JP2729712B2 - 機能性ポリペプチド - Google Patents
機能性ポリペプチドInfo
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- JP2729712B2 JP2729712B2 JP3238935A JP23893591A JP2729712B2 JP 2729712 B2 JP2729712 B2 JP 2729712B2 JP 3238935 A JP3238935 A JP 3238935A JP 23893591 A JP23893591 A JP 23893591A JP 2729712 B2 JP2729712 B2 JP 2729712B2
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- JP
- Japan
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- polypeptide
- plasmid
- chv
- heparin
- cells
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規ポリペプチドに関
し、更に詳しくは細胞接着活性とガン転移抑制活性の両
活性を有する新規なポリペプチド、並びにそれらをコー
ドする核酸、及びそのＤＮＡを用いた該ペプチドの遺伝
子工学的な製造方法に関する。
し、更に詳しくは細胞接着活性とガン転移抑制活性の両
活性を有する新規なポリペプチド、並びにそれらをコー
ドする核酸、及びそのＤＮＡを用いた該ペプチドの遺伝
子工学的な製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】フィブロネクチン（以下、ＦＮと表示す
る）は、血漿や細胞外マトリックスに存在する糖タンパ
ク質で、多彩な機能を持つことが知られている〔アニュ
アルレビュー オブ バイオケミストリー( Annual Rev
iew of Biochemistry ) 、第５７巻、第３７５〜４１３
頁（１９８８）〕。天然のＦＮを創傷治癒、点眼薬等の
医薬品や化粧品に利用する試みがなされているが、血液
から採取するために、供給に制限があること、コスト高
であること、また、病原性の細菌やウイルス等による汚
染の可能性があること等の理由により、実用化されてい
ない。ＦＮにはヘパリンに結合する領域（ヘパリン結合
ドメイン）が２ケ 所存在し、１ケ 所はＮ末端付近にあ
り、結合にＣａイオンが必要であることが知られてい
る。もう一方の領域はＣ末端付近にあり、この領域のヘ
パリンに対する結合活性は、前述の領域よりも強く、し
かもＣａイオンに影響されない。最近の研究からＦＮの
ヘパリン結合ドメインが、細胞接着ドメインと同様に線
維芽細胞、内皮細胞、ある種のガン細胞等の接着、伸
展、移動に重要な役割を果していることが次第に明らか
となってきた。ＦＮのヘパリン結合ドメインは細胞の表
層にあるプロテオグリカンに結合して、細胞と細胞外マ
トリックスとの相互作用を引起すことにより、細胞の接
着、伸展、移動等に寄与すると考えられる。したがっ
て、細胞接着ドメイン構造とヘパリン結合ドメイン構造
の両構造を持つポリペプチドは、細胞と細胞外マトリッ
クスの両方に結合して創傷部の組織の修復や、恒常性の
維持に寄与し、医薬品としての用途が期待できる。
る）は、血漿や細胞外マトリックスに存在する糖タンパ
ク質で、多彩な機能を持つことが知られている〔アニュ
アルレビュー オブ バイオケミストリー( Annual Rev
iew of Biochemistry ) 、第５７巻、第３７５〜４１３
頁（１９８８）〕。天然のＦＮを創傷治癒、点眼薬等の
医薬品や化粧品に利用する試みがなされているが、血液
から採取するために、供給に制限があること、コスト高
であること、また、病原性の細菌やウイルス等による汚
染の可能性があること等の理由により、実用化されてい
ない。ＦＮにはヘパリンに結合する領域（ヘパリン結合
ドメイン）が２ケ 所存在し、１ケ 所はＮ末端付近にあ
り、結合にＣａイオンが必要であることが知られてい
る。もう一方の領域はＣ末端付近にあり、この領域のヘ
パリンに対する結合活性は、前述の領域よりも強く、し
かもＣａイオンに影響されない。最近の研究からＦＮの
ヘパリン結合ドメインが、細胞接着ドメインと同様に線
維芽細胞、内皮細胞、ある種のガン細胞等の接着、伸
展、移動に重要な役割を果していることが次第に明らか
となってきた。ＦＮのヘパリン結合ドメインは細胞の表
層にあるプロテオグリカンに結合して、細胞と細胞外マ
トリックスとの相互作用を引起すことにより、細胞の接
着、伸展、移動等に寄与すると考えられる。したがっ
て、細胞接着ドメイン構造とヘパリン結合ドメイン構造
の両構造を持つポリペプチドは、細胞と細胞外マトリッ
クスの両方に結合して創傷部の組織の修復や、恒常性の
維持に寄与し、医薬品としての用途が期待できる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは特開平２
−３１１４９８号公報に記載のヒトＦＮの細胞接着ドメ
インと、ヘパリン結合ドメインが、直接又はリンカーペ
プチドを介して結合した機能性ポリペプチドを創製し、
該ポリペプチドがガン転移抑制作用等の生理活性を示す
ことを既に見出している（特開平３−１２７７４２号、
特願平１−３０６１４５号、同２−１６５７２７号各明
細書）。ガン転移抑制作用、脈管形成抑制作用等の生理
活性は、機能性ポリペプチドの構造、特に該ポリペプチ
ドのヘパリン結合ドメイン由来のポリペプチドの構造に
より異なることより、更にヘパリン結合ドメイン由来の
ポリペプチド部の構造の異なる上記機能性ポリペプチド
の開発が望まれている。本発明の目的は上記現状にかん
がみ、ヘパリン結合ドメイン由来のポリペプチド部の構
造の異なる細胞接着活性とガン転移抑制活性を合せもつ
機能性ポリペプチド、及び該ポリペプチドを含有するガ
ン転移抑制剤を提供することにある。
−３１１４９８号公報に記載のヒトＦＮの細胞接着ドメ
インと、ヘパリン結合ドメインが、直接又はリンカーペ
プチドを介して結合した機能性ポリペプチドを創製し、
該ポリペプチドがガン転移抑制作用等の生理活性を示す
ことを既に見出している（特開平３−１２７７４２号、
特願平１−３０６１４５号、同２−１６５７２７号各明
細書）。ガン転移抑制作用、脈管形成抑制作用等の生理
活性は、機能性ポリペプチドの構造、特に該ポリペプチ
ドのヘパリン結合ドメイン由来のポリペプチドの構造に
より異なることより、更にヘパリン結合ドメイン由来の
ポリペプチド部の構造の異なる上記機能性ポリペプチド
の開発が望まれている。本発明の目的は上記現状にかん
がみ、ヘパリン結合ドメイン由来のポリペプチド部の構
造の異なる細胞接着活性とガン転移抑制活性を合せもつ
機能性ポリペプチド、及び該ポリペプチドを含有するガ
ン転移抑制剤を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は機能性ポリペプチドに関し、下記一
般式（化１）：
発明の第１の発明は機能性ポリペプチドに関し、下記一
般式（化１）：
【化１】Ａ−（Ｂ）ｍ−（Ｃ）ｎ （式中Ａは配列表の配列番号１で表されるポリペプチ
ド、Ｂは配列表の配列番号２で表されるポリペプチド、
Ｃは配列表の配列番号３で表されるポリペプチド、ｍ、
ｎはそれぞれ１又は０の数を示す。但しｍ、ｎの和は１
以上である）で表されることを特徴とする。また本発明
の第２の発明はガン転移抑制剤に関し、本発明の第１の
発明の機能性ポリペプチドを含有することを特徴とす
る。本発明の第３の発明は、第１の発明の機能性ポリペ
プチドをコードする核酸に関する。本発明の第４の発明
は、第１の発明の機能性ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを組込んだプラスミドに関する。本発明の第５の発明
は、第４の発明のプラスミドを導入した形質転換体に関
する。更に本発明の第６の発明は、第１の発明の機能性
ポリペプチドの製造方法に関し、第５の発明の形質転換
体を培養し、該培養物より第１の発明の機能性ポリペプ
チドを採取することを特徴とする。
ド、Ｂは配列表の配列番号２で表されるポリペプチド、
Ｃは配列表の配列番号３で表されるポリペプチド、ｍ、
