒劑對照物歷時1星期。
測試對胰高血糖素、GLP-1、及GIP受體的活體外活性，且各肽相對於天然激素的活性%示於下表5。
於投與肽或媒劑對照物0、1、3、5、及7天後測量小鼠的體重。在該星期過程期間，相較於媒劑對照物，經注射其中一種醯化三重激動劑肽之小鼠的體重大大地減低。如圖35所示，經注射其中一種醯化三重激動劑肽之小鼠的體重總變化(%)大約為-15%，而利拉魯肽達成低於5%的體重減低。
實施例37
於7組具有58克平均體重的DIO小鼠(每組8隻小鼠)中測試給藥頻率對經聚乙二醇化之醯化肽(mt-309；SEQ ID NO：102)及未經聚乙二醇化之醯化肽(mt-261；SEQ ID NO：105)之效力的影響。將肽以每天(QD)5奈莫耳/公斤之劑量、每兩天10奈莫耳/公斤之劑量、或每星期(QW)30奈莫耳/公斤之劑量經皮下注射至小 鼠。研究持續6天，以致至研究期間結束時，各組小鼠經接受30奈莫耳/公斤。於初次給藥0及6天後測量體重及血糖值。
如圖36所示，經QW注射mt-309之小鼠的體重總變化(%)大約與經QD注射相同肽之小鼠的體重總變化相同。此外，如圖36所示，經QD注射mt-261之小鼠的體重總變化大約與每兩天注射此肽之小鼠的體重總變化相同。
對血糖值亦可觀察到與體重相同的趨勢(圖37)：QW注射mt-309達成與QD注射此肽相同的血糖值減低，及QD注射mt-261達成與每兩天注射此肽相同的血糖值減低。
實施例38
經由對8組具有56克初始體重的DIO小鼠(每組8隻小鼠)皮下注射每天5奈莫耳/公斤、每兩天10奈莫耳/公斤、每三天15奈莫耳/公斤、或一天30奈莫耳/公斤，以致各組接受每星期30奈莫耳/公斤之總劑量，而測試醯化胰高血糖素激動劑肽mt-261(SEQ ID NO：105)之給藥頻率對效力的影響。小鼠係8個月大，且經食用致糖尿病飲食6個月。測量各組的體重、食物攝取、血糖值及脂肪質量。如圖38所示，經每三天注射肽的小 鼠呈現最大的體重減輕。值得注意地，經每天注射肽的小鼠及經每兩天注射肽的小鼠呈現幾乎相同的體重減輕。
實施例39
基本上如文中所述經由固相肽合成製得以下僅對胰高血糖素受體具有明顯激動劑活性而對GIP受體不具活性，且包含肽J HS-X-GTFTSDYSKYLDTRRAAEFVAWL(Nle)DE(SEQ ID NO：240)或肽K HS-X-GTFTSDYSKYLD(Aib)RRAADFVAWLMDE(SEQ ID NO：241)之主鏈與在位置3處之額外修飾的胰高血糖素類似物肽。基本上如實施例16中所述測試此等肽對胰高血糖素受體的活體外活性。各肽的EC50(nM)示於表5。
Q=麩醯胺酸；C(Acm)=乙醯胺甲基-半胱胺酸；Dab(Ac)=乙醯基二胺基丁酸；Dap(脲)=胺甲醯基二胺基丙酸；Q(Me)=甲基麩醯胺酸；M(O)=甲硫胺酸-亞碸；Orn(Ac)=乙醯基鳥胺酸。
如表5所示，多種胺基酸可取代位置3處之Gln，而不會有對胰高血糖素受體之活性的實質損失，且在一些情況中，修飾實際上提高活性，例如，在肽K主鏈上的Dab(Ac)及Q(Me)。
實施例40
基本上如文中所述製得對胰高血糖素受體具有明顯活性而對GIP受體不具活性，且包含在各種胰高血糖素類似物主鏈上之位置3處之Dab(Ac)的胰高血糖素類似物肽，並測試對胰高血糖素受體的活體外活性。各肽的結 構及活性示於表6。
將文中引述之所有參考文獻，包括公告、專利申請案、及專利，以如同各參考文獻經個別且明確地指示為經併入本文為參考資料且以其全體記述於文中之相同程度併入本文為參考資料。
除非文中另作指示或前後文明顯相互衝突，否則應將在描述本發明之文中(尤其係在以下申請專利範圍之文中)之術語「一」及「一個」及「該」及類似指示物的使用解釋為涵蓋單數及複數。除非另作指示，否則術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」應作為開放式術語解釋(即意指「包括，但不限於」)。
除非文中另作指示，否則文中引述值的範圍僅係要充作個別提及落於該範圍及各終點內之各個別值的簡便方法，且將各個別值及終點併入說明書中如同其經個別引述於文中。
除非文中另作指示或者前後文明顯地相互衝突，否則文中所述之所有方法可以任何適當次序進行。除非另作主張，否則文中提供之任何及所有實例、或範例語言(例如，「諸如」)之使用僅係要更佳地闡述本發明，而非要對本發明之範圍提出限制。不應將說明書中之語言解釋為指示任何未主張之要素為實施本發明之基礎。
文中說明本發明之較佳具體例，包括發明者已知為實施本發明的最佳方式。熟悉技藝人士在閱讀先前說明後當可明白該等較佳具體例的變化。本發明人預期熟悉技藝人士可適當地使用該等變化，且本發明人預期本發明可以除明確說明於文中者外的方式實施。因此，本發明包括如由適用法條所許可之於隨附申請專利範圍中所引述之主題 內容的所有修改及等效物。此外，除非文中另作指示或者前後文明顯地相互衝突，否則本發明涵蓋前述要素之所有可能變化的任何組合。
圖1呈現於投與單獨的媒劑(空心倒三角形)、嵌合體2 AIB2 Cys24(40K PEG)(實心方形)、GIP拮抗劑Pro3 Cys24 GIP-NH2 (1-42)40K PEG(空心菱形)、GIP激動劑AIB2 Cys24 GIP(1-42)40K PEG(具有虛線的空心正三角形)、或無關的肽激素(陰暗的倒三角形)後，小鼠體重變化%成時間(天數)之函數的圖。
圖2呈現小鼠之食物攝取(克數)成投與單獨的媒劑(空心倒三角形)、嵌合體2 AIB2 Cys24 40K PEG(實心方形)、GIP拮抗劑Pro3 Cys24 GIP-NH2 (1-42)40K PEG(空心菱形)、GIP激動劑AIB2 Cys24 GIP(1-42)40K PEG(具有虛線的空心正三角形)、或無關的肽激素(陰暗的倒三角形)後之時間之函數的圖。
圖3呈現在投與單獨的媒劑(黑長條)、嵌合體2 AIB2 Cys24(40K PEG)(白長條)、GIP拮抗劑Pro3 Cys24 GIP-NH2(1-42)40K PEG(陰暗長條)、GIP激動劑AIB2 Cys24 GIP(1-42)40K PEG(水平條紋長條)、或無關的肽激素(垂直條紋長條)後第7天之小鼠血糖值 (mg/dL)之變化圖。
圖4呈現於投與單獨的媒劑(實心倒三角形)、嵌合體2 AIB2(空心菱形)、嵌合體2 AIB2內醯胺(空心三角形)、三重激動劑肽MT-170(空心方形)、GIP/胰高血糖素共同激動劑肽MT-182(實心菱形)、GLP-1/GIP共同激動劑肽MT-178(具有虛線的陰暗三角形)、或GIP/胰高血糖素共同激動劑肽MT-179(實心方形)後，小鼠體重變化%成時間(天數)之函數的圖。注意經聚乙二醇化之MT-179係作為三重激動劑。
圖5係在投與單獨的媒劑(實心正三角形)、10奈莫耳/公斤(實心倒三角形)或35奈莫耳/公斤(空心方形)之GLP-1 E 16激動劑、10奈莫耳/公斤(空心倒三角形)或35奈莫耳/公斤(實心菱形)之三重激動劑肽MT-170、或10奈莫耳/公斤(灰色倒三角形)或35奈莫耳/公斤(灰色方形)之GLP-1/GIP共同激動劑肽MT-178後，小鼠體重變化%成時間(天數)之函數的圖。
圖6係在投與單獨的媒劑(黑長條)、10奈莫耳/公斤(白長條)或35奈莫耳/公斤(灰長條)之GLP-1 E 16激動劑、10奈莫耳/公斤(水平條紋長條)或35奈莫耳/公斤(垂直條紋長條)之三重激動劑肽MT-170、或10奈莫耳/公斤(右-左斜紋長條)或35奈莫耳/公斤(左-右斜紋長條)之GLP-1/GIP共同激動劑肽MT-178後第7天之 小鼠血糖值(mg/dL)之變化圖。
圖7呈現在對經以1、3、或10奈莫耳/公斤/星期注射(於時間點-60)媒劑對照物、GLP-1激動劑肽對照物、含內醯胺(環狀)、經聚乙二醇化、GIP-活性胰高血糖素類似物(「mt-178」)、或不含內醯胺(線性)、經聚乙二醇化、GIP-活性胰高血糖素類似物(「mt-274」)之小鼠實施葡萄糖注射(於時間點0時投與)之前及之後，血糖值(mg/dL)成時間之函數的圖。此圖之數據不包含四隻小鼠之數據，因此等小鼠呈現攻擊行為及實質的體重減輕。
圖8呈現在對經以1、3、或10奈莫耳/公斤/星期注射(於葡萄糖注射之前24小時)媒劑對照物、GLP-1激動劑肽對照物、mt-178、或mt-274之小鼠實施葡萄糖注射(於時間點0時投與)之前及之後，血糖值(mg/dL)成時間之函數的圖。此圖之數據不包含四隻小鼠之數據，因此等小鼠呈現攻擊行為及實質的體重減輕。
圖9呈現在以1、3、或10奈莫耳/公斤/星期注射媒劑對照物、GLP-1激動劑肽對照物、mt-178、或mt-274後第0或7天之小鼠血糖值(mg/dL)的圖。此圖之數據不包含四隻小鼠之數據，因此等小鼠呈現攻擊行為及實質的體重減輕。
圖10呈現在以1、3、或10奈莫耳/公斤/星期注射媒劑對照物、GLP-1激動劑肽對照物、mt-178、或 mt-274後第0、1、3、5、及7天之小鼠體重變化百分比的圖。此圖之數據不包含四隻小鼠之數據，因此等小鼠呈現攻擊行為及實質的體重減輕。
圖11呈現在以10或35奈莫耳/公斤/星期注射媒劑對照物、GLP-1激動劑肽對照物、mt-178、mt-178(TE)、mt-274、或mt-274(TE)後第0或7天之小鼠血糖值(mg/dL)的圖。「TE」係指PEG基團連接至位置40處之Cys。
圖12呈現在以10或35奈莫耳/公斤/星期注射媒劑對照物、GLP-1激動劑肽對照物、mt-178、mt-178(TE)、mt-274、或mt-274(TE)後第7天之小鼠血糖變化(mg/dL)的圖。「TE」係指PEG基團連接至位置40處之Cys。
圖13呈現在以10或35奈莫耳/公斤/星期注射媒劑對照物、GLP-1激動劑肽對照物、mt-178、mt-178(TE)、mt-274、或mt-274(TE)後第0、1、3、5、7、及10天之小鼠體重變化百分比的圖。「TE」係指PEG基團連接至位置40處之Cys。
圖14呈現在以10或35奈莫耳/公斤/星期注射媒劑對照物、GLP-1激動劑肽對照物、mt-178、mt-178(TE)、mt-274、或mt-274(TE)後第7天之小鼠體重變化百分比的圖。「TE」係指PEG基團連接至位置 40處之Cys。
圖15呈現在以10奈莫耳/公斤注射媒劑對照物、GLP-1激動劑肽對照物、mt-178、mt-274、線性、未經聚乙二醇化、未醯化肽(「mt-311」)、C14脂肪醯化線性肽(「mt-309」)、C16脂肪醯化線性肽(「mt-298」)、或C18脂肪醯化線性肽(「mt-310」)後第0或7天之小鼠血糖值(mg/dL)的圖。
圖16呈現在以10奈莫耳/公斤注射媒劑對照物、GLP-1激動劑肽對照物、mt-178、mt-274、mt-311、mt-309、mt-298、或mt-310後第0、1、3、5、及7天之小鼠體重變化百分比的圖。
圖17呈現在以10奈莫耳/公斤注射媒劑對照物、GLP-1激動劑肽對照物、mt-178、mt-274、mt-311、mt-309、mt-298、或mt-310後第7天之小鼠體重變化百分比的圖。
圖18呈現在以25或125奈莫耳/公斤QD注射媒劑對照物、利拉魯肽(一種醯化GLP-1類似物)、C14脂肪醯化、未經聚乙二醇化之線性肽(「mt-260」)、C16脂肪醯化、未經聚乙二醇化之線性肽(「mt-261」)、或C18脂肪醯化、未經聚乙二醇化之線性肽(「mt-262」)七天後第0及7天之小鼠血糖值(mg/dL)的變化圖。
圖19呈現在以25或125奈莫耳/公斤注射媒劑對 照物、利拉魯肽、mt-260、mt-261、或mt-262後第0、1、3、5、及7天之小鼠體重變化百分比的圖。
圖20呈現在以25或125奈莫耳/公斤注射媒劑對照物、利拉魯肽、mt-260、mt-261、或mt-262後第7天之小鼠體重變化百分比的圖。
圖21呈現在初次注射媒劑對照物、利拉魯肽(30奈莫耳/公斤/天)、或mt-261(0.3、1、3、10、或30奈莫耳/公斤/天)後第0、1、3、5、及7天之小鼠體重變化的圖。
圖22呈現在初次注射媒劑對照物、利拉魯肽(30奈莫耳/公斤/天)、或mt-261(0.3、1、3、10、或30奈莫耳/公斤/天)後第7天之小鼠脂肪質重的圖。
圖23呈現在初次注射媒劑對照物、利拉魯肽(30奈莫耳/公斤/天)、或mt-261(0.3、1、3、10、或30奈莫耳/公斤/天)後第0及7天之小鼠血糖值(mg/dL)的圖。
圖24呈現經以()中指示之劑量(奈莫耳/公斤/天)注射mt-263、促胰島素分泌素-4、或媒劑對照物之小鼠之體重變化(變化%)成時間之函數的線圖。
