KR101947529B1 - Rhamm 결합 펩타이드 - Google Patents

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케네스 버젤 에스구에라
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런던 헬스 사이언시스 센터 리서치 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 히알루론산 매개 운동성에 대한 수용체(Receptor for Hyaluronic Acid Mediated Motility) 분자에 결합하는 펩타이드를 제공한다. 더욱 상세하게는, RHAMM 분자에 특이적으로 결합할 수 있고 매우 높은 친화성을 가지고 RHAMM에 결합할 수 있는 펩타이드가 제공된다. 이들 신규한 RHAMM-결합 펩타이드는 RHAMM을 발현하는 세포를 동정하는데 사용될 수 있는 새로운 영상화 프로브를 위한 기반 및 RHAMM 발현과 관련된 질환의 영상화, 예측, 진단 및 치료 방법을 제공한다.

Description

RHAMM 결합 펩타이드{RHAMM Binding Peptides}
본 발명은 신규한 펩타이드 및 조성물에서의 이의 사용, 조성물에서 RHAMM을 발현하는 세포를 동정하기 위한 방법, 및 RHAMM/리간드 복합체의 형성이 원인인 장애 또는 질환을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
명세서 전반에 걸쳐, 본 발명이 속하는 기술분야를 더욱 완벽하게 설명하기 위해 다양한 참조가 대괄호 안에 인용된다.
히알루로난(hyaluronan, HA, 글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민의 반복 단위의 음이온성 고분자)은 암 진행과 관련된 기질(stroma)의 하나의 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 성분이며, 종양 HA의 증가된 축적은 암 환자에서 나쁜 경과의 예후이다[1, 2, 3]. HA는 체외에서 암 세포의 운동성을 자극하고, 이는 체내에서의 암 세포 침윤의 중요성을 암시한다. 암의 진행에 연루된 두 개의 HA 세포 수용체는 CD44와 RHAMM(HA-매개 운동성에 대한 수용체)이다.
전구 세포(progenitor cell) 또는 "종양 개시 세포(tumor initiating cell)"는 현재 일반적으로 백혈병의 종양 형성 가능성에 불균형적으로 기여하는 것으로 인정된다. 유사한 현상이 유방암(breast cancer, BC)과 그 밖의 고형 종양에서 최근에 밝혀졌으며 이들 종양 세포 아형의 표현형(phenotype)은 부분적으로 CD44+/CD24-/ESA+로 특징지어졌다. 임상 경과에 대한 이들 세포 아형의 정확한 관계는 논란이 많지만, 원발성 유방암(primary BC)으로부터 FACS에 의해 분류된 CD44+ 세포는 나쁜 임상 경과를 예측하는 유전자 지문을 나타낸다. RHAMM mRNA 및 단백질의 과잉 발현은 또한 원발성 인간 유방 종양 세포 아형에서 나타나고, 이러한 RHAMM 양성 아형의 존재는 나쁜 임상 경과 및 유방암에서의 주변 전이의 증가된 위험을 예측 가능하게 한다.
CD44가 많은 정상 조직에서 발현하지만, RHAMM 발현은 이들 조직에서 검출되지 않고 그 다음의 상처 치유 및 암의 진행과 같은 병리적 과정에서 나타난다. CD44-양성 및 RHAMM-양성 종양 세포 아형의 영상화(imaging)는 따라서 나쁜 경과의 위험에 있는 환자의 식별과 관련이 있다. 그러나, 본 문서의 작성일 현재, 이들 및/또는 그 밖의 종양 전구 세포는 아직 직접적으로 영상화되지는 않았다. 따라서, 비침습적으로 전구 세포의 상태를 영상화하는 수단을 제공하기 위해 RHAMM을 표적으로 할 수 있는 분자 영상 프로브(molecular imaging probe)를 발견하는 것이 바람직할 수 있다.
이러한 표적 방법은 또한 리간드-수용체 상호 작용을 통해 직접적으로 또는 표적 세포에 치료 하중(therapeutic payload)을 전달함으로써 간접적으로 치료 약제를 통해 전구 세포를 선택적으로 표적으로 하는 방법을 제공할 수 있다. 예를 들어, 전구 세포에 입자 방출 동위원소를 전달할 수 있고, 또는 이들 세포에 화학 요법제(예를 들어, 시스플라틴(cisplatin))를 전달할 수 있다. 본 발명은 아직 보고되지 않은, RHAMM을 표적으로 하기 위한 신규한 펩타이드 리간드를 제공한다.
본 발명은 RHAMM에 결합할 수 있는 신규한 펩타이드의 발견에 관한 것이다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 펩타이드를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 분리된 DNA를 제공하며, 상기 DNA는 SEQ. ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 17에 따른 펩타이드를 암호화하는 염기 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 RHAMM에 특이성과 친화성을 가지고 결합하는 펩타이드의 발견에 관한 것으로, 상기 펩타이드는 튜불린(tubulin)에서 유래된다. 일 양태에서, 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드는 튜불린의 카르복시 말단에서 유래된다.
일 실시형태에 따르면, 본 발명은 RHAMM-결합 펩타이드를 제공하며, 상기 RHAMM-결합 펩타이드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 17로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시형태에 따르면, 본 발명은 RHAMM-결합 펩타이드를 제공하며, 상기 RHAMM-결합 펩타이드는 수식 EEXEEZ(SEQ ID NO: 18)를 갖는 서열을 포함하고, 여기서 X는 알라닌(alanine) 또는 글리신(glycine)에서 선택되고, Z는 타이로신(tyrosine) 또는 글루타민산(glutamic acid)에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 약학적 조성물을 제공하며, 상기 약학적 조성물은 효과적인 양의 본 발명의 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드와 검출 기술에 의해 검출될 수 있는 검출 가능한 표지를 포함하는 프로브를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 피험자의 조직 또는 장기 내의 RHAMM 발현을 영상화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드와 검출 기술에 의해 검출될 수 있는 검출 가능한 표지를 포함하는 프로브를 투여하는 단계; 및 (b) 피험자의 조직 또는 장기 내의 표지를 검출하기 위한 영상화 기술을 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 실시형태에서, 세포 내의 RHAMM의 존재를 결정하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 세포를 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드와 검출 기술에 의해 검출될 수 있는 검출 가능한 표지를 포함하는 프로브에 접촉시키는 단계 및 세포 내의 표지를 검출하기 위한 영상화 기술을 적용하는 단계를 포함하고, 세포 내의 표지의 검출은 세포 내의 RHAMM의 존재를 나타내는 것을 특징으로 한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 피험자 내의 종양 전구 세포를 영상화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드와 검출 기술에 의해 검출될 수 있는 검출 가능한 표지를 포함하는 프로브를 투여하는 단계 및 피험자 내의 표지를 검출하기 위한 영상화 기술을 적용하는 단계를 포함하고, 대상자 내의 표지의 검출은 대상자 내의 종양 전구 세포의 존재를 나타내는 것을 특징으로 한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 동물 세포, 조직 또는 장기 내의 종양 전구 세포를 영상화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포, 조직 또는 장기를 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드와 검출 기술에 의해 검출될 수 있는 검출 가능한 표지를 포함하는 프로브에 접촉시키는 단계 및 세포, 조직 또는 장기 내의 표지를 검출하기 위한 영상화 기술을 적용하는 단계를 포함하고, 세포, 조직 또는 장기 내의 표지의 검출은 세포, 조직 또는 장기 내의 종양 전구 세포의 존재를 나타내는 것을 특징으로 한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 암 환자를 대한 예후(prognosis)를 결정하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 환자로부터 종양 조직 샘플을 획득하는 단계; (b) 상기 샘플을 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드와 검출 기술에 의해 검출될 수 있는 검출 가능한 표지를 포함하는 프로브에 접촉시키는 단계; (c) 샘플 내의 표지를 검출하기 위한 영상화 기술을 적용하는 단계; 및 (d) 환자의 예후를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 예후는 환자 내의 암의 공격성 또는 전이의 가능성을 예측하고, 샘플 내의 RHAMM 발현의 검출은 나쁜 예후를 나타내는 것을 특징으로 한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암 환자에 대한 치료의 과정을 결정하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 환자로부터 종양 조직 샘플을 획득하는 단계; (b) 상기 샘플을 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드와 검출 기술에 의해 검출될 수 있는 검출 가능한 표지를 포함하는 프로브에 접촉시키는 단계; (c) 샘플 내의 표지를 검출하기 위한 영상화 기술을 적용하는 단계; (d) 환자의 예후를 결정하는 단계, 상기 예후는 환자 내의 암의 공격성의 가능성을 예측하고, 샘플 내의 RHAMM 발현의 검출은 나쁜 예후를 나타내며; 상기 예후에 근거하여 환자에 대한 치료의 과정을 처방하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 세포 내의 RHAMM 발현과 관련된 장애 또는 질환의 환자를 진단하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 환자로부터 조직 샘플을 획득하는 단계; (b) 상기 샘플을 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드와 검출 기술에 의해 검출될 수 있는 검출 가능한 표지를 포함하는 프로브에 접촉시키는 단계; 및 (c) 샘플 내의 표지를 검출하기 위한 영상화 기술을 적용하는 단계를 포함하고, 샘플 내의 RHAMM 발현의 검출은 장애 또는 질환의 양성 진단을 나타내는 것을 특징으로 한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 세포 내의 RHAMM 발현과 관련된 장애 또는 질환을 앓는 피험자를 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 효과적인 양의 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드 또는 상기 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 효과적인 양의 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드는 수식 EEXEEZ(SEQ ID NO: 18)를 갖는 서열을 포함하고, 여기서 X는 알라닌 또는 글리신에서 선택되고, Z는 타이로신 또는 글루타민산에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 세포 내의 RHAMM 발현과 관련된 장애 또는 질환을 앓는 피험자를 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 효과적인 양의 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드 또는 상기 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 효과적인 양의 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드는 SEQ ID NOs. 1 내지 17로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 RHAMM을 발현하는 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포를 효과적인 양의 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드 또는 상기 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자에 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드는 수식EEXEEZ(SEQ ID NO: 18)를 갖는 서열을 포함하고, 여기서 X는 알라닌 또는 글리신에서 선택되고, Z는 타이로신 또는 글루타민산에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 RHAMM을 발현하는 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포를 효과적인 양의 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드 또는 상기 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자에 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드는 SEQ ID NOs. 1 내지 17로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 RHAMM을 발현하는 세포의 운동성(motility)을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포를 효과적인 양의 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드 또는 상기 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자에 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드는 수식 EEXEEZ(SEQ ID NO: 18)를 갖는 서열을 포함하고, 여기서 X는 알라닌 또는 글리신에서 선택되고, Z는 타이로신 또는 글루타민산에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 RHAMM을 발현하는 세포의 운동성을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포를 효과적인 양의 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드 또는 상기 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자에 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드는 SEQ ID NOs. 1 내지 17로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발의 양태에서, 상기 RHAMM을 발현하는 세포는 암 세포이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 암에 걸린 환자 내의 전이를 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드 또는 상기 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 효과적인 양의 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드는 수식 EEXEEZ(SEQ ID NO: 18)를 갖는 서열을 포함하고, 여기서 X는 알라닌 또는 글리신에서 선택되고, Z는 타이로신 또는 글루타민산에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암에 걸린 환자 내의 전이를 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드 또는 상기 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 효과적인 양의 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드는 SEQ ID NOs. 1 내지 17로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 RHAMM 발현과 관련된 장애 또는 질환의 치료, 개선, 또는 예방에 RHAMM-결합 펩타이드의 사용을 제공하며, 상기 RHAMM-결합 펩타이드는 수식 EEXEEZ(SEQ ID NO: 18)를 갖는 서열을 포함하고, 여기서 X는 알라닌 또는 글리신에서 선택되고, Z는 타이로신 또는 글루타민산에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 RHAMM 발현과 관련된 장애 또는 질환의 치료, 개선, 또는 예방에 상기 RHAMM-결합 펩타이드를 암호화하는 RHAMM-결합 펩타이드 또는 핵산의 사용을 제공하며, 상기 RHAMM-결합 펩타이드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 17로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 양태에서, RHAMM 발현과 관련된 장애 또는 질환은 조직 흉터(tissue scarring)이다. 본 발명의 양태에서, RHAMM 발현과 관련된 장애 또는 질환은 암이다.
본 발명의 양태에서, 본 발명의 펩타이드는 이황화 결합 형성(disulfide bond formation)에 의해 인산기(phosphorous group)와 아세틸기(acetyl group)를 고리화(cyclize)시키도록 펩타이드의 하나 또는 두 말단에 시스테인을 첨가할 수 있다.
또한, 예를 들어 본 발명에 따른 펩타이드의 이량체(dimer) 또는 삼량체(trimer)와 같은 본 발명에 따른 펩타이드의 다량체(multimer)뿐만 아니라 본 발명의 모든 펩타이드의 기능성 유사체(functional analogue)가 본 발명의 범위 내에 있다. 본 발명에 따른 다량체는 다수의 동일한 펩타이드로 구성된 호모머(homomer) 또는 서로 다른 펩타이드로 구성된 헤테로머(heteromer)일 수 있다. 본 발명에 따른 펩타이드의 특징적인 아미노산 서열은 임의의 아미노산 서열이 측면에 있을 수 있다. 펩타이드에 안정 효과를 갖고 따라서 이들의 생물학적 이용성을 증가시키는 측면 서열(flanking sequence)이 바람직하다. 측면 서열은 또한 약동학적 거동(pharmacokinetic behavior)을 향상시키는데 사용될 수 있다. 또한 대사 안정성을 향상시키고, 생물학적 이용 가능성을 증가시키며, 단백질 가수분해에 대한 민감성을 감소시킬 수 있는 융합(fusion) 펩타이드와 페길화된(pegylated) 펩타이드가 본 발명의 범위 내에 있다.
또한 유사한 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산에 의해 대체되는 적어도 하나의 아미노산; N-메틸화된(N-methylated) 아미노산, D-아미노산, 또는 그 밖의 비천연(unnatural) 구성과 같은 비천연 아미노산에 의해 대체되는 적어도 하나의 아미노산; N- 및/또는 C-말단에 존재하는 적어도 하나의 추가 아미노산; 결실되는 적어도 하나의 아미노산; 및 화학적으로 변형된 적어도 하나의 아미노산에 의해 특징지어지는 펩타이드가 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명은, 오직 설명의 형태로 주어지고 본 발명의 의도된 범위를 제한하지 않는, 상세한 설명 및 첨부된 도면으로부터 더욱 완벽하게 이해될 것이다.
도 1A는 RHAMM/히알루로난(hyaluronan, HA)의 상호작용을 위해 필요한 HA-결합 도메인(아미노산 잔기 718 - 750, SEQ ID NO: 19)을 포함하는 72 kDa RHAMM 단백질의 도면을 도시한다.
도 1B는 분자 영상화 프로브 설계 및 최적화의 순서도를 도시한다.
도 2A는 (a) 비변형 튜불린(unmodified tubulin)-유래 펩타이드, (b) N-아세틸 시스테인(N-acetyl cysteine)에 결합된 튜불린-유래 펩타이드, 및 (c) 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate)에 결합된 튜불린-유래 펩타이드의 일반적인 구조를 도시한다.
도 2B는 플루오레세인 또는 N-아세틸 시스테인으로 유도체화된 펩타이드, 튜불린 단편 유형, 계산되고 관찰된 질량 분석 m/z 값(m은 분자 또는 원자 질량을 나타내고 z는 이온에 의해 운반되는 기본 전하의 수를 나타낸다), 순도 퍼센트, 및 결합 상수(Kd)를 포함하는 17개의 합성된 튜불린-유래 펩타이드의 표이다. 도 2B는 외형의 순으로, 각각 SEQ ID NOs: 1, 24-25, 2-3, 26-27, 4-9, 28-29, 10-11, 30-31, 12, 32-33, 13-14, 34-35 및 15-17을 나타낸다.
도 3A는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 센서 플레이트에 고정된 RHAMM-CT의 pH 의존성을 도시하는 표이다. 리간드 밀도는 여섯 번 측정의 평균 SPR로부터 결정되었다. RHAMM pl = 10.1에서, 제어용 중탄산나트륨 완충제(sodium bicarbonate buffer, pH 9.7)가 사용되었다. 단백질은 EDAC(100 mM) 및 sulfo-NHS(25 mM)를 사용하여 센서 플레이트에 결합되었다.
도 3B는 고친화성 리간드를 결정하기 위해 RHAMM에 대한 정제된 튜불린-유래 펩타이드(SEQ ID NOs: 1 내지 17)의 표면 플라즈몬 공명(SPR)-기반 선별(screening)을 도시한다. 선별 결과는 RHAMM에 대한 여섯 개의 고친화성 리간드(SEQ ID NOs: 1, 3, 9, 11, 12 및 14)였다.
도 3C는 본 발명의 플루오레세인-표지된 펩타이드의 RHAMM에 대한 결합을 나타내는 SPR 선별 이후 여섯 개의 펩타이드(SEQ ID NOs: 1, 3, 9, 11, 12 및 14)의 친화성을 확인하기 위한 ELISA 결합 분석이다. 음성 대조군(고정된 RHAMM이 없음)은 각각의 측정에서 제외했다.
도 4A는 음성 대조군 및 기준 센서그램 그래프와 함께, 각각의 특이적 펩타이드-RHAMM에 대한 전체적 적합성을 나타내는 일곱 세트의 센서그램을 도시한다. 항-RHAMM mAb이 양성 대조군으로 사용되었다. 센서그램의 각각의 세트는 고정된 펩타이드와 상호작용하는 세 가지 RHAMM 농도(1000 nM, 750 nM 및 500 nM)의 반응에 해당한다.
도 4B는 선택된 튜불린-유래 펩타이드(SEQ ID NOs: 1, 3, 9, 11, 12 및 14) 및 RHAMM 단일클론 항체(mAb)의 거동을 나타내는 표이다. 표는 계산된 결합률(KON), 해리율(KOFF) 및 결합 상수(KD)를 나타낸다. 오류는 평균 KD의 표준 편차이다.
도 5A는 고정된 RHAMM-CT에 대한 HA(0, 1, 25, 2,5, 5, 및 10 pg/mL)에 의한 본 발명의 여섯 개의 선택된 플루오레세인-표지된 RHAMM-결합 펩타이드(SEQ ID NOs: 1, 3, 9, 11, 12 및 14, 각각 SEQ ID NOs: 25, 27, 29, 31, 33 및 35에 해당함)의 경쟁적 이동을 도시하는 그래프이다. 데이터는 두 번의 독립적인 실험에서 세 번의 측정의 평균을 나타낸다.