ｎはそれぞれ１又は０の数を示す。但しｍ、ｎの和は１
以上である）で表されることを特徴とする。また本発明
の第２の発明はガン転移抑制剤に関し、本発明の第１の
発明の機能性ポリペプチドを含有することを特徴とす
る。本発明の第３の発明は、第１の発明の機能性ポリペ
プチドをコードする核酸に関する。本発明の第４の発明
は、第１の発明の機能性ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを組込んだプラスミドに関する。本発明の第５の発明
は、第４の発明のプラスミドを導入した形質転換体に関
する。更に本発明の第６の発明は、第１の発明の機能性
ポリペプチドの製造方法に関し、第５の発明の形質転換
体を培養し、該培養物より第１の発明の機能性ポリペプ
チドを採取することを特徴とする。
【０００５】配列表の配列番号１のアミノ酸番号１〜２
７７はヒトＦＮの細胞接着ドメインの Pro1239− Ser
1515と同一配列であり、配列表の配列番号２はヒトＦＮ
のヘパリン結合ドメインの Asn1782− Thr1870と同一配
列であり、配列表の配列番号３は同じくヘパリン結合ド
メインの Ala1871− Thr1960と同一配列である。
７７はヒトＦＮの細胞接着ドメインの Pro1239− Ser
1515と同一配列であり、配列表の配列番号２はヒトＦＮ
のヘパリン結合ドメインの Asn1782− Thr1870と同一配
列であり、配列表の配列番号３は同じくヘパリン結合ド
メインの Ala1871− Thr1960と同一配列である。
【０００６】なお、本明細書において、アミノ酸に付与
された肩数字は、ＥＭＢＬデータバンク（ EMBL DATA B
ANK ) のＦＮのｃＤＮＡを翻訳して得られるアミノ酸に
付与されたＮ末端からのアミノ酸残基数を示す。
された肩数字は、ＥＭＢＬデータバンク（ EMBL DATA B
ANK ) のＦＮのｃＤＮＡを翻訳して得られるアミノ酸に
付与されたＮ末端からのアミノ酸残基数を示す。
【０００７】ヒトＦＮの遺伝子構造については、ジ エ
ンボ ジャーナル( The EMBO Journal) 、第４巻、第１
７５５〜１７５９頁（１９８５）に記載されている。ま
た、その細胞接着ドメイン及びヘパリン結合ドメインを
コードするｃＤＮＡクローン( ｐＬＦ５、ｐＬＦ３、ｐ
ＬＦ４及びｐＬＦ５）についてはバイオケミストリー(
Biochemistry )、第２５巻、第４９３６〜４９４１頁
（１９８６）に記載されている。本発明者らは、ｐＬＦ
５から、細胞接着ドメインに対するｃＤＮＡ断片を取出
し、これを発現ベクターに接続して大腸菌に導入するこ
とにより、細胞接着活性ポリペプチド及びその製造方法
を開発し特許出願した（特開平１−２０６９９８号）。
本発明で必要とされる細胞接着ドメインのｃＤＮＡは、
特開平１−２０６９９８号公報に記載されている組換え
体プラスミドpTF7021 を用いることができる。pTF7021
はＦＮの Pro1239− Met1517（２７９アミノ酸残基）を
発現するプラスミドである。pTF7021 の翻訳領域のＣ末
端の終止コドンの直前にクローニングサイト、例えばＮ
coＩサイトを導入することにより、細胞接着ドメインの
ｃＤＮＡと他のドメインのｃＤＮＡを連結させることが
できる。特開平２−３１１４９８号公報に記載のように
pTF7021にＮCOＩサイトを導入したプラスミドは pTF75
20と命名され、該プラスミド中に Pro1239− Ser1515−
Met の配列がコードされている。
ンボ ジャーナル( The EMBO Journal) 、第４巻、第１
７５５〜１７５９頁（１９８５）に記載されている。ま
た、その細胞接着ドメイン及びヘパリン結合ドメインを
コードするｃＤＮＡクローン( ｐＬＦ５、ｐＬＦ３、ｐ
ＬＦ４及びｐＬＦ５）についてはバイオケミストリー(
Biochemistry )、第２５巻、第４９３６〜４９４１頁
（１９８６）に記載されている。本発明者らは、ｐＬＦ
５から、細胞接着ドメインに対するｃＤＮＡ断片を取出
し、これを発現ベクターに接続して大腸菌に導入するこ
とにより、細胞接着活性ポリペプチド及びその製造方法
を開発し特許出願した（特開平１−２０６９９８号）。
本発明で必要とされる細胞接着ドメインのｃＤＮＡは、
特開平１−２０６９９８号公報に記載されている組換え
体プラスミドpTF7021 を用いることができる。pTF7021
はＦＮの Pro1239− Met1517（２７９アミノ酸残基）を
発現するプラスミドである。pTF7021 の翻訳領域のＣ末
端の終止コドンの直前にクローニングサイト、例えばＮ
coＩサイトを導入することにより、細胞接着ドメインの
ｃＤＮＡと他のドメインのｃＤＮＡを連結させることが
できる。特開平２−３１１４９８号公報に記載のように
pTF7021にＮCOＩサイトを導入したプラスミドは pTF75
20と命名され、該プラスミド中に Pro1239− Ser1515−
Met の配列がコードされている。
【０００８】ヘパリン結合ドメインについてはトリプシ
ン、サーモライシン、カテプシンＤ等によって分解され
て得られた断片が報告されており、その大きさは、２９
kDから３８kDに及んでいる。ドメインの詳しい特定はな
されていないが、一般的には約９０アミノ酸から成る I
II型類似配列を３個（ III−１２、 III−１３、 III−
１４）と、それに続く IIIcs型配列の一部を含む断片が
知られている。
ン、サーモライシン、カテプシンＤ等によって分解され
て得られた断片が報告されており、その大きさは、２９
kDから３８kDに及んでいる。ドメインの詳しい特定はな
されていないが、一般的には約９０アミノ酸から成る I
II型類似配列を３個（ III−１２、 III−１３、 III−
１４）と、それに続く IIIcs型配列の一部を含む断片が
知られている。
【０００９】ヘパリン結合ドメインをコードするｃＤＮ
Ａは、 pLF2435から取出すことができる。 pLF2435は、
前記ｐＬＦ２、ｐＬＦ３、ｐＬＦ４及びｐＬＦ５から再
構築されたプラスミドで、ＦＮのヘパリン結合ドメイン
をコードするｃＤＮＡを含んでいる。 pLF2435から必要
なｃＤＮＡ断片を制限酵素で切出し、５′側に開始コド
ンを含む合成ＤＮＡを、また、３′側には、終止コドン
を含む合成ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結した後、適当
な発現ベクターに接続することにより、特開平２−３１
１４９８号公報に記載の III型類似配列が３個つらなっ
た配列を有するペプチド（Ｈ−２７１）を発現するプラ
スミドpHD101を得ることができる。
Ａは、 pLF2435から取出すことができる。 pLF2435は、
前記ｐＬＦ２、ｐＬＦ３、ｐＬＦ４及びｐＬＦ５から再
構築されたプラスミドで、ＦＮのヘパリン結合ドメイン
をコードするｃＤＮＡを含んでいる。 pLF2435から必要
なｃＤＮＡ断片を制限酵素で切出し、５′側に開始コド
ンを含む合成ＤＮＡを、また、３′側には、終止コドン
を含む合成ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結した後、適当
な発現ベクターに接続することにより、特開平２−３１
１４９８号公報に記載の III型類似配列が３個つらなっ
た配列を有するペプチド（Ｈ−２７１）を発現するプラ
スミドpHD101を得ることができる。
【００１０】プラスミドpTF7520 及びプラスミドpHD101
については特開平２−３１１４９８号公報中に更に詳細
に記述されている。ＣＨＶ−１７９、ＣＨＶ−９０及び
ＣＨＶ−８９は、それぞれヘパリン結合ドメインの III
型リピートのうち、 III−１３及び III−１４、III −
１４、及び III−１３が細胞接着ドメインポリペプチド
（ Pro1239− Ser1515) のＣ末端にメチオニン残基を介
して結合したポリペプチドである。これらを発現するプ
ラスミドは、例えば次のようにして構築することができ
る。ヘパリン結合ドメインのポリペプチド（Ｈ−２７
１）をコードするプスラミドpHD101の III−１３のＮ末
端、又はＣ末端に対応する領域にＮCOＩサイトを導入
し、ＮCOＩとＢamＨＩで消化して III−１４、又は III
−１３及び III−１４をコードするＤＮＡ断片を得る。