圖25呈現經以()中指示之劑量(奈莫耳/公斤/天)注射mt-263、促胰島素分泌素-4、或媒劑對照物之小鼠之體重總變化(%)(於第7天相較於第0天所測得)的長條 圖。
圖26呈現經以()中指示之劑量(奈莫耳/公斤/天)注射mt-263、促胰島素分泌素-4、或媒劑對照物之小鼠之血糖值變化(mg/dL)(於第7天相較於第0天所測得)的長條圖。
圖27呈現在初次注射媒劑對照物、利拉魯肽、mt-277、mt-278、或mt-279後第0、1、3、5、及7天之小鼠體重變化%的圖。
圖28呈現在初次注射媒劑對照物、利拉魯肽、mt-277、mt-278、或mt-279後第0及7天之小鼠血糖值(mg/dL)的圖。
圖29呈現於投與mt-331、mt-311、或媒劑對照物後第7天測得之小鼠總體重變化(%)的圖。劑量(奈莫耳/公斤)指示於()中。
圖30呈現於投與mt-331、mt-311、或媒劑對照物後第7天測得之小鼠之總食物攝取(克)的圖。劑量(奈莫耳/公斤)指示於()中。
圖31呈現於投與mt-331、mt-311、或媒劑對照物後第7天測得之小鼠血糖值總變化的圖。劑量(奈莫耳/公斤)指示於()中。
圖32呈現於以()中顯示之指示劑量(奈莫耳/公斤)投與mt-331、mt-353、或媒劑對照物後第7天測得之小 鼠體重總變化的圖。
圖33呈現於以()中顯示之指示劑量(奈莫耳/公斤)投與mt-331、mt-353、或媒劑對照物後第7天測得之小鼠總食物攝取(克)的圖。
圖34呈現於以()中顯示之指示劑量(奈莫耳/公斤)投與mt-331、mt-353、或媒劑對照物後第7天測得之小鼠血糖值變化(mg/dL)的圖。
圖35呈現於初次投與mt-277、mt-278、mt-279、或媒劑對照物後第7天測得之小鼠體重總變化(%)的圖。
圖36呈現於初次投與mt-261、mt-309、或媒劑對照物後第6天測得之小鼠體重總變化(%)的圖。
圖37呈現於初次投與mt-261、mt-309、或媒劑對照物後第6天測得之小鼠血糖值(mg/dL)的圖。相同圖案之各對長條中的第一長條係於第0天測得之血糖值，及各對中的第二長條係第6天的值。
圖38呈現如文中進一步說明經注射媒劑對照物或mt-261之小鼠在初次投與mt-261後第6天測得之體重總變化(%)(相較於在投與第一天時測得的體重)的長條圖。
<110> Dimarchi等人\ <120> 用於治療代謝病症及肥胖症之基於GIP之混合激動劑 <130> 31135/43978C <160> 262 <170> PatentIn版本3.5 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> 人類 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 野生型胰高血糖素 <400> 1<210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> 人類 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> GLP-1(7-37) <400> 2<210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> GLP-1(7-36)醯胺化 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> C-端醯胺化 <400> 3<210> 4 <211> 42 <212> PRT <213> 人類 <220> <221> mat_肽 <222> (1)..(42) <223> 胃抑制多肽 <400> 4<210> 5 <211> 29 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物61 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> 殘基16與20間之內醯胺橋 <400> 5<210> 6 <211> 29 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物62 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> 殘基16與20間之內醯胺橋 <400> 6<210> 7 <211> 29 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物63 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(16) <223> 殘基12與16間之內醯胺橋 <400> 7<210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物66 <400> 8<210> 9 <211> 29 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物68 <400> 9<210> 10 <211> 29 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物69 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> 殘基16與20間之內醯胺橋 <400> 10<210> 11 <211> 29 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物84 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> 殘基16與20間之內醯胺橋 <400> 11<210> 12 <211> 29 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物85 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> 殘基16與20間之內醯胺橋 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> PEG(20kDa)共價連接至半胱胺酸 <400> 12<210> 13 <211> 29 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物92 <400> 13<210> 14 <211> 29 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物93 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> 殘基16與20間之內醯胺橋 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(21) <223> 殘基17與21間之內醯胺橋 <400> 14<210> 15 <211> 29 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物95 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> 殘基16與20間之內醯胺橋 <400> 15<210> 16 <211> 29 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物96 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> 殘基16與20間之內醯胺橋 <400> 16<210> 17 <211> 29 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物97 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> 殘基16與20間之內醯胺橋 <400> 17<210> 18 <211> 29 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物98 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> 殘基16與20間之內醯胺橋 <400> 18<210> 19 <211> 42 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物99 <400> 19<210> 20 <211> 42 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物100 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa為Aib <400> 20<210> 21 <211> 42 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物101 <400> 21<210> 22 <211> 42 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物102 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa為Aib <400> 22<210> 23 <211> 42 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物104 <400> 23<210> 24 <211> 42 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物105 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> PEG(40kDa)連接至半胱胺酸 <400> 24<210> 25 <211> 29 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物106 <400> 25<210> 26 <211> 29 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物107 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> 殘基16與20間之內醯胺橋 <400> 26<210> 27 <211> 29 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> 類似物108 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> 殘基16與20間之內醯胺橋 <400> 27<210> 28 <211> 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類似物115 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> 殘基16與20間之內醯胺橋 <400> 33<210> 34 <211> 39 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽
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<223> 合成多肽
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<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<221> MISC_FEATURE
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<223> 合成多肽
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<221> MISC_FEATURE
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<221> MISC_FEATURE
