TWI558397B - 以受體關連蛋白(rap)胜肽-岩藻醣苷水解酶抑制劑共軛物治療肝腫瘤之方法 - Google Patents
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Description
本發明大體係關於以包含受體關連蛋白(RAP)胜肽分子及岩藻糖苷水解酶抑制劑之共軛物治療諸如肝細胞癌之肝病症及肝腫瘤的方法及組合物。
本發明主張2010年1月28日申請之美國臨時專利申請案第61/299,177號的優先權益,該案以全文引用的方式併入本文中。
已注意到正常細胞與腫瘤細胞之間蛋白質糖基化的差異且該差異已成為研發腫瘤選擇性抗體之基礎[1]。已觀察到相對於正常肝細胞,肝細胞癌(HCC)細胞顯著且不適當地使其醣蛋白岩藻糖基化[2;3;4;5;6]。大部分此等醣蛋白在腫瘤溶酶體中終其一生,其在腫瘤溶酶體中降解。一個報導提出溶酶體α-L-岩藻糖苷水解酶之血清含量增加預示HCC,表明此酶可能由癌前肝細胞上調以適應生物合成路徑中醣蛋白岩藻糖基化之程度增加[7]。
溶酶體α-L-岩藻糖苷水解酶(FUCA1)之不活化(例如由於基因遺傳突變)導致溶酶體儲積症(lysosomal storage disease,LSD),稱為岩藻糖代謝病(fucosidosis)[8;9]。呈現岩藻糖代謝病之患者由於其溶酶體不能降解末端及核心岩藻糖基化寡醣而顯示未降解物質之溶酶體積累,且很少活過六歲[10]。
美國專利第5,240,707號揭示據推測適用作免疫調節劑及抗轉移劑之α-甘露糖苷酶及岩藻糖苷水解酶抑制劑。其他已知岩藻糖苷水解酶抑制劑包括L-去氧岩藻糖野尻黴素(L-deoxyfuconojirimycin,DFJ)[11],其係基於典型野尻黴素(nojirimycin)亞胺基糖結構且對溶酶體岩藻糖苷水解酶之抑制常數為10 nM。亦參見美國專利5,100,797,其揭示基於去氧岩藻糖野尻黴素(DFJ或DNJ)之其他抑制劑,例如β-L-高岩藻糖野尻黴素及1-β-C-經取代之去氧甘露糖野尻黴素(deoxymannojirimycin)。另一有效岩藻糖苷水解酶抑制劑為七員氮雜環庚烷類別之成員((3R,4R,5S,6S)-1-丁基-4,5,6-三羥基氮雜環庚烷-3-甲酸,亦稱為「Faz」)。儘管具有艾杜糖醛酸(iduronate)糖之羥基構型及羧基官能基,但此新穎分子亦以低奈莫耳濃度範圍內之效能抑制岩藻糖苷水解酶[12]。如同大多數亞胺基糖抑制劑,預期胺之烷基修飾不會顯著影響抑制劑效能[13;14],此允許抑制劑與大生物聚合物(諸如胜肽)容易且穩定地共軛。岩藻糖苷水解酶抑制劑另外描述於美國專利第5,382,709號、第5,240,707號、第5,153,325號、第5,100,797號、第5,096,909號及第5,017,704號中。
本發明大體係關於治療諸如肝細胞癌之肝病症的組合物及方法。所涵蓋之組合物包含來源於人類受體關連蛋白(RAP)之胜肽與岩藻糖苷水解酶抑制劑共軛。RAP胜肽結合肝細胞上之LRP1受體,由此使岩藻糖苷水解酶抑制劑靶向肝。
在一態樣中,本發明提供一種包含受體關連蛋白(RAP)胜肽連接於岩藻糖苷水解酶抑制劑之胜肽共軛物,該RAP胜肽包含與SEQ ID NO: 1之RAP多胜肽至少80%同源的多胜肽序列。在又一態樣中,本發明提供一種包含受體關連蛋白(RAP)胜肽連接於岩藻糖苷水解酶抑制劑之胜肽共軛物,該RAP胜肽包含與SEQ ID NO: 1之RAP的胺基酸210-319至少80%同源的多胜肽序列。在一實施例中,RAP胜肽自SEQ ID NO: 1之N端缺失至少200個且至多245個胺基酸。在一相關實施例中,RAP胜肽自SEQ ID NO: 1之N端缺失245個胺基酸。
在某些實施例中,RAP胜肽進一步自SEQ ID NO: 1之C端缺失至少4個且至多11個胺基酸。在另一實施例中,RAP胜肽進一步自SEQ ID NO: 1之C端缺失11個胺基酸。在另一實施例中,RAP胜肽缺少SEQ ID NO: 1之成熟RAP的胺基酸1-245及320-323。
在其他實施例中,本發明所涵蓋之RAP胜肽可由天然RAP序列構成或可包括該天然序列之突變。在例示性實施例中,本發明之RAP胜肽包含與如本文所述來源於SEQ ID NO: 1的任何RAP胜肽至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。在某些實施例中,本發明之RAP胜肽包含與SEQ ID NO: 1所示之RAP的胺基酸210-319、243-313、246-313、249-303或251-303至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。
在另一實施例中,RAP胜肽包含與SEQ ID NO: 2所示之序列至少80%同源之多胜肽序列。在一相關實施例中,RAP胜肽包含SEQ ID NO: 2所示之多胜肽序列。
在一些實施例中,岩藻糖苷水解酶抑制劑係選自由野尻黴素亞胺基糖、七員氮雜環庚烷、經取代之(1-α,2-β,3-α或β,4-α,5-α或β)-2,3,4-三羥基-5-(羥基甲基)環戊胺及2,6-亞胺基-2,6,7-三去氧-D-甘油-D-葡萄庚糖醇組成之群。
例示性岩藻糖苷水解酶抑制劑包括(但不限於)野尻黴素亞胺基糖,諸如L-去氧岩藻糖野尻黴素(DFJ或DNJ)、β-L-高岩藻糖野尻黴素及1-β-C-經取代之去氧甘露糖野尻黴素(β-1-C-甲基去氧甘露糖野尻黴素、β-1-C-乙基去氧甘露糖野尻黴素、β-1-C-苯基去氧甘露糖野尻黴素);及七員氮雜環庚烷,諸如(3R,4R,5S,6S)-1-丁基-4,5,6-三羥基氮雜環庚烷-3-甲酸(「Faz」)。預期用於本發明中之其他岩藻糖苷水解酶抑制劑包括(但不限於)經取代之(1-α,2-β,3-α或β,4-α,5-α或β)-2,3,4-三羥基-5-(羥基甲基)環戊胺及2,6-亞胺基-2,6,7-三去氧-D-甘油-D-葡萄庚糖醇。
在另一實施例中,岩藻糖苷水解酶抑制劑係選自由L-去氧岩藻糖野尻黴素(DFJ或DNJ)、β-1-C-甲基去氧甘露糖野尻黴素、β-1-C-乙基去氧甘露糖野尻黴素、β-1-C-苯基去氧甘露糖野尻黴素及(3R,4R,5S,6S)-1-丁基-4,5,6-三羥基氮雜環庚烷-3-甲酸(Faz)組成之群。
在某些實施例中,岩藻糖苷水解酶抑制劑在活體外以1pM-100 nM範圍或1-100 nM範圍抑制α-L-岩藻糖苷水解酶。
在另一實施例中,預期岩藻糖苷水解酶抑制劑經由胜肽連接子共軛。
在一些實施例中,胜肽連接子為五胜肽連接子或樹枝狀聚合物。例示性樹枝狀聚合物包括(但不限於)離胺酸樹枝狀聚合物、PAMAM樹枝狀聚合物、POPAM樹枝狀聚合物、三嗪樹枝狀聚合物及二胺基丁烷(DAB)樹枝狀聚合物。
在另一實施例中,胜肽連接子為離胺酸樹枝狀聚合物。離胺酸樹枝狀聚合物包括(但不限於)第1、第2、第3、第4、第5或第6代離胺酸樹枝狀聚合物,諸如K4K2K離胺酸樹枝狀聚合物及KG6離胺酸樹枝狀聚合物。在一相關實施例中,胜肽連接子為K4K2K離胺酸樹枝狀聚合物。
在某些實施例中,每一RAP胜肽分子共軛一或多個岩藻糖苷水解酶抑制劑。在一相關實施例中,本發明涵蓋RAP胜肽共軛物包含一或多個抑制劑連接於同一或多個RAP胜肽。在一實施例中,RAP胜肽可包含約1至5個、約1至10個、約5至10個、約10至20個、約20至30個、或30個或30個以上抑制劑分子連接於RAP胜肽。在一些實施例中,預期RAP共軛物包含每一RAP胜肽分子對應至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個或12個以上抑制劑分子。在一相關實施例中,共軛物包含1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1之抑制劑與RAP胜肽的化學計量比。岩藻糖苷水解酶抑制劑與RAP胜肽之其他化學計量比包括1:2、1:3、3:2、5:2、7:2、9:2、11:2、4:3、5:3、7:3、8:3、10:3、11:3。在一些實施例中,抑制劑分子與RAP胜肽分子之比率介於1:1與12:1之間或介於1.5:1與10:1之間。
在另一實施例中,RAP胜肽共軛物包含每一RAP胜肽分子對應至少4個岩藻糖苷水解酶抑制劑。在另一實施例中,RAP胜肽共軛物包含每一RAP胜肽分子對應至少8個岩藻糖苷水解酶抑制劑。
在另一態樣中,本發明提供一種治療有需要之個體之肝腫瘤的方法,其包含投與治療有效量之本文所述之RAP胜肽共軛物。
在一實施例中,肝腫瘤為肝細胞癌、肝炎病毒感染、肝硬化、中毒性肝損傷及遺傳性血色沉著病之結果。
在一相關實施例中,肝腫瘤為肝細胞癌之結果。
在另一實施例中,治療使得個體之肝腫瘤尺寸減小。在另一實施例中,與治療前之含量相比,治療使得個體血液中之α-胎蛋白含量降低。
在某些實施例中,胜肽共軛物係靜脈內投與。在一相關實施例中,胜肽共軛物係經由肝動脈投與。
在又一實施例中,胜肽共軛物與第二藥劑組合投與。在某些實施例中,第二藥劑係選自由化學治療劑、細胞毒性劑、放射性同位素、抗病毒劑、抗真菌劑及消炎劑組成之群。在一相關實施例中,化學治療劑係選自由阿黴素(doxorubicin)及5-氟尿嘧啶組成之群。
在另一實施例中,第二藥劑為細胞毒性劑。在一些實施例中,細胞毒性劑係選自由氮芥鹽酸鹽(mechlorethamine hydrochloride)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法侖(melphalan)、白消安(busulfan)、塞替派(thiotepa)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、氮烯唑胺(dacarbazine)及鏈佐星(streptozocin)組成之群。
在另一實施例中,第二藥劑為放射性同位素。在一些實施例中,放射性同位素係選自由131I、125I、111In、90Y、67Cu、127Lu、212Bi、213Bi、255Fm、149Tb、223Rd、213Pb、212Pb、211At、89Sr、153Sm、166Ho、225Ac、186Re、67Ga、68Ga及99mTc組成之群。
在一實施例中,肝腫瘤與肝炎病毒感染相關連,且第二藥劑為抗病毒劑。
亦涵蓋本文所揭示之任何上述共軛物用於製備用以治療本文所述之任何肝病症之藥劑的用途。亦涵蓋用於治療肝病症之包含如本文所述之RAP-胜肽岩藻糖苷水解酶共軛物的組合物。亦涵蓋視情況連同適合使用說明書包含任何上述共軛物的注射器(例如單用途或預填充注射器)、無菌密封容器(例如小瓶、瓶、容器)及/或套組或包裝。
本文所述之任何上述共軛物可與作為輔助療法適用於治療此項技術中已知或本文所述之肝病症的任何藥劑同時投與。亦涵蓋包含任何上述共軛物以及其他肝治療劑之組合物。