これを細胞接着ドメインポリペプチドをコードしている
プスラミドpTF7520 （特開平２−３１１４９８号）のＮ
COＩ−ＢamＨＩサイトに接続することにより、ＣＨＶ−
１７９及びＣＨＶ−９０をそれぞれ発現するプラスミド
pCHV179 及びpCHV90が得られる。次いで、ＣＨＶ−１７
９を発現するプラスミドから、部位特異的変異の手法
で、 III−１４をコードする配列を欠失させることによ
り、ＣＨＶ−８９を発現するプラスミドpCHV89を得るこ
とができる。
については特開平２−３１１４９８号公報中に更に詳細
に記述されている。ＣＨＶ−１７９、ＣＨＶ−９０及び
ＣＨＶ−８９は、それぞれヘパリン結合ドメインの III
型リピートのうち、 III−１３及び III−１４、III −
１４、及び III−１３が細胞接着ドメインポリペプチド
（ Pro1239− Ser1515) のＣ末端にメチオニン残基を介
して結合したポリペプチドである。これらを発現するプ
ラスミドは、例えば次のようにして構築することができ
る。ヘパリン結合ドメインのポリペプチド（Ｈ−２７
１）をコードするプスラミドpHD101の III−１３のＮ末
端、又はＣ末端に対応する領域にＮCOＩサイトを導入
し、ＮCOＩとＢamＨＩで消化して III−１４、又は III
−１３及び III−１４をコードするＤＮＡ断片を得る。
これを細胞接着ドメインポリペプチドをコードしている
プスラミドpTF7520 （特開平２−３１１４９８号）のＮ
COＩ−ＢamＨＩサイトに接続することにより、ＣＨＶ−
１７９及びＣＨＶ−９０をそれぞれ発現するプラスミド
pCHV179 及びpCHV90が得られる。次いで、ＣＨＶ−１７
９を発現するプラスミドから、部位特異的変異の手法
で、 III−１４をコードする配列を欠失させることによ
り、ＣＨＶ−８９を発現するプラスミドpCHV89を得るこ
とができる。
【００１１】前記プラスミドにおける連結部には、ＮCO
Ｉサイトに由来するメチオニン残基がリンカーとして含
まれる。リンカーの有無は、本発明の効果を左右するも
のではないが、必要とあれば部位特異的変異の手法によ
り、容易に除去することができる。また、任意のスペー
サーを分子間距離の調節のため挿入することもできる。
Ｉサイトに由来するメチオニン残基がリンカーとして含
まれる。リンカーの有無は、本発明の効果を左右するも
のではないが、必要とあれば部位特異的変異の手法によ
り、容易に除去することができる。また、任意のスペー
サーを分子間距離の調節のため挿入することもできる。
【００１２】配列表の配列番号４のアミノ酸配列をコー
ドするプラスミドpCHV89、配列表の配列番号５のアミノ
酸配列をコードするプラスミドpCHV179 、配列表の配列
番号６のアミノ酸配列をコードするプラスミドpCHV90を
それぞれ例えば、大腸菌に導入し、適当な条件下に培養
することにより、目的ペプチドが大腸菌内に蓄積され
る。発現の確認にはイムノブロッティングが用いられ
る。組換え大腸菌の全菌体タンパク質をＳＤＳ−ポリア
クリルアミド電気泳動で分離した後、泳動パターンをニ
トロセルロース膜に移し取る。ＦＮの細胞接着ドメイン
を認識するモノクローナル抗体（ＦＮ−１０、宝酒
造）、及びＦＮのヘパリンドメインを認識するモロクロ
ーナル抗体（ＩＳＴ−１又はＩＳＴ−２、セラ・ラブ
社）等を用いて検出されるバンドが目的のポリペプチド
である。目的ポリペプチドの精製は、例えば次のように
行う。組換え大腸菌をＬ−ブロス等の培地に培養し、集
菌した後、超音波処理により、菌体破砕液を得、これを
遠心分離して上清を得る。上清を透析後、ＤＥＡＥイオ
ン交換体のカラムで分画し、次いで抗体カラム及び／又
はヘパリン−アガロース等のアフィニティクロマトを行
う。以上の操作により、目的のポリペプチドを精製する
ことができる。
ドするプラスミドpCHV89、配列表の配列番号５のアミノ
酸配列をコードするプラスミドpCHV179 、配列表の配列
番号６のアミノ酸配列をコードするプラスミドpCHV90を
それぞれ例えば、大腸菌に導入し、適当な条件下に培養
することにより、目的ペプチドが大腸菌内に蓄積され
る。発現の確認にはイムノブロッティングが用いられ
る。組換え大腸菌の全菌体タンパク質をＳＤＳ−ポリア
クリルアミド電気泳動で分離した後、泳動パターンをニ
トロセルロース膜に移し取る。ＦＮの細胞接着ドメイン
を認識するモノクローナル抗体（ＦＮ−１０、宝酒
造）、及びＦＮのヘパリンドメインを認識するモロクロ
ーナル抗体（ＩＳＴ−１又はＩＳＴ−２、セラ・ラブ
社）等を用いて検出されるバンドが目的のポリペプチド
である。目的ポリペプチドの精製は、例えば次のように
行う。組換え大腸菌をＬ−ブロス等の培地に培養し、集
菌した後、超音波処理により、菌体破砕液を得、これを
遠心分離して上清を得る。上清を透析後、ＤＥＡＥイオ
ン交換体のカラムで分画し、次いで抗体カラム及び／又
はヘパリン−アガロース等のアフィニティクロマトを行
う。以上の操作により、目的のポリペプチドを精製する
ことができる。
【００１３】得られたポリペプチドは、ＢＨＫやＮＲＫ
細胞に対する細胞伸展活性の測定及びヘパリン結合活性
の測定に用いられる。細胞伸展活性の測定は、例えばル
オスラティ（ Ruoslahti )らの方法〔メソッズ イン
エンザイモロジー ( Methodsin Enzymology ）、第８２
巻、第８０３〜８３１頁（１９８１）〕に準じて行う。
すなわち、試料をコートした後、ＢＳＡでブロッキング
したマイクロタイタープレートに、ＢＨＫ又はＮＲＫ細
胞の懸濁液を添加し、３７℃で約１時間インキュベート
した後、未吸着の細胞を洗浄した後、ホルマリン固定し
て、伸展した細胞の割合を顕微鏡下に測定することによ
り、細胞伸展の強さを測定することができる。一方、ヘ
パリン結合活性は、ヘパリンを結合した担体、例えばＡ
Ｆ−ヘパリントヨパール（ Toyopearl、東ソー）のカラ
ムに試料を吸着させ、ＮａＣｌの塩濃度を上昇させて溶
出させ、溶出された塩濃度により、ヘパリンへの結合能
力を示すことができる。
細胞に対する細胞伸展活性の測定及びヘパリン結合活性
の測定に用いられる。細胞伸展活性の測定は、例えばル
オスラティ（ Ruoslahti )らの方法〔メソッズ イン
エンザイモロジー ( Methodsin Enzymology ）、第８２
巻、第８０３〜８３１頁（１９８１）〕に準じて行う。
すなわち、試料をコートした後、ＢＳＡでブロッキング
したマイクロタイタープレートに、ＢＨＫ又はＮＲＫ細
胞の懸濁液を添加し、３７℃で約１時間インキュベート
した後、未吸着の細胞を洗浄した後、ホルマリン固定し
て、伸展した細胞の割合を顕微鏡下に測定することによ
り、細胞伸展の強さを測定することができる。一方、ヘ
パリン結合活性は、ヘパリンを結合した担体、例えばＡ
Ｆ−ヘパリントヨパール（ Toyopearl、東ソー）のカラ
ムに試料を吸着させ、ＮａＣｌの塩濃度を上昇させて溶
出させ、溶出された塩濃度により、ヘパリンへの結合能
力を示すことができる。
【００１４】以上の測定により、本発明のポリペプチド
はＢＨＫやＮＲＫ細胞に対して強い細胞伸展活性を示す
と共に、ＣＨＶ−１７９、ＣＨＶ−８９はそれぞれヘパ
リンに対しても強い親和性を示すことが証明される。
はＢＨＫやＮＲＫ細胞に対して強い細胞伸展活性を示す
と共に、ＣＨＶ−１７９、ＣＨＶ−８９はそれぞれヘパ
リンに対しても強い親和性を示すことが証明される。
【００１５】本発明のポリペプチドを医薬として使用す
る場合、必要に応じて医薬用担体と共に常法により製剤
化し、経口投与又は非経口投与すればよい。賦形剤ある
いは担体としては薬理学的に許容されるものが選ばれ、
その種類及び組成は投与経路や投与方法によって異な
る。例えば液状担体として水、アルコール類若しくは大
豆油、オリーブ油、ミネラル油等の動植物油、又は合成
油が用いられる。固体担体としてマルトース、シューク
ロースなどの糖類、アミノ酸類、ヒドロキシプロピルセ
ルロースなどのセルロース誘導体、ステアリン酸マグネ
シウムなどの有機酸塩などが使用される。
る場合、必要に応じて医薬用担体と共に常法により製剤
化し、経口投与又は非経口投与すればよい。賦形剤ある
いは担体としては薬理学的に許容されるものが選ばれ、
その種類及び組成は投与経路や投与方法によって異な