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<223> 合成多肽
<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> 合成多肽
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<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
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<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物150
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
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<210> 54
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物151
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物155
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> 殘基12與16間之內醯胺橋
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物156
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(24)
<223> 殘基20與24間之內醯胺橋
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物157
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> 殘基24與28間之內醯胺橋
<400> 59
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物158
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<400> 60
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<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物162
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<400> 61
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物163
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<400> 62
<210> 63
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物164
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<400> 63
<210> 64
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物165
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<400> 64
<210> 65
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物166
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為d-丙胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<400> 65
<210> 66
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物167
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(20)
<223> 殘基17與20間之內醯胺橋
<400> 66
<210> 67
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物168
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(21)
<223> 殘基18與21間之內醯胺橋
<400> 67
<210> 68
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物169
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<400> 68
<210> 69
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物170
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<400> 69
<210> 70
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物172
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<400> 70
<210> 71
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物174
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<400> 71
<210> 72
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物175
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<400> 72
<210> 73
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物176
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<400> 73
<210> 74
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物177
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<400> 74
<210> 75
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物178
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<400> 75
<210> 76
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物179
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<400> 76
<210> 77
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物182
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<400> 77
<210> 78
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物186
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<400> 78
<210> 79
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物191
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<400> 79
<210> 80
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物192
<400> 80
<210> 81
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物194
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Xaa為Aib
<400> 81
<210> 82
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物197
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(17)
<223> 殘基13與17間之內醯胺橋
<400> 82
<210> 83
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物198
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(19)
<223> 殘基15與19間之內醯胺橋
<400> 83
<210> 84
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物199
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<400> 84
<210> 85
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物200
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> Xaa為Nle
<400> 85
<210> 86
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物201
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<400> 86
<210> 87
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物202
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<400> 87
<210> 88
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物203
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> Xaa為Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<400> 88
<210> 89
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物204
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<400> 89
<210> 90
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物205
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<400> 90
<210> 91
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物206
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<400> 91
<210> 92
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物207
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<400> 92
