JP3104178B2 - 機能性ポリペプチド - Google Patents
機能性ポリペプチドInfo
- Publication number
- JP3104178B2 JP3104178B2 JP02080676A JP8067690A JP3104178B2 JP 3104178 B2 JP3104178 B2 JP 3104178B2 JP 02080676 A JP02080676 A JP 02080676A JP 8067690 A JP8067690 A JP 8067690A JP 3104178 B2 JP3104178 B2 JP 3104178B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- functional polypeptide
- cell adhesion
- formula
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規ポリペプチドに関し、更に詳しくは、
ヒトフィブロネクチンの細胞接着ドメインポリペプチド
を含有する、新規な人工の機能性ポリペプチド、並びに
それらをコードする遺伝子、及び該遺伝子を用いた該人
工の機能性ポリペプチドの遺伝子工学的な製造方法、更
にその用途に関する。
ヒトフィブロネクチンの細胞接着ドメインポリペプチド
を含有する、新規な人工の機能性ポリペプチド、並びに
それらをコードする遺伝子、及び該遺伝子を用いた該人
工の機能性ポリペプチドの遺伝子工学的な製造方法、更
にその用途に関する。
フィブロネクチン（以下、FNと表示する）は血漿や細
胞外マトリックスに存在する糖タンパク質で、多彩な機
能を持つことが知られている〔アニュアル レビュー
オブ バイオケミストリー（Annual Review of Biochem
istry）、第57巻、第375〜413頁（1988）〕。天然のFN
を創傷治癒、点眼薬等の医薬品や化粧品に利用する試み
がなされているが、血液から採取するために供給に制限
があること、コスト高であること、また、病原性の細菌
やウイルス等による汚染の可能性があるなどの理由によ
り、実用化されていない。また、天然のFNの機能ドメイ
ンを取出して利用することも同様の理由から実用化され
ていない。
胞外マトリックスに存在する糖タンパク質で、多彩な機
能を持つことが知られている〔アニュアル レビュー
オブ バイオケミストリー（Annual Review of Biochem
istry）、第57巻、第375〜413頁（1988）〕。天然のFN
を創傷治癒、点眼薬等の医薬品や化粧品に利用する試み
がなされているが、血液から採取するために供給に制限
があること、コスト高であること、また、病原性の細菌
やウイルス等による汚染の可能性があるなどの理由によ
り、実用化されていない。また、天然のFNの機能ドメイ
ンを取出して利用することも同様の理由から実用化され
ていない。
そこで本発明者らは、ヒトFNの細胞接着ドメインをコ
ードするcDNA断片を発現ベクターに接続して大腸菌に導
入することにより、細胞接着活性ポリペプチド及びその
製造方法を開発し、特許出願した（特開平１−206998
号）。
ードするcDNA断片を発現ベクターに接続して大腸菌に導
入することにより、細胞接着活性ポリペプチド及びその
製造方法を開発し、特許出願した（特開平１−206998
号）。
また、ヒトFMの細胞接着ドメインと、ヘパリン結合ド
メイン又はヘパリン結合ドメインとそれに続くIII cs領
域の一部を含む断片とが共有結合した機能性ポリペプチ
ド及びその遺伝子工学的製造方法を開発して、特許出願
した（特開平２−311498号）。
メイン又はヘパリン結合ドメインとそれに続くIII cs領
域の一部を含む断片とが共有結合した機能性ポリペプチ
ド及びその遺伝子工学的製造方法を開発して、特許出願
した（特開平２−311498号）。
更に、これら機能性ポリペプチドの医薬品への応用に
ついて研究した結果、これらの多くが癌転移抑制作用を
有することを見出し、特許出願した（特開平３−127742
号）。しかしながら、これらの癌転移抑制活性は必ずし
も充分ではなかった。一方、マッカーシーらはヒトFNの
ヘパリン結合ドメインとIII cs領域の一部を含む33−kD
a断片に癌転移抑制作用があることを報告している〔ジ
ャーナル オブ キャンサー インスチチュート（Jour
nal of National Cancer Institute）第80巻、第２号、
第108頁（1988年）〕。
ついて研究した結果、これらの多くが癌転移抑制作用を
有することを見出し、特許出願した（特開平３−127742
号）。しかしながら、これらの癌転移抑制活性は必ずし
も充分ではなかった。一方、マッカーシーらはヒトFNの
ヘパリン結合ドメインとIII cs領域の一部を含む33−kD
a断片に癌転移抑制作用があることを報告している〔ジ
ャーナル オブ キャンサー インスチチュート（Jour
nal of National Cancer Institute）第80巻、第２号、
第108頁（1988年）〕。
しかしながら、33−kDa断片のどの領域にその作用が
あるのかは明らかにされていない。
あるのかは明らかにされていない。
本発明の目的は、癌転移抑制作用の強い新規な機能性
ポリペプチドを開発し、その製造方法を提供することに
ある。
ポリペプチドを開発し、その製造方法を提供することに
ある。
〔課題を解決するための手段〕 本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は人工の機
能性ポリペプチドに関する発明であって、一般式
〔Ｉ〕:C277−CS1（式中C277及びCS1の定義は後記のと
おりである）で表されることを特徴とする。
能性ポリペプチドに関する発明であって、一般式
〔Ｉ〕:C277−CS1（式中C277及びCS1の定義は後記のと
おりである）で表されることを特徴とする。
本発明の第２の発明は、第１の発明の人工の機能性ポ
リペプチドをコードする遺伝子に関する。
リペプチドをコードする遺伝子に関する。
また、本発明の第３の発明は第２の発明の人工の機能
性ポリペプチドをコードする遺伝子を組込んだプラスミ
ドに関し、第４の発明は第１の発明の機能性ポリペプチ
ドの製造方法に関し、第３の発明のプラスミドを導入し
た宿主細胞を培養し、該培養物より第１の発明の機能性
ポリペプチドを採取することを特徴とする。
性ポリペプチドをコードする遺伝子を組込んだプラスミ
ドに関し、第４の発明は第１の発明の機能性ポリペプチ
