CN106188270A - Rhamm结合肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供结合透明质酸介导的运动性受体(RHAMM)分子的肽。更具体地讲，提供了能特异性结合RHAMM分子并能以显著高亲和力结合RHAMM的肽。这些新RHAMM‑结合肽为以下提供了基础：可用于鉴定表达RHAMM的细胞的新的成像探针，以及RHAMM表达相关病况的成像、预后、诊断和治疗的方法。

Description

RHAMM结合肽
本申请是国际申请日为2011年5月31日、国际申请号为PCT/CA2011/000613、进入国家阶段的申请号为201180037528.0、发明名称为“RHAMM结合肽”的PCT申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及新肽，以及它们在用于鉴定表达RHAMM的细胞的组合物和方法中的用途，以及它们在治疗RHAMM/配体复合物形成所致的病症或病况的组合物和方法中的用途。
背景技术
在本申请的全文中，多种参考文献在方括号中引用，以更充分地描述本发明所述领域的现有技术水平。
乙酰透明质酸(HA，葡糖醛酸和N-乙酰基葡糖胺的重复单元的阴离子型聚合物)是基质的一种胞外基质(ECM)组分，其与癌症的进展相关：在癌症患者中肿瘤HA积累增加预示着后果不良[1, 2, 3]。HA在体外刺激癌细胞运动性，表明其在体内在癌细胞侵袭中的重要性。已牵涉癌症进展的2种HA细胞受体是CD44和RHAMM (HA-介导的运动性的受体)。
目前公认祖细胞或“肿瘤起始细胞”不成比例地促进白血病的肿瘤形成潜力。新近已描述了在乳癌(BC)和其它实体瘤中的一种类似现象，并且这些肿瘤细胞亚类的表型已被部分地表征为CD44+/CD24-/ESA+。尽管这些细胞亚类与临床后果间准确的关系尚有争论，但是经FAGS从原代BC中分选出的CD44+细胞表达预测不良临床后果的基因标签。RHAMMmRNA和蛋白过量表达也发生在原代人乳瘤细胞亚类中并且这些RHAMM阳性亚类在BC中的存在预示着不良临床后果和外周转移的风险增加。尽管CD44在许多正常组织中都表达，但在这些组织中未检出RHAMM的表达，而是出现在创伤修复之后和病理过程例如癌症进展期间。因此CD44-阳性和RHAMM-阳性肿瘤细胞亚类的成像在鉴定处于不良后果的风险之中的患者方面是相关的。然而，直到本文件写成之日，还未对这些和/或其它肿瘤祖细胞直接成像。因此，可有利的是，找到能够靶向RHAMM的分子成像探针，以提供对祖细胞状态进行非侵袭性成像的方法。这种靶向方法也可提供用治疗药剂选择性靶向祖细胞的方法，或直接通过配体-受体相互作用，或间接通过将治疗性有效载荷(payload)递送给靶细胞。例如，可以将发射粒子的同位素递送到祖细胞，或可将化疗药递送到细胞(例如顺铂)。本发明提供用于靶向RHAMM的新肽配体，这是以前未报道过的。
发明内容
本发明涉及能结合RHAMM的新肽的发现。
因此在一个实施方案中，本发明提供分离的肽，其包含选自至少以下氨基酸序列的至少一种氨基酸序列：SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 17。
另一方面，本发明提供分离的DNA，所述DNA包含编码SEQ ID No. 1至SEQ ID NO:17的肽的核酸序列(nucleic sequence)。
本发明还涉及以一定的特异性和亲和力与RHAMM结合的肽的发现，其中所述肽源自微管蛋白。一方面，本发明的RHAMM-结合肽源自微管蛋白的羧基端尾。
依照一个实施方案，本发明提供RHAMM-结合肽，其中所述RHAMM-结合肽包含选自SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 17的至少一种氨基酸序列。
依照另一实施方案，本发明提供RHAMM-结合肽，其特征在于所述RHAMM-结合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)的序列，其中X选自丙氨酸或甘氨酸，Z选自酪氨酸或谷氨酸。
在另一个实施方案中，本发明提供药物组合物，其特征在于所述药物组合物包含有效量的一种或多种本发明RHAMM-结合肽和药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供探针，其包含本发明RHAMM-结合肽和能通过检测技术而检测的可检测标记。
在一个实施方案中，本发明提供对受试者组织或器官中的RHAMM表达进行成像的方法，其特征在于所述方法包括：(a) 给予包含本发明RHAMM-结合肽和能通过检测技术而检测的可检测标记的探针；和(b) 应用成像技术以在受试者组织或器官中检测所述标记。
在另一实施方案中，提供测定细胞中RHAMM的存在情况的方法，其特征在于所述方法包括使细胞与包含本发明RHAMM-结合肽和能通过检测技术而检测的可检测标记的探针接触，和应用成像技术以在细胞中检测所述标记，其中细胞中所述标记的检出表示细胞中RHAMM的存在。
在一个实施方案中，本发明提供对受试者的肿瘤祖细胞进行成像的方法，其特征在于所述方法包括将包含本发明RHAMM-结合肽和能通过检测技术而检测的可检测标记的探针给予所述受试者并将成像技术用于在受试者中检测所述标记，其中受试者中所述标记的检出表示受试者中肿瘤祖细胞的存在。
在另一个实施方案中，本发明是对动物细胞、组织或器官中的肿瘤祖细胞进行成像的方法，其特征在于所述方法包括使所述细胞、组织或器官与包含本发明RHAMM-结合肽和能通过检测技术而检测的可检测标记的探针接触，和应用成像技术以在细胞、组织或器官中检测所述标记，其中细胞、组织或器官中所述标记的检出表示细胞、组织或器官中肿瘤祖细胞的存在。
在一个实施方案中，本发明提供确定癌症患者的预后的方法，其特征在于所述方法包括：(a) 从所述患者获取肿瘤组织样品；(b) 使所述样品与包含本发明RHAMM-结合肽和能通过检测技术而检测的可检测标记的探针接触；(c) 应用成像技术以在所述样品中检测所述标记；和(d) 确定所述患者的预后，其中所述预后预测患者的癌症侵占性(aggressiveness)或转移的可能性，和其中所述样品中RHAMM表达的检出表示不良预后。
在另一个实施方案中，本发明提供确定用于癌症患者的疗程的方法，其特征在于所述方法包括：(a) 从所述患者获取肿瘤组织样品；(b) 使所述样品与包含本发明RHAMM-结合肽和能通过检测技术而检测的可检测标记的探针接触；(c) 应用成像技术以在所述样品中检测所述标记；和(d) 确定所述患者的预后，其中所述预后预测患者的癌症侵占性的可能性，和其中所述样品中RHAMM表达的检出表示不良预后；并根据所述预后而确定用于所述患者的疗程。
在另一个实施方案中，本发明提供用于诊断与RHAMM在细胞中表达相关的病症或病况的患者的方法，其特征在于所述方法包括：(a) 从所述患者获取组织样品；(b) 使所述样品与包含本发明RHAMM-结合肽和能通过检测技术而检测的可检测标记的探针接触；和(c) 应用成像技术以在所述样品中检测所述标记；其中所述样品RHAMM表达的检出表示所述病症或病况的阳性诊断。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗患有与RHAMM在细胞中表达相关的病症或病况的受试者的方法，其特征在于所述方法包括给予所述受试者有效量的组合物，所述组合物包含有效量的一种或多种RHAMM-结合肽或编码所述一种或多种RHAMM-结合肽的核酸分子和药学上可接受的载体，其中所述一种或多种RHAMM-结合肽包含具有式EEXEEZ(SEQ ID NO: 18)的序列，其中X选自丙氨酸或甘氨酸，Z选自酪氨酸或谷氨酸。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗患有与RHAMM在细胞中表达相关的病症或病况的受试者的方法，其特征在于所述方法包括给予所述受试者有效量的组合物，所述组合物包含有效量的一种或多种RHAMM-结合肽或编码所述一种或多种RHAMM-结合肽的核酸分子以及药学上可接受的载体，其中所述一种或多种RHAMM-结合肽选自SEQ ID NOs. 1-17。
在另一个实施方案中，本发明提供抑制表达RHAMM的细胞增殖的方法，其特征在于所述方法包括使所述细胞与有效量的一种或多种RHAMM-结合肽或编码所述一种或多种RHAMM-结合肽的核酸分子接触，其中所述一种或多种RHAMM-结合肽包含具有式EEXEEZ(SEQ ID NO: 18)的序列，其中X选自丙氨酸或甘氨酸，Z选自酪氨酸或谷氨酸。
在另一个实施方案中，本发明提供抑制表达RHAMM的细胞增殖的方法，其特征在于所述方法包括使细胞与有效量的一种或多种RHAMM-结合肽或编码所述一种或多种RHAMM-结合肽的核酸分子接触，其中所述一种或多种RHAMM-结合肽选自SEQ ID NOs: 1-17。
在另一个实施方案中，本发明提供抑制表达RHAMM的细胞运动性的方法，其特征在于所述方法包括使所述细胞与有效量(effective)的一种或多种RHAMM-结合肽或编码所述一种或多种RHAMM-结合肽的核酸分子接触，其中所述一种或多种RHAMM-结合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)的序列，其中X选自丙氨酸或甘氨酸，Z选自酪氨酸或谷氨酸。
在另一个实施方案中，本发明提供抑制表达RHAMM的细胞运动性的方法，其特征在于所述方法包括使所述细胞与有效量的一种或多种RHAMM-结合肽或编码所述一种或多种RHAMM-结合肽的核酸分子接触，其中所述一种或多种RHAMM-结合肽选自SEQ ID NOs: 1-17。
在本发明的多个方面，所述表达RHAMM的细胞是癌细胞。
在一个实施方案中，本发明提供在癌症患者中预防转移的方法，其特征在于所述方法包括给予所述患者有效量的包含一种或多种RHAMM-结合肽或编码所述一种或多种RHAMM-结合肽的核酸分子的组合物，其中所述一种或多种RHAMM-结合肽包含具有式EEXEEZ(SEQ ID NO: 18)的序列，其中X选自丙氨酸或甘氨酸，Z选自酪氨酸或谷氨酸。
在另一个实施方案中，本发明提供在癌症患者中预防转移的方法，其特征在于所述方法包括给予所述患者有效量的包含一种或多种RHAMM-结合肽或编码所述一种或多种RHAMM-结合肽的核酸分子的组合物，其中所述一种或多种RHAMM-结合肽选自SEQ ID NOs:1-17。
在一个实施方案中，本发明提供RHAMM-结合肽在治疗、改善或预防RHAMM表达相关病症或病况中的用途，其特征在于所述RHAMM-结合肽包含具有式EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)的序列，其中X选自丙氨酸或甘氨酸，Z选自酪氨酸或谷氨酸。
在另一实施方案中，本发明提供RHAMM-结合肽或编码所述RHAMM-结合肽的核酸在治疗、改善或预防RHAMM表达相关病症或病况中的用途，其特征在于所述RHAMM-结合肽选自SEQ ID NOs: 1-17。
在本发明的多个方面，所述RHAMM表达相关病症或病况是组织瘢痕形成。在本发明的多个方面，所述RHAMM表达相关病症或病况是癌症。
在本发明的多个方面，本发明的肽可在肽的一端或两端添加半胱氨酸，从而通过二硫键形成、磷基团和乙酰基的方式而环化。
在本发明范围之内的还有本发明的任何肽的功能类似物以及本发明肽的多聚体例如本发明肽的二聚体或三聚体。本发明的多聚体可以是由多个相同的肽组成的同型多聚体或由不同的肽组成的异型多聚体。本发明肽的特征性氨基酸序列可侧接随机氨基酸序列。优选的是对肽具有稳定作用、因而增加其生物利用度的侧翼序列。侧翼序列也可用于改进药物动力学行为。在本发明范围之内的还有融合肽和peg化(pegylated)肽，其可改进代谢稳定性，增加生物利用度，降低对蛋白水解的敏感性。
在本发明范围之内的还有这样的肽：其特征为至少一个氨基酸被具有类似化学性质的另一氨基酸取代；至少一个氨基酸被非天然氨基酸取代，所述非天然氨基酸例如N-甲基化氨基酸、D-氨基酸或其它非天然氨基酸构建体；在N-端或/和C-端存在至少一个额外氨基酸；至少一个氨基酸缺失；和至少一个氨基酸被化学修饰。
附图说明
根据本文给出的详细描述和附图，将会更充分理解本发明，所述描述和附图都是以说明性方式给出而并非限制本发明预期范围。
图1A显示72 kDa RHAMM蛋白的图，所述蛋白含有RHAMM/乙酰透明质酸(HA)相互作用所必需的HA-结合结构域(氨基酸残基718-750, SEQ ID NO: 19)。
图1B说明分子成像探针的设计和优化的流程图。
图2A显示以下的通用结构：(a)未经修饰的微管蛋白-衍生的肽，(b)与N-乙酰半胱氨酸缀合的微管蛋白-衍生的肽，和(C)与异硫氰酸荧光素缀合的微管蛋白-衍生的肽。
