ES2555555T3 - Conjugados de péptido de proteína asociada al receptor inhibidor de fucosidasa y su uso en el tratamiento de tumores hepáticos - Google Patents

Abstract

Un conjugado de péptido que comprende un péptido de la proteína asociada al receptor (RAP) unido a un inhibidor de fucosidasa, comprendiendo el péptido RAP una secuencia de polipéptidos con al menos un 80 % de homología con los aminoácidos 210-319 de RAP de la SEQ ID NO: 1, en donde el inhibidor de fucosidasa inhibe la actividad de alfa-L-fucosidasa para escindir residuos de fucosa de las glucoproteínas e induce la acumulación de oligosacáridos derivados de glucoproteína en el lisosoma, en donde el inhibidor de fucosidasa se selecciona del grupo que consiste en L-desoxifuconojirimicina (DFJ), beta-1- C-metil-desoximanojirimicina, beta-1-C-etil-desoximanojirimicina, beta-1-C-fenil-desoximanojirimicina, ácido ((3R,4R,5S,6S)-1-butil-4,5,6-trihidroxiazepano-3-carboxílico (Faz), beta-L-homofucononojirimicina, (1-alfa,2-beta,3- alfa o beta, 4-alfa,5-alfa o beta)-2,3,4-trihidroxi-5-(hidroximetil)-ciclopentilaminas sustituidas y 2,6-imino-2,6,7- tridesoxi-D-glicero-D-gluco-heptitol.

Description

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10-5 M o mejor (esto es, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, o inferior). El término "péptido RAP" incluye específicamente cualquiera de los péptidos descritos en la sección titulada "Péptidos RAP" más adelante.

Los términos "idéntico" o "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son los mismos, cuando se comparan y se alinean para una correspondencia máxima, medida utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual.

La frase "sustancialmente homólogo" o "sustancialmente idéntico" en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere en general a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al menos un 40 %, 50 %, 55 %, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%de identidad de nucleótidos o de residuos de aminoácidos, cuando se comparan y se alinean para una correspondencia máxima, medida utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Preferiblemente, la identidad sustancial existe en una región de las secuencias que tiene al menos aproximadamente 50, 60, 70, 80 o 90 residuos de longitud, o en una región de al menos aproximadamente 100 residuos, o en una región de al menos aproximadamente 150 residuos. Las secuencias son sustancialmente idénticas en toda la longitud del biopolímero de referencia indicado. En algunas realizaciones, las secuencias son sustancialmente idénticas en toda la longitud de ambos biopolímeros de comparación.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuenciación. El algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros diseñados del programa.

El alineamiento óptimo de secuencias para comparación se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante la búsqueda por el método de similitud de Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por inspección visual. Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990).

"Sustancialmente puro" o "aislado" significa que una especie objeto es la especie predominante presente (esto es, en una base molar, es más abundante que cualquier otra especie macromolecular individual en la composición), y una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie objeto comprende al menos aproximadamente 50 % (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura significa que aproximadamente 80 % a 90 % o más de las especies macromoleculares presentes en la composición es la especie purificada de interés. La especie objeto se purifica hasta homogeneidad esencial (no se pueden detectar especies contaminantes en la composición por métodos de detección convencionales) si la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular. Las especies de disolventes, moléculas pequeñas (<500 daltons), estabilizantes (por ejemplo, BSA), y especies de iones elementales no se consideran especies macromoleculares para los fines de esta definición. En algunas realizaciones, los conjugados de la invención son sustancialmente puros o aislados. En algunas realizaciones, los conjugados descritos en la presente memoria son sustancialmente puros o aislados con respecto a los materiales de partida macromoleculares utilizados en su síntesis. La composición farmacéutica descrita aquí puede comprender un conjugado sustancialmente purificado o aislado de un péptido RAP y el agente activo mezclado con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.

De "origen natural" cuando se aplica a un objeto se refiere al hecho de que el objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido o secuencia de polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo los virus) que se puede aislar de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionadamente por el hombre en el laboratorio, es de origen natural.

Un "enlazador" se refiere a una molécula que une otras dos moléculas, o covalentemente o por medio de enlaces iónicos, de Van der Waals o de hidrógeno, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que se hibrida con una secuencia complementaria en el extremo 5' y con otra secuencia complementaria en el extremo 3', uniendo de este modo dos secuencias no complementarias. En ciertas realizaciones, se contempla que el enlazador es un enlazador peptídico que une las moléculas mediante un enlace peptídico.

"Tumores" o "neoplasia" o "cáncer" como se utiliza aquí incluyen tanto los tumores primarios como las metástasis. Los tumores incluyen, por ejemplo, carcinomas de ovario, del cuello uterino, de próstata, de mama, de pulmón, de colon o gástricos y metástasis de los mismos en el hígado.

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utiliza aquí se refiere a un polipéptido que comprende 2 o más péptidos RAP. Los términos "multímero" y "oligómero" se utilizan indistintamente en la presente memoria. En una realización, el oligómero o el multímero comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete o al menos ocho péptidos RAP cíclicos. En una realización a modo de ejemplo, los péptidos RAP cíclicos se conjugan con una molécula de biotina para facilitar la multimerización u oligomerización. Los péptidos cíclicos conjugados con biotina pueden ser multimerizados entonces mediante unión a estreptavidina o mediante unión a un anticuerpo anti-biotina. Se pueden preparar también oligómeros o multímeros de péptidos RAP cíclicos por otros métodos bien conocidos en la técnica y que se describen a continuación.

