KR101784539B1

KR101784539B1 - 수용체 결합 단백질(ｒａｐ) 펩타이드-푸코시다제 억제제 접합체를 이용한 간 질환의 치료방법

Info

Publication number: KR101784539B1
Application number: KR1020127022072A
Authority: KR
Inventors: 토드 씨. 잔켈
Original assignee: 랩터 파마슈티컬스 인코포레이티드
Priority date: 2010-01-28
Filing date: 2011-01-28
Publication date: 2017-10-11
Also published as: TW201132343A; JP2016145231A; EP2528613A1; JP6170675B2; CN102905716A; CA2788175A1; JP2013518128A; AU2011210756A1; EP2528613B1; AU2011210756B2; HK1181642A1; US20110189084A1; KR20130025866A; TWI558397B; EP2528613A4; ES2555555T3; WO2011094536A1; CN102905716B

Abstract

본 발명은, 일반적으로, 수용체 결합 단백질(RAP) 분자의 펩타이드가 푸코시다제 억제제에 접합된 것을 이용해서 간세포 암종 등과 같은 간 종양 및 간 질환의 치료를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

수용체 결합 단백질(ＲＡＰ) 펩타이드-푸코시다제 억제제 접합체를 이용한 간 질환의 치료방법{METHOD FOR TREATING LIVER DISORDERS WITH RECEPTOR ASSOCIATED PROTEIN (RAP) PEPTIDE-FUCOSIDASE INHIBITOR CONJUGATES}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 미국 특허 가출원 제61/299,177호(출원일: 2010년 1월 28일)의 우선권의 혜택을 주장하며, 이는 본원에 참조로 포함된다.

발명의 기술분야

본 발명은, 일반적으로, 수용체 결합 단백질(receptor associated protein: RAP) 분자의 펩타이드 및 푸코시다제 억제제를 포함하는 접합체(conjugate)를 이용해서 간세포 암종 등과 같은 간 종양 및 간 질환의 치료를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

단백질 글라이코실화에 있어서의 차이점은 정상 세포와 종양 세포 간에 알려져 있었고, 종양-선택적 항체의 개발의 기초를 이루고 있다는 점이다[1]. 간세포 암종(hepatocellular carcinoma: HCC) 세포는 정상 간세포에 대해서 그들의 당단백질을 상당히 또한 부적절하게 푸코실화하는 것이 관찰된 바 있다[2; 3; 4; 5; 6]. 이들 당단백질의 많은 부분은, 결국 그들이 분해되는 종양 라이소좀에 있게 된다. 하나의 보고는, 라이소좀 알파-L-푸코시다제의 증가된 혈청 수준이 HCC를 예측하며, 이는 생합성 경로에서 당단백질 푸코실화의 수준 증가를 수용하기 위하여 암발병 전의 간세포에 의해 이 효소의 가능한 상향조절을 나타내는 것임을 시시하고 있었다[7].

예컨대, 유전자에서의 유전적인 변이로 인한 라이소좀 알파-L-푸코시다제(FUCA1)의 불활성화는 푸코사이드축적증이라 불리는 라이소좀 축적병(LSD)을 야기시킨다[8; 9]. 푸코사이드축적증을 보이는 환자들은 이들이 말단 및 코어-푸코실화된 올리고당을 라이소좀 분해시키는 것이 불가능하고 그들의 6년을 경과한 생존이 거의 불가능하기 때문에 미분해 재료의 라이소좀 축적을 나타낸다[10].

미국 특허 제5,240,707호 공보는 면역조절제로서 그리고 전이억제제(antimetastatic agent)로서 유용한 것으로 추측되는 알파-만노사다제 및 푸코시다제 억제제를 개시하고 있다. 기타 공지된 푸코시다제 억제제로는, 10nM의 라이소좀 푸코시다제에 대한 일정한 억제를 지니고 전통적인 노지리마이신 이미노 당 구조에 의거해서, L-데옥시푸코노지리마이신(DFJ)을 들 수 있다[11]. 이에 대해서는, 또한, 데옥시푸코노지리마이신(DFJ 또는 DNJ), 예컨대, 베타-L-호모푸코노노지리마이신 및 1-베타-C-치환된 데옥시만노지리마이신에 의거한 부가적인 억제제를 개시하고 있는 미국 특허 제5,100,797호를 참조할 수 있다. 다른 강력한 푸코시다제 억제제는 7원 아제판 부류("Faz"라고도 불리는 (3R,4R,5S,6S)-1-뷰틸-4,5,6-트라이하이드록시아제판-3-카복실산)의 일원이다. 이두로네이트 당의 하이드록실 입체 형태와 카복실 작용기를 지님에도 불구하고, 이 새로운 분자는 또한 낮은 나노몰 범위에서 역가(potency)를 지니는 푸코시다제를 억제한다[12]. 대부분의 이미노 당 억제제와 마찬가지로, 아민의 알킬 수식(alkyl modification)은 억제제 역가에 상당히 미칠 것으로 예상되지 않아[13; 14], 펩타이드 등과 같은 대형 생체고분자에 억제제의 용이하고도 안정한 접합을 가능하게 한다. 푸코시다제 억제제는 미국 특허 제5,382,709호, 제5,240,707호, 제5,153,325호, 제5,100,797호, 제5,096,909호 및 제5,017,704호에 추가로 기재되어 있다.

본 발명은, 일반적으로, 간세포 암종 등과 같은 간 질환을 치료하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 상정되는 조성물은 푸코시다제 억제제에 접합된(conjugated) 인간 수용체 결합 단백질(RAP)로부터 유래된 펩타이드를 포함한다. RAP 펩타이드는 간 세포 상에 LRP1 수용체를 결합시킴으로써, 간에 대해서 푸코시다제 억제제를 표적화시킨다.

일 양상에 있어서, 본 발명은 푸코시다제 억제제에 연결된(linked) 수용체 결합 단백질(RAP) 펩타이드를 포함하되, 해당 RAP 펩타이드는 서열번호 1의 RAP 폴리펩타이드에 대해서 적어도 80%의 상동성을 지니는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 또 다른 양상에 있어서, 본 발명은 푸코시다제 억제제에 연결된 수용체 결합 단백질(RAP) 펩타이드를 포함하되, 해당 RAP 펩타이드는 서열번호 1의 RAP의 아미노산 210 내지 319에 대해서 적어도 80%의 상동성을 지니는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, RAP 펩타이드는 서열번호 1의 N-말단으로부터 적어도 200개에서 245개까지의 아미노산이 결손되어 있다. 관련된 실시형태에 있어서, RAP 펩타이드는 서열번호 1의 N-말단으로부터 245개의 아미노산이 결손되어 있다.

소정의 실시형태에 있어서, RAP 펩타이드는 서열 번호 1의 C 말단으로부터 적어도 4개에서 11개까지의 아미노산이 추가로 결손되어 있다. 다른 실시형태에 있어서, RAP 펩타이드는 서열 번호 1의 C 말단으로부터 11개의 아미노산이 추가로 결손되어 있다. 추가의 실시형태에 있어서, RAP 펩타이드는 서열번호 1의 성숙 RAP의 아미노산 1 내지 245 및 320 내지 323이 결여되어 있다.

또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명에 의해 상정되는 RAP 펩타이드는 천연 RAP 서열로 구성될 수 있거나 천연 서열에 대한 돌연변이를 포함할 수도 있다. 예시적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 RAP 펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 서열번호 1로부터 유래된 RAP 펩타이드들 중 어느 하나에 대해서 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 지니는 아미노산 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에 있어서, 본 발명의 RAP 펩타이드는 서열번호 1에 기재된 RAP의 아미노산 210 내지 319, 243 내지 313, 246 내지 313, 249 내지 303 또는 251 내지 303에 대해서 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 지니는 아미노산 서열을 포함한다.

부가적인 실시형태에 있어서, RAP 펩타이드는 서열번호 2에 기재된 서열에 대해서 적어도 80%의 상동성을 지니는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 관련된 실시형태에 있어서, RAP 펩타이드는 서열번호 2에 기재된 폴리펩타이드 서열을 포함한다.

일부 실시형태에 있어서, 푸코시다제 억제제는 노지리마이신 이미노 당, 7원 아제판, 치환된 (1-알파,2-베타,3-알파 또는 베타,4-알파,5-알파 또는 베타)-2,3,4-트라이하이드록시-5-(하이드록시메틸)사이클로펜틸아민 및 2,6-이미노-2,6,7-트라이데옥시-D-글라이세로-D-글루코 헵티톨로 이루어진 군으로부터 선택된다.

예시적인 푸코시다제 억제제로는, 노지리마이신 이미노 당, 예컨대, L-데옥시푸코노지리마이신(DFJ 혹은 DNJ), 베타-L-호모푸코노노지리마이신 및 1-베타-C-치환된 데옥시만노지리마이신(베타-1-C-메틸 데옥시만노지리마이신, 베타-1-C-에틸 데옥시만노지리마이신, 베타-1-C-페닐 데옥시만노지리마이신), 및 7원 아제판, 예컨대, (3R,4R,5S,6S)-1-뷰틸-4,5,6-트라이하이드록시아제판-3-카복실산("Faz")을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 이용하기 위하여 상정되는 추가의 푸코시다제 억제제로는, 치환된 (1-알파,2-베타,3-알파 또는 베타,4-알파,5-알파 또는 베타)-2,3,4-트라이하이드록시-5-(하이드록시메틸)사이클로펜틸아민 및 2,6-이미노-2,6,7-트라이데옥시-D-글라이세로-D-글루코 헵티톨을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

추가의 실시형태에 있어서, 푸코시다제 억제제는 L-데옥시푸코노지리마이신(DFJ 혹은 DNJ), 베타-1-C-메틸 데옥시만노지리마이신, 베타-1-C-에틸 데옥시만노지리마이신, 베타-1-C-페닐 데옥시만노지리마이신 및 (3R,4R,5S,6S)-1-뷰틸-4,5,6-트라이하이드록시아제판-3-카복실산(Faz)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

소정의 실시형태에 있어서, 푸코시다제 억제제는 1pM 내지 100nM 범위 또는 1 내지 100nM 범위에서 시험관내에서 알파-L-푸코시다제를 억제한다.

다른 실시형태에 있어서, 푸코시다제 억제제가 펩타이드 링커를 통해서 접합된 것이 상정된다.

일부 실시형태에 있어서, 펩타이드 링커는 펜타펩타이드 링커 또는 덴드리머(dendrimer)이다. 예시적인 덴드리머로는 라이신 덴드리머류, PAMAM 덴드리머류, POPAM 덴드리머류, 트라이아진 덴드리머류 및 다이아미노뷰탄(DAB) 덴드리머류를 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

다른 실시형태에 있어서, 펩타이드 링커는 라이신 덴드리머이다. 라이신 덴드리머는, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 혹은 제6세대 라이신 덴드리머, 예컨대, K4K2K 라이신 덴드리머 및 KG6 라이신 덴드리머를 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 관련된 실시형태에 있어서, 펩타이드 링커는 K4K2K 라이신 덴드리머이다.

소정의 실시형태에 있어서, RAP 펩타이드 분자 하나당 하나 이상의 푸코시다제 억제제가 접합된다. 관련된 실시형태에 있어서, 본 발명은 RAP 펩타이드 접합체가 동일 혹은 다수의 RAP 펩타이드에 연결된 하나 이상의 억제제 제제를 포함하는 것이 상정된다. 일 실시형태에 있어서, RAP 펩타이드는 RAP 펩타이드에 대해서 1 내지 5, 약 1 내지 10, 약 5 내지 10, 약 10 내지 20, 약 20 내지 30, 또는 30개 이상의 억제제 제제 분자를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, RAP 접합체는 RAP 펩타이드 분자 당 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 혹은 그 이상의 억제제 분자를 포함하는 것이 상정된다. 관련된 실시형태에 있어서, 접합체는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1의 억제제 대 RAP 펩타이드 화학량론비를 포함한다. 푸코시다제 억제제 대 RAP 펩타이드의 기타 화학량론비는 1:2, 1:3, 3:2, 5:2, 7:2, 9:2, 11:2, 4:3, 5:3, 7:3, 8:3, 10:3, 11:3이다. 일부 실시형태에 있어서, 억제제 분자 대 RAP 펩타이드 분자의 비는 1:1 내지 12:1, 또는 1.5:1 내지 10:1이다.

다른 실시형태에 있어서, RAP 펩타이드 접합체는 RAP 펩타이드 분자당 적어도 4개의 푸코시다제 억제제를 포함한다. 추가의 실시형태에 있어서, RAP 펩타이드 접합체는 RAP 펩타이드 분자당 적어도 8개의 푸코시다제 억제제를 포함한다.

다른 양상에 있어서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 RAP 펩타이드 접합체를 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체에서 간 종양을 치료하는 방법을 제공한다.

일 실시형태에 있어서, 간 종양은 간세포 암종, 간염 바이러스 감염, 간경화증, 독성 간손상 및 유전성 혈색소증의 결과이다.

관련된 실시형태에 있어서, 간 종양은 간세포 암종의 결과이다.

추가의 실시형태에 있어서, 치료는 대상체에서 간 종양 크기의 감소를 야기시킨다. 다른 실시형태에 있어서, 치료는 치료 전의 수준에 비해서 대상체의 혈중 알파-태아 단백질 수준의 저감을 야기시킨다.

소정의 실시형태에 있어서, 펩타이드 접합체는 정맥내에 투여된다. 관련된 실시형태에 있어서, 펩타이드 접합체는 간동맥을 통해서 투여된다.

또 다른 실시형태에 있어서, 펩타이드 접합체는 제2제제와 병용해서 투여된다. 소정의 실시형태에 있어서, 제2제제는 화학요법제, 세포독성제, 방사성 동위원소, 항바이러스제, 항진균제 및 항염증제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 관련된 실시형태에 있어서, 화학요법제는 독소루비신 및 5-플루오로유라실로 이루어진 군으로부터 선택된다.

추가의 실시형태에 있어서, 제2제제는 세포독성제이다. 일부 실시형태에 있어서, 세포독성제는 메클로레타민 염산염(mechlorethamine hydrochloride), 사이클로포스파마이드, 이포스파마이드, 클로람부실, 멜팔란, 부설판, 티오테파, 카르무스틴, 로무스틴, 다카바진 및 스트렙토조신으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 실시형태에 있어서, 제2제제는 방사성 동위원소이다. 일부 실시형태에 있어서, 방사성 동위원소는 ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹¹¹In, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ¹²⁷Lu, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²⁵⁵Fm, ¹⁴⁹Tb, ²²³Rd,²¹³Pb, ²¹²Pb, ²¹¹At, ⁸⁹Sr, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ²²⁵Ac, ¹⁸⁶Re, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga 및 ^99mTc로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 실시형태에 있어서, 간 종양은 간염 바이러스 감염과 연관되고, 제2제제는 항바이러스제이다.

본 명세서에 기재된 간 장애들의 어느 것의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 명세서에 개시된 상기 접합체들 중 어느 하나의 용도도 상정된다. 또한, 간 질환을 치료하는데 이용하기 위하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 RAP-펩타이드 푸코시다제 접합체를 포함하는 조성물이 상정된다. 전술한 접합체들 중 어느 하나를, 임의선택적으로 사용을 위한 적절한 설명서와 함께, 포함하는 주사기, 예를 들어, 1회용 혹은 미리 충전된 주사기, 멸균 밀봉된 용기, 예컨대, 바이알, 병, 베셀(vessel) 및/또는 키트 혹은 패키지도 상정된다.

본 명세서에 기재된 상기 접합체들 중 어느 것이라도, 부가 요법으로서 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 간 질환을 치료하는데 유용한 제제와 함께 동시에 투여될 수 있다. 전술한 접합체들 중 어느 하나를 기타 간 요법제와 함께 포함하는 조성물도 또한 상정된다.