도 5B는 고정된 RHAMM-CT에 대한 HA에 의한 본 발명의 여섯 개의 선택된 비-표지 RHAMM-결합 펩타이드(SEQ ID NOs: 1, 3, 9, 11, 12 및 14)에 의해 염료-표지된 HA의 경쟁적 이동을 도시하는 그래프이다. 데이터는 두 번의 독립적인 실험에서 세 번의 측정의 평균을 나타낸다.
도 5C는 본 발명의 여섯 개의 플루오레세인-결합된 RHAMM-결합 펩타이드(SEQ ID NOs: 1, 3, 9, 11, 12 및 14, 각각 SEQ ID NOs: 25, 27, 29, 31, 33 및 35에 해당함)와 정제된 CD44 또는 RHAMM-CT의 ELISA 결합 분석을 나타내는 그래프이다. 데이터는 두 번의 독립적인 실험에서 세 번의 측정의 평균을 나타낸다.
도 6A는 형광 영상화를 이용하여 유방 종양 세포(MDA-MB-231) 내의 플루오레세인-결합된 SEQ ID NO: 14(SEQ ID NO: 35)의 흡수의 시각화를 나타내는 현미경 사진이다. DAPI 채널은 세포핵을 나타내는 반면, FITC 채널은 플루오레세인-표지된 펩타이드의 부위를 나타낸다.
도 6B는 유방 종양 세포(MDA-MB-231) 내의 플루오레세인-결합된 SEQ ID NOs: 1, 9 및 14(SEQ ID NOs: 25, 29, 35)의 흡수의 정량화를 나타내는 그래프이다. 각각의 막대는 세 번의 실험 각각의 1048 번의 측정의 평균을 나타낸다. 모든 처리군은 항-RHAMM 처리를 받은 군과 비교해서 상당히 높다(p<0.001). 데이터는 ANOVA를 사용해서 분석하였으며 오류는 평균의 표준 편차이다.
도 7은 형광 영상화를 이용하여 유방 종양 세포(MDA-MB-231) 내의 FITC-결합된 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 9(SEQ ID NOs: 25 및 29)의 흡수의 시각화를 나타내는 현미경 사진이다. DAPI 채널은 세포핵을 나타내는 반면, FITC 채널은 플루오레세인-표지된 펩타이드의 부위를 나타낸다.
도 8A는 RHAMM의 HA-결합 도메인(aa 718-750; SEQ ID NO: 19)의 아미노산 서열이다. HA 결합에 필요한 염기성 아미노산 잔기는 밑줄이 쳐 있다.
도 8B는 네 개의 RHAMM-결합 펩타이드(SEQ ID NOs: 1, 3, 9 및 11)의 아미노산 서열의 정렬이다. 동일한 서열은 회색으로 강조한 반면, 반-보존적(semi-conserved) 잔기는 흰색으로 상자에 넣었다. 이온 결합을 통해 RHAMM 위에서 염기성 아미노산 잔기와 상호작용할 수 있는 산성 아미노산 잔기는 밑줄이 쳐 있다.
도 9는 SEQ ID NOs: 1, 3, 9, 10, 12 및 14의 혈청 안정성 측정을 도시한다. 그래프는 11 시간 동안 30 분 단위로 (RP-HPLC로 검출된) 온전한 펩타이드의 퍼센트를 도시한다. 데이터는 일차 감쇠 곡선에 맞추어져 있다.
도 10A는 RHAMM(왼쪽에서 오른쪽으로의 열에서 각각 SEQ ID NOs: 1 및 36-47)에 대한 SEQ ID NO: 1(SEQ ID NO: 25)의 알라닌-치환된 플루오레세인-결합 펩타이드의 친화성을 도시하는 그래프이다. 별표는 RHAMM 결합에 중요한 잔기의 알라닌 치환으로 인한 관찰된 형광에서의 상당한 감소(p<0.01)를 나타낸다(각각의 측정에서 고정된 RHAMM를 제외하지 않았고 모든 데이터는 두 번의 독립적인 실험에서 세 번의 측정의 평균을 나타낸다).
도 10B는 고정된 RHAMM(왼쪽에서 오른쪽으로 각각 SEQ ID NOs: 1 및 36-47)에 대한 HA에 의한 SEQ ID NO: 1(SEQ ID NO: 25)의 열두 개의 알라닌-치환된 플루오레세인-결합 펩타이드의 경쟁적 이동을 도시하는 그래프이다. 음성 대조군(고정된 RHAMM이 없음)은 각각의 측정에서 제외했으며, 모든 데이터는 두 번의 독립적인 실험에서 세 번의 측정의 평균을 나타낸다.
도 11은 RHAMM-결합 펩타이드 SEQ ID NO: 1의 서로 다른 농도(1 μM 및 10 μM)의 존재 하에 인간 상피성 난소암(epithelial ovarian cancer, EOC) 세포의 증식 분석을 나타내는 그래프이다. 이 분석에서, 세포는 하루에 한 번 처리되었고 증식은 6 일 동안 이루어졌다.
도 12는 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드 SEQ ID NO: 3에 의한 복수(ascites)-유래 인간 EOC 세포의 감소된 생존율(p<0.05)을 나타내는 그래프이다.
도 13은 형광 현미경법을 이용하여 난소 종양 세포 내의 플루오레세인-결합 펩타이드 SEQ ID NO: 1(SEQ ID NO: 25)의 흡수를 나타내는 현미경 사진이다. DAPI 채널은 세포핵을 나타내는 반면, FITC 채널은 플루오레세인-표지된 펩타이드의 부위를 나타낸다.
도 14A는 (a) 형광 현미경법을 이용하여 PC3mLN4 인간 전립선암 세포에 의한 본 발명의 플루오레세인-결합 SEQ ID NO: 9(SEQ ID NO: 29)의 흡수를, (b) 특이적 항-CD44 mAb에 의해 차단되지 않은 플루오레세인-SEQ I D NO: 9의 흡수를, (c) 특이적 항-RHAMM mAb에 의해 차단된 플루오레세인-결합 SEQ I D NO: 9의 흡수를 나타낸다.
도 14B는 PC3mLN4 인간 전립선암 세포에 의한 본 발명의 SEQ ID NO: 9의 정량화를 도시한다. 데이터는 항체 처리를 받지 않은 세포(a) 및 항-CD44로 차단된 세포(b)에서의 통계적 차이를 보여주지 않는다. 프로브의 흡수는 항-RHAMM 항체로 처리된 세포(c)에서 극적으로 감소했다.
도 15A는 Ga-DOTA-결합 펩타이드 SEQ ID NO: 1의 합성을 도시한다.
도 15B는 9.73 분에서 정제된 Ga-DOTA-결합 펩타이드 SEQ ID NO: 1의 RP-HPLC 크로마토그램이다.
도 15C는 정제된 Ga-DOTA-결합 펩타이드 SEQ ID NO: 1의 ESI 질량 스펙트럼이다.
도 16A는 Re(CO)3+-동조 SEQ ID NO: 1 펩타이드의 합성을 도시한다.
도 16B는 11.06 분에서 정제된 Re(CO)3+-동조 펩타이드 SEQ ID NO: 1의 RP-HPLC 크로마토그램이다.
도 16C는 정제된 Re(CO)3+-동조 펩타이드 SEQ ID NO: 1의 ESI 질량 스펙트럼이다.
도 17A는 RHAMM(왼쪽에서 오른쪽으로의 열에서 각각 SEQ ID NOs: 48-55, 14 및 56-58)에 대한 SEQ ID NO: 14(SEQ ID NO: 35)의 알라닌-치환된 플루오레세인-결합 펩타이드의 친화성을 도시하는 그래프이다. 별표는 RHAMM 결합에 중요한 잔기의 알라닌 치환으로 인한 관찰된 형광에서의 상당한 감소(p<0.01)를 나타낸다(각각의 측정에서 고정된 RHAMM를 제외하지 않았고 모든 데이터는 두 번의 독립적인 실험에서 세 번의 측정의 평균을 나타낸다).
도 17B는 고정된 RHAMM(왼쪽에서 오른쪽으로 각각 SEQ ID NOs: 48-55, 14 및 56-58)에 대한 HA에 의한 SEQ ID NO: 14(SEQ ID NO: 35)의 열한 개의 알라닌-치환된 플루오레세인-결합 펩타이드의 경쟁적 이동을 도시하는 그래프이다. 음성 대조군(고정된 RHAMM이 없음)은 각각의 측정에서 제외했으며, 모든 데이터는 두 번의 독립적인 실험에서 세 번의 측정의 평균을 나타낸다.
정의
아미노산 잔기에 대한 다음과 같은 표준적인 하나의 문자 및 세 개의 문자의 약어는 본 명세서 전반에 걸쳐 사용될 수 있다: A, Ala-알라닌(alanine); R, Arg-아르기닌(Arginine); N, Asn-아스파라긴(Asparagine); D, Asp-아스파르트산(Aspartic acid); C, Cys-시스테인(Cysteine); Q, Gln-글루타민(Glutamine); E, Glu-글루타민산(Glutamic acid); G, Gly-글리신(Glycine); H, His- 히스티딘(Histidine); I, lie-이소류신(Isoleucine); L, Leu-류신(Leucine); K, Lys-라신(Lysine); M, Met-메티오닌(Methionine); F, Phe-페닐알라닌(Phenyalanine); P, Pro-프롤린(Proline); S, Ser-세린(Serine); T, Thr-트레오닌(Threonine); W, Trp-트립토판(Tryptophan); Y, Tyr-타이로신(Tyrosine); 및 V, Val-발린(Valine).
"유사체(analog)"는 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드의 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 모든 펩타이드를 포함하고, 여기서 하나 이상의 잔기는 기능적으로 유사한 잔기와 보존적으로 치환되며 HA 결합 펩타이드를 모방할 수 있는 능력을 보인다.
"유도체(derivative)"는 작용 측기(side group)의 반응에 의해 화학적으로 유도체화되는 하나 이상의 잔기를 갖는 펩타이드를 말한다. 이러한 유도체화되는 분자는 예를 들어, 유리 아미노기가 유도체화되어 아민 염산염(amine hydrochlorides), p-톨루엔 술포닐기(p-toluene sulfonyl groups), 카르보벤족시기(carbobenzoxy groups), t-부틸옥시카르보닐기(t- butyloxycarbonyl groups), 클로로아세틸기(chloroacetyl groups) 또는 포르밀기(formyl groups)를 형성하는 분자를 포함할 수 있다. 유리 카르복실기는 유도체화되어 염, 메틸 및 에틸 에스테르 또는 그 밖의 유형의 에스테르 또는 하이드라지드(hydrazides)를 제조할 수 있다. 유리 하이드록실기는 유도체화되어 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 제조할 수 있다. 히스티딘의 이미다졸 질소는 유도체화되어 N-임-벤질히스티딘(N-im-benzylhistidine)을 형성할 수 있다. 또한 유도체는 열두 개의 표준 아미노산의 하나 이상의 자연 발생 아미노산 유도체를 포함하는 펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 4-하이드록시프롤린(4-hydroxyproline)은 프롤린으로 치환될 수 있고, 5- 하이드록시리신(5-hydroxylysine)은 리신으로 치환될 수 있고, 3-메틸히스티딘(3-methylhistidine)은 히스티딘으로 치환될 수 있고, 호모세린(homoserine)은 세린으로 치환될 수 있고, 그리고 오르니틴(ornithine)은 리신으로 치환될 수 있다.
"단편(fragment)"이란 용어는 아미노산 서열이 본원에 개시된 펩타이드보다 짧은 아미노산 잔기 서열을 갖는 모든 펩타이드를 말한다.
"분리된(isolated) 펩타이드" 또는 "분리된 DNA"란 용어는, 경우에 따라서, 자연적으로 펩타이드와 DNA 분자를 포함할 수 있는 그 밖의 세포 성분으로부터 실질적으로 분리되는 펩타이드 또는 DNA 분자로 정의될 수 있다. 이 용어는, 제한 없이, 재조합 또는 복제 DNA 분리체(isolates), 화학적으로 합성된 유사체 또는 이종기원 시스템(heterologous system)으로 생물학적으로 합성된 유사체를 포함한다.
본원에서 사용된 "펩타이드"란 용어는 일반적으로 정의된 서열을 갖는 아미노산 잔기의 사슬로서 정의된다. 본원에서 사용된 "펩타이드"란 용어는 "펩타이드들"과 "단백질들"이란 용어를 상호 포함한다.
본 문서에서 "RHAMM"은 히알루론산 매개 운동성에 대한 수용체(Receptor for Hyaluronic Acid Mediated Motility)를 말하며 또한 CD 168로 알려져 있다. RHAMM은 비-일체형 세포 표면(CD 168)이고 체외에서 세포 운동성을 촉진하는 체포내 히알루로난 결합 단백질이며, 이의 발현은 악성 종양에서 매우 강하게 상향 조절된다[WO 2008/140587].
본원에 사용된 "RHAMM-결합-펩타이드(들)"이란 용어는 RHAMM에 결합할 수 있는 펩타이드를 의미한다.
"피험자(subject)" 또는 "환자"는 질환, 장애 또는 질병에 대한 치료가 필요한, 인간을 포함한, 동물을 말한다.
개요
본 발명은 펩타이드 및 RHAMM에 결합할 수 있는 상기 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세포 내의 RHAMM 발현과 관련될 수 있는 질병, 질환 또는 장애의 치료에 상기 RHAMM-결합 펩타이드 및 상기 RHAMM-결합 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드는 RHAMM을 발현하는 세포를 동정할 수 있는 프로브에서 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 RHAMM을 발현하는 세포를 포함할 수 있는 샘플의 동정에 RHAMM-결합 펩타이드를 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 장점은 다음을 포함한다: (a) 특이성을 갖고 RHAMM에 결합하는 신규한 작은 펩타이드가 발견되었다; (b) 본 발명자들의 지식으로는, 종양 전구 세포가 직접적으로 영상화되지 않았다. 신규한 펩타이드는 비침습적으로 전구 세포의 상태를 영상화하는 분자 영상화 프로브로서 사용될 수 있다; (c) RHAMM에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드의 능력은 리간드-수용체 상호 작용을 통해 직접적으로 또는 표적 세포에 치료 하중을 전달함으로써 간접적으로 치료 약제를 통해 전구 세포를 선택적으로 표적으로 하는데 이용될 수 있다; (d) RHAMM에 대한 본 발명의 펩타이드의 결합은 에피토프 노출(epitope exposure)과 항-RHAMM Mab 결합을 증가시키고, 이는 치료적으로 RHAMM 양성 세포를 표적으로 할 뿐만 아니라 영상화 기술의 향상을 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 사상과 범위 내의 다양한 변화와 변경이 상세한 설명으로부터 본 기술분야의 숙련자에게 명백할 것이기 때문에, 상세한 설명과 본 발명의 실시형태를 나타내는 특정 실시예는 오직 설명의 목적으로만 주어진다는 것을 이해해야 한다.
RHAMM -결합 펩타이드
본 발명자들은 대략 6 내지 14 개의 아미노산 잔기의 신규한 펩타이드를 분리하고, 서열을 결정하고, 특징화했다. 이와 같이, 일 실시형태에서, 본 발명은 펩타이드를 암호화하는 분리된 DNA를 제공하며, 상기 펩타이드는 SEQ ID NOs. 1 내지 17로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 17로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 신규한 펩타이드는 RHAMM에 결합할 수 있다. 본 발명의 양태에서, 본 발명의 신규한 RHAMM-결합 펩타이드는 RHAMM에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 양태에서, 본 발명의 신규한 RHAMM-결합 펩타이드는 매우 높은 친화성을 가지고 RHAMM에 특이적으로 결합할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 신규한 RHAMM-결합 펩타이드는 수식(1)의 서열을 포함할 수 있다:
[수식 1]
EEXEEZ (SEQ ID NO: 18)
여기서 X는 A 또는 G에서 선택되고, Z는 Y 또는 E에서 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 신규한 RHAMM-결합 펩타이드는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 17에서 선택되는 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 RHAMM-결합 펩타이드를 제공하며, 상기 펩타이드는 SEQ ID NOs: 1, 3, 9, 10, 11, 12 및 14로 이루어진 군에서 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 RHAMM-결합 펩타이드를 제공하며, 상기 펩타이드는 SEQ ID NOs: 1, 9 및 14로 이루어진 군에서 선택된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드는 튜불린의 카르복시 말단(carboxy terminal tail, CTT) 영역에서 유래할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, RHAMM-결합 펩타이드는 튜불린의 CTT 영역에 직접적으로 인접한 서열로부터 유래할 수 있다. 놀랍게도, 본 발명자들은 RHAMM이 방추체(mitotic spindles)의 유지에 필수적일 수 있는 단백질과 구조적 및 기능적 유사성을 공유하는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 RHAMM의 HA 결합 도메인이 많은 키네신(kinesin)과 미세관 관련 단백질(microtubule associated proteins, MAPs)의 튜불린 결합 도메인과 일치하는 서열을 보일 수 있다는 것을 발견하였다. 튜불린의 CTT 영역은 종래의 키네신과 MAPs와 상호작용하는 것으로 밝혀졌다.
일례로서, RHAMM을 발현하는 것으로 알려진, 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231은, 도 6A 및 도 7에 도시된 바와 같이, 본 발명의 염료-결합 펩타이드로 배양할 때 세포내 형광을 보인다. 항-RHAMM으로 차단된 세포는 도 6B에 도시한 바와 같이 대략 65% 내지 대략 85%의 세포내 형광의 감소를 보인다. PC3mLN4와 같은 기타 RHAMM 발현 암 세포와 환자-유래 난소 종양 세포는 또한, 도 13 및 도 14에 도시된 바와 같이, 본 발명의 RHAMM 펩타이드로 배양할 때 세포내 형광을 보인다.
본 발명자들은 또한 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드의 RHAMM으로의 결합은 에피토프 노출과 항-RHAMM 단일클론 항체(mAb)의 결합을 증가시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 항-RHAMM mabs에 대한 에피토프 노출을 증가시키는 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드의 이러한 능력은 영상화 기술의 향상을 위해서뿐만 아니라 치료적으로 이용될 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 펩타이드는 예를 들어, 종양(그러나 이러한 질환에 제한되지는 않는다) 에서 이용 가능한 RHAMM을, 예를 들어, "활성화"시키는데 사용될 수 있다. 이후, 치료용 또는 영상화용 (예를 들어, Fab 단편) 항-RHAMM mAb이 투여될 수 있고 RHAMM을 발현하는 (종양) 세포를 더욱 효과적으로 표적으로 할 수 있다.