图2B是17种合成的微管蛋白-衍生的肽的表，包括用荧光素或N-乙酰半胱氨酸衍生的肽、微管蛋白片段种类、计算的和实测的质谱m/z值(m表示分子量或原子量，z表示离子携带的元电荷数量)、%纯度和结合常数Kd。图2B按照出现的顺序分别公开了SEQ ID NOs:1、24-25、2-3、26-27、4-9、28-29、10-11、30-31、12、32-33、13-14、34-35和15-17。
图3A是一个表，说明RHAMM-CT固定在表面等离振子共振(SPR)传感器板的pH依赖性。根据6次测量的平均SPR反应测定配体密度。对于RHAMM pI = 10.1，用碳酸氢钠缓冲液(pH 9.7)作为对照运行。用EDAC (100 mM)和磺基-NHS (25 mM)将蛋白质偶联到传感器板。
图3B说明针对RHAMM，对纯化的微管蛋白-衍生的肽(SEQ ID NOs: 1-17)的基于表面等离振子共振(SPR)的筛选，以测定高亲和力配体。筛选得到6种对RHAMM具有高亲和力的配体(SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14)。
图3C是证实经SPR筛选后的6种肽(SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14)的亲和力的ELISA结合测定，说明荧光素-标记的本发明肽与RHAMM的结合。从每次测量中减去阴性对照(未固定的RHAMM)。
图4A说明7组传感图，显示每组特定肽-RHAMM相互作用的总体拟合，并有阴性对照和参比传感图。抗RHAMM mAb用作阳性对照。每组传感图都对应3个RHAMM浓度(1000 nM、750nM和500 nM)与固定化肽的相互作用的反应。
图4B是一个表，说明所选微管蛋白-衍生的肽(SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14)和RHAMM单克隆抗体(mAb)的动力学概况。该表显示计算的缔合速率(KON)、解离速率(KOFF)和结合常数(KD)。误差是平均KD的标准差。
图5A是一幅图，显示6种所选荧光素-标记的本发明RHAMM-结合肽SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14 (分别对应于SEQ ID NOs: 25、27、29、31、33和35)被HA (0、1.25、2.5、5和10 μg/mL)竞争性置换(competitive displacement)到固定化RHAMM-CT。数据显示在2个独立实验中的3次测量的平均值。
图5B是一幅图，显示染料-标记的HA被6种所选非标记的本发明RHAMM-结合肽(SEQID NOs: 1、3、9、11、12和14)竞争性置换到固定化RHAMM-CT。数据显示在2个独立实验中的3次测量的平均值。
图5C是一幅图，显示6种荧光素-缀合的本发明RHAMM-结合肽SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14 (分别对应于SEQ ID NOs: 25、27、29、31、33和35)和纯化的CD44或RHAMM-CT的ELISA结合测定。数据显示在2个独立实验中的3次测量的平均值。
图6A是显微照片，说明在乳瘤细胞(MDA-MB-231)中使用荧光成像，对荧光素-缀合的SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 35)摄取的显现(visualization)。DAPI通道表示核，而FITC通道说明荧光素-标记的肽的定位。
图6B是一幅图，说明在乳瘤细胞(MDA-MB-231)中荧光素-缀合的SEQ ID NOs: 1、9和14 (SEQ ID NOs: 25、29、35)摄取的定量测定。每一柱形代表来自3个实验的每一个的1048次测量的平均值。与接受抗RHAMM治疗的组相比，所有治疗组显著更高(p< 0.001)。用ANOVA分析数据，误差是平均值的标准差。
图7是显微照片，说明在乳瘤细胞(MDA-MB-231)中使用荧光成像，FITC-缀合的SEQID NO: 1和SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NOs: 25和29)摄取的显现。DAPI通道表示核，而FITC通道说明荧光素-标记的肽的定位。
图8A是RHAMM的HA-结合结构域的氨基酸序列(aa 716-750；SEQ ID NO: 19)。HA结合所需的碱性氨基酸残基用下划线标出。
图8B是4种RHAMM-结合肽(SEQ ID NOs: 1、3、9和11)的氨基酸序列比对。相同序列用灰色突出显示，而半保守残基用白色框标出。可与RHAMM上的碱性氨基酸残基通过离子键合相互作用的酸性氨基酸残基用下划线标出。
图9说明SEQ ID NOs: 1、3、9、10、12和14的血清稳定性研究。图显示%完整肽(经RP-HPLC检测)，以30分钟的增量，共11小时。数据拟合到一级衰减曲线。
图10A是一幅图，说明丙氨酸-取代的荧光素-缀合的肽SEQ ID NO: 1 (SEQ IDNO: 25)与RHAMM (分别为SEQ ID NOs: 1和36-47，从左栏到右栏)的亲和力。星号表示观测到的荧光显著降低(p<0.01)，因为对RHAMM-结合而言重要的残基的丙氨酸取代(从每次测量中减去未固定的RHAMM并且所有数据显示在2个独立实验中的3次测量的平均值)。
图10B说明12种丙氨酸-取代的荧光素-缀合的肽SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 25)被HA竞争性置换到固定化RHAMM (分别为SEQ ID NOs: 1和36-47，从左到右)。阴性对照(从每次测量中减去未固定的RHAMM并且所有数据显示在2个独立实验中的3次测量的平均值)。
图11是一幅图，说明在不同浓度(1 μm和10 μm)的RHAMM-结合肽SEQ ID NO: 1存在下，人上皮卵巢癌(EOC)细胞的增殖测定。在该测定中，在第一天处理细胞，然后增殖6天。
图12是一幅图，说明本发明的Rhamm-结合肽SEQ ID NO: 3降低了腹水-来源的人EOC细胞的活力(p<005)。
图13是显微照片，说明使用荧光显微术，卵巢瘤细胞对荧光素-缀合的肽SEQ IDNO: 1 (SEQ ID NO: 25)的摄取。DAPI通道表示核，而FITC通道说明荧光素-标记的肽的定位。
图14 A显示(a) 使用荧光显微术，PC3mLN4人前列腺癌细胞对本发明荧光素-缀合的SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 29)的摄取，(b) 对荧光素-SEQ ID NO: 9的摄取未被特异性抗CD44 mAb封闭，然而，(c) 对荧光素-缀合的SEQ ID NO: 9的摄取却被特异性抗RKAMMmAb封闭。
图14 B显示PC3mLN4人前列腺癌细胞对本发明SEQ ID NO: 9摄取的定量测定。数据显示接受无抗体治疗的细胞(a)和用抗CD44封闭的细胞(b)间无统计学差异。在用抗RHAMM抗体治疗的细胞中对探针的摄取极大地下降(c)。
图15 A说明Ga-DOTA-缀合的SEQ ID NO: 1肽的合成。
图15 B是纯化的Ga-DOTA-缀合的SEQ ID NO: 1肽在9.73分钟的RP-HPLC色谱图。
图15C是纯化的Ga-DOTA-缀合的SEQ ID NO: 1肽的ESI质谱。
图16A说明Re(CO)3 + -配位的SEQ ID NO: 1肽的合成。
图16B是纯化的Re(CO)3 + -配位的SEQ ID NO: 1肽在11.06分钟的RP-HPLC色谱图。
图16C是纯化的Re(CO)3 + -配位的SEQ ID NO: 1肽的ESI质谱。
图17A说明丙氨酸-取代的荧光素-缀合的SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO；35)肽与RHAMM (分别为SEQ ID NOs: 48-55,14和56-58，从左栏到右栏)的亲和力。星号表示观测到的荧光显著降低(p<0.01)，这是由于对RHAMM-结合而言重要的残基的丙氨酸取代(从每次测量中减去未固定的RHAMM并且所有数据显示在2个独立实验中的3次测量的平均值)所致。
图17B说明11种丙氨酸-取代的荧光素-缀合的SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 35)肽被HA竞争性置换到固定化RHAMM (分别为SEQ ID NOs: 48-55、14和56-58，从左到右)。阴性对照(从每次测量中减去未固定的RHAMM并且所有数据显示在2个独立实验中的3次测量的平均值)。
具体实施方式
定义
氨基酸残基的以下标准单字母和三字母缩写可用于本说明书全文：A, Ala--丙氨酸；R, Arg-精氨酸；N, Asn--天冬酰胺；D, Asp--天冬氨酸；C, Cys--半胱氨酸；Q, Gln--谷氨酰胺；E, Glu--谷氨酸；G, Gly--甘氨酸；H, His--组氨酸；I, lIe--异亮氨酸；L, Leu--亮氨酸；K, Lys--赖氨酸；M, Met--甲硫氨酸；F, Phe-苯丙氨酸；P, Pro--脯氨酸；S, Ser--丝氨酸；T, Thr--苏氨酸；W, Trp色氨酸；Y, Tyr--酪氨酸；和V, Val-缬氨酸。
“类似物”包括具有与本发明RHAMM-结合肽序列基本相同的氨基酸残基序列的任何肽，其中一个或多个残基已被功能类似的残基保守取代和其表现出模拟HA结合肽的能力。
“衍生物”是指一个或多个残基通过功能性侧基反应而化学衍生的肽。这样的衍生分子可包括例如这样的分子：其中游离氨基被衍生而形成胺的盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧基羰基、氯乙酰基或甲酰基。游离羧基可被衍生而形成盐、甲酯和乙酯或其它类型的酯或酰肼。游离羟基可被衍生而形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可被衍生而形成N-im-苄基组氨酸。衍生物还包括含有20种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如: 4-羟脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；同型丝氨酸可取代丝氨酸；和鸟氨酸可取代赖氨酸。
术语“片段”是指所具有的氨基酸残基序列比其氨基酸残基序列已在本文显示的肽更短的任何主题肽。
术语“分离的肽”或“分离的DNA”视情况而定可定义为肽或DNA分子，其可与可天然伴随肽和DNA分子的其它细胞组分基本分离。该术语包括但不限于重组或克隆的DNA分离物和经化学合成的类似物或经异源系统生物合成的类似物。
本文所用的术语“肽”定义为通常具有确定序列的氨基酸残基链。本文所用的术语“肽(peptide)”与术语“肽(peptides)”和“蛋白”互相包含。
在本文件中“RHAMM”是指透明质酸介导的运动性的受体，也称为CD168。RHAMM为非整合细胞表面(CD168)和胞内乙酰透明质酸结合蛋白，其在体外促进细胞运动性并且其表达在侵占性肿瘤中被强烈上调(WO 2008/140587]。
本文所用的术语“RHAMM-结合肽”是指能结合RHAMM的肽。
“受试者”或“患者”是指需要治疗病况、病症或疾病的动物，包括人。
概述
本发明涉及可能够结合RHAMM的肽和编码所述肽的核酸序列。本发明还涉及在可能与RHAMM在细胞中表达相关的疾病、病况或病症的治疗中使用所述RHAMM-结合肽和编码所述RHAMM-结合肽的核酸序列的方法。本发明的RHAMM-结合肽可用于探针，所述探针可能够鉴定表达RHAMM的细胞。本发明还涉及使用RHAMM-结合肽来鉴定可能包含表达RHAMM的细胞的样品的方法。
本发明的优势包括：(a) 已经发现与RHAMM特异性结合的新的小肽；(b) 按照本发明人的了解，肿瘤祖细胞尚不能直接成像。所述新肽可用作分子成像探针，用于对祖细胞状态进行无侵袭性成像；(c)可利用所述新肽特异性结合RHAMM的能力，从而用治疗药剂选择性靶向祖细胞，或者直接通过配体-受体相互作用，或间接通过将治疗性有效载荷递送给靶细胞；(d) 本发明肽与RHAMM的结合增加了表位暴露和抗RHAMM Mab的结合，其可允许增强成像以及治疗性靶向RHAMM阳性细胞。
根据以下详述，本发明的其它特征和优势将会是显而易见的。然而，应当理解，表示本发明实施方案的详述和具体实施例仅通过说明的方式给出，因为根据所述详述，在本发明精神和范围内的各种改变和修饰对于本领域技术人员来说都将是显而易见的。
结合肽
本发明人已经分离、测序和表征了大约6-14个氨基酸残基的新肽。因此，在一个实施方案中，本发明提供编码肽的分离的DNA，所述肽具有选自SEQ ID NO: 1至17的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供包含选自SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的分离的肽。