본 명세서에 기재된 각 특성 혹은 실시형태, 또는 조합은, 본 발명의 양상들 중 어느 하나의 비제한적이면서도 예시적인 예이며, 이는, 그와 같이, 본 명세서에 기재된 임의의 기타 특성 혹은 실시형태, 또는 조합과 조합가능한 것을 의미하는 것이 이해된다. 예를 들어, "일 실시형태", "일부 실시형태", "추가의 실시형태", "특정 예시적인 실시형태" 및/또는 "다른 실시형태" 등과 같은 언어로 특성이 기재된 경우, 이들 유형의 실시형태의 각각은 모든 가능한 배합을 열거하는 일없이도 본 명세서에 기재된 임의의 다른 특성 혹은 특성들의 조합과 조합되도록 의도된 것이다. 이러한 특성들 혹은 특성들의 조합은 본 발명의 양상들의 어느 것에도 적용된다. 범위 내에 들어가는 값의 예가 개시된 경우, 이들 예의 어느 것도 하나의 범위의 가능한 종말점들로서 상정되며, 이러한 종말점 사이의 어느 하나 및 모든 수치가 상정되고, 상부 종말점과 하부 종말점의 어느 하나 및 모든 조합도 고려된다.

도 1은 링커-수식된(linker-modified) N-카복시펜틸-(3R,4R,5S,6S)-1-뷰틸-4,5,6-트라이하이드록시아제판-3-카복실산(Faz)을 도시한 도면;
도 2는 링커-수식된 N-5-카복시펜틸-데옥시푸코노지리마이신(DNJ)을 예시한 도면;
도 3은 K4K2K 라이신 덴드리머 및 접합된 억제제(= "X")를 포함하는 RAP 펩타이드 접합체의 도해;
도 4는 시험관내에서 HepG2 간세포 암종 세포 중에서의 푸코시다제 활성에 대한 데옥시푸코노지리마이신(DNJ)의 효과를 도시한 도면으로, 완충제가 대조군으로서 이용됨.

본 발명은, 푸코시다제 억제제에 연결된, 수용체 결합 단백질(RAP) 혹은 그의 단편 또는 RAP의 변이체 혹은 RAP 단편을 포함하는 접합체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 간 종양, 특히 간세포 암종을 치료하기 위한 이러한 접합체의 용도에 관한 것이다. 해당 접합체의 RAP 부분은 간세포에 대해서 푸코시다제 억제제를 표적화하고, 간세포에 대해서 푸코시다제 억제제의 선택적 수송(selective trafficking)을 허용하여 라이소좀 내로 흡수될 수 있게 한다. 본 발명의 이론에 의해 얽매이는 일없이, 푸코시다제 억제제는, 간세포 내의 라이소좀 축적병의 효과와 마찬가지로, 라이소좀에 구축된 당단백질-유래 올리고당을 유도함으로써, 해당 세포 내에 세포독성 이벤트를 유발시킨다.

정의

달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기법 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자(이하, "당업자"라 약칭함)에 의해 공통적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 지닌다. 이하의 참고문헌은 당업자에게 본 발명에서 이용된 많은 용어의 일반적인 정의를 제공한다[Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger, et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 및 Hale and Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991)].

본 명세서에 인용된 각 공개, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고문헌은 본 발명의 개시내용과 모순되지 않는 정도로 그 전문이 참조로 포함된다.

단, 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 이용되는 바와 같이, 단수 형태의 단어는 본문에서 달리 명확하게 언급하지 않는 한 복수의 의미도 포함한다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 이하의 용어들은 달리 특정되지 않는 한 이들에 속하는 의미를 갖는다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "푸코시다제 억제제"란, 당단백질로부터 푸코스 잔기를 절단시키기 위하여 알파-L-푸코시다제의 활성을 억제하는 제제, 예컨대, 소분자를 의미한다. 예시적인 푸코시다제 억제제로는, 노지리마이신 이미노 당, 예컨대, 데옥시푸코노지리마이신(DFJ 혹은 DNJ)), 데옥시만노지리마이신(DMJ) 및 그의 유도체를 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 구체적인 유도체로는 베타-L-호모푸코노노지리마이신 및 1-베타-C-치환된 데옥시만노지리마이신류(베타-1-C-메틸 데옥시만노지리마이신, 베타-1-C-에틸 데옥시만노지리마이신, 베타-1-C-페닐 데옥시만노지리마이신)를 들 수 있다. 예시적인 푸코시다제 억제제로는 또한 7원 아제판 분자, 예컨대, ((3R,4R,5S,6S)-1-뷰틸-4,5,6-트라이하이드록시아제판-3-카복실산("Faz")을 들 수 있다. 본 발명에서 이용하기 위하여 상정되는 추가의 푸코시다제 억제제로는, 치환된 (1-알파,2-베타,3-알파 또는 베타,4-알파,5-알파 또는 베타)-2,3,4-트라이하이드록시-5-(하이드록시메틸)사이클로펜틸아민 및 2,6-이미노-2,6,7-트라이데옥시-D-글라이세로-D-글루코 헵티톨을 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 미국 특허 제5,382,709호, 제5,240,707호, 제5,153,325호, 제5,100,797호, 제5,096,909호 및 제5,017,704호에 개시된 것들을 들 수 있다. "푸코시다제 억제제"란 용어는 구체적으로 이하의 "알파-L-푸코시다제 및 푸코시다제 억제제"란 표제의 부문 하에 기재된 억제제 및 그의 유도체의 어느 것이라도 포함한다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "간 종양"은 간 내에 혹은 간 상에 발병되거나 혹은 간과 물리적으로 연관된 1차 종양 및/또는 신생물 및/또는 전이물을 모두 포함한다. 또, 체 내의 어느 곳으로도 이동하지만 RAP 펩타이드의 푸코시다제 억제제와의 접합체에 반응성인 채로 있는 간 종양의 전이물을 포함한다. 이러한 종양 및 신생물의 많은 유형이 공지되어 있다. 1차 간 종양은 간세포 암종 및 당업계에 공지된 그 밖의 것들을 포함한다. 이러한 종양은 일반적으로 고형 종양이거나, 또는 간에 편재화된 축적물을 지니는 확산 종양이다. 본 발명에 따른 치료용의 종양 혹은 신생물은 악성 혹은 양성일 수 있고, 또한 화학요법, 방사선 및/또는 기타 치료로 이전에 치료된 것일 수도 있다.

용어 "유효량"은 대상체의 건강 상태, 병상, 및 질병에 바람직한 결과를 생성하거나 또는 진단 목적을 위해 충분한 투약량을 의미한다. 바람직한 결과는 투약량을 받은 수용자에서의 주관적 또는 객관적인 향상을 포함할 수 있다. "치료적 유효량"이란 건강 상에 의도된 유익한 효과를 생성하는데 효과적인 제제의 양을 의미한다. 예를 들어, 유효량은 고형 종양의 성장을 늦추거나 그의 크기를 감소시키는데 효과적인 양을 포함한다. 유효량은 종양 전이물을 감소시킬 수 있다. 유효량은 암 세포의 증식속도를 늦추거나, 암 세포의 증식을 중지시키거나, 암 세포를 사멸시키는데 효과적인 양일 수 있다.

"소형 유기 분자"란 약제학 분야에서 일반적으로 사용되는 유기 분자와 견줄만한 크기의 유기 분자를 의미한다. 이 용어는 유기 생체중합체(예를 들어, 단백질, 핵산 등)는 배제한다. 바람직한 소형 유기 분자는 크기가 약 5,000 Da까지, 약 2,000 Da까지, 또는 약 1,000 Da까지의 범위이다.

진단 또는 치료의 "대상체"는 인간, 또는 포유동물 혹은 영장류를 포함하는 인간 이외의 동물이다.

"치료"란 예방적 치료 또는 처치 치료 또는 진단 치료를 의미한다.

"예방적" 치료는 질병의 징후를 보이지 않거나 발병 중인 병상의 위험을 감소시킬 목적으로 초기 징후만을 보이는 대상체에게 투여되는 치료이다. 본 발명의 접합체 화합물은 병상이 발병할 가망성을 감소시키거나 발병한 경우 병상의 중증도를 최소화시키는 예방적 치료로서 부여될 수 있다.

"처치" 치료는 병상의 징후 또는 증상을 감소 또는 제거하기 위해 그러한 징후 또는 증상을 보이는 대상체에게 투여되는 치료이다. 징후 또는 증상은 생화학적, 세포적, 조직학적, 기능적, 주관적 또는 객관적일 수 있다. 본 발명의 접합체 화합물은 처치 치료 또는 진단으로서 부여될 수 있다.

"진단"이란 병리 상태의 존재 또는 성질을 확인하는 것을 의미한다. 진단 방법은 그의 특이성 및 선택성이 다르다. 특정 진단법은 병태의 명확한 진단을 제공하지 않을 수 있지만, 이 방법이 진단을 돕는 긍적적인 조치를 제공하면 충분하다.

"약제학적 조성물"이란 인간 및 포유동물을 비롯한 대상체 동물에 약제학적 용도에 적합한 조성물을 의미한다. 약제학적 조성물은 활성제에 접합된 RAP 폴리펩타이드의 약리학적 유효량을 포함하고, 또한 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 약제학적 조성물은 활성 성분(들), 및 담체를 구성하는 불활성 성분(들), 및 임의의 둘 이상의 성분들의 조합, 착체화 또는 응집으로부터, 또는 하나 이상의 성분들의 해리로부터, 또는 하나 이상의 성분들의 기타 유형의 반응 또는 상호작용으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 유도되는 임의의 생성물을 포함하는 조성물을 포함한다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 접합체 화합물과 약제학적으로 허용가능한 담체를 혼합하여 제조된 임의의 조성물을 포함한다.

"약제학적으로 허용가능한 담체"란 표준 약제학적 담체, 완충제, 및 부형제, 예컨대, 인산염 완충된 식염 용액, 덱스트로스의 5% 수용액, 및 유화액, 예컨대 유/수 또는 수/유 유화액, 및 각종 유형의 습윤제 및/또는 보조제 중 어느 하나를 의미한다. 적당한 약제학 담체 및 제형은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995)]에 기술되어 있다. 바람직한 약제학적 담체는 활성제의 의도된 투여 방식에 따라 다르다. 전형적인 투여 방식은 장내(예컨대, 경구) 또는 비경구(예컨대, 피하, 근육내, 정맥내 또는 복강내 주사; 또는 국소성, 경피성, 또는 경점막 투여)를 포함한다. "약제학적으로 허용가능한 염"은, 예를 들어, 금속 염(나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등) 및 암모니아 또는 유기 아민의 염을 포함하는 약제학적 용도를 위한 화합물로 조제될 수 있는 염이다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "단위 제형"이란 인간 및 동물 대상체에 단일단위 투약량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말하며, 각 단위는 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 비히클과 결합되어 목적하는 효과를 생성하는데 충분한 양으로 계산된 본 발명의 화합물의 소정량을 포함한다. 본 발명의 신규 단위 제형에 대한 사양은 사용된 특정 접합체 및 실현될 효과, 그리고 숙주에서 각 화합물과 결합된 약역학에 따라 다르다. 예를 들어, 경구 투약을 위한 단위 제형은, 정제, 캡슐 혹은 환제, 또는 이들의 그룹일 수 있다. 비경구 투여를 위한 단위 제형은 바이알 혹은 충전된 주사기, 또는 설정된 ㎎ 투약량을 수용하는 백일 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "조절하다"란 증가 또는 감소에 의해 바뀌는 능력(예컨대, 길항제 또는 작용제로서 작용함)을 의미한다.

본원에 사용된 "증가하는 상대적 전달"이란 RAP 펩타이드와 푸코시다제 억제제를 포함하는 접합체의 의도된 전달 부위(예컨대, 간)에서의 축적은 비접합된 억제제의 축적에 대해서 증가되는 효과를 의미한다.

"치료 지수"란 최소 치료량 이상 및 비허용 독성량 이하의 투여 범위(양 및/또는 타이밍)를 의미한다.

"등가 용량"이란 동일량의 활성제를 포함하는 용량을 의미한다.

"폴리뉴클레오타이드"란 뉴클레오타이드 단위로 이루어진 중합체를 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산("DNA")과 리보핵산("RNA")뿐만 아니라 핵산 유사체 등과 같은 천연(naturally occurring) 핵산을 포함한다. 핵산 유사체는 비천연 염기를 포함하는 것, 천연 포스포다이에스터 결합 이외의 다른 뉴클레오타이드와의 연결에 맞물리거나 또는 포스포다이에스터 결합 이외의 연결을 통해 부착된 염기를 포함하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 따라서, 뉴클레오타이드 유사체는, 예를 들어, 제한없이, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포로트라이에스터, 포스포르아미데이트, 보라노포스페이트, 메틸포스포네이트, 카이럴-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 펩타이드-핵산(PNA) 등을 포함한다. 그러한 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 자동화된 DNA 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. "핵산"이란 용어는 전형적으로 거대한 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. "올리고뉴클레오타이드"란 용어는 전형적으로 짧은 폴리뉴클레오타이드, 일반적으로 약 50개 이하의 뉴클레오타이드를 의미한다. 뉴클레오타이드 서열이 DNA 서열(즉, A, T, G, C)로 표시되는 경우, 이는 또한 RNA 서열(즉, A, U, G, C)을 포함하고, 여기서 "U"는 "T"로 대체된다는 것이 이해될 것이다. 단백질 및 RNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.

"cDNA"란 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 mRNA와 상보적이거나 동일한 DNA를 의미한다.

"상보적"이란 위상기하학적 적합성 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드의 상호작용 표면에 함께 일치되는 것을 의미한다. 첫번째 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 두번째 폴리뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드 결합 파트너의 뉴클레오타이드 서열과 동일한 경우 첫번째 폴리뉴클레오타이드는 두번째 폴리뉴클레오타이드와 상보적이다. 따라서, 서열이 5'-TATAC-3'인 폴리뉴클레오타이드는 서열이 5'-GTATA-3'인 폴리뉴클레오타이드와 상보적이다. 뉴클레오타이드 서열은 완전 상보적(즉, 100% 일치)이거나 부분 상보적일 수 있다.

서던 또는 노던 블롯에서 필터 상에 100개 이상의 상보적 잔기를 갖는 상보적 아미노산의 하이브리드화를 위한 엄격한 하이브리드 조건의 예는 42℃에서 해파린 1㎎을 지니는 50% 포르말린이고, 하이브리드화는 밤새 수행된다. 매우 엄격한 세척 조건의 예는 약 15분 동안 72℃에서 0.15M NaCl이다. 엄격한 세척 조건의 예는 15분 동안 65℃에서 0.2X SSC 세척이다(SSC 완충제의 설명에 관해서는 Sambrook 등 참조).

"재조합 폴리뉴클레오타이드"란 자연적으로 함께 결합하지 않은 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 증폭되거나 조립된 재조합 폴리뉴클레오타이드는 적당한 벡터에 포함될 수 있고, 해당 벡터를 사용하여 적당한 숙주 세포를 형질변환시킬 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포는 "재조합 숙주 세포"라 지칭된다. 상기 유전자는 재조합 숙주 세포 내에 발현되어, 예컨대, "재조합 폴리펩타이드"를 생산한다. 재조합 폴리뉴클레오타이드는 비코딩(non-coding) 기능(예컨대, 프로모터, 복제 기점, 리보솜-결합 부위 등)도 제공할 수 있다.

"발현 제어 서열"이란 이에 작동적으로 연결된 뉴클레오타이드 서열의 발현(전사 및/또는 번역)을 조절하는 폴리뉴클레오타이드 내 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. "작동적으로 연결된"이란 한 부분의 활성(예컨대, 전사를 조절하는 능력)이 다른 나머지 부분 상에서의 작용(예컨대, 서열의 전사)을 초래하는 두 부분 간의 기능적 관계를 의미한다. 발현 제어 서열은, 예를 들어, 제한없이, 프로모터(예컨대, 유도성 또는 구조적), 인핸서, 전사 종결자, 개시 코돈(즉, ATG), 인트론에 대한 접합 신호, 및 종결 코돈의 서열을 포함할 수 있다.