ドの製造方法に関し、第３の発明のプラスミドを導入し
た宿主細胞を培養し、該培養物より第１の発明の機能性
ポリペプチドを採取することを特徴とする。
更に、本発明の第５の発明は癌転移抑制剤に関する発
明であって、一般式〔IV〕：（C277）ｎ−CS1（式中C
277及びCS1の定義は後記のとおりであり、ｎは零又は１
を示す）で表される人工の機能性ポリペプチドを有効成
分として含有していることを特徴とする。
明であって、一般式〔IV〕：（C277）ｎ−CS1（式中C
277及びCS1の定義は後記のとおりであり、ｎは零又は１
を示す）で表される人工の機能性ポリペプチドを有効成
分として含有していることを特徴とする。
本発明者らは、III cs領域を含まないヘパリン結合ド
メイン全域をカバーするポリペプチドを遺伝子工学的に
作製して癌転移抑制作用を調べたところ、全く活性がな
いことを見出した。
メイン全域をカバーするポリペプチドを遺伝子工学的に
作製して癌転移抑制作用を調べたところ、全く活性がな
いことを見出した。
この知見はIII cs領域が癌転移抑制作用に密接に関係
していることを示唆している。本発明者らはB16−F10メ
ラノーマ細胞に対する接着活性を持つことが知られてい
るIII csのＮ末端側25アミノ酸からなるペプチド（以下
CS1と表示する）を化学合成して調べた結果、CS1に癌転
移抑制作用があることを見出した。更に、CS1と細胞接
着ドメインが共有結合した新規ポリペプチドを遺伝子工
学的に作製して、その癌転移抑制作用を調べたところ、
活性は細胞接着ドメイン単独、あるいはCS1単独の場合
に比べて著しく増強されていることを見出した。本発明
は以上の知見に基づいて達成された。
していることを示唆している。本発明者らはB16−F10メ
ラノーマ細胞に対する接着活性を持つことが知られてい
るIII csのＮ末端側25アミノ酸からなるペプチド（以下
CS1と表示する）を化学合成して調べた結果、CS1に癌転
移抑制作用があることを見出した。更に、CS1と細胞接
着ドメインが共有結合した新規ポリペプチドを遺伝子工
学的に作製して、その癌転移抑制作用を調べたところ、
活性は細胞接着ドメイン単独、あるいはCS1単独の場合
に比べて著しく増強されていることを見出した。本発明
は以上の知見に基づいて達成された。
以下本発明を具体的に説明する。
本発明に係る新規ポリペプチドは、ヒトFNの細胞接着
ドメインポリペプチドとCS1ポリペプチドが共有結合し
たものであり、遺伝子工学的に作製することができる。
例えば、細胞接着ドメインをコードするDNAを含むベク
ター、及びCS1領域をコードするDNAを含むベクターか
ら、それぞれ必要な領域を取出して接続することによ
り、目的のポリペプチドを発現するベクターを作製する
ことができる。各領域間の共有結合は、直接結合であっ
てもよく、間接結合、例えばスペーサーを介した間接結
合であってもよい。スペーサーは、細胞接着ドメインと
CS1の分子間距離を調節するための挿入配列であり、任
意のペプチド鎖を用いることができ、例えばFN分子中の
CS1領域の上流配列であってもよい。スペーサー配列は
遺伝子工学的に容易に導入することができる。
ドメインポリペプチドとCS1ポリペプチドが共有結合し
たものであり、遺伝子工学的に作製することができる。
例えば、細胞接着ドメインをコードするDNAを含むベク
ター、及びCS1領域をコードするDNAを含むベクターか
ら、それぞれ必要な領域を取出して接続することによ
り、目的のポリペプチドを発現するベクターを作製する
ことができる。各領域間の共有結合は、直接結合であっ
てもよく、間接結合、例えばスペーサーを介した間接結
合であってもよい。スペーサーは、細胞接着ドメインと
CS1の分子間距離を調節するための挿入配列であり、任
意のペプチド鎖を用いることができ、例えばFN分子中の
CS1領域の上流配列であってもよい。スペーサー配列は
遺伝子工学的に容易に導入することができる。
本発明に係る新規ポリペプチドの具体例としては、下
記一般式〔Ｉ〕で示されるポリペプチドを挙げることが
できる。
記一般式〔Ｉ〕で示されるポリペプチドを挙げることが
できる。
すなわち下記一般式〔Ｉ〕： C277−CS1 ・・・〔Ｉ〕 〔式中C277はヒトFN細胞接着ドメインのPro1239−Ser
1515に相当する277アミノ酸ポリペプチド残基を示し、
下記式〔II〕： で表される配列を有し、CS1はヒトFNのIII cs領域のＮ
末端側25アミノ酸残基を表し、下記式〔III〕： で表されるペプチド残基を示す〕で表されることを特徴
とする機能性ポリペプチドである。
1515に相当する277アミノ酸ポリペプチド残基を示し、
下記式〔II〕： で表される配列を有し、CS1はヒトFNのIII cs領域のＮ
末端側25アミノ酸残基を表し、下記式〔III〕： で表されるペプチド残基を示す〕で表されることを特徴
とする機能性ポリペプチドである。
本発明に係るC277−CS1は、ヒトFNの細胞接着ドメイ
ンのPro1239−Ser1515（277アミノ酸残基、以下C277と
表示する）に対応するポリペプチドと、ヒトFNのヘパリ
ン結合ドメインのＣ末端側に位置するIII cs領域（71ア
ミノ酸残基）のＮ末端25アミノ酸（CS1）が結合したも
のである。
ンのPro1239−Ser1515（277アミノ酸残基、以下C277と
表示する）に対応するポリペプチドと、ヒトFNのヘパリ
ン結合ドメインのＣ末端側に位置するIII cs領域（71ア
ミノ酸残基）のＮ末端25アミノ酸（CS1）が結合したも
のである。
C277はベビーハムスター腎細胞（BHK）や正常ラット
腎細胞（NRK）などの線維芽細胞に対する接着伸展活性
を有することが示されている。一方、CS1はB16−F10メ
ラノーマ細胞が特異的に接着する部位であることが知ら
れている〔ジャーナル オブ セル バイオロジー（J.
Cell Biol.）第103巻、第2637〜2647頁（1986）及びジ
ャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J.Bi
ol.Chem.）第262巻、第6886〜6892頁（1987）〕。更
に、メラノーマ細胞の接着には必ずしもCS1の全域が必
要なのではなく、その一部でも活性があると言われてい
る〔セル（Cell）、第60巻、第53〜61頁（1990）〕。
腎細胞（NRK）などの線維芽細胞に対する接着伸展活性
を有することが示されている。一方、CS1はB16−F10メ
ラノーマ細胞が特異的に接着する部位であることが知ら
れている〔ジャーナル オブ セル バイオロジー（J.