る。例えば液状担体として水、アルコール類若しくは大
豆油、オリーブ油、ミネラル油等の動植物油、又は合成
油が用いられる。固体担体としてマルトース、シューク
ロースなどの糖類、アミノ酸類、ヒドロキシプロピルセ
ルロースなどのセルロース誘導体、ステアリン酸マグネ
シウムなどの有機酸塩などが使用される。
【００１６】注射剤の場合は溶解液は生理食塩液、各種
緩衝液、グルコース、イノシトール、マンニトール、ラ
クトースなどの糖類溶液、エチレングリコール、ポリエ
チレングリコールなどのグリコール類が望ましい。また
イノシトール、マンニトール、ラクトース、シュークロ
ース等の糖類、フェニルアラニン等のアミノ酸等の賦形
剤と共に凍結乾燥製剤とし、それを投与時に注射用の適
当な溶剤、例えば滅菌水、生理食塩液、ブドウ糖液、電
解質溶液、アミノ酸溶液等静脈投与用液体に溶解させて
投与することもできる。製剤中における本発明のポリペ
プチドの含量は製剤により異なるが、通常０．１〜１０
０重量％好ましくは１〜９８重量％である。例えば注射
液の場合には、通常０．１〜３０重量％、好ましくは１
〜１０重量％の有効成分を含むようにすることが望まし
い。経口投与する場合には前記固体担体若しくは液状担
体と共に、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、液剤、ド
ライシロップ剤等の形態で用いられる。カプセル、顆
粒、粉剤は一般に５〜１００重量％、好ましくは２５〜
９８重量％の有効成分を含む。
緩衝液、グルコース、イノシトール、マンニトール、ラ
クトースなどの糖類溶液、エチレングリコール、ポリエ
チレングリコールなどのグリコール類が望ましい。また
イノシトール、マンニトール、ラクトース、シュークロ
ース等の糖類、フェニルアラニン等のアミノ酸等の賦形
剤と共に凍結乾燥製剤とし、それを投与時に注射用の適
当な溶剤、例えば滅菌水、生理食塩液、ブドウ糖液、電
解質溶液、アミノ酸溶液等静脈投与用液体に溶解させて
投与することもできる。製剤中における本発明のポリペ
プチドの含量は製剤により異なるが、通常０．１〜１０
０重量％好ましくは１〜９８重量％である。例えば注射
液の場合には、通常０．１〜３０重量％、好ましくは１
〜１０重量％の有効成分を含むようにすることが望まし
い。経口投与する場合には前記固体担体若しくは液状担
体と共に、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、液剤、ド
ライシロップ剤等の形態で用いられる。カプセル、顆
粒、粉剤は一般に５〜１００重量％、好ましくは２５〜
９８重量％の有効成分を含む。
【００１７】投与量は、患者の年令、体重、症状、治療
目的等により決定されるが治療量は一般に、非経口投与
で１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、経口投与で５〜５００ｍ
ｇ／ｋｇ／日である。
目的等により決定されるが治療量は一般に、非経口投与
で１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、経口投与で５〜５００ｍ
ｇ／ｋｇ／日である。
【００１８】本発明のポリペプチドはＢ１６メラノーマ
を用いる転移のモデル系にて有意な転移防止効果を示す
もので、胃ガン、肺ガン、大腸ガン、乳ガン、前立腺ガ
ン、子宮頸ガン、腎ガンなどガン細胞に対して良好に転
移を防止せしめてなる有用なものである。
を用いる転移のモデル系にて有意な転移防止効果を示す
もので、胃ガン、肺ガン、大腸ガン、乳ガン、前立腺ガ
ン、子宮頸ガン、腎ガンなどガン細胞に対して良好に転
移を防止せしめてなる有用なものである。
【００１９】以上詳細に説明した様に、遺伝子工学的手
法により、細胞接着活性とガン転移抑制剤活性を伴せ持
ち、新規な機能性ポリペプチドを効率よく提供すること
ができる。該ポリペプチドは抗転移抑制剤としての用途
のほか、脈管形成抑制剤、創傷治癒剤、生長促進剤等の
医薬品として、また、化粧料、培養基材等として有用で
ある。
法により、細胞接着活性とガン転移抑制剤活性を伴せ持
ち、新規な機能性ポリペプチドを効率よく提供すること
ができる。該ポリペプチドは抗転移抑制剤としての用途
のほか、脈管形成抑制剤、創傷治癒剤、生長促進剤等の
医薬品として、また、化粧料、培養基材等として有用で
ある。
【００２０】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
【００２１】実施例１ ヘパリン結合ドメインの一部と細胞接着ドメインポリペ
プチドとの融合タンパク質の構築 なお、図１は融合タンパク質を発現するプラスミドの構
築工程を示す図である。Escherichia coli HB 101/pHD
101 （ＦＥＲＭ ＢＰ−２２６４）より調製したヘパリ
ン結合ドメインをコードするプラスミドpHD101（特開平
２−３１１４９８号）を大腸菌ＢＷ３１３に導入し、ヘ
ルパーファージＭ13Ｋ07を感染させてｄＵを含む一本鎖
ＤＮＡを調製した。これをテンプレートとし、ＮCOＩ認
識配列を含む配列表の配列番号６で表す合成ＤＮＡをプ
ライマーとして、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを作用させ、
相補鎖合成を行った。なお、プライマーは、ポリヌクレ
オチドキナーゼにより、あらかじめ５′末端をリン酸化
した。得られた２重鎖ＤＮＡを大腸菌ＤＮＡリガーゼで
環状化し、宿主菌の大腸菌BMH71-18mutS株に導入して、
複製させた。得られた形質転換体からプラスミドを抽出
しＮCOＩで切断してゲル電気泳動で約０．２７kbのバン
ドを与えるプラスミドを選択した。このようにして、ヘ
パリン結合ドメインの III−１３のＮ末端（ Asn1782 )
と、 III−１２のＣ末端（ Glu1781 )をコードする配列
の間にＮCOＩサイトを導入したプラスミドを得た。な
お、この変異導入には市販の変異導入キット（ミュータ
ンＫ、宝酒造）を用いた。このプラスミドを、ＮCOＩと
ＢamＨＩで消化してゲル電気泳動を行い、約０．５４kb
のバンドをゲルから抽出した。一方、Escherichia coli
JM 109/pTF 7021（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９４１）より前
述の組換え体プラスミドpTF 7021を調製し、次いで該プ
ラスミドにＮCOＩサイトを導入した。ＮCOＩサイトの導
入は特開平２−３１１４９８号公報に記載のように、配
列表の配列番号７で表すオリゴヌクレオチドを合成し、
前出ミュータンＫを用いて行い、プラスミドpTF 7520を
得た。前記０．５４kbのＤＮＡ断片をＮCOＩとＢamＨＩ
で消化したpTF 7520とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した
後、大腸菌ＨＢ１０１に導入した。得られた形質転換体
から、プラスミドを抽出し、ＮCOＩと、ＢamＨＩで消化
したときに、０．５４kbのバンドを与えるプラスミドを
選択した。このプラスミドを pCHV179と命名した。pCHV
179は、Ｈ−２７１の III−１２を欠失したヘパリン結
合ドメインポリペプチドと細胞接着ドメインポリペプチ
ド（ Pro1239− Ser1515 )がメチオニン残基を介して結
合した融合タンパク質を発現するプラスミドであること
をＤＮＡの塩基配列分析によって確認した。 pCHV179を
導入した大腸菌ＨＢ１０１を Escherichia coli ＨＢ１
０１／pCHV179 と命名、表示して工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託した〔微工研菌寄第１２１８３号（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１２１８３）〕。
プチドとの融合タンパク質の構築 なお、図１は融合タンパク質を発現するプラスミドの構
築工程を示す図である。Escherichia coli HB 101/pHD
101 （ＦＥＲＭ ＢＰ−２２６４）より調製したヘパリ
ン結合ドメインをコードするプラスミドpHD101（特開平
２−３１１４９８号）を大腸菌ＢＷ３１３に導入し、ヘ
ルパーファージＭ13Ｋ07を感染させてｄＵを含む一本鎖