"발현 벡터"란 발현될 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 의미한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포 또는 생체내 발현 시스템에 의해 공급될 수 있다. 발현 벡터는 당업자에게 공지된 모든 것, 예컨대, 재조합 폴리뉴클레오타이드를 편입시키는 코스미드, 플라스미드(예컨대, 리포솜에 함유되거나 노출된 것) 및 바이러스를 포함한다.

"폴리펩타이드"란 아미노산 잔기, 펩타이드 결합을 통해 연결된 관련 천연 구조적 변이체 및 이의 합성 비천연 유사체, 관련 천연 구조적 변이체, 및 이의 합성 비천연 유사체로 이루어진 중합체를 의미한다. 합성 폴리펩타이드는, 예를 들어, 자동화된 폴리펩타이드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. "단백질"이란 용어는 전형적으로 거대 폴리펩타이드를 의미한다. "펩타이드"란 용어는 전형적으로 짧은 폴리펩타이드를 의미한다.

"RAP 펩타이드" 또는 "RAP 폴리펩타이드"란 서열번호 1의 알파-2-마크로글로불린/저밀도 지질단백질 수용체-관련 단백질-결합 단백질 1(RAP)의 단편 혹은 변이체, 또는 그의 다른 천연 다형체 형태, 유니프로트 등록번호(Uniprot accession) P30533, Pfam 등록번호 PF06400 및 PF06401을 의미한다. 폴리펩타이드 변이체는, 다른 아미노산에 대해 하나 이상의 아미노산의 삽입, 치환 혹은 결손을 포함하는 하나 이상의 돌연변이에 기초한 모(parent) 혹은 기준 폴리펩타이드와 비교해서, 그들의 아미노산 서열의 조성에 있어서 상이하다. 치환은 대체 중인 아미노산 및 그것을 대체하는 아미노산의 물리-화학적 또는 작용적 관련성에 기초하여 보존적이거나 비보존적일 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 경우, "RAP 펩타이드"란 용어는, 서열번호 1의 RAP의 단편, 및 간에 대한 상대적인 선택성을 유지하는 이러한 단편의 실질적으로 상동성인 변이체를 의미하는 것으로 이해된다. 바람직한 RAP 펩타이드는 약 200개 미만의 아미노산 길이, 또는 약 175, 150, 125 또는 100개 미만의 아미노산 길이이고, RAP의 적어도 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 아미노산에 대해서 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 혹은 95% 동일하다. 바람직한 RAP 펩타이드는 RAP의 영역 3에 대해서 실질적으로 상동성이다. 이러한 펩타이드는, 예컨대, 10^-5M 혹은 보다 양호한(즉, 10^-6M, 10^-7M, 10^-8M, 10^-9M 이하)의 친화도를 지니는 LRP1에 결합함으로써 간에 대한 상대적인 선택성을 유지한다. "RAP 펩타이드"란 용어는 구체적으로 이하의 "RAP 펩타이드"란 표제 부분 하에 기재된 펩타이드들 중 어느 하나를 포함한다.

2 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 "동일한" 또는 "백분율 동일성"이란 용어는, 이하의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 시각적 검사에 의해 측정된 바와 같이, 최대 대응값과 비교하여 정렬시킬 경우, 동일하거나 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 특정 백분율을 지니는 2 이상의 서열 또는 하위서열(subsequence)을 의미한다.

2개의 핵산 또는 폴리펩타이드의 맥락에서 "실질적으로 상동성인" 또는 "실질적으로 동일한"이란 어구는, 일반적으로 이하의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 시각적 검사에 의해 측정된 바와 같이, 최대 대응값과 비교하여 정렬시킬 경우, 적어도 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 동일성을 지니는 2 이상의 서열 또는 하위서열을 의미한다. 바람직하게는, 실질적인 동일성은 적어도 약 50, 60, 70, 80 또는 90개의 잔기 길이인 서열 영역에 걸쳐서 또는 적어도 약 100개의 잔기 영역에 걸쳐서 또는 적어도 약 150개의 잔기 영역에 걸쳐서 존재한다. 서열은 인용된 기준 생체고분자의 전체 길이에 걸쳐서 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에 있어서, 서열은 두 비교 생체고분자의 전체 길이에 대해서 실질적으로 동일하다.

서열 비교의 경우, 전형적으로 하나의 서열은 테스트 서열과 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 테스트 서열과 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우, 하위서열 좌표(subsequence coordinate)를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 변수를 지정한다. 서열 비교 알고리즘은, 지정된 프로그램 변수에 의거해서, 기준 서열에 대한 테스트 서열(들)에 대한 백분율 서열 동일성을 계산한다.

비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어, 문헌[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 방법에 대한 탐색에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행(미국 위스콘신주 매디슨시 사이언스 드라이브 575에 소재하는 유전학 컴퓨터 그룹의 위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 시각적 검사에 의해 실시될 수 있다. 백분율 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는데 적합한 알고리즘의 또 다른 예는 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]에 기술된 BLAST 알고리즘이다.

"실질적으로 순수한" 또는 "단리된"이란 대상 종이 존재하는 우세한 종(즉, 몰 기준 상으로, 조성물 내에 다른 어떤 개별 고분자 종 보다 더욱 풍부함)이고, 실질적으로 정제된 단편은 대상 종이 존재하는 모든 고분자 종의 약 50% 이상(몰 기준)을 포함하는 조성물을 의미한다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물 내 존재하는 거대분자 종의 약 80% 내지 90% 이상이 해당 정제된 종인 것을 의미한다. 대상 종은, 조성물이 본질적으로 단일 거대분자 종으로 이루어진 경우 필수적인 균일성으로 정제(통상적인 검출 방법으로는 조성물에서 오염 종을 검출할 수 없음)된다. 용매 종, 소분자(< 500 달톤), 안정화제(예컨대, BSA), 및 기본적인 이온 종은 이러한 정의를 위해 거대분자 종을 고려하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 접합체는 실질적으로 순수하거나 단리된다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법에 유용한 접합체는 그의 합성에 사용된 거대분자 출발 재료와 관련하여 실질적으로 순수하거나 단리된다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 RAP펩타이드 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제 혹은 담체와 혼합된 활성제의 실질적으로 정제되거나 단리된 접합체를 포함한다

대상에 적용되는 바와 같이 "천연"이란 대상이 자연계에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, (바이러스를 비롯한) 유기체에 존재하고 자연계에서 공급원으로부터 단리될 수 있으며 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열이 천연이다.

"링커"란 공유결합, 또는 이온성, 반데르발스 또는 수소 결합, 예컨대 5' 말단에서 하나의 상보 서열에 그리고 3' 말단에서 또 다른 상보 서열에 하이브리드화되어 2개의 비상보 서열을 결합하는 핵산 분자를 통해 2개의 다른 분자를 결합하는 분자를 의미한다. 소정의 실시형태에 있어서, 링커는 펩타이드 결합을 통해서 분자에 결합되는 펩타이드 링커인 것이 상정된다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "종양" 또는 "신생물" 또는 "암"은 원발성 종양 및/또는 전이물을 포함한다. 종양으로는, 예를 들어, 난소, 자궁경부, 전립선, 유방, 폐, 결장 혹은 위 암종 및 이들의 간에 대한 전이물을 들 수 있다.

RAP 펩타이드류

RAP 분자는 323 아미노산 펩타이드인 성숙 RAP를 형성하기 위하여 절단되는 35 아미노산 신호 서열을 지니는 357 아미노산 단백질(유니프로트 등록번호 P30533)로서 초기에 생산된다. 성숙 RAP의 323 아미노산 서열은 서열번호 1에 기재되어 있다. 성숙 RAP는 또한 4 아미노산 C-말단 세포질 세망 체류 신호(endoplasmic reticulum retention signal)를 유지한다.

RAP는, LDLR 내에 보체형 반복(complement-type repeat: CR)의 특정 탄뎀 쌍에 대한 낮은 나노분자 친화성을 가진 제1 및 제3 도메인(d1 및 d3) 결합을 지니는 기능적 바이덴테이트(bidentate)이다(Andersen et al., Biochemistry 40, 15408-15417, 2001). 대략 110개의 아미노산으로 구성된 도메인 3(d3)은 서열번호 1의 아미노산 210 내지 319에 대응한다. 단편들의 이용은 면역원성을 최소화하고 생산 효율을 최대화하며 역가를 향상시키는 경향이 있다. 그러나, 단리된 d3는 전체 길이 RAP의 맥락 내의 d3와 마찬가지로 수용체에 대해서 타이트하게 결합하지 않는다. d3의 N-말단 영역과 d2의 C-말단 영역 내에서 발견되는 추가의 서열은 안정한 접힘 및 고친화성 수용체 결합을 확실하게 할 필요가 있다(Lazic et al., Biochemistry 42, 14913-14920, 2003). RAP d3과 LDLR CR34 간의 착체로부터 유래된 구조 데이터(Fisher et al., Mol Cell 22, 277-283, 2006)는 RAP d3의 수용체-결합 서열이 가요성 루프에 의해 접합된 대략 동일한 길이의 두 역평행 알파-나선 내에서 발견되는 것을 나타내고 있다.

비천연 이황화 결합을 포함하는 고리화된 RAP는 공학적으로 조작되어, RAP d3의 수용체 결합 유닛을 구성하는 두 역평행 나선의 말단들을 접속한 것이다[공동소유된 국제 특허출원 제PCT/US2008/057863호(WO 2008/116171) 및 제PCT/US2007/78792호(WO 2008/036682) 참조, 이들의 개시내용은 그들의 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨]. 일부 실시형태에 있어서, 고리화된 펩타이드는 대략 75개의 아미노산 길이이지만, 비고리화된 펩타이드와 비교해서 향상된 결합 친화성을 지니면서 110-아미노산 RAP d3에 대해서는 견줄만한 친화성을 지닌다. 하나의 예시적인 펩타이드는 인간 RAP의 아미노산 246 내지 313으로부터 유래되되, 아미노산 치환은 다음과 같다: E246C, L247G, G280A, L311A 및 S312C. 이 펩타이드의 서열은 서열번호 2에 기재되어 있다. 다른 예시적인 펩타이드는, 예컨대, 서열 번호 1의 아미노산 247 내지 311에 대해서 적어도 약 80% 동일하고, 또는 서열 번호 1의 아미노산 251 내지 303에 대해서 적어도 약 80% 동일하고, N- 및 C-말단에서 혹은 그 부분에서(예컨대, 말단들의 약 5개의 아미노산 내에) Cys-Cys 결합에 의해 연결되어 있다.

서열번호 2의 특징은 이 고리식 펩타이드가 대략 3.5nM의 친화성을 지니는 LRP1에 결합된 것을 나타낸다(WO 2008/116171 참조). WO 2008/116171은 LRP1을 결합하는 다른 고리식 RAP 펩타이드를 개시하고 있다. 예를 들어, mRAP-8c 펩타이드(다음과 같은 아미노산 치환: E246C, L247G 및 L311G 및 S312C를 지니는 RAP의 아미노산 246 내지 312)(서열번호 3)는 대략 4 내지 6nM 친화성을 지니는 LRP1(클러스터 II) 수용체에 결합되었다. mRAPc 펩타이드(이하의 수식들: A242G, R314G, E241C 및 I315C를 지니는 RAP d3)(서열번호 4)는 대략 10nM의 친화성을 지니는 LRP1을 결합하는 한편, mRAP14c 펩타이드(이하의 아미노산 치환: F250C, L308G 및 Q309C를 지니는 RAP 잔기 250 내지 309를 포함함)는 대략 21nM의 LRP1에 대한 친화성을 발휘하였다. 이들 RAP 펩타이드의 어느 것도 본 발명에서 이용하기 위하여 상정된다.

이러한 펩타이드의 접합은 또한 WO 2008/116171에 개시되어 있다. 이러한 접합체는 펜타펩타이드 링커, GGSGG(서열번호 5)를 포함할 수 있다. 예시적인 실시형태에 있어서, 접합체는 펜타펩타이드 링커의 RAP 펩타이드 자체의 N-말단 글라이신에 한 부분의 접합에 의해 생성된다. 대안적으로, 하나 이상의 라이신은 펩타이드 혹은 링커의 N-말단에 부가될 수 있고, 화학적(예컨대, 치료적) 부분이 이들 라이신에 접합된다. 예를 들어, 하나의 펩타이드 접합체는 각각 2개의 화학적 부분에 접합된 2개의 라이신(K₂, K₃)에 추가로 접속된 라이신(K₁)의 추가에 의해 수식된 N-말단 라이신을 포함한다. 제1라이신(K₁)은 또한 2개의 화학적 부분을 포함하는 오르니틴 잔기에 접속되고, 2개의 화학적 부분에 접합된 최종 라이신 잔기(K₄)에 추가로 접속된다.

이들 펩타이드는 푸코시다제 억제제 DFJ 및 Faz를 비롯한, 다수의 푸코시다제 억제제에 용이하게 접합될 수 있다. 펩타이드에 다수의 억제제 분자의 접합은, 효소용의 DFJ 및 Faz의 이미 높은 친화성에 결합 활성 효과(avidity effect)를 부가함으로써, 다수의 활성 부위를 지니는 호모테트라머인 라이솜 푸코시다제의 매우 강력한 억제를 초래할 것임에 틀림없다[17]. 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30개 혹은 그 이상의 억제제 분자가 단량체 펩타이드 혹은 다량체 펩타이드(multimerized peptide)의 한 분자에 접합되는 것이 상정된다. 일부 실시형태에 있어서, 억제제 분자 대 RAP 펩타이드 분자의 비는 1:1 내지 12:1, 또는 1.5:1 내지 10:1이다.

RAP 펩타이드 접합체들은 간세포 라이소좀에 대해서 신속하게 흡수 및 수송될 것으로 예상되며, 이들은 해당 접합체의 추가의 라이솜 분해와 함께 혹은 해당 분해 없이 전체적으로 활성으로 될 필요가 있다. 이론에 의해 얽매이지 않고, 이 메카니즘을 통해서 LSD-유사 푸코사이드축적증이 간세포에서 유발되어, 이들 세포 내의 당단백질의 과푸코실화의 결과로서, 종양 간세포 내에서 LSD 효과의 유의한 증강이 예상된다. 이 접근법은 간이 아닌 기타 조직을 보존하고 또한 정상 간 조직을 보존하면서 간세포 암종을 치료하는 새로운 수단을 나타낸다.

본 발명에 따라 이용하기 위한 RAP 펩타이드는 미국 특허 제5,474,766호 및 국제 특허 출원 제PCT/US2006/36453호에 개시된 이들 RAP 단편 및 변이체 폴리펩타이드를 포함하며, 이들 문헌의 각각은 본 발명의 화합물 및 조성물에 이용하기 위하여 이러한 펩타이드 및 그들의 생산을 개시할 목적으로 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. RAP 펩타이드는 당업자에게 공지된 임의의 단백질 제조 및 정제 방법을 이용해서 생산된다.