Se conocen una serie de métodos en la técnica para crear multímeros u oligómeros de péptidos. Por ejemplo, los péptidos se pueden unir mediante enlazadores como se describe en esta memoria, o por medio de polietilenglicol. Véase Zhang et al., Bioconjug Chem. 14: 86-92, 2003 (péptidos que se unen a fibrillas de amiloide conectados o por un espaciador de poli(etilenglicol) (PEG) o por sólo dos aminoácidos que presentan aproximadamente una afinidad 100 veces mayor para las fibrillas, mientras que la colocación de seis copias del péptido sobre un PEG ramificado dio como resultado una afinidad 10000 veces mayor). Los péptidos pueden ser multimerizados fácilmente después de biotinilación a través de acoplamiento con estreptavidina. Véase, por ejemplo, Guillaume et al., J. Biol. Chem.,

278: 4500-4509, 2003 (se pueden preparar multímeros de péptidos mediante unión a través de avidina o derivados de avidina, y son posibles preparaciones homogéneas de tetrámeros y octámeros). Los péptidos con capacidad de unión al receptor se pueden injertar en diferentes regiones CDR de un anticuerpo o inmunoglobulina andamio. Véase Frederickson et al., Proc Natl Acad Sci U:S:A: 103: 14307-12, 2006, que describe anticuerpos y fragmentos que contienen dos péptidos de unión al receptor MPL injertados que estimulan el receptor MPL de una manera que se estima que es equipotente al ligando nativo. Los péptidos se pueden unir en tándem o de forma ramificada, con o sin enlazadores, a los dominios de anticuerpo Fc. Véase la publicación internacional Nº WO 00/24782, publicada el 4 de mayo de 2000. Los péptidos y otras proteínas se pueden presentar sobre un andamio macromolecular derivado de un complejo multienzimático. Véase Domingo et al., J Mol Biol. 305: 259-67, 2001. Para una revisión de los andamios de proteínas adecuados para la visualización de péptidos, véase Hosse et al, Protein Science 15:. 14-27, 2006 (revisión de andamios tal como el dominio de fibronectina de tipo III, una lipocalina, una knottina, citocromo b562, un inhibidor de la proteasa de tipo Kunitz, el dominio Z, y el módulo de unión a carbohidratos CBM4-2).

En algunas realizaciones a modo de ejemplo, las combinaciones oligoméricas bivalentes se preparan por homodimerización de un polipéptido que comprende un péptido RAP cíclico y una región de anticuerpo Fc. Las combinaciones oligoméricas tetravalentes se preparan reemplazando las regiones variables de anticuerpo en una inmunoglobulina tetramérica (que contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras) con un péptido RAP cíclico. Aún en otras realizaciones a modo de ejemplo, las combinaciones oligoméricas bivalentes, trivalentes, tetravalentes, u otras se preparan por conjugación del péptido RAP cíclico con una molécula de PEG. Otras combinaciones oligoméricas pueden ser previstas por los expertos en la técnica.

Los dendrímeros son también adecuados para la multimerización de los péptidos RAP. Los dendrímeros son polímeros macromoleculares altamente ramificados, a menudo esféricos. Las estructuras oligoméricas tridimensionales de los dendrímeros se preparan por secuencias de reacción reiterativas partiendo de una molécula núcleo que tiene múltiples grupos reactivos. Cuando las unidades de monómero, que tienen también múltiples grupos reactivos, se hacen reaccionar con el núcleo, aumenta el número de grupos reactivos que comprenden los límites exteriores del dendrímero. Se pueden añadir capas sucesivas de moléculas de monómero a la superficie del dendrímero, aumentando geométricamente el número de ramificaciones y grupos reactivos sobre la superficie cada vez que se añade una capa. El número de capas de moléculas de monómero en un dendrímero se puede denominar como la "generación" del dendrímero. El número total de grupos funcionales reactivos sobre la superficie externa de un dendrímero depende del número de grupos reactivos que posee el núcleo, del número de grupos reactivos que poseen los monómeros que se utilizan para hacer crecer el dendrímero, y de la generación del dendrímero. Véase la patente de Estados Unidos Nº 6.852.842.

Se han descrito en la técnica una variedad de tipos de dendrímeros, tales como los dendrímeros de lisina, que incluyen pero no se limitan a un dendrímero de lisina de 1ª, 2ª, 3ª, 4ª, 5ª o 6ª generación, tal como un dendrímero de lisina K4K2K y un dendrímero de lisina KG6 (Okuda et al., J. Controlled Release 116, 330-336, 2006). Otros dendrímeros incluyen dendrímeros PAMAM, dendrímeros POPAM, dendrímeros de triazina, y dendrímeros de diaminobutano (DAB). Véase, por ejemplo, Grayson and Frechet, Chem Rev. 2001, 101, 3819; Mintzer et al., New J Chem. 2009; 33: 1918-1925; Patente de Estados Unidos Nº 6.852.842; Publicaciones de Estados Unidos Nos. 20090287005, 20090240028 y 20090182151.