應瞭解本文所述之各特徵或實施例或組合為本發明任何態樣的非限制性、說明性實例,且因此意欲可與本文所述之任何其他特徵或實施例或組合進行組合。舉例而言,當以諸如「一實施例」、「一些實施例」、「其他實施例」、「特定例示性實施例」及/或「另一實施例」之措辭描述特徵時,此等類型之實施例各自為意欲與本文所述之任何其他特徵或特徵組合進行組合之特徵的非限制性實例,而不必列出每一可能組合。該等特徵或特徵組合適用於本發明之任何態樣。當揭示屬於一定範圍內之值的實例時,涵蓋任何此等實例作為範圍之可能端點,涵蓋該等端點之間的任何及所有數值,且預見上端點與下端點之任何及所有組合。
本發明係關於一種包含受體關連蛋白(RAP)或其片段或RAP或RAP片段之變異體連接於岩藻糖苷水解酶抑制劑的共軛物。本發明亦關於該等共軛物用於治療肝腫瘤、尤其肝細胞癌之用途。共軛物之RAP部分使岩藻糖苷水解酶抑制劑靶向肝細胞,且使得岩藻糖苷水解酶抑制劑選擇性運輸至肝細胞,並攝取至溶酶體中。不受本發明之理論束縛,岩藻糖苷水解酶抑制劑誘導來源於醣蛋白之寡醣積累於溶酶體中,此與肝細胞中溶酶體儲積症之作用類似,由此誘導細胞之細胞毒性事件。
除非另外定義,否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解之含義相同的含義。以下參考文獻向一般技術者提供本發明中所用之許多術語的通用定義:Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(第2版1994);THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker編,1988);THE GLOSSARY OF GENETICS,第5版,R. Rieger等人(編),Springer Verlag(1991);及Hale及Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY(1991)。
本文中引用之各公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻係在不會與本發明不一致之程度上以引用的方式全部併入本文中。
此處應注意,除非上下文另外明確指示,否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用,單數形式「一」及「該」包括複數個指示物。
除非另有規定,否則如本文中所使用,以下術語具有歸屬於其之含義。
如本文中所使用,「岩藻糖苷水解酶抑制劑」係指抑制α-L-岩藻糖苷水解酶自醣蛋白裂解岩藻糖殘基之活性的藥劑,例如小分子。例示性岩藻糖苷水解酶抑制劑包括(但不限於)野尻黴素亞胺基糖,諸如去氧岩藻糖野尻黴素(DFJ或DNJ)、去氧甘露糖野尻黴素(DMJ)及其衍生物。特定衍生物包括β-L-高岩藻糖野尻黴素及1-β-C-經取代之去氧甘露糖野尻黴素(β-1-C-甲基去氧甘露糖野尻黴素、β-1-C-乙基去氧甘露糖野尻黴素、β-1-C-苯基去氧甘露糖野尻黴素)。例示性岩藻糖苷水解酶抑制劑亦包括七員氮雜環庚烷分子,諸如(3R,4R,5S,6S)-1-丁基-4,5,6-三羥基氮雜環庚烷-3-甲酸(「Faz」)。預期用於本發明中之其他岩藻糖苷水解酶抑制劑包括美國專利5,382,709、5,240,707、5,153,325、5,100,797、5,096,909及5,017,704中所揭示之抑制劑,包括(但不限於)經取代之(1-a,2-β,3-α或β,4-α,5-α或β)-2,3,4-三羥基-5-(羥基甲基)環戊胺及2,6-亞胺基-2,6,7-三去氧-D-甘油-D-葡萄庚糖醇。術語「岩藻糖苷水解酶抑制劑」特定言之包括以下名稱為「α-L-岩藻糖苷水解酶及岩藻糖苷水解酶抑制劑」之章節中所述的任何抑制劑及其衍生物。
如本文中所使用,「肝腫瘤」包括在肝臟內或肝臟上形成或與肝實體關連之原發性腫瘤及/或瘤形成及/或轉移。其亦包括遷移至身體內別處但仍對RAP胜肽與岩藻糖苷水解酶抑制劑之共軛物有反應的肝腫瘤轉移。已知許多類型之該等腫瘤及瘤形成。原發性肝腫瘤包括肝細胞癌及此項技術中已知之其他腫瘤。該等腫瘤一般為實體腫瘤,或其為積累定位於肝之彌漫性腫瘤。對於本發明之治療而言,腫瘤或瘤形成可為惡性或良性的,且可能預先已經化學療法、輻射及/或其他治療進行了治療。
術語「有效量」意謂足以對個體之健康狀況、病理及疾病產生所需結果或足以達成診斷目的之劑量。所需結果可包含劑量接受者之主觀或客觀改良。「治療有效量」係指可對健康有效產生預定有益作用之藥劑量。舉例而言,有效量可包括有效減緩實體腫瘤生長或減小其尺寸之量。有效量可減少腫瘤轉移。有效量可為有效減緩癌細胞增殖速率、停止癌細胞增殖或殺死癌細胞之量。
「小有機分子」係指大小與一般用於藥物中之彼等有機分子相當的有機分子。該術語不包括有機生物聚合物(例如蛋白質、核酸等)。較佳小有機分子之大小範圍為至多約5,000 Da、至多約2,000 Da或至多約1,000 Da。
診斷或治療之「個體」為人類或非人類動物,包括哺乳動物或靈長類動物。
「治療」係指預防性處理或治療性處理或診斷性處理。
「預防性」處理為出於降低發展病理之風險之目的而向未顯示疾病徵象或僅顯示早期徵象之個體投與的治療。本發明之共軛化合物可作為預防性處理給與以降低發展病理之可能性或使病理(若已發展)之嚴重程度降至最低。
「治療性」處理為出於減弱或消除病理徵象或症狀之目的而向顯示該等病理徵象或症狀之個體投與的治療。該等徵象或症狀可為生物化學、細胞、組織學、功能性、主觀或客觀徵象或症狀。本發明之共軛化合物可作為治療性處理給與或給與用於診斷。
「診斷」意謂確定病理學病狀之存在或性質。診斷方法之特異性及選擇性可不同。儘管特定診斷方法可能不提供對病狀之確定性診斷,但若該方法提供有助於診斷之積極指示,則其足矣。
「醫藥組合物」係指適於在個體動物(包括人類及哺乳動物)中進行醫藥應用的組合物。醫藥組合物包含藥理學有效量之RAP胜肽與活性劑共軛,且亦包含醫藥學上可接受之載劑。醫藥組合物涵蓋如下組合物,其包含活性成分及構成載劑之惰性成分,以及由任何兩種或兩種以上成分組合、複合或聚集或由一或多種成分解離或由一或多種成分之其他類型反應或相互作用直接或間接得到之任何產物。因此,本發明之醫藥組合物涵蓋藉由使本發明之共軛化合物與醫藥學上可接受之載劑混合所製備之任何組合物。欲用於非經腸投藥之醫藥組合物須無菌。
「醫藥學上可接受之載劑」係指任何標準醫藥載劑、緩衝液及賦形劑,諸如磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液、5%右旋糖水溶液及乳液(諸如油/水或水/油乳液)及各種類型之濕潤劑及/或佐劑。適合醫藥載劑及調配物描述於Remington's Pharmaceutical Sciences,第19版(Mack Publishing Co.,Easton,1995)中。較佳醫藥載劑視活性劑之預定投藥模式而定。典型投藥模式包括經腸(例如經口)或非經腸(例如皮下、肌肉內、靜脈內或腹膜內注射;或局部、經皮或經黏膜投藥)。「醫藥學上可接受之鹽」為可調配成用於醫藥用途之化合物的鹽,包括例如金屬鹽(鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽等)及氨或有機胺之鹽。
如本文中所使用,術語「單位劑型」係指適合作為單位劑量用於人類及動物個體的物理個別單元,各單元含有經計算足以產生所需作用之量的預定量之本發明化合物與醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或媒劑結合。本發明之新穎單位劑型的規格視以下而定:所用特定共軛物及欲達成之作用,及宿主中與各化合物相關連之藥效學。舉例而言,用於經口投藥之單位劑型可為錠劑、膠囊或丸劑或其群組。用於非經腸投藥之單位劑型可為含有設定毫克數劑量之小瓶或填充注射器或袋子。
如本文中所使用,「調節」係指藉由增加或減少而變化之能力(例如充當拮抗劑或促效劑)。
如本文中所使用,「增加相對傳遞」係指藉以使得包含RAP胜肽及岩藻糖苷水解酶抑制劑之共軛物在預定傳遞部位(例如肝)之積累相對於未共軛抑制劑的積累有所增加之作用。
「治療指數」係指高於最小治療量但低於不可接受之毒性量的劑量範圍(量及/或時序)。
「等效劑量」係指含有相同量之活性劑的劑量。
「聚核苷酸」係指由核苷酸單元構成之聚合物。聚核苷酸包括天然存在之核酸,諸如去氧核糖核酸(「DNA」)及核糖核酸(「RNA」),以及核酸類似物。核酸類似物包含包括非天然存在之鹼基、參與與除天然存在之磷酸二酯鍵以外之其他核苷酸之鍵聯的核苷酸或包括經由除磷酸二酯鍵以外之鍵聯而連接之鹼基的核苷酸之核酸類似物。因此,核苷酸類似物包括例如(但不限於)硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、磷醯胺酸酯(phosphoramidate)、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、甲基膦酸酯、對掌性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、胜肽-核酸(PNA)及其類似物。該等聚核苷酸可例如使用自動DNA合成器來合成。術語「核酸」通常指大的聚核苷酸。術語「寡核苷酸」通常指短的聚核苷酸,一般不超過約50個核苷酸。應瞭解,當以DNA序列(亦即A、T、G、C)表示核苷酸序列時,此亦包括RNA序列(亦即A、U、G、C),其中「U」替代「T」。編碼蛋白質及RNA之核苷酸序列可包括內含子。
「cDNA」係指呈單股或雙股形式之與mRNA互補或一致之DNA。
「互補」係指兩個聚核苷酸之相互作用表面之拓撲相容性或該等表面匹配在一起。若第一聚核苷酸之核苷酸序列與第二聚核苷酸之聚核苷酸結合搭配物之核苷酸序列一致,則第一聚核苷酸與第二聚核苷酸互補。因此,序列為5'-TATAC-3'之聚核苷酸與序列為5'-GTATA-3'之聚核苷酸互補。聚核苷酸序列可完全互補(亦即100%匹配)或部分互補。
用於在南方或北方墨點法(Southern or northern blot)中在過濾器上使具有超過100個互補殘基之互補核酸雜交之嚴格雜交條件的一實例為:在42℃下,含1 mg肝素(heparin)之50%福馬林(formalin),進行雜交隔夜。高度嚴格洗滌條件之一實例為0.15 M NaCl,72℃下洗滌約15分鐘。嚴格洗滌條件之一實例為:在65℃下0.2×SSC洗滌15分鐘(關於SSC緩衝液之描述參見Sambrook等人)。
「重組聚核苷酸」係指具有在天然狀況下並不連接在一起之序列的聚核苷酸。可將擴增或組裝之重組聚核苷酸包括於適合載體中,且該載體可用於轉型適合宿主細胞。包含重組聚核苷酸之宿主細胞稱為「重組宿主細胞」。基因在重組宿主細胞中表現以產生例如「重組多胜肽」。重組聚核苷酸亦可提供非編碼功能(例如啟動子、複製起點、核糖體結合位點等)。