일 실시형태에 있어서, 본 발명에서 유용한 RAP 펩타이드(고리식 RAP 펩타이드를 포함함)의 아미노산 서열은 성숙 RAP의 N-말단으로부터 적어도 200 내지 248개까지의 아미노산이 결여되어 있다. 이와 같이 해서, RAP 펩타이드는 성숙 RAP의 아미노산 1-209, 1-220, 1-225, 1-230, 1-235, 1-240, 1-241, 1-242, 1-243, 또는 대안적으로 1-244, 1-245, 1-246, 1-247, 또는 1-248이 결여될 수 있다. 관련된 실시형태에 있어서, RAP 펩타이드 아미노산 서열은 성숙 RAP의 C-말단으로부터 적어도 4 내지 11개까지의 아미노산이 추가로 결여되어 있다. 이와 같이 해서, RAP 펩타이드는 성숙 RAP의 아미노산 314-323 또는 313-323, 또는 대안적으로 304-323, 305-323, 306-323, 307-323, 308-323, 309-323, 310-323, 311-323 또는 312-323이 결여될 수 있다. 관련된 실시형태에 있어서, RAP 펩타이드 아미노산 서열은 (a) 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80개 또는 85개의 아미노산 길이이고, (b) 아미노산 256 내지 270개를 포함하는 성숙 RAP 도메인 3의 연속 부분을 포함한다. RAP 펩타이드(고리식 RAP 펩타이드를 포함함)에 대한 기초를 형성할 수 있는 RAP의 예시적인 부분은 성숙 RAP의 아미노산 210-323, 221-323, 210-319, 221-319, 243-319, 244-319, 245-319, 246-319, 247-319, 248-319, 249-319, 210-313, 221-313, 243-313, 244-313, 245-313, 246-313, 247-313, 248-313, 249-313, 210-303, 221-303, 243-303, 244-303, 245-303, 246-303, 247-303, 248-303, 또는 249-303(서열번호 1)을 포함한다.

상정되는 기타 RAP 펩타이드 실시형태는 폴리펩타이드가 282-289, 201-210, 및 311-319 위치에 대해서 RAP의 천연 아미노산 서열을 포함하는 인간 혹은 포유동물 RAP 폴리펩타이드를 포함한다. LRP 수용체에 결합하는 변이된 및 N-말단 혹은 C-말단 절두된 변이체는 문헌[Melman et al. (J. Biol. Chem. 276(31): 29338-46, 2001), 이 문헌은 참조로 그의 전문이 본 명세서에 포함됨]에 개시되어 있고, 특히 이들 RAP 변이되고 절두된 변이체에 대해서 개시되어 있다. 기타 상정되는 RAP 폴리펩타이드는 아미노산 85-148과 178-248 사이의 RAP의 천연 서열을 포함한다(문헌[Farquhar et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3161-3162 (1994)] 참조).

추가의 실시형태에 있어서, 본 발명은 약 103, 약 99, 약 95, 약 90, 약 85, 약 82, 약 80, 약 78, 약 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57 혹은 56개 혹은 그 이하의 아미노산 길이를 비롯하여, 각종 크기의 RAP 펩타이드 혹은 고리식 RAP 펩타이드를 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 펩타이드가 고리식 RAP 펩타이드이면, 공유 결합은 약 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57 혹은 56개의 아미노산에 의해 분리된 아미노산들 사이에 형성된다. RAP 펩타이드에 대해서 기초를 형성하는 이들 단편은 이들이 실질적으로 이들에 상동성인 조건 하에 추가의 삽입 혹은 치환을 포함할 수 있음이 이해된다.

WO 2008/116171에 기재된 바와 같이, 천연 RAP와 유사한 LRP1에 대한 친화성 및 선택성(예컨대, 천연 RAP에 비해서 약 5배 이하의 차이)을 발휘하는 고리식 RAP 펩타이드가 제조될 수 있다. 또한 천연 RAP에 대해서 향상된 친화성을 발휘하는 고리식 RAP 펩타이드가 제조될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 고리식 RAP 펩타이드는 LRP1(P98157)에 대해서 (천연 RAP에 비해서) 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배, 5배, 7배, 10배 혹은 20배 향상된 친화성을 발휘한다.

본 발명에 의해 상정되는 RAP 펩타이드는 천연 RAP 서열로 구성될 수 있거나, 또는 천연 서열에 대한 돌연변이를 포함할 수 있다. 예시적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 RAP 펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 서열번호 1로부터 유래된 RAP 펩타이드류의 어느 하나에 대해서 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 혹은 99%의 동일성을 지니는 아미노산 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에 있어서, 본 발명의 RAP 펩타이드는 서열번호 1에 기재된 RAP의 아미노산 210-319, 243-313, 246-313, 249-303 혹은 251-303에 대해서 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 혹은 99%의 동일성을 지니는 아미노산 서열을 포함한다.

LRP1에 대한 결합 친화성을 여전히 유지하지만 천연 RAP 서열에 대해서 보존적 치환(예컨대, 5개까지, 10개까지, 15개까지, 20개까지 또는 25개까지)을 함유하는 고리식 RAP 펩타이드가 제조될 수 있다. 예를 들어, 성숙 RAP의 217, 249 혹은 251 위치들 중 임의의 하나에서의 비보존적 돌연변이는 결합 친화성에 영향이 없는 것을 제시하고 있다. 241, 242, 247, 250, 308, 309, 311, 314 위치들 에서의 비보존적 및 보존적 돌연변이도 제조될 수 있다.

선행하는 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, RAP 펩타이드는 펩타이드의 N-말단에 혹은 그 부근에 시스테인 및 펩타이드의 C-말단에 혹은 그 부근에(예를 들어, 말단의 3, 4 혹은 5개의 아미노산 내에) 시스테인을 함유하여, 두 시스테인 간의 이황화 결합 형성을 통해서 펩타이드의 고리화 및 알파-나선의 안정화를 허용할 수 있다. 임의선택적으로, 글라이신 혹은 프롤린은 시스테인들과 알파-나선들 사이에 개재될 수 있다(예컨대, N-말단에 Cys-Gly 및 C-말단에 Gly-Cys). 글라이신류의 도입은 인접하는 비천연 나선간 이황화 결합에 대해서 알파-나선의 파괴를 허용한다.

본 명세서에 기재된 RAP 펩타이드류의 어느 것이라도 본 명세서에 기재된 바와 같은 올리고머 조합으로 다량체화되는 것이 추가로 상정된다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "다량체화된 RAP 펩타이드"란 2개 이상의 RAP 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. "다량체" 및 "올리고머"는 본 명세서에서 호환가능하게 이용된다. 일 실시형태에 있어서, 올리고머 혹은 다량체는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 혹은 적어도 8개의 고리식 RAP 펩타이드를 포함한다. 하나의 예시적인 실시형태에 있어서, 고리식 RAP 펩타이드는 다량체화 및 올리고머화를 용이하게 하기 위하여 바이오틴 분자에 접합된다. 바이오틴-접합된 고리식 펩타이드는 이어서 스트렙타비딘에 결합함으로써 또는 항바이오틴 항체에 결합함으로써 다량체화될 수 있다. 고리식 RAP 펩타이드 올리고머 혹은 다량체화는 또한 당업계에서 충분히 공지되고 이하에 기재된 기타 수법에 의해 제조될 수 있다.

펩타이드들의 다량체 혹은 올리고머를 작제하기 위하여 다수의 수법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 링커에 의해서 혹은 폴리에틸렌 글라이콜을 개재해서 연결될 수 있다. 이에 대해서는, 문헌[Zhang et al., Bioconjug Chem. 14:86-92, 2003(폴리(에틸렌 글라이콜)(PEG) 스페이서 또는 단지 2개의 아미노산에 의해 접속된 아밀로이드 피브릴-결합 펩타이드는 피브릴에 대해서 약 100배 이상의 친화도를 나타내는 한편, 분지된 PEG 상에 펩타이드의 6개의 복제물을 배치함으로써 10,000배 이상의 친화도가 얻어짐)]을 참조할 수 있고, 이 문헌은 참조로 그의 전문이 본 명세서에 포함된다. 펩타이드는 스트렙타비딘에 대한 결합을 통해서 바이오틴화 후에 용이하게 다량체화될 수 있다. 이에 대해서는, 예컨대, 문헌[Guillaume et al., J. Biol. Chem., 278: 4500-4509, 2003](펩타이드 다량체는 아비딘 혹은 아비딘 유도체를 통한 연결에 의해 제조될 수 있고, 4량체 및 8량체의 균질한 제조도 가능함)을 참조할 수 있고, 이 문헌은 참조로 그의 전문이 본 명세서에 포함된다. 수용체-결합 능력을 지니는 펩타이드는 항체 혹은 면역글로불린 골격의 상이한 CDR 영역 내로 이식될 수 있다. 이에 대해서는, 문헌[Frederickson et al., Proc Natl Acad Sci USA. 103:14307-12, 2006]을 참조할 수 있고, 해당 문헌은 천연 리간드에 대해서 등역가성이 되도록 추정되는 방식으로 2개의 이식된 mp1 수용체-결합 펩타이드 자극된 mp1 수용체를 함유하는 항체 및 단편을 기재하고 있다(이 문헌은 참조로 그의 전문이 본 명세서에 포함된다). 펩타이드는, 항체 Fc 도메인에, 링커를 이용해서 혹은 링커 없이, 탄뎀 혹은 분지 방식으로 부착될 수 있다. 이에 대해서는, 국제 특허 공보 제WO 00/24782호(공개일: 2000년 5월 4일)를 참조할 수 있고, 이 문헌은 참조로 그의 전문이 본 명세서에 포함된다. 펩타이드 및 기타 단백질은 다효소 복합체로부터 유래된 거대분자 골격 상에 전개될 수 있다. 이에 대해서는, 문헌[Domingo et al., J Mol Biol. 305:259-67, 2001]을 참조할 수 있고, 이 문헌은 참조로 그의 전문이 본 명세서에 포함된다. 펩타이드를 전개시키는데 적합한 단백질 골격의 검토를 위하여, 문헌[Hosse et al., Protein Science 15:14-27, 2006](섬유결합소 제III형 도메인, 리포칼린, 노틴(knottin), 사이토크롬 b562, 쿠니츠형(kunitz-type) 프로테아제 억제제, Z-도메인 및 탄수화물 결합 분자 CBM4-2 등과 같은 골격을 검토)을 참조할 수 있고, 이 문헌은 참조로 그의 전문이 본 명세서에 포함된다,

일부 예시적인 실시형태에 있어서, 2가의 올리고머 조합은 고리식 RAP 펩타이드와 항체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드의 동종이량체화에 의해 제조된다. 4가의 올리고머 조합은 4량체 면역글로불린(2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 함유함) 내의 항체 가변 영역을 고리식 RAP 펩타이드로 대체함으로써 제조된다. 또 다른 예시적인 실시형태에 있어서, 2가, 3가, 4가 혹은 기타 올리고머 조합은 PEG 분자에 고리식 RAP 펩타이드의 접합에 의해 제조된다. 기타 올리고머 조합은 당업자에 의해 상정될 수 있다.

덴드리머도 RAP 펩타이드들을 다량체화하는데 적합하다. 덴드리머는 고도로 분지된, 종종 구형의 거대분자 중합체이다. 덴드리머의 3차원 올리고머 구조는 다수의 반응기를 지니는 코어 분자로부터 시작하는 반복적 반응 서열에 의해 제조된다. 다수의 반응기를 또한 지니는 단량체 단위가 상기 코어와 반응되는 경우, 덴드리머의 외부 경계를 포함하는 반응기의 수가 증가한다. 단량체 분자의 연속적인 층은, 덴드리머의 표면에 부가될 수 있고, 그 표면 상의 반응기 및 분지의 수는 층이 부가될 때마다 기하학적으로 증가한다. 덴드리머 내의 단량체 분자의 층들의 수는 덴드리머의 "생성"으로서 지칭될 수 있다. 덴드리머의 외표면 상의 반응성 작용기의 총 수는 코어가 가진 반응기의 수, 덴드리머를 성장시키는 데 이용되는 단량체가 가진 반응기의 수, 및 덴드리머의 생성에 좌우된다. 이에 대해서는, 미국 특허 제6,852,842호 참조를 할 수 있다.

제1, 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제6세대 라이신 덴드리머를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 라이신 덴드리머, 예컨대, K4K2K 라이신 덴드리머 및 KG6 라이신 덴드리머 등과 같은 각종 유형의 덴드리머가 당업계에 기술되어 있다(Okuda et al., J Controlled Release 116, 330-336, 2006). 기타 덴드리머로는 PAMAM 덴드리머, POPAM 덴드리머, 트라이아진 덴드리머 및 다이아미노뷰탄(DAB) 덴드리머를 들 수 있다. 이에 대해서는, 예컨대, 문헌[Grayson and Frechet, Chem Rev. 2001, 101, 3819; Mintzer et al., New J Chem. 2009;33:1918-1925; 미국 특허 제6,852,842호; 미국 특허 공개 제20090287005호, 제20090240028호 및 제20090182151호]을 참조할 수 있다.

RAP 접합체

"RAP 접합체" 또는 "RAP 펩타이드 접합체"는 각각 푸코시다제 억제제 등과 같은 활성제에 부착된 RAP 펩타이드를 포함하는 화합물을 지칭한다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "접합된"이란 용어는, 억제제 제제(들) 및 RAP 펩타이드가, 예를 들어, 공유결합, 또는 이온성, 반데르발스 또는 수소 결합 등과 같은 물리력, 캡슐화, 임베딩(embedding) 혹은 이들의 조합에 의해 물리적으로 연결된 것을 의미한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 억제제 제제(들) 및 RAP 펩타이드는 공유 화학 결합에 의해 물리적으로 연결된다. 다수의 치료제의 경우에, 각종 접합의 조합이 이용될 수 있다. 몇몇 제제는 RAP 펩타이드에 접합하는데 이용될 알코올, 산, 카보닐, 티올 혹은 아민기 등과 같은 작용기를 함유한다.

일부 실시형태에 있어서, 직접적(개재 원자 없음) 또는 간접적(링커, 예컨대, 공유 결합 원자의 사슬을 통함)일 수 있는 공유 화학 결합은 RAP 펩타이드 및 억제제 제제와 결합한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 접합체의 RAP 펩타이드 및 억제제 제제 부분은 RAP 펩타이드의 원자와 억제제 제제의 원자 간의 공유 결합에 의해 직접적으로 연결된다. 일부 바람직한 실시형태에 있어서, 수용체 결합 부분은 RAP 펩타이드를 억제제 제제에 접속할 수 있는 사실상 임의의 아미노산 서열 또는 임의의 분자 또는 원자의 공유 결합 또는 펩타이드를 포함하는 링커에 의해 본 발명에 따른 화합물의 억제제 제제 부분과 접촉된다.

일부 실시형태에 있어서, 링커는 1 내지 약 60개, 또는 1 내지 30개 원자 또는 그 이상, 2 내지 5개 원자, 2 내지 10개 원자, 5 내지 10개 원자, 또는 10 내지 20개 원자 길이의 원자들의 사슬을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 사슬 원자는 모두 탄소 원자이다. 일부 실시형태에 있어서, 사슬 원자는 C, O, N, 및 S로 이루어진 군에서 선택된다. 사슬 원자 및 링커는 더욱 가용성인 접합체를 제공하도록 이의 예상된 용해도(친수성)에 따라 선택될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 링커는 라이소좀에서 효소의 공격을 당하는 작용기를 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 링커는 표적 조직 또는 장기에서 발견되는 효소에 의해 공격 당하거나 공격 또는 가수분해 하에 활성제와 RAP, RAP 단편 또는 RAP 변이체 사이에서 링커를 절단하는 작용기를 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 링커는 표적 부위에서 발견되는 조건(예컨대, 라이소좀의 낮은 pH) 하에 가수분해가 실시되는 작용기를 제공한다. 링커는 하나 이상의 그러한 작용기를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 링커의 길이는 RAP 펩타이드 결합 부위와 활성제 활성 결합 부위 중 한쪽 또는 양쪽 모두 간의 입체 장애(활성제가 큰 경우)에 대한 잠재성을 감소시키기에 충분히 길다.