Cell Biol.）第103巻、第2637〜2647頁（1986）及びジ
ャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J.Bi
ol.Chem.）第262巻、第6886〜6892頁（1987）〕。更
に、メラノーマ細胞の接着には必ずしもCS1の全域が必
要なのではなく、その一部でも活性があると言われてい
る〔セル（Cell）、第60巻、第53〜61頁（1990）〕。
本発明に係るCS1は、メラノーマ細胞の接着活性を持
つ配列であれば、CS1の全域である必要はない。CS1及び
その関連ペプチドは、ペプチド合成機により容易に合成
することができる。細胞接着ドメインポリペプチドとメ
ラノーマ細胞接着配列が共有結合したポリペプチドの例
としては、前記式〔Ｉ〕記載のC277−CS1が挙げられる
が、この新規ポリペプチドは遺伝子工学的に作製するの
が有利である。
つ配列であれば、CS1の全域である必要はない。CS1及び
その関連ペプチドは、ペプチド合成機により容易に合成
することができる。細胞接着ドメインポリペプチドとメ
ラノーマ細胞接着配列が共有結合したポリペプチドの例
としては、前記式〔Ｉ〕記載のC277−CS1が挙げられる
が、この新規ポリペプチドは遺伝子工学的に作製するの
が有利である。
本発明者らは、既にヘパリン結合ドメインとCS1が結
合した296アミノ酸残基ポリペプチド（以下Ｈ−296と表
示する）を発現するプラスミドを作製し、pHD102と命名
した（特開平２−311498号）。
合した296アミノ酸残基ポリペプチド（以下Ｈ−296と表
示する）を発現するプラスミドを作製し、pHD102と命名
した（特開平２−311498号）。
また、このプラスミドを含む大腸菌HB101をEscherich
ia coli HB101/pHD102と表示して工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託している〔微工研菌寄第10721号（FER
M P−10721）〕。
ia coli HB101/pHD102と表示して工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託している〔微工研菌寄第10721号（FER
M P−10721）〕。
一方、細胞接着ドメインポリペプチドC277をコード
し、かつ、その３′末端の終止コドンの直前に他のポリ
ペプチドをコードするDNAを接続するのに有利なクロー
ニングサイトを導入した発現プラスミドpTF7520を構築
してある（特開平２−311498号）。
し、かつ、その３′末端の終止コドンの直前に他のポリ
ペプチドをコードするDNAを接続するのに有利なクロー
ニングサイトを導入した発現プラスミドpTF7520を構築
してある（特開平２−311498号）。
したがって、これらのプラスミドを用いることによ
り、C277−CS1を発現するプラスミドを容易に構築する
ことができる。すなわち、まず、pHD102からヘパリン結
合ドメインのＣ末端側の１個のIII型ホモロジー（III−
16）とCS1を含む領域に対応するDNA断片を取出し、これ
をpTF7520のC277をコードする領域の３′末端のクロー
ニングサイトに接続する。得られたプラスミドから、ヘ
パリン結合ドメインのIII−16に対応するDNAを部位特異
的変異の手法により除去することにより、C277−CS1を
発現するプラスミドを得ることができる（第１図参
照）。得られたプラスミドを大腸菌に導入し、適当な条
件下に培養することにより、目的ポリペプチドが、大腸
菌内に蓄積される。発現の確認にはイムノブロッティン
グが用いられる。組換え大腸菌の全菌体タンパク質をSD
S−ポリアクリルアミド電気泳動で分離した後、泳動パ
ターンをニトロセルロース膜に移し取る。ヒトFNの細胞
接着ドメインを認識するモノクローナル抗体を作用させ
た後、標識第２抗体で33−kDa付近のバンドが染色され
るのが確認できる。
り、C277−CS1を発現するプラスミドを容易に構築する
ことができる。すなわち、まず、pHD102からヘパリン結
合ドメインのＣ末端側の１個のIII型ホモロジー（III−
16）とCS1を含む領域に対応するDNA断片を取出し、これ
をpTF7520のC277をコードする領域の３′末端のクロー
ニングサイトに接続する。得られたプラスミドから、ヘ
パリン結合ドメインのIII−16に対応するDNAを部位特異
的変異の手法により除去することにより、C277−CS1を
発現するプラスミドを得ることができる（第１図参
照）。得られたプラスミドを大腸菌に導入し、適当な条
件下に培養することにより、目的ポリペプチドが、大腸
菌内に蓄積される。発現の確認にはイムノブロッティン
グが用いられる。組換え大腸菌の全菌体タンパク質をSD
S−ポリアクリルアミド電気泳動で分離した後、泳動パ
ターンをニトロセルロース膜に移し取る。ヒトFNの細胞
接着ドメインを認識するモノクローナル抗体を作用させ
た後、標識第２抗体で33−kDa付近のバンドが染色され
るのが確認できる。
目的ポリペプチドの精製は例えば次の様に行う。Ｌ−
ブロス等で培養された組換え大腸菌を超音波破砕して上
清を得る。
ブロス等で培養された組換え大腸菌を超音波破砕して上
清を得る。
これを陰イオン交換樹脂のカラムに吸着させ、食塩濃
度を上げることにより分画する。前記方法により、目的
画分を検出し、これを前記抗体を結合させたセファロー
スカラムに吸着させる。中性付近のバッファーでカラム
を洗浄後、pH3付近のバッファーで溶出し、目的画分を
検出する。電気泳動的に単一のバンドを与える画分を集
めて脱塩した後、凍結乾燥する。得られたポリペプチド
は、Ｎ末端配列分析及びＣ末端アミノ酸分析により、目
的のものであることを確認する。
度を上げることにより分画する。前記方法により、目的
画分を検出し、これを前記抗体を結合させたセファロー
スカラムに吸着させる。中性付近のバッファーでカラム
を洗浄後、pH3付近のバッファーで溶出し、目的画分を
検出する。電気泳動的に単一のバンドを与える画分を集
めて脱塩した後、凍結乾燥する。得られたポリペプチド
は、Ｎ末端配列分析及びＣ末端アミノ酸分析により、目
的のものであることを確認する。