本发明的新肽可能够结合RHAMM。在本发明的多个方面，本发明的新RHAMM-结合肽可能够特异性结合RHAMM。在本发明的多个方面，本发明的新的RHAMM-结合肽可能够以显著高亲和力结合RHAMM。在本发明的多个方面，本发明的新的RHAMM-结合肽可能够以显著高亲和力特异性结合RHAMM。
在一个实施方案中，本发明的新的RHAMM-结合肽可包含下式(1)的序列：
(1) EEXEEZ(SEQ ID NO: 18)
其中X选自A或G，Z选自Y或E。
在另一个实施方案中，本发明的新的RHAMM-结合肽可包含选自SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 17的序列。
在另一个实施方案中，本发明提供RHAMM-结合肽，其中所述肽选自SEQ ID NOs:1、3、9、10、11、12和14。
在另一个实施方案中，本发明提供RHAMM-结合肽，其中所述肽选自SEQ ID NOs:1、9和14。
在一个实施方案中，本发明的肽可源自微管蛋白的羧基端尾(CTT)区。在另一个实施方案中，RHAMM-结合肽可源自与微管蛋白的CTT区紧邻的序列。意想不到的是，本发明人发现RHAMM与维持有丝分裂纺锤体所必需的蛋白质共享结构和功能相似性。此外，本发明人发现RHAMM的HA结合结构域可显示与许多驱动蛋白和微管相关蛋白(MAP)的微管蛋白结合结构域的序列同源性。微管蛋白的CTT区已经证明与常规驱动蛋白和MAP相互作用。
举例而言，当与染料-缀合的本发明肽一起孵育时，已知表达RHAMM的人乳癌细胞系MDA-MB-231显示出胞内荧光，如图6A和图7所示。用抗RHAMM封闭的细胞的胞内荧光减少大约65%至大约85%，如图6B所示。当与本发明的RHAMM肽一起孵育时，其它表达RHAMM的癌细胞例如PC3mLN4和患者来源的卵巢瘤细胞也显示胞内荧光，如图13和图14所示。
本发明人还发现本发明的RHAMM-结合肽与RHAMM结合可增加表位暴露和抗RHAMM单克隆抗体(mAb)结合。本发明RHAMM结合肽的这种增加向抗RHAMM mab的表位暴露的能力，可在治疗上使用并用于增强成像。因此，本发明的肽可用于例如“活化”现存的RHAMM，例如在肿瘤(但不限于该病)中。因此，可给予治疗的或成像(例如Fab片段)的抗RHAMM mAb并可更有效地靶向表达RHAMM的(肿瘤)细胞。
总的来说，本发明证明了一组RHAMM-结合肽，其在某些方面可衍生自微管蛋白序列的CTT，而在其它方面可基于人工肽序列。
本发明的肽可如下被修饰：在肽的一端或两端添加半胱氨酸残基，从而通过形成二硫键而使肽环化。本发明的肽可通过添加磷基和乙酰基而被修饰。磷酸化是发生在动物细胞中的最常见的蛋白修饰之一[4]。它最常发生在苏氨酸残基、丝氨酸残基和酪氨酸残基上并且在许多细胞过程的调节中起关键作用，所述细胞过程包括：细胞周期、生长、细胞凋亡和分化[4]。该过程是可能的，因为本发明的某些肽含有酪氨酸和因为可将酰基加到N-端氨基酸上[5]。本发明肽中的芳族氨基酸即苯基丙氨酸、色氨酸和酪氨酸可被其它芳族氨基酸取代，以评价它们对肽活性的影响。同样，本发明肽中的脂族氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸可被其它脂族氨基酸取代，以评价它们对肽活性的影响。
本发明肽的长度可以是大约6至大约14个氨基酸和可包含其中的任何长度范围(即6-13、6-12、6-11、6-10、6-9、6-8、6-7、7-13、7-12、7-11、7-10、7-9、7-8、8-13、8-12、8-11、8-10、8-9、9-14、9-13、9-12、9-11、9-10、10-11、10-12、10-13和10-14)，正如本领域技术人员所理解的那样。长度超过大约14个氨基酸的肽也可包括在本发明内。肽的长度仅受其结合RHAMM的能力的限制。本发明的肽也可包括肽的二聚体和三聚体以及额外的稳定的侧翼序列，正如本领域技术人员所理解的那样并描述于例如美国专利号5,824,315和美国专利号6,184,204 (其公开内容通过引用全部结合到本文中)。本发明的多聚体可以是由多个相同的肽组成的同型多聚体或由不同的肽组成的异型多聚体。如所述的，本发明肽的氨基酸序列可侧接随机氨基酸序列。可为优选的是对肽具有稳定作用，因而增加它们的生物利用度的侧翼序列。另外，其它肽模拟物(peptidomimetics)也可用于本发明的肽。本发明的肽也可包括可能已通过例如磷酸化、糖基化、peg化或脂质化而修饰的肽。
此外，本发明的肽也可包括本发明肽的功能上等价的变体或类似物。因此，这可包括但不限于具有部分序列同源性的肽、具有一个或多个特定保守和/或非保守氨基酸改变的肽以及不改变所述肽的生物或结构性质(即结合RHAMM的能力)的肽缀合物。
就功能类似物而言，本领域技术人员完全理解，生物功能肽类似物的定义中所固有的概念是：对于在分子的限定部分内可进行改变的数量存在限制，并且仍然产生具有可接受水平的等价生物活性(在本文的情况下，将包括结合RHAMM的能力)的分子。可以容易地制备具有不同取代的多个独特肽/蛋白并可用于本发明。也可理解，某些残基对于蛋白或肽的生物或结构性质而言特别重要，所述残基例如受体识别区内的残基，其中这样的残基通常可不被交换。
功能类似物可通过保守或非保守氨基酸取代而产生。氨基酸取代通常可根据氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。因此，在本发明的范围之内，保守氨基酸改变是指特定位置上的氨基酸改变，其可以是与原先存在的类型相同：即疏水性氨基酸交换为疏水性氨基酸，碱性氨基酸交换为碱性氨基酸等。保守取代的实例可包括但不限于非极性(疏水性)残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代为另一种氨基酸，一种极性(亲水性)残基取代为另一种(例如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间、甘氨酸和丝氨酸之间的取代)，或者一种碱性残基例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代为另一种，一种酸性残基例如天冬氨酸或谷氨酸取代为另一种，支链氨基酸例如异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸取代为另一种，一种芳族氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸取代为另一种。这样的氨基酸改变可产生功能类似物，其中它们可不显著地改变肽的总电荷和/或构型。这类保守改变的实例是本领域技术人员众所周知的并在本发明范围之内。保守取代也可包括使用经化学衍生的残基代替非衍生残基，条件是所得肽是本发明肽的生物功能等价物。因此，本发明的肽可包括其氨基酸序列不同于SEQ ID NOs: 1-17的肽。本发明的肽也可包括其氨基酸序列因单个突变而不同于SEQ ID NOs: 1-17的肽，其中该单突变代表一个氨基酸缺失、插入或取代。
图10A和图10B，例如，说明了就RHAMM-结合肽SEQ ID NO: 1而言，位置1、3、5、6和11的丙氨酸取代看来不影响取代的RHAMM-结合肽与RHAMM的适当结合。
图17A和图17B，例如，说明了就RHAMM-结合肽SEQ ID NO: 14而言，位置1、4、7、8、11和12的丙氨酸取代看来不影响取代的RHAMM-结合肽与RHAMM的适当结合。
结合肽的制备
本发明的肽可通过本领域技术人员已知方法来制备，最特别且优选的方法是通过化学合成，使用蛋白质化学众所周知的技术，例如固相合成[6, 7, 8, 其通过引用结合到本文中]或在均质溶液中合成[9, 其通过引用结合到本文中]，以产生合成肽。
或者，本发明的肽可通过使用本领域技术人员已知的重组DNA技术来制备。
还考虑的是，本发明包括可包含编码至少一种本发明肽的核酸的载体。
结合肽的分离
可通过测定结合RHAMM的肽的样品，分离RHAMM-结合肽。检测蛋白-蛋白相互作用的任何测定系统或试验方法都可使用，包括但不限于免疫共沉淀、交联以及通过梯度或色谱柱而共-纯化。可测试生物样品和市售文库中的RHAMM-结合肽。例如，带标记的RHAMM可用于探测噬菌体展示文库，正如实施例1中更详细描述的那样。另外，针对本发明肽而制备的抗体可用于分离具有RHAMM-结合亲和力的其它肽。例如，带标记的抗体可用于探测噬菌体展示文库或生物样品。
另外，编码RHAMM蛋白的DNA序列可用于探测生物样品或文库中的编码HA-结合蛋白的核酸。
组合物
在一个实施方案中，本发明提供可包含一种或多种本发明RHAMM-结合肽的组合物，所述组合物用于以适于体内给药的生物相容形式给予受试者。在另一个实施方案中，本发明提供可包含一种或多种RHAMM-结合肽的组合物，所述组合物用于在体外研究样品。可使用的样品包括但不限于细胞、组织和器官。
所谓“适于体内给药的生物相容形式”是指所给予物质的形式，其中疗效比任何毒性效应更重要。可将物质给予任何动物，优选人。治疗活性量的本发明药物组合物或“有效量”的给予，可定义为达到在人体内引发免疫应答所需结果所必需的剂量和时间而有效的量。合适的给药途径可以是肌内注射、皮下注射、静脉内注射或腹膜内注射、口服和鼻内给予。
可接受的载体是本领域技术人员众所周知的并包括例如无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、糊精、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、芝麻油和去离子水。
此外本发明的组合物可包含一种或多种稳定剂，例如碳水化合物(包括山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、糊精和葡萄糖)、蛋白质(例如白蛋白或酪蛋白)和缓冲剂(例如碱性磷酸盐)。此外，本发明的组合物可包含可增强本发明肽的抗细胞增殖性能的一种或多种辅助剂。
注射用组合物可包含(但非排它性地)本发明的肽或核酸以及一种或多种药学上可接受的溶媒或稀释剂，并包含在合适pH和与生理流体等渗的缓冲液中。任何药学上合适的稀释剂都可用于注射用组合物：蒸馏水、生理溶液或盐溶液、和/或缓冲液。注射用组合物可按常规体积-重量方法来制备。可用稀释剂或溶剂将一定量的肽稀释至必要体积。然后溶液可通过无菌滤器过滤，装瓶或装入安瓿(ampouled)。所得溶液可以是稳定的透明液体，并且可不含任何化学物或其它杂质。
检测探针
可用合适探针，对样品(包括但不限于细胞、组织或器官)中的RHAMM表达进行检测。探针可至少包含本发明RHAMM-结合肽和可检测标记。可检测标记可能够通过检测手段而被检测。检测手段可以是对可检测标记可能提供任何可测量反应的任何检测技术。在本发明的多个方面，可以图像形式提供可测量反应。可检测标记可允许使用合适检测手段来检测RHAMM阳性细胞的位置。本发明的探针可允许跟踪RHAMM阳性细胞的运动和显像(development)。因此，在一个实施方案中，本发明的探针可用于但不限于在诊断和预后方法中研究RHAMM阳性细胞。
制备探针的方法是本领域技术人员众所周知的[10, 11, 其通过引用结合到本文中]。
标记方法是本领域技术人员众所周知的。优选的标记可以是适用于体内成像的那些。在检测之前可对抗RHAMM探针进行可检测标记。或者，可使用可结合杂交产物的可检测标记。这类可检测标记可包括但不限于具有可检测的物理或化学性质并且在免疫测定领域内已被良好开发的任何材料。用于本发明的标记可以是可通过检测手段而检测的任何组合物，所述手段包括但不限于光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段。
可用于本发明的标记包括基于生物素的标记、磁标记(例如DYNABEADSTM)、放射性标记(例如3H、11S、32P、51Cr或125I)、荧光标记(例如荧光素、罗丹明、德克萨斯红等)、电子-致密试剂(例如金)、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或ELISA中常用的其它酶)、地高辛配基(digoxigenin)或半抗原以及其抗血清或单克隆抗体可得到的蛋白质(例如可通过将放射性标记掺入本发明肽中而使得本发明肽可检测，并用于检测与肽特异性反应的抗体)。本发明的RHAMM-结合肽可与载体一起提供，例如与牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet haemocyanin)偶联。
可将RHAMM-结合肽与金或聚苯乙烯的微球体、玻片、芯片等固体载体，或与微量滴定板壁共价或非共价偶联。可用标记直接或间接地标记RHAMM-结合肽，所述标记选自但不限于生物素、荧光素和酶例如辣根过氧化物酶。