<210> 93
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物208
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<400> 93
<210> 94
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 類似物209
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(12)
<223> 殘基9與12間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<400> 94
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CEX
<400> 95
<210> 96
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa為任何胺基酸
<400> 96
<210> 97
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 97
<210> 98
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 98
<210> 99
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-274
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 99
<210> 100
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-311
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 100
<210> 101
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-298
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 16碳脂肪醯基共價連接至離胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 101
<210> 102
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-309
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 14碳脂肪醯基共價連接離胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 102
<210> 103
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-310
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 18碳脂肪醯基共價連接至離胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 103
<210> 104
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-260
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 14碳脂肪醯基共價連接至離胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 104
<210> 105
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-261
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 16碳脂肪醯基共價連接離胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 105
<210> 106
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-262
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 18碳脂肪醯基共價連接至離胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 106
<210> 107
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-252
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 107
<210> 108
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-255
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<221> MOD_RES
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
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<220>
<221> MOD_RES
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MOD_RES
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<220>
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<220>
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<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<221> MOD_RES
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<220>
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<221> MOD_RES
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<223> 合成多肽
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> Xaa為Aib
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> Xaa為Aib
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<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 132
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-287
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 16碳脂肪醯基共價連接至離胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 133
<210> 134
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-288
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> C-端醯胺化
<400> 134
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-289
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<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<220>
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<223> C-端醯胺化
<400> 135
<210> 136
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<221> MOD_RES
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 136
<210> 137
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-291
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 16碳脂肪醯基共價連接至離胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 137
<210> 138
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-292
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 18碳脂肪醯基共價連接至離胺酸
<220>
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<222> (40)..(40)
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<223> 合成多肽
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<223> 合成多肽
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<221> MISC_FEATURE
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<223> 合成多肽
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<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
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<210> 155
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-334
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<400> 155
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> Xaa為d-離胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-337
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 158
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<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-339
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 14碳脂肪醯基共價連接至離胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> C-端醯胺化
<400> 160
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<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-340
