CN114617956B - 一种高效降糖的蛋白质药物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有高效降糖作用的蛋白质，经实验证实，可用于制备糖尿病治疗药物。

Description

一种高效降糖的蛋白质药物
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种高效降糖的蛋白质药物。
背景技术：
糖尿病是人类健康的重要威胁之一。2017年调查显示中国成人中有11.2％(世界卫生组织糖尿病诊断标准)患有糖尿病。使用降糖药物是目前控制糖尿病的主要方法。
胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，简称GLP-1)是由胃肠道L细胞分泌的胰高血糖素原剪切而成，主要活性形式为GLP-1(7-36)酰胺。GLP-1在体内通过与GLP-1受体结合发挥强效降糖的作用：直接作用于胰腺促进胰岛素释放，抑制胰高糖素的分泌；抑制胃蠕动，延缓胃排空；通过对中枢神经系统的作用来抑制食欲。目前已有8款胰高血糖素样肽-1受体激动剂(简称GLP-1RA)上市，其中以礼来的度拉糖肽注射液最为畅销。
GLP-1RA最常见的安全性问题是胃肠道的不良反应，如度拉糖肽会发生恶心、腹痛、腹泻、食欲减退、呕吐和便秘等。据报道，缓慢增加剂量可以限制其副作用，同时增加GLP-1RAs的疗效。但不是所有接受GLP-1RAs治疗的患者都能达到降糖目标。
因此提高GLP-1RAs疗效不能靠加大用药剂量，而是开发另外一种既具有GLP-1RA活性，又能激活与糖尿病相关的调整营养和能量代谢的其它途径的药物。
葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽(glucose-dependent insulinotropicpolypeptide，简称GIP)是正常人餐后肠促胰素效应的主要原因，具有与GLP-1不同的功能。GIP通过调节葡萄糖摄取、脂解和脂蛋白酶活性，在脂肪组织糖和脂代谢中发挥重要作用。
有实验报道，与单独给予GLP-1RA相比，接受两种药物(GLP-1RA和GIP激动剂)联合给药，可使健康受试者的胰岛素分泌水平更高，在糖尿病患者中，GIP减弱的促胰岛素分泌作用可以在血浆葡萄糖水平恢复正常一段时间后完全恢复。
因此，如果设计并获得一种单个分子，成为GLP-1/GIP双重受体激动剂，使其发挥GLP-1/GIP协同降血糖作用，将产生更理想的降糖效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有显著降糖作用的药物。
本发明发现，以下通式代表的氨基酸序列的蛋白质，能够同时具有GLP-1和GIP双重受体激动活性。
一种GLP-1和GIP双重受体激动蛋白质，其氨基酸序列由通式I所示：
YGEGTFTSDYSIYLDKQA-a-FV-b-WLLA-c-GPSSGAPPPS
通式I
通式I中，
-a-是AKE，或QRA；
-b-是N或E；
-c-是G或Q。
即，通式I分别是以下两个氨基酸序列，从N端到C端顺序为：
YGEGTFTSDYSIYLDKQAAKEFVNWLLAGGPSSGAPPPS
YGEGTFTSDYSIYLDKQAQRAFVEWLLAQGPSSGAPPPS
本发明在上述通式I的两条氨基酸序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2的C端分别连接一段起着增加蛋白稳定性作用的非功能区多肽，分别形成氨基酸序列如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4的蛋白质。
经实验证实，SEQ ID NO.3(简称GGF2)、SEQ ID NO.4(简称GGF7)所示氨基酸序列的蛋白，均同时具有GLP-1和GIP双重受体激动活性。
本发明提供的前述双重受体激动蛋白质以同源二聚体的形式存在。
本发明将所述双重受体激动蛋白质基因构建至表达载体。
所述表达载体为真核表达载体，可以通过瞬时转染或稳定转染的方式导入宿主细胞。
所述宿主细胞为哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾293细胞。