종합하면, 본 발명은 일부 양태에서 튜불린 서열의 CTT에서 유래될 수 있고 다른 양태에서 인공 펩타이드 서열에 근거할 수 있는 일련의 RHAMM-결합 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 펩타이드는 이황화 결합 형성에 의해 펩타이드를 고리화시키도록 펩타이드의 하나 또는 두 말단에 시스테인 잔기의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 본 발명의 펩타이드는 인산 및 아세틸기의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 인산화(phosphorylation)는 동물 세포에서 발생하는 가장 일반적인 단백질 변형 중의 하나이다[4]. 이는 대부분 트레오닌(threonine), 세린 및 타이로신에 일반적으로 발생하며, 세포 주기, 성장, 소멸 및 분화를 포함하는 많은 세포 과정의 조절에서 중요한 역할을 한다[4]. 이러한 과정은 본 발명의 일부 펩타이드가 타이로신을 포함하기 때문에 그리고 아실기가 N-말단 아미노산에 첨가될 수 있기 때문에 가능하다[5]. 본 발명의 펩타이드 내의 방향족 아미노산 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 펩타이드 활성에 대한 이들의 영향을 평가하기 위해 다른 방향족 아미노산으로 치환될 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 펩타이드 내의 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 및 류신과 같은 지방족 아미노산은 펩타이드 활성에 대한 이들의 영향을 평가하기 위해 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 길이가 대략 6 내지 대략 14인 아미노산일 수 있고, 본 기술분야의 숙련자가 이해하듯이, 본원에서 모든 길이 범위를 포함할 수 있다(즉, 6-13, 6-12, 6-11, 6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-13, 7-12, 7-11, 7-10, 7-9, 7-8, 8-13, 8-12, 8-11, 8-10, 8-9, 9-14, 9-13, 9-12, 9-11, 9-10, 10-11, 10-12, 10-13 및 10-14). 길이가 대략 14 이상의 아미노산의 펩타이드가 또한 본 발명에 포함될 수 있다. 펩타이드의 길이는 RHAMM에 결합하는 펩타이드의 능력에 의해서만 제한된다. 본 발명의 펩타이드는 또한 본 기술분야의 숙련자가 이해하듯이 그리고 미국 특허 제 5,824,315호 및 미국 특허 제 6, 184,204호(이들의 개시는 그 전체로서 본원에 참조로서 포함됨)에 개시된 바와 같이 추가의 안정화 측면 서열뿐만 아니라 이량체 및 삼량체를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 다량체는 다수의 동일한 펩타이드로 구성된 호모머 또는 서로 다른 펩타이드로 구성된 헤테로머일 수 있다. 명시한 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드의 아미노산 서열은 임의의 아미노산 서열이 측면에 있을 수 있다. 펩타이드에 안정 효과를 갖고 따라서 이들의 생물학적 이용성을 증가시키는 측면 서열이 바람직할 수 있다. 또한, 그 밖의 펩타이드 모방체(peptidomimetics)가 또한 본 발명의 펩타이드에서 유용할 수 있다. 본 발명의 펩타이드는 또한, 예를 들어, 인산화, 글리코실화(glycosylation), 페길화(pegylation), 또는 지질화(lipidation)에 의해 변형될 수 있는 펩타이드를 포함한다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 또한 본 발명의 펩타이드의 기능적으로 동일한 변종 또는 유사체를 포함할 수 있다. 이와 같이, 부분적인 서열 상동성을 갖는 펩타이드, 하나 이상의 특이 보존적 및/또는 비-보존적인 아미노산 변화를 갖는 펩타이드 및 펩타이드의 생물학적 또는 구조적 특성(즉, RHAMM에 결합하는 능력)을 변경하지 않는 펩타이드 접합체(peptide conjugates)를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
기능성 유사체에 관해서, 생물학적으로 기능적인 펩타이드 유사체의 정의에 내재하는 것은, 분자의 정의된 부분 내에서 변경될 수 있고, 여전히 동등한 생물학적 활동의 허용 수준을 갖는, 이 경우, RHAMM에 결합하는 능력을 포함하는, 분자를 초래할 수 있는 변경의 수에 제한이 있다는 개념이다라는 것은 본 기술분야의 숙련자가 잘 이해할 것이다 서로 다른 치환을 갖는 다수의 서로 다른 펩타이드/단백질이 쉽게 제조되고 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 또한 특정 잔기는, 일반적으로 교환되지 않는 수용체 인식 영역에서의 잔기와 같은, 단백질 또는 펩타이드의 생물학적 또는 구조적 특성에 특히 중요할 수 있다고 생각된다. 기능성 유사체는 일반적으로 보존적 또는 비-보존적인 아미노산 치환에 의해 제조될 수 있다. 아미노산 치환은 일반적으로, 예를 들어, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등과 같은 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사성에 근거할 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위 내에서, 보존적 아미노산 변화는 원제 존재하는 것과 동일한 유형일 수 있는 특정 위치에서의 아미노산 변화, 즉 소수성 아미노산, 염기성 아미노산 등과 교환되는 친수성 아미노산을 의미한다. 보존적 치환의 예는, 제한 없이, 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 비-극성(소수성) 잔기의 치환, 아르기닌과 리신 사이, 글루타민과 아스파라긴 사이, 글리신과 세린 사이와 같은 일극성 잔기의 치환, 리신, 아르기닌, 또는 히스티딘과 같은 염기성 잔기의 치환, 아스파르트산 또는 글루타민산과 같은 산성 잔기의 치환, 이소류신, 류신, 또는 발린과 같은 분쇄 아미노산의 치환, 페닐알라닌, 타이로신 또는 트립토판과 같은 방향족 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 이러한 아미노산 변화는 펩타이드의 전하 및/또는 구성을 크게 변경시키지 않는 기능성 유사체를 초래할 수 있다.
이러한 보존적 변화의 예는 숙련자에게 잘 알려져 있으며 본 발명의 범위 내에 있다. 보존적 치환은 또한 그 결과로 생긴 펩타이드가 본 발명의 펩타이드에 대해 생물학적으로 기능적인 등가물인 경우, 비-유도체화 잔기를 대신해서 화학적으로 유도체화된 잔기의 사용을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 SEQ ID NOs: 1 내지 17와는 다른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 펩타이드는 또한 하나의 돌연변이에 의한 SEQ ID NOs: 1 내지 17와는 다른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함할 수 있으며, 여기서 하나의 돌연변이는 하나의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환을 나타낸다.
도 10A 및 도 10B는, 예를 들어, RHAMM-결합 펩타이드(SEQ ID NO: 1)인 경우, 1, 3, 5, 6 및 11번 위치에서의 알라닌 치환이 RHAMM에 대한 치환된 RHAMM-결합 펩타이드의 적절한 결합에 영향을 미치지 않는 것으로 보이는 것을 설명하고 있다.
도 17A 및 도 17B는, 예를 들어, RHAMM-결합 펩타이드(SEQ ID NO: 14)인 경우, 1, 4, 7, 8, 11 및 14번 위치에서의 알라닌 치환이 RHAMM에 대한 치환된 RHAMM-결합 펩타이드의 적절한 결합에 영향을 미치지 않는 것으로 보이는 것을 설명하고 있다.
RHAMM -결합 펩타이드의 제조
본 발명의 펩타이드는 고체상 합성과 같은 단백질 화학에서 공지된 기술을 사용하는 화학 합성에 의해[6, 7, 8, 참조로 포함됨] 또는 합성 펩타이드를 제조하기 위한 균일 용액(homogenous solution)에서의 합성에 의해[9, 참조로 포함됨] 특히 바람직하게 본 기술분야의 숙련자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 펩타이드는 본 기술분야의 숙련자에게 공지된 재조합 DNA 기술의 사용에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있는 벡터를 포함한다는 것이 더 고려된다.
RHAMM -결합 펩타이드의 분리
RHAMM-결합 펩타이드는 RHAMM에 결합하는 펩타이드에 대한 샘플을 분석함으로써 분리될 수 있다. 공동 면역침강법(co-immunoprecipitation), 기울기 및 크로마토그래피 칼럼을 통한 가교 및 공동 정제법(co-purification)을 포함하는, 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 모든 분석 시스템 또는 시험 방법이 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 표지된 RHAMM은 실시예 1에 더욱 상세하게 설명된 바와 같이 파지 디스플레이 라이브러리를 검출하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드에 대해 제조된 항체가 RHAMM 결합 친화성을 갖는 다른 펩타이드를 분리하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 표지된 항체는 파지 디스플레이 라이브러리 또는 생물학적 샘플을 검출하는데 사용될 수 있다. 또한, RHAMM 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 생물학적 샘플 또는 HA-결합 단백질을 암호화하는 핵산에 대한 라이브러리를 검출하는데 사용될 수 있다.
조성물
일 실시형태에서, 본 발명은 체내 투여에 적절한 생물학적으로 호환 가능한 형태로 피험자에 투여하기 위한 하나 이상의 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드를 포함할 수 있는 조성물을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 체외에서 샘플을 연구하기 위해 사용되는 하나 이상의 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드를 포함할 수 있는 조성물을 제공한다.
"체내 투여에 적절한 생물학적으로 호환 가능한 형태"란, 치료 효과가 독성 효과보다 큰, 투여되는 물질의 형태를 의미한다. 물질은 모든 동물, 바람직하게는, 인간에 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 치료적으로 활성인 양, 또는 "효과적인 양"은 인간의 면역 반응을 유도할 수 있는 바람직한 결과를 달성하는데 필요한, 투여량과 기간 동안 효과적인 양으로 정의될 수 있다. 적절한 투여 경로는 근육 주사, 피하 주사, 정맥 주사 또는 복강내 주사, 경구 및 비강내 투여일 수 있다.
허용 가능한 담체는 본 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 멸균 생리식염수, 락토스, 수크로스, 인산 칼슘, 젤라틴, 덱스트린, 한천, 펙틴, 땅콩기름, 올리브유, 참기름 및 탈염수를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은, 예를 들어, 솔비톨, 만니톨, 전분, 수크로스, 덱스트린 및 글루코오스와 같은 탄수화물, 알부민 또는 카세인과 같은 단백질, 및 알칼리 인산염과 같은 완충제를 포함하는 하나 이상의 안정화제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 본 발명의 펩타이드의 세포 증식 억제 특성을 향상시킬 수 있는 하나 이상의 보강제(adjuvant)를 포함할 수 있다.
주사용 조성물은, 독점적이지는 않지만, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 비히클 또는 희석제와 함께, 그리고 적절한 pH를 갖고 생리학적 유체와 삼투압이 같은 완충액에 포함된 본 발명의 펩타이드 또는 핵산을 포함할 수 있다. 증류수, 생리적 식염수, 및/또는 완충액과 같은 모든 약학적으로 적절한 희석제가 주사용 조성물에 사용될 수 있다. 주사용 조성물은 종래의 용적-중량에 의한 방법으로 제조될 수 있다. 특정양의 펩타이드가 희석제 또는 용매로 필요한 용적으로 희석될 수 있다. 용액은 이후 멸균 필터로 여과되어, 병에 담기거나, 또는 앰플에 담길 수 있다. 그에 따른 용액은 안정한 투명 액체일 수 있고, 화학물질 또는 기타 불순물을 포함하지 않을 수 있다.
검출 프로브
세포, 조직 또는 장기를 제한 없이 포함하는 샘플 내의 RHAMM 발현의 검출은 적절한 프로브에 의해 수행될 수 있다. 프로브는 적어도 하나의 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드와 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 검출 가능한 표지는 검출 수단에 의해 검출될 수 있다. 검출 수단은 검출 가능한 표지에 측정 가능한 반응을 제공할 수 있는 모든 검출 기술일 수 있다. 본 발명의 양태에서, 측정 가능한 반응은 이미지의 형태로 제공될 수 있다. 검출 가능한 표지는 적절한 검출 수단으로 RHAMM 양성 세포의 위치 검출을 가능하게 할 수 있다. 본 발명의 프로브는 RHAMM 양성 세포의 뒤이은 이동 및 성장을 가능하게 할 수 있다. 이와 같이, 일 실시형태에서, 본 발명의 프로브는 진단 및 예측 방법에서 RHAMM 양성 세포를 연구하는데 제한 없이 사용될 수 있다.
프로브의 제조 발명은 본 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다[10, 11, 참조로 포함됨].
표지 방법은 본 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 바람직한 표지는 체내 영상화에서 사용하기에 적합한 것일 수 있다. 항-RHAMM 프로브는 검출 이전에 분리 가능하게 표지화될 수 있다. 대안적으로, 혼성화(hybridization) 생성물에 결합할 수 있는 검출 가능한 표지가 사용될 수 있다. 이러한 검출 가능한 표지는 검출 가능한 물리적 또는 화학적 특성을 갖고 면역 분석 분야에서 잘 발달된 모든 물질을 제한 없이 포함할 수 있다. 본 발명에서의 사용을 위한 표지는, 제한 없이, 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학, 또는 화학 수단과 같은 검출 수단에 의해 검출될 수 있는 모든 조성물일 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 표지는 비오틴(biotin)-기반 표지, 자기(magnetic) 표지(예를 들어, DYNABEADSTM), 방사성 표지(예를 들어, 3H, 35S, 32P, 51Cr, 또는 125I), 형광 표지(예를 들어, 플루오레세인, 로마딘(rhodamine), 텍사스 레드(Texas Red), 등), 전자 밀도(electron-dense) 시약(예를 들어, 금), 효소(예를 들어, 알칼리 포스파타아제(phosphatase), 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase), 또는 EUSA에서 일반적으로 사용되는 것들), 디곡시게닌(digoxigenin), 또는 항혈청(antisera) 또는 단일클론 항체가 사용될 수 있는 합텐(hapten) 또는 단백질을 포함한다(예를 들어, 본 발명의 펩타이드는, 예를 들어, 방사성표지(radiolabel)를 펩타이드에 통합함으로써 검출 가능하고, 펩타이드에 특이적으로 반응하는 항체를 검출하는데 사용될 수 있다). 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드는, 예를 들어, 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA) 또는 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(keyhole limpet haemocyanin)에 결합될 수 있는 담체를 구비할 수 있다.
RHAMM-결합 펩타이드는 금 또는 폴리스티렌의 미립구(microsphere), 슬라이드, 칩과 같은 고체 담체에 또는 마이크로타이터 플레이트(microtitre plate)의 벽에 공유 또는 비-공유 결합될 수 있다. RHAMM-결합 펩타이드는 비오틴, 플루오레세인 및 양고추냉이 과산화효소와 같은 효소로부터 선택되는 표지로 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
사용되는 특정 표지는 RHAMM/RHAMM-결합 펩타이드 복합체의 제조에 방해가 되지 않는 한 본 발명에서 중요하지 않을 수 있다. 그러나, 일 실시형태에서, RHAMM/RHAMM-결합 펩타이드 복합체 및 종양 전구 세포의 체내 검출을 위한 SPECT, CT 및 PET 영상화와 같은 기술들의 사용의 용이함으로 인해, 영상화 성분은 방사성핵종(radionuclide)(예를 들어, 18F, 11C, 13N, 64Cu, 68Ga, 123l, 111In, 99 mTc, 등)일 수 있다. SPECT 또는 PET 영상화에서 사용되는 물질을 위한 적절한 영상화 성분의 결정은 또한 방사성핵종이 발생기 또는 사이클로트론(cyclotron)에 의해 생성되었는지 또는 방사성핵종이 킬레이터(chelator)인지 또는 유기/할로겐화물인지에 따라 결정될 수 있다. 도 15 및 도 16은 Ga-DOTA-결합 펩타이드(SEQ ID NO: 1) 및 Re(CO)3+-동조 펩타이드(SEQ ID NO: 1)의 합성 및 질량 스펙트럼 특성을 설명한다.
직접 표지된 프로브는, 본원에서 사용된 바와 같이, 검출 가능한 표지가 부착될 수 있는 프로브일 수 있다. 직접 표지가 이미 프로브에 부착되기 때문에, 프로브를 검출 가능한 표지와 결부시키는데 후속 단계가 필요하지 않다. 반면에, 간접 표지된 프로브는, 일반적으로 RHAMM-결합 펩타이드가 표적 RHAMM과 혼성화된 이후, 검출 가능한 표지가 이후 결합되는 부분(moiety)을 갖는 것일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 임의의 RHAMM-결합 펩타이드를 인식할 수 있는 단일클론 항체(mAb)가 또한 형성되어 샘플 내의 RHAMM-결합 펩타이드의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. Mab는 본 발명의 조성물의 품질을 시험하는 신속하고 간단한 방법을 제공할 수 있다. 일반적으로, 항체 제조 방법이 잘 알려져 있다. 예를 들어, 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드를 특이적으로 인식할 수 있는 mAb를 생산하는 방법이 본 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다.
일반적으로 펩타이드는 프로인트 항원보강제(Freund's adjuvant) 내에서 마우스에 주사될 수 있다. 3 주 동안 9 번의 주사 이후, 마우스 비장을 제거하고 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)에 재부유시킨다. 비장 세포는 림프구의 소스 역할을 할 수 있고, 이의 일부는 적절한 특이성의 항체를 제조할 수 있다. 이들은 이후 영구 성장 골수종 파트너 세포와 융합될 수 있고, 융합 생성물은 HAT와 같은 선택적 약제의 존재 하에 다수의 조직 배양 용기에 분주될 수 있다. 이후 용기는 ELISA에 의해 유용한 항체를 형성하는 세포를 포함하는 것들을 동정하기 위해 선별될 수 있다. 이들은 이후 새롭게 분주될 수 있다. 성장 기간 이후, 이들 용기는 항체 생성 세포를 동정하기 위해 다시 선별될 수 있다. 90% 이상의 용기가 항체 생산에 긍정적인 단일클론을 포함할 때까지 여러 번의 복제 과정이 수행될 수 있다. 이 과정으로부터 mAb를 생산할 수 있는 클론의 안정적인 라인이 확립될 수 있다. mAb는 이후 단백질 A 또는 단백질 G 세파로오스(Sepharose)를 이용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다(미국 특허 제 4,609,893호, 제 4,713,325호, 제 4,714,681호, 제 4,716,111호, 제 4,716,117호 및 제 4,720,459호 참조).
RHAMM -결합 펩타이드의 적용
본 발명은 리간드-RHAMM 매개 세포 운동성 반응을 촉진하는 중요한 역할을 할 수 있는 RHAMM/리간드 복합체의 형성을 방해할 수 있는, 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드에 RHAMM을 표적으로 하는 것을 제한 없이 포함할 수 있는 검출, 영상화, 진단 및 치료 전략을 포함할 수 있다. 이들 방법은 병원성 질환, 염증 및 병원성 감염과 관련된 질환을 치료하기 위한 그 밖의 공지된 치료법과 함께 사용될 수 있다.