링커는 공유 결합 또는 펩타이드이고 활성제는 폴리펩타이드인 경우, 전체 접합체는 융합 단백질일 수 있다. 그러한 펩티딜 링커는 임의의 길이일 수 있다. 예시적 링커는 약 1 내지 50개의 아미노산 길이, 5 내지 50개, 또는 10 내지 30개의 아미노산 길이이다. 그러한 융합 단백질은 당업계에게 공지된 재조합 유전적 처리 방법에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 접합체의 RAP 펩타이드 부분은 활성 화합물을 방출하기 위하여 신속하게 분해되도록 조제된다. 다른 구체예에서, 링커는 세포내, 또는 더욱 바람직하게는 라이소좀 환경 조건에서 절단되어 RAP 펩타이드 폴리펩타이드 부분으로부터 활성제 부분을 방출하거나 분리시킨다.

예시적인 펩타이드 링커로는 당업계에 공지된 임의의 덴드리머, 예를 들어, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 혹은 제6세대 라이신 덴드리머, 예컨대, K4K2K 라이신 덴드리머 또는 KG6 라이신 덴드리머 등과 같은 라이신 덴드리머를 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다(Okuda et al., J Controlled Release 116, 330-336, 2006). 기타 덴드리머로는 PAMAM(폴리(아미도 아민)) 덴드리머, POPAM(폴리아미노 프로필렌 아민) 덴드리머, POPAM-PAMAM 혼성 덴드리머, 트라이아진 덴드리머를 들 수 있다. 이에 대해서는, 예컨대, 문헌[Grayson and Frechet, Chem Rev. 101: 3819, 2001; Mintzer et al., New J Chem. 33:1918-1925, 2009; Majoros et al., Macromolecules, 41:8372-8379, 2008; 및 미국 특허 공개 공보 제20090287005호, 제20090240028호 및 제20090182151호]를 참조할 수 있다.

접합체는 동일 혹은 다수의 RAP 펩타이드에 연결된 하나 이상의 억제제 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 접합 반응은 RAP 펩타이드(들)에 억제제 제제 약 1 내지 5, 약 1 내지 10, 약 5 내지 10, 약 10 내지 20, 약 20 내지 30, 혹은 30개 이상의 분자를 접합시킬 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, RAP 접합체는 RAP 펩타이드 분자 하나당 주로 (예컨대, 50%, 70%, 80% 혹은 90% 이상) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 혹은 그 이상의 억제제 분자를, 예컨대, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1의 화학량론비로 포함하는 것이 상정된다. 푸코시다제 억제제 대 RAP 펩타이드의 기타 화학량론비는 1:2, 1:3, 3:2, 5:2, 7:2, 9:2, 11:2, 4:3, 5:3, 7:3, 8:3, 10:3, 11:3이다. 일부 실시형태에 있어서, 억제제 분자 대 RAP 펩타이드 분자의 비는 1:1 내지 12:1, 또는 1.5:1 내지 10:1이다. 이들 제형은 혼합물로서 이용될 수 있거나, 또는 특정 화학량론적 제형으로 정제될 수 있다.

당업자라면 어떠한 포맷과 어떠한 화학량론비가 바람직한지 결정하는 것이 가능하다. 또, 하나보다 많은 유형의 억제제 제제가 RAP 펩타이드에 연결될 수 있고, 여기서 하나 보다 많은 제제의 표적 부위 혹은 보체로의 전달이 바람직하다. 복수의 억제제 제제 종이 동일한 RAP 펩타이드, 예컨대, DFJ-Faz RAP 혹은 다른 접합체에 부착될 수 있다. 이와 같이 해서, 접합체는 소정 범위의 화학량론비로 이루어질 수 있고, 하나보다 많은 유형의 억제제 제제를 편입시킬 수 있다. 또한, 이들은 정제된 혼합물로 분리될 수 있거나 혹은 이들은 응집체로 이용될 수도 있다.

본 명세서에 기재된 RAP 펩타이드 접합체는, 그의 안정성 혹은 약역학적 특성(예컨대, 기타 수가용성 고분자를 페길화(PEGylation) 혹은 부착)을 증강시키기 위하여 당업계에 공지된 바와 같이 수식될 수 있다. 예시적인 수가용성 고분자로는, 폴리(알킬렌 글라이콜류), 예컨대, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 폴리(프로필렌 글라이콜)("PPG"), 에틸렌 글라이콜과 프로필렌 글라이콜 등과의 공중합체, 모노메톡시-PEG, 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO), 덱스트란, 폴리-(N-비닐 피롤리돈), 지방산, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올류(예컨대, 글라이세롤), HPMA, FLEXIMAR(상표명), 및 폴리비닐 알코올, 모노-(C1-C10)알콕시-PEG, 아릴옥시-PEG, 트레실 모노메톡시 PEG, PEG 프로피온알데하이드, 비스-숙신아미딜 카보네이트 PEG, 셀룰로스, 기타 탄수화물계 중합체, 및 전술한 것들의 임의의 것의 조합물을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

일부 실시형태에 있어서, 수가용성 고분자는 직쇄형(예컨대, 알콕시 PEG 혹은 이작용성 PEG), 분지쇄형 혹은 다중 분지형(multi-armed)(예컨대, 갈래진(forked) PEG 혹은 폴리올 코어에 부착된 PEG), 수지상(dendritic), 또는 분해가능한 연쇄를 지니는 것이다. 더욱이, 중합체 분자의 내부 구조는 임의의 수의 상이한 패턴으로 조직화될 수 있고, 단독 중합체, 교호 공중합체, 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 교호 삼중합체, 랜덤 삼중합체 및 블록 삼중합체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "페길화"란 용어는 하나 이상의 PEG 부분에 결합된 단백질, 단백질 접합체 혹은 폴리펩타이드를 의미한다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "페길화"란 용어는 단백질에 하나 이상의 PEG를 결합시키는 과정을 의미한다. 일 실시형태에 있어서, 상기 PEG의 분자량의 범위는 3 내지 100 kDa, 5 내지 60 kDa, 5 내지 40 kDa, 5 내지 25 kDa, 5 내지 15 kDa, 혹은 5 내지 10 kDa이다.

적절한 링커 및 그들의 작용기 그리고 그와 같이 제조하기 위하여 용이하게 적응가능한 합성 화학 방법은, 미국 특허 공개 공보 제2003253890호에 기재되어 있으며, 이 문헌은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.

RAP 접합체의 특징

i. 표지

일부 실시형태에 있어서, RAP 펩타이드계 접합체는 그의 검출을 용이하게 하기 위하여 표지된다. "표지" 또는 "검출가능한 부분"은 분광적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적, 또는 다른 물리적 수단에 의해 검출가능한 조성물이다.

상기 언급된 바와 같이, 사용된 스크리닝 검정에 따라서, 접합체의 활성제, 링커 또는 RAP 펩타이드 부분이 표지될 수 있다. 접합체의 생물학적 활성이 유의적으로 방해되지 않는 한, 사용된 특정 표지 또는 검출가능한 기는 본 발명의 중요한 측면이 아니다. 검출가능한 기는 검출가능한 물리적 또는 화학적 성질을 갖는 임의의 재료일 수 있다. 따라서, 표지는 분광적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물이다.

본 발명에 사용하기에 적당한 표지의 예로는, 형광 염료(예컨대, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 텍사스 레드, 로다민 등), 식별용 방사성 동위원소(예컨대, ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C 또는 ³²P), 전자 치밀 시약(electron dense reagent), 효소(예컨대, 호스 라디쉬퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제 및 ELISA에 흔히 사용되는 기타 물질), 및 색체계적 표지, 예컨대, 콜로이드 골드 또는 착색 유리 또는 플라스틱 비드(예컨대, 폴리스타이렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등)를 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 바이오틴, 디곡시게닌 혹은 헵텐류 혹은 기타 단백질은, 예컨대, 합텐 혹은 펩타이드에 표지를 내포시킴으로써 검출가능하게 만들 수 있다.

표지는 당업계에 충분히 공지된 방법에 따른 검정법의 목적으로 하는 성분과 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 일 실시형태에서의 표지는 본 발명에 따른 활성제를 접합시키기 위한 아이소사이아네이트 시약을 사용하여 생체고분자에 공유결합된다. 본 발명의 일 양상에서, 본 발명의 이작용성 아이소사이아네이트 시약을 사용하여 생체고분자에 표지를 접합시켜 이에 부착된 활성제 없이 표지 생체고분자 접합체를 형성할 수 있다. 표지 생체고분자 접합체는 본 발명에 따른 표지된 접합체의 합성을 위한 중간체로 사용될 수 있거나 생체고분자 접합체를 검출하는데 사용될 수 있다. 상기 제시된 바와 같이, 광범위한 각종 표지는 필요한 감광성, 검정의 목적으로 하는 성분과의 접합의 용이성, 안정성 필요성, 이용가능한 기구, 및 처분 설비에 따른 표지의 선택과 함께 사용될 수 있다. 비방사성 표지는 종종 간접적 수단에 의해 부착된다. 일반적으로, 리간드 분자(예컨대, 바이오틴)는 분자에 공유결합된다. 리간드는 또 다른 분자(예컨대, 스트렙타비딘 분자)에 결합하고, 이는 신호계, 예컨대, 검출가능한 효소, 형광 화합물 또는 화학발광 화합물에 고유하게 검출가능하게 되거나 공유결합된다.

접합체는 또한, 예컨대, 효소 또는 형광물질과의 접합에 의해, 신호 생성 화합물에 직접적으로 접합될 수 있다. 표지로서 사용하기에 적합한 효소로는, 가수분해효소, 특히 포스파타제, 에스테라제 및 글라이코시다제, 또는 옥시다제, 특히 퍼옥시다제를 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 표지로 사용하기에 적합한 형광 화합물, 즉, 형광물질로는, 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론 등을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 적절한 형광물질의 추가예로는, 에오신, TRITC-아민, 퀴닌, 플루오레세인 W, 아크리딘 옐로우, 리사민 로다민, B 설포닐 클로라이드 에리스로세인, 루테늄(트리스, 바이피리디늄), 텍사스 레드, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드, 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드 등을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 표지로 사용하기에 적합한 화학발광 화합물로는, 루시페린 및 2,3-다이하이드로프탈라진다이온류, 예컨대 루미놀을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 각종 표지 또는 신호 생성 시스템의 검토에 대해서는, 미국 특허 제4,391,904호를 참조할 수 있다.

표지를 검출하는 수단은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 따라서, 예를 들어, 표지가 방사성 표지일 경우, 검출을 위한 수단은 방사능 사진촬영으로서 섬광 계수기 또는 사진 필름을 포함한다. 표지가 형광 표지인 경우, 광의 적절한 파장으로 형광색소를 여기시키고 얻어진 형광을 검출함으로써 검출될 수 있다. 형광은 전자 검출기, 예컨대, 전하 결합 소자(CCD) 또는 광전자 배증관 등의 사용에 의해 시각적으로 검출될 수 있다. 마찬가지로, 효소 표지는 효소에 대한 적절한 기질을 제공하고 얻어진 반응 생성물을 검출함으로써 검출될 수 있다. 색체계적 또는 화학발광 표지는 표지와 관련된 색을 관찰함으로써 간단하게 검출될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 기타 표지 및 검출 시스템은 당업자라면 쉽게 알 수 있을 것이다. 질병 또는 건강 상태의 진단에 이러한 표지된 조절자 및 리간드를 사용할 수 있다.

RAP 수용체 LRP1

LRP1(저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질 1)은 저밀도 지질단백질 수용체 "LDLR" 패밀리의 구성원이다. LRP1은 4525개의 아미노산(600 kDa)의 대형 단백질로, 이는, 퓨린(furin)에 의해 절단되어, 비공유 결합을 유지하는 515-(알파) kD와 85-(B) kDa의 두 서브유닛을 생성한다. LRP는 대부분의 조직 유형 상에 발현되지만, 간에서 주로 발견된다. 저밀도 지질단백질(LDL) 수용체 패밀리의 기타 구성원은 LDL-R(132 kDa); LRP2(메갈린, gp330); LRP/LRP1 및 LRP1B(600 kDa); VLDL-R(130 kDa); LRP5; LRP6; apoER-2(LRP-8, 130 kDa); 모자이크 LDL-R(LRU, 250 KDa); 및 기타 구성원, 예컨대, LRP3, LRP6 및 LRP-7을 포함한다. 패밀리의 특징적인 특성은 세포 표면 발현; 세포외 리간드 결합 도메인 반복부(DxSDE); 리간드 결합을 위한 Ca++의 필요; RAP와 apoE의 결합; EGF 전구체 상동성 도메인 반복부(YWTD); 단일 막 경간 영역; 세포질 도메인 내 내재화 신호(FDNPXY); 및 다양한 리간드의 수용체 매개 엔도시토시스를 포함한다. LRP1을 포함하는 패밀리의 일부 구성원은 신호 전달 경로에 관여한다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 RAP 펩타이드 접합체는 LDL-R 패밀리의 다른 구성원에 비해서 LRP1에 우선적으로, 예컨대, LRP1에 대해서 1.5, 2, 3, 4, 5, 10배 혹은 그 이상의 친화도로 결합한다.

LRP1은 GenBank 등록번호: X13916 및 SwissProt 초기 등록번호: Q07954를 지닌다. LRP1 유전자/단백질에 대한 대안적인 명칭은 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질 1[전구체], LRP, 알파-2-마크로글루불린 수용체, A2MR, 아포지질단백질 E 수용체, ApoER, CD91, LRP1 혹은 A2MR을 포함한다. 간 및 혈관 평활근 조직 상에 발현되는 LRP1은 이들 조직 내에 리간드를 흡수할 수 있다.

알파-L-푸코시다제 및 푸코시다제 억제제

알파-L-푸코시다제 효소(Genbank 등록번호 NP_000138)(참조로 본 명세서에 포함됨)는 통상 라이소좀 내에 장쇄 당 사슬(올리고당)의 절단에 관여한다. 효소가 없을 경우, 당 사슬은 축적되어, 결과적으로 푸코사이드축적증의 임상 특성으로 초래하게 된다. 푸코사이드축적증은 조직 내의 당 푸코스의 축적과 함께 결함성의 알파-L-푸코시다제에 의해 초래되는 상염색제 열성 라이소좀 축적병이다. 이에 대해서는, 예컨대, 문헌[Johnson et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 133:90-7, 1986]을 참조할 수 있다. 상이한 표현형은 임상적 특성, 예컨대, 중증의 조기 형태의 신경학적 악화, 성장 지연, 내장비대증, 및 발작; 보다 장기 생존 형태의 거친 안면 특성, 미만성구간혈관각화종, 경련 및 정신운동 발달 지연을 포함한다.

푸코사이드축적증은 푸코시다제 유전자에서의 돌연변이를 확인하기 위하여 유전적 검사를 이용해서 검출될 수 있다. 푸코시다제는 푸코사이드축적증 환자의 소변에서의 푸코실화된 단백질의 증가된 수준의 존재에 의해서도 진단된다(Michalski et al., Eur J Biochem. 201: 439-58, 1991).

알파-L-푸코시다제는 간세포 암종의 증가된 수준에서 검출되었고, 또한 HCC용의 표지자인 것을 시사하였다(Giardina et al., Cancer 70:1044-48, 1992).

많은 푸코시다제 억제제는 탄수화물 결합의 푸코시다제 가수분해의 효소 활성을 간섭하는 소분자이다. 몇몇 푸코시다제 억제제는 노지리마이신 이미노 당의 구조에 기초하고 있고(미국 특허 제5,100,797호 참조), 이는 천연 기질의 당 부분에 대한 그들의 구조적 유사성으로 인해 글라이코시다제를 억제하는 당-모방형 알칼로이드류이다. 이미노당은 박테리아 글라이코시다제 억제제와 유사하다. 이미노당 화합물을 제조하기 위하여, 단당류의 산소-함유 고리는 당모방체(glycomimetic)로서 작용하는 이미노당을 초래하는 질소-함유 고리(피롤리딘, 피페리딘)에 의해 대체된다.

