CN101861334A - 受体相关蛋白（rap）环肽 - Google Patents

Abstract

本发明总体涉及低密度脂蛋白受体相关蛋白(RAP)的受体选择性变体及其组合物，制备这些变体的方法和为治疗目的使用这些受体选择性RAP变体组合物的方法。

Description

受体相关蛋白(RAP)环肽

本申请要求2007年3月21日递交的美国临时专利申请60/919,238的优先权，其全文并入本申请作为参考。

发明领域

本发明涉及低密度脂蛋白受体相关蛋白(RAP)环肽，包括其类似物，其组合物，以及制备和使用此RAP环肽的方法。

背景技术

受体相关蛋白(RAP)，也称为α2-巨球蛋白/低密度脂蛋白受体相关蛋白相关蛋白1(Uniprot数据库中编号为P30533，Pfam中编号PF06400和PF06401)，是一种独特的39KD的蛋白，其几乎与低密度脂蛋白受体(LDLR)的所有家族成员结合。其位于内质网和高尔基体(Bu andSchwartz，Trends Cell.Biol.8(7)：272-6，1998)，RAP起这些家族成员的伴侣的作用。例如，在这些间隔中RAP紧密结合LRP，防止受体和共表达的配体过早结合(Herz and Willnow，Atherosclerosis 118 Suppl：S37-41，1995)。

全长的人RAP包括其信号序列有357个氨基酸。成熟的RAP含有323个氨基酸，其中后四个氨基酸(HNEL)组成了一个内质网滞留信号。已有报道，RAP由三个同源性较低的结构域组成(d1、d2和d3)。所有这三个结构域都能够结合LRP，尽管d3以较高的亲和力结合。不同的出版物对RAP的三个结构域的分界的报道稍有不同(氨基酸残基1-100，101-200和201-323，或18-112，113-218和219-323)，这些结构域在结合特性方面表现出略有不同。例如，据报道d1抑制α2-巨球蛋白与LRP的结合，而d3则被报道促进LRP的正确折叠(见Obermoeller等人，J.Biol.Chem.272(16)：10761-100768(1997))。Medved等人，J.Biol.Chem.，274(2)：717-727(1999)报道了另一种四结构域的划分方式(残基1-92，93-163，164-216和217-323)。

RAP的截短和/或突变形式已有研究。Melman等人，J.Biol..Chem.，276(31)：29338-29346(2001)报道了一些GST/RAP片段融合的制备方法，包括成熟RAP残基221-323，221-275，276-323，221-290，221-300和221-310，这些全部显示出与LRP结合时没有或低的亲和力。从这些数据中，Melman等得出结论，残基201-210对于以高亲和力结合LRP是必需的。Melman等人还制备了RAP突变体，该突变体含有203-206(A位点)，282-289(B位点)和314-319(C位点)的突变；单独A位点突变或单独B位点突变对LRP结合活性的降低较小。然而A位点和B位点同时突变显著地降低LRP结合活性。Medved等人，同上，制备了两种GST/RAP C末端片段融合，其中一个含有成熟RAP残基216-323，另一个含有残基206-323。Rall等人，J.Biol.Chem.，273(37)：24152-24157(1998)报道了将成熟RAP蛋白水解为多种片段并鉴定作为高度蛋白酶抵抗部分的残基223-323。Obermoeller等人，同上，也制备了含有成熟RAP残基191-323的RAP片段，并研究了与不同LRP结构域的结合相互作用。McCormick等人，Biochemistry，44：5794-803(2005)构建了含有RAP的221-323残基的GSP/RAP片段融合，并评价了其与内质网分子伴侣ERp57的结合。Andersen等人，Biochemistry 42，9355-64(2003)测试了RAP结构域片段与apoE受体2的结合，并报道只有第三结构域(残基216-323)与之结合。Andersen等人，J Biol Chem 275，21017-24(2000)测试了RAP d3(残基216-323)与各种LRP片段结合的情况。Andersen等人，Biochemistry 40，15408-17(2001)同样测试了RAP d3变体，将C末端截短形成残基219-309，以便能够与融合到泛素(U-CR56)的LRP片段结合，并观察到与U-CR56结合力显著下降。Lee等人Mol Cell 22，423-30(2006)构建了全长RAP的突变体，在这些突变体中将每个保守组氨酸突变为丙氨酸，结构域1中所有组氨酸突变为丙氨酸，结构域2中所有组氨酸突变为丙氨酸，结构域3中所有组氨酸突变为丙氨酸。Migliorini等人，J BiolChem 278，17986-92(2003)构建了含有在RAP的残基206-323中随机突变的克隆的库，并报道RAP256位置的赖氨酸突变或270位置的赖氨酸突变后RAP不能够与LRP结合。

脂蛋白受体相关蛋白(LRP)受体家族包括一组细胞表面和跨膜蛋白，这些蛋白介导了多种生理现象。所有这些受体与LDLR相似，并具有相似的结构域组成，包括LDL受体A类结构域组，或补充型重复序列(CR)，这是保守蛋白序列大家族的部分。这些家族成员的结构数据显示CR

序列采用了典型的折叠，LDL受体样模块(蛋白构造分级，SCOP，术语学)。CR序列在多种不同类型的蛋白中均被发现，包括LDLR家族和II型跨膜丝氨酸蛋白酶(matriptase)家族。

LRP家族成员的作用机理包括结合配体的内吞作用和从细胞外间隙的信号转导(1)。LRP参与多种细胞功能，包括但不限于脂蛋白的代谢(2，3)，基质蛋白酶和凝结因子调控(4-6)，细胞命运(3，7)的决定，神经细胞迁移引导(3，7)，肿瘤细胞增殖诱导，鼻病毒结合(11，12)，通过神经递质的信号传导，通过抗原呈递细胞的抗原获取，配体通过血脑屏障转胞吞(16-19)，肾小球滤过液中蛋白质回收(20)，内分泌激素运输(21)，从脑中β-淀粉样蛋白流出(22)，骨沉积激活(23)和内皮细胞增殖调节(24)。LDLR起多种作用的能力部分源于这些受体能够结合的不同组的配体。此受体家族的另一特性就是每一个LDLR上的多种和唯一的组织分布模式。

II型跨膜丝氨酸蛋白酶家族包括corin和matriptases ST14，matriptase-2和matriptase-3。Matriptase(MT-SP1、ST14、TADG-15)在多种上皮肿瘤(癌)中过度表达(25-33)。肝细胞激活物抑制因子1(HAI-1)引起的反式激活后，matriptase通过直接降解细胞外基质成分，或通过激活其他蛋白酶(如，尿激酶血浆酶原激活剂(uPA))，致使基质降解(26，34，35)，来促进肿瘤的生长和代谢。除LDLR和matriptase家族外，还包括多种具有CR结构域的其他蛋白。一种这样的蛋白，FDC-8D6抗原(CD320)，具有一对这样的结构域并在淋巴滤泡中的B细胞分化中起重要作用(36，37)。

含有CR的蛋白在病理生理过程中起重要作用，以及其家族的一些成员独特的组织分布图形，使得这些蛋白成为有用的药物靶标。蛋白选择性药物可直接影响目标蛋白的功能，从而减少蛋白在具体疾病状态下的支持效果。或者，所述药物可利用目标蛋白的组织分布的优点有效传递其他治疗分子至受疾病影响的具体组织。尽管相当多的证据证明了含CR蛋白在哺乳动物生理及病理生理中的重要性，也有一些选择性作用于LDLR或含CR蛋白家族具体成员的药物的实例。构建结合这些家族具体成员的分子的能力为开发此类药物提供了手段。

例如，WO 2006/138343(Zankel等人)报道的数据显示GDNF与RAP融合(穿过血脑屏障)后产生缀合物，该缀合物保留了GDNF二硫键连接的同型二聚体结构。RAP-GDNF缀合物以与GDNF相同的亲和力(Kd)结合并激活GDNF受体(GFRα-1)，在培养的PC12细胞中用RAP-GDNF诱导神经突起生长证明其在体外保留有生物活性。

假设含有CR的蛋白普遍参与整个哺乳动物生理过程，那么就需要保留RAP原始结合特性的RAP片段和变体，或具有针对具体含有CR的蛋白提高的结合选择性的RAP片段和变体，并且显示出其他期望的特性，如，改善的稳定性或易生产和制备的特性。

发明综述

补充型重复序列(CR)是保守蛋白序列的大家族，其采用特征性折叠。含有CR的蛋白包括LDL受体家族成员，II型跨膜丝氨酸蛋白酶(matriptase)家族成员和其他蛋白，如FDC-8D6抗原(CD320)。受体关联蛋白(RAP)与很多这些含有CR的蛋白以高亲和力结合。成熟RAP的323氨基酸序列如SEQ ID NO：95所示，成熟RAP结构域3的氨基酸序列(201-323氨基酸)，长度为123个氨基酸，如SEQ ID NO：96阐明。氨基酸243-313如SEQ ID NO：97阐明。RAP249-303氨基酸如SEQ ID NO：98阐明。

本发明提供了以高亲和力与含有CR的蛋白结合的RAP环肽(包括类似物或衍生物)，以及含有该环肽的缀合物和组合物，以及这些多肽的治疗和诊断用途，如，作为这些含有CR蛋白的抑制剂或增强剂，或诊断剂或治疗剂到表达这些含有CR蛋白的组织的靶向传递。所述RAP环肽可显示出预期的特性，如改善的亲和力，提高的对含CR蛋白的结合选择性，改善的稳定性和/或易生产性。

本发明的RAP环肽基于成熟RAP的氨基酸序列，优选结构域3，优选少于123个氨基酸的长度，并在两个非连续氨基酸之间包含共价键。在一些实施方式中，该共价键稳定RAP肽的三维结构。在一些实施方式中，该共价键提供改善的结合亲和力以使RAP环肽与含CR的蛋白以约1x10^-8M或更少Kd(更少意味着更好的亲和力)的结合。这种结合的亲和力可通过本领域任何已知方法测定，如，放射性免疫测定，ELISA，基于技术(如，Biacore)分析的表面等离子共振(SPR)，或动力排斥试验(如，KinExA)。亲和力数据可进行分析，如，通过Scatchard等人，Ann N.Y.Acad.Sci.，51：660(1949)中所述的方法。在示范性实施方式中，对CR蛋白的结合亲和力大约在1x10^-9，10^-10，10^-11，10^-12，10^-13，10^-14M或更少。本发明提供不同大小的RAP环肽，包括长度约103，约99，约95，约90，约85，约82，约80，约78，约76，75，74，73，72，71，70，69，68，67，66，65，64，63，62，61，60，59，58，57或56个氨基酸或更短的氨基酸。在一些实施方式中，该共价键在氨基酸之间形成，它们分别为约76，75，74，73，72，71，70，69，68，67，66，65，64，63，62，61，60，59，58，57或56个氨基酸。

本发明的RAP环肽可包含基于成熟的人的RAP序列(SEQ ID NO：95)的氨基酸序列。在一实施方式中，RAP环肽的氨基酸序列至少缺失了成熟RAP N末端200到243个氨基酸。因此，RAP环肽可缺失成熟RAP的1-200，1-220，1-225，1-230，1-235，1-240，1-241，1-242，1-243氨基酸，或1-244，1-245，1-246，1-247，或1-248氨基酸。在一相关实施方式中，所述RAP肽的氨基酸序列进一步缺失成熟RAP C末端至少4到11个氨基酸。因此，所述RAP环肽可缺失成熟RAP的314-323或313-323，或者304-323，305-323，306-323，307-323，308-323，309-323，310-323，311-323，或312-323氨基酸。在另一实施方式中，所述RAP肽氨基酸序列含有成熟RAP的一段连续部分，该RAP(a)至少有71氨基酸长度，以及(b)包含氨基酸256-270。在一相关实施方式中，所述RAP肽氨基酸序列含有成熟RAP结构域3的一段连续部分，该RAP结构域3(a)至少有71氨基酸长度，以及(b)包含氨基酸256-270。RAP示范性部分可形成RAP环肽的基础，其包括成熟RAP(SEQ ID NO：95)的氨基酸200-323，221-323，200-319，221-319，243-319，244-319，249-319，200-313，221-313，243-313，244-313，249-313，200-303，221-303，243-303，244-303，246-311，246-313或249-303。

如此处描述，可制备RAP环肽，其显示出对含CR蛋白的亲和力和选择性与天然的RAP相似(如，与天然RAP约5倍或者更少不同)。也可制备RAP环肽，其与天然RAP相比，显示对一个或多个含CR蛋白的改善的亲和力和/或变化的选择性。在一实施方式中，所述RAP环肽显示对含CR的蛋白至少1.5-倍，2-倍，2.5-倍，3-倍，4-倍，5-倍，7-倍，10-倍或20-倍提高的亲和力(相对于天然RAP)和/或改善的结合选择性，所述含CR的蛋白选自：LDLR(P01130)，LRP1(P98157)，LRP1B(Q9NZR2)，LRP2(P98164)，LRP3(O75074)，LRP4(O75096)，LRP5(O75197)，LRP6(O75581)，LRP8(Q14114)，选蛋白-相关受体，SorLA(Q92673)，LRP10(Q7Z4F1)，LRP11(Q86VZ4)，LRP12(Q9Y561)，FDC-8D6(CD320)，VLDLR(P98155)，TADG-15(ST14，Q8WVC1)，TMPS3(P57727)，TMPS4(Q9NRS4)，TMPS6(Q8IU80)，Q6ICC2，Q6PJ72，Q76B61，Q7RTY8，Q7Z7K9，Q86YD5，Q8NAN7，Q8NBJ0，Q8WW88，Q96NT6，Q9BYE1，Q9BYE2，Q9NPF0和corin(Q8IZR7)。这一结合选择性是可估算的，如，通过所述肽对具体含CR蛋白的结合亲和力与所述肽对至少一种其他含CR蛋白的结合亲和力的比率。所述肽可显示出相对于1，2，3，4，5，6，7或8个其他含CR蛋白的对含CR蛋白的结合亲和力。

本发明的RAP环肽可由天然的RAP序列构成或包含这些天然序列的突变体。在示范性实施方式中，本发明的RAP环肽包含与SEQ ID NO：97或SEQ ID NO：98至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述RAP环肽少于约85个氨基酸的长度，包含50个连续的氨基酸，这些氨基酸与SEQ ID NO：98至少70％相同，并以约1x10^-8M或更少的结合亲和力Kd与含CR蛋白相结合。在一些实施方式中，所述RAP环肽包含选自成熟RAP氨基酸200-319，300-319或247-257中区域内任何一个的1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多位置的突变。在示范的实施方式中，所述RAP环肽包含选自成熟RAP(SEQ ID NO：95)氨基酸175，205，213，217，226，230，232，239，241，242，246，247，249，250，251，256，257，261，266，267，268，270，273，279，280，287，290，294，296，297，298，305，308，311，312，313，314或315的1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多位置的突变。在其他实施方式中，所述RAP环肽包含在205，217，249，251，256，257，266，270，294，296，297，305位置中的三个或更多的突变。在一个实施方式中，所述RAP环肽包含成熟RAP的251，256和270位置的至少一个突变。

在一方面，所述RAP环肽选择性结合matriptase蛋白。可以预见的是matriptase特异性的肽可含有成熟RAP(SEQ ID NO：95)的氨基酸243-313或249-303，并且进一步含有成熟RAP在位置251，256，257，266，270或280中的任意一位置的突变。进一步可以预见matriptase特异性的RAP肽含有成熟RAP在位置251，256，257，266，270和/或280中至少1个、2个、3个、4个、5个或6个突变。

在另一方面，所述RAP环肽选择性结合VLDLR蛋白。可以预见的是VLDLR特异性肽可包含成熟RAP(SEQ ID NO：95)的氨基酸243-313或249-303，并进一步包含在RAP的位置251，256，270或296中的任何一位置的突变。进一步可以预见，VLDLR特异的RAP肽含有在成熟RAP的位置251，256，270和/或296中至少一个，两个，三个，或四个突变。

在更进一步方面，所述RAP环肽选择性结合FDC-8D6(CD320)蛋白。可以预见，FDC-8D6特异性肽可含有成熟RAP(SEQ ID NO：95)的氨基酸243-313或249-303，和进一步含有在RAP的位置251，256，270，279或305中任一位置的突变。进一步可预见，FDC-8D6特异性肽含有在成熟RAP的位置251，256，270，279和/或305中至少一个、两个、三个、四个或五个突变。

任何前述突变可包括用碱性氨基酸(K，R)置换酸性氨基酸(D，E)，或者相反置换。任何前述突变也可包括用组(F，Y，W，H)置换选自组(A，C，D，E，G，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V)的氨基酸。在进一步实施方式中，与成熟RAP(SEQ ID NO：95)相比，所述RAP环肽包括下述突变的三个、四个、五个、六个或更多的突变：V175L，R205S，S213T，E217K，L226M，H249Y，E230V，S232P，E239G，E246G，E251L，E251K，E251T，E251G，E251P，E251N，E251R，K256R，K256V，K256A，K256I，K256P，K256L，I266F，I266T，K257Y，Q261R，A267V，H268R，K270P，K270D，K270N，K270G，K270E，K270W，L271M，H273Y，D279Y，V283M，R287H，H290Y，H290L，E294V，R296L，T297I，K298R，K305T，K306M，S312F，G313D，E246C，L247G，G280A，L311A，S312C，Q309C，F250C，L308G，L311G，E241C和I315C。

在前述任何一个实施方式中，所述RAP肽可含有所述肽的N末端或靠近其N末端的半胱氨酸和所述肽的C末端或靠近C末端的半胱氨酸，通过两个半胱氨酸之间的二硫键形成使所述肽环化并稳定α螺旋。任选地，甘氨酸或脯氨酸可插入半胱氨酸和α螺旋之间(如，N末端Cys-Gly和C末端Gly-Cys)。甘氨酸的引入使α螺旋中断，形成邻近的非天然的内部螺旋的二硫键。

本发明也涵盖了至少2、3、4、5或6个本发明的RAP环肽的寡聚体组合或阵列。这些阵列可是同样RAP环肽的重复阵列或不同RAP环肽的阵列。多种组合可以是邻近的或者被肽连接子(如，1，2，3，4或5个氨基酸长度)分开，其展示每一个RAP环肽的三维机构，使得这些结构域能够与相同的含CR的蛋白的不同CR对结合，或与不同的含CR的蛋白的CR对结合。

在另一方面，本发明提供包含RAP环肽(或RAP环肽阵列)与诊断或治疗剂缀合的缀合物。在一个实施方式中，所述多肽和诊断或治疗剂通过连接子连接。在进一步的实施方式中，所述的连接子是肽连接子。在另一实施方式中，含有本发明多肽的缀合物为体内转胞吞。在示范实施方式中，连接本发明多肽的治疗剂选自：胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、或者本领域内已知的其他神经生长因子、解联蛋白和金属蛋白酶结构域10[人]ADAM10、或其他作用于APP或Abeta的蛋白酶、MESD(一种将受体转运到细胞表面所需的LRP5/6伴侣蛋白)、癌症化疗制剂、蛋白酶抑制剂、促凋亡分子、自身免疫剂、溶酶体酶。在一相关实施方式中，含有所述RAP环肽(或RAP环肽阵列)的缀合物与一活化剂缀合。在进一步实施方式中，所述活化剂是化疗剂。在更进一步实施方式中，所述化疗剂是放射性同位素。

在又一方面，本发明预期递送诊断或治疗剂到个体具体组织的方法，其主要通过给所述个体施用含有所述试剂和本发明的RAP环肽(或其阵列)的缀合物。在一实施方式中，与RAP环肽缀合的诊断或治疗剂通过转胞吞跨过上皮或内皮屏障，递送到具体组织。在一实方式中，所述试剂被递送穿过血脑屏障。在一相关实施方式中，所述个体患有神经疾病，其包括但不限于，阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、其他脱髓鞘疾病、中枢神经系统癌症、创伤性脑损伤、脊髓损伤、中风或脑缺血、斑样硬化、脑脉管炎、癫痫症、亨廷顿病、图雷特综合征、吉-巴综合征、威尔逊病、皮克病、神经炎性疾病、脑炎、脑脊髓炎或病毒性、真菌或细菌性脑膜炎或其他中枢神经系统感染、朊蛋白(prion)疾病、小脑共济失调、小脑变性、脊髓小脑变性综合征、弗里德赖希共济失调、毛细血管扩张性共济失调、脊髓肌萎缩、进行性核上麻痹、肌张力异常、肌肉强直、震颤、视网膜色素变性、老年痴呆、皮层下痴呆、动脉硬化痴呆、AIDS关联痴呆或其他痴呆、纹状体黑质变性、线粒体脑肌病、神经元蜡样质脂褐质症、中枢神经系统引起的溶酶体贮积紊乱、脑白质营养不良、尿素循环缺陷疾病、肝性脑病、肾性脑病、代谢性脑病、卟啉病、神经毒性物质中毒、放射诱导的脑损伤、或精神疾病，如，精神异常、焦虑、抑郁、注意力分散、记忆障碍、认知障碍、食欲障碍、肥胖、成瘾、倾向或药物依赖。本发明进一步提供递送治疗蛋白到个体特异组织中的细胞溶酶体间隔的方法，其包括使所述细胞接触有效量的含有与本发明RAP环肽缀合的所述治疗蛋白的缀合物。在一实施方式中，所述个体患有溶酶贮积症(LSD)。

在另一实施方式中，本发明预期治疗癌症或转移性肿瘤的方法，或与含CR的蛋白联合降低致瘤或转移影响的方法。这些方法包括给予个体与含有CR的致瘤蛋白的RAP环肽(或其阵列)选择性结合，或给予含有与所述RAP环肽(或其阵列)缀合的癌症治疗剂的缀合物。这些含CR的致瘤蛋白包括但不限于LRP5、LRP6、任何一个matriptases或FDC-8D6抗原。本发明的RAP环肽可通过与含CR的靶蛋白结合直接干扰其功能，从而减少致瘤效果，如，通过阻断结合或活化位点。或者，包含与癌症治疗剂缀合的本发明的RAP环肽的缀合物，可通过抗肿瘤药药物用于过量表达这些含CR蛋白的靶组织。例如，过量表达matriptase的组织包括癌组织，如，卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌或胃癌。

在另一实施方式中，本发明预期递送治疗剂到达肝脏以治疗肝脏疾病(包括肝炎或肝癌)的方法。这些方法包括给个体施用缀合物，该缀合物含有与RAP环肽(或其阵列)缀合的治疗剂，该RAP环肽保持了天然RAP结合特性或对LRP1以甚至更高的亲和力选择性结合。在一些实施方式中，所述方法还包括递送化疗/细胞毒性试剂到肝脏以治疗肝癌或其他肝脏疾病。

在另一实施方式中，本发明预期治疗骨质疏松或其他伴有造骨细胞活性减少和/或破骨细胞活性增加的疾病，该方法包括施用RAP环肽或含有与RAP环肽缀合的活化剂的缀合物，其特异性的结合到LRP5，因此抑制抗造骨细胞分化和骨沉积的因子，并促进破骨细胞活性。这种治疗方法预期用于增加成骨细胞和/或减少破骨的活性，从而进一步减少骨的流失或增强骨的强度。

在一相关方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含一种含有与诊断剂或治疗剂缀合的RAP环肽的缀合物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一不同方面，本发明提供一种与可检测的部分或标记缀合的RAP环肽。所述RAP环肽具有对特殊的含CR蛋白的结合选择性，RAP环肽可用于检测此类含CR蛋白的存在。它同样可用于检测含CR蛋白的表达模式，包括如，与致瘤相关的过量表达。本发明进一步提供使用该RAP环肽来诊断含CR蛋白过量表达或表达不足相关的疾病。

在其他方面，本发明介绍一种制备RAP肽的方法，通过合成或重组方式，这一方式可自然环化或能够通过共价连接进一步化学修饰而环化。本发明提供编码任意一种上述RAP环肽的核酸、含有该核酸的载体、含有上述核酸或载体的宿主细胞，以及制备该多肽的方法，该方法包括在适宜的培养基中培养所述宿主细胞以及从所述宿主细胞或培养基中分离该肽。

本发明的其他特征和优势将在以下详细描述中显示出来。然而应该理解，因为通过详细的描述，在本发明精神和范围内的不同的变型和改型对于本领域技术人员而言是显而易见的，尽管本发明仅仅通过示例的方式描述了详细的说明书和具体实施例，以及本发明优选实施例。

附图说明

图1是对补充型重复序列的代表性说明，其基于低密度脂蛋白受体相关蛋白1的第七个重复序列的序列(LRP1 CR7，PDB 1J8E)，如Simonovic等人(43)所测定的，该图显示了标记为A，B，C，D位置形成的钙结合环的表面，球形代表钙。

图2显示了为结合分析所选的CR序列对比以及RAP突变体或CR抗体选择。在左侧用括号标出具体序列对和三联体。。筛选底物(LRP2 CR89)用红色(较浅的颜色)括号指示。对比中的AxcBxCxD基序(motif)以每一个CR序列加下划线的位置A和C来表示。每一对CR的A、C、A’和C’氨基酸串联文字串在右侧指示。带底纹的氨基酸与对比位置中突出的氨基酸相同；粗体的氨基酸与对比位置中突出的氨基酸同源。序列对比Clustal W格式(44)并用BOXSHADE来形成。

图3显示了CR蛋白质的SDS-PAGE分析。在有2mM DTT或缺少2mM DTT的SDS上样缓冲液中纯化的再折叠蛋白变性。如方法中所述，处理后的样品溶解在12％NuPAGE Bis-Tris凝胶中。胶用考马斯亮蓝染色。每一对泳道在底部用相关检测的CR蛋白标注，并标注了分子量标记的大小。已经显示了典型的结果。缩写：L1是LRP1；L2是LRP2；L6是LRP6；M是MAT(matriptase，ST14)；V是VLDLR；YVWR＝LRP2 CR89；YVWD＝LRP2 CR89 R1088D；YDWR＝LRP2 CR89 V1047D；YDWD＝LRP2 CR89 V1047D R1088D；WVWR＝LRP2 CR89 Y1042W；WDWR＝LRP2 CR89 Y1042W V1047D；WVWD＝LRP2 CR89 Y1042W R1088D；WDWD＝LRP2 CR89 Y1042W V1047D R1088D。

图4显示了用制备的100-1.25nM稀释系列的RAP3与经选择的CR蛋白的结合。

图5A-B显示RAP d3、MegaRAP1 d3(RAPv2A d3)和中间序列的变体与LRP2 CR89和LRP1 CR3-5的结合。图5A显示了RAP d3突变体和RAPv2A d3回复体与LRP2 CR89的结合情况。图5B显示了RAP d3突变体和RAPv2A d3回复体与LRP1 CR3-5的结合情况。对数据作图并使之适应在假设的单个结合点呈非线性回归GraphPad Prism)。Kd值和标准差通过回归分析得出。

表2显示了RAP d3和RAP v2(RAP v2A)变体与LRP1 CR3-5和LRP2 CR89的结合情况。NF显示出结合不能测定或者说所述数据用通过假设单个结合点形成的非线性回归并不能可靠地适合。最大的结合百分比是每一个配体的最高测试浓度的OD值和在此浓度下测得的所有这些配体的最高OD的比值。

图6显示了MegaRAP1 d3和RAP d3与LRP2 CR89变体的结合情况。图中所用到的缩写：LRP2 CR89 Y1042W(WVWR)，LRP2 CR89V1047D(YDWR)，LRP2 CR89 R1088D(YVWD)，LRP2 CR89 V1047DR1088D(YDWD)，LRP2 CR89 Y1042W V1047D R1088D(WDWD)，LRP2CR89 Y1042W V1047D(WDWR)，LRP2 CR89 Y1042W R1088D(WVWD)。

表3显示了RAP d3和RAPv2A d3与LRP2 CR89变体结合的情况。NF显示出结合不能测定或者说该数据用通过假设单个结合点形成的非线性回归并不可靠地适合。最大的结合百分比是每一个配体的最高测试浓度的OD值和在此浓度下所有这些配体的最高OD的比值。

表4显示了在不同的CR对中，通过筛选突变噬菌体库分离的RAP d3变体序列。只显示了可变的位置。氨基酸编号对应成熟RAP。变体名字(d3)，用于亲和力选择的CR对(CR)，变体与靶CR对(当测定时)间的表现解离常数(Kd)和可变位置氨基酸的同一性均显示在表4。

图7显示了RAP d3变体与CR对结合的情况。RAP d3，MegaRAP1 d3，VRAP2 d3，MatRAP1 d3和MatRAP2 d3分别与LRP1 CR3-5，LRP6 CR12，LRP6 CR23，LRP6 CR1-3，LRP2 CR89，LRP2 CR2728，LRP2 CR3031，LRP2 CR3435，LRP2 CR34-36，VLDLR CR78，VLDLR CR6-8，MAT CR12，MAT CR23和MAT CR34在80nM浓度下孵育。重复检测两次样品，将数值叠加。然后计算出平均值和标准差。没有配体孔的空白值用来校正吸光值。任何情况下的方差系数没有超过20％(平均为6％)并在此没有显示。

图8显示了在此分离的RAP d3变体的全部氨基酸序列。

图9显示了MatRAP1变体N末端和C末端截短后在结合亲和力上的阳性效应。用所述全长变体的制备方法制备截短变体。

图10显示了320RAP1和对应截短变体与FDC-8D6抗原来源的靶CR的结合情况。

图11A和图11B分别显示了RAP肽与rhLRP1簇2以及与rmVLDLR胞外结构域的相对结合情况。

图12显示了毒素缀合的mRAPc对在表达LRP的CHO细胞和LRP缺失的CHO细胞的细胞生存力的影响。

图13A、13B和13C显示了RAP环肽，Heptide与不同细胞毒性试剂缀合后的化学结构。

图14A、14B和14C显示了通过与链霉抗生物素缀合的mRAPc肽和mRAP抑制RAP和uPA-PAI-1与LRP1受体结合的情况。

图15显示了动物静脉给予RAP环肽后的生物分布情况。

发明详述

RAP是功能性双配位基，具有与LDLR内的补充性重复序列的具体串联对以低纳摩尔亲和力结合的第一和第三结构域(d1和d3)。结构域3由约110个氨基酸组成，与相关的CR对显示出最高的亲和力。为了使免疫原性最小化，使生产效果最大化，同时改进性能，最小化RAP至那些直接参与受体结合的序列是有用的。然而，d3的稳定折叠显示出需要RAP内不直接参与形成受体接触表面的序列。因此，这些发现在d3的N末端和d2的C末端的额外序列对保证稳定的折叠和受体结合的高亲和力是必需的。分离的d3并不像上下文中的全长RAP的d3一样与受体紧密结合。d3的截短形式缺少稳定折叠的序列，其同样与受体的结合很低。来自RAP d3和LDLRCR34复合体的结构数据揭示RAP d3受体结合序列被发现位于通过可变形环连接的大约相同长度的两个反向平行的α螺旋之间。这一对双螺旋集合有着显著的逆时针扭转和类似于延伸的扭转“U”。

本发明提供RAPd3的基本上截短形式，该RAPd3通过一个分子内共价键来稳定，如，二硫键。没有分子内共价键的截短的非环化形式对LRP1的结合亲和力下降。相反，环RAP肽则与那些全长的RAPd3相比具有改良的受体结合亲和力。通过一个非天然的共价键而不是天然RAP内的大的肽区域来稳定RAP d3片段内的三维螺旋结构的能力，提供了改善的亲和力并由此产生很多优势。本发明能够快速生产小分子RAP肽，如，通过固体肽合成，无需重组生物体，能够尽可能地减少免疫原性，并更易于与活化剂缀合。

基于靶受体两个一般特性，本发明的环RAP肽具有潜在的药学应用：首先，一些受体在疾病状态的稳定和发展中起作用。因此，与这些受体选择性结合的药剂可用于改变这些受体所支持的活动和病理效应。第二，一些受体具有独特的组织分布。因此，选择性结合这些受体的药剂可用于选择性运载其他药物到靶受体突出表达的那些组织。本发明也涵盖了本发明所述的组合物在预防、处理和治疗疾病中的用途，其包括但不限于细胞增殖性疾病，如，肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、激素异常性疾病、退行性疾病、老化病、中枢神经系统疾病(如，阿尔茨海默病、癫痫症、高血脂)、精神疾病或病变(如，精神分裂症、情绪紊乱如，抑郁和焦虑)、传染性疾病、自身免疫疾病、酶缺乏疾病、如之前所述的那些溶酶体贮积症等等。

LDLR家族成员在中枢神经系统细胞类型包括神经元和星形胶质细胞的毛细血管内皮表达较多(如，LDL受体、巨蛋白、LRP1)。LDL受体家族内吞结合的配体，并证明在肾、甲状腺跨极化的上皮细胞转胞吞配体，以及在脑的跨毛细血管内皮细胞转胞吞配体。所以，LDLR含有一个在组成和功能相关的受体池，该受体在不同组织以不同水平表达。例子包括VLDLR在肌肉组织上的表达，LRP1B在神经组织上的表达，巨蛋白在肾脏和神经组织的表达，以及LRP1在肝脏和血管平滑肌组织的表达。本发明的RAP环肽可用于靶向这些受体的任何一个，也可用于靶向所述的表达其他含CR蛋白的组织。

在更全面的实施方式中，本发明的受体选择性的RAP环肽，以单独、阵列或与治疗剂缀合的方式，构建了一种特定性调节含CR蛋白质的方法(活化或抑制)。至少有四种影响调节的机制：通过RAP环肽与配体结合位点直接结合竞争性阻断配体结合；通过RAP环肽诱导配体结合位点变构变化来非竞争性阻断配体结合；通过RAP环肽结合诱导相同或不同受体间交联，来清除细胞表面的受体或其他含CR的蛋白；或者选择性的递送结合了经选择的RAP环肽的活化剂到组织(如，蛋白酶、蛋白酶抑制剂、其他酶、放射性同位素、促凋亡剂、毒素、治疗性分子(药物)、其他受体结合部分等等)。

A定义

除非另有定义，本发明所用的所有技术及科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解相同的意义。以下参考给本领域技术人员提供了本发明所用的很多术语的通常定义：Singleton，等人，微生物学和分子生物学字典(1994年第二版)，剑桥科技字典(1988年Walker编辑)，遗传学术语表R.Rieger等人(编辑)，Springer Verlag(1991)，Hale和Marham，THEHARPER COLLINS生物字典(1991)。

每一出版物、专利申请、专利和其他本文引用的参考文献均以参考方式将其全文并入本申请，其并入的程度与本发明的公开一致。

应当注意的是本说明书以及附加的权利要求书中使用的“一”、“一个”和“所述”包括其复数意义，除非上下文中有明确规定。

本申请所使用的如下术语具有归属于它们的意义，除非另外详细说明。

本申请所使用的术语“RAP环肽”表示少于100氨基酸长度，与SEQ IDNO：98(氨基酸249-303)至少80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％或更多相同或相似的多肽，并且含有在两个非连续氨基酸之间形成的共价键。在示范的实施方式中，所述共价键是两个半胱氨酸间形成的二硫键。

“RAP缀合物”或“缀合物”指含有附着在活化剂上的本发明RAP环肽的化合物。正如本发明所使用的，所述术语“缀合物”意指治疗剂和RAP环肽以通过如共价化学键的物理作用(如范德华力或氢相互作用、包囊作用、包埋或其结合)物理连接起来。