1. RHAMM 양성 세포의 검출
도 9를 참조하면, 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드는 체외 또는 체내 영상화를 용이하게 하기에 충분히 긴 생물학적 환경(대략 110 내지 대략 250 분의 반감기)에서 적당한 안정성을 갖는 것으로 나타났다.
본 발명의 일 실시형태에서, RHAMM-결합 펩타이드는 RHAMM 양성 세포를 동정하는 방법에서 사용될 수 있다. RHAMM 양성 세포를 동정하기 위한 방법은 세포를 본 발명의 프로브를 접촉시키는 단계 및 세포 내의 검출 가능한 표지를 검출하기 위한 적절한 검출 기술을 적용하는 단계를 포함할 수 있고, RHAMM 양성 세포의 동정은 검출 기술을 이용한 검출 가능한 세포의 검출을 기반으로 결정될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 피험자의 조직 또는 장기 내의 RHAMM 발현을 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) 본 발명에 따른 프로브를 피험자에 투여하는 단계; 및 (b) 피험자의 조직 또는 장기 내의 표지를 검출하기 위한 검출 기술을 적용하는 단계를 포함할 수 있다.
종양형성(tumorigenic) 전구 세포는, 또 다른 실시형태에서, RHAMM 발현에 의해 특징지어질 있기 때문에, 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드는 종양 생검(biopsy)과 같은 샘플이, 암 환자를 전이로의 진행 위험에 처하게 할 수 있는, 종양형성 전구 세포를 포함하는지를 결정하는 진단 방법에서 사용될 수 있다. 하나의 이러한 진단 방법은 샘플내에 RHAMM의 존재를 검출하기 위해 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드를 사용하는 단계를 포함할 수 있다. RHAMM 양성 세포는 샘플이 암 전구 세포를 포함하는 것을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따른 암 환자를 진단하기 위한 방법은 (a) 환자로부터 조직 샘플을 획득하는 단계; (b) 상기 샘플을 본 발명의 프로브에 접촉시키는 단계; (c) 샘플 내의 프로브의 검출 가능한 표지를 검출하기 위한 검출 기술을 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 샘플 내의 RHAMM 발현의 검출은 암 진단을 나타낼 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 따른 암 환자를 진단하기 위한 방법은 (a) 본 발명에 따른 프로브를 피험자에 투여하는 단계; 및 (b) 피험자의 조직 또는 장기 내의 프로브의 표지를 검출하기 위한 검출 기술을 적용하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 따른 암 환자에 대한 예후를 결정하기 위한 방법은 (a) 환자로부터 종양 조직 샘플을 획득하는 단계; (b) 상기 샘플을 본 발명의 프로브에 접촉시키는 단계; (c) 샘플 내의 프로브의 표지를 검출하기 위한 검출 기술을 적용하는 단계; 및 (d) 환자의 예후를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 예후는 환자 내의 암의 공격성 또는 전이의 가능성을 예측할 수 있다. 샘플 내의 RHAMM 발현의 검출은 나쁜 예후를 나타낼 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암 환자에 대한 치료의 과정을 결정하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 환자로부터 종양 조직 샘플을 획득하는 단계; (b) 상기 샘플을 본 발명의 프로브에 접촉시키는 단계; (c) 샘플 내의 프로브의 표지를 검출하기 위한 검출 기술을 적용하는 단계; (d) 환자의 예후를 결정하는 단계를 포함한다. 상기 예후는 환자 내의 암의 공격성의 가능성을 예측할 수 있다. 따라서, 샘플 내의 측정 가능한 RHAMM 발현의 검출은 나쁜 예후를 나타내며; 상기 예후에 근거하여 환자에 대한 치료의 과정을 처방하는 단계를 포함한다.
본 발명의 진단 및 예측 방법의 일 양태에서, 샘플 내의 RHAMM 발현은 알려진 음성 대조군 또는 알려진 표준과 비교될 수 있다. 알려진 음성 대조군 또는 알려진 표준과 관련된 샘플 내의 측정 가능한 RHAMM 발현의 검출은, 경우에 따라서, 샘플 내의 RHAMM의 존재, 암의 진단, 또는 나쁜 예후를 나타낼 수 있다.
도 6 및 도 7은 플루오레세인 결합 RHAMM-결합 펩타이드 SEQ ID NO: 14 (도 6A; SEQ ID NO. 35) 및 SEQ ID NOs: 1 및 9 (도 7; SEQ ID NOs: 25 및 29)를 사용한 인간 유방암 세포의 시각화를 도시한다.
도 13은 플루오레세인 결합 RHAMM-결합 펩타이드 SEQ ID NO: 1(SEQ ID NO: 25)를 사용한 인간 난소암 세포 내의 시각화를 도시하는 반면, 도 14는 플루오레세인 결합 RHAMM-결합 펩타이드 SEQ ID NO: 9(SEQ ID NO: 29)를 사용한 인간 전립선암 세포의 시각화를 나타낸다. 도 14에 도시된 바와 같이, 공격적으로 침습성이고 전이성인 PC3mLN4 인간 전립선암 세포주는, HA 펩타이드 모방체(SEQ ID NO: 9)의 신속한 흡수를 나타내는 형광 염색에 대해 매우 양성적이다.
본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드의 세포내 흡수는 특이적 항-RHAMM mAb에 의해 차단될 수 있지만 특이적 항-CD44 mAb에 의해서는 차단되지 않지만, 이는 CD44에의 HA의 결합을 차단할 수 있다(도 6, 도 7, 도 13 및 도 14 참조). 이러한 결과는 본 발명의 HA 펩타이드 모방체가 RHAMM 의존성 메커니즘에 의해 전립선, 유방 및 난소 암세포와 연관될 수 있고 이들 세포에 흡수될 수 있다는 것을 나타낸다.
2. 치료법
도 9를 참조하면, 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드는 치료 방법에서의 사용을 용이하게 하기에 충분히 긴 생물학적 환경(대략 110 내지 대략 250 분의 반감기)에서 실질적 안정성을 가질 수 있다.
본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드는 암, 염증 및 자기면역 질환, 포유동물에서의 조직 외상 및 이의 회복과 관련된 섬유증 장애와 같은 세포 운동(cell locomotion)을 포함하는 병원성 질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드는 RHAMM/리간드 복합체의 형성을 방해함으로써 RHAMM/리간드 복합체의 형성이 원인인 장애 또는 질환의 치료용 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 세포 내의 RHAMM 발현과 관련된 장애 또는 질환을 앓고 있을 수 있는 피험자를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 효과적인 양의 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드 또는 상기 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 효과적인 양의 조성물을 피험자에게 최소한 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 조직 흉터를 예방 또는 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 효과적인 양의 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드 또는 본 발명의 상기 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 이를 필요로 하는 피험자에 최소한 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
암세포의 증식을 억제하는 RHAMM-결합 펩타이드의 능력은 종양 전이를 예방하는 효과 및 암 화학치료제로서의 이용을 시사할 수 있다. 따라서, 본 발명은 효과적인 양의 RHAMM-결합 펩타이드 또는 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 이를 필요로 하는 피험자에 투여하는 단계를 포함하는 종양 전이를 예방 또는 감소시키는 방법을 제공한다.
이와 같이, 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드는 폐암, 위장암, 유방암, 방광암, 피부암(흑색종 및 비-흑색종), 뇌암, 자궁암, 및 백혈병을 제한 없이 포함하는, RHAMM 발현과 관련될 수 있는 암을 치료하는데 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 피험자의 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공할 수 있다. 이 방법은 효과적인 양의 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드 또는 본 발명의 상기 하나 이상의 RHAMM-결합 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 이를 필요로 하는 피험자에 최소한 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드는 암과 같은 RHAMM 발현과 관련된 장애 또는 질환을 갖는 환자에서의 병적 상태 및 사망률을 감소시키는 기존의 치료법과 함께 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시형태에서, RHAMM 발현과 관련된 장애 또는 질환에 대해 피험자를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 상기 RHAMM 관련 장애에 대한 적어도 하나의 다른 치료법과 함께 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드를 피험자에 최소한 투여하는 단계를 포함할 수 있다. RHAMM-결합 펩타이드와 적어도 하나의 치료법의 조합은 질병 치료의 효능을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 암 치료의 경우, 피험자는 또한 영양 세포 및 내피 세포에 대한 증식 신호를 제공할 뿐만 아니라 혈관형성 스위치의 역할을 할 수 있는 하나 이상의 성장 인자를 표적으로 할 수 있는 저분자 약품, siRNAs, 안티센스 치료법, 또는 이들의 조합과 같은 혈관형성을 상당히 감소시킬 수 있는 치료법이 투여될 수 있다. 성장 인자는 다양한 암의 성장 및 생존에 필요할 수 있으며 암 진행에 필수적일 수 있다. 따라서, RHAMM-결합 분자를 이용하는 본 발명의 항암 방법은 VEGF, FGR 및 hCG를 포함하는, 하나 이상의 성장 인자에 표적이 되는 치료법과 결합될 수 있다. 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드는 또한 방사선요법(radiotherapy)또는 화학요법(chemotherapy)과 결합될 수 있다. 이러한 결합 요법은 암을 치료하는데 시너지 효과에 기여한다.
본 발명자들은, 예를 들어, 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드가 인간 상피성 난소암(EOC)의 증식을 억제할 수 있다는 것을 증명하였다(도 11 참조). 본 발명자들은 또한 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드가 인간 EOC 세포의 생존 능력을 감소시킬 수 있다는 것을 증명하였다(도 12 참조).
앞서 제안한 바와 같이, 암 전구 세포를 동정함으로써, 본 발명의 검출 방법은 이들 전구 세포의 말단 분화(terminal differentiation)를 선택적으로 사멸시키거나 강제하는 신규한 치료법의 개발을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 기술은 전이 위험에 있거나 위험이 없는 환자에 대한 선택적인 치료를 가능하게 할 수 있는, 종양형성 전구 세포 아형을 많이 포함할 수 있는 종양의 체내 영상화를 위해 사용될 수 있다. 가장 중요하게, 본 발명의 기술은 유방암과 같은 원발성 암 내의 많은 종양형성 전구 세포 아형에 항암제를 전달하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 RHAMM을 발현하는 세포에 세포독성의 표적화된 전달을 가능하게 하기 위해 세포독성 약품과 결합될 수 있다. 이러한 메커니즘에 의해, 알칼화제(alkylating agent), 항신생혈관제(anti-angiogenic agent), 세포분열억제제(antimitotic), 호르몬 치료제, 뉴클레오시드 유사체(nucleoside analogue), 또는 이들의 전구약물을 포함하는, 그 밖의 치료제의 전달이 가능할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드가 입자 방출 방사성핵종에 결합할 수 있고, 따라서 RHAMM 양성 세포에 세포 파괴제를 선택적으로 전달하는 메커니즘을 제공하는 방사선 치료가 고려된다. 치료용 방사성핵종은 90Y, 또는 186Re와 같은 베타-방출 방사성핵종; 47Sc, 153Sm, 177Lu, 또는 188Re와 같은 베타/감마 방출 방사성핵종; 213Bi, 223Ra, 또는 225Ac와 같은 알파-방출 방사성핵종; 또는 67Ga 또는 111ln과 같은 오거(Auger) 방출 방사성핵종을 포함할 수 있다.
3. 투여 및 투여량
본 발명의 프로브 및/또는 펩타이드는, 예를 들어, 주사(예를 들어, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 또는 피내), 흡입, 경피 도포, 직장 투여, 비강내 또는 경구 투여를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는, 본 기술분야에 공지된 모든 경로를 이용하여 포유류 피험자에 직접 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 검출 프로브 및/또는 펩타이드는 피하 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 검출 프로브 및/또는 펩타이드는 정맥내 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 효과적인 양의 프로브 또는 RHAMM-결합 펩타이드는 주변 근육, 선내(intraglandular), 및 피하 투여 경로를 포함하고, 상기 프로브 및/또는 펩타이드가 RHAMM 발현 세포 및 종양형성 세포군을 갖는 부위에 수 시간 내에 체내 전달될 수 있게 하는, 주변 투여와 같은 비-침투성(non-systemic) 국부 투여를 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 이식 가능한 장치를 통해 RHAMM-결합 펩타이드를 투여할 수 있다. 본 발명의 양태에서, 이식 가능한 장치는 RHAMM-결합 펩타이드의 방출을 제어할 수 있다.
본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드는 본원에서 상기한 바와 같이 체계적으로 제공될 수 있다. 본 기술분야의 숙련자가 이해하듯이, 본 발명의 RHAMM-결합 펩타이드는 종래의 리포좀, 전문화된 리포좀(specialized liposome), 지질 형성(lipid formulation) 및 면역리포좀(immunoliposome) 내에서 사용될 수 있다.
리포좀은 단일막(unilamellar)이거나 다중막(multilamellar)일 수 있고 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine), 콜레스테롤(cholesterol), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 디미리스토일포스파티딜콜린(demyristoylphosphatidylcholine) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 성분으로 제조될 수 있다. 다중막 리포좀은 단일막 소포체(vesicle)와 유사한 성분의 다중막 소포체를 포함할 수 있으나, 용액 또는 에멀젼 내의 은 성분이 포획되는 다수의 구획을 형성할 수 있도록 제조될 수 있다. 또한, 폴리에틸렌글리콜 또는 다른 물질과 같은 그 밖의 보강제 또는 조절제가 리포좀 제조에 포함될 수 있다.
리포좀의 제조는 디팔미토일포스파티딜콜린:콜레스테롤(1:1)을 포함할 수 있으나, 본 발명의 조성물에서 임의의 수의 리포좀 이중층 조성물이 사용될 수 있다는 것을 본 기술분야의 숙련자는 이해할 것이다. 리포좀은 참조로 포함된 미국 특허 제 4,235,871호 및 문헌 RRC(리포좀: 실질적인 접근(A Practical Approach). IRL Press, Oxford, 1990, 33-101쪽)에 개시된 것과 같은 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다.
RHAMM-결합 펩타이드를 포함하는 리포좀은, 헵탄, 효소, 항체 또는 항체 단편, 사이토카인(cytokine) 및 호르몬 및 기타 작은 단백질, 바람직한 효소 또는 표면 인식 기능을 리포좀에 부여하는 폴리펩타이드 또는 비-단백질 분자와 같은 리포좀의 외부에 결합되는 비-폴리머 분자를 갖는 것과 같은 변형을 가질 수 있다. 특이 조직 또는 세포 유형에 리포좀을 우선적으로 표적으로 하는 표면 분자는 예를 들어, 특이 항원을 갖는 세포에 리포좀을 표적으로 하는 항체를 포함할 수 있다. 이러한 분자를 결합시키는 기술은 본 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제 4,762,915호 참조, 이의 개시는 본원에 참조로 포함됨). 대안적으로 또는 이와 함께, 양 또는 음의 순전하를 갖는 임의의 수의 지질이 리포좀 막의 표면 전하 또는 표면 전하 밀도를 변경시키는데 사용될 수 있다는 것을 본 기술분야의 숙련자는 이해할 것이다.
리포좀은 또한 지질 소포막(vesicle membrane)의 제어된 분해를 제공하도록 지질 이중층의 성분으로서 열 민감성 또는 pH 민감성 지질을 포함할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 환자에 투여되는 투여량은, 외과의가 RHAMM/RHAMM-결합 펩타이드 복합체의 영상화에 의해 검출된 종양형성 세포군을 제거하는 생체검사 또는 기타 과정을 수행할 수 있도록, 충분한 특이성으로 RHAMM/RHAMM-결합 리간드 복합체 및 종양형성 세포군의 부위를 효과적으로 영상화할 수 있는 적절한 투여량일 수 있다. 투여량은 치료되는 환자의 체중 또는 표면적뿐만 아니라, 사용되는 특정 벡터(예를 들어, 펩타이드 또는 핵산)의 효능 및 환자의 상태에 의해 결정될 수 있다. 투여량의 크기는 또한 특정 환자에의 프로브의 투여에 따른 모든 유해한 부작용의 존재, 종류 및 범위에 의해 결정될 수 있다.
투여에 있어서, 본 발명의 검출 프로브는 폴리펩타이드 또는 핵산의 LD-50(50% 치사량) 및 환자의 성분 및 전반적인 건강에 적용된 바와 같이, 다양한 농도의 폴리펩타이드 또는 핵산의 부작용에 의해 결정되는 비율로 투여될 수 있다. 투여는 단일 또는 분할 투여를 통해, 예를 들어, 일정 기간 동안(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 일 또는 1 내지 3 주 이상) 정기적으로(예를 들어, 매일) 투여되는 투여량을 통해 투여될 수 있다.
여전히 다른 실시형태에서, 표지된 프로브의 대략 5 내지 대략 2000의 LD50 단위가 인정된 임상 표준 및 실습을 이용하여 상기 피험자에 투여될 수 있다.
상기한 개시는 일반적으로 본 발명을 설명한다. 더욱 완전한 이해가 다음의 특정 실시예를 참조로 달성될 것이다. 이들 실시예는 오직 설명의 목적으로만 설명되며 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다. 상황이 편법을 제안하거나 제공할 수 있으므로 등가물의 형태와 대체의 변경이 고려된다. 특정 용어가 본원에서 사용되었지만, 이들 용어는 서술적인 의미로 의도되었으며 제한의 목적은 아니다.
실시예
실시예는 설명의 목적으로 제공되며 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.
실시예 1: BLAST 검색 및 서열 정렬
서열 상동성을 보여주는 단백질의 리스트를 만들기 위해 기본 검색 정렬 검색 도구(basic search alignment search tool, BLAST)에 RHAMM(SEQ ID NO: 19)의 HA-결합 도메인(aa 718-750)에 해당하는 질의 서열(query sequence)을 사용하였다. 도 1B는 분자 영상화 프로브 설계 및 최적화의 순서도를 도시한다. HA-결합 도메인은 상동 단백질 서열을 결정하기 위해 BLAST에서 질의 서열로서 사용하였다. 이후, 상동 서열을 위한 추정되는 결합 파트너(리간드)를 밝혔다. 펩타이드의 라이브러리를 리간드 서열의 절단에 근거해서 합성하였고 고친화성 리간드를 결정하기 위한 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 결합 분석을 이용하여 선별하였다. 이후 후보 펩타이드 리간드를 다양한 체외 결합 분석을 사용하여 더 평가하였다.
