KR101801454B1 - 환형의 수용체-연관된 단백질(ｒａｐ) 펩티드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대체로 저밀도 지단백질 수용체 연관된 단백질(RAP)의 수용체 선택적인 변이체 및 이의 조성물, 이러한 변이체의 생성 방법 및 이러한 수용체 선택적 RAP 변이체 조성물을 치료 목적을 위해 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

환형의 수용체-연관된 단백질(ＲＡＰ) 펩티드{CYCLIC RECEPTOR-ASSOCIATED PROTEIN(RAP) PEPTIDES}

본 출원은 2007년 3월 21 출원된 U.S. 가출원 제60/919,238호를 우선권으로 주장하며, 이를 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다.

-기술분야-

본 발명은 저밀도 지단백질 수용체-연관된 단백질(RAP)의 환형 펩티드와, 이의 유사체, 이의 조성물을 포함하여, 이러한 환형 RAP 펩티드의 생성 방법 및 사용 방법에 관한 것이다.

수용체-연관된 단백질(RAP)는 알파-2-마크로글로불린/저밀도 지단백질 수용체-관련된 단백질-연관된 단백질 1(Uniprot 수탁번호 P30533, Pfam 수탁번호PF06400 및 PF06401)이라고도 알려져 있으며, 저밀도 지단백질 수용체(LDLR) 패밀리의 거의 모든 구성원에 결합하는 고유한 39kD 단백질이다. 소포체 및 골지체에 위치하는 경우(Bu and Schwartz , Trends Cell. Biol. 8(7):272-6, 1998), RAP는 상기 패밀리 구성원에 대한 샤페론으로서 작용한다. 예를 들어, RAP는 이러한 구역에서 LRP에 단단히 결합하여 공동 발현된 리간드와 수용체의 미성숙한 연합을 방지한다(Herz and Willnow, Atherosclerosis 118 Suppl:S37-41, 1995).

신호 서열을 포함하는 전체 길이의 인간 RAP는 그 길이가 357 아미노산이다. 성숙한 RAP는 323 아미노산을 포함하는데, 이 중 마지막의 4 아미노산(HNEL)은 소포체 체류 신호를 구성한다. RAP는 3개의 약한 상동성 도메인(d1, d2 및 d3)으로 구성되어 있다고 보고된 바 있다. 이들 모든 3 도메인은 LRP에 결합하는데, d3이 최고의 친화력으로 결합한다. 여러 공개 문헌에서 RAP의 3 도메인 경계에 대해 약간 상이하게 지정하여 보고하고 있는데(잔기 1-100, 101-200 및 201-323, 또는 18-112, 113-218 및 219-323), 이들 도메인은 약간씩 다른 결합 특징을 갖는 것으로 나타난다. 예를 들어, d1은 알파-2-마크로글로불린이 LRP에 결합하는 것을 억제하는 것으로 보고된 반면, d3은 LRP의 적절한 폴딩을 촉진하는 것으로 보고되었다(Obermoeller et al., J. Biol. Chem. 272(16):10761-100768 (1997) 참조). 대안적으로, 문헌 [Medved et al., J. Biol. Chem., 274(2):717-727 (1999)]에는 4-도메인으로 지정하여 보고하고 있다(잔기 1-92, 93-163, 164-216 및 217-323).

RAP의 절단형 및/또는 돌연변이형이 연구되었다. 문헌 [Melman et al., J. Biol.. Chem., 276(31):29338-29346 (2001)]에서는 성숙한 RAP의 잔기 221-323, 221-275, 276-323, 221-290, 221-300 및 221-310을 포함하는 다수의 GST/RAP 단편 융합체의 생성 방법이 보고되어 있는데, 이들은 모두 LRP에 대한 결합 친화력이 없거나 낮은 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터, Melman 등은 잔기 201-210이 높은 친화력의 LRP 결합에 필요하다고 결론내렸다. Melman 등은 또한 위치 203-206(A 부위), 282-289(B 부위) 및 314-319(C 부위) 내 돌연변이를 포함하는 RAP 돌연변이체를 제조하였는데; A 부위 단독 또는 B 부위 단독에서의 돌연변이는 LRP 결합 활성에 대해 소량의 감소가 일어난 반면, A 부위와 B 부위 양쪽에서의 돌연변이는 LRP 결합 활성을 상당히 감소시켰다. Medved 등(상동)은 2개의 GST/RAP C 말단 단편 융합체를 제조하였는데, 하나는 성숙한 RAP의 잔기 216-323으로 이루어지고, 다른 하나는 잔기 206-323으로 이루어 진 것이다. 문헌 [Rall et al., J. Biol. Chem., 273(37):24152-24157 (1998)]에는 성숙한 RAP를 다양한 단편으로 단백질 가수분해 절단하고 잔기 223-323을 고도의 프로테아제 내성 영역으로 동정하였음이 보고되어 있다. 문헌 [Obermoeller et al., 상동]은 또한 성숙한 RAP의 잔기 191-323으로 구성된 RAP 단편을 제조하고 LRP의 다양한 도메인과의 결합 상호작용성을 연구하였다. 문헌 [McCormick et al., Biochemistry, 44:5794-803 (2005)]에서는 RAP의 잔기 221-323을 포함하는 GSP/RAP 단편을 제작하고 소포체 샤페론 ERp57에 대한 이의 결합성을 평가하였다. 문헌 [Andersen et al., Biochemistry 42, 9355-64 (2003)]에서는 apoE 수용체 2에 대한 결합성에 대해서 RAP 도메인 단편을 시험하고 제3(잔기 216-323) 도메인만이 결합하였음이 보고되어 있다. 문헌 [Andersen et al., J Biol Chem 275, 21017-24 (2000)]에서는 LRP의 다양한 단편에 대한 결합성에 대해서 RAP d3(잔기 216-323)을 시험하였다. 문헌 [Andersen et al., Biochemistry 40, 15408-17 (2001)]는 또한 잔기 219-309에 대해 C-말단에서 절단된 RAP d3의 변이체에 대하여, 유비퀴틴(U-CR56)에 융합된 LRP 단편에 대한 이의 결합능을 시험하였고, U0CR56에 대한 치화력이 상당히 감소한다는 것을 관찰하였다. 문헌 [Lee et al. Mol Cell 22, 423-30 (2006)]에서는 각각의 보존 히스티틴을 알라닌으로 돌연변이시키고, 도메인 1의 모든 히스티틴을 알라닌으로 돌연변이시키며, 도메인 2의 모든 히스티틴을 알라닌으로 돌연변이시키고, 및 도메인 3의 모든 히스티틴을 알라닌으로 돌연변이시켜서 전체 길이 RAP의 돌연변이체들을 제작하였다. 문헌 [Migliorini et al., J Biol Chem 278, 17986-92 (2003)]에서는 RAP의 잔기 206-323 내에 무작위 돌연변이를 갖는 클론을 포함하는 라이브러리를 제작하였고, RAP의 256 위치 라이신 또는 270 위치의 라이신에서의 돌연변이가 LRP에 대한 RAP의 결합성을 소멸시킨다고 보고하고 있다.

지단백질 수용체-관련된 단백질(LRP) 수용체 패밀리는 광범위한 생리적 현상을 매개하는 세포 표면의 막관통(transmembrane) 단백질 군을 포함한다. 상기 모든 수용체는 LDLR에 상동성을 가지며 유사한 도메인 구성을 공유하는데, LDL 수용체 클래스 A 도메인, 또는 거대한 보존 단백질 서열 패밀리의 일부인 보체-형 반복부(CR)를 포함한다. 이러한 패밀리 구성원에 대한 구조 데이타는 CR 서열이 특징적인 폴드, LDL 수용체 유사 모듈(Structural Classification of Proteins, SCOP, 용어)을 채택한다는 것을 시사한다. CR 서열은 LDLR 패밀리 및 II형 막관통 세린 프로테아제(매트립타제) 패밀리를 포함하여 다양한 여러 유형의 단백질에서 발견된다.

LRP 패밀리 구성원의 작용 기전은 결합된 리간드의 세포내이입(endocytosis)과 세포외 공간으로부터의 신호 전달 둘 모두를 포함한다(1). LRP는 이에 제한되는 것은 아니나 지단백질의 대사(2,3), 매트릭스 메탈로프로테아제 및 응고 인자의 조절(4-6), 세포 운명의 지정(3,7), 신경 세포 이동 안내(7,8), 종양 세포의 증식 유도(9,10), 리노바이러스의 결합(11,12), 신경전달물질에 의한 신호화(13,14), 항원 개시 세포에 의한 항원 획득(15), 혈뇌 장벽을 가로지르는 리간드의 트랜스사이토시스(transcytosis)(16-19), 사구체 여과물로부터 단백질 회수(20), 내분비 호르몬의 전달(21), 뇌로부터 아밀로이드 β 펩티드 유출(22), 골침착 활성화(23) 및 내피 세포 증식 조절(24)을 포함한, 다양한 세포 기능에 관여한다. 다양한 역할을 하는 LDLR의 능력은 부분적으로는 이들 수용체가 결합할 수 있는 리간드 세트가 다양한데서 연유한다. 상기 수용체 패밀리의 다른 특징은 각 LDLR의 다양하고, 때때로 고유한 조직 분포 패턴이다.

II형 막관통 세린 프로테아제 패밀리는 코린 및 매트립타제(매트립타제) ST14, 매트립타제-2 및 매트립타제-3을 포함한다. 매트립타제(MT-SP1, ST14, TADG-15)는 다양한 상피 종양(암종)에서 과발현된다(25-33). 간세포 활성인자 억제제-1(HAI-1)에 의해 촉진된 트랜스활성화(transactivation) 후에, 매트립타제는 세포외 매트릭스 성분을 직접적으로 분해시키거나 또는 다른 프로테아제, 예컨대 우로키나제 플라스미노겐 활성인자(uPA)를 활성화시켜, 매트릭스 분해 사건을 일으켜서 종양 성장 및 전이를 촉진시킨다(26, 34, 35). LDLR 및 매트립타제 패밀리 이외에도, 다양한 다른 단백질이 CR 도메인을 갖는다. 이러한 단백질 중 하나인 FDC-8D6 항원(CD320)은 이러한 도메인 쌍을 가지며 림프 소낭 내 B 세포 분화에서 중요한 역할을 한다(36, 37).

CR 함유 단백질이 병리 생리학적 프로세스에서 수행하는 중요한 역할과 함께 이들 패밀리의 일부 구성원의 고유한 조직 분포 프로파일로 인해 이들 단백질은 유용한 약물 표적이 된다. 단백질 선택적 약물은 표적화된 단백질의 기능에 직접적으로 영향을 주고, 그 단백질이 특정한 병태에 대해 갖는 지속 효과를 감소시킬 수 있다. 다르게, 상기 약물은 질병에 영향받는 특정 조직에 다른 치료 분자를 효과적으로 전달하도록 표적화된 단백질의 조직 분포를 이용할 수 있다. 포유류의 생리학 및 병리 생리학에서 CR 함유 단백질이 중요하다는 상당한 증거에도 불구하고, LDLR 또는 CR 함유 단백질 패밀리의 특정 구성원에 대해 선택적으로 작용하는 약물의 예는 드물다. 이들 패밀리의 특정 구성원에 결합하는 분자를 생성하는 능력은 이러한 약물을 개발하는 수단을 제공한다.

예를 들어, WO 2006/138343(Zankel et al.)은 RAP(혈뇌 장벽을 통과)와 GDNF의 융합으로 GDNF의 이황화 결합된 단독이량체 구조를 유지하는 접합체가 생성되었음을 보여주는 데이타를 개시하고 있다. RAP-GDNF 접합체는 GDNF와 동일한 친화력(K_d)으로 GDNF의 수용체(GFRα-1)에 결합하고 활성화되며, 배양중인 PC12 세포에서 RAP-GDNF 유도된 뉴라이트 과성장으로 증명된 바와 같이 시험관 내 생물학적 활성을 유지한다.

포유류의 생리학 전반에서 CR 함유 단백질의 광범위한 참여로 인해, RAP의 고유한 결합 특징을 보유하거나, 또는 특정한 CR 함유 단백질에 대한 개선된 결합 선택성을 갖고, 또한 예컨대 개선된 안정성이나 생성 및 제조 용이함 등의 다른 바람직한 특성을 나타내는 RAP 단편 또는 변이체에 대한 요구가 존재한다.

-발명의 요약-

보체형 반복부(CR)는 특징적인 폴드를 채택한 보존성 단백질 서열의 거대 패밀리이다. CR 함유 단백질은 LDL 수용체 패밀리, II형 막관통 세린 프로테아제(매트립타제) 패밀리의 구성원, 및 다른 단백질 예컨대 FDC-8D6 항원(CD320)을 포함한다. 수용체 연관된 단백질(RAP)은 높은 친화력으로 다양한 이들 CR 함유 단백질에 결합한다. 성숙한 RAP의 323 아미노산 서열을 서열 번호 95에 나타내었다. 길이가 123 아미노산인, 성숙한 RAP의 도메인 3의 아미노산 서열(아미노산 201-323)은 서열 번호 96에 나타내었다. 아미노산 243-313은 서열 번호 97에 나타내었다. RAP의 아미노산 249-303은 서열 번호 98에 나타내었다.

본 발명은 높은 친화력으로 CR 함유 단백질에 결합하는 환형 RAP 펩티드(유사체 또는 유도체 포함), 이러한 환형 펩티드를 포함하는 접합체 및 조성물, 및 이러한 펩티드의 치료 및 진단 용도, 예를 들어 CR 함유 단백질의 억제제 또는 보강제로서의 용도, 또는 CR 함유 단백질을 발현하는 조직에 진단제 또는 치료제를 표적 전달하기 위한 용도 등을 제공한다. 환형 RAP 펩티드는 예컨대 CR 함유 단백질에 대한 개선된 친화력, 개선된 결합 선택성, 개선된 안정성 및/또는 제조 용이성 등의 바람직한 특성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 환형 RAP 펩티드는 성숙한 RAP의 아미노산 서열, 바람직하게는 도메인 3을 주성분으로 하며, 바람직하게는 길이가 123 아미노산보다 짧고 2개의 비보존 아미노산 사이에 공유 결합을 포함한다. 일 구체예에서, 공유 결합은 RAP 펩티드의 3차 구조를 안정화시킨다. 일 구체예에서, 공유 결합은 결합 친화력을 개선시켜 환형 RAP 펩티드가 약 1 x 10^-8 M 또는 그 이하의 Kd(보다 낮은 것이 보다 좋은 친화력을 의미함)로 CR 함유 단백질에 결합하게 된다. 이러한 결합 친화력은 당분야에 공지된 임의 방법, 예컨대 방사성 면역 분석법, ELISA, 표면 플라스몬 공명(SPR) 기반 기법(예를 들어, 비아코아) 분석법 또는 역학 배제 분석법(예를 들어, KinExA) 등으로 측정할 수 있다. 친화력 데이타는 예를 들어 문헌 [Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949)]의 방법으로 분석할 수 있다. 예시적인 구체예에서, CR 단백질에 대한 결합 친화력은 약 1 x 10^-9, 10^-10, 10^-11, 10^-12, 10^-13, 10^-14 M 또는 그 이하이다. 본 발명은 약 103, 약 99, 약 95, 약 90, 약 85, 약 82, 약 80, 약 78, 약 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57 또는 56 아미노산 길이 또는 그 이하의 길이를 포함하여, 다양한 크기의 환형 RAP 펩티드를 제공한다. 일 구체예에서, 공유 결합은 약 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57 또는 56 아미노산 만큼 떨어진 아미노산 간에 형성된다.

본 발명의 환형 RAP 펩티드는 성숙한 인간 RAP 서열(서열 번호 95)을 기초로 하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 환형 RAP 펩티드의 아미노산 서열은 성숙한 RAP의 N 말단으로부터 200 이상, 최대 243 아미노산이 생략된다. 따라서, 환형 RAP 펩티드는 성숙한 RAP의 아미노산 1-200, 1-220, 1-225, 1-230, 1-235, 1-240, 1-241, 1-242, 1-243, 또는 다르게는 1-244, 1-245, 1-246, 1-247 또는 1-248을 생략한다. 관련 구체예에서, RAP 펩티드 아미노산 서열은 성숙한 RAP의 C 말단으로부터 4 이상, 최대 11 아미노산을 더욱 생략한다. 그에 따라, 환형 RAP 펩티드는 성숙한 RAP의 아미노산 314-323 또는 313-323, 또는 다르게는 304-323, 305-323, 306-323, 307-323, 308-323, 309-323, 310-323, 311-323 또는 312-323을 생략할 수 있다. 다른 구체예에서, RAP 펩티드 아미노산 서열은 (a) 길이가 71 아미노산 이상이고 (b) 아미노산 256-270을 포함하는 성숙한 RAP의 연속 부분을 포함한다. 관련 구체예에서, RAP 펩티드 아미노산 서열은 (a) 길이가 71 아미노산 이상이고 (b) 아미노산 256-270을 포함하는 성숙한 RAP 도메인 3의 연속 부분을 포함한다. 환형 RAP 펩티드에 대한 기준물을 형성할 수 있는 예시적인 RAP 부분은 성숙한 RAP(서열 번호 95)의 아미노산 200-323, 221-323, 200-319, 221-319, 243-319, 244-319, 249-319, 200-313, 221-313, 243-313, 244-313, 249-313, 200-303, 221-303, 243-303, 244-303, 246-311, 246-313 또는 249-303을 포함한다.

본 명세서에서 기술한 바와 같이, 천연 RAP와 유사한 CR 함유 단백질에 대한 선택성 및 친화력을 나타내는 환형 RAP 펩티드를 제조할 수 있다(예를 들어, 천연 RAP와 비교하여 약 5배 편차 또는 그 이하). 또한 천연 RAP와 비교하여 하나 이상의 CR 함유 단백질에 대하여 개선된 친화력 및/또는 변경된 선택성을 나타내는 환형 RAP 펩티드를 제조할 수 있다. 일 구체예에서, 환형 RAP 펩티드는 LDLR (P01130), LRP1 (P98157), LRP1B (Q9NZR2), LRP2 (P98164), LRP3 (O75074), LRP4 (O75096), LRP5 (O75197), LRP6 (O75581), LRP8 (Q14114), 소르틸린 관련 수용체, SorLA (Q92673), LRP10 (Q7Z4F1), LRP11 (Q86VZ4), LRP12 (Q9Y561), FDC-8D6 (CD320), VLDLR (P98155), TADG-15 (ST14, Q8WVC1), TMPS3 (P57727), TMPS4 (Q9NRS4), TMPS6 (Q8IU80), Q6ICC2, Q6PJ72, Q76B61, Q7RTY8, Q7Z7K9, Q86YD5, Q8NAN7, Q8NBJ0, Q8WW88, Q96NT6, Q9BYE1, Q9BYE2, Q9NPF0 및 코린 (Q8IZR7)으로 이루어진 군에서 선택된 CR 함유 단백질에 대해 개선된 결합 선택성 및/또는 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배, 5배, 7배, 10배 또는 20배 이상으로 개선된 친화력(천연 RAP에 대해서)을 나타낸다. 이러한 결합 선택성은 예를 들어, 하나 이상의 다른 CR 함유 단백질에 대한 펩티드의 결합 친화력에 대한 특정 CR 함유 단백질의 펩티드 결합 친화력의 비율을 통해서 계산할 수 있다. 상기 펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 다른 CR 함유 단백질에 대하여 CR 함유 단백질에 대한 결합 선택성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 환형 RAP 펩티드는 천연 RAP 서열을 포함하거나 또는 천연 서열에 돌연변이를 포함할 수 있다. 예시적인 구체예에서, 본 발명의 환형 RAP 펩티드는 서열 번호 97 또는 서열 번호 98에 대한 서열 동일성이 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 환형 RAP 펩티드는 길이가 약 85 아미노산보다 짧고, 서열 번호 98에 대한 서열 동일성이 70% 이상인 인접한 50 아미노산을 포함하고, 약 1 x 10^-8 M 또는 그 이하의 K_d로 CR 함유 단백질에 결합한다. 일 구체예에서, 환형 RAP 펩티드는 성숙한 RAP의 아미노산 200-319, 300-319 또는 247-257에서 선택된 어느 하나의 영역 내 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 또는 그 이상의 위치에 돌연변이를 포함한다. 예시적인 구체예에서, 환형 RAP 펩티드는 성숙한 RAP(서열 번호 95)의 175, 205, 213, 217, 226, 230, 232, 239, 241, 242, 246, 247, 249, 250, 251, 256, 257, 261, 266, 267, 268, 270, 273, 279, 280, 287, 290, 294, 296, 297, 298, 305, 308, 311, 312, 313, 314 또는 315로 이루어진 군에서 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 위치에 돌연변이를 포함한다. 다른 구체예에서, 환형 RAP 펩티드는 205, 217, 249, 251, 256, 257, 266, 270, 294, 296, 297, 305 위치 중 3 또는 그 이상에 돌연변이를 포함한다. 일 구체예에서, 환형 RAP 펩티드는 성숙한 RAP의 251, 256 및 270 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.

일 측면에서, 환형 RAP 펩티드는 매트립타제 단백질에 선택적으로 결합한다. 매트립타제 특이적 펩티드는 성숙한 RAP(서열 번호 95)의 아미노산 243-313 또는 249-303을 포함하고, 또한 성숙한 RAP의 251, 256, 257, 266, 270 또는 280 위치 중 임의의 한 위치에 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 고려한다. 또한, 매트립타제 특이적 RAP 펩티드가 성숙한 RAP의 251, 256, 257, 266, 270 및/또는 280 위치에 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 고려한다.

다른 측면에서, 환형 RAP 펩티드는 VLDLR 단백질에 특이적으로 결합한다. VLDLR 특이적 펩티드는 성숙한 RAP(서열 번호 95)의 아미노산 243-313 또는 249-303을 포함하고, 또한 RAP의 251, 256, 270 또는 296 중 임의의 한 위치에 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 고려한다. 또한, VLDLR 특이적 RAP 펩티드는 성숙한 RAP의 251, 256, 270 및/또는 296 위치에 1, 2, 3 또는 4 이상의 돌연변이를 포함하게 된다는 것을 고려한다.

추가 측면에서, 환형 RAP 펩티드는 FDC-8D6(CD320) 단백질에 선택적으로 결합한다. FDC-8D6 특이적 펩티드는 성숙한 RAP(서열 번호 95)의 아미노산 243-313 또는 249-303을 포함하고, 또한 RAP의 251, 256, 270, 279 또는 305 위치 중 임의의 한 위치에 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 고려한다. 또한, FDC-8D6 특이적 RAP 펩티드는 성숙한 RAP의 251, 256, 270, 279 및 305 위치에 1, 2, 3, 4 또는 5 이상의 돌연변이를 포함한다는 것을 고려한다.

전술한 임의의 돌연변이는 산성 그룹의 아미노산(D, E)을 염기성 그룹의 아미노산(K, R)으로 치환, 또는 그 역으로의 치환을 포함할 수 있다. 전술한 임의의 돌연변이는 또한 (A, C, D, E, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V) 그룹으로부터의 아미노산을 (F, Y, W, H) 그룹으로부터의 아미노산으로 치환을 포함할 수 있다. 추가 구체예에서, 환형 RAP 펩티드는 성숙한 RAP(서열 번호 95)와 비교하여 V175L, R205S, S213T, E217K, L226M, H249Y, E230V, S232P, E239G, E246G, E251L, E251K, E251T, E251G, E251P, E251N, E251R, K256R, K256V, K256A, K256I, K256P, K256L, I266F, I266T, K257Y, Q261R, A267V, H268R, K270P, K270D, K270N, K270G, K270E, K270W, L271M, H273Y, D279Y, V283M, R287H, H290Y, H290L, E294V, R296L, T297I, K298R, K305T, K306M, S312F, G313D, E246C, L247G, G280A, L311A, S312C, Q309C, F250C, L308G, L311G, E241C 및 I315C의 돌연변이 중 3, 4, 5, 6 또는 그 이상을 포함한다.

전술한 임의의 구체예에서, RAP 펩티드는 펩티드의 N 말단 또는 그 근처에 시스테인, 및 펩티드의 C 말단 또는 그 근처에 시스테인을 포함하여, 상기 2 시스테인간에 이황화 결합 형성을 통해서 알파-나선의 안정화와 펩티드의 고리화를 가능하게 할 수 있다. 경우에 따라서, 글리신 또는 프롤린이 시스테인과 알파 나선 사이에 위치할 수 있다(예를 들어, N 말단에 Cys-Gly 및 C 말단에 Gly-Cys). 글리신의 도입은 인접한 비천연 내부 나선 이황화 결합을 위해서 알파 나선 내에 절단을 가능하게 한다.

본 발명은 또한 본 발명의 환형 RAP 펩티드의 2, 3, 4, 5 또는 6 이상의 올리고머 조합 또는 배열을 고려한다. 이러한 어레이는 동일한 환형 RAP 펩티드의 반복 어레이이거나 상이한 환형 RAP 펩티드의 어레이일 수 있다. 다양한 조합물은 도메인이 동일한 CR 함유 단백질 내에서 상이한 CR 쌍에 결합가능하거나 또는 상이한 CR 함유 단백질의 CR 쌍에 결합가능한 3차 구조로 각각의 환형 RAP를 나타내는 펩티드 링커(예를 들어, 길이가 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산)에 의해 분리되거나 또는 인접할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 진단제 또는 치료제에 접합된 환형 RAP 펩티드(또는 환형 RAP 펩티드의 어레이)를 포함하는 접합체를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 폴리펩티드 및 진단제 또는 치료제는 링커를 통해 연결된다. 추가 구체예에서, 상기 링커는 펩티드 링커이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 접합체는 생체내로 트랜스사이토시스(transcytosis)된다. 예시적인 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드에 연결된 치료제는 아교 세포유래 뉴런 성장 인자(GDNF), 뇌 유래 뉴런 성장 인자(BDNF), 뉴런 성장 인자(NGF) 또는 당 분야에 공지된 다른 신경 성장 인자, 디스인테그린 및 메탈로프로테아제 도메인 10[호모 사피언스] ADAM10, 또는 APP 또는 Aβ에 작용하는 다른 프로테아제, MESD(세포 표면에 수용체를 전달하는데 필요한 LRP5/6을 위한 샤페론 단백질), 암 화학치료제, 프로테아제 억제제, 프로아폽토시스 분자, 자가면역 항원 또는 리소좀 효소로 이루어진 군에서 선택된다. 관련 구체예에서, 환형 RAP 펩티드(또는 환형 RAP 펩티드의 어레이)를 포함하는 접합체는 활성 제제에 접합된다. 추가 구체예에서, 활성 제제는 화학치료제이다. 또 다른 구체예에서, 화학치료제는 방사성 동위원소이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 피험체의 특정 조직에 진단제 또는 치료제를 전달하는 방법으로서, 본 발명의 환형 RAP 펩티드(또는 이의 어레이) 및 상기 제제를 포함하는 접합체를 상기 피험체에게 투여하는 것인 전달 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 환형 RAP에 접합된 진단제 또는 치료제는 상피 또는 내피 장벽을 가로질러 트랜스사이토시스를 통해 특정 조직으로 전달된다. 일 구체예에서, 상기 제제는 혈뇌 장벽을 가로질러 전달된다. 관련 구체예에서, 상기 피험체는 이에 제한되는 것은 아니고, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 다른 탈수초성 관련 질병, 중추 신경계 암, 외상성 뇌손상, 척수 손상, 발작 또는 뇌허혈증, 반(plaque) 경화증, 뇌혈관암, 간질, 헌팅턴병, 투렛 증후군, 길렝 바레 증후군, 윌슨병, 피크병, 신경염증 질환, 뇌염, 바이러스, 진균 또는 박테리아 기원의 뇌척수염 또는 수막염, 또는 다른 중추신경계 감염증, 프라이온 질환, 소뇌성 운동실조, 소뇌성 변성, 척수소뇌성 변성증, 프리드리히형 실조증, 모세혈관확장성 운동실조증, 척수성 근위축증, 비진행성 핵상 마비, 근긴장이상, 근육 강직, 진동(tremor), 색소성 망막염, 노인성 치매, 피질하 치매, 동맥경화성 치매, AIDS 연관성 치매, 또는 다른 치매, 선조체 흑질 변성, 미토콘드리아성 뇌근병증, 신경 세로이드 리포푸신증, 중추신경계 관여 리소좀 보관성 질병, 백질이영양증, 요소 주기 결함 질병, 간성 뇌증, 신장 뇌증, 대사성 뇌증, 포르피린증, 신경독성 화합물에 의한 중독, 방사능 유도된 뇌손상, 또는 정신 질환 예컨대 정신 이상, 불안증, 우울증, 주의력 결핍, 기억 장애, 인지 장애, 식욕 장애, 비만, 중독, 욕구(appetence) 또는 약물 의존증을 포함하는 신경학적 질환을 앓고 있다. 본 발명은 또한 피험체의 특정 조직 내 세포의 리포좀 구획에 치료 단백질을 전달하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명의 환형 RAP 펩티드에 접합된 상기 치료 단백질을 포함하는 접합체의 유효량과 상기 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 피험체는 리포좀 축적병(LSD)을 앓고 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 암 또는 전이의 치료 방법, 또는 CR 함유 단백질과 연관된 종양형성성 또는 전이성 효과를 저하시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 종양형성 CR 함유 단백질에 선택적으로 결합하는 환형 RAP 펩티드(또는 이의 어레이), 또는 상기 환형 RAP 펩티드(이의 어레이)에 접합된 암 치료제를 포함하는 접합체를 피험체에 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 종양형성성 CR 함유 단백질은 이에 제한되는 것은 아니고, LRP5, LRP6, 임의의 매트립타제 또는 FDC-8D6 항원을 포함한다. 본 발명의 환형 RAP 펩티드는 예를 들어, 결합 또는 활성 부위를 차단하여, 기능을 직접적으로 방해하여서 표적 CR 함유 단백질과 연관된 종양형성성 효과를 감소시킬 수 있다. 다르게, 암 치료제에 접합된 본 발명의 환형 RAP를 포함하는 접합체는 항종양제를 사용하여 CR 함유 단백질을 과발현하는 조직을 표적화하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 매트립타제를 과발현하는 조직은 암종, 예를 들어 난소, 자궁경부, 전립선, 유방, 폐, 결장 또는 위 암종을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 간염 또는 간암을 포함하는 간 질환을 치료하기 위해 간에 치료제를 전달하는 방법을 제공한다. 이 방법은 천연 RAP의 결합 특징을 보유하거나 또는 LRP1에 대해 보다 높은 친화력을 가지고 선택적으로 결합하는 환형 RAP 펩티드(또는 이의 어레이)에 접합된 치료제를 포함하는 접합체를 피험체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 이 방법은 간세포 암종 및 다른 간 질환을 치료하기 위해 화학치료제/세포독성 제제를 전달하는 단계를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 골다공증 또는 골아세포 감소 및/또는 파골세포 활성 증가와 관련된 다른 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 LRP에 선택적으로 결합하여 파골세포 활성을 촉진시킬 뿐만 아니라 골아세포 분화 및 골침착에 대해 길항작용을 하는 인자를 억제하는, 환형 RAP 펩티드에 접합된 활성제를 포함하는 접합체 또는 환형 RAP 펩티드를 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 치료 방법은 골아세포를 증가시키고/시키거나 파골세포 활성을 감소시켜서 골손실을 줄이거나 골강화를 촉진할 것으로 기대된다.

관련 측면에서, 본 발명은 진단제 또는 치료제에 접합된 환형 RAP 펩티드를 포함하는 접합체, 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 검출가능한 부위 또는 표지에 접합된 환형 RAP 펩티드를 제공한다. 환형 RAP 펩티드가 특정 CR 함유 단백질에 대한 결합 선택성을 갖는 경우, 이 환형 RAP 펩티드는 이러한 CR 함유 단백질의 존재를 검출하는데 사용할 수 있다. 또한, 예를 들어, 종양형성성과 연관된 과발현을 포함하여, CR 함유 단백질의 발현 패턴을 검출하는데 사용할 수도 있다. 본 발명은 또한, CR 함유 단백질의 과발현 또는 저발현과 연관된 병태를 진단하기 위해 이러한 환형 RAP 펩티드를 사용하는 방법을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 천연적으로 고리화할 수 있거나 또는 공유 결합을 통해 고리화되도록 추가로 화학 변형시킬 수 있는, 재조합 방법을 통해서 또는 합성법을 통해서 RAP 펩티드를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 본 발명은 임의의 전술한 RAP 펩티드를 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 이러한 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주, 및 적절한 배양 배지에서 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 펩티드를 단리하는 단계를 포함하는 상기 펩티드의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 특징 및 장점은 이하의 상세한 설명을 통해 분명해질 것이다. 그러나 상세한 설명과 특정예가 본 발명의 바람직한 구체예를 나타내고 있지만, 상세한 설명을 통해서 본 발명의 범주 내에서 다양한 변화 및 변형이 가능하다는 것은 당분야의 당업자에게 자명하므로, 이는 예시를 위해 제공하는 것임을 이해해야 한다.

도 1은 보체형 반복부의 대표적인 예시도이고, 이는 문헌 [Simonovic et al.](43)에서 확인된 바와 같이, 저밀도 지단백질 수용체 관련된 단백질 1(LRP1 CR7, PDB 1J8E)의 7번째 보체형 반복부의 서열을 기초로 하는 것으로서, A, B, C, D로 표시한 위치의 잔기에 의해 형성된 칼슘 결합 루프 표면을 나타내고 있다. 칼슘은 구형으로 나타내었다.
도 2는 결합 분석법 및 RAP 돌연변이체 또는 CR 항체 선별을 위해 선택한 CR 서열을 정렬한 도면이다. 사용된 특정한 쌍 및 트리플렛은 좌측에 괄호로 나타내었다. 패닝한 기질(LRP2 CR89)은 적색(보다 연한 색상) 괄호로 표시하였다. 정렬부 내의 AxcBxCxD 부위는 각 CR 서열에 대해 위치 A 및 C를 밑줄그어 표시하였다. 각 CR 쌍에 대한 A, C, A' 및 C'에서의 아미노산의 텍스트 줄 연결부는 우측에 나타내었다. 명암처리된 아미노산은 정렬된 위치에서 우세한 아미노산과 동일하고; 굵은 글씨 아미노산은 정렬된 위치에서 우세한 아미노산에 상동성을 갖는다. 서열은 Clustal W(44)로 정렬하고 BOXSHADE를 사용하여 포맷하였다.
도 3은 CR 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 도면이다. 정제하고, 리폴딩한 단백질을 2 mM DTT의 존재 또는 부재하에서 SDS 로딩 완충제 상에서 변성시켰다. 처리된 샘플을 방법에 기재한 바와 같이 12% NuPAGE Bis-Tris 겔 에서 분리하였다. 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다. 시험한 연관된 CR 단백질이 있는 하단에서 각 레인 쌍을 표지화하였다. 분자량 마커 크기를 표시하였다. 대표적인 결과를 도시하였다. 약어: L1은 LRP1임; L2는 LRP2임; L6은 LRP6임; M은 MAT(매트립타제, ST14)임; V는 VLDLR임; YVWR = LRP2 CR89; YVWD = LRP2 CR89 R1088D; YDWR = LRP2 CR89 V1047D; YDWD = LRP2 CR89 V1047D R1088D; WVWR = LRP2 CR89 Y1042W; WDWR = LRP2 CR89 Y1042W V1047D; WVWD = LRP2 CR89 Y1042W R1088D; WDWD = LRP2 CR89 Y1042W V1047D R1088D.
도 4는 100-1.25 nM로부터 제조된 일련의 RAP d3 희석물을 사용하여 선택된 CR 단백질에 대한 RAP d3의 결합을 나타낸 도면이다.
도 5A-B는 LRP2 CR89 및 LRP1 CR3-5에 대한 RAP d3, MegaRAP1 d3(RAPv2A d3) 및 중간 서열 변이체의 결합을 나타낸 도면이다. 도 5A는 LRP2 CR89에 대한 RAP d3 돌연변이체 및 RAPv2A d3 복귀변이체(revertant)의 결합을 나타내는 도면이다. 도 5B는 LRP1 CR3-5에 대한 RAP d3 돌연변이체 및 RAPv2A d3 복귀변이체의 결합을 나타내는 도면이다. 결과는 단일 결합 부위를 가정하여 비선형 회귀법으로 그래프화 및 적합화하였다(GraphPad Prism). 표준 편차를 갖는 K_d 값은 회귀 분석법으로 산출하였다.
도 6은 LRP2 CR89 변이체에 대한 MegaRAP1 d3 및 RAP d3의 결합을 나타내는 도면이다. 도면에서 사용한 약어: LRP2 CR89 Y1042W (WVWR), LRP2 CR89 V1047D (YDWR), LRP2 CR89 R1088D (YVWD), LRP2 CR89 V1047D R1088D (YDWD), LRP2 CR89 Y1042W V1047D R1088D (WDWD), LRP2 CR89 Y1042W V1047D (WDWR), LRP2 CR89 Y1042W R1088D (WVWD).
도 7은 CR 쌍에 대한 RAP d3 변이체의 결합을 나타낸 도면이다. RAP d3, MegaRAP1 d3, VRAP2 d3, MatRAP1 d3 및 MatRAP2 d3을 각각 80 nM 농도에서 LRP1 CR3-5, LRP6 CR12, LRP6 CR23, LRP6 CR1-3, LRP2 CR89, LRP2 CR2728, LRP2 CR3031, LRP2 CR3435, LRP2 CR34-36, VLDLR CR78, VLDLR CR6-8, MAT CR12, MAT CR23 및 MAT CR34와 항온반응시켰다. 샘플을 이중으로 2회 시험하고, 값을 조합하였다. 이어서 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 리간드없이 항온반응시킨 웰에서 얻은 블랭크 값을 사용하여 흡광도 데이타를 보정하였다. 변동 계수(CV)는 시험한 임의 조건에 대해서 20%(평균 6%)를 넘지않았고 이는 도시하지 않았다.
도 8은 본 명세서에서 단리한 RAP d3 변이체의 완전한 아미노산 서열을 도시한 도면이다.
도 9는 C 말단 및 N 말단 양쪽에서 MatRAP1 변이체의 절단이 결합 친화력에 긍정적인 영향을 주는 것을 나타낸 도면이다. 절단형 변이체는 전체 길이 변이체에 대해 기술한 바와 같이 제조하였다.
도 10은 FDC-8D6 항원 유래의 표적 CR 쌍에 대한 320RAP1 및 상응하는 절단형 변이체의 결합을 나타내는 도면이다.
도 11A 및 11B는 각각 rhLRP1 cluster 2 및 rmVLDLR 엑토도메인에 대한 RAP 펩티드의 상대적인 결합을 나타내는 도면이다.
도 12는 LRP 발현 및 LRP 결핍 CHO 세포의 세포 생존능에 대한 독소 접합된 mRAPc의 효과를 나타낸 도면이다.
도 13A, 13B 및 13C는 상이한 세포독성 제제에 접합된 환형 RAP 펩티드, 헵티드의 화학 구조를 나타낸 도면이다.
도 14A, 14B 및 14C는 스트렙타비딘에 접합된 mRAPc 펩티드 및 mRAP에 의해 RAP 및 uPA-PAI-1 결합이 억제됨을 보여주는 도면이다.
도 15는 동물에 정맥 내 투여한 후 환형 RAP 펩티드의 생체내 분포를 나타내는 도면이다.
표 2는 LRP1 CR3-5 및 LRP2 CR89에 대한 RAP d3 및 RAP v2(RAP v2A) 변이체의 결합 데이타를 나타내는 도면이다. NF는 결합을 측정할 수 없거나 또는 단일 결합 부위 가정의 비선형 회귀법으로 신뢰할 만하게 데이타를 적합화할 수 없음을 의미한다. 최대 결합 퍼센트는 각 리간드에 대해 시험한 최고 농도에서의 OD와 그 농도에서 모든 리간드에 대해 측정한 최고 OD의 비율이다.
표 3은 LRP2 CR89 변이체에 대한 RAP d3 및 RAPv2A d3의 결합 데이타를 나타내는 도면이다. NF는 결합을 측정할 수 없거나 또는 단일 결합 부위 가정의 비선형 회귀법을 사용하여 데이타를 신뢰할만하게 적합화할 수 없는 것을 의미한다. 최대 결합 퍼센트는 각 리간드에 대해 시험한 최대 농도에서의 OD와 그 농도에서 모든 리간드에 대해 측정한 최고 OD의 비율이다.
표 4는 상이한 CR 쌍에 대하여 돌연변이체 파지 라이브러리를 패닝하여 분리한 RAP d3 변이체 서열을 도시한 도면이다. 가변 위치만을 나타내었다. 아미노산 번호화는 성숙한 RAP에 대응된다. 변이체 명칭(d3), 친화력-선택을 위해 사용된 CR 쌍(CR), 변이체와 표적 CR 쌍 간 복합체에 대한 분명한 해리 상수(K_d)(측정시), 및 가변 위치에서 아미노산 정체를 도시하였다.

RAP는 기능적으로 이중성인데, 제1 및 제3 도메인(d1 및 d3)의 2 도메인이 모두 낮은 나노몰 친화력으로 LDLR 내 보체형 반복부(CR)의 특정 직렬쌍에 결합한다. 도메인 3은 대략 110 아미노산으로 구성되며, 관련 CR 쌍에 최고의 친화력을 갖는 것으로 확인되었다. 면역원성을 최소화하고, 생산 효율을 최대화하며 효능을 개선시키기 위해, 수용체 결합에 직접적으로 관여하는 서열로 RAP를 최소화시키는 것이 유용하다. 그러나, d3의 안정한 폴딩에는 수용체 접촉면을 형성하는데 직접 관여하지 않는 RAP 내 서열이 필요한 것으로 나타났다. 그에 따라, d3의 N 말단 영역 및 d2의 C 말단 영역 내에서 발견되는 이러한 추가적인 서열은 안정한 폴딩과 높은 친화력 수용체 결합을 보장하기 위해 필수적이다. 단리된 d3은 전체 길이 RAP에서의 d3처럼 수용체에 강하게 결합하지 않는다. 폴딩 안정화 서열이 결여된 d3의 절단형 역시 수용체에 대한 결합이 빈약하다. RAP d3 및 LDLR CR34 간 복합체에서 유도된 구조 데이타에 따르면 RAP d3의 수용체 결합 서열이 탄성 루프에 의해 연결된 대략 동일한 길이의 2개의 역평행 알파 나선 내에서 발견되는 것으로 나타났다. 상기 쌍을 이룬 나선 집합체는 두드러진 시계반대 방향 꼬임을 가지며 신장되고, 꼬여진 "U"와 닮았다.