Conjugados RAP

Un "conjugado RAP" o "conjugado de péptido RAP", se refiere cada uno a un compuesto que comprende un péptido RAP unido a un agente activo, tal como un inhibidor de fucosidasa. Como se utiliza en esta memoria, el término "conjugado" significa que el agente o agentes inhibidores y el péptido RAP están unidos físicamente, por ejemplo, mediante enlaces químicos covalentes, fuerzas físicas tales como fuerzas de van der Waals o interacciones hidrófobas, encapsulación, inclusión, o combinaciones de las mismas. En realizaciones preferidas, el agente o agentes inhibidores y el péptido RAP están unidos físicamente por enlaces químicos covalentes. En el caso de agentes terapéuticos múltiples, se puede utilizar una combinación de varias conjugaciones. Algunos agentes

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óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), HPMA, FLEXIMAR™, y alcohol polivinílico, mono-(alcoxi C1-C10)-PEG, ariloxi-PEG, tresil-monometoxi-PEG, PEG-propionaldehído, bis-succinimidilcarbonato-PEG, celulosa, otros polímeros basados en carbohidratos, y combinaciones de cualquiera de los anteriores.

En algunas realizaciones, el polímero soluble en agua es lineal (por ejemplo, alcoxi-PEG o PEG bifuncional), ramificado o brazos múltiples (por ejemplo, PEG bifurcado o PEG unido a un núcleo de poliol), dendrítico, o con enlaces degradables. Por otra parte, la estructura interna de la molécula de polímero se puede organizar en una serie de diferentes patrones y se puede seleccionar del grupo que consiste en homopolímero, copolímero alternante, copolímero aleatorio, copolímero de bloque, tripolímero alternante, tripolímero aleatorio, y tripolímero de bloque.

El término "PEGilado", como se usa aquí, se refiere a una proteína, conjugado de proteína o polipéptido unido a uno

o más restos de PEG. El término "PEGilación" como se utiliza aquí, se refiere al proceso de unión de uno o más PEGs a una proteína. En una realización, el peso molecular de dicho PEG está en el intervalo de 3 a 100 kDa, de 5 a 60 kDa, de 5 a 40 kDa, de 5 a 25 kDa, de 5 a 15 kDa, o de 5 al 10 kDa.

Enlazadores adecuados y sus grupos funcionales y los métodos químicos de síntesis fácilmente adaptables para la preparación de los mismos, se describen en la Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 2003253890.

Caracterización de los conjugados RAP

I. Marcadores

En algunas realizaciones, el conjugado basado en péptido RAP está marcado para facilitar su detección. Un "marcador" o un "resto detectable" es una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos, u otros medios físicos.

Como se ha indicado anteriormente, dependiendo del ensayo de cribado empleado, se pueden marcar el agente activo, el enlazador o la parte de péptido RAP de un conjugado. El marcador o grupo detectable particular utilizado no es un aspecto crítico de la invención, siempre que no interfiera significativamente con la actividad biológica del conjugado. El grupo detectable puede ser cualquier material que tenga una propiedad física o química detectable. Por lo tanto, un marcador es cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos.

Los ejemplos de marcadores adecuados para su uso incluyen, pero no se limitan a, colorantes fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rojo Texas, rodamina, y similares), radiomarcadores (por ejemplo, 3H, 125I,35S, 14C, o 32P), reactivos de densidad electrónica, enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina y otras comúnmente utilizadas en un ensayo ELISA), y marcadores colorimétricos tales como oro coloidal o perlas de vidrio o plástico coloreadas (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.). La biotina, digoxigenina o haptenos y otras proteínas se pueden hacer detectables, por ejemplo, incorporando un marcador en el hapteno o péptido.

El marcador se puede acoplar directa o indirectamente al componente deseado del ensayo según métodos bien conocidos en la técnica. El marcador en una realización se une covalentemente al biopolímero utilizando un reactivo de isocianato para conjugar un agente activo como se describe en esta memoria. Los reactivos bifuncionales de isocianato descritos aquí se pueden usar para conjugar un marcador con un biopolímero para formar un conjugado de biopolímero con marcador sin un agente activo unido al mismo. El conjugado de biopolímero con marcador se puede utilizar como un intermedio para la síntesis de un conjugado marcado como se describe en esta memoria o se puede utilizar para detectar el conjugado de biopolímero. Como se ha indicado antes, se pueden utilizar una amplia variedad de marcadores, dependiendo la elección del marcador de la sensibilidad requerida, de la facilidad de conjugación con el componente del ensayo deseado, de los requisitos de estabilidad, de la instrumentación disponible, y de los recursos de eliminación. Los marcadores no radiactivos se unen a menudo por medios indirectos. Generalmente, una molécula ligando (por ejemplo, biotina) se une covalentemente a la molécula. El ligando se une a otra molécula (por ejemplo, estreptavidina), que o bien es inherentemente detectable o está unida covalentemente a un sistema señal, tal como una enzima detectable, un compuesto fluorescente, o un compuesto quimioluminiscente.