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> C-端醯胺化
<400> 161
<210> 162
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-341
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 14碳脂肪醯基共價連接至離胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> C-端醯胺化
<400> 162
<210> 163
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-343
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 14碳脂肪醯基共價連接至離胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> C-端醯胺化
<400> 163
<210> 164
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-344
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> C-端醯胺化
<400> 164
<210> 165
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-345
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 14碳脂肪醯基共價連接至離胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 165
<210> 166
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-353
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 14碳脂肪醯基共價連接至離胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 166
<210> 167
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-241
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 167
<210> 168
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-242
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 168
<210> 169
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-273
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(16)
<223> 殘基12與16間之內醯胺橋
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 169
<210> 170
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 170
<210> 171
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Xaa係Gly或小的脂族或非極性或輕度極性胺基酸
<400> 171
<210> 172
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Xaa係Gly或小的脂族或非極性或輕度極性胺基酸
<400> 172
<210> 173
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-248
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 173
<210> 174
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-249
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 174
<210> 175
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-250
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 175
<210> 176
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-251
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 176
<210> 177
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-258
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> C-端醯胺化
<400> 177
<210> 178
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-259
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> C-端醯胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<400> 178
<210> 179
<211> 30
-107-
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> PEG(40kDa)共價連接至半胱胺酸
<400> 179
<210> 180
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：24
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<400> 180
<210> 181
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：69
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<400> 181
<210> 182
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：70
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸
<400> 182
<210> 183
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：72
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<400> 183
<210> 184
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：75
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<400> 184
<210> 185
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：76
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<400> 185
<210> 186
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：77
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<400> 186
<210> 187
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：78
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<400> 187
<210> 188
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：87
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<400> 188
<210> 189
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：88
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> Xaa為Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<400> 189
<210> 190
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：90
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<400> 190
<210> 191
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：93
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 殘基16與20間之內醯胺橋
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<400> 191
<210> 192
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：99
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 192
<210> 193
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：100
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 193
<210> 194
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：101、102、103
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 194
<210> 195
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：104、105、106
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 195
<210> 196
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：108
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 196
<210> 197
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：113、114、115
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> C-端醯胺化
<400> 197
<210> 198
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：117、118、119
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> C-端醯胺化
<400> 198
<210> 199
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：123、124、125