「表現控制序列」係指聚核苷酸中調節以操作方式所連接核苷酸序列之表現(轉錄及/或轉譯)的核苷酸序列。「以操作方式連接」係指兩個部分之間的功能關係,其中一個部分之活性(例如調節轉錄之能力)對另一個部分產生作用(例如序列之轉錄)。表現控制序列可包括例如(但不限於)啟動子(例如誘導性或組成性)、強化子、轉錄終止子、起始密碼子(亦即ATG)、內含子拼接信號及終止密碼子之序列。
「表現載體」係指包含重組聚核苷酸之載體,該重組聚核苷酸包含表現控制序列以操作方式連接於待表現之核苷酸序列。表現載體包含足以用於表現之順式作用元件;用於表現之其他元件可由宿主細胞或活體外表現系統供應。表現載體包括此項技術中已知之所有表現載體,諸如黏質體、質體(例如裸質體或含於脂質體中之質體)及併有重組聚核苷酸之病毒。
「多胜肽」係指由胺基酸殘基構成之聚合物、其天然存在之相關結構變異體及其經由胜肽鍵連接之非天然存在之合成類似物、其天然存在之相關結構變異體及非天然存在之合成類似物。合成多胜肽可例如使用自動多胜肽合成器來合成。術語「蛋白質」通常指大型多胜肽。術語「胜肽」通常指短型多胜肽。
「RAP胜肽」或「RAP多胜肽」係指SEQ ID NO: 1之α-2-巨球蛋白/低密度脂蛋白受體相關蛋白關連蛋白1(RAP)的片段或變異體或其另一種天然存在之多形形式、Uniprot寄存編號P30533、Pfam寄存編號PF06400及PF06401。基於涉及插入一或多個胺基酸、一或多個胺基酸取代其他胺基酸或缺失一或多個胺基酸的一或多個突變,與親本或參考多胜肽比對,多胜肽變異體之胺基酸序列組成不同。基於被置換胺基酸與置換其之胺基酸的物理化學或功能相關性,取代可為保守性或非保守性取代。如本文中所使用,術語「RAP胜肽」應理解為指SEQ ID NO: 1之RAP的片段,及該等片段之保留對於肝之相對選擇性的實質上同源變異體。較佳RAP胜肽之長度小於約200個胺基酸,或長度小於約175、150、125或100個胺基酸,且與RAP之至少50、60、70、80、90或100個胺基酸至少75%、80%、85%、90%或95%一致。較佳RAP胜肽實質上與RAP之域3同源。該等胜肽保留對於肝之相對選擇性,例如以10-5 M或更佳(亦即10-6 M、10-7 M、10-8 M、10-9 M或10-9 M以下)之親和力結合於LRP1。術語「RAP胜肽」特定言之包括以下名稱為「RAP胜肽」之章節中所述之任何胜肽。
在兩個或兩個以上聚核苷酸或多胜肽序列之情形中,術語「一致」或「一致性百分比」係指當出於最大對應性進行比較及比對時,如使用以下序列比較演算法中之一者或藉由目測所量測,兩個或兩個以上序列或子序列相同或具有指定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基。
在兩個核酸或多胜肽之情形中,短語「實質上同源」或「實質上一致」一般指當出於最大對應性進行比較及比對時,如使用以下序列比較演算法中之一者或藉由目測來量測,兩個或兩個以上序列或子序列具有至少40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%核苷酸或胺基酸殘基一致性。較佳地,實質一致性存在於序列之長度為至少約50、60、70、80或90個殘基的區域上,或至少約100個殘基之區域上,或至少約150個殘基之區域上。在所述參考生物聚合物之整個長度範圍內,該等序列實質上一致。在一些實施例中,在兩個比較生物聚合物之整個長度範圍內,該等序列實質上一致。
為進行序列比較,通常一個序列充當與測試序列進行比較之參考序列。當使用序列比較演算法時,將測試及參考序列輸入電腦,必要時指定子序列座標,並指定序列演算法程式參數。序列比較演算法根據指定程式參數,計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。
用於比較之序列的最佳對準可例如藉由Smith及Waterman,Adv. Appl. Math. 2:482(1981)之局部同源性演算法,藉由Needleman及Wunsch,J. Mol. Biol. 48:443(1970)之同源性比對演算法,藉由Pearson及Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)之相似性搜尋法,藉由此等演算法之電腦化實施(威斯康辛遺傳學套裝軟體(Wisconsin Genetics Software Package),Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)或藉由目測來進行。適於測定序列一致性及序列相似性百分比之演算法的另一實例為BLAST演算法,其描述於Altschul等人,J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)中。
「實質上純」或「經分離」意謂目標物質為存在之主要物質(亦即,以莫耳計,在組合物中比任何其他個別大分子物質更豐富),且實質上純化之部分為目標物質佔所有存在之大分子物質之至少約50%(以莫耳計)的組合物。一般而言,實質上純的組合物意謂約80%至90%或90%以上存在於組合物中之大分子物質為所關注之經純化物質。若組合物基本上由單一大分子物質組成,則目標物質經純化至基本上均質(藉由習知偵測方法不能在組合物中偵測出污染物質)。出於此定義之目的,溶劑物質、小分子(<500道爾頓(Dalton))、穩定劑(例如BSA)及元素離子物質不視為大分子物質。在一些實施例中,本發明之共軛物為實質上純或經分離。在一些實施例中,適用於本發明方法之共軛物相對於其合成中所用之大分子起始物質為實質上純或經分離。在一些實施例中,本發明之醫藥組合物包含實質上純化或分離之RAP胜肽與活性劑之共軛物與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑或載劑混合。
「天然存在」當應用於一對象時係指該對象可見於自然界中。舉例而言,存在於可自自然界來源分離的生物體(包括病毒)中且未經人類在實驗室中有意修飾之多胜肽或聚核苷酸序列為天然存在的。
「連接子」係指以共價方式或經由離子鍵、凡得瓦爾力(van der Waals)或氫鍵來聯接兩個其他分子之分子,例如在5'端與一個互補序列雜交且在3'端與另一個互補序列雜交,由此聯接兩個非互補序列之核酸分子。在某些實施例中,預期連接子為經由胜肽鍵聯接於分子之胜肽連接子。
如本文中所使用,「腫瘤」或「瘤形成」或「癌症」包括原發性腫瘤及/或轉移。腫瘤包括例如卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌或胃癌及其向肝之轉移。
RAP分子最初產生為357個胺基酸之蛋白質(Uniprot寄存編號P30533),該蛋白質具有35個胺基酸之信號序列,該信號序列裂解形成為323個胺基酸之胜肽的成熟RAP。成熟RAP之323個胺基酸的序列如SEQ ID NO: 1所示。成熟RAP亦保留4個胺基酸之C端內質網滯留信號。
RAP在功能上為雙牙,其中第一與第三域(d1與d3)皆以低奈莫耳濃度親和力結合於LDLR中之一串特定互補型重複(CR)對(Andersen等人,Biochemistry 40,15408-15417,2001)。由約110個胺基酸組成之域3(d3)對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸210至319。使用片段傾向於使免疫原性減至最小,使生產效率達到最大及改良效能。然而,經分離之d3與受體之結合不如全長RAP情形中之d3緊密。d3之N端區域及d2之C端區域中所見之其他序列為確保穩定摺疊及高親和力受體結合所必需。(Lazic等人,Biochemistry 42,14913-14920,2003)。來源於RAP d3與LDLR CR34之間的複合物之結構資料(Fisher等人,Mol Cell 22,277-283,2006)指示RAP d3之受體結合序列存在於由可撓性環聯接之長度近似相等之兩個反平行α螺旋中。
包含非天然二硫鍵之環化RAP已經工程改造,連接構成RAP d3之受體結合單元的兩個反平行螺旋之末端。[參見共同擁有之專利申請案第PCT/US2008/057863號(WO 2008/116171)及第PCT/US2007/78792號(WO 2008/036682),其揭示內容以全文引用的方式併入本文中]。在一些實施例中,環化胜肽之長度為約75個胺基酸,但與未環化胜肽相比結合親和力提高且親和力與110個胺基酸之RAP d3相當。一個例示性胜肽係來源於人類RAP之胺基酸246至313,具有如下胺基酸取代:E246C、L247G、G280A、L311A及S312C。此胜肽之序列如SEQ ID NO: 2所示。其他例示性胜肽例如與SEQ ID NO: 1之胺基酸247-311至少約80%一致或與SEQ ID NO: 1之胺基酸251-303至少約80%一致,且在N及C端處或附近(例如在距離末端約5個胺基酸以內)經Cys-Cys鍵連接。
SEQ ID NO: 2之表徵顯示此環狀胜肽以約3.5 nM之親和力結合於LRP1(參見WO 2008/116171)。WO 2008/116171揭示結合LRP1之其他環狀RAP胜肽。舉例而言,mRAP-8c胜肽(RAP之胺基酸246至312,具有如下胺基酸取代:E246C、L247G及L311G及S312C)(SEQ ID NO: 3)以約4至6 nM親和力結合於LRP1(叢集II)受體。mRAPc胜肽(具有以下修飾之RAP d3:A242G、R314G、E241C及I315C)(SEQ ID NO: 4)以約10 nM之親和力結合LRP1,而mRAP14c胜肽(包含具有以下胺基酸取代之RAP殘基250-309:F250C、L308G及Q309C)顯示對於LRP1之親和力為約21 nM。預期任何此等RAP胜肽用於本發明。
該等胜肽之共軛亦揭示於WO 2008/116171中。該等共軛物可包括五胜肽連接子,GGSGG(SEQ ID NO: 5)。在例示性實施例中,藉由使部分與RAP胜肽自身或五胜肽連接子之N端甘胺酸共軛來產生共軛物。或者,一或多個離胺酸可添加至胜肽或連接子之N端中,且使化學(例如治療性)部分與此等離胺酸共軛。舉例而言,一胜肽共軛物包含藉由添加另外連接於兩個離胺酸(K2、K3)(各自與兩個化學部分共軛)之離胺酸(K1)而修飾之N端離胺酸。第一離胺酸(K1)亦連接於包含兩個化學部分之鳥胺酸殘基,且進一步連接於與兩個化學部分共軛之最終離胺酸殘基(K4)。
此等胜肽可易於與多個岩藻糖苷水解酶抑制劑(包括岩藻糖苷水解酶抑制劑DFJ及Faz)共軛。多個抑制劑分子與胜肽共軛應藉由向已較高的DFJ及Faz對於酶之親和力添加親合性作用而使得溶酶體岩藻糖苷水解酶(具有多個活性位點之均四聚物[17])得到極其有效抑制。預期每分子單體胜肽或多聚化胜肽共軛至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30個或30個以上抑制劑分子。在一些實施例中,抑制劑分子與RAP胜肽分子之比率介於1:1與12:1之間或介於1.5:1與10:1之間。