본 발명은 단일한, 분자내 공유 결합, 예를 들어 이황화 결합에 의해 안정된 RAP d3의 실질적으로 절단된 형태를 제공한다. 분자내 공유 결합이 없는, 절단된, 비환형은 LRP1에 대한 결합 친화력이 감소되었다. 대조적으로, 환형 RAP 펩티드 전체 길이 RAP d3과 구별되지 않는 개선된 수용체 결합 친화력을 가졌다. 천연 RAP에 존재하는 거대한 펩티드 영역 대신, 단일한 비천연 공유 결합을 갖는 RAP d3 단편 내에 3차 나선 구조를 안정화하는 능력이 개선된 친화력을 제공하며 다수의 장점을 부여한다. 본 발명은 예를 들어 재조합 유기체를 필요로 하지 않으면서, 고체상 펩티드 합성 등을 통해 소형 RAP 펩티드를 빠르게 제조할 수 있게 하며, 면역원성을 가능하게 감소시킬 수 있고, 활성 제제에 대한 접합이 상당히 용이하다.

본 발명의 환형 RAP 펩티드는 표적 수용체의 하기 2가지 보편적인 특성을 기초로 하여 가능한 약학 용도를 가지는데, 우선, 다수의 수용체가 질병 상태의 확립 및 진행 중에 그 역할을 갖는다. 따라서, 이러한 수용체에 선택적으로 결합하는 시약을 사용하여 이들을 지지하는 수용체의 양태 및 병리 생리학적 효과를 변경시킬 수 있다. 두번째는, 다수의 수용체가 고유한 조직 분포도를 갖는다는 점이다. 그러므로, 이러한 수용체에 선택적으로 결합하는 시약을 사용하여 표적 수용체가 주로 발현되는 조직에 다른 약물 물질을 선택적으로 전달할 수 있다. 본 발명은 또한 이에 제한되는 것은 아니며, 세포 증식성 질환, 예컨대 신생물성 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 호르몬 이상 질환, 퇴행성 질환, 노화 관련 질환, 중추 신경계 질환(예를 들어, 알츠하이머병, 간질, 고지혈증 등), 정신 질환 및 병태(예를 들어, 정신분열증, 기분 장애 예컨대 우울증 및 불안증), 감염성 질환, 자가면역 질환, 효소 결핍 질환, 리소좀 축적병 예컨대 상기 기술된 질환 등을 포함하는 질환의 예방, 관리 및 치료에서의 이러한 조성물의 용도를 고려한다.

LDLR 패밀리 구성원은 뉴론 및 성상 세포를 포함하는 CNS 세포 유형 및 모세혈관 내피 상에서 많이 발현된다(예를 들어, LDL 수용체, Megalin, LRP1). LDL 수용체 패밀리는 결합된 리간드를 세포내이입하고 신장, 갑상선의 분극 상피 세포를 가로질러서, 그리고 뇌의 모세혈관 내피 세포를 가로질러서 리간드를 트랜스사이토시스하는 것으로 확인되었다. 그러므로, LDLR은 상이한 조직에서 다양한 수준으로 발현되는 구성적으로, 기능적으로 관련된 수용체 풀을 포함한다. 이러한 예에는 근육 조직에서 발현되는 VLDLR, 뉴런 조직 상에 발현되는 LRP1B, 신장과 뉴런 조직 양쪽에서 발현되는 Megalin, 및 간과 혈관 평활근 조직에서 발현되는 LRP1 등이 포함된다. 본 발명의 환형 RAP 펩티드는 임의의 이들 수용체뿐만 아니라, 본 명세서에서 기술하는 다른 CR 함유 단백질을 발현하는 조직을 표적화하는데 사용할 수 있다.

보다 일반적인 구체예에서, 본 발명의 수용체 선택적 환형 RAP 펩티드는, 단독으로, 어레이로, 또는 치료제에 접합되어, CR 함유 단백질을 특이적으로 조절(활성화 또는 억제)할 수 있는 수단을 구성한다. 조절을 실시할 수 있는 최소 하기 4가지 기전이 존재한다: 리간드 결합 부위와 환형 RAP 펩티드의 직접 회합을 통한 리간드 결합의 경쟁적 차단; 리간드 결합 부위의 환형 RAP 펩티드-유도된 알로스테릭 변형을 통해 리간드 결합의 비경쟁적 차단; 환형 RAP 펩티드의 결합에 의해 유도된 동일하거나 또는 상이한 수용체 간의 교차 결합 후에 세포 표면에서 수용체 또는 다른 CR 함유 단백질 제거; 또는 선택적 환형 RAP 펩티드에 결합된 활성 제제의 조직으로의 대체적인 전달(예를 들어, 프로테아제, 프로테아제 억제제, 다른 효소, 방사성 동위원소, 프로아폽토시스 제제, 독소, 치료 분자(약물), 다른 수용체 결합 부분 등).

A. 정의

달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용하는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 하기 참조 문헌들을 본 발명에서 사용하는 다양한 용어의 일반적인 정의를 제공하기 위해 당분야의 숙련가들에게 제공한다: Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger, et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale and Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991).

본 명세서에서 인용하는 각각의 출판물, 특허 출원서, 특허 및 다른 참조 문헌은 본 명세서와 일치하는 정도로 전체로서 참조하여 포함시킨다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수형은 구체적으로 달리 언급하지 않는다면 복수 형을 포함하는 것임을 주지한다.

본 명세서에서 사용되는 하기 용어들은 달리 특정하지 않으면 이에 속하는 의미를 갖는다.

본 명세서에서 사용하는 용어 "환형 RAP 펩티드"는 길이가 약 100 아미노산보다 짧고, 서열 번호 98(아미노산 249-303)에 대한 서열 동일성 또는 유사성이 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이며, 2개의 비연속적인 아미노산 간에 공유 결합을 포함하는 펩티드를 의미한다. 예시적인 구체예에서, 공유 결합은 2개 시스테인 간의 이황화 결합이다.

"RAP 접합체" 또는 "접합체"는 활성 제제에 결합된 본 발명의 환형 RAP 펩티드를 포함하는 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "접합된"은 치료제(들) 및 환형 RAP 펩티드가 예를 들어, 공유적인 화학 결합, 물리력 예컨대 반데발스 또는 소수성 상호작용, 캡슐화, 삽입 또는 이의 조합 등에 의해 물리적으로 연결된 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "돌연변이"는 펩티드 서열 내 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 의미한다. 천연 또는 야생형 아미노산에 대해서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 펩티드를 "유사체"로서 간주한다.

용어 "유도체"는 예를 들어 치료제 또는 진단제에 접합, 표지화(예를 들어, 방사성 핵종 또는 다양한 효소에 의함), 공유적인 중합체 결합 예컨대 PEG화(폴리에틸렌 글리콜로 유도체화) 및 비천연 아미노산의 화학 합성에 의한 삽입 또는 치환 등에 의한 펩티드의 공유적 변형을 의미한다. 본 발명의 유도체는 본 발명의 비유도체화된 분자의 결합 특성을 보유하게 된다. 세포독성 제제, 예를 들어 방사성 동위원소(예를 들어, I131, I125, Y90 및 Re186), 화학치료제 또는 독소에 암 표적화 항체의 접합은 암성 세포의 파괴를 증강시킬 수 있다.

저밀도 지단백질 수용체 클래스 A 도메인(LDL-A, Pfam)으로도 알려진 "보체-반복부(complement-repeat)" 또는 "CR"은 다른 특징들 중에서도, 산성 아미노산 클러스터 및 6개 시스테인으로 정의되는 단백질 도메인 패밀리의 구성원이다. 다수의 보체 반복부가 LDL 수용체 유사 모듈이라고 하는 정해진 구조로 폴딩되는 것이 밝혀졌다(단백질의 구조적 분류, SCOP). CR 도메인은 LDLR에 속하는 수용체를 포함하여, 많은 수용체의 리간드 결합 결정 인자를 구성한다. 모티프 AxcBxCxD(여기서, c는 보존성 시스테인이고, x는 임의의 아미노산이며, B와 D는 아스파테이트, 글루타메이트 또는 아스파라긴임)를 갖는 각 CR 내 선형 아미노산 서열이 칼슘 결합 및 리간드 결합에 관여하는 것으로 증명되었다. 특정 CR 도메인에 바로 인접한 쌍이 RAP에 결합하는 것으로 확인되었다. RAP-결합 CR 쌍의 2 CR 도메인 중 2 도메인의 A 및 C 위치(A, C, A' 및 C')가 RAP 결합에 관여하는 것으로 검증되었다.

"CR 함유 단백질"은 하나 이상의 CR을 함유하는 단백질이다. CR 함유 단백질의 비제한적인 예에는 LDLR (P01130), LRP1 (P98157), LRP1B (Q9NZR2), LRP2 (P98164), LRP3 (O75074), LRP4 (O75096), LRP5 (O75197), LRP6 (O75581), LRP8 (Q14114), 솔틸린 관련 수용체, SorLA (Q92673), LRP10 (Q7Z4F1), LRP11 (Q86VZ4), LRP12 (Q9Y561), FDC-8D6 (CD320), VLDLR (P98155), TADG-15 (ST14/매트립타제/MT-SP1, Q8WVC1), TMPS3 (P57727), TMPS4 (Q9NRS4), TMPS6 (Q8IU80), Q6ICC2, Q6PJ72, Q76B61, Q7RTY8, Q7Z7K9, Q86YD5, Q8NAN7, Q8NBJ0, Q8WW88, Q96NT6, Q9BYE1, Q9BYE2, Q9NPF0 및 코린 (Q8IZR7)이 포함된다. 각각의 이들 단백질 신원 확인을 위해 Uniprot 수탁번호를 제공하였다.

결합 친화력 Kd은 당분야에서 통상적으로 공지된 방법으로 측정하였다.

"선택성", "결합 선택성", 또는 "선택적으로 결합"은 다양한 수용체에 대한 리간드 친화력의 차이를 의미한다. 리간드가 다른 수용체보다 3배 이상 높은 친화력으로 수용체에 결합하면 특정 수용체에 대해 선택적이다. 예를 들어, RAP는 거의 동일한 친화력으로 LRP1, LRP1B, LRP2, SorLA, apoER2 및 VLDLR에 결합한다. 그러므로, RAP는 다른 수용체에 비하여 이들 수용체 중 하나에 대해 선택적인 것이 아니다. 그러나, RAP는 5 nM 보다 낮은 해리 상수로, LRP1, LRP1B, LRP2, SorLA, apoER2 및 VLDLR에 강하게 결합하는 반면, LRP1 보다 10배 이상 낮은 친화력으로, LDLR, LRP5 및 LRP6에는 약하게만 결합한다. 따라서, RAP는 LDLR, LRP5 및 LRP6에 비하여 LRP1, LRP1B, LRP2, SorLA, apoER2 및 VLDLR에 대해서는 선택적이다. HRV2 코트 단백질은 VLDLR에는 강력하게 결합하지만 다른 LDLR에는 결합하지 않는다. 그러므로, HRV2 코트 단백질은 다른 LDLR 보다 VLDLR에 우선적으로, 이의 결합에 선택성을 보인다. Reelin은 apoER2 및 VLDLR에는 결합하지만 다른 LDLR에는 결합하지 않는다. 즉, reelin은 다른 LDLR에 비해 apoER2 및 VLDLR에 대해 선택적이다.

본 명세서에서 사용하는 용어 "증가된 상대적 전달도"는 본 발명의 환형 RAP 펩티드에 접합된 활성 제제를 포함하는 접합체의 목적하는 전달 부위(예를 들어, 뇌 또는 CR 함유 단백질을 발현하는 조직)에서 축적도가 비접합된 활성 제제의 축적도에 비하여 증가한 것을 의미한다.

"코딩"은 정해진 뉴클레오티드 서열(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정해진 아미노산 서열 및 이로부터 생성되는 생물학적 특성을 가지는 생물학적 과정에서의 다른 중합체 및 거대분자를 합성하기 위한 주형으로 제공되는, 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA 또는 mRNA의 특정 뉴클레오티드 서열의 고유 특성을 의미한다. 따라서, 유전자는 이 유전자에 의해 생성되는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성한다면 단백질을 코딩하는 것이다. 유전자 또는 cDNA 중에서 mRNA 서열과 동일하고 일반적으로 서열 목록에서 제공되는 뉴클레오티드 서열인 코딩 가닥, 및 전사 주형으로 사용되는 비코딩 가닥의 양 가닥이 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 코딩하는 것이라고 할 수 있다. 달리 특정하지 않으면, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 상호의 축퇴형인, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드를 포함한다. 단백질 및 RAN를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.

"재조합 폴리뉴클레오티드"는 천연적으로 함께 연결되지 않은 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 "재조합 숙주 세포"라 한다. 유전자가 재조합 숙주 세포에서 발현되어, 예를 들어, "재조합 폴리뉴클레오티드"를 생성한다.

"발현 제어 서열"은 이에 작동적으로 연결된 뉴클레오티드 서열의 발현(전사 및/또는 번역)을 조절하는 폴리뉴클레오티드 내 뉴클레오티드 서열을 의미한다. "작동적으로 연결된"은 한 부분의 활성(예를 들어, 전사를 조절하는 능력)이 다른 부분(예를 들어 서열의 전자)에 대한 작용을 일으키는 2 부분 간의 기능적 관계를 의미한다. 발현 제어 서열은 예를 들어, 이에 제한없이, 프로모터(예를 들어, 유도성 또는 항상성), 인핸서, 전사 종결부, 개시 코돈(즉, ATG), 인트론용 스플라이싱 신호 및 중지 코돈의 서열을 포함할 수 있다.

"발현 벡터"는 발현되는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 의미한다. 발현 벡터는 발현을 위해 충분한 cis-작용성 성분을 포함하며; 발현을 위한 다른 성분은 숙주 세포 또는 시험관 내 발현 시스템을 통해 제공할 수 있다. 발현 벡터는 당분야에 공지된 모든 것, 예컨대 코스미드, 플라스미드(예를 들어, 네이키드 또는 리포솜 내 함유된 것 등) 및 재조합 폴리뉴클레오티드가 도입된 바이러스 등을 포함한다.

"증폭"은 임의 수단, 예를 들어, 역전사, 중합효소 연쇄 반응 및 리가제 연쇄 반응 등을 통해서 폴리뉴클레오티드 서열을 복제하여 다량의 폴리뉴클레오티드 분자로 증대시키는 것을 의미한다.

핵산 혼성화 실험에서 "엄격 혼성화" 및 "엄격 혼성화 세정 조건"은 서열 의존적이고, 상이한 환경적 매개 변수 하에서 다양하다. 핵산 혼성화에 대한 광범위한 지침은 하기 문헌에서 확인할 수 있다: Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York. 일반적으로, 고도의 엄격 혼성화 및 세정 조건은 정해진 이온 농도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열적 용융점(Tm)보다 약 5℃ 낮게 선택된다. 상기 Tm은 표적 서열의 50%가 완벽하게 일치하는 프로브와 혼성화하는 온도(정해진 이온 농도 및 pH 하에서)이다. 특정 프로브에 대한 Tm과 동일하도록 매우 엄격한 조건을 선택한다.

고도로 엄격한 세정 조건의 일례는 약 15분간 72℃에서 0.15 M NaCl이다. 엄격 세정 조건의 일례는 15분간 65℃에서 0.2X SSC 세정이다(SSC 완충제에 대한 설명은 문헌 [Sambrook et al.] 참조). 종종, 고도의 엄격 세정은 배경 프로프 신호를 제거하기 위해 낮은 엄격 세정이 선행되기도 한다. 예를 들어, 100 뉴클레오티드 보다 긴 중복 부위에 대한 중간 엄격 세정의 일례는 15분간 45℃에서 1x SSC 세정이다. 예를 들어, 100 뉴클레오티드보다 긴 중복 부위에 대한 낮은 엄격 세정 조건의 예는 15분간 40℃에서 4∼6x SSC 세정이다. 대체로, 특정 혼성화 어세이에서 비관련 프로브에 대해 관찰되는 것보다 2x (또는 그 이상) 높은 노이즈에 대한 신호 비율은 특정 혼성화 검출을 의미한다.

"폴리펩티드" 또는 "펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산 잔기로 구성된 중합체, 이의 천연 발생한 구조 변이체 및 비천연 발생 유사체를 의미한다. 합성 폴리펩티드는 예를 들어, 자동화 폴리펩티드 합성기를 사용하여 합성할 수 있다. 용어 "단백질"은 대체로 거대한 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "펩티드"는 대체로 짧은 폴리펩티드를 의미한다.

2 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 관련된 용어 "동일한" 또는 "동일성 비율"은 하기의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 또는 육안 조사를 통해 측정하여, 최대 일치도에 대해 비교 및 정렬시켰을 때, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 특정 비율로 갖거나 또는 동일한 2 이상의 서열 또는 하위 서열을 의미한다. 바람직하게, 동일성 비율은 길이가 약 50 잔기 이상, 약 100 잔기 이상, 약 150 잔기 이상인 서열 영역 전체, 또는 비교 생중합체 중 하나 또는 양쪽의 전체 길이 전체에 존재한다.

비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 [Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘, [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 조사 방법에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행([Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI]의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)을 통해서, 또는 육안 조사를 통해서 수행할 수 있다.

서열 동일성 및 서열 유사성 비율을 결정하는데 적합한 알고리즘의 다른예는 BLAST 알고리즘이고, 이는 문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]에 기술되어 있다.

폴리펩티드 서열에 대해 사용되는 용어 "유사성 비율"은 통상의 서열 비교 알고리즘 또는 육안 조사를 사용하여 측정하여, 최대 일치도에 대해 비교 및 정렬시, (1) 동일하거나 또는 (2) 보존성 치환만 상이한(즉, 유사한) 아미노산 잔기의 비율을 설명하는 것이다.

"실질적으로 순수한" 또는 "단리한"은 대상 종이 존재하는 우세한 종(즉, 몰을 기준으로, 조성물 중에 다른 임의의 개별 거대 분자보다 풍부함)인 것을 의미하고, 실질적으로 순수한 분획은 대상 종이 존재하는 모든 거대분자 종의 약 50% 이상(몰 기준)으로 포함된 조성물이다. 대체로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 거대분자 종의 약 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상이 목적하는 정제된 종인 것을 의미한다. 대상 종은 조성물이 실질적으로 단일한 거대분자 종으로 구성되면 실질적으로 균질하게 정제된 것이다(통상이 검출 방법으로 조성물에서 오염 종을 검출할 수 없음). 용매 종, 소형 분자(<500 달톤), 안정화제(예를 들어, BSA), 원소 이온 종은 이러한 정의의 목적에 대한 거대분자 종으로 간주하지 않는다. 일 구체예에서, 본 발명의 접합체는 실질적으로 순수하거나 또는 단리된 것이다. 일 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 실질적으로 순수하거나 또는 단리된 환형 RAP 펩티드 또는 활성 제제와 이의 접합체를 포함한다.

어떠한 대상에 대해 사용되는 "천연 발생"은 그 대상이 자연계에 존재할 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 자연계 공급원에서 단리할 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 천연 발생인 것이다.

"검출"은 샘플 중 분석물의 존재 유무 또는 양을 결정하는 것을 의미하고, 샘플 중에 또는 샘플 내 세포 당 분석물의 양을 정량하는 것을 포함할 수 있다.

"검출가능 부분" 또는 "표지"는 분광 분석, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학 수단을 통해 검출가능한 조성물을 의미한다. 예를 들어, 유용한 표지는 ³²P, ³⁵S, 형광 염료, 전자 밀도 시약, 효소(예를 들어, ELISA에서 통상 사용되는 것), 비오틴-스트렙타비딘, 디옥시제닌, 헵텐, 및 항혈청 또는 단일클론 항체를 이용가능한 단백질, 또는 표적에 상보적인 서열을 갖는 핵산 분자 등을 포함한다. 검출가능 부분은 대체로 측정가능한 신호, 예컨대 샘플내에 결합된 검출가능 부분의 양을 정량하는데 이용할 수 있는 방사성, 발색단 또는 형광성 신호를 생성한다. 검출가능 부분은 공유적으로 또는 이온 결합, 반데발스 또는 수소 결합으로 프라이머 또는 프로브에 결합되거나 도입될 수 있고, 예를 들어 방사성 뉴클레오티드, 또는 스트렙타비딘이 인지하는 비오틴화 뉴클레오티드의 도입 등이 있다. 검출가능 부위는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능하다. 간접 검출은 검출가능 부위에 제2의 직접적 또는 간접적 검출가능 부위를 결합시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 검출가능 부위는 결합 파트너의 리간드일 수 있는데 예컨대, 스트렙타비딘의 결합 파트너인 비오틴, 또는 특이적으로 혼성화할 수 있는 상보성 서열의 결합 파트너인 뉴클레오티드 서열 등일 수 있다. 결합 파트너는 그 자체로 직접적으로 검출가능한데, 예를 들어, 항체는 그 자체를 형광 분자로 표지화할 수 있다. 결합 파트너는 또한 간접적으로 검출가능하며, 예를 들어, 상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산은 다른 표지화 핵산 분자와 혼성화를 통해 검출할 수 있는 분지형 DNA 분자의 일부분일 수 있다. (예를 들어, 문헌 [PD. Fahrlander and A. Klausner, Bio/Technology (1988) 6:1165.] 참조). 신호의 정량은 예를 들어, 섬광 계측, 밀도 계측 또는 유세포 계측 등을 통해 수행한다.

"링커"는 공유적으로, 또는 이온, 반데발스 또는 수소 결합으로 2개의 다른 분자를 연결하는 분자를 의미하는데, 예를 들어 5' 말단에서 하나의 상보성 서열과, 그리고 3' 말단에서 다른 상보성 서열과 혼성화하여, 2개의 비상보성 서열을 연결하는 핵산 분자가 있다.

본 명세서에서 사용하는 "종양" 또는 "신생물" 또는 "암"은 원발성 종양 및/또는 전이성을 포함한다. 이러한 종양은 대체로 고체 종양이거나, 또는 국소적으로 축적되는 미만형 종양이다. 많은 유형의 이러한 종양 및 신생물이 알려져 있다. 원발성 뇌종양은 신경교종, 수막종, 신경초종, 뇌하수체 선종, 수아세포종, 두개인두종, 혈관종, 유표피종, 육종 등을 포함한다. 암종은 예를 들어, 난소, 자궁경부, 전립선, 유방, 폐, 결장 또는 위 암종을 포함한다. 간세포 암종 또는 간종양은 전세계적으로 5번째로 흔한 암이고 이환율이 꾸준히 증가하고 있다. 간세포 암종은 간세포의 질환이다. 모든 두개강내 종양의 50%가 두개강내 전이이다. 뇌 종양 및 신생물은 뇌 및 신경 조직과 연관되거나, 또는 뇌척수막, 두개골, 혈관 또는 머리 또는 목에서 머리까지의 임의의 다른 조직과 연관될 수 있다. 본 발명에 따른 치료를 위한 종양 또는 신생물은 악성이거나 양성이며, 이전에 화학치료법, 방사선 및/또는 다른 치료법으로 치료한 것일 수 있다.

용어 "유효량"은 피험체의 건강 상태, 병상 및 질환에 대해서 또는 진단 목적을 위해서 목적하는 결과를 내기에 충분한 용량을 의미한다. 목적하는 결과는 이 용량의 수용체에서의 주관적이거나 객관적인 개선을 포함할 수 있다. "치료적 유효량"은 건강상에 의도하는 이로운 효능을 생성하는데 유효한 제제의 양을 의미한다.

"소형 유기 분자"는 약학 분야에서 대체로 사용되는 유기 분자와 유사한 크기의 유기 분자를 의미한다. 이 용어는 유기 생체중합체(예를 들어, 단백질, 핵산 등)는 배제한다. 바람직한 소형 유기분자는 크기가 약 5,000 Da 이하, 약 2,000 Da 이하, 또는 약 1,000 Da 이하의 범위이다.

진단 또는 치료 "피험체"는 인간 또는 포유류 또는 영장류를 포함하는 인간 이외의 동물이다.

"치료"는 예방적 치료 또는 치료적 치료 또는 진단적 치료를 의미한다.

"예방적" 치료는 병변의 진행 위험을 감소시키려는 목적으로 질환 징후를 나타내지 않거나 또는 초기 징후만을 나타내는 피험체에게 투여하는 치료이다. 본 발명의 접합체 화합물을 예방적 치료에 제공하여 병변의 진행 가능성을 줄이거나 또는 진행되었다면, 병변의 중증도를 최소화할 수 있다.

"치료적" 치료는 병변의 징후 또는 증상을 제거하거나 줄이려는 목적으로 병변 징후 또는 증상을 나타내는 피험체에게 투여하는 치료이다. 상기 징후 또는 증상은 생화학적이거나, 세포적이거나, 조직학적이거나, 기능적이거나, 주관적이거나 또는 객관적일 수 있다. 본 발명의 접합체 화합물을 진단을 위해서 또는 치료적 치료로서 제공할 수 있다.

"진단"은 병적 상태의 존재 또는 성질을 확인하는 것을 의미한다. 진단 방법은 그 특이성 및 선택성이 상이하다. 특정 진단 방법이 병태의 정확한 진단을 제공하지는 않지만, 이 방법이 진단에 도움이 되는 양성적 징후를 제공한다면 충분하다.

"약학적으로 허용되는 담체"는 인간에게 투여하기 적합한 것으로 합당한 규제 기관에서 승인한, 임의의 표준 약학 담체, 완충제, 및 부형제 예컨대, 인산 완충 염수액, 5% 엑스트로스 수용액, 에멀션, 예컨대 수중유 에멀션 또는 유중수 에멀션, 다양한 유형의 습윤제 및/또는 보조제 등을 의미한다. 적절한 담체 및 제형은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995)]에 기술되어 있다. 바람직한 약학적 담체는 활성 제제의 목적하는 투여 방식에 따라 좌우된다. 통상의 투여 방식은 장(예를 들어, 경구) 또는 비경구(예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내, 복강내, 수막강내 주사; 또는 국소, 경피 또는 폐내 투여를 포함하는 경점막 등)를 포함한다. "약학적으로 허용되는 염"은 예를 들어, 금속 염(나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등) 및 암모니아 또는 유기 아민의 염을 포함하는 약학적으로 사용하기 위한 화합물로 제형화할 수 있는 염이다.

A. CR 함유 단백질 및 이의 역할

"LDLR"은 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질 1(LRP1)을 포함하는 저밀도 지단백질 수용체 패밀리의 구성원을 의미한다. LRP1은 4525 아미노산의 거대 단백질(600 kDa)로서, 퓨린(furin)에 의해 절단되어 비공유적으로 결합되어 있는 2개의 서브유닛 515-(알파) kD 및 85-(β) kDa을 생성한다. LRP1은 대부분의 조직 유형에서 발현되지만, 주로 간에서 발견된다. 저밀도 지단백질 (LDL) 수용체 패밀리의 다른 구성원은 LDL-R (132 kDa); LRP2 (megalin, gp330); LRP/LRP1 and LRP1B (600 kDa); VLDL-R (130 kDa); LRP5; LRP6; apoER-2 (LRP-8, 130 kDa); 모자이크 LDL-R (LR11, 250 KDa); 및 다른 구성원 예컨대 LRP3, LRP6 및LRP-7을 포함한다. 이러한 패밀리의 특징에는 세포 표면 발현; 세포외 리간드 결합 도메인 반복부(DxSDE); 리간드 결합을 위해 Ca++ 요구; RAP 및 apoE의 결합; EGF 전구체 상동성 도메인 반복부(YWTD); 단일 막 스패닝 영역; 세포질 도메인 내 내재화 신호(FDNPXY); 및 다양한 리간드의 수용체 매개 세포내이입 등이 포함된다. LRP1, LRP5, LRP6, apoER2 및 VLDLR을 포함하여 이 패밀리의 일부 구성원은 신호 전달 경로에 관여한다.

RAP d3은 역평행 나선 헤어핀으로 폴딩된다. 제1 나선은 대략 D237-V277이고, 잔기 G278-G280로 구성된 회전부(turn)에 의해 제2 나선, 잔기 E281-R317에 연결된다. 이 2 나선은 우측 다리부(나선 2)-교차된-좌측 다리부(나선 1) 구조로서 근접해 있다. LDLR의 CR3은 주로 K270에서 RAP d3과 접촉하는 반면, CR4는 주로 K256에서 RAP d3과 접촉부를 형성한다. K256 및 K270은 둘 다 나선 2의 동일 면 상에 존재한다. RAP R282 및 R285는 CR3의 음으로 하전된 칼슘 킬레이팅 포켓을 향하지만, RAP K253은 CR4 결합에서 유사한 역할을 수행한다. LDLR CR 쌍은 단지 RAP d3 역평행 나선 헤어핀의 대략 H249-T303 사이의 잔기와 연관된다. 이 영역의 외측은 나선 1의 N 말단 확장부 및 나선 2의 C 말단 확장부이다. 나선 1 및 2의 이 부분은 아마도 나선 다발을 안정화시키는데 도움을 주는 듯하다. 또한, 나선 1은 회전부, S232-T236, 짧은 나선 및 R206-Q231 사이 잔기를 포함하는 일부 추가 서열이 상위에 위치한다. 이는 짧은 나선, 및 추가 서열도 역시 RAP d3의 폴딩 안정성에 중요하다는 것을 의미하는 것이다.

i. LRP1 선택적 RAP 펩티드

천연 RAP는 간세포에서 고도로 발현되는 LRP1에 강력하게 결합한다. 본 발명의 일 측면은 간 질환을 치료하기 위하여 간에 치료 화합물을 전달하기 위해서 환형 RAP 펩티드에 간 질환 치료를 위한 화학치료 약물 또는 다른 제제를 접합시키는 것을 고려한다. 간 질환 치료를 위한 RAP 접합체의 투여는 다수의 약물이 거의 주사 직후에 간세포에 직접 전달되기 때문에, 간 질환 치료와 관련된 몇몇 문제, 예컨대 간에 의한 제제의 제거 등을 해결할 수 있다. 추가적으로, RAP 접합체는 LRP1을 통해 세포내이입되기 때문에, 원형질막의 약물 내성 기전(MDR, P-당단백질)을 피할 수 있다.

ii. LRP2 선택적 RAP 펩티드

LRP2는 뇌의 모세혈관 내피에서 발현되고 뇌의 유조직 내로 apoJ의 수송을 매개하는 것으로 확인되었다(Lundgren, et al., (1997) J Histochem Cytochem 45, 383-392; Zlokovic, et al., (1996) Proc Natl Acad Sci U S A 93, 4229-4234; Shayo, et al., (1997) Life Sci 60, PL115-118). 다른 LDLR보다 높은 친화력으로 LRP2에 선택적으로 결합하는 본 발명의 환형 RAP 펩티드 및 이의 접합체는 뇌에서의 분포가 증가할 것으로 예상된다. 예를 들어, GDNF는 파킨슨 병이 있는 피험체의 흑진선조체 뉴런의 생존 및 성장을 촉진하는 것으로 확인되었다( Lin, et al., (1993) Science 260, 1130-1132). 그러나, GDNF는 혈관으로부터 뇌로 교차되어 들어가지 않는다. LRP2-선택적 RAP 펩티드와 GDNF의 융합체는 뇌에 GDNF 분포도를 증가시킬 것으로 예상된다.

iii. VLDLR 선택적 RAP 펩티드

유사하게, VLDLR은 뇌 모세혈관 내피 세포에서 발현되고 대동맥의 내피 세포를 가로질러 지단백질 리파제 수송을 매개하는 것을 알려져 있다( Wyne, et al., (1996) Arterioscler Thromb Vasc Biol 16, 407-415; Obunike, et al., (2001) J Biol Chem 276, 8934-8941). VLDLR에 선택적으로 결합하는 본 발명의 환형 RAP 펩티드 및 이의 접합체는 뇌에서의 분포도가 증가될 것으로 기대된다. VLDLR은 또한 혈관 마크로파지로의 과량의 유리 지방산(FFA) 흡수를 매개하여 포말 세포 형성에 관여하는 것으로 알려져 있다( Hiltunen, et al., (1998) Circulation 97, 1079-1086; Qu, et al., (2004) J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci 24, 1-4, 8). VLDLR에 선택적으로 결합하는 환형 RAP 펩티드 및 이의 접합체는 마크로파지와 지단백질 입자의 회합을 차단하고 포말 세포의 형성을 억제할 것으로 예상된다. 이러한 환형 RAP 펩티드 및 이의 접합체는 순환하는 지단백질로부터 지방 세포로의 FFA 전달을 제한하여, 민감한 피험체에서 비만으로의 진행을 완화시킬 것으로 예상되었다(Goudriaan, et al., (2001) Arterioscler Thromb Vasc Biol 21, 1488-1493; Goudriaan, et al. (2004) J Lipid Res 45, 1475-1481; Tacken, et al., (2001) Curr Opin Lipidol 12, 275-279; Yagyu, et al., (2002) J Biol Chem 277, 10037-10043). 간에서 낮은 수준의 VLDLR 발현과 함께, 근육 내피세포의 내강 표면 상에서 높은 수준의 VLDLR의 발현은 정맥 내 투여후 근육 조직으로 환형 RAP 펩티드 및 이의 접합체의 분포를 추진시킬 것으로 예상된다. 근육 조직에 치료 효능을 갖는 제제를 VLDLR 선택적 환형 RAP 펩티드에 부착시켜 이러한 제제의 근육 분포를 개선시킬 수 있다.

iv. 종양 및 전이와 연관된 CR 함유 단백질

3 이상의 CR 함유 단백질, LRP5, LRP6 및 ST14(TADG-15)의 과발현은 독립적으로 종양형성성 또는 발암성 증가와 관련되어 있다(Li, et al., (2004) Oncogene 23, 9129-9135; Hoang, et al., (2004) Int J Cancer 109, 106-111; Tanimoto, et al., (2005) Br J Cancer 92, 278-283; Santin, et al., (2004) Int J Cancer 112, 14-25; Santin, et al., (2003) Cancer 98, 1898-1904; Tanimoto, et al., (2001) Tumour Biol 22, 104-114). 이들 단백질에 선택적으로 결합하는 본 발명의 환형 RAP 펩티드 또는 접합체는 이러한 종양형성 효과를 감소시키는 수단을 제공할 것으로 기대된다. 환형 RAP 펩티드는 CR 함유 단백질의 기능(들)을 직접적으로 방해할 수 있다. 다르게, 환형 RAP 펩티드를 암 치료제에 접합시켜 상기 CR 함유 단백질을 과발현하는 조직에 표적 전달할 수 있다. 예를 들어, 매트립타제(MT-SP1, ST14, TADG-15)는 다양한 상피성 종양(암종)에서 과발현된다(25-33).

간세포 활성인자 억제제-1(HAI-1)에 의해 촉진된 전이활성화(transactivation) 이후에, 매트립타제는 세포외 매트릭스 성분을 직접 분해하거나 또는 다른 프로테아제, 예컨대 우로키나제 플라스미노겐 활성인자(uPA)를 활성화시켜, 매트릭스 분해 사건을 일으켜서 종양 성장 및 전이를 촉진시킨다(26, 34, 35). 매트립타제(ST14) 엑토도메인의 CR 어레이에 인접한 프로테아제 도메인은 매트립타제(ST14)를 과발현하는 세포의 종양형성성 및 침윤성 증가에 관여한다. 매트립타제는 N 말단 II형 막관통 도메인을 통해서 상피 세포의 측면 또는 기저외측면 막에 고정되어 있다(Pfistermueller, et al. (1996) FEBS Lett 396, 14-20). 막 삽입된 서열은 단백질의 C 말단에 세포외 SEA 도메인, 2개의 CUB 도메인, 4개의 CR 도메인 및 트립신 도메인이 후속된다. 매트립타제 내 CR 서열의 돌연변이 유발에 의해서 최종 프로테아제 돌연변이체는 활성화되지 않게 된다(Qiu, et al. (2003) Neuroscience 122, 291-303). 유사하게, 매트립타제의 제3 CR 도메인에 결합하는 항체는 이 효소의 활성화를 차단한다(Basu, et al. (2001) Immunity 14, 303-13). 제3 CR 도메인을 포함하는 매트립타제 내 2 CR 쌍 중 하나에 대해 친화력을 갖는 환형 RAP 펩티드는 관찰된 이 영역에 의한 억제와 유사한 방식으로, 단백질 가수분해 활성화를 방해할 것으로 예상된다. 이러한 RAP 펩티드는 영향을 받은 조직에서 매트립타제 과발현에 의한 전이 및 종양형성성 영향을 줄일 것으로 생각된다. 매트립타제 선택적 환형 RAP 펩티드 및 프로테아제 억제제를 포함하는 접합체는 또한 이의 단백질 가수분해 활성과 관련된 매트립타제의 영향을 특이적으로 차단한다.

LRP6 선택적 환형 RAP 펩티드는 LRP6에 의해 매개되는 Wnt 신호 전달 이벤트를 방해하거나 또는 LRP6의 세포내이입을 유도하여, 종양 세포 상에서 LRP6을 하향 조절하도록 설계할 수 있다. 유사하게, 치료제(예를 들어, 암 화학치료 약물) 또는 진단제에 접합된 LRP6-선택적 환형 RAP 펩티드를 사용하여 LRP6을 과발현하는 조직에 표적 전달할 수 있다.

v. LRP5 선택적 RAP 펩티드 및 골질환

LRP5를 통해 증가된 Wnt 신호화는 골아세포 분화를 증가시키고, 파골세포 활성을 억제하며 골침착을 증가시키는 것으로 확인되었다(Westendorf, et al., (2004) Gene 341, 19-39; Zhang, et al., (2004) Mol Cell Biol 24, 4677-4684). 이러한 신호화 기전은 골아세포 특이적 APC(adenomatous polyposis coli) 넉아웃 마우스, 및 DKK(Dickkopf)-1 및 스크레로스틴 매개 억제에 비감응성인 LRP5 돌연변이체를 사용하여 검증하였다(Zhang, et al., (2004) Mol Cell Biol 24, 4677-4684; Holmen, et al., (2005) J Biol Chem ). 억제제 결합을 방해하거나, 또는 다른 수단(예를 들어, Wnt 결합을 차단하지 않고 LRP5를 안정화)을 통해서 Wnt 신호화를 증가시키는 LRP5 특이적 환형 RAP 펩티드는 유사한 효과를 가질 것으로 보인다. 예를 들어, 베타-프로펠러 샤페론 단백질 Mesd 및 2개의 LRP5 CR 쌍 중 하나에 특이적인 환형 RAP 펩티드 간의 융합체는 LRP5를 통해서 Wnt 신호화의 DKK-1-매개 길항작용을 방해하는 것으로 알려져 있다(Hsieh, et al., (2003) Cell 112, 355-367; Herz, et al., (2003) Cell 112, 289-292). LRP5의 억제(예를 들어, LRP5의 억제 또는 이에 DKK-1의 결합을 감소시킴)를 방해하는 이러한 환형 RAP 펩티드 및 이의 접합체는 골다공성 또는 골아세포 활성 감소 및/또는 파골세포 활성 증가와 연관된 다른 질환의 치료에서 치료 효과를 갖게 된다. 유사하게, LRP5를 통해서 Wnt 신호화를 억제하는 환형RAP 펩티드는 골아세포 활성 증가와 관련된 질환, 예컨대 골화석증의 치료에서 치료 효과를 가질 것이다.

vi. FDC-8D6 선택적 RAP 펩티드

FDC-8D6 항원(CD320)은 이러한 도메인 쌍을 가지며 림프소절의 B 세포 분화에서 중요한 역할을 수행한다(36, 37).

비호지킨 림프종(NHL)은 B 세포라 불리는 면역 세포 부류의 증식 및 결절외 이동을 수반한다. NHL은 20세 내지 39세 남성에서 암 사망의 주된 원인이다. FDC-8D6 항원 단백질(CD320)이 신생물성 B 세포 성장을 촉진한다는 것이 연구로 밝혀졌다(36, 37). 8D6 항원은 단일한 CR 도메인 쌍을 포함한다. 8D6에 결합하고 이의 기능을 차단하는 환형 RAP 펩티드와 같은 제제가 인간에서 비호지킨 림프종의 진행을 완화시킬 것으로 기대된다.

B. 치료

본 발명의 환형 RAP 펩티드 또는 이의 접합체의 투여로 치료가능한 특정 질환 병태는 접합체에 존재할 수 있는 약물 부분 및 표적화하는 CR 함유 단백질의 유형만큼 다양하다. 따라서, 질환 병태에는 세포 증식 질환, 예컨대 신생물성 질환, 자가면역 질환, 심혈관계 질환, 호르몬 이상 질환, 퇴행성 질환, 노화 관련 질환, 중추 신경계 질환(예를 들어, 알츠하이머병, 간질, 고지혈증), 정신 질환 및 병태(예를 들어, 정신분열증, 기분 장애 예컨대 우울증 및 불안증), 감염성 질환, 효소 결핍 질환, 리소좀 축적병 예컨대 상기 기술된 질환 등이 포함된다.