このようにして得られたＣ−CS1ポリペプチドのCS1部
分は25アミノ酸残基であるが、前述〔セル第60巻、第53
〜61頁（1990）〕のごとくメラノーマ細胞への接着活性
に必要な最小単位は、Ｃ末端約10アミノ酸に集約するこ
とができる。
分は25アミノ酸残基であるが、前述〔セル第60巻、第53
〜61頁（1990）〕のごとくメラノーマ細胞への接着活性
に必要な最小単位は、Ｃ末端約10アミノ酸に集約するこ
とができる。
したがって、Ｃ−CS1のCS1部分は、例えばCS1領域の
Ｎ末端から15番目までの配列を除去したポリペプチドで
あってもよい。この配列の除去は、対応するDNA配列を
部位特異的変異の手法により、除去することで容易に達
成することができる。
Ｎ末端から15番目までの配列を除去したポリペプチドで
あってもよい。この配列の除去は、対応するDNA配列を
部位特異的変異の手法により、除去することで容易に達
成することができる。
得られたポリペプチドの細胞接着活性は例えばルオス
ラティ（Ruoslahti）等の方法〔メソッズ イン エン
ザイモロジー（Methods in Enzymology）、第82巻、第8
03〜831頁（1981）〕に準じて行う。すなわち、試料を
コートした後BSAでブロッキングしたマイクロタイター
プレートに、BHK又はB16−F10細胞の懸濁液を添加し、3
7℃で約１時間インキュベートした後、洗浄する。吸着
した細胞をホルマリン固定し、伸展した細胞の割合を顕
微鏡下に測定することにより細胞接着活性を測定するこ
とができる。このようにしてC277−CS1は、BHKよりもB1
6−F10細胞に対して強い親和性を示すことが示された。
ラティ（Ruoslahti）等の方法〔メソッズ イン エン
ザイモロジー（Methods in Enzymology）、第82巻、第8
03〜831頁（1981）〕に準じて行う。すなわち、試料を
コートした後BSAでブロッキングしたマイクロタイター
プレートに、BHK又はB16−F10細胞の懸濁液を添加し、3
7℃で約１時間インキュベートした後、洗浄する。吸着
した細胞をホルマリン固定し、伸展した細胞の割合を顕
微鏡下に測定することにより細胞接着活性を測定するこ
とができる。このようにしてC277−CS1は、BHKよりもB1
6−F10細胞に対して強い親和性を示すことが示された。
本発明に係るポリペプチドの癌転移抑制活性の測定は
例えば次のように行う。高転移性のB16−F10メラノーマ
細胞を、PBSに溶解した試料と混合し、マウスの尾静脈
に投与する。約２週間後の肺に転移したコロニーを計測
する。以上の実験により、CS1及びC277−CS1に癌転移抑
制効果のあることが示される。また、その効果は、CS1
よりも、C277−CS1の方が強いことが示される。
例えば次のように行う。高転移性のB16−F10メラノーマ
細胞を、PBSに溶解した試料と混合し、マウスの尾静脈
に投与する。約２週間後の肺に転移したコロニーを計測
する。以上の実験により、CS1及びC277−CS1に癌転移抑
制効果のあることが示される。また、その効果は、CS1
よりも、C277−CS1の方が強いことが示される。
以上のようにして得られた本発明のポリペプチドを医
薬として使用する場合、必要に応じて医薬用担体と共に
常法により製剤化し、経口投与又は非経口投与すればよ
い。賦形剤あるいは担体としては薬理学的に許容される
ものが選ばれ、その種類及び組成は投与経路や投与方法
によって異なる。例えば液状担体として水、アルコール
類若しくは大豆油、オリーブ油、ミネラル油等の動植物
油、又は合成油が用いられる。個体担体としてマルトー
ス、シュークロースなどの糖類、アミノ酸類、ヒドロキ
シプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、ステア
リン酸マグネシウムなどの有機酸塩などが使用される。
薬として使用する場合、必要に応じて医薬用担体と共に
常法により製剤化し、経口投与又は非経口投与すればよ
い。賦形剤あるいは担体としては薬理学的に許容される
ものが選ばれ、その種類及び組成は投与経路や投与方法
によって異なる。例えば液状担体として水、アルコール
類若しくは大豆油、オリーブ油、ミネラル油等の動植物
油、又は合成油が用いられる。個体担体としてマルトー
ス、シュークロースなどの糖類、アミノ酸類、ヒドロキ
シプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、ステア
リン酸マグネシウムなどの有機酸塩などが使用される。
注射剤の場合は溶解液は生理食塩液、各種緩衝液、グ
ルコース、イノシトール、マンニトール、ラクトースな
どの糖類溶液、エチレングリコール、ポリエチレングリ
コールなどのグリコール類が望ましい。またイノシトー
ル、マンニトール、ラクトース、シュークロース等の糖
類、フェニルアラニン等のアミノ酸等の賦形剤と共に凍
結乾燥製剤とし、それを投与時に注射用の適当な溶剤、
例えば滅菌水、生理食塩液、ブドウ糖液、電解質溶液、
アミノ酸溶液等静脈投与用液体に溶解させて投与するこ
ともできる。製剤中における本発明のポリペプチドの含
量は製剤により異なるが、通常0.1〜100重量％好ましく
は１〜98重量％である。例えば注射液の場合には、通常
0.1〜30重量％、好ましくは１〜10重量％の有効成分を
含むようにすることが望ましい。経口投与する場合には
前記個体担体若しくは液状担体と共に、錠剤、カプセル
剤、粉剤、顆粒剤、液剤、ドライシロップ剤等の形態で
用いられる。カプセル、顆粒、粉剤は一般に５〜100重
量％、好ましくは25〜98重量％の有効成分を含む。
ルコース、イノシトール、マンニトール、ラクトースな
どの糖類溶液、エチレングリコール、ポリエチレングリ
コールなどのグリコール類が望ましい。またイノシトー
ル、マンニトール、ラクトース、シュークロース等の糖
類、フェニルアラニン等のアミノ酸等の賦形剤と共に凍
結乾燥製剤とし、それを投与時に注射用の適当な溶剤、
例えば滅菌水、生理食塩液、ブドウ糖液、電解質溶液、
アミノ酸溶液等静脈投与用液体に溶解させて投与するこ
ともできる。製剤中における本発明のポリペプチドの含
量は製剤により異なるが、通常0.1〜100重量％好ましく