本发明使用的术语“突变”指肽序列中的氨基酸插入、删除或替代。相对于天然或野生型氨基酸序列具有一个或多个突变的肽被认为是类似物。

术语“衍生物”指经共价修饰的肽，如，通过与治疗性或诊断性制剂缀合、结合标记物(如，使用放射性核素或各种酶)、共价聚合物连接如，乙二醇化(由聚乙二醇衍化而来)，以及通过用化学合成的非天然氨基酸插入或替代的方式。本发明的衍生物将保留本发明非衍生化的分子的结合特性。用癌症靶向抗体与细胞毒性试剂缀合(如，放射性同位素(如，I131、I125、Y90和Re186)，化疗剂，或毒素)可提高对癌症细胞的破坏性。

“补充重复序列”或“CR”，也称为低密度脂蛋白受体A类结构域(LDL-A，Pfam)，除了其他特性外，其是由六个半胱氨酸和一簇酸性氨基酸来定义的蛋白质结构域家族的成员之一。业已发现，很多补充重复序列折叠成一个确定的结构，术语称LDL受体样单元(蛋白结构分类，SCOP)。CR结构域构成很多受体的配体结合决定簇，包括那些属于LDLR的受体。每一个CR的氨基酸线形序列具有基序AxcBxCxD，其中c是保守的半胱氨酸，x是任何一个氨基酸，B和D是天冬氨酸、谷氨酸或天冬酰胺，业已证明其参与钙的结合和配体的结合。具体CR结构域的直接邻近对已显示与RAP结合。业已证明在结合RAP的CR对的两个CR结构域上的位置A和C的氨基酸(A、C、A’和C’)参与RAP结合。

“含有CR的蛋白”是指含有一个或多个CR的蛋白。含CR蛋白的非限制性例子包括：LDLR(P01130)，LRP1(P98157)，LRP1B(Q9NZR2)，LRP2(P98164)，LRP3(O75074)，LRP4(O75096)，LRP5(O75197)，LRP6(O75581)，LRP8(Q14114)，选蛋白相关受体，SorLA(Q92673)，LRP10(Q7Z4F1)，LRP11(Q86VZ4)，LRP12(Q9Y561)，FDC-8D6(CD320)，VLDLR(P98155)，TADG-15(ST14/matriptase/MT-SP1，Q8WVC1)，TMPS3(P57727)，TMPS4(Q9NRS4)，TMPS6(Q8IU80)，Q6ICC2，Q6PJ72，Q76B61，Q7RTY8，Q7Z7K9，Q86YD5，Q8NAN7，Q8NBJ0，Q8WW88，Q96NT6，Q9BYE1，Q9BYE2，Q9NPF0和corin(Q8IZR7)。Uniprot数据库提供有关这些蛋白的每一个的索引编码。

结合亲和力Kd通过本领域已知方法测定。

“选择性”“结合选择性”“选择性结合”指配体与不同受体间不同的亲和力。如果配体结合受体的亲和力比其他受体高至少3倍，那么配体对该具体受体是有选择性的。例如，RAP以几乎相同的亲和力与LRP1，LRP1B，LRP2，SorLA，apoER2和VLDLR结合，因此，RAP对这些受体之一相对于另一个没有选择型。然而，RAP牢固地结合LRP1，LRP1B，LRP2，SorLA，apoER2和VLDLR，其解离常数少于5nM，其与LDLR，LRP5和LRP6结合较弱，其亲和力至少低于LRP1的10倍。因此，相对于LDLR，LRP5和LRP6，RAP对LRP1，LRP1B，LRP2，SorLA，apoER2和VLDLR有选择性。HRV2壳蛋白与VLDLR牢固地结合，但却不结合其他LDLR。因此，相对于其他LDLR，HRV2壳蛋白对VLDLR优先选择，表现出其结合的选择性。颤蛋白与apoER2和VLDLR结合，但不结合其他LDLR。因此，相对于其他LDLR，颤蛋白对apoER2和VLDLR有选择性。

本发明所用的“增加的相对递送”指一种效应，通过这种效应，相对于非缀合的活化剂的聚集，含有与本发明的RAP环肽结合的活化剂的缀合物在期望递送部位(如，脑，或表达含CR的蛋白的组织)的聚集增加。。

“编码”指多核苷酸中核苷酸具体序列的固有特性，这些多核苷酸如，作为合成生物学过程中其他聚合物和大分子的模版的基因、cDNA或mRNA，这些聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(即，rRNA，tRNA和mRNA)，或确定的氨基酸序列以及由此获得的生物学特性。因此，在细胞或其他生物系统中，如果通过基因产生的mRNA转录和翻译生成蛋白，那么这个基因就编码蛋白质。一个基因或cDNA的编码链(与mRNA序列相同的核苷酸序列并通常在序列表中提供)和用于转录模板的非编码链均可指编码蛋白或其他产物的基因或cDNA。除非另有指定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括所有彼此简并形式的核苷酸序列和编码同一氨基酸序列的核苷酸序列。编码蛋白和RNA的核苷酸序列可包括内含子。

“重组多核苷酸”指含有非天然结合在一起的序列的多核苷酸。含有所述重组多核苷酸的宿主细胞被称为重组宿主细胞”。基因在所述重组宿主细胞中的表达形成，如，“重组多肽”。

“表达调控序列”指在调节与其可操控性连接的核苷酸序列表达(转录和/或翻译)的多核苷酸中的核苷酸序列。“可操控连接”是指两部分之间的功能关系，所述两部分中的一部分活性(如，调节转录的能力)导致其他部分的作用(如，序列转录)。表达调控序列可包括但不限于，如：启动子(例，可诱导的或可构建的)、增强子、转录终止子、起始密码子(即，ATG)，内含子剪接信号以及终止密码子的序列。

“表达载体”指含有重组核苷酸的载体，该重组核苷酸含有操控性连接待表达核苷酸序列的表达调控序列。表达载体包含足够的表达顺式作用元件；其他表达元件可由宿主细胞提供或由体外表达系统来提供。表达载体包括本领域已知的所有表达载体，如，黏粒，质粒(如，无修饰的或包含在脂质体里的)以及整合重组多核苷酸的病毒。

“放大”指通过其复制多核苷酸序列并扩展到大量多核苷酸分子的任何手段，如：通过逆转录、聚合酶链反应以及连接酶链反应。

上下文核酸杂交试验中“严格杂交”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同环境参数下不同。在Tijssen(1993)生化和分子生物学-核酸探针杂交中的实验室技术的第一部分第二章中对核苷酸杂交有深入的分析(“杂交原则汇总和核酸探针试验策略”，Elsevier，纽约)。通常，高度严格杂交和洗涤条件选择为5℃左右，低于特定离子强度和PH值下具体序列的热熔点(Tm)。Tm是50％的目标序列与精确匹配的探针杂交的温度。选择非常严格的条件以与具体探针的Tm相等。

高度严格的洗涤条件实施例是72℃下0.15M NaCl洗涤15分钟。严格的洗涤条件实施例是温度65℃下0.2X SSC洗涤15分钟(见，Sambrook等对SSC缓冲液的描述)。通常，高度严格的洗涤前应该用低严格的洗涤去除背景探针信号。，如，多于100个核苷酸的双链体的培养基严格洗涤实施例为，45℃温度下1x SSC洗涤15分钟。如多于100个核苷酸的双链体的低度严格洗涤实施例为，40℃下4-6x SSC洗涤15分钟。一般来说，比在具体杂交试验中对于不相关探针观察到的信噪比高2x(或更高)的信噪比显示具体杂交的检测。

“多肽”或“肽”指的是一种通过通过肽键相连接的氨基酸残基组合而成的聚合物，其天然存在的结构变体以及其非天然存在的类似物。合成多肽可人工合成，如，通过自动多肽合成仪。术语“蛋白质”通常指大分子多肽。术语“肽”通常指短多肽。

上下文中的两个或更多多核苷酸或多肽序列中的术语“相同”或“相同百分比”是指两个或更多序列或亚序列，当使用如下序列比对法则之一或通过肉眼检查的方法测量来比较或对比最大相关性时，其是相同的或具有一定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基。优选的，相同百分比存在于两个对比的生物聚合物中的一个或两者的至少约50个氨基酸的，至少约100个氨基酸，至少约150个氨基酸残基长度的序列的区域，或其全长。

用于对照的序列最佳对比可通过例如，Smith和Waterman的局部相同算法Adv.Appl.Math.2：482(1981)，Needleman和Wunsch的相同对比算法J.Mol.Biol.48：443(1970)，Pearson和Lipman的探索相似方法Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)，这些法则的计算机处理(GAP，BESTFIT，FASTA，and TFASTA in the Wisconsin Genetics SoftwarePackage，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或肉眼检测等来实现。

适用于检测序列的相同百分比和序列相似百分比的运算法则的另一例子是BLAST运算法则，其在Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中有描述。

当通过常规的序列对比运算法则或用肉眼来对比和比对最大相关性时，当用于多肽序列时，术语“相似百分比”描述其氨基酸残基的百分比是：(1)相同或(2)仅仅因保守性置换而不同(即，相似)。

“基本纯”或“分离的”意味着目标种类是存在的主要种类(即，在摩尔基础上，组合物中比任何其他个别的大分子种类更丰富)，以及基本纯化的片段是一种组合物，其中所述目标种类包含存在的全部大分子的至少约50％(在摩尔基础上)。通常，基本纯的组合物意味着存在的组合物中的约80％、90％、95％、99％或更多是纯化的目标种类。如果组合物本质上含有一种单一的大分子种类，那么目标种类即被纯化到达了基本均一性(通常的检测手段无法检测出组合物中的污染物)。本定义的大分子种类不包括溶剂、小分子(＜500道尔顿)、稳定剂(如，BSA)以及基本的离子种类。在一些实施方式中，本发明的药物组合物含有基本纯化的或分离的RAP环肽或其与活化剂缀合的缀合物。

“天然存在的”被用于一种物质时指的是在自然界中能够找到该物质。例如，存在于能够从自然界中分离的生物体中的多肽或多核苷酸序列，并且没有被人类在实验室中有意修饰的，就是天然存在的。

“检测”指测定样本中被分析物的存在、缺少或者含量，其可包括对样本中或样本中每一个细胞中的被分析物进行定量。

“可检测部分”或“标记”指可通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可检测到的组合物。例如，有用的标记包括³²P、³⁵S、荧光染料、电密度反应物、酶(如，常用于ELISA的)、生物素-链霉抗生物素、地高辛配基(dioxigenin)、半抗原以及可获得抗血清或单克隆抗体的蛋白，或具有与目标互补的序列的核酸分子。可检测部分通常可以生成可检测的信号，如放射性、发光或者荧光性信号，这可用于定量检测样本中结合的可检测的部分。所述可检测部分可通过共价键或离子键、范德华力或氢键结合或附在引物或探针上，如，与放射性核素结合或链霉抗生物素识别的生物素化的核苷酸。所述可检测部分可被直接或间接的检测。间接检测可包括第二直接或间接可检测部分与所述可检测部分的结合。例如，所述可检测部分可以是结合伴侣的配体，如，生物素，其为链霉抗生物素的结合伴侣，或核苷酸序列，其是互补序列的结合伴侣，并可以与互补序列特异性杂交。所述结合伴侣本身可被直接检测，如，其自身标记了荧光分子的抗体。所述结合伴侣也可以是可被间接检测的，例如，具有互补核苷酸序列的核酸可以是分支DNA的一部分，该分支DNA反过来可通过与其他标记的核酸分子杂交来检测(见，例如，PD.Fahrlander和A.Klausner，Bio/Technology(1988)6：1165.)。信号定量可通过如，闪烁计数、密度分析或流式细胞仪等来获得。

“连接体”指一种通过共价键或离子键、范德华力或氢键连接两个其他分子的分子，如，与互补序列的5′端杂交和与另一互补序列的3′端杂交的核苷酸分子，这样就连接了两个非互补序列。

本申请中使用的“肿瘤”或“瘤生成”或“癌症”，包括原发肿瘤和/或转移瘤。这样的肿瘤通常是实体瘤，或局部堆积扩散的肿瘤。已知有很多种这样的肿瘤和瘤形成。原发性的脑肿瘤包括，胶质瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤、垂体腺瘤、成髓细胞瘤、颅咽管瘤、血管瘤、表皮样囊肿、肉瘤以及其他。癌症包括，例如，卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌或胃癌。肝细胞癌或肝脏肿瘤，是世界上第五大常见癌症，其发生率逐渐稳步升高。肝细胞癌是一种肝细胞疾病。百分之五十的颅内肿瘤是颅内转移肿瘤。脑肿瘤和瘤形成可与脑或神经组织相关，或与脑膜、颅骨、脉管系统或头颈部的其他组织相关。根据本发明治疗的肿瘤或瘤生成可以是恶性或良性肿瘤，并可以在之前经过化疗、放疗和/或其他治疗手段治疗。

术语“有效剂量”指对病人的健康条件、病理学和疾病或为诊断目的足以产生想要得到的效果的剂量。想要得到的结果可包括接受这一剂量后主观或客观的改善。“治疗性有效剂量”指对健康有效产生想要的有益效果的试剂的量。

“有机小分子”指其大小与药学上常用的那些有机分子可比较的有机分子。所述术语不包括有机生物聚合物(如，蛋白质、核酸等)。优选的有机小分子的大小范围高达约5,000Da、高达约2,000Da、或高达约1,000Da。

诊断或治疗的“个体”，指人或非人类的动物，其包括哺乳动物或灵长类动物。

“治疗”是指预防性治疗或治疗性治疗或诊断性治疗。

“预防性”治疗是指对没有疾病迹象或仅仅是有早期迹象的个体进行治疗以减少疾病发展的风险。可施用本发明的缀合物作为预防性治疗以降低疾病发展的可能性，或如果疾病发生后，使其病理发展的严重性最小化。

“治疗性”治疗是指对有病理性迹象或症状的个体实施治疗，以减少或消除这些迹象或症状。这些迹象或症状可以是生化的、细胞的、组织的、功能的、主观的或客观的。可施用本发明的缀合物进行治疗性治疗或诊断。

“诊断的”是指鉴别病理性疾病的存在或性质。诊断方法依其特异性和选择性而不同。然而具体的诊断方法不能提供疾病的确定性诊断时，如果所述方法提供有助于诊断的阳性指征，那么就是支持性的诊断。

“药学上可接受的载体”指任何一种标准药学载体、缓冲液以及赋形剂，如，磷酸盐缓冲溶液，5％的葡萄糖水溶液以及乳液(如，油/水或水/油乳液)以及各种类型湿润剂和/或佐剂，这些药学载体已经被有资质的管理机构批准适合于给予人体。合适的药学载体和制剂在Remington′s PharmaceuticalSciences，19th Ed.(Mack Publishing Co.，Easton，1995)中有描述。优选的药学载体取决于活化剂预期的施用方式。典型的施用方式包括经肠的(如，口服)或非肠道的(如，皮下注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射或鞘内注射；或局部、透皮，或包括肺内施用的)。“药学上可接受的盐”是指能够配制成用于治疗用途的化合物的盐，如，金属盐(钠、钾、镁、钙等等)以及铵盐或有机胺盐。

A  含CR的蛋白及其作用

“LDLR”指包括低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)在内的低密度脂蛋白受体家族的成员。LRP1是4525个氨基酸的大分子蛋白(600kDa)，该蛋白通过弗林蛋白酶切割为保留非共价键的515-(α)kD和85-(β)kDa的两个亚单位。LRP1在大多数组织类型中均有表达，但最早发现于肝脏。所述低密度脂蛋白(LDL)受体家族的其他成员包括LDL-R(132kDa)；LRP2(巨蛋白，gp330)；LRP/LRP1和LRP1B(600kDa)；VLDL-R(130kDa)；LRP5；LRP6；apoER-2(LRP-8，130kDa)；嵌合LDL-R(LR11，250KDa)；以及其他成员，诸如，LRP3、LRP6和LRP-7。这一家族的典型特征包括，细胞表面表达；胞外配体结合域重复(DxSDE)；配体结合对Ca++的需要；RAP和apoE的结合；EGF前体的同源结构域重复(YWTD)；单一膜跨越区域；胞质结构域内的内化信号(FDNPXY)；以及受体介导的多种配体的胞吞。这一家族的一些成员，包括LRP1，LRP5，LRP6，apoER2和VLDLR，参与信号转导通路。

RAP d3折叠成反向平行螺旋发夹。第一个螺旋大约在D237-V277，通过转角(由残基G278-G280构成)连接到第二个螺旋(残基E281-R317)。在右臂(螺旋2)交叉左臂(螺旋1)的构象中，这两个螺旋是最接近的。LDLR的CR3基本在K270接触RAP d3，而CR4形式基本在K256与RAPd3接触。K256和K270在螺旋2的同一表面。RAP R282和R285被引入CR3的负电荷钙螯合囊中，而RAP K253在结合CR4中起类似的作用。所述LDLR CR对仅仅在RAP d3反向平行螺旋发夹约H249-T303间与残基相连。在这一区域外是螺旋1的N末端的延伸和螺旋2的C末端的延伸。据推测是螺旋1和螺旋2的这些部分帮助稳定螺旋束。此外，在螺旋1前有一个转角S232-T236，其是一个短螺旋和一些附加序列，包括R206-Q231间的残基。已经表明所述短螺旋和附加的序列对于RAP d3折叠的稳定性也起着非常重要的作用。

i.LRP1选择的RAP肽

天然的RAP强有力的结合LRP1，LRP1在肝细胞上高度表达。本发明一方面预期化疗药物或其他治疗肝脏疾病的制剂与RAP环肽缀合，以递送治疗化合物到达肝脏，从而治疗肝脏疾病。施用RAP缀合物来治疗肝脏疾病将解决与肝脏疾病治疗相关的几个问题，如，肝脏对制剂的清除，因为大部分药物在注射后几乎立即被直接递送到肝细胞。此外，因为RAP缀合物将会通过LRP1来被胞吞，质膜(MDR，P-糖蛋白)中的药物抵抗机制将被绕开。

ii.LRP2选择的RAP肽

现已表明LRP2在脑毛细血管内皮表达，其介导apoJ到脑实质的运输(Lundgren，等人，(1997)J Histochem Cytochem 45，383-392；Zlokovic，等人，(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93，4229-4234；Shayo，等人，(1997)LifeSci 60，PL115-118)。以比其它LDLR更高的亲和力选择性结合LRP2的本发明的RAP环肽及其缀合物，被期望提高脑内的分布。例如，GDNF已被证明促进帕金森病人黑质纹状体神经元的存活和生长(Lin，等人，(1993)Science 260，1130-1132)。然而，GDNF本身并不能穿过脉管系统进入脑部。LRP2选择的RAP肽与GDNF融合将预期提高GDNF在脑内的分布。

iii.VLDLR选择的RAP肽

相似的，现已表明VLDLR表达于脑毛细血管内皮，并介导脂蛋白脂肪酶跨过主动脉内皮的运输(Wyne，等人，(1996)Arterioscler Thromb VascBiol 16，407-415；Obunike，等人，(2001)J Biol Chem 276，8934-8941)。选择性与VLDLR结合的本发明的RAP环肽及其缀合物预期提高脑内的分布。VLDLR也通过介导吸收多余的游离脂肪酸(FFA)到血管巨噬细胞来参与泡沫细胞的形成。(Hiltunen，等人，(1998)Circulation 97，1079-1086；Qu，等人，(2004)J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci 24，1-4，8)。本发明选择地与VLDLR结合的RAP环肽及其缀合物被期望用于阻断脂蛋白颗粒和巨噬细胞间的联系，从而抑制泡沫细胞形成。RAP环肽及其缀合物也被期望限制FFA从循环脂蛋白进入脂肪细胞的转移，减慢易感个体肥胖的进程(Goudriaan，等人，(2001)Arterioscler Thromb Vasc Biol 21，1488-1493；Goudriaan，等人(2004)J Lipid Res 45，1475-1481；Tacken，等人，(2001)Curr Opin Lipidol 12，275-279；Yagyu，等人，(2002)J Biol Chem 277，10037-10043)。VLDLR在肌肉内皮管腔表面的高水平表达联合VLDLR在肝脏的低水平表达，被期望在静脉注射后驱动RAP环肽及其缀合物分布到肌肉组织。对肌肉组织具有治疗效果的制剂可结合VLDLR选择性的RAP环肽上来提高该制剂在肌肉组织的分布。

iv.与肿瘤和转移瘤关联的含CR蛋白

至少三个含CR的蛋白，LRP5、LRP6和ST14(TADG-15)的过量表达独立地与增加的致瘤性或致癌作用相关联(Li，等人，(2004)Oncogene 23，9129-9135；Hoang，等人，(2004)Int J Cancer 109，106-111；Tanimoto，等人，(2005)Br J Cancer 92，278-283；Santin，等人，(2004)Int J Cancer 112，14-25；Santin，等人，(2003)Cancer 98，1898-1904；Tanimoto，等人，(2001)Tumour Biol 22，104-114)。与这些蛋白选择性结合的本发明RAP环肽或其缀合物将被期望提供减小这些蛋白致瘤影响的手段。RAP环肽可直接干扰含CR蛋白的功能。另外，所述RAP环肽可与治疗癌症的制剂缀合来靶向递送其到过量表达含CR蛋白的组织。例如，matriptase(MT-SP1，ST14，TADG-15)在多种上皮肿瘤(癌)中过量表达(25-33)。

在肝细胞活化抑制剂1促进的反式激活作用后，matriptase直接或通过激活其他蛋白酶降解细胞外基质成分来促进肿瘤生长和转移，其他蛋白酶如，尿激酶血浆酶原激活剂(uPA)，其导致基质降解活动(26，34，35)。已有提示表明在matriptase(ST14)胞外结构域中的邻近CR阵列的蛋白酶结构域提高了过量表达matriptase(ST14)细胞的侵润性和致瘤性。matriptase通过II型跨膜结构域的N末端锚定在上皮细胞膜的侧面或底侧面(Pfistermueller，等人(1996)FEBS Lett 396，14-20)。包埋在膜内的序列在蛋白C末端连接一个细胞外SEA结构域，两个CUB结构域，四个CR结构域以及胰蛋白酶结构域。Matriptase中的CR序列突变导致所得到的蛋白酶突变体活化失败(Qiu，等人(2003)Neuroscience 122，291-303)。相似地，结合到matriptase第三CR结构域的抗体阻断所述酶的活化(Basu，等人(2001)Immunity 14，303-13)。与包含第三CR结构域的matriptase的两对CR对中一对具有亲和力的RAP环肽被期望用于干扰蛋白水解的活化，其方式与已观察到的抗体对这一区域的抑制相似。这样的RAP肽将被期望减小在受影响组织的matriptase过量表达的转移和致瘤效应。含有matriptase选择性的RAP环肽以及蛋白酶抑制剂的缀合物也期望用于特异地阻断涉及其蛋白水解活性的matriptase的效应。

LRP6选择性的RAP环肽可被设计通过诱导LRP6胞吞或干扰LRP6介导的Wnt信号转导活动来下调肿瘤细胞上的LRP6。相似地，缀合了治疗制剂(如，癌症化疗药物)或诊断制剂的LRP6选择性RAP环肽可用于靶向递送到过量表达LRP6的组织。

V.LRP5选择性RAP肽和骨疾病

通过LRP5增强Wnt信号传导已被证明增加了造骨细胞的分化，抑制破骨细胞的活动，并提高了骨的沉积(Westendorf，等人，(2004)Gene 341，19-39；Zhang，等人，(2004)Mol Cell Biol 24，4677-4684)。通过造骨细胞特异的APC(结肠腺瘤息肉病)敲除小鼠和对DKK(Dickkopf)-1和硬骨素(sclerostin)介导的抑制敏感的LRP5突变体，这一信号传导机制已得到确认(Zhang，等人，(2004)Mol Cell Biol 24，4677-4684；Holmen，等人，(2005)J Biol Chem)。LRP5特异的RAP环肽通过结合抑制剂或通过其他方式增强Wnt信号传导(如，不阻断Wnt结合而稳定LRP5)，将被预期具有相似的效果。例如，对两个LRP5 CR对中任一个特异的RAP环肽与β推进伴侣蛋白Mesd融合将被期望通过LRP5干扰DKK-1介导的Wnt信号传导的拮抗作用(Hsieh，等人，(2003)Cell 112，355-367；Herz，等人，(2003)Cell112，289-292)。干扰LRP5抑制的这些RAP环肽(如，减少DKK-1结合至或LRP5抑制)及其缀合物预期在骨质疏松症或其他与造骨活性减少和/或破骨活性增加相关的疾病的治疗中具有治疗效果。相似地，通过LRP5抑制Wnt信号传导的RAP环肽预期在造骨活性增加相关的疾病的治疗中具有治疗效果，如，骨硬化病。

vi.FDC-8D6选择性RAP肽

FDC-8D6抗原(CD320)有一对这样的结构域并在淋巴滤泡B细胞分化中起重要作用(36，37)。

非霍奇金淋巴瘤(NHL)包括一类称为B细胞的免疫细胞的增殖和结外迁移。NHL是年龄为20岁到39岁之间的男性主要致死性癌症。已有研究表明FDC-8D6抗原蛋白(CD320)促进肿瘤B细胞的生长(36，37)。8D6抗原含有一个单一的CR结构域对。试剂，如RAP环肽，其结合并阻断8D6的功能，并期望减慢人非霍奇金淋巴瘤的病情发展。

B.治疗

能够通过施用本发明的RAP环肽或缀合物治疗的特定疾病病变，其依据含CR蛋白靶向类型和能够存在于缀合物中的药物部分变化。因此，疾病病变包括细胞增殖性疾病，如，肿瘤疾病、自身免疫疾病、心血管疾病、荷尔蒙异常疾病、退行性疾病、老化病，中枢神经系统疾病(如，阿尔茨海默病、癫痫病、高血脂)、精神疾病和病变(如，精神分裂症、情绪紊乱，如抑郁和焦虑)、感染性疾病、酶缺乏症、之前所述的那些溶酶体贮积症等等。

治疗意味着包括使施用缀合物相关的个体产生的任何有益效果，包括降低获得疾病的可能性，预防疾病，减慢、停止或逆转疾病的进程，或改善给宿主带来痛苦的疾病的相关症状，此处所述的改善或有益广义上指至少一个参数数值的减小，如，治疗的病理病变相关的症状(如，与之相关的发炎和疼痛)。同样地，治疗也包括病理状况或至少相关症状被完全抑制的情形，如，预防发生或停止，如，终止，以使宿主不再遭受病理病变，或至少病理病变的特征性症状。

i.溶酶体贮积症

在一些实施方式中，经治疗的疾病是溶酶体贮积症，所述缀合物作为本发明的药物组合物以足以减少所述哺乳动物脑组织中贮存的颗粒数量的有效剂量施用。典型地，这一疾病的症状通过以下监测：常规的病史评估、身体检查、超声心动图、心电图、磁共振成像、多道睡眠描记术、骨骼检查、活动度测量、角膜照片、皮肤活组织检查。对这种疾病施用RAP环肽或其缀合物可使所述个体的发展延缓或衰退正常化，减轻高压脑积水，减轻所述个体的脊髓压迫，并减少所述个体脑血管周围血管周囊泡的数量和/或大小。监测和评估这一结果的方法对本领域技术人员而言是已知的。对这个结果的其他描述，本领域技术人员参见美国专利6,585,971；美国专利6,569,661和美国专利6,426,208以及美国专利公开号20040009906。

在优选的实施方式中，动物患有I型粘多糖贮积病并有50％或更少的正常α-L-艾杜糖苷酸酶活性。在这些实施方式中，预期如每周一次施用约0.001mg/kg体重到0.5mg/kg体重之间的有效剂量的人α-L-艾杜糖苷酸酶作为缀合物的一部分给患有这一疾病的个体。在其他实施方式中，每周一次给所述个体施用哺乳动物的约0.01mg/15cc CSF到约5.0mg/15cc CSF之间的剂量的所述人α-L-艾杜糖苷酸酶。本文所述的治疗包括促进患有溶酶体贮积症病人的脑细胞中粘多糖(GAG)的分解。这些脑细胞可以是神经元、神经胶质细胞、室管膜细胞。典型地，颗粒堆积发生并可通过使用本发明的缀合物来改善的脑细胞包括神经元、胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、血管周细胞、外皮细胞、脑膜细胞、室管膜细胞、蛛网膜颗粒细胞、蛛网膜、硬膜、软膜以及脉络丛细胞。优选实施方式中的治疗与没有施用所述缀合物的相似细胞中的溶酶体贮积颗粒的数量相比，其减少了脑膜细胞中贮积颗粒的数量。在一些个体中这产生了减轻高压脑积水症状的治疗效果。并且，所述的施用减少了所述个体脑膜组织中CSF液体的量。

可用本发明的缀合物治疗的溶酶体贮积症的非限定性实施例包括I型粘多糖贮积病，II型粘多糖贮积病亨特综合征，IIIA型粘多糖贮积病桑菲利波综合征，IIIB型粘多糖贮积病桑菲利波综合征，IIIC型粘多糖贮积病桑菲利波综合征，IIID型粘多糖贮积病桑菲利波综合征，IVA型粘多糖贮积病莫基奥综合征，IVB型粘多糖贮积病莫基奥综合征，VI型粘多糖贮积病，VII型粘多糖贮积病斯莱综合征，IX型粘多糖贮积病，天冬氨酰葡萄糖胺尿症，胆固醇脂贮积病/沃尔曼病，胱氨酸病，Danon病，法布里病，法伯脂肪肉芽肿病/法伯病，岩藻糖苷贮积症，I/II型半乳糖涎酸贮积病，I/IIIII型高切尔病，球形细胞脑白质营养不良/克拉伯(Krabbe)病，II型糖原贮积病/庞皮病，I/II/III型GM1-神经结苷脂贮积病，I型GM2-神经结苷脂贮积病/泰-萨病，II型GM2-神经结苷脂贮积病桑德霍夫病，GM2-神经结苷脂贮积病，I/II型α-甘露糖苷贮积症，β-甘露糖苷贮积症，异染性脑白质营养不良，异染性脑白质营养不良，粘脂贮积症I型/涎酸贮积症I/II，II/III型粘脂贮积症I型-细胞病，III型粘脂贮积症假胡尔勒多种营养不良，多发性硫酸酯酶缺乏症，神经细胞蜡样脂褐素病，CLN1巴滕病，神经细胞蜡样脂褐素病，CLN2巴滕病，A型尼曼-皮克病/B型尼曼-皮克病，C1型尼曼-皮克病尼曼-皮克病，C2型尼曼-皮克病尼曼-皮克病，致密成骨不全症(Pycnodysostosis)，I型施德勒病(Schindler disease)/II型施德勒病或涎酸贮积症。

ii.神经紊乱

在其他实施方式中，接受治疗的疾病是神经疾病，缀合物作为药物组合物以足以预防、处理或治疗这些神经疾病的有效剂量施用。神经疾病包括但不限于阿尔茨海默病，帕金森病，多发性硬化，肌萎缩侧索硬化，其他脱髓鞘相关疾病，中枢神经系统癌症，创伤性脑损伤，脊髓损伤，中风或脑缺血，斑样硬化，脑脉管炎，癫痫症，亨廷顿病，图雷特综合征，吉-巴综合征，威尔逊病，皮克病，神经炎性疾病，脑炎，脑脊髓炎或病毒性、真菌或细菌性脑膜炎，或其他中枢神经系统感染，朊蛋白疾病，小脑共济失调，小脑变性，脊髓小脑变性综合征，弗里德赖希共济失调，毛细血管扩张性共济失调，脊髓肌萎缩，进行性核上麻痹，肌张力异常，肌肉强直，震颤，视网膜色素变性，老年痴呆，皮层下痴呆，动脉硬化痴呆，AIDS关联痴呆，或其他痴呆，纹状体黑质变性，线粒体脑肌病，神经细胞蜡样脂褐素病，中枢神经系统引起的溶酶体贮积紊乱，脑白质营养不良，尿素循环缺陷疾病，肝性脑病，肾性脑病，代谢性脑病，卟啉病，神经毒性物质中毒，放射诱导的脑损伤，或精神疾病，如，精神异常，焦虑，抑郁，注意力分散，记忆障碍，认知障碍，食欲障碍，肥胖，成瘾，倾向或药物依赖。

阿尔茨海默病

在一个优选的实施方式中，被治疗的疾病是阿尔茨海默病，该病与受影响病人脑内40-42氨基酸肽的淀粉样β蛋白(Aβ)水平增高有关(Selkoe，等人(1996)J Biol Chem 271，18295-18298)。随着一系列连续的蛋白酶水解的2产生，Aβ寡聚化并最终堆积在神经间隙形成不可溶斑块。体内及体外试验证明可溶及不可溶的形式的Aβ均有神经毒性(Zerbinatti，等人，(2004)ProcNatl Acad Sci USA 101，1075-1080；Tsai，等人，(2004)Nat Neurosci；Schmitz，等人(2004)Am J Pathol 164，1495-1502；Gong，等人(2003)Proc Natl Acad Sci USA 100，10417-10422；Bard，等人(2000)Nat Med 6，916-919；Schenk，等人(1999)Nature 400，173-177；Hsia，等人(1999)ProcNatl Acad Sci USA 96，3228-3233)。可溶Aβ单体及其低聚体被证明通过抑制长时程电位可逆地诱导记忆缺陷(Gong，等人(2003)Proc Natl Acad SciUSA 100，10417-10422)。

Aβ是淀粉前体蛋白或APP的蛋白水解片段，一种功能尚未确定的细胞表面膜蛋白。Aβ的形成由神经分泌途径或通过LRP1(LDLR受体家族成员之一)的APP胞吞启动(Cam，等人，(2004)J Biol Chem 279，29639-29646)。一旦到达内体系统，APP即被β位点APP裂解酶或BACE(一种膜蛋白酶)裂解。BACE在671位点切割APP，恰好是跨膜结构域的N末端。然后APP保留下来的部分被三种蛋白的联合体(早老蛋白-1，早老蛋白-2和呆蛋白，构成了γ-分泌酶联合体)再次切割(Xia，等人(2003)J Cell Sci 116，2839-2844)。早老蛋白在脂质双分子层内部小叶内对底物进行切割。在APP的跨膜结构域内，γ-分泌酶切割步骤发生在711和713位点之间。γ-分泌酶切割释放Aβ，Aβ保留在神经元内或分泌到细胞外间隙。在任何一个部位对神经元都是具有毒性的(Casas，等人(2004)Am J Pathol 165，1289-1300)。

通过β和γ分泌酶连续切割APP被定义为淀粉样生成(amyloidogenic)途径。一交替性途径控制正常脑组织。通过受体脱落释放APP的整个胞外域，蛋白水解过程通过α分泌酶催化。释放的胞外域被定义为sAPPα，并且已被证明具有保护神经和增强记忆的效果(Furukawa，等人(1996)JNeurochem67，1882-1896；Meziane，等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95，12683-12688)。在非淀粉样生成途径中，APP胞外域释放是关键的事件。在淀粉样生成过程中，蛋白水解发生在变为Aβ的APP区域内的688位点(Allinson，等人(2003)J Neurosci Res 74，342-352)。因此，淀粉样生成和非淀粉样生成途径是相互排斥的。sAPPα的释放通过α分泌酶ADAM10(也是一种膜结合蛋白酶)催化(Fahrenholz，等人(2000)Ann N Y Acad Sci 920，215-222)。ADAM10是解联蛋白和金属蛋白酶，是“脱落酶”酶家族的一部分，包括Notch裂解酶(Kuzbanian)和TNF-α前体裂解酶(TACE，ADAM17)。ADAM10已被发现是造成BACE胞外脱落的原因(Hussain，等人(2003)JBiol Chem 278，36264-36268)。