L-데옥시푸코노지리마이신(DFJ)은 인간의 간 알파-L-푸코시다제의 강력하고, 특이적이면서 경쟁적인 억제제(10nM의 범위에서)이다. 피페리딘 고리 탄소 원자 2, 3 및 4번에서 하이드록실기의 입체 형태를 유지하는 데옥시푸코노지리마이신의 구조 유사체는 푸코시다제 억제제 활성을 유지하는 것으로 제시되어 있다. 예를 들어, 탄소 원자 1번에서(즉, 1-알파 및 1-베타-호모푸코노지리마이신) 그리고 탄소 원자 5번에서의 입체 형태에서 상이한 치환체는 역가를 변경시킬 수 있지만, 활성을 파괴하지는 못한다. 이에 대해서는, 문헌[Winchester et al., Biochem. J. 265:277-282, 1990]을 참조할 수 있다.

기타 푸코시다제 억제제는, 탄수화물 구조를 모방하고 글라이코실 하이드롤라제 기능의 강력한 억제제인 질소-고리 함유 화합물인 아자당(azasugar), 예컨대, 7원 아제판이다[12]. 이두로네이트 당의 하이드록실 입체 형태와 카복실 작용기를 지님에도 불구하고, 이 새로운 분자는 또한 낮은 나노몰 범위에서 역가를 지니는 푸코시다제를 억제한다[12]. 대부분의 이미노 당 억제제와 마찬가지로, 아민의 알킬 수식은 억제제 역가에 상당히 미칠 것으로 예상되지 않아[13; 14], 펩타이드 등과 같은 대형 생체고분자에 억제제의 용이하고도 안정한 접합을 가능하게 한다. 추가의 푸코시다제 억제제는 치환된 사이클로펜틸아민이다(미국 특허 제5,382,709호).

예시적인 푸코시다제 억제제로는, 노지리마이신 이미노 당, 예컨대 L-데옥시푸코노지리마이신(DFJ), 베타-L-호모푸코노노지리마이신 및 1-베타-C-치환된 데옥시만노지리마이신류(베타-1-C-메틸 데옥시만노지리마이신, 베타-1-C-에틸 데옥시만노지리마이신, 베타-1-C-페닐 데옥시만노지리마이신), 및 7원 아제판, 예컨대, (3R,4R,5S,6S)-1-뷰틸-4,5,6-트라이하이드록시아제판-3-카복실산("Faz")을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 이용하기 위하여 상정되는 추가의 푸코시다제 억제제로는 치환된 (1-알파,2-베타,3-알파 또는 베타,4-알파,5-알파 또는 베타)-2,3,4-트라이하이드록시-5-(하이드록시메틸)사이클로펜틸아민 및 2,6-이미노-2,6,7-트라이데옥시-D-글라이세로-D-글루코 헵티톨을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 추가의 푸코시다제 억제제는 미국 특허 제5,382,709호, 제5,240,707호, 제5,153,325호, 제5,100,797호, 제5,096,909호 및 제5,017,704호에 개시되어 있다.

활성, 즉, 1pM 내지 100 nM 범위 혹은 1 내지 100nM 범위에서 알파-L-푸코시다제를 억제하는 능력을 유지하는 푸코시다제 억제제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 접합체에서 이용하기 위하여 상정된다.

약제학적 조성물들의 이용 방법 및 그들의 투여

접합체는, 수성 혹은 비수성 용매, 예컨대, 식물성 혹은 기타 유사한 오일, 합성 지방산 글라이세라이드류, 고급 지방산의 에스터 혹은 프로필렌 글라이콜 내에; 필요한 경우, 가용화제, 등장성제, 현탁제, 유화제, 안정화제 및 보존제 등과 같은 통상의 첨가제와 함께, 이들을 용해, 현탁 혹은 유화시킴으로써 주입용의 제제로 제형화될 수 있다.

접합체는 흡입을 통하여 투여될 에어로졸 제형으로 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 다이클로로다이플루오로메탄, 프로판, 질소 등과 같은 가압된 허용가능한 추진제 내에 제형화될 수 있다.

주사 혹은 정맥내 투여용의 단위 제형은 멸균수, 멸균 정상 식염수 혹은 기타 멸균성의 약제학적 허용가능한 담체로서 조성물 중에 접합체를 포함할 수 있다.

실제 사용에 있어서, 본 명세서에 기재된 RAP 펩타이드 접합체는 종래의 약제학적 컴파운딩 기술에 따라서 약제학적 담체와 친밀한 혼합물 중에서 활성 성분으로서 배합될 수 있다. 해당 담체는 투여를 위하여 바람직한 제제 형태, 예컨대, 경구 혹은 비경구(정맥내 포함)의 형태에 따라서 광범위한 각종 형태를 취할 수 있다.

경피 투여 경로에 관하여, 약물의 경피 투여 방법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, (Gennaro et al. Eds. Mack Publishing Co., 1985)]에 개시되어 있다. 피부의 혹은 피부 패취는 본 발명의 방법에 유용한 접합체의 경피 전달을 위한 하나의 수단이다. 패취는 바람직하게는 화합물의 흡수를 증가시키기 위하여 DMSO 등과 같은 흡수 증강제를 제공한다. 경피 약물 전달을 위한 기타 방법은 미국 특허 제5,962,012호, 제6,261,595호 및 제6,261,595호에 개시되어 있다. 이들 각 문헌은 참조로 그들의 전문이 본 명세서에 포함된다.

약제학적으로 허용가능한 부형제, 예컨대, 비히클, 보조제, 담체 혹은 희석제는 상업적으로 입수가능하다. 더욱이, 약제학적으로 허용가능한 보조제 물질, 예컨대, pH 조정 및 완충제, 등장성 조정제, 안정화제, 습윤제 등은 상업적으로 입수가능하다.

당업자라면, 용량 수준이 특정 화합물, 증상의 중증도 및 부작용에 대한 대상체의 민감도의 함수로서 다양할 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 주어진 화합물에 대한 바람직한 투약량은, 용량 반응 및 환자에 있어서 행해진 약역학적 평가, 테스트 동물 및 시험관내 등을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 각종 수단에 의해, 당업자에 의해 용이하게 결정가능하다.

이들 양상의 각각에 있어서, 조성물은, 임의의 주어진 경우에 가장 적절한 경로가 치료 중인 병태의 속성과 중증도 및 활성 성분의 속성에 부분적으로 좌우될 것이지만, 경구, 직장, 국소, 비경구(피하, 근육내 및 정맥내를 포함함), 폐(비강 혹은 구강 흡입) 또는 비강 투여를 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 예시적인 투여 경로는 경구 및 정맥내 경로이다. 조성물은 편리하게는 단위 제형으로 제공될 수 있고 약제학의 분야에서 충분히 공지된 방법들의 어느 것에 의해서도 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 바이러스막(viral envelope) 혹은 소포 내에 캡슐화되거나 또는 이들에 부착되어서 투여되거나, 세포 내로 편입될 수 있다. 소포는 통상 구형이고 흔히 지질인 마이셀 입자이다. 리포솜은 2층막으로 형성된 소포이다. 적절한 소포로는, 단일층 소포 및 다중층 지질 소포 또는 리포솜을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이러한 소포 및 리포솜은 광범위한 지질 또는 인지질 화합물, 예컨대, 포스파티딜콜린, 포스파티드산, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고미엘린, 당지질, 강글리오사이드 등으로부터 표준 방법, 예컨대, 미국 특허 제4,394,448호에 기술된 바와 같은 방법으로 제조될 수 있다. 이러한 소포 또는 리포솜은 세포 내에 화합물을 투여하고 표적 장기에 화합물을 전달하는데 사용할 수 있다. 목적으로 하는 조성물의 제어된 방출은 또한 캡슐화를 이용해서 달성될 수 있다(예컨대, 미국 특허 제5,186,941호 참조).

혈류 내로 RAP 펩타이드 접합체를 전달하는 임의의 투여 경로가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 비경구적으로, 가장 바람직하게는 정맥 내로 투여된다. 일부 실시형태에 있어서, 조성물은 간문맥을 통해서 투여된다. 경정맥내 및 경동맥내 주사도 유용하다. 조성물은 국소 또는 국부적으로, 예컨대, 복강내 또는 피하내 또는 근육내로 투여될 수 있다. 일 측면에서, 조성물은 적절한 약제학적 희석제 또는 담체와 함께 투여된다.

투여되는 투약량은 개체의 요구도, 목적으로 하는 효능, 사용되는 활성제, 생체고분자 및 선택된 투여 경로에 따라 좌우될 것이다. 접합체의 바람직한 투약량 범위는 약 0.2 p㏖/㎏ 내지 약 25 n㏖/㎏, 특히 바람직한 투약량 범위는 2 내지 250p㏖/㎏이고; 대안적으로, 접합체의 바람직한 용량은 0.02 내지 2000 mg/kg 범위 또는 0.1 내지 100 mg/kg이다. 이들 투약량은 RAP 접합체와 연관된 억제제 부분의 수에 의해 영향을 받게 될 것이다. 대안적으로, 투약량은 투여되는 억제제 제제의 몰에 의거해서 산출될 수 있다.

당업자라면 접합된 활성제의 유리 형태에 대해서 사용되는 권장 투약량에 부분적으로 기초해서 RAP 펩타이드에 연결된 화합물의 적절한 용량을 결정할 수 있다.

본 발명의 접합체 및 조절자는 동물, 예컨대, 포유동물, 특히 인간에서 치료, 예방 및 진단적 중재를 위해 유용하다.

본 방법은 각종 상이한 질병 병태의 치료에서의 용도를 발견하였다. 소정의 실시형태에 있어서, 특히 관심으로 하는 바는 푸코시다제 억제제의 유익이 확인되었지만, 억제제가 표적 부위, 영역 혹은 구획에 적절하게 전달되어 충분히 만족스러운 치료 결과를 산출하지 못한 질병 병태에서의 본 방법의 용도이다. 억제제 제제를 RAP 펩타이드에 접합시키는 본 방법은 푸코시다제 억제제의 치료 효능 및 치료 지수를 증가시키는데 이용된다.

본 접합체로 치료가능한 특정 질병 병태는 다양하다. 따라서, 간에 병이 걸려 본 발명의 방법에 의해 치료가능한 질병 병태로는 간 종양의 성장을 초래할 수 있는 세포 증식성 질병, 예컨대, 신생물병, 자가면역병, 호르몬 비정상 질병, 퇴행병, 노화 질병 등을 들 수 있다.

치료는, 질병에 걸릴 가능성 감소, 질병의 예방, 질병의 진행을 지연, 중지 또는 역전, 또는 숙주에 영향을 주는 질병 병태와 관련된 징후의 완화를 비롯하여 접합체의 투여와 관련하여 피험체에 유익한 임의의 결과를 포함하는 것을 의미하며, 여기서 완화 또는 유익은 변수, 예를 들어, 치료 중인 병변 상태와 관련된, 징후, 예컨대, 이와 관련된 염증 및 통증 등의 규모를 적어도 감소시키는 것을 지칭하도록 광범위한 의미로 사용된다. 이와 같이, 치료는 또한 병적 상태 또는 적어도 이와 관련된 증상이 완전하게 억제, 예를 들어, 발병을 예방하거나, 또는 중지, 예를 들어 종결시켜서 숙주가 더 이상 병적 상태, 또는 적어도 병적 상태를 특징으로 하는 증상을 앓지 않게 되는 상황을 포함한다.

RAP 펩타이드 접합체의 간으로의 전달

대부분의 간은 간문맥에 의해 주로 관류된다. 초회 통과 포획(first-pass capture)의 효능과 결부시켜, 동맥 혈액에 대한 종양의 의존도는 RAP 접합체의 정맥내 투여 후 비암성(non-cancerous) 간 조직의 상당 부분을 살릴 수 있을 것이다.

간 맥관구조에 의해 갖게 되는 잠재적인 이점 이외에, HCC 종양 세포 및 주변 조직 상의 LRP1의 상대 발현 수준은 RAP 접합체의 효능을 추가로 촉진할 수 있다. 연구들은 신생물 형질전환 후 간세포 상의 LRP1 발현의 적어도 10배의 향상을 입증하였다(Laithwaite et al., Toxicon 39, 1283-1290, 2001). 현저하게 대조적으로, 다른 문헌들은 비암성이지만 간경변인 간 조직에서 상당히 저발현되는 것으로 제시하였다(Hollestelle et al., Thromb Haemost 91, 267-275, 2004). 병에 걸린 간의 어디에서든 발현이 감소되는 종양 세포 상에서 향상된 LRP1의 발현은, 초회 통과 포획을 이용한 동맥 전달과 같이, 종양 조직을 선호하는 RAP 접합체의 불균일한 전달을 초래할 것이다. 불균일한 전달은, 화학요법제에 대해 신속하게 급증하는 종양 세포의 일반적으로 향상된 민감도와 함께, 대부분의 HCC 환자에서 감소된 간 여력에 의해 제시되는 치료로 장벽을 우회할 수 있다.

RAP는 투여 후 간으로 신속한 확산을 입증한다. 단백질 30 피코몰의 정맥내 환약 주사 후, 70% 이상의 외인성 RAP가 10분 내에 간에 축적된다(Warshawsky et al., J Clin Invest 92:937-944, 1993). 주사된 RAP의 순환성 반감기는 1분 미만이다. 이러한 약역학은 또한 래트에서 정맥내 주사로 2.5㎎/㎏(60 n㏖/㎏)까지 관찰된다(Warshawsky et al., 상동). 유사한 약역학은 또 다른 높은 친화성 LRP1 리간드, 프로테아제-활성 α-2-마크로글로불린, 725kD 4량체 혈청 당단백질에 대해 보고되었다(Davidsen et al., Biochim Biophys Acta 846:85-92, 1985). 소량의 RAP(주사된 용량의 1% 미만)만이 심장, 뇌, 근육 또는 신장에 축적되며, 이는 이들 조직에서 RAP 결합 LDLR의 조직 및 혈관 발현 둘다가 이 응용에 대해서 무시해도 될 정도인 것을 나타낸다. 정맥내 투여된 RAP는 설치류 및 고양잇과 종에서 측정가능한 독성이 없었음을 나타내었다. 간에 의한 RAP의 포획 효능은, 간세포 상에 풍부한 세포 표면 헤파린 설페이트 프로테오글리칸과 초기의 낮은 친화도로 결합하는 단계에 이어서, LRP1에 의해 고 친화도 결합과 세포내이입(endocytosis)을 이용하여 향상된다(Herz et al., Proc Natl Acad Sci USA 92:4611-4615, 1995; Mahley et al., J Lipid Res 40: 1-16, 1999).

다수의 인자들이 RAP 접합체에 의한 선택성 간 종양 표적화를 선호하지만, 이는 또한 그러한 제제가 전이된 HCC에 효과적일 것임을 시사한다. 전이된 종양 세포는 이소성 부위로 이동 시 그의 특성을 그대로 유지시키려는 경향이 있어서, 간외성 전이된 인간 HCC에서 LRP1의 줄지않은 발현을 입증한다(Gao et al., World J Gastroenterol 10:3107-3111, 2004). 이러한 요인은 푸코시다제 억제제를 포함하는 정맥내-투여된 RAP 펩타이드 접합체에 대해서 유사하게 민감한 전이된 HCC를 부여할 수 있다.

간 질환

본 발명의 일 양상은 푸코시다제 억제제의 RAP 펩타이드로의 접합과 이러한 접합체의 투여를 상정한다.