は１〜98重量％である。例えば注射液の場合には、通常
0.1〜30重量％、好ましくは１〜10重量％の有効成分を
含むようにすることが望ましい。経口投与する場合には
前記個体担体若しくは液状担体と共に、錠剤、カプセル
剤、粉剤、顆粒剤、液剤、ドライシロップ剤等の形態で
用いられる。カプセル、顆粒、粉剤は一般に５〜100重
量％、好ましくは25〜98重量％の有効成分を含む。
投与量は、患者の年令、体重、症状、治癒目的等によ
り決定されるが治療量は一般に、非経口投与で１〜100m
g/kg/日、経口投与で５〜500mg/kg/日である。
り決定されるが治療量は一般に、非経口投与で１〜100m
g/kg/日、経口投与で５〜500mg/kg/日である。
また、C57BL/6マウスを用いた、機能性ポリペプチド
の毒性試験において、本ポリペプチド100mg/kgの静脈内
投与で毒性は認められない。
の毒性試験において、本ポリペプチド100mg/kgの静脈内
投与で毒性は認められない。
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されない。
が、本発明はこれら実施例に限定されない。
参考例１ CS1ペプチドの合成 25アミノ酸から成るCS1ペプチドは、Fmoc法により、
化学合成した。試薬及び装置は、LKB社のものを用い、
0.2mmolスケールで合成した。合成後、常法により脱保
護し、逆相HPLCにより目的画分を分取し、凍結乾燥し
た。収量は100mgであった。得られたペプチドは、プロ
ティンシークエンサー（モデル477A/120A、アプライド
バイオシステムズ社）により正しい配列であることを確
認した。
化学合成した。試薬及び装置は、LKB社のものを用い、
0.2mmolスケールで合成した。合成後、常法により脱保
護し、逆相HPLCにより目的画分を分取し、凍結乾燥し
た。収量は100mgであった。得られたペプチドは、プロ
ティンシークエンサー（モデル477A/120A、アプライド
バイオシステムズ社）により正しい配列であることを確
認した。
また、アミノ酸分析の結果も予想通りであった。
実施例１ ヒトFNの細胞接着ドメインのPro1239−Ser1515（277ア
ミノ酸残基）とCS1との融合タンパク質をコードするcDN
A断片のクローニング（第１図参照） （１−１）pHD102へのNco Iサイトの導入 pHD102はヘパリン結合ドメインとCS1が結合したポリ
ペプチドＨ−296を発現するプラスミドであり、特開平
２−311498号公報に記載されている。Ｈ−286から、ヘ
パリン結合部位を除去するために、まずpHD101のAla
1871に対応する配列の直前にNco Iサイトを導入した。N
co Iサイトの導入には、変異導入用プライマーとしてｄ
〔pATCAATGGCCATGGTGGAGGCG〕を用い、変異導入用キッ
トとして、サイト−ダイレクテッドミュータジェネシス
システムミュータン−Ｋ〔宝酒造（株）販売〕を用い
た。実験は添付のプロトコールに従って行い、目的のプ
ラスミドを得た。
ミノ酸残基）とCS1との融合タンパク質をコードするcDN
A断片のクローニング（第１図参照） （１−１）pHD102へのNco Iサイトの導入 pHD102はヘパリン結合ドメインとCS1が結合したポリ
ペプチドＨ−296を発現するプラスミドであり、特開平
２−311498号公報に記載されている。Ｈ−286から、ヘ
パリン結合部位を除去するために、まずpHD101のAla
1871に対応する配列の直前にNco Iサイトを導入した。N
co Iサイトの導入には、変異導入用プライマーとしてｄ
〔pATCAATGGCCATGGTGGAGGCG〕を用い、変異導入用キッ
トとして、サイト−ダイレクテッドミュータジェネシス
システムミュータン−Ｋ〔宝酒造（株）販売〕を用い
た。実験は添付のプロトコールに従って行い、目的のプ
ラスミドを得た。
（１−２） Nco I−Hinc II断片の調製 （１−１）で得たプラスミド１μｇをNco I及びHinc
IIで分解し、アガロース電気泳動で分離して1.3kbのNco
I−Hinc II断片約120ngを回収した。
IIで分解し、アガロース電気泳動で分離して1.3kbのNco
I−Hinc II断片約120ngを回収した。
（１−３） Nco I−Hinc II断片のpTF7520へのクロー
ニング pTF7520はヒトFNの細胞接着ドメインポリペプチドC
277を発現することができ、かつ、そのＣ末端に対応す
る部位にNco Iサイトが付加されており、他のポリペプ
チドをコードするDNAを接続することができる発現プラ
スミドである。このプラスミドは特開平２−311498号公
報に記載されている。pTF7520をNco I及びHinc IIで分
解後、脱リン酸した。このプラスミド50ngを（１−２）
で得たNco I−Hinc II断片50ngと共に５μ溶液とし、
20μのDNAライゲーションキット〔宝酒造（株）販
売〕Ａ液、５μのＢ液を加え、16℃で30分インキュベ
ートした。この反応液10μを用いて大腸菌HB101を形
質転換し、細胞接着ドメインのPro1239−Ser1515（277
アミノ酸残基）とＨ−296のAla1871−Thr1985（115アミ
ノ酸残基）がMetを介して結合した融合タンパク質（C
277−Met−H115）を発現するプラスミドを得た。
ニング pTF7520はヒトFNの細胞接着ドメインポリペプチドC
277を発現することができ、かつ、そのＣ末端に対応す
る部位にNco Iサイトが付加されており、他のポリペプ
チドをコードするDNAを接続することができる発現プラ
スミドである。このプラスミドは特開平２−311498号公
報に記載されている。pTF7520をNco I及びHinc IIで分
解後、脱リン酸した。このプラスミド50ngを（１−２）
で得たNco I−Hinc II断片50ngと共に５μ溶液とし、
20μのDNAライゲーションキット〔宝酒造（株）販
売〕Ａ液、５μのＢ液を加え、16℃で30分インキュベ
ートした。この反応液10μを用いて大腸菌HB101を形
質転換し、細胞接着ドメインのPro1239−Ser1515（277
アミノ酸残基）とＨ−296のAla1871−Thr1985（115アミ