치료는 질환에 걸릴 가능성 감소, 질환 예방, 질환의 진행을 완화, 중지 또는 역전, 또는 숙주에 영향을 주는 질환 병태와 관련된 징후의 완화를 포함하여 접합체의 투여와 관련하여 피험체에 이로운 임의의 결과를 포함하는 것을 의미하며, 여기서 완화 또는 잇점은 변수, 예를 들어 치료되는 병변 상태와 관련된, 징후, 예컨대 이와 관련된 염증 및 동통 등의 규모를 적어도 감소시키는 광범위한 의미로 사용된다. 이와 같이, 치료는 또한 병적 상태 또는 적어도 이와 관련된 증상이 완전하게 억제, 예를 들어, 발병을 억제하거나, 또는 중지, 예를 들어 종결시켜서 숙주가 더 이상 병적 상태, 또는 적어도 병적 상태를 특징으로 하는 증상을 앓지 않게 되는 상황을 포함한다.

i. 리소좀 축적병

일 구체예에서, 치료하려는 질환은 리소좀 축적병이고 접합체를 상기 포유류의 뇌조직에 존재하는 저장 과립체의 양을 감소시키는데 유효한 양으로 약학 조성물로서 투여된다. 대체로, 이러한 질환의 증상은 병력, 신체 검사,초음파심장검사, 심전도검사, 자기공명 영상술, 수면다원검사, 골격계 검사, 운동 범위 측정, 각막 사진술 및 피부 생검을 통해 모니터링한다. 이러한 질환에서 환형 RAP 펩티드 또는 이의 접합체의 투여는 상기 피험체의 발육 지연 및 퇴화를 정상화시키고, 고압 뇌수종의 감소, 상기 피험체에서의 척수 압박 감소, 및 상기 피험체의 뇌혈관 주위의 주변혈관 낭종의 수 및 크기 감소를 수반한다. 이러한 결과를 모니터링하고 평가하는 방법은 당분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 당분야의 숙련가는 이러한 결과에 대한 추가적인 설명을 위해 U.S. 특허 제6,585,971호; U.S. 특허 제6,569,661호 및 U.S. 특허 제6,426,208호 및 U.S. 공개특허 출원 제20040009906호를 참조할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 상기 동물은 점액다당류증 I을 앓고 있으며 정상적인 α-L-이두로니다제 활성을 약 50% 이하로 갖는다. 이러한 구체예에서, 접합체의 일부로서 인간 α-L-이두로니다제의 체중 1 kg 당 약 0.001mg/kg∼0.5 mg/kg의 유효 용량을, 예를 들어 주 1회 이의 결핍증을 앓는 피험체에게 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 피험체에게 상기 인간 α-L-이두로니다제를 주 1회 포유류의 CSF 15 cc 당 약 0.01 mg/15 cc∼약 5.0 mg/15 cc로 투여한다. 본 명세서에서 고려하는 이러한 치료는 리소좀 축적병을 갖는 피험체의 뇌 세포에서 글리코사미노글리칸(GAG)의 분해를 촉진한다. 뇌세포는 뉴런, 신경교세포, 뇌실막세포일 수 있다. 대체로, 과립체 축적이 일어나고 본 발명의 접합체를 투여하여 개선될 수 있는 뇌세포에는 뉴런, 아교세포, 소교세포, 성상세포, 소돌기아교세포, 혈관주위 세포, 외피세포, 뇌막세포, 뇌실막세포, 거미막 과립 세포, 거미막, 경뇌막, 연뇌막 및 맥락막 세포가 포함된다. 바람직한 구체예에서 상기 치료법은 상기 접합체가 투여되지 않은 유사한 세포에 존재하는 리소좀 저장 과립체의 수와 비교하여 뇌막세포의 저장 과립체를 감소시킨다. 이는 일부 피험체에서 고압 뇌수종의 증상을 경감시키는 치료 효능을 일으킨다. 그리고 상기 투여는 상기 피험체의 상기 피험체의 뇌막 조직에서 CSF 액의 양을 감소시킨다.

본 발명의 접합체로 치료가능한 리소좀 축적병은 I형 점액다당류증, II형 점액다당류증 헌터 증후군, IIIA형 점액다당류증 산필립포 증후군, IIIB형 점액다당류증 산필립포 증후군, IIIC형 점액다당류증 산필립포 증후군, IIID형 점액다당류증 산필립포 증후군, IVA형 점액다당류증 모르퀴오 증후군, IVB형 점액다당류증 모르퀴오 증후군, VI형 점액다당류증, VII형 점액다당류증 슬라이 증후군, IX형 점액다당류증, 아스파르틸글루코사민뇨증, 콜레스테롤 에스테르 축적병/월만병, 시스틴증, 데이넌병(Danon disease), 파브리병, 파버 지질육아종증/파버병, 푸코시드 축적증, I/II형 갈락토시알리도시스(galacosialidosis), I/IIIII형 고셔병, 공세포 백색질장애/크라베병, 글리코겐 축적병 II/폼페병, I/II/III형 GM1-강글리오시드증, I형 GM2-강글리오시드증/테이 삭스병, II형 GM2-강글리오시드증 type II 샌드호프병, GM2-강글리오시드증, I/II형 α-만노스축적증, β-만노스축적증, 이염성 백질이영양증, 이염성 백질이영양증, I형 뮤코리피드증/I/II형 시알리도시스, II/III형 뮤코리피드증 I-세포 질환, IIIC형 뮤코리피드증 가성 후를러 다발성영양장애, 다중 설파타제 결핍증, 신경 세로이드 리포푸신증, CLN1 바텐병, 신경 세로이드 리포푸신증, CLN2 바텐병, 니만-피크병 A/B형 니만-피크병, 니만-피크병 C1형 니만-피크병, 니만-피크병 C2형 니만-피크병, 농축이골증, 쉰들러병 I/II형 쉰들러병, 또는 시알산 축적병을 포함한다.

ii. 신경 질환

다른 구체예에서, 치료되는 질환은 신경 질환이고 상기 접합체를 이러한 신경 질환을 예방, 관리 또는 치료하기 위한 유효량으로 약학 조성물로서 투여한다. 신경 질환은 이에 제한되는 것은 아니고, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 다른 탈수초성 관련 질병, 중추 신경계 암, 외상성 뇌손상, 척수 손상, 발작 또는 뇌허혈증, 반(plaque) 경화증, 뇌혈관암, 간질, 헌팅턴병, 투렛 증후군, 길렝 바레 증후군, 윌슨병, 피크병, 신경염증 질환, 뇌염, 바이러스, 진균 또는 박테리아 기원의 뇌척수염 또는 수막염, 또는 다른 중추신경계 감염증, 프라이온 질환, 소뇌성 운동실조, 소뇌성 변성, 척수소뇌성 변성증, 프리드리히형 실조증, 모세혈관확장성 운동실조증, 척수성 근위축증, 비진행성 핵상 마비, 근긴장이상, 근육 강직, 진동, 색소성 망막염, 노인성 치매, 피질하 치매, 동맥경화성 치매, AIDS 연관성 치매, 또는 다른 치매, 선조체 흑질 변성, 미토콘드리아성 뇌근병증 , 신경 세로이드 리포푸신증, 중추신경계 관여 리소좀 보관성 질병, 백질이영양증, 요소 주기 결함 질병, 간성 뇌증, 신장 뇌증, 대사성 뇌증, 포르피린증, 신경독성 화합물에 의한 중독 , 방사능 유도된 뇌손상, 또는 정신 질환 예컨대 정신 이상, 불안증, 우울증, 주의력 결핍s, 기억 장애, 인지 장애, 식욕 장애, 비만, 중독, 욕구, 또는 약물 의존증을 포함한다.

알츠하이머병

바람직한 구체예에서, 치료되는 질환은 알츠하이머병이고, 이는 영향을 받고 있는 환자의 뇌에 40∼42 아미노산 펩티드, 아밀로이드 베타(Aβ)의 높은 농도와 연관이 있다(Selkoe, et al.(1996) J Biol Chem 271, 18295-18298). 일련의 순차적인 단백질 가수분해 사건에 의한 이의 형성후에, Ab는 올리고머화되어 결국 뉴런 간질 내에 불용성 반에 축적된다. Aβ가용성 및 불용성 형태는 시험관 내 및 생체 내에서 신경독성이 있는 것으로 증명되었다(Zerbinatti, et al., (2004) Proc Natl Acad Sci U S A 101, 1075-1080; Tsai, et al., (2004) Nat Neurosci; Schmitz, et al. (2004) Am J Pathol 164, 1495-1502; Gong, et al. (2003) Proc Natl Acad Sci U S A 100, 10417-10422; Bard, et al.(2000) Nat Med 6, 916-919; Schenk, et al. (1999) Nature 400, 173-177; Hsia, et al. (1999) Proc Natl Acad Sci U S A 96, 3228-3233). 가용성 Aβ 단량체 및 올리고머 역시 장기 증강작용을 억제하여 기억 결손을 가역적으로 유도하는 것으로 증명되었다(Gong, et al. (2003) Proc Natl Acad Sci U S A 100, 10417-10422).

Aβ는 미확인된 기능의 세포 표면막 단백질인 아밀로이드 전구체 단백질 또는 APP의 단백질 가수분해 단편이다. Aβ 형성은 LDLR 수용체 패밀리의 구성원인 LRP1에 의한 APP의 세포내이입을 통해서 또는 뉴런성 분비 경로 내에서 개시된다(Cam, et al., (2004) J Biol Chem 279, 29639-29646). 엔도솜 시스템에 도착시, APP는 베타-부위 APP-절단 효소, 또는 막 프로테아제 BACE에 의해 절단된다. BACE는 관통막 도메인에 바로 N 말단인 671 위치에서 APP를 절단한다. 다음으로, APP의 나머지 부분은 감마-세크리타제 복합체를 구성하는 3 단백질인, 프레세닐린-1, 프레세닐린-2 및 니카스트린의 복합체에 의해 재차 절단된다(Xia, et al. (2003) J Cell Sci 116, 2839-2844). 프레세닐린은 지질 이중층의 내부 소엽내에서 이들의 기질을 절단한다. 감마-세크리타제 절단 단계는 APP의 막관통 도메인내 711위치 내지 713 위치 사이에서 일어난다. 감마-세크리타제는 Aβ를 방출하고, 이는 뉴런 내에서 체류하거나 또는 세포외 공간으로 분비된다. 양 위치에서, Aβ는 뉴런에 독성을 갖는다(Casas, et al. (2004) Am J Pathol 165, 1289-1300).

베타 및 감마-세크리타제에 의한 APP의 순차적 절단을 아밀로이드형성 경로라한다. 대체 경로는 정상뇌에서 우세하다: APP의 전체 엑토도메인은 알파-세크리타제가 촉매하는 단백질 가수분해 과정인, 수용체 쉐딩(shedding)을 통해 방출된다. 방출된 엑토도메인을 sAPPα라하고 신경보호 및 기억 강화 효과를 갖는 것으로 확인되었다(Furukawa, et al. (1996) J Neurochem 67, 1882-1896; Meziane, et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U S A 95, 12683-12688). APP 엑토도메인 방출은 비아밀로이드형성 경로의 핵심 사건이다. 이 경우에서의 단백질 가수분해는 아밀로이드형성 동안 Aβ가 되는 APP 영역 내 688 위치에서 발생한다(Allinson, et al. (2003) J Neurosci Res 74, 342-352). 따라서, 아밀로이드형성 및 비아밀로이드형성 경로는 상호 배타적이다. sAPPα의 방출은 막결합된 프로테아제이기도 한 알파-세크리타제, ADAM10에 의해 촉매된다(Fahrenholz, et al. (2000) Ann N Y Acad Sci 920, 215-222). ADAM10은 디스인테그린 및 메탈로프로테아제(a disintegrin and metalloproteinase)으로서, Notch 절단 효소(Kuzbanian) 및 TNF-알파 전구체-절단 효소(TACE, ADAM17)를 포함하는 "쉐다제(sheddase)" 효소 패밀리의 일부이다. ADAM10은 BACE의 엑토도메인을 쉐딩하는데 관여하는 것으로 확인되었다(Hussain, et al. (2003) J Biol Chem 278, 36264-36268).

ADAM 패밀리의 다른 구성원과 유사하게, ADAM10은 N 말단 프로도메인, 촉매 프로테아제 도메인, 디스인테그린 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 테일을 갖는다. 프로도메인은 효소의 적절한 폴딩을 위해 필수적인, 촉매 도메인과 강력하게 연합되어 있다. 이러한 연합은 또한 프로도메인 내 시스테인이 활성 부위 내 아연 원자에 가역적으로 결합하도록 하여, 분비 경로를 이동하면서 효소의 단백질 가수분해 활성을 마스킹한다. 트랜스-골지에 도착시, 항상성 분비 경로의 프로단백질 컨버타제 퓨린(furin)이 ADAM10의 잔기 211-214(RKKR)를 인식하고 프로도메인을 절단하고 효소를 단백질 가수분해적으로 활성화되도록 한다.

ADAM10에 의한 sAPPα 방출의 손실로 인해, 베타 및 감마-세크리타제에 의한 Aβ 방출이 증가되는 것이 알츠하이머병의 원인인 것으로 여겨지고 있다. APP 프로세싱을 아밀로이드형성 경로로부터 변경시키기 위해서, BACE 또는 감마-세크리타제 복합체의 약물학적 억제제를 개발하고자 다수의 프로그램이 진행중이다. 보완적인 접근법은 뇌 간질에서 알파-세크리타제의 농도를 증가시켜 Aβ를 손실하여 sAPPα 생성을 증가시키는 것이다. APP의 단백질가수분해 프로세싱의 불균형은 특정한 뉴런성 프로테아제, ADAM10의 내재 농도를 적당하게 보충하여 동물 모델에서 보정되었다. 뇌에서 ADAM10 농도 증가의 장점은 알츠하이머병의 마우스 모델에서 검증되었다(Postina, et al. (2004) J Clin Invest 113, 1456-1464; Lichtenthaler, et al.(2004) J Clin Invest 113, 1384-1387). 뇌 ADAM10 농도를 약간 증가시켜서 질환의 표현형이 예방되는 것으로 확인되었다.

본 발명은 환형 RAP 펩티드와 ADAM10의 융합체를 정맥 내 투여하는 것을 기초로 알츠하이머병을 치료하는 것을 고려한다. 바람직한 구체예는 ADAM10-환형 RAP 펩티드 접합체를 투여하고 뇌 알파-세크리타제 활성을 증가시키는 것을 포함하는 알츠하이머병의 치료방법이고, 여기서 상기 투여는 정맥내, 경동맥내 또는 수막강내 투여이다. 알파-세크리타제 농도 증가는, 이후 APP 프로세싱을 아밀로이드형성 경로로부터 전환시키게 된다. sAPPα 및 이의 계의 생성 증가, Aβ의 생성 감소는 알츠하이머병을 앓고 있는 환자에게 치료 효과를 가질 것으로 예상되다. 다르게, 본 발명은 환형 RAP펩티드와 APP 또는 Aβ에 작용하는 다른 프로테아제간의, 또는 베타-세크리타제 억제제 또는 감마-세크리타제 억제제와의 융합체를 투여하는 단계를 포함하는 알츠하이머병의 치료를 고려한다.

관련 측면에서, 본 발명은 프로도메인이 부착된 ADAM10-RAP 융합체를 사용하여 정맥내 주사된 활성 쉐다제 효소의 주변부 효과를 최소화하는 것을 고려한다. 완전한 프로-ADAM10-RAP를 퓨린 억제제, α1-항트립신 포트랜드와 공동발현시켜 표준 생성주로부터 단리할 수 있다(Srour, et al. (2003) FEBS Lett 554, 275-283; Benjannet, et al. (1997) J Biol Chem 272, 26210-26218). 퓨린의 활성화는 이후에 뇌 간질에 도착시 또는 트랜스사이토시스 동안에, 조직으로 통과후 프로도메인의 제거를 통해 일어나게된다. 트랜스사이토시스 동안, 융합체는 LRP와의 회합으로 인해 막과 회합된다. 이후 융합체-수용체 복합체는 엔도솜 내에서 세포로 운반된다. 이전의 생체 내 및 시험관 내 실험은 트랜스사이토시스 동안 운반시 일부 단백질이 부분적으로 단백질 가수분해되는 것으로 확인되었다(Lisi, et al. (2003) J Endocrinol Invest 26, 1105-1110). 초기에 내피 세포로 세포내이입 또는 뉴런으로 최종 세포내이입 등의 ADAM10-RAP 접합체의 세포내이입은 초기 엔도솜에서 상기 융합체를 퓨린에 노출시키게 된다(Mayer, et al. (2004) J Histochem Cytochem 52, 567-579; Bosshart, et al. (1994) J Cell Biol 126, 1157-1172; Rohn, et al. (2000) J Cell Sci 113 (Pt 12), 2093-2101). ADAM10의 지연 활성화에 대한 다른 접근법은 프로도메인과 촉매 도메인을 연결하는 퓨린-감응성 펩티드를 ADAM-감응성 펩티드 링커로 교체하는 것이다. 생성된 세포주에서 변형된 프로도메인이 절단되는 정도까지, 이 반응은 히드록사메이트 억제제의 존재하에 배양하거나, 또는 TIMP1 또는 TIMP3과의 공동발현을 통해서 억제할 수 있다(Amour, et al. (2000) FEBS Lett 473, 275-279). 주변부에서 RAP 융합체의 반감기가 짧지만, ADAM-감응성 프로-ADAM10-RAP 융합체의 축적은 간질부 내에 뉴런 표면에서 내재하는 활성 ADAM10에 상기 융합체가 노출되도록 한다. 이후, 단백질 가수분새적인 사슬-반응이 일어나게 되고, 그 후 각각의 활성화된 ADAM10-RAP 융합체는 더 많은 ADAM10-RAP를 활성화시키게 된다. 만니톨과의 경동맥내 공동 투여를 비롯하여 수막강내 투여는 불활성화 ADAM10이 요구되지 않는다.

본 발명에서 고려하는 추가적인 신경 질환을 하기에 기술하였다. 예를 들어, 파킨슨병은 진동 및 운동 뉴런 기능 감소, 강직 및 무운동을 특징으로 한다. 이러한 신경 징후는 흑질, 즉, 흑질선조체의 주요 원심성 돌출부의 기능장애에 의한다. 도파민형성 시스템 내 뉴런의 세포체가 PD 진행에 관여하는 주요 세포이다. 원발성 파킨슨 증후군의 예는 다발 신경계 위축증(MSA)이라 알려진 증후군에 올리브교뇌소뇌변성 (OPCD) 및 샤이 드래거 증후군(SDS)과 함께 포함되는, 선조체 흑질 변성(SND), 비진행성 핵상 마비(PSP) 및 파킨슨병(PD)을 포함한다.

"루게릭병"이라고도 알려져 있는 근위축성측삭경화증(ALS)은 뇌 및 척수에서 운동 뉴런을 공격하는 진행성 신경변성 질환이다. ALS에서 운동 뉴런의 진행성 변성은 결국 이들을 사멸시켜서, 근육 운동을 개시하고 제어하는 뇌의 능력을 저하시킨다.

헌팅턴병(HD)은 유전성 질환이지만, 선조체 매질 가시 GABA 형성성 뉴런에서 뉴런의 변성을 야기한다(Hickey et al., Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 27:255-65, 2003). 이러한 변성은 비제어적인 운동성, 지적 능력 손실 및 정서 장애를 일으킨다.

다발성 경화증(MS)은 젊은층에서 빈번하지만 검증되지 않은 질환이다. 이 질환은 아마도 자가면역 유형의 염증 반응, 및 중추신경계에서 미엘린 형성 세포인 소돌기아교세포 손실과 연관된 탈수초화를 특징으로 한다. 최근 이용가능한 치료법은 MS의 염증 인자를 사용하지만, 재수초화에 대한 효능이 있더라도 거의 없다.

본 발명의 조성물은 뇌의 암 치료에 유용하다. 가장 일반적인 뇌 종양은 신경교종이며, 이는 아교 조직에서 시작된다. 성상세포종은 성상세포라고 하는 소형, 별 형태의 세포에서 발생하고, 성인 대뇌에서 주로 일어난다.

III 등급 성상세포종은 종종 역형성 성상세포종이라 한다. IV 등급 성상세포종은 일반적으로 다형성 교아종이라 한다. 뇌간 신경교종은 뇌의 최하부, 줄기 유사부분에서 발생한다. 뇌간은 많은 생명유지 기능을 제어한다. 대부분의 뇌간 신경교종은 고등급 성상세포종이다. 뇌실막세포종은 일반적으로 뇌실 안쪽에서 진행한다. 이는 또한 척수에서 발생할 수 있다. 소돌기신경교종은 신경을 보호하는 지방층인 미엘린을 생산하는 세포에서 일어난다. 이들 종양은 일반적으로 대뇌에서 발생한다. 이들은 서서히 증식하고 일반적으로 뇌조직 주변으로 퍼지지않는다. 수아세포종은 정상적으로는 출생 후에 신체에 남아있지 않는 원신 신경 세포에서부터 발병한다. 이러한 이유로, 수아세포종은 종종 원시 신경외배엽종양(PNET)이라고 한다. 대부분의 수아세포종은 소뇌에서 발생하지만, 다른 영역에서도 발생할 수 있다. 수막종은 뇌막에서부터 증식한다. 이들인 일반적으로 양성이다. 이들 종양이 서서히 증식하기 때문에 뇌는 이들 존재에 적응할 수 있게 된다. 따라서, 수막종은 증상이 야기되기 전에 상당히 크게 성장하게 된다. 신경초종은 청각 신경을 보호하는 미엘린을 생성하는 슈완 세포에서 시작되는 양성 종양이다. 청신경초종은 신경초종의 한 유형이다. 두개인두종은 시상하부 근처의 뇌하수체 영역에서 진행된다. 이들은 일반적으로 양성이지만, 때때로 시상하부를 압박하거나 손상을 입혀서 생명유지 기능에 영향을 줄 수 있기 때문에 심각한 악성일 수 있다. 생식세포 종양은 원시(발생) 성세포, 또는 생식세포에서 발생한다. 뇌에서 생식세포 종양의 가장 흔한 유형은 배세포종이다. 송과체 부위 종양은 송과선 안 또는 그 주변에서 발생한다. 이 종양은 서서히 증식하는 송과체종이거나 빠르게 증식하는 (송과체모세포종)이다. 송과체 영역은 도달하기가 매우 어려워서 이들 종양을 제거할 수 없는 경우가 있다.

뇌종양 치료는 다수의 인자에 따라 좌우된다. 이러한 인자들은 환자의 연령 및 전반적인 건강 상태를 비롯하여 종양의 유형, 위치 및 크기 등이다. 보통 뇌종양은 수술, 방사선 치료 및 화학치료법으로 치료한다. 일 측면에서, 본 발명은 환형 RAP 펩티드를 포함하는 조성물을 신경아세포종 또는 신경성 종양을 갖는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 신경아세포종 및 신경성 종양의 성장 및 진행을 억제하는 방법을 제공한다. 추가 측면에서 환형 RAP 펩티드는 신경성 종양을 치료하는데 유용한 제제에 접합시킬 수 있다.

GDNF

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 뉴런 성장 인자 예컨대 아교세포주 유래 신경영양인자(GDNF)에 접합된 환형 RAP 펩티드를 투여하여 신경변성 질환을 치료하는 방법을 제공하다. 이러한 신경변성 질환은 이에 제한되는 것은 아니고 파킨슨병을 포함한다. GDNF는 원래 배아 중뇌 도파민 뉴런에 대한 영양 인자로서 래트 신경교종 세포주 상등액으로부터 정제하였다. 생체 내에서, GDNF 동종이량체는 이의 수용체 GFRα-1(아마도 이 역시 이량체)에 결합한 후, GDNF-GFRα-1 복합체가 Ret 단백질에 결합해서, 이량체화된다. Ret의 이량체화는 티로신 1062의 자가인산화를 일으킨다. 실험에 의하면 GDNF는 다른 뉴런성 하위집단에 두드러진 영향을 준다. GDNF는 파킨슨병의 동물 모델에서 도파민 뉴런을 보호하고, 생체 내에서 운동뉴런을 안전하게 하기 때문에, 몇몇 신경변성 질환을 치료하기 위한 치료제로서 GDNF를 사용할 수 있을 것이라 기대되었다. 그러나, GDNF는 혈뇌 장벽을 횡단하지 못하다. 본 발명은 GDNF에 접합된 환형 RAP 펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 혈뇌 장벽을 통해 GDNF를 수송하는 방법을 제공하다.

iii. 간질환

본 발명의 환형 RAP 펩티드 또는 이의 접합체를 사용하여 치료할 수 있을 것으로 고려되는 간 질환에는 이에 제한되는 것은 아니며, 하기 기술한 질환들이 포함된다. 간세포 암종, 또는 간암은 전세계적으로 5번째로 흔한 암이고 발병률이 꾸준하게 증가하고 있다. 간세포 암종은 간세포의 질환이다. 종양형성성 간세포는 높은 수준으로 LRP1 발현을 유지한다. 간세포 암종은 이의 종양 세포가 약물 내성 비율이 높고 사용되는 화학치료제가 전신(정맥내) 투여되어 특히 심장과 신장에서 상당한 독성을 갖기 때문에 화학치료제에는 충분하게 반응하지 않는다.

간염은 간 염증에 대한 총칭이다. 간염은 급성 또는 만성일 수 있고, 예를 들어 바이러스(예를 들어, 간연바이러스 A, B, C, D 또는 E, 또는 비-ABCDE, CMV, 엡스테인-바), 진균, 리케치아 또는 기생체 감염, 알콜, 화학물 독소, 약물(예를 들어, 아세트아미노펜, 아미오다론, 이소니아지드, 할로탄, 클로르프로마진, 에리트로마이신)에 의한 급성 또는 만성 간부전, 대사성 간질환(예를 들어, 윌슨병, 알파1-항트립신 결핍증), 암, 특발성 자가면역 간질환, 간경화(예를 들어, 원발성 담도 경화), 담도 폐색을 포함한다. A, B 및/또는 C형 간염바이러스에 의한 간 감염은 간부전을 야기하는 간 질환으로 서서히 진행시킬 수 있다. 급성 간염바이러스 감염은 A형 간염바이러스에 의해 가장 일반적으로 야기된다. B형 간염바이러스 및 C형 간염바이러스 감염은 신체 내에서 지속될 수 있고 장기적인 감염이 될수 있다(만성). C형 간염바이러스는 간경화 및 암을 포함하여 위독한 병태를 야기할 수 있다.

환형 RAP 펩티드에 접합된 조성물을 사용하여 치료할 수 있는 추가적인 간질환 또는 병태는 간지방증(U.S. 특허 6,596,762), 담즙정체증(U.S. 특허 6,069,167), 간경화, 독성 간 손상, 간절제후 병태, 담즙 폐색을 포함한다.

간질환을 치료하기 위해 환형 RAP 펩티드에 접합하기 위한 후보 약물은 이에 제한되는 것은 아니고, 5-플루오로우라실, 독소루비신(아드리아마이신), 마이토마이신 C, 시스플라틴, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드, 및 하기 표 1에 기재한 다른 화학치료제, 아데포비르, 라미부딘, 엔테카비르, 리바비린, 인터페론 알파, PEG화 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b 및 기타 항바이러스제, 비타민 E, 우르소데옥시콜산, 및 기타 간질환 치료에 사용되는 제제를 포함한다.

iv. 암

매트립타제는 상피암, 예를 들어 암종 예컨대 난소, 자궁경부, 전립선, 유방, 폐, 결장 또는 위 암종 상에서 과발현된다. 다른 예에는 폐 중피종, 흑색종, 비소세포 폐암, 신경교종, 간세포(간) 암종, 갑상선 종양, 방광암, 교아세포종, 자궁내막암, 신장암, 췌장암 또는 비흑색종 피부암이 포함된다. 환형 RAP 펩티드를 사용하여 매트립타제 활성을 억제하거나 또는 세포독성 또는 다른 암치료제의 전달을 위한 표적화 제제로서 사용할 수 있다.

LRP6은 결장 및 유방암에서 과발현되는 것으로 확인되었다. 환형 RAP 펩티드를 사용하여 LRP6 활성을 억제하거나 또는 세포독성 또는 다른 암치료제의 전달을 위한 표적화 제제로서 사용할 수 있다.

본 발명의 환형 RAP 펩티드 또는 이의 접합체를 사용하여 치료할 수 있는 암의 다른 예에는 버킷 림프종, 비호지킨 림프종, B-세포 림프종, T-세포 림프종 및 백혈병이 포함된다.

v. 골 대사성 질환

본 발명의 환형 RAP 펩티드 및 이의 접합체를 사용하여 치료할 수 있는 골 대사성 질환은 골다공성과 연관된 골 질환(예를 들어, 비정상적인 골침착, 비정상적 골손실 또는 골 약화 등), 골화석증, 골염증, 관절염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 고코르티솔증, 성선기능저하증, 원발성 또는 속발성 부갑상선기능항진증 또는 갑상선기능항진증; 고칼슘혈증; 비타민 D 결핍증(예를 들어, 구루병/골연화증, 괴혈병, 영양실조), 흡수장애 증후군, 만성신부전증(신장성 골이영양증), 만성 간질환(간성 골이영양증), 노화 또는 부동성; 약물(글루코코르티코이드 또는 스테로이드, 헤파린, 알콜 등)에 의한 골다공증 또는 유전병(예를 들어, 불완전 골형성증, 호모시스틴뇨증), 골전이암, 골수종, 골절, 골이식, 섬유성 골이형성증 및 파제트병을 포함한다.

C. 환형 RAP 펩티드 및 활성 제제의 접합체

환형 RAP 펩티드 및 활성제제를 당분야에 공지된 임의 수단을 통해 부착시킬 수 있다. 이들은 예를 들어, 공유 화학 결합, 물리력 예컨대 반데발스 또는 소수성 상호작용 캡슐화, 삽입 또는 이의 조합 등을 통해 물리적으로 연결될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 치료제(들) 및 환형 RAP 펩티드를 공유 화학 결합을 통해 물리적으로 연결한다. 이와 같이, 바람직한 화학치료제는 RAP 펩티드에 접합하는데 사용하기 위해서 작용기 예컨대 알콜, 산, 카르보닐, 티올 또는 아민 기를 포함한다. 아드리아마이신은 아민 부류에 속하고 또한 카르보닐을 통해서 연결시킬 수 있는 가능성도 있다. 팍클리탁셀은 알콜 부류이다. 적절한 접합기가 없는 화학치료제는 이러한 기를 부가하기 위해 더욱 변형시킬 수 있다. 이러한 모든 화합물을 본 발명에서 고려한다. 다수의 치료제의 경우, 다양한 접합 조합물을 사용할 수 있다.

일 구체예에서, 직접적(개재 원자없이) 또는 간접적(링커, 예를 들어, 공유 연결된 원자 사슬 등)일 수 있는 공유 화학 결합은 RAP 펩티드와 활성 제제를 연결한다. 일 구체예에서, 접합체의 활성 제제 부분 및 RAP 펩티드는 RAP 펩티드의 원자와 활성 제제의 원자간에 공유 결합을 통해서 직접 연결된다. 다른 구체예에서, RAP 펩티드는 활성 제제 부분에 RAP 펩티드를 연결할 수 있는 임의의 분자 또는 원자 또는 실질적으로 임의 아미노산 서열의 펩티드 또는 공유 결합을 포함하는 링커에 의해 활성 제제 부분에 연결된다.

일 구체예에서, 링커는 1∼약 60 원자 사슬, 또는 1∼30 원자 또는 그 이상, 2∼5 원자, 2∼10원자, 5∼10 원자, 또는 10∼20 원자 길이의 사슬을 포함한다. 일 구체예에서, 사슬 원자는 모두 탄소 원자이다. 일 구체예에서, 사슬 원자는 C, O, N 및 S로 이루어진 군에서 선택된다. 사슬 원자 및 링커는 보다 가용성 접합체를 제공하도록 예상되는 가용성(친수성)에 따라 선택할 수 있다. 일 구체예에서, 링커는 리소좀에서 효소 공격을 받을 수 있는 작용기를 제공한다. 일 구체예에서, 링커는 표적 조직 또는 장기에서 발견되는 효소에 의해 공격받고, 공격시 또는 가수분해시에 활성 제제와 RAP 펩티드 사이의 연결을 끊는 작용기를 제공한다. 일 구체예에서, 링커는 표적 부위에서 발견되는 조건(예를 들어, 리소좀의 낮은 pH) 하에서 가수분해되는 작용기를 제공한다. 링커는 하나 이상의 이러한 작용기를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 링커의 길이는 활성 제제 활성 결합 부위 및 RAP 펩티드 결합 부위 중 하나 또는 둘 간에 입체 장애 가능성을 줄이기에 충분한 정도로 길다.

링커가 공유 결합이거나 또는 펩티드 및 활성 제제가 폴리펩티드이면, 전체 접합체는 융합 단백질일 수 있다. 이러한 펩티딜 링커는 임의 길이일 수 있다. 예시적인 링커는 길이가 약 1∼50 아미노산, 5∼50, 3∼5, 5∼10, 5∼15, 또는 10∼ 30 아미노산이다. 이러한 융합 단백질은 당분야의 숙련가에게 공지된 재조합 유전자 조작법으로 제조할 수 있다. 일 구체예에서, 접합체의 RAP 펩티드 부분은 활성 화합물을 방출하도록 절단되거나 빠르게 분해되도록 제형화된다. 다른 구체예에서, 링커는 세포 내에서, 또는 보다 바람직하게는 리소좀 환경 조건 하에서 절단되어서 RAP 펩티드 부분으로부터 활성 제제가 방출되거나 분리된다.

접합체는 동일한 RAP 펩티드에 연결된 하나 이상의 활성 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어 접합 반응은 RAP 펩티드에 대해 활성 제제 1∼5, 약 5, 약 1∼ 10, 약 5∼10, 약 10∼20, 약 20∼30, 또는 30 이상의 분자를 접합시킬 수 있다. 이러한 제형은 혼합물로서 사용하거나, 또는 특수한 화학양론적 제형으로 정제할 수 있다. 당분야의 숙련가는 제형 및 바람직한 화학양론비를 결정할 수 있다. 또한, 표적 부위 또는 구획에 하나 이상의 제제 유형을 전달하고자 하는 경우에는 하나 이상의 활성 제제 유형을 RAP 펩티드에 연결시킬 수 있다. 다수의 활성 제제 종을 동일한 RAP 펩티드에 부착시킬 수 있으며, 예를 들어 아드리아마이신-시스플라티넘 RAP 펩티드 접합체가 있다. 따라서, 접합체는 화학양론적 비율 범위로 구성될 수 있고 하나 이상의 활성 제제 유형을 도입시킬 수 있다. 또한, 이는 정제 혼합물로 분리되거나 또는 응집체로 사용할 수 있다.

본 발명의 환형 RAP 펩티드 또는 이의 접합체는 또한 안정성 또는 약동력학을 증가시키고자 하는 경우 변형시킬 수 있다(예를 들어, PEG화에 의함).

본 발명의 RAP 펩티드를 치료 단백질 예컨대 아교 세포 유래 뉴런 성장 인자(GDNF), 뇌유래 뉴런 성장 인자(BDNF), 뉴런 성장 인자(NGF), 당분야에 공지된 신경영양 인자, ADAM10, APP 또는 Aβ에 작용하는 다른 프로테아제, MESD, 암 화학치료제, 프로테아제 억제제, 자가면역 항원, 프로아폽토시스 분자, 리소좀 효소, DNA 또는 siRNA에 융합하거나 연결하는 것을 고려한다. CR 함유 단백질에 대한 친화력 또는 결합 선택성이 개선된 환형 RAP 펩티드와 이러한 제제의 융합체는 혈뇌 장벽 또는 다른 조직 부위를 가로지르는 수송성을 증가를 촉진하게 될 것으로 생각된다. 일 측면에서, 환형 RAP 펩티드에 접합은 접합체의 정맥내, 피하내, 근육내, 뇌실내, 수막강내 또는 뇌실질내 투여 후에 접합체의 조직 분포도를 변경시키거나 또는 전달성을 증가시키는 것으로 생각된다.

또한 환형 RAP 펩티드에 접합은 하나 이상의 하기 효과에 의해 야기되는 활성 제제의 약학 활성의 변경을 일으키도록 제공된다: 효능 증가, 목적하는 표적 수용체 또는 조직과 다른 수용체 또는 조직에 대한 결합성 감소, 목적으로 하는 표적 수용체 또는 조직인 수용체 또는 조직에 대한 결합성 증가, 신체에서의 제거율 변경 및 상기 단백질에 대한 면역 반응 특성 변경.

또한, 본 발명의 환형 RAP 펩티드는, 치료 핵산, 예컨대 DNA 또는 siRNA에 접합되어 상기 핵산의 조직 선택적 분포를 개선시키고 상기 핵산의 세포내로의 세포내이입을 촉진시키도록 제공된다(Kim et al., (2004) Bioconjugate Chemistry 15, 326-332).

D. 활성 제제

본 발명에 따른 활성 제제는 생물학적 과정에 영향을 줄 수 있는 제제를 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위해 특히 바람직한 활성 제제는 약물을 포함하는 치료제 및 진단제이다. 상기 용어 약물 또는 치료제는 치료 유효량을 투여시 건상에 혜택을 주거나 또는 약리학적 활성을 갖는 활성 제제를 의미한다. 특히 바람직한 제제는 천연 발생 생물학적 제제(예를 들어, 효소, 단백질, 폴리뉴클레오티드, 항체, 폴리펩티드, 나노입자, 당접합체)이다. 약물 또는 치료제의 예에는 질환 또는 병태의 예방, 진단, 경감, 치료 또는 치유에 사용되는 물질을 포함한다. 상기 제제는 질환을 야기하는 제제가 아님을 특히 유념한다.

i. 단백질 활성 제제

활성 제제는 비-단백질이거나 또는 단백질일 수 있다. 활성 제제는 단백질 또는 효소이거나 또는 이 단백질 또는 효소의 치료 또는 생물학적 활성의 일부, 실질적으로 전부, 또는 전부를 여전히 보유하는 임의 단편일 수 있다. 일 구체예에서, 단백질 또는 효소는 발현되거나 생성되지 않을 경우 또는 실질적으로 발현 또는 생성이 감소된 경우에, 이에 제한되는 것은 아니며 리소좀 축적병 등을 포함하는 질환을 일으키는 것이다. 바람직하게, 단백질 또는 효소는 인간 또는 마우스에서 유래하거나 또는 이로부터 얻는다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 환형 RAP 펩티드에 접합된 활성 제제가 단백질 또는 효소, 또는 이 단백질 또는 효소의 생물학적 활성을 보유하는 단편인 경우, 활성 제제는 인간 또는 포유류 단백질 또는 효소의 상응하는 부분에 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 다른 구체예에서, 접합체의 활성 제제의 부분은 인간 또는 포유류 종에서 천연인 단백질 또는 효소이다. 다른 구체예에서, 단백질 또는 효소, 또는 이의 단편은 상응하는 인간 또는 포유류 단백질 또는 효소의 천연 서열과 실질적으로 상동성이다(즉, 활성제제의 10, 25, 50, 100, 150, 또는 200 아미노산 이상의 길이, 또는 전체 길이에 걸친 아미노산 서열에서 동일성이 80%, 85%, 90%, 95%, 보다 바람직하게는 98%, 또는 가장 바람직하게는 99% 이상임).

화합물이 단백질인 경우, 이 화합물은 효소이거나, 또는 이 효소 활성의 일부, 실질적으로 전부, 또는 전부를 여전히 보유하는 이 효소의 임의 단편일 수 있다. 바람직하게, 리소좀 축적병의 치료에서, 효소는 발현 또는 생성되지 않을 경우 또는 발현 또는 생성이 실질적으로 감소한 경우에 리소좀 축적병을 일으키게 되는 세포에서 발견된 효소이다. 바람직하게, 효소는 인간 또는 마우스에서 유래하거나 또는 이로부터 얻는다. 바라직하게, 효소는 리소좀 저장 효소, 예컨대 α-L-이두로니다제, 이두로네이트-2-설파타제, 헤파란 N-설파타제, α-N-아세틸글루코사미니다제, 아릴설파타제 A, 갈락토실세라미다제, 산-알파-글루코시다제, 트리펩티딜 펩티다제, 헥소스아미니다제 알파, 산 스핑고미엘리나제, β-갈락토시다제, 또는 임의의 다른 리소좀 저장 효소이다.

일부 구체예에서, 인간 리소좀 축적병(LSD)을 치료하기 위해, 환형 RAP 펩티드 접합체는 치료하려는 피험체 또는 환자의 리소좀에 결핍된 활성 제제 단백질 또는 효소를 포함한다. 이러한 효소에는 예를 들어, 알파-L-이두로니다제, 이두로네이트-2-설파타제, 헤파란 N-설파타제, 알파-N- 세틸글루코사미니다제, 아릴설파타제 A, 갈락토실세라미다제, 산-알파-글루코시다제, 티오에스터라제, 헥소스아미니다제 A, 산 스핑고미엘리나제, 알파-갈락토시다제, 또는 임의의 다른 리소좀 저장 효소가 포함된다. 하기에, 리소좀 축적병 및 이에 결핍된, 활성 제제로서 유용한 단백질에 대한 표를 기재하였다:

따라서, 본 발명의 방법을 사용하여 치료하거나 또는 예방할 수 있는 리소좀 축적병은 이에 제한되는 것은 아니고, 점액다당류증 I(MPS I), MPS II, MPS IIIA, MPS IIIB, 이염성 백질이영양증 (MLD), 크라베, 폼페, 세로이드 리포푸신증, 타이-삭스, 니만-피크 A 및 B, 및 다른 리소좀 질환을 포함한다.

따라서, 상기 표를 통해, 각 질환에 대해 접합된 제제는 바람직하게 질환에서 결핍된 특정한 활성 제제 효소를 포함한다. 예를 들어, MPS I을 포함하는 방법에 대에서, 바람직한 화합물 또는 효소는 α-L-이두로니다제이다. MPS II를 포함하는 방법에 대해서, 바람직한 화합물 또는 효소는 이두로네이트-2-설파타제이다. MPS IIIA를 포함하는 방법에 대해서, 바람직한 화합물 또는 효소는 헤파란 N-설파타제이다. MPS IIIB를 포함하는 방법에 대해, 바람직한 화합물 또는 효소는 α-N-아세틸글루코사미니다제이다. 이염성백질이영양증(MLD)을 포함하는 방법에 대해, 바람직한 화합물 또는 효소는 아릴설파타제 A이다. 크라베를 포함하는 방법에 대해, 바람직한 화합물 또는 효소는 갈락토실세라미다제이다. 폼페를 포함하는 방법에 대해, 바람직한 화합물 또는 효소는 산 -글루코시다제이다. CLN을 포함하는 방법에 대해, 바람직한 화합물 또는 효소는 트리펩티딜 펩티다제이다. 타이-삭스를 포함하는 방법에 대해, 바람직한 화합물 또는 효소는 헥소스아미니다제 알파이다. 니만-피크 A 및 B를 포함하는 방법에 대해, 바람직한 화합물 또는 효소는 산 스핑고미엘리나제이다.