像其它ADAM家族成员一样，ADAM10有N端的前结构域(prodomain)，催化酶结构域，解联蛋白结构域，跨膜结构域以及胞质尾巴。前结构域与催化结构域紧密结合，是酶正确折叠的必要条件。这一结合也使前结构域中的半胱氨酸可逆地结合激活部位的锌原子，当其转运分泌途径时屏蔽酶的水解活性。一旦到达转运高尔基体，组成型分泌途径中的前蛋白(proprotein)转换酶弗林蛋白酶(Furin)识别ADAM10的残基211-214(RKKR)，切割掉前结构域，表现出酶的蛋白水解活性。

以通过ADAM10释放sAPPα为代价来增加通过β和γ分泌酶释放的Aβ，被认为是阿尔茨海默病的基础。在进行大量的程序来开发BACE的药理学抑制剂或γ分泌酶复合物，以转移APP使其从淀粉样生成途径中被加工清除。一个补充途径是通过增加脑间质α分泌酶的水平来消耗Aβ，增加sAPPα产生。动物模型中APP蛋白水解过程的不平衡已经通过适当地补充具体的神经蛋白酶(ADAM10)内生水平来得到矫正。增加脑内ADAM10水平的好处已经在阿尔海默小鼠模型中被证实(Postina，等人(2004)J ClinInvest 113，1456-1464；Lichtenthaler，等人(2004)J Clin Invest 113，1384-1387)。业已发现脑内ADAM10水平的轻度增加可预防疾病的表型。

本发明预期基于静脉施用RAP环肽与ADAM10的融合物来治疗阿尔茨海默病。一个优选的实施方式是，治疗阿尔茨海默病的方法，其包括施用ADAM10-RAP环肽缀合物病提高脑α分泌酶的活性，其中所述施用是通过静脉内或颈动脉内或鞘内施用。α分泌酶水平提高反过来预期转移淀粉样生成途径中的APP加工。sAPPα产量增加及其必然的结果，产生的Aβ减少，被预测对于阿尔茨海默病人有治疗效果。或者，本发明涵盖了阿尔茨海默病的治疗，其包括施用RAP环肽与其它作用于APP或Aβ的蛋白酶，或与β分泌酶的抑制剂，或与γ分泌酶抑制剂的融合物。

在一相关方面，本发明涵盖了通过使用主要附加的ADAM10-RAP融合物来使经静脉注射的活化的脱落酶的外周效应最小化。完整的pro-ADAM10-RAP可通过弗林蛋白酶抑制剂和α1抗胰蛋白酶Portland共表达，从标准的生产线分离(Srour，等人(2003)FEBS Lett 554，275-283；Benjannet，等人(1997)J Biol Chem 272，26210-26218)。然后在转胞吞过程中，或在到达脑间隙时，通过移除清除至组织之后的前结构域活化所述融合物。在转胞吞过程中，因为与LRP相关，因此融合物变得与膜相关。所述融合受体复合物则在内涵体内转运细胞。早期的体内及体外研究表明在转胞吞过程中，转运中一些蛋白质部分被蛋白酶水解(Lisi，等人(2003)JEndocrinol Invest 26，1105-1110)。内吞的ADAM10-RAP缀合物无论是在最初的内吞至内皮细胞还是在最终的内吞进入神经元，都会在早期内涵体中将融合物暴露至弗林蛋白酶(Mayer，等人(2004)J Histochem Cytochem 52，567-579；Bosshart，等人(1994)J Cell Biol 126，1157-1172；Rohn，等人(2000)J Cell Sci 113(Pt 12)，2093-2101)。一种可选择的延迟ADAM10活化的途径是，用对ADAM敏感的肽连接体替换连接前结构域和催化结构域的对弗林蛋白酶敏感的肽连接体。达到修饰的前结构域在生产线中被裂解的程度时，该反应可通过含氧肟酸抑制剂培养或通过共表达TIMP1或TIMP3来抑制(Amour，等人(2000)FEBS Lett 473，275-279)。然而在外周中RAP融合物的半衰期很短，对ADAM敏感的pro-ADAM10-RAP融合物的堆积，将会导致所述融合物对空隙中神经元表面内生活化的ADAM10的暴露。每一个活化的ADAM10-RAP融合物随后活化更多ADAM10-RAP，那么可预测蛋白酶水解连锁反应。用甘露醇颈动脉内共注射和鞘内注射可不需要非活化的ADAM10。

本发明涵盖的其他的神经疾病描述如下。如，以震颤和运动神经元功能下降、僵直和丧失运动为特征的帕金森病。这些神经症状主要因黑质纹状体即黑质纹状体束主要传出投射的机能失常导致的。多巴胺能系统中的神经元胞体是PD疾病发展中涉及的主要细胞。原发性帕金森综合征包括，帕金森病(PD)，进行性核上麻痹(PSP)，和纹状体黑质变性(SND)，其包括橄榄体脑桥小脑变性(OPCD)和夏-德综合征SDS)(其已知症状是多系统萎缩MSA)。

肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)通常也称为“洛盖赫里格”病，是一种攻击脑和脊髓的运动神经元的进行性神经退行性疾病。ALS中运动神经元的进行性退变最终导致其死亡，使得脑启动和控制肌肉活动的能力下降。

亨廷顿病(HD)，虽然是一种遗传性疾病，但导致了纹状体中间棘状GABA能神经元的退变(Hickey等人，Prog Neuropsychopharmacol Biol6Psychiatry.27：255-65，2003)。这一退变引起行动失控、智力下降以及情绪障碍。

多发性硬化(MS)是一种多发于年轻人的致残的疾病。该病较典型的表现是炎症反应，可能是自身免疫型炎症反应，以及通常与中枢神经系统的少突胶质细胞和髓磷脂形成细胞缺失关联的脱髓鞘。目前可利用的治疗手段集中于MS的炎症因子，但是对髓鞘形成的效果甚微，如果有效果的话。

本发明的组合物用于治疗脑部肿瘤。最常见的脑肿瘤是起源于胶质组织的胶质瘤。星形细胞瘤起源于一种被称为星形胶质细胞的小的星形细胞，大多数发生于成年大脑。III级星形细胞瘤有时称为间变型星形细胞瘤。IV级星形细胞瘤通常被称为多形性胶质母细胞瘤。脑干胶质瘤发生在脑最低的杆样部分。脑干控制着很多重要的功能。大部分脑干胶质瘤是高分化星形细胞瘤。室鼓膜瘤通常发生在脑室内层，也可发生在脊髓。少突胶质细胞瘤发生于产生髓磷脂的细胞，其包裹的脂肪保护神经。这些肿瘤通常发生于大脑，它们生长缓慢，通常不会扩散到周围脑组织。成神经管细胞瘤发生在较原始的神经细胞，这些细胞通常在个体出生后不再保留。因为这一原因成神经管细胞瘤通常被称为原始的神经外胚层瘤(PNET)。大多数成神经管细胞瘤发生于小脑，然后，它们也可发生于其它区域。脑膜瘤发源于脑膜，它们通常是良性的。因为这些肿瘤生长非常缓慢，脑组织可调整适应它们的存在；脑膜瘤在其产生症状前通常生长得较大。神经鞘瘤是发生于施旺氏细胞的良性肿瘤，施旺细胞产生髓磷脂保护听神经。听神经瘤是神经鞘瘤的一种类型。颅咽管瘤发生于脑垂体腺靠近视丘下部，通常为良性。然而，有时认为它们是恶性的，因为它们会压迫或破坏视丘下部，影响重要功能。生殖细胞瘤起源于原始的性细胞，或生殖细胞。脑部最常见的生殖细胞肿瘤是生殖细胞瘤。松果体区瘤发生在松果腺或其周围。这一肿瘤可以是缓慢生长的松果体细胞瘤或快速生长的成松果体细胞瘤。松果体部位很难触及，因此这些肿瘤通常不能清除。

对脑部肿瘤的治疗取决于很多因素。包括类型、部位和肿瘤的大小以及病人的年龄和健康程度。通常脑部肿瘤通过外科手术、放疗和化疗来治疗。在一个方面，本发明提供了一种抑制成神经瘤细胞和神经肿瘤生长和发展的方法，其包括对患有成神经细胞瘤或神经肿瘤的病人施用含RAP环肽的组合物。另一方面，所述RAP环肽可与对治疗神经瘤有用的制剂缀合。

GDNF

在另一优选的实施方式中，本发明预期治疗神经退行性疾病的方法，其包括施用与神经生长因子(如，胶质细胞源性神经营养因子(GDNF))缀合的RAP环肽。这些神经退行性疾病包括但不限于帕金森病。GDNF最初从大鼠的胶质瘤细胞系上清液中纯化而来，作为胚胎中脑多巴胺能神经元的营养因子。在体内，GDNF同型二聚体与其受体GFRα-1(可能也是一个二聚物)结合，然后GDNF-GFRα-1复合物与Ret蛋白结合，使其二聚体化。Ret的二聚体化导致酪氨酸1062自磷酸化。研究表明GDNF对其他神经亚群有着显著的影响。因为GDNF保护帕金森病动物模型中的多巴胺神经元，并在体内挽救运动神经元，因此GDNF期望用来作为治疗几种神经退行性疾病的治疗制剂。然而，GDNF不能穿过血脑屏障。本发明提供了转运GDNF跨过血脑屏障的方法，其包括使用缀合至GDNF的RAP环肽。

iii肝脏疾病

使用本发明RAP环肽或其缀合物治疗的肝脏疾病，包括但不限于以下讨论的那些疾病。肝细胞瘤或肝脏肿瘤是世界第五大最常见的癌症，其发生率稳步上升。肝细胞瘤是一种肝细胞疾病。致瘤性肝细胞保持着高水平的LRP1表达。肝细胞瘤对化疗反应不是很好，因为肿瘤细胞表现出高度的抗药性，并且因为系统性(静脉给药)给药化疗有严重的毒性，尤其对心脏和肾脏。

肝炎是肝脏炎症的一般术语。肝炎可是急性或慢性的并包括急性或慢性肝衰竭，如，因为病毒(如，肝炎病毒A，B，C，D，或E，或非ABCDE，CMV(巨细胞病毒)，Epstein-Barr病毒)，真菌，里克次氏体属微生物，或寄生虫感染，酒精，化学毒素，药物(如，对乙酰氨基酚，胺碘酮，异烟肼，氟烷，氯丙嗪，红霉素)，代谢性肝病(如，威尔逊病，α1-抗胰蛋白酶缺乏症)，癌症，先天自身免疫疾病，肝硬化(如，原发性胆汁肝硬化)，胆道堵塞等引起。肝脏感染A，B或C型肝炎病毒可引起导致肝衰竭的缓慢进展的肝脏疾病。急性肝炎感染最常见由感染A型肝炎病毒引起。B和C型肝炎病毒可同时感染身体，演变为长时间感染(慢性)。C型肝炎病毒可引起严重的病变，包括肝硬化和癌症。

本发明涵盖的其他肝脏疾病或病变可通过施用缀合至RAP环肽的组合物治疗，其包括肝脂肪变(美国专利6,596,762)，胆汁淤积(美国专利6,069,167)，肝硬化，中毒性肝损伤，肝切除后的病变，胆管阻塞。

能够与RAP环肽缀合来治疗肝脏疾病的候选药物包括但不限于：5-氟尿嘧啶，多柔比星(阿霉素)，丝裂霉素C，顺铂，表柔比星，柔红霉素，依托泊苷以及其他化疗表1中所列的化学药物，阿德福韦，拉米夫定，恩替卡韦，利巴韦林，干扰素α，聚乙二醇化干扰素α-2a，，干扰素α-2b及其他抗病毒剂，维生素E，熊去氧胆酸，以及其他用于治疗肝脏疾病的制剂。

表1

iv.癌症

Matriptase在上皮癌中过量表达，如，卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌或胃癌。其他实施例包括肺间皮瘤、黑色素瘤、非小细胞性肺癌、胶质瘤、肝细胞(肝)瘤、甲状腺癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、子宫内膜癌、肾脏癌症、胰腺癌、非黑色素皮肤癌。RAP环肽可用于抑制matriptase活性，或作为递送细胞毒性或其他癌症治疗试剂的靶向制剂。

已经确定LRP6在结肠和乳腺癌中过量表达。RAP环肽可用于抑制LRP6的活性，或作为递送细胞毒性或其他癌症治疗试剂的靶向试剂。

可使用本发明的RAP环肽或其缀合物治疗的其他癌症还包括伯基特淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤以及白血病。

V，骨代谢疾病

可使用本发明的RAP环肽和缀合物治疗的骨代谢疾病包括与相关的骨的疾病(如，异常骨沉积、异常骨流失或骨弱化(bone weakening))：骨质疏松症，骨骼石化症，骨发炎，关节炎，风湿性关节炎，骨关节炎，皮质醇增多症，性腺机能衰退，原发或继发的甲状旁腺功能亢进，或甲状腺亢进，血钙过多，维生素D缺乏状态(如，佝偻病/骨软化，坏血病，营养不良)，吸收障碍综合征，慢性肾衰(肾性骨营养不良)，慢性肝脏疾病(肝性骨营养不良)，老化，卧床，药物引起的骨质疏松症(糖皮质激素或类固醇，肝磷脂，酒精)或遗传疾病(成骨不全症，高胱氨酸尿症)，骨转移癌，骨髓瘤，骨折，骨移植，纤维结构不良，和/或佩奇病。

C.RAP环肽缀合物及活化剂

RAP环肽和活化剂可通过本领域已知的任何方法结合。它们可生理连接，如，通过共价化学键、物理作用力例如，范德华力或氢键，包囊作用，包埋或其结合。在优选的实施方式中，所述治疗剂与RAP环肽通过共价化学键生理结合。正如，优选的化疗剂含有官能团如，醇、酸、羰基、硫醇或胺基团，用于缀合RAP肽。阿霉素是胺类的，同时也有可能通过羰基来结合。紫杉醇是醇类。不含适合的缀合基团的化疗剂可添加这种基团进一步修饰。所有这些化合物均包括在本发明之内。在有多种治疗剂的情况下，可使用各种缀合物的组合。

在一些实施方式中，共价化学键可直接(没有干扰原子)或间接(通过连接体，如共价连接原子链)连接RAP肽和活化剂。在一些实施方式中，所述RAP肽和所述缀合物的活化剂部分通过RAP肽原子和活化剂的原子之间的共价键直接连接。在其他实施方式中，RAP肽与活化剂部分通过连接体相连，该连接体包含能够将所述RAP肽与所述活化剂部分相连的共价键或差不多任何氨基酸序列或任何分子或原子的肽。

在一些实施方式中，所述连接体包含长度从1至约60，或1至30个原子或更长，2至5个原子，2至10个原子，5至10个原子或10至20个原子的原子链。在一些实施方式中，所述链原子均为碳原子。在一些实施方式中，所述链原子选自C、O、N和S。链原子和连接体可根据其预期溶解度(亲水性)选择，以提供更高可溶性的缀合物。在一些实施方式中，所述连接体提供经受在溶酶体中酶的攻击的官能团。在一些实施方式中，所述连接体提供经受在目标组织或器官中发现的酶的攻击的官能团，并且在受攻击或水解时在所述活化剂和所述RAP肽之间起连接体的作用。在一些实施方式中，所述连接体提供在目标位点发现的条件下(如，溶酶体的低pH)经受水解的官能团。连接体可含有一个或多个这样的官能团。在一些实施方式中，所述连接体的长度足以降低所述一个或两个RAP肽结合位点与活化剂结合位点之间的空间位阻电位(当活化剂较大时)。

如果连接体是共价键或肽，活化剂是多肽，整个缀合物可是融合蛋白。这样的肽连接体可以是任何长度。示范性连接体为约1-50个氨基酸的长度，5至50，3至5，5至10，5至15，或10至30个氨基酸的长度。这样的融合蛋白可通过本领域普通技术人员已知的重组基因工程方法来获得。在一些实施方式中，缀合物的RAP肽部分被制成迅速降解或清除的剂型以便释放活性化合物。在其他实施方式中，连接体在细胞内，或更优选的，在溶酶体环境条件下经受裂解，以从所述RAP肽部分释放或分离活化剂部分。

所述缀合物可含有一个或多个连接在相同RAP肽的活化剂。例如，缀合反应可缀合约1-5，约5，约1-10，约5-10，约10-20，约20-30，约30，或更多的活化剂分子到RAP肽上。这些制剂可作为混合物来使用，或它们可纯化成为特殊的化学计量制剂。本领域的普通技术人员可确定哪一种形式和哪一种化学计量比率是优选的。进一步地，人们期望实现超过一种活化剂可与RAP肽连接，递送一种以上的制剂到所需靶位点或间隔。大多数的活化剂种类可附在相同的RAP肽上，例如，阿霉素-顺铂RAP肽缀合物。因此，缀合物可含有一定化学计量比率并结合超过一种类型的活化剂。这些也可分为纯化的混合物或它们以聚集物使用。

本发明的RAP环肽，或其缀合物，可根据需要修饰来提高稳定性或药物动力学特性(如，通过PEG化)。

可以预见的是本发明的RAP肽可被融合或连接治疗性蛋白，如，胶质细胞来源的神经生长因子(GDNF)，脑源性神经生长因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，以及其他本领域已知的神经营养因子，ADAM10，作用于APP或Aβ的其它蛋白酶，MESD，癌症化疗剂，蛋白酶抑制剂，自身免疫性抗原，促凋亡分子，溶酶体酶，DNA或siRNA。可以预见的是，这些制剂与对含CR蛋白具有改进的亲和力和结合选择性的RAP环肽的融合，可促进跨血脑屏障的运输增加或至其他组织位点的运输增加。在一个方面，可以预见的是在静脉内、皮下、肌肉、心室内、鞘内或脑室内给予所述缀合物后与RAP环肽的缀合引起组织分布的改变或改善缀合物的递送。

本发明进一步提供缀合至RAP环肽导致活化剂药理学活性改变，其通过一个或多个下述效应：增加的效力，对不同于想要的靶受体或组织的受体或组织的结合减少，对想要的靶受体或组织的受体或组织结合增加，到达想要的靶受体或组织的受体或组织的通路增加，改变的体内清除率，以及改变的对蛋白的免疫反应特征。

本发明进一步提供了RAP环肽可缀合治疗性核酸，如DNA或siRNA，以改善所述核酸的组织选择性分布，促进所述核酸胞吞进入细胞(Kim等人，(2004)Bioconjugate Chemistry 15，326-332)。

D活化剂

根据本发明的活化剂包括能够影响生物学过程的试剂。本发明中用于化合物组合物及方法中的具体优选活化剂是治疗试剂，包括药物或诊断试剂。术语“药物”或“治疗试剂”指当施用有效治疗剂量时，具有药理学作用或有益于健康的活化剂。特别首选的试剂是天然存在的生物学试剂(如，酶、蛋白、多核苷酸、抗体、多肽、纳米颗粒、糖蛋白缀合物(glyconjugates))。药物或治疗试剂的例子包括用于预防/诊断/减缓/治疗或治愈疾病或病变的物质。特别预期不引发疾病的试剂。

i.蛋白活化剂

所述活化剂可以是非蛋白或蛋白。活化剂可以是蛋白或酶，或者仍保持着一些、基本上全部、或所有治疗或生物学活性的蛋白或酶的任何片段。在一些实施方式中，蛋白或酶是一种这样的蛋白：如果不表达或产生，或者表达或产生的量基本上减少则会引起疾病，其包括但不限于，溶酶体贮积症。所述蛋白或酶优选来源或得自人或小鼠。

在本发明优选实施方式中，当与RAP环肽缀合的活化剂是蛋白或酶，或其具有这种蛋白或酶的生物活性的片段时，这种活化剂具有与人或哺乳动物的蛋白或酶相应部分氨基酸序列相同的氨基酸序列。在其他的实施方式中，这种缀合物的活化剂部分是对于人类或哺乳动物物种而言是天然的蛋白或酶。在其他实施方式中，这种蛋白或酶，或其片段对这种相应的人或哺乳动物的蛋白或酶天然序列而言是基本上同源的(即在长度至少10，25，50，100，150或200个氨基酸或活化剂全长的氨基酸序列上至少80％，85％，90％，95％，更优选98％，或最优选99％的氨基酸序列相同)。

若所述化合物为蛋白，则所述化合物可为酶，或仍保持一些、基本上全部或全部酶活性的酶片段。在治疗溶酶体贮积病中，所述酶优选是在细胞内发现、且如果不表达或表达或生成大量减少将导致溶酶体贮积病的酶。所述酶优选来自或得自人或小鼠。所述酶优选溶酶体贮积酶，如α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，类肝素-N-硫酸酯酶，α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶，芳基硫酸酯酶A，半乳糖神经鞘氨醇酶，酸性α-葡萄糖苷酶，三肽基肽酶，α-己糖胺酶，酸性神经鞘磷脂酶，β-半乳糖苷酶，或任何其他溶酶体贮积酶。

因此，在一些实施方式中，在治疗人溶酶体贮积症(LSDs)中，所述RAP环肽缀合物包括活化剂蛋白或酶，其在待治疗的个体或患者的溶酶体内是不足的。这些酶包括例如α-L-艾杜糖苷酸酶，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，类肝素-N-硫酸酯酶，α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶，芳基硫酸酯酶A，半乳糖神经鞘氨醇酶，酸性α-葡萄糖苷酶，硫酯酶，己糖胺酶A，酸性神经鞘磷脂酶，β-半乳糖苷酶，和任何其他溶酶体贮积酶。溶酶体贮积症及其缺陷蛋白，这些蛋白用作活化剂，列表如下：

溶酶体贮积症	缺失蛋白
		I型粘多糖贮积病	L-艾杜糖苷酸酶
II型粘多糖贮积病亨特综合征	艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶
		IIIA型粘多糖贮积病桑菲利波综合征	类肝素-N-硫酸酯酶
IIIB型粘多糖贮积病桑菲利波综合征	α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶
		IIIC型粘多糖贮积病桑菲利波综合征	乙酰辅酶A:N-乙酰转移酶
IIID型粘多糖贮积病桑菲利波综合征	N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶
		IVA型粘多糖贮积病莫基奥综合征	半乳糖6-硫酸酯酶
IVB型粘多糖贮积病莫基奥综合征	β-半乳糖苷酶

溶酶体贮积症	缺失蛋白
		VI型粘多糖贮积病	N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶
VII型粘多糖贮积病斯莱综合征	β-葡糖醛酸糖苷酶
		IX型粘多糖贮积病	透明质酸氨基葡糖苷酶
天冬氨酰葡萄糖胺尿症	天冬氨酰氨基葡糖苷酶
		胆固醇脂贮积病/沃尔曼病	酸性脂(肪)酶
胱氨酸病	胱氨酸转运体
		Danon病	Lamp-2
法布里病	α-半乳糖苷酶A
		法伯脂肪肉芽肿病/法伯病	酸性酰胺酶
岩藻糖苷贮积症	α-L-岩藻糖苷酶
		I/II型半乳糖涎酸贮积病	防御蛋白
I/IIIII型高切尔病高切尔病	葡糖脑苷脂酶(β-糖苷酶)
		球形细胞脑白质营养不良/克拉伯病病	半乳糖(基)脑苷脂酶
II型糖原贮积病/庞皮病	α-糖苷酶
		I/II/III型GM1-神经结苷脂贮积病	β-半乳糖苷酶
I型GM2-神经结苷脂贮积病/泰-萨病	β-氨基己糖酶A
		II型GM2-神经结苷脂贮积病桑德霍夫病	β-氨基己糖酶A
GM2-神经结苷脂贮积病	GM2-激活子缺乏
		I/II型α-甘露糖苷贮积病	α-D-甘露糖苷酶
β-甘露糖苷贮积病	β-D-甘露糖苷酶

溶酶体贮积症	缺失蛋白
		异染性脑白质营养不良	芳基硫酸酯酶A
异染性脑白质营养不良	皂草苷B
		黏脂沉积I/涎酸贮积症I/II	神经氨酸酶
黏脂沉积II/III I型-细胞病	磷酸转移酶
		IIIC型黏脂沉积假胡尔勒多种营养不良	磷酸转移酶γ-亚单位
多发性硫酸酯酶缺乏症	复合硫酸酯酶
		神经细胞蜡样脂褐素症CLN1巴滕病	棕榈酰蛋白硫酯酶
神经细胞蜡样脂褐素症CLN2巴滕病	三肽基肽酶I
		A型尼曼-皮克病/B型尼曼-皮克病	酸性神经鞘磷脂酶
C1型尼曼-皮克病尼曼-皮克病	胆固醇运输蛋白
		C2型尼曼-皮克病尼曼-皮克病	胆固醇运输蛋白
致密成骨不全症	组织蛋白酶K
		I型施德勒病/II型施德勒病	α-半乳糖苷酶B
涎酸贮积病	唾液酸转运体

因此，采用本发明的方法可被治疗或预防的溶酶体贮积病包括但不限于粘多糖贮积病I(MPS I)，MPS II，MPS IIIA，MPS IIIB，异染性脑白质营养不良(MLD)，克拉伯病，庞皮病，神经细胞蜡样脂褐素症(CeroidLipofuscinosis)，泰-萨病，A型尼曼-皮克病/B型尼曼-皮克病和其他溶酶体病。

因此，根据上面的表格，就每一疾病而言，所述缀合剂应优选包含在这种疾病中缺失的特异性活化剂酶。例如，对于涉及MPS I的方法，优选的化合物或酶是α-L-艾杜糖苷酸酶。对于涉及MPS II的方法，优选的化合物或酶是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。对于涉及MPS IIIA的方法，优选的化合物或酶是类肝素-N-硫酸酯酶。对于涉及MPS IIIB的方法，优选的化合物或酶是α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。对于涉及异染性脑白质营养不良(MLD)I的方法，优选的化合物或酶是芳基硫酸酯酶A。对于涉及克拉伯病的方法，优选的化合物或酶是半乳糖神经鞘氨醇酶。对于涉及庞皮病的方法，优选的化合物或酶是酸性α-葡萄糖苷酶。对于涉及CLN的方法，优选的化合物或酶是三肽基肽酶。对于涉及Tay-Sachs的方法，优选的化合物或酶是α-己糖胺酶。对于涉及尼曼-皮克病A和B的方法，优选的化合物或酶是酸性神经鞘磷脂酶。

RAP环肽缀合物可包括一个或多个与RAP环肽连接的活化剂部分(如1-10或4-2或2-3部分)。例如缀合反应可为1-4或更多个α-L-艾杜糖苷酸酶分子缀合到单一RAP环肽。这些制剂可以混合物使用，或它们被纯化为特异性RAP环肽-活化剂化学计量制剂。本领域技术人员能确定哪种形式和哪种化学计量比是优选的。此外，为了促进被贮积的底物更加完全降解，一个或多个不同的活化剂可连接到任何给定的RAP环肽分子。这些缀合活化剂的RAP环肽可包括化学计量比的范围。它们也可分成纯化的混合物或以聚集物使用。在融合体内RAP环肽和LSD的次序可能是重要的。因此，在一些实施方式中，所述RAP环肽为N-端结合LSD酶，而在另一些实施例中，所述RAP环肽为C-端结合LSD酶。

这些缀合活化剂的RAP环肽可进入或被转运进入或最终定位于属于或不属于CNS的细胞的溶酶体中。这种缀合试剂的迁移效率可由调控受体转运活性的任何化合物或蛋白调节。这类细胞可来自受溶酶体贮积症影响的任何组织或器官系统。例如这些细胞可为内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、心肌细胞、骨细胞、肺细胞、脂肪细胞、肾细胞或肝细胞。在一些实施方式中，所述细胞优选为在BBB内发现的细胞。在一些实施方式中，所述细胞为神经元或脑细胞。在其他实施方式中，所述细胞为外周的细胞或不能通过内皮组织从全身循环分离的细胞，如BBB中的细胞。

ii.药物活化剂

通常，药物活化剂可为任何大小。优选的药物为能结合于目的靶点的有机小分子。这种缀合物的药物部分为小分子时，常有至少约50D的分子量，通常为至少约100D分子量，其中分子量可为500D大或更大，但通常不超过约2000D。

在上述治疗方法的实施中，所述药物部分可与被给药的宿主内的靶点相互作用。这种靶点为许多种不同类型夫的天然存在的结构，其中目的靶点包括细胞内或细胞外的靶点，其中这些靶点可为蛋白、磷脂、核酸等，其中蛋白是优选的目标。特定的蛋白性的目的靶点包括但不限于酶，如激酶、磷酸酶、还原酶、环氧合酶、蛋白酶等，靶点包含涉及蛋白-蛋白相互作用的结构域，如SH2，SH3，PTB和PDZ结构域，结构蛋白，如肌动蛋白、微管蛋白等，膜受体，免疫球蛋白，如IgE，细胞黏合受体，如整联蛋白等，离子通道，膜转运泵，转录因子，信号蛋白等。

在一些实施方式中，所述活化剂或药物具有羟基或氨基基团以与异氰酸酯试剂反应或活化剂被化学修饰以便引入羟基或氨基基团以与异氰酸酯试剂反应。

在一些实施方式中，所述活化剂或药物包括可被修饰和/或参与共价连接的区域，优选活化剂没有所需的生物活性的丧失。所述药物部分通常包括带有一个或多个的上述官能团取代的碳环或杂环结构和/或芳香或多芳香族结构。另外目的药物部分是可在生物分子、蛋白、酶、多糖和多聚核酸中发现的结构，包括肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或其组合。

合适的活化剂包括但不限于精神药理学试剂，如(1)中枢神经系统抑制药物，例如，全身麻醉药(巴比妥类，苯二氮

类，类固醇类，环己酮衍生物和杂项试剂)，镇静催眠药(苯二氮

类，巴比妥类，哌啶二酮类和三酮类，喹唑啉衍生物，氨基甲酸酯，醛及衍生物，酰胺，无环酰脲，苯丙氮(benzazepines)和相关药物，吩噻嗪等)，中央随意肌张力调节药物(抗惊厥药如乙内酰脲，巴比妥类，噁唑烷二酮，丁二酰亚胺类，无环酰脲(acylureides)，戊二酰亚胺，苯二氮

类，仲醇和叔醇，二苯阿嗪吡丁(dibenzazepine)衍生物，丙戊酸及其衍生物，GABA类似物等)，止痛剂(吗啡及衍生物，东罂粟碱衍生物，吗啡南衍生物，苯基哌啶，2，6-甲烷3-苯杂坐卡因(benzazocaine)衍生物，二苯基丙胺(diphenylpropylamines)和等排物，水杨酸，对氨基苯酚衍生物，5-吡唑啉酮衍生物，芳基乙酸(arylaceticacid)衍生物，芬那酸(fenamates)和等排物等)，以及止吐药(抗胆碱能药物，抗组胺药物，抗多巴胺能药物等)，(2)中枢神经系统兴奋剂，例如，苏醒药(呼吸兴奋剂，惊厥兴奋剂，精神运动兴奋剂)，麻醉药拮抗药(吗啡衍生物，东罂粟碱衍生物，2，6-甲烷3-苯并噁嗪(benzoxacine)衍生物，吗啡南衍生物)促智药(3)精神药理学药物，例如，抗焦虑镇静药物(苯二氮

类，丙二醇氨基甲酸酯)抗精神病药(吩噻嗪衍生物，硫代黄嘌呤(thioxanthine)衍生物，其他三环类化合物，丁酰苯衍生物和等排物，二苯基丁胺衍生物，取代的苯甲酰胺类，芳基哌嗪衍生物，吲哚衍生物等)，抗抑郁药(三环类化合物，MAO抑制剂等)，(4)呼吸道的药物，例如，中枢性镇咳药(鸦片类生物碱及其衍生物)；药效动力学制剂，如(1)周围神经系统的药物，如局部麻醉剂(酯衍生物，酰胺衍生物)，(2)作用于突触或神经感受器接触位点的药物，如胆碱能剂，胆碱能阻断剂，神经肌肉阻断剂，肾上腺素能剂，抗肾上腺素剂，(3)平滑肌活性药物，如解痉药(抗胆碱能药物，向肌性解痉药(musculotropic spasmolytics)，血管扩张剂，平滑肌兴奋剂，(4)组胺和抗组胺药，如组胺和其衍生物(倍他唑)，抗组胺药(H1受体拮抗剂，H2受体拮抗剂)，组胺代谢药物，(5)心血管药物，如强心剂(植物提取物，丁烯羟酸内酯，戊二烯醇(pentadienolids)，来自格木(erythrophleum)属的生物碱，离子载体，肾上腺素受体兴奋剂等)，抗心律失常药物，抗高血压药，降血脂剂(氯贝酸衍生物，烟酸衍生物，激素及类似物，抗生素，水杨酸及衍生物)，抗静脉曲张药，止血剂，(6)血液和造血系统药物例如，抗贫血药品，血液凝固的药物(止血剂，抗凝血剂，抗血栓剂，溶栓剂，血液蛋白及其成分)，(7)胃肠道药物，如助消化剂(健胃药，利胆剂)，抗溃疡药物，止泻剂，(8)局部作用药物；化疗药物，如(1)抗感染药，例如，杀体外寄生虫药(氯化烃，除虫菊素(pyrethins)，硫化化合物)，驱虫药，抗原虫剂，抗疟疾药物，抗阿米巴药，抗利什曼虫药，抗毛滴虫剂，抗锥体虫剂，磺胺药，抗分支杆菌药物，抗病毒化疗药等，(2)细胞生长抑制剂，即抗肿瘤药物或细胞毒类药物，如烷化剂，如氮芥盐酸盐(氮芥，Mustargen，HN2)，环磷酰胺(Cytovan，Endoxana)，异磷酰胺(IFEX)，苯丁酸氮芥(留可然)，美法仑(苯丙氨酸芥，L-溶肉瘤素，爱克兰，L-PAM)，白消安(马利兰)，噻替哌(三亚乙基硫化磷酰胺)，卡氮芥(BiCNU，BCNU)，洛莫司汀(CeeNU，CCNU)，链佐星(Zanosar)等，植物生物碱，如长春新碱(安可平)，长春碱(Velban，Velbe)，紫杉醇(泰素)等，抗代谢药物，如甲氨喋呤(MTX)，巯基嘌呤(巯嘌呤，6-MP)，鸟嘌呤(6-TG)和氟尿嘧啶(5-FU)，阿糖胞苷(Cytosar-U，Ara-C)，氮杂胞苷(Mylosar，5-AZA)等；抗生素，如更生霉素(放线菌素D，Cosmegen)，多柔比星(阿霉素)，柔红霉素(duanomycin，Cerubidine)，去甲氧柔红霉素(Idamycin)，博莱霉素(Blenoxane)，普卡霉素(光神霉素，光辉霉素)，丝裂霉素(自力霉素)等，以及其他抗细胞增殖剂，如羟基脲(羟基脲)，甲基苄肼(Mutalane)，达卡巴嗪(DTIC-Dome)，顺铂(铂)，卡铂(碳铂)，门冬酰胺酶(Elspar)，依托泊苷(VePesid，VP-16-213)，安吖啶(Amsarcrine)(AMSA，m-AMSA))，米托坦(Lysodren)，米托蒽醌(Novatrone)等等。首选化疗药物是那些药物，其以游离形式在所需剂量下表现不可接受的全身毒性。通过与RAP环肽连接，与这些药物的治疗水平相关的总体全身毒性可降低。特别优选的是用于治疗但剂量受心脏毒性限制的心脏毒性化合物。一个典型的例子是阿霉素(也称为多柔比星)及其类似物，如柔红霉素。RAP环肽与这种药物连接可以防止活化剂和相关的心脏毒性在心脏积累。