ノ酸残基）がMetを介して結合した融合タンパク質（C
277−Met−H115）を発現するプラスミドを得た。
（１−４） Met及びAla1871−Thr1960に対応する配列
の除去 （１−３）で得たプラスミドから、Met及びAla1871−
Thr1960（90アミノ酸残基）に対応する配列を部位特異
的変異の手法により除去した。Met及びAla1871−Thr
1960（90アミノ酸残基）に対応する配列の除去は、オリ
ゴヌクレオチドｄ〔pGGGAAGCTCGTCGGATGGTTTGTC〕を合
成し、サイト−ダイレクテッドミュータジェネシスシス
テムミュータン−Ｋ（宝酒造（株））販売〕を用いて行
った。その結果、細胞接着ドメインのPro1239−Ser1515
（277アミノ酸残基）とCS1が直接結合した融合タンパク
質（C277−CS1）を発現するプラスミドを得、pCS25と命
名した。
の除去 （１−３）で得たプラスミドから、Met及びAla1871−
Thr1960（90アミノ酸残基）に対応する配列を部位特異
的変異の手法により除去した。Met及びAla1871−Thr
1960（90アミノ酸残基）に対応する配列の除去は、オリ
ゴヌクレオチドｄ〔pGGGAAGCTCGTCGGATGGTTTGTC〕を合
成し、サイト−ダイレクテッドミュータジェネシスシス
テムミュータン−Ｋ（宝酒造（株））販売〕を用いて行
った。その結果、細胞接着ドメインのPro1239−Ser1515
（277アミノ酸残基）とCS1が直接結合した融合タンパク
質（C277−CS1）を発現するプラスミドを得、pCS25と命
名した。
またこのプラスミドを保持する大腸菌HB101はEscheri
chia coli HB101/pCS25と表示し、通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託されている（FERM BP
−5723）。
chia coli HB101/pCS25と表示し、通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託されている（FERM BP
−5723）。
実施例２ 組換え体からのペプチドの精製 実施例１で得たEscherichia coli HB101/pCS25を50μ
g/mlのアンピシリンを添加した5mlのＬ−ブロスを含む
試験管で37℃、一夜振とう培養した。これを500mlの同
培地を含む２の三角フラスコに接種し、100rpmで培養
を続け、20時間後に集菌した。菌体の一部を用いてイム
ノブロッテイングを行った。すなわち、全菌体タンパク
質をSDS−PAGEで分離し、泳動パターンをニトロセルロ
ースメンブランに転写した後、ヒトFNの細胞接着ドメイ
ンを特異的に認識するモノクローナル抗体FN−10〔宝酒
造（株）販売〕を作用させ、次いでパーオキシダーゼ標
識第２抗体を作用させた。結合した第２抗体のパーオキ
シダーゼ活性を４−クロロ−１−ナフトールと過酸化水
素の存在下で発色させ、33kD付近に目的のペプチドが生
産されていることを確認した。次に、全菌体ペレットを
20mMトリス（Tris）−HCl（pH7.5）、1mM−EDTA、5mMメ
ルカプトエタノール、３μＭパラアミジノフェニルメタ
ンスルホニルフルオライド（ｐ−APMSF）を含む溶液に
懸濁して、超音波処理を行った。12000rpmで20分遠心し
て、上清25mlを得た。これを20mMトリス−HCl（pH7.5）
バッファーで平衡化したDE−53のカラム（40ml）に通し
た。カラムを0.1M NaClを含む20mMトリス−HCl（pH7.
5）バッファーで洗浄後、0.15M NaClを含む20mMトリス
・HCl（pH7.5）バッファーで溶出し、分画した。溶出液
のイムノブロッティングを行い、目的画分を集めた。次
に、この画分をモノクローナル抗体FN−10を結合させた
セファロース4Bのカラム（10ml）に通した。カラムを0.
1M NaClを含む20mMトリス・HCl（pH7.5）バッファーで
洗浄後、0.1Mグリシン・HCl（pH3.0）バッファーで溶出
し、分画した。イムノブロッティングにより目的画分を
集め、脱塩、凍結乾燥して、電気泳動的にほぼ単一なペ
プチド約7.5mgを得た。ABI社のペプチドシーケンサー47
7A/120Aを用いて、本ペプチドのＮ末端からのアミノ酸
配列を調べたところ目的のペプチドのＮ末端配列と一致
した。また、カルボキシペプチダーゼＰ〔宝酒造（株）
販売〕消化法により、Ｃ末端はThrであることが確認さ
れた。
g/mlのアンピシリンを添加した5mlのＬ−ブロスを含む
試験管で37℃、一夜振とう培養した。これを500mlの同
培地を含む２の三角フラスコに接種し、100rpmで培養
を続け、20時間後に集菌した。菌体の一部を用いてイム
ノブロッテイングを行った。すなわち、全菌体タンパク
質をSDS−PAGEで分離し、泳動パターンをニトロセルロ
ースメンブランに転写した後、ヒトFNの細胞接着ドメイ
ンを特異的に認識するモノクローナル抗体FN−10〔宝酒
造（株）販売〕を作用させ、次いでパーオキシダーゼ標
識第２抗体を作用させた。結合した第２抗体のパーオキ
シダーゼ活性を４−クロロ−１−ナフトールと過酸化水
素の存在下で発色させ、33kD付近に目的のペプチドが生
産されていることを確認した。次に、全菌体ペレットを
20mMトリス（Tris）−HCl（pH7.5）、1mM−EDTA、5mMメ
ルカプトエタノール、３μＭパラアミジノフェニルメタ
ンスルホニルフルオライド（ｐ−APMSF）を含む溶液に
懸濁して、超音波処理を行った。12000rpmで20分遠心し
て、上清25mlを得た。これを20mMトリス−HCl（pH7.5）
バッファーで平衡化したDE−53のカラム（40ml）に通し
た。カラムを0.1M NaClを含む20mMトリス−HCl（pH7.
5）バッファーで洗浄後、0.15M NaClを含む20mMトリス
・HCl（pH7.5）バッファーで溶出し、分画した。溶出液
のイムノブロッティングを行い、目的画分を集めた。次
に、この画分をモノクローナル抗体FN−10を結合させた
セファロース4Bのカラム（10ml）に通した。カラムを0.