所用的具体标记对本发明而言并非关键，只要它不干扰RHAMM/RHAMM-结合肽复合物的形成。然而，在一个实施方案中，成像组分可以是放射性核素(例如18F、11C、13N、64Cu、88Ga、123I、111In、99mTC等)，因为SPECT、CT和PET成像等技术容易使用，用于体内检测RHAMM/RHAMM-结合肽复合物和肿瘤祖细胞。用于SPECT或PET成像试剂的合适成像成分的判定也可通过放射性核素是否是由发生器或回旋加速器产生或者是螯合剂或有机/卤化物而确定。图15和图16说明Ga-DOTA缀合的肽SEQ ID NO: 1和Re(CO)3 +-配位的肽SEQ ID NO: 1的合成和质谱表征。
本文所用的直接标记的探针可以是连接可检测标记的探针。因为直接标记已经与探针连接，所以无需后续步骤将探针与可检测标记缔合。相反，间接标记的探针可以是携带了某一部分的探针，所述部分在随后(通常在RHAMM-结合肽与靶RHAMM杂交之后)与可检测标记结合。
在另一个实施方案中，也可制备和使用可识别任何本发明RHAMM-结合肽的单克隆抗体(mAb)，以检测样品中RHAMM-结合肽的存在情况。Mab可提供检测本发明组合物品质的快速而简单的方法。一般而言，制备抗体的方法是众所周知的。例如，产生特异性识别本发明RHAMM-结合肽的mAb的方法是本领域技术人员众所周知的。一般而言，用弗氏佐剂中的肽注射小鼠。在3周时间内注射9次之后，取出小鼠脾脏并重悬于磷酸缓冲盐水(PBS)。脾细胞可作为淋巴细胞来源，其中的一些可产生具有合适特异性的抗体。然后可将这些细胞与永久生长的骨髓瘤伙伴细胞融合，并且可在选择试剂例如HAT存在下将融合产物铺板到多个组织培养孔中。然后筛选各孔，以通过ELISA鉴定那些含有制造有用抗体的细胞。然后将这些细胞用于新鲜铺板。经过生长周期之后，这些孔可再次经筛选而鉴定产生抗体的细胞。可进行若干克隆程序，直到超过90%的孔都含有抗体产生为阳性的单克隆。从该程序中，可建立稳定克隆系，其产生mAb。然后通过亲和力色谱，使用蛋白A或蛋白G琼脂糖而纯化mAb (另见美国专利号4,609,893；4,713,325；4,714,681；4,716,111；4,716,117；和4,720,459)。
结合肽的应用
本发明可包含检测、成像、诊断和治疗性策略，所述策略可包括但不限于用本发明RHAMM-结合肽靶向RHAMM，其可破坏RHAMM/配体复合物的形成，并可起到刺激配体-RHAMM介导的细胞运动性反应的作用。这些方法可与治疗病原性病况、炎症和病原性感染相关的病症的其它已知疗法联用。
阳性细胞的检测
参考图9，本发明的RHAMM-结合肽已经证明在生物环境中具有适度稳定性(大约110至大约250分钟的半衰期)，这足够长，有利于体外或体内成像。
在本发明的一个实施方案中，RHAMM-结合肽可用于鉴定 RHAMM阳性细胞的方法。鉴定RHAMM阳性细胞的方法可包括使细胞接触本发明探针并应用合适的检测技术来检测细胞中的可检测标记。根据用检测技术对可检测标记进行检测，可确定对RHAMM阳性细胞的鉴定。
在另一个实施方案中，提供了在受试者组织或器官中检测RHAMM表达的方法。所述方法可包括：(a)将本发明的探针给予受试者；(b)应用检测技术来检测受试者组织或器官中的标记。
因为致瘤祖细胞可通过RHAMM表达而得以表征，在另一个实施方案中，本发明的RHAMM-结合肽可用于确定样品例如肿瘤活检中是否可能包含致瘤祖细胞的诊断方法，致瘤祖细胞可使癌症患者处于发展转移的风险之中。一种这样的诊断方法可包括使用一种或多种RHAMM-结合肽来检测样品中RHAMM的存在情况。RHAMM阳性样品可表示该样品中含有癌症祖细胞。
依照本发明的一个实施方案，诊断癌症患者的方法可包括：(a) 从所述患者获取组织样品；(b) 使所述样品与本发明的探针接触；(c) 应用检测技术以在所述样品中检测探针的可检测标记。样品中RHAMM表达的检出可表示癌症诊断。
依照本发明另一个实施方案，诊断癌症患者的方法可包括：(a) 将本发明的探针给予受试者；和(b) 应用检测技术以在受试者的组织或器官中检测探针的标记。受试者中RHAMM的检出可表示癌症诊断。
依照本发明另一个实施方案，确定癌症患者的预后的方法可包括：(a) 从患者获取肿瘤组织样品；(b) 使所述样品与本发明的探针接触；(c) 应用检测技术以在所述样品中检测探针的标记；和(d) 确定患者的预后。预后可预测患者的癌症侵占性或转移的可能性。样品中RHAMM表达的检出可表示不良预后。
在另一个实施方案中，本发明提供确定癌症患者的疗程的方法。所述方法可包括：(a) 从患者获取肿瘤组织样品；(b) 使所述样品与本发明的探针接触；(c) 应用检测技术以在所述样品中检测探针的标记；和(d) 确定患者的预后。预后可预测患者的癌症侵占性或转移的可能性。因此，样品中可测量RHAMM表达的检出可表示不良预后；并根据预后而确定用于患者的疗程。
在本发明诊断和预后方法的一方面，可将样品中的RHAMM表达与已知阴性对照或已知标准进行比较。相对于阴性对照或已知标准而言，样品中可测量RHAMM表达的检出可表示：样品中RHAMM的存在，癌症的诊断，或不良预后，视情况而定。
图6和图7说明使用荧光素-缀合的RHAMM-结合肽SEQ ID NO: 14 (图6A；SEQ IDNO: 35)和SEQ ID NOs: 1和9 (图7；SEQ ID NOs: 25和29)，人乳癌细胞的显现。
图13说明使用荧光素-缀合的RHAMM-结合肽SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 25)，人卵巢癌细胞的显现，而图14表明使用荧光素-缀合的RHAMM-结合肽SEQ ID NO: 9 (SEQ 1DNO: 29)，人前列腺癌细胞的显现。
如图14所说明的，侵占性侵袭和转移的PC3mLN4人前列腺癌系对于荧光染色是强阳性，表示HA肽模拟物SEQ ID NO: 9的快速摄取。
本发明RHAMM-结合肽的细胞摄取可被特异性抗RHAMM mAb封闭，但不被特异性抗CD44 mAb封闭，但后者可封闭HA与CD44的结合(参见图6, 7, 13和14)。这些结果可表明本发明的HA肽模拟物可通过RHAMM依赖性机制与前列腺癌细胞、乳癌细胞和卵巢癌细胞缔合并被这些细胞所摄取。
治疗药
参考图9，本发明的RHAMM-结合肽在生物环境中可具有显著稳定性(substantialstability) (大约110至大约250分钟的半衰期)，这可为足够长，有利于将它们用于治疗性方法。
本发明的RHAMM-结合肽可用于在哺乳动物中预防或治疗涉及细胞运动性的病理性病况例如癌症、炎性和自身免疫病症和组织创伤及其恢复相关的纤维化病症。
本发明的RHAMM-结合肽可用于通过破坏所述RHAMM/配体复合物的形成而治疗RHAMM/配体复合物的形成所致的病症或病况的组合物和方法。
在一个实施方案中，本发明可提供用于治疗可能患有RHAMM在细胞中表达相关的病症或病况的受试者的方法。所述方法可包括至少给予所述受试者有效量的组合物，所述组合物包含有效量的一种或多种RHAMM-结合肽或编码所述一种或多种RHAMM-结合肽的核酸分子和药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，本发明提供预防或减少组织瘢痕形成的方法。所述方法可包括至少给予有需要的受试者有效量的一种或多种RHAMM-结合肽或编码所述一种或多种本发明RHAMM-结合肽的核酸分子。
RHAMM-结合肽抑制癌细胞增殖的能力可涉及它们在预防肿瘤转移中的有效性和它们作为癌症化疗药剂的效用。因此，本发明提供预防或减少肿瘤转移的方法，所述方法包括将有效量的RHAMM-结合肽或编码本发明的RHAMM-结合肽的核酸分子给予有需要的受试者。
因此，本发明的RHAMM-结合肽可用于治疗RHAMM表达相关的癌症，包括但不限于肺癌、胃肠癌、乳癌、膀胱癌、皮肤癌(黑素瘤和非黑素瘤)、脑癌、宫颈癌和白血病。因此，本发明可提供在受试者中预防或治疗癌症的方法。该方法可包括至少给予有需要的受试者有效量的一种或多种RHAMM-结合肽或者编码所述一种或多种本发明RHAMM-结合肽的核酸分子。
在一个实施方案中，本发明的RHAMM-结合肽可与现有疗法联用，以降低RHAMM表达相关病症或病况例如癌症的患者的发病率和死亡率。因此，在本发明的一个实施方案中提供的是用于在患者中治疗RHAMM表达相关病症或病况的方法。所述方法可包括至少给予受试者本发明的RHAMM-结合肽并联合用于所述RHAMM相关病症的至少一种其它疗法。RHAMM-结合肽和至少一种其它疗法的联用可增加疾病治疗的功效。例如，就癌症治疗而言，也可给予受试者可能够显著降低血管生成的疗法，例如小分子药物、siRNAs、反义疗法(antisensetherapy)或其任何组合，其可靶向一种或多种生长因子(其可作为血管生成的开关)，并为滋养层和内皮细胞提供增殖信号。生长因子对于多种癌症的生长和存活而言可能是需要的并且对癌症进展而言可能是必需的。因此，可将使用RHAMM-结合分子的本发明抗癌方法与靶向一种或多种生长因子(包括VEGF、FGR和hCG)的疗法联合。也可将本发明的RHAMM-结合肽与放疗或化疗联合。这样的联合疗法促进治疗癌症的协同作用。
本发明人已经证明，例如，本发明的RHAMM-结合肽可能够抑制人上皮卵巢癌(EOC)细胞的增殖(参见图11)。本发明人也已证明本发明的RHAMM-结合肽可能够降低人EOC细胞的活力(参见图12)。
通过如上所提出的方法鉴定癌症祖细胞，本发明的检测方法可允许开发新的治疗药，以选择性杀伤这些祖细胞或迫使其末端分化。例如，本发明的技术可用于可含有高度致瘤的祖细胞亚类的肿瘤的体内成像，其可允许选择性治疗具有转移风险的患者，相对于没有风险的患者而言。最重要的是，本发明的技术可用于将抗癌药递送给原发性癌症例如乳癌中存在的高度致瘤的祖细胞亚类。例如，可将肽与细胞毒剂缀合，以使得能够将细胞毒剂靶向递送至表达RHAMM的细胞。通过同样的机制，其它治疗实体的递送也是可能的，包括但不限于烷化剂、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、激素治疗药、核苷类似物或其前体药物。此外，可预见放疗药，其中可将本发明的RHAMM-结合肽与发射粒子的放射性核素连接，从而提供将细胞破坏性实体选择性递送给RHAMM阳性细胞的机制。治疗性放射性核素可包括发射β的放射性核素，例如90Y或186Re；发射β/γ的放射性核素，例如47Sc、153Sm、177Lu或186Re；发射α的放射性核素，例如213Bi、223Ra或225Ac；或发射Auger的放射性核素，例如67Ga或111In。
给药和剂量
可采用本领域已知的任何途径将本发明的探针和/或肽直接给予哺乳动物受试者，所述途径包括但不限于例如注射(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内或皮内)、吸入、透皮施用、直肠给药、鼻内或口服给药。在一个实施方案中，可经皮下给予本发明的检测探针和/或肽。在另一个实施方案中，可经静脉内给予本发明的检测探针和/或肽。在另一个实施方案中，有效量的探针或RHAMM-结合肽可通过非系统性的局部给药而给予，例如通过外周给药，包括外周肌内、腺体内和皮下给药途径，并且允许探针和/或肽在体内经数小时而携带到具有表达RHAMM的细胞和致瘤性细胞群体的位点。
本发明的另一实施方案可以是通过可植入装置来给予RHAMM-结合肽。在本发明的多个方面，可植入装置可能够控制RHAMM-结合肽的释放。
可按上文所述，全身性提供本发明的RHAMM-结合肽。正如本领域技术人员所理解的那样，本发明的RHAMM-结合肽可用在常规脂质体、特化脂质体、脂质制剂和免疫脂质体中。
脂质体可以是单层或多层并可由选自以下的组分形成：磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱及其组合。多层脂质体可包括组成与单层囊泡类似、但可经制备从而产生多区室的多层囊泡，其中包埋银组分/溶液或乳液。另外，其它辅助剂和改性剂也可包入脂质体制剂中，例如聚乙二醇或其它材料。
虽然脂质体制剂可包括二棕榈酰磷脂酰胆碱:胆固醇(1:1)，但本领域技术人员了解，任何数量的脂质体双层组合物都可用于本发明的组合物。脂质体可通过各种已知方法来制备，例如公开于以下文献中的那些方法：美国专利号4,235,871和RRC, Liposomes: APractical Approach, IRL Press, Oxford, 1990, 第33-101页，其通过引用结合到本文中。
含有RHAMM-结合肽的脂质体可具有修饰，例如具有与脂质体外部结合的非聚合物分子，例如半抗原、酶、抗体或抗体片段、细胞因子和激素和其它小蛋白、多肽或非蛋白分子，所述分子赋予脂质体所需的酶促或表面识别特征。优先将脂质体靶向特定器官或细胞类型的表面分子包括例如能将脂质体靶向带有特定抗原的细胞的抗体。将所述分子偶联的技术是本领域技术人员众所周知的(参见例如美国专利号4,762,915，其公开内容通过引用结合到本文中)。或者，或同时，本领域技术人员将会理解，携带正或负净电荷的任何数量的脂质都可用于改变脂质体膜的表面电荷或表面电荷密度。