合适的活化剂包括但不限于：抗生素：如氨基糖苷类抗生素，如阿米卡星，安普霉素，阿贝卡星，班贝霉素，布替罗星，地贝卡星，双氢链霉素，福提霉素，庆大霉素，异帕米星，卡那霉素，小诺米星，新霉素，奈替米星，巴龙霉素，核糖霉素，西索米星，壮观霉素，链霉素，妥布霉素，丙大观霉素；酰胺醇类(amphenicols)，如叠氮氯霉素，氯霉素，氟苯尼考和甲砜霉素(theimaphenicol)；安莎霉素类，如利福酰胺，利福平，利福霉素，利福喷丁，利福昔明；β-内酰胺类，如碳头孢烯类，碳青霉烯类抗生素，头孢菌素，头孢霉素(cehpamycins)，单环β-内酰胺类，氧头孢烯(oxaphems)，青霉素；林可酰胺类抗生素，如氯林肯霉素(clinamycin)，林可霉素；大环内酯类，如克拉霉素，地红霉素，红霉素等；多肽，如安福霉素，杆菌肽，卷曲霉素等；四环素，例如阿哌环素，金霉素，氯莫环素等；合成抗菌剂，如2，4-二氨基嘧啶，硝基呋喃类药物，喹诺酮类及其类似物，磺胺类药，砜；

合适的活化剂包括但不限于：抗真菌剂，如：多烯，如两性霉素B，克念菌素，制皮菌素，菲利平，制霉色基素，曲古霉素，哈霉素，鲁斯霉素，甲帕霉素，纳他霉素，制霉菌素，培西洛星，表霉素；合成抗真菌药物如烯丙基胺类，如布替萘芬，萘替芬，特比萘芬；咪唑类，如联苯苄唑，布托康唑，氯海因，氯苄甲咪唑等，硫代氨基甲酸酯类，例如甲苯硫萘酯，三唑类，如氟康唑，伊曲康唑，特康唑；

合适的活化剂包括但不限于驱蠕虫药，如：槟榔碱，绵马素，绵马酚，双氯酚，酸藤子酚，苦苏素，萘(napthalene)，氯硝柳胺，石榴皮碱，奎纳克林，土木香内酯，阿莫卡嗪，硝硫氰胺，驱蛔素，苄酚宁，双硫氰苯，四氯化碳，香芹酚，环苯达唑，乙胺嗪等；

合适的活化剂包括但不限于：抗疟药，如：二乙酰氨苯砜，酚喹，蒿乙醚，蒿甲醚，青蒿素，青蒿琥酯，阿托伐醌，比比林(bebeerine)，黄连素，基拉策，氯胍，氯喹，氯丙胍，金鸡纳，辛可尼定，辛可宁，环氯胍，龙胆苦苷，氯氟菲醇，羟基氯喹，甲氟喹盐酸盐，3-甲基对乙酰氨基苯胂酸(methylarsacetin)，扑疟喹啉，甲氧胺喹，伯氨喹，乙胺嘧啶，阿的平，奎尼丁，奎宁，喹西特，喹啉，砷酸二钠；

合适的活化剂包括但不限于：抗原虫剂，如：氯甲氧吖胺，替硝唑，异丙硝哒唑，乙睇胺，喷他脒，乙酰胂胺，醋胺硝唑，茴香霉素，硝呋噁酮，替硝唑，联苯唑(benzidazole)，苏拉明等等。

作为活化剂的合适药物也已被列举在：Goodman and Gilman′s，ThePharmacological Basis of Therapeutics(第9版本)(Goodman等编)(McGraw-Hill)(1996)；以及1999 Physician′s Desk Reference(1998)。

合适的活化剂包括但不限于：如下美国专利公开的抗肿瘤药

5,880,161，5,877,206，5,786,344，5,760,041，5,753,668，5,698,529，5,684,004，5,665,715，5,654,484，5,624,924，5,618,813，5,610,292，5,597,831，5,530,026，5,525,633，5,525,606，5,512,678，5,508,277，5,463,181，5,409,893，5,358,952，5,318,965，5,223,503，5,214,068，5,196,424，5,109,024，5,106,996，5,101,072，5,077,404，5,071,848，5,066,493，5,019,390，4,996,229，4,996,206，4,970,318，4,968,800，4,962,114，4,927,828，4,892,887，4,889,859，4,886,790，4,882,334，4,882,333，4,871,746，4,863,955，4,849,563，4,845,216，4,833,145，4,824,955，4,785,085，4,684,747，4,618,685，4,611,066，4,550,187，4,550,186，4,544,501，4,541,956，4,532,327，4,490,540，4,399,283，4,391,982，4,383,994，4,294,763，4,283,394，4,246,411，4,214,089，4,150,231，4,147,798，4,056,673，4,029,661，4,012,448；

如下美国专利公开的精神药理学的/治疗精神病药物：

5,192,799，5,036,070，4,778,800，4,753,951，4,590,180，4,690,930，4,645,773，4,427,694，4,424,202，4,440,781，5,686,482，5,478,828，5,461,062，5,387,593，5,387,586，5,256,664，5,192,799，5,120,733，5,036,070，4,977,167，4,904,663，4,788,188，4,778,800，4,753,951，4,690,930，4,645,773，4,631,285，4,617,314，4,613,600，4,590,180，4,560,684，4,548,938，4,529,727，4,459,306，4,443,451，4,440,781，4,427,694，4,424,202，4,397,853，4,358,451，4,324,787，4,314,081，4,313,896，4,294,828，4,277,476，4,267,328，4,264,499，4,231,930，4,194,009，4,188,388，4,148,796，4,128,717，4,062,858，4,031,226，4,020,072，4,018,895，4,018,779，4,013,672，3,994,898，3,968,125，3,939,152，3,928,356，3,880,834，3,668,210；

如下美国专利公开的心血管药物：

4,966,967，5,661,129，5,552,411，5,332,737，5,389,675，5,198,449，5,079,247，4,966,967，4,874,760，4,954,526，5,051,423，4,888,335，4,853,391，4,906,634，4,775,757，4,727,072，4,542,160，4,522,949，4,524,151，4,525,479，4,474,804，4,520,026，4,520,026，5,869,478，5,859,239，5,837,702，5,807,889，5,731,322，5,726,171，5,723,457，5,705,523，5,696,111，5,691,332，5,679,672，5,661,129，5,654,294，5,646,276，5,637,586，5,631,251，5,612,370，5,612,323，5,574,037，5,563,170，5,552,411，5,552,397，5,547,966，5,482,925，5,457,118，5,414,017，5,414,013，5,401,758，5,393,771，5,362,902，5,332,737，5,310,731，5,260,444，5,223,516，5,217,958，5,208,245，5,202,330，5,198,449，5,189,036，5,185,362，5,140,031，5,128,349，5,116,861，5,079,247，5,070,099，5,061,813，5,055,466，5,051,423，5,036,065，5,026,712，5,011,931，5,006,542，4,981,843，4,977,144，4,971,984，4,966,967，4,959,383，4,954,526，4,952,692，4,939,137，4,906,634，4,889,866，4,888,335，4,883,872，4,883,811，4,847,379，4,835,157，4,824,831，4,780,538，4,775,757，4,774,239，4,771,047，4,769,371，4,767,756，4,762,837，4,753,946，4,752,616，4,749,715，4,738,978，4,735,962，4,734,426，4,734,425，4,734,424，4,730,052，4,727,072，4,721,796，4,707,550，4,704,382，4,703,120，4,681,970，4,681,882，4,670,560，4,670,453，4,668,787，4,663,337，4,663,336，4,661,506，4,656,267，4,656,185，4,654,357，4,654,356，4,654,355，4,654,335，4,652,578，4,652,576，4,650,874，4,650,797，4,649,139，4,647,585，4,647,573，4,647,565，4,647,561，4,645,836，4,639,461，4,638,012，4,638,011，4,632,931，4,631,283，4,628,095，4,626,548，4,614,825，4,611,007，4,611,006，4,611,005，4,609,671，4,608,386，4,607,049，4,607,048，4,595,692，4,593,042，4,593,029，4,591,603，4,588,743，4,588,742，4,588,741，4,582,854，4,575,512，4,568,762，4,560,698，4,556,739，4,556,675，4,555,571，4,555,570，4,555,523，4,550,120，4,542,160，4,542,157，4,542,156，4,542,155，4,542,151，4,537,981，4,537,904，4,536,514，4,536,513，4,533,673，4,526,901，4,526,900，4,525,479，4,524,151，4,522,949，4,521,539，4,520,026，4,517,188，4,482,562，4,474,804，4,474,803，4,472,411，4,466,979，4,463,015，4,456,617，4,456,616，4,456,615，4,418,076，4,416,896，4,252,815，4,220,594，4,190,587，4,177,280，4,164,586，4,151,297，4,145,443，4,143,054，4,123,550，4,083,968，4,076,834，4,064,259，4,064,258，4,064,257，4,058,620，4,001,421，3,993,639，3,991,057，3,982,010，3,980,652，3,968,117，3,959,296，3,951,950，3,933,834，3,925,369，3,923,818，3,898,210，3,897,442，3,897,441，3,886,157，3,883,540，3,873,715，3,867,383，3,873,715，3,867,383，3,691,216，3,624,126；

如下美国专利公开的抗微生物剂：

5,902,594，5,874,476，5,874,436，5,859,027，5,856,320，5,854,242，5,811,091，5,786,350，5,783,177，5,773,469，5,762,919，5,753,715，5,741,526，5,709,870，5,707,990，5,696,117，5,684,042，5,683,709，5,656,591，5,643,971，5,643,950，5,610,196，5,608,056，5,604,262，5,595,742，5,576,341，5,554,373，5,541,233，5,534,546，5,534,508，5,514,715，5,508,417，5,464,832，5,428,073，5,428,016，5,424,396，5,399,553，5,391,544，5,385,902，5,359,066，5,356,803，5,354,862，5,346,913，5,302,592，5,288,693，5,266,567，5,254,685，5,252,745，5,209,930，5,196,441，5,190,961，5,175,160，5,157,051，5,096,700，5,093,342，5,089,251，5,073,570，5,061,702，5,037,809，5,036,077，5,010,109，4,970,226，4,916,156，4,888,434，4,870,093，4,855,318，4,784,991，4,746,504，4,686,221，4,599,228，4,552,882，4,492,700，4,489,098，4,489,085，4,487,776，4,479,953，4,477,448，4,474,807，4,470,994，4,370,484，4,337,199，4,311,709，4,308,283，4,304,910，4,260,634，4,233,311，4,215,131，4,166,122，4,141,981，4,130,664，4,089,977，4,089,900，4,069,341，4,055,655，4,049,665，4,044,139，4,002,775，3,991,201，3,966,968，3,954,868，3,936,393，3,917,476，3,915,889，3,867,548，3,865,748，3,867,548，3,865,748，3,783,160，3,764,676，3,764,677；

如下美国专利公开的抗炎药：

5,872,109，5,837,735，5,827,837，5,821,250，5,814,648，5,780,026，5,776,946，5,760,002，5,750,543，5,741,798，5,739,279，5,733,939，5,723,481，5,716,967，5,688,949，5,686,488，5,686,471，5,686,434，5,684,204，5,684,041，5,684,031，5,684,002，5,677,318，5,674,891，5,672,620，5,665,752，5,656,661，5,635,516，5,631,283，5,622,948，5,618,835，5,607,959，5,593,980，5,593,960，5,580,888，5,552,424，5,552,422，5,516,764，5,510,361，5,508,026，5,500,417，5,498,405，5,494,927，5,476,876，5,472,973，5,470,885，5,470,842，5,464,856，5,464,849，5,462,952，5,459,151，5,451,686，5,444,043，5,436,265，5,432,181，RE034918，5,393,756，5,380,738，5,376,670，5,360,811，5,354,768，5,348,957，5,347,029，5,340,815，5,338,753，5,324,648，5,319,099，5,318,971，5,312,821，5,302,597，5,298,633，5,298,522，5,298,498，5,290,800，5,290,788，5,284,949，5,280,045，5,270,319，5,266,562，5,256,680，5,250,700，5,250,552，5,248,682，5,244,917，5,240,929，5,234,939，5,234,937，5,232,939，5,225,571，5,225,418，5,220,025，5,212,189，5,212,172，5,208,250，5,204,365，5,202,350，5,196,431，5,191,084，5,187,175，5,185,326，5,183,906，5,177,079，5,171,864，5,169,963，5,155,122，5,143,929，5,143,928，5,143,927，5,124,455，5,124,347，5,114,958，5,112,846，5,104,656，5,098,613，5,095,037，5,095,019，5,086,064，5,081,261，5,081,147，5,081,126，5,075,330，5,066,668，5,059,602，5,043,457，5,037,835，5,037,811，5,036,088，5,013,850，5,013,751，5,013,736，5,006,542，4,992,448，4,992,447，4,988,733，4,988,728，4,981,865，4,962,119，4,959,378，4,954,519，4,945,099，4,942,236，4,931,457，4,927,835，4,912,248，4,910,192，4,904,786，4,904,685，4,904,674，4,904,671，4,897,397，4,895,953，4,891,370，4,870,210，4,859,686，4,857,644，4,853,392，4,851,412，4,847,303，4,847,290，4,845,242，4,835,166，4,826,990，4,803,216，4,801,598，4,791,129，4,788,205，4,778,818，4,775,679，4,772,703，4,767,776，4,764,525，4,760,051，4,748,153，4,725,616，4,721,712，4,713,393，4,708,966，4,695,571，4,686,235，4,686,224，4,680,298，4,678,802，4,652,564，4,644,005，4,632,923，4,629,793，4,614,741，4,599,360，4,596,828，4,595,694，4,595,686，4,594,357，4,585,755，4,579,866，4,578,390，4,569,942，4,567,201，4,563,476，4,559,348，4,558,067，4,556,672，4,556,669，4,539,326，4,537,903，4,536,503，4,518,608，4,514,415，4,512,990，4,501,755，4,495,197，4,493,839，4,465,687，4,440,779，4,440,763，4,435,420，4,412,995，4,400,534，4,355,034，4,335,141，4,322,420，4,275,064，4,244,963，4,235,908，4,234,593，4,226,887，4,201,778，4,181,720，4,173,650，4,173,634，4,145,444，4,128,664，4,125,612，4,124,726，4,124,707，4,117,135，4,027,031，4,024,284，4,021,553，4,021,550，4,018,923，4,012,527，4,011,326，3,998,970，3,998,954，3,993,763，3,991,212，3,984,405，3,978,227，3,978,219，3,978,202，3,975,543，3,968,224，3,959,368，3,949,082，3,949,081，3,947,475，3,936,450，3,934,018，3,930,005，3,857,955，3,856,962，3,821,377，3,821,401，3,789,121，3,789,123，3,726,978，3,694,471，3,691,214，3,678,169，3,624,216；

如下美国专利公开的免疫抑制剂：

4,450,159，4,450,159，5,905,085，5,883,119，5,880,280，5,877,184，5,874,594，5,843,452，5,817,672，5,817,661，5,817,660，5,801,193，5,776,974，5,763,478，5,739,169，5,723,466，5,719,176，5,696,156，5,695,753，5,693,648，5,693,645，5,691,346，5,686,469，5,686,424，5,679,705，5,679,640，5,670,504，5,665,774，5,665,772，5,648,376，5,639,455，5,633,277，5,624,930，5,622,970，5,605,903，5,604,229，5,574,041，5,565,560，5,550,233，5,545,734，5,540,931，5,532,248，5,527,820，5,516,797，5,514,688，5,512,687，5,506,233，5,506,228，5,494,895，5,484,788，5,470,857，5,464,615，5,432,183，5,431,896，5,385,918，5,349,061，5,344,925，5,330,993，5,308,837，5,290,783，5,290,772，5,284,877，5,284,840，5,273,979，5,262,533，5,260,300，5,252,732，5,250,678，5,247,076，5,244,896，5,238,689，5,219,884，5,208,241，5,208,228，5,202,332，5,192,773，5,189,042，5,169,851，5,162,334，5,151,413，5,149,701，5,147,877，5,143,918，5,138,051，5,093,338，5,091,389，5,068,323，5,068,247，5,064,835，5,061,728，5,055,290，4,981,792，4,810,692，4,410,696，4,346,096，4,342,769，4,317,825，4,256,766，4,180,588，4,000,275，3,759,921；

如下美国专利公开的免疫调节剂：

4,446,128，4,524,147，4,720,484，4,722,899，4,748,018，4,877,619，4,998,931，5,049,387，5,118,509，5,152,980，5,256,416，5,468,729，5,583,139，5,604,234，5,612,060，5,612,350，5,658,564，5,672,605，5,681,571，5,708,002，5,723,718，5,736,143，5,744,495，5,753,687，5,770,201，5,869,057，5,891,653，5,939,455，5,948,407，6,006,752，6,024,957，6,030,624，6,037,372，6,037,373，6,043,247，6,060,049，6,087,096，6,096,315，6,099,838，6,103,235，6,124,495，6,153,203，6,169,087，6,255,278，6,262,044，6,290,950，6,306,651，6,322,796，6,329,153，6,344,476，6,352,698，6,365,163，6,379,668，6,391,303，6,395,767，6,403,555，6,410,556，6,412,492，6,468,537，6,489,330，6,521,232，6,525,035，6,525,242，6,558,663，6,572,860；

如下美国专利公开的止痛剂：

5,292,736，5,688,825，5,554,789，5,455,230，5,292,736，5,298,522，5,216,165，5,438,064，5,204,365，5,017,578，4,906,655，4,906,655，4,994,450，4,749,792,4,980,365，4,794,110，4,670,541，4,737,493，4,622,326，4,536,512，4,719,231，4,533,671，4,552,866，4,539,312，4,569,942，4,681,879，4,511,724，4,556,672，4,721,712，4,474,806，4,595,686，4,440,779，4,434,175，4,608,374，4,395,402，4,400,534，4,374,139，4,361,583，4,252,816，4,251,530，5,874,459，5，688,825，5,554,789，5,455,230，5,438,064，5,298,522，5,216,165，5,204,365，5,030,639，5,017,578，5,008,264，4,994,450，4,980,365，4,906,655，4,847,290，4,844,907，4,794,110，4,791,129，4,774,256，4,749,792，4,737,493，4,721,712，4,719,231，4,681,879，4,670,541，4,667,039，4,658,037，4,634,708，4,623,648，4,622,326，4,608,374，4,595,686，4,594,188，4,569,942，4,556,672，4,552,866，4,539,312，4,536,512，4,533,671，4,511,724，4,440,779，4,434,175，4,400,534，4,395,402，4,391,827，4,374,139，4,361,583，4,322,420，4,306,097，4,252,816，4,251,530，4,244,955，4,232,018，4,209,520，4,164,514，4,147,872，4,133,819，4,124,713，4,117,012，4,064,272，4,022,836，3,966,944；

如下美国专利公开的拟胆碱剂：

5,219,872，5,219,873，5,073,560，5,073,560，5,346,911，5,424,301，5,073,560，5,219,872，4,900,748，4,786,648，4,798,841，4,782,071，4,710,508，5,482,938，5,464,842，5,378,723，5,346,911，5,318,978，5,219,873，5,219,872，5,084,281，5,073,560，5,002,955，4,988,710，4,900,748，4,798,841，4,786,648，4,782,071，4,745,123，4,710,508；

如下美国专利公开的肾上腺素能剂：

5,091,528，5,091,528，4,835,157，5,708,015，5,594,027，5,580,892，5,576,332，5,510,376，5,482,961，5,334,601，5,202,347，5,135,926，5,116,867，5,091,528，5,017,618，4,835,157，4,829,086，4,579,867，4,568,679，4,469,690，4,395,559，4,381,309，4,363,808，4,343,800，4,329,289，4,314,943，4,311,708，4,304,721，4,296,117，4,285,873，4,281,189，4,278,608，4,247,710，4,145,550，4,145,425，4,139,535，4,082,843，4,011,321，4,001,421，3,982,010，3,940,407，3,852,468，3,832,470；

如下美国专利公开的抗组胺剂：

5,874,479，5,863,938，5,856,364，5,770,612，5,702,688，5,674,912，5,663,208，5,658,957，5,652,274，5,648,380，5,646,190，5,641,814，5,633,285，5,614,561，5,602,183，4,923,892，4,782,058，4,393,210，4,180,583，3,965,257，3,946,022，3,931,197；

如下美国专利公开的甾体试剂：

5,863,538，5,855,907，5,855,866，5,780,592，5,776,427，5,651,987，5,346,887，5,256,408，5,252,319，5,209,926，4,996,335，4,927,807，4,910,192，4,710,495，4,049,805，4,004,005，3,670,079，3,608,076，5,892,028，5,888,995，5,883,087，5,880,115，5,869,475，5,866,558，5,861,390，5,861,388，5,854,235，5,837,698，5,834,452，5,830,886，5,792,758，5,792,757，5,763,361，5,744,462，5,741,787，5,741,786，5,733,899，5,731,345，5,723,638，5,721,226，5,712,264，5,712,263，5,710,144，5,707,984，5,705,494，5,700,793，5,698,720，5,698,545，5,696,106，5,677,293，5,674,861，5,661,141，5,656,621，5,646,136，5,637,691，5,616,574，5,614,514，5,604,215，5,604,213，5,599,807，5,585,482，5,565,588，5,563,259，5,563,131，5,561,124，5,556,845，5,547,949，5,536,714，5,527,806，5,506,354，5,506,221，5,494,907，5,491,136，5,478,956，5,426,179，5,422,262，5,391,776，5,382,661，5,380,841，5,380,840，5,380,839，5,373,095，5,371,078，5,352,809，5,344,827，5,344,826，5,338,837，5,336,686，5,292,906，5,292,878，5,281,587，5,272,140，5,244,886，5,236,912，5,232,915，5,219,879，5,218,109，5,215,972，5,212,166，5,206,415，5,194,602，5,166,201，5,166,055，5,126,488，5,116,829，5,108,996，5,099,037，5,096,892，5,093,502，5,086,047，5,084,450，5,082,835，5,081,114，5,053,404，5,041,433，5,041,432，5,034,548，5,032,586，5,026,882，4,996,335，4,975,537，4,970,205，4,954,446，4,950,428，4,946,834，4,937,237，4,921,846，4,920,099，4,910,226，4,900,725，4,892,867，4,888,336，4,885,280，4,882,322，4,882,319，4,882,315，4,874,855，4,868,167，4,865,767，4,861,875，4,861,765，4,861,763，4,847,014，4,774,236，4,753,932，4,711,856，4,710,495，4,701,450，4,701,449，4,689,410，4,680,290，4,670,551，4,664,850，4,659,516，4,647,410，4,634,695，4,634,693，4,588,530，4,567,000，4,560,557，4,558,041，4,552,871，4,552,868，4,541,956，4,519,946，4,515,787，4,512,986，4,502,989，4,495,102；上述所有公开内容以参考方式并入本申请。

所述缀合物的药物部分可为整个药物或其结合片段或部分，该结合片段或部分保持其亲和力和对目的靶点特异性，同时具有一连接位点以便共价连接载体蛋白配体或连接体。这些药物的缀合物可与药物自身一样用于相同的失调症、疾病和适应证。

iii.优选的肿瘤化疗性化学的活化剂

优选用于本发明的RAP环肽缀合物的肿瘤化疗剂包括可以其游离形式用于治疗在脑内或脑附近的脑瘤或其他瘤形成，或如果其游离形式对这些肿瘤没有效果，而当连接RAP环肽时有效果的所有的药物。这些化疗剂优选为细胞毒性化疗剂，包括但不限于对阿霉素(也称为多柔比星)，顺铂，紫杉醇及其类似物，以及体内外表现抑癌活性的其他化疗剂。这种化疗剂还包括烷化剂，抗代谢药物、天然产物(如长春花生物碱，表叶毒素，抗生素，酶和生物反应调节剂)、拓扑异构酶抑制剂，微管抑制剂，纺锤体毒素，激素及拮抗剂，以及杂项药剂如铂配位络合物，蒽二酮，取代的尿素等，本领域技术人员将了解其他化疗剂。

用于治疗癌症或瘤形成的细胞毒性放射性同位素包括但不限于，¹³¹I(碘)，¹²⁵I，¹¹¹In(铟)，⁹⁰Y(钇)，⁶⁷Cu(铜)，¹²⁷Lu(镥)，²¹²Bi(铋)，²¹³Bi，²⁵⁵Fm(镄)，¹⁴⁹Tb(铽)，²²³Rd(镭)，²¹³Pb(铅)，²¹²Pb，²¹¹At(砹)，⁸⁹Sr(锶)，¹⁵³Sm(钐)，¹⁶⁶Ho(钬)，²²⁵Ac(锕)，¹⁸⁶Re(铼)，⁶⁷Ga(镓)，⁶⁸Ga和^99mTc(锝)，可缀合到本发明所述的RAP环肽。为此目的使用本领域常用的金属螯合剂，该放射性同位素可与多肽连接，该金属螯合剂包括但不限于1，4，7，10-四氮杂环-11-十二烷-N，N’，N”，N’”-四乙酸(DOTA)，1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(TETA)，二乙烯三胺戊-乙酸酯(diethylene triamine penta-acetate)(DTPA)，二巯基琥珀酸(DMSA)，四氮杂环十三烷(tetraazacyclotridecane)-N，N′，N″，N″′-四乙酸(TRITA)，以及1，5，9，13-四氮杂环十六烷(tetraazacyclohexadecane)-N，N′，N″，N″′-四乙酸(HETA)，羟基亚乙基二膦酸酯(hydroxyethylidene diphosphonate)(HEDP)，HEXA，和乙二胺四乙酸(EDTA)的，它们允许将放射性同位素“装载”在多肽上。

优选的化疗剂是那些以其游离形式在所需剂量下表现出不可接受的全身毒性的药物。其通过与RAP环肽连接，与这种药物的治疗水平相关的总体全身毒性降低。特别优选的是用于治疗但剂量受心脏毒性限制的心脏毒性化合物。一个典型的例子是阿霉素(也称为多柔比星)及其类似物，如柔红霉素。这些药物连接RAP环肽可减少在心脏的积聚和伴随的心脏毒性。。

iv.复合糖

复合糖是其中包括碳水化合物部分的任何分子。例子包括但不限于，糖蛋白、寡糖、糖脂质和蛋白多糖。这些分子具有如提高治疗剂的生物利用度的有益功能，或如阻止发病机制的能力。例如，α-L-艾杜糖苷酸酶是一复合糖(糖蛋白)，由于低聚甘露糖7-二磷酸盐决定子吸附这种酶，它可广泛地分布在全身。硫酸肝素是一蛋白多糖的碳水化合物部分，其在人体内用于阻止凝血途径。合适的RAP环肽与带有治疗活性复合糖的连接可通过影响生物分布提供一种增加这种复合糖效力的手段。或者，RAP环肽的复合糖融合体可被设计成作为双特异性受体结合的分子，该分子在特定组织具有直接影响一个或多个受体分子功能的能力。

v.纳米粒

纳米粒是生物可降解的和非生物可降解聚合物构成的或其他材料如脂类构成的大分子集合。这些集合可被设计为在颗粒内的空腔里包含治疗分子。通过这种方式，纳米粒提供了改变药物的生物分布、药代动力学、免疫原性和效力的手段。连接适宜的RAP环肽将反过来提供增加这些分子组织分布特异性的手段。

E.制备RAP环肽的方法

RAP环肽优选通过共价键的形成而环化，这些共价键可通过本领域所描述任何方法形成。在一些实施方式中，所述共价键在肽的N端氨基酸和C端氨基酸之间形成。在一些实施方式中，所述共价键在两末端氨基酸的支链之间形成。在其他实施中，所述共价键在一末端氨基酸的支链和另一末端氨基酸的末端基团之间形成，或每个末端氨基酸的末端基团之间形成。如，头-尾、支链-支链、支链-头、支链-尾均有可能。

自然环化的RAP肽可以通过在目的位点插入2个半胱氨酸并容许这些半胱氨酸自然形成二硫键很容易地设计。甘氨酸或脯氨酸可插入到半胱氨酸内(如C端到最远N端-半胱氨酸和N端到最远C端-半胱氨酸)以使因RA蛋白天然三维结构的共价键导致的任何结构扭曲最小化。

末端氨基和末端羧基基团偶联的头-尾环化可采用许多方法进行，如采用P-硝基苯基酯、叠氮化合法、2，4，5-三氯苯酯和五氟代苯酯，混合酸酐法，碳二亚胺伴有催化剂如HOBt或HONSu或HoAt或HATU，DIC，DCC，或在树脂上的环化。

此外，这种环化结构可用桥连基团、肽的氨基酸残基的支链或肽的末端氨基酸残基形成。桥连基团是一种让肽的两部分得以环化的化学部分。桥连基团的非限定性实例包括酰胺、硫醚、硫酯、二硫化合物、脲、氨基甲酸酯、磺胺类物质等。本领域公知合并具有这些桥连基团的单元的各种方法，。例如，内酰胺桥(例如环酰胺)可通过具有氨基和羧酸的氨基酸的支链而形成，如赖氨酸、鸟氨酸和谷氨酸或门冬氨酸。硫酯可在半胱氨酸残基的C端和支链之间形成。或者，硫酯可通过具有巯基和羧酸的氨基酸的支链之间形成。

或者，可采用结合羊毛硫氨酸(硫二丙氨酸)残基连接通过硫醚键共价连接在一起的丙氨酸残基形成交联。另一种方法中，交联剂，诸如二羧酸，例如软木酸(辛二酸)等，可引入二个氨基酸支链的官能团之间的连接，如游离氨基、羟基、巯基及其组合。

也可采用酶催化的环化。例如，据报道短杆菌酪肽合成酶的硫酯酶结构域可用于环化硫酯前体，枯草杆菌蛋白酶突变体可用于环化肽苯丙氨酰胺羟乙酸酯，以及抗体连接酶16G3可用于催化对硝基苯酯的环化。就肽的环化综述，参见Davies，J.Peptide Sci.，9：471-501(2003)，通过引用将其全文结合到本文中。

F.RAP肽的制备

i.合成

本发明的肽可按照常规技术采用液相固相或液相肽合成技术而合成。多种自动化合成仪是市售的，可按照已知方法使用。参见例如stewart和Young，固相肽合成，第2版，Pierce chemical co.，(1984)；Tam等，J.Am.Chem.soc.105：6442，1983；Merrifield，Science 232：341-347，1986；以及Barany和Metrifield，The Peptides，Gross和Meienhofer编辑，Academic Press，New York，1284；Barany等，Int.J.PeptideProtein Res.30：705-739，1987；Bodanszky，The Principles of PeptideSynthesis，第2版，Springer，New York(1993)；以及Molina等，Pept.Res.9：151-5，1996，美国专利5,424,398，和Fischer等，Journal of PeptideScience 8：529-542，2002，所述每个文献都通过引用结合到本文中。

例如，可采用液相技术如叠氮化物法，酸氯化法，酸酐法，混合酸酐法，活性酯法(如对硝基苯酯，N-羟基丁二酰亚胺酯，或氰甲基酯)，碳二亚胺法，氧化还原法，或二环己基碳二亚胺(DCCD)/添加法。

固相肽合成方法使用含有0.1-1.0mMol胺/g聚合物的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。这些用于肽合成的方法使用α-氨基的丁氧基羰基(t-BOC)或9-芴甲氧基羰基(FMOC)保护。两种方法都涉及分步合成，其中在每个步骤由肽的C端开始加入单个氨基酸(参见coligan等，current Protocols inImmunology，wiley Interscience，1991，第9单元)。在完成化学合成后，通过用酸在降低的温度处理(例如液态HF-10％苯甲醚，在0℃约0.25至约1小时)，所述肽脱去t-BOC或FMOC氨基酸封闭基团，从聚合物上切下。在蒸发试剂后，用1％乙酸溶液将肽从聚合物中萃取出来，然后冻干，得到粗产物。粗产物一般可通过例如在Sephadex G-15上使用5％乙酸作为溶剂进行凝胶过滤的技术来纯化。柱子的适宜馏分冻干将得到均一的肽或肽衍生物，然后其可通过诸如氨基酸分析、薄层层析、高效液相层析、紫外吸收分光光度法、摩尔旋光法、溶解性等标准技术来鉴定，并通过固相Edman降解定量。

液相技术包括可逆地连接聚乙二醇的多肽链的合成装配，是传统的溶液化学和固相化学的混合体。这种方法采用常用于固相肽合成中N-芴甲氧羰基技术和在反复的氨基脱保护步骤中氟离子替代传统的有机碱哌啶而进行。参见Fischer等，Journal of Peptide Science 8：529-542，2002。

ii.宿主细胞

用于制备嵌合蛋白的宿主细胞可是细菌、酵母、昆虫、非哺乳类脊柱细胞或哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞包括但不限于仓鼠、猴子、黑猩猩、狗、猫、牛、猪、小鼠、大鼠、兔、绵羊或人细胞。所述宿主细胞可是永生化细胞(细胞系)或非永生化(原代或二代)细胞，以及可是任何类型的细胞种类，诸如，但不限于成纤维细胞，角质化细胞，上皮细胞(如，哺乳动物上皮细胞、肠上皮细胞)，卵巢细胞(如中国仓鼠卵巢或CHO细胞)，上皮细胞，胶质细胞，神经细胞，血液的有形成分(如淋巴细胞、骨髓细胞)，肌肉细胞，肝细胞和这些体细胞类型的前体。宿主细胞可包括不表达LRP的CHO细胞的突变体，如CHO13-5-1(FitzGerald等人，J.Biol.Chem.，129(6)：1533-41，1995)。

包含和表达编码所述嵌合蛋白的DNA或RNA的细胞在此处是指遗传基因修饰细胞。包含和表达编码所述嵌合蛋白的DNA或RNA的哺乳动物细胞在此处是指基因修饰的哺乳动物细胞。这些DNA或RNA导入细胞可采用公知的转染方法，如电穿孔，显微注射，微粒轰击，磷酸钙沉淀，改良磷酸钙沉淀，阳离子脂质体处理，光穿孔(photoporation)，融合方法，受体介导的转化，或1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)沉淀。或者，这些DNA或RNA可采用病毒载体感染导入。表达编码嵌合蛋白的DNA或RNA的细胞的制备方法，包括哺乳动物细胞，正如美国专利号6,048,729，5,994,129和6,063,630中所描述。这些申请的每一篇的教导以其全文作为参考结合到本文中。

iii.核酸构建体

用来表达嵌合蛋白的核酸构建体可为在转化的哺乳动物细胞的染色体外(游离基因的)表达的核酸构建体或为以随机地或通过同源重组预定的靶点整合进入接受细胞的基因组内的核酸构建体。染色体外表达的构建体包含，除了嵌合蛋白编码序列外，还包含在细胞内足以表达所述蛋白的序列和任选足以复制这些构建体的序列。它典型地包括启动子、嵌合蛋白编码DNA和聚腺苷酸化位点。编码嵌合蛋白的DNA采用它的表达处于启动子的控制之下这样的方式放置于构建体中。任选地，这种构建体可包含额外的诸如一个或多个下列成分：剪切位点、增强子序列、在适当的启动子控制下的选择标记基因，和在适当的启动子控制下的可扩增标记基因。