Los conjugados se pueden conjugar también directamente a compuestos generadores de señales, por ejemplo, mediante conjugación con una enzima o fluoróforo. Las enzimas adecuadas para su uso como marcadores incluyen, pero no se limitan a, hidrolasas, particularmente fosfatasas, esterasas y glucosidasas, u oxidasas, particularmente peroxidasas. Los compuestos fluorescentes, esto es, fluoróforos, adecuados para uso como marcadores incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, etc. Otros ejemplos de fluoróforos adecuados incluyen, pero no se limitan a, eosina, TRITC-amina, quinina, fluoresceína W, amarillo de acridina, lisamina rodamina, eritrosina B sulfonil-cloruro, rutenio (tris, bipiridinio), rojo Texas, dinucleótido de nicotinamida adenina, dinucleótido de flavina adenina, etc. Los compuestos quimioluminiscentes adecuados para uso como marcadores incluyen, pero no se limitan a, luciferina y 2,3-dihidroftalazindionas, por ejemplo, luminol. Para una revisión de los diversos sistemas para producir marcas o señales que se pueden utilizar en los métodos descritos en la presente memoria, véase la patente de Estados Unidos Nº 4.391.904.

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Los medios de detección de marcadores son bien conocidos por los expertos en la técnica. Así, por ejemplo, cuando el marcador es un marcador radiactivo, los medios para la detección incluyen un contador de centelleo o una película fotográfica como en autorradiografía. Cuando el marcador es un marcador fluorescente, se puede detectar excitando el fluorocromo con la longitud de onda apropiada de la luz y detectando la fluorescencia resultante. La fluorescencia se puede detectar visualmente, mediante el uso de detectores electrónicos tales como dispositivos acoplados de carga (CCD) o fotomultiplicadores y similares. Del mismo modo, los marcadores enzimáticos se pueden detectar proporcionando los sustratos apropiados para la enzima y detectando el producto de reacción resultante. Los marcadores colorimétricos o quimioluminiscentes se pueden detectar simplemente observando el color asociado con el marcador. Otros sistemas de marcaje y detección adecuados para su uso en los métodos descritos en la presente memoria serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Dichos moduladores y ligandos marcados se pueden utilizar en el diagnóstico de una enfermedad o condición de salud.

Receptor LRP1 de RAP

LRP1 (proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad) es un miembro de la familia "LDLR" de receptores de lipoproteína de baja densidad. La LRP1 es una proteína grande de 4525 aminoácidos (600 kDa), que es escindida por la furina para producir dos subunidades de 515 kD (alfa) y 85 kDa (β) que permanecen unidas no covalentemente. La LRP se expresa en la mayor parte de los tipos de tejidos, pero se encuentra principalmente en el hígado. Otros miembros de la familia de receptores de lipoproteína de baja densidad (LDL) incluyen LDL-R (132 kDa); LRP2 (megalina, gp330); LRP/LRP1 y LRP1B (600 kDa); VLDL-R (130 kDa); LRP5; LRP6; apoER-2 (LRP-8, 130 kDa); LDL-R Mosaico (LR11, 250 kDa); y otros miembros tales como LRP3, LRP6 y LRP-7. Los rasgos característicos de la familia incluyen la expresión en la superficie celular; repeticiones extracelulares de dominio de unión a ligando (DxSDE); necesidad de Ca++ para la unión al ligando; unión de RAP y apoE; repeticiones del dominio de homología del precursor EGF (YWTD); una región que abarca una sola membrana; señales de internalización en el dominio citoplásmico (FDNPXY); y endocitosis de diversos ligandos mediada por receptores. Algunos miembros de la familia, incluyendo LRP1, participan en las rutas de transducción de señales. En algunas realizaciones, los conjugados de péptido RAP de la invención se unen preferiblemente a LRP1 en comparación con otros miembros de la familia LDL-R, por ejemplo, con una afinidad 1,5, 2, 3, 4, 5, 10 veces o más alta para LRP1.

LRP1 tiene el Nº de acceso de GenBank X13916 y el Nº de acceso de SwissProt Primary Q07954. Los nombres alternativos para el gen/proteína LRP1 incluyen: proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad [precursora], LRP, receptor de alfa-2-macroglobulina, A2MR, receptor de apolipoproteína E, ApoER, CD91, LRP1 o A2MR. La LRP1 expresada en el hígado y en el tejido muscular liso vascular puede producir la endocitosis del ligando en estos tejidos.

Inhibidores de alfa-L-fucosidasa y fucosidasa

La enzima alfa-L-fucosidasa (Nº de acceso de GenBank NP_000138) normalmente participa en la escisión de las cadenas largas de azúcar (oligosacáridos) en el lisosoma. Cuando falta la enzima, las cadenas de azúcar se acumulan y eventualmente dan lugar a las características clínicas de la fucosidosis. La fucosidosis es una enfermedad por almacenamiento lisosómico, recesiva autosómica, causada por alfa-L-fucosidasa defectuosa con acumulación del azúcar fucosa en los tejidos. Véase, por ejemplo, Johnson et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.

133: 90-7, 1986. Diferentes fenotipos incluyen características clínicas tales como deterioro neurológico, retraso del crecimiento, visceromegalia y convulsiones en una forma precoz severa; rasgos faciales toscos, angioqueratoma corporal difuso, espasticidad y retraso del desarrollo psicomotor en una forma de mayor supervivencia.

La fucosidosis se puede detectar utilizando ensayos genéticos para identificar una mutación en el gen de la fucosidasa. La fucosidasa se diagnostica también por la presencia de niveles aumentados de proteínas fucosiladas en la orina de pacientes con fucosidosis (Michalski et al, Eur J Biochem 201:.. 439-58, 1991).