預期RAP胜肽共軛物經歷快速攝取且運輸至肝細胞溶酶體,在肝細胞溶酶體中其應具有完全活性且共軛物進一步由溶酶體降解或不降解。不受理論束縛,提出經由此機制,在肝細胞中誘發類似LSD之岩藻糖代謝病,預期由於在腫瘤肝細胞中醣蛋白之過度岩藻糖基化而使此等細胞中之LSD作用明顯增強。此方法代表治療肝細胞癌而不傷害其他非肝組織及不傷害正常肝組織之新穎方法。
用於本發明之RAP胜肽包括美國專利第5,474,766號及國際專利申請案第PCT/US2006/36453號中所揭示之彼等RAP片段及變異型多胜肽,出於揭示用於本發明之化合物及組合物中的該等胜肽及其製造之目的,該等專利之每一者以全文引用的方式併入本文中。RAP胜肽係使用熟習此項技術者已知之任何蛋白質製備及純化方法製備。
在一實施例中,適用於本發明之RAP胜肽(包括環狀RAP胜肽)之胺基酸序列自成熟RAP之N端缺失至少200個且至多248個胺基酸。因此,RAP胜肽可缺失成熟RAP之胺基酸1-209、1-220、1-225、1-230、1-235、1-240、1-241、1-242、1-243或者1-244、1-245、1-246、1-247或1-248。在一相關實施例中,RAP胜肽胺基酸序列進一步自成熟RAP之C端缺失至少4個且至多11個胺基酸。因此,RAP胜肽可缺失成熟RAP之胺基酸314-323或313-323或者304-323、305-323、306-323、307-323、308-323、309-323、310-323、311-323或312-323。在一相關實施例中,RAP胜肽胺基酸序列包含成熟RAP域3中具有以下特徵之連續部分:(a)長度為至少50、55、60、65、70、75、80或85個胺基酸及(b)包含胺基酸256-270。RAP中可形成RAP胜肽(包括環狀RAP胜肽)之基礎的例示性部分包括成熟RAP(SEQ ID NO: 1)之胺基酸210-323、221-323、210-319、221-319、243-319、244-319、245-319、246-319、247-319、248-319、249-319、210-313、221-313、243-313、244-313、245-313、246-313、247-313、248-313、249-313、210-303、221-303、243-303、244-303、245-303、246-303、247-303、248-303或249-303。
所涵蓋之其他RAP胜肽實施例包含人類或哺乳動物RAP多胜肽,其中該多胜肽包含RAP中位置282-289、201-210及311-319之天然胺基酸序列。RAP之結合LRP受體的突變型及N端或C端截短變異體揭示於Melman等人(J. Biol. Chem. 276(31): 29338-46,2001)(其以全文引用的方式併入本文中)中且尤其為此等RAP突變型及截短變異體。其他所涵蓋之RAP多胜肽包含RAP中胺基酸85-148及178-248之間的天然序列。(參見Farquhar等人,Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3161-3162(1994))。
在另一實施例中,本發明提供一種各種大小之RAP胜肽或環狀RAP胜肽,包括長度為約103、約99、約95、約90、約85、約82、約80、約78、約76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57或56個胺基酸或少於56個胺基酸。在一些實施例中,若胜肽為環狀RAP胜肽,則在間隔約76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57或56個胺基酸之胺基酸之間形成共價鍵。應瞭解形成RAP胜肽之基礎的此等片段可包括其他插入或取代,其限制條件為該等片段實質上與其同源。
如WO 2008/116171中所述,可製備顯示對於LRP1之親和力及選擇性與天然RAP類似(例如與天然RAP相比差異為約5倍或低於5倍)的環狀RAP胜肽。亦可製備與天然RAP相比顯示改良之對於LRP1之親和力的環狀RAP胜肽。在一實施例中,環狀RAP胜肽顯示對於LRP1(P98157)之親和力改良(相對於天然RAP)至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、7倍、10倍或20倍。
本發明所涵蓋之RAP胜肽可由天然RAP序列構成或可包括該天然序列之突變。在例示性實施例中,本發明之RAP胜肽包含與如本文所述來源於SEQ ID NO: 1的任何RAP胜肽至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。在某些實施例中,本發明之RAP胜肽包含與SEQ ID NO: 1所示之RAP的胺基酸210-319、243-313、246-313、249-303或251-303至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。
可製備相對於天然RAP序列含有保守性取代(例如至多5個、至多10個、至多15個、至多20個或至多25個)但仍保留對於LRP1之結合親和力的環狀RAP胜肽。含有非保守性取代之RAP胜肽亦可能保留對於LRP1之結合親和力。舉例而言,已顯示成熟RAP之位置217、249或251中任一者的非保守性突變不影響結合親和力。亦產生位置241、242、247、250、308、309、311、314之非保守性及保守性突變。
在任何先前實施例中,RAP胜肽可在胜肽之N端處或附近含有半胱胺酸及在胜肽之C端處或附近含有半胱胺酸(例如距離末端3、4或5個胺基酸以內),從而允許經由在兩個半胱胺酸之間形成二硫鍵而使胜肽環化及使α螺旋穩定。視情況,甘胺酸或脯胺酸可插入半胱胺酸與α螺旋之間(例如在N端為Cys-Gly及在C端為Gly-Cys)。引入甘胺酸使得α螺旋被破壞,產生相鄰非天然螺旋間二硫鍵。
另外預期本文所述之任何RAP胜肽多聚化為如本文所述之寡聚組合。如本文中所使用,「多聚化RAP胜肽」係指包含2個或2個以上RAP胜肽之多胜肽。術語「多聚物」及「寡聚物」在本文中可互換使用。在一實施例中,寡聚物或多聚物包含至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個或至少8個環狀RAP胜肽。在一例示性實施例中,環狀RAP胜肽與生物素分子共軛以促進多聚化或寡聚化。生物素共軛之環狀胜肽可隨後藉由結合於抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)或藉由結合於抗生物素抗體而多聚化。環狀RAP胜肽寡聚物或多聚物亦可藉由此項技術中熟知及下文描述之其他技術來製備。
形成胜肽之多聚物或寡聚物的許多技術為此項技術中所已知。舉例而言,胜肽可藉由如本文所述之連接子或經由聚乙二醇連接。參見Zhang等人,Bioconjug Chem. 14:86-92,2003(藉由聚(乙二醇)(PEG)間隔子或僅兩個胺基酸連接之類澱粉原纖維結合胜肽對於原纖維顯示高達約100倍之親和力,而將6個胜肽複本置於分支PEG上會使得親和力達到高達10 000倍),該案以全文引用的方式併入本文中。胜肽可在生物素化後經由偶合於抗生蛋白鏈菌素容易地進行多聚化。參見例如Guillaume等人, J. Biol. Chem., 278:4500-4509, 2003(胜肽多聚物可藉由經由抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物鍵聯來製備,且可進行四聚物及八聚物之均質製備),該案以全文引用的方式併入本文中。具有受體結合能力之胜肽可移植於抗體或免疫球蛋白骨架之不同CDR區域中。參見Frederickson等人,Proc Natl Acad Sci U S A. 103:14307-12, 2006,其描述含有兩個移植mpl受體結合胜肽的抗體及片段以估計等效於天然配位體之方式刺激mpl受體(該案以全文引用的方式併入本文中)。胜肽可以串聯或分支方式利用或不利用連接子連接於抗體Fc域。參見2000年5月4日公開之國際公開案第WO 00/24782號,該案以全文引用的方式併入本文中。胜肽及其他蛋白質可呈現於來源於多酶複合物之大分子骨架上。參見Domingo等人,J Mol Biol. 305:259-67,2001,該案以全文引用的方式併入本文中。關於適於呈現胜肽之蛋白質骨架的評述,請參見Hosse等人,Protein Science 15: 14-27,2006(評述諸如纖維結合蛋白III型域、脂質運載蛋白、扭結素(knottin)、細胞色素b562、孔尼茲(kunitz)型蛋白酶抑制劑、Z域及碳水化合物結合模組CBM4-2之骨架),該案以全文引用的方式併入本文中。
在一些例示性實施例中,藉由均二聚化包含環狀RAP胜肽及抗體Fc區之多胜肽來製備二價寡聚組合。藉由以環狀RAP胜肽置換四聚免疫球蛋白(含有兩個重鏈及兩個輕鏈)中之抗體可變區來製備四價寡聚組合。在其他例示性實施例中,藉由使環狀RAP胜肽與PEG分子共軛來製備二價、三價、四價或其他寡聚組合。一般技術者可設想其他寡聚組合。
樹枝狀聚合物亦適於使RAP胜肽多聚化。樹枝狀聚合物為高度分支、通常呈球形之大分子聚合物。藉由自具有多個反應性基團之核心分子開始按順序反覆反應來製備樹枝狀聚合物之三維寡聚結構。當使亦具有多個反應性基團之單體單元與核心反應時,構成樹枝狀聚合物之外部邊界的反應性基團之數目增加。可將連續數層單體分子添加至樹枝狀聚合物之表面,表面上分支及反應性基團之數目每添加一層則幾何式地增加。樹枝狀聚合物中單體分子層之數目可稱為樹枝狀聚合物之「代」。樹枝狀聚合物外表面上之反應性官能基的總數視核心所具有之反應性基團數目、用於生長樹枝狀聚合物之單體所具有之反應性基團數目及樹枝狀聚合物之代數而定。參見美國專利6,852,842。
此項技術中已描述多種類型之樹枝狀聚合物,諸如離胺酸樹枝狀聚合物,包括(但不限於)第1、第2、第3、第4、第5或第6代離胺酸樹枝狀聚合物,諸如K4K2K離胺酸樹枝狀聚合物及KG6離胺酸樹枝狀聚合物(Okuda等人,J Controlled Release 116,330-336,2006)。其他樹枝狀聚合物包括PAMAM樹枝狀聚合物、POPAM樹枝狀聚合物、三嗪樹枝狀聚合物及二胺基丁烷(DAB)樹枝狀聚合物。參見例如Grayson及Frechet,Chem Rev. 2001,101,3819;Mintzer等人,New J Chem. 2009;33:1918-1925;美國專利6,852,842;美國公開案第20090287005號、第20090240028號及第20090182151號。