RHAMM과 MAPs 및 키네신의 미세관 결합 도메인과의 쌍대 비교(pair-wise comparison)는 적당한 서열 상동성(ClustalX2[12]를 사용하여 계산된 바와 같이 대략 17% 내지 25%)을 밝혀냈지만, MAPs와 RHAMM은 이들의 튜불린 결합 부위의 아미노산 서열과 관련해서 유사한 생리화학적 특성을 공유했다. 다시 말해서, RHAMM과 MAPs 모두는 튜불린에 결합하는 것으로 상정되는 염기성 잔기의 구간을 갖는다. 또한, MAPs의 튜불린 결합 부위의 이차 구조와 RHAMM의 히알루로난 결합 부위는 동일한 정도의 헬리시티(helicity)를 가지며 이들 모두는 베이직-지퍼 도메인(basic-zipper domain)으로 분류될 수 있다[13].
RHAMM은 세포외 표면에서의 HA와 시토졸(cytosol) 내의 미세관과 결부시키기 위해 공통 결합 부위를 사용하는 것으로 보고되었다[14]. 미세관 관련 운동 단백질과 MAPs는 튜불린의 CTT에의 직접적인 결합을 보이기 때문에, 본 발명자들은 RHAMM이 다른 튜불린 아류형의 CTT를 나타내는 합성 펩타이드와의 직접적인 상호작용을 보일 수 있다는 가설을 세웠다. HA는 주로 RHAMM 상의 음전하기와 양전하기 사이의 이온 상호작용을 통해 RHAMM과 상호작용을 하기 때문에, 음전하의 유사한 분포를 갖는 분자는 원칙적으로 HA 모방체의 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 튜불린의 CTT 상의 Glu 및 Asp 잔기는 HA 상의 카르복실기를 모방할 수 있다. 따라서, RHAMM의 HA 결합 도메인에 합성 CTT의 결합은 HA 결합에 중요할 것으로 생각되는 동일한 하전 측쇄를 이용할 수 있다.
실시예 2: RHAMM 에 대한 튜불린 -유래 펩타이드의 선별
재료: 모든 용매를 추가의 정제 없이 사용하였고, VWR, 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 또는 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)에서 구입하였다. 펩타이드 합성을 위한 플루오레닐메틸옥시카르보닐(fluorenylmethyloxycarbonyl, Fmoc)-링크 아미드 MBHA(100-200 메쉬) 수지, Fmoc 아미노산, Fmoc-보호된 아미노헥산산(Fmoc-protected aminohexanoic acid, Fmoc-Ahx) 및 2-(1H-벤조트리아졸 1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(2-(1H-benzotriazole 1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate, HBTU) 결합 시약은 펩타이드 인터내셔널(Peptides International)로부터 입수하였다. N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'- ethylcarbodiimide hydrochloride, EDAC), N-하이드록시설포숙신이미드 나트륨 염(N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt, sulfo-NHS), 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC) 이성질체 I 및 소태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)은 시그마 알드리치에서 구입하였다. NHS-비오틴은 노바 바이오켐(Nova BioChem)으로부터 입수하였다. 항-RHAMM(Santa Cruz Biotechnology, USA), 항-CD44(Pharmigen) 및 IgG ab(Santa Cruz Biotechnology USA)와 같은 항체는 상업적으로 입수하였다.
펩타이드 합성: 다른 튜불린 아류형의 CTT 및 H12 영역에 해당하는 12 개의 아미노산 잔기를 갖는 열일곱(17) 개의 펩타이드를 Fmoc 프로토콜에 따라 고형 펩타이드 합성법을 이용하여 합성하였다.
링크 아미드 MBHA 수지(0.1 mmol) 상의 펩타이드 사슬의 연장을 자동화된(APEX 396 자동-합성기(auto-synthesizer)) 및/또는 Fmoc 탈보호 및 아미노산 결합 사이클을 포함하는 표준 고상 펩타이드 합성법을 이용하는 수동 방법에 의해 수행하였으며, 각각의 사이클을 카이저 테스트(Kaiser test)를 이용하여 관찰했다[15, 16]. 합성 전반에 걸쳐(15 분 및 20 분의 기간) 반복적인 Fmoc 탈보호를 N,N-디메틸포르마이드(N,N-dimethylformide, DMF) 내의 20% 피페리딘 용액을 사용하여 수행하였다. 모든 아미노산 결합은 30 분 및 90 분 간격으로 0.05 이상의 농도의 Fmoc-보호된 아미노산 및 HBTU, DMF 내의 5 당량의 N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-diisopropylethylamine, DIPEA)을 사용하여 수행하였다. 각각의 탈보호 및 결합 단계 이후, 수지를 DMF(3x)와 디클로로메탄(DCM)(3x)으로 반복해서 세척하였다. Fmoc-Ahx는 동일한 매개변수를 사용하여 결합하였다. 아미노 말단의 아실화(acylation)를 Fmoc 탈보호 이후 DMF 내의 10% 무수 아세트산을 사용하여 수행하였다. 플루오레세인 결합은 펩타이드의 아미노기를 DMF 내의 FITC 형광 염료(4 당량)와 DIPEA(2 당량)으로 4 시간 동안 반응시켜 수행하였다.
시스테인-함유 펩타이드의 완전한 탈보호는 1.0 내지 1.5 시간 동안 94% v/v 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA), 1 % v/v 트리이소프로필실란(triisopropylsilane, TIPS), 2.5% v/v H2O 및 2.5% v/v 1,2-에탄디티올(1,2-ethanedithiol, EDT)의 용액을 사용하여 달성하였다. 그 밖의 모든 펩타이드의 완전한 탈보호는 2 내지 4 시간 동안 88% v/v TFA, 5% v/v 물, 5% m/v 페닐, 2% v/v TIPS의 용액을 사용하여 이루어졌다. 여과물을 수집하고, 차가운 터트-부틸 메틸 에테르를 사용하여 침전시키고, 10 분 동안 -5℃에서 3000 rpm으로 원심 분리하여 페렛화하였다. 이후 펠렛을 탈염 증류수에 용해시키고 동결 건조하여 고체 분말을 수득하였다.
단백질 정제: 본 연구에서 사용된 모든 펩타이드는 역상 HPLC로 92% 이상의 순도로 정제하였고 ESI 질량 분석법으로 특징화하였다.
펩타이드의 정제는 각각 분석적 및 예비적인 HPLC를 위해 1.5 mL/min 및 20 mL/min의 선형 유속에서 H2O + 0.1 % TFA(용매 A) and CH3CN + 0.1 % TFA(용매 B)를 포함하는 기울기 용매 시스템을 사용하여 수행하였다. 분석적인 HPLC는 Grace Vydac 단백질/펩타이드 RP-C18 칼럼(4.6 mm x 250 μm, 5 μm)를 사용하여 수행하였고, 예비적인 HPLC는 Grace Vydac 단백질/펩타이드 RP-C18 칼럼(22.0 mm x 250 mm, 10 μm)을 사용하여 수행하였다. 흡광도를 워터스 2998 포토다이오드 어레이(Waters 2998 Photodiode Array) 검출기를 사용하여 220 nm 및 254 nm의 파장에서 검출하였다. 정제하는 동안, 분획을 수집하고, 동결 건조한 후, ESI-MS(Waters Micromass Quattro MicroTM API)로 분석하였다.
재조합 단백질 RHAMM-CT(HA 결합 도메인을 포함하는 카르복시 말단에만 대응되는 절단된 RHAMM, 아미노산 706-766, 서열: RDSYAQLLGH QNLKQKIKHV VKLKDENSQL KSEVSKLRSQ LVKRKQNELR LQGELDKALG I, M.W. 7.1 kDa, pl = 10.1; SEQ ID NO: 20)를 플라스미드 pPAL7-RHAMM을 포함하는 E. coli BL21(D3) 균주로부터 분리하였다. 암피실린(ampicillin, 100 μg/ml)과 0.5% 포도당을 포함하는 37℃의 LB 배지에서 밤새 성장시켜, 중기 대수기까지 성장하도록 하였다. 재조합 RHAMM 유전자 발현을 37℃에서 4 시간 동안 2 mM IPTG로 유도하였고, 박테리아 세포를 20 분 동안 10,000 x g로 원심 분리하여 수득하였다. 박테리아 세포를 분해 완충액(0.2 M 인산 나트륨, 0.2 M 초산 칼륨, 1 % 트리톤 X-100, 및 0.1 % 프로테아제 억제제로 구성됨, pH = 7.0) 에서 재부유시키고. 초음파 처리(60 초, 10 초/펄스)한 후, 원심 분리(4℃, 12000 x g, 20 min)하였다. 그 결과로서 생긴 상층액을 깨끗한 관으로 옮긴 후 (0.45 μm 필터를 사용하여) 여과하였다. 정확하게 태그된 재조합 RHAMM의 정제를 제조사의 프로토콜에 따른 Profinity eXact(Bio-Rad, 미국) 친화성 수지로 수행하였다. 본 실험에서, 용해물(lysate)을 세척 완충액(0.2M 인산 나트륨, pH = 7.0)과 균형을 이룬 Profinity eXact 친화성 수지(4 mL 수지, 칼럼 15 x 1.5 cm)로 충진된 중력 칼럼에 로딩하였다. 칼럼을 세척 완충액으로 세척하여 불순물을 제거하고, 재조합 RHAMM을 용출 완충액(0.2M 인산 나트륨, 0.1 M 불화 나트륨으로 구성됨, pH = 7.0)으로 용출시켰다. 그런 다음, 0.2M 인산 나트륨과 0.2 M 초산 칼륨으로 구성된 완충액(pH = 7.0) 내에서 Millipore Filter(Millipore, 미국, 컷-오프 3 kDa)를 사용하여 단백질을 투석하였다. 분리된 단백질의 순도를 1D SDS-PAGE 상에서 확인하였다. 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)에 의해 항-RHAMM 항원으로 RHAMM의 동정을 수행하고 확인하였다.
표면 플라즈몬 공명( surface plasmon resonance , SPR ) 선별 분석: RHAMM에 대한 서로 다른 튜불린 유래 펩타이드의 선택 및 순위를 위해 ProteON XPR36 시스템을 사용하였다. RHAMM의 고정을 위해, ProteON GLC 센서 칩 표면을 100 mM EDAC 및 24 mM sulfo-NHS를 사용하는 아민 결합에 의해 활성화시켰다. RHAMM(중탄산나트륨 완충액 내 30 μg/mL, pH 9.7)를 30 μl/min의 유속으로 주입하였다. 완충액 샘플을 기준으로 사용하기 위한 다른 센서 플레이트에 주입하였다. 그런 다음 에탄올아민 HCI(1 M, pH 8.5)을 주입하여 잔류하는 모든 표면기를 비활성화시켰다. 펩타이드(PBS-T 내 10 μM, 2% DMSO)를 3 분 동안 50 μL/min에서 RHAMM 기능화된 표면에 주입한 후, 10 분의 해리(즉, PBS-T 완충액의 주입) 기간이 이어졌다. 다음 펩타이드 주입 이전에 30 μL의 1 M NaCl의 두 주입을 사용하여 표면을 재형성시켰다. 모든 실험에서, 기준 플레이트(RHAMM 없음)과 RHAMM 기능화된 플레이트로부터 획득한 데이터를 사용하여 기준 추출을 수행하였다.
플루오레세인 - 표지된 펩타이드를 사용한 경쟁적 ELISA 실험: RHAMM을 갖는 결합 부위에 대한 HA와 경쟁하는 FITC-표지된 튜불린-유래 펩타이드의 능력을 시험하기 위해 ELISA를 수행하였다. 재조합 RHAMM(0.05 M PBS 내의 100 μL, 10 μg/mL, pH = 9)을 96-웰 ELISA 플레이트(최종 농도 1 μg/웰) 상에 고정시킨 후 4℃에서 밤새 배양하여 1 μg/웰의 최종 단백질 양을 수득하였다. 플레이트를 (0.05%) PBS-트윈-20 완충액(200 L 웰)으로 세 번 세척하고, 차단 완충액(5% 200 μL/웰, PBS-트윈-20/웰)으로 세척한 후, 상온에서 1 시간 동안 배양하였다. 상기한 바와 같이 세 번의 세척 이후, FITC-표지된 튜불린 유래 펩타이드(최종 농도 1 μg/mL)와 HA(100 μL/웰, M.W. 220 kDa, PBS 내 10 μg/mL, HA = 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16를 위해 계열 희석을 수행함)를 플레이트에 첨가한 후 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 상기한 바와 같이 세척한 후, 485/535 nm에서 흡광도를 측정하였다.
플루오레세인 - 표지된 RHAMM 을 사용한 경쟁적 ELISA 실험: RHAMM에 대한 염료(Alexa Fluor 647)-결합 HA와 경쟁하는 비-표지된 튜불린-유래 펩타이드의 능력을 시험하기 위해 ELISA를 수행하였다. RHAMM(0.05 M PBS 내의 100 μL, 10 μg/mL, pH = 9)을 96-웰 ELISA 플레이트 상에 고정시킨 후(1 μg/웰의 최종 양을 달성하도록) 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 (0.05%) PBS-트윈-20 완충액(200 μL/웰)으로 세 번 세척한 후, 차단 완충액(200 μL/웰, PBS 내의 5% PBS-트윈-20/웰)으로 상온에서 1 시간 동안 배양하였다. (0.05%) PBS-트윈-20 완충액의 세 번의 세척 이후, 튜불린-유래 펩타이드(10 μg/mL)와 HA-결합 Alexa Fluor 647(100 μL/웰, M.W. 220 kDa, PBS 내 10 μg/mL)을 플레이트에 첨가한 후 4℃에서 밤새 배양하였다. 음성 대조군 플레이트는 염료-결합 HA를 투여하지 않았고, 모든 실험은 세 차례 수행하였다. 플레이트를 상기한 바와 같이 세척한 후, 650 nm에서 형광도를 측정하였다.
표면 플라즈몬 공명( surface plasmon resonance , SPR ) 결합 분석: 펩타이드 선별 이후, 결합 반응속도 상수를 결정하기 위해 GWC SPRimager®II 시스템을 사용하였다. 밀리-Q 워터(milliQ water) 내의 1 nM 농도의 티올-함유 펩타이드를 3 시간 동안 말레이미드-기능화된(maleimide-functionalized) 금-플레이트 칩 상에 고정시켰다. 과잉의 펩타이드를 밀리-Q 워터로 세척하여 제거하였다. 결합 분석을 위해, 일련의 농도(500 nM, 750 nM, 및 1000 nM)의 RHAMM을 고정된 펩타이드 상에 주입하였다. 15 분의 해리 단계 이후, 센서 칩 표면을 100 mL/min에서 재형성 완충액(HBS-EP 내의 2 M NaCl, pH 7.4)의 두 번의 10 분 펄스 주입의 처리를 통해, 다음 펩타이드 샘플 주입을 위해 재형성시켰다. 재형성 단계 이후 기준치는 초기값으로 돌아갔고, 결합된 모든 분해물질(analyte)의 제거를 확인하였다. 데이터를 분석하고 해당 해리 상수(KD)를 랭뮤어 결합 모델(Langmuir binding model)로의 비선형 회귀 분석을 통해 수득하였다[17]. 모든 실험에서, 기준 플레이트(펩타이드 없음)와 펩타이드 기능화된 플레이트로부터 획득한 데이터를 사용하여 기준 추출을 수행하였다.
혈청 안정성 연구: 혈청 내의 튜불린 CTT의 안정성을 최대 11 시간 동안 평가하였다. 각각의 펩타이드를 예열된(37℃, pH 7.2 ± 0.1) 소태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)과 혼합하였다(3 mL의 최종 샘플 부피 및 15 μM의 펩타이드 농도). 초기 시간을 기록하였고, 매 30 분 시점마다, 반응 혼합물로부터 40 μL 표본을 취한 후 역상(C18 Sep-Pak
Figure 112012109541232-pct00001
) 카트리지에 통과시켰다. 0.1 % TFA를 함유한 3 mL 에탄올(70% v/v)을 사용하여 카트리지로부터 펩타이드를 용출시키고, 동결 건조한 후, 분석적인 RP-HPLC (Grace Vydac 단백질/펩타이드 RP-C18 칼럼 4.6 x 250 mm, 5 μm)를 사용하여 분석하였다. 이 시스템의 사용된 이동상은 물에서의 0.1 % TFA(용리액 A) 및 CH3CN에서의 0.1% TFA(용리액 B)이었다. 각각의 펩타이드 샘플에 대해 20 분에 걸친 1.5 ml/min의 유속에서 용리액 B의 10 내지 95%의 선형 기울기를 사용하였다. 220 및 254 nm에서 워터스 2998 포토다이오드 어레이 검출기를 사용하여 온전한 펩타이드의 퍼센트를 검출하였고, ESI-MS를 사용하여 동정하였다. 펩타이드의 반감기는 GraphPad 프리즘 버전 5.01을 사용하여 결정하였다.
세포 흡수 연구: RHAMM-CT에 대해 높은 친화성을 보이는 후보 펩타이드를 형광 염료(FITC)에 결합하였고, RHAMM 발현 암 세포(MDA-MB-231)에 대한 이들의 특이성을 세포내 형광 영상화 분석(cellular fluorescence imaging assay)을 사용하여 평가하였다.
MDA-MB-231 세포를 DMEM 배지와 10% FBS에서 90%의 밀집도(confluency)까지 배양하였다. 그런 다음, 세포를 배양 하루 후에 2 x 24-웰 조직 배양 플레이트(밀집도 20,000/웰) 내의 유리 커버 슬립(12 x 12 mm, 50 μg/ml 피브로넥틴(fibronectin)으로 코팅됨) 상에 접종하였다. 기아(starvation) 단계는 37℃에서 DMEM + 0.1 % FCS로 밤새 수행하였다. 그런 다음, 배양 배지를 흡입하고 37℃에서 DMEM + 0.1 % FCS로 밤새 세척하였다. 세포를 상온에서 1 시간 동안 DMEM + 0.1 % FCS 내의 3% BSA로 차단하였다. 차단 실험을 위해, 항체(희석 1:100, DMEM + 0.1 % FCS ℃배지 내의 마우스 IgG ab, 염소, 항-RHAMM mAb, 또는 마우스 항-CD44 mAb)를 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 항체가 RHAMM에 대한 결합 친화성을 보이지 않기 때문에, 항-마우스 IgG로 차단된 세포는 양성 대조군 역할을 하였다.