具体地，本发明进行了如下研究工作：
1、根据GGF2、GGF7的氨基酸序列基于CHO细胞密码子的偏爱性设计合成对应的核苷酸序列，将其构建至载体pcDNA3.4中，获得表达载体pcDNA3.4-GGF2、pcDNA3.4-GGF7。
2、利用转染试剂将表达载体转染至CHO细胞中，经培养获得表达GGF2、GGF7蛋白的细胞上清。
3、通过Protein A进行GGF2、GGF7的分离纯化，并利用SDS-PAGE电泳进行检测。
4、基于GLP-1受体、GIP受体检测GGF2、GGF7蛋白的生物学活性。
5、利用db/db糖尿病模型小鼠进行GGF2、GGF7蛋白的降糖活性研究。
本发明提供的蛋白质，可同时激活GLP-1和GIP双重受体(见实施例2、3)，可极显著的降低非空腹血糖(NFBG)、空腹血糖(FBG)水平(P<0.0001)，相较于市售度拉糖肽(Dulaglutide，简称Dul)，可显著降低糖化血红蛋白(HbAlc)水平(P<0.01)，具有更高效的降糖活性(见实施例4)。
附图说明
图1：琼脂糖凝胶电泳检测PCR方法筛选的构建GGF2蛋白表达载体pcDNA3.4-GGF2阳性克隆。
图2：琼脂糖凝胶电泳检测PCR方法筛选的构建GGF7蛋白表达载体pcDNA3.4-GGF7阳性克隆。
图3：非还原SDS-PAGE电泳检测GGF2、GGF7蛋白表达上清。
图4：非还原SDS-PAGE电泳检测Protein A纯化的GGF2、GGF7蛋白。
图5：在db/db糖尿病模型小鼠上GGF2蛋白降低非空腹血糖(NFBG)水平效果
图6：在db/db糖尿病模型小鼠上GGF2蛋白降低空腹血糖(FBG)水平效果
图7：在db/db糖尿病模型小鼠上GGF7蛋白降低非空腹血糖(NFBG)水平效果
图8：在db/db糖尿病模型小鼠上GGF7蛋白降低空腹血糖(FBG)水平效果
图9：在db/db糖尿病模型小鼠上GGF2、GGF7蛋白降低糖化血红蛋白(HbAlc)水平效果
序列表信息
SEQ ID NO.1：通式I的氨基酸序列(一)。
SEQ ID NO.2：通式I的氨基酸序列(二)
SEQ ID NO.3：双重受体激动蛋白质GGF2的氨基酸序列。
SEQ ID NO.4：双重受体激动蛋白质GGF7的氨基酸序列。
具体实施方式
以下实施例仅用于举例说明本发明的方法和装置，并不限定本发明的范围。
其中，两个双重受体激动蛋白质GGF2和GGF7的制备方法以及生物学活性测定方法均相同，因此合并在各实施例中一同公开。
实施例中提到的GGF2、GGF7，是本发明制备的两个双重受体激动蛋白质；“Dul”是对照降糖药物，中文名：度拉糖肽，已上市，礼来公司生产。
实施例1双重受体激动蛋白质GGF2和GGF7的制备
1、蛋白质GGF2和GGF7表达载体的构建
根据CHO细胞表达的特点将GGF2、GGF7氨基酸序列优化逆翻译为核苷酸序列并进行化学合成，利用限制性内切酶EcoRI、BamHI进行酶切，胶回收试剂盒纯化获取酶切DNA片段。对载体pcDNA3.4利用相同的限制性内切酶EcoRI、BamHI进行双酶切，酶切产物经DNA纯化试剂盒进行纯化。
利用T4 DNA连接酶将EcoRI、BamHI双酶切后的基因GGF2、GGF7连接至相同双酶切后的载体pcDNA3.4上，连接子化学转化至Top 10感受态细胞。转化长出的单菌落通过菌体PCR筛选阳性克隆，若目的基因成功连接至表达载体上，则PCR产物大小为900～1000bp左右，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物图谱如图1～图2。
挑选PCR筛选的阳性克隆pcDNA3.4-GGF2、pcDNA3.4-GGF7进行测序，经序列比对分析，GGF2、GGF7核苷酸序列与理论序列一致。
2、蛋白质GGF2和GGF7的表达