脂质体也可掺入热敏性或pH敏感性脂质作为脂质双层的组分，以提供脂质囊泡膜的控制降解。
在本发明上下文中，给予患者的剂量可以是对RHAMM/RHAMM-结合配体复合物和致瘤细胞群体的位置有效成像并具有足够特异性的合适剂量，从而使外科医生可进行活检或其它程序以除去通过对RHAMM/RHAMM-结合肽复合物成像而检测的致瘤细胞群体。该剂量可根据所用的具体载体(例如肽或核酸)的功效和患者状况、以及所治疗患者的体重或表面积而确定。剂量大小也可根据在具体患者中伴随给予探针的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定。
对于给药，本发明检测探针可以由多肽或核酸的LD-50和不同浓度的多肽或核酸的副作用确定的比率给予，当考虑到患者的整体(mass)和总体健康时。可通过单次或分次剂量来完成给药，例如定期(例如每天)并持续一段时间(例如2、3、4、5、6天或1-3周或更长)给予的剂量。
在又一些实施方案中，可用公认的临床标准和实践，将大约5至大约2000 LD 50单位的标记的探针给予所述受试者。
以上公开内容一般性地描述了本发明。参考以下具体实施例可获得更完整的理解。这些实施例仅以说明的目的而描述，并非意欲限制本发明范围。当情况可暗示或使得有利时，考虑了形式上的改变和等价物取代。
尽管本文使用了具体术语，但这样的术语旨在描述性意义而非限制性目的。
实施例
实施例是为了说明的目的而描述并且不得视为限制本发明的范围。
实施例1 - BLAST搜索和序列比对
在基本搜索比对搜索工具(BLAST)中使用对应于RHAMM (SEQ ID NO: 19)的HA-结合结构域(aa 718-750)的查询序列，以搜集显示序列同源性的蛋白列表。图1 B说明分子成像探针设计和优化的流程图。HA-结合结构域用作BLAST中的查询序列，以确定同源蛋白序列。然后，阐明同源序列的推定的结合配偶体(配体)。根据截短的配体序列合成肽文库并用表面等离振子共振(SPR)结合测定进行筛选，以确定高亲和力配体。再用多种体外结合测定进一步评价候选肽配体。
RHAMM和MAP的微管结合结构域和驱动蛋白间的成对比较揭示出与RHAMM的HA结合结构域的适度序列同源性(使用ClustalX2 计算出大约17-24%[12])；然而，MAP和RHAMM在它们的微管蛋白结合位点的氨基酸序列方面共享类似的理化性质。换句话说，RHAMM和MAPS都具有推测与微管蛋白结合的碱性残基段(stretch)。
此外，MAP的微管蛋白结合位点和RHAMM的乙酰透明质酸结合位点的二级结构具有同样的螺旋程度并且都可以归类为碱性-拉链结构域[13]。
据报道RHAMM使用通用结合位点与胞外表面的HA和胞质溶胶中的微管缔合[14]。因为微管相关动力蛋白和MAP表现出与微管蛋白的CTT直接结合，所以本发明人假设RHAMM可显示与代表不同微管蛋白亚类的CTT的合成肽的直接相互作用。因为HA与RHAMM主要通过其带负电荷基团与RHAMM上的正电荷基团之间的离子相互作用而相互作用，所以具有类似的负电荷分布的分子原则上可作为HA模拟物。
例如，微管蛋白CTT上的Glu残基和Asp残基可模拟HA上的羧酸基。因此，合成CTT与RHAMM的HA结合结构域的结合可利用被认为对于HA结合而言重要的相同带电荷侧链。
实施例2 - 针对RHAMM的微管蛋白-衍生的肽的筛选
材料：所有溶剂无需进一步纯化就可使用，并且都购自VWR、Fisher Scientific或Sigma Aldrich。对于肽合成，芴基甲氧基羰基(Fmoc) Rink amide MBHA (100-200目)树脂、Fmoc氨基酸、Fmoc-保护的氨基己酸(Fmoc-Ahx)和HBTU (六氟磷酸2-(1H-苯并三唑1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓)偶联剂得自Peptides International。N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(磺基-NHS)、异硫氰酸荧光素(FITC)异构体I和胎牛血清(FBS)都购自Sigma Aldrich。NHS-生物素得自Nova BioChem。抗体例如抗RHAMM (Santa Cruz Biotechnology, USA)、抗CD44 (Pharmigen)和IgG ab(Santa Cruz Biotechnology USA)都市购获得。
肽合成：使用固相肽合成，按照Fmoc方案，合成17种肽，其具有对应于不同微管蛋白亚类的CTT和H12区的12个氨基酸残基。
在rink amide MBHA树脂(0.1 mmol)上进行肽链延伸，使用自动化(APEX 396自动合成仪)和/或手动方法，使用标准固相肽合成，包括Fmoc脱保护和氨基酸偶联循环，每次循环用Kaiser试验进行监测[15, 16]。在整个合成中重复进行Fmoc脱保护(15和20分钟周期)，使用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20%哌啶溶液。以30分钟和90分钟间隔使用0.05 M或更高浓度的Fmoc-保护的氨基酸和HBTU, 5当量N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)/DMF，进行所有氨基酸偶联。每次脱保护和偶联步骤之后，树脂都用DMF (3x)和二氯甲烷(DCM) (3x)重复洗涤。使用同样参数偶联Fmoc-Ahx。进行氨基端酰化(15和10分钟)，使用10%乙酸酐/DMF，接着Fmoc脱保护。进行荧光素偶联，即通过使肽的氨基与FITC荧光染料(4当量)/DMF和DIPEA(2当量)反应4小时。
使用94% v/v三氟乙酸(TFA)、1% v/v三异丙基硅烷(TIPS)、2.5% v/v H2O和2.5%v/v 1,2-乙烷二硫醇(EDT)的溶液，对含半胱氨酸的肽进行完全脱保护，达1.0-1.5小时。使用88% V/v TFA、5% v/v水、5% m/v苯酚、2% v/v TIPS的溶液，对所有其它肽进行完全脱保护，达2-4小时。收集滤液，用冷的叔丁基甲醚沉淀并通过在3000 rpm在-5℃离心10分钟而沉淀。再将沉淀物溶于蒸馏的去离子水并冻干，得到固体粉末。
蛋白纯化: 通过反相HPLC将本项研究中所用的所有肽都纯化至纯度大于92%并通过ESI质谱来表征。
对肽进行纯化，使用由H2O + 0.1% TFA (溶剂A)和CH3CN + 0.1% TFA (溶剂B)组成的梯度溶剂系统，对分析型和制备型HPLC分别以线性流速1.5 mL/min和20 mL/min。使用Grace Vydac蛋白/肽RP-C18柱(4.6 mm x 250 μm, 5 μm)，进行分析型HPLC，并使用GraceVydac蛋白/肽RP-C18柱(22.0 mm x 250 mm, 10 μm)，进行制备型HPLC。使用Waters 2998光电二极管阵列检测器，在220 nm和254 nm波长处检测吸光度。纯化期间，收集各流分，冻干并通过ESI-MS (Waters Micromass Quattro MicroTM API)分析。
从携带重组质粒pPAL7-RHAMM的大肠杆菌BL21 (D3)菌株中分离重组蛋白RHAMM-CT (一种截短的RHAMM，仅对应于含有HA结合结构域的羧基端，氨基酸706-766, 序列:RDSYAQLLGH QNLKQKIKHV VKLKDENSQL KSEVSKLRSQ LVKRKQNELR LQGELDKALG I, M.W. 7.1kDa, pI = 10.1；SEQ ID NO: 20)。将细菌在含氨苄青霉素(100 μg/ml)和0.5 %葡萄糖的LB培养基中在37℃培养过夜，让其生长到对数期中期。用2 mM IPTG在37℃诱导重组 RHAMM基因表达，持续4小时，然后通过在10,000 x g离心20 mm收获细菌细胞。
将细菌细胞重悬于裂解缓冲液(由0.2 M磷酸钠、0.2 M乙酸钾、1% triton X-100和0.1 %蛋白酶抑制剂, pH = 7.0组成)，超声处理(60 s, 10 s/脉冲)并离心(4℃, 12000x g, 20 mm)。将所得上清液移至干净管中并过滤(使用0.45 μm滤器)。用Profinity eXact(Blo-Rad, USA) 亲和力树脂，依照制造商方案，对eXact标签的-重组 RHAMM进行纯化。对于本实验，将裂解液上样到填装有Profinity eXact 亲和力树脂(4 mL树脂, 柱15 x 1.5cm)并用洗涤缓冲液(0.2M磷酸钠, pH 7.0)平衡的重力柱。该柱用洗涤缓冲液洗涤以除去杂质，然后用洗脱缓冲液(由0.2 M磷酸钠、0.1 M氟化钠, pH 7.0组成)洗脱重组 RHAMM。然后使用Millipore滤器在由0.2M磷酸钠和0.2 M乙酸钾组成的缓冲液(pH = 7.0)中，对蛋白进行透析和浓缩(Millipore, USA, 截止3 kDa)。所分离蛋白的纯度在1D SDS-PAGE上得以证实。使用抗RHAMM抗体，通过蛋白质印迹分析，对RHAMM进行鉴定和证实。
SPR (表面等离振子共振)筛选测定: ProteON XPR36系统用于针对RHAMM而对不同微管蛋白衍生的肽进行选择和分级。对于RHAMM的固定，通过胺偶联，使用100 mM EDAC和24 mM磺基-NHS使ProteON GLC传感器芯片表面活化。以30 μl/mm的流速注射RHAMM (30 μg/mL的碳酸氢钠缓冲液, pH 9.7)。将缓冲液样品注入不同传感器板上，用作参考。然后注射乙醇胺HCl (1M, pH 8.5)以使任何剩余表面基团失活。在3分钟内，以50 μL/min将肽(在PBS-T中的10 μm, 2% DMSO)注射到RHAMM功能化表面，接着是10分钟的解离(即注射PBS-T缓冲液)期。用两次注射30 μL 1M NaCl使表面再生，然后再注射下一种肽。在所有实验中，使用得自参考板(无RHAMM)和RHAMM功能化板的数据，减去参考。
使用荧光素-标记的肽的竞争性ELISA实验：进行ELISA，以测试FITC-标记的微管蛋白-衍生的肽与HA竞争RHAMM结合位点的能力。将重组RHAMM (0.05M PBS中的100 μL、10μg/mL, pH = 9)固定在96-孔ELISA板(终浓度1 μg/孔)并在4℃孵育过夜，得到最终蛋白量1 μg/孔。各板用(0.05%) PBS-吐温-20缓冲液(200 μL/孔)洗涤3次，用封闭缓冲液(5% 200μL/孔, PBS-吐温-20/孔)洗涤，然后在室温下孵育1小时。如上所述洗涤3次之后，将FITC-标记的微管蛋白衍生的肽(终浓度1 μg/mL)和HA (100 μL/孔, M.W. 220 kDa, PBS中的10μg/mL, 进行系列稀释，得到HA＝1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)加入各板并在4℃孵育过夜。如上所述洗涤各板，然后在485/535 nm处测量吸光度。
使用荧光素-标记的RHAMM的竞争性ELISA实验：进行ELISA，以测试无标记的微管蛋白-衍生的肽与染料(Alexa Fluor 647)-缀合的HA竞争RHAMM的能力。将RHAMM (100 μ1,10 μg/mL的0.05 M PBS, pH = 9)固定在96-孔 ELISA板(以达到最终量1 μg/孔)并在4℃孵育过夜。各板用(0.05%) PBS-吐温-20缓冲液(200 μL/孔)洗涤3次，再与封闭缓冲液(200μ1/孔, 5 %吐温-20的PBS)在室温下孵育1小时。用(0.05 %) PBS-吐温-20缓冲液洗涤3次之后，将微管蛋白-衍生的肽(10 μg/ml)和HA-缀合的Alexa Fluor 647(100 μg/孔, M.W.220 kDa, PBS中的10μg/ml)加入各板并在4℃孵育过夜。阴性对照板接受无染料-缀合的HA并且所有实验都一式三份地进行。如上所述地洗涤各板，然后在650 nm处测量荧光。
SPR (表面等离振子共振)结合测定：肽筛选之后，GWC SPRimager®系统用于测定结合动力学常数。将milliQ水中的1 nM浓度含Thiol肽固定在马来酰亚胺-功能化的镀金芯片上达3小时。用milliQ水洗涤除去过量肽。对于结合研究，将一系列浓度(500 nM、750 nM和1000 nM)的RHAMM注射到固定化肽。15 min解离期之后，通过用2次10 min脉冲注射(以100 mL/min)再生缓冲液(2 M NaCl的HBS-EP, pH 7.4)的处理，使传感器芯片表面再生，用于下一种肽样品注射。再生步骤之后，基线回到起始值，证实所有结合的分析物都除去。分析数据并通过非线性回归拟合到Langmuir结合模型获取相应的解离常数(kD)[17]。在所有实验中，使用得自参考板(无肽)和肽功能化板的数据，减去参考。