在那些DNA构建体整合至细胞基因组的实施方式中，它仅需要包含编码嵌合蛋白的核酸序列。任选地，它包括启动子和增强子序列、聚腺苷酸化位点、一个或多个剪切位点、编码一个或多个选择性标记的核酸序列、编码一个或多个的可扩增标记基因和/或接受细胞基因组DNA的DNA同源序列，以靶向所述DNA整合至基因组选定的位点(靶向DNA或DNA序列)。

iv.细胞培养方法

含有编码嵌合蛋白的DNA或RNA的哺乳动物细胞在适宜所述细胞生长和DNA或RNA表达的条件下培养。那些表达所述嵌合蛋白的细胞可采用公知技术和本文所述的技术而鉴定，可采用公知技术和本文所述的技术分离和纯化所述嵌合蛋白，或利用或不利用嵌合蛋白产物的扩增。鉴定可通过如下方法进行，如通过筛选基因修饰的哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞显示出编码嵌合蛋白的DNA或RNA存在的的表型迹象，诸如PCR筛选，Southern印迹分析的筛选，或嵌合蛋白表达分析的筛选。具有合并编码嵌合蛋白的DNA的细胞的选择可通过以下完成：DNA构建体中包含选择性标记和在仅适宜表达选择性标记基因的细胞能存活的条件下培养包含选择性标记基因的转染的或感染的细胞。进而这种导入的DNA构建体的扩增可通过在适宜扩增的条件下培养基因修饰的哺乳动物细胞而被影响(如在存在仅使包含多拷贝可扩增标记基因的细胞存活的药物浓度的条件下培养包含可扩增标记基因的基因修饰的哺乳动物细胞)。

如本文所描述，表达嵌合蛋白的基因修饰的哺乳动物细胞可通过表达产物的检测而被鉴定。例如，其中所述载体为为RAP环肽的表达嵌合蛋白的哺乳动物细胞可采用夹心酶免疫方法来鉴定。抗体可直接导向RAP部分或所述缀合物的活化剂部分。

v.RAP肽的纯化

采用本领域公知技术RAP肽可通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化。参见，如，“The Handbook of Analysis and Purification of Peptides andProteins by Reversed-Phase HPLC”，第3版，Grace Vydac，W.R.Grace &Co.，Columbia，MD(2002)。乙腈和含三氟乙酸的水的梯度混合液常作为洗脱液。通常采用制备的RP-HPLC纯化毫克和克级合成肽，和纯化毫克级到公斤级的用于治疗的重组制备的多肽，。

RAP肽也可如WO 2006/138343(Zankel等人)所述制备和纯化，以其全文作为参考结合到本文中。

RAP肽也可在偶联适当的CR对的琼脂糖珠上采用亲合层析法来纯化。这个技术可单独采用或作为RP-HPLC后的下一步骤。包含CR对或三联体的含有CR的蛋白片段按照下列描述制备。编码每CR对或三联体的DNA片段可采用HotStart

聚合酶和试剂(Stratagene)从人cDNA(BDBiosciences Marathon-

)PCR扩增得到。每种扩增片段连续地采用BamHI和HindIII相继酶切，然后与相似的消化的pET30(+)a(EMDBiosciences)连接。得到的质粒编码由融合至CR片段的N-端六聚组氨酸和S-肽组成的蛋白片段。对所有的表达构建体测序以确定植入片段的完整性。然后将每一质粒用于转化BL21(DE3)CodonPlus-

细胞(Stratagene)。正，所述CR片段如前所述表达和再折叠，并按照制造商的手册(Qiagen)采用Ni-NTA层析纯化。活化的琼脂糖珠AffiGel 15，Bio-Rad)被移入一10mL玻璃化的塑料柱(Pierce)内。小珠采用3倍体积的含5mMCaCl2缓冲液的10mM HEPES，100mM NaCl溶液清洗2次。然后加入CR片段(2.5mg/mL填充珠，含在5倍柱体积相同缓冲液中)，然后混合物在室温下混合孵育过夜。小珠接着用缓冲液清洗直至用Bradford方法检测在洗脱液中没有蛋白存在。小珠储存在20％乙醇中直至使用。TBS中的RAP肽加到已平衡的CR交联珠中1mg/mL填充珠)，然后室温下混合孵育2小时。小珠用相同缓冲液清洗，然后结合肽被含100mM EDTA的TBS洗脱。

G.RAP缀合物的鉴定

i.标记

在一些实施方式中，标记RAP环肽或它的缀合物以便于检测。“标记”或“可检测的部分”是为可通过分光的、光化学的、生化的、免疫化学的、化学的或其他物理方法检测的组合物。例如，适合用于本发明的标记包括，如放射性标记(如32P)，荧光团(如荧光素)，高电子密度试剂，酶(如常用于ELISA)，生物素，地高辛配基，或可制成可检测的半抗原或肽，如通过将放射性标记结合到半抗原或肽，或用于检测与半抗原或肽特异性反应的抗体。

如上所述，依靠所采用的筛选方法，可标记缀合物的活化剂、连接体或RAP环肽部分。只要不显著地干扰缀合物的生物活性，所用的特定的标记或可检测的基团不是本发明关键性的部分。可检测的基团可为任何具有能被检测的物理或化学上的特性的物质。因而标记为可被分光的、光化学的、生化的、免疫化学的、电学的、光学的或化学的方法检测的任何组合物。

适于用于本发明的标记例子包括但不限于荧光染料(如异硫氰酸荧光素，德克萨斯红，罗丹明等)，放射性标记(如³H，¹²⁵I，³⁵S，¹⁴C，或³²P)，酶(如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，和常用于ELISA的其它酶)，以及比色标记诸如胶体金或有色玻璃或塑料珠(如聚苯乙烯，聚丙烯，橡胶等)。

依据本领域的公知方法，标记可与检测的所需成分直接地或间接地偶联。优选地，根据本发明，在一实施方式中的标记采用异氰酸盐试剂与生物聚合物共价结合以缀合活性剂。在本发明的一个方面，本发明的双功能异氰酸盐试剂可用于将标记缀合到生物聚合物，以形成不附着活化剂的标记生物聚合物缀合物。这种标记生物聚合物缀合物可用作合成本发明的标记缀合物的中间体或可用于检测所述生物聚合物缀合物。如上所述，可使用广泛的标记，标记的选择取决于要求的敏感性，与检测方法所需成分易于缀合，稳定性要求可用的仪器和处理规定。非放射性标记常采用间接方法连接。通常，配体分子(如生物素)与所述分子共价结合。这种配体结合另一分子(如链霉抗生物素)，所述另一分子是固有可检测的或是共价结合到一信号系统，如可检测的酶、荧光化合物或化学发光化合物。

所述缀合物也可直接与信号生成化合物缀合，如通过与酶或荧光团缀合。适于用作标记的酶包括但不限于水解酶，尤其磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化酶，尤其过氧化物酶。适于用作标记的荧光化合物，即荧光团，包括但不限于荧光黄和它的衍生物，罗丹明和它的衍生物，丹酰，伞形花内酯等。适合的荧光团的其他实施例包括但不限于伊红，四甲基异硫氰基罗丹明-胺，奎宁，荧光素W，吖啶黄，丽丝胺罗丹明，B磺酰氯红(B sulfonyl chlorideerythroscein)，钌(三，联吡啶)，德克萨斯红，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，黄素腺嘌呤二核苷酸等。适于用作标记的化学发光化合物包括但不限于虫荧光素和2，3-二氢酞嗪二酮，如鲁米诺。可用于本发明方法中的不同标记或信号生成系统的综述，参见美国专利号4,391,904。

检测标记的工具是本领域技术人员所公知的。因此，比如，当所述标记为放射性标记，检测工具包括闪烁计数器或放射自显影术中的照相胶片。当所述标记为荧光标记，它可通过合适波长的光激发荧光并检测得到的荧光而检测。所述荧光可通过采用电子探测器如电荷偶联器件(CCDs)或光电倍增器等而在视觉上检测。类似地，酶标记可通过提供酶合适的底物并检测得到的反应产物而检测。比色法的或化学发光的标记可简单地通过观察与标记相关的颜色而检测。用于本发明方法中的其它标记或检测系统对于本领域技术人员而言是显而易见的。这些标记的调节剂和配体可用于疾病或健康状况的诊断。

ii.缀合物筛选实验和它们的递送调节剂

本发明提供RAP环肽缀合物筛选实验，其中检测所述缀合物影响特异性受体可测量的活性的能力，这种特异性受体可位于全细胞、细胞抽提物、允许其活性检测的部分纯化的、纯化的或其它任何形式。这种活性可为含CR蛋白在表达、功能或降解方面的活性，其包括，如这些活性的总量或时限。这些活性包括，如，受体基因序列或mRNA转录物的转录、转录加工、翻译或转录物稳定性。这些活性包括，如，新受体的合成、受体的亚细胞结构的定位和受体生物活性的激活。这些活性包括，如，受体结合物质、采用构型、催化反应、结合已知配体等方面的能力。这些活性包括，如，受体的数量和稳定性、受体加工和移除或降解等。在一优选实施方式中，采用的RAP环肽是被修饰的或自然具有对靶向受体的亲和力高于其它受体的RAP环肽。

本发明预期许多种不同的筛选形式。考虑到一些设计的低通量，以系列或平行方式仅测试一个或几个化合物。高通量筛选实验适于在数周或数月内筛选数万或几十万个化合物。“计算机”筛选形式应用计算机辅助推理设计技术以鉴定生物活性的潜在调节剂。

H.药物组合物及其给药

缀合物和调节剂可采用多种途径给予。对于口服制剂，所述缀合物可单独使用或与适当的添加剂联合以制成片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊，如，与常用的添加剂，例如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉，粘合剂如微晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；与崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羟甲基纤维素钠；与润滑剂，如滑石或硬脂酸镁；以及如果需要的话，还可含稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂或调味剂。

所述缀合物和调节剂可按配制成注射制剂，通过使它们在水溶剂或非水溶剂中溶解、悬浮或乳化，如植物油或其它类似油、合成脂肪酸甘油酯，高碳脂肪酸酯或丙二醇；以及如果需要的话，还可含有常规添加剂如助溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。

所述缀合物、调节剂和LDLR配体可以吸入法给药的气溶胶形式使用。本发明的化合物配制成增压可接受的推进剂如二氟二氯甲烷、丙烷、氮气等。

此外，所述缀合物和调节剂可通过与不同的基质如乳化基质或水溶性基质混合制成栓剂。本发明的化合物可通过栓剂经直肠给药。所述栓剂可包含载体如可可脂、碳蜡和聚乙二醇，其在体温下融化而在室温下呈固体状。

可提供以口服或直肠给药如糖浆剂、酏剂和悬浮液时缀合物、调节剂和LDLR配体的单位剂型，其中每一剂量单位，如，一茶匙容量、一汤匙容量、片或栓，包含预定数量的含活化剂的组合物。类似地，注射或静脉给药的单位剂型可包含在作为无菌水、生理盐水或其它药学上可接受的载体溶液中的组合物的缀合物。

在实际应用中，可根据常规药剂配制技术，将本发明所述的缀合物、调节剂和LDLR配体作为均匀混合物中的活性成分与药学载体混合。根据所需给药如口服或非胃肠(包含静脉内)的制剂形式，载体可采取许多形式。在制备口服剂型的组合物中，可采用任何常用的药学介质，例如，如在口服液体制剂情况下，例如，如悬浮液、酏剂和溶液，可采用水、乙二醇、油脂、乙醇、调味剂、防腐剂、着色剂等；或例如，在口服固体制剂如粉剂、硬和软胶囊以及片剂的情况下，载体如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等，所述固体口服制剂优于液体制剂。

关于透皮途径给药，药物透皮给药方法已在Remington’sPharmaceutical Sciences，第17版，(Gennaro等人Eds.Mack PublishingCo.，1985)公开。真皮或皮肤贴剂是本发明所述缀合物、调节剂和LDLR配体透皮递送给药的优选方式。贴剂优选提供吸收促进剂如DMSO以增加化合物的吸收。透皮药物输送的其它方法已在美国专利5,962,012、6,261,595和6,261,595中公开。每一专利以其全文作为参考纳入本文中。

在具体的实施方式中，预期本文所述缀合物的给药方式为鞘内给药至脑脊液。本发明的鞘内给药可包括将药物组合物引导入脑室。或者，所述鞘内给药可包括将所述药物组合物引导入腰椎区域。在另一个备选方案，所述鞘内给药包括将药物组合物引导入大池。任何这样的给药方式优选通过推注注射(bolus injection)。根据症状的严重程度和个体对治疗的反应性，这种推注注射可每周一次，每月一次，每6个月一次或一年一次给药。在其他的实施方式中，所述鞘内给药是通过使用输液泵进行。药物当然可在至少数天的时间内被连续地鞘内给药，或者，鞘内给药在至少四周的时间内连续给予。当然，当给药是通过不断的注入，相比推注注射给药，酶替代疗法的给药剂量的比率可大大降低。在优选的实施方式中，所述缀合物的活化剂是艾杜糖苷酸酶，按接受MPS治疗的哺乳动物每20公斤体重约1毫克艾杜糖苷酸酶的量给予。在具体的实施方式中，上述剂量递送到15cc脑脊液中。在这样的浓度下，可预期这种酶的浓度将达到每毫升脑脊液18,000单位。应该理解，上述剂量仅仅是一示范剂量和本领域技术人员应认识到剂量是可变动的。

本发明所述方法和组合物在酶替代疗法之前可与诱导抗原特异性耐受的方法和组合物联合。这些方法包括诱导抗原特异性耐受，其包括给予免疫抑制剂如环孢霉素A的给予，进一步包括给予抗增殖药物，其包括但不限于核苷酸类似物或抗代谢药。抗增殖药物可为硫唑嘌呤。更多的方法已在以下文献中描述：美国专利申请10/141,668，以美国专利公开号20030211113发表；和美国专利申请号10/429,314，以美国专利公开号0040009906发表，每一专利以其全文作为参考纳入到本文中。

药学上可接受的赋形剂，如溶媒、佐剂、载体或稀释剂，都可以购买。此外，药学上可接受的辅助物质，如pH值调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、润湿剂等，都可以购买。

本领域技术人员容易理解考虑特定化合物的功能、症状的严重程度和个体对副作用的敏感性，剂量水平可以改变。通过各种途径，包括但不限于在患者、试验动物和体外进行的剂量反应和药代动力学评估，特定化合物的优选剂量容易被本领域技术人员确定。

在这些方面的每一方面，所述组合物包括但不限于，成分适合口服、直肠、局部、非胃肠道(包括皮下、肌肉和静脉)、肺(鼻或口腔吸入)，或鼻腔给药的组合物，虽然在任何特定情况下大多数合适的给药途径部分取决于正在接受治疗病况的性质和病情轻重，以及取决于有效成分的性质。给药的示范途径是口服和静脉途径。所述组合物可以单位剂型形式很方便地存在，并可采用药学领域公知的任何方法制备。

在实际应用中，根据常规药剂配制技术，本发明所述的调节剂可作为均匀混合物中的活性成分与药学载体混合。根据所需给药如口服或非口服(包含静脉)的制剂形式，载体可采取许多形式。在制备口服剂型组合物中，可采用任何常用的药学介质，例如，如在口服液体制剂情况下，例如，如悬浮液、酏剂和溶液里，可采用水、乙二醇、油脂、乙醇、调味剂、防腐剂、着色剂等；或例如，在口服固体制剂如粉剂、硬和软胶囊和片剂的情况下，载体如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等，固体口服制剂优于液体制剂。

由于其易于给药，片剂和胶囊代表了最有利的口服剂量单位的形式，在这种情况下，显然应用固体药学载体。如果需要，片剂可通过标准的水性和非水性技术包被。当然，在这些组合物中活性化合物百分比是可变化的，并可方便地在单位重量比约2％和约60％之间。

本发明所述的缀合物、调节剂和配体可用于对动物治疗的、预防的和诊断的介入，尤其对人。如本文所述，所述缀合物显示出在任何靶器官、区域或取决于所用的生物聚合物的位点中的优先的积聚和/或活化剂释放。

本发明所述的组合物可通过包裹在或吸附在病毒被膜或小囊泡，或封装纳入细胞给药。小囊泡通常是球形的胶粒(micellular particles)，其经常为油脂的。脂质体是为从双层膜形成的小囊泡。适合的小囊泡包括但不限于单层脂质体和多层脂质体或脂质体。这种小囊泡和脂质体可使用如美国专利4,394,448所述的标准技术由广泛的油脂或磷脂化合物制备而成，如磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、神经鞘磷脂、糖脂、神经节苷脂等。这些小囊泡或脂质体可用于细胞内给予化合物和递送化合物至靶器官。通过胶囊化也可实现目的p97-组合物的可控释放(参见美国专利5,186,941)。

可采用任何递送RAP环肽活化剂缀合物或调节剂组合物进入血流，或优选地至少在血脑屏障外的给药途径。组合物优选体表给药，最优选静脉给药或通过心导管给药。也可采用颈静脉内的和颈动脉内的注射。组合物也可局部或区域给药，如腹膜内给药或皮下给药或肌肉内给药。在一个方面，组合物可与合适的药学稀释剂或载体一起给药。

给药剂量取决于个体需要、预期效果、采用的活化剂、生物聚合物和选择的给药途径。缀合物的优选剂量为约0.2pmol/kg至约25nmol/kg，特别优选的剂量范围为2-250pmol/kg；或者，所述缀合物的优选剂量为0.02至2000mg/kg。这些剂量将被活化剂的数量或与生物聚合物相关的药物部分所影响。或者，剂量可基于给予的活化剂来计算。

在优选实施方式中所述缀合物包含RAP环肽。例如含有0.005-100mg/kg阿霉素的RAP环肽-阿霉素的剂量也用于体内。特别优选的是含有0.05-20mg/kg阿霉素的RAP环肽-阿霉素剂量。本领域技术人员可部分基于所述化合物游离形式所用的推荐剂量确定与RAP环肽连接的化合物的合适剂量。所述活化剂与RAP环肽的缀合物一般减少获得相同效果的所需药物量。

本发明所述的缀合物和调节剂可用于对动物治疗的、预防的和诊断的介入，尤其对人。RAP环肽化合物在具体组织中可显示出优先的积聚。首选的诊断用途的医学指征包括例如，与目标靶器官(如肺、肝、肾、脾)相关的任何病况。在具体优选的实施方式中，所述目标靶器官为脑。

上述方法用于各种不同的疾病病况治疗。在某些实施方式中，特别感兴趣的是上述方法在疾病病况中的应用，，其中具有所需活性的活化剂或药物已在之前鉴定，但其中所述活化剂或药物不能充分传递到目标位点、区域或间隔以产生完全令人满意的治疗效果。用这些活化剂或药物，将这种活化剂与RAP环肽缀合的上述方法可用来提高治疗效果和活化剂或药物的治疗指数。

根据上述方法，许多宿主或个体是可治疗的。一般而言，这类宿主为“哺乳动物”或“哺乳动物的”，其中这些术语广泛用于描述生物体归属哺乳纲，包括食肉动物(例如，狗和猫)，啮齿目(如小鼠、豚鼠和大鼠)，以及灵长类动物(如人类、黑猩猩和猴子)。在许多实施方式中，所述宿主为人类。

实施例

以下包括的实施例用来证明本发明的优选实施方案。本领域普通技术人员应了解在实施例中公开的技术，其遵循发明者发现的代表性技术，在本发明实施中很好地起作用，并且因此可以认为对于本发明的实施构成优选的模式。然而，本领域普通技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，根据本公开内容，在公开的具体实施方案中可以进行许多变型，并且仍然得到相似或类似的结果。以下实施例提供了生成、分离和表征RAP环肽与它们优选的受体相互作用的示范性实验方法。

实施例1

RAP变体的生成和分析

材料和方法

材料-M13噬菌体展示载体购自Maxim Biotechnology。表达载体pET30(+)a和S-tag纯化试剂购自EMD Biosciences。抗-RAP抗体产自BioMarin Pharmaceutical，Inc。限制性内切酶和T4DNA连接酶来自NewEngland Biolabs。ABI公司3100-AVANT型DNA自动测序仪用于序列数据生成和分析。六聚组氨酸标签纯化试剂来自Qiagen。抗-RAP多克隆抗体之前已有描述(49)。

CR蛋白的表达、再折叠和纯化

其它报道已完美地证实了CR蛋白可在体外表达、纯化和再折叠成其天然形式45，50-54)。就本文的实验而言，选择下列CR用于这一过程：来自LRP6(CR1-3)的CR三联体，来自在三联体(CR1和2，称为CR12，CR2以及3，称为CR23)内LRP6的两个CR对，来自人VLDLR(CR6-8)的CR三联体，来自VLDLR(CR78)的CR对，来自LRP2(CR34-36)的CR三联体，来自LRP2(CR89，CR3435)的两个CR对，来自matriptase/ST14/TADG-15(CR12，CR23 and CR34)的三个CR对，来自LRP1(CR3-5)的CR三联体和来自FDC-8D6抗原的CR对。编码上述每一个的DNA片段从人cDNA(BDBiosciences Marathon-ready^TM)或从之前克隆的LRP6 cDNA(9)用HotStart PfuTurbo^TM(Stratagene)和引物进行PCR扩增：

LRP6CR1F：5’-G C G A T A G G A T C C C C A A C A T G T T C TC C T C A G C A G T T T A C T T G T T T C A C G G G G G A A A T TG A C T G T A T C-3’；(SEQ ID NO：3)

LRP6CR2R：5’-G C G A T A A A G C T T T T A T C A A A G C A CT T C A C A G T T C T T C T C A T C T G A T T T G T C C T G G C A GT T T G C A T C T C C A-3’；(SEQ ID NO：4)

LRP6CR2F：5’-G C G A T A G G A T C C C C T G T A T G C T C AG A G T C C C A G T T C C A G T G T G C C A G T G G G C A G T G TA T T G A T G G-3’；(SEQ ID NO：5)

LPR6CR3R：5’-G C G A T A A A G C T T T C A C T A A G T C GG A T A A C A A T C C A G T T C A T C T G A C T T G T C A C T G C AA T C C A C-3’；(SEQ ID NO：6)

VLDLRCR6F：5’-G C G A T A G G A T C C C A C A C C A A G TG T C C A G C C A G C G A A A T C C A G T G C G G C T C T G G C GA G T G C-3’；(SEQ ID NO：7)

VLDLRCR7F：5’-G C G A T A G G A T C C A C T T G C C G A CC T G A C C A A T T T G A A T G T G A G G A T G G C A G C-3’；(SEQID NO：8)

VLDLRCR8R：5’-G C G A T A A A G C T T T T A T C A T T C G TT T A T A T G A C A C T C T T T C A G G G G C T C A T C A C T C C AG T C C C T G-3’；(SEQ ID NO：9)

LRP2CR8F：5’-G C G A T A G G A T C C C C C A C G G A G C AG T G T G G C T T A T T T T C C T T C C C C T G T A A A A A T G GC-3’；(SEQ ID NO：10)

LRP2CR9R：5’-G C G A T A A A G C T T T T A T C A T G C G TG G G T G G G G C A G T T G T G C T C A T C A C T G C C A T C C AC A C A G T C G T T G C G T T T G-3’；(SEQ ID NO：11)

LRP2CR34F：5’-G C G A T A G G A T C C G A T G G T G C A T AC T G C C A G G C T A C T A T G T T C G A A T G C A A A A A C C AT G T T T G T A T C C C G C-3’；(SEQ ID NO：12)

LRP2CR35F：5’-G C G A T A G G A T C C G A T G T T C C C T GT A A T T C A C C A A A C C G T T T C C G G T G T G A C A A C A A TC G C T G C-3’；(SEQ ID NO：13)

LRP2CR36R：5’-G C G A T A A A G C T T T T A T C A T A T A TT T T C A G C A C A T G T T C T T T C T T T T C C T T T A T T G C AA C C C A G T T C A T C G-3’；(SEQ ID NO：14)

ST14F1：5’-G C G A T A G G A T C C C C A T G C C C G G G G CA G T T C A C G T G C C G C A C G G G G C G G T G T A T C-3’；(SEQID NO：15)

ST14F2：5’-G C G A T A G G A T C C T G C G A C G C C G G C CA C C A G T T C A C G T G C A A G A A C A A G T T C T G C-3’；(SEQID NO：16)

ST14F3：5’-G C G A T A G G A T C C A G T T G T C C G G C C CA G A C C T T C A G G T G T T C C A A T G G G A A G T G-3’；(SEQ IDNO：17)

ST14R1：5’-G C G A T A A A G C T T T T A T C A A C C C C T GC T C G T C G C T G T T G T C T C C G C A G T C G T T C A C A C TG-3’；(SEQ ID NO：18)

ST14R2：5’-G C G A T A A A G C T T T T A T C A A C T G C A CC C C T G C T C G T C G C T G T T G-3’；(SEQ ID NO：19)

ST14R3：5’-G C G A T A A A G C T T T T A T C A G T C G C A GT C C T T C T C A T C T G A G C C G T C G C T A C A G T C C T C C TT C C C G-3’；(SEQ ID NO：20)

LRP1CR3F：5’-G C G A T A G G A T C C C C C C A G T G C C AG C C A G G C G A G T T T G C C-3’；(SEQ ID NO：21)

LRP1CR5R：5’-G C G A T A A G C T T T C A A T A G G C A C AC G A A G C A G A C T C A T C A G A G C G G-3’(SEQ ID NO：22)

8D6AF：5’-G C G A T A G G A T C C T C G T G C C C A C C C AC C A A G T T C C A G T G C C G CA C C A G T G G C T T A TG-3’(SEQ ID NO：23)

8D6SAR：5’-G C G A T A A A G C T T T T A T C A T C C A C A GC C G A G C T C G T C G C T G G A G T C G G G A C-3’(SEQ ID NO：24)。

每一扩增的片段连续地采用BamHI和HindIII消化然后与同样消化的pET30(+)a连接。得到的质粒编码由N-端6聚组氨酸和与CR片段融合的S-肽组成的蛋白。连接反应物通过电穿孔转化至XL-BlueMRF’(Stratagene)和从单一克隆分离的质粒。三个突变体，Y1040W、V1047D和R1088D，采用Stratagene QuikChange II XL试剂和下列引物被导入LRP2 CR89单独或组合表达质粒：

CR89YWF：5’-G T G C C C A A T T A C T G G C T C T G T G A TG G A G-3’(SEQ ID NO：25)；

CR89YWR：5’-C T C C A T C A C A G A G C C A G T A A T T G GG C A C-3’(SEQ ID NO：26)；

CR89V1047DF：5’-C T C T G T G A T G G A G A C G A T G A T TG T C A T G A T A-3’(SEQ ID NO：27)；

CR89V1047DR：5’-T A T C A T G A C A A T C A T C G T C T C CA T C A C A G A G-3’(SEQ ID NO：28)；

CR89R1088DF：5’-C A C A C T G G C G C T G T G A C A A A G AC A A C G A C T G T G T G G A T G G C-3’(SEQ ID NO：29)；

CR89R1088DR：5’-G C C A T C C A C A C A G T C G T T G T C TT T G T C A C A G C G C C A G T G T G-3’(SEQ ID NO：30)。

为了验证插入序列和与表达载体的接点，对所有的表达构建体测序。然后每一质粒用于转化BL21(DE3)CodonPlus-RIPL^TM细胞(Stratagene)。在对数生长期细胞中诱导CR蛋白表达，这些对数生长期细胞生长在含34μg/mL氯霉素，12.5μg/mL四环素和15μg/mL卡那霉素并加入2mMIPTG的LB培养液中，然后在将培养箱温度降至32℃，以250×g搅拌培养4个小时。沉淀细胞，然后以3.5％的起始培养体积在10mM Tris-HCl pH 8，100mM NaH₂PO₄，8M尿素中重悬。重悬细胞然后在液氮中冷冻，接着迅速解冻至37℃，紧接着采用连有3mm探头的Cole-Parmer CP-130超声粉碎仪以60的振幅设置超声粉碎处理10秒。这个过程重复3次，以完成细胞的全裂解。通过在Sorvall RC-5离心机中在15℃下以10,000xg离心20分钟，离心2次，澄清裂解液。Ni-NTA柱(Qiagen Superflow^TM，1.5mL填充床)被用来纯化CR蛋白。简而言之，树脂用2个柱体积的裂解溶液平衡。澄清的裂解液被补入咪唑至20mM，然后与平衡后的Ni-NTA树脂在4℃下孵育过夜。弃去流过的液体。柱用1倍柱体积裂解液洗一次，然后用1倍柱体积的补充20mM咪唑的TBS pH 8洗涤3次。通过采用1倍体积含200mM咪唑的相同缓冲液室温下孵育30分钟，然后然后从柱中移除CR上样珠，CR蛋白被洗脱。这个步骤重复1次并合并洗脱液。洗脱的CR蛋白溶液添加至2M尿素，10mM CaCl₂和5mM DTT。已纯化的、变性的蛋白溶液被移入3,500MWCO Slide-A-Lyzer^TM盒(Pierce)，继而在200倍超量体积50mM Tris-HCl pH 8.5，10mM CaCl₂，1mM还原性谷胱甘肽，0.5mM氧化谷胱甘肽中透析，室温下过夜；然后在补充5mM CaCl₂的TBS溶液中透析，4℃下过夜。蛋白浓度采用Bradford法检测，蛋白纯度通过SDS-PAGE和考马斯亮兰染色来验证。

噬菌体展示库的制备-噬菌体展示噬菌粒pHage 3.2用QuikChange II^TM试剂(Stratagene)改造以移去在pIII前导序列内的PflMI和HindIII位点。另外，通过连接一含BamHI、NotI和AgeI位点的双链连接体，pHage 3.2的多连接体被改造。所得到的改造的噬菌粒被称为pHage 3.6。之前所述的表达RAP和人α-L-艾杜糖苷酸酶融合体的载体，pc3B-RAPIDU(49)采用BamHI和AgeI消化，以获得编码人RAP序列的DNA片段。这个序列在RAP cDNA的102位核苷酸开始，在059位核苷酸结束。所述编码的RAP蛋白既缺少N-端RAP信号肽也少了C-端HNEL内质网滞留信号(SEQ IDNO：____)。另外，在5’-端存在框内BamHI位点，在3’-端存在包含AgeI位点的编码AEAETG肽的框内序列。所述RAP序列接入相似消化的pHage3.6，生成M13pIII前导肽、RAP序列和pIII序列的融合。这个构建体被称为pHage 3.6RAP。接着，在RAP第三结构域(RAP d3 K256和K270)内2个位点被诱导突变(55)，之前已有报道，这两位点对于受体结合很重要。通过采用下列正常的和突变的引物对进行RAP d35’-半分子和3’-半分子的单独PCR扩增，这两个位点饱和。

RAP2KXF：5’-C C C T C G G A C G T C A G C G A C A T C A A GG G C A G C G T C C T G-3’(SEQ ID NO：31)；

RAP2KX2：5’-C T C C A G C T G C T T C T G G T A G T G G T TG T G V N N C T C C T C G A T T T T G G C T T C G A A G T G C T T GA G C T C C T-3’(SEQ ID NO：32)；

RAP2KX1：5’-A A G C A G C T G G A G A T T G C G C A C G A GN N B C T G A G G C A C G C A G A G A G C G T G G G C G A A C G GC-3’(SEQ ID NO：33)；和

RAPmut1R：5’-G G T G C G G G G C C T C A C C G G T-3’)(SEQID NO：34)。

所述片段从pc3B-RAPIDU扩增。每个诱变的引物采用47种其它密码子之一或3个可能的终止密码子之一取代一个被选择的赖氨酸密码子。这种取代产生了2304种可能的核苷酸组合和441种可能的氨基酸(或终止密码子)的组合。RAP d3 5’-和RAP d3 3’-PCR片段均在正常位点用PvuII消化。然后用T4DNA连接酶通过连接反应结合。，由在PvuII位点融合的5’-和3’-片段组成的异二聚体连接产物在FMC NuSieve GTG^TM的琼脂糖凝胶上分解，并采用Amersham GFX^TM试剂纯化。这种异二聚体通过UV光谱法来定量，并且采用GeneMorph II EZ clone^TM试剂(Stratagene)和引物RAPKXF和RAPmut1R(如上所述)通过倾向差错PCR使这种异二聚体进行进一步突变。为了最大化最后的突变频率，在每50μL反应体系中这种异二聚体浓度保持400pg以下。诱变的DN用被AgeI消化，GFX纯化，UV光谱法定量，并用Stratagene EZclone^TM试剂用于无连接酶克隆法导入pHage3.6RAP。无连接酶克隆反应产物采用Qiagen MinElute^TM柱纯化。等份量纯化的无连接酶克隆产物(3μL)用于转化50μL等份量XL10-Gold^TM化学感受态细胞。等份量的转化细胞连续稀释，然后在含100μg/mL羧苄青霉素钠的LB平板上铺板，以便检测原始转化体的数目。剩余的转化细胞在Nunclon 25x 25cm培养皿上铺板。借助350mL Qiagen GigaPrep^TM P1缓冲液，总数119,500原始转化体集落可从那些培养皿中回收。质粒DNA采用Qiagen试剂和方法制备。定量这种质粒制剂，并用BamHI和AgeI消化，以便验证适当大小的植入片段的存在。

RAP d3突变体库的制备-采用PfuUltra酶和试剂(Stratagene)通过PCR制备RAP d3突变体库。d3编码序列的5’-半分子和3’-半分子分别PCR扩增，使用下列HPLC纯化的引物：

MORPHF4：5’-G G C C C A G A T C T A C C G G T T T C T G C CT C G G C-3’(SEQ ID NO：35)；

D3HALFR2：5’-G T G C G C A A T C T C G A G C T G C T T C TG G T A G T G G T T G T G V N N C T C G A T T T T G G C V N N G AA G T G C T T G A G C T C C T C C C G G-3’(SEQ ID NO：36)；

D3HALFF2：5’-C C A C T A C C A G A A G C A G C T C G A G AT T G C G C A C G A G N N B C T G A G G C A C G C A G A G A G C GT G G G C G A C G G C-3’(SEQ ID NO：37)；

MORPHR3：5’-G A G T G C G G C C G C A A G C T T A T C T TC T G C C T C G G C-3’(SEQ ID NO：38)。

所述引物采用NNB替换251、256和270位点的密码子，导致在这些位点上可为所有可能的氨基酸。此外，在RAP d3编码序列内的PvuII位点通过单一的、沉默的、碱基置换而被除去。扩增片段采用Amersham GFX试剂纯化，然后采用PfuUltra通过primer-less PCR而装配。定量RAP d3变体序列组合库，接着采用GeneMorph II试剂(Stratagene)使其经受突变。突变的DNA相继被BamHI、PvuII和AgeI消化，每次反应后采用GFX试剂纯化。这些消化的RAP d3变体片段库然后连接到被同样消化处理的pHage 3.6(同上)。质粒库可通过XL10-Gold细胞(Stratagene)的转化和含有含羧苄青霉素钠的LB培养液的25x 25cm培养皿上的培养制备。集落可从所述培养皿和上述制备的质粒DNA中回收。