본 발명에 의해 상정되는 간 질병 혹은 간 질환은, 비제한적인 예로서, 하기 논의된 질환을 포함한다. 간세포 암종, 또는 간암은 세계에서 5번째로 가장 흔한 암이며 발생률은 끊임없이 증가하고 있다. 발암성 간세포는 높은 수준의 LRP1 발현을 유지한다. 간세포 암종은 화학요법에 잘 반응하지 않는데, 그 이유는 종양 세포가 높은 비율의 내약물성을 보이고 사용된 화학요법이 전신(정맥내) 투여로 인해 특히 심장 및 신장에 심각한 독성을 갖기 때문이다.

간염은 간의 염증에 대한 총칭이다. 간염은 급성 또는 만성일 수 있고, 예를 들어 바이러스(예컨대, A, B, C, D 혹은 E형 또는 ABCDE 이외 유형의 간염, CMV, 엡스테인-바), 진균, 리케치아 또는 기생충 감염, 알코올, 화학적 독소, 약물(예컨대, 아세타미노펜, 아미오다론, 아이소니아지드, 할로탄, 클로르프로마진, 에리스로마이신), 대사성 간 질병(예컨대, 윌슨병, 알파1-항트립신 결핍), 암, 특발성 자가면역 간 질병, 간경화증(예컨대, 1차 담즙 간경화증), 담도 폐쇄로 인한 급성 또는 만성 간부전을 포함한다. A, B 및/또는 C형 바이러스에 의한 간의 감염은 간 부전을 일으키는 서행성 간 질병을 초래할 수 있다. 급성 간염 감염은 A형 간염에 의해 가장 통상적으로 야기된다. B형 간염 및 C형 간염 감염은 둘다 체내에 잔존할 수 있고 다년간의 감염(만성)으로 될 수 있다. C형 간염은 간경화증 및 암을 비롯한 치명적인 병태를 야기할 수 있다.

RAP 펩타이드에 접합된 푸코시다제 억제제를 이용해서 치료가능한 상정되는 추가의 간 질환 혹은 병태는, 간 황색지방증(hepatic steatitis), 담즙 울혈, 간 간경화증, 독성 간손상(예컨대, 아플라톡신(Aflatoxin) B1 관련 암 등과 같은 약물 독성 혹은 환경 독성에 기인함) 및 유전성 혈색소증과 연관되거나 이들에 기인하는 종양을 포함한다.

간 종양 대상체에 대한 RAP-펩타이드-푸코시다제 억제제 접합체의 투여는, 간 종양 혹은 간종의 발병과 연관된 기타 질병을 치료하는데 유용한 화학요법제, 세포독성제, 방사성 동위원소, 항바이러스제, 항진균제, 항염증제, 항체 및 기타 치료제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 제2제제와 병용해서 행해지는 것이 상정된다.

간 암종의 치료를 위한 RAP 펩타이드-접합체와 병용해서 HCC 환자에게 투여하기 위한 후보자 약물로는, 5-플루오로유라실, 독소루비신(아드리아마이신), 미토마이신 C, 시스플라틴, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포사이드, 및 표 1에 제시된 기타 화학요법제, 아데포비어, 라미부딘, 엔테카비어, 리바비린, 인터페론 알파, 페길화된 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b 및 기타 항바이러스, 비타민 E, 우르소데옥시콜산, 및 간 질환을 치료하는데 사용되는 기타 제제를 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 추가의 제제는 이하의 표 1에 표시되어 있다.

종양을 치료하는 데 유용한 세포독성제로는, 메클로레타민 염산염, 사이클로포스파마이드, 이포스파마이드, 클로람부실, 멜팔란, 부설판, 티오테파, 카무스틴, 로무스틴, 다카바진 및 스트렙토조신을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

종양을 치료하는 데 유용한 방사성 동위원소로는, ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹¹¹In, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ¹²⁷Lu, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²⁵⁵Fm, ¹⁴⁹Tb, ²²³Rd,²¹³Pb, ²¹²Pb, ²¹¹At, ⁸⁹Sr, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ²²⁵Ac, ¹⁸⁶Re, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga 및 ^99mTc를 들 수 있지만 이들로 제한되는 것은 아니다.

종양을 치료하는 데 유용한 항체로는, 항-상피 성장인자 수용체(EGFR)(시툭시맙, 파니투마맙), 항-혈소판 유래 성장인자 수용체 알파(PDGFRalpha), 항-글라이피칸 3(GPC3), 및 간 암 혹은 간으로 전이된 암을 치료하는데 유용한 기타 항체를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌, 간 암 및 간 질환을 치료하는데 이용되는 것들을 들 수 있다.

키트

추가의 양상으로서, 본 발명은 본 발명의 방법을 실시하기 위하여 그들의 이용을 용이하게 하는 방식으로 포장된 본 명세서에 기재된 1종 이상의 접합체 혹은 조성물을 포함하는 키트를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 이러한 키트는 밀봉된 병 혹은 베셀 등과 같은 용기 내에 포장된, 본 명세서에 기재된 접합체 혹은 조성물(예컨대, RAP 펩타이드-푸코시다제 억제제 접합체를 단독으로 혹은 제2제제와 병용하여 포함하는 조성물)을 포함하며, 방법을 실시함에 있어서 해당 접합체 혹은 조성물의 용도를 기재한 라벨이 상기 용기에 부착되어 있거나, 포장에 포함되어 있다. 바람직하게는, 접합체 혹은 조성물은 단위 제형으로 포장된다. 키트는 특정 투여 경로에 따라서 조성물을 투여하는데 적합한 기구를 더 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 키트는 RAP 펩타이드 접합체 조성물의 용도를 기재한 라벨을 포함한다.

본 발명의 추가의 양상들 및 상세는 제한용이라보다는 오히려 예시용으로 의도된 이하의 실시예로부터 명확해질 것이다.

실시예

실시예 1

RAP 펩타이드-푸코시다제 억제제 접합체의 생산 및 특징

방법

펩타이드 접합체의 제조: 두 푸코시다제 억제제를 개발하는 합성 경로는 이미 발표되어 있다[11; 12]. RAP 펩타이드의 동정(identification) 및 제조는 이미 기술되어 있다[15; 16]. RAP 펩타이드 분자에 8개의 푸코시다제 억제제 분자를 부착시키기 위하여, 펩타이드의 N-말단은 K4K2K 라이신 덴드리머로 수식된다. 접합체 제조의 최종 단계는 8개의 덴드리머 1차 아민과 푸코시다제 억제제를 함유하는 카복실레이트 링커의 8개의 분자(N-5-카복시펜틸-데옥시푸코노지리마이신 혹은 N-5-카복시펜틸-Faz)의 각각 사이에 펩타이드 결합 형성이다.

HepG2 세포에서의 생화학적 효능: HCC 종양으로부터 원래 유래된 HepG2 세포는, 과푸코실화된 당단백질을 생산하고 RAP를 LRP1을 개재해서 라이소좀에 흡수시킨다. 간세포 내의 RAP 펩타이드-억제제 접합체의 생화학적 효능을 평가하기 위하여, HepG2 세포는 표준 상태를 이용해서 배양하고, 완충제 단독, 푸코시다제 억제제, 서열번호 2 단독 또는 서열번호 2와 푸코시다제 억제제를 포함하는 접합체를 이용해서 다수-웰 플레이트에서 인큐베이팅하였다. 전체 길이 RAP를 몇몇 웰에 1μM로 첨가하여 서열번호 2 또는 RAP 펩타이드 접합체의 흡수를 차단한다. 하룻밤 인큐베이션 후에, 세포들을 냉 PBS로 헹구고 pH 4.8의 50mM 시트르산나트륨 중에 동결-융해에 의해 용해시켰다. 세포 용해물을 원심분리에 의해 투명하게 하고, 제조사의 프로토콜에 따라서 4-메틸움벨리페릴(methylumbelliferylumbelliferyl)-알파-L-푸코스 검정(Sigma-Aldrich로부터 입수가능함, reference PMID 2137330)을 이용해서 푸코시다제 활성 검정을 행하였다. 세포수 및 라이소좀 기능을 정규화시키기 위하여 표준 절차를 이용해서 β-글루쿠로니다제 수준을 또한 검정하였다.

HepG2 세포에서의 기능적 효능 연구: HepG2 세포를 12-웰 플레이트에 웰당 1×10⁵ 세포로 파종(seed)하고, 24시간 동안 회복하도록 허용하였다. 이어서, 세포를 푸코시다제 억제제, RAP 펩타이드 접합체 혹은 RAP 펩타이드 단독을 이용해서 72시간 동안 인큐베이팅하였다. 그 후, 세포 상태는 MTT 증식 검정에 의해 평가하였다.

HepG2 세포에서의 푸코시다제 활성의 억제는 세포 내의 푸코실화된 단백질의 증가를 유발할 것이고, 이는 세포 사멸 또는 적어도 세포 증식의 감속 혹은 중지를 초래할 것으로 예상된다.

정상 및 HCC 주-siRNA에서의 푸코시다제 FUCA1의 결핍의 유의성: 각종 1차 인간 간세포(Lonza, 스위스 바젤시에 소재) 및 인간 간세포 암종 주(시판품 입수가능, MDS Pharma, Hep3B, HepG2, HLE, HLF, HuCCT1, HUH-6 클론 5, PLC/PRF/5, SNU-423)를 적절한 배지에서 평판배양하고 siRNA 표적화 FUCA1(Invitrogen, 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)의 풀(pool)을 이용해서 전달이입(transfect)시켰다. 세포를 이어서 72시간 인큐베이팅하고 MOA-HCA(multiplexed mechanism of action high-content assay)를 행하였다. 세포는 핵 내 총 DAPI 형광을 평가함으로써 증식에 대해서, 그리고 항활성화 카스파제 3 검정을 이용해서 세포자멸사에 대해서 검정하였다(예컨대, 문헌["A High-Content Analysis Assay and a Full-Automation Design Soley Using Noncontact Liquid Dispensing," Rodriguez, et al. Journal of The Association for Laboratory Automation, 2007] 참조). 모든 유체 전달은 Biomek FX(Beckman Coulter) 상에서 수행하였다. 12 비트 TIFF 화상을 InCell 분석기 1000 3.2를 이용해서 획득하고 Developer Toolbox 1.6 소프트웨어를 이용해서 정량화하였다. EC50값을 S자형상 4점, 4 파라미터 1-부위 용량-반응 모델에 의한 비선형 회귀를 이용해서 계산하였다. 곡선-적합화 및 계산은 MathIQ-기반 소프트웨어(AIM)를 이용해서 수행하였다. 셀 수치는 상대 셀 계수치(테스트 웰)/상대 셀 계수치(비히클 웰)×100으로서 산출되었다. 상대 셀 계수치 EC50은 최대 유효 반응의 절반을 생성하는 테스트 화합물 농도로서 측정된다. 활성화된 카스파제-3은 조기 내지 후기 단계 세포자멸사에서 세포를 정량화하는 데 이용되었다. 이 검정을 위한 출력은 각 웰 내의 상대 세포 계수치에 대해서 정규화된, 비히클 웰 내의 세포자멸사 세포에 대해서 테스트 웰 내의 세포자멸사 세포의 4배 증가였다. 카스파제-3 신호에서 5배 증가를 유발하는 테스트 물질의 농도는 유의한 세포자멸사 유도를 나타낸다.

FUCA1 siRNA의 투여에 의한 푸코시다제 활성의 억제는 세포 내 푸코실화된 단백질의 증가를 유발하여 푸코시다제 억제제로 배양된 샘플에서의 카스파제-3 활성 증가 및 세포 사멸을 초래할 것으로 예상된다.

정상 및 HCC 주-DNJ에서의 푸코시다제 결핍의 유의성: 각종 1차 인간 간세포(시판품 입수가능, Lonza) 및 인간 간세포 암종 주(시판품 입수가능, MDS Pharma, Hep3B, HepG2, HLE, HLF, HuCCT1, HUH-6 클론 5, PLC/PRF/5, SNU-423)를 적절한 배지에서 평판배양하였다. 세포를 10μM 데옥시푸코노지리마이신 중에서 72시간 인큐베이팅하고, 전술한 바와 같은 MOA-HCA를 실시하였다.

같은자리(orthotopic) 종양 이종이식 모델에서의 기능적 효능: 푸코시다제 억제제-접합된 RAP 펩타이드의 효능은 앞서 기술된 바와 같은 같은자리 간내 이종이식 모델에서 검정되었다[18; 19]. 간단하게는, 6 내지 8주령의 중증 복합 면역결핍증(severe combined immunodeficient: SCID) 마우스를 적절한 마취제, 예컨대, 케타민, 다이아제팜 혹은 이들의 조합물을 이용해서 마취시키고, 상부 정중선 개복술을 행하여 복부의 정중선을 통해 마우스의 간문맥을 노출시켰다. 이어서 30게이지 바늘을 이용해서 1분의 과정에 걸쳐서 간문맥 내로 10⁶ HepG2 세포의 현탁액을 주입하였다. 이어서 절개부분을 봉합하고 해당 동물을 완전히 깨어날 때까지 따뜻하게 유지시켰다.

RAP 펩타이드-푸코시다제 억제제 치료의 효능을 측정하기 위하여, 2-데옥시-2-(F-18)-플루오로-D-글루코스(¹⁸F-FDG) 등과 같은 적절한 방사성 표지제를 이용하는 양전자 방사 단층 촬영(PET)을 행하여[18], 치료된 마우스 및 대조군 마우스에서의 HepG2 유래 종양의 진행을 비침습 방법을 통해서 추적하였다. 푸코시다제 억제제-RAP 펩타이드 치료의 효능은 또한 치료된 동물과 대조군 동물에서의 종양 면적의 조직학적 분석에 의해 생체내에서 측정하였다.

라이소좀, 소변 및 혈액 내의 글라이코사미노글라이칸(GAG) 수준을 비롯한, 라이소좀 축적병 지표의 측정도 또한 같은자리 종양 모델에서 검정하였다.

RAP 펩타이드-푸코시다제 억제제 접합체의 투여가 푸코시다제 억제제를 투입하지 않은 대상체와 비교해서 종양 크기를 저감시키거나 종양 성장의 진행을 늦출 것으로 예상된다. 또, 펩타이드-억제제 접합체의 투여는, GAG 검정에서 측정된 바와 같이, 펩타이드 수용체를 통해 억제제를 흡수하는 세포의 라이소좀 내의 푸코실화된 단백질의 수준을 증가시킬 것으로 예상된다.

실시예 2

HepG2 세포에의 푸코시다제 억제제의 투여는 라이소좀 푸코시다제를 억제한다

간세포 상에서 푸코시다제 억제제 자체의 효과를 결정하기 위하여, 시험관내 검정을 수행하였다.

HepG2 인간 간세포 암종 세포를 웰당 4×10⁵에서 6-웰 조직 배양판 상에 파종하였다. 세포에 신선한 배지를 24시간에 공급하고, 30μM 데옥시푸코노지리마이신(DNJ) 혹은 완충액으로 72시간 동안 2회 처리하였다. 이어서, 세포를 냉 PBS로 세척하고, 마이크로퓨지 튜브(microfuge tube) 내로 긁어모아, 펠릿화하고 용해시켰다. 총 단백질 농도는 각 샘플에 대해서 브래드포드 검정(Bradford assay)에 의해 결정하고, 용해물 체적은 0.3 ㎎/㎖로 조정하였다. 각 용해물 샘플 20㎕ 중의 푸코시다제 활성은, 0.5mM 4-MU-푸코피라노사이드 100㎕를 첨가함으로써 측정하고, 이어서 37℃에서 30분간 인큐베이팅하였다. 반응은 pH 9에서의 600 mM 시트르산염/탄산염 완충액 130㎕를 이용해서 중지시켰다. 방출된 4-MU를 형광 마이크로플레이트 판독기에서 검정하였다(상기 실시예 1 참조). 그 결과는 도 4에 도시되어 있다. 2개의 샘플 활성값을 평균하여 플로팅하였다.