血清稳定性研究：评价微管蛋白CTT在血清中的稳定性达11小时。将每种肽与预热(37℃, pH 7.3 ±0.1)胎牛血清(FBS)混合，(最终样品体积3 mL，肽浓度15 μm)。记录开始时间，并在每个30分钟时间点，从反应混合物中取出40 μL等分试样并通过C18 反相(C18Sep-Pak©)柱。用3 mL含0.1% TEA的乙醇(70% v/v)将肽从柱上洗脱下来，冻干并用分析型RP-HPLC (Grace Vydac蛋白/肽RP-C18柱4.6 x 250 mm, 5 μm)进行分析。该系统所用的流动相是0.1% TFA的水(洗脱液A)和0.1% TFA的CH3CN (洗脱液B)。对于每种肽样品，使用在20分钟内流速1.5 ml/min的10-95%洗脱液B的线性梯度。使用Waters 2998光电二极管阵列检测器，设置在220和254 nm处，检测%完整肽并用ESI-MS鉴定。用GraphPad Prism 5.01版测定肽的半衰期。
细胞摄取研究：将对RHAMM-CT显示出高亲和力的候选肽与荧光染料(FITC)缀合，并使用细胞荧光成像测定评价它们对表达RHAMM的癌细胞(MDA-MB-231)的特异性。
将MDA-MB-231细胞在DMEM培养基和10% FBS中培养至90%汇合。然后将细胞接种在2 x 24-孔组织培养板中的盖玻片(12 x 12 mm, 包被有50 μg/ml纤连蛋白)上(20000/孔的汇合)，接种之后一天。用DMEM + 0.1% FCS在37℃过夜，进行饥饿步骤。然后吸出培养基并用DMEM + 0.1% FCS在37℃漂清过夜。细胞用3% BSA的DMEM + 0.1% FCS在室温下封闭1小时。对于封闭实验，加入抗体(稀释度1:100, 小鼠 IgG ab, 山羊, 抗RHAMM mAb, 或小鼠抗CD44 mAb的DMEM + 0.1% FCS培养基)并在37℃孵育1小时。用抗小鼠 IgG封闭的细胞作为阳性对照，因为该抗体显示出对RHAMM无结合亲和力。
然后吸出所得培养基，细胞用DMEM + 0.1% FCS在RT洗涤。加入荧光素-缀合的肽(50 μg/mL)并在37℃孵育30分钟。细胞用DMEM + 0.1% FCS洗涤，再用PBS (pH = 7.6)洗涤。然后使用含Fluoro-gel 11的DAPI (Electron microscopy sciences, USA)，通过制造商方案将细胞封固。用Olympus FluoView FV1000偶联的Motorized Inverted SystemMicroscope对细胞进行摄影。使用ImageJ (v1.42q)软件分析Tiff图像。将每幅图像转化为8-bit格式并经受阈值20和255。选择对应于细胞体(n=15)的目标区(ROI)。再用8 bit所获数据计算每一ROI的平均荧光。用Prism (GraphPad Software, San Diego, USA)统计程序，用单向ANOVA，分析数据。
结果
针对RHAMM，筛选微管蛋白-衍生的肽：
图2 A显示未经修饰的微管蛋白-衍生的肽(图2 A a)、以及与N-乙酰半胱氨酸(图2 Ab)和异硫氰酸荧光素缀合的肽的通用结构(图2 A c)。图2 B是描述为本研究而制备的所有17种肽的表。17种合成肽的序列包括不同微管蛋白亚类的CTT以及直接侧接(SEQ IDNOs: 6、7和8)和的序列(SEQ ID NOs: 13和14)。一个6碳接头用于增加肽和额外肽修饰之间的距离。图2 B也包括衍生的肽。制备衍生的肽，其具有荧光素(图2B的肽1c、3c、9c、11c、12c、14c；SEQ ID NOs: 25、27、29、31、33和35)或N-乙酰半胱氨酸修饰的N-端(图2B的肽1b、3b、9b、11b、12b、14b；SEQ ID NOs: 24、26、28、30、32和34)。
所有肽都通过ESI+质谱来表征并通过反相HPLC来分析其纯度。图2 B是说明使用ESI-MS和RP HPLC，分析17种合成的微管蛋白-衍生的肽的表。计算的和实测的m/z值基于经ES1测定的所观测到的明显信号。%纯度经RP HPLC测定，在220 nm处检测。
基于SPR (表面等离振子共振)的筛选方法用于快速而准确测定能识别RHAMM的HA-结合结构域的潜在候选肽。筛选17种微管蛋白-衍生的肽，所得传感图用于推测显示出对RHAMM的亲和力的肽。筛选之前，测定配体固定(在该情况下是RHAMM)到传感器板的最佳条件。固定缓冲液的最佳pH平衡蛋白与传感器板的静电引力，同时使蛋白失活减至最小。在本研究中，用于固定的最佳pH经测定是产生最高配体密度的pH。使用不同pH的碳酸氢钠缓冲液，流速30 μL/min和固定浓度的EDAC和磺基-NHS，将RHAMM偶联到传感器板。根据6次测量的平均SPR反应测定各pH固定条件的RHAMM配体密度，并且最大配体固定发生在pH 9.7(图3 A)。配体固定稍低于pH 10.1，部分地因为RHAMM上的净电荷在其等电点损失。
RHAMM在SPR传感器芯片上固定之后，将一系列微管蛋白衍生的肽进行注射。肽与RHAMM的缔合进行3分钟并且在无分析物缓冲液中进行解离10分钟。图3 B显示在浓度为10μm时得到的实验传感图。对于每次肽注射，从试验传感图中减去对照传感图(未固定的RHAMM和缓冲液注射)，并在下一次肽注射之前使芯片表面再生，以除去任何残余的结合肽。对17种肽进行筛选得到对RHAMM显示出亲和力增加的6种肽，即：1a (SEQ ID NO: 1)、3a(SEQ ID NO: 3)、9a (SEQ ID NO: 9)、11a (SEQ ID NO: 11)、12a (SEQ ID NO: 12)和14a(SEQ ID NO: 14)。
固定化微管蛋白衍生的肽对RHAMM的亲和力：对以上部分得到的这6种肽与RHAMM的结合进行定量测定。截短研究表明CTT (即S-肽最后12个羧端残基)足以诱导MAP-指导的微管装配[18]，因此将通过接头部分间隔的标记放在CTT的氨基端，不会影响肽-蛋白相互作用。将肽固定在传感器板并使不同浓度的RHAMM流过衍生的表面，恒定流速100μL/min。图4 A描述所得传感图。同样，每幅传感图都通过从参考传感图(数据得自无固定化肽的传感图)中减去各曲线而得以校正，以说明运行缓冲液和样品溶液之间的折射指数差异。
用得自动力学模型的曲线拟合实验传感图，用于1:1 Langmuir结合模型。图4 B的表中给出了得自不同 RHAMM浓度的6种肽的KD平均值以及相应的标准误差。作为阳性对照，也测量了抗RHAMM mAb的动力学概况，结果显示对RHAMM的5.53 nM 亲和力。肽SEQ ID NO:1 (KD = 24 nM), SEQ ID NO: 9 (KD= 32 nM)和SEQ ID NO: 14 (KD = 30 nM)显示出在低纳摩尔范围内的解离常数，表明对RHAMM的高亲和力。
还使用ELISA测量了6种肽的每一种的相对结合亲和力。在该测定中，肽用荧光素标记，通过加入氨基己酸接头而使染料远离肽。如图3 C所示，ELISA结果也表明肽SEQ IDNOs: 1、9和14在所有浓度时都具有最高相对结合亲和力。可能的是，肽的荧光团修饰可对配体-RHAMM相互作用或对非特异性结合有影响，因此SPR和ELISA结果可能并不准确匹配。
微管蛋白-衍生的肽被HA竞争性置换：进行竞争性ELISA，以测定肽对RHAMM的HA结合结构域的选择性。在该测定中，使用荧光素-标记的肽并评价未标记的HA封闭肽与RHAMM结合的有效性。将荧光素-标记的肽SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14，对应于图2B中的肽1c、3c、9c、11c、12c和14c (SEQ ID NO 25、27、29、31、33和35)加入到含固定化RHAMM的ELISA板，然后加入不同浓度的HA，其是RHAMM的天然配体。可见所观测的荧光减少，因为HA置换了荧光素-标记的肽，如果它们竞争同一结合位点的话。图5 A显示肽与RHAMM的结合被HA竞争性置换，并在所有6种配体中都观测到随着HA竞争者浓度增加，荧光的浓度依赖性减少，其中最有效的相对置换发生在荧光素-标记的肽SEQ ID NOs: 1、12和14 (SEQ ID NOs: 25、33和35)，尽管SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 29)的肽也被置换。
设计出备选的竞争性实验，进一步评价肽配体，因为荧光素标记的存在可能影响这些低分子量肽的物理性质和所得结合潜力。使用ELISA，未标记的肽SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14 (对应于图2B的肽1a、3a、9a、11a、12a和14a)用于与染料-标记的HA竞争。本测定消除了如下所致的混杂结果：染料标记和蛋白之间的相互作用或者因大量染料加入到肽配体中所导致的亲和力变化。如图5B所示，因荧光信号减少而容易观测到标记的-HA被无荧光的微管蛋白衍生的肽置换。未标记的RHAMM配体或荧光素-标记的配体SEQ ID NO: 14和未标记的RHAMM配体或荧光素-标记的配体SEQ ID NO: 9尤其显示出能够一贯性地与HA竞争结合，因此支持了以下观点：在肽的氨基端上的进一步修饰对与RHAMM的结合几乎无影响。然而，与SEQ ID NO: 1的未修饰肽相比，含有序列SEQ ID NO: 1的荧光素-标记的α1a-CTT(肽1c；SEQ ID NO: 25)，似乎更好地与HA竞争。
对RHAMM和CD44的特异性：先前的结果表明这些肽可能够靶向RHAMM的HA结合结构域。然而，为了显示这些HA模拟物是特异性靶向RHAMM的，有必要测试所述肽对其它透明质酸粘素(hyaladerin)例如CD44的亲和力。为此，用CD44功能化表面进行固相肽结合测定(ELISA)，其在图5 C中说明。如上所述，SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14 (SEQ ID NOs: 25、27、29、31、33和35)的每种FITC-缀合的肽与每一种透明质酸粘素(RHAMM或CD44)孵育，并在充分洗涤方案后记录所得荧光测量。正如所料，产生自RHAMM和荧光素-肽的荧光测量显示最高信号，并且在加入HA之后，观测到荧光明显减少。相反，如荧光所表明的CD44和荧光素-肽相互作用，显著更低并且在加入HA之后未显示出预期的荧光测量的下降。因此，肽的结合是由与RHAMM的特异性相互作用所致，而它们显示出与CD44有限的相互作用。
血清稳定性：为了测试它们作为靶向实体或治疗药的潜力，需要研究RHAMM-结合肽在生物环境中的稳定性，在11小时的时间内评价了肽SEQ ID NOs: 1、3、9、11、12和14的每一种的体外血清稳定性，并且用RP-HPLC对剩余完整肽进行定量测定。在本测定中，在37℃让肽经受胎牛血清，以30分钟间隔取出等分试样。在每个时间点，通过用三氟乙酸(TFA)沉淀血清蛋白而终止反应，并用离心以获取含肽的粗制溶液。将溶液通过C18反相柱(C18Sep-Pak©)，以除去低分子量杂质。从柱子上洗脱完整肽，冻干并分析。如图9所示，未经修饰的RHAMM-结合肽表现出血清稳定性，且合理半衰期为大约 2-4小时。
细胞荧光测定(MDA-MB-231摄取研究)：为了测定本发明微管蛋白衍生的肽对表达RHAMM的细胞的特异性以及它们作为靶向实体的潜力，使用经抗RHAMM抗体处理的MDA-MB-231细胞，进行细胞荧光测定。MDA-MB-231乳瘤细胞系显示出RHAMM受体的高表达，因此该细胞系是评价合成微管蛋白肽的靶向和特异性的理想选择。将MDA-MB-231细胞与荧光素-缀合的肽SEQ ID NOs: 1、9和14 (SEQ ID NOs: 25、29和35)一起孵育，并且测量细胞对探针的摄取。如图6A (对于SEQ ID NO: 35)和图7 (对于SEQ ID NOs: 25和29)所说明的，对于所有测试的肽，在未接受封闭处理的细胞以及在与非特异性抗体(lgG抗体)一起孵育的细胞中观测到荧光信号的积累，表明对荧光标记的探针的高摄取。有趣的是，用抗CD44封闭的细胞显示出无信号降低。然而，用抗RHAMM mAb封闭的细胞显示出细胞荧光的显著降低，证实肽SEQ ID NOs: 1、9和14对RHAMM的特异性(p <0.001)。如图6 B所说明的，用抗RHAMMmAb封闭的细胞显示出大约65%至大约85%的细胞荧光降低(荧光素-标记的SEQ ID NOs: 1、9和14分别显示出大约85%、大约76%和大约65%的荧光降低)。
讨论