La alfa-L-fucosidasa se ha detectado en niveles aumentados en el carcinoma hepatocelular y se ha sugerido que es un marcador del HCC (Giardina et al, Cancer 70:. 1044-48, 1992).

Muchos inhibidores de la fucosidasa son moléculas pequeñas que interfieren con la actividad enzimática de la hidrólisis por la fucosidasa de los enlaces de hidratos de carbono. Algunos inhibidores de fucosidasa se basan en la estructura de los imino azúcares de nojirimicina (Véase la patente de Estados Unidos Nº. 5.100.797.), que son alcaloides imitadores de azúcar que inhiben las glucosidasas debido a su parecido estructural con el resto de azúcar del sustrato natural. Los iminoazúcares son similares a los inhibidores de glucosidasas bacterianas. Para preparar los compuestos iminoazúcares, el anillo de monosacáridos que contiene oxígeno se reemplaza por un anillo que contiene nitrógeno (pirrolidina, piperidina) llevando a un iminoazúcar que actúa como un glucomimético.

La L-desoxifuconojirimicina (DFJ) es un inhibidor potente, específico y competitivo (en el intervalo de 10 nM) de la alfa-L-fucosidasa del hígado humano. Se ha demostrado que análogos estructurales de la desoxifuconojirimicina que conservan la configuración de los grupos hidroxilo en los átomos de carbono 2, 3 y 4 del anillo de piperidina conservan la actividad inhibidora de la fucosidasa. Por ejemplo, diferentes sustituyentes en cualquier configuración en el átomo de carbono 1 (esto es, 1-alfa y 1-beta-homofuconojirimicinas) y en el átomo de carbono 5 pueden alterar la potencia, pero no destruir la actividad. Véase Winchester et al., Biochem. J. 265: 277-282, 1990.

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Otros inhibidores de fucosidasa son los azaazúcares, tales como los azepanos de siete miembros, que son compuestos que contienen anillo con nitrógeno que imitan la estructura de los hidratos de carbono y que son potentes inhibidores de la función de glucosi-hidrolasa [12]. A pesar de tener la configuración de hidroxilo y la funcionalidad carboxilo de un azúcar iduronato, estas nuevas moléculas inhiben también la fucosidasa con una potencia en el intervalo nanomolar bajo [12]. Como la mayor parte de los inhibidores de iminoazúcares, no se espera que la modificación alquílica de la amina tenga un efecto inhibidor significativo de la potencia [13; 14], lo que permite la conjugación fácil y estable del inhibidor con biopolímeros grandes, tales como los péptidos. Otros inhibidores más de la fucosidasa son ciclopentilaminas sustituidas (patente de Estados Unidos Nº 5.382.709).

Los ejemplos de inhibidores de la fucosidasa, incluyen L-desoxifuconojirimicina (DFJ), beta-Lhomofucononojirimicina y 1-beta-C-desoximanojirimicinas sustituidas (beta-1-C-metil-desoximanojirimicina, beta-1-Cetil-desoximanojirimicina, beta-1-C-fenil desoximanojirimicina), y un azepano de siete miembros, ácido (3R,4R,5S,6S)-1-butil-4,5,6-trihidroxiazepano-3-carboxílico ("Faz") Inhibidores adicionales de la fucosidasa contemplados para uso en la invención incluyen (1-alfa,2-beta,3-alfa o beta,4-alfa,5-alfa o beta)-2,3,4-trihidroxi-5(hidroximetil)ciclopentilaminas sustituidas y 2,6-imino-2,6,7-tridesoxi-D-glicero-D-gluco-heptitol.

Los inhibidores de la fucosidasa que retienen la actividad, esto es, la capacidad para inhibir la alfa-L-fucosidasa in vitro, en el intervalo de 1 pM-100 nM, o intervalo 1-100 nM, se revelan para su uso en los conjugados como se describen en la presente memoria.

Composiciones farmacéuticas y su administración

Los conjugados se pueden formular en preparaciones para inyección mediante disolución, suspensión o emulsión de los mismos en un disolvente acuoso o no acuoso, tal como aceites vegetales u otros aceites similares, glicéridos de ácidos alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol; y si se desea, con aditivos convencionales tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizantes y conservantes.

Los conjugados se pueden utilizar en formulación en aerosol para ser administrada por inhalación. Los compuestos descritos aquí se pueden formular en propelentes presurizados aceptables tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.

Las formas farmacéuticas unitarias para inyección o administración intravenosa pueden comprender el conjugado en una composición como una solución en agua estéril, solución salina normal estéril u otro vehículo farmacéuticamente aceptable estéril.

En la práctica, el conjugado de péptido RAP descrito en esta memoria se puede combinar como el ingrediente activo en mezcla íntima con un vehículo farmacéutico según las técnicas convencionales de preparación de compuestos farmacéuticos. El vehículo puede tomar una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para administración, por ejemplo, oral o parenteral (incluyendo intravenosa),.

Con respecto a las vías de administración transdérmicas, los métodos para la administración transdérmica de fármacos están descritos en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th edition, (Gennaro et al. Eds. Mack Publishing Co., 1985). Los parches dérmicos o de la piel son un medio para la administración transdérmica de los conjugados de la invención. Los parches proporcionan preferiblemente un potenciador de la absorción tal como DMSO para aumentar la absorción de los compuestos. Otros métodos para la administración transdérmica de fármacos están descritos en las patentes de Estados Unidos Números 5.962.012, 6.261.595 y 6.261.595.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como vehículos, adyuvantes, portadores o diluyentes, están comercialmente disponibles. Además, están comercialmente disponibles sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes para ajuste del pH y agentes tampón, agentes para ajuste de la tonicidad, estabilizantes, agentes humectantes y similares.