ＤＮＡを調製した。これをテンプレートとし、ＮCOＩ認
識配列を含む配列表の配列番号６で表す合成ＤＮＡをプ
ライマーとして、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを作用させ、
相補鎖合成を行った。なお、プライマーは、ポリヌクレ
オチドキナーゼにより、あらかじめ５′末端をリン酸化
した。得られた２重鎖ＤＮＡを大腸菌ＤＮＡリガーゼで
環状化し、宿主菌の大腸菌BMH71-18mutS株に導入して、
複製させた。得られた形質転換体からプラスミドを抽出
しＮCOＩで切断してゲル電気泳動で約０．２７kbのバン
ドを与えるプラスミドを選択した。このようにして、ヘ
パリン結合ドメインの III−１３のＮ末端（ Asn1782 )
と、 III−１２のＣ末端（ Glu1781 )をコードする配列
の間にＮCOＩサイトを導入したプラスミドを得た。な
お、この変異導入には市販の変異導入キット（ミュータ
ンＫ、宝酒造）を用いた。このプラスミドを、ＮCOＩと
ＢamＨＩで消化してゲル電気泳動を行い、約０．５４kb
のバンドをゲルから抽出した。一方、Escherichia coli
JM 109/pTF 7021（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９４１）より前
述の組換え体プラスミドpTF 7021を調製し、次いで該プ
ラスミドにＮCOＩサイトを導入した。ＮCOＩサイトの導
入は特開平２−３１１４９８号公報に記載のように、配
列表の配列番号７で表すオリゴヌクレオチドを合成し、
前出ミュータンＫを用いて行い、プラスミドpTF 7520を
得た。前記０．５４kbのＤＮＡ断片をＮCOＩとＢamＨＩ
で消化したpTF 7520とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した
後、大腸菌ＨＢ１０１に導入した。得られた形質転換体
から、プラスミドを抽出し、ＮCOＩと、ＢamＨＩで消化
したときに、０．５４kbのバンドを与えるプラスミドを
選択した。このプラスミドを pCHV179と命名した。pCHV
179は、Ｈ−２７１の III−１２を欠失したヘパリン結
合ドメインポリペプチドと細胞接着ドメインポリペプチ
ド（ Pro1239− Ser1515 )がメチオニン残基を介して結
合した融合タンパク質を発現するプラスミドであること
をＤＮＡの塩基配列分析によって確認した。 pCHV179を
導入した大腸菌ＨＢ１０１を Escherichia coli ＨＢ１
０１／pCHV179 と命名、表示して工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託した〔微工研菌寄第１２１８３号（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１２１８３）〕。
【００２２】同様にして、ＮCOＩサイトを含む配列表の
配列番号８で表す変異導入プライマーを用いて、pHD101
に変異導入を行い、III −１３のＣ末端（ Thr1870 )と
III−１４のＮ末端（ Ala1871 )をコードする配列の間
にＮCOＩサイトを導入したプラスミドを得た。これをＮ
COＩとＢamＨＩで消化して約０．２７kbのバンドを切り
出し、 pTF7520のＮCOＩ−ＢamＨＩサイトに接続して、
大腸菌ＨＢ１０１に導入した。得られた形質転換体か
ら、プラスミドを抽出し、ＮCOＩとＢamＨＩで消化した
とき０．２７kbのバンドを与えるプラスミドを選択し、
このプラスミドをpCHV 90 と命名した。pCHV 90 は、Ｈ
−２７１の III−１２と III−１３を欠失したヘパリン
結合ドメインポリペプチドを細胞接着ドメインポリペプ
チドがメチオニン残基を介して結合した融合タンパク質
を発現するプラスミドであることをＤＮＡの塩基配列分
析により確認した。pCHV 90 を導入した大腸菌ＨＢ１０
１をEscherichia coli ＨＢ１０１／pCHV 90 と命名し
た。
配列番号８で表す変異導入プライマーを用いて、pHD101
に変異導入を行い、III −１３のＣ末端（ Thr1870 )と
III−１４のＮ末端（ Ala1871 )をコードする配列の間
にＮCOＩサイトを導入したプラスミドを得た。これをＮ
COＩとＢamＨＩで消化して約０．２７kbのバンドを切り
出し、 pTF7520のＮCOＩ−ＢamＨＩサイトに接続して、
大腸菌ＨＢ１０１に導入した。得られた形質転換体か
ら、プラスミドを抽出し、ＮCOＩとＢamＨＩで消化した
とき０．２７kbのバンドを与えるプラスミドを選択し、
このプラスミドをpCHV 90 と命名した。pCHV 90 は、Ｈ
−２７１の III−１２と III−１３を欠失したヘパリン
結合ドメインポリペプチドを細胞接着ドメインポリペプ
チドがメチオニン残基を介して結合した融合タンパク質
を発現するプラスミドであることをＤＮＡの塩基配列分
析により確認した。pCHV 90 を導入した大腸菌ＨＢ１０
１をEscherichia coli ＨＢ１０１／pCHV 90 と命名し
た。
【００２３】次いで、 pCHV179から、 III−１４をコー
ドする領域を欠失するために欠失導入プライマーとして
III−１３のＣ末端をコードする配列に相補的な配列
と、ストップコドン以下の配列に相補的な配列とが直接
結合した配列表の配列番号９で表す３０塩基のオリゴヌ
クレオチドを合成した。これをプライマーとして前記の
方法で相補鎖を合成し、ＤＮＡリガーゼで閉環した後、
大腸菌BMH71-18mutSを形質転換し、得られたプラスミド
をＮCOＩとＢamＨＩで消化して、０．２７kbの断片を生
成するものを目的の変異体として選択した。最終的に
は、塩基配列分析により、変異を確認した。このように
して得られたプラスミドはＨ−２７１の III−１２と I
II−１４を欠失したヘパリン結合ドメインポリペプチド
と細胞接着ドメインポリペプチドがメチオニン残基を介
して結合した融合タンパク質を発現するプラスミドであ
り、該プラスミドをpCHV89と命名した。これを再び大腸
菌ＨＢ１０１に導入して、得られた形質転換体を Esche
richia coli ＨＢ１０１／pCHV89と命名、表示して工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託した〔微工研菌寄第
１２１８２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２１８２）〕。
ドする領域を欠失するために欠失導入プライマーとして
III−１３のＣ末端をコードする配列に相補的な配列
と、ストップコドン以下の配列に相補的な配列とが直接
結合した配列表の配列番号９で表す３０塩基のオリゴヌ
クレオチドを合成した。これをプライマーとして前記の
方法で相補鎖を合成し、ＤＮＡリガーゼで閉環した後、
大腸菌BMH71-18mutSを形質転換し、得られたプラスミド
をＮCOＩとＢamＨＩで消化して、０．２７kbの断片を生
成するものを目的の変異体として選択した。最終的に
は、塩基配列分析により、変異を確認した。このように
して得られたプラスミドはＨ−２７１の III−１２と I
II−１４を欠失したヘパリン結合ドメインポリペプチド
と細胞接着ドメインポリペプチドがメチオニン残基を介
して結合した融合タンパク質を発現するプラスミドであ
り、該プラスミドをpCHV89と命名した。これを再び大腸
菌ＨＢ１０１に導入して、得られた形質転換体を Esche
richia coli ＨＢ１０１／pCHV89と命名、表示して工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託した〔微工研菌寄第
１２１８２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２１８２）〕。
【００２４】実施例２ ＣＨＶ−８９、ＣＨＶ−９０、及びＣＨＶ−１７９の大
腸菌による生産と精製 pCHV89を導入した Escherichia coli ＨＢ１０１／pCHV
89（ＦＥＲＭ Ｐ−１２１８２）を５０μｇ／mlのアン
ピシリンを含む５mlのＬ−ブロス培地に接種し、３７
℃、１夜振とう培養した。これを５００mlの同培地に接