환형 RAP 펩티드 접합체는 환형 RAP 펩티드에 연결된 하나 이상의 활성 제제 부분(예를 들어, 1∼10, 또는 1∼4, 또는 2∼3 부분)을 포함한다. 예를 들어, 접합 반응은 단일 환형 RAP 펩티드에 1∼4 또는 그 이상의 알파-L-이두로니다제 분자를 접합시킬 수 있다. 이러한 제형을 혼합물로서 사용하거나, 또는 특수한 환형 RAP 펩티드-제제 화학양론 제형으로 정제할 수 있다. 당분야의 숙련가는 제형 및 바람직한 화학양론적 비율을 결정할 수 있다. 또한, 하나 이상의 상이한 활성 제제를 임의의 주어진 환형 RAP 펩티드 분자에 연결시켜서 저장된 기질의 보다 완전한 분해를 촉진시킬 수 있다. 이러한 환형 RAP 펩티드 접합된 제제는 화학양론적 비율 범위로 구성될 수 있다. 이들은 또한 정제된 혼합물로 분리되거나 또는 응집체로 사용할 수 있다. 융합체에서 LSD 및 환형 RAP 펩티드의 순서가 중요할 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 환형 RAP 펩티드는 LSD 효소에 대해 N 말단에 존재할 수 있고, 다른 구체예에서, 환형 RAP 펩티드는 LSD 효소에 대해 C-말단에 존재할 수 있다.

환형 RAP 펩티드 접합된 활성 제제는 CNS 내에서 또는 없이 세포의 리소좀으로 들어가서나 또는 수송되거나 또는 체류를 종결할 수 있다. 접합체의 통과(passage) 비율은 수용체 수송 활성을 조절할 수 있는 임의 화합물 또는 단백질에 의해 조절할 수 있다. 세포는 리소좀 저장 질환을 앓고 있는 임의 조직 또는 장기로부터 유래할 수 있다. 세포는 예를 들어, 내피, 상피, 근육, 심장, 뼈, 폐, 지방, 신장 또는 간 세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 바람직하게 BBB 내에 존재하는 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 뉴런 또는 뇌세포이다. 다른 구체예에서, 세포는 주변부 세포이거나 또는 BBB 등과 같이 내피에 의한 전체 순환에서 단리되지 않는 것이다.

ii. 약물 활성 제제

대체로, 약물 활성 제제는 임의 크기일 수 있다. 바람직한 약물은 목적 표적에 결합할 수 있는 소형 유기 분자이다. 접합체의 약물 부분은, 소형 분자인 경우, 대체로 분자량애 약 50 D 이상이고, 일반적으로 약 100 D 이상이고, 분자량이 500 D 이상만큼 큰 경우에서는 일반적으로 2000 D을 넘지 않는다.

약물 부분은 대상 방법을 실시하는 동안 접합체를 투여하는 숙주내 표적과 상호작용할 수 있다. 표적은 다수의 상이한 유형의 천연 발생 구조물일 수 있고, 여기서 목적 표적은 세포내 및 세포외 표적 둘 모두를 포함하며, 이러한 표적에는 단백질, 인지질, 핵산 등이 포함되는데, 단백질이 특히 흥미롭다. 목적하는 특정 단백질성 표적은 이에 제한되는 것은 아니고, 효소 예를 들어 키나제, 포스파타제, 리덕타제, 시클로옥시게나제, 프로테아제 등, 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 도메인을 포함하는 표적, 예컨대 SH2, SH3, PTB 및 PDZ 도메인, 구조 단백질, 예를 들어 액틴, 튜불린 등, 막 수용체, 면역글로불린, 예를 들어 IgE, 세포 부착 수용체, 예컨대 인테그린 등, 이온 채널, 막관통 펌프, 전사 인자, 신호화 단백질 등을 포함한다.

일 구체예에서, 활성 제제 또는 약물은 이소시아네이트 시약과의 반응을 위해 아미노 기 또는 히드록실기를 가지거나 또는 활성 제제를 이소시아네이트 시약과의 반응을 위하여 히드록실 또는 아미노기를 도입하도록 화학적으로 변형시킨다.

일 구체예에서, 활성 제제 또는 약물은 바람직하게는 활성 제제의 목적하는 생물학적 활성 손실없이, 공유 결합에 관여 및/또는 변형될 수 있는 영역을 포함한다. 약물 부분은 종종 상기 작용기 중 하나 이상으로 치환된 순환 탄소 또는 복소환 구조 및/또는 방향족 또는 폴리방향족 구조를 포함한다. 또한 약물 부분으로서 관심 대상은 생체 분자에서 발견되는 구조물, 펩티드 사카라이드, 지방산, 스테로이드, 푸린, 피리미딘 등을 포함하는, 생체분자, 단백질, 효소, 다당류, 및 폴리핵산, 유도체, 구조 유사체 또는 이의 조합 등이다.

적절한 활성 제제는 이에 제한되는 것은 아니고, 정신약물 제제, 예컨대 (1) 중추신경계 진정제, 예를 들어 전신마취제(바비튜레이트, 벤조디아제핀, 스테로이드, 시클로헥사논 유도체, 및 기타 제제), 진정-수면제(벤조디아제핀, 바비튜레이트, 피페리딘디온 및 트리온, 퀴나졸린 유도체, 카바메이트, 알데히드 및 유도체, 아미드, 비환형 우레이드, 벤자제핀 및 관련 약물, 페노티아진 등), 중추 수의근 긴장 변형 약물 (경련억제제, 예컨대 히드란토인, 바비튜레이트, 옥사졸리딘디온, 숙신이미드, 아실우레이드, 글루타르이미드, 벤조디아제핀, 2차 및 3차 알콜, 디벤자제핀 유도체, 발프르산 및 유도체, GABA 유사체 등), 진통제 (몰핀 및 유도체, 오리파빈 유도체, 몰피난 유도체, 페닐피페리딘, 2,6-메탄-3-벤즈아조카인 유도체, 디페닐프로필아민 및 이소스테르, 살리실레이트, p-아미노페놀 유도체, 5-피라졸론 유도체, 아릴아세트산 유도체, 페나메이트 및 이소스테르 등) 및 구토억제제(콜린억제제, 항히스타민제, 항도파민제 등), (2) 중추신경계 자극제 예를 들어, 강장제(호흡 자극제, 경련 자극제, 정신운동 자극제), 마약 길항제(몰핀 유도체, 오리파빈 유도체, 2,6-메탄-3-벤즈옥사신 유도체, 몰피난 유도체) 정신부활약, (3) 정신약물, 예를 들어, 불안완화 진정제(벤조디아제핀, 프로판디올 카바메이트), 항정신병제(페노티아진 유도체, 티오잔틴 유도체, 다른 삼중환형 화합물, 부티로페논 유도체 및 이소스테르, 디페닐부틸아민 유도체, 치환된 벤즈아미드, 아릴피페라진 유도체, 인돌 유도체 등), 항울제(삼중환형 화합물, MAO 억제제 등), (4) 호흡관 약물, 예를 들어 중추 진해제(오퓸 알칼로이드 및 이의 유도체); 약력학 제제, 예컨대 (1) 말초신경계 약물, 예를 들어 국소 마취제(에스테르 유도체, 아미드 유도체), (2) 시냅스 또는 신경효과기 연접 부위 작용 약물, 예를 들어 콜린효능제, 콜린효능 차단제, 아드레날린성 제제, 항아드레날린성 제제, (3) 평활근 활성 약물, 예를 들어, 진경제(콜린억제제, 근친화성 진경제), 혈관확장제, 평활근 자극제 (4) 히스타민 및 항히스타민제, 예를 들어, 히스타민 및 이의 유도체(베타졸), 항히스타민(H1-길항제, H2 -길항제), 히스타민 대사 약물, (5) 심혈관 약물, 예를 들어, 강심제(식물 추출물, 부테놀리드, 펜타디에놀리드, 에리트로플레움(erythrophleum) 종 유래 알칼로이드칼랄로이드, 이온운반체, 아드레노셉터 자극제 등), 항부정맥제, 항고혈압제, 항고지혈제(클로피브르산 유도체, 니코틴산 유도체, 호르몬 및 유사체, 항생제, 살리실산 및 유도체), 항정맥류제, 지혈제, (6) 혈액 및 조혈계 약물, 예를 들어, 항빈혈제, 혈액 응고 약물(지혈제, 항응고제, 항혈전제, 혈전용해제, 혈액 단백질 및 이들의 분획), (7) 위장관 약물, 예를 들어 소화제(건위제, 담즙분비촉진제), 항궤양제, 지사제, (8) 국소 작용제; 화학치료제, 예를 들어 (1) 항감염제, 예를 들어 체외기생충 구충제(염화 탄화수소, 피레틴, 황화 화합물), 회충제, 항원충제, 항말라리아제, 항아메바제, 항레슈마니아제(antileiscmanial agent), 항트리코모나스제(antitrichomonal agent), 항트리파노소마제(antitrypanosomal agent), 설폰아미다, 항미코박테리아제, 항바이러스 화학치료제등, 및 (2) 세포증식억제제, 즉, 항신생물제 또는 세포독성제, 예컨대 알킬화제, 예를 들어, 메클로레타민 히드로클로라이드(질소 머스타드, 머스타르겐, HN2), 시클로포스파미드(사이토반, 엔독산), 이포스파미드 IFEX), 클로람부실(류케란), 멜팔란(페닐알라닌 머스타드, L-사르코라이신, 알케란, L-PAM), 부설판(밀레란), 티오테마(트리에틸렌티오포스포르아미드), 카르무스틴(BiCNU, BCNU), 로무스틴(CeeNU, CCNU), 스트렙토조신(자노사르) 등; 식물 알칼로이드, 예를 들어 빈크리스틴(온고빈), 빈블라스틴(벨반, 벨베), 파클리탁셀(탁솔) 등; 항대사산물, 예를 들어, 메토트렉세이트(MTX), 머캅토푸린(푸린네톨, 6-MP), 티오구아닌(6-TG), 플루오로우라실(5-FU), 시타라빈(사이토사르-U, Ara-C), 아자시티딘(밀로사르, 5-AZA) 등; 항생제, 예를 들어, 닥티노마이신(악티노마이신 D, 코스메겐), 독소루비신 (아드리아마이신), 다우노루비신 (두아노마이신, 세루비딘), 이다루비신(이다마이신), 블레오마이신(블레녹산), 피카마이신(미트라마이신, 미트라신), 마이토마이신(무타마이신) 등, 기타 항세포증식제, 예를 들어 히드록시우레아(히드레아), 프로카르바진(무탈란), 다카르바진 (DTIC-Dome), 시스플라틴(플라티놀) 카르보플라틴(파라플라틴), 아스파라기나제(엘스파르) 에토포시드(VePesid, VP-16-213), 암사르크린(AMSA, m-AMSA), 미토탄(리소드렌), 미톡산트론(노바트론), 등을 포함한다. 바람직한 화학치료제는, 유리 형태로 존재하는, 바람직한 용량에서 허용되지 않는 전신 독성을 검증한 것이다. 이러한 제제의 치료 농도와 연관된 전신 독성은 환형 RAP에 이들을 연결하여 줄일 수 있다. 특히 바람직한 것은 치료제로 유용하지만 심장독성으로 용량이 제한적인 심장독성 화합물이다. 고전적인 예로는 아드리아마이신(독소루비신이라고도 알려짐) 및 이의 유도체, 예컨대 다우노루비신이다. 이러한 약물에 환형 RAP 펩티드 연결은 심장 및 연관 심장독성에 활성 제제의 축적을 방지한다.

적절한 활성 제제는 이에 제한되지 않으며; 항생체, 예컨대 아미노글리코시드, 예를 들어 아미카신, 아프라마이신, 아르베카신, 밤베르마이신, 부티로신, 디페카신, 디히드로스트렙토마이신, 포르티미신, 젠타미신, 이세파미신, 카나마이신, 마이크로놈신, 네오마이신, 네틸미신, 파로마이신, 리보스타마이신, 시소미신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 트로스펙토마이신; 암페니콜, 예컨대 아지담페니콜, 클로람페니콜, 플로르페니콜, 및 테이마페니콜; 안사마이신, 예를 들어 리파미신, 리팜핀, 리파마이신, 리파펜틴, 리팍시민; 베타-락탐, 예를 들어, 카르바세펨, 카르바페넴, 세팔로스포린, 세파마이신, 모노박탐, 옥사펨, 페니실린; 린코사미드, 예를 들어 클리나마이신, 린코마이신; 마크로리드, 예를 들어 클리트로마이신, 디르트로마이신, 에리트로마이신 등; 폴리펩티드 예를 들어 암포마이신, 박시트라신, 카프레오마이신 등; 테트라사이클린, 예를 들어 아피사이클린, 클로르테트라사이클린, 클로모사이클린 등; 합성 항박테리아제, 예컨대 2,4-디아미노피리미딘, 니트로퓨란, 퀴놀론 및 이의 유사체 설폰아미드, 설폰을 포함한다;

적절한 활성 제제는 이에 제한되는 것은 아니고; 항진균제, 예를 들어 폴리엔, 예를 들어 암포테리신 B, 칸디시딘, 데르모스타틴, 필리핀, 펀지크로민, 하키마이신, 하마이신, 루센소마이신, 메파르트리신, 나타마이신, 나이스타틴, 페실로신, 페리마이신; 합성 항진균제, 예컨대 알릴아민, 예를 들어 부텐아핀, 나프티핀, 테르비나핀; 이미다졸, 예를 들어 비포나졸, 부토코나졸, 클로르단토인, 클로르미다졸 등, 티오카바메이트, 예를 들어 톨시크레이트, 트리아졸, 예를 들어 플루코나졸, 이트라코나졸, 테르코나졸을 포함한다;

적절한 활성 제제는 이에 제한되는 것은 아니고, 구충제, 예컨대 아레콜린, 아스피딘, 아스피디놀, 디클로로펜, 엠벨린, 코신, 납탈렌, 니클로사미드, 펠레티에린, 퀴나크린, 알란토락톤, 아모카르진, 아모스카네이트, 아스카리돌, 베페니움, 비토스카네이트, 사염화탄소, 카르바크롤, 시클로벤다졸, 디에틸카르바마진 등을 포함한다;

적절한 활성 제제는 이에 제한되는 것은 아니고 항말라리아제, 예컨대 아세답손, 아모디아퀸, 아르테에테르, 아르테메테르, 아르테미시닌, 아르테수네이트, 아토바퀴온, 베베에린, 베르베린, 키라타, 클로르구아니드, 클로로퀸, 클로르프로가우닐, 신코나, 신코니딘, 신코닌, 시클로구아닐, 젠티오피크린, 할로판트린, 히드록시클로로퀸, 메플로퀸 히드로클로라이드, 3-메틸아르사세틴, 파마퀸, 플라스모시드, 프리마퀸, 피리메타민, 퀴나크린, 퀴니딘, 퀴닌, 퀴노시드, 퀴놀린, 2염기성 나트륨 아르세네이트를 포함한다;

적절한 활성 제제는 이에 제한되는 것은 아니고, 항원충제, 예컨대 아크라닐, 티니다졸, 이프로니다졸, 이테리스티바민, 펜타미딘, 아세타르손, 아미니트로졸, 아니소마이신, 니프라텔, 티니다졸, 벤지다졸, 수라민 등을 포함한다.

활성 제제로 사용하기 적절한 약물은 또한 하기 문헌 [Goodman and Gilman's, The Pharmacological Basis of Therapeutics (9th Ed) (Goodman et al. eds) (McGraw-Hill) (1996); and 1999 Physician's Desk Reference (1998)]에 열거되어 있다.

적절한 활성 제제는 다음을 포함한다: U.S. 특허 5,880,161, 5,877,206, 5,786,344, 5,760,041, 5,753,668, 5,698,529, 5,684,004, 5,665,715, 5,654,484, 5,624,924, 5,618,813, 5,610,292, 5,597,831, 5,530,026, 5,525,633, 5,525,606, 5,512,678, 5,508,277, 5,463,181, 5,409,893, 5,358,952, 5,318,965, 5,223,503, 5,214,068, 5,196,424, 5,109,024, 5,106,996, 5,101,072, 5,077,404, 5,071,848, 5,066,493, 5,019,390, 4,996,229, 4,996,206, 4,970,318, 4,968,800, 4,962,114, 4,927,828, 4,892,887, 4,889,859, 4,886,790, 4,882,334, 4,882,333, 4,871,746, 4,863,955, 4,849,563, 4,845,216, 4,833,145, 4,824,955, 4,785,085, 4,684,747, 4,618,685, 4,611,066, 4,550,187, 4,550,186, 4,544,501, 4,541,956, 4,532,327, 4,490,540, 4,399,283, 4,391,982, 4,383,994, 4,294,763, 4,283,394, 4,246,411, 4,214,089, 4,150,231, 4,147,798, 4,056,673, 4,029,661, 4,012,448에 개시된 항신생물제;

U.S. 특허 5,192,799, 5,036,070, 4,778,800, 4,753,951, 4,590,180, 4,690,930, 4,645,773, 4,427,694, 4,424,202, 4,440,781, 5,686,482, 5,478,828, 5,461,062, 5,387,593, 5,387,586, 5,256,664, 5,192,799, 5,120,733, 5,036,070, 4,977,167, 4,904,663, 4,788,188, 4,778,800, 4,753,951, 4,690,930, 4,645,773, 4,631,285, 4,617,314, 4,613,600, 4,590,180, 4,560,684, 4,548,938, 4,529,727, 4,459,306, 4,443,451, 4,440,781, 4,427,694, 4,424,202, 4,397,853, 4,358,451, 4,324,787, 4,314,081, 4,313,896, 4,294,828, 4,277,476, 4,267,328, 4,264,499, 4,231,930, 4,194,009, 4,188,388, 4,148,796, 4,128,717, 4,062,858, 4,031,226, 4,020,072, 4,018,895, 4,018,779, 4,013,672, 3,994,898, 3,968,125, 3,939,152, 3,928,356, 3,880,834, 3,668,210에 개시된 정신약물제/향정신제;

U.S. 특허 4,966,967, 5,661,129, 5,552,411, 5,332,737, 5,389,675, 5,198,449, 5,079,247, 4,966,967, 4,874,760, 4,954,526, 5,051,423, 4,888,335, 4,853,391, 4,906,634, 4,775,757, 4,727,072, 4,542,160, 4,522,949, 4,524,151, 4,525,479, 4,474,804, 4,520,026, 4,520,026, 5,869,478, 5,859,239, 5,837,702, 5,807,889, 5,731,322, 5,726,171, 5,723,457, 5,705,523, 5,696,111, 5,691,332, 5,679,672, 5,661,129, 5,654,294, 5,646,276, 5,637,586, 5,631,251, 5,612,370, 5,612,323, 5,574,037, 5,563,170, 5,552,411, 5,552,397, 5,547,966, 5,482,925, 5,457,118, 5,414,017, 5,414,013, 5,401,758, 5,393,771, 5,362,902, 5,332,737, 5,310,731, 5,260,444, 5,223,516, 5,217,958, 5,208,245, 5,202,330, 5,198,449, 5,189,036, 5,185,362, 5,140,031, 5,128,349, 5,116,861, 5,079,247, 5,070,099, 5,061,813, 5,055,466, 5,051,423, 5,036,065, 5,026,712, 5,011,931, 5,006,542, 4,981,843, 4,977,144, 4,971,984, 4,966,967, 4,959,383, 4,954,526, 4,952,692, 4,939,137, 4,906,634, 4,889,866, 4,888,335, 4,883,872, 4,883,811, 4,847,379, 4,835,157, 4,824,831, 4,780,538, 4,775,757, 4,774,239, 4,771,047, 4,769,371, 4,767,756, 4,762,837, 4,753,946, 4,752,616, 4,749,715, 4,738,978, 4,735,962, 4,734,426, 4,734,425, 4,734,424, 4,730,052, 4,727,072, 4,721,796, 4,707,550, 4,704,382, 4,703,120, 4,681,970, 4,681,882, 4,670,560, 4,670,453, 4,668,787, 4,663,337, 4,663,336, 4,661,506, 4,656,267, 4,656,185, 4,654,357, 4,654,356, 4,654,355, 4,654,335, 4,652,578, 4,652,576, 4,650,874, 4,650,797, 4,649,139, 4,647,585, 4,647,573, 4,647,565, 4,647,561, 4,645,836, 4,639,461, 4,638,012, 4,638,011, 4,632,931, 4,631,283, 4,628,095, 4,626,548, 4,614,825, 4,611,007, 4,611,006, 4,611,005, 4,609,671, 4,608,386, 4,607,049, 4,607,048, 4,595,692, 4,593,042, 4,593,029, 4,591,603, 4,588,743, 4,588,742, 4,588,741, 4,582,854, 4,575,512, 4,568,762, 4,560,698, 4,556,739, 4,556,675, 4,555,571, 4,555,570, 4,555,523, 4,550,120, 4,542,160, 4,542,157, 4,542,156, 4,542,155, 4,542,151, 4,537,981, 4,537,904, 4,536,514, 4,536,513, 4,533,673, 4,526,901, 4,526,900, 4,525,479, 4,524,151, 4,522,949, 4,521,539, 4,520,026, 4,517,188, 4,482,562, 4,474,804, 4,474,803, 4,472,411, 4,466,979, 4,463,015, 4,456,617, 4,456,616, 4,456,615, 4,418,076, 4,416,896, 4,252,815, 4,220,594, 4,190,587, 4,177,280, 4,164,586, 4,151,297, 4,145,443, 4,143,054, 4,123,550, 4,083,968, 4,076,834, 4,064,259, 4,064,258, 4,064,257, 4,058,620, 4,001,421, 3,993,639, 3,991,057, 3,982,010, 3,980,652, 3,968,117, 3,959,296, 3,951,950, 3,933,834, 3,925,369, 3,923,818, 3,898,210, 3,897,442, 3,897,441, 3,886,157, 3,883,540, 3,873,715, 3,867,383, 3,873,715, 3,867,383, 3,691,216, 3,624,126에 개시된 심혈관제;

U.S. 특허 5,902,594, 5,874,476, 5,874,436, 5,859,027, 5,856,320, 5,854,242, 5,811,091, 5,786,350, 5,783,177, 5,773,469, 5,762,919, 5,753,715, 5,741,526, 5,709,870, 5,707,990, 5,696,117, 5,684,042, 5,683,709, 5,656,591, 5,643,971, 5,643,950, 5,610,196, 5,608,056, 5,604,262, 5,595,742, 5,576,341, 5,554,373, 5,541,233, 5,534,546, 5,534,508, 5,514,715, 5,508,417, 5,464,832, 5,428,073, 5,428,016, 5,424,396, 5,399,553, 5,391,544, 5,385,902, 5,359,066, 5,356,803, 5,354,862, 5,346,913, 5,302,592, 5,288,693, 5,266,567, 5,254,685, 5,252,745, 5,209,930, 5,196,441, 5,190,961, 5,175,160, 5,157,051, 5,096,700, 5,093,342, 5,089,251, 5,073,570, 5,061,702, 5,037,809, 5,036,077, 5,010,109, 4,970,226, 4,916,156, 4,888,434, 4,870,093, 4,855,318, 4,784,991, 4,746,504, 4,686,221, 4,599,228, 4,552,882, 4,492,700, 4,489,098, 4,489,085, 4,487,776, 4,479,953, 4,477,448, 4,474,807, 4,470,994, 4,370,484, 4,337,199, 4,311,709, 4,308,283, 4,304,910, 4,260,634, 4,233,311, 4,215,131, 4,166,122, 4,141,981, 4,130,664, 4,089,977, 4,089,900, 4,069,341, 4,055,655, 4,049,665, 4,044,139, 4,002,775, 3,991,201, 3,966,968, 3,954,868, 3,936,393, 3,917,476, 3,915,889, 3,867,548, 3,865,748, 3,867,548, 3,865,748, 3,783,160, 3,764,676, 3,764,677에 개시된 항미생물제;

U.S. 특허 5,872,109, 5,837,735, 5,827,837, 5,821,250, 5,814,648, 5,780,026, 5,776,946, 5,760,002, 5,750,543, 5,741,798, 5,739,279, 5,733,939, 5,723,481, 5,716,967, 5,688,949, 5,686,488, 5,686,471, 5,686,434, 5,684,204, 5,684,041, 5,684,031, 5,684,002, 5,677,318, 5,674,891, 5,672,620, 5,665,752, 5,656,661, 5,635,516, 5,631,283, 5,622,948, 5,618,835, 5,607,959, 5,593,980, 5,593,960, 5,580,888, 5,552,424, 5,552,422, 5,516,764, 5,510,361, 5,508,026, 5,500,417, 5,498,405, 5,494,927, 5,476,876, 5,472,973, 5,470,885, 5,470,842, 5,464,856, 5,464,849, 5,462,952, 5,459,151, 5,451,686, 5,444,043, 5,436,265, 5,432,181, RE034918, 5,393,756, 5,380,738, 5,376,670, 5,360,811, 5,354,768, 5,348,957, 5,347,029, 5,340,815, 5,338,753, 5,324,648, 5,319,099, 5,318,971, 5,312,821, 5,302,597, 5,298,633, 5,298,522, 5,298,498, 5,290,800, 5,290,788, 5,284,949, 5,280,045, 5,270,319, 5,266,562, 5,256,680, 5,250,700, 5,250,552, 5,248,682, 5,244,917, 5,240,929, 5,234,939, 5,234,937, 5,232,939, 5,225,571, 5,225,418, 5,220,025, 5,212,189, 5,212,172, 5,208,250, 5,204,365, 5,202,350, 5,196,431, 5,191,084, 5,187,175, 5,185,326, 5,183,906, 5,177,079, 5,171,864, 5,169,963, 5,155,122, 5,143,929, 5,143,928, 5,143,927, 5,124,455, 5,124,347, 5,114,958, 5,112,846, 5,104,656, 5,098,613, 5,095,037, 5,095,019, 5,086,064, 5,081,261, 5,081,147, 5,081,126, 5,075,330, 5,066,668, 5,059,602, 5,043,457, 5,037,835, 5,037,811, 5,036,088, 5,013,850, 5,013,751, 5,013,736, 5,006,542, 4,992,448, 4,992,447, 4,988,733, 4,988,728, 4,981,865, 4,962,119, 4,959,378, 4,954,519, 4,945,099, 4,942,236, 4,931,457, 4,927,835, 4,912,248, 4,910,192, 4,904,786, 4,904,685, 4,904,674, 4,904,671, 4,897,397, 4,895,953, 4,891,370, 4,870,210, 4,859,686, 4,857,644, 4,853,392, 4,851,412, 4,847,303, 4,847,290, 4,845,242, 4,835,166, 4,826,990, 4,803,216, 4,801,598, 4,791,129, 4,788,205, 4,778,818, 4,775,679, 4,772,703, 4,767,776, 4,764,525, 4,760,051, 4,748,153, 4,725,616, 4,721,712, 4,713,393, 4,708,966, 4,695,571, 4,686,235, 4,686,224, 4,680,298, 4,678,802, 4,652,564, 4,644,005, 4,632,923, 4,629,793, 4,614,741, 4,599,360, 4,596,828, 4,595,694, 4,595,686, 4,594,357, 4,585,755, 4,579,866, 4,578,390, 4,569,942, 4,567,201, 4,563,476, 4,559,348, 4,558,067, 4,556,672, 4,556,669, 4,539,326, 4,537,903, 4,536,503, 4,518,608, 4,514,415, 4,512,990, 4,501,755, 4,495,197, 4,493,839, 4,465,687, 4,440,779, 4,440,763, 4,435,420, 4,412,995, 4,400,534, 4,355,034, 4,335,141, 4,322,420, 4,275,064, 4,244,963, 4,235,908, 4,234,593, 4,226,887, 4,201,778, 4,181,720, 4,173,650, 4,173,634, 4,145,444, 4,128,664, 4,125,612, 4,124,726, 4,124,707, 4,117,135, 4,027,031, 4,024,284, 4,021,553, 4,021,550, 4,018,923, 4,012,527, 4,011,326, 3,998,970, 3,998,954, 3,993,763, 3,991,212, 3,984,405, 3,978,227, 3,978,219, 3,978,202, 3,975,543, 3,968,224, 3,959,368, 3,949,082, 3,949,081, 3,947,475, 3,936,450, 3,934,018, 3,930,005, 3,857,955, 3,856,962, 3,821,377, 3,821,401, 3,789,121, 3,789,123, 3,726,978, 3,694,471, 3,691,214, 3,678,169, 3,624,216에 개시된 항염증제;

U.S. 특허 4,450,159, 4,450,159, 5,905,085, 5,883,119, 5,880,280, 5,877,184, 5,874,594, 5,843,452, 5,817,672, 5,817,661, 5,817,660, 5,801,193, 5,776,974, 5,763,478, 5,739,169, 5,723,466, 5,719,176, 5,696,156, 5,695,753, 5,693,648, 5,693,645, 5,691,346, 5,686,469, 5,686,424, 5,679,705, 5,679,640, 5,670,504, 5,665,774, 5,665,772, 5,648,376, 5,639,455, 5,633,277, 5,624,930, 5,622,970, 5,605,903, 5,604,229, 5,574,041, 5,565,560, 5,550,233, 5,545,734, 5,540,931, 5,532,248, 5,527,820, 5,516,797, 5,514,688, 5,512,687, 5,506,233, 5,506,228, 5,494,895, 5,484,788, 5,470,857, 5,464,615, 5,432,183, 5,431,896, 5,385,918, 5,349,061, 5,344,925, 5,330,993, 5,308,837, 5,290,783, 5,290,772, 5,284,877, 5,284,840, 5,273,979, 5,262,533, 5,260,300, 5,252,732, 5,250,678, 5,247,076, 5,244,896, 5,238,689, 5,219,884, 5,208,241, 5,208,228, 5,202,332, 5,192,773, 5,189,042, 5,169,851, 5,162,334, 5,151,413, 5,149,701, 5,147,877, 5,143,918, 5,138,051, 5,093,338, 5,091,389, 5,068,323, 5,068,247, 5,064,835, 5,061,728, 5,055,290, 4,981,792, 4,810,692, 4,410,696, 4,346,096, 4,342,769, 4,317,825, 4,256,766, 4,180,588, 4,000,275, 3,759,921에 개시된 면역억제제;

U.S. 특허 4,446,128, 4,524,147, 4,720,484, 4,722,899, 4,748,018, 4,877,619, 4,998,931, 5,049,387, 5,118,509, 5,152,980, 5,256,416, 5,468,729, 5,583,139, 5,604,234, 5,612,060, 5,612,350, 5,658,564, 5,672,605, 5,681,571, 5,708,002, 5,723,718, 5,736,143, 5,744,495, 5,753,687, 5,770,201, 5,869,057, 5,891,653, 5,939,455, 5,948,407, 6,006,752, 6,024,957, 6,030,624, 6,037,372, 6,037,373, 6,043,247, 6,060,049, 6,087,096, 6,096,315, 6,099,838, 6,103,235, 6,124,495, 6,153,203, 6,169,087, 6,255,278, 6,262,044, 6,290,950, 6,306,651, 6,322,796, 6,329,153, 6,344,476, 6,352,698, 6,365,163, 6,379,668, 6,391,303, 6,395,767, 6,403,555, 6,410,556, 6,412,492, 6,468,537, 6,489,330, 6,521,232, 6,525,035, 6,525,242, 6,558,663, 6,572,860에 개시된 면역조절제;

U.S. 특허 5,292,736, 5,688,825, 5,554,789, 5,455,230, 5,292,736, 5,298,522, 5,216,165, 5,438,064, 5,204,365, 5,017,578, 4,906,655, 4,906,655, 4,994,450, 4,749,792, 4,980,365, 4,794,110, 4,670,541, 4,737,493, 4,622,326, 4,536,512, 4,719,231, 4,533,671, 4,552,866, 4,539,312, 4,569,942, 4,681,879, 4,511,724, 4,556,672, 4,721,712, 4,474,806, 4,595,686, 4,440,779, 4,434,175, 4,608,374, 4,395,402, 4,400,534, 4,374,139, 4,361,583, 4,252,816, 4,251,530, 5,874,459, 5,688,825, 5,554,789, 5,455,230, 5,438,064, 5,298,522, 5,216,165, 5,204,365, 5,030,639, 5,017,578, 5,008,264, 4,994,450, 4,980,365, 4,906,655, 4,847,290, 4,844,907, 4,794,110, 4,791,129, 4,774,256, 4,749,792, 4,737,493, 4,721,712, 4,719,231, 4,681,879, 4,670,541, 4,667,039, 4,658,037, 4,634,708, 4,623,648, 4,622,326, 4,608,374, 4,595,686, 4,594,188, 4,569,942, 4,556,672, 4,552,866, 4,539,312, 4,536,512, 4,533,671, 4,511,724, 4,440,779, 4,434,175, 4,400,534, 4,395,402, 4,391,827, 4,374,139, 4,361,583, 4,322,420, 4,306,097, 4,252,816, 4,251,530, 4,244,955, 4,232,018, 4,209,520, 4,164,514, 4,147,872, 4,133,819, 4,124,713, 4,117,012, 4,064,272, 4,022,836, 3,966,944에 개시된 진통제;

U.S. 특허 5,219,872, 5,219,873, 5,073,560, 5,073,560, 5,346,911, 5,424,301, 5,073,560, 5,219,872, 4,900,748, 4,786,648, 4,798,841, 4,782,071, 4,710,508, 5,482,938, 5,464,842, 5,378,723, 5,346,911, 5,318,978, 5,219,873, 5,219,872, 5,084,281, 5,073,560, 5,002,955, 4,988,710, 4,900,748, 4,798,841, 4,786,648, 4,782,071, 4,745,123, 4,710,508에 개시된 콜린효능제;

U.S. 특허 5,091,528, 5,091,528, 4,835,157, 5,708,015, 5,594,027, 5,580,892, 5,576,332, 5,510,376, 5,482,961, 5,334,601, 5,202,347, 5,135,926, 5,116,867, 5,091,528, 5,017,618, 4,835,157, 4,829,086, 4,579,867, 4,568,679, 4,469,690, 4,395,559, 4,381,309, 4,363,808, 4,343,800, 4,329,289, 4,314,943, 4,311,708, 4,304,721, 4,296,117, 4,285,873, 4,281,189, 4,278,608, 4,247,710, 4,145,550, 4,145,425, 4,139,535, 4,082,843, 4,011,321, 4,001,421, 3,982,010, 3,940,407, 3,852,468, 3,832,470에 개시된 아드레날린성 제제;

U.S. 특허 5,874,479, 5,863,938, 5,856,364, 5,770,612, 5,702,688, 5,674,912, 5,663,208, 5,658,957, 5,652,274, 5,648,380, 5,646,190, 5,641,814, 5,633,285, 5,614,561, 5,602,183, 4,923,892, 4,782,058, 4,393,210, 4,180,583, 3,965,257, 3,946,022, 3,931,197에 개시된 항히스타민제;

U.S. 특허 5,863,538, 5,855,907, 5,855,866, 5,780,592, 5,776,427, 5,651,987, 5,346,887, 5,256,408, 5,252,319, 5,209,926, 4,996,335, 4,927,807, 4,910,192, 4,710,495, 4,049,805, 4,004,005, 3,670,079, 3,608,076, 5,892,028, 5,888,995, 5,883,087, 5,880,115, 5,869,475, 5,866,558, 5,861,390, 5,861,388, 5,854,235, 5,837,698, 5,834,452, 5,830,886, 5,792,758, 5,792,757, 5,763,361, 5,744,462, 5,741,787, 5,741,786, 5,733,899, 5,731,345, 5,723,638, 5,721,226, 5,712,264, 5,712,263, 5,710,144, 5,707,984, 5,705,494, 5,700,793, 5,698,720, 5,698,545, 5,696,106, 5,677,293, 5,674,861, 5,661,141, 5,656,621, 5,646,136, 5,637,691, 5,616,574, 5,614,514, 5,604,215, 5,604,213, 5,599,807, 5,585,482, 5,565,588, 5,563,259, 5,563,131, 5,561,124, 5,556,845, 5,547,949, 5,536,714, 5,527,806, 5,506,354, 5,506,221, 5,494,907, 5,491,136, 5,478,956, 5,426,179, 5,422,262, 5,391,776, 5,382,661, 5,380,841, 5,380,840, 5,380,839, 5,373,095, 5,371,078, 5,352,809, 5,344,827, 5,344,826, 5,338,837, 5,336,686, 5,292,906, 5,292,878, 5,281,587, 5,272,140, 5,244,886, 5,236,912, 5,232,915, 5,219,879, 5,218,109, 5,215,972, 5,212,166, 5,206,415, 5,194,602, 5,166,201, 5,166,055, 5,126,488, 5,116,829, 5,108,996, 5,099,037, 5,096,892, 5,093,502, 5,086,047, 5,084,450, 5,082,835, 5,081,114, 5,053,404, 5,041,433, 5,041,432, 5,034,548, 5,032,586, 5,026,882, 4,996,335, 4,975,537, 4,970,205, 4,954,446, 4,950,428, 4,946,834, 4,937,237, 4,921,846, 4,920,099, 4,910,226, 4,900,725, 4,892,867, 4,888,336, 4,885,280, 4,882,322, 4,882,319, 4,882,315, 4,874,855, 4,868,167, 4,865,767, 4,861,875, 4,861,765, 4,861,763, 4,847,014, 4,774,236, 4,753,932, 4,711,856, 4,710,495, 4,701,450, 4,701,449, 4,689,410, 4,680,290, 4,670,551, 4,664,850, 4,659,516, 4,647,410, 4,634,695, 4,634,693, 4,588,530, 4,567,000, 4,560,557, 4,558,041, 4,552,871, 4,552,868, 4,541,956, 4,519,946, 4,515,787, 4,512,986, 4,502,989, 4,495,102에 개시된 스테로이드성 제제; 상기 모든 문헌의 개시 내용을 참조하여 포함시킨다.

접합체의 약물 부분은 전체 약물이거나 또는 벡터 단백질 리간드 또는 링커에 공유 결합하기 위한 연결 부위를 가지면서 목적 표적에 대한 친화력 및 특이성을 보유하는 이의 단편 또는 부분일 수 있다. 이러한 약물의 접합체는 약물 자체와 동일한 질환, 질병 및 징후에 사용할 수 있다.

iii. 바람직한 암 화학치료 활성 제제

본 발명의 환형 RAP 펩티드 접합체에 사용하기 위해 바람직한 암 화학치료제는 뇌종양 또는 뇌 또는 뇌주변의 다른 신생물 치료를 위해, 유리 형태, 또는 유리형태로 상기 종양 등에 유용하지 않은 경우에는 환형 RAP 펩티드에 연결시 유용한 모든 약물을 포함한다. 이러한 화학치료제는 바람직하게, 이에 제한되는 것은 아니고 아드리아마이신(독소루비신이라고도 함), 시스플라틴, 팍클리탁셀, 이의 유사체를 포함하는 세포독성 화학치료제, 및 생체 외 및 생체 내에 종양에 대해 활성이 검증된 다른 화학치료제이다. 이러한 화학치료제는 또한 알킬화제, 항대사산물제, 천연 생성물(예컨대 빈카 알칼로이드, 에피도필로톡신, 항생제, 효소 및 생물학적 반응 변형제 등), 토포이소머라제 억제제, 미소관 억제제, 스핀들 독소, 호르몬 및 길항제, 및 기타 제제 예컨대 백금 배위결합 착체, 아트라센디온, 치환된 우레아 등을 포함한다. 당분야의 당업자에게 다른 화학치료제는 공지이다.

이에 제한되는 것은 아니고, ¹³¹I (요오딘), ¹²⁵I, ¹¹¹In (인듐), ⁹⁰Y (이트륨), ⁶⁷Cu (구리), ¹²⁷Lu (루테튬), ²¹²Bi (비스무쓰), ²¹³Bi, ²⁵⁵Fm (페르뮴), ¹⁴⁹Tb (테르븀), ²²³Rd (라듐), ²¹³Pb (납), ²¹²Pb, ²¹¹At (아스타틴), ⁸⁹Sr (스트론튬), ¹⁵³Sm (사마륨), ¹⁶⁶Ho (홀뮴), ²²⁵Ac (악티늄), ¹⁸⁶Re (레늄), ⁶⁷Ga (갈륨), ⁶⁸Ga 및 ^99mTc (테크네늄)을 포함하는, 암 또는 신생물 치료에 유용한 세포독성 방사성동위원소를 본 발명의 RAP 환형 펩티드에 접합시킬 수 있다. 상기 방사성동위원소는 이러한 목적으로 당분야에서 통상 사용되는 금속 킬레이팅제를 사용하여 폴리펩티드에 연결시킬 수 있는데, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니고, 1,4,7,10-테트라아자시클로-11 도데칸-N,N',N'',N'''-테트라아세트산(DOTA), 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸 N,N',N'',N'''-테트라아세트산(TETA), 디에틸렌 트리아민 펜타아세테이트(DTPA), 디머캅토숙신산(DMSA), 테트라아자시클로트리데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산(TRITA) 및 1,5,9,13-테트라아자시클로헥사데칸-N,N',N",N'"-테트라아세트산(HETA), 히드록시에틸리덴 디포스포네이트(HEDP), HEXA 및 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 포함되고, 이들은 폴리펩티드 상에 방사성 동위원소 충전을 가능하게 한다.