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 199
<210> 200
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：127
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> C-端醯胺化
<400> 200
<210> 201
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：128、129、130
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> C-端醯胺化
<400> 201
<210> 202
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：132
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯醯基或烷基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 202
<210> 203
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：136、137、138
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
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<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：139
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
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<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：140
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 205
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<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：141
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 206
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<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：142
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 207
<210> 208
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：143
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
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<210> 209
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：144、145
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 209
<210> 210
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：148
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 210
<210> 211
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：152
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 211
<210> 212
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：152
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 212
<210> 213
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：153
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 213
<210> 214
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：154
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
-132-
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 214
<210> 215
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：156
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 215
<210> 216
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：157
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 216
<210> 217
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：235
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 217
<210> 218
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：160
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> C-端醯胺化
<400> 218
<210> 219
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：162
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> C-端醯胺化
<400> 219
<210> 220
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：163
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> C-端醯胺化
<400> 220
<210> 221
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：164
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> C-端醯胺化
<400> 221
<210> 222
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：165
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 222
<210> 223
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：166
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至醯基或烷基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 223
<210> 224
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：173
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 224
<210> 225
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SEQ ID NO：174
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 225
<210> 226
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> 經取代胺基酸共價鍵聯至親水性基團
<400> 226
<210> 227
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> C-端醯胺化
<400> 227
<210> 228
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為D-Ser、DAla、Val、Gly、N-甲基Ser、N-甲基Ala、或Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為Lys、Glu、Ser、Orn、Dab、Aib或任何α,α-二取代胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為任何α,α-二取代胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> Xaa為Ile、Leu、或Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)..(28)
<223> Xaa為Ala或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (29)..(29)
<223> Xaa為Thr、Ala、或Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> C-端醯胺化
<400> 228
<210> 229
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> C-端醯胺化
<400> 229
<210> 230
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為D-Ser、DAla、Val、Gly、N-甲基Ser、N-甲基Ala、或Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為Lys、Glu、Ser、Orn、Dab、Aib或任何α,α-二取代胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為任何α,α-二取代胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> Xaa為Ile、Leu、或Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)..(28)
<223> Xaa為Ala或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (29)..(29)
<223> Xaa為Thr、Ala、或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (29)..(29)
<223> C-端醯胺化
<400> 230
<210> 231
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Mt-354
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 均二聚體