이들 결과는, 푸코시다제 억제제(비접합된 데옥시푸코노지리마이신)가 인간 간세포 암종 주에서 라이소좀 푸코시다제를 50% 초과하여 억제하는 것을 나타내고, RAP-접합된 푸코시다제 억제제가 간 암의 치료에 효과적인 것을 시사한다.

실시예 3

RAP 펩타이드 접합체의 생체내 투여

HCC는 5번째로 가장 흔하게 진단되는 악성 종양이며, 세계적으로 매년 거의 500,000명의 사망이 보고되고 있다. 종양 조직의 외과적 제거, 이식 및 물리적 파괴가 치료를 위한 첫번째 선택이지만, 5 내지 10%의 환자만이 이러한 접근에 적당한 종양을 제시하고 있는 실정이다(20-22). 또한, 전신 화학요법은, 화학요법제의 독성과 종양 세포의 내성 둘 모두로 인해, 15 내지 20%의 낮은 반응률을 얻는다(23-24).

예를 들어, 독소루비신은 광범위하게 다양한 종양에 대해 효율이 높은 암 화학요법제이며, 특히 종양 세포를 비롯한 급성장하는 세포에 대해 유독하다. 하지만, 간세포 암종의 치료에서 독소루비신의 사용은 유의한 간 및 심장 독성 및 혈액 세포 생산의 억제로 인해 제한된다(25). 또한, 간세포 암종 세포는 빠른 속도로 내약물성 유형으로 전환됨을 나타낸다(26).

치료에 대한 대안적 접근은 방사선을 이용한다. 예를 들어, 현재 치료 중인 간 암에 대한 새로운 치료는 종양 조직을 관류시키는 작은 혈관으로 통과시키는 주요 간 동맥으로 방사성 재료(⁹⁰Y)로 표지된 미세한 유리 비드(microscopic glass bead)들을 주입하는 것을 포함한다. 이후 방사선은 종양 조직을 파괴한다. 하지만, 간 동맥에서 폐까지의 혈액의 중요한 문합은 다수의 환자에서 상기 유리 비드들의 사용을 방해한다. 위장관에 공급하는 동맥으로의 상당한 비드들의 환류는 또한 심각한 부작용을 야기할 수 있다. 따라서, 종양 조직에의 효과적인 요법 전달은 혈관에서 포집될 거대한 재료에 의존하지 않는 보다 유도된 접근을 필요로 한다.

RAP 펩타이드를 간세포에 체내에서 결합시키는 수용체를 평가할 뿐만 아니라, 세포독성 화합물을 체내에서 세포에 전달하는 분자의 능력을 평가하기 위하여, 인간 간세포 암종의 같은자리 모델이 이용된다.

동물에서의 같은자리 종양을 생성시키기 위하여, 인간 간암종 세포주를 누드 마우스, 래트, 혹은 기타 적절한 동물 내에 이식하고, 해당 종양 세포를 생체내에서 성장시켰다. 같은자리 모델에 유용한 HCC 세포주로는 전술한 세포주의 것들, 예컨대, Heb3B, HepG2 및 Huh-7을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. HCC의 같은자리 종양 모델은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Okubo et al. (J Gastroenterol Hepatol. 2007 22:423-8); Armengol et al., (Clin Cancer Res. 2004 10:2150-7); 및 Yao et al., (Clin Cancer Res. 2003 9:2719-26)]에 기재되어 있다.

우선 접합된 RAP 펩타이드 및 대조군의 생체내 투여를 위한 용량 범위를 확립하기 위하여, 작은 용량 범위 연구를, 군당 5마리의 마우스를 이용해서, 접합된 RAP 펩타이드, (예컨대, RAP 펩타이드-DMJ(200 ㎎/㎏/day까지), RAP 펩타이드-Faz(200 ㎎/㎏/day까지)), RAP 펩타이드 단독(200 ㎎/㎏/day)까지, DMJ 혹은 Faz 단독을 투입하여 수행하였다. 테스트 제제를 2주 동안(QD×14) 매일 정맥내 혹은 복강내에 투여하고, 대상체 동물은 체중 변화, 임의의 임상 관찰, 그리고 연구 종료점에서의 조직임상 병리 및 조직의 조직병리에 대해서 테스트하였다.

효능 연구를 수행하기 위하여, 군당 8 내지 10마리의 마우스를 이용해서, 상기 화합물의 3 테스트 용량 범위를, 인간 HCC 세포를 투입한 동물과 대조군 동물에 투여하였다. 테스트 제제는 정맥내 혹은 복강내에 투여하고, 적절한 빈도로, 예컨대, 4주 동안 매일(QD×28), 3주 동안 매일(QD×21) 혹은 2주 동안 매일(QD×14) 투여하였다. 이어서 대상 동물은, 당업계에 공지된 수법을 이용해서, 체중의 임의의 변화, 임상 관찰, 그리고 생체내 효능 측정, 예컨대, 종양 체적, 간 조직병리, 및 일반적 임상 병리 등에 대해서 평가하였다.

생체내 간세포 암종 세포의 성장을 저감시키는 접합된 RAP 펩타이드의 능력은, 펩타이드가 종양 세포의 표면 상의 세포 수용체에 결합하여, 생물학적으로 측정가능한 효과를 가져오는 간 세포 내로 제제를 전달하는 효과적인 수단인 것을 입증한다. 동물 모델 내의 효율적인 종양 사멸의 입증은, 접합된 RAP 펩타이드가 간암종 혹은 기타 간 병태로 고통받고 있는 인간에서의 종양 세포에 푸코시다제 억제제를 전달하는 효율적인 방법인 것을 시사한다.

치료제의 생체분포(biodistribution) 및 효능을 시험하기 위하여 간세포 암종(HCC)에 대한 또 다른 관련된 동물 모델은 마못 간염 바이러스(woodchuck hepatitis virus: WHV)-감염된 이스턴 마못이다(27). 바이러스에 의해 신생아로 감염된 거의 모든 마못이 24개월의 중간 간격 내에 HCC를 발병시켰다. 중앙 수명 기대치는 30개월이지만, WHV-감염된 마못은 HCC 환자의 대다수에서 존재하는 병태인 간경화증을 발병하지 않았다. 마못 간염 바이러스 및 인간 B형 간염 바이러스는 구조, 유전학, 전염 방법, 감염 과정 및 간세포 암종으로의 진행이 유사하다. 이 모델의 중요성을 강조하는 상당한 유사성이 있다. 인간과 마찬가지로, 생후 단기간에 간염 바이러스에 노출된 모든 마못의 절반 이상이 만성 감염을 발병하였고, 거의 모든 만성적으로 감염된 마못이 노출 후 대략 20 내지 28개월에 간세포 암종을 발병하였다. 나머지 접종된 신생아 마못은 흔히 급성 간염을 발병시키지만, 바이러스에 대한 항체를 발달시켜 회복할 것이다. 이들 "회복된" 동물의 17 내지 25%는 노출 후 29 내지 56개월 사이에 HCC를 발병시켰다. 간염 감염으로부터 명백하게 회복된 후 HCC의 발병은 인간에서도 보여진다.

간에 대한, 특히 종양 세포에 대한 제제의 전달에 관한 RAP 펩타이드-푸코시다제 억제제 접합체의 효과를 결정하기 위하여, 대조군 및 RAP 펩타이드 접합체 치료제의 섭취율 및 독성이 마못 HCC 모델에서 연구된다. 일 실시형태에서, 대략 1.5 내지 2년된, 6마리의 만성 감염된 마못과 4마리의 미감염된 마못이 이용된다.

유용한 전달 화합물은 일반적으로 이하의 특징을 발휘할 것이다: 1) 간의 이미 면역약화된(compromised) 기능에 악영향을 미치지 않음, 2) 간 및 악성 간 조직에 의한 측정가능한 흡수, 및 3) 흡수 시 종양 세포에 유독하여 종양 회귀를 유발함.

라이소좀, 소변 및 혈액 내의 올리고당 수준을 비롯하여 라이소좀 축적병 지표의 측정이 또한 종양 모델에서 검정된다.

당업자라면 상기 예시적인 실시예에 기재된 바와 같은 본 발명에 있어서의 수많은 변형과 변화가 일어날 것으로 예상된다. 결과적으로, 첨부된 특허청구범위에서 나타나는 바와 같은 이러한 제한만이 본 발명에 가해져야만 한다.

참조문헌

SEQUENCE LISTING <110> Zankel, Todd <120> METHOD FOR TREATING LIVER DISORDERS WITH RECEPTOR ASSOCIATED PROTEIN (RAP) PEPTIDE-FUCOSIDASE INHIBITOR CONJUGATES <130> 31075/45130A <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 323 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Tyr Ser Arg Glu Lys Asn Gln Pro Lys Pro Ser Pro Lys Arg Glu Ser 1 5 10 15 Gly Glu Glu Phe Arg Met Glu Lys Leu Asn Gln Leu Trp Glu Lys Ala 20 25 30 Gln Arg Leu His Leu Pro Pro Val Arg Leu Ala Glu Leu His Ala Asp 35 40 45 Leu Lys Ile Gln Glu Arg Asp Glu Leu Ala Trp Lys Lys Leu Lys Leu 50 55 60 Asp Gly Leu Asp Glu Asp Gly Glu Lys Glu Ala Arg Leu Ile Arg Asn 65 70 75 80 Leu Asn Val Ile Leu Ala Lys Tyr Gly Leu Asp Gly Lys Lys Asp Ala 85 90 95 Arg Gln Val Thr Ser Asn Ser Leu Ser Gly Thr Gln Glu Asp Gly Leu 100 105 110 Asp Asp Pro Arg Leu Glu Lys Leu Trp His Lys Ala Lys Thr Ser Gly 115 120 125 Lys Phe Ser Gly Glu Glu Leu Asp Lys Leu Trp Arg Glu Phe Leu His 130 135 140 His Lys Glu Lys Val His Glu Tyr Asn Val Leu Leu Glu Thr Leu Ser 145 150 155 160 Arg Thr Glu Glu Ile His Glu Asn Val Ile Ser Pro Ser Asp Leu Ser 165 170 175 Asp Ile Lys Gly Ser Val Leu His Ser Arg His Thr Glu Leu Lys Glu 180 185 190 Lys Leu Arg Ser Ile Asn Gln Gly Leu Asp Arg Leu Arg Arg Val Ser 195 200 205 His Gln Gly Tyr Ser Thr Glu Ala Glu Phe Glu Glu Pro Arg Val Ile 210 215 220 Asp Leu Trp Asp Leu Ala Gln Ser Ala Asn Leu Thr Asp Lys Glu Leu 225 230 235 240 Glu Ala Phe Arg Glu Glu Leu Lys His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys 245 250 255 His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg 260 265 270 His Ala Glu Ser Val Gly Asp Gly Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu 275 280 285 Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val 290 295 300 Lys Lys His Leu Gln Asp Leu Ser Gly Arg Ile Ser Arg Ala Arg His 305 310 315 320 Asn Glu Leu <210> 2 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Cys Gly Lys His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys His Asn His Tyr Gln 1 5 10 15 Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg His Ala Glu Ser Val 20 25 30 Gly Asp Ala Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu Lys His Ala Leu Leu 35 40 45 Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val Lys Lys His Leu Gln 50 55 60 Asp Ala Cys Gly 65 <210> 3 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Cys Gly Lys His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys His Asn His Tyr Gln 1 5 10 15 Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg His Ala Glu Ser Val 20 25 30 Gly Asp Gly Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu Lys His Ala Leu Leu 35 40 45 Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val Lys Lys His Leu Gln 50 55 60 Asp Gly Cys 65 <210> 4 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Cys Gly Phe Arg Glu Glu Leu Lys His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys 1 5 10 15 His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys Leu Arg 20 25 30 His Ala Glu Ser Val Gly Asp Gly Glu Arg Val Ser Arg Ser Arg Glu 35 40 45 Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Val 50 55 60 Lys Lys His Leu Gln Asp Leu Ser Gly Gly Cys 65 70 75 <210> 5 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 5 ggsgg 5

Claims

푸코시다제 억제제에 연결된 수용체 결합 단백질(receptor associated protein: RAP) 펩타이드를 포함하는 펩타이드 접합체(peptide conjugate)로서, 해당 RAP 펩타이드는 서열번호 1의 RAP의 아미노산 210 내지 319에 대해 적어도 95% 상동성인 폴리펩타이드 서열을 포함하며, 상기 푸코시다제 억제제는 N-5-카복시펜틸-데옥시푸코노지리마이신, N-카복시펜틸-(3R,4R,5S,6S)-1-뷰틸-4,5,6-트라이하이드록시아제판-3-카복실산, L-데옥시푸코노지리마이신, 베타-1-C-메틸 데옥시만노지리마이신, 베타-1-C-에틸 데옥시만노지리마이신, 베타-1-C-페닐 데옥시만노지리마이신 및 (3R,4R,5S,6S)-1-뷰틸-4,5,6-트라이하이드록시아제판-3-카복실산으로부터 선택되는 것인 펩타이드 접합체.
제1항에 있어서, 상기 RAP 펩타이드는 서열번호 1의 RAP의 아미노산 210 내지 319를 포함하는 것인 펩타이드 접합체.
푸코시다제 억제제에 연결된 수용체 결합 단백질(RAP) 펩타이드를 포함하는 펩타이드 접합체로서, 해당 RAP 펩타이드는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 상동성인 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 푸코시다제 억제제는 N-5-카복시펜틸-데옥시푸코노지리마이신, N-카복시펜틸-(3R,4R,5S,6S)-1-뷰틸-4,5,6-트라이하이드록시아제판-3-카복실산, L-데옥시푸코노지리마이신, 베타-1-C-메틸 데옥시만노지리마이신, 베타-1-C-에틸 데옥시만노지리마이신, 베타-1-C-페닐 데옥시만노지리마이신 및 (3R,4R,5S,6S)-1-뷰틸-4,5,6-트라이하이드록시아제판-3-카복실산으로부터 선택되는 것인 펩타이드 접합체.
제3항에 있어서, 상기 RAP 펩타이드는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 펩타이드 접합체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 푸코시다제 억제제는 N-5-카복시펜틸-데옥시푸코노지리마이신 및 N-카복시펜틸-(3R,4R,5S,6S)-1-뷰틸-4,5,6-트라이하이드록시아제판-3-카복실산으로부터 선택되는 것인 펩타이드 접합체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 푸코시다제 억제제는 펩타이드 링커를 통해서 접합된 것인 펩타이드 접합체.
제6항에 있어서, 상기 펩타이드 링커는 라이신 덴드리머(lysine dendrimer) 또는 K4K2K 라이신 덴드리머인 펩타이드 접합체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, RAP 펩타이드 분자 하나당 적어도 4개의 푸코시다제 억제제가 접합되거나 또는 RAP 펩타이드 분자 하나당 적어도 8개의 푸코시다제 억제제가 접합된 것인 펩타이드 접합체.
간 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 간 종양을 치료하는데 사용하기 위한 약학 조성물로서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드 접합체를 포함하는 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 간 종양은 간세포 암종, 간염 바이러스 감염, 간경화증, 독성 간손상 및 유전성 혈색소증의 결과인 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 치료는 상기 대상체에서 간 종양 크기의 감소, 또는 대상체의 혈중 알파-태아 단백질 수준의 치료 전의 수준과 비교한 감소를 야기하는 것인 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 펩타이드 접합체는 정맥내 투여되는 것인 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 펩타이드 접합체는 제2 제제와 병용해서 투여되는 것인 약학 조성물.
제13항에 있어서, 상기 제2 제제는 독소루비신 및 5-플루오로유라실로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법제인 약학 조성물.
제13항에 있어서, 상기 제2 제제는 세포독성제 또는 방사성 동위원소인 약학 조성물.
제13항에 있어서, 상기 간 종양은 간염 바이러스 감염과 연관되고, 상기 제2 제제는 항바이러스제인 약학 조성물.
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