바람직한 화학치료제는, 유리 형태로서, 바람직한 용량에서 허용되지 않는 전신 독서가 검증된 것이다. 이러한 제제의 치료 농도와 관련된 전신 독성은 환형 RAP 펩티드에 이를 연결하여 감소시킨다. 특히 바람직하게는 심장독성으로 인해 용량이 제한되는 유용한 치료제인 심장독성 화합물이다. 고전적인 예로는 아드리아마이신(독소루비신이라고도 함) 및 이의 유사체, 예컨대 다우노루비신 등이다. 이러한 약물에 환형 RAP 펩티드를 연결한 것은 심장에서 축적 및 연관된 심장독성을 감소시킨다.

iv. 당접합체

당접합체는 탄수화물 부분을 포함하는 임의 분자이다. 이의 예는 이에 제한되는 것은 아니고, 당단백질, 올리고당, 당지질 및 프로테오글리칸이 포함되다. 이러한 분자는 예컨대 치료제의 생체 이용률 또는 병원성 기전 차단능의 증가 등 이로운 기능을 갖는다. 예를 들어, 알파-L-이두로니다제는 효소에 부착된 올리고만노스 7-비스포스페이트 결정인자때문에 신체 전반에 효율적으로 분포되는 당접합체(당단백질)이다. 헤파린 설페이트는 인간에서 응고 경로를 차단하는데 유용한 프로테오글리칸의 탄수화물 부분이다. 치료 활성을 갖는 당접합체에 적절한 환형 RAP 펩티드의 부착은 생체 분포도에 영향을 주어서 당접합체의 효능을 증가시키는 수단을 제공할 수 있다. 다르게, 환형 RAP 펩티드 당접합체 융합물을 조작하여 특정 조직에서 하나 이상의 수용체의 기능에 직접적으로 영향을 줄 수 있는 능력을 갖는 비스-특이적 수용체-결합 분자로서 작용하게 할 수 있다.

v. 나노입자

나노입자는 생체분해성 및 비생체 분해성 중합체 또는 다른 물질 예컨대 지질로부터 제작된 거대분자 어셈플리이다. 이러한 어셈플리를 입자내 공동에 치료 분자를 포함하도록 조작할 수 있다. 이러한 방법을 통해서 나노입자는 약물의 생체 분포도, 약물동력학, 면역원성 및 효능을 변경시키는 수단을 제공한다. 적절한 환형 RAP 펩티드의 부착은 이러한 분자의 조직 분포 특이성을 증가시키는 수단을 제공한다.

E. 환형 RAP 펩티드의 제조 방법

RAP 펩티드는 바람직하게 당분야에 기술된 임의 방법을 사용하여 형성시킬 수 있는, 공유 결합의 형성을 통해 고리화된다. 일 구체예에서, 공유 결합은 펩티드의 N 말단에 아미노산 및 C 말단에 아미노산간에 형성된다. 일 구체예에서, 공유 결합은 2 말단 아미노산의 측쇄사이에서 형성된다. 다른 구체예에서, 공유 결합은 한 말단 아미노산의 측쇄와 다른 말단 아미노산의 말단기 사이에, 또는 각 말단 아미노산의 말단기 사이에 형성된다. 예를 들어, 헤드 대 테일, 측쇄 대 측쇄, 측쇄 대헤드, 측쇄 대 테일이 모두 가능하다.

천연적으로 고리화되는 RAP 펩티드는 목적하는 위치에 2개의 시스테인을 삽입하고 이 시스테인이 자연적으로 이황화 결합을 형성하도록 하여 용이하게 조작할 수 있다. 글리신 또는 프롤린을 시스테인에 대해 내부에 삽입(예를 들어, C 말단 에서 N 말단-대부분 시스테인 및 N 말단에서 C 말단-대부분 시스테인)하여 RAP 펩티드의 천연 3차 구조의 공유 결합에 의한 임의의 구조 뒤틀림을 최소화할 수 있다.

말단 카르복실 기에 말단 아민의 헤드 대 테일 고리화 커플링은 다수의 방법, 예를 들어, p-니트로페닐 에스테르, 아지드 방법, 2,4,5-트리클로로페닐 및 펜타플루오로페닐 에스테르, 혼합 무수물 방법, 카르보디미드와 촉매 예컨대 HOBt 또는 HONSu 또는 HoAt 또는 HATU, DIC, DCC, 또는 수지상에서의 고리화를 사용하여 수행할 수 있다.

또한, 환형 구조는 브릿징 기, 펩티드의 아미노산 잔기의 측쇄, 또는 펩티드의 말단 아미노산 잔기를 사용하여 형성할 수 있다. 브릿징기는 펩티드의 2부분의 고리화를 가능하게 하는 화학 부분이다. 브릿징 기의 비제한적 예는 아미드, 티오에테르, 티오에스테르, 디설피드, 우레아, 카바메이트, 설폰아미드 등을 포함한다. 이러한 브릿징 기를 갖는 단위의 도입을 위한 다양한 방법이 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 락탐 브릿지(즉, 환형 아미드)는 예를 들어, 라이신 또는 오르니틴 및 글루탐산 또는 아스파르트산 등, 아민 및 카르복실산을 갖는 아미노산의 측쇄를 통해 형성할 수 있다. 티오에스테르는 Cys 잔기의 측쇄와 C 말단간에 형성시킬 수 있다. 다르게, 티오에스테르는 티올 및 카르복실산을 갖는 아미노산의 측쇄를 통해서 사이에 형성시킬 수 있다.

다르게, 티오에테르 결합에 의해서 함께 공유 결합된 알라닌 잔기를 연결하기 위해 란티오닌(티오디알라닌)을 도입하여 가교결합을 형성시킬 수 있다. 다른 방법에서, 가교결합제, 예컨대 디카르복실산 예를 들어 수베르산(옥탄디오산) 등은 아미노산 측쇄의 2 작용기, 예컨대 자유 아미노, 히드록실, 티올기 및 이의 조합 사이에 연결을 도입할 수 있다.

효소 촉매 고리화도 사용할 수 있다. 예를 들어, 티로시딘 합성효소의 티오에스터라제 도메인을 사용하여 티오에스테르 전구체를 고리화하고, 서브틸리신 돌연변이체를 사용하여 펩티드 글리콜레이트 페닐알라닐아미드 에스테르를 고리화하고, 항체 리가제 16G3을 사용하여 p-니트로페닐에스테르 고리화를 촉매하는 것이 보고되어 있다. 펩티드 고리화에 대한 리뷰는 문헌 [Davies, J. Peptide Sci., 9:471-501 (2003)]을 참조할 수 있으며, 이를 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다.

F. RAP 펩티드의 생성

i. 합성

본 발명의 펩티드는 통상의 방법에 따라서 용액상, 고체상 또는 액체상 펩티드 합성을 통해 합성할 수 있다. 다양한 자동 합성기가 시판되며 공지 프로토콜에 따라 사용할 수 있다. 예를 들어, 하기 문헌들을 참조며, 이들을 참조문헌으로 본 발명에 포함시킨다: Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. ed., Pierce Chemical Co., (1984);Tam et al., J. Am. Chem. Soc. 105:6442, 1983; Merrifield, Science 232:341-347, 1986; and Barany and Merrifield, The Peptide, Gross and Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1 284; Barany et al., Int. J. Peptide Protien Res. 30:705-739, 1987; Bodanszky, The Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed., Springer, New York (1993); and Molina et al., Pept. Res. 9:151-5, 1996, U.S. Pat. No. 5,424,398, and Fischer et al., Journal of Peptide Science 8: 529 - 542, 2002.

예를 들어, 용액상 방법, 예컨대 아지드 방법, 산클로라이드 방법, 산무수물 방법, 혼합 무수물 방법, 활성 에스테르 방법(예를 들어, p-니트로페닐 에스테르, N-히드록시-숙신이미드 에스테르 또는 시아노메틸 에스테르), 카르보디이미다졸 방법, 산화-환원 방법 또는 디시클로헥실카르보디이미드(DCCD)/부가 방법을 사용할 수 있다.

고체상 펩티드 합성법은 0.1∼1.0 mMol 아민/중합체 1 g을 포함하는 공중합(스티렌-디비닐벤젠)을 사용한다. 펩티드 합성을 위한 이들 방법은 알파-아미노기의 부틸옥시카르보닐(t-BOC) 또는 9-플루오레닐메틸옥시-카르보닐(FMOC) 보호물을 사용한다. 양 방법은 단계식 합성을 포함하여서 펩티드의 C 말단으로부터 출발하는 각 단계에서 단일 아미노산을 부가한다(문헌 [Coligan, et al., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, Unit 9] 참조). 화학 합성 완료시, 펩티드를 탈보호화하여 t-BOC 또는 FMOC 아미노산 차단기를 제거하고 저온에서 산을 처리하여 중합체로부터 절단시킨다(예를 들어 0℃에서 약 1시간 동안 액체 HF-10% 아니솔). 시약을 증발시킨 후, 펩티드를 1% 아세트산 용액을 사용하여 중합체로부터 추출한 후 동결건조하여 미정제 물질을 얻는다. 이 미정제 물질을 용매로서 5% 아세트산을 사용하여 세파덱스 G-15 상에서 겔 투과 등의 방법을 통해 통상적으로 정제할 수 있다. 컬럼의 적절한 분획의 동결 건조로 균질한 펩티드 또는 펩티드 유도체를 얻고 이를 아미노산 분석, 박층 크로마토그래피 고성능 액체 크로마토그래피, 자외서 흡광 분광분석, 몰회전, 가용성 등의 표준 방법으로 특징규명하고 고체상 에드만 분해를 통해 정량화할 수 있다.

액체상 방법은 전통적인 용액과 고체상 화학법간의 하이브리드인 폴리에틸렌 글리콜에 가역적으로 연결된 폴리펩티드쇄의 합성 어셈블리를 포함한다. 이 방법은 반복적인 아미노 탈보호 단계를 위해서 통상의 유기 염기 피페리딘 대신에 사용되는 플루오리드 이온 및 고체상 펩티드 합성에서 통상 사용되는 N-플루오레닐메톡시카르보닐 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 문헌 [Fischer et al., Journal of Peptide Science 8: 529 - 542, 2002]을 참조한다.

ii. 숙주 세포

키메라 단백질을 생성하기 위해 사용되는 숙주 세포는 박테리아, 효모, 곤충, 비포유류 척추동물, 또는 포유류 세포이며, 포유류 세포는 이에 제한되는 것은 아니고, 햄스터, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 소, 돼지, 마우스, 래트, 토끼, 양 및 인간 세포를 포함한다. 숙주 세포는 불멸화된 세포(세포주)이거나 또는 비불멸화된(1차 또는 2차) 세포일 수 있고 임의의 광범위한 세포 유형일 수 있는데, 이에 제한되는 것은 아니고, 섬유아세포, 케라틴생성세포, 상피세포(예를 들어, 유선 상피 세포, 장 상피 세포 등), 난소 세포(예를 들어, 중국 햄스터 난소 또는 CHO 세포), 내피 세포, 아교세포, 신경 세포, 혈액의 형성 성분(예를 들어, 리프구, 골수 세포), 근육 세포, 간세포 및 이들 체세포 유형의 전구체 등일 수 있다. 숙주 세포는 LRP를 발현하지 않는 CHO 세포의 돌연변이체, 예컨대 CHO13-5-1를 포함할 수 있다(FitzGerald et al., J. Biol. Chem., 129(6):1533-41, 1995).

키메라 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 포함하고 발현하는 세포를 본 명세서에서는 유전자 변형 세포라고 한다. 키메라 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 함유하고 발현하는 포유류 세포를 유전자 변형된 포유류 세포라 한다. 세포로 DNA 또는 RNA 도입은 당분야에 공지된 형질감염 방법, 예컨대 전기영동, 미세주입, 유전자총, 인산칼슘 침번, 양이온 지질 처리, 포토포레이션(photoporation), 융합법, 수용체 매개 전달법, 폴리프렌 침전법 등을 통해 수행한다. 다르게, DNA 또는 RNA는 바이러스 벡터로 감염시켜 도입시킬 수 있다. 키메라 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 발현하는 포유류 세포를 포함하는 세포의 제조 방법은 예를 들어 U.S. 특허 6,048,729, 5,994,129, 및 6,063,630에 기술되어 있다. 이들 각 출원서의 교시 내용을 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다.

iii. 핵산 구성체

키메라 단백질을 발현시키는데 사용하는 핵산 구성체는 형질감염된 포유류 세포 내에서 염색체 외(에피솜으로)에서 발현되는 것이거나 또는 수용체 세포 게놈에 상동성 재조합을 통해서 사전 선택된 표적 부위에 또는 무작위적으로 통합되는 것일 수 있다. 염색체외로 발현하는 구성체는 키메라 단백질 코딩 서열이외에도, 세포 내에서 단백질을 발현시키기 위해 충분한 서열, 경우에 따라 구성체의 복제를 위한 서열을 포함한다. 대체로, 프로모터, 키메라 단백질 코딩 DNA 및 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 키메라 단백질을 코딩하는 DNA는 이의 발현이 프로모터 제어하에 존재하도록 구성체에 위치한다. 경우에 따라서, 구성체는 추가 성분 예컨대 하기 성분 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 스플라이싱 부위, 인핸서 서열, 적절한 프로모터 제어하의 선별 마커 유전자, 및 적절한 프로모터 제어하의 증폭가능 마커 유전자.

DNA 구성체가 세포 게놈에 통합되는 구체예에서는 키메라 단백질 코딩 핵산 서열만을 포함할 필요가 있다. 경우에 따라 프로모터 및 인핸서 서열, 폴리아데닐화 부위 또는 부위들, 스플라이싱 부위 또는 부위들, 선별 마커 또는 마커들을 코딩하는 핵산 서열, 증폭가능 마커를 코딩하는 핵산 서열 및/또는 게놈 내 선택 부위에 DNA의 표적 통합을 위해서 수용체 세포의 게놈 DNA에 상동성인 DNA(표적화 DNA 또는 DNA 서열)를 포함할 수 있다.

iv. 세포 배양 방법

키메라 단백질 코딩 DNA 또는 RNA를 포함하는 포유류 세포를 DNA 또는 RNA의 발현 및 세포의 성장을 위해 적절한 조건하에서 배양한다. 키메라 단백질을 발현하는 세포들을 공지 방법 및 본 명세서에 기술한 방법을 사용하여 동정하고, 키메라 단백질 생산을 증폭시키거나 증폭시키지 않고, 공지 방법 및 본 명세서에 기술한 방법을 사용하여 키메라 단백질을 단리 및 정제할 수 있다. 동정은 예를 들어, 키메라 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA의 존재를 표시하는 표현형을 보이는 유전자 변형 포유류 세포를 스크리닝하여 수행할 수 있는데, 예컨대 PCR 스크리닝, 서던 블랏 분석을 통해 스크리닝, 또는 키메라 단백질 발현에 대한 스크리닝을 수행할 수 있다. 도입된 키메라 단백질 코딩 DNA를 갖는 세포의 선별은 DNA 구성체에 선별 마커를 포함시키고 선별 마커 유전자를 발현하는 세포만이 생존하는 적절한 조건하에서 선별 마커 유전자를 함유하는 형질감염 또는 감염 세포를 배양하여 수행할 수 있다. 도입된 DNA의 추가 증폭은 증폭을 위해 적절한 조건 하에서 유전자 변형 포유류 세포를 배양하여 실시할 수 있다(예를 들어, 증폭 마커 유전자의 다수 카피를 함유하는 세포만이 생존할 수 있는 약물 농도 존재하에 증폭가능 마커 유전자를 포함하는 유전자 변형 포유류 세포를 배양함).

키메라 단백질을 발현하는 유전자 변형 포유류 세포를 발현된 생성물을 검출하여, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 동정할 수 있다. 예를 들어, 담체가 환형 RAP 펩티드인 키메라 단백질을 발현하는 포유류 세포는 샌드위치 효소 면역어세이를 통해 동정할 수 있다. 항체는 RAP 부분 또는 접합체의 활성제 부분에 대한 것일 수 있다.

v. RAP 펩티드의 정제

RAP 펩티드는 당분야에서 공지된 방법을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 통해 정제할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [The Handbook of Analysis and Purification of Peptide and Proteins by Reversed-Phase HPLC, 3^rd ed., Grace Vydac, W.R. Grace & Co., Columbia, MD (2002)]을 참조한다. 용리액으로서는 대체로 트리플루오로아세트산과 물 및 아세토니트릴의 농도 구배를 사용한다. 분취용 RP-HPLC가 밀리그램 및 그램 양으로 합성 펩티드를 정제하는데 통상 사용되고, 치료용도의 재조합 생성 폴리펩티드를 mg 내지 kg의 양으로 정제하는데 사용된다.

RAP 펩티드는 또한 WO 2006/138343(Zankel et al.)에 기술된 바와 같이 생산 및 정제할 수 있으며, 이 문헌을 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다.

RAP 펩티드는 또한 적절한 CR 쌍이 커플링된 아가로스 비드 상에서 친화력 크로마토그래피를 통해 정제할 수 있다. 이 방법은 단독으로 사용하거나 또는 HR-HPLC 정제를 후속하는 추가 단계로서 수행할 수 있다. CR 쌍 또는 트리플렛을 포함하는 CR 함유 단백질의 단편을 다음과 같이 제조한다. 각 CR 쌍 또는 트리플렛을 코딩하는 DNA를 HotStart PfuTurbo^® 중합효소 및 시약(Stratagene)을 사용하여 인간 cDNA(BD Biosciences Marathon-ready^®)로부터 PCR 증폭하였다. 각 증폭된 단편을 순차적으로 BamHI 및 HindIII로 절단한 후 유사하게 분해한 pET30(+)a(EMD Biosciences)에 결찰시켰다. 얻어진 플라스미드는 CR 단편에 융합된 S-펩티드 및 N 말단 헥사히스티딘으로 구성된 단백질 단편을 코딩한다. 모든 발현 구성체를 서열분석하여 삽입물 존재를 검증하였다. 이후 각 플라스미드를 사용하여 BL21(DE3) CodonPlus-RIPL 세포(Stratagene)를 형질전환시켰다. 상기 기술한 바와 같이 CR 단편을 발현시키고 리폴딩하였으며, 제조사의 프로토콜에 따라 Ni-NTA 크로마토그래피(Qiagen)를 통해 정제하였다. 활성화 아가로스 비드(AffiGel 15, Bio-Rad)를 10 mL의 융해된, 플라스틴 컬럼(Pierce)으로 옮겼다. 비드를 5 mM CaCl₂가 보충된 10 mM HEPES, 100 mM NaCl 완충액 3부피로 2회 세정하였다. 이어서 CR 단편(동일 완충액 5 컬럼 부피 중 2.5 mg/mL의 패킹된 비드)을 부가하고 혼합물을 실온에서 혼합하면서 밤새 항온반응시켰다. 이후 브래드포드 어세이로 측정시 용리물에 추가의 단백질이 더이상 존재하지 않을 때까지 비드를 완충액으로 세정하였다. 비드를 사용전까지 20% 에탄올 중에 보관하였다. TBS 중 RAP 펩티드를 평형화한 CR-연결 비드(1 mg/mL 패킹 비드)에 부가하고 2시간 동안 실온에서 혼합하면서 항온반응시켰다. 비드를 동일 완충액으로 세정하고 결합된 펩티드를 100 mM EDTA가 보충된 TBS에 용리하였다.

G. RAP 접합체의 특징규명

i. 표지

일 구체예에서, 환형 RAP 펩티드 또는 이의 접합체를 표지화하여 검출을 용이하게 하였다. 표지 또는 검출가능 부분은 분광기, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적 또는 다른 물리적 수단으로 검출가능한 조성물이다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기 적합한 표지는 예를 들어, 방사성 표지(예를 들어, ³²P), 형광단(예를 들어, 플루오레세인), 전자 밀집 시약, 효소(예를 들어, ELISA에서 통상 사용되는 것, 비오틴, 디그옥시게닌, 또는 헵텐 또는 펩티드와 특이적으로 결합하는 항체를 검출하기 위해 사용되거나, 또는 헵텐 또는 단백질에 예를 들어 방사성표지를 도입하여 검출가능하게 만들 수 있는 햅텐 및 단백질 등을 포함한다,

상기 기술한 바와 같이, 사용하는 스크리닝 어세이에 따라서, 접합체의 활성 제제, 링커 또는 환형 RAP 펩티드 부분을 표지화할 수 있다. 사용되는 특정 표지 또는 검출가능기는 이것이 접합체의 생물학적 활성을 유의하게 방해하지 않는 한, 본 발명의 핵심 측면은 아니다. 검출가능 기는 검출가능한 물리적 또는 화학적 성질을 갖는 임의 물질일 수 있다. 따라서, 표지는 분광기, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단으로 검출가능한 임의의 조성물이다.

본 발명에서 사용하기 적합한 표지의 예는 이에 제한되는 것은 아니고, 형광 염료(예를 들어, 플루오레세인, 이소티오시아네이트, 텍사스 레드 및 로다민 등), 방사성표지(예를 들어, ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, or ³²P), 효소 (예를 들어, 홀스 래디시 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제 및 ELISA에서 통상 사용되는 다른 것들 등) 및 발색 표지 예컨대 콜로이드성 금 또는 채색 유리 또는 플라스틱 비드(예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등)를 포함한다.

표지는 당분야에 공지된 방법에 따라서 목적하는 어세이 성분에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링시킬 수 있다. 바람직하게, 일 구체예에서, 표지는 본 발명에 따라서 활성제를 접합하기 위하여 이소시아네이트 시약을 사용하여 생체중합체에 공유 결합시킨다. 본 발명의 일 측면에서, 본 발명의 2작용성 이소시아네이트 시약을 사용하여 생체중합체에 표지를 접합시켜서 이에 부착된 활성 제제 없이 표지 생체중합체 접합체를 형성시킬 수 있다. 상기 표지 생체중합체 접합체를 본 발명에 따른 표지화 접합체의 합성을 위한 중간체로서 사용하거나 또는 생체중합체 접합체를 검출하는데 사용할 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 다양한 표지를 사용할 수 있는데 표지 선택은 요구되는 감도, 목적하는 어세이 성분과의 접합 용이성, 안정성 요구 정도, 이용가능한 장치 및 처리 규정 등에 따라 좌우된다. 비방사성 표지는 종종 간접 수단을 통해 부착된다. 일반적으로, 리간드 분자(예를 들어, 비오틴)를 분자에 공유 결합시킨다. 리간드는, 고유하게 검출가능하거나 또는 신호 시스템에 공유 결합되는, 예컨대 검출가능 효소, 형광 화합물 또는 화학발광 화합물 등의 다른 분자(예를 들어, 스트렙타비딘)에 결합한다.

접합체는 또한 예를 들어, 효소 또는 형광단과의 접합을 통해서 신호 발생 화합물에 직접적으로 접합될 수 있다. 표지로서 사용하기 적절한 효소는 이에 제한되는 것은 아니며, 구체적으로 포스파타제, 에스터라제 및 글리코시다제 또는 옥시도타제, 특히 퍼록시다제를 포함한다. 표지로 사용하기 적절한 형광 화합물, 즉 형광단은 이에 제한되는 것은 아니고 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이이 유도체, 단실, 엄벨리페론 등을 포함한다. 적절한 형광단의 추가예에는 이에 제한되는 것은 아니고, 에오신, TRITC-아민, 퀴닌, 플루오레세인 W, 아그리딘 옐로우, 리사민 로다민, B 설포닐 클로라이드 에리트로세인, 루테늄(트리스, 비피리디늄), 텍사스 레드, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 등이 포함된다. 표지로 사용하기 적합한 화학발광 화합물은 이에 제한되는 것은 아니고 루시페린 및 2,3-디히드로프탈라진디온, 예를 들어 루미놀을 포함한다. 본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 다양한 표지 또는 신호 생성 시스템에 대한 리뷰는 예를 들어 U.S. 특허 4,391,904를 참조한다.

표지 검출 수단은 당분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들어, 표지가 방사성 표지인 경우, 검출 수단은 섬광계측기 또는 방사능사진 촬영의 사진 필름을 포함한다. 표지가 형광 표지인 경우, 적절한 파장광으로 형광 색소를 여기하여 생성된 형광발광을 검출하여 검출할 수 있다. 형광은 전자 검출기 예컨대 전하 결합 소자(CCD) 또는 광전자증배기 등의 전자 검출기를 사용하여 육안으로 검출할 수 있다. 유사하게 효소 표지는 효소에 대한 적절한 기질을 제공하고 얻어진 반응 생성물을 검출하여 확인할 수 있다. 발색 또는 화학발광 표지는 표지와 연관된 색상을 관찰하여 간단히 검출할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용하기 적합한 다른 표지화 및 검출 시스템은 당분야의 당업자들이 용이하게 이해할 것이다. 이러한 표지화 조절인자 및 리간드를 질환 또는 건강 상태이 진단시에 사용할 수 있다.

ii. 접합체 및 이의 전달 조절인자에 대한 스크리닝 어세이

본 발명은 환형 RAP 펩티드 접합체를 위한 스크리닝 어세이를 제공하며, 여기서 접합체는 전체 세포에, 세포 추출물에, 반정제 형태, 정제 형태 또는 이의 활성을 측정가능한 임의의 다른 형태로 존재할 수 있는 특정 수용체의 측정가능한 활성에 영향을 주는 능력에 대해 테스트한다. 활성은 예를 들어 활성 양 또는 시기를 포함하는 CR 함유 단백질의 발현, 기능 또는 분해에서의 임의의 활성일 수 있다. 이러한 활성은 예를 들어, 전사, 전사체 프로세싱, 번역 또는 수용체 유전자 서열의 전사체 안정성 또는 mRNA 전사체를 포함한다. 이러한 활성은 예를 들어 새로운 수용체의 합성, 수용체의 세포하위 위치화 및 수옹체 생물학적 활성의 활성화 등을 포함한다. 활성은 예를 들어, 수용체의 기질 결합능, 형태 채택능, 반응 촉매능, 공지 리간드에 결합능을 포함한다. 활성은 예를 들어, 수용체의 안정성 또는 양, 수용체의 프로세싱 및 제거 또는 분해를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 사용되는 환형 RAP 펩티드는 임의 수용체에 비하여 표적 수용체에 대해 보다 높은 친화력을 자연적으로 갖거나 또는 변형된 것이다.

본 발명은 다양한 스크리닝법을 고려한다. 일부 디자인은 낮은 효율성을 고려하고 연속 또는 평행하게 하나 또는 소수의 화합물만을 테스트한다. 높은 효율성의 스크리닝 어세이는 수주 또는 수개월 동안 수만 또는 수천만 화합물을 스크리닝하는데 적합하다. "인 실리코(in silico)" 스크리닝법은 생물학적 활성의 가능성 있는 조절인자를 동정하기 위해 컴퓨터 보조의 합리적인 디자인법을 사용한다.

H. 약학 조성물 및 이의 투여

상기 접합체 및 조절인자는 다양한 경로로 투여될 수 있다. 경구 조제물을 위해, 접합체는 단독으로 또는 적절한 첨가제 예를 들어 통상의 첨가제 예컨대 락토스, 만니톨, 옥수수 전분 또는 감자 전분, 결합체 예컨대 결정성 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴, 붕해제 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 윤활제 예컨대 탈크, 스테아르산마그네슘, 및 필요에 따라 희석제, 완충제, 습윤제, 보존제 및 향미제와 배합하여 정제, 분말, 과립 또는 캡슐 등을 제조할 수 있다.

접합제 및 조절인자는 수성 또는 비수성 용매, 예컨대 식물성 또는 다른 유사 오일, 합성 지방산 글리세리드, 고급 지방산 또는 프로필렌 글리콜의 에스테르에, 필요에 따라 통상의 첨가제 예컨대 가용화제, 등장성 제제, 현탁제, 유화제, 안정화제 및 보존제와 함께 용해, 현탁 또는 유화시켜서 주사용 조제물로 제형화할 수 있다.

접합체, 조절인자 및 LDLR 리간드를 흡입을 통해 투여되는 에어로졸 제형으로 사용할 수 있다. 본 발명의 화합물은 가압가능한 추진제 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등으로 제형화시킬 수 있다.

또한, 접합체 및 조절인자는 다양한 베이스 예컨대 유화 베이스 또는 수용성 베이스 등과 혼합하여 좌제로 제조할 수 있다. 본 발명의 화합물은 좌제를 통해 직장 투여될 수 있다. 좌제는 체온에서는 용융되지만 실온에서는 고체인 비히클 예컨대 코코아 버터, 카르보왁스 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다.

예컨대 시럽, 엘릭시르 및 현탁제 등 경구 또는 직장 투여용 접합체, 조절인자 및 LDLR 리간드의 단위 제형을 제공할 수 있는데, 여기서 각 단위 제형, 예를 들어 티스푼 양, 또는 큰스푼 양, 정제 또는 좌제는 활성 제제를 포함하는 조성물의 사전정해진 양을 포함한다. 유사하게, 주사 또는 정맥내 투여를 위한 단이 제형은 멸균수, 정상 염수 또는 다른 약학적으로 허용되는 담체 중 용액으로서 조성물에 접합체를 포함할 수 있다.

실제 사용시에, 본 발명에 따른 접합체, 조절인자 및 LDLR 리간드는 통상의 약제 배합법에 따라서 약학적 담체와 함께 친밀 혼합물 중 활성 성분으로서 배합할 수 있다. 담체는 투여에 적합한 조제물의 형태, 예를 들어 경구 또는 비경구(정맥내 포함) 형태에 따라 광범위한 형태를 취할 수 있다. 경구 제형용 조성물 제조에서, 임의의 일반적인 약학 매질 예컨대 경구 액체 조제물인 경우 물, 글리콜, 오일, 알콜, 향미제, 보존제, 착색제 등, 예컨대 현탁제, 엘릭시르 및 용액제; 또는 경구 고체 조제물 예컨대 분말, 경질 및 연길 캡슐 및 정제 등의 경우에는 담체 예컨대 전분, 당류, 미세결정 셀룰로스, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등을 사용할 수 있고, 고체 경구 조제물이 액체 조제물보다 바람직하다.

경피 투여 경로에 있어서, 약물의 경피 투여 방법은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, (Gennaro et al. Eds. Mack Publishing Co., 1985)]에 개시되어 있다. 진피 또는 피부 팻치가 본 발명의 접합체, 조절인자 및 LRP 리간드의 경피 전달을 위해 바람직한 수단이다. 팻치는 바람직하게 화합물의 흡수성을 증가시키기 위한 흡수 강화제 예컨대 DMSO를 제공한다. 경피 약물 전달을 위한 다른 방법은 U.S. 문헌 No. 5,962,012, 6,261,595 및 6,261,595에 개시되어 있다. 각 문헌을 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다.

특정 구체예에서, 본 명세서에서 기술한 접합체의 치료적 투여는 CSF에 수막강내로 투여하는 것을 고려한다. 본 발명의 수막강내(intrathecal) 투여는 뇌실에 약학 조성물을 투입하는 단계를 포함할 수 있다. 다르게, 수막강내 투여는 요추 부위로 약학 조성물을 투입하는 단계를 포함할 수 있다. 또다른 대안법에서, 수막강내 투여는 대조(cisterna magna)로 약학 조성물을 투입하는 단계를 포함할 수 있다. 임의의 이러한 투여는 바람직하게 볼러스 주사를 통한다. 증상의 중증도 및 치료법에 대한 피험체의 반응성에 따라서, 볼러스 주사는 주당 1회, 1개월당 1회, 6개월 마다 또는 1년마다 1회 투여할 수 있다. 다른 구체예에서, 수막강내 투여는 주입 펌프를 사용하여 수행할 수 있다. 약학적 과정은 수일 이상의 기간 동안 연속적으로 수막강내 투여하거나 또는 대안적으로, 4주 이상의 기간 동안 연속적으로 수막강내 투여한다. 물론, 연속 주입을 통한 투여인 경우, 효소 대체 치료제의 용량 투여 비율은 볼러스 주사 투입에 비하여 상당히 줄일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 접합체의 활성제제는 이두로니다제이고 MPS에 대해 치료하려는 포유류의 체중 20 kg 당 약 1 mg의 이두로니다제를 포함하는 양으로 전달된다. 구체예에서, 상기 용량은 15 cc CSF로 전달된다. 이러한 농도에서, 효소 농도는 CSF 1 mL 당 18,000 유닛으로 고려한다. 상기 언급한 용량은 단지 예시적인 용량이며 이러한 용량이 다양할 수 있음을 당분야의 숙련가는 이해할 것이다.

본 발명의 방법 및 조성물은 효소 고체 치료제 이전에 항원 특이적 내성을 유도하는 방법 및 조성물과 조합될 수 있다. 이러한 방법은 면역억제제 예컨대 시클로스포린 A의 투여를 포함하고, 이에 제한되는 것은 아니며 뉴클레오티드 유사체 또는 항대사산물제를 포함하는 항증식제의 투여를 더욱 포함할 수 있는 항원 특이적 내성을 유도하는 단계를 포함한다. 항증식제는 아자티오프린일 수 있다. 추가 방법은 예를 들어, U.S. 공개특허출원 20030211113로 공개된, U.S. 특허출원 10/141,668; 및 U.S. 공개특허출원 20040009906로 공개된 U.S. 특허출원 10/429,314에 기술되어 있으며, 이 각각을 참조하여 포함시킨다.

약학적으로 허용되는 부형제, 예컨대 비히클, 보조제, 담체 또는 희석제는 시판된다. 또한, 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예컨대 pH 조절제 및 완충제, 삼투성 조절제, 안정화제, 습윤제 등도 시판된다.

당분야의 숙련가는 용량 범위가 특정 화합물, 증상의 중증도 및 부작용에 대한 피험체의 감응성 등에 따라 다양할 수 있음을 이해할 것이다. 주어진 화합물에 대한 바람직한 용량은 이에 제한되는 것은 아니나 환자, 테스트 동물 및 시험관 내에서 수행된 약동력학 평가 및 용량 반응 등을 포함하는 다양한 방법으로 당분야의 당업자가 용이하게 측정할 수 있다.

각 측면에서, 조성물은 이에 제한되는 것은 아니고, 경구, 직장, 국소, 비경구(피하, 근육내 및 정맥 내 포함), 폐(비내 또는 구강 흡입) 또는 비내 투여에 적합한 조성물을 포함할 수 있지만, 임의의 주어진 경우에서 가장 적절한 경로는 부분적으로 치료하려는 병태의 성질 및 중증도 및 활성 성분의 성질에 따라 좌우된다. 예시적인 투여 경로는 경구 및 정맥 내 경로이다. 조성물은 편리하게 단위 제형으로 존재할 수 있고 제약 분야에서 공지된 임의 방법으로 제조할 수 있다.

실제 사용시에, 본 발명에 따른 조절인자는 통상의 약학 배합 방법에 따라서 약학 담체와 함께 친밀 혼합물 중에 활성 성분으로서 배합될 수 있다. 담체는 투여를 위해 바람직한 조제물의 형태, 예를 들어 경구 또는 비경구(정맥내 포함) 등의 형태에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다. 경구 투여형 조성물 제조에서, 임의의 약학 매질, 예컨대 경구 액체 조제물, 예컨대 좌제, 엘릭시르 및 용액제 등의 경우에는 예를 들어 물, 글리콜, 오일, 알콜, 향미제, 보존제, 착색제 등; 또는 경구 고체 조제물 예컨대 분말, 경질 및 연질 캡슐 및 정제 등의 경우에는 담체 예컨대 전분, 당류, 미세결정 셀룰로스, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등을 사용할 수 있으며, 고체 경구 조제물이 액체 조제물보다 바람직하다.

투여가 용이하기 때문에, 정제 및 캡슐이 가장 이로운 경구 단위 제형인데 이 경우 고체 약학 담체가 분명하게 사용된다. 바람직하다면, 정제는 표준 수성 또는 비수성 방법으로 피복될 수 있다. 이러한 조성물 중 활성 화합물의 비율도 역시 다양할 수 있으며 용이하게는 유닛 무게의 약 2% 내지 약 60%일 수 있다.

본 발명의 접합체, 조절인자 및 리간드는 동물, 구체적으로 인간에서 치료, 예방 및 진단적 중재에 유용하다. 본 명세서에 기술한 바와 같이, 접합체는 사용되는 생체중합체에 따라서 임의의 표적 장기, 구획 또는 부위에서 우선적으로 활성 제제를 축적 및/또는 방출하는 것으로 나타난다.

본 발명의 조성물은 바이러스 엔벨로프 또는 소포에 캡슐화되거나 또는 부착되어서 투여되거나, 또는 세포로 도입된다. 소포는 일반적으로 구형이고 대체로 지질인 미셀 입자이다. 리포좀은 2층막으로 형성된 소포이다. 적절한 소포는 이에 제한되는 것은 아니고, 단일층 소포 및 다중층 지질 소포 또는 리포좀이 있다. 이러한 소포 및 리포좀은 광범위한 지질 또는 인지질 화합물, 예컨대 포스파티딜콜린, 포스파티드산, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고미엘린, 당지질, 강글리오시드 등으로부터 표준 방법, 예컨대 U.S. 특허 4,394,448에 기술된 바와 같은 방법으로 제조할 수 있다. 소포 또는 리포좀은 세포내에 화합물을 투여하고 표적 장기에 화합물을 전달하는데 사용할 수 있다. 목적하는 p97-조성물의 제어 방출을 또한 캡슐화를 사용하여 수행할 수 있다(예를 들어, U.S. 특허 5,186,941참조).

혈류로, 또는 바람직하게는 혈뇌 장벽의 적어도 외면에 환형 RAP 펩티드 활성 제제 또는 조절인자 조성물을 전달하는 임의의 투여 경로를 사용할 수 있다. 바람직하게, 조성물은 말초로, 가장 바람직하게는 정맥 내로 또는 심장 카테터를 통해서 투여한다. 경정맥내 및 경동맥내 주사도 유용하다. 조성물은 국소 또는 국부적으로, 예컨대 복강내 또는 피하내 또는 근육내로 투여될 수 있다. 일 측면에서, 조성물은 적절한 약학 희석제 또는 담체와 함께 투여된다.

투여되는 용량은 개체의 요구도, 목적 효능, 사용되는 활성 제제, 생체중합체 및 선택된 투여 경로에 따라 좌우된다. 접합체의 바람직한 용량 범위는 약 0.2 pmol/kg∼약 25 nmol/kg, 특히 바람직한 용량 범위는 2∼250 pmol/kg이고, 대안적으로, 접합체의 바람직한 용량은 0.02∼2000 mg/kg 범위이다. 이러한 용량은 생체중합체와 연관된 활성 제제 또는 약물 부위의 수에 의해 영향을 받게 된다.

바람직한 구체예에서, 접합체는 환형 RAP 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 0.005∼100 mg/kg의 아드리아마이신을 포함하는 환형 RAP 펩티드-아드리아마이신의 용량은 생체 내에서도 유용하다. 특히 바람직하게는 아드리아마이신 0.05 mg/kg∼20 mg/kg을 포함하는 환형 RAP 펩티드-아드리아마이신의 용량이다. 당분야의 당업자는 화합물의 유리 형태에 대해 사용되는 추천 용량을 부분적으로 기초로 하여 환형 RAP 펩티드에 연결된 화합물에 대한 적절한 용량을 결정할 수 있다. 환형 RAP 펩티드에 활성 제제의 접합은 대체로 동일 효능을 얻기 위해 필요한 약물의 양을 감소시킨다.

본 발명의 접합체 및 조절인자는 동물, 특히 인간에서 치료, 예방 및 진단적 중재를 위해 유용하다. 환형 RAP 펩티드 화합물은 특정 조직에서 우선적인 축적을 나타낼 수 있다. 진단 용도에 대해 바람직한 의학 징후는 예를 들어, 목적하는 표적 장기(예를 들어, 폐, 간, 신장, 비장 등)와 관련된 임의 병태를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 목적하는 표적 장기는 뇌이다.

본 발명의 방법은 다양한 상이한 질환 상태를 치료하는 용도를 갖는다. 일 구체예에서, 구체적인 관심은 바람직한 활성을 갖는 활성 제제 또는 약물이 이전에 동정되었지만, 이 활성 제제 또는 약물이 표적 부위, 영역 또는 구획에 적절하게 전달되어 완전하게 만족할만한 치료 결과를 생성하지 못했던 병태에서의 본 방법의 용도이다. 이러한 활성 제제 또는 약물을 사용하여, 환형 RAP 펩티드에 활성 제제를 접합하는 본 발명의 방법을 활성 제제 또는 약물의 치료 효능 및 치료 지수를 증가시키기 위해 사용할 수 있다.

다양한 숙주 또는 피험체를 본 발명의 방법에 따라서 치료할 수 있다. 대체로 이러한 숙주는 "포유류" 또는 "포유동물"이고, 여기서 이러한 용어는 육식동물목(예를 들어, 개 및 고양이), 설치목(예를 들어, 마우스, 귀니아피그 및 래트), 및 영장류(예를 들어 인간, 침팬지 및 원숭이) 를 포함하여, 포유동물강에 속하는 유기체를 기술하는데 광범위하게 사용된다.

[실시예]

하기 실시예(들)는 본 발명의 바람직한 구체예를 설명하기 위해 포함시킨다. 하기의 실시예(들)에 개시한 방법들은 본 발명의 실시에서 충분하게 기능하는 것으로 본 발명자들이 밝혀낸 방법들을 대표하는 것이고, 따라서 본 발명의 실시를 위한 바람직한 형태를 구성하는 것으로 고려해야 함을 당분야의 당업자들은 이해할 것이다. 그러나, 당분야의 당업자는 본 발명의 관점에서, 이에 개시된 특정 구체예들을 다양하게 변형시킬 수 있고 본 발명의 범주를 벗어나지 않는 범주 내에서 유사하거나 동일한 결과를 도출할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 하기 실시예들은 환형 RAP 펩티드와 이들의 바람직한 수용체의 상호작용을 생성하고, 단리하고 특징규명하기 위한 예시적인 프로토콜을 제공한다.

실시예 1: RAP 변이체의 생성 및 분석

재료 및 방법

재료: M13 파지 디스플레이 벡터를 Maxim Biotechnology에서 구매하였다. 발현 벡터 pET30(+)a 및 S-태그 정제 시약은 EMD Biosciences에서 구매하였다. 항-RAP 항체는 BioMarin Pharmaceutical, Inc에서 생산한 것이다. 제한 효소 및 T4 DNA 리가제는 New England Biolabs에서 구매하였다. ABI 3100 Avant 자동화 DNA 서열분석기를 사용하여 서열 데이타를 작성하고 분석하였다. 헥사히스티딘 태그 정제 시약은 Qiagen에서 구매하였다. 항-RAP 폴리클론 항체는 이전에 기술한 바와 같이 얻었다(49).