噬菌体的制备-质粒库(10ng)通过电穿孔法用于转化XL-Blue MRF’。在1mL补充2％葡萄糖的2x YT培养液中37℃下孵育1小时后，转化细胞培养物添加羧苄青霉素钠至100μg/mL，继续培养6小时。接着这1mL培养物用于接种在50mL锥形瓶中的含2％葡萄糖，100μg/mL羧苄青霉素钠和10⁸pfu/mL M13K07辅助噬菌体(New England Biolabs)的10mL 2x YT培养液中。所述培养物以250xg在37℃下摇菌2小时，然后在SorvallRC-5离心机中以2,000xg离心沉淀细胞。细胞用10mL含2％葡萄糖，100μ/mL羧苄青霉素钠和100μg/ml卡那霉素的2x YT培养液重悬，继续在37℃下摇菌过夜。以10,000xg离心两次使培养物澄清，收集上清液。采用一倍体积冷TBS和0.2倍体积2％PEG 8000(Sigma)，2.5M NaCl合并上清液使噬菌体沉淀，沉淀以10,000xg离心收集并用TBS重悬。通过连续稀释噬菌体样品与对数期XL-Blue MRF’孵育和在补充100μg/mL羧苄青霉素钠的2xYT琼脂上平板接种，确定噬菌体的滴度。

噬菌体筛选-用补充5mM CaCl₂的TBS溶液将纯化的折叠的CR蛋白以1g/孔包被Nunc MaxiSorp^TM 96-孔板，4℃过夜。然后加入噬菌体前漂洗孔，用含5mM CaCl₂ TBS Superblock^TM((Pierce)溶液封闭。溶于补充5mMCaCl₂和0.05％Tween-20的TBS Superblock((Pierce)溶液中的10⁹cfu(10¹⁰cfu/mL)纯化的噬菌体库加入到已包被的孔，室温孵育2小时。然后孔用TBSTC(20mM Tris-HCl pH7.4，150mM NaCl，补充5mM CaCl₂和0.05％Tween-20)洗涤15次。吸附的噬菌体采用含1mg/ml BSA的0.2M甘氨酸-HCl pH 2.2洗脱，然后移入含0.2体积1M Tris-HCl pH 9.1的管中，调节pH至中性。洗脱的噬菌体可采用洗脱液与对数期XL-Blue MRF’细胞混合洗脱物重悬回收。通过30℃过夜(16小时)的液体培养物中的生长细胞扩增回收的噬菌体。此外，通过样品连续稀释和在含有100μg/mL羧苄青霉素钠的2x YT琼脂培养基上平板接种确定转化细胞等份样品的滴度。采用PEG沉淀方法从培养基中纯化和富集噬菌体。

RAP d3蛋白的表达-用引物d3 Rescue F：5’-G C G A T A G G A TC C C T G G A C C G C C T G C G C A G G G T C A G C C A C C-3’(SEQ ID NO：39)和d3Rescue R：5’-G C G A T A A A G C T T T T A TC A A G A T C T A C C G G T T T C T G C C T C G G C-3’(SEQ ID NO：40)，扩增RAP d3片段，然后采用BamHI和HindIII消化，并连接到相似消化的pET30(+)a。RAP d3蛋白在BL21(DE3)CodonPlus-RIPL^TM中表达，通过上述的Ni-NTA层析纯化。蛋白浓度采用Bradford法测定，蛋白纯度通过SDS-PAGE来评估。

突变的RAP d3序列回复(sequential reversion)和野生型RAP d3正向突变-在亲和力选择的RAP d3变体内每一突变通过StratageneQuickChange II XL^TM试剂和下列引物单独恢复到野生型：

V2AR1：5’-A G G G T C A G C C A C C A G G G C T A C A G C AC T G A G G C T A A G T T C G A G G A G C C C A G G G T G A T-3’(SEQ ID NO：41)；

V2AR2：5’-C A G C C A C C A G G G C T A C A C C A C T G A GG C T G A G T T C G A G G A G C C C A G G G T G A T T G A C C-3’(SEQ ID NO：42)；

V2AR3：5’-G G A G G C G T T C C G G G A G G A G C T C A AG C A C T T C A A A G C C A A A A T T G A G G C C C A C A A C C-3’(SEQ ID NO：43)；

V2AR4：5’-C G T T C C G G G A G G A G C T C A A G T A C T TC G A A G C C A A A A T T G A G G C C C A C A A C C A C T A C-3’(SEQ ID NO：44)；

V2AR5：5’-G C T C A A G T A C T T C A A A G C C A A A A T TG A G A A G C A C A A C C A C T A C C A G A A G C A G C T G G AG-3’(SEQ ID NO：45)；

V2AR6：5’-A G A A G C A G C T G G A G A T T G C G C A C G AG A A G C T G A G G C A C G C A G A G A G C G T G G G C G A C GG-3’(SEQ ID NO：46)；

V2ARR1：5’-A T C A C C C T G G G C T C C T C G A A C T T AG C C T C A G T G C T G T A G C C C T G G T G G C T G A C C C T-3’(SEQ ID NO：47)；

V2ARR2：5’-G G T C A A T C A C C C T G G G C T C C T C G AA C T C A G C C T C A G T G G T G T A G C C C T G G T G G C T G-3’(SEQ ID NO：48)；

V2ARR3：5’-G G T T G T G G G C C T C A A T T T T G G C T TT G A A G T G C T T G A G C T C C T C C C G G A A C G C C T C C-3’(SEQ ID NO：49)；

V2ARR4：5’-G T A G T G G T T G T G G G C C T C A A T T T TG G C T T C G A A G T A C T T G A G C T C C T C C C G G A A C G-3’(SEQ ID NO：50)；

V2ARR5：5’-C T C C A G C T G C T T C T G G T A G T G G T TG T G C T T C T C A A T T T T G G C T T T G A A G T A C T T G A GC-3’(SEQ ID NO：51)；

V2ARR6：5’-C C G T C G C C C A C G C T C T C T G C G T G C CT C A G C T T C T C G T G C G C A A T C T C C A G C T G C T T CT-3’(SEQ ID NO：52)。

采用相同方法和下列引物，诱变处理野生型RAP d3：

K256AF：5’-C T T C G A A G C C A A A A T C G A G G C G C A CA A C C A C T A C C A G A A G C-3’(SEQ ID NO：53)；

K256AR：5’-G C T T C T G G T A G T G G T T G T G C G C C T CG A T T T T G G C T T C G A A G-3’(SEQ ID NO：54)；

K270EF：5’-G C T G G A G A T T G C G C A C G A G G A G C T GA G G C A C G C A G A G A G-3’(SEQ ID NO：55)；

K270ER：5’-C T C T C T G C G T G C C T C A G C T C C T C G TG C G C A A T C T C C A G C-3’(SEQ ID NO：56)；

d3E251KF：5’-G A G G A G C T C A A G C A C T T C A A A G C CA A A A T C G A G A A G C A C A A C-3’(SEQ ID NO：57)；

d3E251KR：5’-G T T G T G C T T C T C G A T T T T G G C T T TG A A G T G C T T G A G C T C C T C-3’(SEQ ID NO：58)；

d3E217KF：5’-C A G G G C T A C A G C A C T G A G G C T A A GT T C G A G G A G C C C A G G G T G-3’(SEQ ID NO：59)；

d3E217KR：5’-C A C C C T G G G C T C C T C G A A C T T A G CC T C A G T G C T G T A G C C C T G-3’(SEQ ID NO：60)；

d3H249YF：5’-G T T C C G G G A G G A G C T C A A G T A C T TC G A A G C C A A A A T C G A G-3’(SEQ ID NO：61)；

d3H249YR：5’-C T C G A T T T T G G C T T C G A A G T A C T TG A G C T C C T C C C G G A A C-3’(SEQ ID NO：62)。

固相结合试验-用补充5mM CaCl₂的TBS溶液pH 8(TBSC)将纯化的再折叠CR蛋白(1μg)与Nunc MaxiSorp^TM 96-孔板结合，4℃下过夜。孔用TBSC漂洗，接着用含2％牛血清白蛋白(BSA)的TBSC溶液封闭。RAP配体在补充0.05％Tween-20的上述封闭缓冲液一系列浓度范围中与固相化的受体室温下孵育2小时。对照孔不加配体。作为一额外对照以检测钙的缺失是否影响结合，在一些样品的孵育培养基中包含10mM EGTA。孔用TBSTC清洗，结合配体采用抗-RAP多克隆抗体(BP41/42，1∶1,000，BioMarin)检测。过量的一级抗体被弃去，清洗孔，然后与二级抗体HRP-缀合羊抗兔IgG(Bio-Rad)孵育。清洗后，加入TMB底物溶液(Bio-Rad)以检测HRP。用1N HCl中止颜色发展。采用微板分光光度仪(MolecularDevices)检测在450nm下的光吸收度。对数据绘图，通过单点结合假设的非线性回归分析获得K_d值(GraphPad Prism)。

结果

为了鉴定在人类蛋白组内的串联CR对和分析这些在之前已表明结合RAP的所述串联对中的位置，在Pfam数据库中(pfam.wustl.edu)经鉴定的190条非冗余人CR序列的序列转移至电子数据表。采用在已发现的蛋白原始序列中2个CR序列彼此直接靠近为所述串联对分配的唯一要求，鉴定CR序列的串联对。如在Pfam数据库定义，为充分测定此条件，限制每一CR序列第一个氨基酸之间的距离强行限制为75个氨基酸。因为关于RAP结合的历史数据优势以定义CR序列涉及这些串联对，所以制定关于串联排列要求的设想。包括重叠串联对，以致于3个CR序列的线性阵列含有2个CR对。以这种方式存在149个确定的串联的CR对。在钙结合环的区域里序列的保守性促进了下一步分析，在之前研究中4个氨基酸的提取直接涉及RAP结合(56，57)。这些等同于来自CR对的每一CR序列的AxcBxCxD基序的A和C。为了比较，来自每一对的第一CR序列的A和C位点的氨基酸同一性，与来自每一对的第二CR序列的A和C位点的氨基酸(以下标记为，A’和C’)一起联体为单一的四聚体字符串(ACA’C’)。每一CR对的这种字符串与所有其它CR对的字符串比较，并对每个频率计数。在本分析中已鉴定的149条非冗余人串联CR对序列中，在A、C、A’和C’位点的最常见的氨基酸组合为WDWD，其被发现16次。此外，WEWD标签有4个CR对，WEWE有2个，WDWE有6个，总数达28个符合我们的规范CR对定义。所述规分CR对标签仅在LDLR家族发现，尤其在VLDLR、LRP1、LRP1B、LRP2、LRP4、apoER2和SorLA中。之前所有这些受体已表现出高亲和力结合RAP。除了低频率的冗余组合外，101个独特的组合被鉴定出来，所有含CR对的蛋白至少具有一种。然后在A、C、A’和C’位点的氨基酸的各四联体组合基于其侧链的近似理化性质概括分配成6组之一。疏水性脂肪族氨基酸被分类为组1(I、L、M、V)，亲水性氨基酸为组2(A、C、G、P、S、T)，碱性氨基酸为组3(H、K、R)，酸性氨基酸为组4(D、E)，酰胺氨基酸为组5(N、Q)和芳香族氨基酸为组6(F、W、Y)。如前，每一概括的组合与所有其它这样的组合比较并计数它们的频率。最常见的概括组合被发现有6464个，为A和A’位点的芳香族氨基酸和在C和C’位点的酸性氨基酸。这组包括所有28种具体规范组合，占149个CR对组合中的44个。这类CR对的代表在10种蛋白中被发现，包括LDLR家族蛋白外的2个，丝氨酸蛋白酶(corin)和基底膜蛋白聚糖。总数为57个的概括组合是独特的，如前，至少一种独特的组合可在每种LDLR受体胞外结构域中发现，除VLDLR外。含在选定的位置带有氨基酸的独特概括组合的CR对的其它蛋白包括跨膜丝氨酸蛋白酶matriptases 1、2和3(MT-SP1、ST14、TADG-15)，FDC-8D6抗原、corin、补体因子I和硫酸肝素蛋白多糖蛋白、基底膜蛋白聚糖(25，58)。

从每一CR对的钙结合环内A、C、A’和C’位点带有氨基酸独特组合的大量CR对中，选择CR对或三联体以检测它们对RAP d3的结合(图2)。测试来自FDC-8D6蛋白的另一对，指定为8D6CR12，其序列为(GSSCPPTKFQCRTSGLCVPLTWRCDRDLDCSDGSDEEECRIEPCTQKGQCPPPPGLPCPCTGVSDCSGGTDKKLRNCSRLACLAGELRCTLSDDCIPLTWRCDGHPDCPDSSDELGCG)(SEQ ID NO：91)。选定的受体片段包含CR序列的单一序列对或2个重叠的序列对(三联体)，意图反映在选定位置氨基酸组合的范围。考虑到重叠的序列对折叠效率低于单独的序列对，一个或二个重叠序列对组成的各三联体也可在一些情况下表达。序列包括LRP6CR三联体，相当于全长人LRP6(Uniprot编号O75581)的1247-1363位氨基酸，被命名为LRP6CR1-3；两重叠CR对包括LRP6三联体、LRP6CR12和LRP6CR23、1247-1322位和1323-1363位氨基酸；VLDLR片段，为235-358位氨基酸(Uniprot编号P98155)，命名为VLDLRCR6-8；在VLDLR三联体内的一CR对被命名为VLDLR CR78，其包含295-358位氨基酸；三个来自跨膜丝氨酸蛋白酶matriptases的CR对被命名为MAT CR12(ST14 CR12)，为452-524位氨基酸；MAT CR23(ST14 CR23)，为487-566位氨基酸(Uniprot编号Q8WVC1)和MAT CR34(ST14 CR34)，为525-602位氨基酸；来自FDC-8D6抗原的CR对，为53-168位氨基酸(Uniprot编号Q9NPF0)(SEQ ID NO：94)，以及来自LRP1的三联体，被命名为LRP1 CR3-5，其包含852-973位氨基酸(Uniprot编号P98157)。LRP1 CR3-5由2个带WDWD标签的重叠规范CR对组成，其每一个已在之前被证实与RAP d3以高亲和力结合(56)。

许多之前的研究已证实CR对和三联体可在细菌内表达，在体外可再折叠为天然的结构(45，50-54，56，57，59-62)。每种纯化的、再折叠的CR蛋白被表达，在还原条件和非还原条件下采用SDS-PAGE分析图3)。在还原条件下，CR迁移率与预测的分子量一致，每一蛋白被判断为＞90％纯度。在非还原条件下，每个CR蛋白通过凝胶的迁移率要比预期的预测分子量快。这一观察结果符合依赖于分子内二硫键形成的致密折叠结构。当可能存在许多可能的二硫键组合的时候，以上引用的研究已证实，天然二硫键结合方式在再折叠过程中有利，特别是在钙离子的存在下。在大多数情况下，考虑到电泳分析法的解析度相当低，CR蛋白的折叠形式表现为一条带(图3)。

通过固相分析检测野生型RAP d3与每种CR对或一组重叠对的结合(图4)。在这种方法中RAP d3与LRP1 CR3-5结合的表观K_d为11nM，与之前报道的值范围相同(56，57，63)。在最高测试配体浓度下，RAP d3结合LRP6 CR12，LRP6 CR23，LRP6 CR1-3，VLDLR CR78，LRP2 CR3536，LRP2 CR34-36和MAT CR23比结合LRP1 CR3-5低5％。在单独的一组实验中，不能检测到RAP d3与MAT CR12和CR34的结合。RAP d3与VLDLR CR6-8和LRP2 CR89的结合稍微高，使曲线可靠地符合结合等温线。然而，RAP d3与这些受体片段的表观结合离解常数高于300nM。

已确定RAP d3不与在钙结合环内含有氨基酸独特组合的CR对结合，已开发能与这些对结合的RAP d3突变体的亲和力选择系统。在哺乳动物细胞和细菌中可表达RAP与其它蛋白的融合体，业已证实其保持天然RAP受体结合特点49，64，65)。因此，正如用其它蛋白已进行的实验(66)，建立全长RAP的N-端与M13 pIII结构蛋白融合的库。为了产生RAP突变体群，2个诱变过程被用于全长RAP编码序列内的第三结构域。2个被证实直接参与受体结合的密码子，K256和K270，首先经受进行饱和诱变。采用倾向差错PCR将另外的突变随机地引入RAP d3。这些过程之后，对总共38个随机挑选的克隆测序以确定突变频率。10个克隆(26％)有碱基插入、缺失或置换，导致在所述RAP序列内的终止密码子。既然仅野生型pIII被合并如噬菌体的衣壳，那么在噬菌体组装和感染过程里编码这些序列的重组噬菌体将有利。另外4个克隆(11％)被发现编码野生型RAP。剩下的24个RAP噬菌体-pIII融合体克隆(63％)编码在d3突变的RAP蛋白。这些克隆在位点256和270没有相同的氨基酸组合，这表明置换范围按预想在这些位点发生。不计256和270位点，在RAP(RAP d3)末尾110个氨基酸内平均突变频率为2.4氨基酸置换。38个克隆之一有7个密码子框内缺失，而另一有未知序列部分取代RAP 3’-端的框内插入。在RAP的d1或d2内没有发现突变。

制备第二个噬菌体展示库，其仅编码RAP d3。这个库以建立全长RAP库相似的方式建立，除了额外位点251外，基于早期筛选(见下)的变体中这个位点的明显重要性，将这个位点进行饱和诱变。除了位点251、256和270外，RAP d3突变库在RAP末尾110个氨基酸内平均突变频率为2个氨基酸置换。在这个库中没有野生型RAP的表观过度表现(over-representation)。

为了检测噬菌体筛选系统是否可用于基于亲和力分离RAP序列，将表达野生型RAP的噬菌体制品稀释1千倍到表达预期减少CR对结合能力的RAP突变体(K256D，K270D)的噬菌体制品中(55)。筛选如方法中所述进行。对回收的噬菌体扩增和测滴度。对来自10个回收集落的RAP d3序列测序。单轮筛选后，来自筛选试验的10个集落中的2个包含野生型RAP，其为起始群的200倍富集。作为这个体系利用更复杂的序列群的额外检测，随机排列256-270位点的RAP噬菌体库通过LRP1 CR3-5筛选。在起始噬菌体库中，野生型RAP序列大约被10个噬菌体之一(基于选择之前的随机克隆测序)编码。第一轮筛选之后，所述野生型RAP序列被10个噬菌体中7个编码。这个结果表明经过一轮筛选后从序列复合群中选择的序列被7倍富集。

得到RAP序列可通过亲和选择从噬菌体展示库中分离出来的结论，我们首先选择一个不与野生型RAP结合的CR对，LRP2 CR89，并利用它作为双突变的全长RAP噬菌体库的筛选底物。4轮筛选后，8个随机挑选的克隆中的3个相同。所述普通序列有7个突变：V175L，S213T，E217K，H249Y，E251K，K256A，K270E。4个克隆中的第2组在256和270位点有置换(K256A，K270R)，而且在这2个位点外还存在可变的置换方式。5轮筛选后，8个随机挑选的克隆中的7个具有先前观察到的V175L，S213T，E217K，H249Y，E251K，K256A，K270E突变组。所有这个序列的突变被命名为RAPv2A或MegaRAP1(SEQ ID NO：93)，其位于这个特别诱导处理的区域内以获得变体库。

为确认所述库的分辨是由于亲和选择的结果，制备RAP和MegaRAP1噬菌体，并分析其与LRP2 CR89的结合。采用相同的起始滴度，用MegaRAP1噬菌体筛选回收的集落形成单位(cfu)比用野生型RAP噬菌体高2.6倍。当用抗-pIII抗体检测结合的噬菌体时获得相似的结果，表明这2种噬菌体间感染力的差异不是由于回收的噬菌体滴度的差异导致的。通过在50mM EDTA存在下进行结合反应，确认MegaRAP1结合是钙依赖的，这与有序CR折叠为受体的要求一致。既然RAP和MegaRAP1噬菌体两者有相同的d1序列和d2序列，这两序列在单个的保守置换(V175L)上存在差异，我们假定在d3的差异与与LRP2 CR89结合的提高有关。因此，亚克隆和表达RAP d3和MegaRAP1 d3作后续的结合分析。虽然为进一步研究而表达的d3区域包括成熟RAP 201-319位氨基酸，V175L突变体对RAPv2A的结合特点的效果没有检测到。

接着，评估RAP d3和MegaRAP1 d3蛋白与LRP1 CR3-5和LRP2CR89的结合。为了理解每一MegaRAP1 d3突变体对亲和性差异的相对作用，我们也制备许多MegaRAP1 d3回复株和RAP d3正向突变株，它们都含有MegaRAP1 d3和野生型RAP d3之间的序列变体中间体缺少4个氨基酸C-端滞留信号(SEQ ID NO：92)(图5A和5B，表2)。在所有情况下，10mM EGTA阻止RAP d3和MegaRAP1 d3两者结合CR蛋白。既然钙是存在于结合缓冲液中唯一的二价金属离子，这个观测结果与RAP d3和MegaRAP1 d3两者结合钙负载的CR对一致。RAP d3以解离常数16nM结合LRP1 CR3-5，并表现与LRP2 CR89没有显著的亲和力，这与图4的数据一致。相反地，MegaRAP1 d3以表观解离常数38nM结合LRP2 CR89，并表现与LRP1 CR3-5没有显著的亲和力。因此，野生型RAP d3和MegaRAP1 d3对这2类受体片段有相反的结合优先选择。2个MegaRAP1 d3回复突变株T213S和K217E具有对LRP2 CR89略微提高的亲和力，但仍不能检测到与LRP1 CR3-5结合。3个MegaRAP1 d3回复突变株Y249H、K251E和A256K，未能结合受体片段之一，这表明所述突变对于在MegaRAP1 d3和LRP2 CR89之间的相互作用很重要，并不单独是破坏与LRP1 CR3-5结合的原因。有趣的是，E270K回复突变株比MegaRAP1 d3以更高的亲和力结合两受体片段，其对LRP2 CR89的表观解离常数为8nM和对LRP1 CR3-5表观解离常数为142nM。既然MegaRAP1 d3突变体基于对LRP2 CR89亲和力来选择，这个结果与起始库的多样性一致，不足说明所有可能的序列变体。或者，MegaRAP1 d3和MegaRAP1 d3E270K之间亲和力的差别可能不足以允许后者在反复的筛选上占优势。在我们的检测中一双回复突变株，T213S，E270K，具有与MegaRAP1 d3不能区别的结合特点。既然在这些位点这2个单一位点回复突变株表现出对LRP2 CR89提高的亲和力，以及在E270K的情况下，LRP1 CR3-5也如此，这个结果表明，在我们检测中，这些回复突变导致的结合效果缺乏相加性或在这个亲和力范围内缺少精确性。这种K251E，E270K双回复突变株的结合特点暗示MegaRAP1 d3对LRP2 CR89亲和力强烈的依赖于E251K突变。这种回复突变株和单一位点E270K回复突变株之间对LRP2 CR89亲和力的差异几乎为20倍。所述A256K，E270K双回复突变株导致对LRP2 CR89亲和力减少2倍，这暗示了K256A MegaRAP1 d3突变体对这个片段的亲和力为温和地阳性作用。然而，这种双回复突变株和单一位点E270K回复突变株之间最显著的不同是对LRP1 CR3-5亲和力近30倍的提高。因此，在MegaRAP1d3中K256A突变是在这2种片段间鉴别这种变体的能力的关键因素，其通过阴性影响对LRP1 CR3-5的亲和力而同时提高对LRP2 CR89的亲和力来发挥它的作用。

被检测的RAP正向突变株中，仅E251K、K256A和K270E的组合导致对LRP2 CR89可检测的亲和力。这个三联突变体结合LRP2 CR89的表观解离常数为114nM，与MegaRAP1 d3相比，仍然相当高。这个亲和力差异在添加H249Y突变后将推测进一步减少。在217、249和251位单一位点RAPd3突变体对结合LRP1 CR3-5有最小的影响而没有将对LRP2CR89亲和力带到可检测的范围。K270E突变，无论单独或与E251K，K256A或两者的组合，不能可检测地结合LRP1 CR3-5。K256A或K270E对RAPd3与LRP1结合有显著阴性影响在关于功能损失RAP突变体的研究中早已报道(55)。报道的结果与本工作一致。总之，在MegaRAP1 d3结合LRP2CR89方面249、251和256位点突变是阳性影响，而在结合LRP1 CR3-5方面256和270位点突变是阴性影响，这似乎基本上说明了在结合这2种受体片段方面MegaRAP1 d3和野生型RAP d3之间的差异性。

本工作的一个前提是在CR对的钙离子结合环内A，C，A’和C’位点氨基酸是对RAP结合亲和力的关键因素，对RAP变体结合也相似地重要。为了验证这种观点，制备LRP2 CR89突变体，其中在这些位点天然的、非规范的残基用非天然的、规范的残基连续地取代。如上面定义，LRP2 CR89的A，C，A’，C’串联是YVWR。突变体包括LRP2 CR89 Y1042W(WVWR)，LRP2 CR89 V1047D(YDWR)，LRP2 CR89 R1088D(YVWD)，LRP2 CR89V1047D R1088D(YDWD)，LRP2 CR89 Y1042W V1047D R1088D(WDWD)，LRP2 CR89 Y1042W V1047D(WDWR)，LRP2 CR89 Y1042W R1088D(WVWD)。通过固相分析法检测每一LRP2 CR89突变体与RAP d3和MegaRAP1 d3两者的结合。仅YVWD突变体保持与MegaRAP1 d3的显著结合，而相对于RAP d3亲和力大约减少2倍(图6和表3)。位点C突变体，伴随这个四聚体序列YDWR串联体不能可检测地结合MegaRAP1 d3，如同其它单一突变或涉及A或C位点突变组合一样。有趣的是，名义上保守的Y1042W突变单独就足以阻止与MegaRAP1 d3的结合。在LRP2 CR89内A’位点为色氨酸，为野生型RAP d3结合的规范残基，其在我们的研究中没有突变。当A，C和C’位点的氨基酸置换对MegaRAP1 d3结合有强烈的阴性影响时，这些置换没有大大提高对RAP d3的亲和力，尽管在其它CR对如LRP1 CR56内氨基酸置换对RAP d3是优选的。我们发现在A，C，A’和C’位点RAP d3与WVWD和WDWD组合的结合略有增加。这些结果表明在钙离子结合环内的一些氨基酸对于RAP和RAPv2A结合特点很重要，但它们单独作用不足以达到这样的效果。

作为一般性筛选方法，噬菌体库筛选试验对另外的CR蛋白应用。分离出的变体序列被列在表4和图8中。构建人VLDLR的最后3个CR结构域的起始VLDLR CR6-8，用作仅仅编码RAP d3突变体的噬菌体展示库的筛选底物。在五轮筛选后，8个随机挑选的克隆中的5个有相同的突变组：R205S，E251R，K256L，K270E，R296L，G313D。为了固相结合研究表达这个VRAP1)d3序列变体。比较VRAP1 d3，MegaRAP1 d3和RAP d3与LRP1 CR3-5，LRP2 CR89和VLDLR CR6-8的结合。相似的变体序列，E251T，K256I，K270E，R296L，在VLDLR CR78上选择。利用相同的d3库，我们也对3个来自人matriptase的CR对，MAT CR12，MAT CR23和MATCR34进行筛选。通过对matriptase对的第6轮筛选，噬菌体库分解出主要序列。在MAT CR23上选择的主要序列是E251G，K256R，K270W。这个变体被命名为MatRAP1(RAP vMA)。在MAT CR34上选择的主要序列是S232P，E239G，E246G，E251L，K256P，I266T，A267V，H268R，K270P，H273Y，R287H，H290Y，K298R，S312F。这个变体被命名为MatRAP2(RAPvMB)。在来自FDC-8D6的CR对上也进行筛选实验。选择的主要序列是K256S，K270S，L271M，D279Y，V283M，K305T，K306M。这个变体被命名为320RAP1。

为了检测RAP d3序列变体长度最小化的程度，按照上面所述采用PCR制备MatRAP1的连续截短片段，经表达、纯化并检测其结合(图9)。去除10个氨基酸，其亲和力略有减少，但从N-端去除31和42个氨基酸导致亲和力相比全长d3变体增加高达3倍。进一步N-端截短，以另外的10个氨基酸(总共52)开始，导致结合完全丧失。最好的N-端截短变体(MatRAP1N-42)随后的C-端截短导致结合亲和力更进一步的显著增加，以C-端连接体和亲和标记物的去除带来2倍的增加(相对全长6倍增加)开始，然后在C-端去除另外6个氨基酸带来4倍的增加(相对全长12倍增加)。更进一步C-端截短，以另外19个氨基酸开始，导致结合完全丧失。最好的截短的变体由243-313位氨基酸组成(71个氨基酸)。为了验证这个修饰对提高亲和性的一般性，我们制备相同的截短320RAP1。得到的这种变体的截短形式结合FDC-8D6抗原对的亲和力与全长变体相比有3.5倍的提高(图10)。

VRAP1 d3和VLDLR CR78结合的表观解离常数检测为44±9nM。然后我们比较RAP d3，MegaRAP1 d3，VRAP1 d3，MatRAP1 d3和MatRAP2 d3(每种浓度为80nM)与14种CR对或3联体的结合，包括与LRP1 CR3-5，LRP2 CR89，LRP2 CR2728，LRP2 CR3031，LRP2 CR34-36，LRP2 CR3536，VLDLR CR78，VLDLR CR6-8，LRP6 CR1-3，LRP6 CR12，LRP6 CR23，MAT CR12，MAT CR23和MAT CR34的结合(图7)。如前，RAP d3仅结合LRP1 CR3-5。MegaRAP1 d3仅结合LRP2 CR89。VRAP1d3结合VLDLR CR78和VLDLR CR6-8，其为一包含CR78对的3联体。MatRAP1和MatRAP2结合MAT CR12和MAT CR23但完全不结合其它CR对。

除了在CR对和三联体上筛选外，整个含CR对的人蛋白用作RAP d3变体噬菌体筛选操作的靶点。这些市售的蛋白包含corin胞外结构域、LRP6、FDC-8D6抗原和补体因子I。筛选按已述的分离的CR对和3联体完全一样进行。

实施例2

采用体外和体内实验评估RAP变体或CR特异性抗体

RAP变体或CR特异性抗体被用作治疗剂或用于运输治疗剂或诊断剂穿过血脑屏障或其它类型组织膜以治疗许多种人体病变或疾病。体外活性或运输检测和体内RAP变体活性或分布的测量是为评估RAP变体效力方法的例子。这些检测的例子如下所述。

识别本文所述的重复的CR结构域的CR特异性抗体可采用本领域公知的任何方法进行制备，相比其它CR对而言，可筛选如此制备的抗体以相对较高地与所需CR对结合。然后检测如此选择的抗体与所需含CR蛋白的结合，并与所述家族中一个或多个其它含CR蛋白比较，。可检测满足这些条件的抗体，单独地或与其它活化剂缀合，检测其靶向所需组织的能力，受体活性的改变，和/或采用如下所述的示范检测预防或治疗疾病。

采用matriptase-选择的RAP变体的体内抗肿瘤检测-为了评估matriptase-选择的RAP变体或CR特异性抗体对肿瘤形成和发展的拮抗作用，至少采用2种体内模型。第一种模型利用裸鼠接种人肿瘤细胞系，已在文献中有详细描述。这种系统用于检测RAP变体或CR特异性抗体对减缓肿瘤发展的能力。第二种模型利用转基因小鼠模型，该转基因小鼠模型在角蛋白启动子的控制下过量表达小鼠matriptase，在上皮组织限制性地表达。这种模型之前也有描述(List等人，Genes and Development，2005，19：1934-1950)。

利用重组MDCK细胞进行LRP2和VLDLR-选择的RAP的体外转运检测-为了评估RAP变体或CR特异性抗体的跨膜转运，使用体外转运检测。体外培养表达人LRP2(LB2)模拟受体(minireceptor)和全长人VLDLR的稳定转染的MDCK细胞。这些细胞平铺于0.4μm均匀孔径聚乙烯膜插入式Transwell细胞培养板(Costar，Cambridge，MA)。细胞按2x10⁵/ml密度接种，在补充10％FBS的DMEM中培养。每3天换液。细胞置于5％CO₂ 37℃培养箱内。转胞吞研究重复进行3次。转运检测前20分钟，Transwell细胞板的插膜用转运缓冲液(含25mM HEPES和0.1％白蛋白的Hank’s平衡盐溶液)在37℃下平衡。通过加入¹²⁵I-RAP变体(1μCi/ml)和⁹⁹mTc-白蛋白(2μCi/ml)到上端或下端的小室启动转运实验。在整个实验期间细胞板保持在37℃并以130rpm温和晃动。在加入标记蛋白后5，10，15，20，30，40，50，和60分钟时间点，每一培养孔的上端和下端小室各取10μ样品。在60分钟时，在上端和下端小室的剩余液体被移入置于冰上的分离的试管。来自¹²⁵I和⁹⁹mTc的总放射强度采用双通道程序用γ-计数器同时测量。转运后完整的RAP和白蛋白的量可通过酸化沉淀和比较样品中溶解部分或不溶部分的放射性计数来测量。

小鼠RAP和RAP变体组织分布测量-为了确定RAP变体或CR特异性抗体体内转入组织(transcytose tissue)的能力，测量来自处理动物的组织样品中RAP变体或CR特异性抗体的组织分布。

雄性CD1小鼠，称重25-35g(Charles River Laboratories)，采取腹腔注射30mg/kg戊巴比妥钠和30mg/kg氯胺酮麻醉。然后每一小鼠通过左侧颈静脉推注¹²⁵I-RAP或RAP变体或CR特异性抗体和¹³¹I-白蛋白作为血管间隙标记(1μCi每个标记蛋白溶于含1％白蛋白的乳酸钠林格液)。在指定的时间间隔(注射后1-60分钟)，通过割开右颈总动脉收集血液，小鼠被处死。收集脑和外周组织样品，进行重量和放射性检测。分布体积按照本领域的公知技术计算。组织样品放射性的减少表明RAP变体与标记的野生型RAP竞争结合，并取代野生型RAP内化。

在细胞增殖检测中LRP6-选择的RAP变体的抗增殖作用测量-LRP6过量表达与增强的致瘤性相关。RAP蛋白是LRP6潜在的结合体，RAP变体可能用于抑制RAP/LRP6相互作用，或用于将药物转运到LRP6表达细胞。为了检测RAP变体调节LRP6介导细胞增殖的能力，进行细胞增殖检测。

用LRP6表达构建体转染的HT1080细胞(Li，(2004)Oncogene 23，9129-9135)接种于6孔平板(5x10⁴细胞/孔)中。RAP变体和其它测试化合物以5-50nM溶于生长培养基。每天换液和收获细胞。用Vi-Cell细胞分析仪计数细胞和对生存力评分。通过GraphPad Prism软件，不同实验条件下的倍增时间以非线性回归获得。RAP变体的存在下细胞增殖减少表明所述RAP变体是能诱导细胞增殖的LRP6的有效抑制剂。相似的检测也可用CR特异性抗体进行。

利用软琼脂集落检测LRP6-选择的RAP变体的抗增殖作用-用LRP6表达构建体转染的HT1080细胞在包被琼脂层(含0.5％琼脂和6％FBS的DMEM培养液)的6孔平板中培养。细胞接种在含2x10³细胞的第二层用含0.33％琼脂、6％FBS的DMEM培养液中。所述琼脂和细胞用培养基覆盖以防变干。测试化合物，包括RAP变体，直接加入到培养基中，使之与细胞孵育。培养基每隔3天换液。每个细胞系准备3份细胞孔。孵育3周后，对直径大于0.1mm的集落评分。RAP变体出现导致集落形成减少表明RAP变体是能诱导细胞增殖的LRP6的有效抑制剂。

在肿瘤发生的裸鼠模型中检测LRP6-选择、matriptase-选择的和FDC-8D6-选择的RAP变体的抗肿瘤作用的测量-为了检验体内RAP变体对LRP6、matriptase或FDC-8D6抗原抑制的效果，应用致瘤性的实验动物模型。相似的检测也用CR特异性抗体进行。