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 14碳脂肪醯基共價鍵結至離胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<220>
<221> 二硫化
<222> (41)..(41)
<223> 與具有相同結構之第二個肽之Cys殘基形成的二硫化物鍵
<400> 231
<210> 232
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Mt-356
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 232
<210> 233
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Mt-357
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 233
<210> 234
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Mt-358
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 16碳脂肪醯基共價鍵結至離胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 234
<210> 235
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Mt-367
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 16碳脂肪醯基透過γ-Glu-γ-Glu間隔物共價鍵結至離胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 235
<210> 236
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Mt-368
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 16碳脂肪醯基透過γ-Glu-γ-Glu間隔物共價鍵結至離胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 236
<210> 237
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Mt-369
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 16碳脂肪醯基透過γ-Glu-γ-Glu間隔物共價鍵結至離胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> C-端醯胺化
<400> 237
<210> 238
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Mt-376
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 均二聚體
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 14碳脂肪醯基共價鍵結至離胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> C-端醯胺化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> Cys殘基共價連接至20kDa PEG，其接著再共價連接至具有相同結構之第 二個肽之Cys殘基
<400> 238
<210> 239
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Mt-377
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 均二聚體
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> 14碳脂肪醯基共價鍵結至離胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> PEG(5kDa)共價鍵結至半胱胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> C-端醯胺化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> Cys殘基共價連接至5kDa PEG，其接著再共價連接至具有相同結構之第 二個肽之Cys殘基
<400> 239
<210> 240
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 肽J
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為麩醯胺酸類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> Xaa為Nle
<400> 240
<210> 241
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 肽K
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為麩醯胺酸類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為Aib
<400> 241
<210> 242
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> Xaa為Nle
<400> 242
<210> 243
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為乙醯胺基甲基-半胱胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> Xaa為Nle
<400> 243
<210> 244
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為乙醯二胺基丁酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> Xaa為Nle
<400> 244
<210> 245
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為胺甲醯基二胺基丙酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> Xaa為Nle
<400> 245
<210> 246
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為甲基麩醯胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> Xaa為Nle
<400> 246
<210> 247
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為甲硫胺酸亞碸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> Xaa為Nle
<400> 247
<210> 248
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為乙醯基鳥胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> Xaa為Nle
<400> 248
<210> 249
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為Aib
<400> 249
<210> 250
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為乙醯二胺基丁酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為Aib
<400> 250
<210> 251
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為甲基麩醯胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為Aib
<400> 251
<210> 252
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 252
<210> 253
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為乙醯二胺基丁酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為Aib
<400> 253
<210> 254
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為乙醯二胺基丁酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> C-端醯胺化
<400> 254
<210> 255
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為乙醯二胺基丁酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為Aib
<400> 255
<210> 256
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為乙醯二胺基丁酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為Aib
<400> 256
<210> 257
<400> 257 000
<210> 258
<400> 258 000
<210> 259
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-225
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 內醯胺橋鍵聯Glu16及Lys20
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> Lys之ε胺連接至Ala-Ac-Cys(PEG)，其中該Ac-Cys(PEG)係包含經乙醯基 (CH3CO)封端之α胺基且包含共價連接至其側鏈之40kDa PEG的Cys殘基
<400> 259
<210> 260
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-227
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 內醯胺橋鍵聯Glu16及Lys20
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> Lys之ε胺連接至Arg-Ac-Cys(PEG)，其中該Ac-Cys(PEG)係包含經乙醯基 (CH3CO)封端之α胺基且包含共價連接至其側鏈之40kDa PEG的Cys殘基
<400> 260
<210> 261
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> mt-294
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(20)
<223> 內醯胺橋鍵聯Glu16及Lys20
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> Cys-PEG透過硫醚鍵聯共價連接
<400> 261
<210> 262
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Aib