1M NaClを含む20mMトリス・HCl（pH7.5）バッファーで
洗浄後、0.1Mグリシン・HCl（pH3.0）バッファーで溶出
し、分画した。イムノブロッティングにより目的画分を
集め、脱塩、凍結乾燥して、電気泳動的にほぼ単一なペ
プチド約7.5mgを得た。ABI社のペプチドシーケンサー47
7A/120Aを用いて、本ペプチドのＮ末端からのアミノ酸
配列を調べたところ目的のペプチドのＮ末端配列と一致
した。また、カルボキシペプチダーゼＰ〔宝酒造（株）
販売〕消化法により、Ｃ末端はThrであることが確認さ
れた。
実施例３ 細胞接着活性の測定 実施例２で得られたC277−CS1ポリペプチドのBHK及び
マウスメラノーマ細胞B16−F10に対する細胞接着活性を
測定した。
マウスメラノーマ細胞B16−F10に対する細胞接着活性を
測定した。
細胞接着活性は、ルオスラティらの方法〔メソッズ
イン エンザイモロジー、第82巻、第803〜831頁（198
1）〕に準じて測定した。試料を蒸留水、PBS（リン酸緩
衝化生理食塩水）等に溶かし、96穴マイクロプレート上
で段階的に希釈した。４℃、２時間インキュベートし
て、試料をプレート上に吸着させた（50μ／ウエ
ル）。３％BSAを含むPBS溶液を100μ／ウエル加え、3
7℃、１時間インキュベートしてプレートをブロックし
た。PBSでプレードを洗浄後、あらかじめダルベッコ（D
ulbecco's）イーグル最小栄養培地（DMEM）に５×105細
胞/mlとなるように懸濁させたベビーハムスター腎細胞
（BHK−21）、又はマウスメラノーマ細胞B16−F10を100
μ／ウエル分注し、37℃、１時間インキュベートし
た。なお使用した細胞は、凍結保存した株を継代培養
後、トリプシン処理（37℃、５分）したものを用いた。
PBSでプレートを洗浄後、３％ホルマリン溶液で細胞を
プレート上に固定した。
イン エンザイモロジー、第82巻、第803〜831頁（198
1）〕に準じて測定した。試料を蒸留水、PBS（リン酸緩
衝化生理食塩水）等に溶かし、96穴マイクロプレート上
で段階的に希釈した。４℃、２時間インキュベートし
て、試料をプレート上に吸着させた（50μ／ウエ
ル）。３％BSAを含むPBS溶液を100μ／ウエル加え、3
7℃、１時間インキュベートしてプレートをブロックし
た。PBSでプレードを洗浄後、あらかじめダルベッコ（D
ulbecco's）イーグル最小栄養培地（DMEM）に５×105細
胞/mlとなるように懸濁させたベビーハムスター腎細胞
（BHK−21）、又はマウスメラノーマ細胞B16−F10を100
μ／ウエル分注し、37℃、１時間インキュベートし
た。なお使用した細胞は、凍結保存した株を継代培養
後、トリプシン処理（37℃、５分）したものを用いた。
PBSでプレートを洗浄後、３％ホルマリン溶液で細胞を
プレート上に固定した。
顕微鏡下でBHK−21細胞、又はB16−F10細胞の伸展を
観察し、伸展細胞数が、ヒトFNの高濃度における伸展細
胞数の50％となる試料の濃度（ED50）を求め細胞接着活
性の指標とした。
観察し、伸展細胞数が、ヒトFNの高濃度における伸展細
胞数の50％となる試料の濃度（ED50）を求め細胞接着活
性の指標とした。
その結果を第１表に示す。
以上の結果、C277−CS1は、BHK細胞よりもB16−F10メ
ラノーマ細胞に対して、強い細胞接着活性を持つことが
示された。
ラノーマ細胞に対して、強い細胞接着活性を持つことが
示された。
実施例４ 癌転移抑制試験 化学合成したCS1ペプチド及びC277−CS1を用いて実験
的肺転移に対する影響を調べた。C57BL/6マウス５匹を
一群として、PBSに溶解した試料とB16−BL6メラノーマ
細胞（３×104）を混合した後、マウスの尾静脈に投与
した。２週間後に肺に転移したコロニー数を計測してコ
ントロールと比較した。
的肺転移に対する影響を調べた。C57BL/6マウス５匹を
一群として、PBSに溶解した試料とB16−BL6メラノーマ
細胞（３×104）を混合した後、マウスの尾静脈に投与
した。２週間後に肺に転移したコロニー数を計測してコ
ントロールと比較した。
その結果を第２表に示す。
以上の結果、CS1ペプチドに癌転移抑制作用があるこ
とが示された。また、CS1と細胞接着ドメインポリペプ
チドとの融合ペプチドは更に強い転移抑制効果を持つこ
とが示された。
とが示された。また、CS1と細胞接着ドメインポリペプ
チドとの融合ペプチドは更に強い転移抑制効果を持つこ
とが示された。
実施例５ 実施例２で得たポリペプチド30重量部に対しPBSを加
え、全量を2000重量部としてこれを溶解後、ミリポアフ
ィルターGSタイプを用いて除菌ろ過する。このろ液2gを
10mlのバイアル瓶にとり凍結乾燥し、１バイアルに該ポ
リペプチド30mgを含む凍結乾燥注射剤を得た。
え、全量を2000重量部としてこれを溶解後、ミリポアフ
ィルターGSタイプを用いて除菌ろ過する。このろ液2gを
10mlのバイアル瓶にとり凍結乾燥し、１バイアルに該ポ
リペプチド30mgを含む凍結乾燥注射剤を得た。
以上述べたごとく、本発明により、癌転移抑制作用を
持つ新規ポリペプチド、並びにそれらをコードする遺伝
子、及び該遺伝子を用いた該新規ポリペプチドの遺伝子
工学的な製造方法、更にその用途が提供される。
持つ新規ポリペプチド、並びにそれらをコードする遺伝
子、及び該遺伝子を用いた該新規ポリペプチドの遺伝子
工学的な製造方法、更にその用途が提供される。
第１図はC277−CS1ポリペプチドを発現させるためのプ
ラスミドの構築の工程図を示す。
ラスミドの構築の工程図を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 君塚 房夫 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 東 市郎 北海道札幌市南区真駒内上町５丁目３番 ２号 (72)発明者 済木 育夫 北海道札幌市西区八軒三条西３丁目６番 ７―45号 (56)参考文献 特開 昭62−89699（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−206998（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓ ｔ．，80（２），ｐ．108−116，1988 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，81, ｐ．782−790，1988 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，262 （14），ｐ．6886−6892，1987 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/78 ＧＥＮＢＡＮＫ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ＥＮＥＳＥＱ ＰＩＲ／ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ／ＧＥＮＥＳ ＥＱ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】下記一般式〔Ｉ〕： C277−CS1 ・・・〔Ｉ〕 〔式中C277はヒトフィブロネクチン細胞接着ドメインの
Pro1239−Ser1515に相当する277アミノ酸ポリペプチド
残基を示し、下記式〔II〕： で表される配列を有し、CS1はヒトフィブロネクチンのI
II cs領域のＮ末端側25アミノ酸残基を表し、下記式〔I
II〕： で表されるペプチド残基を示す〕で表されることを特徴
とする人工の機能性ポリペプチド。 - 【請求項２】請求項１記載の人工の機能性ポリペプチド
をコードする遺伝子。 - 【請求項３】請求項２記載の人工の機能性ポリペプチド
をコードする遺伝子を組込んだプラスミド。 - 【請求項４】請求項３記載のプラスミドを導入した宿主
細胞を培養し、該培養物より請求項１記載の人工の機能
性ポリペプチドを採取することを特徴とする請求項１記
載の人工の機能性ポリペプチドの製造方法。 - 【請求項５】下記一般式〔IV〕： （C277）ｎ−CS1 ・・・〔IV〕 ［式中C277及びCS1は式〔Ｉ〕と同義であり、ｎは零又
は１を示す］で表される人工の機能性ポリペプチドを有
効成分として含有していることを特徴とする癌転移抑制
剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02080676A JP3104178B2 (ja) | 1990-03-30 | 1990-03-30 | 機能性ポリペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02080676A JP3104178B2 (ja) | 1990-03-30 | 1990-03-30 | 機能性ポリペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03284700A JPH03284700A (ja) | 1991-12-16 |
| JP3104178B2 true JP3104178B2 (ja) | 2000-10-30 |
Family
ID=13724958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02080676A Expired - Fee Related JP3104178B2 (ja) | 1990-03-30 | 1990-03-30 | 機能性ポリペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3104178B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005019450A1 (ja) | 2003-08-22 | 2005-03-03 | Takara Bio Inc. | 細胞傷害性リンパ球の製造方法 |