CR 단백질의 발현, 리폴딩 및 정제: 다른 연구자들에 의해 CR 단백질이 시험관 내에서 발현, 정제되어 이들의 천연 형태로 리폴딩될 수 있다는 것이 분명하게 검증되었다(45, 50-54). 본 명세서에서 기술하는 실험에 대해, 하기 CR 서열을 이 과정을 위해 선택하였다: LRP6 유래 CR 트리플렛(CR1-3), 상기 트리플렛 내 LRP6 유래의 2 CR 쌍(CR1 및 2, CR12라 함, CR2 및 3, CR23이라 함), 인간 VLDLR 유래 CR 트리플렛(CR6-8), VLDLR 유래 CR 쌍(CR78), LRP2 유래 CR 트리플렛(CR34-36), LRP2 유래 2 CR 쌍(CR89, CR3435), 매트립타제/ST14/TADG-15 유래 3 CR 쌍(CR12, CR23 및 CR34), LRP1 유래 CR 트리플렛(CR3-5) 및 FDC-8D6 항원 유래 CR 쌍. 각각을 코딩하는 DNA 단편은 인간 cDNA(BD Biosciences Marathon-ready™ 또는 이전에 클로닝된 LRP6 cDNA(9)로부터 HotStart PfuTurbo™(Stratagene) 및 하기 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다:

LRP6CR1F: 5'-G C G A T A G G A T C C C C A A C A T G T T C T C C T C A G C A G T T T A C T T G T T T C A C G G G G G A A A T T G A C T G T A T C -3'; (서열 번호 3)

LRP6CR2R: 5'-G C G A T A A A G C T T T T A T C A A A G C A C T T C A C A G T T C T T C T C A T C T G A T T T G T C C T G G C A G T T T G C A T C T C C A -3'; (서열 번호 4)

LRP6CR2F: 5'-G C G A T A G G A T C C C C T G T A T G C T C A G A G T C C C A G T T C C A G T G T G C C A G T G G G C A G T G T A T T G A T G G -3'; (서열 번호 5)

LPR6CR3R: 5'-G C G A T A A A G C T T T C A C T A A G T C G G A T A A C A A T C C A G T T C A T C T G A C T T G T C A C T G C A A T C C A C -3'; (서열 번호 6)

VLDLRCR6F: 5'-G C G A T A G G A T C C C A C A C C A A G T G T C C A G C C A G C G A A A T C C A G T G C G G C T C T G G C G A G T G C-3'; (서열 번호 7)

VLDLRCR7F: 5'-G C G A T A G G A T C C a c t t g c c g a c c t g a c c a a t t t g a a t g t g a g g a t g g c a g c-3'; (서열 번호 8)

VLDLRCR8R: 5'-G C G A T A A A G C T T T T A T C A T T C G T T T A T A T G A C A C T C T T T C A G G G G C T C A T C A C T C C A G T C C C T G-3'; (서열 번호 9)

LRP2CR8F: 5'-G C G A T A G G A T C C C C C A C G G A G C A G T G T G G C T T A T T T T C C T T C C C C T G T A A A A A T G G C-3'; (서열 번호 10)

LRP2CR9R: 5'-G C G A T A A A G C T T T T A T C A T G C G T G G G T G G G G C A G T T G T G C T C A T C A C T G C C A T C C A C A C A G T C G T T G C G T T T G-3'; (서열 번호 11)

LRP2CR34F: 5'-G C G A T A G G A T C C G A T G G T G C A T A C T G C C A G G C T A C T A T G T T C G A A T G C A A A A A C C A T G T T T G T A T C C C G C-3'; (서열 번호 12)

LRP2CR35F: 5'-G C G A T A G G A T C C G A T G T T C C C T G T A A T T C A C C A A A C C G T T T C C G G T G T G A C A A C A A T C G C T G C-3'; (서열 번호 13)

LRP2CR36R: 5'-G C G A T A A A G C T T T T A T C A T A T A T T T T C A G C A C A T G T T C T T T C T T T T C C T T T A T T G C A A C C C A G T T C A T C G-3'; (서열 번호 14)

ST14F1: 5'-G C G A T A G G A T C C C C A T G C C C G G G G C A G T T C A C G T G C C G C A C G G G G C G G T G T A T C-3'; (서열 번호 15)

ST14F2: 5'-G C G A T A G G A T C C T G C G A C G C C G G C C A C C A G T T C A C G T G C A A G A A C A A G T T C T G C-3'; (서열 번호 16)

ST14F3: 5'-G C G A T A G G A T C C A G T T G T C C G G C C C A G A C C T T C A G G T G T T C C A A T G G G A A G T G-3'; (서열 번호 17)

ST14R1: 5'-G C G A T A A A G C T T T T A T C A A C C C C T G C T C G T C G C T G T T G T C T C C G C A G T C G T T C A C A C T G-3'; (서열 번호 18)

ST14R2: 5'-G C G A T A A A G C T T T T A T C A A C T G C A C C C C T G C T C G T C G C T G T T G-3'; (서열 번호 19)

ST14R3: 5'-G C G A T A A A G C T T T T A T C A G T C G C A G T C C T T C T C A T C T G A G C C G T C G C T A C A G T C C T C C T T C C C G-3'; (서열 번호 20)

LRP1CR3F: 5'-G C G A T A G G A T C C C C C C A G T G C C A G C C A G G C G A G T T T G C C-3'; (서열 번호 21)

LRP1CR5R: 5'-G C G A T A A G C T T T C A A T A G G C A C A C G A A G C A G A C T C A T C A G A G C G G-3' (서열 번호 22)

8D6AF: 5'-G C G A T A G G A T C C T C G T G C C C A C C C A C C A A G T T C C A G T G C C G CA C C A G T G G C T T A T G-3'(서열 번호 23)

8D6SAR: 5'-G C G A T A A A G C T T T T A T C A T C C A C A G C C G A G C T C G T C G C T G G A G T C G G G A C-3' (서열 번호 24).

각각의 증폭된 단편은 BamHI 및 HindIII로 순차적으로 분해한 후 유사하게 분해한 pET30(+)a에 결찰시켰다. 얻어진 플라스미드는 CR 단편에 융합된 S-펩티드 및 N 말단 헥사히스티딘으로 구성된 단백질을 코딩한다. 전기천공을 통해서 결찰 반응물로 XL-Blue MRF'(Stratagene)을 형질전환시키고 단일 콜로니로부터 플라스미드를 분리하였다. Stratagene QuikChange II XL 시약 및 하기 프라이머를 사용하여 단독으로, 그리고 조합하여 3종 돌연변이 Y1040W, V1047D 및 R1088D를 LRP2 CR89 발현 플라스미드에 도입하였다:

CR89YWF: 5'-G T G C C C A A T T A C T G G C T C T G T G A T G G A G-3' (서열 번호 25);

CR89YWR: 5'-C T C C A T C A C A G A G C C A G T A A T T G G G C A C-3' (서열 번호 26);

CR89V1047DF: 5'-C T C T G T G A T G G A G A C G A T G A T T G T C A T G A T A-3' (서열 번호 27);

CR89V1047DR: 5'-T A T C A T G A C A A T C A T C G T C T C C A T C A C A G A G-3' (서열 번호 28);

CR89R1088DF: 5'-C A C A C T G G C G C T G T G A C A A A G A C A A C G A C T G T G T G G A T G G C-3' (서열 번호 29);

CR89R1088DR: 5'-G C C A T C C A C A C A G T C G T T G T C T T T G T C A C A G C G C C A G T G T G-3' (서열 번호 30).

모든 발현 구성체를 서열분석하여 삽입된 서열 및 발현 벡터와의 접합부를 검증하였다. 이어서, 각 플라스미드를 사용하여 BL21(DE3) CodonPlus-RIPL™ 세포(Stratagene)를 형질전환시켰다. CR 단백질의 발현은 34 ㎍g/mL 클로람페니콜, 12.5 ㎍/mL 테트라사이클린 및 15 ㎍/mL 카나마이신이 보충된 LB 배지에서 성장한 대수 증식기 세포에 2 mM IPTG를 부가한 후, 32℃로 배양기 온도를 낮추고 250 x g에서 진탕하면서 4시간 동안 항온배양하여 유도시켰다. 세포를 펠렛화하고 초기 배양 부피의 3.5%로, 10 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM NaH₂PO₄, 8M 우레아 중에 재현탁하였다. 다음으로, 재현탁된 세포를 액체 질소에 동결시키고, 빠르게 37℃로 해동시켰으며 3 mm 프로브에 접속된 Cole-Parmer CP-130 초음파 프로세서를 사용하여 60으로 설정된 진폭에서 10초간 초음파처리하였다. 세포를 완전하게 용해시키기 위해 이 과정을 3회 반복하였다. 15℃에서 20분간 Sorvall RC-5 원심분리기에서 10,000 x g로 2회 원심분리하여 용해물을 투명화하였다. Ni-NTA 컬럼(Qiagen Superflow™, 1.5 mL 패킹층)을 사용하여 CR 단백질을 정제하였다. 간략하게, 레진을 2 컬럼 부피의 용해 완충액으로 평형화시켰다. 투명한 용해물에 20 mM 이미다졸을 부가하고 평형화된 Ni-NTA 레진과 밤새 4℃에서 항온반응시켰다. 유통액(flow through)을 버렸다. 컬럼을 1 컬럼 부피의 용해 완충액으로 1회 세정한 후 20 mM 이미다졸이 보충된 TBS(pH 8) 1 컬럼 부피로 3회 세정하였다. CR 충전된 비드를 컬럼에서 제거하고 20 mM 이미다졸이 함유된 동일 완충액 1 컬럼 부피와 30분간 실온에서 항온반응시켜서 CR 단백질을 용리하였다. 이 단계를 1회 반복하여 용리물을 모았다. 용리된 CR 단백질 용액에 2 M 우레아, 10 mM CaCl₂ 및 5 mM DTT를 부가하였다. 정제하고, 변성된 CR 단백질 용액을 3,500 MWCO Slide-A-Lyzer™(Pierce) 카세트로 옮기고 실온에서 밤새 200배 과량의 50 mM Tris-HCl pH 8.5, 10 mM CaCl₂, 1 mM 환원 글루타티온, 0.5 mM 산화 글루타티온에 대해 연속적으로 투석한 후, 이어서 4℃에서 밤새 5 mM CaCl₂가 보충된 TBS에 대해 투석하였다. 단백질 농도는 브래드포드(Bradford) 어세이를 통해 측정하였고 순도는 SDS-PAGE와 쿠마시 브릴리언트 블루 염색을 통해 확인하였다.

RAP 파지 디스플레이 라이브러리의 제조: QuikChange II™ 시약(Stratagene)을 사용하여 pIII 리더 서열 내에 PflMI 및 HindIII 부위를 제거하여 파지 디스플레이 파지미드 pHage 3.2를 변형시켰다. 또한, pHage 3.2의 폴리링커를 BamHI, NotI 및 AgeI 부위를 포함하는 이중 가닥 링커에 결찰시켜 변형시켰다. 얻어진 변형 파지미드를 pHage 3.6이라 하였다. RAP 및 인간 □-L-이두로니다제간의 융합체 발현을 위해 이전에 기술된 벡터인 pc3B-RAPIDU(49)를 BamHI 및 AgeI로 분해하여 인간 RAP 서열을 코딩하는 DNA 단편을 얻었다. 이 서열은 RAP cDNA의 뉴클레오티드 102에서 시작하고 뉴클레오티드 1059에서 종결된다. 코딩된 RAP 단백질은 N 말단에 RAP 신호 펩티드 및 C 말단의 HNEL 소포체 체류 신호(서열 번호 ___) 둘 모두 결여되어 있다. 또한, 5'-말단에 인프레임 BamHI 부위가 존재하고 3'-말단에는 AgeI 부위를 포함하여 펩티드 AEAETG를 코딩하는 인프레임 서열이 존재한다. 상기 RAP 서열을 유사하게 분해된 3.6에 결찰시켜서 M13 pIII 리더 펩티드, RAP 서열 및 pIII 서열 간에 융합물을 생성시켰다. 이 구성체를 pHage 3.6 RAP이라 하였다. 다음으로, 수용체 결합에 중요하다고 이미 보고된 RAP의 제3 도메인 내 2 위치(RAP d3 K256 및 K270)에 돌연변이를 유발시켰다(55). 정상 및 돌연변이유발 프라이머 쌍을 사용하여 RAP d3의 5' 및 3'-절반부의 개별 PCR 증폭을 통해 이들 2 위치를 포화시켰다:

RAP2KXF: 5'-C C C T C G G A C G T C A G C G A C A T C A A G G G C A G C G T C C T G -3' (서열 번호 31);

RAP2KX2: 5'-C T C C A G C T G C T T C T G G T A G T G G T T G T G V N N C T C C T C G A T T T T G G C T T C G A A G T G C T T G A G C T C C T -3' (서열 번호 32);

RAP2KX1: 5'-A A G C A G C T G G A G A T T G C G C A C G A G N N B C T G A G G C A C G C A G A G A G C G T G G G C G A A C G G C -3' (서열 번호 33); 및

RAPmut1R: 5'-G G T G C G G G G C C T C A C C G G T -3') (서열 번호 34).

상기 단편들은 pc3B-RAPIDU로부터 증폭하였다. 각 돌연변이유발 프라이머는 선택된 라이신 코돈 중 하나를 47개의 다른 코돈 중 하나로 또는 3개의 가능한 종결 코돈 중 하나로 치환시킨다. 이러한 치환으로 2304의 가능한 뉴클레오티드 조합물 풀 및 441의 가능한 아미노산 조합물 풀(또는 종결 코돈)이 생성된다. RAP d3 5' 및 RAP d3 3'-PCR 단편은 공통 부위에서 PvuII로 분해한 후 T4 DNA 리가제를 사용하여 결찰 반응으로 조합하였다. PvuII 부위에서 융합된 5' 및 3'-단편으로 구성된 이종이량체 결찰 생성물을 FMC NuSieve GTG™ 아가로스 겔 상에서 분리하고 Amersham GFX™ 시약을 사용하여 정제하였다. 상기 이종이량체를 UV 분광계로 정량하고 GeneMorph II EZclone™ 시약(Stratagene) 및 프라이머 RAPKXF와 RAPmut1R(상기에 나타냄)를 사용하는 에러-프론 PCR을 통해 추가의 돌연변이유발 과정을 실시하였다. 이종이량체 농도는 각 50 ㎕ 반응물 당 500 pg 이하로 유지시켜서 최종 돌연변이 빈도를 최대화하였다. 돌연변이유발된 DNA를 AgeI로 분해하고, GFX로 정제하여, UV 분광계로 정량한 후 Stratagene EZclone™ 시약을 사용하여 pHage 3.6 RAP로 무-리가제 클로닝하였다. 무-리가제 클로닝 반응 생성물을 Qiagen MinElute™ 컬럼을 사용하여 정제하였다. 정제된 무-리가제 클로닝 생성물의 분취물(3 ㎕)을 사용하여 XL10-Gold™ 화학적 컴피턴트(chemically-competent) 세포 50 ㎕를 형절전환시켰다. 상기 형질전환된 세포의 분취물을 연속 희석하고 100 ㎍/mL 카르베니실린을 함유하는 LB 플레이트 상에 도말하여 1차 형질전환체의 수를 측정하였다. 나머지 형질전환 세포를 25 x 25 cm 디쉬에 도말하였다. 총 119,500의 1차 형질전환체 콜로니를 350 mL의 Qiagen GigaPrep™ P1 완충액을 사용하여 상기 디쉬로부터 회수하였다. Qiagen 시약 및 프로토콜을 사용하여 플라스미드 DNA를 제조하였다. 플라스미드 제조물을 정량하고 BamHI 및 AgeI로 분해하여 적절한 크기의 삽입물의 존재를 확인하였다.

RAP d3 돌연변이체 라이브러리의 제조: RAP d3 돌연변이체 라이브러리는 PfuUltra 효소 및 시약(Stratagene)을 사용하여 PCR을 통해 제조하였다. d3 코딩 서열의 5' 및 3' 절반부를 HPLC-정제된 프라이머를 사용하여 개별적으로 증폭하였다.

MorphF4: 5'-G G C C C A G A T C T A C C G G T T T C T G C C T C G G C-3' (서열 번호 35);

D3hAlfR2: 5'-G T G C G C A A T C T C G A G C T G C T T C T G G T A G T G G T T G T G V N N C T C G A T T T T G G C V N N G A A G T G C T T G A G C T C C T C C C G G-3' (서열 번호 36);

D3hAlfF2: 5'-C C A C T A C C A G A A G C A G C T C G A G A T T G C G C A C G A G N N B C T G A G G C A C G C A G A G A G C G T G G G C G A C G G C-3' (서열 번호 37);

MorphR3: 5'-G A G T G C G G C C G C A A G C T T A T C T T C T G C C T C G G C-3' (서열 번호 38).

상기 프라이머는 251, 256 및 270 위치의 코돈을 NNB로 치환시켜, 이들 위치에 가능한 모든 아미노산을 생성하게 된다. 또한, RAP d3 코딩 서열 내 PvuII 부위는 단일, 침묵, 염기 치환으로 제거하였다. 증폭된 단편을 Amersham GFX 시약을 사용하여 정제한 후 PfuUltra를 사용하여 무프라이머(primer-less) PCR을 통해 어셈블링하였다. RAP d3 변이체 서열의 어셈블링된 풀을 정량하고 GeneMorph II 시약(Stratagene)을 사용하여 돌연변이유발을 수행하였다. 돌연변이유발된 DAN를 BamHI, PvuII 및 AgeI으로 순차적으로 분해하고 각 반응 후에 GFX 시약을 사용해 정제하였다. 분해된 RAP d3 변이체 단편 풀을 유사하게 분해한 pHage 3.6(상기 참조)에 결찰시켰다. 플라스미드 라이브러리는 XL10-Gold 세포(Stratagene)를 형질전환시키고 카르베니실린이 보충된 25 x 25 cm의 LB 디쉬에 도말하여 제조하였다. 콜로니를 디쉬에서 회수하고 상기 기술한 바와 같이 플라스미드 DNA를 준비하였다.

파지의 제조: 플라스미드 라이브러리(10 ng)를 사용하여 전기천공을 통해 XL-Blue MRF'을 형질전환시켰다. 2% 글루코스가 보충된 1 mL의 2 x YT에서 1시간 동안 37℃에서 항온반응시킨 후, 형질전환된 세포 배양물에 100 ㎍/mL 카르베니실린을 보충하고 추가 6시간 동안 성장시켰다. 상기 시간 기간 이후, 1 mL 배양물을 사용하여 50 mL 엘렌메이어 플라스크 중에 2% 글루코스, 100 ㎍/mL 카르베니실린 및 10⁸ pfu/mL M13K07 헬퍼 파지(New England Biolabs)가 보충된 10 mL 2 x YT에 접종하였다. 이 배양물을 37℃에서 2시간 동안 250 x g에서 진탕 배양한 후, 10분간 2,000 x g에 Sorvall RC-5에서 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다. 세포를 100 ㎍/mL 카르베니실린 및 100 ㎍/mL 카나마이신이 보충된 10 mL 2 x YT에 재현탁하고 37℃에서 밤새 진탕하였다. 배양물을 10,000 x g에서 2회 원심분리하여 투명하게 하고 상등액을 회수하였다. 1 부피의 차가운 TBS 및 0.2 부피의 2% PEG 8000(Sigma), 2.5 M NaCl과 상등액을 배합하여 파지를 침전시키고, 10,000 x g에서 원심분리하여 회수한 후 TBS에 재현탁하였다. 파지 역가는 연속 희석한 파지 샘플로 측정하고, 대수기 증식한 XL-Blue MRF'와 함께 항온반응하고 100 ㎍/mL 카르베니실린이 보충된 2 x YT 아가에 도말하였다.

파지 패닝: 정제하고, 폴딩된 CR 단백질을 사용하여 5 mM CaCl₂이 보충된 TBS 중에서 4℃에서 밤새 1 ㎍/웰로 Nunc MaxiSorp™ 96 웰 플레이트를 코팅하였다. 파지를 부가하기 전에 웰을 세정하고 5 mM CaCl₂이 보충된 TBS Superblock™(Pierce)으로 블로킹하였다. 5 mM CaCl₂ 및 0.05% Tween-20이 보충된 TBS Superblock™ 중 10⁹ cfu(10¹⁰ cfu/mL)의 정제된 파지 라이브러리를 코팅된 웰에 부가하고 실온에서 2시간 동안 항온반응시켰다. 이후 웰을 TBSTC(5 mM CaCl₂ 및 0.05% Tween-20이 보충된 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl)로 15회 세정하였다. 결합된 파지를 1 mg/mL BSA를 포함하는 0.2 M 글리신-HCl pH 2.2로 용리하고 pH를 중성이 되도록 0.2 부피의 1M Tris-HCl pH 9.1을 포함하는 튜브로 옮겼다. 용리된 파지는 대수기 XL-Blue MRF' 세포와 용리물을 혼합하여 회복시켰다. 방출된 파지는 30℃에서 밤새(16시간) 액체 배양으로 세포를 성장시켜 증폭시켰다. 또한, 형질전환된 세포의 분취액은 샘플을 연속 희석하여 역가를 확인하였고, 100 ㎍/mL 카르베니실린이 함유된 2 x YT 아가에 도말하였다. PEG 침전을 통해 배지 상등액으로부터 파지를 정제하고 농축하였다.

RAP d3 단백질의 발현: d3 Rescue F: 5'- G C G A T A G G A T C C C T G G A C C G C C T G C G C A G G G T C A G C C A C C-3' (서열 번호 39) 및 d3 Rescue R: 5'-G C G A T A A A G C T T T T A T C A A G A T C T A C C G G T T T C T G C C T C G G C-3' (서열 번호 40)를 사용하여 RAP d3 서열을 PCR 증폭하고, BamHI 및 HindIII으로 분해한 후 유사하게 분해한 pET30(+)a에 결찰시켰다. 상기 기술한 바와 같이 RAP d3 단백질을 BL21(DE3) CodonPlus-RIPL™에서 발현시키고 Ni-NTA 크로마토그래피하여 정제하였다. 단백질 농도는 브래드포드 어세이를 통해 측정하였고 순도는 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.

돌연변이체 RAP d3의 연속 복귀변이 및 야생형 RAP d3의 전진 돌연변이: Stratagene QuickChange II XL™ 시약 및 하기 프라이머를 사용하여 친화력-선별된 RAP d3 변이체 내의 각 돌연변이를 개별적으로 야생형으로 복귀변이시켰다:

V2AR1: 5'-A G G G T C A G C C A C C A G G G C T A C A G C A C T G A G G C T A A G T T C G A G G A G C C C A G G G T G A T-3' (서열 번호 41);

V2Ar2: 5'-C A G C C A C C A G G G C T A C A C C A C T G A G G C T G A G T T C G A G G A G C C C A G G G T G A T T G A C C-3' (서열 번호 42);

V2Ar3: 5'-G G A G G C G T T C C G G G A G G A G C T C A A G C A C T T C A A A G C C A A A A T T G A G G C C C A C A A C C-3' (서열 번호 43);

V2Ar4: 5'-C G T T C C G G G A G G A G C T C A A G T A C T T C G A A G C C A A A A T T G A G G C C C A C A A C C A C T A C-3' (서열 번호 44);

V2Ar5: 5'-G C T C A A G T A C T T C A A A G C C A A A A T T G A G A A G C A C A A C C A C T A C C A G A A G C A G C T G G A G-3' (서열 번호 45);

V2Ar6: 5'-A G A A G C A G C T G G A G A T T G C G C A C G A G A A G C T G A G G C A C G C A G A G A G C G T G G G C G A C G G-3' (서열 번호 46);

V2Arr1: 5'-A T C A C C C T G G G C T C C T C G A A C T T A G C C T C A G T G C T G T A G C C C T G G T G G C T G A C C C T-3' (서열 번호 47);

V2Arr2: 5'-G G T C A A T C A C C C T G G G C T C C T C G A A C T C A G C C T C A G T G G T G T A G C C C T G G T G G C T G-3' (서열 번호 48);

V2Arr3: 5'-G G T T G T G G G C C T C A A T T T T G G C T T T G A A G T G C T T G A G C T C C T C C C G G A A C G C C T C C-3' (서열 번호 49);

V2Arr4: 5'-G T A G T G G T T G T G G G C C T C A A T T T T G G C T T C G A A G T A C T T G A G C T C C T C C C G G A A C G-3' (서열 번호 50);

V2Arr5: 5'-C T C C A G C T G C T T C T G G T A G T G G T T G T G C T T C T C A A T T T T G G C T T T G A A G T A C T T G A G C-3' (서열 번호 51);

V2Arr6: 5'-C C G T C G C C C A C G C T C T C T G C G T G C C T C A G C T T C T C G T G C G C A A T C T C C A G C T G C T T C T-3' (서열 번호 52).

동일한 방법 및 하기 프라이머를 사용하여 야생형 RAP d3에 대해 돌연변이를 유발시켰다:

K256AF: 5'-C T T C G A A G C C A A A A T C G A G G C G C A C A A C C A C T A C C A G A A G C-3' (서열 번호 53);

K256AR: 5'-G C T T C T G G T A G T G G T T G T G C G C C T C G A T T T T G G C T T C G A A G-3' (서열 번호 54);

K270EF: 5'-G C T G G A G A T T G C G C A C G A G G A G C T G A G G C A C G C A G A G A G-3' (서열 번호 55);

K270ER: 5'-C T C T C T G C G T G C C T C A G C T C C T C G T G C G C A A T C T C C A G C-3'(서열 번호 56);

d3E251KF: 5'-G A G G A G C T C A A G C A C T T C A A A G C C A A A A T C G A G A A G C A C A A C-3' (서열 번호 57);

d3E251KR: 5'-G T T G T G C T T C T C G A T T T T G G C T T T G A A G T G C T T G A G C T C C T C-3' (서열 번호 58);

d3E217KF: 5'-C A G G G C T A C A G C A C T G A G G C T A A G T T C G A G G A G C C C A G G G T G-3' (서열 번호 59);

d3E217KR: 5'-C A C C C T G G G C T C C T C G A A C T T A G C C T C A G T G C T G T A G C C C T G-3' (서열 번호 60);

d3H249YF: 5'-G T T C C G G G A G G A G C T C A A G T A C T T C G A A G C C A A A A T C G A G-3' (서열 번호 61);

d3H249YR: 5'-C T C G A T T T T G G C T T C G A A G T A C T T G A G C T C C T C C C G G A A C-3' (서열 번호 62).

고체상 결합 어세이: 정제하고, 리폴딩한 CR 단백질(1 ㎍)을 4℃에서 밤새 5 mM CaCl₂ 보충된 TBS pH 8(TBSC) 중에서 Nunc Maxisorp™ 96 웰 플레이트에 결합시켰다. 웰을 TBSC로 세정한 후 2% 소혈청 알부민(BSA) 함유된 TBSC로 블로킹하였다. 이후, 실온에서 0.05% Tween-20이 보충된 상기 블로킹 완충액 중에서 2시간 동안 일련의 농도 범위에서 고정된 수용체와 RAP 리간드를 항온반응시켰다. 대조군 웰은 부가된 리간드를 함유하지 않는다. 추가 대조군으로서, 결합성에 칼슘 부재가 영향을 주는지 확인하기 위해서, 일부 샘플에 대해 10 mM EGTA를 항온반응 매질에 포함시켰다. 웰을 TBSTC로 세정하고 결합된 리간드를 폴리클론 항-RAP(BP41/42, 1:1,000, BioMarin)를 사용하여 검출하였다. 과량의 1차 항체를 제거하고 웰을 세정한 후 2차 항체인 HRP 접합된 염소 항토끼 IgG(Bio-Rad)와 항온반응시켰다. 세정 후, TMB 기질 용액(Bio-Rad)을 부가하여 HRP를 검출하였다. 발색을 1N HCl을 사용하여 중지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 마이크로플레이트 분광 광도계(Molecular Devices)로 측정하였다. 단일 부위 결합성을 가정한 비선형 회귀법으로 데이타를 그래프화하고 K_d 값을 계산하였다(GraphPad Prism).

결과

인간 단백체 내 직렬 CR 쌍을 확인하고 RAP에 대한 결합에 이미 연루되어 있는 쌍들 중에서 이들의 위치를 분석하기 위해, Pfam 데이타베이스(pfam.wustl.edu)에서 동정된 190 비중복 인간 CR 서열의 서열들을 스프레드시트로 전송하였다. CR 서열의 직렬쌍을 동정하였는데, 쌍으로서 지정하기 위한 유일한 필수조건은 2 CR 서열이 이들이 존재하는 단백질의 1차 서열 내에서 상호 바로 인접하는 것이다. 각 CR 서열의 제1 아미노산 간 거리에 대한 75 아미노산 한계치 부과는, Pfam 데이타베이스에서 정의한 바와 같이, 이 조건을 위해 적절하게 테스트하였다. 정해진 CR 서열에 RAP의 결합에 대해 기록된 데이타의 다수가 이러한 쌍을 포함하기 때문에 직렬 배열을 위한 필요 조건을 가정하였다. 3 CR 서열의 선형 어레이가 2 CR 쌍을 포함하도록 중첩되는 쌍을 포함시켰다. 이러한 방법으로 149 직렬 CR 쌍이 동정되었다. 칼슘 결합 루프 영역의 서열 보존성은 이 분석의 다음 단계를 용이하게 하였고, 이전 연구에서는 추출된 4 아미노산이 RAP 결합에 직접적으로 연관되어 있었다(56,57). 이들은 CR 쌍의 각 CR 서열의 AxcBxCxD 모티브에서의 A 및 C와 동등하였다. 각 쌍의 제1 CR 서열의 A 및 C 위치에서 아미노산 존재들과, 각 쌍의 제2 CR 서열의 A 및 C 위치의 아미노산(이하, A' 및 C'이라함)은 이후 비교를 위해서 단일한 4량체 테스트 스트링(ACA'C')으로 연결시켰다. 각 CR 쌍에 대한 테스트 스트링을 모든 다른 CR 쌍의 스트링과 비교하였고 각각의 빈도를 계산하였다. 본 분석에서 동정된 149개의 비중복 인간 직렬 CR 쌍 서열 중에서, A, C, A' 및 C'에서 가장 일반적인 아미노산 조합은 WDWD였으며, 이는 16회 존재하였다. 또한, 본 발명자들의 정규(canonical) CR 쌍 정의에 적합화시킨 총 28개에 대해, 총 4 CR 쌍은 WEWD 신호를 가졌고, 2개는 WEWE를 가졌으며 6개는 WDWE를 가졌다. 정규 CR 쌍 신호는 LDLR 패밀리에서만, 특히 VLDLR, LRP1, LRP1B, LRP2, LRP4, apoER2 및 SorLA에서만 발견되었다. 이들 수용체 모두는 이미 높은 친화력으로 RAP에 결합하는 것으로 확인된 것들이다. 보다 낮은 빈도의 중복 조합 이외에도, 101개의 고유한 조합이 동정되었고, 모든 CR 쌍 함유 단백질은 1 이상을 가졌다. 아미노산을 이들 측쇄의 적절한 물리 화학적 특성을 기초로 6 그룹 중 하나로 지정하여 A, C, A' 및 C'에서의 각 아미노산의 4량체 조합을 일반화하였다. 소수성 지방족 아미노산은 1 그룹(I, L, M, V), 소형의 소수성 아미노산은 2 그룹(A, C, G, P, S, T), 염기성 아미노산은 3 그룹(H, K, R), 산성 아미노산은 4 그룹(D, E), 카르복스아미드 아미노산은 5 그룹(N, Q), 그리고 방향족 아미노산은 6 그룹(F, W, Y)으로 지정하였다. 이전과 같이, 각각의 일반화된 조합을 다른 모든 이러한 조합과 비교하고 그 빈도를 계산하였다. 가장 공통적인 일반화 조합은 A 및 A'에 방향족 아미노산, C 및 C'에 산성 아미노산인 6464로 확인되었다. 이 그룹은 28개의 모든 특이적 정규 조합을 포함하였고, 149 CR 쌍 조합 중 44의 비율을 차지하였다. 이러한 부류의 CR 쌍의 대표예는 LDLR 패밀리의 2 극단, 즉 코린(corin) 및 페레칸(perlecan)을 포함하여, 10개 단백질에 존재하였다. 총 57개의 일반화 조합은 고유한 것이었고, 이전처럼, 1 이상의 고유한 조합은 VLDLR을 제외하고 각 LDLR 수용체 엑토도메인에서 확인할 수 있다. 선택된 위치에서 아미노산의 고유한 일반화 조합을 갖는 CR 쌍을 포함하는 다른 단백질에는 관통막 세린 프로테아제 매트립타제 1, 2 및 3(MT-SP1, ST14, TADG-15), FDC-8D6 항원, 코린, 보체 인자 I 및 헤파린 설페이트 프로테오글리칸 단백질, 페레칸이 포함되었다(25,58).

각 CR의 칼슘 결합 루프 내 A, C, A' 및 C'에서 고유한 아미노산 조합을 갖는 다수의 CR 쌍에서, CR 쌍 또는 트리플렛을 선택하여 RAP d3에 대한 이들 결합을 테스트하였다(도 2). FDC-8D6에서 유래한 추가 쌍을 테스트하였으며, 이를 8D6 CR12이라 하였고 다음의 서열을 갖는다:

(GSSCPPTKFQCRTSGLCVPLTWRCDRDLDCSDGSDEEECRIEPCTQKGQCPPPPGLPCPCTGVSDCSGGTDKKLRNCSRLACLAGELRCTLSDDCIPLTWRCDGHPDCPDSSDELGCG)(서열 번호 91).

선택한 수용체 단편은 CR 서열의 단일 쌍 또는 중첩되는 2 쌍을 포함하며 선택 위치에서의 아미노산 조합 범위를 반영하는 것을 의미한다. 중첩쌍이 분리한 쌍에 비하여 덜 효과적으로 폴딩된다는 것을 고려하여, 각 트리플렛을 구성하는 1 또는 2 중첩쌍을 또한 일부 경우에서 발현시켰다. 서열은 LRP6 CR1-3이라 명명한, 전체 길이 인간 LRP6(Uniprot 수탁번호 O75581)의 아미노산 1247-1363과 동등한, LRP6 CR 트리플렛; LRP6 트리플렛을 포함하는 2 중첩 CR 쌍인, LRP6 CR12 및 LRP6 CR23(각각 아미노산 1247-1322 및 1323-1363 포함); VLDLR CR6-8이라고 명명한, VLDLR, 아미노산 235-358의 단편(Uniprot 수탁번호 P98155); VLDLR CR78이라 명명한, 아미노산 295-358을 포함하는 VLDLR 트리플렛 내 CR 쌍; MAT CR12(ST14 CR12)(아미노산 452-524), MAT CR23(ST14 CR23)(아미노산 487-566)(Uniprot 수탁번호 Q8WVC1) 및 MAT CR34(ST14 CR34)(아미노산 525-602)이라 명명한, 관통막 세린 프로테아제 매트립타제 유래의 3 CR 쌍; FDC-8D6 항원, 아미노산 53-168(Uniprot 수탁번호 Q9NPF0)(서열 번호 94) 유래의 CR 쌍, 및 아미노산 852-973을 포함하는, LRP1 CR3-5라 명명한 LRP1 유래 트리플렛(Uniprot 수탁번호 P98157)을 포함시켰다. LRP1 CR3-5은 WDWD 신호를 갖는 2개의 중첩 정규 CR 쌍으로 구성되고, 이들 각각은 높은 친화력으로 RAP d3에 결합한다는 것이 이미 증명되었다(56).

다수의 이전 연구들은 CR 쌍 및 트리플렛이 박테리아에서 발현되고 시험 관 내에서 천연 구조로 리폴딩될 수 있다는 것을 증명하였다(45, 50-54, 56, 57, 59-62). 정제하고, 리폴딩된 각각의 CR 단백질을 발현시키고, 환원 및 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 분석하였다(도 3). CR 이동성은 환원 조건 하에서 예상한 분자량과 일치하였고, 각 단백질은 순도가 >90%인 것으로 판단되었다. 비환원 조건 하에서, 각 CR 단백질은 예상 분자량에 대해 기대했던 것 보다 빠르게 겔을 통해 이동하였다. 이러한 관찰 결과는 분자내 이황화 결합 형성에 따른 조밀하게 폴딩된 구조와 일치하는 것이다. 다수의 가능한 이황화 결합 조합이 가능하지만, 상기 언급한 연구들은 천연 이황화 결합 패턴이 특히 칼슘 존재하에 리폴딩 동안 선호된다는 것을 증명하였다. 대부분의 경우에서, 그리고 전기영동 분석의 해상도가 비교적 낮은 것을 고려하여, CR 단백질의 폴딩 형태는 단일 밴드로 나타났다(도 3).

각 CR 쌍 또는 중첩 쌍 세트에 대한 야생형 RAP d3의 결합은 고체상 어세이를 통해 측정하였다(도 4). 이러한 어세이에서 LRP1 CR3-5에 대한 RAP d3 결합력은 K_d가 11 nM이었고, 이는 이전에 보고된 값과 동일한 범위이다(56, 57, 63). LRP6 CR12, LRP6 CR23, LRP6 CR1-3, VLDLR CR78, LRP2 CR3536, LRP2 CR34-36 및 MAT CR23에 대한 RAP d3 결합력은 테스트한 최고 리간드 농도에서 LRP1 CR3-5에 대한 결합력의 5% 보다 낮았다. 개별적인 실험 세트에서 측정한 MAT CR12 및 CR34에 대한 RAP d3의 결합력 역시 검출되지 않았다. VLDLR CR6-8 및 LRP2 CR89에 대한 RAP d3 결합력은 보다 약간 높아서, 그래프를 신뢰할만하게 결합 등온선에 적합화할 수 있었다. 그럼에도, 이들 수용체 단편에 대한 RAP d3 결합력의 해리 상수는 300 nM 이상이었다.

RAP d3이 칼슘 결합 루프 내에 아미노산의 고유 조합을 포함하는 CR 쌍에 결합하지 않는다는 것이 확인된 후, 이러한 쌍에 결합할 수 있는 RAP d3 돌연변이체에 대한 친화력-선택 시스템을 개발하였다. 다른 단백질에 RAP의 융합물을 포유류 및 박테리아 세포 양쪽에서 발현시키고 천연 RAP의 수용체-결합 양태를 보유하는 것을 확인하였다(49, 64, 65). 따라서, 다른 단백질에 대해 이전에 수행된 바와 같이(66), M13 pIII 구조 단백질에 N 말단으로 융합된 전체 길이 RAP의 라이브러리를 생성하였다. RAP 돌연변이체 풀을 생성하기 위해, 2개의 돌연변이 유발 과정을 전체 길이 RAP 코딩 서열 내 제3 도메인에 대해 적용하였다. 수용체 결합에 직접 관여하는 것으로 이미 증명된 2 위치 K256 및 K270에 대한 코돈에 대해 먼저 포화 돌연변이 유발을 수행하였다. 이후 에러-프론 PCR을 사용하여 추가의 돌연변이를 무작위적으로 RAP d3에 도입하였다. 이러한 과정 이후에, 총 38개의 무작위 선별 클론을 서열 분석하여 돌연변이 빈도를 확인하였다. 10 클론(26%)은 RAP 서열 내에 중지 코돈이 생성되는 염기 삽입, 결실 또는 치환을 가졌다. 이러한 서열을 코딩하는 재조합 파지가 파지 어셈블리 및 감염 과정 동안 선호되는데 야생형 pIII만이 파지 캡시드 내로 도입되기 때문이다. 추가의 4 클론(11%)이 야생형 RAP를 코딩하는 것으로 확인되었다. RAP 파지-pIII 융합물의 나머지 24 코돈(63%)은 d3에 돌연변이를 갖는 RAP 단백질을 코딩하였다. 이들 클론 중 어떠한 것도 위치 256 및 270에 동일한 아미노산 조합을 갖지 않았는데, 이는 치환 범위가 기대한 대로 이들 부위에 대해 발생했음을 의미한다. 256 및 270 위치를 제외한 평균 돌연변이 빈도는 RAP의 마지막 110 아미노산(RAP d3) 내에서 2.4 아미노산 치환이었다. 38 클론 중 하나는 7 코돈의 인프레임 결실을 가진 반면 다른 것은 RAP d3의 3' 말단을 부분적으로 교체한 미확인 서열의 인프레임 삽입을 가졌다. RAP d1 또는 d2에서는 어떠한 돌연변이도 발견되지 않았다.

RAP d3만을 코딩하는 제2 파지 디스플레이 라이브러리를 제조하였다. 이 라이브러리는 추가 위치 251에 대해서 초기 스크리닝에서 얻은 변이체 내에서 이 부위의 중요도를 기초로 하여 포화 돌연변이유발을 수행한 것을 제외하고는 전체 길이 RAP 라이브러리와 유사한 방식으로 생성하였다(하기 참조). 251, 256 및 270 위치 이외에도, RAP d3 돌연변이체 라이브러리는 RAP의 마지막 110 아미노산 내에 2 아미노산 치환의 평균 돌연변이 빈도를 갖는다. 이 라이브러리에 야생형 RAP 서열이 과도하게 존재하지는 않았다.

상기 파지 패닝 시스템을 친화력을 기초로 RAP를 단리하는데 사용할 수 있는지 테스트하기 위해서, 야생형 RAP를 발현하는 파지 조제물을 CR 쌍-결합능이 감소된 것으로 예상되는 돌연변이체 RAP(K256D, K270D)(55)를 발현하는 파지 제조물로 1000배 희석하였다. 패닝은 방법에 기술한 바와 같이 수행하였다. 회복시킨 파지를 증폭하고 역가를 확인하였다. 10개의 회수한 콜로니에서 유래한 RAP d3 서열을 서열분석하였다. 1회 패닝 후, 패닝 실험에서 얻은 10 콜로니 중 2개가 야생형 RAP을 포함하였고, 출발 풀로부터 200배 농축된 것이었다. 보다 복합적인 서열 풀을 사용하여 상기 시스템을 추가 테스트하여서, 256 및 270 위치를 무작위화시킨 RAP 파지 라이브러리를 LRP1 CR3-5에 대해 패닝하였다. 초기 파지 라이브러리에서, 야생형 RAP 서열은 10 파지 중 대략 1 파지에 의해 코딩되었다(선별 전에 무작위 클론을 서열 분석한 것을 기초로 함). 제1회 패닝 후, 야생형 RAP 서열은 10 파지중 7 파지에 의해 코딩되었다. 이러한 결과는 1회 패닝 후 서열의 복합 풀에서 선택한 서열에 대해 7배 농축되었음을 증명하는 것이다.