「RAP共軛物」或「RAP胜肽共軛物」各指包含RAP胜肽連接於活性劑(諸如岩藻糖苷水解酶抑制劑)之化合物。如本文中所使用,術語「共軛」意謂抑制劑及RAP胜肽藉由例如共價化學鍵、物理力(諸如凡得瓦爾力)或疏水性相互作用、囊封、包埋或其組合而實體連接。在較佳實施例中,抑制劑及RAP胜肽藉由共價化學鍵實體連接。在多個治療劑之情況下,可使用各種共軛之組合。一些藥劑含有將用於共軛於RAP胜肽之官能基,諸如醇、酸、羰基、硫醇基或胺基。
在一些實施例中,可為直接(無插入原子)或間接(經由連接子,例如共價連接之原子鏈)之共價化學鍵聯接RAP胜肽及抑制劑。在較佳實施例中,共軛物之RAP胜肽及抑制劑部分藉由RAP胜肽之原子與抑制劑之原子之間的共價鍵直接連接。在一些較佳實施例中,受體結合部分藉由包含共價鍵或能夠使RAP胜肽連接於抑制劑之幾乎任何胺基酸序列之胜肽或任何分子或原子的連接子連接於本發明之化合物的抑制劑部分。
在一些實施例中,連接子包含長度為1至約60個或1至30個原子或更長、2至5個原子、2至10個原子、5至10個原子、或10至20個原子之原子鏈。在一些實施例中,鏈原子全部為碳原子。在一些實施例中,鏈原子係選自由C、O、N及S組成之群。鏈原子及連接子可根據其預期溶解性(親水性)進行選擇以提供溶解性更高之共軛物。在一些實施例中,連接子提供在溶酶體中易受酶攻擊的官能基。在一些實施例中,連接子提供易受目標組織或器官中所存在之酶攻擊且在攻擊或水解後切斷抑制劑與RAP胜肽之間的鍵聯之官能基。在一些實施例中,連接子提供在目標部位所存在之條件(例如溶酶體之低pH值)下易發生水解之官能基。連接子可含有一或多個此類官能基。在一些實施例中,連接子之長度足夠長以降低一個或兩個RAP胜肽結合位點與活性劑活性結合位點之間的位阻(當活性劑較大時)之可能性。
若連接子為共價鍵或胜肽且活性劑為多胜肽,則整個共軛物可為融合蛋白。該等胜肽基連接子可為任何長度。例示性連接子之長度為約1至50個胺基酸,長度為5至50個或10至30個胺基酸。該等融合蛋白可藉由一般技術者已知之重組遺傳工程改造方法來產生。在一些實施例中,共軛物之RAP胜肽部分經調配以快速降解以便釋放活性化合物。在其他實施例中,連接子在細胞內或更佳溶酶體環境條件下易發生裂解以使活性劑部分自RAP胜肽多胜肽部分釋放或分離。
例示性胜肽連接子包括此項技術中已知之任何樹枝狀聚合物,諸如離胺酸樹枝狀聚合物,包括(但不限於)第1、第2、第3、第4、第5或第6代離胺酸樹枝狀聚合物,諸如K4K2K離胺酸樹枝狀聚合物或KG6離胺酸樹枝狀聚合物(Okuda等人,J Controlled Release 116,330-336,2006)。其他樹枝狀聚合物包括PAMAM(聚(醯胺基胺))樹枝狀聚合物、POPAM(聚胺基伸丙基胺)樹枝狀聚合物、POPAM-PAMAM雜交樹枝狀聚合物、三嗪樹枝狀聚合物。參見例如Grayson及Frechet,Chem Rev. 101: 3819,2001;Mintzer等人,New J Chem. 33:1918-1925,2009;Majoros等人,Macromolecules,41:8372-8379,2008;及美國專利公開案第20090287005號、第20090240028號及第20090182151號。
共軛物可包含一或多個抑制劑連接於同一或多個RAP胜肽。舉例而言,共軛反應可使約1至5個、約1至10個、約5至10個、約10至20個、約20至30個、或30個或30個以上抑制劑分子與RAP胜肽共軛。在某些實施例中,預期RAP共軛物主要(例如超過50%、70%、80%或90%)包含每一RAP胜肽分子對應1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個或12個以上抑制劑分子,例如化學計量比為1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1。岩藻糖苷水解酶抑制劑與RAP胜肽之其他化學計量比包括1:2、1:3、3:2、5:2、7:2、9:2、11:2、4:3、5:3、7:3、8:3、10:3、11:3。在一些實施例中,抑制劑分子與RAP胜肽分子之比率介於1:1與12:1之間或介於1.5:1與10:1之間。此等調配物可以混合物形式使用,或其可純化為特定化學計量調配物。
熟習此項技術者能夠判定何種格式及何種化學計量比較佳。此外,若需要將一種以上類型之藥劑傳遞至目標部位或代謝區,則可將一種以上類型之抑制劑連接於RAP胜肽。複數個抑制劑物質可連接於同一RAP胜肽,例如DFJ-Faz RAP或其他共軛物。因此,共軛物可由多種化學計量比組成且併有一種以上類型之抑制劑。此等物質亦可分離為經純化混合物或其可以聚集體使用。
本文所述之RAP胜肽共軛物可如此項技術中所已知經修飾以增強其穩定性或藥物動力學性質(例如聚乙二醇化或連接其他水溶性聚合物)。例示性水溶性聚合物包括(但不限於)聚(烷二醇),諸如聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(「PPG」)、乙二醇與丙二醇之共聚物及其類似物;單甲氧基-PEG;聚(環氧乙烷)(PEO);葡聚糖;聚-(N-乙烯基吡咯啶酮);脂肪酸;聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物;聚氧乙基化多元醇(例如甘油);HPMA;FLEXIMARTM;及聚乙烯醇;單(C1-C10)烷氧基-PEG;芳氧基-PEG;三氟乙磺酸基單甲氧基PEG;PEG丙醛;雙丁二醯亞胺基碳酸酯PEG;纖維素;其他基於碳水化合物之聚合物;及任何上述物質之組合。
在一些實施例中,水溶性聚合物為線性(例如烷氧基PEG或雙官能PEG)、分支或多臂(例如叉狀PEG或連接於多元醇核心之PEG)、樹枝狀,或具有可降解鍵聯。此外,聚合物分子之內部結構可以許多不同型態組織化且可選自由均聚物、交替共聚物、無規共聚物、嵌段共聚物、交替三聚物、無規三聚物及嵌段三聚物組成之群。
如本文中所使用,術語「聚乙二醇化」係指蛋白質、蛋白質共軛物或多胜肽結合於一或多個PEG部分。如本文中所使用,術語「聚乙二醇化」係指一或多個PEG結合於蛋白質之過程。在一實施例中,該PEG之分子量在3至100 kDa、5至60 kDa、5至40 kDa、5至25 kDa、5至15 kDa或5至10 kDa之範圍內。
適合連接子及其官能基及容易適用於製備其之合成化學方法描述於美國專利公開案第2003253890號中,該案以全文引用的方式併入本文中。
i. 標記
在一些實施例中,基於RAP胜肽之共軛物經標記以促進其偵測。「標記」或「可偵測部分」為可藉由光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其他物理方法偵測之組合物。
如上文所述,視所用篩選檢定而定,可對共軛物之活性劑、連接子或RAP胜肽部分進行標記。所用之特定標記或可偵測基團並非本發明之關鍵態樣,只要其不顯著干擾共軛物之生物活性即可。可偵測基團可為具有可偵測物理或化學性質之任何物質。因此,標記為可藉由光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學方法偵測之任何組合物。
適用於本發明中之標記的實例包括(但不限於)螢光染料(例如異硫氰酸螢光素(fluorescein isothiocyanate)、德克薩斯紅(Texas red)、羅丹明(rhodamine)及其類似物)、放射性標記(例如3H、125I、35S、14C或32P)、電子緻密試劑、酶(例如辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶及常用於ELISA中之其他酶)及比色標記,諸如膠體金或有色玻璃或塑膠珠粒(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)。生物素、地高辛(digoxigenin)或半抗原及其他蛋白質可例如藉由將標記併入半抗原或胜肽中而變得可偵測。
標記可根據此項技術中熟知之方法直接或間接偶合於檢定之所需組分。在一實施例中,使用異氰酸酯試劑使標記共價結合於生物聚合物以共軛本發明之活性劑。在本發明之一態樣中,本發明之雙官能異氰酸酯試劑可用於使標記與生物聚合物共軛以形成未連接活性劑之標記生物聚合物共軛物。標記生物聚合物共軛物可用作合成本發明之經標記共軛物的中間物或可用於偵測生物聚合物共軛物。如上文所指示,可使用多種標記,其中標記之選擇視所需敏感性、與檢定之所需組分共軛之容易性、穩定性要求、可用儀器及處置規定而定。非放射性標記常常藉由間接方法來連接。配位體分子(例如生物素)一般共價結合於分子。配位體結合另一分子(例如抗生蛋白鏈菌素),該分子本身即可偵測或共價結合於信號系統,諸如可偵測酶、螢光化合物或化學發光化合物。
共軛物亦可直接與產生信號之化合物共軛,例如藉由與酶或螢光團共軛。適用作標記之酶包括(但不限於)水解酶,尤其為磷酸酶、酯酶及醣苷酶(glycosidase);或氧化酶,尤其為過氧化酶。適用作標記之螢光化合物(亦即螢光團)包括(但不限於)螢光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹醯基(dansyl)、繖酮(umbelliferone)等。適合螢光團之其他實例包括(但不限於)伊紅(eosin)、TRITC-胺、奎寧(quinine)、螢光素W、吖啶黃(acridine yellow)、麗絲胺羅丹明(lissamine rhodamine)、B磺醯氯紅螢素(B sulfonyl chloride erythroscein)、釕(tris,聯吡錠)、德克薩斯紅、菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸、黃素腺嘌呤二核苷酸等。適用作標記之化學發光化合物包括(但不限於)蟲螢光素(luciferin)及2,3-二氫酞嗪二酮,例如魯米諾(luminol)。關於可用於本發明方法中之各種標記或信號產生系統的評述,請參見美國專利第4,391,904號。
偵測標記之方法為熟習此項技術者所熟知。因此,舉例而言,當標記為放射性標記時,偵測方法包括閃爍計數器或如自動放射攝影術中之感光膠片。當標記為螢光標記時,其可藉由以適當波長之光激發螢光染料及偵測所產生之螢光來偵測。可藉由使用諸如電荷耦合裝置(CCD)或光電倍增器及其類似物之電子偵測器來視覺偵測螢光。類似地,可藉由提供酶之適當受質及偵測所產生之反應產物來偵測酶標記。可藉由觀察與標記關連之顏色來簡單地偵測比色或化學發光標記。適用於本發明之方法中的其他標記及偵測系統對於熟習此項技術者將顯而易知。該等經標記之調節劑及配位體可用於診斷疾病或健康狀況。