Los expertos apreciarán fácilmente que los niveles de dosis pueden variar en función del compuesto específico, de la gravedad de los síntomas y de la predisposición del sujeto a los efectos secundarios. Las dosificaciones preferidas para un compuesto dado pueden ser determinadas fácilmente por los expertos en la técnica mediante una variedad de medios, incluyendo, pero sin limitarse a evaluaciones de respuesta a la dosis y evaluaciones farmacocinéticas realizadas en pacientes, animales de ensayo, e in vitro.

Las composiciones incluyen, pero no se limitan a, composiciones adecuadas para administración oral, rectal, tópica, parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, e intravenosa), pulmonar (inhalación nasal o bucal), o administración nasal, aunque la vía más adecuada en cualquier caso dado dependerá en parte de la naturaleza y gravedad de las afecciones a tratar y de la naturaleza del ingrediente activo. Ejemplos de vías de administración son las vías oral e intravenosa. Las composiciones se pueden presentar convenientemente en formas farmacéuticas unitarias y se pueden preparar por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia.

Las composiciones descritas en la presente memoria se pueden administrar encapsuladas en o unidas a envolturas virales o vesículas, o incorporadas a las células. Las vesículas son partículas micelares que normalmente son

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quimioterapéuticos indicados en la Tabla 1, adefovir, lamivudina, entecavir, ribavirina, interferón alfa, interferón alfa2a pegilado, interferón alfa-2b y otros antivirales, vitamina E, ácido ursodesoxicólico, y otros agentes utilizados para tratar trastornos hepáticos. En la Tabla 1 se muestran agentes adicionales.

Tabla 1

Agentes alquilantes

Productos naturales

Mostazas nitrogenadas

Fármacos antimicóticos

mecloretamina

ciclofosfamida

ifosfamida

Taxanos

melfalán

paclitaxel

clorambucilo

alcaloides de la Vinca

vinblastina (VLB)

Nitrosoureas

vincristina

carmustina (BCNU)

vinorelbina

lomustina (CCNU)

Taxotere ® (docetaxel)

semustina (metil-CCNU)

estramustina

fosfato de estramustina

Etilenimina/Metil-melamina

trietilenmelamina (TEM)

Epipodofilotoxinas

trietilen tiofosforamida

etopósido

(tiotepa)

teniposida

hexametilmelamina

(HMM, altretamina)

Antibióticos

actimomicina D

Sulfonatos de alquilo

daunomicina (rubido-micina)

busulfán

doxorubicina (adria-micina)

mitoxantroneidarubicina

Triazinas

bleomicina

dacarbazina (DTIC)

esplicamicina (mitramicina)

mitomicinaC

Antimetabolitos

dactinomicina

Análogos de ácido fólico

afidicolina

metotrexato

trimetrexato

Enzimas

Pemetrexed

L-asparaginasa

(antifolato multi-dirigido)

L-arginasa

Análogos de pirimidina

Radiosensibilizadores

5-fluorouracilo

metronidazol

fluorodesoxiuridina

misonidazol

gemcitabina

desmetilmisonidazol

arabinósido de citosina

pimonidazol

(AraC, citarabina)

etanidazol

5-azacitidina

nimorazol

2,2'-difluorodesoxi-citidina

RSU 1069

EO9

Análogos de purina

RB 6145

6-mercaptopurina

SR4233

6-tioguanina

nicotinamida

azatioprina

5-bromodesoxiuridina

2'-desoxicoformicina

5-yododesoxiuridina

(pentostatina)

bromodesoxicitidina

eritrohidroxinonil-adenina (EHNA)

fosfato de fludarabina

2-clorodeoxiadenosina

Agentes diversos

(cladribina, 2-CδA)

Complejos de coordinación de platino

cisplatino

carboplatino

Inhibidores de la topoisomerasa tipo I

oxaliplatino

camptotecina

Antracenediona

topotecan

mitoxantrona

irinotecán

Urea sustituida

Modificadores de la respuesta biológica

hidroxiurea

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desoxifuconojirimicina 10 mM y se someten a un mecanismo multiplexado de ensayo de acción de alto contenido (MOA-HCA) como se ha descrito antes.

Eficacia funcional en un modelo de xenoinjerto de tumor ortotópico: La eficacia del péptido RAP conjugado con inhibidor de fucosidasa se ensaya en un modelo de xenoinjerto intrahepático ortotópico como se ha descrito previamente [18; 19]. En resumen, se anestesian ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) de 6-8 semanas, con un anestésico apropiado, por ejemplo, ketamina, diazepam o una combinación de los mismos, y se realiza una laparotomía en la línea media superior para exponer la vena porta del ratón a través de una incisión en la línea media del abdomen. Se inyecta entonces una suspensión de 106 células HepG2 en la vena porta durante un minuto utilizando una aguja de calibre 30. Se cierra después la incisión con sutura y se mantienen los animales calientes hasta que estén completamente despiertos.