種して振とう培養し、６６０nmの吸光度が０．３のとき
に、２mMのＩＰＴＧを添加して、更に２０時間培養し
た。次に遠心分離により集菌し、１mM ＥＤＴＡ、５mM
メルカプトエタノール、３μＭ ｐ−アミジノフェニル
メタンスルホニルフルオライドを含む２０mMトリス塩酸
バッファー（ pH ８．０）に懸濁した。これを超音波処
理した後、遠心分離を行って２５mlの上清を得た。上清
をＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｍ（１５ml）をカラム
に吸着させ、カラムを２０mMトリス塩酸バッファー（ p
H ８．０）で洗浄後、バッファー中のＮａＣｌ濃度の上
昇により吸着物を分画した。イムノブロッティングによ
り検出された目的画分を集め、２０mMトリス塩酸バッフ
ァー（pH８．０）で平衡化した抗体カラム（ＦＮ−１０
を結合させたセファロース４Ｂ、１０ml）に吸着させ、
次に０．１Ｍ ＮａＣｌを含む同バッファー、２０mM酢
酸アンモニウムの順に洗浄した後、４０mM酢酸で目的画
分を溶出した。その中でＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一のバン
ドを与える画分を集めて、脱塩、凍結乾燥した。このよ
うにして５００mlの培養菌体から約５mgのＣＨＶ−８９
を得た。このＣＨＶ−８９の一部をプロテインシーケン
サー（４７７Ａ／１２０Ａ、アプライドバイオシステム
ズ社）で分析して、Ｎ末端配列を確認した。また、カル
ボキシペプチダーゼＰ消化法により、Ｃ末端アミノ酸を
確認した。
腸菌による生産と精製 pCHV89を導入した Escherichia coli ＨＢ１０１／pCHV
89（ＦＥＲＭ Ｐ−１２１８２）を５０μｇ／mlのアン
ピシリンを含む５mlのＬ−ブロス培地に接種し、３７
℃、１夜振とう培養した。これを５００mlの同培地に接
種して振とう培養し、６６０nmの吸光度が０．３のとき
に、２mMのＩＰＴＧを添加して、更に２０時間培養し
た。次に遠心分離により集菌し、１mM ＥＤＴＡ、５mM
メルカプトエタノール、３μＭ ｐ−アミジノフェニル
メタンスルホニルフルオライドを含む２０mMトリス塩酸
バッファー（ pH ８．０）に懸濁した。これを超音波処
理した後、遠心分離を行って２５mlの上清を得た。上清
をＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｍ（１５ml）をカラム
に吸着させ、カラムを２０mMトリス塩酸バッファー（ p
H ８．０）で洗浄後、バッファー中のＮａＣｌ濃度の上
昇により吸着物を分画した。イムノブロッティングによ
り検出された目的画分を集め、２０mMトリス塩酸バッフ
ァー（pH８．０）で平衡化した抗体カラム（ＦＮ−１０
を結合させたセファロース４Ｂ、１０ml）に吸着させ、
次に０．１Ｍ ＮａＣｌを含む同バッファー、２０mM酢
酸アンモニウムの順に洗浄した後、４０mM酢酸で目的画
分を溶出した。その中でＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一のバン
ドを与える画分を集めて、脱塩、凍結乾燥した。このよ
うにして５００mlの培養菌体から約５mgのＣＨＶ−８９
を得た。このＣＨＶ−８９の一部をプロテインシーケン
サー（４７７Ａ／１２０Ａ、アプライドバイオシステム
ズ社）で分析して、Ｎ末端配列を確認した。また、カル
ボキシペプチダーゼＰ消化法により、Ｃ末端アミノ酸を
確認した。
【００２５】同様の方法により、pCHV179 を導入した E
scherichia coli ＨＢ１０１／pCHV179 （ＦＥＲＭ Ｐ
−１２１８３）を培養し、５００mlの培養菌体から、約
５mgのＣＨＶ−１７９を得た。また、pCHV90を導入した
Escherichia coli ＨＢ１０１／pCHV90の５００ml培養
液から約４mgのＣＨＶ−９０を得た。ＣＨＶ−１７９、
ＣＨＶ−９０のＮ末端アミノ酸、Ｃ末端アミノ酸も、上
記と同様の方法でそれぞれ確認した。
scherichia coli ＨＢ１０１／pCHV179 （ＦＥＲＭ Ｐ
−１２１８３）を培養し、５００mlの培養菌体から、約
５mgのＣＨＶ−１７９を得た。また、pCHV90を導入した
Escherichia coli ＨＢ１０１／pCHV90の５００ml培養
液から約４mgのＣＨＶ−９０を得た。ＣＨＶ−１７９、
ＣＨＶ−９０のＮ末端アミノ酸、Ｃ末端アミノ酸も、上
記と同様の方法でそれぞれ確認した。
【００２６】実施例３ 生物活性の測定 前記実施例２で得られた各ポリペプチドを用いて細胞接
着活性、ヘパリン結合活性及びヘパリン結合ドメインに
対するモノクローナル抗体との反応性を測定した。細胞
接着活性は、ルオスラティらの方法〔メソッズ イン
エンザイモロジー、第８２巻、該８０３〜８３１頁（１
９８１）〕に準じて測定した。試料を蒸留水、ＰＢＳ
（リン酸緩衝化生理食塩水）等に溶かし、９６穴マイク
ロプレート上で階段的に希釈した。４℃、２時間インキ
ュベートして、試料をプレート上に吸着させた（５０μ
ｌ／ウエル）。３％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を含む
ＰＢＳ溶液を１００μｌ／ウエル加え、３７℃、１時間
インキュベートしてプレートをブロックした。ＰＢＳで
プレートを洗浄後、あらかじめダルベッコ( Dulbecoo′
s)イーグル最小栄養培地（ＤＭＥＭ）に５×１０5 細胞
／mlとなるように懸濁させたベビーハムスター腎細胞
（ＢＨＫ−２１）を１００μｌ／ウエル分注し、３７
℃、１時間インキュベートした。なお使用したＢＨＫ−
２１細胞は、凍結保存した株を継代培養後、トリプシン
処理（３７℃、５分）したものを用いた。ＰＢＳでプレ
ートを洗浄後、３％ホルマリン溶液で細胞をプレート上
に固定した。顕微鏡下でＢＨＫ−２１細胞の伸展を観察
し、伸展細胞数が、ｎ−ＦＮの高濃度における伸展細胞
数の５０％となる試料の濃度（ＥＤ50）を求め細胞接着
活性の指標とした。
着活性、ヘパリン結合活性及びヘパリン結合ドメインに
対するモノクローナル抗体との反応性を測定した。細胞
接着活性は、ルオスラティらの方法〔メソッズ イン
エンザイモロジー、第８２巻、該８０３〜８３１頁（１
９８１）〕に準じて測定した。試料を蒸留水、ＰＢＳ
（リン酸緩衝化生理食塩水）等に溶かし、９６穴マイク
ロプレート上で階段的に希釈した。４℃、２時間インキ
ュベートして、試料をプレート上に吸着させた（５０μ
ｌ／ウエル）。３％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を含む
ＰＢＳ溶液を１００μｌ／ウエル加え、３７℃、１時間
インキュベートしてプレートをブロックした。ＰＢＳで
プレートを洗浄後、あらかじめダルベッコ( Dulbecoo′
s)イーグル最小栄養培地（ＤＭＥＭ）に５×１０5 細胞
／mlとなるように懸濁させたベビーハムスター腎細胞
（ＢＨＫ−２１）を１００μｌ／ウエル分注し、３７
℃、１時間インキュベートした。なお使用したＢＨＫ−
２１細胞は、凍結保存した株を継代培養後、トリプシン
処理（３７℃、５分）したものを用いた。ＰＢＳでプレ
ートを洗浄後、３％ホルマリン溶液で細胞をプレート上
に固定した。顕微鏡下でＢＨＫ−２１細胞の伸展を観察
し、伸展細胞数が、ｎ−ＦＮの高濃度における伸展細胞
数の５０％となる試料の濃度（ＥＤ50）を求め細胞接着
活性の指標とした。
【００２７】ヘパリン結合活性の測定は以下のようにし
た。２０mMリン酸バッファー（ pH ７．０）で平衡化し
たＡＦヘパリン−トヨパール６５０Ｍのカラム（１．５
ml）に試料を乗せ、バッファー中のＮａＣｌ濃度を段階
的に上昇させ、溶出される塩濃度によりヘパリンへの結
合力を表した。
た。２０mMリン酸バッファー（ pH ７．０）で平衡化し
たＡＦヘパリン−トヨパール６５０Ｍのカラム（１．５
ml）に試料を乗せ、バッファー中のＮａＣｌ濃度を段階
的に上昇させ、溶出される塩濃度によりヘパリンへの結
合力を表した。
【００２８】ヘパリン結合ドメインに対するモノクロー
ナル抗体との反応性の測定は、試料１〜２μｇをＳＤＳ
−ＰＡＧＥで分離し、これをセミドライブロッター（ザ
ルトリウス社）を用いて、ニトロセルロースメンブラン
にブロッティングした。メンブランをブロッキング液