LRP1(低密度脂蛋白受體相關蛋白1)為低密度脂蛋白受體「LDLR」家族之成員。LRP1為具有4525個胺基酸之大蛋白質(600 kDa),其由弗林蛋白酶(furin)裂解以產生保持非共價結合之515-(α) kD與85-(β) kDa的兩個次單元。LRP表現於大多數組織類型上,但主要發現於肝臟中。低密度脂蛋白(LDL)受體家族之其他成員包括LDL-R(132 kDa);LRP2(陰離子蛋白(megalin),gp330);LRP/LRP1及LRP1B(600 kDa);VLDL-R(130 kDa);LRP5;LRP6;apoER-2(LRP-8,130 kDa);鑲嵌LDL-R(Mosaic LDL-R)(LR11,250 kDa);及其他成員,諸如LRP3、LRP6及LRP-7。該家族之特徵包括細胞表面表現;細胞外配位體結合域重複(DxSDE);配位體結合需要Ca++;RAP與apoE之結合;EGF前驅物同源域重複(YWTD);單一跨膜區;細胞質域中之內化信號(FDNPXY);及各種配位體之受體介導之內飲作用。該家族之一些成員(包括LRP1)參與信號轉導路徑。在一些實施例中,與LDL-R家族之其他成員相比,本發明之RAP胜肽共軛物優先結合於LRP1,例如對於LRP1之親和力為1.5、2、3、4、5、10倍或10倍以上。
LRP1具有GenBank寄存編號: X13916及SwissProt初級寄存編號: Q07954。LRP1基因/蛋白質之替代名稱包括:低密度脂蛋白受體相關蛋白1[前驅物]、LRP、α-2-巨球蛋白受體、A2MR、脂蛋白元E受體、ApoER、CD91、LRP1或A2MR。表現於肝及血管平滑肌組織上之LRP1可將配位體內飲至此等組織中。
α-L-岩藻糖苷水解酶(Genbank寄存編號NP_000138)(以引用的方式併入本文中)通常參與溶酶體中長糖鏈(寡醣)的裂解。當不存在該酶時,糖鏈積累且最終導致岩藻糖代謝病之臨床特徵。岩藻糖代謝病為由α-L-岩藻糖苷水解酶缺陷及岩藻糖積累於組織中所引起之體染色體隱性溶酶體儲積症。參見例如Johnson等人,Biochem. Biophys. Res.Commun. 133:90-7,1986。不同表型包括以下臨床特徵:諸如神經退化、生長遲滯、內臟肥大及重度早期形式之疾病發作;粗糙臉部特徵、彌漫性體血管角質瘤(angiokeratoma corporis diffusum)、痙攣狀態及較長存活形式之精神運動發育延遲。
岩藻糖代謝病可使用鑑別岩藻糖苷水解酶基因中之突變的遺傳學測試來偵測。岩藻糖苷水解酶亦根據岩藻糖代謝病患者之尿中岩藻糖基化蛋白質之含量增加的存在進行診斷(Michalski等人,Eur J Biochem. 201: 439-58,1991)。
已在肝細胞癌中偵測到α-L-岩藻糖苷水解酶之含量增加且已表明其為HCC之標記(Giardina等人,Cancer 70:1044-48,1992)。
許多岩藻糖苷水解酶抑制劑為干擾碳水化合物鍵之岩藻糖苷水解酶水解之酶活性的小分子。一些岩藻糖苷水解酶抑制劑係基於野尻黴素亞胺基糖之結構(參見美國專利5,100,797),該等糖為由於其結構類似於天然受質之糖部分而抑制糖苷酶的擬糖生物鹼。亞胺基糖與細菌糖苷酶抑制劑類似。為製備亞胺基糖化合物,以含氮環(吡咯啶、哌啶)置換單醣之含氧環,產生亞胺基糖,其充當擬糖物(glycomimetic)。
L-去氧岩藻糖野尻黴素(DFJ)為人類肝α-L-岩藻糖苷水解酶之有效、特異性及競爭性之抑制劑(在10 nM之範圍內)。已顯示去氧岩藻糖野尻黴素之保留哌啶環碳原子2、3及4處羥基之構型的結構類似物保留岩藻糖苷水解酶抑制劑活性。舉例而言,碳原子1(亦即1-α及1-β-高岩藻糖野尻黴素)及碳原子5處呈任一構型之不同取代基可改變效能,但不破壞活性。參見Winchester等人,Biochem. J. 265:277-282,1990。
其他岩藻糖苷水解酶抑制劑為氮雜糖,諸如七員氮雜環庚烷,其為模擬碳水化合物結構之含氮環化合物且為糖基水解酶功能之有效抑制劑[12]。儘管具有艾杜糖醛酸糖之羥基構型及羧基官能基,但此等新穎分子亦以低奈莫耳濃度範圍內之效能抑制岩藻糖苷水解酶[12]。如同大多數亞胺基糖抑制劑,預期胺之烷基修飾並不顯著影響抑制劑效能[13;14],此使得抑制劑可與大生物聚合物(諸如胜肽)容易且穩定地共軛。其他岩藻糖苷水解酶抑制劑為經取代之環戊胺(美國專利5,382,709)。
例示性岩藻糖苷水解酶抑制劑包括(但不限於)野尻黴素亞胺基糖,諸如L-去氧岩藻糖野尻黴素(DFJ)、β-L-高岩藻糖野尻黴素及1-β-C-經取代之去氧甘露糖野尻黴素(β-1-C-甲基去氧甘露糖野尻黴素、β-1-C-乙基去氧甘露糖野尻黴素、β-1-C-苯基去氧甘露糖野尻黴素);及七員氮雜環庚烷,諸如(3R,4R,5S,6S)-1-丁基-4,5,6-三羥基氮雜環庚烷-3-甲酸(「Faz」)。預期用於本發明中之其他岩藻糖苷水解酶抑制劑包括(但不限於)經取代之(1-α,2-β,3-α或β,4-α,5-α或β)-2,3,4-三羥基-5-(羥基甲基)環戊胺及2,6-亞胺基-2,6,7-三去氧-D-甘油-D-葡萄庚糖醇。其他岩藻糖苷水解酶抑制劑揭示於美國專利5,382,709、5,240,707、5,153,325、5,100,797、5,096,909及5,017,704中。
預期在1 pM-100 nM範圍或1-100 nM範圍內保留活性(亦即活體外抑制α-L-岩藻糖苷水解酶之能力)之岩藻糖苷水解酶抑制劑用於如本文所述之共軛物中。
可藉由將共軛物溶解、懸浮或乳化於水性或非水性溶劑(諸如植物油或其他類似油、合成脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸之酯或丙二醇)中及必要時連同習知添加劑(諸如增溶劑、等張劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑及防腐劑)一起而將其調配為注射用製劑。
共軛物可用於待經由吸入投與之氣霧劑調配物中。可將本發明之化合物調配於經加壓之可接受推進劑(諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣及其類似物)中。
用於注射或靜脈內投藥之單位劑型可在呈無菌水、無菌生理食鹽水或另一醫藥學上可接受之無菌載劑中的溶液形式之組合物中包含共軛物。
在實際使用中,根據習知醫藥混配技術,本文所述之RAP胜肽共軛物可作為活性成分與醫藥載劑均勻混合。載劑可視投藥(例如經口或非經腸(包括靜脈內))所需之製劑形式而定採用多種形式。
關於經皮投藥途徑,經皮投與藥物之方法揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,(Gennaro等人編Mack Publishing Co.,1985)中。真皮或皮膚貼片為一種經皮傳遞適用於本發明方法的共軛物之手段。貼片較佳提供吸收增強劑(諸如DMSO)以增加化合物之吸收。其他經皮藥物傳遞方法揭示於美國專利第5,962,012號、第6,261,595號及第6,261,595號中,各專利均以全文引用的方式併入本文中。
醫藥學上可接受之賦形劑(諸如媒劑、佐劑、載劑或稀釋劑)可購得。此外,醫藥學上可接受之輔助物質(諸如pH值調節劑及緩衝劑、張力調節劑、穩定劑、濕潤劑及其類似物)亦可購得。
熟習此項技術者將易於瞭解,劑量可隨特定化合物、症狀嚴重程度及個體發生副作用之容易性而變化。指定化合物之較佳劑量易於由熟習此項技術者藉由多種方法來確定,該等方法包括(但不限於)在患者、測試動物及在活體外進行劑量反應及藥物動力學評估。
在此等態樣之每一者中,組合物包括(但不限於)適於經口、經直腸、局部、非經腸(包括皮下、肌肉內及靜脈內)、經肺(經鼻或經頰吸入)或經鼻投藥之組合物,但在任何指定情況下,最適合之途徑將部分視所治療病狀之性質及嚴重程度及活性成分之性質而定。例示性投藥途徑為經口及靜脈內途徑。組合物宜以單位劑型提供且可以藥劑學技術中熟知之任何方法製備。
本發明之組合物可以囊封於或附著於病毒被膜或微脂粒或併入細胞中之形式投與。微脂粒為微胞(micellular)顆粒,其通常呈球形且常常為脂類。脂質體為由雙層膜形成之微脂粒。適合微脂粒包括(但不限於)單層微脂粒及多層脂質微脂粒或脂質體。該等微脂粒及脂質體可使用標準技術(例如美國專利第4,394,448號中所述之技術),由多種脂質或磷脂化合物(諸如磷脂醯膽鹼、磷脂酸、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯乙醇胺、鞘磷脂、糖脂、神經節苷脂等)製成。該等微脂粒或脂質體可用於將化合物投與至細胞內及將化合物傳遞至目標器官。所關注組合物的控制釋放亦可使用囊封來達成(例如參見美國專利第5,186,941號)。
可使用將RAP胜肽共軛物傳遞至血流中之任何投藥途徑。較佳地,組合物係非經腸投與,最佳為靜脈內投與。在一些實施例中,組合物係經由門靜脈投與。頸靜脈內及頸動脈內注射亦為適用的。組合物可局部或區域性投與,諸如腹膜內或皮下或肌肉內投與。在一態樣中,組合物與適合醫藥稀釋劑或載劑一起投與。
待投與之劑量將視個體需要、所需效果、所用活性劑、生物聚合物及所選投藥途徑而定。共軛物之較佳劑量在約0.2 pmol/kg至約25 nmol/kg之範圍內,且尤其較佳劑量在2-250 pmol/kg之範圍內;或者,共軛物之較佳劑量可在0.02 mg/kg至2000 mg/kg或0.1 mg/kg至100 mg/kg之範圍內。此等劑量將受與RAP共軛物關連之抑制劑部分之數目影響。或者,劑量可基於所投與之抑制劑的莫耳數來計算。
熟習此項技術者可部分基於用於游離形式之共軛活性劑的推薦劑量來確定適於連接至RAP胜肽之化合物的劑量。
本發明之共軛物及調節劑適用於動物(例如哺乳動物,且尤其為人類)之治療性、預防性及診斷性介入。
本發明方法可用於治療多種不同疾病病狀。在某些實施例中,尤其關注本發明方法在以下疾病病狀中之用途:其中認定岩藻糖苷水解酶抑制劑有益,但該抑制劑並未適當地傳遞至目標部位、區域或代謝區以產生完全令人滿意的治療效果。使用共軛抑制劑與RAP胜肽之本發明方法以便增強岩藻糖苷水解酶抑制劑之治療功效及治療指數。
可以本發明共軛物治療之特定疾病病狀有多種。因此,影響肝且可由本發明之方法治療之疾病病狀包括細胞增殖性疾病(諸如贅生性疾病)、自體免疫性疾病、激素異常疾病、退化性疾病、老化疾病及其可能會導致肝腫瘤生長之類似疾病。
治療意欲涵蓋與投與共軛物關連之任何對個體有益之結果,包括患病之可能性降低、預防疾病、減緩、阻止或逆轉疾病之進程或改善與折磨宿主之疾病病狀關連之症狀,其中改善或益處係在廣泛意義上用於指至少降低參數(例如與所治療之病理學病狀關連之症狀,諸如與其關連之發炎及疼痛)之量值。因此,治療亦包括完全抑制(例如防止發生或阻止,例如終止)病理學病狀或至少與其關連之症狀以使得宿主不再罹患該病理學病狀或至少不再罹患作為該病理學病狀特徵之症狀的情況。
大部分肝主要由門靜脈灌注。腫瘤對動脈血之依賴(與首渡捕捉(first-pass capture)之效率相關)將允許在靜脈內投與RAP共軛物後不傷害大部分非癌性肝組織。