Para medir la eficacia del tratamiento con péptido RAP-inhibidor de fucosidasa, se lleva a cabo [18] una tomografía por emisión de positrones (PET) utilizando un agente radiomarcado apropiado, tal como 2-desoxi-2-(F-18)-fluoro-Dglucosa (18F-FDG), para seguir la progresión del tumor inducida por HepG2 en los ratones tratados y en los ratones control mediante un método no invasivo. La eficacia del tratamiento con péptido RAP-inhibidor de fucosidasa se mide también in vivo mediante análisis histológico de la zona del tumor en los animales tratados y en los animales control.

La medida de indicadores de enfermedades de almacenamiento lisosómico, incluyendo los niveles de glucosaminoglicanos (GAG) en el lisosoma, orina y sangre, se ensayan también en el modelo de tumor ortotópico.

Es de esperar que la administración del conjugado péptido RAP-inhibidor de fucosidasa disminuirá el tamaño del tumor o hará más lenta la progresión del crecimiento del tumor en comparación con los sujetos que no recibieron el inhibidor de fucosidasa. Es de esperar también que la administración del conjugado de péptido-inhibidor aumentará el nivel de proteínas fucosiladas en los lisosomas de las células que absorben el inhibidor a través del receptor del péptido, tal como se mide por los ensayos GAG.

Ejemplo 2

La administración de inhibidor de fucosidasa a células HepG2 inhibe la fucosidasa lisosómica

Con el fin de determinar los efectos del propio inhibidor de la fucosidasa sobre las células hepáticas, se llevó a cabo un ensayo in vitro.

Se sembraron células de carcinoma hepatocelular humano HepG2 en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos a 4 × 105 por pocillo. Se alimentaron las células a las 24 horas con medio fresco y se trataron durante 72 horas por duplicado, o con desoxifuconojirimicina 30 µM (DNJ) o con tampón. Se lavaron después las células con PBS frío, se pasaron a un tubo de microcentrífuga, se sedimentaron y se lisaron. La concentración de proteínas totales se determinó mediante el ensayo de Bradford para cada muestra y los volúmenes de lisado, se ajustaron a 0,3 mg/mL. Se midió la actividad de fucosidasa en 20 µL de cada muestra de lisado añadiendo 100 µL de 4-MU-fucopiranósido 0,5 mM con posterior incubación a 37 ºC durante 30 minutos. Se inactivaron las reacciones con 130 µL de citrato 600 mM/tampón de carbonato a pH 9. Se ensayó el 4-MU liberado en un lector de microplacas de fluorescencia (véase el Ejemplo 1 anterior). Los resultados se ilustran en la Figura 4. Se calcularon las medias de los valores de actividad de muestras duplicadas y se representaron gráficamente.

Estos resultados muestran que un inhibidor de fucosidasa (desoxifuconojirimicina no conjugada) inhibe la fucosidasa lisosómica en > 50 % en una línea de carcinoma hepatocelular humano, y sugiere que un inhibidor de fucosidasa conjugado con RAP es eficaz para el tratamiento del cáncer hepático.

Ejemplo 3

Administración de conjugados de péptido RAP in vivo

El carcinoma hepatocelular humano es el quinto tumor maligno más común diagnosticado, y en todo el mundo representa cerca de 500.000 muertes al año. La extirpación quirúrgica, el trasplante y la destrucción física del tejido tumoral son las primeras opciones de tratamiento, pero sólo el 5 a 10 % de los pacientes tienen tumores adecuados para estas estrategias (20-22). Además, la quimioterapia sistémica produce bajas tasas de respuesta del 15-20 %, debido tanto a la toxicidad de los agentes quimioterapéuticos como a la resistencia de las células tumorales (23-24).

Por ejemplo, la doxorubicina es un agente quimioterapéutico del cáncer con una alta eficacia frente una amplia variedad de tumores, y es especialmente tóxica para las células que sufren un crecimiento rápido, incluyendo las células tumorales. Sin embargo, el uso de doxorubicina en el tratamiento del carcinoma hepatocelular es limitado por la importante toxicidad hepática y cardíaca y la reducción de la producción de células sanguíneas (25). Además, las células de carcinoma hepatocelular muestran altas tasas de conversión a tipos resistentes a los fármacos (26).

Una estrategia alternativa a la terapia utiliza la radiación. Por ejemplo, un nuevo tratamiento para el cáncer de hígado que se está ensayando actualmente incluye la inyección de perlas de vidrio microscópicas, que han sido

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marcadas con un material radiactivo (90Y), en la arteria hepática principal, desde donde pasan a los pequeños vasos sanguíneos que irrigan el tejido tumoral. La radiación destruye entonces el tejido tumoral. Sin embargo, la derivación significativa de sangre desde la arteria hepática a los pulmones impide el uso de las perlas de vidrio en muchos pacientes. El reflujo significativo de perlas a las arterias que alimentan el tracto gastrointestinal puede causar también efectos secundarios graves. La administración eficaz de la terapia al tejido tumoral, requiere por lo tanto un enfoque más directo que no se base en materiales grandes que serán atrapados en los vasos sanguíneos.

A fin de evaluar la unión al receptor de los péptidos RAP en las células hepáticas in vivo, así como evaluar la capacidad de la molécula para administrar compuestos citotóxicos a las células in vivo, se utilizan modelos ortotópicos de carcinoma hepatocelular humano.