（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で処理した後、ＦＮのヘパ
リン結合ドメインを認識するモノクローナル抗体（ＩＳ
Ｔ−１及び−２、セラ・ラブ社）を含むブロッキング液
と約１時間インキュベートし、５０mM ＮａＣｌ及び
０．０５％ ＮＰ−４０を含む１０mMトリス・ＨＣｌバ
ッファー（ pH ７．５）でメンブランを洗浄、更にＮＰ
−４０を含まない上記バッファーでメンブランを洗浄し
た。次いで、パーオキシダーゼ標識２次抗体（アマシャ
ム社）を含むブロッキング液と約１時間インキュベート
し、同様にメンブランを洗浄した。４−クロロ−１−ナ
フトール及びＨ2 Ｏ2 を含む５０mM ＮａＣｌ−トリス
・ＨＣｌ（pH７．５）溶液にメンブランを浸して、メン
ブランにブロッティングされたバンドを発色させた。
ナル抗体との反応性の測定は、試料１〜２μｇをＳＤＳ
−ＰＡＧＥで分離し、これをセミドライブロッター（ザ
ルトリウス社）を用いて、ニトロセルロースメンブラン
にブロッティングした。メンブランをブロッキング液
（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で処理した後、ＦＮのヘパ
リン結合ドメインを認識するモノクローナル抗体（ＩＳ
Ｔ−１及び−２、セラ・ラブ社）を含むブロッキング液
と約１時間インキュベートし、５０mM ＮａＣｌ及び
０．０５％ ＮＰ−４０を含む１０mMトリス・ＨＣｌバ
ッファー（ pH ７．５）でメンブランを洗浄、更にＮＰ
−４０を含まない上記バッファーでメンブランを洗浄し
た。次いで、パーオキシダーゼ標識２次抗体（アマシャ
ム社）を含むブロッキング液と約１時間インキュベート
し、同様にメンブランを洗浄した。４−クロロ−１−ナ
フトール及びＨ2 Ｏ2 を含む５０mM ＮａＣｌ−トリス
・ＨＣｌ（pH７．５）溶液にメンブランを浸して、メン
ブランにブロッティングされたバンドを発色させた。
【００２９】以上のようにして得られた測定結果を表１
に示す。なお、特開平２−３１１４９８号公報記載のＣ
277 −Ｍet−Ｈ271 を対照とし用いた。
に示す。なお、特開平２−３１１４９８号公報記載のＣ
277 −Ｍet−Ｈ271 を対照とし用いた。
【００３０】
【表１】 表 １ ─────────────────────────────────── 細胞接着活性 ヘパリン結合活性 抗体との反応性 試 料 ( ED50、nM） （溶出塩濃度、mM） ───────── IST-1 IST-2 ─────────────────────────────────── C277 -Met-H271 176 300 有 有 CHV-179 176 300 有 有 CHV-90 176 150 無 無 CHV-89 176 300 有 有 ───────────────────────────────────
【００３１】実施例４ 次に本発明のポリペプチドの生理活性を示す。 （１）ガン転移抑制作用 C57BL/6 マウス（１群５匹）にB16-BL6 メラノーマ細胞
３×１０4 個と本発明のポリペプチド１０００μｇを静
脈内に注入する（細胞とポリペプチドをＰＢＳ中で混合
し、その０．０５ｍｌを静注する）。対照としてメラノ
ーマ細胞のみを静注し、対照群とする。メラノーマ細胞
移植後１４日目に肺を摘出して、肺表面における転移結
節数を実体顕微鏡を用いて測定する。その結果を表２に
示す。
３×１０4 個と本発明のポリペプチド１０００μｇを静
脈内に注入する（細胞とポリペプチドをＰＢＳ中で混合
し、その０．０５ｍｌを静注する）。対照としてメラノ
ーマ細胞のみを静注し、対照群とする。メラノーマ細胞
移植後１４日目に肺を摘出して、肺表面における転移結
節数を実体顕微鏡を用いて測定する。その結果を表２に
示す。
【００３２】
【表２】 表 ２ ─────────────────────────────────── 投与量 肺への転移数 μｇ／マウス 平均±ＳＤ ─────────────────────────────────── 対 照 − ４５±７ ＣＨＶ−８９ １０００ １２±９ ＣＨＶ−９０ １０００ １１±５ ＣＨＶ−１７９ １０００ ４±３ ───────────────────────────────────
【００３３】以上のように、本発明のポリペプチド投与
群で、メラノーマの肺転移が抑制されている。
群で、メラノーマの肺転移が抑制されている。
【００３４】（２）急性毒性試験 C57BL/6 マウスにＣＨＶ−８９、ＣＨＶ−９０、ＣＨＶ
−１７９をそれぞれ静脈内投与した。１００ｍｇ／ｋｇ
において毒性は認められなかった。
−１７９をそれぞれ静脈内投与した。１００ｍｇ／ｋｇ
において毒性は認められなかった。
【００３５】実施例５ 次に、本発明のポリペプチドの製剤例を示す。なお各例
において、部は重量部を意味する。
において、部は重量部を意味する。
【００３６】製剤例１ ＣＨＶ−８９ ３０部に対しＰＢＳを加え、全量を２０
００部としてこれを溶解後、ミリポアフィルターＧＳタ
イプを用いて除菌ろ過する。このろ液２ｇを１０ｍｌの
バイアル瓶にとり凍結乾燥し、１バイアルに該ポリペプ
チド３０ｍｇを含む凍結乾燥注射剤を得た。
００部としてこれを溶解後、ミリポアフィルターＧＳタ
イプを用いて除菌ろ過する。このろ液２ｇを１０ｍｌの
バイアル瓶にとり凍結乾燥し、１バイアルに該ポリペプ
チド３０ｍｇを含む凍結乾燥注射剤を得た。
【００３７】製剤例２ ＣＨＶ−９０ ３０部に対しＰＢＳを加え、全量を２０
００部としてこれを溶解後、ミリポアフィルターＧＳタ
イプを用いて除菌ろ過する。このろ液２ｇを１０ｍｌの
バイアル瓶にとり凍結乾燥し、１バイアルに該ポリペプ
チド３０ｍｇを含む凍結乾燥注射剤を得た。
００部としてこれを溶解後、ミリポアフィルターＧＳタ
イプを用いて除菌ろ過する。このろ液２ｇを１０ｍｌの
バイアル瓶にとり凍結乾燥し、１バイアルに該ポリペプ
チド３０ｍｇを含む凍結乾燥注射剤を得た。
【００３８】製剤例３ ＣＨＶ−１７９ ３０部に対しＰＢＳを加え、全量を２
０００部としてこれを溶解後、ミリポアフィルターＧＳ
タイプを用いて除菌ろ過する。このろ液２ｇを１０ｍｌ
のバイアル瓶にとり凍結乾燥し、１バイアルに該ポリペ
プチド３０ｍｇを含む凍結乾燥注射剤を得た。
０００部としてこれを溶解後、ミリポアフィルターＧＳ
タイプを用いて除菌ろ過する。このろ液２ｇを１０ｍｌ
のバイアル瓶にとり凍結乾燥し、１バイアルに該ポリペ
プチド３０ｍｇを含む凍結乾燥注射剤を得た。
【００３９】製剤例４ ＣＨＶ−８９ ５０部、乳糖６００部、結晶セルロース
３３０部及びヒドロキシプロピルセルロース２０部をよ
く混和し、ロール型圧縮機（ローラーコンパクター）を
用いて圧縮し、破砕して１６〜６０メッシュの間に入る
ように篩過し、顆粒とした。
３３０部及びヒドロキシプロピルセルロース２０部をよ
く混和し、ロール型圧縮機（ローラーコンパクター）を
用いて圧縮し、破砕して１６〜６０メッシュの間に入る
ように篩過し、顆粒とした。
【００４０】製剤例５ ＣＨＶ−９０ ５０部、乳糖６００部、結晶セルロース
３３０部及びヒドロキシプロピルセルロース２０部をよ
く混和し、ロール型圧縮機（ローラーコンパクター）を
用いて圧縮し、破砕して１６〜６０メッシュの間に入る
ように篩過し、顆粒とした。
３３０部及びヒドロキシプロピルセルロース２０部をよ
く混和し、ロール型圧縮機（ローラーコンパクター）を
用いて圧縮し、破砕して１６〜６０メッシュの間に入る
ように篩過し、顆粒とした。
【００４１】製剤例６ ＣＨＶ−１７９ ５０部、乳糖６００部、結晶セルロー
ス３３０部及びヒドロキシプロピルセルロース２０部を
よく混和し、ロール型圧縮機（ローラーコンパクター）
を用いて圧縮し、破砕して１６〜６０メッシュの間に入
るように篩過し、顆粒とした。
ス３３０部及びヒドロキシプロピルセルロース２０部を
よく混和し、ロール型圧縮機（ローラーコンパクター）
を用いて圧縮し、破砕して１６〜６０メッシュの間に入
るように篩過し、顆粒とした。
【００４２】
【発明の効果】本発明によりＦＮのヘパリン結合ドメイ
ン由来のポリペプチド部の構造が異なり、細胞接着活性
とガン転移抑制活性の両活性を合せ持つ新規低分子ポリ
ペプチド、並びにそれらをコードする核酸、及びそのＤ
ＮＡを用いる該ポリペプチドの遺伝子工学的な製造方法