除由肝血管結構提供之潛在優點外,LRP1於HCC腫瘤細胞及周圍組織上之相對表現量進一步有利於RAP共軛物之功效。研究已證明,在贅生性轉型後LRP1於肝細胞上之表現增強至少10倍(Laithwaite等人,Toxicon 39,1283-1290,2001)。作為顯著對比,其他研究已顯示LRP1在非癌性但硬變之肝組織中顯著表現不足(Hollestelle等人,Thromb Haemost 91,267-275,2004)。LRP1於腫瘤細胞上之表現增強而在患病肝別處之表現減弱應類似使用首渡捕捉之動脈傳遞,導致RAP共軛物之不均一傳遞,其中對腫瘤組織存在偏好。不均一傳遞以及快速增殖腫瘤細胞對化學治療劑之敏感性普遍增強可解決大多數HCC患者中因肝儲備能力減弱所造成之治療阻礙。
RAP顯示在投藥後快速擴散至肝。在靜脈內快速注射30皮莫耳蛋白質後,在10分鐘內超過70%之外源性RAP積累於肝臟中(Warshawsky等人,J Clin Invest 92:937-944,1993)。所注射之RAP的循環半衰期小於1分鐘。亦在大鼠中在高達2.5 mg/kg(60 nmol/kg)之靜脈內注射中觀察到此等藥物動力學(Warshawsky等人,同上)。關於另一高親和力LRP1配位體,亦即蛋白酶活化之α-2-巨球蛋白(一種725 kD四聚血清醣蛋白),已報導類似藥物動力學(Davidsen等人,Biochim Biophys Acta 846:85-92,1985)。僅少量RAP(小於注射劑量之1%)積累於心臟、腦、肌肉或腎臟中,表明此等組織中結合RAP之LDLR的組織與血管表現對於此應用而言可忽略不計。靜脈內投與之RAP已顯示在齧齒動物及貓類物種中無可量測之毒性。肝對RAP之捕捉效率藉由肝細胞上之豐富細胞表面硫酸肝素蛋白聚糖的初始低親和力結合步驟,及隨後LRP1之高親和力結合及內飲作用來增強(Herz等人,Proc Natl Acad Sci U S A 92:4611-4615,1995;Mahley等人,J Lipid Res 40:1-16,1999)。
雖然許多因素有利於RAP共軛物選擇性靶向肝腫瘤,但亦提出該等藥劑將對轉移之HCC有效。轉移之腫瘤細胞傾向於在遷移至異位部位後保留其特徵,說明LRP1於肝外轉移之人類HCC中之表現未減弱(Gao等人,World J Gastroenterol 10:3107-3111,2004)。此因素可使得轉移之HCC同樣易受靜脈內投與之包含岩藻糖苷水解酶抑制劑的RAP胜肽共軛物影響。
本發明之一態樣涵蓋岩藻糖苷水解酶抑制劑與RAP胜肽之共軛及該等共軛物之投藥。
本發明所涵蓋之肝病或肝病症包括(但不限於)以下所討論之病症。肝細胞癌或肝細胞瘤為世界範圍內第五種最常見癌症且發病率已不斷攀升。腫瘤形成性肝細胞保持高LRP1表現量。肝細胞癌對化學療法反應並不好,因為腫瘤細胞顯示高比率的抗藥性及因為所用化學療法因全身性(靜脈內)投藥而具有嚴重毒性,尤其對心臟及腎臟。
肝炎為肝臟炎症之通用術語。肝炎可為急性或慢性的且包括急性或慢性肝臟衰竭,例如歸因於病毒(例如A、B、C、D或E或非ABCDE型肝炎,CMV,埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr))、真菌、立克次體(rickettsial)或寄生蟲感染、酒精、化學毒素、藥物(例如乙醯胺苯酚(acetaminophen)、乙胺碘呋酮(amiodarone)、異菸肼(isoniazid)、氟烷(halothane)、氯丙嗪(chlorpromazine)、紅黴素(erythromycin))、代謝型肝病(例如威爾森氏症(Wilson's disease)、α1-抗胰蛋白酶缺乏症)、癌症、特發性自體免疫性肝病、肝硬化(例如原發性膽汁性肝硬化)、膽阻塞。A、B及/或C型肝病毒感染肝臟可導致緩慢發展之肝病,從而導致肝臟衰竭。急性肝炎感染最常由A型肝炎引起。B型肝炎與C型肝炎感染皆可在體內持久存留且變成長期感染(慢性)。C型肝炎可能會引起危急病狀,包括肝硬化及癌症。
預期可使用岩藻糖苷水解酶抑制劑與RAP胜肽之共軛物治療的其他肝病症包括與以下關連或由以下引起之腫瘤:肝脂肪組織炎、膽汁鬱滯、肝硬化、中毒性肝損傷(例如歸因於藥物毒性或環境毒性,諸如黃曲酶毒素B1(Aflatoxin B1)關連癌症)及遺傳性血色沉著病。
預期向具有肝腫瘤之個體投與RAP-胜肽-岩藻糖苷水解酶抑制劑共軛物係與第二藥劑組合進行,該藥劑包括(但不限於)化學治療劑、細胞毒性劑、放射性同位素、抗病毒藥、抗真菌藥、消炎藥、抗體及適用於治療肝腫瘤或與肝腫瘤發展關連之其他肝病的其他療法。
與RAP胜肽共軛物組合投與HCC患者以治療肝癌之候選藥物包括(但不限於):5-氟尿嘧啶、阿黴素(阿德力黴素(adriamycin))、絲裂黴素C(mitomycin C)、順鉑(cisplatin)、表柔比星(epirubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、依託泊苷(etoposide)及表1中所示之其他化學治療劑、阿德福韋(adefovir)、拉米夫定(lamivudine)、恩替卡韋(entecavir)、病毒唑(ribavirin)、干擾素α、聚乙二醇化干擾素α-2a、干擾素α-2b及其他抗病毒藥、維生素E、熊去氧膽酸及用於治療肝病症之其他藥劑。其他藥劑展示於表1中。
適用於治療腫瘤之細胞毒性劑包括(但不限於)氮芥鹽酸鹽、環磷醯胺、異環磷醯胺、苯丁酸氮芥、美法侖、白消安、塞替派、卡莫司汀、洛莫司汀、氮烯唑胺及鏈佐星。
適用於治療腫瘤之放射性同位素包括(但不限於)131I、125I、111In、90Y、67Cu、127Lu、212Bi、213Bi、255Fm、149Tb、223Rd、213Pb、212Pb、211At、89Sr、153Sm、166Ho、225Ac、186Re、67Ga、68Ga及99mTc。
預期用於方法中之抗體包括用於治療肝癌及其他肝病症之抗體,包括(但不限於)抗表皮生長因子受體(EGFR)(西妥昔單抗(cituximab)、帕尼單抗(panitumamab))、抗血小板衍生生長因子受體α(PDGFRα)、抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3(anti-glypican 3,GPC3)及適用於治療肝癌或已轉移至肝臟之癌症的其他抗體。
作為另一態樣,本發明包括包含本文所述之一或多種共軛物或組合物以促進其用於實施本發明方法之方式包裝的套組。在一實施例中,該種套組包括本文所述之共軛物或組合物(例如包含單獨RAP胜肽-岩藻糖苷水解酶抑制劑共軛物或RAP胜肽-岩藻糖苷水解酶抑制劑共軛物與第二藥劑之組合的組合物)包裝於諸如密封瓶或密封容器之容器中,其中該容器上貼有或該包裝中包括描述該共軛物或組合物用於實施方法之用途的標籤。較佳地,共軛物或組合物以單位劑型包裝。套組可進一步包括適於根據特定投藥途徑投與組合物之裝置。較佳地,套組含有描述RAP胜肽共軛物組合物之用途的標籤。
本發明之其他態樣及細節將自以下實例顯而易知,該等實例意欲為說明性的而非具限制性。
方法
製造胜肽共軛物:先前已公開產生兩種岩藻糖苷水解酶抑制劑之合成途徑[11;12]。先前已描述RAP胜肽之鑑別及製造[15;16]。為使8個岩藻糖苷水解酶抑制劑分子連接於RAP胜肽分子,以K4K2K離胺酸樹枝狀聚合物修飾該胜肽之N端。共軛物製備之最終步驟為在8個樹枝狀聚合物一級胺與8個含有甲酸酯連接子之岩藻糖苷水解酶抑制劑(N-5-羧基戊基-去氧岩藻糖野尻黴素或N-5-羧基戊基-Faz)分子各自之間形成胜肽鍵。
HepG2細胞中之生物化學功效:最初來源於HCC腫瘤之HepG2細胞產生過度岩藻糖基化醣蛋白且經由LRP1將RAP內飲至溶酶體中。為評估RAP胜肽-抑制劑共軛物在肝細胞中之生物化學功效,使用標準條件培養HepG2細胞且在多孔培養板中與單獨緩衝液、岩藻糖苷水解酶抑制劑、單獨SEQ ID NO: 2或包含SEQ ID NO: 2及岩藻糖苷水解酶抑制劑之共軛物一起培育。在一些孔中添加1 μM全長RAP以阻斷SEQ ID NO: 2或RAP胜肽共軛物之攝取。在培育隔夜後,用冷PBS沖洗細胞且藉由冷凍-解凍溶解於50 mM檸檬酸鈉(pH 4.8)中。藉由離心使細胞溶胞物澄清且根據製造商方案,使用4-甲基香豆素-α-L-岩藻糖檢定(自Sigma-Aldrich獲得,參考PMID 2137330)來檢定岩藻糖苷水解酶活性。亦使用標準程序檢定β-葡糖醛酸酶含量以針對細胞數及溶酶體功能進行校正。
HepG2細胞中之功能性功效研究:以每孔1×105個細胞將HepG2細胞接種於12孔培養板中且允許其恢復24小時。隨後將細胞與岩藻糖苷水解酶抑制劑、RAP胜肽共軛物或單獨RAP胜肽一起培育72小時。隨後藉由MTT增殖檢定評估細胞狀態。
預期抑制HepG2細胞中之岩藻糖苷水解酶活性將引起細胞中之岩藻糖基化蛋白質增加,從而導致細胞死亡或至少使細胞增殖減緩或停止。
正常及HCC細胞株-siRNA中岩藻糖苷水解酶FUCA1消耗之顯著性:將多種初級人類肝細胞(Lonza,Basel,Switzerland)及人類肝細胞癌細胞株(市售,MDS Pharma,Hep3B、HepG2、HLE、HLF、HuCCT1、HUH-6純系5、PLC/PRF/5、SNU-423)塗鋪於適當培養基中且以靶向FUCA1之siRNA池(Invitrogen,Calsbad,CA)轉染。隨後培育細胞72小時且對其進行多重作用機制高含量檢定(MOA-HCA)。藉由評估細胞核中之總DAPI螢光來檢定細胞增殖及使用抗活化卡斯蛋白酶3檢定來檢定細胞凋亡(參見例如「A High-Content Analysis Assay and a Full-Automation Design Soley Using Noncontact Liquid Dispensing,」Rodriguez等人Journal of The Association for Laboratory Automation,2007)。在Biomek FX(Beckman Coulter)上進行所有流體轉移。使用InCell分析儀1000 3.2獲取12位元TIFF影像且用Developer Toolbox 1.6軟體定量。使用非線性回歸,以S形四點、四參數單部位劑量-反應模型計算EC50值。使用基於MathIQ之軟體(AIM)進行曲線擬合及計算。細胞數目值計算為相對細胞計數(測試孔)/相對細胞計數(媒劑孔)×100。相對細胞計數EC50量測為產生一半最大有效反應之測試化合物濃度。使用活化卡斯蛋白酶-3來定量處於早期至晚期階段細胞凋亡之細胞。此檢定之結果為測試孔中之凋亡細胞相較於媒劑孔成倍增加,根據各孔中之相對細胞計數進行校正。引起卡斯蛋白酶-3信號增加5倍之測試物質的濃度指示誘導顯著細胞凋亡。
預期藉由投與FUCA1 siRNA來抑制岩藻糖苷水解酶活性將引起細胞中之岩藻糖基化蛋白質增加,從而導致與岩藻糖苷水解酶抑制劑一起培養之樣品中之細胞死亡及卡斯蛋白酶-3活性增強。