Para generar tumores ortotópicos en animales, las líneas celulares de hepatocarcinoma humano se implantan en ratones desnudos, ratas, u otro animal apropiado y las células tumorales se dejan crecer in vivo. Las líneas celulares de HCC útiles para los modelos ortotópicos incluyen, pero no se limitan a aquellas líneas celulares descritas anteriormente, tales como Heb3B, HepG2 y Huh-7. Los modelos de tumores ortotópicos de HCC son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Okubo et al. (J Gastroenterol Hepatol 2007 22: 423-8); Armengol et al, (Clin Cancer Res 2004 10: 2150-7), y Yao et al, (Clin Cancer Res 2003 9:. 2719-26)..

Para establecer en primer lugar un intervalo de dosis para la administración de los péptidos RAP conjugados y de los controles in vivo, se lleva a cabo un estudio de intervalo de dosis pequeñas utilizando 5 ratones por grupo, que reciben péptido RAP conjugado, (por ejemplo, o péptido RAP -DMJ (hasta 200 mg/kg/día), péptido RAP-Faz (hasta 200 mg/kg/día)), o péptido RAP solo (hasta 200 mg/kg/día), DMJ o Faz solo. Los agentes de ensayo se administran intravenosa o intraperitonealmente diariamente durante dos semanas (QDx14) y los animales se analizan en cuanto al cambio en el peso corporal, cualquier observación clínica y patología clínica e histopatología del tejido al final del estudio.

Para llevar a cabo un estudio de eficacia, se utilizan 8 a 10 ratones por grupo, y se administran 3 intervalos de dosis de ensayo de los compuestos anteriores a los animales que reciben células de HCC humanas y a los animales control. Los agentes de ensayo se administran ya sea inravenosamente o intraperitonealmente y se administran con una frecuencia apropiada, por ejemplo, diariamente durante 4 semanas (QDx28), diariamente durante 3 semanas (QDx21) o diariamente durante 2 semanas (QDx14). Se evalúan los animales para cualquier cambio en el peso corporal, observaciones clínicas, y medidas de eficacia in vivo, tales como el volumen del tumor, la histopatología del hígado, y la patología clínica general, utilizando métodos conocidos en la técnica.

La capacidad de los péptidos RAP conjugados para reducir el crecimiento de las células de carcinoma hepatocelular in vivo demuestra que los péptidos se unen al receptor celular en la superficie de la célula tumoral y son un medio eficaz para administrar agentes a las células del hígado dando como resultado un efecto biológicamente medible. La demostración de la muerte tumoral eficiente en modelos animales sugiere que los péptidos RAP conjugados son un método eficaz para la administración de inhibidores de fucosidasa a las células tumorales en los seres humanos que sufren de hepatocarcinoma o de otras afecciones del hígado.

Otro modelo animal relevante para el carcinoma hepatocelular (HCC) para ensayar la biodistribución y la eficacia de los compuestos terapéuticos es la marmota oriental infectada con el virus de hepatitis de la marmota (WHV) (27). Casi todas las marmotas infectadas neonatalmente con el virus desarrollan HCC dentro de un intervalo medio de 24 meses. La mediana de la esperanza de vida es de 30 meses, sin embargo las marmotas infectadas por WHV no desarrollan cirrosis, una condición presente en la mayoría de los pacientes con HCC. El virus de la hepatitis de la marmota y el virus de la hepatitis B humana son similares en estructura, genética, métodos de transmisión, curso de la infección y la progresión a carcinoma hepatocelular. Hay similitudes importantes que ponen de relieve la importancia de este modelo. Al igual que en los seres humanos, más de la mitad de todas las marmotas expuestas al virus de la hepatitis desarrollan poco después de nacer una infección crónica y casi todas las marmotas infectadas crónicamente desarrollan carcinoma hepatocelular en aproximadamente 20 a 28 meses después de la exposición. Las marmotas neonatales inoculadas restantes desarrollan a menudo hepatitis aguda, pero desarrollarán anticuerpos contra el virus y se recuperarán. Entre el 17 y el 25 % de estos animales "recuperados" desarrollan HCC entre 29 a 56 meses después de la exposición. El desarrollo de HCC después de que aparentemente se han recuperado de la infección por hepatitis se observa también en los seres humanos.

Para determinar el efecto de los conjugados de péptido RAP-inhibidor de fucosidasa sobre la administración de agentes al hígado, y en particular a las células tumorales, se estudian la absorción y la toxicidad del control y de los compuestos terapéuticos de conjugado de péptido RAP en el modelo de HCC en marmota. En una realización, se utilizan seis marmotas infectadas crónicamente y cuatro marmotas no infectadas, de aproximadamente 1,5-2 años de edad.

Un compuesto de administración útil generalmente presentará las siguientes características: 1) no afecta adversamente a la función ya comprometida del hígado, 2) absorción medible por el hígado y por el tejido hepático maligno, 3) y después de la absorción, es tóxico para las células tumorales y produce la regresión del tumor.

La medida de los indicadores de enfermedades de almacenamiento lisosómico, incluyendo los niveles de oligosacáridos en el lisosoma, orina y sangre, se ensayan también en los modelos tumorales.

Es de esperar que numerosas modificaciones y variaciones en la invención tal como se ha expuesto en los ejemplos ilustrativos anteriores se les podrán ocurrir a los expertos en la técnica. En consecuencia las únicas limitaciones que se podrían poner a la invención son las que aparecen en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (1)

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