<400> 262

Claims (41)

  1. 一種具有GIP激動劑活性之胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的類似物，其具有以下的修飾：(a)在位置1處有不含咪唑側鏈之大的芳族胺基酸的修飾，(b)在位置16及/或位置處20有α,α-二取代胺基酸的修飾，(c)在位置27、28及29之一、二或全部處的胺基酸修飾，及(d)1-9個相對於胰高血糖素(SEQ ID NO：1)之進一步的胺基酸修飾，其中該類似物對GIP受體活化的EC50係約10nM或以下，且其對GIP受體之EC50較其對GLP-1受體之EC50高未達約50倍或低未達約50倍，且該類似物之GIP效力係在該類似物之GLP-1效力的約15倍之內。
  2. 一種具有GIP激動劑活性之胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的類似物，其具有以下的修飾：(a)在位置1處賦予GIP激動劑活性之胺基酸修飾，選擇性地，其中該位置1處之胺基酸係為不含咪唑側鏈之胺基酸，(b)位置16處之Ser經式IV之胺基酸的胺基酸取代： 其中n係1至7，其中R1 及R2 各係獨立地選自由以下基團組成之群：H、C1 -C18 烷基、(C1 -C18 烷基)OH、(C1 -C18 烷基)NH2 、(C1 -C18 烷基)SH、(C0 -C4 烷基)(C3 -C6 )環烷基、(C0 -C4 烷基)(C2 -C5 雜環基)、(C0 -C4 烷基)(C6 -C10 芳基)R7 、及(C1 -C4 烷基)(C3 -C9 雜芳基)，其中R7 係H或OH，及式IV之胺基酸的側鏈包含自由胺基，該式IV之胺基酸係升Lys、Lys、Orn、或2,4-二胺基丁酸(Dab)，(c)位置20處之Gln經α,α-二取代胺基酸的胺基酸取代，選擇性地為AIB，(d)在位置27、28及29之一、二或全部處的胺基酸修飾，及(e)1-9個相對於胰高血糖素(SEQ ID NO：1)之進一步的胺基酸修飾，其中該類似物對GIP受體活化的EC50係約10nM或以下，且其對GIP受體之EC50較其對GLP-1受體之EC50高未達約50倍或低未達約50倍，且選擇性地，該類似物之GIP效力係在該類似物之GLP-1效力的約15倍之內。
  3. 如申請專利範圍第1項之類似物，其中(a)該位置1處之胺基酸係Tyr，且(b)其中(i)該位置27處之Met係經大的脂族 胺基酸取代，(ii)該位置28處之Asn係經小的脂族胺基酸取代，或(iii)該位置29處之Thr係經小的脂族胺基酸取代，或(iv)該類似物包含(i)、(ii)、及(iii)之組合。
  4. 如申請專利範圍第3項之類似物，其中(i)該位置27處之該大的脂族胺基酸為Leu，(ii)該位置28處之該小的脂族胺基酸為Ala，(iii)該位置29處之該小的脂族胺基酸為Gly，或(iv)其組合。
  5. 如申請專利範圍第2項之類似物，其中(a)該位置1處之胺基酸係不含咪唑側鏈之大的芳族胺基酸，且(b)其中(i)該位置27處之Met係經大的脂族胺基酸取代，(ii)該位置28處之Asn係經小的脂族胺基酸取代，或(iii)該位置29處之Thr係經小的脂族胺基酸取代，或其中該類似物包含(i)、(ii)、及(iii)之組合。
  6. 如申請專利範圍第5項之類似物，其中(i)該位置27處之該大的脂族胺基酸為Leu，(ii)該位置28處之該小的脂族胺基酸為Ala，(iii)該位置29處之該小的脂族胺基酸為Gly，或(iv)其組合。
  7. 如申請專利範圍第5項之類似物，其中該不含咪唑側鏈之大的芳族胺基酸為Tyr。
  8. 如申請專利範圍第1項之類似物，其進一步包括在位置 29處之胺基酸C-端之GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：95)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：96)的胺基酸序列。
  9. 如申請專利範圍第2項之類似物，其進一步包括在位置29處之胺基酸C-端之GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：95)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：96)的胺基酸序列。
  10. 如申請專利範圍第2項之類似物，其中式IV的胺基酸為Lys及/或在位置20處之α,α-二取代胺基酸為AIB。
  11. 如申請專利範圍第1項之類似物，其中該α,α-二取代胺基酸為AIB。
  12. 如申請專利範圍第1項之類似物，其包括一或多個以下的修飾：(a)位置2處之Ser經D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、AIB、Val、或α-胺基-N-丁酸取代；(b)位置3處之Gln經Glu取代；(c)位置10處之胺基酸Tyr經包含共價鍵聯至醯基或烷基之側鏈的胺基酸，選擇性地為式I的胺基酸，取代，其中式I為： [式I]其中n=1至4；(d)加成一包含共價鍵聯至醯基或烷基之側鏈的胺基酸，選擇性地為式I的胺基酸，作為該類似物之C-端胺基酸，其中式I為： 其中n=1至4；(e)位置12處之Lys經Ile取代；(f)位置17處之Arg經Gln取代；(g)位置18處之Arg經Ala取代；(h)位置21處之Asp經Glu取代；(i)位置24處之Gln經Asn取代；及(j)C-端胺基酸之羧酸經電中性之基團取代，選擇性地經一醯胺取代。
  13. 如申請專利範圍第2項之類似物，其包括一或多個以下的修飾：(a)位置2處之Ser經D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、AIB、Val、或α-胺基-N-丁酸取代； (b)位置3處之Gln經Glu取代；(c)位置10處之胺基酸Tyr經包含共價鍵聯至醯基或烷基之側鏈的胺基酸，選擇性地為式I的胺基酸，取代，其中式I為： 其中n=1至4；(d)加成一包含共價鍵聯至醯基或烷基之側鏈的胺基酸，選擇性地為式I的胺基酸，作為該類似物之C-端胺基酸，其中式I為： 其中n=1至4；(e)位置12處之Lys經Ile取代；(f)位置17處之Arg經Gln取代；(g)位置18處之Arg經Ala取代；(h)位置21處之Asp經Glu取代； (i)位置24處之Gln經Asn取代；及(j)C-端胺基酸之羧酸經電中性之基團取代，選擇性地經一醯胺取代。
  14. 如申請專利範圍第12項之類似物，其包括(a)在位置2處之AIB，及(b)至少十一個胺基酸的延伸，其中在位置40處之該胺基酸係共價鍵聯至醯基或烷基。
  15. 如申請專利範圍第2項之類似物，其包含根據SEQ ID NO：227、228、229或230中任一者之胺基酸序列及一延伸，該延伸包含(a)GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：95)或XGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：96)之胺基酸序列，其中X係任何胺基酸，或(b)包含一或多個相對於SEQ ID NO：95或96之保留性取代的胺基酸序列，其中該延伸係在位置29處之胺基酸C-端，選擇性地進一步包含至多6個胺基酸修飾。
  16. 如申請專利範圍第15項之類似物，其中在對應於位置37-43中任一者之位置處之該延伸的至少一個胺基酸，選擇性地為位置40處式I之胺基酸，經醯化或烷化，其中該式I為： [式I]其中n=1至4。
  17. 如申請專利範圍第1項之類似物，其包含選自由SEQ ID NO：99-141、144-164、166、192-207、209-221及223所組成之群之胺基酸序列。
  18. 一種胜肽，其包含SEQ ID NO：105之序列。
  19. 一種胜肽，其係由SEQ ID NO：105之序列組成。
  20. 一種胜肽，其包含SEQ ID NO：153之序列。
  21. 一種胜肽，其係由SEQ ID NO：153之序列組成。
  22. 一種胜肽，其包含SEQ ID NO：109之序列。
  23. 如申請專利範圍第22項之胜肽，其包含一親水性部分，該親水性部分共價鍵聯至位置19、20、23、24、27、32、43或C-端之任一者處的胺基酸。
  24. 如申請專利範圍第1項之類似物，其包含透過一間隔物鍵聯至胺基酸側鏈之醯基或烷基，其中該間隔物選擇性地為二肽，且選擇性地包含二個帶負電之胺基酸。
  25. 如申請專利範圍第24項之類似物，其中該醯基係C12至C18脂肪醯基。
  26. 如申請專利範圍第25項之類似物，其中該醯基為一C14至C16脂肪醯基。
  27. 如申請專利範圍第1之類似物，其中該類似物位置19、20、23、24、27、32、43或C-端之胺基酸係共價鍵聯至一親水性部分，該親水性部分選擇性地為聚乙二醇(PEG)，其中該親水性部分係共價鍵聯至Lys、Cys、Orn、升半胱胺酸、或乙醯基-苯基丙胺酸。
  28. 如申請專利範圍第27之類似物，其中該類似物位置24處之胺基酸係共價鍵聯至一親水性部分。
  29. 如申請專利範圍第27項之類似物，其中該PEG具有約20,000道耳吞至約40,000道耳吞之分子量。
  30. 一種具有GIP激動劑活性之胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的類似物，其具有以下的修飾：(a)在位置1處之不含咪唑側鏈之大的芳族胺基酸，(b)在位置i及i+4處之胺基酸之側鏈之間或在位置j及j+3處之胺基酸之側鏈之間的內醯胺橋，其中i係12、13、16、17、 20或24，及其中j係17，(c)在位置27、28及29之一、二或全部處的胺基酸修飾，及(d)1-9個進一步的胺基酸修飾，其中該類似物對GIP受體活化的EC50係約10nM或以下，且其對GIP受體之EC50較其對GLP-1受體之EC50高未達約50倍或低未達約50倍。
  31. 一種具有GIP激動劑活性之胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的類似物，其包括：(a)在位置1處之不含咪唑側鏈之大的芳族胺基酸，及(b)在位置29處之胺基酸C-端之至少8至21個胺基酸的延伸，其中對應於相對於SEQ ID NO：1之位置37-43之任一者的該延伸之至少一個胺基酸經醯化或烷化，其中該類似物對GIP受體活化的EC50係約10nM或以下，且其對GIP受體之EC50較其對GLP-1受體之EC50高未達約50倍或低未達約50倍。
  32. 一種胰高血糖素類似物，其包含一選自SEQ ID NO：99-141、144-164、166、192-207、209-221及223，或選自SEQ ID NO：167-169、173-178與225，或選自SEQ ID NO：5-94所組成之群組之胺基酸序列。
  33. 一種結合物，其係包含如前述申請專利範圍中任一項 之胜肽或類似物。
  34. 一種二聚體，其係包含如前述申請專利範圍中任一項之胜肽或類似物。
  35. 一種融合多肽，其係包含如前述申請專利範圍中任一項之胜肽或類似物。
  36. 一種醫藥組成物，其包含如前述申請專利範圍中任一項之類似物或胜肽、如申請專利範圍第33項之結合物、如申請專利範圍第34項之二聚體、或如申請專利範圍第35項之融合胜肽、或其之組合，及醫藥學上可接受之載劑。
  37. 一種套組，其包含如申請專利範圍第36項之醫藥組成物及用於將該醫藥組成物投與病患的裝置，該裝置選擇性地為包含有該醫藥組成物之針筒。
  38. 如申請專利範圍第36項之醫藥組成物，其係用來降低體重、誘發減重、或治療肥胖症。
  39. 如申請專利範圍第36項之醫藥組成物，其係用來治療糖尿病。
  40. 一種如前述申請專利範圍中任一項之類似物或胜肽、 如申請專利範圍第33項之結合物、如申請專利範圍第34項之二聚體、或如申請專利範圍第35項之融合胜肽、或其之組合之用途，其係用於製備降低體重、誘發減重、或治療肥胖症之醫藥物。
  41. 一種如前述申請專利範圍中任一項之類似物或胜肽、如申請專利範圍第33項之結合物、如申請專利範圍第34項之二聚體、或如申請專利範圍第35項之融合胜肽、或其之組合之用途，其係用於製備治療糖尿病之醫藥物。
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