宿主细胞CHO细胞的培养条件为：培养基CHO细胞表达培养基，轨道摇床(轨道直径2.5cm)，转速120rpm，二氧化碳浓度8％，温度37℃。CHO细胞在达到4～6×106个细胞/mL时传代，传代后调整细胞密度2～5×105个细胞/mL。在转染前一天传代细胞，细胞密度调整为3～4×105个细胞/mL。在转染前用完全培养基调整细胞密度到6×106个细胞/mL。根据实验目的选择合适的转染体积。在1.5mL离心管中，按每106待转细胞0.133μg的比例分别加入纯化后的实施例1中的表达载体pcDNA3.4-GGF2、pcDNA3.4-GGF7，加入optiPRO SFM使终体积为每106待转细胞6.7μL，温和混均。在另一个1.5mL离心管中按每106细胞0.533μLExpiFectamine CHO Reagent转染试剂和6.134μL optiPRO SFM的比例加入两种试剂，温和混均。立即把稀释后的转染试剂同载体溶液混合，室温放置1～5min。逐滴把载体：转染试剂混合溶液加入到细胞悬液中，立即放入37℃、8％CO2摇床中培养。培养20个小时后，按每106待转细胞1μL和40μL的比例在摇瓶中分别加入Enhancer和Feed，同时将培养条件调整为32℃、5％CO2，培养至第9天，离心收集培养上清至-70℃以下保存，取样进行非还原SDS-PAGE电泳检测，如图3所示，结果证实GGF2、GGF7顺利表达。
3、蛋白质GGF2和GGF7的分离纯化
采用Protein A填料对实施例2中GGF2、GGF7蛋白表达上清进行分离纯化，平衡缓冲液为磷酸盐缓冲液PBS，洗脱缓冲液为pH3.0的100mM柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，收集洗脱峰，并置换至PBS缓冲液中，获得GGF2、GGF7蛋白，紫外法测定蛋白含量，非还原SDS-PAGE电泳检测图谱如图4所示。
实施例2双重受体激动蛋白质(GGF2、GGF7)与GLP-1(胰高血糖素样肽-1)受体的结合活性测定
实验方法和原理：
采用荧光素酶报告基因的方法检测双重受体激动蛋白质刺激GLP-1受体的生物学活性。HEK293-GLP1R-CRE-Luc细胞可以稳定表达GLP-1受体，并通过CRE特异启动luciferase的表达，双重受体激动蛋白质处理的HEK293-GLP1R-CRE-Luc细胞可以通过与GLP-1受体结合后特异启动这一信号通路，最后加入底物产生化学发光信号，信号值大小与双重受体激动蛋白质生物学活性正相关。
具体步骤如下：
将多聚赖氨酸以0.1mg/mL的浓度，100μL/孔的量加入96孔板，37℃包被24h，临用前以无菌双蒸水洗涤一遍，培养箱中挥干，备用。HEK293-GLP1R-CRE-Luc细胞以3×104个/孔的细胞密度接种至96孔板。根据检测样本的量确定铺板的量，每个药物铺3(行)×9(列)细胞。将GGF2、GGF7、Dul蛋白分别稀释至10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032、0.00064、0.000128、0nM浓度，弃去各孔培养液，每孔加入100μL GGF2、GGF7的稀释液，继续培养24h后取出96孔板，每孔加入100μL配制好的提前恢复至常温的One-Glo Luciferase Assay溶液，混匀后静置裂解5min，多功能酶标仪化学发光法检测各孔数值。采用GraphPad Prism软件拟合各融合蛋白的化学发光值-浓度关系曲线(选择三参数非线性回归方程拟合)；计算出GGF2、GGF7生物学活性的EC50值。
实验结果：见表1。
表1 GGF2、GGF7与GLP-1受体亲和力结果
双重受体激动蛋白质 GGF2 GGF7 Dul
EC50值(pM) 24.34 46.06 41.17
实验结论：GGF2、GGF7可以与GLP-1(胰高血糖素样肽-1)受体结合，
与阳性对照药物Dul相比，GGF2效果显著，GGF7效果近似。
实施例3双重受体激动蛋白质(GGF2、GGF7)与GIP(葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽)受体的结合活性测定
实验方法和原理：
采用GIP受体过表达细胞株(CHO-K1-GIPR)测定双重受体激动蛋白质刺激GIP受体的生物学活性，其原理为双重受体激动蛋白质与CHO-K1-GIPR细胞作用一段时间后，细胞内环磷酸腺苷(cAMP)含量增加，且cAMP含量与药物活性在一定范围内呈正相关，通过测定细胞内cAMP信号随药物刺激浓度的变化即可反映待测药物的生物学活性。本实验中采用外加标记的cAMP竞争生成的cAMP的实验方法测定双重受体激动蛋白质刺激GIP受体的生物学活性.