雌性无胸腺裸鼠(4-5周龄)(Harlan Sprague-Dawley)(Indianapolis，IN)在侧腹皮下注射用LRP6表达构建体转染的HT1080细胞(6x10⁶细胞在200μL无血清含50％ Metrigel基质的DMEM(BD Biosciences)中)、CWR22R前列腺癌细胞(matriptase)(67)或L3055 Burkitt’s淋巴瘤细胞(FDC-8D6抗原)(36)。选择的RAP变体，或仅载体溶于无菌PBS，每两天尾静脉注射接种肿瘤细胞的小鼠或对照小鼠。肿瘤大小每7天测量一次，肿瘤体积采用宽(a)和长(b)测量结果计算得到(a2x b/2，其中a＜b)。

在培养的成骨细胞中检测RAP变体对LRP5-依赖的Wnt信号传导的影响-通过LRAP5的Wnt信号传导已被证实可增加成骨细胞分化、抑制破骨细胞活性和提高骨沉积(Westendorf，(2004)Gene 341，19-39；Zhang，等人，(2004)Mol Cell Biol 24，4677-4684；Mizuguchi，等人，(2004)J HumGenet 49，80-86)。因为RAP结合LRP5中的CR，所以RAP变体可用于通过这个受体调控Wnt信号传导。RAP变体调控Wnt信号传导的能力用培养的成骨细胞检测。相似的分析也用CR特异性抗体进行。

成骨细胞系MG63表达大量的LRP1但不表达VLDLR。SAOS-2细胞表达大量VLDLR但几乎不表述LRP1(美国典型培养物中心(ATCC)编号#HTB-85)。MG63和SAOS-2细胞在37℃，10％CO2，补充10％FBS的DMEM中生长。培养基中加入Wnt7a诱导Wnt信号通路，并分别加入缓冲液，DKK-1，Mesd，RAP或RAP变体。用冰浴的PBS清洗后，收集细胞，然后采用100mM Tris-HCl，pH 7.4，140mM NaCl，2mM DTT，2mMPMSF和1x Complete^TM蛋白酶抑制剂(500μl/孔)在玻璃Dounce匀浆仪中匀化。匀浆液以500xg离心10分钟，然后上清液进一步在4℃下以100,000xg离心90分钟。采用来自Cell Signaling Technology的β-联蛋白-特异性抗体通过Western印迹检测澄清的上清液中β-联蛋白的水平。采用ECL系统检测免疫反应性蛋白。或者，细胞首先用0.5μg的TOP-FLASH TCF荧光素酶构建体(Upstate Biotechnology)转染，接着用0.5μg β-联蛋白表达载体，0.5μg Wnt1表达载体，或空白pcDNA3载体转化。β-半乳糖苷酶表达载体(Promega，Madison，WI)被用作判断转染效率的内参照。48小时后，换液，然后分别加入缓冲液，DKK-1，Mesd，RAP或RAP变体。继续孵育6小时后，细胞被裂解，然后荧光素酶和β-半乳糖苷酶的活性采用酶检测试剂盒(Promega)检测。荧光素酶的活性采用分光仪用双荧光素酶检测系统(DualLuciferase Assay system)(Promega)检测。荧光素酶活性针对β-半乳糖苷酶的活性标准化。

实施例3

RAP环肽的制备和鉴定

RAP环肽的制备和结合亲和力鉴定如下。RAP肽用Abgent(San Diego)制备。采用HPLC纯化肽，通过质谱法鉴定肽。NS0-表达的、纯化的重组小鼠VLDLR胞外结构域和重组人LRP1配体结合簇II购自R&DSystems(Minneapolis)。无标签的RAP d3由GeneScript(San Diego)表达和纯化。人RAP来自Dr.Guojun Bu(Washington University in St.Louis，School of Medicine)。Bradford法用于蛋白定量。

固相结合分析如下进行。溶于补充5mM CaCl₂(TBSC)的TBS pH 8中的重组小鼠VLDLR胞外结构域氨基酸1-798，C-端六聚组氨酸，1μg)或rhLRP1簇II(氨基酸786-1165，C-端Fc，1μg)结合到Nunc Maxisorp^TM 96孔板4℃下过夜。细胞孔用TBSC清洗然后用含2％BSA的TBSC封闭。溶于补充0.05％Tween-20的上述封闭缓冲液中的肽与不同浓度的固相化的受体室温下孵育2小时。为了提供非特异性结合的测量，在50mM EDTA存在下进行同样的实验。对照孔不含任何加入的肽，额外的对照确定抗体和受体之间没有交叉反应。培养孔用TBSTC清洗，然后被结合的肽用链霉抗生物素-HRP(Pierce)或抗RAP多克隆抗体(1∶1,000，Raptor Pharmaceutical)检测。抗RAP多克隆抗体和测试肽的结合通过Western blotting定性确定(数据未公开)。多余的链霉抗生物素-HRP或一级抗体被弃去，在与二级抗体孵育前清洗培养孔，必要时，所述二级抗体为HRP-缀合羊抗兔IgG(Bio-Rad)。采用TMB试剂(BioRad)显示颜色。采用微板分光光度计Molecular Devices)检测450nm下的光吸收。分析之前，在EDTA存在下得到的光吸收值减去在钙存在下得到的光吸收值。对数据绘图，用单点结合假设通过非线性回归分析获得K_d值(GraphPad Prism)。

细菌表达的、纯化的、无标签的RAP d3肽含成熟的人RAP第201-309位氨基酸，其购自GeneScript。这个肽缺少C-端HNEL四肽。C-端包含仅有的半胱氨酸以促进亲和标记。所述RAP d3肽结合到马来酰亚胺-PEO₂-生物素(Pierce)采用盐洗和用活化的巯基琼脂糖珠(GE Biosciences)捕捉未反应的肽来纯化得到的缀合物。所有其它肽采用固相肽合成法制备。检查RAPd3与LDLR CR3和4之间的复合物的结构数据，表明可进行RAP d3的显著截短而不去除与CR对构成接触面的残基。既然接触面侧翼的某些序列牵涉到折叠稳定性，我们有理由认为在这些序列缺失条件下可引入非天然二硫键作为稳定折叠结构的手段。为了生成RAP d3的最小化形式，mRAPc(SEQID NO：99)，与AP d3 LDLR CR3和4的复合物的结构中定位于N-端至螺旋1上的H249和C-端至螺旋2上的T303的残基对紧密相对，鉴定和用甘氨酸替换该残基对。这些置换为A242G和R314G。在这些位点甘氨酸的引入意图允许螺旋被打断为邻近的非天然的螺旋间二硫键。为了二硫键的形成，2个半胱氨酸在螺旋1和2内G242和G314前后分别被置换。这些置换为E241C和I315C。C-端至螺旋2的C315没有包含另外的残基。所述序列生物素-GGSGG(SEQ ID NO：102)被加到N-端至螺旋1的E241C，以便采用链霉抗生物素-受体缀合物有效检测。在固相化合成期间这种肽通过分子内二硫键的形成而环化。对于mRAPc肽的线性化对照，被命名为mRAP，两个半胱氨酸用丝氨酸取代。作为一附加的mRAPc对照，制备带有K256A和K270E突变的另一形式相同的肽，mRAPcko。之前已表明这些突变显著地降低RAP d3对LRP1的亲和力。

这些肽对LRP1和VLDLR，LDLR家族其它受体的结合亲和力如下测量。NS0-表达的和纯化的hrLRP1或mVLDLR(R&D Systems)用来包被96-孔培养板的孔。在50mM EDTA存在和不存在条件下，不同稀释浓度的测试肽与固相化的受体孵育，重复3次。全面清洗后结合的肽用链霉抗生物素-HRP检测。在EDTA存在下测得的结合值减去在EDTA不存在下测得的值，以测定钙-依赖结合水平。对校正的值绘图，使之符合用GraphPadPrism通过单点结合假设的非线性回归分析。结果在图12A和12B显示。

mRAP(SEQ ID NO：107)和mRAPcko不具有对hrLRP1簇II的可测的亲和力，mRAPc以钙-依赖的方式以高亲和力结合，其K_d为10±2nM。这个结合亲和力和在这个系统中的全长RAP d3的亲和力(8±1nM)很难区别。此外，也测量这些肽对小鼠VLDLR的整个胞外结构域的结合。再比较结合亲和力，mRAPc解离常数为5±1nM而全长RAP d3解离常数为1±0.2nM。

实施例4

另外的RAP环肽的鉴定

按上述开发另外的RAP环肽，并检测它们结合LRP1受体的能力。

为了生成mRAP-8c肽，采用来自246-312位氨基酸截短的RAP肽序列被，按如下进行氨基酸置换：E246C，L247G和L311G和S312C，mRAP-8c肽如SEQ ID NO：100所示。为了生成进一步截短的肽，mRAP-14c，使用一从250位开始309位结束的截短的RAP肽。为制成mRAP-14c按如下进行氨基酸置换：F250C和L308G和Q309C。在mRAP-14c的情况下半胱氨酸后没有甘氨酸置换，因为在复合体结构中来自螺旋1的F250C侧链已经直接指向(potinted)螺旋2。mRAP-14c序列如SEQ ID NO：101所示。开发另一截短的环肽Heptide。所述Heptide序列来自RAP的246-313位氨基酸。为了生成Heptide，如下进行氨基酸置换：E246C，L247G，G280A，L311A和S312C。Heptide的序列如SEQ ID NO：103所示。

如上评估mRAP-8c和mRAP-14c肽对LRP1和VLDLR受体结合。mRAp-8c以近似4-6nM的亲和力(2次单独检测)结合LRP1(簇II)受体而mRAP-14c以近似21nM的亲和力结合。所述Heptide环肽以近似3.5nM的亲和力结合LRP1。

这些结果表明几种不同的RAP环肽能以高亲和力结合LRP1受体。

实施例5

体外RAP环肽与细胞的结合

为了测定RAP环肽与细胞表面上的受体结合的能力，在培养细胞系存在下检测结合。为了检测RAP环肽是否能被培养的细胞表达的全长LRP1结合和胞吞，采用胞吞依赖性的毒性检测。使用2个细胞系，仅表达高亲和力的RAP受体LRP1的中国仓鼠卵巢CHO-K1细胞和用作对照的LRP1表达缺失的CHO-K1突变体。这些细胞在补充2.5％胎牛血清的BioWhittakerUltraCHO培养基(Lonza，Basel，Switzerland)中培养。细胞接种于12孔细胞培养板中。生物素化的mRAPc与等摩尔量的链霉抗生物素和细菌毒素肥皂草毒蛋白(ZAP，Avanced Targeting Systems，San Diego，CA)的缀合物结合。混合物采用不含酚红且补充10％FBS的MEM(Mediatech，Manassas，VA)稀释至100nM。缀合的mRAPc(100nM)和对照试剂(单独的mRAPc，100nM，单独的链霉抗生物素-肥皂草毒蛋白，100nM，单独的肥皂草毒蛋白，1mM)与融合细胞培养，48小时后用MTT法(Invitrogen，San Diego，CA)检测细胞死亡。

结果如图12所示。不管采用的细胞类型，mRAPc肽单独使用不影响细胞存活。单独链霉抗生物素-肥皂草毒蛋白缀合物减少野生型CHO-K1近10％活细胞数量，而对LRP-缺失的细胞没有影响。mRAPc和细胞毒素缀合物的组合减少野生型CHO-K1近40％活细胞数量，而对LRP-缺失的细胞仅减少5％活细胞数量。

这些数据表明通过LRP1胞吞途径内部化毒素，mRAPc可以受体依赖的方式显著地增强细胞毒性缀合物的毒性。

也进行结合抑制试验，以测定mRAPc肽干扰RAP d3结合LRP1(簇II)的能力，以及LRP配体α-2-巨球蛋白和uPA/PAI-1结合的能力。为了用链霉抗生物素或抗生物素抗体络合，mRAPc肽用N-端生物素残基安装，该残基用一五肽连接体GGSGG)与RAP序列分开。采用溶于补充5mMCaCl₂的TBS pH 8(TBSC)的重组人LRP1簇II(氨基酸786-1165，带C-端Fc标签，1μg，R&D Systems，Minneapolis，MN)包被NuncMAXISORP^TM 96孔板，4℃下过夜，进行固相结合试验。通过ELISA方法获得数据。细胞孔用TBSC清洗然后用含2％BSA的TBSC封闭。在涉及链霉抗生物素和生物素化肽复合物的检测方法中，在有或无抑制剂的条件下，溶于补充0.05％Tween-20的上述封闭液的LRP1配体(RAP d3(2nM)，胰蛋白酶活化的α-2-巨球蛋白(1nM)或uPA/PAI-1(10nM)与固相化的受体室温下孵育2小时。在涉及抗生物素抗体和生物素化肽复合物的检测方法中，所有抑制剂溶液与固相化的LRP1-C2在清洗之前预孵育，接着与配体孵育。既然CR对的配体结合能力需要钙，在50mM EDTA的存在下进行相同反应，以测量非特异性结合。对照细胞孔不包含任一被加入的抑制剂。细胞孔用补充5mM CaCl₂和0.05％Tween-20的TBS溶液清洗。结合的配体采用抗-S-肽-HRP缀合物(Abcam，Cambridge，MA)，抗-α-2-巨球蛋白-HRP或抗-PAI-1-HRP来检测。弃去多余的HRP缀合物，清洗细胞孔。采用TMB试剂(BioRad)显示颜色。采用微板分光光度计(Molecular Devices，Palo Alto，CA)检测450nm下的光吸收。

在链霉抗生物素或抗生物素抗体存在和不存在的条件下检测mRAPc抑制重组RAP d3与LRP1-C2结合的能力。这个单体肽的抑制度(EC₅₀)为32±12nM(图14A)。但在其它相同条件下，与一半摩尔数量的链霉抗生物素组合的mRAPc EC₅₀为4±2nM，比只有肽时有近8倍的提高(图14)。成熟RAP的EC₅₀为0.5±2nM，比RAPc单体肽好64倍，比装配在链霉抗生物素上的肽好8倍。所述链霉抗生物素单独不具有抑制效果。在链霉抗生物素的存在下看到抑制作用增强多倍，这与最小化RAP结构域的多聚化导致亲和力的提高是一致的。

如果抗生物素抗体对生物素相对较弱的单价亲和力(低纳摩尔KD)，就可假设由2个适当邻近的受体结合肽和一单个抗体组成的多价复合物的预装配将稳定这种肽-抗体复合物。因此，这种抗体和肽以1-3的摩尔比可与固相化受体孵育，然后清洗，随后加入RAP d3配体。对对照组、单独肽组、单独抗体组和RAP组也进行相同的步骤。采用这种方法，就单独mRAPc肽而言得到EC₅₀为17±1nM(图14B)。mRAPc和抗生物素抗体组合产生的EC₅₀为2±1nM。全长RAP的EC₅₀为0.3±7nM。单独抗体没有抑制作用。当采用四价链霉抗生物素时，二价抗体的加入显著地提高肽抑制RAP d3与LRP1-C2结合的能力。接着检测多聚化的mRAPc的效果。在单一配体浓度条件下，所述多聚化的mRAPc与mRAPc单体和全长RAP进行比较，比较2个其它配体与LRP1-C2、与胰蛋白酶活化的α-2-巨球蛋白和uPA/PAI-1的复合体结合的抑制。链霉抗生物素和mRAPc的复合体以EC₅₀1±1nM抑制异源配体的结合，比单独的单肽的7±1nM好7倍(图14C)。在两种情况下，链霉抗生物素和mRAPc的复合物以近似在RAP和mRAPc单体的EC₅₀中间值抑制结合。

上述结果证明多价RAP结合多价受体的亲和力优势。这些结果表明在链霉抗生物素或免疫球蛋白上多聚的合成肽序列可部分重现金长RAP抗3个LRP1配体的抑制效力。

实施例6

RAP环肽体内给药

前期结果证明在体外截短的RAP环肽高效结合细胞表面的LRP1受体。为了检测体内RAP环肽的效力，进行生物分布检测。

研究在加拿大蒙特利尔Charles River实验室进行。生物素化mRAPc肽，生物素化RAP蛋白或缓冲液与³⁵S-SLR-链霉抗生物素(0.7mCi/mL，300Ci/mmol，GE Healthcare)结合，接着采用D-TUBE^TM透析盒(14kDMWCO，EMD Biosciences/Merck，Darmstadt，Germany)在磷酸盐缓冲液(PBS)中透析。雄性Sprague-Dawley大鼠(6-8周龄)通过尾静脉注射测试材料(2μL/g；～20μCi/大鼠)。注射戊巴比妥(200mg/kg)后30分钟处死动物。所有实验个体按照加拿大动物关怀委员会设立的实验动物人道实验操作指南进行。尸体被冷冻，包埋在羧甲基纤维素中，切片以便用Fuji BAS-2500磷光仪进行半定量全身放射自显影法(QWBA)分析。对每一动物挑选出在检测器官内清晰描绘的区域进行发光分析(Fuji Image Reader v1.1和FujiImage Gauge v3.12)。数值以每单位面积光刺激的发光单位表示标识(PSL/mm2)。

若确定多聚化的mRAPc抑制结合LRP1-C2的效力，则测定这种多聚化肽的功效及其模拟全长RAP静脉注射后体内生物分布状态的能力。这种特点以肝脏初期积聚为特征(Warshawsky等人，J Clin Invest 92：937-944，1993)，其中流经肝细胞上的LRP1的血液中的分布很高(Beisiegel等人，Nature 341：162-164，1989；Moestrup等人，Cell Tissue Res 269：375-382，1992)。³⁵S-标记的链霉抗生物素制剂与生物素化mRAPc肽以20∶1的摩尔比结合，或与体内生物素化RAP以5∶1的摩尔比结合，静脉注射进入大鼠。单独标记的链霉抗生物素用作对照。据报道链霉抗生物素静脉注射后富集在肾脏，但在肝脏不显著(Wilbur等人，Bioconjug Chem 9：100-107，1998；Rosebrough等人，J Nucl Med 37：1380-1384，1996)。

生物素化RAP制剂以高于单独链霉抗生物素2.7倍的水平分布到肝脏，而在其它所有测试组织分布水平近似或更低(图15)。在标记的链霉抗生物素上预组合的mRAP肽以高于单独链霉抗生物素7倍的水平分布到肝脏，而在其它所有测试组织中与对照比较分布水平近似或更低(图15)。值得注意的是血液中高浓度竞争性LRP1配体明显不能阻止肝脏摄取这种肽复合体，之前关于全长RAP静脉给药的观察与本文一致(参见Isbell等人，Biochem Biophys Res Comm 364：614-619，2007)。

这些生物分布的结果表明这些较小的、基于肽的RAP形式可证明在靶向肝脏的药理学试剂的开发方面是有益的。

实施例7

RAP环肽的缀合物

RAP肽和RAP环肽可被缀合不同的细胞毒性试剂或其它试剂以递送这些试剂到表达RAP受体的细胞。肽缀合物可采用本领域公知技术制备。

示范RAP环肽缀合物在图13描述，图13显示Heptide与二氟甲基鸟氨酸缀合(Heptide-八-二氟甲基鸟氨酸)和Heptide与酪氨酸激酶抑制剂SU6668缀合(Heptide-单SU6668)。图13A中的Heptide肽(SEQ ID NO：104)包含5肽连接体GGSGG(SEQ ID NO：102)。Heptide-单SU6668(图13C，SEQ ID NO：105)通过SU6668部分与heptide N-端甘氨酸缀合而生成。Heptide-八-二氟甲基鸟氨酸(DMFO)通过将赖氨酸加入到胃蛋白肽(peptapeptide)的N端甘氨酸而生成。这个N端赖氨酸可通过加入赖氨酸(K₁)而修饰，该赖氨酸(K₁)进一步连接2个赖氨酸(K₂，K₃)，其每一个缀合2个DMFO部分的。第一个赖氨酸(K₁)也连接包含2个DMFO部分的鸟氨酸残基，并进一步连接到与2个DMFO残基缀合的最后一个赖氨酸残基(K₄)(图13B和SEQ ID NO：106)。

本领域普通技术人员利用本文所述的任何试剂或本领域公知的试剂可制备出另外的缀合物。

实施例8

缀合的RAP环肽的体外给药

肝细胞系被用来评估细胞表面结合的RAP环肽以及与化学试剂缀合的RAP环肽。

肝细胞癌(HCC)细胞系，如Heb3B、HepG2和Huh-7，或正常人肝细胞系，如THLE-5b或原代肝细胞(例如参见，Shimizu等人，Metabolism.56：1478-85，2007；Agrawal等人，Stem Cells.2008 Feb 21)，按照本领域公知技术培养。培养的细胞用与以下缀合的RAP环肽处理：细胞毒性试剂，如二氟甲基鸟氨酸(RAP环肽-八-二氟甲基鸟氨酸)或SU6668(RAP环肽-单SU6668)，仅仅RAP环肽，或仅仅二氟甲基鸟氨酸或SU6668。细胞采用下列浓度范围内的试剂处理：0.05-50μM RAP环肽-八-二氟甲基鸟氨酸，0.2-200μM RAP环肽-单SU6668，仅仅0.05-200μM RAP环肽，0.05-50μM二氟甲基鸟氨酸或0.2-200μM SU6668。评估缀合的RAP环肽对肝细胞培养物的细胞抑制和细胞毒性效果。

与RAP环肽或缀合的RAP环肽处理后，按照本领域公知的技术检测细胞抑制和细胞毒性效果(参见，Elmore等人，In Vitr Mol Toxicol.14：191-207，2001；Miret等人，J Biomol Screen.11：184-93，2006)，在这些测试试剂的存在测定细胞生长或细胞死亡的程度。

缀合的RAP环肽可减少培养中细胞生长的能力表明这些环肽结合细胞表面的受体，是一种递送试剂进入细胞导致生物学上可测的效应的有效方式。

实施例9

RAP环肽体内给药

为了评估体内结合RAP环肽的受体，以及评估体内这种分子递送细胞毒性化合物至细胞的能力，使用人肝细胞癌的同位模型。

为了在动物内生成同位肿瘤，人肝癌细胞系被植入裸鼠、大鼠或其它合适动物，使肿瘤细胞在体内生长。用于同位模型的HCC细胞系包括但不限于，上述所述的那些细胞，如Heb3B、HepG2和Huh-7。本领域公知HCC同位肿瘤模型，其在，如Okubo等人(J Gastroenterol Hepatol.200722：423-8)；Armengol等人，(Clin Cancer Res.2004 10：2150-7)；和Yao等人，(Clin Cancer Res.20039：2719-26)中有描述。

为了首先确定体内缀合的RAP环肽和对照的给药剂量范围，进行小剂量范围实验，用每组5只小鼠，给予缀合的RAP环肽(如，RAP环肽-八-二氟甲基鸟氨酸(多达200mg/kg/天)，RAP环肽-单-SU6668(多达200mg/kg/天))，仅仅RAP环肽(多达200mg/kg/天)，仅仅二氟甲基鸟氨酸或SU6668。这些测试试剂每天静脉注射或腹膜内给药2周(QDx14)，然后检测这些实验动物的体重、任何临床表现和研究终点时临床病理学和组织的组织病理学方面的变化。

为了进行药效研究，用每组8-10小鼠，3个测试剂量范围的上述化合物(RAP环肽-八-二氟甲基鸟氨酸、RAP环肽-单SU6668、仅仅RAP环肽、二氟甲基鸟氨酸或SU6668)给予接受人HCC细胞的动物和对照动物。测试试剂静脉注射或腹膜内注射给药，以适当的频率给药，如每天一次持续4周(QDx28)，每天一次持续3周(QDx21)或每天一次持续2周(QDx14)。然后采用本领域公知的技术，评估实验动物的体重、临床表现、和体内药效测量，如肿瘤体积、肝脏组织病理学和常规临床病理学方面的任何变化。

缀合的RAP环肽可减少体内肝细胞性癌细胞生长的能力表明这些环肽结合肿瘤细胞表面的细胞受体，是一种将试剂递送进入细胞导致生物学上可测的效应的有效方式。动物模型中高效的肿瘤死亡的实证表明缀合的RAP环肽是递送细胞毒性试剂至患有肝癌或其它涉及RAP受体的病变的人的肿瘤细胞的有效方式。

根据本发明所公开的内容，在此所公开并要求保护的所有组合物和/或方法均无需进行过多实验即可进行制备和实施。虽然根据优选实施方案对本发明的组合物和方法进行了描述，但对本领域技术人员而言，显而易见的是：在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对在此所述的组合物和/或方法以及所述方法的步骤或步骤的顺序进行改变。更具体而言，显而易见的是：可以用化学和结构上相关的某些试剂替换在此所述的试剂而得到相似的结果。对本领域技术人员而言，显而易见的是：所有这些相似的替换和改变均被认为落入所附权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念之内。

本文引用的所有文献的公开内容通过引用结合于此，引用的程度为，它们提供示例性的、程序上或其它的细节补充本文所述内容。

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56.ANDERSEN，O.M.，CHRISTENSEN，L.L.，CHRISTENSEN，P.A.，SORENSEN，E.S.，JACOBSEN，C.，MOESTRUP，S.K.，ETZERODT，M.，AND THOGERSEN，H.C.(2000)J.BIOL.CHEM.275，21017-24.

57.ANDERSEN，O.M.，SCHWARZ，F.P.，EISENSTEIN，E.，JACOBSEN，C.，MOESTRUP，S.K.，ETZERODT，M.，AND THOGERSEN，H C.(2001)BIOCHEMISTRY 40，15408-17.

58.OLSEN，B.R.(1999)J.CELL BIOL.147，909-12.

59.ANDERSEN，O.M.，PETERSEN，H.H.，JACOBSEN，C.，MOESTRUP，S.K.，ETZERODT，M.，ANDREASEN，P.A.，AND THOGERSEN，H.C.(2001)BIOCHEM.J.357，289-96.

60.ANDERSEN，O.M.，VORUM，H.，HONORE，B.，AND THOGERSEN，H.C.(2003)BMCBIOCHEM 4，7.

61.HORN，I.R.，VAN DEN BERG，B.M.，VAN DER MEIJDEN，P.Z.，PANNEKOEK，H.，AND VAN ZONNEVELD，A.J.(1997)J.BIOL.CHEM.272，13608-13.

62.ANDERSEN，O.M.，CHRISTENSEN，P.A.，CHRISTENSEN，L.L.，JACOBSEN，C.，MOESTRUP，S.K.，ETZERODT，M.，AND THOGERSEN，H.C.(2000)BIOCHEMISTRY 39，10627-33.

63.MEDVED，L.V.，MIGLIORINI，M.，MIKHAILENKO，I.，BARRIENTOS，L.G.，LLINAS，M.，AND STRICKLAND，D.K.(1999)J.BIOL.CHEM.274，717-27.

64.ZHENG，G.，BACHINSKY，D.R.，STAMENKOVIC，I.，STRICKLAND，D.K.，BROWN，D.，ANDRES，G.，AND MCCLUSKEY，R.T.(1994)J.HISTOCHEM.CYTOCHEM.42，531-42.

65.ORLANDO，R.A.，EXNER，M.，CZEKAY，R.P.，YAMAZAKI，H.，SAITO，A.，ULLRICH，R.，KERJASCHKI，D.，AND FARQUHAR，M.G.(1997)PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A.94，2368-73.

66.SIDHU，S.S.，LOWMAN，H.B.，CUNNINGHAM，B.C.，AND WELLS，J.A.(2000)METHODS ENZYMOL.328，333-63.

67.GALKIN，A.V.，MULLEN，L.，FOX，W.D.，BROWN，J.，DUNCAN，D.，MORENO，O.，MADISON，E.L.，AND AGUS，D.B.(2004)PROSTATE 61，228-35.

序列表

 

<110>赞克尔等人

 

<120>受体相关蛋白(RAP)环肽

 

<130>31075/42620A

 

<160>107

 

<170>PatentIn 版本3.3

 

<210>1

<211>1493

<212>DNA

<213>人

 

<400>1

tgagcggggg atgatggcgc cgcggagggt caggtcgttt ctgcgcgggc tcccggcgct     60

gctactgctg ctgctcttcc tcgggccctg gcccgctgcg agccacggcg gcaagtactc    120

gcgggagaag aaccagccca agccgtcccc gaaacgcgag tccggagagg agttccgcat    180

ggagaagttg aaccagctgt gggagaaggc ccagcgactg catcttcctc ccgtgaggct    240

ggccgagctc cacgctgatc tgaagataca ggagagggac gaactcgcct ggaagaaact    300

aaagcttgac ggcttggacg aagatgggga gaaggaagcg agactcatac gcaacctcaa    360

tgtcatcttg gccaagtatg gtctggacgg aaagaaggac gctcggcagg tgaccagcaa    420

ctccctcagt ggcacccagg aagacgggct ggatgacccc aggctggaaa agctgtggca    480

caaggcgaag acctctggga aattctccgg cgaagaactg gacaagctct ggcgggagtt    540

cctgcatcac aaagagaaag ttcacgagta caacgtcctg ctggagaccc tgagcaggac    600

cgaagaaatc cacgagaacg tcattagccc ctcggacctg agcgacatca agggcagcgt    660

cctgcacagc aggcacacgg agctgaagga gaagctgcgc agcatcaacc agggcctgga    720

ccgcctgcgc agggtcagcc accagggcta cagcactgag gctgagttcg aggagcccag    780

ggtgattgac ctgtgggacc tggcgcagtc cgccaacctc acggacaagg agctggaggc     840

gttccgggag gagctcaagc acttcgaagc caaaatcgag aagcacaacc actaccagaa     900

gcagctggag attgcgcacg agaagctgag gcacgcagag agcgtgggcg acggcgagcg     960

tgtgagccgc agccgcgaga agcacgccct gctggagggg cggaccaagg agctgggcta    1020

cacggtgaag aagcatctgc aggacctgtc cggcaggatc tccagagctc ggcacaacga    1080

actctgaagg cactggggag cccagcccgg cagggaagag gccagcgtga aggacctggg    1140

ctcttggccg tggcatttcc gtggacagcc cgccgtcagg gtggctgggg ctggcacggg    1200

tgtcgaggca ggaaggattg tttctggtga ctgcagccgc tgccgtcgcg acacagggct    1260

tggtggtggt agcatttggg tctgagatcg gcccagctct gactgaaggg gcttggcttc    1320

cactcagcat cagcgtggca gtcaccaccc cagtgaggac ctcgatgtcc agctgctgtc    1380

aggtctgata gtcctctgct aaaacaacac gatttacata aaaaatctta cacatctgcc    1440

accggaaata ccatgcacag agtccttaaa aaatagagtg cagtatttaa acc           1493

 

<210>2

<211>357

<212>PRT

<213>人

 

<400>2

Met Ala Pro Arg Arg Val Arg Ser Phe Leu Arg Gly Leu Pro Ala Leu

1           5                       10                  15

Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Gly Pro Trp Pro Ala Ala Ser His Gly

            20                  25                  30

Gly Lys Tyr Ser Arg Glu Lys Asn Gln Pro Lys Pro Ser Pro Lys Arg

        35                  40                  45

Glu Ser Gly Glu Glu Phe Arg Met Glu Lys Leu Asn Gln Leu Trp Glu

    50                  55                  60

Lys Ala Gln Arg Leu His Leu Pro Pro Val Arg Leu Ala Glu Leu His

65                  70                  75                  80

Ala Asp Leu Lys Ile Gln Glu Arg Asp Glu Leu Ala Trp Lys Lys Leu

                85                  90                  95

Lys Leu Asp Gly Leu Asp Glu Asp Gly Glu Lys Glu Ala Arg Leu Ile

            100                 105                 110

Arg Asn Leu Asn Val Ile Leu Ala Lys Tyr Gly Leu Asp Gly Lys Lys

        115                 120                 125

Asp Ala Arg Gln Val Thr Ser Asn Ser Leu Ser Gly Thr Gln Glu Asp

    130                 135                 140

Gly Leu Asp Asp Pro Arg Leu Glu Lys Leu Trp His Lys Ala Lys Thr

145                 150                 155                 160

Ser Gly Lys Phe Ser Gly Glu Glu Leu Asp Lys Leu Trp Arg Glu Phe

                165                 170                 175

Leu His His Lys Glu Lys Val His Glu Tyr Asn Val Leu Leu Glu Thr

            180                 185                 190

Leu Ser Arg Thr Glu Glu Ile His Glu Asn Val Ile Ser Pro Ser Asp

        195                 200                 205

Leu Ser Asp Ile Lys Gly Ser Val Leu His Ser Arg His Thr Glu Leu

    210                 215                 220

Lys Glu Lys Leu Arg Ser Ile Asn Gln Gly Leu Asp Arg Leu Arg Arg

225                 230                 235                 240

Val Ser His Gln Gly Tyr Set Thr Glu Ala Glu Phe Glu Glu Pro Arg

                245                 250                 255

Val Ile Asp Leu Trp Asp Leu Ala Gln Ser Ala Asn Leu Thr Asp Lys

            260                 265                 270

Glu Leu Glu Ala Phe Arg Glu Glu Leu Lys His Phe Glu Ala Lys Ile

        275                 280                 285

Glu Lys His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys

    290                 295                 300

Leu Arg His Ala Glu Ser Val Gly Asp Gly Glu Arg Val Ser Arg Ser

305                 310                 315                 320

Arg Glu Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr

                325                 330                 335

Thr Val Lys Lys His Leu Gln Asp Leu Ser Gly Arg Ile Ser Arg Ala

            340                 345                 350

Arg His Asn Glu Leu

        355

 

<210>3

<211>66

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-LRP6CR1F

 

<400>3

gcgataggat ccccaacatg ttctcctcag cagtttactt gtttcacggg ggaaattgac    60

tgtatc                                                               66

 

<210>4

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-LRP6CR2R

 

<400>4

gcgataaagc ttttatcaaa gcacttcaca gttcttctca tctgatttgt cctggcagtt    60

tgcatctcca                                                           70

 

<210>5

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-LRP6CR2F

 

<400>5

gcgataggat cccctgtatg ctcagagtcc cagttccagt gtgccagtgg gcagtgtatt    60

gatgg                                                                65

 

<210>6

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-LPR6CR3R

 

<400>6

gcgataaagc tttcactaag tcggataaca atccagttca tctgacttgt cactgcaatc    60

cac                                                                  63

 

<210>7

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-VLDLRCR6F

 

<400>7

gcgataggat cccacaccaa gtgtccagcc agcgaaatcc agtgcggctc tggcgagtgc        60

 

<210>8

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-VLDLRCR7F

 

<400>8

gcgataggat ccacttgccg acctgaccaa tttgaatgtg aggatggcag c                 51

 

<210>9

<211>64

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-VLDLRCR8R

 

<400>9

gcgataaagc ttttatcatt cgtttatatg acactctttc aggggctcat cactccagtc        60

cctg                                                                     64

 

<210>10

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-LRP2CR8F

 

<400>10

gcgataggat cccccacgga gcagtgtggc ttattttcct tcccctgtaa aaatggc        57

 

<210>11

<211>73

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-LRP2CR9R

 

<400>11

gcgataaagc ttttatcatg cgtgggtggg gcagttgtgc tcatcactgc catccacaca     60

gtcgttgcgt ttg                                                        73

 

<210>12

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-LRP2CR34F

 

<400>12

gcgataggat ccgatggtgc atactgccag gctactatgt tcgaatgcaa aaaccatgtt     60

tgtatcccgc                                                            70

 

<210>13

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-LRP2CR35F

 