正常及HCC細胞株-DNJ中岩藻糖苷水解酶消耗之顯著性:將多種初級人類肝細胞(市售,Lonza)及人類肝細胞癌細胞株(市售,MDS Pharma,Hep3B、HepG2、HLE、HLF、HuCCT1、HUH-6純系5、PLC/PRF/5、SNU-423)塗鋪於適當培養基中。在10 μM去氧岩藻糖野尻黴素中培育細胞72小時且對其進行如上文所述之多重作用機制高含量檢定(MOA-HCA)。
正位腫瘤異種移植模型中之功能性功效:如先前所述在正位肝內異種移植模型中檢定與岩藻糖苷水解酶抑制劑共軛之RAP胜肽的功效[18;19]。簡言之,用適當麻醉劑(例如氯胺酮(ketamine)、安定(diazepam)或其組合)麻醉6-8週重度組合免疫缺陷(severe combined immunodeficient,SCID)小鼠,且經由腹部中線切開進行上中線剖腹術以暴露小鼠之門靜脈。隨後使用30號針經一分鐘時程將106個HepG2細胞之懸浮液注入門靜脈中。隨後緊密縫合切口且保持動物溫暖直至完全清醒。
為量測RAP胜肽-岩藻糖苷水解酶抑制劑處理之功效,使用適當的經放射性標記之藥劑(諸如2-去氧-2-(F-18)-氟-D-葡萄糖(18F-FDG))進行正電子發射斷層攝影術(PET)[18]以經由非侵入性方法追蹤經處理及對照小鼠中HepG2誘發之腫瘤的進程。岩藻糖苷水解酶抑制劑-RAP胜肽處理之功效亦在活體內藉由對經處理及對照動物中之腫瘤區域進行組織學分析來量測。
亦在正位腫瘤模型中檢定溶酶體儲積症指標(包括溶酶體、尿及血液中之葡糖胺聚糖(GAG)含量)之量測。
預期與未接受岩藻糖苷水解酶抑制劑之個體相比,投與RAP胜肽-岩藻糖苷水解酶抑制劑共軛物將減小腫瘤尺寸或減緩腫瘤生長進程。亦預期投與胜肽-抑制劑共軛物將增加經由胜肽受體吸收抑制劑的細胞溶酶體中岩藻糖基化蛋白質之含量,如藉由GAG檢定所量測。
為了測定岩藻糖苷水解酶抑制劑自身對肝細胞之影響,進行活體外檢定。
將HepG2人類肝細胞癌細胞以每孔4×105個接種於6孔組織培養板中。在24小時時,用新鮮培養基餵養細胞且用30 μM去氧岩藻糖野尻黴素(DNJ)或緩衝液處理72小時,一式兩份。隨後用冷PBS洗滌細胞,刮至微量離心管中,集結成粒並溶解。藉由Bradford檢定測定各樣品之總蛋白質濃度且將溶胞物體積調整至0.3 mg/mL。藉由添加100 μL 0.5 mM 4-MU-岩藻糖哌喃糖苷,隨後在37℃下培育30分鐘來量測20 μL各溶胞物樣品中之岩藻糖苷水解酶活性。用130 μL 600 mM檸檬酸鹽/碳酸鹽緩衝液(pH 9)淬滅反應。在螢光微板讀取器中檢定釋放之4-MU(參見上述實例1)。結果說明於圖4中。取雙份樣品活性值之平均值並製圖。
此等結果顯示在人類肝細胞癌細胞株中岩藻糖苷水解酶抑制劑(未共軛之去氧岩藻糖野尻黴素)抑制溶酶體岩藻糖苷水解酶達>50%,且表明RAP共軛之岩藻糖苷水解酶抑制劑有效治療肝癌。
HCC為待確診之第五種最常見惡性腫瘤,且全世界範圍內每年有將近500,000例死亡。腫瘤組織之外科移除、移植及實體破壞為治療首選,但僅5至10%存在腫瘤之患者適於此等方法(20-22)。此外,由於化學治療劑之毒性與腫瘤細胞抗性,全身化學療法產生15-20%之低反應率(23-24)。
舉例而言,阿黴素為對多種腫瘤具有高效率之癌症化學治療劑,且尤其對快速生長之細胞(包括腫瘤細胞)具有毒性。然而,阿黴素在治療肝細胞癌中之使用受到顯著肝臟及心臟毒性及抑制血液細胞產生所限制(25)。另外,肝細胞癌細胞顯示高比率轉化為抗藥型(26)。
替代治療方法利用輻射。舉例而言,目前所測試之新肝癌治療涉及將已經標記放射性物質(90Y)之微小玻璃珠注射至主肝動脈中,該等玻璃珠自肝動脈進入灌注腫瘤組織之小血管中。隨後輻射破壞腫瘤組織。然而,血液自肝動脈顯著分流至肺會阻礙在許多患者中使用玻璃珠。珠粒顯著回流至供給胃腸道之動脈中亦可能引起嚴重副作用。因此,將療法有效傳遞至腫瘤組織需要一種不要依賴會截留於血管中之大物質且更具定向性之方法。
為了評估活體內RAP胜肽與肝細胞之受體結合,以及評估在分子活體內將細胞毒性化合物傳遞至細胞之能力,使用人類肝細胞癌之正位模型。
為了在動物體內產生正位腫瘤,將人類肝癌細胞株植入裸小鼠、大鼠或其他適當動物體內,且允許腫瘤細胞在活體內生長。適用於正位模型之HCC細胞株包括(但不限於)彼等上述細胞株,諸如Heb3B、HepG2及Huh-7。HCC之正位腫瘤模型為此項技術中所已知且描述於例如Okubo等人(J Gastroenterol Hepatol. 2007 22:423-8);Armengol等人,(Clin Cancer Res. 2004 10:2150-7);及Yao等人,(Clin Cancer Res. 2003 9:2719-26)中。
為首先在活體內確定投與共軛之RAP胜肽及對照組的劑量範圍,使用每組5隻小鼠進行小劑量範圍研究,該等小鼠接受共軛之RAP胜肽(例如RAP胜肽-DMJ(每天至多200 mg/kg)、RAP胜肽-Faz(每天至多200 mg/kg)、單獨RAP胜肽(每天至多200 mg/kg)、單獨DMJ或Faz。每日靜脈內或腹膜內投與測試藥劑,歷時兩週(QD×14),且在研究終點時測試個體動物之體重變化、任何臨床觀測結果及臨床病理學及組織病理學。
為進行功效研究,每組使用8至10隻小鼠,且向接受人類HCC細胞之動物及對照動物投與3個測試劑量範圍之上述化合物。測試藥劑係靜脈內或腹膜內投與且以適當頻率投與,例如每日投與歷時4週(QD×28)、每日投與歷時3週(QD×21)或每日投與歷時2週(QD×14)。隨後使用此項技術中已知之技術評估個體動物之任何體重變化、臨床觀測結果及活體內功效量測(諸如腫瘤體積、肝臟組織病理學及全身臨床病理學)。
共軛之RAP胜肽在活體內使肝細胞癌細胞生長減少的能力說明胜肽結合於腫瘤細胞表面上之細胞受體且為將藥劑傳遞至肝細胞中從而產生生物學上可量測之作用的有效方式。在動物模型中證明有效腫瘤死亡表明共軛之RAP胜肽為將岩藻糖苷水解酶抑制劑傳遞至罹患肝癌或其他肝病狀之人類的腫瘤細胞之有效方法。
用於測試治療劑之生物分佈及功效之肝細胞癌(HCC)之另一相關動物模型為經土撥鼠肝炎病毒(WHV)感染之東方土撥鼠(27)。幾乎所有新生期經病毒感染之土撥鼠均在24個月之中值時間間隔內發展HCC。中值預期壽命為30個月,但經WHV感染之土撥鼠未發展肝硬化,此為大多數HCC患者中存在之病狀。土撥鼠肝炎病毒及人類B型肝炎病毒在結構、遺傳學、傳播方法、感染過程及肝細胞癌發展方面類似。存在凸顯此模型之重要性的顯著相似性。類似於人類,所有在出生後不久暴露於肝炎病毒之土撥鼠中超過一半土撥鼠發展慢性感染且幾乎所有長期感染之土撥鼠在暴露後約20至28個月均發展肝細胞癌。其餘經接種之新生土撥鼠常常發展急性肝炎,但將會產生針對病毒之抗體並恢復。17%至25%之此等「恢復」動物在暴露後29至56個月發展HCC。亦在人類中見到自肝炎感染明顯恢復後發展HCC。
為測定RAP胜肽-岩藻糖苷水解酶抑制劑共軛物對藥劑傳遞至肝臟及尤其腫瘤細胞之影響,在土撥鼠HCC模型中研究對照及RAP胜肽共軛物治療劑之攝取及毒性。在一實施例中,使用6隻長期感染之土撥鼠及4隻未受感染之土撥鼠,約1.5-2歲。
適用傳遞化合物一般將顯示以下特徵:1)不會不利地影響已受損之肝臟功能;2)肝臟及惡性肝組織的攝取可量測;3)及在攝取後,對腫瘤細胞具有毒性且引起腫瘤消退。
亦在腫瘤模型中檢定溶酶體儲積症指標(包括溶酶體、尿及血液中之寡醣含量)之量測。
預期熟習此項技術者能想到如以上說明性實例中所闡述之本發明的許多修改及變化形式。因此,本發明應僅受諸如隨附申請專利範圍中所出現之限制。
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圖1描繪經連接子修飾之N-羧基戊基-(3R,4R,5S,6S)-1-丁基-4,5,6-三羥基氮雜環庚烷-3-甲酸(Faz)。
圖2說明經連接子修飾之N-5-羧基戊基-去氧岩藻糖野尻黴素(DNJ)。
圖3為包含K4K2K離胺酸樹枝狀聚合物及共軛抑制劑(=「X」)之RAP胜肽共軛物的圖。
圖4顯示在活體外在HepG2肝細胞癌細胞中去氧岩藻糖野尻黴素(DNJ)對岩藻糖苷水解酶活性之作用。使用緩衝液作為對照組。
(無元件符號說明)
Claims (14)
- 一種胜肽共軛物,其包含受體關連蛋白(RAP)胜肽連接於岩藻糖苷水解酶抑制劑,該RAP胜肽包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示之多胜肽,其中該岩藻糖苷水解酶抑制劑抑制細胞中α-L-岩藻糖苷水解酶活性,其中該RAP胜肽結合LRP1,且其中該岩藻糖苷水解酶抑制劑係選自由L-去氧岩藻糖野尻黴素(L-deoxyfuconojirimycin,DFJ)、β-1-C-甲基去氧甘露糖野尻黴素(beta-1-C-methyl deoxymannojirimycin)、β-1-C-乙基去氧甘露糖野尻黴素(beta-1-C-ethyl deoxymannojirimycin)、β-1-C-苯基去氧甘露糖野尻黴素(beta-1-C-phenyl deoxymannojirimycin)、(3R,4R,5S,6S)-1-丁基-4,5,6-三羥基氮雜環庚烷-3-甲酸(Faz)、β-L-高岩藻糖野尻黴素、經取代之(1-α,2-β,3-α或β,4-α,5-α或β)-2,3,4-三羥基-5-(羥基甲基)環戊胺及2,6-亞胺基-2,6,7-三去氧-D-甘油-D-葡萄庚糖醇組成之群。
- 如請求項1之胜肽共軛物,其中該RAP胜肽包含SEQ ID NO:2所示之胺基酸序列。
- 如請求項1或2之胜肽共軛物,其中該岩藻糖苷水解酶抑制劑係經由胜肽連接子共軛。
- 如請求項3之胜肽共軛物,其中該胜肽連接子為離胺酸樹枝狀聚合物或K4K2K離胺酸樹枝狀聚合物。
- 如請求項1或2之胜肽共軛物,其中每一RAP胜肽分子共軛至少4個岩藻糖苷水解酶抑制劑,或其中每一RAP胜肽 分子共軛至少8個岩藻糖苷水解酶抑制劑。
- 一種如請求項1至5中任一項之胜肽共軛物於製備藥物之用途,該藥物係用於治療個體之肝腫瘤。
- 如請求項6之用途,其中該肝腫瘤為肝細胞癌、肝炎病毒感染、肝硬化、中毒性肝損傷及遺傳性血色沉著病之結果。
- 如請求項6或7之用途,其中該治療導致該個體之肝腫瘤尺寸減小,或該個體血液中之α-胎蛋白(alpha-fetoprotein)含量比治療前之含量降低。
- 如請求項6或7之用途,其中該藥物係靜脈內投與。
- 如請求項6或7之用途,其中該藥物係與第二藥劑組合投與。
- 如請求項10之用途,其中該第二藥劑係選自由阿黴素(doxorubicin)及5-氟尿嘧啶組成之群之化學治療劑。
- 如請求項10之用途,其中該第二藥劑為細胞毒性劑或放射性同位素。
- 如請求項10之用途,其中該肝腫瘤與肝炎病毒感染相關連,且該第二藥劑為抗病毒劑。
- 一種醫藥組合物,其含有如請求項1至5中任一項之胜肽共軛物及其醫藥上可接受賦形劑。
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