が提供される。このポリペプチドは遺伝子工学的に大量
に供給可能であり、創傷治癒等種々の分野で有用な新規
タンパク質である。
ン由来のポリペプチド部の構造が異なり、細胞接着活性
とガン転移抑制活性の両活性を合せ持つ新規低分子ポリ
ペプチド、並びにそれらをコードする核酸、及びそのＤ
ＮＡを用いる該ポリペプチドの遺伝子工学的な製造方法
が提供される。このポリペプチドは遺伝子工学的に大量
に供給可能であり、創傷治癒等種々の分野で有用な新規
タンパク質である。
【配列表】
【図１】プラスミドpCHV179 、pCHV89、及びpCHV90をそ
れぞれ構築するための工程図である。
れぞれ構築するための工程図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 君塚 房夫 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内
Claims (6)
- 【請求項１】 下記一般式（化１）： 【化１】Ａ−（Ｂ）ｍ−（Ｃ）ｎ （式中Ａは配列表の配列番号１で表されるポリペプチ
ド、Ｂは配列表の配列番号２で表されるポリペプチド、
Ｃは配列表の配列番号３で表されるポリペプチド、ｍ、
ｎはそれぞれ１又は０の数を示す。但しｍ、ｎの和は１
以上である）で表されることを特徴とする機能性ポリペ
プチド。 - 【請求項２】 請求項１記載の機能性ポリペプチドを含
有することを特徴とするガン転移抑制剤。 - 【請求項３】 請求項１記載の機能性ポリペプチドをコ
ードする核酸。 - 【請求項４】 請求項１記載の機能性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡを組込んだプラスミド。 - 【請求項５】 請求項４記載のプラスミドを導入した形
質転換体。 - 【請求項６】 請求項５記載の形質転換体を培養し、該
培養物より請求項１記載の機能性ポリペプチドを採取す
ることを特徴とする機能性ポリペプチドの製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3-117886 | 1991-04-23 | ||
| JP11788691 | 1991-04-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05271291A JPH05271291A (ja) | 1993-10-19 |
| JP2729712B2 true JP2729712B2 (ja) | 1998-03-18 |
Family
ID=14722664
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3238935A Expired - Fee Related JP2729712B2 (ja) | 1991-04-23 | 1991-08-27 | 機能性ポリペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2729712B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005019450A1 (ja) | 2003-08-22 | 2005-03-03 | Takara Bio Inc. | 細胞傷害性リンパ球の製造方法 |
| WO2007020880A1 (ja) | 2005-08-17 | 2007-02-22 | Takara Bio Inc. | リンパ球の製造方法 |
| WO2007040105A1 (ja) | 2005-09-30 | 2007-04-12 | Takara Bio Inc. | Ｔ細胞集団の製造方法 |
| EP2070542A2 (en) | 2001-08-15 | 2009-06-17 | Takara Bio Inc. | Method of extended culture of antigen-specific cyotoxic T lymphocytes |
| EP2305796A1 (en) | 2002-03-25 | 2011-04-06 | Takara Bio Inc. | Process for producing cytotoxic lymphocytes |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0119476D0 (en) * | 2001-08-09 | 2001-10-03 | Novartis Forschungsstiftlung Z | Anti-tumour agents and method of identifying anti-tumour agents |
| FR2857598A1 (fr) * | 2003-07-18 | 2005-01-21 | Inst Nat Sante Rech Med | Composes anti-angiogeniques, composition pharmaceutique les comprenant, et leur utilisation |
| BR112013015213B1 (pt) * | 2010-12-16 | 2021-11-03 | Merck Patent Gmbh | Uso de um meio de cultura de células seco granulado |
-
1991
- 1991-08-27 JP JP3238935A patent/JP2729712B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2070542A2 (en) | 2001-08-15 | 2009-06-17 | Takara Bio Inc. | Method of extended culture of antigen-specific cyotoxic T lymphocytes |
| US7910368B2 (en) | 2001-08-15 | 2011-03-22 | Takara Bio Inc. | Method of extended culture for antigen-specific cytotoxic lymphocytes |
| EP2305796A1 (en) | 2002-03-25 | 2011-04-06 | Takara Bio Inc. | Process for producing cytotoxic lymphocytes |
| EP2305793A1 (en) | 2002-03-25 | 2011-04-06 | Takara Bio Inc. | Process for producing cytotoxic lymphocytes |
| US8975070B2 (en) | 2002-03-25 | 2015-03-10 | Takara Bio Inc. | Process for producing cytotoxic lymphocyte |
| WO2005019450A1 (ja) | 2003-08-22 | 2005-03-03 | Takara Bio Inc. | 細胞傷害性リンパ球の製造方法 |
| US8927273B2 (en) | 2003-08-22 | 2015-01-06 | Takara Bio Inc. | Process for producing cytotoxic lymphocytes |
| WO2007020880A1 (ja) | 2005-08-17 | 2007-02-22 | Takara Bio Inc. | リンパ球の製造方法 |
| US8765469B2 (en) | 2005-08-17 | 2014-07-01 | Takara Bio Inc. | Method of producing lymphocytes |
| WO2007040105A1 (ja) | 2005-09-30 | 2007-04-12 | Takara Bio Inc. | Ｔ細胞集団の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05271291A (ja) | 1993-10-19 |
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