具体步骤如下：
选用生长状态良好的CHO-K1-GIPR细胞，用胰酶消化，DPBS清洗细胞两次，用1×Stimulation Buffer重悬细胞并计数，调整细胞密度为6×105cells/mL，96孔板中每孔分别加入5μL细胞悬液，然后分别加入5μL相对应的最高浓度200nM，5倍梯度稀释的待测药物GGF2、GGF7以及对照Dul，同时设置cAMP标准品反应区，每孔分别加入5μL相对应浓度的cAMP，密封膜覆盖96孔板，放置于细胞培养箱中，37℃孵育30min；取出96孔板，每孔加入5μLcAMP工作液，混匀，然后每孔加入5μL Anti-cAMP-Cryptate工作液，再次混匀，密封膜覆盖，室温孵育1小时，用多功能酶标仪读取ratio值[(signal 665nm/signal 620nm)*10000]，用GraphPad Prism6软件进行数据处理分析，计算待测药物GGF2、GGF7的EC50值。
实验结果：见表2。
表2 GGF2、GGF7与GIP受体亲和力结果
双重受体激动蛋白质 GGF2 GGF7 Dul
EC50值(pM) 177.9 35.3 无信号
实验结论：GGF2、GGF7均可以与GIP受体结合，且GGF7与受体亲和力更高，度拉糖肽(Dul)与GIP受体无结合信号。
实施列4 db/db糖尿病模型小鼠中考察双重受体激动蛋白质的降糖活性
实验目的：
考察双重受体激动蛋白质GGF2、GGF7在db/db二型糖尿病模型小鼠体内的降糖活性。
实验方法：
选取db/db雄性小鼠32只进行实验，接收时为6周龄时，进入动物房适应性饲养一周。一周后，尾尖取血检测非空腹血糖(NFBG)，禁食6小时，尾尖取血检测空腹血糖(FBG)，眼后静脉丛取血50μL全血分离血浆检测糖化血红蛋白(HbAlc)。以空腹血糖(FBG)水平为主要依据，以体重辅助，随机分为模型组(n＝8)、阳性药物组(Dul，n＝8)、各供试品组(GGF2、GGF7，n＝8)，每3天颈后皮下给药16.67nmol/kg，给药前尾尖取血检测非空腹血糖(NFBG)，禁食6小时，检测空腹血糖(FBG)，持续给药16次，末次给药后3天，禁食6小时，检测空腹血糖(FBG)、HbAlc。
实验结果：
图5和图6分别为GGF2蛋白在db/db糖尿病模型小鼠上降低非空腹血糖(NFBG)、降低空腹血糖(FBG)的效果；
图7和图8分别为GGF7蛋白在db/db糖尿病模型小鼠上降低非空腹血糖(NFBG)、降低空腹血糖(FBG)的效果；
图9为GGF2和GGF7蛋白在db/db糖尿病模型小鼠上降低糖化血红蛋白(HbAlc)水平的效果。
从各图的结果可以看出，
与模型组相比，GGF2、GGF7均可：
1)极显著降低非空腹血糖(NFBG)(****，P<0.0001)；
2)极显著降低空腹血糖(FBG)水平(****，P<0.0001)；
3)显著降低HbAlc水平(**，P<0.01)；
与阳性药度拉糖肽(Dul)组相比：
1)显著降低糖化血红蛋白(HbAlc)水平(**，P<0.01)，效果优于度拉糖肽(Dul)；
2)在降低非空腹血糖(NFBG)水平方面，GGF2、GGF7的效果优于度拉糖肽(Dul)；
3)在降低降低空腹血糖(FBG)水平方面，GGF2、GGF7的效果优于度拉糖肽(Dul)。
实验结论：
动物实验表明，本发明的双重受体激动蛋白质GGF2、GGF7具有降低血糖的功能。
序列表
<110> 江苏中新医药有限公司
<120> 一种高效降糖的蛋白质药物
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Tyr Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Leu Asp Lys
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 39
<210> 2
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Tyr Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Leu Asp Lys
1 5 10 15
Gln Ala Gln Arg Ala Phe Val Glu Trp Leu Leu Ala Gln Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35 39
<210> 3
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Tyr Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Leu Asp Lys
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
50 55 60
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
65 70 75 80
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
85 90 95
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
100 105 110
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
115 120 125
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
130 135 140
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
145 150 155 160
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
165 170 175
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
180 185 190
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
195 200 205
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
210 215 220
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
225 230 235 240
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
245 250 255
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
260 265 270
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
275 280 283
<210> 4
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Tyr Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Tyr Leu Asp Lys
1 5 10 15
Gln Ala Gln Arg Ala Phe Val Glu Trp Leu Leu Ala Gln Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
50 55 60
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
65 70 75 80
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
85 90 95
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
100 105 110
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
115 120 125
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
130 135 140
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
145 150 155 160
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
165 170 175
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
180 185 190
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
195 200 205
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
210 215 220
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
225 230 235 240
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
245 250 255
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
260 265 270
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
275 280 283

Claims (6)

1.氨基酸序列如以下通式I所示的蛋白质在制备GLP-1和/或GIP的受体激动剂中的应用：
YGEGTFTSDYSIYLDKQA-a-FV-b-WLLA-c-GPSSGAPPPS
通式I
通式I的氨基酸排列顺序，是从N端到C端，其中字母a、b、c分别代表的氨基酸如下所示：
a是AKE，或QRA；
b是N或E；
c是G或Q；
所述通式I所示蛋白质的氨基酸序列是SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。
2.SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质在制备降糖制剂中的应用。
3.SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的蛋白质在制备降糖制剂中的应用。
4.一种糖尿病治疗药物，其活性成分是SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的蛋白质。
5.SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质。
6.SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的蛋白质。
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