RAP 서열을 친화력 선별을 통해서 파지 디스플레이 라이브러리로부터 분리할 수 있다는 결론하에, 본 발명자들은 우선 야생형 RAP가 결합하지 않는 CR 쌍, LRP2 CR89를 선택하고, 이중 돌연변이 유발된 전체 길이 RAP 파지 라이브러리와의 패닝 기질로서 사용하였다. 4회째 패닝 이후, 8개의 무작위 선택한 클론 중 3개가 동일하였다. 공통 서열은 다음의 7 돌연변이를 가졌다: V175L, S213T, E217K, H249Y, E251K, K256A, K270E. 4 클론 중 2번째 그룹은 256 및 270 위치에 동일한 치환(K256A, K270R)을 가졌지만, 이들 2 부위의 극단에서는 가변 치환 패턴을 가졌다. 제5회째 패닝 후, 8개의 무작위 선택된 클론 중 7개가 이전에 관찰된 V175L, S213T, E217K, H249Y, E251K, K256A, K270E 돌연변이 세트를 가졌다. 이 서열에 대한 RAPv2A 또는 MegaRAP1(서열 번호 93)라 명명한 이 서열에 대한 모든 돌연변이는 가변 라이브러리를 제조하기 위해 돌연변이 유발한 영역에 존재하였다.

친화력 선별 결과로 발생한 라이브러리 분해능을 확인하기 위해서, RAP 및 MegaRAP1 파지를 준비하고 LRP2 CR89에 대한 결합에 대해 어세이하였다. 동일한 출발 역가를 사용하여, 야생형 RAP를 사용한 것에 비하여 MegaRAP1을 사용한 패닝을 통해서 2.6배 보다 많은 콜로니 형성 단위(cfu)를 회수하였다. 결합된 파지를 항-pIII 항체를 사용하여 검출시에 유사한 결과를 얻었으며, 이는 2 파지 간 감염성 차이가 회수된 파지 역가 차이의 원인은 아님을 의미한다. 50 mM EDTA 존재 하에 결합 반응을 수행하여, MegaRAP1 결합이 칼슘에 의존적이고, 수용체에 따라 정해진 CR 폴드에 대한 필수 조건과 일치함을 확인하였다. RAP 및 MegaRAP1 파지는 단일, 보존성 치환(V175L)에 의해 상이한, 동일 d1 서열 및 d2 서열을 갖기 때문에, 본 발명자들은 d3의 차이는 LRP2 CR89에 대한 결합성을 향상시키기 위한 것이라는 가설을 세웠다. 따라서, 후속 결합 분석을 위해서 RAP d3 및 MegaRAP1 d3을 서브클로닝하고 발현시켰다. 후속 실험을 위해 발현시킨 d3 영역은 성숙한 RAP의 아미노산 201-319를 포함하므로, RAPv2A의 결합 양태에 대한 V175L 돌연변이 영향은 측정하지 않았다.

다음으로, LRP1 CR3-5 및 LRP2 CR89에 대한 RAP d3 및 MegaRAP1 d3 단백질의 결합을 분석하였다. 친화력 차이에 대한 각 MegaRAP1 d3 돌연변이의 상대적인 기여도를 이해하기 위해서, 본 발명자들은 또한, 다수의 MegaRAP1 d3 복귀변이체 및 RAP d3 전진 돌연변이체를 제조하였으며, 이들 모두는 MegaRAP1 d3 및 야생형 RAP d3 간의 서열 변이 중간체(4 아미노산 C 말단 체류 신호 결여)(서열 번호 92)(도 5A 및 5B, 표 2)를 포함한다. 모든 경우에서, 10 mM EGTA는 CR 단백질에 대한 RAP d3 및 MegaRAP1 d3의 결합을 방해하였다. 칼슘은 결합 완충액에 존재하는 유일한 2가 금속 이온이므로, 이러한 관찰 결과는 RAP d3 및 MegaRAP1 d3 결합이 칼슘 충전딘 CR 쌍에 결합한다는 것과 일치한다. RAP d3은 해리 상수가 16 nM로 LRP1 CR3-5에 결합하였고, LRP2 CR89에 대해 유의한 친화력을 나타내지 않았는데 이는 도 4에 나타낸 결과와 일치한다. 반대로, MegaRAP1 d3은 38 nM의 해리 상수로 LRP2 CR89에 결합하였지만 LRP1 CR3-5에 대해서는 유의한 친화력을 나타내지 않았다. 따라서, 야생형 RAP d3 및 MegaRAP1 d3은 이들 2 수용체 단편에 대해 반대의 결합 선호도를 갖는다. 2 MegaRAP1 d3 복귀변이체, T213S 및 K217E는 LRP2 CR89에 대한 친화력이 약간 개선되었지만, 검출가능하게 LRP1 CR3-5에 결합하지는 않았다. 3 MegaRAP1 d3 복귀변이체, Y249H, K251E 및 A256K는 수용체 단편에 결합하지 않았는데, 이 돌연변이는 MegaRAP1 d3과 LRP2 CR89간의 상호작용에는 중요하지만 개별적으로 LRP1 CR3-5에 대한 결합을 파괴하는데 관여하지는 않았다. 흥미롭게도, E270K 복귀변이체는 MegaRAP1 d3보다 높은 친화력으로 2 수용체 단변에 결합하였는데, LRP2 CR89에 대한 해리 상수는 8 nM이고 LRP1 CR3-5에 대해서는 142 nM이었다. MegaRAP1 d3 돌연변이체는 LRP2 CR89에 대한 친화력을 기초로 선택하였기 때문에, 이러한 결과는 모든 가능한 서열 변이체를 고려하는 것이 불충분했던 출발 라이브러리의 다양성과 일관성이 있다. 다르게, MegaRAP1 d3 및 MegaRAP1 d3 E270K 간의 친화력 차이는 후자가 반복적인 패닝에서 우세하도록 하는데는 충분하지 못하였다. 이중 복귀변이체, T213S, E270K는 본 발명자들의 어세이에서 MegaRAP1 d3과 구별되지 않는 결합 양태를 나타내었다. 이들 위치에서의 2 단일 부위 복귀변이체는 LRP2 CR89에 대한 친화력이 개선된 것으로 나타났고, E270K, LRP1 CR3-5 경우에서도 역시 그러하였기 때문에, 이 결과는 본 발명자들의 어세이에서 이러한 친화력 범위 내에 정확도 결여 또는 이들 복귀변이에 의한 결합 효과에 가감성 결여를 의미한다. K251E, E270K 이중 복귀변이체의 결합 양태는 E251K 돌연변이 상에서 LRP2 CR89에 대한 MegaRAP1 d3의 친화력에 상당히 의존적임을 시사한다. 이 복귀변이체와 단일 부위 E270K 복귀변이체간의 LRP2 CR89 친화력 차이는 거의 20배이다. A256K, E270K 이중 복귀변이체는 LRP2 CR89에 대한 2배 친화력이 손실을 초래하였는데, 이는 K256A MegaRAP1 d3 돌연변이가 이 단편의 친화력에 대해 적절하게 긍정적인 영향을 준다는 것을 의미한다. 그러나, 상기 이중 복귀변이체와 E270K 단일 부위 복귀변이체간의 가장 두드러진 차이는 LRp1 CR3-5에 대한 친화력이 거의 30배 개선되었다는 것이다. 따라서, MegaRAP1 d3의 K256A 돌연변이는 LRP1 CR3-5에 대한 친화력에 음성적인 영향을 주는 동시에 LRP2 CR89에 대한 친화력은 개선시키는 영향을 발휘하는, 2 수용체 단편을 구별하는 상기 변이체의 능력에 대한 핵심적인 결정인자이다.

테스트한 RAP d3 전진 돌연변이체 중에서, E251K, K256A 및 K270E의 조합만이 LRP2 CR89에 대해 측정가능한 친화력을 나타내었다. LRP2 CR89에 대한 상기 트리플렛 돌연변이체의 결합성에 대한 해리 상수는 114 nM로서, MegaRAP1 d3에 비하여 여전히 상대적으로 높았다. 이러한 친화력 차이는 아마도 H249Y 돌연변이체의 부가와 더욱 밀접한 듯하다. 217, 249 및 251에서 단일 부위 RAP d3 돌연변이체는 LRP1 CR3-5 결합에 대해 최소한의 영향을 가지며, LRP2 CR89에 대한 친화력은 측정가능한 범위가 아니었다. K270E 돌연변이는, 이의 단독이나 또는 E251K, K256A와의 조합 또는 이들 양쪽 경우에서 LRP1 CR3-5 결합을 측정할 수 없었다. LRP1에 RAP d3의 결합에 대한 K256A 또는 K270E의 상당한 음성적 영향은 기능 손실 RAP 돌연변이체에 대한 연구에서 이미 보고되었다(55). 여기서 보고된 결과는 본 발명의 연구와 일관성을 보인다. 전체적으로, LRP2 CR89의 결합에 대한 MegaRAP1 d3의 249, 251 및 256에서의 돌연변이의 긍정적 기여도 및 LRP1 CR3-5의 결합에 대한 256 및 270에서의 돌연변이의 부정적 기여도는 2 수용체 단편에 대한 결합에서 MegaRAP1 d3과 야생형 RAP d3간의 차이를 주로 설명하는 듯 하다.

본 연구의 전제 중 하나는 CR 쌍의 칼슘 결합 루프 내 A, C, A' 및 C'에서의 아미노산이 RAP에 대한 결합 친화력의 핵심 결정인자이고 RAP 변이체의 결합에 대해 유사하게 중요하다는 것이다. 이러한 견해를 테스트하기 위해서, 이들 위치에서 천연의 비정규 잔기를 순차적으로 비천연의 정규(canonical) 잔기로 치환시켜서 돌연변이체 LRP2 CR89를 제조하였다. 상기 정의한 바와 같이, LRP2 CR89에 대한 A, C, A', C' 스트링은 YVWR이다. 돌연변이체는 LRP2 CR89 Y1042W (WVWR), LRP2 CR89 V1047D (YDWR), LRP2 CR89 R1088D (YVWD), LRP2 CR89 V1047D R1088D (YDWD), LRP2 CR89 Y1042W V1047D R1088D (WDWD), LRP2 CR89 Y1042W V1047D (WDWR), LRP2 CR89 Y1042W R1088D (WVWD)를 포함하였다. RAP d3 및 MegaRAP1 d3 둘 모두에 대한 결합은 고체상 어세이를 통해서 각 LRP2 CR89 돌연변이체에 대해 측정하였다. YVWD 돌연변이체만이 MegaRAP1 d3에 대해 유의한 결합성을 보유하였고, LRP2 CR89에 대한 친화력은 대략 2배 손실되었다(도 6 및 표 3). YDWR의 사량체 서열 스트링을 갖는 C 위치 돌연변이체는 A 또는 C를 포함하는 다른 모든 단일 돌연변이 또는 돌연변이 조합처럼 MegaRAP1 d3에 대한 결합을 측정할 수 없었다. 흥미롭게도, 명목상 보존성 Y1042W 돌연변이 단독은 충분하게 MegaRAP1 d3의 결합을 억제하였다. LRP2 CR89에서 A' 위치는 트립토판으로서, 야생형 RAP d3 결합을 위한 정규 잔기이었고, 본 연구에서는 돌연변이되지 않았다. A, C 및 C'에서 아미노산 치환은 MegaRAP1 d3의 결합에 대해 강한 음성적 영향을 주지만, LRP1 CR56 등과 같은 다른 CR 쌍에서 RAP d3이 선호되는 아미노산으로의 치환에도 불구하고, 이들 치환은 RAP d3에 대한 친화력을 크게 개선시키지 않았다. 본 발명자들은 A, C, A' 및 C'에서 WVWD 및 WDWD 조합에 대한 RAP d3의 결합이 약간 증가되었음을 확인하였다. 이러한 결과는 칼슘 결합 루프 내 일부 아미노산이 RAPD 및 RAPv2A 결합 양태를 정하는데 중요하지만, 이들이 단독으로 작용하기에는 불충분하다는 것을 시사한다.

스크리닝 방법의 일반성 테스트로서, 파지 라이브러리 패닝 실험을 추가의 CR 단백질에 대해 수행하였다. 단리한 변이체 서열을 표 4 및 도 8에 도시하였다. 먼저 인간 VLDLR의 마지막 3 DR 도메인을 구성하는 VLDLR CR6-8을 RAP d3 돌연변이체 단독을 코딩하는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 패닝하기 위한 기질로서 사용하였다. 5회 패닝 후, 8개의 무작위 선택된 클론 중 5개가 다음의 동일한 돌연변이 세트를 가졌다: R205S, E251R, K256L, K270E, R296L, G313D. 이러한 서열 변이체, VRAP1) d3을 고체상 결합 실험을 위해 발현시켰다. LRP1 CR3-5, LRP2 CR89 및 VLDLR CR6-8에 대한 VRAP1 d3, MegaRAP1 d3 및 RAP d3의 결합을 비교하였다. 유사한 변이체 서열, E251T, K256I, K270E, R296L을 VLDLR CR78에 대해 선택하였다. 본 발명자들은 또한 동일한 d3 라이브러리를 사용하여 인간 매트립타제, MAT CR12, MAT CR23 및 MAT CR34 유래의 3 CR 쌍에 대해 패닝하였다. 매트립타제 쌍에 대한 6번째 패닝을 통해 파지 라이브러리는 우세한 서열이 결정되었다. MAT CR23에 대해 선별된 우세 서열은 E251G, K256R, K270W였다. 이 변이체를 MatRAP1(RAP vMA)이라 하였다. MAT CR34에 대해 선별된 우세 서열은 S232P, E239G, E246G, E251L, K256P, I266T, A267V, H268R, K270P, H273Y, R287H, H290Y, K298R, S312F였다. 이 변이체를 MatRAP2(RAP vMB)라 하였다. 패닝 실험을 또한 FDC-8D6 항원 유래 CR 쌍에 대해 수행하였다. 선별된 우세한 변이체는 K256S, K270S, L271M, D279Y, V283M, K305T, K306M이었다. 이 변이체를 320RAP1이라 하였다

RAP d3 서열 변이체의 길이를 어느 정도까지 최소화할 수 있는지 테스트하기 위해서, 상기 기술한 바와 같이 PCR을 통해 MatRAP1의 순차적 절단형을 제조하고, 발현시키고, 정제하여 결합을 테스트하였다(도 9). 10개 아미노산 제거로 친화력이 약하게 감소하였지만 N 말단에서부터 31 및 42 아미노산을 제거한 결과 전체 길이 d3 변이체에 비하여 최대 3배까지 친화력이 상당하게 증가하였다. 추가 10 아미노산으로 시작하여 추가의 N 말단 절단형(총 52)은 결합이 완전하게 소실되었다. 최고의 N 말단 절단 변이체(MatRAP1 N-42)의 후속 C 말단 절단은 C 말단 링커 및 친화성 태그 제거에 의해 2배가 증가(전체 길이로부터 6배)한 것으로부터 출발하여 이후 C 말단으로부터 추가 6 아미노산 제거 이후에는 4배로 증가(전체 길이에 비해 12배)되어, 결합 친화력이 추가로, 상당하게 증가하였다. 추가 19 아미노산에서 시작하여, 추가의 C 말단 절단은 결합성을 완전하게 소실시켰다. 최고 절단 변이체는 아미노산 243-313(71 아미노산)으로 구성되었다. 친화력을 개선시키는데서 이러한 변형의 일반성을 테스트하기 위해, 본 발명자들은 320RAP1와 동일한 절단형을 제조하였다. 얻어진 이 변이체의 절단형은 전체 길이 변이체에 비하여 FDC-8D6 항원 쌍에 대해 3.5배 개선된 친화력으로 결합하였다(도 10).

VLDLR CR78에 VRAP1 d3의 결합에 대한 해리 상수는 44 ± 9 nM로 측정되었다. 본 발명자들은 다음으로, LRP1 CR3-5, LRP2 CR89, LRP2 CR2728, LRP2 CR3031, LRP2 CR34-36, LRP2 CR3536, VLDLR CR78, VLDLR CR6-8, LRP6 CR1-3, LRP6 CR12, LRP6 CR23, MAT CR12, MAT CR23 및 MAT CR34를 포함하는, 14 CR 쌍 또는 트리플렛에 대한, RAP d3, MegaRAP1 d3, VRAP1 d3, MatRAP1 d3 및 MatRAP2 d3의 결합을, 각각 80 nM의 농도에서 비교하였다(도 7). 이전에서 처럼, RAP d3은 LRP1 CR3-5에만 결합하였다. MegaRAP1 d3은 LRP2 CR89에만 결합하였다. VRAP1 d3은 CR 78 쌍을 포함하는 트리플렛인, VLDLR CR6-8 및 VLDLR CR78 둘 모두에 결합하였다. MatRAP1 및 MatRAP2는 MAT CR12 및 MAT CR23 둘 모두에 결합하였지만, 다른 CR 쌍에는 분명하게 결합하지 않았다.

CR 쌍 및 트리플렛에 대한 패닝 이외에도, 전체, CR 쌍 함유 인간 단백질을 RAP d3 변이체 파지 패닝 과정에 대한 표적으로서 사용하였다. 이러한 시판 단백질에는 코린의 엑토도메인, LRP6, FDC-8D6 항원 및 보체 인자 I이 포함된다. 패닝은 단리한 CR 쌍 및 트리플렛에 대해 기술한 바대로 정확하게 수행하였다.

실시예 2: 시험관 내 및 생체 내 어세이를 사용한 RAP 변이체 또는 CR 특이적 항체의 평가

RAP 변이체 또는 CR 특이적 항체는 다양한 인간 병태 또는 질환을 치료하기 위하여 치료제로서 또는 혈뇌 장벽 또는 다른 유형의 조직막을 가로질러 치료제 또는 진단제를 수송하는데 유용하다. RAP 변이체 활성 또는 분포도의 시험관 내 활성 또는 수송 어세이 및 생체 내 측정하는 것은 RAP 변이체의 효능을 평가하는 방법의 예들이다. 이러한 어세이의 예들을 하기에 기술하였다.

본 명세서에서 기술한 임의의 반복된 CR 도메인에 결합하는 CR 특이적 항체의 제조는 당분야에서 공지된 임의의 방법을 사용하여 수행할 수 있으며, 그에 따라 제조된 항체는 다른 CR 쌍과 비교하여 목적하는 CR 쌍에 비교적 높게 결합하는가에 대해 스크리닝할 수 있다. 이렇게 선별된 항체에 대해서는 이후에 패밀리 내 하나 이상의 다른 CR 함유 단백질과 비교하여 목적하는 CR 함유 단백질에 대해 결합하는지를 테스트하게 된다. 이러한 기준을 충족하는 항체를 단독으로 또는 다른 활성 제제와 접합시켜서, 이하에 기술하는 예시적인 어세이에서 목적 조직을 표적화하는 능력, 수용체 활성의 변경, 및/또는 질환의 예방 또는 치료 능력을 분석할 수 있다.

매트립타제 선택적 RAP 변이체를 사용한 생체 내 항종양 어세이: 매트립타세 선택적 RAP 변이체 또는 CR 특이적 항체의 종양 형성 및 진행에 대한 길항 효능을 분석하기 위해서, 2 이상의 생체 내 모델을 사용하였다. 제1 모델은 인간 종양 세포주를 접종하고 문헌에 충분히 설명되어 있는 누드 마우스를 사용하였다. 이 시스템은 종양 진행을 완화시키는 RAP 변이체 또는 CR 특이적 항체의 능력을 테스트하는데 유용하다. 제2 모델은 상피 조직에 발현을 제한하는, 케라틴 프로모터 조절 하에서 마우스 매트립타제를 과발현하는 형질전환 마우스 모델을 사용하였다. 이 모델은 이미 보고된 것이다(List et al., Genes and Development, 2005, 19:1934-1950).

재조합 MDCK 세포를 사용한 LRP2 및 VLDLR 선택적 RAP의 시험관 내 수성 어세이: 세포막을 횡단하는 RAP 변이체 또는 CR 특이적 항체의 수송능을 평가하기 위해서, 시험관내 수송 어세이를 사용하였다. 인간 LRP2(LB2)의 미니수용체 및 전체 길이 인간 VLDLR을 발현하는 안정하게 형질감염된 MDCK 세포를 시험관 내에서 배양하였다. 이 세포를 0.4 ㎛의 균일한 공극 크기를 갖는 트랜스웰 폴리아세테이트 멤브레인 삽입부(Costar, Cambridge, MA)에 도말하였다. 세포를 2 x 10⁵/mL의 농도로 접종하고 10% FBS가 보충된 DMEM에서 배양하였다. 배지를 3일마다 교체하였다. 세포를 37℃에 5% CO₂ 항온배양기에서 유지시켰다. 트랜스사이토시스 실험을 삼중으로 수행하였다. 수송 어세이전 20분에, 트랜스웰 삽입부를 37℃에서 수송 완충액(25 mM HEPES 및 0.1% 알부민이 포함된 HBSS(Hank's balanced salt solution)으로 평형화시켰다. 수송은 ¹²⁵I-RAP 변이체(1 Ci/mL) 및 ⁹⁹mTc-알부민(2 Ci/mL)을 상부 또는 하부 챔버에 부가하여 개시하였다. 이 플레이트를 전체 과정 동안 130 rpm에서 부드럽게 교반하면서 37℃에서 유지시켰다. 표지화 단백질을 부가한 후 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 및 60분에, 샘플 10 ㎕를 각 웰의 하부 챔버 및 상부 챔버에서 회수하였다. 60분에, 상부 및 하부 챔버의 전체 용액을 얼음 상의 개별 테스트 튜브로 옮겼다. ¹²⁵I 및 ⁹⁹mTc로부터의 총 방사능을 이중 채널 프로그램의 γ-계측기에서 동시에 측정하였다. 수송 후 손상되지 않은 RAP 및 알부민의 양은 산침전 및 샘플의 가용성 및 불용성 분획 중 방사능 계측 비교를 통해 측정하였다.

마우스에서 RAP 및 RAP 변이체의 조직 분포 측정: 생체 내에서 조직을 트랜스사이토시스하는 RAP 변이체 또는 CR 특이적 항체의 능력을 확인하기 위해서, 치료 동물 유래의 조직 샘플에서 RAP 변이체 또는 CR 특이적 항체의 조직 분포를 측정하였다.

체중이 25∼35 그램인 숫컷 CD1 마우스(Charles River Laboratories)를 펜토바비탈 30 mg/kg 및 케타민 30 mg/kg을 복강내 주사하여 마취시켰다. 각 마우스에게 좌측 경정맥을 통해서 ²⁵I-RAP 또는 RAP 변이체 또는 CR 특이적 항체 및 혈관부 마커로서 ¹³¹I-알부민(1% 알부민을 포함하는 락트화 링커액 중 각 표지화 단백질 1 uCi)을 볼러스 주사하였다. 지정된 시간 간격(주사 후 1∼60분)에, 우측 총경동맥을 절단하여 혈액을 채취하고 마우스를 희생시켰다. 뇌 및 말초 조직 샘플을 회수하고 체중 및 방사능을 분석하였다. 분포량은 당분야에 공지된 방법을 사용하여 계산하였다. 조직 샘플 내 방사능의 감소는 RAP 변이체가 표지화된 야생형 RAP와 결합에 대해 경쟁하고 야생형 RAP 대신 흡수된 것을 의미한다.

세포 증식 어세이에서 LRP6 선택적 RAP 변이체의 항증식 효과 측정: LRP6 과발현은 종양형성성 증가와 상호관계가 있다. RAP 단백질은 강력한 LRP6의 결합인자이고, RAP의 변이체는 RAP/LRP6 상호작용을 억제하는데 유용하거나, 또는 LRP6 발현 세포에 약물을 전달하는데 유용할 수 있다. LRP6 매개된 세포 증식을 조절하는 RAP 변이체의 능력을 시험하기 위해서, 세포 증식 어세이를 수행하였다.

LRP6 발현 구성체(Li, (2004) Oncogene 23, 9129-9135)로 형질감염된 HT1080 세포를 6웰 플레이트에 접종하였다(웰 당 5 x 10⁴ 세포). RAP 변이체 및 다른 테스트 화합물을 5∼50 nM로 성장 배지에 포함시켰다. 날마다 배지를 교체하고 세포를 회수하였다. Vi-Cell 세포 분석 시스템을 사용하여 세포를 계측하고 생존능에 대해 점수를 기록하였다. 다양한 시험 조건 하에서 배가 시간은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀법을 통해 얻었다. RAP 변이체 존재하에 세포 증식 감소는 RAP 변이체가 LRP6 유도된 세포 증식에 대해 유효한 억제제라는 것을 의미한다. 유사한 어세이를 CR 특이적 항체를 사용하여 수행할 수 있다.

연질 아가 콜로니 어세이로 LRP6 선택적 RAP 변이체의 항증식 효과 측정: LRP6 발현 구성체로 형질감염된 HT1080 세포를 아가층으로 코팅된 6웰 플레이트에서 배양하였다(0.5% 아가 및 5% FBS 포함 DMEM 배지). 0.33% 아가 및 5% FBS를 포함하는 DMEM 중 2 x 10³ 세포를 포함하는 제2층 내에 세포를 접종하였다. 상기 아가 및 세포 위에 배지를 덮어 건조를 방지하였다. RAP 변이체를 포함하여 테스트 화합물을 배지에 직접 부가하고 세포와 함께 항온반응시켰다. 배지를 3일마다 교환하였다. 각 세포주에 대해 3개 웰을 준비하였다. 항온배양 3주 후, 직경이 0.1 mm 보다 큰 콜로니를 기록하였다. RAP 변이체 존재하여 콜로니 형성 감소는 RAP 변이체가 LRP6 유도된 세포 증식에 대해 유효한 억제제라는 것을 의미한다.

종양형성성 누드 마우스 모델에서 LRP6-선택적, 매트립타제-선택적 및 FDC-8D6-선택적 RAP 변이체의 항종양 효과 측정: 생체 내에서 LRP6, 매트립타제 또는 FDC-8D6 항원 억제에 대한 RAP 변이체의 효과를 조사하기 위해서, 종양형성성 실험 동물 모델을 사용하였다. CR 특이적 항체를 사용하여 유사한 어세이를 수행할 수 있다.

암컷 무흉선 누드 마우스(4∼5주령)(Harlan Sprague-Dawley) (Indianapolis, IN)에 LRP6 발현 구성체로 형질감염된 HT1080 세포(50% 마트리겔 매트릭스(BD Biosciences)를 포함하는 무혈청 DEME 200 ㎕ 중 6 x 10⁶ 세포), CWR22R 전립선 암종 세포(매트립타제)(67) 또는 L3055 버킷 림프종 세포(FDC-8D6 항원)(36)를 옆구리(9)에 피하 주사하였다. 종양 세포가 주사된 마우스 또는 대조군 동물에게 2일마다 멸균 PBS 중에 선택적 RAP 변이체 또는 비히클 단독을 꼬리 정맥 주사로 투여하였다. 종양 크기를 7일 마다 측정하였고 종양 부피는 너비(a) 및 길이(b) 측정을 사용해 산출하였다(a2 x b/2, 이때 a < b).

배양된 골아세포에서 LRP5 의존적 Wnt 신호화에 대한 RAP 변이체의 효가 측정: LRP5를 통한 Wnt 신호화는 골아세포 분화를 증가시키고, 파골세포 활성을 억제하며, 골침착을 증가시키는 것으로 확인되었다(Westendorf, (2004) Gene 341, 19-39; Zhang, et al.,(2004) Mol Cell Biol 24, 4677-4684; Mizuguchi, et al., (2004) J Hum Genet 49, 80-86). RAP가 LRP5의 CR에 결합하기 때문에, 이 수용체를 통해서 Wnt 신호화를 조절하는데 RAP 변이체가 유용할 수 있다. Wnt 신호화를 조절하는 RAP 변이체의 능력을 배양된 골아세포를 사용하여 측정하였다. 유사한 어세이를 CR 특이적 항체를 사용하여 수행할 수 있다.

골아세포주 MG63은 과량의 LRP1을 발현하고 VLDLR은 발현하지 않는다. SAOS-2 세포는 과량의 VLDLR은 발현하지만 LRP1은 거의 발현하지 않는다(American Type Culture Collection (ATCC) Accesion #HTB-85). MG63 및 SAOS-2 세포를 10% CO₂에 37℃에서 10% FBS가 보충된 DMEM 중에 성장시켰다. 배지에 완충제, DKK-1, Mesd, RAP 또는 RAP 변이체와 함께, Wnt 신호 경로를 유도하기 위해 Wnt7a를 부가하였다. 빙냉 PBS로 세정한 후, 세포를 회수하고 100 mM Tris-HCl, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2 mM DTT, 2 mM PMSF, 및 1 x Complete™ 프로테아제 억제제(500 L/웰)를 사용하여 유리 다운스 균질기에서 균질화하였다. 균질물을 10분간 500 x g에서 원심분리하고, 상등액을 추가로 90분 동안 4℃에서 100,000 x g에서 원심분리하였다. β-카테닌 농도를 세포 Signaling Technology에서 구매한 β-카테닌 특이적 항체를 사용한 웨스턴 블랏을 통해서 투명 상등액에서 측정하였다. 면역 반응성 단백질은 ECL 시스템을 사용하여 검출하였다. 다르게는, 세포를 0.5 ㎍의 β-카테닌 발현 벡터, 0.5 ㎍의 Wnt1-발현 벡터, 또는 빈 pcDNA3 벡터와 함께, 0.5 ㎍의 TOP-FLSH TCF 루시퍼라제 구성체(Upstate Biotechnology)로 우선 형질감염시켰다. 형질감염 효율에 대한 내부 대조군으로서 β-갈락토시다제 발현 벡터(Promega, Madison, WI)를 포함시켰다. 48시간 후, 배지를 교환하고, 완충액, DKK-1, Mesd, RAP 또는 RAP 변이체를 부가하였다. 추가 6시간 동안 항온반응시킨 후, 세포를 용해하고 효소 어세이 키트(Promega)를 사용하여 루시퍼라제와 β-갈락토시다제 활성을 측정하였다. 루시퍼라제 활성은 Dual Luciferase Assay system(Promega)를 사용하여 발광측정기로 측정하였다. 루시퍼라제 활성을 β-갈락토시다제 활성에 대해 정규화하였다.

실시예 3: 환형 RAP 펩티드의 생성 및 특징규명

하기와 같이 환형 RAP 펩티드를 생성하고 결합 친화력에 대하여 특징을 규명하였다. RAP 펩티드는 Abgent(샌디에고 소재)에서 제작하였다. 펩티드는 HPLC로 정제하고 질량 분광법으로 특징규명하였다. NS0 발현되고 정제된 재조합 마우스 VLDLR 엑토도메인 및 재조합 인간 LRP1 리간드 클러스터 II는 R&D Systems(미네아폴리스 소제)에서 구매하였다. 태그 없는 RAP d3을 발현시키고 GeneScript(샌디에고 소재)로 정제하였다. 인간 RAP는 Dr. Guojun Bu(Washington University in St. Louis, School of Medicine)로부터 얻었다. 브래드포드 어세이를 사용하여 단백질을 정량하였다.

고체상 결합 어세이를 하기와 같이 수행하였다. 재조합 쥣과동물 VLDLR 엑토도메인(aa 1-798, C 말단 헥사히스티틴, 1 ㎍) 또는 rhLRP1 클러스터 II(aa 786-1165, C 말단 Fc, 1 ㎍)을 4℃에서 밤새 5 mM CaCl₂가 보충된 TBS pH 8(TBSC) 중에 Nunc Maxisorp™ 96웰에 결합시켰다. 이 웰들을 TBSC로 세정한 후 2% BSA를 포함하는 TBSC로 블로킹하였다. 이후 펩티드를 실온에서 0.05% Tween-20이 보충된 상기 블로킹 완충액 중에서 2시간 동안 일련의 농도 범위에서 고정된 수용체와 항온반응시켰다. 동일한 결합 반응을 50 mM EDTA 존재하에 수행하여 비특이적 결합의 측정 결과를 제공하였다. 대조군 웰에는 부가 펩티드를 포함시키지 않았다. 추가 대조군으로 항체와 수용체간의 교차 반응성 부재를 확인하였다. 웰을 TBSTC로 세정하고 결합된 펩티드를 스트렙타비딘-HRP(Pierce) 또는 폴리클론 항-RAP(1:1,000, Raptor Pharmaceutical)를 사용하여 검출하였다. 테스트 펩티드에 대한 항-RAP 폴리클론 항체의 결합은 웨스턴 블랏을 통해 정량적으로 확인하였다(결과 도시하지 않음). 필요하면, 2차 항체, HRP-접합된 염소 항 토끼 IgG(Bio-Rad)와 항온반응 전에 과량의 스트렙타비딘-HRP 또는 1차 항체를 제거하고 웰을 세정하였다. TMB 시약(BioRad)을 사용하여 발색시켰다. 450 nm에서 흡광도를 마이크로플레이트 분광분석계(Molecular Devices)를 사용하여 측정하였다. EDTA 존재하에 얻은 흡광도를 분석전에 칼슘 존재하에 얻은 흡광도에서 빼주었다. 결과는 단일 부위 결합으로 가정하여 비선형 회귀법을 통해 결과를 그래프화하고 K_d값을 유추하였다(GraphPad Prism).

성숙한, 인간 RAP의 아미노산 201-319을 포함하는 박테리아에서 발현되고, 정제한, 태그 없는 RAP d3 펩티드를 GeneScript에서 구매하였다. 이 펩티드는 C 말단 HNEL 테트라펩티드가 결여되어 있다. 고유 시스테인을 C 말단에 포함하여 친화력 태깅을 촉진시켰다. RAP d3 펩티드를 말레이미드-PEO₂-비오틴(Pierce)에 연결하고, 얻어진 접합체를 탈염하고 활성화된 티올 세파로스 비드(GE Biosciences)를 사용하여 미반응 펩티드를 트래핑하여 정제하였다. 모든 다른 펩티드는 고체상 펩티드 합성법으로 제조하였다. RAP d3 및 LDLR CR3과 4 간의 복합체에 대한 구조 데이타를 조사한 결과 CR 쌍과의 접촉면을 구성하는 잔기의 제거없이 RAP d3의 유의한 절단이 수행되었음을 확인하였다. 접촉부에 측접한 서열 일부가 폴딩 안정화에 관여하기 때문에, 본 발명자들은 비천연 디설피드를 이의 부재하에 폴링딩 구조를 안정화시키기 위한 수단으로서 도입할 수 있을 것으로 판단하였다. RAP d3의 최소형, mRAPc(서열 번호 99)을 생성하기 위해서, RAP d3 LDLR CR 3 및 4 복합체의 구조에서 나선 1에서 H249에 대해 N 말단에 그리고 나선 2상의 T303에 대해 C 말단에 위치한 잔기의 밀접하게 대항되는 쌍을 동정하고 글리신으로 치환하였다. 이러한 치환은 A242G 및 R314G이다. 이들 부위에 글리신 도입은 인접한 비천연의 나선내 이황화 결합을 위해 나선을 절단하기 위한 의도였다. 2 시스테인을 각각 나선 1 및 2의 G242과 G314의 전후에서 치환시켜 이황화 결합이 형성되도록 하였다. 이 치환은 E241C 및 I315C이다. 나선 2의 C315에 대해 C 말단에서는 어떠한 잔기도 포함시키지 않았다. 이 서열 비오틴-GGSGG(서열 번호 102)를 나선 1의 E241C에 대해 N 말단에서 부가하여 스트렙타비딘-수용체 접합체를 효율적으로 검출할 수 있게 하였다. 이 펩티드는 고체 상 합성 동안 분자내 이황화 결합이 형성되어 고리화되었다. mRAP라 하는 mRAPc 펩티드의 선형 대조군은 두 시스테인을 세린으로 치환하였다. mRAPc에 대한 추가 대조군으로서, 돌연변이 K256A 및 K270E를 갖는 것 외에는 동일한 펩티드, mRAPcko를 제조하였다. 이들 돌연변이는 LRP1에 대한 RAP d3의 친화력을 상당히 낮추는 것으로 알려져 있는 것이다.

LDLR 패밀리의 다른 수용체, VLDLR 및 LRP1에 대한 펩티드의 결합 친화력은 다음과 같이 측정하였다. NS0 발현되고 정제된 hrLRP1 또는 mVLDLR(R&D Systems)을 사용하여 96웰 플레이트를 코팅하였다. 테스트 펩티드의 다양한 희석물을 3중으로 50 mM EDTA 존재 및 부재하에 고정된 수용체와 항온반응시켰다. 결합된 펩티드는 대량 세정 후 스트렙타비딘-HRP를 사용하여 검출하였다. 칼슘 의존적 결합 수준을 결정하기 위해서 EDTA 존재하에 측정한 결합값을 EDTA 부재하에 측정한 값에서 빼주었다. 보정된 값을 그래프화하고 GraphPad Prism을 사용하여 단일 결합 부위 가정하여 비선형 회귀법을 통해 적합화하였다. 결과를 도 11A 및 11B에 도시하였다.

mRAP(서열 번호 107) 및 mRAPcko가 hrLRP1 클러스터 II에 대해 측정가능한 친화력을 갖지 않았지만, mRAPc는 10 ± 2 nM의 K_d로 칼슘 의존적 방식의 높은 친화력으로 결합하였다. 이러한 결합 친화력은 이 시스템에서 전체 길이 RAP d3의 친화력(8 ± 1 nM)과 구별할 수 없었다. 또한, 마우스 VLDLR의 전체 엑토도메인에 대한 펩티드의 결합력을 측정하였다. 결합 친화력은 역시 유사하였는데, mRAPc에 대해서 해리 상수가 5 ± 1 nM이었고, 전체 길이 RAP d3에 대해서는 1 ± 0.2였다.

실시예 4: 추가적인 환형 RAP 펩티드의 특징규명

추가적인 환형 RAP 펩티드를 상기 기술한 바와 같이 만들었고 LRP1 수용체에 대한 이들의 결합능을 시험하였다.

mRAP-8c 펩티드를 생성하기 위해서, 아미노산 246∼312로부터 절단된 RAP 펩티드 서열을 사용하였고, 아미노산 치환을 다음과 같이 수행하였다: E246C, L247G 및 L311G 및 S312C. mRAP-8c 펩티드는 서열 번호 100에 기재하였다. 추가로 절단된 펩티드, mRAP-14c를 생성하기 위해서, 250 위치에서 출발하고 309 위치에서 종결되는 절단된 RAP를 사용하였다. mRAP-14c에 대해서 다음과 같은 아미노산 치환을 수행하였다: F250C 및 L308G 및 Q309C. 복합체의 구조에서 나선 1로부터의 F250C 측쇄가 이미 나선 2에 직접적으로 향하고 있기 때문에 mRAP-14c의 경우는 시스테인 이후에 글리신을 치환하지 않았다. mRAP-14c의 서열은 서열 번호 101에 개시하였다. 또다른 절단된, 고리화 펩티드인 헵티드를 제작하였다. 헵티드 서열은 RAP의 아미노산 246∼313에서 유도시켰다. 헵티드를 생성하기 위해 다음의 아미노산 치환을 수행하였다: E246C, L247G, G280A, L311A 및 S312C. 헵티드의 서열은 서열 번호 103에 개시하였다.

LRP1 및 VLDLR 수용체에 대한 mRAP-8c 및 mRAP-14c 펩티드의 결합을 상기와 같이 수행하였다. mRAP-8c는 대략 4∼6 nM 친화력(2개의 개별 어세이에서)으로 LRP1(클러스터 II)에 결합하는 반면 mRAP-14c는 대략 21 nM의 친화력으로 결합하였다. 헵티드 환형 펩티드는 대략 3.5 nM의 친화력으로 LRP1에 결합하였다.

이러한 결과로 몇몇 상이한 환형 RAP 펩티드가 높은 친화력으로 LRP1 수용체에 결합한다는 것이 증명되었다.

실시예 5: 시험관 내에서 세포에 환형 RAP의 결합

세포 표면 상의 수용체에 결합하는 환형 RAP 펩티드의 능력을 측정하기 위해서, 배양된 세포주 존재하에서 결합력을 평가하였다. 환형 RAP 펩티드가 배양중인 세포 상에서 발현되는 전체 길이 LRP1에 결합하여 세포내이입되는지 확인하기 위해서, 세포내이입 의존적 독성 어세이를 사용하였다. 2종의 세포주를 사용하였는데, 하나의 높은 친화력 RAP 수용체, LRP1만을 발현하는 중국 햄스터 난소 CHO-K1 세포, 및 대조군으로서 LRP1 발현이 결여된 돌연변이체 CHO-K1을 사용하였다. 세포를 2.5% 태아 소혈청이 보충된 BioWhittaker UltraCHO 배지(Lonza, Basel, Switzerland)에서 배양하였다. 세포를 12웰 조직 배양 플레이트에 접종하였다. 비오틴화 mRAPc를 등몰량의 스트렙타비딘과 박테리아 독소 사포린간의 접합체(ZAP, Avanced Targeting Systems, San Diego, CA)와 배합하였다. 이 혼합물을 10% FBS가 보충된 페놀레드가 없는 MEM(Mediatech, Manassas, VA)으로 100 nM까지 희석하였다. 접합된 mRAPc(100 nM) 및 대조군 제제(mRAPc 단독, 100 nM, 스트렙타비딘-사포린 단독, 100 nM, 단독 1 mM)를 포화량(confluent) 세포와 함께 배양하고 세포 사멸을 48시간 후에 MTT 어세이(Invitrogen, San Diego, CA)를 통해 확인하였다.

결과는 도 12에 도시하였다. mRAPc 펩티드 단독은 사용된 세포 유형과 무관하게, 세포 생존에 어떠한 영향도 없었다. 스트렙타비딘-사포린 접합체 단독은 야생형 CHO-K1 세포에 대해서는 대략 10%만큼 생존 세포수를 감소시켰지만 LRP 결핍 세포에 대해서는 어떠한 영향도 없었다. mRAPc 및 세포독성 접합체의 조합물은 야생형 CHO-K1에 대해서 거의 40% 만큼 생존 세포수를 감소시켰지만 LRP 결핍 세포에 대해서는 5% 손실만 있었다.