그런 다음, 그 결과로 생긴 배양 배지를 흡입하고, 세포를 상온에서 DMEM + 0.1 % FCS로 세척하였다. 플루오레세인-결합 펩타이드(50 μg/ml)를 첨가하고 37℃에서 30 분 동안 배양하였다. 세포를 DMEM + 0.1 % FCS로 세척한 후 PBS(pH = 7.6)로 세척하였다. 그런 다음, 제조사의 프로토콜을 통해 DAPI(Electron microscopy sciences, 미국)를 포함하는 Fluoro-gel 11을 사용하여 세포를 장착하였다. Olympus FluoView FV1000를 연결한 1X81 Motorized Inverted System Microscope를 사용하여 세포를 촬영하였다. Image J(v1.42q) 소프트웨어를 사용하여 Tiff 이미지를 분석하였다. 각각의 이미지를 8-비트 형식으로 변환하고 20 및 255의 임계값을 부여하였다. 세포체(n = 15)에 해당하는 관심 영역(region of interest, ROI)을 선택하였다. 각각의 ROI의 평균 형광도를 8 기가비트 획득 데이터를 사용하여 계산하였다. 일방향 ANOVA를 위한 Prism(GraphPad Software, San Diego, 미국) 통계 프로그램을 사용하여 데이터를 분석하였다.
결과
RHAMM 에 대한 튜불린 -유래 펩타이드의 선별
도 2A는 비변형 튜불린-유래 펩타이드(도 2A a)뿐만 아니라, N-아세틸 시스테인에 결합된 펩타이드(도 2A b) 및 플루오레세인 이소티오시아네이트에 결합된 펩타이드(도 2A c) 의 일반적인 구조를 도시한다. 도 2B는 본 연구를 위해 제조한 17 개의 모든 펩타이드를 설명하는 표이다. 17 개의 합성 펩타이드의 서열은 다른 튜불린 아형의 CTT뿐만 아니라 αIa-(SEQ ID NOs: 6, 7 및 8) 및 βIIIa-CTT(SEQ ID NOs: 13 및 14) 측면에 배치된 서열을 포함한다. 펩타이드와 추가 펩타이드 변형 사이의 거리를 증가시키기 위해 6 탄소 링커를 사용하였다. 도 2B는 또한 유도체화된 펩타이드를 포함한다. 유도체화된 펩타이드는 플루오레세인(도 2B의 펩타이드 1c, 3c, 9c, 11c, 12c, 14c; SEQ ID NOs: 25, 27, 29, 31, 33 및 35) 또는 N-아세틸 시스테인 변형 N-말단(도 2B의 펩타이드 1b, 3b, 9b, 11b, 12b, 14b; SEQ ID NOs: 24, 26, 28, 30, 32 및 34)로 제조하였다.
모든 펩타이드를 ES1+ 질량 분석법으로 특징화하였고 역상 HPLC로 순도를 분석하였다. 도 2B는 ESI-MS 및 RP HPLC를 사용하여 17 개의 합성 튜불린 펩타이드를 분석한 결과를 나타내는 표이다. 계산되고 관찰된 m/z 값은 ESI에 의해 결정된 바와 같이 눈에 뜨는 관찰 신호에 기초하였다. 220 nm에서의 검출을 통해 RP HPLC에 의해 순도 퍼센트를 결정하였다.
RHAMM의 HA-결합 도메인을 인식할 수 있는 잠재적인 펩타이드 후보의 신속하고 정확한 결정을 위해 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR)-기반 선별 방법을 사용하였다. 17 개의 튜불린-유래 펩타이드를 선별하였고, RHAMM에 친화성을 보이는 펩타이드를 감소시키기 위해 생성된 센서그램을 사용하였다. 선별 이전에, 센서 플레이트에 대한 리간드 고정, 이 경우 RHAMM에 대한 고정을 위한 최적의 조건을 결정하였다. 고정 완충액에 대한 최적의 pH는 단백질 비활성화를 최소화하면서 센서 플레이트에 대한 단백질의 정전기 인력의 균형을 유지한다. 본 연구에서, 고정을 위한 최적의 pH는 가장 높은 리간드 밀도를 생성하는 pH로 결정하였다. 다양한 pH의 중탄산나트륨 완충액을 사용하여 30 μL/min의 유속으로 그리고 고정된 농도의 EDAC 및 sulfo-NHS를 가지고 RHAMM을 센서 플레이트에 결합하였다. 각각의 pH 고정 조건에 대한 RHAMM 리간드 밀도를 여섯 번의 측정의 평균 SPR 반응과 pH 9.7에서 발생한 최대 리간드 고정으로부터 결정하였다(도 3A). 리간드 고정은 부분적으로 등전점(isoelectric point)에서의 RHAMM 상의 순전하 손실로 인해 pH 10.1보다 약간 낮았다.
SPR 센서 칩 상의 RHAMM 고정 이후, 일련의 튜불린 유래 펩타이드의 주입을 수행하였다. 펩타이드와 RHAMM의 결합은 3 분 동안 진행되었고 분해물질 없는 완충액 내에서 해리를 10 분 동안 수행하였다. 도 3B는 10 μM의 농도에서 수득한 실험 센서그램을 도시한다. 각각의 펩타이드 주입을 위해, 대조 센서그램(고정된 RHAMM 및 완충액 주입이 없음)을 시험 센서그램에서 제외하였고, 잔류하는 모든 결합된 펩타이드를 제거하기 위해 다음 펩타이드 주입 이전에 칩 표면을 재형성시켰다. 17 개의 펩타이드에서 RHAMM에 향상된 친화성을 나타내는 여섯 개의 펩타이드, 즉 1a(SEQ ID NO: 1), 3a(SEQ ID NO: 3), 9a(SEQ ID NO: 9), 11a(SEQ ID NO: 1), 12a(SEQ ID NO: 12), 및 14a(SEQ ID NO: 14)를 선별하였다.
RHAMM 에 대한 고정된 튜불린 유래 펩타이드의 친화성: 위에서 추정된 여섯 개의 펩타이드의 RHAMM과의 결합을 정량화하였다. 절단 연구는 CTT(즉 S-펩타이드의 마지막 12 개의 카르복시 말단 잔기)가 MAP-지향 미세관 장치를 유도하기에 충분하며[18], 따라서 CTT의 아미노 말단 상에 링커 잔기에 의해 이격된 표지를 배치하는 것은 펩타이드-단백질 상호작용에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 펩타이드를 센서 플레이트 상에 고정시켰고 RHAMM 100 μL/min의 일정한 유속으로 다양한 농도에서 유도체화된 표면 상에 흐르게 하였다. 도 4A는 그에 따른 센서그램을 도시한다. 다시, 러닝 완충액과 샘플 용액 간의 굴절률 차이를 설명하기 위해 각각의 센서그램을 기준 센서그램(고정된 펩타이드 없이 센서그램으로부터 획득한 데이터)에서 각각의 곡선을 차감하여 수정하였다.
실험 센서그램을 1:1 랭뮤어 결합 모델을 위한 역동 모델로부터 기인하는 곡선과 일치시켰다. 다른 RHAMM 농도에서 수득한 6 개의 펩타이드의 KD에 대한 평균 값을 각각의 표준 오차와 함께 도 4B의 표에 나타내었다. 양성 대조군으로서, 또한 항-RHAMM mAb의 거동을 측정하였고 그 결과는 RHAMM에 대한 5.53 nM 친화성을 보여준다. 펩타이드 SEQ ID NO: 1(KD = 24 nM), SEQ ID NO: 9(KD = 32 nM), 및 SEQ ID NO: 14(KD = 30 nM)는 RHAMM에 대한 높은 친화성을 나타내는 낮은 나노몰(nanomolar) 범위에서의 해리 상수를 보여준다. 또한 6 개의 펩타이드 각각의 상대적 결합 친화성을 ELISA를 이용하여 측정하였다. 이 분석에서, 플루오레세인으로 표지하였고, 염료는 아미노헥산산 링커의 추가로 인해 펩타이드에서 멀리 위치시켰다. 도 3C에 도시된 바와 같이, ELISA 결과는 또한 펩타이드 SEQ ID NOs: 1, 9 및 14가 모든 농도에서 가장 높은 상대적 결합 친화성을 갖는 것을 나타낸다. 펩타이드에 대한 형광단(fluorophore) 변형은 리간드-RHAMM의 상호작용 또는 비-특이적 결합에 영향을 줄 수 있고, 따라서 SPR 및 ELISA 결과는 정확하게 일치하지 않을 수 있다.
HA 에 의한 튜불린 -유래 펩타이드의 경쟁적 이동: RHAMM의 HA 결합 도메인에 대한 펩타이드의 선택성(selectivity)을 결정하기 위해 경쟁적 ELISA를 수행하였다. 이 분석에서, 플루오레세인-표지된 펩타이드를 사용하였고, 펩타이드의 RHAMM에 대한 결합을 차단하기 위해 미표지된 HA의 효과를 평가하였다. 도 2B의 펩타이드 1c, 3c, 9c, 11c, 12c 및 14c(SEQ ID NOs: 25, 27, 29, 31, 33 및 35)에 해당하는 플루오레세인-표지된 펩타이드 SEQ ID NOs: 1, 3, 9, 11, 12 및 14를 고정된 RHAMM을 포함하는 ELISA 플레이트에 첨가한 후, RHAMM의 천연 리간드인, 다양한 농도의 HA를 첨가하였다. 관찰된 형광도의 감소는, 플루오레세인-표지된 펩타이드가 동일한 결합 부위에 대해 경쟁한 경우 HA가 플루오레세인-표지된 펩타이드를 이탈시킨 것으로 보여진다. 도 5A는 HA에 의한 RHAMM에 결합하는 펩타이드의 경쟁적 이동을 도시하며, 펩타이드 SEQ ID NO: 9(SEQ ID NO: 29)가 또한 이동되었지만, 플루오레세인-표지된 펩타이드 SEQ ID NOs: 1, 12 및 14(SEQ ID NOs: 25, 33 및 35)에서 가장 효과적인 상대적 이동이 발생하면서, 형광도의 농도 의존적 감소는 HA 경쟁자 농도가 증가함에 따라 여섯 개의 모든 리간드에 대해 관찰되었다.
플루오레세인 표지의 존재가 이들 저분자량 펩타이드의 물리적 특성 및 그에 따른 결합 잠재능에 영향을 미칠 수 있기 때문에 펩타이드 리간드를 평가하기 위해 대안적인 경쟁 실험을 고안하였다. ELISA를 이용하여, 미표지된 펩타이드 SEQ ID NOs: 1, 3, 9, 11, 12 및 14 (도 2B의 펩타이드 1a, 3a, 9a, 11a, 12a 및 14a에 해당함)를 사용하여 염료-표지된 HA와 경쟁시켰다. 이 분석은 염료 표지와 단백질 간의 상호작용에서 발생하는 혼란 결과 또는 펩타이드 리간드로의 부피가 큰 염료의 첨가로 인한 친화성의 변화를 제거한다. 도 5B에 도시된 바와 같이, 튜불린에서 유래된 비-플루오레세인 펩타이드에 의한 표지된-HA의 이동은 형광 신호의 감소에 의해 쉽게 관찰된다. 미표지된 RHAMM 리간드 또는 플루오레세인-표지된 리간드 SEQ ID NO: 14 및 미표지된 RHAMM 또는 플루오레세인-표지된 리간드 SEQ ID NO: 9는 지속적으로 HA와의 결합을 특히 경쟁할 수 있는 것으로 보이며, 따라서 펩타이드의 아미노 말단에서의 추가의 변형은 RHAMM에 대한 결합에 영향을 별로 미치지 않는다는 개념을 강화한다. 그러나, 서열 SEQ ID NO: 1을 포함하는 플루오레세인-표지된 αIa-CTT(펩타이드 1c; SEQ ID NO: 25)는 SEQ ID NO: 1의 미표지된 펩타이드에 비해 HA와의 보다 나은 경쟁을 보인다.
RHAMM 대 CD44 에 대한 특이성: 이전의 결과는 이들 펩타이드가 RHAMM의 HA 결합 도메인을 표적으로 할 수 있다는 것을 나타낸다. 그러나, 이들 HA 모방체가 RHAMM을 특이적으로 표적으로 한다는 것을 증명하기 위해서는, CD44와 같은 다른 히알라데린(hyaladerin)에 대한 펩타이드의 친화성을 시험할 필요가 있다. 이를 위해, 고형 펩타이드 결합 분석(ELISA)를 CD44 기능화된 표면을 가지고 수행하였고 이는 도 5C에 도시되어 있다. 상기한 바와 같이, SEQ ID NOs: 1, 3, 9, 11, 12 및 14(SEQ ID NOs. 25, 27, 29, 31, 33 및 35)의 각각의 FITC-결합 펩타이드를 각각의 히알라데린(RHAMM 또는 CD44)에 배양하였고, 그에 따른 형광 측정을 광범위 세척 프로토콜에 따라 기록하였다. 예상대로, RHAMM과 플루오레세인-펩타이드에서 발생하는 형광 측정은 가장 높은 신호를 보여주며, 형광의 현저한 강하가 HA의 첨가 이후 관찰되었다. 정반대로, CD44와 플루오레세인-펩타이드의 상호작용은, 형광에 의해 나타나는 바와 같이, 상당히 낮고 HA의 첨가에 따른 예상된 형광의 감소를 보여주지 못한다. 따라서, 펩타이드의 결합은 RHAMM와의 특이적 상호작용에 의해 발생하는 반면, 이들은 CD44와의 제한된 상호작용을 보인다.
혈청 안정성: 표적제(targeting entity) 또는 치료제로서의 이들의 잠재능을 시험하기 위해, 생물학적 환경에서의 RHAMM-결합 펩타이드의 안정성을 검토할 필요가 있다. 각각의 펩타이드 SEQ ID NOs: 1, 3, 9, 11, 12 및 14의 체외 혈청 안정성을 11 시간 동안 평가하였고, 잔류하는 온전한 펩타이드의 정량화를 RP-HPLC를 사용하여 추정하였다. 이 분석에서, 펩타이드에 소태아 혈청을 37℃에서 부여하였고 30 분 간격으로 표본을 추출하였다. 각각의 시점에서, 혈청 단백질을 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)으로 침전시켜 반응을 종료하였고, 펩타이드를 포함하는 원 용액을 수득하기 위해 원심 분리기를 사용하였다. 용액을 C18 역상 칼럼(C18 Sep-Pak
Figure 112012109541232-pct00002
)에 통과시켜 저분자량 불순물을 제거하였다. 온전한 펩타이드를 칼럼에서 용출시키고, 동결 건조한 후, 분석하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 미표지된 RHAMM-결합 펩타이드는 대략 2 내지 4 시간의 적당한 반감기를 갖는 혈청 안정성을 보였다.
세포내 형광 분석(( MDA - MB -231 흡수 연구): RHAMM 발현 세포에 대한 본 발명의 튜불린 유래 펩타이드의 특이성 및 표적제로서의 이들의 잠재능을 결정하기 위해, 항- RHAMM 항체로 처리한 MDA-MB-231 세포를 사용하여 세포내 형광 분석을 수행하였다. MDA-MB-231 유방 종양 세포주는 RHAMM 수용체의 높은 발현을 보이기 때문에, 이 세포주는 합성 튜불린 펩타이드의 표적화 및 특이성을 평가하는 이상적인 선택이었다. MDA-MB-231 세포를 플루오레세인-결합 펩타이드 SEQ ID NOs. 1, 9 및 14(SEQ ID NOs: 25, 29 및 35)와 함께 배양하였고 프로브의 세포내 흡수를 측정하였다. 도 6A(SEQ ID NO: 35) 및 도 7(SEQ ID NOs: 25 및 29)에 도시된 바와 같이, 시험된 모든 펩타이드에서, 차단 처리를 하지 않은 세포 및 비-특이적 항체(IgG 항체)로 배양한 세포에서 형광 신호의 축적이 관찰되었으며, 이는 플루오레세인-표지된 프로브의 높은 흡수를 나타낸다. 흥미롭게도, 항-CD44로 차단된 세포는 신호의 감소를 보이지 않았다. 그러나, 항-RHAMM mAb로 차단된 세포는 세포내 형광의 상당한 감소를 보였으며, 이는 RHAMM에 대한 펩타이드 SEQ ID NOs: 1, 9 및 14의 특이성을 나타낸다(p < 0.001). 도 6B에 도시된 바와 같이, 항-RHAMM mAb로 차단된 세포는 대략 65% 내지 대략 85%의 세포내 형광의 감소를 보였다(SEQ ID NOs: 1, 9 및 14는 각각 대략 85%, 대략 76% 및 대략 65%의 형광 감소를 보임).
논의
RHAMM은 다양한 암에서 과잉 발현되는 종양유전자(oncogene)이다. 또한, RHAMM-발현 암 세포 내에서의, RHAMM의 세포외 리간드인, HA의 증가된 축적은 나쁜 임상 경과에 대한 예후 인자이다. 따라서, 결합을 위해 HA와 경쟁할 수 있는 RHAMM을 표적으로 하는 저분자량 리간드는 진단 및 치료 목적으로 유용할 수 있다. 이 연구에서, 본 발명자들은 RHAMM의 HA 결합 도메인을 표적으로 할 수 있는 리간드를 동정하기 위해 노력하였다. 본 발명자들은, HA 결합 도메인을 포함하는 RHAMM의 카르복시 말단이 세포 내의 미세관 망에서의 현지화(localization)를 중재한다고 판단하였고, 데이터베이스 검색 및 RHAMM과 공지된 튜불린 관련 단백질(예를 들어, MAPs) 간의 쌍대 비교를 수행하였다. 또한, 이들 단백질이 튜불린의 CTT에 직접적인 결합을 보이기 때문에, 본 발명자들은 RHAMM이 다른 튜불린 아류형의 CTT를 나타내는 합성 펩타이드와의 직접적인 상호작용을 보일 수 있다는 가설을 세운다. MAPs의 튜불린 결합 도메인과 RHAMM의 HA-결합 도메인 사이의 적당한 상동성으로 인해, 튜불린의 어떠한 펩타이드 단편이 RHAMM과 상호작용을 하는지 결정하기 위해 추가의 연구를 수행하였다. 이 연구에서, RHAMM과 신규 리간드 사이의 특이적 상호작용을 추정하였다.
다른 튜불린 아형(즉, CTT 영역)의 카르복시 말단 도메인에서 유래한 펩타이드 단편뿐만 아니라 상기한 도메인에 직접적으로 인접한 서열을 고형 펩타이드 합성법을 이용하여 합성하였다. 고친화성 리간드를 결정하기 위해, 그 결과로 생긴 펩타이드를 RHAMM에 대해 선별하였다. 이를 위해, SPR 선별 방법이 이용되었고, 여기서 SPR 센서 플레이트에 RHAMM 단백질을 고정하였고, 높은 친화성과 특이성을 갖는 리간드를 발견하기 위해 펩타이드를 흐르게 하였다. 이 방법은 단일 RHAMM-하전된 센서 플레이트를 사용하여 높은 처리량의 선별을 가능하게 하고 SPR-결합된 RHAMM이 세포 수용체로서 본연의 막 결합 상태를 반영할 수 있기 때문에 이 방법을 이용하였다. 이 선별은 ELISA에 의해 결정된 바와 같이 RHAMM의 HA 결합 영역에 대해 HA와 경쟁할 수 있는 여섯 개의 고친화성 리간드를 제공하였다. 추가의 평가는 이들 펩타이드가, HA와 또한 결합하는 공지된 히알라데린인, CD44에 비해 RHAMM에 대한 매우 높은 특이성을 보인다는 것을 결정하였다.