RHAMM是在各种癌症中过量表达的癌基因。另外，在表达RHAMM的癌细胞中HA (RHAMM的胞外配体)的积累增加是不良临床后果的预后因素。因此，靶向RHAMM并能与HA竞争结合的低分子量配体可用于诊断和治疗目的。在本研究中，本发明人寻求鉴定能靶向RHAMM的HA结合结构域的配体。本发明人理由充分地说明，因为含有HA结合结构域的RHAMM羧基端介导在细胞内的微管网络上的定位，所以进行了数据库搜索和RHAMM与已知微管蛋白相关蛋白(例如MAP)的微管结合结构域之间的成对比较。此外，因为这些蛋白表现出与微管蛋白的CTT直接结合，所以本发明人假设RHAMM可显示出与代表不同微管蛋白亚类的CTT的合成肽的直接相互作用。因为MAP的微管蛋白结合结构域和RHAMM的HA-结合结构域之间的适度特异性，所以进行进一步研究，以测定微管蛋白的哪些肽片段与RHAMM相互作用。在本研究中，推导出RHAMM和新配体之间的特异性相互作用。
使用固相肽合成，合成衍生自不同微管蛋白亚类羧基端结构域(即CTT区)的肽片段、以及直接接近上述结构域的序列。针对RHAMM，对所得肽进行筛选，以测定高亲和力配体。为此，使用SPR筛选方法，其中将RHAMM蛋白固定到SPR传感器板，并让肽流过，以发现具有高亲和力和特异性的配体。使用该方法，因为它允许使用单个RHAMM-带电荷的传感器板进行高通量筛选，并且SPR-结合的RHAMM可反映其作为细胞受体的天然膜结合状态。筛选得到6种高亲和力配体，其能与HA竞争经ELISA测定的RHAMM的HA结合区。进一步评价确定这些肽相较于CD44(一种已知也结合HA的透明质酸粘素)显示出对RHAMM的更高特异性。
肽在生物环境(牛血清)中显示出适度稳定性(大约110-250分钟的半衰期)，这可为足够长，有利于体外、离体或体内成像。通过在表达RHAMM的癌细胞中定量测定对配体的相对摄取，分析了对RHAMM具有更高亲和力的3种HA肽模拟物(SEQ ID NOs:. 1、9和14)的特异性。为此，将SEQ ID NOs:. 1、9和14的肽与荧光素缀合(SEQ ID NOs: 25、29和35)并与MDA-MB-231细胞(过量表达RHAMM的细胞系)孵育。对于所有3种肽都观测到细胞荧光，并且加入抗CD44或非特异性抗体(即IgG抗体)并未减少摄取。然而，当加入抗RHAMM抗体时观测到探针摄取大大减少，表明对探针摄取的特异性封闭。因此，探针的高特异性与适度稳定性联合可允许进一步开发为诊断试剂，用于表达RHAMM的癌细胞。
该报告中显示的所述结果表明RHAMM的HA结合结构域在微管蛋白可变羧基-端部分存在通用位点。在大多数候选肽中注意到重复的6肽基序，并且共享该酸性羧基-端区段的肽与RHAMM相互作用。基序EEXEEZ (其中X为A或G，Z为V或E；SEQ ID NO: 18)存在于合成的(SEQ ID NO:9)和(SEQ ID NO: 11)中，如图8B所说明的。该结果与先前的报告是一致的，即短序列EEGEE (SEQ ID NO: 21)(Paschal等, 1989)可参与微管蛋白和MAP结合，是与RHAMM共享序列同源性的蛋白家族。
尽管酸性官能团在HA和RHAMM相互作用中的作用，结果也可表明在CTT区内的这些酸性残基的随机发生或增加，看来并不直接影响RHAMM-微管蛋白相互作用。意想不到的是，含有DEXEEZ (如在肽SEQ ID NOs: 2和4中所见) (SEQ ID NO: 22)和EEXEDZ (如在SEQ IDNO: 10中所见) (SEQ ID NO: 23)基序的肽未通过最初的筛选，表明第一和第五序列内的Asp残基不可取代该基序中的类似酸性Glu残基。这表明CTT与RHAMM的相互作用同时被静电力和构象效应介导。
显著性
本研究公开了至少6种与RHAMM的HA结合结构域相互作用的新配体的发现。这6种肽对RHAMM具有强亲和力并且能够被内源HA置换，因此显示出特异性靶向HA-结合结构域。另外，在基于无细胞的(即ELISA)和基于细胞的(即细胞荧光)测定中，这些配体与RHAMM结合的倾向大于与另一种透明质酸粘素CD44，可证明其作为靶向实体的潜力。RHAMM的过量表达及其所导致的与HA的相互作用亦牵涉癌症病理学。因此，这些肽可作为可封闭RHAMM-HA相互作用的拮抗剂，因此限制了RHAMM的转化潜力。
实施例3 - 丙氨酸-取代的RHAMM-结合肽与RHAMM的亲和力
材料：溶剂无需进一步纯化就可使用，并且购自VWR, Fisher Scientific或SigmaAldrich。对于肽合成，芴基甲氧基羰基(Fmoc)-Rink amide MBHA (100-200目)树脂、Fmoc氨基酸、Fmoc-保护的氨基己酸(Fmoc-Ahx)和HBTU (六氟磷酸2-(1H-苯并三唑1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓)偶联剂得自Peptides International。
肽合成：使用自动化(APEX 396自动合成仪)和/或手动方法，使用标准固相肽合成，包括Fmoc脱保护和氨基酸偶联循环，在rink amide MBHA树脂(0.1 mmol)上进行肽链延伸。使用20%哌啶在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的溶液，在整个合成中重复进行Fmoc脱保护(15和20分钟周期)。以30和90分钟间隔使用0.05 M或更高浓度的Fmoc-保护的氨基酸和HSTU, 5当量N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)/DMF，进行所有氨基酸偶联。每次脱保护和偶联步骤之后，树脂都用DMF (3x)和二氯甲烷(DCM) (3x)重复洗涤。使用同样参数偶联Fmoc-Ahx。如下进行荧光素偶联：使肽的氨基与FITC荧光染料(4当量)在含有DIPEA(2当量)的DMF中反应4小时。所得树脂用由88% TFA和12%清除剂(5%水、5%三异丙基硅烷和2%苯酚)组成的裂解混合物处理。将所得树脂在700 rpm振摇3小时并通过RP-HPLC纯化。
ELISA结合测定：进行酶联免疫吸附测定(ELISA)，以测试荧光素-标记的肽SEQ IDNO: 1 (SEQ ID NO: 25)或荧光素-标记的肽SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 35)中丙氨酸取代的影响，以确定对RHAMM结合而言重要的残基。
将重组RHAMM (0.05M PBS中的100 μL、10 μg/mL, pH 9)加入到96孔板(终浓度1pg/孔)并在4℃孵育过夜。
各板用(0.05%) PBS-吐温-20缓冲液(200 μL/孔)洗涤3次，然后在室温下与BSA封闭液孵育1小时。加入荧光素-标记的肽(SEQ ID NO:25或SEQ ID NO: 35) (终浓度1 μg/mL)，用(0.05%) PBS-吐温-20缓冲液(200 μL/孔)洗涤，然后在485/535 nm处测量吸光度。
竞争性ELISA：使用竞争性ELISA，测量丙氨酸取代的荧光素-标记的SEQ ID NO: 1(SEQ ID NO: 25)或荧光素-标记的SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 35)置换HA和竞争RHAMM的能力。如上所述地进行蛋白固定和3次洗涤之后，将荧光素-标记的微管蛋白衍生的肽(终浓度1 μg/mL)和HA (100μL/孔, M.W. 220 kDa, PBS中的10 μg/mL, HA = 1 mg/mL、5 mg/mL和10 mg/mL)加入到各板并在4℃孵育过夜。洗涤方案之后，在485/535 nm处测量吸光度。
结果
图10 A说明12种丙氨酸-取代的(丙氨酸扫描)荧光素-缀合的肽SEQ ID NO: 1 (SEQID NO: 25)对RHAMM的亲和力。数据表明SEQ ID NO: 1的残基2、4、7-10和12对与RHAMM的适当结合可为重要的。图10 B说明12种丙氨酸-取代的荧光素-标记的SEQ ID NO: 1肽(SEQID NO: 25)被HA竞争性置换到固定化Rhamm-CT。数据显示在SEQ ID NO: 1的位置2、4、7-10和12的丙氨酸取代消除了所述肽与HA竞争的能力。从每次测量中减去阴性对照(未固定的RHAMM)并且所有数据显示在2个独立实验中的3次测量的平均值。
图17 A说明11种丙氨酸-取代的荧光素-缀合的肽SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO:35)对RHAMM的HA-结合区的亲和力。数据表明SEQ ID NO: 14的残基2、3、5、6、9和10对RHAMM的适当结合可为重要的。图17 B说明11种丙氨酸-取代的荧光素-标记的SEQ ID NO: 14(SEQ ID NO: 35)被HA竞争性置换到固定化RHAMM-CT。数据显示在SEQ ID NO: 14的位置2、3、5、6、9和10的丙氨酸取代消除了所述肽与HA竞争的能力。从每次测量中减去阴性对照(未固定的RHAMM)并且所有数据显示在2个独立实验中的3次测量的平均值。
实施例4-人上皮卵巢癌细胞
材料：缓冲液和培养基购自Invitrogen、Sigma和VWR。AlamarBlue测定试剂盒购自Invitrogen。二甲亚砜(DMSO)购自Aldrich。上皮卵巢癌(EOC)细胞经患者同意后得自London Regional Cancer Center。
增殖测定：检查了一种RHAMM-结合肽(SEQ ID NO: 1)限制患者来源的上皮卵巢癌肿瘤的增殖的能力和另一种RHAMM-结合肽(SEQ ID NO: 3)降低腹水-来源的人EOC细胞的活力的能力。在这些测定中，将上皮卵巢癌细胞(源自患者腹水)铺板在96孔板中，密度为5,000细胞/孔，并让其在37℃和5% CO2中生长24小时。在第一天将肽(1 μM和10 μM)加入细胞，并测量增殖达6天。每天将1/10体积的Alamar Blue试剂直接加入培养基内的细胞中，共6天。在570/590 nm处读出荧光。数据得自两次实验的平均值。实验中包括了仅用DMSO (二甲亚砜)处理的细胞和“无细胞”对照样品。
EOC细胞摄取研究：将EOC细胞在DMEM培养基 + 10% FBS中培养至90%汇合。然后将细胞接种在2 x 24-孔组织培养板(20,000细胞/孔的汇合)。然后细胞用3% BSA的DMEM +0.1% FCS在室温下封闭1小时。对于封闭实验，加入抗体(稀释度1:100, 抗IgG, 山羊抗-Rhamm mAb或小鼠抗CD44 mAb的DMEM + 0.1% FCS培养基)并在37℃孵育1小时。然后吸出所得培养基，并用DMEM + 0.1% FCS在室温下洗涤细胞。加入荧光素缀合的肽(SEQ ID NO:25；50 ug/mL)并在37℃孵育30分钟。细胞用DMEM + 0.1% FCS洗涤，然后用PBS(pH 7.6)洗涤，使用含Fluoro-gel 11的DAPI (Electron microscopy sciences, USA)，通过制造商方案将细胞封固。用Olympus FluoView FV1000偶联的Motorized Inverted SystemMicroscope对细胞进行摄影。使用ImageJ (v1.42q)软件分析Tiff图像。将每幅图像转化为8-bit格式并经受阈值20和255。选择目标区(ROI)并求出平均细胞荧光。
人上皮卵巢癌细胞的增殖
图11说明肽SEQ ID NO: 1在人上皮卵巢癌(EOC)细胞中的增殖测定。EOC细胞是来自上皮卵巢癌患者腹水的样品。用alamarBlue测定来测量增殖水平。在第一天加入一次肽SEQID NO: 1并测量随时间而变的作用。数据显示在4份患者OC细胞样品中有3份表现出对增殖的抑制。
图13说明使用荧光显微术，卵巢瘤细胞对荧光素-缀合的肽SEQ ID NO: 1 (SEQID NO: 25)的摄取的显现。正如所料，当EOC细胞与抗RHAMM一起孵育时，对荧光素-标记的SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 25)的摄取减少，而对于经抗IgG或抗CD44处理的细胞，探针的摄取不受影响。
图12是一幅图，说明RHAMM-结合肽降低了腹水-来源的人EOC细胞的活力(p<0.05)。将来自患者样品EOC的原代细胞接种到24-孔培养皿中，并在24小时后用RHAMM-结合肽SEQ ID NO: 3 (7和0.7 uM的浓度)或DMSO溶媒对照开始处理。每天进行重复给药，共6天，并且通过荧光测定术，使用alamarBlue TM试剂评价细胞活力(以荧光单位FU测量)。
实施例5 - PC3mLN4人前列腺癌系
材料和方法