이러한 데이타는 mRAPc 펩티드가 LRP1 세포내이입 경로를 통해서 독소를 흡수하여 수용체 의존적 방식으로 세포독성 접합체의 독성을 상당히 증가시킬 수 있다는 것을 시사한다.

결합 억제 어세이를 또한 수행하여 LRP 리간드 α-2-마크로글로불린 및 uPA/PAI-1의 결합뿐만 아니라, LRP1(클러스터 II)에 대한 RAP d3의 결합을 방해하는 mRAPc 펩티드의 능력을 확인하였다. 스트렙타비딘 또는 항비오틴 항체와의 복합체 형성을 위해서, mRAPc 펩티드를 펜타펩티드 링커(GGSGG)에 의해 RAP 서열로부터 떨어진 N 말단 비오틴 잔기와 일치시켰다. 4℃에서 밤새 5 mM CaCl₂가 보충된 TBS pH 8(TBSC) 중에 Nunc MAXISORP™ 96웰 플레이트를 코팅하기 위해 재조합 인간 LRP1 클러스터 II(아미노산 786-1165, C 말단 Fc 태그가짐, 1 ㎍, R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 고체상 결합 어세이를 수행하였다. 데이타는 ELISA 어세이를 통해 얻었다. 웰을 TBSC로 세정하고 2% BSA를 포함하는 TBSC로 블로킹하였다. 스트렙타비딘 및 비오틴화 펩티드간의 복합체를 포함하는 어세이에서, LRP1 리간드(RAP d3(2nM), 트립신 활성화된 α-2-마크로글로불린(1 nM) 또는 uPA/PAI-1 (10 nM)를 실온에서 0.05% Tween-20이 보충된 상기 블로킹 완충액 중에서 2시간 동안, 억제제 존재 또는 부재하에 고정화된 수용체와 함께 항온반응시켰다. 항비오틴 항체와 비오틴화 펩티드의 복합체를 포함하는 어세이에서, 모든 억제제 용액을, 세정전에 고정화된 LRP1-C2와 사전항온반응시키고 이후에 리간드와 항온반응시켰다. CR 쌍의 리간드 결합 능력에는 칼슘이 필요하기 때문에, 동일한 결합 반응을 50 mM EDTA 존재하에서 수행하여 비특이적 결합을 측정하였다. 대조군 웰에는 어떠한 부가 억제제를 포함하지 않는다. 웰을 5 mM CaCl₂ 및 0.05% Tween-20이 보충된 TBS로 세정하였다. 결합된 리란드를 항-S-펩티드-HRP 접합체(Abcam, Cambridge, MA), 항-α-2-마크로글로불린-HRP 또는 항-PAI-1-HRP를 사용하여 검출하였다. 과량의 HRP 접합체를 제거하고 웰을 세정하였다. TMB 시약(BioRad, Hercules, CA)을 사용하여 발색시켰다. 450 nm에서 흡광도를 마이크로플레이트 분광분석계(Molecular Devices, Palo Alto, CA)를 사용하여 측정하였다.

스트렙타비딘 또는 항비오틴 항체의 존재 및 부재하에서, LRP1-C2에 대한 재조합 RAP d3의 결합을 억제하는 mRAPc의 능력을 측정하였다. 단량체 펩티드에 대한 억제도(EC₅₀)는 32 ± 12 nM이었다(도 14A). 1/2몰 등량 스트렙타비딘과 조합된 mRAPc에 대한 EC₅₀는 그외 동일한 조건 하에서는 4 ± 2 nM로서, 펩티드 단독에 비해 거의 8배 개선되었다(도 14). 성숙한 RAP는 EC₅₀이 0.5 ± 2 nM로서, 단량체 mRAPc 펩티드보다 64배 양호하였고, 스트렙타비딘상에 어셈블리된 펩티드보다 약 8배 양호하였다. 스트렙타비딘 단독은 억제 효과를 나타내지 않았다. 스트렙타비딘 존재하에서 나타난 다수배의 억제 증가는 최소화된 RAP 도메인의 다량체화시 화합력 개선과 일치하는 것이다.

비오틴에 대한 항비오틴 항체의 비교적 약한 1가 친화력(낮은 나노몰 Kd)으로 인해, 2개의, 적절하게 근접한, 수용체 결합된 펩티드 및 단일 항체로 구성된 다가 복합체의 사전어셈블리가 펩티드-항체 복합체를 안정화시킨다고 가정하였다. 따라서, 몰 비율 1 대 3으로 항체와 펩티드를 고정된 수용체와 항온반응시키고 세정한 후, RAP d3 리간드를 첨가하였다. 동일한 과정을 대조군: 펩티드 단독, 항체 단독 및 RAP에 대해서 수행하였다. 이 방법을 사용하여, mRPAc 펩티드 단독에서 17 ± 1 nM의 EC₅₀을 얻었다(도 14B). mRAPc와 항비오틴 항체의 조합으로 2 ± 1 nM의 EC₅₀을 얻었다. 전체 길이 RAP는 EC₅₀가 0.3 ± 7 nM이었다. 항체 단독으로는 어떠한 효과도 없었다. 4가 스트렙타비딘을 사용한 경우에서 처럼, 2가 항체의 첨가는 LRP1-C2에 대한 RAP d3의 결합을 억제하는 펩티드의 능력을 상당히 개선시켰다. 다음으로, 다량체화한 mRAPc의 효과를 측정하였다. 단일한 리간드 농도에서, LRP1-C2, 트립신 활성화된 α-2-마크로글로불린 및 uPA/PAI-1 복합체에 대한 다른 2 리간드의 결합 억제에서 mRAPc 단량체 및 전체 길이 RAP와 다량체화된 mRAPc를 비교하였다. 스트렙타비딘 및 mRAPc의 복합체는 7 ± 1 nM인 단량체 펩티드 단복보다 7배 양호한 1 ± 1 nM의 EC₅₀으로 이종 리간드의 결합을 억제하였다(도 14C). 양쪽 경우에서, 스트렙타비딘과 mRAPc의 복합체는 RAP 및 mRAPc 단량체간 결합을 대략 중간정도의 EC₅₀으로 억제하였다.

이러한 결과는 다가 수용체와의 결합에서 다가 RAP의 회합력의 장점을 검증한 것이다. 이 결과는 스트렙타비딘 또는 면역글로불린 상에 다량체화된 합성 펩티드 서열이 3 LRP1 리간드에 대해서 전체 길이 RAP의 억제 효능을 부분적으로 재현할 수 있음을 보여준다.

실시예 6: 생체 내에서 환형 RAP 펩티드의 투여

이전 결과들은 절단된, 환형 RAP 펩티드가 시험관 내에서 세포 표면 상의 LRP1 수용체에 유효하게 결합한다는 것을 증명하였다. 생체 내에서 환형 RAP 펩티드의 효능을 측정하기 위해서, 생체분포 어세이를 수행하였다.

이 실험은 캐나다, 몬트리올에 소재하는 Charles River Laboratories에서 수행하였다. 비오틴화 mRAPc 펩티드, 비오틴화 RAP 단백질 또는 완충액을 ³⁵S-SLR-스트렙타비딘(0.7 mCi/mL, 300 Ci/mmol, GE Healthcare)과 배합하고 D-TUBE ™ 투석 카세트(14 kD MWCO, EMD Biosciences/Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하여 인산 완충 염수(PBS)에 대해 투석하였다. 숫컷 스프라그-다우리 래트(6∼8주령)에 꼬리 정맥을 통해 테스트 물질(2 ㎕/g; ∼20 uCi/래트)을 주사하였다. 동물에 펜토바비탈(200 mg/kg)을 주사한 후 30분경에 희생시켰다. 모든 피험체는 실험실 동물의 인도적 취급을 위한 Canadian Council on Animal Care에서 정한 지침서에 따라 취급하였다. Fuji BAS-2500 phosphorimager를 사용한 QWBA(semi-quantitative whole-body autoradioluminography)를 통해서 분석하기 위해 사체를 동결시키고, 카르복시메틸셀룰로스에 삽입하여 절개하였다. 각 동물에 대해 분석하려는 장기에서 곽이 분명한 영역을 선택하여 발광 분석하였다(Fuji Image Reader v1.1 및 Fuji Image Gauge v3.12). 단위 영역 당 광자극된 발광 단위로 값을 기록하였다(PSL/mm2).

LRP1-C2에 대한 결합 억제에서 다량체 mRAPc의 효능을 확인하기 위해, 정맥 내 주입후 전체 길이 RAP의 생체 내 생체 분포 양태를 모방하는 다량체 펩티드 및 이의 효능 및 능력을 측정하였다. 이러한 양태는 간에서 1차 축적을 특징으로 하는데(Warshawsky et al., J Clin Invest 92:937-944, 1993), 여기서 간세포 상의 LRP1에 접근하는 혈액이 높다(Beisiegelet al., Nature 341:162-164, 1989; Moestrupet al., 세포 Tissue Res 269:375-382, 1992). ³⁵S-표지된 스트렙타비딘의 제조물을 20 대 1의 몰 비율로, 비오틴화 mRAPc 펩티드와 배합하거나, 또는 5 대 1의 비율로 생체 내에서 비오틴화 RAP와 배합하고, 래트에 정맥 내 주사하였다. 표지된 스트렙타비딘 단독을 대조군으로 사용하였다. 정맥 내 주사 이후, 스트렙타비딘은 신장에 축적되는 것으로 보고되었지만, 간에서는 유의하게 축적되지 않는 것으로 보고되었다(Wilbur et al., Bioconjug Chem 9:100-107, 1998; Rosebrough et al., J Nucl Med 37:1380-1384, 1996).

비오틴화 RAP의 제조물은 스트렙타비딘 단독에 비하여 2.7배 많은 수준으로 간에 분포하였으며, 다른 테스트 조직에서는 유사하거나 또는 낮은 수준으로 분포하였다(도 15). 표지화된 스트렙타비딘 상에 사전어셈블리된 mRAPc 펩티드는 스트렙타비딘 단독에 비하여 7배 높은 수준으로 간에 분포하였고, 다른 테스트한 모든 조직에서는 대조군에 비하여 유사하거나 또는 낮은 수준으로 분포하였다(도 15). 혈액 내에 높은 수준의 경쟁 LRP1 리간드가 정맥 내 투여된 전체 길이 RAP에 대해서, 본 발명에서뿐만 아니라 이전 관찰에서도, 펩티드 복합체의 간 흡수를 차단할 수 없었다는 것은 주목할 만 하다(문헌 [Isbell et al., Biochem Biophys Res Comm 364:614-619, 2007] 참조).

생체 분포도 데이타 결과는 보다 소형의 펩티드계의 RAP 형태가 간을 표적화하는 약리학적 제제 개발에 유용하다는 것을 시사한다.

실시예 7: 환형 RAP 펩티드의 접합체

RAP 펩티드 및 환형 RAP 펩티드를 RAP 수용체를 발현하는 세포에 제제를 전달하기 위해서 다양한 세포독성 제제 또는 다른 제제에 접합시킬 수 있다. 펩티드 접합체는 당분야에 공지된 방법으로 제조한다.

예시적인 환형 RAP 펩티드 접합체는 도 13에 도시하였으며, 여기서는 디플루오로메틸오르니틴에 접합된 헵티드(헵티드-옥타-디플루오로메틸오르니틴) 및 티로신 키나제 억제제 SU6668에 접합된 헵티드(헵티드-모도-SU6668)를 예시적으로 나타내었다. 도 13A의 헵티드 펩티드(서열 번호 104)는 펜타펩티드 링커 GGSGG(서열 번호 102)를 포함한다. 헵티드-모노-SU6668은 헵티드 사의 N 말단 글리신에 SU6668 부분을 접합시켜 생성하였다(도 13C, 서열 번호 105). 헵티드-옥타-디플루오로메틸오르니틴(DMFO)은 펩타펩티드의 N 말단 글리신에 라이신을 부가하여 생성시켰다. 이 N 말단 라이신은 각각 2개의 DMFO 부분에 접합된, 2개의 라이신(K₂, K₃)에 추가로 연결된 라이신(K₁)을 부가하여 변형시켰다. 제1 라이신(K₁)은 또한 2개의 DMFO 부분을 포함하는 오르니틴 잔기에 연결되고, 2개의 DMFO 잔기에 접합된 마지막 라이신 잔기(K₄)에 추가로 연결된다(도 13B 및 서열 번호 106).

추가 접합체는 본 명세서에 기술되거나 당분야에 공지된 임의의 제제를 사용하여 당분야의 숙련가라면 제조할 수 있다.

실시예 8: 시험관 내 접합된 환형 RAP 펩티드의 투여

간세포주를 사용하여 화학제제에 접합된 환형 RAP 펩티드를 비롯하여 환형 RAP 펩티드의 세포 표면 결합을 측정하였다.

간세포 암종(HCC) 세포주, 예컨대 Heb3B, HepG2 및 Huh-7, 또는 정상적인 인간 간세포주, 예컨대 THLE-5b 또는 1차 간세포(예를 들어, 문헌 [Shimizu et al., Metabolism. 56:1478-85, 2007; Agrawal et al., Stem 세포. 2008 Feb 21] 참조)를 당분야에 공지된 방법에 따라 배양하였다. 배양된 세포를 세포독성 제제 예컨대 디플루오로메틸오르니틴(환형 RAP 펩티드-옥타-디플루오로메틸오르니틴) 또는 SU6668(환형 RAP 펩티드-모노-SU6668)과 접합시킨 환형 RAP 펩티드, 환형 RAP 펩티드 단독, 또는 디플루오로메틸오르니틴 또는 SU6668 단독으로 처리하였다. 세포는 하기 농도 내에의 시약으로 처리하였다: 0.05∼50 uM 환형 RAP 펩티드-옥타-디플루오로메틸오르니틴, 0.2∼200 uM 환형 RAP 펩티드-모노-SU6668, 0.05∼200 uM 환형 RAP 펩티드 단독, 0.05∼50 uM 디플루오로메틸오르니틴 또는 0.2∼200 uM SU6668. 접합된 환형 RAP 펩티드를 간세포주 배양물에 대한 세포증식 억제 및 세포 독성 효과에 대해 시험하였다.

환형 RAP 펩티드 또는 접합된 환형 RAP 펩티드를 처리한 후, 세포독성 및 세포증식 억제 효과를 당분야에 공지된 방법에 따라서 측정하였고(예를 들어, 문헌 [Elmore et al., In Vitr Mol Toxicol. 14:191-207, 2001; Miret et al., J Biomol Screen. 11:184-93, 2006] 참조), 테스트 제제 존재하에서 세포 성장 또는 세포 사멸 정도를 측정하였다.

배양중인 세포의 성장을 감소시키는 접합된 환형 RAP 펩티드의 능력은 환형 펩티드가 세포 표면 상의 수용체에 결합하며 세포에 제제를 전달하여 생물학적으로 측정가능한 효과를 생성하는 유효한 수단임을 의미한다.

실시예 9: 생체 내 환형 RAP 펩티드의 투여

생체 내에서 세포로 세포독성 화합물을 전달하는 환형 RAP 펩티드의 능력을 비롯하여, 생체 내에서 환형 RAP 펩티드의 수용체 결합을 확인하기 위해서, 인간 간세포 암종의 동소(orthotopic) 모델을 사용하였다.

동물에서 동소 종양을 생성하기 위해서, 간암종 세포를 누드 마우스, 래트 또는 다른 적절한 동물에 이식하여 종양 세포를 생체 내에서 성장시켰다. 동소 모델로 유용한 HCC 세포주는 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 기술한 세포주, 예컨대 Heb3B, HepG2 및 Huh-7을 포함한다. HCC의 동소 종양 모델은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Okubo et al. (J Gastroenterol Hepatol. 2007 22:423-8); Armengol et al., (Clin Cancer Res. 2004 10:2150-7); and Yao et al., (Clin Cancer Res. 2003 9:2719-26)]을 참조한다.

먼저 생체 내에서 접합된 환형 RAP 펩티드 및 대조군의 투여를 위한 용량 범위를 정하기 위해서, 접합된 환형 RAP 펩티드(예를 들어, 환형 RAP 펩티드-옥타-디플루오로메틸오르니틴(200 mg/kg/day 이하), 환형 RAP 펩티드-모노-SU6668(200 mg/kg/day 이하), 환형 RAP 펩티드 단독(200 mg/kg/day 이하), 디플루오로메틸오르니틴 또는 SU6668 단독을 투여한, 군당 5마리의 마우스를 사용하여 소 용량 범위 실험을 수행하였다. 테스트 제제를 2주(QDx14) 동안 날마다 정맥내 또는 복강내로 투여하고 피험체 동물의 체중 변화, 임의의 임상 관찰 및 임상 병변 및 실험 종료 시점에 조직 병변을 조사하였다.

효능 검사를 수행하기 위해서, 군 당 8 내지 10마리의 마우스를 사용하고, 상기 화합물(환형 RAP 펩티드-옥타-디플루오로메틸오르니틴, 환형 RAP 펩티드-모노-SU6668, 환형 RAP 펩티드 단독, 디플루오로메틸오르니틴 또는 SU6668)의 3가지 테스트 용량 범위를 인간 HCC 세포를 투여받은 동물 및 대조군 동물에 투여하였다. 테스트 제제를 정맥내 또는 복강내 투여하고 적절한 빈도로, 예를 들어 4주 동안 매일(QDx28), 3주간 매일(QDx21) 또는 2주간 매일(QDx14) 투여하였다. 피험체 동물에 대해 이후 체중 변화, 임상 관찰, 및 생체 내 효능 측정, 예컨대 종양 부피, 간 조직병변, 및 일반적인 임상 병변을 당분야에서 공지된 방법을 사용하여 평가하였다.

생체 내에서 간세포 암종 세포의 성장을 감소시키는 접합된 RAP의 능력으로 환형 펩티드가 종양 세포의 표면 상에서 세포 수용체에 결합하고 제제를 세포로 전달하여 생물학적으로 측정가능한 효과를 생성시키는 유효한 수단이라는 것이 증명되었다. 동물 모델에서 효과적인 종양 사멸에 대한 검증 결과는 접합된 환형 RAP 펩티드가 RAP 수용체와 연관된 간암종 또는 다른 병변을 앓고있는 인간에서 종양 세포에 세포독성 제제를 전달하기 위한 효과적인 방법이라는 것을 시사한다.

본 발명에서 개시하고 청구한 모든 조성물 및/또는 방법은 본 명세서의 개시 내용의 견지에서 과도한 실험없이 제조 및 실시될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법을 바람직한 구체예를 들어 기술하였지만, 본 발명의 개념, 정신 및 범주를 벗어나지 않고 본 명세서에 기술된 조성물 및/또는 방법 및 이 방법의 단계 또는 단계의 순서등에 변화를 줄 수 있음은 당분야의 당업자에게 자명하다. 보다 구체적으로, 동일하거나 유사한 결과를 얻으면서 화학적으로 그리고 생리학적으로 관련있는 일정 제제를 본 명세서에 기술된 제제 대신 사용할 수 있음은 자명하다. 당분야의 숙련가에게 자명한 이러한 모든 유사한 치환물 및 변형은 첨부된 청구항에서 한정하는 본 발명의 정신, 범주 및 개념 내에 속하는 것이다.

본 명세서 전반에 걸쳐 인용한 참조 문헌은 본 명세서에서 개시한 예시적인 절차 또는 다른 구체적인 보충 설명을 제공하는 정도로, 참조하여 모두 구체적으로 포함시킨다.

참고 문헌

SEQUENCE LISTING <110> Zankel, et al. <120> Cyclic Receptor-Associated Protein (RAP) Peptides <130> 31075/42620A <160> 107 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1493 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tgagcggggg atgatggcgc cgcggagggt caggtcgttt ctgcgcgggc tcccggcgct 60 gctactgctg ctgctcttcc tcgggccctg gcccgctgcg agccacggcg gcaagtactc 120 gcgggagaag aaccagccca agccgtcccc gaaacgcgag tccggagagg agttccgcat 180 ggagaagttg aaccagctgt gggagaaggc ccagcgactg catcttcctc ccgtgaggct 240 ggccgagctc cacgctgatc tgaagataca ggagagggac gaactcgcct ggaagaaact 300 aaagcttgac ggcttggacg aagatgggga gaaggaagcg agactcatac gcaacctcaa 360 tgtcatcttg gccaagtatg gtctggacgg aaagaaggac gctcggcagg tgaccagcaa 420 ctccctcagt ggcacccagg aagacgggct ggatgacccc aggctggaaa agctgtggca 480 caaggcgaag acctctggga aattctccgg cgaagaactg gacaagctct ggcgggagtt 540 cctgcatcac aaagagaaag ttcacgagta caacgtcctg ctggagaccc tgagcaggac 600 cgaagaaatc cacgagaacg tcattagccc ctcggacctg agcgacatca agggcagcgt 660 cctgcacagc aggcacacgg agctgaagga gaagctgcgc agcatcaacc agggcctgga 720 ccgcctgcgc agggtcagcc accagggcta cagcactgag gctgagttcg aggagcccag 780 ggtgattgac ctgtgggacc tggcgcagtc cgccaacctc acggacaagg agctggaggc 840 gttccgggag gagctcaagc acttcgaagc caaaatcgag aagcacaacc actaccagaa 900 gcagctggag attgcgcacg agaagctgag gcacgcagag agcgtgggcg acggcgagcg 960 tgtgagccgc agccgcgaga agcacgccct gctggagggg cggaccaagg agctgggcta 1020 cacggtgaag aagcatctgc aggacctgtc cggcaggatc tccagagctc ggcacaacga 1080 actctgaagg cactggggag cccagcccgg cagggaagag gccagcgtga aggacctggg 1140 ctcttggccg tggcatttcc gtggacagcc cgccgtcagg gtggctgggg ctggcacggg 1200 tgtcgaggca ggaaggattg tttctggtga ctgcagccgc tgccgtcgcg acacagggct 1260 tggtggtggt agcatttggg tctgagatcg gcccagctct gactgaaggg gcttggcttc 1320 cactcagcat cagcgtggca gtcaccaccc cagtgaggac ctcgatgtcc agctgctgtc 1380 aggtctgata gtcctctgct aaaacaacac gatttacata aaaaatctta cacatctgcc 1440 accggaaata ccatgcacag agtccttaaa aaatagagtg cagtatttaa acc 1493 <210> 2 <211> 357 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Pro Arg Arg Val Arg Ser Phe Leu Arg Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Gly Pro Trp Pro Ala Ala Ser His Gly 20 25 30 Gly Lys Tyr Ser Arg Glu Lys Asn Gln Pro Lys Pro Ser Pro Lys Arg 35 40 45 Glu Ser Gly Glu Glu Phe Arg Met Glu Lys Leu Asn Gln Leu Trp Glu 50 55 60 Lys Ala Gln Arg Leu His Leu Pro Pro Val Arg Leu Ala Glu Leu His 65 70 75 80 Ala Asp Leu Lys Ile Gln Glu Arg Asp Glu Leu Ala Trp Lys Lys Leu 85 90 95 Lys Leu Asp Gly Leu Asp Glu Asp Gly Glu Lys Glu Ala Arg Leu Ile 100 105 110 Arg Asn Leu Asn Val Ile Leu Ala Lys Tyr Gly Leu Asp Gly Lys Lys 115 120 125 Asp Ala Arg Gln Val Thr Ser Asn Ser Leu Ser Gly Thr Gln Glu Asp 130 135 140 Gly Leu Asp Asp Pro Arg Leu Glu Lys Leu Trp His Lys Ala Lys Thr 145 150 155 160 Ser Gly Lys Phe Ser Gly Glu Glu Leu Asp Lys Leu Trp Arg Glu Phe 165 170 175 Leu His His Lys Glu Lys Val His Glu Tyr Asn Val Leu Leu Glu Thr 180 185 190 Leu Ser Arg Thr Glu Glu Ile His Glu Asn Val Ile Ser Pro Ser Asp 195 200 205 Leu Ser Asp Ile Lys Gly Ser Val Leu His Ser Arg His Thr Glu Leu 210 215 220 Lys Glu Lys Leu Arg Ser Ile Asn Gln Gly Leu Asp Arg Leu Arg Arg 225 230 235 240 Val Ser His Gln Gly Tyr Ser Thr Glu Ala Glu Phe Glu Glu Pro Arg 245 250 255 Val Ile Asp Leu Trp Asp Leu Ala Gln Ser Ala Asn Leu Thr Asp Lys 260 265 270 Glu Leu Glu Ala Phe Arg Glu Glu Leu Lys His Phe Glu Ala Lys Ile 275 280 285 Glu Lys His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys 290 295 300 Leu Arg His Ala Glu Ser Val Gly Asp Gly Glu Arg Val Ser Arg Ser 305 310 315 320 Arg Glu Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr 325 330 335 Thr Val Lys Lys His Leu Gln Asp Leu Ser Gly Arg Ile Ser Arg Ala 340 345 350 Arg His Asn Glu Leu 355 <210> 3 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - LRP6CR1F <400> 3 gcgataggat ccccaacatg ttctcctcag cagtttactt gtttcacggg ggaaattgac 60 tgtatc 66 <210> 4 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - LRP6CR2R <400> 4 gcgataaagc ttttatcaaa gcacttcaca gttcttctca tctgatttgt cctggcagtt 60 tgcatctcca 70 <210> 5 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - LRP6CR2F <400> 5 gcgataggat cccctgtatg ctcagagtcc cagttccagt gtgccagtgg gcagtgtatt 60 gatgg 65 <210> 6 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - LPR6CR3R <400> 6 gcgataaagc tttcactaag tcggataaca atccagttca tctgacttgt cactgcaatc 60 cac 63 <210> 7 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synethic primer - VLDLRCR6F <400> 7 gcgataggat cccacaccaa gtgtccagcc agcgaaatcc agtgcggctc tggcgagtgc 60 <210> 8 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - VLDLRCR7F <400> 8 gcgataggat ccacttgccg acctgaccaa tttgaatgtg aggatggcag c 51 <210> 9 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - VLDLRCR8R <400> 9 gcgataaagc ttttatcatt cgtttatatg acactctttc aggggctcat cactccagtc 60 cctg 64 <210> 10 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - LRP2CR8F <400> 10 gcgataggat cccccacgga gcagtgtggc ttattttcct tcccctgtaa aaatggc 57 <210> 11 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - LRP2CR9R <400> 11 gcgataaagc ttttatcatg cgtgggtggg gcagttgtgc tcatcactgc catccacaca 60 gtcgttgcgt ttg 73 <210> 12 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - LRP2CR34F <400> 12 gcgataggat ccgatggtgc atactgccag gctactatgt tcgaatgcaa aaaccatgtt 60 tgtatcccgc 70 <210> 13 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - LRP2CR35F <400> 13 gcgataggat ccgatgttcc ctgtaattca ccaaaccgtt tccggtgtga caacaatcgc 60 tgc 63 <210> 14 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - LRP2CR36R <400> 14 gcgataaagc ttttatcata tattttcagc acatgttctt tcttttcctt tattgcaacc 60 cagttcatcg 70 <210> 15 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - ST14F1 <400> 15 gcgataggat ccccatgccc ggggcagttc acgtgccgca cggggcggtg tatc 54 <210> 16 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - ST14F2 <400> 16 gcgataggat cctgcgacgc cggccaccag ttcacgtgca agaacaagtt ctgc 54 <210> 17 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - ST14F3 <400> 17 gcgataggat ccagttgtcc ggcccagacc ttcaggtgtt ccaatgggaa gtg 53 <210> 18 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - ST14R1 <400> 18 gcgataaagc ttttatcaac ccctgctcgt cgctgttgtc tccgcagtcg ttcacactg 59 <210> 19 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - ST14R2 <400> 19 gcgataaagc ttttatcaac tgcacccctg ctcgtcgctg ttg 43 <210> 20 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - ST14R3 <400> 20 gcgataaagc ttttatcagt cgcagtcctt ctcatctgag ccgtcgctac agtcctcctt 60 cccg 64 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - LRP1CR3F <400> 21 gcgataggat ccccccagtg ccagccaggc gagtttgcc 39 <210> 22 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - LRP1CR5R <400> 22 gcgataagct ttcaataggc acacgaagca gactcatcag agcgg 45 <210> 23 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - 8D6AF <400> 23 gcgataggat cctcgtgccc acccaccaag ttccagtgcc gcaccagtgg cttatg 56 <210> 24 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - 8D65AR <400> 24 gcgataaagc ttttatcatc cacagccgag ctcgtcgctg gagtcgggac 50 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - CR89YWF <400> 25 gtgcccaatt actggctctg tgatggag 28 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - CR89YWR <400> 26 ctccatcaca gagccagtaa ttgggcac 28 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - CR89V1047DF <400> 27 ctctgtgatg gagacgatga ttgtcatgat a 31 <210> 28 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - CR89V1047DR <400> 28 tatcatgaca atcatcgtct ccatcacaga g 31 <210> 29 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - CR89R1088DF <400> 29 cacactggcg ctgtgacaaa gacaacgact gtgtggatgg c 41 <210> 30 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - CR89R1088DR <400> 30 gccatccaca cagtcgttgt ctttgtcaca gcgccagtgt g 41 <210> 31 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - RAP2KXF <400> 31 ccctcggacg tcagcgacat caagggcagc gtcctg 36 <210> 32 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - RAP2KX2 <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <400> 32 ctccagctgc ttctggtagt ggttgtgvnn ctcctcgatt ttggcttcga agtgcttgag 60 ctcct 65 <210> 33 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - RAP2KX1 <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> n is a, c, g, or t <400> 33 aagcagctgg agattgcgca cgagnnbctg aggcacgcag agagcgtggg cgaacggc 58 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - RAPmut1R <400> 34 ggtgcggggc ctcaccggt 19 <210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - MORPHF4 <400> 35 ggcccagatc taccggtttc tgcctcggc 29 <210> 36 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - D3HALFR2 <220> <221> misc_feature <222> (38)..(39) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (53)..(54) <223> n is a, c, g, or t <400> 36 gtgcgcaatc tcgagctgct tctggtagtg gttgtgvnnc tcgattttgg cvnngaagtg 60 cttgagctcc tcccgg 76 <210> 37 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - D3HALFF2 <220> <221> misc_feature <222> (35)..(36) <223> n is a, c, g, or t <400> 37 ccactaccag aagcagctcg agattgcgca cgagnnbctg aggcacgcag agagcgtggg 60 cgacggc 67 <210> 38 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - MORPHR3 <400> 38 gagtgcggcc gcaagcttat cttctgcctc ggc 33 <210> 39 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - d3 Rescue F <400> 39 gcgataggat ccctggaccg cctgcgcagg gtcagccacc 40 <210> 40 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - d3 Rescue R <400> 40 gcgataaagc ttttatcaag atctaccggt ttctgcctcg gc 42 <210> 41 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - V2AR1 <400> 41 agggtcagcc accagggcta cagcactgag gctaagttcg aggagcccag ggtgat 56 <210> 42 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - V2AR2 <400> 42 cagccaccag ggctacacca ctgaggctga gttcgaggag cccagggtga ttgacc 56 <210> 43 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - V2AR3 <400> 43 ggaggcgttc cgggaggagc tcaagcactt caaagccaaa attgaggccc acaacc 56 <210> 44 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - V2AR4 <400> 44 cgttccggga ggagctcaag tacttcgaag ccaaaattga ggcccacaac cactac 56 <210> 45 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - V2AR5 <400> 45 gctcaagtac ttcaaagcca aaattgagaa gcacaaccac taccagaagc agctggag 58 <210> 46 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - V2AR6 <400> 46 agaagcagct ggagattgcg cacgagaagc tgaggcacgc agagagcgtg ggcgacgg 58 <210> 47 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - V2ARR1 <400> 47 atcaccctgg gctcctcgaa cttagcctca gtgctgtagc cctggtggct gaccct 56 <210> 48 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - V2ARR2 <400> 48 ggtcaatcac cctgggctcc tcgaactcag cctcagtggt gtagccctgg tggctg 56 <210> 49 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - V2ARR3 <400> 49 ggttgtgggc ctcaattttg gctttgaagt gcttgagctc ctcccggaac gcctcc 56 <210> 50 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - V2ARR4 <400> 50 gtagtggttg tgggcctcaa ttttggcttc gaagtacttg agctcctccc ggaacg 56 <210> 51 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - V2ARR5 <400> 51 ctccagctgc ttctggtagt ggttgtgctt ctcaattttg gctttgaagt acttgagc 58 <210> 52 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - V2ARR6 <400> 52 ccgtcgccca cgctctctgc gtgcctcagc ttctcgtgcg caatctccag ctgcttct 58 <210> 53 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - K256AF <400> 53 cttcgaagcc aaaatcgagg cgcacaacca ctaccagaag c 41 <210> 54 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - K256AR <400> 54 gcttctggta gtggttgtgc gcctcgattt tggcttcgaa g 41 <210> 55 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - K270EF <400> 55 gctggagatt gcgcacgagg agctgaggca cgcagagag 39 <210> 56 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - K270ER <400> 56 ctctctgcgt gcctcagctc ctcgtgcgca atctccagc 39 <210> 57 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - d3E251KF <400> 57 gaggagctca agcacttcaa agccaaaatc gagaagcaca ac 42 <210> 58 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - d3E251KF <400> 58 gttgtgcttc tcgattttgg ctttgaagtg cttgagctcc tc 42 <210> 59 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - d3E217KF <400> 59 cagggctaca gcactgaggc taagttcgag gagcccaggg tg 42 <210> 60 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - d3E217KR <400> 60 caccctgggc tcctcgaact tagcctcagt gctgtagccc tg 42 <210> 61 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - d3H249YF <400> 61 gttccgggag gagctcaagt acttcgaagc caaaatcgag 40 <210> 62 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer - d3H249YR <400> 62 ctcgattttg gcttcgaagt acttgagctc ctcccggaac 40 <210> 63 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LDLR CR1 <400> 63 Trp Val Cys Asp Gly Ser Ala Glu 1 5 <210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> LDLR 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10 15 His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg 20 25 30 His Ala Glu Ser Val Gly Asp Gly Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu 35 40 45 Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val 50 55 60 Lys Lys His Leu Gln Asp Leu Ser Gly Gly Cys 65 70 75 <210> 100 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 100 Cys Gly Lys His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys His Asn His Tyr Gln 1 5 10 15 Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg His Ala Glu Ser Val 20 25 30 Gly Asp Gly Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu Lys His Ala Leu Leu 35 40 45 Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val Lys Lys His Leu Gln 50 55 60 Asp Gly Cys 65 <210> 101 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 101 Cys Glu Ala Lys Ile Glu Lys His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu 1 5 10 15 Ile Ala His Glu Lys Leu Arg His Ala Glu Ser Val Gly Asp Gly Glu 20 25 30 Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg Thr 35 40 45 Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val Lys Lys His Gly Cys 50 55 60 <210> 102 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 102 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 103 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 103 Cys Gly Lys His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys His Asn His Tyr Gln 1 5 10 15 Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg His Ala Glu Ser Val 20 25 30 Gly Asp Ala Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu Lys His Ala Leu Leu 35 40 45 Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val Lys Lys His Leu Gln 50 55 60 Asp Ala Cys Gly 65 <210> 104 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 104 Gly Gly Ser Gly Gly Cys Gly Lys His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys 1 5 10 15 His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg 20 25 30 His Ala Glu Ser Val Gly Asp Ala Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu 35 40 45 Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val 50 55 60 Lys Lys His Leu Gln Asp Ala Cys Gly 65 70 <210> 105 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is glycine modified with SU6668 <400> 105 Xaa Gly Ser Gly Gly Cys Gly Lys His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys 1 5 10 15 His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg 20 25 30 His Ala Glu Ser Val Gly Asp Ala Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu 35 40 45 Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val 50 55 60 Lys Lys His Leu Gln Asp Ala Cys Gly 65 70 <210> 106 <211> 74 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Xaa is lysine modified with octa-difluoromethylornithine <400> 106 Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Cys Gly Lys His Phe Glu Ala Lys Ile Glu 1 5 10 15 Lys His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys Leu 20 25 30 Arg His Ala Glu Ser Val Gly Asp Ala Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg 35 40 45 Glu Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr 50 55 60 Val Lys Lys His Leu Gln Asp Ala Cys Gly 65 70 <210> 107 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 107 Ser Gly Phe Arg Glu Glu Leu Lys His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys 1 5 10 15 His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg 20 25 30 His Ala Glu Ser Val Gly Asp Gly Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu 35 40 45 Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val 50 55 60 Lys Lys His Leu Gln Asp Leu Ser Gly Gly Ser 65 70 75

Claims (27)

1. 길이가 85 아미노산보다 짧고, 서열 번호 97에 대한 서열 동일성이 85% 이상인 인접한 50 아미노산을 포함하며, 1 x 10^-8 M 이하의 결합 친화력 K_d로 CR(complement-repeat, 보체-반복부) 함유 단백질에 결합하며, 서열번호 97은 4, 5, 7, 8, 9, 14, 15, 19, 24, 25, 26, 28, 31, 37, 38, 45, 48, 52, 54, 55, 56, 63, 66, 69, 70 및 71 위치 중 1 이상의 위치에 돌연변이를 포함하는 것인 환형 RAP 펩티드.
2. 제1항에 있어서, 인접한 50 아미노산을 포함하는 펩티드는 서열 번호 97과 90% 이상 동일한 것인 환형 RAP 펩티드.
3. 제1항에 있어서, 1 x 10^-8 M 이하의 K_d로 LRP1에 결합하는 것인 환형 RAP 펩티드.
4. 제1항 있어서, 서열 번호 97은 9, 14, 15, 24, 28, 37, 38, 54 및 63 위치 중 임의의 한 위치에 돌연변이를 포함하는 것인 환형 RAP 펩티드.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 97은 7, 9 및 28 위치 중 임의의 한 위치에 돌연변이를 포함하는 것인 환형 RAP 펩티드.
6. 제1항에 있어서, 매트립타제(matriptase), VLDLR 및 FDC-8D6(CD320)으로 이루어진 군에서 선택된 단백질에 선택적으로 결합하는 것인 환형 RAP 펩티드.
7. 제6항에 있어서, 서열 번호 97은 9, 14, 15, 24, 28 및 38 위치 중 임의의 한 위치에 돌연변이를 포함하는 것인 환형 RAP 펩티드.
8. 제6항에 있어서, 서열 번호 97은 9, 14, 28 및 54 위치 중 임의의 한 위치에 돌연변이를 포함하는 것인 환형 RAP 펩티드.
9. 제6항에 있어서, 서열 번호 97은 9, 14, 28, 37 및 63 위치 중 임의의 한 위치에 돌연변이를 포함하는 것인 환형 RAP 펩티드.
10. 제1항에 있어서, 서열 번호 97을 포함하는 것인 환형 RAP 펩티드.
11. 제4항에 있어서, 서열 번호 97은 29∼71 위치 내에 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함하는 것인 환형 RAP 펩티드.
12. 제1항에 있어서, 서열 번호 97은 4, 5, 7 및 8 위치 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 환형 RAP 펩티드.
13. 제4항에 있어서, 상기 돌연변이는 산성 아미노산을 염기성 아미노산으로 치환한 것이거나 염기성 아미노산을 산성 아미노산으로 치환한 것인 환형 RAP 펩티드.
14. 제13항에 있어서, 상기 산성 아미노산이 D 및 E로 이루어진 군에서 선택되거나 또는 상기 염기성 아미노산이 K 및 R로 이루어진 군에서 선택되는 것인 환형 RAP 펩티드.
15. 제4항에 있어서, 상기 돌연변이는 A, C, D, E, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T 및 V로 이루어진 군에서 선택된 아미노산을 F, Y, W 및 H로 이루어진 군에서 선택된 아미노산으로 치환한 것인 환형 RAP 펩티드.
16. 제1항에 있어서, 서열 번호 97은 4, 5, 7, 8, 9, 14, 15, 19, 24, 25, 26, 28, 31, 37, 38, 45, 48, 52, 54, 55, 56, 63, 66, 69, 70 및 71 위치 중 3 이상의 위치에 돌연변이를 포함하는 것인 환형 RAP 펩티드.
17. 제1항에 있어서, E4G, E9L, E9K, E9T, E9G, E9P, E9N, E9R, K14R, K14V, K14A, K14I, K14P, K14L, I24F, I24T, Q19R, A25V, H26R, K28P, K28D, K28N, K28G, K28E, K28W, H31Y, D37Y, R45H, H48Y, H48L, E52V, R54L, T55I, K56R, K63T, S70F, G71D, E4C, L5G, G38A, L69A, S70C, F8C, L66G 및 L69G의 돌연변이 중 3 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 환형 RAP 펩티드.
18. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 따른 환형 RAP 펩티드를 포함하는 질환 치료를 위한 약제로서, 상기 환형 RAP 펩티드는 질환의 병리생리학에 관여하는 CR(complement-repeat, 보체-반복부) 함유 단백질에 선택적으로 결합하며, 상기 질환은 자가면역 질환, 심혈관계 질환, 중추 신경계 질환, 정신 질환, 감염성 질환 및 리소좀 축적병으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 약제.
19. 진단제 또는 치료제에 접합된 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 따른 환형 RAP 펩티드를 포함하는 접합체.
20. 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제 중에 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 따른 환형 RAP 펩티드를 포함하는, 자가면역 질환, 심혈관계 질환, 중추 신경계 질환, 정신 질환, 감염성 질환, 리소좀 축적병 및 신경 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 질환의 치료용 약학 조성물.
21. 활성 제제에 접합된 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 따른 환형 RAP 펩티드를 포함하는 접합체.
22. 의약에 사용하기 위한 제1항의 환형 RAP 펩티드.
23. 제20항에 있어서, 신경 질환의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
24. 제23항에 있어서, 신경 질환이 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 및 중추 신경계 암으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
25. 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제 중에 제19항의 접합체를 포함하는, 자가면역 질환, 심혈관계 질환, 중추 신경계 질환, 정신 질환, 감염성 질환, 리소좀 축적병 및 신경 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 질환의 치료용 약학 조성물.
26. 제25항에 있어서, 신경 질환의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
27. 의약에 사용하기 위한 제19항의 접합체.

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