체외, 생체외, 또는 체내 영상화를 용이하게 하기에 충분히 길 수 있는 생물학적 환경(소 혈청)에서 적당한 안정성(대략 110 내지 250 분의 반감기)를 보였다. RHAMM-발현 암 세포 내에서 리간드의 상대적 흡수를 정량화함으로써, RHAMM에 대해 높은 친화성을 보이는 세 개의 HA 펩타이드 모방체(SEQ ID NOs: 1, 9 및 14)의 특이성을 분석하였다. 이를 위해, SEQ ID NOs: 1, 9 및 14의 펩타이드를 플루오레세인과 결합시켰고(SEQ ID NOs: 25, 29 및 35), RHAMM을 과잉 발현하는 세포주인 MDA-MB-231 세포로 배양하였다. 세 개의 모든 펩타이드에 대해 세포내 형광을 관찰하였고, 항-CD44 또는 비특이적 항체(즉, IgG 항체)의 첨가에 의해 흡수가 줄어들지 않았다. 그러나, 항-RHAMM 항체의 첨가 시, 프로브 흡수의 극적인 감소가 관찰되었고, 이는 프로브 흡수의 특이적 차단을 암시한다. 따라서, 적당한 안정성과 결합된 프로브의 높은 특이성은 RHAMM-발현 암 세포에 대한 진단제로서의 추가적인 개발을 가능하게 할 수 있다.
본 보고서에 나타난 상기한 결과는 튜불린의 다양한 카르복시 말단 잔기에서 RHAMM의 HA 결합 도메인에 대한 공통 부위의 존재를 시사한다. 되풀이하여 발생하는 헥사펩타이드 모티프(hexapeptide motif)가 대부분의 펩타이드 후보 및 RHAMM과 상호작용하는 산성 카르복시-말단 부분을 공유하는 펩타이드에서 발견되었다. 도 8B에 도시된 바와 같이, 모티프(EEXEEZ(여기서 X는 A 또는 G, 그리고 Z 는 Y 또는 E; SEQ ID NO: 18))가 합성 αIa(SEQ ID NO: 1), αIIIc(SEQ ID NO: 3), βIa(SEQ ID NO: 9), 및 βIV-CTT(SEQ ID NO: 11)에 존재한다. 이러한 결과는 RHAMM에 대한 서열 상동성을 공유하는 단백질 집단인, 튜불린 및 MAP 결합에 짧은 서열(EEGEE (SEQ ID NO: 21))(Paschal 등 1989)이 포함될 수 있다는 이전의 보고와 일치한다.
HA 및 RHAMM 상호작용에서의 산성 작용기의 역할에도 불구하고, 결과는 또한 CTT 영역 내의 이들 산성 잔기의 무작위 발생 또는 증가가 RHAMM-튜불린 상호작용에 직접적으로 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다는 것을 시시할 수 있다. DEXEEZ(펩타이드 SEQ ID NOs: 2 및 4에서 보이는 바와 같이)(SEQ ID NO: 22) 및 EEXEDZ(SEQ ID NO: 10에서 보이는 바와 같이)(SEQ ID NO: 23) 모티프를 포함하는 펩타이드는 초기 선별을 실패하였고, 이는 첫 번째 및 다섯 번째 서열 내의 Asp 잔기가 이러한 모티프 내의 유산한 산성 Glu 잔기를 대체할 수 없음을 시사한다. 이는 RHAMM과의 CTT의 상호작용이 정전력(electrostatic force) 및 형태 효과(conformational effect) 모두에 의해 중재된다는 것을 시사한다.
중요성
이 연구는 RHAMM의 HA 결합 도메인과 상호작용하는 적어도 여섯 개의 신규한 리간드의 발견을 개시한다. 이들 여섯 개의 펩타이드는 RHAMM에 대한 강력한 친화성을 보였고 내생(endogenous) HA에 의해 대체될 수 있으며, 따라서 HA-결합 도메인에 대한 특이적 표적화를 나타낸다. 또한, 비-세포 기반(즉, ELISA) 및 세포 기반(즉, 세포내 형광) 분석 모두에서의 다른 히알라데린 CD44와 비교해서, RHAMM에 결합하는 이들 리간드의 뛰어난 성향은 표적제로서의 이들의 잠재능을 나타낼 수 있다. RHAMM의 과잉 발현 및 이에 따른 HA와의 상호작용은 암의 병리에 연루되었음을 시사한다. 따라서, 이들 펩타이드는 RHAMM-HA 상호작용을 차단할 수 있고 RHAMM의 형질전환 잠재능을 제한하는 길항제(antagonist)로서의 역할을 할 수 있다.
실시예 3: RHAMM 에 대한 알라닌-치환된 RHAMM -결합 펩타이드의 친화성
재료: 용매를 추가의 정제 없이 사용하였고, VWR, 피셔 사이언티픽, 또는 시그마 알드리치에서 구입하였다. 펩타이드 합성을 위한 플루오레닐메틸옥시카르보닐-링크 아미드 MBHA(100-200 메쉬) 수지, Fmoc 아미노산, Fmoc-보호된 아미노헥산산(Fmoc-Ahx) 및 2-(1H-벤조트리아졸 1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU) 결합 시약은 펩타이드 인터내셔널로부터 입수하였다.
펩타이드 합성: 링크 아미드 MBHA 수지(0.1 mmol) 상의 펩타이드 사슬의 연장을 자동화된(APEX 396 자동-합성기) 및/또는 Fmoc 탈보호 및 아미노산 결합 사이클을 포함하는 표준 고상 펩타이드 합성법을 이용하는 수동 방법에 의해 수행하였다. 합성 전반에 걸쳐(15 분 및 20 분의 기간) 반복적인 Fmoc 탈보호를 N,N-디메틸포르마이드(DMF) 내의 20% 피페리딘 용액을 사용하여 수행하였다. 모든 아미노산 결합은 30 분 및 90 분 간격으로 0.05 이상의 농도의 Fmoc-보호된 아미노산 및 HBTU, DMF 내의 5 당량의 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 사용하여 수행하였다. 각각의 탈보호 및 결합 단계 이후, 수지를 DMF(3x)와 디클로로메탄(DCM)(3x)으로 반복해서 세척하였다. Fmoc-Ahx는 동일한 매개변수를 사용하여 결합하였다. 플루오레세인 결합은 펩타이드의 아미노기를 DMF 내의 FITC 형광 염료(4 당량)와 DIPEA(2 당량)으로 4 시간 동안 반응시켜 수행하였다. 그 결과로 생긴 수지를 88% TFA와 12% 제거제(scavenger)(5% 물, 5% 트리이소프로필실란, 및 2% 페놀)로 구성된 절단(cleavage) 칵테일로 처리하였다. 그 결과로 생긴 수지를 700 rpm에서 3 시간 동안 흔들고 RP-HPLC를 통해 정제하였다.
ELISA 결합 분석: RHAMM와의 결합에 중요한 잔기를 결정하기 위해 플루오레세인-표지된 펩타이드 SEQ ID NO: 1(SEQ ID NO: 25) 또는 플루오레세인-표지된 SEQ ID NO: 14(SEQ ID NO: 35) 내에서 알라닌 치환의 효과를 시험하기 위해 효소-결합 면역흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 수행하였다. 재조합 RHAMM(0.05 M PBS 내의 100 μL, 10 μg/mL, pH = 9)을 96-웰 플레이트(최종 농도 1 μg/웰)에 첨가하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 (0.05%) PBS-트윈-20 완충액(200 μL 웰)으로 세 번 세척한 후, BSA 차단 용액으로 상온에서 1 시간 동안 배양하였다. 플루오레세인-표지된 펩타이드(SEQ ID NO: 25 또는 SEQ ID NO: 35)(최종 농도 1 μg/mL)를 첨가하고, (0.05%) PBS-트윈-20 완충액으로 세척한 후, 485/535 nm에서 흡광도를 측정하였다.
경쟁적 ELISA : 경쟁적 ELISA를 이용하여, HA를 대체하고 RHAMM과 경쟁하는, 알라닌-치환된 플루오레세인-표지된 SEQ ID NO: 1(SEQ ID NO: 25) 또는 플루오레세인-표지된 SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 35)의 능력을 측정하였다. 단백질 고정 및 상기한 바와 같은 세 번의 세척 이후, 플루오레세인-표지된 튜불린 유래 펩타이드(최종 농도 1 μg/mL) 및 HA(100 μL/웰, M.W. 220 kDa, PBS so 10 μg/mL, HA = 1 mg/mL, 5 mg/mL 및 10 mg/mL)를 플레이트에 첨가하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 세척 프로토콜 이후 485/535 nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과
도 10A는 RHAMM에 대한 열두 개의 알라닌-치환된(알라닌 스캔) 플루오레세인-결합 펩타이드 SEQ ID NO: 1(SEQ ID NO: 25)의 친화성을 도시한다. 데이터는 SEQ ID NO: 1의 잔기 2, 4, 7 내지 10 및 12가 RHAMM에 대한 적절한 결합에 있어서 중요할 수 있다는 것을 나타낸다. 도 10B는 고정된 RHAMM-CT에 대한 HA에 의한 12 개의 알라닌-치환된 플루오레세인-표지된 펩타이드 SEQ ID NO: 1(SEQ ID NO: 25)의 경쟁적 이동을 도시한다. 데이터는 2, 4, 7 내지 10 및 12번 위치에서의 SEQ ID NO: 1의 알라닌 치환이 HA와 경쟁하는 펩타이드의 능력을 폐지시킨 것을 나타낸다. 음성 대조군(고정된 RHAMM이 없음)은 각각의 측정에서 제외했으며, 모든 데이터는 두 번의 독립적인 실험에서 세 번의 측정의 평균을 나타낸다.
도 17A는 RHAMM의 HA-결합 영역에 대한 11 개의 알라닌-치환된 플루오레세인-결합 펩타이드 SEQ ID NO: 14(SEQ ID NO: 35)의 친화성을 도시한다. 데이터는 SEQ ID NO: 14의 잔기 2, 3, 5, 6, 9 및 10이 RHAMM에 대한 적절한 결합에 있어서 중요할 수 있다는 것을 나타낸다. 도 17B는 고정된 RHAMM-CT에 대한 HA에 의한 11 개의 알라닌-치환된 플루오레세인-표지된 펩타이드 SEQ ID NO: 14(SEQ ID NO: 35)의 경쟁적 이동을 도시한다. 데이터는 2, 3, 5, 6, 9 및 10번 위치에서의 SEQ ID NO: 14의 알라닌 치환이 HA와 경쟁하는 펩타이드의 능력을 폐지시킨 것을 나타낸다. 음성 대조군(고정된 RHAMM이 없음)은 각각의 측정에서 제외했으며, 모든 데이터는 두 번의 독립적인 실험에서 세 번의 측정의 평균을 나타낸다.
실시예 4: 인간 상피성 난소암 세포
재료: 완충액과 배지를 인비트로젠(Invitrogen), 시그마, 및 VWR에서 구입하였다. 알라마블루(AlamarBlue) 분석 키트를 인비트로젠에서 구입하였다. 디메틸설폭사이드(DMSO)는 알드리치에서 구입하였다. 상피성 난소암(EOC) 세포는 환자의 동의를 얻은 후 런던 지역 암 센터(London Regional Cancer Center)로부터 입수하였다.
증식 분석: 환자 유래 상피성 암 종양의 증식을 제한하는 하나의 RHAMM-결합 펩타이드(SEQ ID NO: 1)의 능력 및 복수(ascites)-유래 인간 EOC 세포의 생존율을 감소시키는 다른 하나의 RHAMM-결합 펩타이드(SEQ ID NO: 3)의 능력을 검사했다. 이러한 분석에서, 상피성 난소암 세포(환자의 복수로부터 유래됨)를 5,000 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하고 37℃ 및 5% CO2에서 24 시간 동안 성장하도록 하였다. 펩타이드(1 μM 및 10 μM)를 하루에 한 번 세포에 첨가하고 증식을 6일 동안 측정하였다. 10분의 1 부피의 알라마블루 시약을 6 일 동안 매일 배양 배지 내의 세포에 직접 첨가하였다. 570/590 nm에서 형광도를 측정하였다. 데이터는 두 번의 실험의 평균으로부터 획득하였다. 단지 디메틸설폭사이드(DMSO)로 처리한 세포와 "비-세포" 대조군 샘플을 실험에 포함하였다.
EOC 세포 흡수 연구: EOC 세포를 DMEM 배지 + 10% FBS에서 90%의 밀집도까지 배양하였다. 그런 다음, 세포를 2 x 24-웰 조직 배양 플레이트(밀집도 20,000 세포/웰) 상에 접종하였다. 그런 다음, 세포를 상온에서 1 시간 동안 DMEM + 0.1 % FCS 내의 3% BSA로 차단하였다. 차단 실험을 위해, 항체(희석 1:100, DMEM + 0.1 % FCS 배지 내의 항-IgG, 염소 항-RHAMM mAb, 또는 마우스 항-CD44 mAb)를 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 그 결과로 생긴 배양 배지를 흡입하고, 세포를 상온에서 DMEM + 0.1 % FCS로 세척하였다. 플루오레세인-결합 펩타이드(SEQ ID NO: 25; 50 μg/ml)를 첨가하고 37℃에서 30 분 동안 배양하였다. 세포를 DMEM + 0.1% FCS로 세척하고 PBS (pH = 7.6)로 세척한 후, 제조사의 프로토콜을 통해 DAPI(Electron microscopy sciences, 미국)를 포함하는 Fluoro-gel 11을 사용하여 장착하였다. Olympus FluoView FV1000를 연결한 1X81 Motorized Inverted System Microscope를 사용하여 세포를 촬영하였다. Image J(v1.42q) 소프트웨어를 사용하여 Tiff 이미지를 분석하였다. 각각의 이미지를 8-비트 형식으로 변환하고 20 및 255의 임계값을 부여하였다. 관심 영역(region of interest, ROI)을 선택하고 세포내 평균 형광을 추정하였다.
인간 상피성 난소암 세포의 증식
도 11은 인간 상피성 난소암(epithelial ovarian cancer, EOC) 세포 내의 펩타이드 SEQ ID NO: 1의 증식 분석을 도시한다. EOC 세포는 상피성 난소암 환자의 복수로부터 채취한 샘플이다. 알라마블루 분석을 이용하여 증식의 정도를 측정하였다. SEQ ID NO: 1의 펩타이드를 하루에 한 번 첨가하고, 시간에 따른 효과를 측정하였다. 데이터는 4 명의 OC 세포 샘플 중 3 개에서 증식의 억제를 보여준다.
도 13은 형광 현미경법을 이용하여 난소 종양 세포 내의 플루오레세인-결합 펩타이드 SEQ ID NO: 1(SEQ ID NO: 25)의 흡수의 시각화를 도시한다. 예상대로, 플루오레세인-표지된 SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 25)의 흡수는 EOC가 항- RHAMM로 배양될 때 감소하고, 프로브의 흡수는 항- lgG 또는 항-CD44로 처리한 세포에서 영향을 받지 않았다.
도 12는 RHAMM-결합 펩타이드에 의한 복수-유래 인간 EOC 세포의 감소된 생존율(p<0.05)을 나타내는 그래프이다. EOC 환자 샘플에서의 단일 세포를 24-웰 배양 접시에 접종하고 24 시간 후에 RHAMM-결합 펩타이드 SEQ ID NO. 3 (7 및 0.7 μM 농도) 또는 DMSO 비히클 대조군으로 처리를 개시하였다. 최대 6 일 동안 매일 재-투여(re-dosing)가 발생하였고, 세포 생존율을 알라마블루TM 시약을 사용하여 형광법(fluorometry)에 의해 평가하였다(형광 단위(fluorescence unit(FU)로 측정함).
실시예 5: PC3mLN4 인간 전립선암 라인
재료 및 방법
세포 흡수 연구: 침습성/전이성의 전립선 종양 세포에 의해 발현되는 두 개의 히알루로난 수용체는 CD44 와 RHAMM이다. 따라서, 전립선암 세포를 선택적으로 표적으로 하는 본 발명의 펩타이드의 능력을 평가하였다. 이 분석에서, PC3mLN4 인간 전립선암 세포를 DMEM 배지 + 10% FBS에서 90%의 밀집도까지 배양하였다. 그런 다음, 세포를 2 x 24-웰 조직 배양 플레이트(밀집도 20,000 세포/웰) 내의 유리 커버 슬립(12 x 12 mm, 50 μg/ml 피브로넥틴으로 코팅됨) 상에 접종하였다. 그런 다음, 세포를 상온에서 1 시간 동안 DMEM + 0.1 % FCS 내의 3% BSA로 차단하였다. 차단 실험을 위해, 항체(희석 1:100, DMEM + 0.1 % FCS 배지 내의 염소 항-RHAMM mAb 또는 마우스 항-CD44 mAb)를 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 그 결과로 생긴 배양 배지를 흡입하고, 세포를 상온에서 DMEM + 0.1 % FCS로 세척하였다. 플루오레세인-결합 펩타이드(SEQ ID NO: 29; 50 μg/ml)를 첨가하고 37℃에서 30 분 동안 배양하였다. 세포를 DMEM + 0.1 % FCS로 세척하고 PBS(pH = 7.6)로 세척한 후, 제조사의 프로토콜을 통해 DAPI(Electron microscopy sciences, 미국)를 포함하는 Fluoro-gel 11을 사용하여 장착하였다. Olympus FluoView FV1000를 연결한 1X81 Motorized Inverted System Microscope를 사용하여 세포를 촬영하였다. Image J(v1.42q) 소프트웨어를 사용하여 Tiff 이미지를 분석하였다. 각각의 이미지를 8-비트 형식으로 변환하고 20 및 255의 임계값을 부여하였다. 관심 영역(region of interest, ROI)을 선택하고 세포내 평균 형광을 추정하였다.