细胞摄取研究: 由侵袭性/转移性前列腺肿瘤细胞表达的2种乙酰透明质酸受体是CD44和RHAMM。因此，评价了本发明肽选择性靶向前列腺癌细胞的能力。在该测定中，将PC3mLN4人前列腺癌细胞在DMEM培养基 + 10% FBS中培养至90%汇合。然后将细胞接种在2x 24-孔组织培养板中的盖玻片(12 x 12 mm, 包被有50 μg/ml纤连蛋白)上(20000/孔的汇合)。然后细胞用3% BSA的DMEM + 0.1% FCS在室温下封闭1小时。对于封闭实验，加入抗体(稀释度1:100, 山羊抗Rhamm mAb或小鼠抗CD44 mAb的DMEM + 0.1% FCS培养基)并在37℃孵育1小时。然后吸出所得培养基，并用DMEM + 0.1% FCS 在室温下洗涤细胞。加入荧光素-缀合的肽(SEQ ID NO: 29；50 ug/mL)并在37℃孵育30分钟。细胞用DMEM + 0.1% FCS洗涤，然后用PBS (pH = 7.6)洗涤，使用含Fluoro-gel 11的DAPI(Electron microscopysciences, USA)，通过制造商方案将细胞封固。用Olympus FluoView FV1000Motorized Inverted System Microscope对细胞进行摄影。使用ImageJ (v1.42q)软件分析Tiff图像。将每幅图像转化为8-bit格式并经受阈值20和255。选择目标区(ROI)并求出平均细胞荧光。
人前列腺癌系中的肽摄取
图14 A显示侵占性侵袭和转移的PC3mLN4人前列腺癌系对HA的荧光素-缀合的肽SEQID NO: 9模拟物(SEQ ID NO: 29)的摄取。使用共聚焦显微镜，在肿瘤细胞中检测荧光素-缀合的肽(图14A (a)，然而，当RHAMM蛋白被抗RHAMM mAb封闭时，FITC信号减少(图14A(C))。这表明探针摄取被特定抗RHAMM单克隆抗体封闭。另外，当用抗CD44单克隆抗体处理细胞时，对荧光素-缀合的HA模拟物的摄取不变(图14A (b))。这些结果表明本发明的HA肽模拟物通过RHAMM依赖性机制与前列腺癌细胞缔合并且被这些细胞所摄取。对摄取的定量测定(图14 B)显示接受无抗体治疗的细胞(a)和用抗CD44封闭的细胞(b)间无统计学差异。在用抗RHAMM抗体治疗的细胞中对探针的摄取极大地下降(c) (p<0.001)。
实施例6 - Ga-DOTA-缀合的肽的合成和表征
材料：所用溶剂购自VWR, Fisher Scientific或Sigma Aldrich。Rink amide M8HA树脂(100-200目, 0.56 mmol/g)、标准Fmoc氨基酸和HBTU偶联试剂得自PeptidesInternational。1-溴己酸、甘氨酸。溴乙酸乙酯和硝酸镓(III)购自Sigma Aldrich。Cyclen(1,4,7,10-四氮杂环十二烷)和Re(CO)5Br购自Strem Chemicals。
肽合成：使用标准固相肽合成，包括Fmoc脱保护和氨基酸偶联循环，在rink amideMBHA树脂(0.1 mmol)上合成肽。使用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20%哌啶溶液，在整个合成中重复进行Fmoc脱保护(15和20分钟周期)。以30分钟和90分钟间隔使用0.05 M或更高浓度的Fmoc-保护的氨基酸和HBTU, 5当量N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)/DMF，进行所有氨基酸偶联。每次脱保护和偶联步骤之后，树脂都用DMF (3x)和二氯甲烷(DCM) (3x)重复洗涤。使用同样参数偶联6-溴己酸。让DMF中的Cyclen (1,4,7,10-四氮杂环十二烷) (10当量)与肽基链末端反应3天。让DMF中的溴乙酸乙酯(3当量/胺)与cyclen的仲胺反应24小时，产生镓螯合物(DOTA)。用88% TFA处理之后，对肽进行纯化，使用由H2O + 0.1% TFA (溶剂A)和CH3CN + 0.1% TFA (溶剂B)组成的梯度溶剂系统，对分析型和制备型HPLC分别以线性流速1.5 mL/min和20 mL/min。使用Grace Vydac蛋白/肽RP-C18柱(4.6 mm x 250 μm, 5 μm)，进行分析型HPLC，并使用Grace Vydac蛋白/肽RP-C18柱(22.0 mm x 250 mm, 10 μm)，进行制备型HPLC。使用Waters 2998光电二极管阵列检测器，在220 nm和254 nm波长处检测吸光度。纯化期间，收集各流分，冻干并通过ESI-MS (Waters Micromass Quattro MicroTM API)分析。
Ga-69/71标记：使用69/71Ga(NO3)3的乙酸缓冲液，pH 5.5，对镓进行配位达15分钟。产物使用C18反相(C18 Sep-Pak©)柱分离。使用含1%三氟乙酸的30%乙腈的去离子水将产物从柱子上洗脱下来。所得产物用质谱表征，并用RP-HPLC分析纯度。
缀合的肽的合成和表征
合成和表征69/71Ga-DOTA-缀合的肽SEQ ID NO: 1作为68Ga-配位的放射性示踪剂的可能的非放射性替代物，用于PET成像。图15 A描述DOTA-缀合的肽的镓标记。图15 B说明纯化的镓配位的肽在9.73分钟的RP-HPLC色谱图。图15 C说明图15 A化合物的ESI质谱(实测的：936.7 [M+2H] 2+, 计算的：934.87 [M+2H]2+)。
实施例7 - Re(CO)3+-配位的肽的合成和表征
材料：所用溶剂购自VWR. Fisher Scientific或Sigma Aldrich。Rink amide MBHA树脂(100-200目, 0.56 mmol/g)、标准Fmoc氨基酸和HBTU偶联试剂得自PeptidesInternational。甘氨酸、氰基硼氢化钠和3-吡啶甲醛购自Sigma Aldrich。Re(CO)5Br购自Strem Chemicals。
Re(CO)3 +螯合剂合成([双(吡啶-2-基甲基)氨基]乙酸)：向甘氨酸(0.602 g, 8.02mmol)的10%乙酸(20 mL)溶液中加入过量3-吡啶甲醛(4.28 g 0.02 mol)。在室温下搅拌1小时后，加入氰基硼氢化钠(1.01 g, 0.016 mol)并将所得反应混合物搅拌24小时。所得混合物用氯仿(3 x 40 mL)萃取，经MgSO4干燥，并蒸发挥发物，得到黄色油状物。粗制产物用二氧化硅色谱纯化(90% 氯仿: 10% 甲醇) (1.67 g, 81%收率)。
肽合成：使用标准固相肽合成，包括Fmoc脱保护和氨基酸偶联循环，在rink amideMBHA树脂(0.1 mmol)上合成肽。使用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20%哌啶溶液，在整个合成中重复进行Fmoc脱保护(15和20分钟周期)。以30分钟和90分钟间隔使用0.05 M或更高浓度的Fmoc-保护的氨基酸和HBTU, 5当量N,N-二异丙基乙胺 (DIPEA)/DMF，进行所有氨基酸偶联。每次脱保护和偶联步骤之后，树脂都用DMF (3x)和二氯甲烷(DCM) (3x)重复洗涤。用上述方法偶联Fmoc-氨基己酸和([双(吡啶-2-基甲基)氨基]乙酸。使用过量[Re(CO)3Br3](NEt4)2进行铼配位。用88%三氟乙酸进行从固体支持物上的裂解。
对肽进行纯化，使用由H2O + 0.1% TFA (溶剂A)和CH3CN + 0.1% TFA (溶剂B)组成的梯度溶剂系统，对分析型和制备型HPLC分别以线性流速1.5 mL/min和20 mL/min。使用Grace Vydac蛋白/肽RP-C18柱(4.6 mm x 250 μm, 5 μm)进行分析型HPLC，并使用GraceVydac蛋白/肽RP-C18柱(22.0 mm x 250 mm, 10 μm)进行制备型HPLC。使用Waters 2998光电二极管阵列检测器，在220 nm和254 nm波长处检测吸光度。纯化期间，收集各流分，冻干并通过ESI-MS (Waters Micromass Quattro MicroTM API)分析。
合成和表征Re(CO)3 + -配位的肽SEQ ID NO: 1作为99Tc(CO) 3 +配位的放射性示踪剂的可能的非放射性替代物，用于SPECT成像。图16 A描述Re(CO)3 + -配位的肽SEQ ID NO:1的合成，图16 B说明纯化的铼配位的肽在11.06分钟的RP-HPLC色谱图。图16 C说明铼配位的肽的ESI质谱(实测的：939.1 [M+2H]2+, 计算的：940.2 [M+2H] 2+)。
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Claims (33)

1.RHAMM-结合肽，其包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQID NO: 49、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53和SEQ ID NO: 58。
2.RHAMM-结合肽，其中所述RHAMM-结合肽由包含 SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7或SEQID NO: 8的12-14个氨基酸长度的肽组成。
3.RHAMM-结合肽，其中所述RHAMM-结合肽由包含 SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7或SEQID NO: 8的13个氨基酸长度的肽组成。
4.RHAMM-结合肽，其中所述RHAMM-结合肽由SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7或SEQ IDNO: 8组成。
5.权利要求1-4中任一项所述的RHAMM-结合肽，其中所述RHAMM-结合肽是微管蛋白-衍生的肽。
6.RHAMM-结合肽，其中所述RHAMM-结合肽是权利要求1-4中任一项所述的肽的功能类似物。
7.权利要求6所述的RHAMM-结合肽，其中所述肽的至少一个氨基酸被具有类似化学性质的另一氨基酸取代。
8.权利要求7所述的RHAMM-结合肽，其中所述肽的单个氨基酸被具有类似化学性质的另一氨基酸取代。
9.权利要求1-4中任一项所述的RHAMM-结合肽，其中所述肽是PEG化的。
10.权利要求1-4中任一项所述的RHAMM-结合肽，其中所述肽包括一个或更多个D-氨基酸。
11.权利要求1-4中任一项所述的RHAMM-结合肽，其中所述肽是乙酰化的。
12.权利要求1-4中任一项所述的RHAMM-结合肽，其中所述肽是酰胺化的。
13.编码权利要求1所述的RHAMM-结合肽的核酸。
14.权利要求1-4中任一项所述的RHAMM-结合肽，其中所述RHAMM-结合肽与可检测标记缀合。
15.权利要求14所述的RHAMM-结合肽，其中所述可检测标记选自基于生物素的标记、磁标记、放射性标记、荧光标记、电子致密试剂、酶、地高辛配基或半抗原。
16.权利要求14所述的RHAMM-结合肽，其中所述RHAMM-结合肽与Ga-DOTA标记或与Re(CO)3 +标记缀合。
17.权利要求1-4中任一项所述的RHAMM-结合肽，其中所述RHAMM-结合肽与细胞毒性分子或放射性分子缀合。
18.药物组合物，其包含有效量的一种或多种权利要求1-4中任一项所述的肽或者权利要求13所述的核酸以及药学上可接受的载体。
19.权利要求18所述的药物组合物，其中所述组合物额外包含辅助剂。
20.权利要求18所述的药物组合物，其中所述一种或多种RHAMM-结合肽或核酸在脂质体内提供。
21.权利要求20所述的药物组合物，其中所述脂质体包括免疫脂质体。
22.权利要求18所述的药物组合物，其中所述一种或多种RHAMM-结合肽或核酸在脂质制剂内提供。
23.权利要求14所述的RHAMM-结合肽在制备用于对受试者的组织或器官中的RHAMM表达进行成像的试剂盒中的用途。
24.权利要求23所述的用途，其中所述可检测标记是放射性核素。
25.权利要求14所述的RHAMM-结合肽在制备用于测定细胞中RHAMM的存在情况的试剂盒中的用途。
26.权利要求14所述的RHAMM-结合肽在制备用于对受试者中的肿瘤祖细胞进行成像的试剂盒中的用途。
27.权利要求14所述的RHAMM-结合肽在制备用于对动物细胞、组织或器官中的肿瘤祖细胞进行成像的试剂盒中的用途。
28.权利要求14所述的RHAMM-结合肽在制备用于确定癌症患者的预后的试剂盒中的用途。
29.权利要求14所述的RHAMM-结合肽在制备用于确定癌症患者的疗程的试剂盒中的用途。
30.权利要求14所述的RHAMM-结合肽在制备用于诊断RHAMM在细胞中表达相关的病症或病况的患者的试剂盒中的用途。
31.权利要求30所述的用途，其特征在于所述病症或病况是癌症。
32.权利要求1-4中任一项所述的RHAMM-结合肽在制备用于治疗患有RHAMM在细胞中表达相关的病症或病况的受试者的药物中的用途，所述RHAMM-结合肽与能够对表达RHAMM的细胞具有细胞毒性的分子缀合，其中所述病症或病况是癌症或组织瘢痕形成。
33.权利要求1-4中任一项所述的RHAMM-结合肽在制备用于RHAMM表达相关病症或病况的治疗、改善或预防的药物中的用途，其中所述病症或病况是癌症或组织瘢痕形成。
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