<400>13

gcgataggat ccgatgt tcc ctgtaattca ccaaaccgtt tccggtgtga caacaatcgc    60

tgc                                                                   63

 

<210>14

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-LRP2CR36R

 

<400>14

gcgataaagc ttttatcata tattttcagc acatgttctt tcttttcctt tattgcaacc        60

cagttcatcg                                                               70

 

<210>15

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-ST14F1

 

<400>15

gcgataggat ccccatgccc ggggcagttc acgtgccgca cggggcggtg tatc              54

 

<210>16

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-ST14F2

 

<400>16

gcgataggat cctgcgacgc cggccaccag ttcacgtgca agaacaagtt ctgc              54

 

<210>17

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-ST14F3

 

<400>17

gcgataggat ccagttgtcc ggcccagacc ttcaggtgtt ccaatgggaa gtg            53

 

<210>18

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-ST14R1

 

<400>18

gcgataaagc ttttatcaac ccctgctcgt cgctgttgtc tccgcagtcg ttcacactg      59

 

<210>19

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-ST14R2

 

<400>19

gcgataaagc ttttatcaac tgcacccctg ctcgtcgctg ttg                       43

 

<210>20

<211>64

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-ST14R3

 

<400>20

gcgataaagc ttttatcagt cgcagtcctt ctcatctgag ccgtcgctac agtcctcctt     60

cccg                                                                  64

 

<210>21

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-LRP1CR3F

 

<400>21

gcgataggat ccccccagtg ccagccaggc gagtttgcc                        39

 

<210>22

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-LRP1CR5R

 

<400>22

gcgataagct ttcaataggc acacgaagca gactcatcag agcgg                45

 

<210>23

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-8D6AF

 

<400>23

gcgataggat cctcgtgccc acccaccaag ttccagtgcc gcaccagtgg cttatg    56

 

<210>24

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-8D65AR

 

<400>24

gcgataaagc ttttatcatc cacagccgag ctcgtcgctg gagtcgggac           50

 

<210>25

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-CR89YWF

 

<400>25

gtgcccaatt actggctctg tgatggag                28

 

<210>26

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-CR89YWR

 

<400>26

ctccatcaca gagccagtaa ttgggcac                28

 

<210>27

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-CR89V1047DF

 

<400>27

ctctgtgatg gagacgatga ttgtcatgat a            31

 

<210>28

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-CR89V1047DR

 

<400>28

tatcatgaca atcatcgtct ccatcacaga g                    31

 

<210>29

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-CR89R1088DF

 

<400>29

cacactggcg ctgtgacaaa gacaacgact gtgtggatgg c         41

 

<210>30

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-CR89R1088DR

 

<400>30

gccatccaca cagtcgttgt ctttgtcaca gcgccagtgt g         41

 

<210>31

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-RAP2KXF

 

<400>31

ccctcggacg tcagcgacat caagggcagc gtcctg               36

 

<210>32

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-RAP2KX2

 

<220>

<221>其他特征

<222>(29)..(30)

<223>n为a，c，g或t

 

<400>32

ctccagctgc ttctggtagt ggttgtgvnn ctcctcgatt ttggcttcga agtgcttgag         60

ctcct                                                                     65

 

<210>33

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-RAP2KX1

 

<220>

<221>其他特征

<222>(25)..(26)

<223>n为a，c，g或t

 

<400>33

aagcagctgg agattgcgca cgagnnbctg aggcacgcag agagcgtggg cgaacggc           58

 

<210>34

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-RAPmut1R

 

<400>34

ggtgcggggc ctcaccggt                                                      19

 

<210>35

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-MORPHF4

 

<400>35

ggcccagatc taccggtttc tgcctcggc                                       29

 

<210>36

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-D3HALFR2

 

<220>

<221>其他特征

<222>(38)..(39)

<223>n为a，c，g或t

 

<220>

<221>其他特征

<222>(53)..(54)

<223>n是a，c，g或t

 

<400>36

gtgcgcaatc tcgagctgct tctggtagtg gttgtgvnnc tcgattttgg cvnngaagtg    60

cttgagctcc tcccgg                                                    76

 

<210>37

<211>67

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-D3HALFF2

 

<220>

<221>其他特征

<222>(35)..(36)

<223>n为a，c，g或t

 

<400>37

ccactaccag aagcagctcg agattgcgca cgagnnbctg aggcacgcag agagcgtggg    60

cgacggc                                                              67

 

<210>38

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-MORPHR3

 

<400>38

gagtgcggcc gcaagcttat cttctgcctc ggc                                 33

 

<210>39

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-d3Rescue F

 

<400>39

gcgataggat ccctggaccg cctgcgcagg gtcagccacc                          40

 

<210>40

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-d3Rescue R

 

<400>40

gcgataaagc ttttatcaag atctaccggt ttctgcctcg gc                     42

 

<210>41

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-V2AR1

 

<400>41

agggt cagcc accagggcta cagcactgag gctaagttcg aggagcccag ggtgat     56

 

<210>42

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-V2AR2

 

<400>42

cagccaccag ggctacacca ctgaggctga gttcgaggag cccagggtga ttgacc      56

 

<210>43

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-V2AR3

 

<400>43

ggaggcgttc cgggaggagc tcaagcactt caaagccaaa attgaggccc acaacc      56

 

<210>44

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-V2AR4

 

<400>44

cgt tccggga ggagctcaag tact tcgaag ccaaaattga ggcccacaac cactac       56

 

<210>45

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-V2AR5

 

<400>45

gctcaagtac ttcaaagcca aaattgagaa gcacaaccac taccagaagc agctggag       58

 

<210>46

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-V2AR6

 

<400>46

agaagcagct ggagattgcg cacgagaagc tgaggcacgc agagagcgtg ggcgacgg       58

 

<210>47

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-V2ARR1

 

<400>47

atcaccctgg gctcctcgaa cttagcctca gtgctgtagc cctggtggct gaccct        56

 

<210>48

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-V2ARR2

 

<400>48

ggtcaatcac cctgggctcc tcgaactcag cctcagtggt gtagccctgg tggctg      56

 

<210>49

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-V2ARR3

 

<400>49

ggt tgtgggc ctcaattttg gctttgaagt gcttgagctc ctcccggaac gcctcc    56

 

<210>50

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-V2ARR4

 

<400>50

gtagtggttg tgggcctcaa ttttggcttc gaagtacttg agctcctccc ggaacg     56

 

<210>51

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-V2ARR5

 

<400>51

ctccagctgc ttctggtagt ggttgtgctt ctcaattttg gctttgaagt acttgagc   58

 

<210>52

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-V2ARR6

 

<400>52

ccgtcgccca cgctctctgc gtgcctcagc ttctcgtgcg caatctccag ctgcttct        58

 

<210>53

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-K256AF

 

<400>53

cttcgaagcc aaaatcgagg cgcacaacca ctaccagaag c                          41

 

<210>54

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-K256AR

 

<400>54

gcttctggta gtggttgtgc gcctcgattt tggcttcgaa g                          41

 

<210>55

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-K270EF

 

<400>55

gctggagatt gcgcacgagg agctgaggca cgcagagag              39

 

<210>56

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-K270ER

 

<400>56

ctctctgcgt gcctcagctc ctcgtgcgca atctccagc             39

 

<210>57

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-d3E251KF

 

<400>57

gaggagc tca agcact tcaa agccaaaatc gagaagcaca ac      42

 

<210>58

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-d3E251KF

 

<400>58

gttgtgcttc tcgattttgg ctttgaagtg cttgagctcc tc       42

 

<210>59

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-d3E217KF

 

<400>59

cagggctaca gcactgaggc taagttcgag gagcccaggg tg     42

 

<210>60

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-d3E217KR

 

<400>60

caccctgggc tcctcgaact tagcctcagt gctgtagccc tg     42

 

<210>61

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-d3H249YF

 

<400>61

gttccgggag gagctcaagt acttcgaagc caaaatcgag        40

 

<210>62

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成引物-d3H249YR

 

<400>62

ctcgattttg gcttcgaagt acttgagctc ctcccggaac        40

 

<210>63

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>LDLR CR1

 

<400>63

Trp Val Cys Asp Gly Ser Ala Glu

1               5

 

<210>64

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>LDLR CR3

 

<400>64

Phe Val Cys Asp Ser Asp Arg Asp

1               5

 

<210>65

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>LDLR CR5

 

<400>65

Trp Arg Cys Asp Gly Gly Pro Asp

1               5

 

<210>66

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>LDLR CR6

 

<400>66

Arg Gln Cys Asp Arg Glu Tyr Asp

1               5

 

<210>67

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>LDLR CR7

 

<400>67

Lys Val Cys Asn Met Ala Arg Asp

1               5

 

<210>68

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>TVA CR

 

<400>68

Trp Leu Cys Asp Gly His Pro Asp

1               5

 

<210>69

<211>44

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>LRP1CR3

 

<400>69

Arg Pro Gln Cys Gln Pro Gly Glu Phe Ala Cys Ala Asn Ser Arg Cys

1               5                   10                  15

Ile Gln Glu Arg Trp Lys Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Leu Asp Asn

            20                  25                  30

Ser Asp Glu Ala Pro Ala Leu Cys His Gln His Thr

        35                  40

 

<210>70

<211>41

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>LRP1CR4

 

<400>70

Cys Pro Ser Asp Arg Phe Lys Cys Glu Asn Asn Arg Cys Ile Pro Asn

1               5                   10                  15

Arg Trp Leu Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Gly Asn Ser Glu Asp Glu

            20                  25                  30

Ser Asn Ala Thr Cys Ser Ala Arg Thr

        35                  40

 

<210>71

<211>38

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>LRP1CR5

 

<400>71

Cys Pro Pro Asn Gln Phe Ser Cys Ala Ser Gly Arg Cys Ile Pro Ile

1               5                   10                  15

Ser Trp Thr Cys Asp Leu Asp Asp Asp Cys Gly Asp Arg Ser Asp Glu

            20                  25                  30

Ser Ala Ser Cys Ala Tyr

        35

 

<210>72

<211>42

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>VLDLRCR6

 

<400>72

His Thr Lys Cys Pro Ala Ser Glu Ile Gln Cys Gly Ser Gly Glu Cys

1               5                   10                  15

Ile His Lys Lys Trp Arg Cys Asp Gly Asp Pro Asp Cys Lys Asp Gly

            20                  25                  30

Ser Asp Glu Val Asn Cys Pro Ser Arg Thr

        35                  40

 

<210>73

<211>40

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>VLDLRCR7

 

<400>73

Cys Arg Pro Asp Gln Phe Glu Cys Glu Asp Gly Ser Cys Ile His Gly

1               5                   10                  15

Ser Arg Gln Cys Asn Gly Ile Arg Asp Cys Val Asp Gly Ser Asp Glu

            20                  25                  30

Val Asn Cys Lys Asn Val Asn Gln

        35                  40

 

<210>74

<211>42

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>VLDLRCR8

 

<400>74

Cys Leu Gly Pro Gly Lys Phe Lys Cys Arg Ser Gly Glu Cys Ile Asp

1               5                   10                  15

Ile Ser Lys Val Cys Asn Gln Glu Gln Asp Cys Arg Asp Trp Ser Asp

            20                  25                  30

Glu Pro Leu Lys Glu Cys His Ile Asn Glu

        35                  40

 

<210>75

<211>36

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>MATCR1

 

<400>75

Pro Cys Pro Gly Gln Phe Thr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ile Arg Lys

1               5                   10                  15

Glu Leu Arg Cys Asp Gly Trp Ala Asp Cys Thr Asp His Ser Asp Glu

            20                  25                  30

Leu Asn Cys Ser

        35

 

<210>76

<211>37

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>MATCR2

 

<400>76

Cys Asp Ala Gly His Gln Phe Thr Cys Lys Asn Lys Phe Cys Lys Pro

1               5                   10                  15

Leu Phe Trp Val Cys Asp Ser Val Asn Asp Cys Gly Asp Asn Ser Asp

            20                  25                  30

Glu Gln Gly Cys Ser

        35

 

<210>77

<211>42

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>MATCR3

 

<400>77

Cys Pro Ala Gln Thr Phe Arg Cys Ser Asn Gly Lys Cys Leu Ser Lys

1               5                   10                  15

Ser Gln Gln Cys Asn Gly Lys Asp Asp Cys Gly Asp Gly Ser Asp Glu

            20                  25                  30

Ala Ser Cys Pro Lys Val Asn Val Val Thr

        35                  40

 

<210>78

<211>37

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>MATCR4

 

<400>78

Cys Thr Lys His Thr Tyr Arg Cys Leu Asn Gly Leu Cys Leu Ser Lys

1               5                   10                  15

Gly Asn Pro Glu Cys Asp Gly Lys Glu Asp Cys Ser Asp Gly Ser Asp

            20                  25                  30

Glu Lys Asp Cys Asp

        35

 

<210>79

<211>45

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>LRP2CR8

 

<400>79

Pro Thr Glu Gln Cys Gly Leu Phe Ser Phe Pro Cys Lys Asn Gly Arg

1               5                   10                  15

Cys Val Pro Asn Tyr Tyr Leu Cys Asp Gly Val Asp Asp Cys His Asp

            20                  25                  30

Asn Ser Asp Glu Gln Leu Cys Gly Thr Leu Asn Asn Thr

        35                  40                  45

 

<210>80

<211>40

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>LRP2CR9

 

<400>80

Cys Ser Ser Ser Ala Phe Thr Cys Gly His Gly Glu Cys Ile Pro Ala

1               5                   10                  15

His Trp Arg Cys Asp Lys Arg Asn Asp Cys Val Asp Gly Ser Asp Glu

            20                  25                  30

His Asn Cys Pro Thr His Ala Phe

        35                  40

 

<210>81

<211>41

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>LRP2CR27

 

<400>81

Cys Arg Leu Gly Gln Phe Gln Cys Ser Asp Gly Asn Cys Thr Ser Pro

1               5                   10                  15

Gln Thr Leu Cys Asn Ala His Gln Asn Cys Pro Asp Gly Ser Asp Glu

            20                  25                  30

Asp Arg Leu Leu Cys Glu Asn His His

        35                  40

 

<210>82

<211>39

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>LRP2CR28

 

<400>82

Cys Asp Ser Asn Glu Trp Gln Cys Ala Asn Lys Arg Cys Ile Pro Glu

1               5                   10                  15

Ser Trp Gln Cys Asp Thr Phe Asn Asp Cys Glu Asp Asn Ser Asp Glu

            20                  25                  30

Asp Ser Ser His Cys Ala Ser

        35

 

<210>83

<211>42

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>LRP2CR30

 

<400>83

Leu Cys Asp Asn Phe Thr Glu Phe Ser Cys Lys Thr Asn Tyr Arg Cys

1               5                   10                  15

Ile Pro Lys Trp Ala Val Cys Asn Gly Val Asp Asp Cys Arg Asp Asn

            20                  25                  30

Ser Asp Glu Gln Gly Cys Glu Glu Arg Thr

        35                  40

 

<210>84

<211>40

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>LRP2CR31

 

<400>84

Cys His Pro Val Gly Asp Phe Arg Cys Lys Asn His His Cys Ile Pro

1               5                   10                  15

Leu Arg Trp Gln Cys Asp Gly Gln Asn Asp Cys Gly Asp Asn Ser Asp

            20                  25                  30

Glu Glu Asn Cys Ala Pro Arg Glu

        35                  40

 

<210>85

<211>45

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>LRP2CR34

 

<400>85

Asp Gly Ala Tyr Cys Gln Ala Thr Met Phe Glu Cys Lys Asn His Val

1               5                   10                  15

Cys Ile Pro Pro Tyr Trp Lys Cys Asp Gly Asp Asp Asp Cys Gly Asp

            20                  25                  30

Gly Ser Asp Glu Glu Leu His Leu Cys Leu AspVal Pro

        35                  40                  45

 

<210>86

<211>45

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>LRP2CR35

 

<400>86

Cys Asn Ser Pro Asn Arg Phe Arg Cys Asp Asn Asn Arg Cys Ile Tyr

1               5                   10                  15

Ser His Glu Val Cys Asn Gly Val Asp Asp Cys Gly Asp Gly Thr Asp

            20                  25                  30

Glu Thr Glu Glu His Cys Arg Lys Pro Thr Pro Lys Pro

        35                  40                  45

 

<210>87

<211>47

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>LRP2CR36

 

<400>87

Cys Thr Glu Tyr Glu Tyr Lys Cys Gly Asn Gly His Cys Ile Pro His

1               5                   10                  15

Asp Asn Val Cys Asp Asp Ala Asp Asp Cys Gly Asp Trp Ser Asp Glu

            20                  25                  30

Leu Gly Cys Asn Lys Gly Lys Glu Arg Thr Cys Ala Glu Asn Ile

        35                  40                  45

 

<210>88

<211>41

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>LRP6CR1

 

<400>88

Pro Thr Cys Ser Pro Gln Gln Phe Thr Cys Phe Thr Gly Glu Ile Asp

1               5                   10                  15

Cys Ile Pro Val Ala Trp Arg Cys Asp Gly Phe Thr Glu Cys Glu Asp

            20                  25                  30

His Ser Asp Glu Leu Asn Cys Pro Val

        35                  40

 

<210>89

<211>38

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>LRP6CR2

 

<400>89

Cys Ser Glu Ser Gln Phe Gln Cys Ala Ser Gly Gln Cys Ile Asp Gly

1               5                   10                  15

Ala Leu Arg Cys Asn Gly Asp Ala Asn Cys Gln Asp Lys Ser Asp Glu

            20                  25                  30

Lys Asn Cys GluVal Leu

        35

 

<210>90

<211>38

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>LRP6CR3

 

<400>90

Cys Leu Ile Asp Gln Phe Arg Cys Ala Asn Gly Gln Cys Ile Gly Lys

1               5                   10                  15

His Lys Lys Cys Asp His Asn Val Asp Cys Ser Asp Lys Ser Asp Glu

            20                  25                  30

Leu Asp Cys Tyr Pro Thr

        35

 

<210>91

<211>118

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>806 CR12

 

<400>91

Gly Ser Ser Cys Pro Pro Thr Lys Phe Gln Cys Arg Thr Ser Gly Leu

1               5                  10                   15

Cys Val Pro Leu Thr Trp Arg Cys Asp Arg AspLeu Asp Cys Ser Asp

            20                  25                 30

Gly Ser Asp Glu Glu Glu Cys Arg Ile Glu Pro Cys Thr Gln Lys Gly

        35                  40                   45

Gln Cys Pro Pro Pro Pro Gly Leu Pro Cys Pro Cys Thr Gly Val Ser

    50                  55                  60

Asp Cys Ser Gly Gly Thr Asp Lys Lys Leu Arg Asn Cys Ser Arg Leu

    65              70                  75                  80

Ala Cys Leu Ala Gly Glu Leu Arg Cys Thr Leu Ser Asp Asp Cys Ile

                85                  90                  95

Pro Leu Thr Trp Arg Cys Asp Gly His Pro Asp Cys Pro Asp Ser Ser

            100                 105                 110

Asp Glu Leu Gly Cys Gly

        115

 

<210>92

<211>119

<212>PRT

<213>人

 

<400>92

Leu Asp Arg Leu Arg Arg Val Ser His Gln Gly Tyr Ser Thr Glu Ala

1               5                   10                  15

Glu Phe Glu Glu Pro Arg Val Ile Asp Leu Trp Asp Leu Glu Gln Ser

            20                  25                  30

Ala Asn Leu Thr Asp Lys Glu Leu Glu Ala Phe Arg Glu Glu Leu Lys

        35                  40                  45

His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu

    50                  55                  60

Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg His Ala Glu Ser Val Gly Asp Gly

65                  70                  75                  80

Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg

                85                  90                  95

Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val Lys Lys His Leu Gln Asp Leu Ser

            100                     105             110

Gly Arg Ile Ser Arg Ala Arg

        115

 

<210>93

<211>119

<212>PRT

<213>人

 

<400>93

Leu Asp Arg Leu Arg Arg Val Ser His Gln Gly Tyr Ser Thr Glu Ala

1               5                   10                  15

Glu Phe Glu Glu Pro Arg Val Ile Asp Leu Trp Asp Leu Glu Gln Ser

            20                  25                  30

Ala Asn Leu Thr Asp Lys Glu Leu Glu Ala Phe Arg Glu Glu Leu Lys

        35                  40                  45

His Phe Lys Ala Lys Ile Glu Ala His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu

    50                  55                  60

Glu Ile Ala His Glu Asp Leu Arg His Ala Glu Ser Val Gly Asp Gly

65                  70                  75                  80

Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg

                85                  90                  95

Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val Lys Lys His Leu Gln Asp Leu Ser

            100                105                  110

Gly Arg Ile Ser Arg Ala Arg

        115

 

<210>94

<211>118

<212>PRT

<213>人

 

<400>94

Gly Ser Ser Cys Pro Pro Thr Lys Phe Gln Cys Arg Thr Ser Gly Leu

1               5                   10                  15

Cys Val Pro Leu Thr Trp Arg Cys Asp Arg Asp Leu Asp Cys Ser Asp

            20                  25                  30

Gly Ser Asp Glu Glu Glu Cys Arg Ile Glu Pro Cys Thr Gln Lys Gly

        35                  40                  45

Gln Cys Pro Pro Pro Pro Gly Leu Pro Cys Pro Cys Thr Gly Val Ser

    50                  55                  60

Asp Cys Ser Gly Gly Thr Asp Lys Lys Leu Arg Asn Cys Ser Arg Leu

65                  70                  75                  80

Ala Cys Leu Ala Gly Glu Leu Arg Cys Thr Leu Ser Asp Asp Cys Ile

                85                  90                  95

Pro Leu Thr Trp Arg Cys Asp Gly His Pro Asp Cys Pro Asp Ser Ser

            100                 105                 110

Asp Glu Leu Gly Cys Gly

115

 

<210>95

<211>323

<212>PRT

<213>人

 

<400>95

Tyr Ser Arg Glu Lys Asn Gln Pro Lys Pro Ser Pro Lys Arg Glu Ser

1               5                   10                  15

Gly Glu Glu Phe Arg Met Glu Lys Leu Asn Gln Leu Trp Glu Lys Ala

            20                  25                  30

Gln Arg Leu His Leu Pro Pro Val Arg Leu Ala Glu Leu His Ala Asp

        35                  40                  45

Leu Lys Ile Gln Glu Arg Asp Glu Leu Ala Trp Lys Lys Leu Lys Leu

    50                  55                  60

Asp Gly Leu Asp Glu Asp Gly Glu Lys Glu Ala Arg Leu Ile Arg Asn

65                  70                  75                  80

Leu Asn Val Ile Leu Ala Lys Tyr Gly Leu Asp Gly Lys Lys Asp Ala

                85                  90                  95

Arg Gln Val Thr Ser Asn Ser Leu Ser Gly Thr Gln Glu Asp Gly Leu

            100                 105                 110

Asp Asp Pro Arg Leu Glu Lys Leu Trp His Lys Ala Lys Thr Ser Gly

        115                 120                 125

Lys Phe Ser Gly Glu Glu Leu Asp Lys Leu Trp Arg Glu Phe Leu His

    130                 135                 140

His Lys Glu Lys Val His Glu Tyr Asn Val Leu Leu Glu Thr Leu Ser

145                 150                 155                 160

Arg Thr Glu Glu Ile His Glu Asn Val Ile Ser Pro Ser Asp Leu Ser

                165                 170                 175

Asp Ile Lys Gly Ser Val Leu His Ser Arg His Thr Glu Leu Lys Glu

            180                 185                 190

Lys Leu Arg Ser Ile Asn Gln Gly Leu Asp Arg Leu Arg Arg Val Ser

        195                 200                 205

His Gln Gly Tyr Ser Thr Glu Ala Glu Phe Glu Glu Pro Arg Val Ile

    210                 215                 220

Asp Leu Trp Asp Leu Ala Gln Ser Ala Asn Leu Thr Asp Lys Glu Leu

225                 230                 235                 240

Glu Ala Phe Arg Glu Glu Leu Lys His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys

                245                 250                 255

His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg

            260                 265                 270

His Ala Glu Ser Val Gly Asp Gly Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu

        275                 280                 285

Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val

    290                 295                 300

Lys Lys His Leu Gln Asp Leu Ser Gly Arg Ile Ser Arg Ala Arg His

305                 310                 315                 320

Asn Glu Leu

 

<210>96

<211>123

<212>PRT

<213>人

 

<400>96

Leu Asp Arg Leu Arg Arg Val Ser His Gln Gly Tyr Ser Thr Glu Ala

1               5                   10                  15

Glu Phe Glu Glu Pro Arg Val Ile Asp Leu Trp Asp Leu Ala Gln Ser

            20                  25                  30

Ala Asn Leu Thr Asp Lys Glu Leu Glu Ala Phe Arg Glu Glu Leu Lys

        35                  40                  45

His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu

    50                  55                  60

Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg His Ala Glu Ser Val Gly Asp Gly

65                  70                  75                  80

Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg

                85                  90                  95

Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val Lys Lys His Leu Gln Asp Leu Ser

            100                     105             110

Gly Arg Ile Ser Arg Ala Arg His Asn Glu Leu

        115                 120

 

<210>97

<211>71

<212>PRT

<213>人

 

<400>97

Phe Arg Glu Glu Leu Lys His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys His Asn

1               5                   10                  15

His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg His Ala

            20                  25                  30

Glu Ser Val Gly Asp Gly Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu Lys His

        35                  40                  45

Ala Leu Leu Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val Lys Lys

    50                  55                  60

His Leu Gln Asp Leu Ser Gly

65                  70

 

<210>98

<211>55

<212>PRT

<213>人

 

<400>98

His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu

1               5                   10                  15

Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg His Ala Glu Ser Val Gly Asp Gly

            20                  25                  30

Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg

        35                  40                  45

Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr

    50                  55

 

<210>99

<211>75

<212>PRT

<213>合成肽

 

<400>99

Cys Gly Phe Arg Glu Glu Leu Lys His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys

1               5                   10                  15

His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg

            20                  25                  30

His Ala Glu Ser Val Gly Asp Gly Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu

        35                  40                  45

Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val

    50                  55                  60

Lys Lys His Leu Gln Asp Leu Ser Gly Gly Cys

65                  70                  75

 

<210>100

<211>67

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>100

Cys Gly Lys His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys His Ash His Tyr Gln

1               5                   10                  15

Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg His Ala Glu Ser Val

            20                  25                  30

Gly Asp Gly Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu Lys His Ala Leu Leu

        35                  40                  45

Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val Lys Lys His Leu Gln

    50                  55                  60

Asp Gly Cys

65

 

<210>101

<211>60

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>101

Cys Glu Ala Lys Ile Glu Lys His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu

1               5                   10                  15

Ile Ala His Glu Lys Leu Arg His Ala Glu Ser Val Gly Asp Gly Glu

            20                  25                  30

Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg Thr

        35                  40                  45

Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val Lys Lys His Gly Cys

    50                  55                  60

 

<210>102

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>102

Gly Gly Ser Gly Gly

1               5

 

<210>103

<211>68

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>103

Cys Gly Lys His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys His Asn His Tyr Gln

1               5                   10                  15

Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg His Ala Glu Ser Val

            20                  25                  30

Gly Asp Ala Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu Lys His Ala Leu Leu

        35                  40                  45

Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val Lys Lys His Leu Gln

    50                  55                  60

Asp Ala Cys Gly

65

 

<210>104

<211>73

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>104

Gly Gly Ser Gly Gly Cys Gly Lys His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys

1               5                   10                  15

His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg

            20                  25                  30

His Ala Glu Ser Val Gly Asp Ala Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu

        35                  40                  45

Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val

    50                  55                  60

Lys Lys His Leu Gln Asp Ala Cys Gly

65                  70

 

<210>105

<211>73

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>Xaa是用SU6668修饰的甘氨酸

 

<400>105

Xaa Gly Ser Gly Gly Cys Gly Lys His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys

1               5                   10                  15

His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg

            20                  25                  30

His Ala Glu Ser Val Gly Asp Ala Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu

         35                  40                  45

Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val

    50                  55                  60

Lys Lys His Leu Gln Asp Ala Cys Gly

65                  70

 

<210>106

<211>74

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>Xaa是用八-二氟甲基鸟氨酸修饰的赖氨酸

 

<400>106

Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Cys Gly Lys His Phe Glu Ala Lys Ile Glu

1               5                   10                  15

Lys His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys Leu

            20                  25                  30

Arg His Ala Glu Ser Val Gly Asp Ala Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg

        35                  40                  45

Glu Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr

    50                  55                  60

Val Lys Lys His Leu Gln Asp Ala Cys Gly

65                  70

 

<210>107

<211>75

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>107

Ser Gly PheArg Glu Glu Leu Lys His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys

1              5                   10                  15

His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg

            20                  25                  30

His Ala Glu Ser Val Gly Asp Gly Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu

        35                  40                  45

Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val

    50                  55                  60

Lys Lys His Leu Gln Asp Leu Ser Gly Gly Ser

65                  70                  75

Claims (52)

1.RAP环肽，其长度少于约85个氨基酸，包括与SEQ ID NO：97序列至少70％相同的50个连续的氨基酸，其以Kd约1×10^-8M或更少的结合亲和力与含CR的蛋白相结合。

2.如权利要求1所述的RAP环肽，其以约1×10^-8M或更少的Kd与LRP1结合。

3.如权利要求1所述的RAP环肽，其包含在成熟RAP的251、256、257、266、270、279、280、296或305位置中任一位置的突变。

4.如权利要求1所述的RAP环肽，其与matriptase选择性结合。

5.如权利要求4所述的RAP环肽，其包含在RAP的251、256、257、266、270或280位置中任一位置的突变。

6.如权利要求4所述的RAP环肽，其包含在RAP 251位置的突变。

7.如权利要求4所述的RAP环肽，其包含在RAP 256位置的突变。

8.如权利要求4所述的RAP环肽，其包含在RAP 257位置的突变。

9.如权利要求4所述的RAP环肽，其包含在RAP 266位置的突变。

10.如权利要求4所述的RAP环肽，其包含在RAP 270位置的突变。

11.如权利要求4所述的RAP环肽，其包含在RAP 280位置的突变。

12.如权利要求1所述的RAP环肽，其与VLDLR蛋白选择性结合。

13.如权利要求12所述的RAP环肽，其包含在RAP的251、256、270或296位置中任一位置的突变。

14.如权利要求12所述的RAP环肽，其包含在RAP 251位置的突变。

15.如权利要求12所述的RAP环肽，其包含在RAP 256位置的突变。

16.如权利要求12所述的RAP环肽，其包含在RAP 270位置的突变。

17.如权利要求12所述的RAP环肽，其包含在RAP 296位置的突变。

18.如权利要求1所述的RAP环肽，其与FDC-8D6(CD320)蛋白选择性结合。

19.如权利要求18所述的RAP环肽，其包含在RAP的251、256、270、279或305位置中任一位置的一突变。

20.如权利要求18所述的RAP环肽，其包含在RAP251位置的突变。

21.如权利要求18所述的RAP环肽，其包含在RAP256位置的突变。

22.如权利要求18所述的RAP环肽，其包含在RAP270位置的突变。

23.如权利要求18所述的RAP环肽，其包含在RAP279位置的突变。

24.如权利要求18所述的RAP环肽，其包含在RAP305位置的突变。

25.如权利要求1所述的RAP环肽，其包含SEQ ID NO：97。

26.如权利要求1-25中任一项所述的RAP环肽，其在RAP的271-319位置内包含至少一个附加的突变。

27.如权利要求1-26中任一项所述的RAP环肽，其在RAP的205-250位置内包含至少一个突变。

28.如权利要求1-27中任一项所述的RAP环肽，其特征在于，所述突变为用碱性氨基酸置换酸性氨基酸。

29.如权利要求28所述的RAP环肽，其特征在于，所述酸性氨基酸选自由D和E组成的组。

30.如权利要求28所述的RAP环肽，其特征在于，所述碱性氨基酸选自由K和R组成的组。

31.如权利要求1-27中任一项所述的RAP环肽，其特征在于，所述突变为用酸性氨基酸置换碱性氨基酸。

32.如权利要求31所述的RAP环肽，其特征在于，所述碱性氨基酸选自由K和R组成的组。

33.如权利要求31所述的RAP环肽，其特征在于，所述酸性氨基酸选自由D和E组成的组。

34.如权利要求1-27中任一项所述的RAP环肽，其特征在于，所述突变为用选自F、Y、W和H的氨基酸置换选自A、C、D、E、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T和V的氨基酸。

35.如权利要求1-34中任一项所述的RAP环肽，其包含在下列位置中3个或更多位置的突变：175、205、213、217、226、230、232、239、241、242、246、247、249、250、251、256、257、261、266、267、268、270、273、279、280、287、290、294、296、297、298、305、308、311、312、313、314或315。

36.如权利要求1-34中任一项所述的RAP环肽，其包含在下列位置中3个或更多位置的突变：205、217、249、251、256、257、266、270、294、296、297、305。

37.如权利要求1-34中任一项所述的RAP环肽，其包含在下列突变中3个或更多的突变：R205S、S213T、E217K、L226M、H249Y、E230V、S232P、E239G、E246G、E251L、E251K、E251T、E251G、E251P、E251N、E251R、K256R、K256V、K256A、K256I、K256P、K256L、I266F、I266T、K257Y、Q261R、A267V、H268R、K270P、K270D、K270N、K270G、K270E、K270W、L271M、H273Y、D279Y、V283M、R287H、H290Y、H290L、E294V、R296L、T297I、K298R、K305T、K306M、S312F、G313D、E246C、L247G、G280A、L311A、S312C、Q309C、F250C、L308G、L311G、E241C和I315C。

38.通过给予权利要求1-37中任一项所述的RAP环肽治疗疾病的方法，其特征在于，所述RAP环肽与涉及疾病病理生理学的含CR的蛋白选择性结合。

39.化合物，其包含与诊断或治疗试剂缀合的权利要求1-37中任一项所述的RAP环肽。

40.如权利要求39所述的化合物，其特征在于，所述RAP环肽与诊断或治疗试剂通过连接体连接。

41.如权利要求40所述的化合物，其特征在于，所述连接体是肽连接体。

42.如权利要求39所述的化合物，其特征在于，所述治疗试剂选自：胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、解联蛋白和金属蛋白酶结构域10(ADAM10)、LRP5/6伴侣蛋白(MESD)、癌症化疗制剂、蛋白酶抑制剂、促凋亡分子、自身免疫抗原、溶酶体酶、纳米粒、复合糖和核酸。

43.药物组合物，其包含在药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的如权利要求1-37或39-42中任一项所述的化合物。

44.递送诊断或治疗试剂进入动物的中枢神经系统的方法，其包含给予所需个体如权利要求43所述的药物组合物。

45.权利要求44所述的方法，其特征在于，所述个体为患有神经学疾病的人。

46.权利要求45所述的方法，其特征在于，所述神经学疾病选自阿尔茨海默病，帕金森病、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化和中枢神经系统肿瘤。

47.递送诊断或治疗试剂进入个体的具体组织或组织群的方法，其包含给予所需个体如权利要求43所述的药物组合物。

48.权利要求47所述的方法，其特征在于，所述试剂被递送穿过血脑屏障。

49.缀合物，其包含与活化剂缀合的如权利要求1-37中任一项所述的RAP环肽。

50.权利要求49所述的缀合物，其特征在于，所述RAP环肽与活化剂通过连接体连接。

51.权利要求49所述的缀合物，其特征在于，所述活化剂为化疗剂。

52.权利要求51所述的缀合物，其特征在于，所述化疗剂是放射性同位素。

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