PC3mLN4 인간 전립선암 라인
도 14A는 공격적으로 침습성이고 전이성인 PC3mLN4 인간 전립선암 라인에 의한 HA(SEQ ID NO. 29)의 플루오레세인-결합 펩타이드 SEQ ID NO: 9 모방체의 흡수를 도시한다. 공초점 현미경을 사용하여, 종양 세포 내에서 플루오레세인-결합 펩타이드를 검출하였다(도 14A (a)). 그러나, RHAMM 단백질이 항-RHAMM mAb에 의해 차단될 때 FITC 신호는 감소한다(도 14A (b)). 이는 프로브 흡수가 특이적 항-RHAMM 단일클론 항체에 의해 차단됨을 나타낸다. 또한, 플루오레세인-결합 HA 모방체의 흡수는 세포가 항-CD44 단일클론 항체로 처리될 때 변하지 않는다(도 14A (b)). 이러한 결과는 본 발명의 HA 펩타이드 모방체가 RHAMM 의존성 메커니즘에 의해 전립선암 세포와 연관되고 이들 세포에 흡수되는 것을 나타낸다. 흡수의 정량화(도 14B)는 항체 처리를 받지 않은 세포(a) 및 항-CD44로 차단된 세포(b)에서의 통계적 차이를 보여주지 않는다. 프로브의 흡수는 항-RHAMM 항체로 처리된 세포(c)에서 극적으로 감소했다(p<0.001).
실시예 6: Ga - DOTA -결합 펩타이드의 합성 및 특성
재료: 사용된 용매는 VWR, 피셔 사이언티픽, 또는 시그마 알드리치에서 구입하였다. 링크 아미드 MBHA 수지(100-200 메쉬, 0.56 mmol/g), 표준 Fmoc 아미노산, 및 HBTU 결합 시약은 펩타이드 인터내셔널로부터 입수하였다. 1-브로모헥산산(1-bromohexanocic acid), 글리신, 브로모 에틸아세이트 및 갈륨(III) 나이트레이트(gallium (III) nitrate)는 시그마 알드리치에서 구입하였다. 1,4,7,10-테트라아자시클로도데케인(1,4,7,10-tetraazacyclododecane, 시클렌(cyclen))과 Re(CO)5Br은 스트렘 케미칼스(Strem Chemicals)에서 구입하였다.
펩타이드 합성: Fmoc 탈보호 및 아미노산 결합 사이클을 포함하는 표준 고상 펩타이드 합성법을 이용하여 링크 아미드 MBHA 수지(0.1 mmol) 상에서 펩타이드를 합성하였다. 합성 전반에 걸쳐(15 분 및 20 분의 기간) 반복적인 Fmoc 탈보호를 N,N-디메틸포르마이드(N,N-dimethylformide, DMF) 내의 20% 피페리딘 용액을 사용하여 수행하였다. 모든 아미노산 결합은 30 분 및 90 분 간격으로 0.05 이상의 농도의 Fmoc-보호된 아미노산 및 HBTU, DMF 내의 5 당량의 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 사용하여 수행하였다. 각각의 탈보호 및 결합 단계 이후, 수지를 DMF(3x)와 디클로로메탄(DCM)(3x)으로 반복해서 세척하였다. 6-브로모헥산산은 동일한 매개변수를 사용하여 결합하였다. DMF 내의 1,4,7,10-테트라아자시클로도데케인(cyclen, 10 당량)을 펩티딜(peptidyl) 사슬의 말단과 3 일 동안 반응시켰다. DMF 내의 에틸 브로모아세테이트(아민 당 3 당량)를 시클렌의 이차 아민과 24 시간 동안 반응시켜 갈륨 킬레이터(gallium chelator, DOTA)를 형성하였다. 펩타이드의 정제는 각각 분석적 및 예비적인 HPLC를 위해 1.5 mL/min 및 20 mL/min의 선형 유속에서 H2O + 0.1 % TFA(용매 A) and CH3CN + 0.1 % TFA(용매 B)를 포함하는 기울기 용매 시스템을 사용하여 수행하였다. 분석적인 HPLC는 Grace Vydac 단백질/펩타이드 RP-C18 칼럼(4.6 mm x 250 μm, 5 μm)를 사용하여 수행하였고, 예비적인 HPLC는 Grace Vydac 단백질/펩타이드 RP-C18 칼럼(22.0 mm x 250 mm, 10 μm)을 사용하여 수행하였다. 흡광도를 워터스 2998 포토다이오드 어레이(Waters 2998 Photodiode Array) 검출기를 사용하여 220 nm 및 254 nm의 파장에서 검출하였다. 정제하는 동안, 분획을 수집하고, 동결 건조한 후, ESI-MS(Waters Micromass Quattro MicroTM API)로 분석하였다.
Ga -69/71 표지화: pH 5.5의 아세테이트 완충액 내의 69/71Ga(NO3)3를 사용하여 15 분 동안 갈륨 동조(coordination)를 수행하였다. C18 역상(C18 Sep-Pak
Figure 112012109541232-pct00003
) 카트리지를 사용하여 생성물을 분리하였다. 생성물을 1% 트리플루오로아세트산을 포함하는 탈염수 내의 30% 아세토니트릴을 사용하여 카트리지에서 용출시켰다. 그 결과로 생긴 생성물을 질량 분석법으로 특징화하였고 순도는 역상 HPLC를 사용하여 분석하였다.
Ga - DOTA -결합 펩타이드의 합성 및 특성
PET 영상화를 위한 68Ga-동조 방사성트레이서(radiotracer)에 대한 가능한 비-방사성 대용품(surrogate)으로서 57/71Ga-DOTA-동조 펩타이드 SEQ ID NO: 1를 합성하고 특징화하였다. 도 15A는 DOTA-결합 펩타이드의 갈륨 표지화를 설명한다. 도 15B는 9.73 분에서 정제된 갈륨-동조 펩타이드의 RP-HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 도 15C는 도 15A의 화합물의 ESI 질량 스펙트럼을 도시한다(관찰된 것: 936.7 [M+2H]2+, 계산된 것: 934.87 [M+2H]2+).
실시예 7: Re ( CO )3 + -동조 펩타이드의 합성 및 특성
재료: 사용된 용매는 VWR, 피셔 사이언티픽, 또는 시그마 알드리치에서 구입하였다. 링크 아미드 MBHA 수지(100-200 메쉬, 0.56 mmol/g), 표준 Fmoc 아미노산, 및 HBTU 결합 시약은 펩타이드 인터내셔널로부터 입수하였다. 글리신, 소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride) 및 3-피리딘카르복스알데하이드(3-pyridinecarboxaldehyde)는 시그마 알드리치에서 구입하였다. Re(CO)5Br은 스트렘 케미칼스에서 구입하였다.
Re ( CO )3 + 킬레이터 합성([비스(피리딘-2- 일메틸 )아미노]아세트산)([bis( pyridn -2- lymethyl ) amino ] acetic acid ): 10% 아세트산(20 mL) 내의 글리신(0.602 g, 8.02 mmol)의 용액에 3-피리딘카르복스알데하이드(4.28 g, 0.02 mol)를 과잉으로 첨가하였다. 상온에서 1 시간의 교반 이후, 소듐 시아노보로하이드라이드(1.01 g, 0.016 mol)를 첨가하고 그 결과로 생긴 반응 혼합물을 24 시간 동안 교반하였다. 그 결과로 생긴 혼합물을 클로로포름(3 x 40 mL)으로 추출하고, MgSO4로 건조한 후, 휘발물을 증발시켜 노란색 오일을 수득하였다. 실리카 크로마토그래피(90% 클로로포름: 10% 메탄올)를 이용하여 조생성물을 정제하였다(1.67 g, 81 % 수율).
펩타이드 합성: Fmoc 탈보호 및 아미노산 결합 사이클을 포함하는 표준 고상 펩타이드 합성법을 이용하여 링크 아미드 MBHA 수지(0.1 mmol) 상에서 펩타이드를 합성하였다. 합성 전반에 걸쳐(15 분 및 20 분의 기간) 반복적인 Fmoc 탈보호를 N,N-디메틸포르마이드(N,N-dimethylformide, DMF) 내의 20% 피페리딘 용액을 사용하여 수행하였다. 모든 아미노산 결합은 30 분 및 90 분 간격으로 0.05 이상의 농도의 Fmoc-보호된 아미노산 및 HBTU, DMF 내의 5 당량의 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 사용하여 수행하였다. 각각의 탈보호 및 결합 단계 이후, 수지를 DMF(3x)와 디클로로메탄(DCM)(3x)으로 반복해서 세척하였다. Fmoc-아미노헥산산과 [비스(피리딘-2-일메틸)아미노]아세트산은 상기한 방법을 이용하여 결합하였다. 과잉의 [Re(CO)3Br3](Net4)2를 사용하여 레늄 동조를 수행하였다. 88% 트리플루오로아세트산을 사용하여 고체 지지체로부터의 절단을 수행하였다.
펩타이드의 정제는 각각 분석적 및 예비적인 HPLC를 위해 1.5 mL/min 및 20 mL/min의 선형 유속에서 H2O + 0.1 % TFA(용매 A) and CH3CN + 0.1 % TFA(용매 B)를 포함하는 기울기 용매 시스템을 사용하여 수행하였다. 분석적인 HPLC는 Grace Vydac 단백질/펩타이드 RP-C18 칼럼(4.6 mm x 250 μm, 5 μm)를 사용하여 수행하였고, 예비적인 HPLC는 Grace Vydac 단백질/펩타이드 RP-C18 칼럼(22.0 mm x 250 mm, 10 μm)을 사용하여 수행하였다. 흡광도를 워터스 2998 포토다이오드 어레이(Waters 2998 Photodiode Array) 검출기를 사용하여 220 nm 및 254 nm의 파장에서 검출하였다. 정제하는 동안, 분획을 수집하고, 동결 건조한 후, ESI-MS(Waters Micromass Quattro MicroTM API)로 분석하였다.
SPECT 영상화를 위한 99Tc(CO)3+-동조 방사성트레이서에 대한 가능한 비-방사성 대용품으로서 Re(CO)3+-동조 펩타이드 SEQ ID NO: 1를 합성하고 특징화하였다. 도 16A는 Re(CO)3+-동조 펩타이드 SEQ ID NO: 1의 합성을 설명하고, 도 16B는 11.06 분에서 정제된 레늄-동조 펩타이드의 RP-HPLC 크로마토그램을 도시한다. 도 16C는 레늄 동조 펩타이드의 ESI 질량 스펙트럼을 도시한다(관찰된 것: 939.1 [M+2H]2+, 계산된 것: 940.2 [M+2H]2+).
비-특허 참조문헌
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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Val Gln Gln Leu Ile Asp Glu Tyr His Ala Ala Thr 1 5 10 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Asp Asn Pro Asp Glu Met Asp Thr Ser Arg Glu Ile 1 5 10 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Ala or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> Tyr or Glu <400> 18 Glu Glu Xaa Glu Glu Xaa 1 5 <210> 19 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 19 Leu Lys Gln Lys Ile Lys His Val Val Lys Leu Lys Asp Glu Asn Ser 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Glu Val Ser Lys Leu Arg Ser Gln Leu Val Lys Arg 20 25 30 Lys <210> 20 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 20 Arg Asp Ser Tyr Ala Gln Leu Leu Gly His Gln 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Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> FITC-Ahx <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> Ahx <400> 35 Xaa Phe Thr Glu Ala Glu Ser Asn Met Asn Asp Leu Val 1 5 10 <210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Ala Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Tyr 1 5 10 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Val Ala Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Tyr 1 5 10 <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Val Glu Ala Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Tyr 1 5 10 <210> 39 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Val Glu Gly Ala Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Tyr 1 5 10 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Val Glu Gly Glu Ala Glu Glu Glu Gly Glu Glu Tyr 1 5 10 <210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Val Glu Gly Glu Gly Ala Glu Glu Gly Glu Glu Tyr 1 5 10 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Val Glu Gly Glu Gly Glu Ala Glu Gly Glu Glu Tyr 1 5 10 <210> 43 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Val Glu Gly Glu Gly Glu Glu Ala Gly Glu Glu Tyr 1 5 10 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Val Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Ala Glu Glu Tyr 1 5 10 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Val Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu 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Thr Ala Ala Glu Ser Asn Met Asn Asp Leu Val 1 5 10 <210> 57 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Phe Ala Glu Ala Glu Ser Asn Met Asn Asp Leu Val 1 5 10 <210> 58 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Ala Thr Glu Ala Glu Ser Asn Met Asn Asp Leu Val 1 5 10

Claims (59)

  1. 삭제
  2. RHAMM-결합 펩타이드로서,
    상기 RHAMM-결합 펩타이드는 서열번호 14를 포함하는 12 내지 14 아미노산 길이로 구성되는 것인, RHAMM-결합 펩타이드.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서,
    상기 RHAMM-결합 펩타이드는 서열번호: 14를 포함하는 12 또는 13 아미노산 길이로 구성되는 것인, RHAMM-결합 펩타이드.
  5. 삭제
  6. 제2항에 있어서,
    상기 RHAMM-결합 펩타이드는 튜불린-유래 펩타이드인 것인, RHAMM-결합 펩타이드.
  7. 제2항 또는 제6항에 있어서,
    상기 RHAMM-결합 펩타이드는 펩타이드의 기능성 유사체(functional analog)인 것인, RHAMM-결합 펩타이드.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 RHAMM-결합 펩타이드는 펩타이드 내 1, 4, 7, 8, 11 및 12번 위치의 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치의 아미노산이 알라닌으로 대체되는 것인, RHAMM-결합 펩타이드.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 펩타이드는 단일 보존적(single conservative) 아미노산 치환을 포함하는 것인, RHAMM-결합 펩타이드.
  10. 제2항 또는 제6항에 있어서,
    상기 펩타이드는 페길화된(PEGylated) 것인, RHAMM-결합 펩타이드.
  11. 제2항 또는 제6항에 있어서,
    상기 펩타이드는 D-아미노산을 포함하는 것인, RHAMM-결합 펩타이드.
  12. 제2항 또는 제6항에 있어서,
    상기 펩타이드는 아세틸화된(acetylated) 것인, RHAMM-결합 펩타이드.
  13. 제2항의 RHAMM-결합 펩타이드를 암호화하는 핵산.
  14. 제2항 또는 제6항에 있어서,
    상기 RHAMM-결합 펩타이드는 검출 가능한 표지에 결합되는 것인, RHAMM-결합 펩타이드.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 검출 가능한 표지는 비오틴(biotin)-기반 표지, 자기(magnetic) 표지, 방사성 표지, 형광 표지, 전자 밀도(electron-dense) 시약, 효소, 디곡시게닌(digoxigenin), 또는 합텐(hapten)으로부터 선택되는 것인, RHAMM-결합 펩타이드.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 펩타이드는 플루오레세인(fluorescein)에 결합되며, 서열번호 35인, RHAMM-결합 펩타이드.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 펩타이드는 Ga-DOTA 표지 또는 Re(CO)3+ 표지에 결합되는 것인, RHAMM-결합 펩타이드.
  18. 제2항 또는 제6항에 있어서,
    상기 RHAMM-결합 펩타이드는 세포독성 분자 또는 방사성 분자에 결합되는 것인, RHAMM-결합 펩타이드.
  19. 유효량의 제2항 또는 제6항의 RHAMM-결합 펩타이드 또는 제13항의 핵산 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 암 또는 조직 흉터(tissue scarring) 치료용 약학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 조성물은 보강제(adjuvant)를 추가로 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 RHAMM-결합 펩타이드 또는 핵산은 리포좀, 면역리포좀(immunoliposome) 또는 지질 형성(lipid formulation) 내에서 제공되는 것인, 약학적 조성물.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 제14항의 RHAMM-결합 펩타이드를 포함하는, 세포 내의 표지를 검출하기 위한 영상화용 조성물로서,
    상기 세포 내의 표지의 검출은 세포 내 RHAMM의 존재를 나타내는 것인, 조성물.
  27. 삭제
  28. 인간을 제외한 동물 세포, 조직 또는 장기를 제14항의 RHAMM-결합 펩타이드와 접촉시키는 단계; 및
    상기 인간을 제외한 동물 세포, 조직 또는 장기 내의 표지를 검출하기 위한 영상화 기술을 적용하는 단계;를 포함하고,
    여기서, 상기 세포, 조직 또는 장기 내의 표지의 검출은 세포, 조직 또는 장기 내 종양 전구 세포의 존재를 나타내는 것인, 인간을 제외한 동물 세포, 조직 또는 장기 내의 종양 전구 세포를 영상화하는 방법.
  29. (a) 환자 유래의 샘플을 제14항의 RHAMM-결합 펩타이드와 접촉시키는 단계;
    (b) 샘플 내의 표지를 검출하기 위한 영상화 기술을 적용하는 단계; 및
    (c) 환자의 예후(prognosis)를 결정하는 단계;를 포함하고,
    여기서, 예후는 환자 내의 암의 공격성 또는 전이의 가능성을 예측하고, 샘플 내의 RHAMM 발현의 검출은 나쁜 예후를 나타내는 것인, 암 환자의 예후를 결정하기 위한 정보 제공 방법.
  30. (a) 상기 환자 유래의 샘플을 제14항의 RHAMM-결합 펩타이드와 접촉시키는 단계;
    (b) 샘플 내의 표지를 검출하기 위한 영상화 기술을 적용하는 단계; 및
    (c) 환자의 예후를 결정하는 단계;를 포함하고,
    여기서, 예후는 환자 내의 암의 공격성의 가능성을 예측하고, 샘플 내의 RHAMM 발현의 검출은 좋지 않은 예후를 나타내며; 및 상기 예후에 근거하여 환자에 대한 치료의 과정을 처방하는 단계를 포함하는 것인, 암 환자에 대한 치료의 과정을 결정하기 위한 정보 제공 방법.
  31. (a) 상기 환자 유래의 샘플을 제14항의 RHAMM-결합 펩타이드와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 샘플 내의 표지를 검출하기 위한 영상화 기술을 적용하는 단계를 포함하고,
    상기 샘플 내의 RHAMM 발현의 검출은 장애 또는 질환의 양성 진단을 나타내는 것인, 세포 내의 RHAMM 발현과 관련된 장애 또는 질환의 환자의 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법으로서,
    상기 장애 또는 질환은 암인 것인, 방법.
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 제19항에 있어서,
    상기 RHAMM-결합 펩타이드는 RHAMM을 발현하는 세포에 대해 세포독성이 있는 분자에 결합되는 것인, 조성물.
  35. 삭제
  36. 제19항에 있어서,
    상기 RHAMM-결합 펩타이드는 종래의 암 치료법으로 투여되는 것인, 조성물.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 암 치료법은 암 백신, 화학요법, 면역요법, 방사선 요법 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 유효량의 제2항 또는 제6항의 RHAMM-결합 펩타이드 또는 제13항의 핵산을 포함하는, 암에 걸린 환자 내의 전이 예방용 약학적 조성물.
  43. 삭제
  44. 삭제
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