| WO2007020880A1 (ja) | 2005-08-17 | 2007-02-22 | Takara Bio Inc. | リンパ球の製造方法 |
| WO2007040105A1 (ja) | 2005-09-30 | 2007-04-12 | Takara Bio Inc. | Ｔ細胞集団の製造方法 |
| EP2070542A2 (en) | 2001-08-15 | 2009-06-17 | Takara Bio Inc. | Method of extended culture of antigen-specific cyotoxic T lymphocytes |
| EP2305793A1 (en) | 2002-03-25 | 2011-04-06 | Takara Bio Inc. | Process for producing cytotoxic lymphocytes |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005052001A (ja) * | 2001-07-05 | 2005-03-03 | Takara Bio Inc | 遺伝子治療剤 |
-
1990
- 1990-03-30 JP JP02080676A patent/JP3104178B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２（１４），ｐ．６８８６−６８９２，１９８７ |
| Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８１，ｐ．７８２−７９０，１９８８ |
| Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８０（２），ｐ．１０８−１１６，１９８８ |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2070542A2 (en) | 2001-08-15 | 2009-06-17 | Takara Bio Inc. | Method of extended culture of antigen-specific cyotoxic T lymphocytes |
| US7910368B2 (en) | 2001-08-15 | 2011-03-22 | Takara Bio Inc. | Method of extended culture for antigen-specific cytotoxic lymphocytes |
| EP2305793A1 (en) | 2002-03-25 | 2011-04-06 | Takara Bio Inc. | Process for producing cytotoxic lymphocytes |
| EP2305796A1 (en) | 2002-03-25 | 2011-04-06 | Takara Bio Inc. | Process for producing cytotoxic lymphocytes |
| US8728811B2 (en) | 2002-03-25 | 2014-05-20 | Takara Bio Inc. | Process for producing cytotoxic lymphocyte |
| US8975070B2 (en) | 2002-03-25 | 2015-03-10 | Takara Bio Inc. | Process for producing cytotoxic lymphocyte |
| WO2005019450A1 (ja) | 2003-08-22 | 2005-03-03 | Takara Bio Inc. | 細胞傷害性リンパ球の製造方法 |
| US8927273B2 (en) | 2003-08-22 | 2015-01-06 | Takara Bio Inc. | Process for producing cytotoxic lymphocytes |
| WO2007020880A1 (ja) | 2005-08-17 | 2007-02-22 | Takara Bio Inc. | リンパ球の製造方法 |
| US8765469B2 (en) | 2005-08-17 | 2014-07-01 | Takara Bio Inc. | Method of producing lymphocytes |
| WO2007040105A1 (ja) | 2005-09-30 | 2007-04-12 | Takara Bio Inc. | Ｔ細胞集団の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03284700A (ja) | 1991-12-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5198423A (en) | Functional polypeptide containing a cell binding domain and a heparin binding domain of fibronectin | |
| Zolkiewska et al. | Integrin alpha 7 as substrate for a glycosylphosphatidylinositol-anchored ADP-ribosyltransferase on the surface of skeletal muscle cells. | |
| US8263095B2 (en) | Methods of use for peptides having activities of insulin like growth factor-1 | |
| JPH02501113A (ja) | リンパ球機能関連抗原―３（ｌｆａ―３）を製造するためのｄｎａ配列、組換ｄｎａ分子及び方法 | |
| McGavin et al. | Fibronectin binding determinants of the Staphylococcus aureus fibronectin receptor | |
| JPH02238892A (ja) | ウイルスの感染性を阻止するヒトライノウイルス受容体タンパク質 | |
| JP2002302500A (ja) | 新規蛋白質及びこれを使用した薬剤の製法 | |
| CA2117747A1 (en) | A novel hyaluronan receptor protein and novel hyaluronan binding peptides | |
| CA2329054A1 (en) | A novel polypeptide hormone phosphatonin | |
| JP2829405B2 (ja) | 機能性ポリペプチド | |
| JP3104178B2 (ja) | 機能性ポリペプチド | |
| US20160222362A1 (en) | Target-Specific Double-Mutant Fusion Protein and Preparation Process Therefor | |
| JP2729712B2 (ja) | 機能性ポリペプチド | |
| JPH02152990A (ja) | 細胞接着活性ポリペプチド | |
| JPH01206998A (ja) | 細胞接着活性ポリペプチド | |
| JPH06501620A (ja) | 可溶性マンノース受容体ペプチド | |
| CA1341508C (en) | Transforming growth factor peptides | |
| JP2561149B2 (ja) | 機能性ポリペプチド | |
| US5591831A (en) | Solubilization and purification of the active gastrin releasing peptide receptor | |
| Vita et al. | Synthesis and characterization of biologically functional biotinylated RANTES | |
| HUT52154A (en) | Recombinant interleukin-2 hybrid proteins. | |
| JP2017526653A (ja) | 骨分化促進能及び歯周靭帯線維母細胞活性促進能を有するペプチド及びその用途 | |
| CN114617956B (zh) | 一种高效降糖的蛋白质药物 | |
| JP2623807B2 (ja) | セリンプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼ遺伝子 | |
| JPH0380096A (ja) | モチリン様ポリペプチドの製法並びにそのための組換えｄｎａ及び発現用プラスミド |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080901 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090901 Year of fee payment: 9 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |